ES2561179T3 - Marcadores de expresión génica para prognosis del cáncer de mama - Google Patents

Abstract

Un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente de cáncer de mama sin recurrencia del cáncer de mama, que comprende determinar el nivel de expresión del transcrito de RNA de MYBL2 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente; normalizar dicho nivel del transcrito de RNA para obtener un nivel de expresión normalizado de MYBL2; en donde un mayor nivel de expresión normalizado de MYBL2 en comparación con el nivel normalizado del transcrito de RNA de MYBL2 en la serie de referencia de tejidos de cáncer de mama indica una probabilidad reducida de supervivencia a largo plazo sin recurrencia de cáncer de mama.

Description

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Marcadores de expresión génica para prognosis del cáncer de mama

Antecedentes de la Invención

Campo de la Invención

5 La presente invención proporciona genes y series de genes cuya expresión es importante en la diagnosis y/o prognosis del cáncer de mama.

Descripción de la Técnica Anterior

Los oncólogos tienen diversas opciones de tratamiento disponibles, con inclusión de diferentes combinaciones de fármacos quimioterapéuticos que están caracterizados como "patrón de atención", y cierto número de fármacos

10 que no llevan una reivindicación indicadora de un cáncer particular, pero para los cuales se dispone de pruebas de eficacia contra dicho cáncer. La probabilidad óptima de resultados satisfactorios del tratamiento requiere que se asignen los pacientes al tratamiento óptimo disponible para el cáncer, y que esta asignación se haga lo más pronto posible después de la diagnosis.

En la actualidad, los tests de diagnóstico utilizados en la práctica clínica son de analito simple, y por tanto no

15 capturan el valor potencial del conocimiento de relaciones entre docenas de marcadores diferentes. Además, los tests de diagnóstico frecuentemente no son cuantitativos, basándose en inmunohistoquímica. Este método proporciona a menudo resultados diferentes en laboratorios diferentes, debido en parte a que los reactivos no están normalizados, y en parte debido a que las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. Tests basados en RNA no han sido utilizados con frecuencia debido al problema de la degradación del

20 RNA a lo largo del tiempo y al hecho de que es difícil obtener muestras de tejido recientes de los pacientes para el análisis. El tejido fijado incrustado en parafina está disponible más fácilmente y se han establecido métodos para detectar RNA en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos no permiten típicamente el estudio de grandes números de genes (DNA o RNA) a partir de pequeñas cantidades de material. Por ello, tradicionalmente el tejido fijado ha sido utilizado raras veces para usos distintos de la detección inmunohistoquímica de proteínas.

25 Recientemente, varios grupos han publicado estudios concernientes a la clasificación de diversos tipos de cáncer por análisis de la expresión génica en microrredes (véase, v.g. Golub et al., Science 286:531-537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:13790-13795 (2001); Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (Suppl. 1):S316-S322 (2001); Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001)). Ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basadas en patrones de expresión génica han sido también

30 publicadas (Martin et al., Cancer Res. 60:2232-2238 (2000); West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1146211467 (2001); Sorlie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:10869-10874 (2001); Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001)). Sin embargo, estos estudios están enfocados en la mayoría de los casos en la mejora y el refino de la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, con inclusión de cáncer de mama, y generalmente no proporcionan ideas nuevas acerca de las relaciones de los genes expresados diferencialmente, y no relacionan los

35 descubrimientos con estrategias de tratamiento a fin de mejorar el resultado clínico de la terapia del cáncer.

Aunque la biología y la bioquímica moleculares modernas han descubierto centenares de genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de las células tumorales, el estado de su diferenciación, y su sensibilidad o resistencia a ciertos fármacos terapéuticos, con unas pocas excepciones, el estado de estos genes no ha sido aprovechado para el propósito de tomar rutinariamente decisiones clínicas acerca de los tratamiento con fármacos.

40 Una excepción notable es el uso de la expresión de la proteína receptora de estrógenos (ER) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes para el tratamiento con fármacos anti-estrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptina® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA).

45 A pesar de los avances recientes, el problema del tratamiento del cáncer sigue siendo el direccionamiento de los regímenes específicos de tratamiento a tipos de tumor patogénicamente distintos, y la personalización final del tratamiento del tumor a fin de maximizar el resultado. Por tanto, existe necesidad de tests que proporcionen simultáneamente información predictiva acerca de las respuestas del paciente a la diversidad de opciones de tratamiento. Esto es particularmente cierto para el cáncer de mama, cuya biología se conoce escasamente. Está

50 claro que la clasificación del cáncer de mama en un pequeño número de subgrupos, tales como el subgrupo ErbB2+, y subgrupos caracterizados por expresión génica baja a inexistente del receptor de estrógenos (ER) y un pequeño número de factores de transcripción adicionales (Perou et al., Nature, 406:747-752 (2000)) no refleja la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente.

55 WO02/10436 divulga un método para la clasificación del cáncer de mama en función del pronóstico, basado en la determinación del nivel de expresión de una o más transcripciones de RNA seleccionadas de una lista de 57 genes. Estos 57 genes se encuentran preferentemente expresados en tumores con un mal pronóstico respecto de los tumores con un buen pronóstico. La supervivencia a largo plazo de los pacientes sin recidiva se mide a través del índice de actividad mitótica, que es un indicador de la probabilidad de muerte, recidiva o metástasis en el

60 cáncer de mama.

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independent from MYCN amplification" CANCER RESEARCH, vol. 59, n.º 14, págs. 3365-3368) divulga el gen MYBL2 como marcador de una mala prognosis en el neuroblastoma.

Resumen de la Invención

5 La presente divulgación proporciona una serie de genes, cuya expresión tiene valor pronóstico, específicamente con respecto a la supervivencia sin enfermedad.

La presente descripción acomoda el uso de material de biopsia archivado incrustado en parafina para ensayo de todos los marcadores de la serie, y por consiguiente es compatible con los tipos de materiales de biopsia de mayor disponibilidad. La misma es compatible también con varios métodos diferentes de recogida de tejido tumoral, por ejemplo, por biopsia de núcleo o aspiración con aguja fina. Adicionalmente, para cada miembro de la serie de genes, la invención especifica secuencias de oligonucleótidos que pueden utilizarse en el test.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para predecir la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin recidiva del cáncer de mama tal y como se especifica en la reivindicación 1.

15 En una realización concreta, el cáncer de mama es un carcinoma de mama invasivo. En otra realización, el RNA se aísla de una muestra de tejido de cáncer de mama fijada e incrustada en cera obtenida del paciente. El aislamiento se puede realizar mediante un método conocido en la técnica, por ejemplo con tejido obtenido mediante biopsia core o con células obtenidas por aspiración con aguja fina.

Es posible que al paciente se le diagnostique un cáncer de mama invasivo con receptor de estrógeno (ER) positivo.

El método puede incluir la elaboración de un informe en el que se resuman los datos obtenidos a través del análisis de expresión génica.

