ES2562607T3 - MIR-21 para el diagnóstico de adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia - Google Patents

MIR-21 para el diagnóstico de adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia Download PDF

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Abstract

Un método para determinar un mal pronóstico en pacientes con adenocarcinoma de colon en estadio III que están recibiendo o han recibido quimioterapia basada en fluorouracilo, que comprende: medir el nivel de al menos un producto génico de miR-21 en una muestra de ensayo de un paciente con adenocarcinoma de colon, determinar un mal pronóstico en el paciente con adenocarcinoma de colon cuando hay incremento en al menos el nivel del producto génico de miR-21 en la muestra de ensayo con respecto al nivel de un correspondiente producto génico de miR-21 en una muestra control.

Description

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DESCRIPCION
MIR-21 para el diagnostico de adenocarcinoma de colon con mal pronostico de supervivencia Antecedentes de la invencion
El adenocarcinoma de colon es una causa principal de mortalidad en todo el mundo1. El cancer colorrectal es la tercera causa mas frecuente y la segunda causa principal de muerte por cancer en Estados Unidos2. Los adenocarcinomas de colon esporadicos se inician como adenomas y evolucionan a traves de una progresion de cambios moleculares, celulares e histologicos3. Aunque las tasas de mortalidad a los 5 anos han disminuido modestamente en las ultimas 3 decadas4, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevos biomarcadores pronosticos y dianas terapeuticas para esta enfermedad. En la actualidad, la quimioterapia tiene un valor terapeutico significativo pero la cirugla es la unica forma curativa de tratamiento5.
Los objetivos terapeuticos ideales deberlan asociarse causalmente a enfermedad y ser propensos a disenar intervenciones terapeuticas; mientras que los biomarcadores ideales deberlan ser faciles de medir y tener fuertes asociaciones con resultados cllnicos. Los microARN podrlan cumplir ambos criteri os6-8.
Los microARN son moleculas de ARN no codificante de 18-25 nucleotidos que regulan la traduccion de muchos genes9. Desde su descubrimiento 1011, se ha encontrado que regulan diversos procesos celulares entre los que se incluyen apoptosis 12-14, diferenciacion101115 y proliferacion celular16. Los microARN tambien pueden tener un papel causal en la carcinogenesis 611, los niveles de expresion de los microARN estan alterados en la mayorla de los tipos de tumores1819, incluidos los tumores de colon19-22. Los microARN miR-15 y miR-16a estan eliminados o regulados por disminucion en la mayorla de las leucemias linfoclticas cronicas23. La manipulacion experimental de los microARN especlficos modula el desarrollo tumoral en sistemas de modelos de raton 1624-26. El potencial pronostico de los microARN tambien se ha demostrado para la leucemia linfocltica cronica7, el cancer de pulmon8 y los neuroblastomas27.
La expresion aberrante de los microARN puede ser causa de carcinogenesis, la inhibicion de microARN especlficos puede tener implicaciones terapeuticas. Se pueden disenar oligonucleotidos antisentido modificados para inhibir especlficamente la funcion del microARN28. Los antagomires son un tipo de oligonucleotidos antisentido que se ha demostrado que son eficaces en la inhibicion de la funcion de microARN in vivo en ratones29. La facilidad de diseno de inhibidores especlficos de la funcion de los microARN les convierte en candidatos a objetivos terapeuticos
Sumario de la invencion
En un amplio aspecto se proporciona en el presente documento un metodo para diagnosticar si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar o tiene un pronostico de menor supervivencia para una enfermedad relacionada con el cancer de colon. El metodo incluye medir el nivel de al menos un producto genico de miR-21 en una muestra de ensayo del sujeto en el que dicho sujeto en el que una alteracion en al nivel del producto genico de miR en la muestra de ensayo con respecto al nivel de un correspondiente producto genico de miR en una muestra control, es indicativo de que el sujeto tiene la enfermedad relacionada con el cancer de colon o esta en riesgo de desarrollarla. En un aspecto concreto, el al menos un producto del gen miR se selecciona del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos. En una realizacion, el producto del gen miR es miR-21.
En otro aspecto amplio, se proporciona en el presente documento un metodo de analisis para al menos un inicio de, predisposicion a o disminucion del pronostico de supervivencia para una respuesta de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, que comprende:
(1) determinar un nivel de expresion de al menos un marcador en una muestra de un sujeto de ensayo; el al menos un marcador incluye al menos un producto genico de miR-21 seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR- 181b, miR-203 y combinaciones de los mismos;
(2) comparar el nivel de expresion determinado en la etapa (1) con un nivel de expresion control del marcador en una muestra de un sujeto sano; y
(3) juzgar que el sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon cuando el resultado de la comparacion en la etapa (2) indica que: (i) el nivel de expresion del al menos un marcador en el sujeto de ensayo es mayor que en el control; o ii) el nivel de expresion del al menos un marcador en el sujeto de ensayo es menor que en el control.
La muestra puede comprender uno o mas de tejido, sangre, suero, plasma, suero, orina y heces. Asimismo, todas las etapas del metodo se pueden realizar in Vitro.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo asistido para diagnosticar si un sujeto tiene un pronostico de menor supervivencia para una enfermedad relacionada con el cancer de colon, o esta en riesgo de desarrollarla, que comprende:
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(1) transcripcion inversa de ARN desde una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un grupo de oligodesoxinucleotidos diana;
(2) hibridar los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende sondas oligonucleotldicas especlficas de miRNA-181b para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra de ensayo; y
(3) comparar el perfil de hibridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a partir de una muestra control, en el que una alteration en la senal de al menos un miRNA es indicativa de que el sujeto tiene un pronostico de menor supervivencia para una enfermedad relacionada con el cancer de colon, o esta en riesgo de desarrollarla.
En un aspecto concreto, la senal de al menos un miRNA respecto a la senal generada a partir de la muestra control esta regulada por aumento o por disminucion, Asimismo, la micromatriz puede comprender sondas oligonucleotldicas especlficas de miARN para uno o mas miARN seleccionados del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-706a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo de inhibition de la tumorigenesis en un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, una enfermedad relacionada con cancer de colon, en el que al menos un producto genico miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-1816, miR-203 y combinaciones de los mismos esta regulado por disminucion o regulado por aumento en las celulas cancerosas del sujeto, con respecto a las celulas control, que comprende:
(1) cuando el al menos un producto genico de miR esta regulado por disminucion en las celulas cancerosas, administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un producto genico de miR aislado, seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, de modo que la tumorigenesis en el sujeto esta inhibida; o
(2) cuando el al menos un producto genico de miR esta regulado por aumento en las celulas cancerosas, administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresion del al menos un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, de modo que la tumorigenesis en el sujeto esta inhibida.
En un aspecto concreto, el al menos un producto genico de miR aislado en la etapa (1) y/o en la etapa (2) es miR-21 o una variante aislada o fragmento biologicamente activo o equivalente funcional del mismo, o un anticuerpo que se une al mismo.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo de inhibicion de la tumorigenesis en un sujeto que tiene cancer de colon, que comprende:
(1) determinar la cantidad de al menos un producto genico de miR en celulas cancerosas del sujeto, con respecto a las celulas control; y
(2) alterar la cantidad del producto genico de miR expresado en las celulas cancerosas mediante:
(i) administration al sujeto de una cantidad eficaz de al menos un producto genico de miR aislado, seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, si la cantidad del producto genico de miR expresado en las celulas cancerosas es inferior a la cantidad del producto genico de miR expresado en las celulas control; o
(ii) administracion al sujeto de una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresion del al menos un producto genico de miR, si la cantidad del producto genico de miR expresado en las celulas cancerosas es superior a la cantidad del producto genico de miR expresado en las celulas control,
de modo tal que se inhibe la tumorigenesis en el sujeto.