El informe puede incluir, por ejemplo, la predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo del paciente y/o la recomendación de la modalidad de tratamiento para dicho paciente.

Breve Descripción de los Dibujos

25 La Tabla 1 es una lista de genes, cuya expresión se correlaciona con supervivencia del cáncer de mama. Resultados de una prueba clínica retrospectiva. Análisis estadístico binario.

La Tabla 2 es una lista de genes, cuya expresión se correlaciona con la supervivencia del cáncer de mama en pacientes positivos a receptores de estrógenos (ER). Resultados de una prueba clínica retrospectiva. Análisis estadístico binario.

La Tabla 3 es una lista de genes, cuya expresión se correlaciona con la supervivencia del cáncer de mama en pacientes negativos a receptores de estrógenos (ER). Resultados de una prueba clínica retrospectiva. Análisis estadístico binario.

La Tabla 4 es una lista de genes, cuya expresión se correlaciona con la supervivencia del cáncer de mama. Resultados de una prueba clínica retrospectiva. Análisis estadístico binario de riesgos proporcionales de Cox.

35 Las Tablas 5A y B muestran una lista de genes, cuya expresión se correlaciona con la supervivencia del cáncer de mama. Resultados de una prueba clínica retrospectiva. La tabla incluye números de acceso para los genes, y secuencias amplicón utilizadas para amplificación de la PCR.

Tablas 6A-6F. La tabla incluye secuencias para los iniciadores directo e inverso (designados por "f" y "r", respectivamente) y sondas (designadas por "p") utilizadas para amplificación PCR de los amplicones enumerados en las Tablas 5A-B.

Descripción Detallada de la Realización Preferida

A. Definiciones

A no ser que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que es comprendido comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que

45 pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (Nueva York, NY 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, que podrían utilizarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos. Para los propósitos de la presente invención, se definen a continuación los términos siguientes.

El término "microrred" se refiere a una disposición ordenada de elementos de red hibridables, preferiblemente sondas de polinucleótidos, sobre un sustrato.

55 El término "polinucleótido", tanto si se utiliza en singular como en plural, se refiere generalmente a cualquier Así, por ejemplo, los polinucleótidos que se definen en esta memoria incluyen, sin limitación, DNA mono-y bicatenario, DNA que incluye regiones mono-y bicatenarias, RNA mono-y bicatenario, y RNA que incluye regiones mono-y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden DNA y RNA que puede ser monocatenario o, más típicamente, bicatenario o que incluyen regiones mono-y bicatenarias. Adicionalmente, el término "polinucleótido" como se utiliza en esta memoria se refiere a regiones de triple hélice que comprenden RNA o DNA o a la vez RNA y DNA. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más de las moléculas, pero más típicamente implican sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es a menudo un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente cDNAs. El término incluye DNAs (con inclusión de cDNAs) y RNAs que contiene una o más bases modificadas. Así, DNAs o RNAs con cadenas principales modificadas por estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" tal como se entiende dicho término en esta memoria. Además, DNAs o RNAs que comprenden bases poco comunes, tales como inosina, o bases modificadas, por ejemplo bases tritiadas, se incluyen dentro del término "polinucleótidos" como se define en esta memoria. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas química, enzimática y/o metabólicamente modificadas de polinucleótidos sin modificar, así como las formas químicas de DNA y RNA características de virus y células, con inclusión de células simples y complejas.

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El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto, que incluye, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos mono-o bicatenarios, híbridos RNA:DNA y DNAs bicatenarios. Oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos sonda de DNA monocatenario, se sintetizan a menudo por métodos químicos, por ejemplo utilizando sintetizadores automáticos de oligonucleótidos que están disponibles comercialmente. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden fabricarse por una diversidad de otros métodos, con inclusión de técnicas mediadas por DNA recombinante in vitro y por expresión de DNAs en células y organismos.

Los términos "gen expresado diferencialmente", "expresión génica diferencial" y sus sinónimos, que se utilizan de modo intercambiable, se refieren a un gen cuya presión está activada en un nivel mayor o menor en un individuo que sufre una enfermedad, especialmente cáncer, tal como cáncer de mama, con relación a su expresión en un individuo normal o de control. Los términos incluyen también genes cuya expresión está activada en un nivel mayor

o menor en diferentes etapas de la misma enfermedad. Se entiende también que un gen expresado diferencialmente puede estar activado o inhibido al nivel del ácido nucleico o al nivel de proteínas, o puede estar sometido a remodelación alternativa para dar como resultado un producto polipeptídico diferente. Tales diferencias pueden evidenciarse por un cambio en los niveles de mRNA, expresión superficial, secreción u otra distribución de un polipéptido, por ejemplo. La expresión diferencial de genes puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o una comparación de las relaciones de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o incluso una comparación de dos productos del mismo gen procesados diferentemente, que difieren entre individuos normales e individuos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre diversos estadios de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en el patrón de expresión temporal o celular en un gen o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células normales y enfermas, o entre células que han sufrido sucesos o estadios de enfermedad diferentes. Para el propósito de esta invención, se considera que está presente "expresión diferencial de genes" cuando existe al menos una diferencia aproximada de 2 veces, de modo preferible al menos aproximadamente de 4 veces, de modo más preferible al menos aproximadamente de 6 veces, y de modo muy preferible al menos aproximadamente de 10 veces entre la expresión de un gen dado en individuos normales y enfermos, o en diversos estadios del desarrollo de la enfermedad en un individuo enfermo.

La expresión "amplificación génica" se refiere a un proceso por el cual se forman copias múltiples de un gen o fragmento de gen en una célula o línea de células particular. La región duplicada (un tramo de DNA amplificado) se conoce a menudo como "amplicón". Usualmente, la cantidad del RNA mensajero (mRNA) producida, es decir, el nivel de expresión génica, aumenta también en la proporción del número de copias producidas del gen particular expresado.

El término "diagnosis" se utiliza en esta memoria para hacer referencia a la identificación de un estado, enfermedad

o afección molecular o patológica, tal como la identificación de un subtipo molecular de cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, u otro tipo de cáncer.

El término "prognosis" se utiliza en esta memoria para hacer referencia a la predicción de la probabilidad de muerte atribuida al cáncer o progresión, con inclusión de recurrencia, propagación metastásica, y resistencia a los fármacos, de una enfermedad neoplástica, tal como cáncer de mama.

El término "predicción" se utiliza en esta memoria para hacer referencia a la probabilidad de que un paciente responda favorable o desfavorablemente a un fármaco o serie de fármacos, así como el grado de dichas respuestas, o de que de un paciente sobreviva, después de eliminación quirúrgica del tumor primario y/o quimioterapia durante cierto tiempo sin recurrencia del cáncer. Los métodos predictivos de la presente invención pueden utilizarse clínicamente para tomar decisiones acerca del tratamiento por selección de las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son instrumentos valiosos en la predicción de si un paciente tiene probabilidad de responder favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco o combinación de fármacos dado(a), y/o terapia de radiación, o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, después de cirugía y/o finalización de la quimioterapia u otras modalidades de tratamiento.

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al menos 3 años, más preferiblemente durante al menos 8 años, muy preferiblemente durante al menos 10 años después de cirugía u otro tratamiento.

El término "tumor", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a todo crecimiento y proliferación de células neoplásticas, sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" hacen referencia a o describen la afección fisiológica en los mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular descontrolado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero sin carácter limitante, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma, y cáncer cerebral.

La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que ponen en peligro el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citoquinas u otros productos de secreción a niveles anormales, supresión o agravación de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de los tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc.

"La severidad" de las reacciones de hibridación puede ser determinada fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica, y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sales. En general, las sondas más largas requieren mayores temperaturas para reasociación apropiada, en tanto que las sondas más cortas precisan temperaturas más bajas. La hibridación depende por lo general de la capacidad del DNA desnaturalizado para reasociarse cuando están presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, tanto mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se sigue que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer más severas las condiciones de la reacción, en tanto que las temperaturas más bajas harían lo contrario. Para detalles y explicación adicionales de la severidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).

"Condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", como se definen en esta memoria, típicamente: (1) emplean concentración iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con tampón 0,1% de seroalbúmina bovina/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 MM a 42ºC; o (3) emplean 50% formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos (50 μg/ml), 0,1% SDS, y 10% sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% formamida a 55ºC, seguido por un lavado de alta severidad consistente en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente severas" pueden identificarse como ha sido descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (v.g., temperatura, concentración iónica y % SDS) menos severas que las arriba descritas. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas consiste en incubación durante una noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado cizallado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 3750ºC. El profesional experto reconocerá el modo de ajustar la temperatura, la concentración iónica, etc en caso necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y análogos.

En el contexto de la presente invención, la referencia a "al menos uno", "al menos dos", "al menos cinco", etc de los genes enumerados en cualquier serie de genes particular significa uno cualquiera o cualquiera y la totalidad de las combinaciones de los genes enumerados.

Los términos "umbral de expresión", y "umbral de expresión definido" se utilizan intercambiablemente y hacen referencia al nivel de un gen o producto génico en cuestión, por encima del cual el gen o producto génico sirve como marcador predictivo para supervivencia de un paciente sin recurrencia de cáncer. El umbral viene definido experimentalmente por estudios clínicos tales como los descritos en el ejemplo que sigue. El umbral de expresión puede seleccionarse para sensibilidad máxima, para selectividad máxima, o para error mínimo. La determinación del umbral de expresión para cualquier situación está plenamente dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

B. Descripción Detallada

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, métodos convencionales de biología molecular (con inclusión de métodos recombinantes), microbiología, biología celular, y bioquímica, que están dentro de la experiencia en la técnica. Dichos métodos se explican detalladamente en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis"

(M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental immunology", 4ª edición (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science

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1.Determinación del Perfil de la Expresión Génica

5 En general, los métodos de determinación del perfil de la expresión génica pueden dividirse en dos grandes grupos: métodos basados en análisis de hibridación de polinucleótidos, y métodos basados en secuenciación de polinucleótidos. Los métodos utilizados más comúnmente conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de mRNA en una muestra incluyen transferencia Northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)), ensayos de protección de RNAsas (Hod, Biotechniques 13:852854 (1992); y reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, con inclusión de dúplex de DNA, dúplex de RNA, y dúplex híbridos DNA-RNA o dúplex DNA-proteína. Métodos representativos para análisis de expresión de genes Basándose en secuenciación incluyen Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), y análisis de expresión de genes por secuenciación masiva de firma paralela (MPSS).

15 2.PCR de Transcriptasa Inversa (RT-PCR)

De las técnicas arriba enumeradas, el método cuantitativo más sensible y más flexible es RT-PCR, que puede utilizarse para comparar los niveles de mRNA en poblaciones de muestra diferentes, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento mediante fármacos, para caracterizar patrones de expresión génica, discriminar entre mRNAs estrechamente relacionados, y para analizar la estructura del RNA.

El primer paso es el aislamiento de mRNA de una muestra diana. El material de partida es típicamente RNA total aislado de tumores humanos o líneas de células tumorales, y tejidos o líneas de células normales correspondientes, respectivamente. Así, puede aislarse RNA de una diversidad de tumores primarios, que incluyen tumores o líneas de células tumorales de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículo, ovario, útero, etc., con DNA recogido de donantes sanos. Si la fuente de mRNA es un tumor

25 primario, el mRNA puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas incrustadas en parafina y fijadas (v.g. fijadas en formalina).

Los métodos generales para extracción de mRNA son bien conocidos en la técnica y se describen en libros de texto estándar de biología molecular, con inclusión de Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Métodos para extracción de RNA a partir de tejidos incrustados en parafina se describen, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab. Invest. 56: A67 1987), y De Andrés et al., BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, el aislamiento del RNA puede realizarse utilizando kit de purificación, series de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el RNA total de células en cultivo puede aislarse utilizando mini-columnas Qiagen RNeasy. Otros kits de aislamiento de RNA disponibles comercialmente incluyen MasterPureTM Complete DNA and RNA Purification Kit (EPICENTRE®,

35 Madison, WI), y Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.). El RNA total de muestras de tejido puede aislarse utilizando RNA Stat-60 (Tel-Test). El RNA preparado a partir de un tumor puede aislarse, por ejemplo, por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Dado que el RNA no puede servir como molde para la PCR, el primer paso en la determinación del perfil de expresión génica por RT-PCR es la transcripción inversa del molde de RNA en cDNA, seguido por su amplificación exponencial en una reacción PCR. Las dos transcriptasas inversas utilizadas más corrientemente son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis de las aves (AMV-RT) y la transcriptasa inversa de virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). El paso de transcripción inversa se inicia típicamente utilizando iniciadores específicos, hexámeros aleatorios, o iniciadores oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y de la meta de determinación del perfil de expresión. Por ejemplo, el RNA extraído puede transcribirse inversamente

45 utilizando un kit RNA PCR de GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA derivado puede utilizarse luego como molde en la reacción PCR subsiguiente.