En un aspecto concreto, el al menos un producto genico de miR aislado en la etapa (1) es miR-21 o una variante aislada o fragmento biologicamente activo del mismo. Asimismo, en ciertas realizaciones, el al menos un producto genico de miR en la etapa (ii) se selecciona del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR- 203 y combinaciones de los mismos, o una variante aislada o fragmento biologicamente activo de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente se proporciona un metodo de identification de un inhibidor de la tumorigenesis, que comprende proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de miR asociado con niveles de expresion alterados en una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que un incremento o disminucion del nivel del producto genico de miR en la celula, respecto a una celula control adecuada, es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorigenesis
En otro aspecto amplio, en el presente se proporciona un metodo de identificacion de un inhibidor de la tumorigenesis, que comprende proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de miR asociado con niveles de expresion alterados en una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que una disminucion del nivel del producto genico de miR en la celula, respecto a una celula control adecuada, es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorigenesis
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En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un marcador para evaluar una o mas vlas metabolicas que contribuyen a al menos uno de iniciacion, progresion, gravedad, patologla, agresividad, grado, actividad, discapacidad, mortalidad, morbididad, subclasificacion de la enfermedad u otra caracterlstica patogenica o patologica subyacente de al menos una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el marcador comprende uno o mas productos genicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR- 106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona una composition que comprende uno o mas de los marcadores descritos en el presente documento.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo de identification de un potencial para el inicio o desarrollo de al menos una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un sujeto, proporcionando el metodo medir uno o mas de los marcadores descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, uno o mas marcadores estan presentes en una muestra aislada y todas las etapas del metodo se realizan in vitro.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un reactivo para analizar una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el reactivo comprende un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleotidos de al menos un marcador descrito en el presente documento o una secuencia de nucleotidos complementaria a la secuencia de nucleotidos del marcador.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un reactivo para analizar una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el reactivo comprende un anticuerpo que reconoce una protelna codificada por al menos un marcador descrito en el presente documento.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un circuito de ADN para analizar una enfermedad relacionada con el cancer de colon, sobre el que una sonda se ha inmovilizado para analizar al menos un marcador descrito en el presente documento.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo de evaluation de la eficacia de un tratamiento para prevenir, diagnosticar y/o tratar al menos una enfermedad relacionada con el cancer de colon, que comprende:
1) someter a un animal a una terapia cuya eficacia se esta evaluando, y
2) determinar el nivel de eficacia del tratamiento que se esta analizando en el tratamiento o prevention de la enfermedad relacionada con el cancer de colon evaluando al menos un marcador descrito en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el agente terapeutico candidato comprende uno o mas de: composiciones farmaceuticas, composiciones nutraceuticas y composiciones homeopaticas. Asimismo, el tratamiento en evaluacion puede ser para usar en un sujeto humano. En determinadas realizaciones, el metodo no es un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugla o terapia.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo de evaluar el potencial de al menos un material segun la capacidad de iniciar una respuesta a una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un modelo animal, proporcionando el metodo:
1) medir uno o mas de los marcadores regulados por aumento o por disminucion descritos en el presente documento tras la exposition del animal a uno o mas materiales en cantidades suficientes para iniciar una respuesta de la enfermedad relacionada con el cancer de colon en el animal; y
2) determinar si al menos uno de los marcadores regulados por aumento o por disminucion tiene la capacidad para iniciar una respuesta de la enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad relacionada con el cancer de colon, que comprende: al menos un producto genico de miR se selecciona del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos; y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona una composicion farmaceutica para tratar un cancer de colon, que comprende al menos un compuesto de inhibition de la expresion de miR y un vehlculo farmaceuticamente aceptable, en el que el al menos un compuesto de inhibicion de la expresion de miR es especlfico de un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR- 181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un artlculo de fabrication que comprende: al menos un reactivo de captura que se une a un marcador de una enfermedad relacionada con el cancer de colon seleccionado de al menos uno de los marcadores descritos en el presente documento.
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En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un kit para el cribado de un compuesto candidato a un agente terapeutico para tratar una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el kit comprende: uno o mas reactivos de al menos un marcador descrito en el presente documento y una celula que expresa al menos un marcador. En determinadas realizaciones, la presencia del marcador se detecta usando un reactivo que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une especlficamente a al menos un marcador. Asimismo, en determinadas realizaciones, el reactivo esta marcado, radiomarcado o marcado con biotina y/o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo esta radiomarcado, marcado con cromoforo, marcado con fluoroforo o marcado con enzima. En una realizacion concreta, el kit incluye ademas un contenedor que comprende al menos uno de los marcadores. Asimismo, el reactivo puede comprender uno o mas de: un anticuerpo, una sonda a la que el reactivo esta unido o se puede unir, y un quilato metalico inmovilizado.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un ensayo de cribado de una enfermedad relacionada con el cancer de colon, que comprende:
poner en contacto uno o mas de los marcadores de la reivindicacion 20 con un sustrato para dicho marcador y con un agente de ensayo, y
determinar si el agente de ensayo modula la actividad del marcador.
En determinadas realizaciones, todas las etapas del metodo se pueden realizar in vitro.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona una micromatriz para predecir la presencia de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un sujeto, que comprende un anticuerpo dirigido a al menos un marcador de la reivindicacion 20.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporcionan metodos, composiciones y similares, en los que un nivel de expresion del marcador se evalua detectando la presencia de un polinucleotido transcrito o una porcion del mismo, en los que el polinucleotido transcrito comprende una region de codificacion del marcador. Asimismo, la muestra puede ser un fluido corporal o tejido asociado con el cancer de colon. En una realizacion concreta, la muestra comprende celulas obtenidas del paciente.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo para tratar, prevenir, invertir o limitar la gravedad de una complicacion de la enfermedad relacionada con el cancer de colon en un individuo que lo necesite, que comprende:
Administrar al individuo un agente que interfiere en al menos una via de senalizacion de la respuesta de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, en una cantidad suficiente para interferir con dicha senalizacion, en el que el agente comprende al menos un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona el uso de un agente que interfiere con al menos una via de senalizacion de respuesta de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, para la fabricacion de un medicamento para tratar, prevenir, inventor o limitar la gravedad de una complicacion de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, en un individuo, en el que el agente comprende al menos un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo para tratar, prevenir, inventor o limitar la gravedad de una complicacion de la enfermedad relacionada con el cancer de colon en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo un agente que interfiere en al menos una cascada de respuesta de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el agente comprende al menos un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona el uso de un agente que interfiere con al menos una cascada de respuesta de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, para la fabricacion de un medicamento para tratar, prevenir, inventor o limitar la gravedad de una complicacion de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, en un individuo, en el que el agente comprende al menos un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un medio legible por ordenador que comprende una base de datos que tiene una pluralidad de perfiles de referencia codificados digitalmente, en el que al menos un primer perfil de referencia representa un nivel de al menos un primer marcador en una o mas muestras de uno o mas sujetos que exhiben indicios de una respuesta de enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el marcador comprende uno o mas productos genicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
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En determinadas realizaciones, el medio legible por ordenador incluye al menos un segundo perfil de referenda que representa un nivel de al menos un segundo marcador en una o mas muestras de uno o mas sujetos que exhiben indicios de una respuesta de enfermedad relacionada con el cancer de colon o sujetos que tienen una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un sistema informatico para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon, es propenso a sufrirla o tiene un mal pronostico de supervivencia a ella, que comprende la base de datos descrita en el presente documento y un servidor que comprende un codigo ejecutable por ordenador para hacer que el ordenado reciba un perfil de un sujeto, identificar de la base de daros un perfil de referencia equivalente que es relevante en terminos diagnosticos para el perfil del sujeto y generar una indicacion de si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o es propenso a sufrirla.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un metodo asistido por ordenador para evaluar la presencia, ausencia, naturaleza o extension de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un sujeto, que comprende:
1) proporcionar un ordenador que comprende un modelo o algoritmo para clasificar los datos de una muestra obtenida del sujeto, en el que la clasificacion incluye analizar los datos para determinar la presencia, ausencia o cantidad de al menos un marcador, en el que el marcador comprende uno o mas productos genicos de miR seleccionados de miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos;
2) introducir datos de la muestra biologica obtenida del sujeto; y
3) clasificar la muestra biologica para indicar la presencia, ausencia, naturaleza o extension de una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En otro aspecto amplio, al menos un producto genico de miT y combinaciones de los mismos incluye variantes aisladas o fragmentos biologicamente activos o equivalentes funcionales de los mismos o anticuerpos que se unen a los mismos.
En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un modelo animal para el cancer de colon en el que al menos uno de los siguientes procesos biologicos o qulmicos se produce en un modelo animal de regulacion por aumento o por disminucion de uno o mas productos genicos de miR se selecciona del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, el modelo animal es un vertebrado no humano. En realizaciones concretas, el animal es un raton, rata, conejo o primate.
Varios objetos y ventajas de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la siguiente descripcion detallada de la realizacion preferida, cuando se lea a la luz de las figuras adjuntas.
Breve descripcion de las figuras
La patente o archivo de solicitud contiene al menos una figura ejecutada en color. La Oficina entregara copias de la presente patente o publication de solicitud de patente con figuras a color tras petition y abono de la tarifa necesaria.
Figuras 1a - 1g: MiR-21 se expresa a niveles mas altos en los adenocarcinomas de colon con expresion creciente en los tumores mas avanzados.
(Fig. (1a) La hibridacion in situ para miR-21 se optimizo para distinguir una expresion alta y baja de miR-21. Las celulas epiteliales colonicas en tumores humanos (T) expresan niveles mas altos de miR-21 en comparacion con el tejido no tumoral (N) adyacente. (Fig. 1c) Los nucleos y citoplasmas de las celulas epiteliales colonicas en tejido tumoral expresan cantidades significativas de miR-21 en tejido tumoral, a alto aumento. (Fig. 1e) El tejido no tumoral no muestra expresion significativa de miR-21 con el mismo aumento.
(Fig. 1b, Fig. 1d, Fig. 1f) La sonda control mixta no muestra tincion significativa con un aumento bajo o alto en secciones seriadas de tejido tumoral y no tumoral, segun lo previsto. La barra de escala (Figs. 1 c-f) indican que (g) miR-21500 pM se expresa a niveles mas altos en tumores mas avanzados. Los graficos de puntos representan valores Ct relativos a miR-21 (de RT-PCR cuantitativa) para los niveles de expresion en adenoma y tumores que se han normalizado con respecto a tejido no adenoma o no tumoral pareado, respectivamente. Los tipos de tejido se han ordenado desde adenoma a tumores en estadio I-IV. Las barras indican la mediana del valor. Existe una tendencia significativa de que los tumores mas avanzados tienen una expresion mas alta de miR-21 (ensayo no parametrico para la tendencia a traves de grupos ordenados).
Figura 2: miR-21 se expresa a niveles mas altos en tumores mas avanzados. Se usaron micromatrices de microARN para medir los niveles de expresion de miR-21. Los graficos de puntos representan el log2 de miR-21 (proporciones tumor/no tumor) calculado a partir de micromatrices de microARN de la cohorte original. La sonda hsa-miR-21-prec 17No 1 de la micromatriz se uso para medir la expresion de miR-21. Se excluyeron los tejidos con expresion indetectable de miR-21 basada en los datos de la micromatriz. Los tipos de tejido se han ordenado
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como tumores TNM en estadio I a estadio IV. Las barras indican la mediana del valor. Existe una tendencia significativa de que los tumores mas avanzados tienen una expresion mas alta de miT-21 (p= 0,04; ensayo no parametrico para la tendencia a traves de grupos ordenados).