Aunque el paso PCR puede utilizar una diversidad de DNA-polimerasas termoestables dependientes de DNA, el mismo emplea típicamente la DNA-polimerasa Taq, que tiene actividad de 5'-3'-nucleasa pero carece de actividad de endonucleasa 3'-5' de corrección de lectura. Así, la PCR TaqMan® utiliza típicamente la actividad de 5'nucleasa de la polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación fijada a su amplicón diana, pero se puede utilizar cualquier enzima con actividad de 5'-nucleasa equivalente. Se utilizan dos iniciadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, está diseñado para detectar secuencias de nucleótidos localizadas entre los dos iniciadores PCR. La sonda es noextensible por la enzima DNA-polimerasa Taq, y está marcada con un tinte informador fluorescente y un tinte

55 fluorescente de extinción. Cualquier emisión inducida por láser procedente del tinte informador es extinguida por el tinte de extinción cuando los dos tintes están localizados próximos uno a otro como ocurre en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima DNA-polimerasa Taq escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal procedente del tinte informador liberado se libera del efecto de extinción del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de tinte informador por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte informador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR Taqman® puede realizarse utilizando el tipo disponible comercialmente, tal como, por ejemplo, ABI de la 5'-nucleasa se ejecuta en un dispositivo PCR cuantitativo en tiempo real tal como el ABI PRISM 7700™ Sequence Detection SystemTM. El sistema consiste en un termociclador, láser, dispositivo acoplado de carga (CCD), cámara y computadora. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por el láser es recogida en tiempo real por cables de óptica de fibras para la totalidad de los 96 pocillos, y es detectada en el CCD. El sistema incluye software para la ejecución del instrumento y para el análisis de los datos.

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Los datos del ensayo de 5'-nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Como se ha expuesto anteriormente, los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificada hasta dicho momento en la reacción de amplificación. El momento en el que se registra la señal fluorescente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar los errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR se realiza usualmente utilizando un patrón interno. El patrón interno ideal se expresa a un nivel constante entre tejidos diferentes, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los RNAs utilizados más frecuentemente para normalizar patrones de expresión génica son mRNAs para los genes internos gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y βactina.

Una variación más reciente de la técnica RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de productos PCR mediante una sonda fluorígena de doble etiquetado (a saber, la sonda TaqMan®). La PCR en tiempo real es compatible no sólo con la PCR competitiva cuantitativa, en la que se utiliza un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, sino también con la PCR cuantitativa comparativa que utiliza un gen de normalización contenido en la muestra, o un gen interno para RT-PCR. Para detalles adicionales véase,

v.g. Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996).

Los pasos de un protocolo representativo para determinación del perfil de expresión génica utilizando tejidos fijados incrustados en parafina como la fuente de RNA, que incluyen aislamiento del mRNA, purificación, extensión con iniciadores y amplificación se dan en diversos artículos de revista publicados { por ejemplo: T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 [2001]}. Resumidamente, un proceso representativo comienza con corte de secciones de aproximadamente 10 μm de espesor de muestras de tejido tumoral incrustadas en parafina. Se extrae a continuación el RNA, y se eliminan las proteínas y el DNA. Después de análisis de la concentración de RNA, pueden incluirse si es necesario pasos de reparación y/o amplificación del RNA, y el RNA se transcribe inversamente utilizando promotores específicos de genes seguido por RT-PCR.

Los iniciadores y sondas de PCR pueden diseñarse basándose en secuencias de intrón presentes en el gen a amplificar. En este caso, el primer paso en el diseño del iniciador/sonda es la delineación de secuencias de intrón dentro de los genes. Esto puede hacerse mediante software públicamente disponible, tal como el software DNA BLAT desarrollado por Kent, W.J. Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002), o por el software BLAST con inclusión de sus variaciones. Los pasos subsiguientes siguen métodos bien establecidos de diseño de iniciadores y sondas PCR.

Con objeto de evitar señales inespecíficas, es importante enmascarar las secuencias repetitivas dentro de los intrones cuando se diseñan los iniciadores y las sondas. Esto puede realizarse fácilmente utilizando el programa Repeat Masker disponible en línea del Baylor College of Medicine, que criba secuencias de DNA contra una biblioteca de elementos repetitivos y devuelve una secuencia de consulta en la cual los elementos repetitivos están enmascarados. Las secuencias de intrón enmascaradas pueden utilizarse luego para diseñar secuencias de iniciadores y sondas utilizando cualesquiera paquetes de diseño iniciador/sonda disponibles al público comercialmente o de cualquier otro modo, tales como Primer Express (Applied Biosystems); MGB 'assay-bydesign' (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 en la WWW para usuarios generales y para biólogos programadores. En: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386).

Los factores más importantes considerados en el diseño de iniciadores PCR incluyen longitud del iniciador, temperatura de fusión (Tm), y contenido en G/C, especificidad, secuencias complementarias de iniciadores, y secuencia del extremo 3'. Por lo general, los iniciadores PCR óptimos tienen habitualmente 17-30 bases de longitud, y contienen aproximadamente 20-80%, tal como, por ejemplo, aproximadamente 50-60% de bases G+C. Típicamente se prefieren valores Tm entre 50 y 80ºC, v.g. aproximadamente 50 a 70ºC.

Para directrices adicionales en relación con el diseño de iniciadores y sondas PCR véase, v.g. Dieffenbach, C.W. et al., "General Concepts for PCR Primer Design" en: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1995, pp. 133-155; Innis y Gelfand, "Optimization of PCRs" en: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, Londres, 1994, pp. 5-11; y Plasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997).

3.Microrredes

La expresión diferencial de genes puede identificarse también, o confirmarse utilizando la técnica de microrredes. Así, el perfil de expresión de genes asociados con el cáncer de mama puede medirse en tejido tumoral reciente o incrustado en parafina, utilizando tecnología de microrredes. En este método, las secuencias polinucleotídicas de

interés (con inclusión de cDNAs y oligonucleótidos) se extienden en placas, o se despliegan, sobre un sustrato de microchip. Las secuencias dispuestas en redes se hibridan luego con sondas de DNA específicas de las células o tejidos de interés. De igual modo que en el método RT-PCR, la fuente de mRNA es típicamente RNA total aislado de tumores o líneas de células tumorales humanos, y tejidos o líneas de células normales correspondientes. Así, puede aislarse RNA de una diversidad de tumores primarios o líneas de células tumorales. Si la fuente de mRNA es un tumor primario, el mRNA puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejidos congeladas o archivadas incrustadas en parafina y fijadas (v.g. fijadas en formalina), que se emplean rutinariamente y se guardan en la práctica clínica diaria.

En una realización específica de la técnica de microrredes, se aplican inserciones amplificadas por PCR de clones de cDNA a un sustrato en una red densa. Preferiblemente, se aplican al sustrato al menos 10.000 secuencias de nucleótidos. Los genes dispuestos en microrredes, inmovilizados en el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para hibridación en condiciones severas. Pueden generarse sondas de cDNA marcadas fluorescentemente por incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa de RNA extraído de los tejidos de interés. Las sondas de cDNA marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada mancha de DNA en la red. Después de lavado severo para eliminar las sondas no fijadas específicamente, se escanea el chip por microscopia láser confocal o por otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento dispuesto en red permite la evaluación de la abundancia de mRNA correspondiente. Con la fluorescencia dual en color, las sondas de CDNA marcadas por separado generadas por dos fuentes de RNA se hibridan por pares a la red. La abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado se determina de este modo simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación proporciona una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para grandes números de genes. Se ha demostrado que dichos métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcritos raros, que se expresan a razón de un pequeño número de copias por célula, y para detectar reproduciblemente al menos aproximadamente diferencias de dos veces en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)). El análisis de microrredes puede realizarse por medio de equipos disponibles comercialmente, siguiendo protocolos del fabricante, por ejemplo por utilización de la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología de microrredes de Incyte.

El desarrollo de métodos de microrredes para análisis en gran escala de la expresión génica hace posible la búsqueda sistemática de marcadores moleculares de clasificación del cáncer y la predicción de resultados en una diversidad de tipos de tumor.

4.Análisis Serial de la Expresión Génica (SAGE)

El análisis serial de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de un gran número de transcritos génicos, sin necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En primer lugar, se genera un marcador de secuencia corto (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar singularmente un transcrito, con tal que la etiqueta se obtenga de una posición singular en cada transcrito. A continuación, se enlazan muchos transcritos unos a otros para formar moléculas seriadas largas, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de los marcadores múltiples simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente por determinación de la abundancia de marcadores individuales, e identificación del gen correspondiente a cada marcador. Para más detalles véase, v.g. Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995); y Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997).

5.Tecnología MassARRAY

La tecnología MassARRAY (Sequenon, San Diego, California) es un método automatizado de alta capacidad para el análisis de la expresión génica utilizando espectrometría de masas (MS) para la detección. De acuerdo con este método, después del aislamiento del RNA, transcripción inversa y amplificación por PCR, los cDNAs se someten a escisión con iniciadores. Los productos de escisión con iniciadores derivados de cDNA se purifican, y se distribuyen en una red de chips que está pre-cargada con los componentes necesarios para la preparación de la muestra de MS MALTI-TOF. Los diversos cDNAs presentes en la reacción se cuantifican por análisis de las áreas de los picos del espectro de masas obtenido.

6.Análisis de la Expresión Génica por Secuenciación Masiva de Huellas Paralelas (MPSS)

Este método, descrito por Brenner et al., Nature Biotechnology 18: 630-634 (2000), es un método de secuenciación que combina la secuenciación de firmas no basadas en gel con clonación in vitro de millones de moldes sobre microcuentas separadas de 5 μm de diámetro. En primer lugar, se construye una biblioteca de microcuentas de moldes de DNA por clonación in vitro. Esto va seguido por el ensamblaje de una red planar de las microcuentas que contienen moldes en una celda de flujo a una densidad elevada (típicamente mayor que 3 x 106 microcuentas/cm2). Los extremos libres de los moldes clonados en cada microcuenta se analizan simultáneamente, utilizando un método de secuenciación de firmas Basándose en fluorescencia que no requiere separación de los fragmentos de DNA. Se ha demostrado que este método proporciona simultánea y exactamente, en una sola operación, centenares de miles de secuencias firma de genes a partir de una biblioteca de cDNA de levadura.

7.Inmunohistoquímica

Los métodos de inmunohistoquímica son adecuados también para detectar los niveles de expresión de los marcadores de pronóstico. Así, anticuerpos o antisueros, preferiblemente antisueros policlonales, y muy

preferiblemente anticuerpos monoclonales específicos para cada marcador se utilizan para detectar la expresión. Los anticuerpos pueden detectarse por marcación directa de los anticuerpos propiamente dichos, por ejemplo, con marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de haptenos tales como biotina, o una enzima tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Alternativamente, se utiliza un anticuerpo primario sin marcar en asociación con un anticuerpo secundario marcado, que comprende antisueros, antisueros policlonales o un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo primario. Protocolos y kits de inmunohistoquímica son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

8.Proteómica

El término "proteoma" se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (v.g. tejido, organismo, o cultivo de células) en un momento determinado. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de expresión de las proteínas en una muestra (a lo que se hace referencia también como "proteómica de expresión"). La proteómica incluye típicamente los pasos siguientes: (1) separación de las proteínas individuales en una muestra por electroforesis en gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel (v.g. por espectrometría de masas o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos utilizando bioinformática. Los métodos de la proteómica son suplementos valiosos para otros métodos de determinación del perfil de la expresión génica, y pueden utilizarse, solos o en combinación con otros métodos, para detectar productos de los marcadores de pronóstico.

9.Descripción General del Aislamiento, Purificación y Amplificación del mRNA

Los pasos de un protocolo representativo para la determinación del perfil de la expresión génica utilizando tejidos fijos incrustados en parafina como la fuente de RNA, que incluyen aislamiento del mRNA, purificación, extensión con iniciadores y amplificación, se dan en diversos artículos de revistas publicados {por ejemplo: T.E. Godfrey et al.

J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 [2001]). Resumidamente, un proceso representativo comienza con el corte de secciones de aproximadamente 10 μm de espesor de muestras de tejido tumoral incrustadas en parafina. El RNA se extrae a continuación, y se eliminan las proteínas y el DNA. Después del análisis de la concentración de RNA, pueden incluirse pasos de reparación y/o amplificación del RNA en caso necesario, y el RNA se transcribe inversamente utilizando promotores específicos de genes seguido por RT-PCR. Finalmente, los datos se analizan para identificar la o las mejores opciones de tratamiento disponibles para el paciente sobre la base del patrón de expresión génica característico identificado en la muestra de tumor examinada.

10.Serie de Genes de Cáncer de Mama, Subsecuencias de Genes Ensayadas, y Aplicación Clínica de los Datos de Expresión Génica

Un aspecto importante de la presente invención es la utilización de la expresión medida de ciertos genes por tejido de cáncer de mama para proporcionar información de pronóstico. Para este propósito es necesario corregir (normalizar) tanto las diferencias en la cantidad de RNA ensayada como la variabilidad en la calidad del RNA utilizado. Por tanto, el ensayo mide e incorpora típicamente la expresión de ciertos genes de normalización, que incluyen genes internos bien conocidos, tales como GAPDH y Cyp1. Alternativamente, la normalización puede basarse en la señal media o mediana (Ct) de la totalidad de los genes ensayados o una gran subserie de los mismos (enfoque de normalización global). Sobre una base de gen por gen, la cantidad medida normalizada de mRNA del tumor de un paciente se compara con la cantidad encontrada en una serie de referencia de tejido del cáncer de mama. El número (N) de tejidos de cáncer de mama en esta serie de referencia debería ser suficientemente alto para asegurar que las diferentes series de referencia (como un todo) se comportan esencialmente de igual manera. Si se cumple esta condición, la identidad de los tejidos de cáncer de mama individuales presentes en una serie particular no tendrá un impacto significativo sobre las cantidades relativas de los genes ensayados. Usualmente, la serie de referencia de tejidos de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 30, con preferencia al menos aproximadamente 40 especímenes de tejido de cáncer de mama FPE diferentes. A no ser que se indique otra cosa, los niveles de expresión normalizados para cada mRNA/tumor testado/paciente se expresarán como un porcentaje del nivel de expresión medido en la serie de referencia. De modo más específico, la serie de referencia de un número suficientemente alto (v.g. 40) de tumores produce una distribución de niveles normalizados de cada especie de mRNA. El nivel medido en una muestra de tumor particular a analizar cae en cierto percentil dentro de este intervalo, el cual puede ser determinado por métodos bien conocidos en la técnica. A continuación, a no ser que se indique otra cosa, la referencia a los niveles de expresión de un gen supone expresión normalizada con relación a la serie de referencia, aunque esto no siempre se indica explícitamente.