Figuras 3a y 3b: una expresion elevada de miR-21 en los tumores predice una mala supervivencia en sujetos con histologla de adenocarcinoma tlpica en ambas cohortes independientes. Este analisis excluye a los sujetos con histologla de adenocarcinoma mucinoso o carcinoma adenoescamoso.
(Fig. 3a) Se usaron micromatrices de microARN en la cohorte de ensayo de Maryland para medir los niveles de expresion de microARN de tejidos tumorales y no tumorales. Se excluyeron los tejidos con expresion indetectable de miR-21 basada en los datos de la micromatriz. La expresion alta de miR-21 se clasifico basandose en el tercil mas alto. Las llneas rojas indican individuos con expresion alta, mientras que las llneas verdes corresponden a la expresion baja. Para el tejido no tumoral, 24/69 tejidos se clasificaron como altos mientras que 26/72 tumores se clasificaron como altos. La expresion alta de miR-21 en tumores (derecha) se asocia a una mala supervivencia mientras que no se asocia a ella en el tejido no tumoral.
(Fig. 3b) Validacion de la asociacion con expresion alta de miR-21 en tumores y un mal pronostico en una cohorte independiente. Los niveles de expresion de miR-21 se midieron mediante RT-PCR cuantitativa. La expresion alta se basa en el tercil mas alto. 35/103 tejidos no tumorales se clasificaron como altos y 34/103 tejidos tumorales se clasificaron como altos. Los valores P son valores p del orden logarltmico del analisis de Kaplan-Meier. Las X en todas las llneas indican el momento en el que se censuro a un individuo.
Figuras 4a y 4b: La expresion alta de miR-21 en tumores predice una mala supervivencia en ambas cohortes independientes. Este analisis incluye a todos los sujetos con independencia de la histologla del adenocarcinoma.
(Fig. 4a) Se usaron micromatrices de microARN en la cohorte de ensayo de Maryland para medir los niveles de expresion de microARN de tejidos tumorales y no tumorales. Se excluyeron los tejidos con expresion indetectable de miR-21 basada en los datos de la micromatriz. La expresion alta de miR-21 se clasifico basandose en el tercil mas alto. Las llneas rojas indican individuos con expresion alta, mientras que las llneas verdes corresponden a la expresion baja. Para el tejido no tumoral, 26/74 tejidos se clasificaron como altos mientras que 28/79 tumores se clasificaron como altos. La expresion alta de miR-21 en tumores (derecha) se asocia a una mala supervivencia mientras que no se asocia a ella en el tejido no tumoral.
(Fig. 4b) Validacion de la asociacion con expresion alta de miR-21 en tumores y un mal pronostico en una cohorte independiente. Los niveles de expresion de miR-21 se midieron mediante RT-PCR cuantitativa. La expresion alta se basa en el tercil mas alto. 37/111 tejidos no tumorales se clasificaron como altos y 37/111 tejidos tumorales se clasificaron como altos. Todos los valores P son valores p del orden logarltmico del analisis de Kaplan-Meier. Las X en todas las llneas indican el momento en el que se censuro a un individuo.
Figuras 5a, 5b y 5c: La expresion alta de miR-21 esta asociada a una mala respuesta a la quimioterapia adyuvante para los casos con histologla convencional de adenocarcinoma. Este analisis incluye a los sujetos de la cohorte de validacion, excluyendo a los sujetos con histologlas de adenocarcinoma mucinoso o carcinoma adenoescamoso.
(Fig. 5a) Comparacion de las tasas de supervivencia de los sujetos con TNM en estadio II/III con histologla convencional de adenocarcinoma por los niveles de expresion de miR-21 y recepcion de quimioterapia adyuvante. Para los 77 sujetos en estadio II/III, 25 se clasificaron como expresion baja de miR-21 que reciben tratamiento, 28 como expresion baja de miR-21 y que no reciben tratamiento, 11 como expresion alta que reciben tratamiento y 13 como expresion alta y que no reciben tratamiento. Para los sujetos en estadio II/III que recibieron quimioterapia adyuvante, la expresion alta de miR-21 en tumores esta asociada a una supervivencia mala (p = 0,03).
(Fig. 5b) Comparacion de sujetos con TNM en estadio II con histologla convencional de adenocarcinoma. Para los 33 sujetos en estadio II, 8 se clasificaron como expresion baja de miR-21 que reciben tratamiento, 15 como expresion baja de miR-21 y que no reciben tratamiento, 3 como expresion alta que reciben tratamiento y 7 como expresion alta y que no reciben tratamiento. Todos los sujetos en estadio II que recibieron quimioterapia sobrevivieron durante todo el estudio.
(Fig. 5c) Comparacion de sujetos con TNM en estadio III con histologla convencional de adenocarcinoma. Para los 44 sujetos en estadio III, 17 se clasificaron como expresion baja de miR-21 que reciben tratamiento, 13 como expresion baja de miR-21 y que no reciben tratamiento, 8 como expresion alta que reciben tratamiento y 6 como expresion alta y que no reciben tratamiento. Para los sujetos en estadio III que recibieron quimioterapia adyuvante, la expresion alta de miR-21 en tumores esta asociada a una supervivencia mala (p = 0,02). Las X en todas las llneas indican el momento en el que se censuro a un individuo.
Figuras 6a, 6b y 6c: Analisis combinado de la cohorte del ensayo de Maryland y cohorte de validacion de Hong
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Kong que analiza asociaciones entre la expresion de miR-21 en tumores y recepcion de quimioterapia adyuvante con pronostico. Este analisis incluye todos los sujetos con TNM en estadio II/III de ambas cohortes. Se excluyo a los sujetos con histologla de adenocarcinoma mucinoso o carcinoma adenoescamoso. La columna de la izquierda incluye graficos de Kaplan-Meier que analiza la asociacion entre la recepcion de tratamiento adyuvante y el pronostico. La columna del dentro incluye el analisis de la asociacion entre niveles de expresion alta de miR- 21 en tumores y el pronostico y la columna de la derecha subdivide a los individuos basandose en la quimioterapia y al estado de expresion de miR-21.
(Fig. 6a) Todos los sujetos en estadio II/III. Para los 119 sujetos en estadio II/III, 40 se clasificaron como expresion baja de miR-21 que reciben tratamiento, 41 como expresion baja de miR-21 y que no reciben
tratamiento, 16 como expresion alta que reciben tratamiento y 22 como expresion alta y que no reciben
tratamiento. La expresion alta de miR-21 se asocia a una mala supervivencia para los que reciben quimioterapia (= 0,003) as! como para aquellos que no reciben tratamiento (p = 0,04).
(Fig. 6b) Todos los sujetos en estadio II. Para los 52 sujetos en estadio II/III, 10 se clasificaron como expresion baja de miR-21 que reciben tratamiento, 25 como expresion baja de miR-21 y que no reciben tratamiento, 4 como expresion alta que reciben tratamiento y 13 como expresion alta y que no reciben tratamiento. Las asociaciones entre expresion alta de miR-21 y el pronostico no fueron estadlsticamente significativas en los individuos que recibieron quimioterapia (p= 0,11) ni en aquellos que no recibieron quimioterapia (p = 0,06).
(Fig. 6c) Todos los sujetos de TNM en estadio III. Para los 67 sujetos en estadio III, 30 se clasificaron como expresion baja de miR-21 que reciben tratamiento, 16 como expresion baja de miR-21 y que no reciben
tratamiento, 12 como expresion alta que reciben tratamiento y 9 como expresion alta y que no reciben
tratamiento. La expresion alta de miR-21 se asocia significativamente a una mala supervivencia en los sujetos en estadio III que recibieron quimioterapia (p= 0,007), pero no en los sujetos ni que no recibieron quimioterapia (p = 0,30). Las X en todas las llneas indican el momento en el que se censuro a un individuo.
Figuras 7a - 7c. Los perfiles de miARN globales se asocian a una estadificacion cllnica de TNM y el pronostico de la supervivencia. El agrupamiento jerarquico de las proporciones miARN TIN tuvieron como resultado la formacion de dos grupos denominados de forma arbitraria grupo A y grupo B. El mapa HEAR resultante y las asignaciones de grupos se muestran en la Fig. 7a. Estos dos grupos estaban compuestos por individuos con pronosticos de supervivencia significativamente diferentes para la estadificacion de TNM, teniendo los individuos del grupo B muy probablemente un pronostico de estadio III o IV en comparacion con los individuos del grupo A (Fig. 7b). El analisis de Kaplan-Meier muestra que los individuos del grupo B tambien tienen un peor pronostico de la supervivencia (Fig. 7c).
Figuras 8a - 8i. Las proporciones TIN de miARN individuales son predictivas del pronostico de la supervivencia. Se presentan graficos que muestran proporciones TIN por estadificacion de TNM (izquierda) y analisis de Kaplan-Meier (derecha) para cada uno de estos 9 miARN. El eje Y (proporcion TIN por graficos de la estadificacion del TNM) indica la proporcion TIN transformada por log(2) para cada individuo, mientras que el eje Y agrupa a los individuos por estadificacion del TNM (I, II, III o IV). Los valores de significacion mostrados son el resultado de un ensayo no parametrico para la tendencia de los valores medios de la proporcion TIN a traves de individuos agrupados por estadificacion. Los graficos de Kaplan-Meier incluyen todos los individuos con datos de proporcion TIN para dicho miARN concreto. Los inventores han encontrado que las proporciones de TIN se asociaban tanto a la estadificacion cllnica como al pronostico de la supervivencia.