Detalles adicionales de la invención se describirán en el ejemplo no limitante siguiente.

Ejemplo

Un Estudio en Fase II de la Expresión Génica en 79 Tumores de Mama Malignos

Se diseñó y condujo un estudio de expresión de genes con el objetivo primario de caracterizar molecularmente la expresión de genes en muestras de tejido incrustadas en parafina y fijadas de carcinoma ductal invasivo de mama, y explorar la correlación entre tales perfiles moleculares y la supervivencia sin enfermedad.

Diseño del Estudio

Se realizaron ensayos moleculares sobre tejidos de tumor de mama primario incrustados en parafina y fijados con formalina, obtenidos de 79 pacientes individuales diagnosticados con cáncer de mama invasivo. Todos los pacientes en el estudio presentaban 10 o más ganglios positivos. La edad media era 57 años, y el tamaño medio de los tumores clínicos era 4,4 cm. Los pacientes se incluyeron en el estudio únicamente si la evaluación histopatológica, realizada como se describe en la sección de Materiales y Métodos, indicaba cantidades adecuadas de tejido tumoral y patología homogénea.

Materiales y Métodos

Cada bloque representativo de tumor se caracterizó por histopatología estándar para diagnóstico, evaluación semicuantitativa de la cantidad de tumor, y grado del tumor. Un total de 6 secciones (de 10 micrómetros de espesor cada una) se prepararon y pusieron en dos tubos de microcentrífuga de la marca Costar (polipropileno, tubos de 1,7 ml, transparentes; 3 secciones en cada tubo). Si el tumor constituía menos del 30% del área total del espécimen, la muestra puede haber sido disecada toscamente por el patólogo, utilizando microdisección grosera, e introduciendo el tejido tumoral directamente en el tubo Costar.

Si se obtuvo más de un bloque de tumor como parte del procedimiento quirúrgico, se utilizó para el análisis el bloque más representativo de la patología.

Análisis de la Expresión Génica

Se extrajo el mRNA y se purificó a partir de muestras de tejido fijadas e incrustadas en parafina, y se preparó para el análisis de la expresión génica como se describe en la sección 9 anterior.

Los ensayos moleculares de la expresión génica cuantitativa se realizaron por RT-PCR, utilizando el Sistema de Detección de Secuencia™ ABI PRISM 7900™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El ABI PRISM 7900™ se compone de un termociclador, láser, dispositivo acoplador de carga (CCD), cámara y computadora. El sistema amplifica las muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por el láser se recoge en tiempo real mediante cables de fibra óptica para la totalidad de los 384 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para operación del instrumento y para el análisis de los datos.

Análisis y Resultados

Se analizó el tejido tumoral para 185 genes relacionados con el cáncer y 7 genes de referencia. Los valores umbrales de ciclo (CE) para cada paciente se normalizaron basados en la mediana de los 7 genes de referencia para dicho paciente particular. Los datos de resultados clínicos estaban disponibles para todos los pacientes a partir de una revisión de los datos de registro y de gráficos de paciente seleccionados.

Los resultados se clasificaron como:

0 murieron debido a cáncer de mama o a causa desconocida o sobreviven con recurrencia de cáncer de mama;

1 sobreviven sin recurrencia de cáncer de mama o murieron debido a una causa distinta del cáncer de mama

El análisis se realizó por:

1.

Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y los desenlaces binarios de 0 ó 1.

2.

Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y el tiempo hasta el acontecimiento (0 ó 1 como se ha definido arriba) donde se confirmaron los pacientes que sobrevivían sin recurrencia del cáncer de mama o que murieron debido a una causa distinta del cáncer de mama. Este enfoque se utilizó para evaluar el impacto de pronóstico de genes individuales así como de series de genes múltiples.

Análisis de Pacientes con Carcinoma de Mama Invasivo por Enfoque Binario

En el primer enfoque (binario), el análisis se realizó sobre la totalidad de los 79 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Se realizó un test t sobre los grupos de pacientes clasificados como sin recurrencia y sin muerte relacionada con cáncer de mama al cabo de 3 años, frente a recurrencia, o muerte relacionada con cáncer de mama al cabo de 3 años, y se calcularon los valores p para diferencias entre los grupos para cada gen.

La Tabla 1 enumera los 47 genes para los cuales el valor p para las diferencias entre los grupos era < 0,10. La primera columna de valores medios de expresión se refiere a pacientes que no tenían una recurrencia metastásica

o no murieron de cáncer de mama. La segunda columna de valores medios de expresión se refiere a pacientes que

o bien tenían una recurrencia metastásica o murieron de cáncer de mama.

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Tabla 1 Media N válido

imagen8

inversamente, los valores t mayores (positivos) mayor indican expresión asociada con mejores desenlaces. Así, por ejemplo, la expresión elevada del gen CD68 (valor t = -3,41, CT medio de vivos < CT medio de fallecidos) indica una probabilidad reducida de supervivencia sin enfermedad. Análogamente, la expresión elevada del gen BC12

5 (valor t = 4,00; CT medio de vivos > CT medio de fallecidos) indica una probabilidad incrementada de supervivencia sin enfermedad.

Basándose en los datos indicados en la tabla 1, la expresión de cualquiera de los genes siguientes en el cáncer de mama por encima de un umbral de expresión definido indica una probabilidad reducida de supervivencia sin recurrencia de cáncer después de la cirugía: Grb7, CD68, CTSL, Chk1, Her2, STK15, AIB1, SURV, EGFR, MYBL2,

10 HIF 1α.

Basándose en los datos indicados en la Tabla 1, la expresión de cualquiera de los genes siguientes en el cáncer de mama por encima de un umbral de expresión definido indica un mejor pronóstico para supervivencia sin recurrencia de cáncer de mama después de cirugía: TP53BP2, PR, Bcl2, KRT14, EstR1, IGFBP2, BAG1, CEGP1, KLK10, β-Catenina, GSTM1, FHIT, Rizl, IGF1, BBC3, IGFR1, TBP, p27, IRS1, IGF1R, GATA3, CEGP1, ZNF217,

15 CD9, pS2, ErbB3, TOP2B, MDM2, RAD51, y KRT19.

Análisis de los Pacientes ER-positivos por Enfoque Binario

57 pacientes con CT normalizado para el receptor de estrógenos (ER) > 0 (es decir, pacientes ER-positivos) se sometieron a análisis separado. Se realizó un test t sobre los dos grupos de pacientes clasificados como sin recurrencia y sin muerte relacionada con cáncer de mama al cabo de 3 años, o con recurrencia o muerte

20 relacionada con cáncer de mama a los 3 años, y se calcularon los valores p para las diferencias entre los grupos para cada gen. La Tabla 2, siguiente, enumera los genes en los cuales el valor p para las diferencias entre los grupos era < 0,105. La primera columna de valores medios de expresión se refiere a pacientes que no tenían recurrencia metastásica ni murieron por cáncer de mama. La segunda columna de valores medios de expresión se refiere a pacientes que o bien padecían una recurrencia de metástasis o murieron por cáncer de mama.

25

Tabla 2

N válido

Media

Para cada gen, se utilizó un algoritmo de clasificación a fin de identificar el mejor valor umbral (CT) para utilizar cada gen aisladamente en la predicción del desenlace clínico.

Basándose en la serie de datos indicados en la Tabla 2, la expresión de los genes siguientes en el cáncer ER

5 positivo por encima de un nivel de expresión definido es indicativa de una probabilidad reducida de supervivencia sin recurrencia de cáncer después de cirugía: CD68; CTSL; FBX05; SURV; CCNB1; MCM2; Chk1; MYBL2; HIF1A; cMET; EGFR; TS; STK15. Muchos de estos genes (CD68, CTSL, SURV, CCNB1, MCM2, Chk1, MYBL2, EGFR, y STK15) se identificaron también como indicadores de mal pronóstico en el análisis previo, que no estaba limitado al cáncer de mama ER-positivo. Basándose en la serie de datos indicada en la Tabla 2, la expresión de los genes

10 siguientes en el cáncer ER-positivo por encima de un nivel de expresión definido es indicativa de un mejor pronóstico para la supervivencia sin recurrencia de cáncer después de cirugía: IGFR1; BC12; HNF3A; TP53BP2; GATA3; BBC3; RAD51C; BAG1; IGFBP2; PR; CD9; RB1; EPHX1; CEGP1; TRAIL; DR5; p27; p53; MTA; RIZ1; ErbB3; TOP2B; EIF4E. De los últimos genes, IGFR1; BC12; TP53BP2; GATA3; BBC3; RAD51C; BAG1; IGFBP2; PR; CD9; CEGP1; DR5; p27; RIZ1; ErbB3; TOP2B; EIF4E se han identificado también como indicadores de buen

15 pronóstico en el análisis previo, no limitado a cáncer de mama ER-positivo.

Análisis de pacientes ER-negativos por enfoque binario

Veinte pacientes con CT normalizado para receptor de estrógenos (ER) < 1,6 (es decir, pacientes ER-negativos) se sometieron a análisis separado. Se realizó un test t sobre los dos grupos de pacientes clasificados como sin 20 recurrencia y sin muerte relacionada con cáncer de mama a los 3 años, o con recurrencia o muerte relacionada con cáncer de mama a los 3 años, y se calcularon los valores p para las diferencias entre los grupos para cada gen. La Tabla 3 enumera los genes en los cuales el valor p para las diferencias entre los grupos era < 0,118. La primera columna de valores de expresión media se refiere a pacientes que no presentaban una recurrencia metastásica ni murieron por cáncer de mama. La segunda columna de valores de expresión media se refiere a pacientes que o

25 bien presentaban una recurrencia metastásica o murieron por cáncer de mama.

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Tabla 3

imagen10

imagen11

sin recurrencia de cáncer (p<0,05): CCND1; UPA; HNF3A; CDH1; Her2; GRB7; AKT1; STMY3; α-Catenina; VDR;

GRO1. Únicamente 2 de estos genes (Her2 y Grb7) se identificaron también como indicadores de mal pronóstico

5 en el análisis previo, no limitado a cáncer de mama ER-negativo. Basándose en la serie de datos indicada en la Tabla 3, la expresión de los genes siguientes en el cáncer ER-negativo por encima de un nivel de expresión definido es indicativa de un mejor pronóstico para supervivencia sin recurrencia de cáncer (KT14; KLK10; Maspin, TGFα, y FRP1). De los últimos genes, únicamente KLK10 ha sido identificado como indicador de buen pronóstico en el análisis previo, no limitado a cáncer de mama ER-negativo.

10 Análisis de genes múltiples e indicadores de desenlace

Se emprendieron dos enfoques a fin de determinar si la utilización de genes múltiples podría proporcionaría mejor discriminación entre los desenlaces.

En primer lugar, se realizó un análisis de discriminación utilizando un enfoque gradual directo. Se generaron 15 modelos que clasificaban el desenlace con mayor discriminación que la obtenida con cualquier gen individual solo.

De acuerdo con un segundo enfoque (enfoque de tiempo hasta el acontecimiento), se definió para cada gen un modelo de Riesgo Proporcional de Cox (véase, v.g., Cox, D.R., y Oakes, D. (1984), Analysis of Survival Data, Chapman and Hall, Londres, Nueva York) con el tiempo hasta recurrencia o muerte como variable dependiente, y el nivel de expresión del gen como la variable independiente. Se identificaron los genes que tienen un valor p <

20 0,10 en el modelo de Cox. Para cada gen, el modelo de Cox proporciona el riesgo relativo (RR) de recurrencia o muerte para un cambio unidad en la expresión del gen. Puede seleccionarse distribuir los pacientes en subgrupos para cualquier valor umbral de la expresión medida (en la escala CT), en la cual todos los pacientes con valores de expresión superiores al umbral presentan mayor riesgo, y todos los pacientes con valores de expresión inferiores al umbral presentan un riesgo menor, o viceversa, dependiendo de si el gen es un indicador de pronóstico malo (RR

25 > 1,01) o bueno (RR < 1,01). Así, cualquier valor umbral definirá subgrupos de pacientes con riesgo respectivamente incrementado o reducido. Los desenlaces se resumen en la Tabla 4. La tercera columna, con el encabezamiento: exp(coef) muestra los valores RR.

Tabla 4

imagen12

5

15

35

45

Los análisis binarios y de tiempo hasta el acontecimiento, con pocas excepciones, identificaban los mismos genes como marcadores de pronóstico. Por ejemplo, la comparación de las Tablas 1 y 4 muestra que 10 genes estaban representados en los 15 primeros genes en ambas listas. Adicionalmente, cuando ambos análisis identificaban el mismo gen a [p < 0,10], lo que ocurría para 21 genes, los mismos eran siempre concordantes con respecto a la dirección (signo positivo o negativo) de la correlación con supervivencia/recurrencia. Globalmente, estos resultados respaldan la conclusión de que los marcadores identificados tienen valor de pronóstico significativo.

Para los modelos de Cox que comprenden más de dos genes (modelos multivariante), se realiza la entrada escalonada de cada gen individual en el modelo, donde el primer gen introducido se preselecciona de entre aquellos genes que tienen valores p univariantes significativos, y el gen seleccionado para entrada en el modelo en cada paso subsiguiente es el gen que mejora óptimamente el ajuste del modelo a los datos. Este análisis puede realizarse con cualquier número total de genes. En el análisis cuyos resultados se muestran a continuación, la entrada escalonada se realizó para hasta 10 genes.