Figuras 9a y 9b. Una firma de miARN de 9 miARN predice el riesgo de morir de cancer de colon. Se demostro que las proporciones TIn de miR-21, miR-106a, miR181b, miR-16b, miR-203, let-7g, miR-29a, miR-103-2 y miR- 10a eran cada una predictivas de pronostico del cancer de colon. La agrupacion jerarquica de las proporciones TIn de estos 9 miARN tuvo como resultado la division de los individuos en dos grupos (1A) con pronostico de supervivencia significativamente (1B). Grupo B en el que los individuos presentaban un riesgo significativamente mas alto de morir por cancer de colon que los del grupo A. Se excluyo del analisis a los individuos si les faltaban 2 de las 9 proporciones TIN que conforman la firma de miARN.
Descripcion detallada de la realizacion preferida
En un amplio aspecto, en el presente documento se proporciona la identificacion de microARN concretos cuya expresion esta alterada en las celulas cancerosas asociadas a diferentes canceres de colon, con respecto a las celulas control normales.
Como se usa en el presente documento de forma intercambiable, un “producto genico de miR”, “microARN” o “miR” o “miARN” se refiere al transcrito de ARN procesado (p. ej., maduro) o sin procesar (p. ej., precursor) de un gen miR. Dado que los productos del gen miR no se traducen en protelna, el termino “productos genicos de miR” no incluye protelnas. El transcrito del gen miR sin procesar tambien se denomina “precursor de miR” o “prec de miR”, y normalmente comprende un transcrito de ARN de aproximadamente 70-100 nucleotidos de longitud. El precursor de miR se puede procesar mediante digestion con una ARNasa (por ejemplo, Dicer, Argonaut, o ARNasa III (p. ej.,
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ARNasa III de E. coli) en una molecula de ARN activa de 19-25 nucleotidos. Esta molecula de ARN activa de 19-25 nucleotidos tambien se denomina transcrito del gen miR “procesado” o miARN “maduro”.
La molecula de ARN activa de 19-25 nucleotidos se puede obtener del precursor del precursor de miR a traves de rutas de procesamiento naturales (p. ej., usando celulas intactas o lisados celulares) o mediante rutas de procesamiento sinteticas (p. ej., usando enzimas de procesamiento aisladas, tales como Dicer, Argonaut o ARNasa Ill aisladas). Se entiende que la molecula de aRn activa de 19-25 nucleotidos tambien se puede producir directamente mediante slntesis biologica o qulmica sin tener que haberla procesado desde el precursor de miR. Cuando en el presente documento se hace referencia a un microARN pos su nombre, el nombre corresponde tanto al precursor como a la forma madura, a menos que se indique lo contrario.
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan metodos de diagnostico de si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, un cancer de colon, que comprende medir el nivel de al menos un producto genico de miR en una muestra de ensayo del sujeto y comparar el nivel del producto genico de miR en la muestra de ensayo con el nivel de un correspondiente producto genico de miR de una muestra control. Como se usa en el presente documento, un “sujeto” puede ser cualquier mamlfero que tenga, o se sospecha que tiene, un cancer solido. En una realizacion preferida, el sujeto es un ser humano que tiene, o se sospecha que tiene, un cancer de colon.
En una realizacion, el al menos un producto genico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos. En una realizacion concreta, el producto de miR es miR-21.
La enfermedad relacionada con el cancer de colon puede ser cualquier trastorno o cancer que aparece en los tejidos del colon. Dichos canceres normalmente se asocian a la formacion y/o presencia de masas tumorales y pueden ser, por ejemplo, adenocarcinomas.
En una realizacion, el colon es un adenocarcinoma y el al menos un producto genico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En una realizacion adicional, el al menos un producto genico de miR medido en la muestra de ensayo es miR-21.
El nivel de al menos un producto genico de miR se puede medir en una muestra biologica (p. ej., celulas, tejidos) obtenida del sujeto. Por ejemplo, se puede extraer una muestra de tejido (p. ej., de un tumor) de un sujeto que se sospecha que tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon mediante tecnicas de biopsia convencionales. En una realizacion, se puede extraer una muestra de sangre del sujeto y las celulas sangulneas (p. ej., globulos blancos) se pueden aislar para extraccion del ADN mediante tecnicas estandar. La muestra de sangre o de tejido se obtiene, preferentemente, del sujeto antes del inicio de la radioterapia, la quimioterapia u otro tratamiento terapeutico. Se puede obtener una correspondiente muestra control de tejido o de sangre de tejidos no afectados del sujeto, de un ser humano normal individual o de una poblacion de individuos normales, o de celulas cultivadas correspondientes a la mayorla de las celulas en la muestra del sujeto. Despues, la muestra de tejido control o de sangre se procesa junto con la muestra del sujeto, de modo que los niveles de producto genico de miR producido a partir de un gen miR dado en celulas de la muestra del sujeto se puede comparar con los correspondientes niveles del producto genico de miR de las celulas de la muestra control. Una expresion del miR de referencia estandar para la muestra biologica tambien se puede usar como control.
Una alteration (p. ej., un incremento o disminucion) en el nivel de un producto genico de miR en la muestra obtenida del sujeto, con respecto al nivel de un correspondiente producto genico de miR en una muestra control, es indicativa de la presencia de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en el sujeto.
En una realizacion, el nivel del al menos un producto genico de miR en la muestra de ensayo es mayor que el nivel del correspondiente producto genico de miR en la muestra control (es decir, la expresion del producto genico de miR esta “regulada por aumento”). Como se usa en el presente documento, la expresion de un producto genico de miR esta “regulada por aumento” cuando la cantidad de producto genico de miR en una muestra de celula o tejido de un sujeto es superior a la cantidad del mismo producto genico en una muestra control de celula o tejido.
En otra realizacion, el nivel del al menos un producto genico de miR en la muestra de ensayo es menor que el nivel del correspondiente producto genico de miR en la muestra control (es decir, la expresion del producto genico de miR esta “regulada por disminucion”). Como se usa en el presente documento, la expresion de un gen miR esta “regulada por disminucion” cuando la cantidad de producto genico de miR producido a partir de dicho gen en una muestra de celula o tejido de un sujeto es inferior a la cantidad producida a partir del mismo gen en una muestra control de celula o tejido.
La expresion relativa del gen miR en las muestras control y normal se puede determinar con respecto a uno o mas patrones de expresion de ARN. Los patrones pueden comprender, por ejemplo, un nivel de expresion del gen miR de cero, el nivel de expresion del gen miR en tejidos no afectados del sujeto o el nivel medio de expresion del gen
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miR obtenido previamente para una poblacion de controles humanos normales.
El nivel de un producto genico de miR en una muestra se puede medir usando cualquier tecnica que sea adecuada para detectar niveles de expresion de ARN en una muestra biologica. Tecnicas adecuadas (p. ej., analisis de transferencia Northern, RT-PCR, hibridacion in situ) para determinar los niveles de expresion de ARN en una muestra biologica (p. ej., celulas o tejidos) son bien conocidas para los expertos en la tecnica. En una realizacion concreta, el nivel de al menos un producto genico de miR se detecta usando analisis de transferencia Northern. Por ejemplo, el ARN celular total se puede purificar a partir de las celulas mediante homogeneizacion en presencia de tampon de extraccion de acido nucleico, seguido de centrifugacion. Los acidos nucleicos se precipitan y el ADN se elimina mediante tratamiento con ADNasa y precipitacion. Despues, las moleculas de ARN se separan mediante electroforesis en gel sobre geles de agarosa de acuerdo con tecnicas estandar y se transfieren a filtros de nitrocelulosa. El ARN se inmoviliza despues sobre los filtros mediante calentamiento. La deteccion y cuantificacion del ARN especlfico se consigue usando sondas de ADN o de ARN adecuadamente marcadas complementarias al ARN en cuestion. Vease, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capltulo 7.
Se pueden producir sondas adecuadas para hibridacion de transferencia de tipo Northern de un producto genico de miR dado a partir de las secuencias de acido nucleico e incluyen, entre otras, sondas que tienen una complementariedad de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o completa con un producto genico de miR de interes. Los metodos para la preparacion de sondas de ADN y de ARN marcadas y las condiciones de hibridacion de las mismas a secuencias nucleotldicas diana se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capltulos 10 y 11.
En un ejemplo no limitante, la sonda de acido nucleico se puede marcar con, por ejemplo, un radionuclido, tal como 3H, 32P, 33P, 14C o 35S, un metal pesado o un ligando capaz de funcionar como un miembro del par de union especlfica para un ligando marcado (p. ej., biotina, avidina o un anticuerpo), una molecula fluorescente, una molecula quimioluminiscente, una enzima o similar.
Las sondas se pueden marcar a una actividad especlfica elevada mediante el metodo de desplazamiento de mella de Rugby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113:237-251 o mediante el metodo de cebado aleatorio de Fienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13. Este ultimo es el metodo de eleccion para sintetizar sondas marcadas con 32P de actividad especlfica alta a partir de moldes de ADN monocatenario o de ARN. Por ejemplo, sustituyendo los nucleotidos preexistentes con nucleotidos altamente radioactivos de acuerdo con el metodo de desplazamiento de mella, es posible preparar sondas de acido nucleico marcadas con 32P con una actividad especlfica muy superior a 108 cpm/microgramo. La deteccion autorradiografica de la hibridacion se puede realizar despues exponiendo los filtros hibridados a una pellcula fotografica. La densitometrla de las pellculas fotograficas expuestas mediante los filtros hibridados proporciona una medicion precisa de los niveles del transcrito del gen miR. Usando otro enfoque, los niveles del transcrito del gen miR se pueden cuantificar mediante sistemas de imagen computarizada, tal como Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager disponible en Amersham Biosciences, Piscataway, NJ.
Cuando el marcaje con radionuclidos de las sondas de ADN o de ARN no es practico, se puede usar el metodo de cebado aleatorio para incorporar un analogo, por ejemplo el analogo de dTTP 5-(N-(N-biotinil-epsilon-aminocaproil)- 3-aminoalil)desoxiuridina trifosfato, en la molecula de sonda. El oligonucleotido de sonda biotinilado se puede detectar mediante reaccion con protelnas de union a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (p. ej., anticuerpos anti-biotina) acopladas a pigmentos fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.
Ademas de las tecnicas Northern y otras de hibridacion de ARN, determinar los niveles de los transcritos de ARN se puede conseguir usando la tecnica de la hibridacion in situ. Esta tecnica requiere menos celulas que la tecnica de transferencia Northern e implica depositar celulas enteras sobre un cubre de microscopio y sondar el contenido de acido nucleico de la celula con una solucion que contiene sondas de acido nucleico radioactivo o marcado de otro modo (p. e., ADNc o ARN). Esta tecnica es particularmente adecuada para analizar muestras de biopsia de tejidos procedentes de sujetos. La practica de la tecnica de hibridacion in situ se describe con mas detalle en la patente de EE.UU. N° 5.427.916.
En un ejemplo no limitante, se pueden producir sondas adecuadas para hibridacion in situ de un producto genico de miR dado a partir de las secuencias de acido nucleico e incluyen, entre otras, sondas que tienen una complementariedad de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o completa con un producto genico de miR de interes, como se ha descrito con anterioridad.
El numero relativo de transcritos del gen miR en las celulas tambien se puede determinar mediante transcripcion inversa de los transcritos del gen miR, seguido de amplificacion de los transcritos sometidos a transcripcion inversa mediante reaccion en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de los transcritos del gen miR se pueden cuantificar en comparacion con un patron interno, por ejemplo el nivel de ARNm de un gen “domestico” presente en la misma muestra. Un gen “domestico” adecuado para usar como patron interno incluye, por ejemplo, miosina o gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Los metodos para realizar una RT-PCR cuantitativa y
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semicuantitativa, y variaciones de los mismos son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
En algunos casos, puede ser deseable determinar de forma simultanea el nivel de expresion de una pluralidad de diferentes productos genicos de miR en una muestra. En otros casos, puede ser deseable determinar el nivel de expresion de los transcritos de todos los genes miR conocidos con un cancer. Evaluar los niveles de expresion especlficos de cancer para cientos de genes miR o productos genicos de miR consume tiempo y requiere una gran cantidad de ARN total (al menos 20 mg para cada transferencia Northern) y tecnicas autorradiograficas que requieren isotopos radioactivos.
Para superar estas limitaciones se puede construir una oligobiblioteca en formato de microchip (es decir, una micromatriz) que contenga un conjunto de sondas oligonucleotldicas (p. ej., oligodesoxinucleotidos) que sean especlficas de un grupo de genes miR. Usando dicha micromatriz, el nivel de expresion de multiples microARN en una muestra biologica se puede determinar mediante transcripcion inversa de los ARN para generar un grupo de oligodesoxinucleotidos diana e hibridarlos con sondas oligonucleotldicas sobre la micromatriz para generar un perfil de hibridacion, o de expresion. Despues, el perfil de hibridacion de la muestra de ensayo se puede comparar con el de una muestra control, para determinar que microARN tienen un nivel de expresion alterado celulas de cancer solido.
Como se usa en el presente documento, “sonda oligonucleotldica” o “sonda oligodesoxinucleotldica” se refiere a un oligonucleotido que es capaz de hibridar con un oligonucleotido diana. “Oligonucleotido diana” u “oligodesoxinucleotido diana” se refiere a una molecula que se va a detectar (p. ej., mediante hibridacion). Con “sonda oligonucleotldica especlfica de miR” o “sonda oligonucleotldica especlfica de un miR” se quiere decir una sonda oligonucleotldica que tiene una secuencia seleccionada para hibridar con un producto genico de miR especlfico o a un transcrito inverso del producto genico de miR especlfico.
Un “perfil de expresion” o “perfil de hibridacion” de una muestra concreta es, esencialmente, una huella del estado de la muestra; mientras que dos estados pueden tener un gen concreto expresado de forma similar, la evaluacion de una serie de genes de forma simultanea permite la generacion de un perfil de expresion genica unico para el estado de la celula. Es decir, el tejido normal se puede distinguir de tejido canceroso (p. ej., un tumor) y de entre varios tejidos cancerosos se pueden determinar diferentes estados pronosticos (por ejemplo, perspectivas de supervivencia buena o mala a largo plazo). Comparando los perfiles de expresion del tejido de cancer de colon en diferentes
estados se obtiene la informacion sobre los genes son importantes (incluida la regulacion por aumento o por
disminucion de los genes) en cada uno de estos estados. La identificacion de las secuencias expresadas de forma diferente en tejido de cancer de colon, as! como la expresion diferencial resultante en diferentes resultados pronosticos, permite el uso de esta informacion de numerosas formas.
En un ejemplo no limitante, se puede evaluar un regimen de tratamiento concreto (p. ej., para determinar su un farmaco quimioterapeutico actua mejorando el pronostico a largo plazo en un paciente concreto. De un modo similar, el diagnostico se puede establecer o confirmar comparando muestras de pacientes con los perfiles de expresion conocidos. Ademas, estos perfiles de expresion (o genes individuales) permiten el cribado de farmacos candidato
que suprimen el perfil de expresion del cancer de colon o convierten un perfil de mal pronostico en un perfil de
pronostico mejor.
De acuerdo con esto, en el presente documento tambien se proporcionan metodos de diagnostico de si un sujeto presenta un cancer de colon, o este en riesgo de desarrollarlo, que comprende la transcripcion inversa del ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana, hibridacion de los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende sondas oligonucleotldicas especlficas del miARN, para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra de ensayo y comparacion del perfil de hibridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a partir de una muestra control o patron de referencia, en los que una alteration de la serial del al menos un miARN es indicativa de que el sujeto tiene un cancer solido o esta en riesgo de desarrollarlo.
En una realization, la micromatriz comprende sondas oligonucleotldicas especlficas de miARN para una portion considerable de todos los miARN humanos conocidos. En una realizacion concreta, la micromatriz comprende sondas oligonucleotldicas especlficas de miARN para uno o mas miARN seleccionados del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
La micromatriz se puede preparar a partir de sondas oligonucleotldicas especlficas generadas a partir de secuencias de miARN conocidas. La matriz puede contener dos sondas oligonucleotldicas diferentes para cada miARN, conteniendo una la secuencia activa madura y siendo la otra especlfica del precursor del miARN. Asimismo, la matriz puede contener controles, tales como una o mas secuencias de raton que difieren de ortologos humanos en solo unas pocas bases, que puede servir como controles para hibridacion en condiciones rigurosas. Los ARNt u otros ARN (p. ej., ARNr, ARNm) de ambas especies tambien se pueden imprimir sobre el microcircuito, lo que proporciona un control positivo interno relativamente estable para hibridacion especlfica. En el microcircuito tambien se pueden incluir uno o mas controles adecuados para hibridacion inespeclfica. Para este fin, las secuencias se seleccionan basandose en la ausencia de cualquier homologla con cualquier miARN conocido.
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La micromatriz se puede fabricar usando tecnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, sondas oligonucleotidicas de una longitud adecuada, por ejemplo 40 nucleotidos, son las modificadas con 5'-amina en la posicion C6 y se imprimen usando sistemas de micromatriz disponibles comercialmente, por ejemplo los portaobjetos activados de GenMachine OmniGrid™ 100 Microarrayer y Amersham CodeLink™. El oligomero de ADNc marcado correspondiente a los ARN diana se prepara mediante transcripcion inversa del ARN diana con un cebador marcado. Tras la slntesis de la primera hebra, los hlbridos de ARN/ADN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados preparados de este modo hibridan despues con el chip de la micromatriz en condiciones de hibridacion, por ejemplo 6X SSPE/30 % de formamida a 25 °C durante 18 horas, seguido de lavado en 0,75X de TNT (Tris HCl/NaCl/Tween 20) a 37 °C durante 40 minutos. En las posiciones de la matriz en las que la sonda de ADN inmovilizada reconoce un ADNc diana complementario en la muestra se produce hibridacion. El ADNc diana marcado marca la posicion exacta sobre la matriz en la que se produce la union, lo que permite la deteccion y cuantificacion automaticas. El resultado consiste en una lista de acontecimientos de hibridacion que indican la abundancia relativa de secuencias de ADNc especlfico y, por tanto, la abundancia relativa de los miR complementarios correspondientes, en la muestra del paciente.
De acuerdo con una realizacion, el oligomero de ADNc marcado es un ADNc marcado con biotina preparado a partir de un cebador marcado con biotina. Despues, la micromatriz se procesa mediante deteccion directa de los transcritos que contienen biotina usando, por ejemplo, el conjugado estreptavidina-Alexa647 y se escanea usando metodos de barrido convencionales. Las intensidades en la imagen de cada mancha sobre la matriz son proporcionales a la abundancia del correspondiente miR en la muestra del paciente.
El uso de la matriz tiene varias ventajas para la deteccion de la expresion de miARN. En primer lugar, la expresion global de varios cientos de genes se puede identificar en la misma muestra en un punto de tiempo. En segundo lugar, mediante un diseno cuidadoso de las sondas oligonucleotidicas, se puede identificar la expresion de moleculas tanto maduras como precursoras. En tercer lugar, en comparacion con el analisis de transferencia Northern, el chip requiere una cantidad pequena de ARN y proporciona resultados reproducibles usando 2,5 pg de ARN total. El numero relativamente limitado de miARN (unos pocos cientos por especie) permite la construccion de una micromatriz comun para varias especies, con distintas sondas oligonucleotidicas para cada uno. Dicha herramienta permite el analisis de la expresion de especies trans para cada miR conocido en varias condiciones.