El análisis multivariante se realiza utilizando la ecuación siguiente:

RR=exp[coef(genA) x Ct(genA) + coef(genB) x Ct(genB) + coef(genC) x Ct(genC) + …………].

En esta ecuación, los coeficientes para los genes que son indicadores de desenlace favorable son números positivos y los coeficientes para los genes que son indicadores de desenlace desfavorable son números negativos. Los valores "Ct" en la ecuación son ΔCts, es decir reflejan la diferencia entre el valor Ct medio normalizado para una población y el valor Ct normalizado medido para el paciente en cuestión. La convención utilizada en el análisis presente ha sido que los ΔCts por debajo y por encima del valor medio de la población tienen signos positivos y signos negativos, respectivamente (reflejando mayor o menor abundancia de mRNA). El riesgo relativo (RR) calculado por resolución de esta ecuación indicará si el paciente tiene una probabilidad aumentada o reducida de supervivencia a largo plazo sin recurrencia de cáncer.

Análisis multivariante de genes de 79 pacientes con carcinoma de mama invasivo

Se realizó un análisis multivariante escalonado, utilizando el Modelo de Riesgo Proporcional

B-Catenina

de Cox, sobre los datos de expresión génica obtenidos para el total de 79 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Por este análisis se han identificado las series de 10 genes siguientes como genes que tienen valor predictivo particularmente fuerte de supervivencia del paciente:

(a)TP53BP2, Bcl2, BAD, EPHX1, PDGFRβ, DIABLO, XIAP, YB1, CA9, y KRT8.

(b)GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6, y WISP1.

(c)

PR, TP53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, IGFBP2, TIMP1, CA9, MMP9, y COX2.

(d)

CD68, GRB7, TOP2A, Bcl2, DIABLO, CD3, ID1, PPM1D, MCM6, y WISP1.

(e)

Bcl2, TP53BP2, BAD, EPHX1, PDGFRβ, DIABLO, XIAP, YB1, CA9, y KRT8.

(f)

KRT14, KRT5, PRAME, TP53BP2, GUS1, AIB1, MCM3, CCNE1, MCM6, e ID1.

(g)

PRAME, TP53BP2, EstR1, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3, y VEGFB.

(h)

CTSL2, GRB7, TOP2A, CCNB1, Bcl2, DIABLO, PRAME, EMS1, CA9, y EpCAM.

(i)

EstR1, TP53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, BBC3, y VEGFB.

(k)

Chk1, PRAME, p53BP2, GRB7, CA9, CTSL, CCNB1, TOP2A, 'tumor size', e IGFBP2.

(l)

IGFBP2, GRB7, PRAME, DIABLO, CTSL, (β-Catenina, PPM1D, Chk1, WISP1, y LOT1.

(m)

HER2, TP53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, EPHX1, TOP2A, TRAIL, CA9, y AREG.

(n)

BAG1, TP53BP2, PRAME, IL6, CCNB1, PAI1, AREG, 'tumor size', CA9, y Ki67.

(o)

CEGP1, TP53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, AKT2, y FGF18.

(p)

STK15, TP53BP2, PRAME, IL6, CCNE1, AKT2, DIABLO, cMet, CCNE2, y COX2.

(q)

KLK10, EstR1, TP53BP2, PRAME, DIABLO, CTSL, PPM1D, GRB7, DAPK1, yBBC3.

(r)

AIB1, TP53BP2, Bcl2, DIABLO, TIMP1, CD3, p53, CA9, GRB7, y EPHX1.

(s)

BBC3, GRB7, CD68, PRAME, TOP2A, CCNB1, EPHX1, CTSL, GSTM1, y APC.

(t)

CD9, GRB7, CD68, TOP2A, Bcl2, CCNB1, CD3, DIABLO, ID1, y PPM1D.

(w)

EGFR, KRT14, GRB7, TOP2A, CCNB1, CTSL, Bcl2, TP, KLK10, y CA9.

(x)

HIF1α, PR, DIABLO, PRAME, Chk1, AKT2, GRB7, CCNE1, TOP2A, y CCNB1.

(y)

MDM2, TP53BP2, DIABLO, Bcl2, AIB1, TIMP1, CD3, p53, CA9, y HER2.

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(aa) p27, TP53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, STK15, AKT2, e ID1. (ab) RAD51, GRB7, CD68, TOP2A, CIAP2, CCNB1, BAG1, IL6, FGFR1, y TP53BP2. (ac) SURV, GRB7, TOP2A, PRAME, CTSL, GSTM1, CCNB1, VDR, CA9, y CCNE2.

5 (ad) TOP2B, TP53BP2, DIABLO, Bcl2, TIMP1, AIB1, CA9, p53, KRT8, y BAD. (ae) ZNF217, GRB7, p53BP2, PRAME, DIABLO, Bcl2, COX2, CCNE1, APC4, y β-Catenina. Si bien la presente invención se ha descrito con referencia a lo que se considera son las realizaciones específicas,

debe entenderse que la invención no está limitada a tales realizaciones.

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Gen Acceso Nombre Sonda Sec Long

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Claims (6)

1. imagen1

   1. Un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente de cáncer de mama sin recurrencia del cáncer de mama, que comprende determinar el nivel de expresión del transcrito de RNA de MYBL2 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente; normalizar dicho nivel del

   5 transcrito de RNA para obtener un nivel de expresión normalizado de MYBL2; en donde un mayor nivel de expresión normalizado de MYBL2 en comparación con el nivel normalizado del transcrito de RNA de MYBL2 en la serie de referencia de tejidos de cáncer de mama indica una probabilidad reducida de supervivencia a largo plazo sin recurrencia de cáncer de mama.
2. 2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente determinar los niveles de expresión

   10 normalizados de los transcritos de RNA de cualquiera de los genes siguientes: GRB7, CD68, CTSL, Chk1, AIB1, CCNB1, MCM2, FBXO5, Her2, STK15, SURV, EGFR, HIF1α y TS o sus productos de expresión, en donde unos mayores niveles de expresión normalizados de al menos uno de estos genes indica una probabilidad reducida de supervivencia a largo plazo sin recurrencia del cáncer de mama.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en el cual el cáncer de mama es un carcinoma de mama invasivo.

   15 4. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de tumor de cáncer de mama es una muestra de tejido fijada, incrustada en cera.

4. 5.

   El método de la reivindicación 1, en el cual el cáncer de mama es cáncer de mama ER-positivo.

5. 6.

   El método de la reivindicación 1, donde el nivel del transcrito de RNA de MYBL2 se determina mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR).

   20 7. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente el paso de crear un informe basado en el nivel de expresión normalizado de MYBL2.

6. 8. El método de la reivindicación 7, donde el informe incluye una predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recurrencia del cáncer de mama.

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