Ademas del uso para ensayos del nivel de expresion cuantitativos de miR especificos, se puede usar un microchip que contiene sondas oligonucleotidicas especificas de miARN correspondiente a una porcion considerable del miRNoma, preferentemente todo el miRNoma, para llevar a cabo el perfil de expresion del gen miR, para analizar el patron de expresion de miR. Distintas formas de miR se pueden asociar a marcadores de enfermedad establecidos, o directamente con un estado de enfermedad.
De acuerdo con los metodos de perfil de expresion descritos en el presente documento, el ARN total de una muestra de un sujeto que se sospecha que tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon) se somete a transcripcion inversa cuantitativa para proporcionar un grupo de oligodesoxinucleotidos diana marcados complementarios al ARN en la muestra. Despues, los oligodesoxinucleotidos diana se hibridan con una micromatriz que comprenden sondas oligonucleotidicas especificas de miARN para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra. El resultado es un perfil de hibridacion para la muestra que representa el patron de expresion de miARN en la muestra. El perfil de hibridacion comprende la senal de una union de los oligodesoxinucleotidos diana de la muestra a las sondas oligonucleotidicas especificas de miARN en la micromatriz. El perfil se puede registrar como la presencia o ausencia de union (senal frente a senal cero).
Mas preferentemente, el perfil registrado incluye la intensidad de la senal de cada hibridacion. El perfil se compara con el perfil de hibridacion generado de la muestra control normal, es decir no cancerosa. Una alteration en la senal es indicativa de la presencia de cancer, o de la propension a desarrollarlo, en el sujeto.
Otras tecnicas para medir la expresion del gen miR tambien entran dentro de la experiencia en la tecnica e incluyen varias tecnicas para medir los indices de transcripcion y degradation del ARN.
En el presente documento tambien se proporcionan metodos de determination del pronostico de un sujeto con cancer de colon, que comprenden medir el nivel de al menos un producto genico de miR, que esta asociado a un pronostico concreto en una enfermedad relacionada con el cancer de colon (p. ej., un pronostico bueno o positivo, un pronostico malo o adverso) en una muestra de ensayo del sujeto.
De acuerdo con estos metodos, una alteracion en el nivel de un producto genico de miR que esta asociado a un pronostico concreto en la muestra de ensayo, en comparacion con el nivel de un correspondiente producto genico de miR en una muestra control, es indicativa de que el sujeto tienen un cancer solido con un pronostico concreto. En una realizacion, el producto genico de miR se asocia a un pronostico adverso (es decir, malo). Ejemplos de un pronostico adverso incluyen, entre otros, una tasa de supervivencia baja y una rapida progresion de la enfermedad. En determinadas realizaciones, el nivel del al menos un producto genico de miR se mide mediante transcripcion inversa del ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana, hibridacion de los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende
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sondas oligonucleotidicas especlficas del miARN, para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra de ensayo y comparacion del perfil de hibridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a parti r de una muestra control.
Sin desear quedar ligado a teorla alguna, se cree que las alteraciones en el nivel de uno o mas productos genicos de miR en las celulas puede tener como resultado la alteracion de la regulacion de una o mas dianas previstas para estos miR, que puede conducir a la formacion de canceres solidos. Por tanto, alterar el nivel del producto genico de miR (p. ej., disminuyendo el nivel de un gen miR que esta regulado por aumento, en las celulas de cancer solido incrementando el nivel de un producto genico de miR que esta regulado por disminucion en las celulas de cancer solido) pueden tratar con exito el cancer solido.
De acuerdo con esto, en el presente documento tambien se proporcionan metodos de inhibir la tumorigenesis en un sujeto que tiene un cancer solido, o que se sospecha que o tiene, en los que la regulacion de al menos un producto genico de miR esta alterada (p. ej., regulada por disminucion, regulada por aumento) en las celulas cancerosas del sujeto. Cuando el al menos un producto genico de miR aislado esta regulado por disminucion en las celulas cancerosas (p. ej., miR-21), el metodo comprende administrar una cantidad eficaz de al menos un producto genico de miR aislado, o una variante o un fragmento biologicamente activo aislados del mismo, de modo que la proliferacion de las celulas cancerosas en el sujeto esta inhibida.
Por ejemplo, cuando un producto genico de miR esta regulado por disminucion en una celula cancerosa en un sujeto, la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de un producto genico de miR aislado puede inhibir la proliferacion de la celula cancerosa. El producto genico de miR aislado que se administra al sujeto puede ser identico al producto genico de miR silvestre endogeno (p. ej., un producto genico de miR) que esta regulado por disminucion en la celula cancerosa o puede ser una variante o fragmento biologicamente activo del mismo.
Como se define en el presente documento, una “variante” de un producto genico de miR hace referencia a un miARN que tiene una identidad inferior al 100% con un correspondiente producto genico de miR silvestre y posee una o mas actividades biologicas del correspondiente producto genico de miR silvestre. Ejemplos de dichas actividades biologicas incluyen, entre otras, la inhibicion de la expresion de una molecula de ARN diana (p. ej., inhibition de la traduction de una molecula de ARN diana, modulation de la estabilidad de un molecula de ARN diana, inhibicion del procesamiento una molecula de ARN diana) e inhibicion de un proceso celular asociado a un cancer solido (p. ej., diferenciacion celular, crecimiento celular, muerte celular). Estas variantes incluyen variantes de especies y variantes que son la consecuencia de una o mas mutaciones (p. ej., una sustitucion, una deletion, una insertion) en un gen de miR. En determinadas realizaciones, la variante tiene una identidad de aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 94 %, 95 %, 98 % o 99 % con un correspondiente producto genico de miR silvestre.
Como se define en el presente documento, un “fragmento biologicamente activo” de un producto genico de miR hace referencia a un fragmento de ARN del gen miR que posee una o mas actividades biologicas de un correspondiente producto genico de miR silvestre. Como se ha descrito en lo que antecede, ejemplos de dichas actividades biologicas incluyen, entre otras, la inhibicion de la expresion de una molecula de ARN diana y la inhibicion de un proceso celular asociado a un cancer de colon. En determinadas realizaciones, el fragmento biologicamente activo” tiene una longitud de al menos aproximadamente 5, 7, 10, 12, 15 o 17 nucleotidos. En una realization concreta, se puede administrar a un sujeto un producto genico de miR aislado en combination con uno o mas tratamientos antitumorales adicionales. Tratamientos antitumorales adecuados incluyen, entre otros, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de los mismos (p. ej., quimiorradiacion).
Cuando el al menos un producto genico de miR aislado esta regulado por aumento en las celulas cancerosas, el metodo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresion del al menos un producto genico de miR, denominados en el presente documento compuestos de inhibicion de la expresion del gen de miR, de modo que la proliferacion de las celulas de cancer solido esta inhibida. En una realizacion concreta, el al menos un compuesto de inhibicion de la expresion de miR es especlfico de un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
Se puede administrar a un sujeto un compuesto de inhibicion de la expresion de un gen miR en combinacion con uno o mas tratamientos antitumorales adicionales. Tratamientos antitumorales adecuados incluyen, entre otros, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de los mismos (p. ej., quimiorradiacion).
Los terminos “tratar”, “que trata” y “tratamiento”, como se usan en el presente documento, se refieren a aliviar los slntomas asociados a una enfermedad o afeccion, por ejemplo un cancer solido, incluyendo prevenir o retrasar el inicio de los slntomas de la enfermedad y/o atenuar la gravedad o la frecuenta de los slntomas de la enfermedad o afeccion. Los terminos, “sujeto”, “paciente” e “individuo”, como se define en el presente documento, incluyen, entre otros, primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedores o murinas. En una realizacion preferida, el animal es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" de un producto genico de miR aislado es una
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cantidad suficiente para inhibir la proliferacion de una celula cancerosa en un sujeto que sufre un cancer solido. Un experto en la tecnica puede determinar facilmente una cantidad eficaz de un producto genico de miR que se ha de administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como el tamano y el peso del sujeto, la extension de la penetracion de la enfermedad, la edad, la salud y el sexo del sujeto, la via de administracion y si la administracion es regional o sistemica.
Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto genico de miR aislado se puede basar en el peso aproximado de una masa tumoral que se va a tratar. El peso aproximado de una masa tumoral se puede determinar calculando el volumen aproximado de la masa, en el que un centlmetro cubico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Una cantidad eficaz del producto genico de miR aislad basado en el peso de una masa tumoral puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-500 microgramos/gramo de masa tumoral. En ciertas realizaciones, la masa tumoral puede ser de al menos aproximadamente 10 microgramos/gramo de la masa tumoral, de al menos aproximadamente 60 microgramos/gramo de la masa tumoral o de al menos aproximadamente 100 microgramos/gramo de la masa tumoral.
Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto genico de miR aislado tambien se puede basar en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto que se va a tratar. Preferentemente, dichas cantidades eficaces se administran por via parenteral o enteral, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto genico de miR aislado administrada a un sujeto puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 3.000 microgramos/kg de peso corporal, de aproximadamente 700-1.000 microgramos/kg de peso corporal o mayor que aproximadamente 1.000 microgramos/kg de peso corporal.
Un experto en la tecnica puede determinar facilmente un regimen de dosificacion adecuado para la administracion de un producto genico de miR aislado a un sujeto dado. Por ejemplo, un producto genico de miR se puede administrar al sujeto una vez (p. ej., en forma de una unica inyeccion o deposito). Como alternativa, un producto genico de miR se puede administrar a un sujeto una o dos veces al dla durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho dlas, mas particularmente de aproximadamente siete a aproximadamente diez dlas. En un regimen de dosificacion concreto, un producto genico de miR se administra una vez al dla durante siete dlas. Cuando un regimen de dosificacion comprende multiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz del producto genico de miR administrada al sujeto puede comprender la cantidad total de producto genico de administrado durante todo el regimen de dosificacion.
Como se usa en el presente documento, un producto genico de miR “aislado” es uno que se sintetiza o altera o elimina del estado natural mediante intervencion humana. Por ejemplo, un producto genico de miR sintetico, o un producto genico de miR parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural, se considera “aislado”. Un producto genico de miR aislado puede existir en forma purificada sustancialmente o puede existir en una celula en la que se ha liberado el producto genico de miR. Por tanto, producto genico de miR que se libera deliberadamente en una celula, o se expresa en ella, se considera un producto genico de miR aislado. Un producto genico de miR producido dentro de una celula a partir de una molecula precursora de miR tambien se considera una molecula “aislada”. De acuerdo con una realizacion concreta, los productos genicos de miR aislados descritos en el presente documento se pueden usar para la fabricacion de un medicamento para tratar un cancer solido en un sujeto (p. ej., un ser humano).
Los productos genicos de miR aislados se pueden obtener usando una serie de tecnicas estandar. Por ejemplo, los productos genicos de miR se pueden sintetizar qulmicamente o producir de forma recombinante usando metodos conocidos en la tecnica. En una realizacion, los productos genicos de miR se sintetizan qulmicamente usando fosforoamiditas ribonucleosldicas protegidas y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los suministradores comerciales de moleculas de ARN sinteticas o reactivos de slntesis incluyen, por ejemplo, Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, EE.UU.), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, IL, EE.UU.), Gien Research (Sterling, VA, EE.UU..), ChemGenes (Ashland, MA, EE.UU.) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido).
Como alternativa, los productos genicos de miR se pueden expresar de plasmidos recombinantes de ADN circular o lineal usando cualquier promotor adecuado. Promotores adecuados para expresar el ARN de un plasmido incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras de ARN pol III de U6 o de H1 o los promotores del citomegalovirus. La seleccion de otros promotores adecuados esta dentro de la experiencia en la tecnica. Los plasmidos recombinantes de la invencion tambien pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresion de los productos genicos de miR en celulas cancerosas.
Los productos genicos de miR que se expresan a partir de plasmidos recombinantes se pueden aislar de sistemas de expresion de celulas cultivadas mediante tecnicas estandar. Los productos genicos de miR que se expresan a partir de plasmidos recombinantes tambien se pueden liberar en las celulas cancerosas y expresarse directamente en ellas. El uso de plasmidos recombinantes para liberar los productos genicos de miR en las celulas cancerosas se trata con mayor detalle mas adelante.
Los productos genicos de miR se pueden expresar a partir de un plasmido recombinante distinto o se pueden
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expresar a partir del mismo plasmido recombinante. En una realizacion, los productos genicos de miR se expresan como moleculas precursoras de ARN de un unico plasmido y las moleculas precursoras se procesan en el producto genico de miR funcional mediante un sistema de procesamiento adecuado, incluyendo, entre otros, sistemas de procesamiento EXTANT con una celula cancerosa. Otros sistemas de procesamiento incluyen, por ejemplo, el sistema de lisado celular in vitro de Drosophila (p. ej., como se describe en la solicitud de patente publicada de EE.UU. n° 2002/0086356 concedida a Tuschl et al., la totalidad de cuya divulgacion se incorpora en el presente documento por referencia) y el sistema de ARNasa III de E. coli (p. ej., como se describe en la solicitud de patente publicada de EE.UU. n° 2004/0014113 concedida a Yang et al.).
La seleccion de plasmidos adecuados para expresar los productos genicos de miR, metodos para insertar secuencias de acido nucleico en el plasmido para expresar los productos genicos y metodos para liberar el plasmido recombinante en las celulas de interes estan dentro de la experiencia en la tecnica. Vease, por ejemplo, Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505; y Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508.
En una realizacion, un plasmido que expresa los productos genicos de miR comprende una secuencia que codifica un ARN precursor de miR bajo el control del promotor intermedio-temprano de CMV. Como se usa en el presente documento, “bajo el control” de un promotor significa que las secuencias de acido nucleico que codifican el producto genico de miR se localizan en 3' del promotor, de modo que el promotor puede iniciar la transcripcion de las secuencias codificadoras del producto genico de miR.
Los productos genicos de miR tambien se pueden expresar en vectores virales recombinantes. Se contempla que los productos genicos de miR puedan expresarse en dos vectores virales recombinantes distintos o en el mismo vector viral. El ARN expresado en vectores virales recombinantes puede aislarse de sistemas de expresion en celulas cultivadas mediante tecnicas estandar o se pueden expresar directamente en celulas cancerosas. El uso de plasmidos recombinantes para liberar los productos genicos de miR en las celulas cancerosas se trata con mayor detalle mas adelante.
Los vectores virales recombinantes de la invencion comprenden secuencias que codifican los productos genicos de miR y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias de ARN. Promotores adecuados incluyen, entre otros, las secuencias promotoras de ARN pol III de U6 o de H1 o los promotores del citomegalovirus. La seleccion de otros promotores adecuados esta dentro de la experiencia en la tecnica. Los vectores virales recombinantes de la invencion tambien pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresion de los productos genicos de miR en una celula cancerosa.
Se puede usar cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias de codificacion para los productos genicos de miR; por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociados (AAV); retrovirus (p. ej., lentivirus (LV), rabdovirus, virus de la leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores virales se puede modificar mediante seudotipado de los vectores con protelnas de la cubierta u otros antlgenos de superficie de otros virus o sustituyendo diferentes protelnas de la capside viral, segun sea adecuado.
Por ejemplo, los vectores lentivirus de la invencion se pueden seudotipar con protelnas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), de la rabia, Ebola, Mokola y similares. Los vectores AAV de la invencion pueden fabricarse para dirigirlos a celulas diferentes sometiendo a ingenierla a los vectores para que expresen diferentes serotipos de la protelna de la capside. Por ejemplo, un vector AAV que expresa una capside del serotipo 2 en un genoma del serotipo 2 se denomina AAV 2/2. Este gen de la capside de serotipo 2 en el vector AAV 2/2 se puede reemplazar con un gen de la capside de serotipo 5 para producir un vector AAV 2/5. Las tecnicas para construir vectores AAV que expresan diferentes serotipos de la protelna de la capside estan dentro de la experiencia en la tecnica; vease, por ejemplo, Rabinowitz, J.E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801.
La seleccion de vectores virales recombinantes adecuados para usar en la invencion, metodos para insertar secuencias de acido nucleico para expresar ARN en el vector, metodos para liberar el vector viral a las celulas de interes y recuperacion de los productos de ARN expresados estan dentro de la experiencia en la tecnica. Vease, por ejemplo, Dornburg (1995), Gene Therapy 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therapy 1:5-14; y Anderson (1998), Nature 392:25-30.
Vectores virales particularmente adecuados son los derivados de AV y AAV. Un vector AV adecuado para expresar los productos genicos de miR, un metodo para construir el vector Av recombinante y un metodo para liberar el vector en celulas diana, se describen en Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010.
Vectores AAV adecuados para expresar los productos genicos de miR, metodos para construir el vector AAV recombinante y metodos para liberar los vectores en las celulas diana, se describen en Samulski et al. (1987), J. Virol, 61:3096-3101; Fisher et al., (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826; la patente de EE.UU. n° 5.252.479; la patente de EE.UU. n° 5.139.941; la solicitud de patente internacional n° WO 94/13788; y la solicitud de patente internacional n° WO 93/24641.
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En una realizacion, los productos genicos de miR se expresan a partir de un unico vector AAV recombinante que comprende el promotor intermedio-temprano del CMV.
En una realizacion concreta, un vector viral AAV recombinante de la invencion comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un ARN precursor de miR en conexion operable con una secuencia de terminacion de poli T bajo el control de un promotor de ARN U6 de humano. Como se usa en el presente documento, “en conexion operable con una secuencia de terminacion poli T” significa que las secuencias de acido nucleico que codifica las hebras sentido o antisentido estan inmediatamente adyacentes a la senal de terminacion polo T en direccion 5'. Durante la transcripcion de las secuencias miR del vector, las senales de terminacion poli T actuan finalizando la transcripcion.
En otras realizaciones de los metodos de tratamiento de la invencion, tambien se puede administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto que inhibe la expresion de miR. Como se usa en el presente documento, “inhibir la expresion de miR” significa que la produccion del precursor y/o la forma activa, madura del producto genico de miR tras el tratamiento es inferior a la cantidad producida antes del tratamiento. Un experto en la tecnica puede determinar facilmente si la expresion de miR se ha inhibido en una celula cancerosa usando, por ejemplo, las tecnicas para determinar el nivel de transcritos de miR tratadas anteriormente para el metodo diagnostico. La inhibicion se puede producir a nivel de la expresion genica (es decir, inhibiendo la transcripcion de un gen miR que codifica el producto genico miR) o a nivel del procesamiento (p. ej., inhibiendo el procesamiento de un precursor de miR en un miR maduro activo).
Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" de un compuesto que inhibe la expresion de miR es una cantidad suficiente para inhibir la proliferacion de una celula cancerosa en un sujeto que sufre un cancer (p. ej., un cancer de colon). Un experto en la tecnica puede determinar facilmente una cantidad eficaz de un compuesto de inhibicion de la expresion de miR que se ha de administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como el tamano y el peso del sujeto, la extension de la penetracion de la enfermedad, la edad, la salud y el sexo del sujeto, la via de administration y si la administration es regional o sistemica.
Por ejemplo, una cantidad eficaz de un compuesto de inhibicion de la expresion se puede basar en el peso aproximado de una masa tumoral que se va a tratar, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un compuesto que inhibe la expresion de miR tambien se puede basar en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto que se va a tratar, como se describe en el presente documento.
Un experto en la tecnica tambien puede determinar facilmente un regimen de dosificacion adecuado para la administracion de un compuesto que inhibe la expresion de miR aislado a un sujeto dado.
Compuestos adecuados para inhibir la expresion del gen miR incluyen ARN bicatenario (tal como un ARN de interferencia corto o pequeno o “ARNip”, acidos nucleicos antisentido y moleculas de ARN enzimaticas, tales como ribozimas. Cada uno de estos compuestos puede estar dirigido a un producto genico de miR dado e interferir en la expresion (p. ej., inhibir la traduction, inducir la escision o la destruction) del producto genico de miR diana.
Por ejemplo, la expresion de un gen miR dado se puede inhibir induciendo ARN de interferencia del gen miR con una molecula de ARN bicatenario aislado ("ARNbc") que tiene al menos un 90 %, por ejemplo al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de homologla se secuencia con al menos una portion del producto genico de miR. En una realizacion concreta, la molecula de ARNbc es un “ARN de interferencia corto o pequeno” o “ARNip”.
El ARNip util en los presentes metodos comprenden ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleotidos a aproximadamente 29 nucleotidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud. El ARNip comprende una hebra de ARN de hebra sentido y una hebra de ARN antisentido complementaria hibridada junto con interacciones de apareamiento de bases de Watson y Crick convencionales (en lo sucesivo en el presente documento “con apareamiento de bases"). La hebra sentido comprende una secuencia de acido nucleico que es sustancialmente identica a una secuencia de acido nucleico contenida dentro del producto genico de miR diana.
Como se usa en el presente documento, una secuencia de acido nucleico en un ARNip que es “sustancialmente identica” a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana es una secuencia de acido nucleico que es identica a la secuencia diana o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleotidos. Las hebras sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moleculas de ARN monocatenarios complementarios o pueden comprender una unica molecula en la que las dos porciones complementarias estan apareadas sus bases y estan unidas covalentemente mediante un area "en horquilla" monocatenaria.
El ARNip tambien puede ser ARN alterado que difiere del ARN natural en la adicion, deletion, sustitucion y/o alteration de uno o mas nucleotidos. Dichas alteraciones puede incluir la adicion de material no nucleotldico, tal como en el(los) extremo(s) del ARNip o a uno o mas nucleotidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen el ARNip resistente a la digestion con nucleasa, o la sustitucion de uno o mas nucleotidos en el ARNip con desoxirribonucleotidos.
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Una o ambas hebras del ARNip pueden tambien comprender un saliente en 3'. Como se usa en el presente documento, un “saliente en 3'” se refiere a al menos un nucleotido desapareado que se extiende desde el extremo 3' de una hebra de ARN duplex. Por tanto, en ciertas realizaciones, el ARNip comprende al menos un saliente en 3' de 1 a aproximadamente 6 nucleotidos (que incluye ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos) de longitud, de 1 a aproximadamente 5 nucleotidos de longitud, de 1 a aproximadamente 4 nucleotidos de longitud o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleotidos de longitud. En una realizacion concreta, el saliente en 3' esta presente en ambas hebras del ARNip y tiene 2 nucleotidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra del ARNip puede comprender salientes en 3' de acido ditimidllico (“TT”) o de acido diuridllico (“uu”).
El ARNip se puede producir qulmica o biologicamente, o se puede expresar en un plasmido recombinante o vector viral, como se ha descrito antes para los productos genicos de miR aislados. Ejemplos de metodos para producir y analizar las moleculas de ARNbc o ARNip se describen en la solicitud de patente publicada de EE.UU. n° 2002/0173478 a Gewirtz y la solicitud de patente publicada de EE.UU. n° 2004/0018176 a Reich et al.
La expresion de un gen miR dado tambien se puede inhibir mediante un acido nucleico antisentido. Como se usa en el presente documento, un “acido nucleico antisentido” se refiere a una molecula de acido nucleico que se une al ARN diana por medio de interacciones de acido nucleico ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-peptido, que altera la actividad del ARN diana. Los acidos nucleicos antisentido adecuados para usar en los presentes metodos son acidos nucleicos monocatenarios (p. ej., ARN, ADN, quimeras ARN-ADN, acido nucleico peptldico (PNA)) que generalmente comprenden una secuencia de acido nucleico complementaria a una secuencia de acido nucleico contigua en un producto genico de miR. El acido nucleico antisentido puede comprender una secuencia de acido nucleico que es un 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria con una secuencia de acido nucleico contigua en un producto genico de miR.
Sin desear quedar ligado a teorla alguna, se cree que los acidos nucleicos antisentido activan la ARNasa H u otra nucleasa celular que digiere el duplex producto genico de miR/acido nucleico antisentido.
Los acidos nucleicos antisentido tambien pueden contener modificaciones en la estructura del acido nucleico o en los restos de azucar y base (o su equivalente) para potenciar la especificidad por la diana, la resistencia a la nucleasa, la liberacion u otras propiedades relacionadas con la eficacia de la molecula. Dichas modificaciones incluyen restos de colesterol, intercalates de duplex, tales como acridina, o uno o mas grupos de resistencia a nucleasa.
Los acidos nucleicos antisentido se pueden producir qulmica o biologicamente, o se puede expresar en un plasmido recombinante o vector viral, como se ha descrito antes para los productos genicos de miR aislados. Ejemplos de metodos para producir y analizar estan dentro de la experiencia en la tecnica, vease, por ejemplo, Stein y Cheng (1993), Science 261:1004 y la patente de EE.UU. n° 5.849.902 a Woolf et al.
La expresion de un gen miR dado tambien se puede inhibir mediante un acido nucleico enzimatico. Como se usa en el presente documento, un “acido nucleico enzimatico” se refiere a un acido nucleico que comprende una region de union al sustrato que tiene complementariedad con una secuencia de acido nucleico contiguo de un producto genico de miR y que es capaz de escindir especlficamente el producto genico de miR. La region de union al sustrato del acido nucleico enzimatico puede ser, por ejemplo, 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria de una secuencia de acido nucleico contigua en un producto genico de miR. Los acidos nucleicos enzimaticos tambien pueden comprender modificaciones en los grupos de bases, azucar y/o fosfatos. Un ejemplo de acido nucleico enzimatico para usar en los presentes metodos es una ribozima.
Los acidos nucleicos enzimaticos se pueden producir qulmica o biologicamente, o se puede expresar en un plasmido recombinante o vector viral, como se ha descrito antes para los productos genicos de miR aislados. Ejemplos de metodos para producir y analizar moleculas de ARNbc o si ARN se describen en Werner y Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23:2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31; y la patente de EE.UU. n° 4.987.071 de Cech et al.
La administracion de al menos un producto genico de miR, o al menos un compuesto para inhibir la expresion de miR, inhibira la proliferation de celulas cancerosas en un sujeto que tiene un cancer solido. Como se usa en el presente documento, “inhibir la proliferacion de un celula cancerosa” significa matar la celula o detener o ralentizar de forma permanente o temporal el crecimiento de la celula. La inhibition de la proliferacion de celulas cancerosas se puede deducir si el numero de dichas celulas en el sujeto permanece constante o disminuye tras la administracion de los productos genicos de mIR o de compuestos inhibidores de la expresion del gen miR. Una inhibicion de la proliferacion de celulas cancerosas tambien se puede deducir si el numero absoluto de dichas celulas aumenta, pero la tasa de crecimiento tumoral disminuye.
El numero de celulas cancerosas en el cuerpo de un sujeto se puede determinar mediante medicion directa o mediante la estimation a partir del tamano de las masas tumorales primarias o metastasicas. Por ejemplo, el numero de celulas cancerosas en un sujeto se puede medir mediante metodos inmunohistologicos, citometrla de flujo u otras tecnicas disenadas para detectar marcadores de superficie caracterlsticos de las celulas cancerosas.
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El tamano de una masa tumoral se puede determinar mediante observacion visual directa o mediante pruebas de imagen diagnosticas, tales como rayos X, resonancia magnetica, ecografla y gammagrafla. Las pruebas de imagen diagnosticas usadas para determinar el tamano de la masa tumoral se pueden usar con o sin medios de contraste, como se conoce en la tecnica. El tamano de una masa tumoral tambien se puede determinar por medios flsicos, tales como palpacion de la masa tumoral o medicion de la masa tisular con un instrumento de medida, como, por ejemplo, un compas.
Los productos genicos de miR o los compuestos inhibidores de la expresion del gen miR se pueden administrar a un sujeto por cualquier medio adecuado para liberar estos compuestos en las celulas cancerosas del sujeto. Por ejemplo, los productos genicos de miR o los compuestos inhibidores de la expresion de miR se pueden administrar mediante metodos adecuados para transfectar celulas del sujeto con estos compuestos o con acidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican estos compuestos.
En una realizacion, las celulas se transfectaron con un plastico o vector viral que comprende secuencias que codifican al menos un producto genico de miR o un compuesto inhibidor de la expresion del gen miR.
Los metodos de transfeccion para celulas eucariotas son bien conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, inyeccion directa del acido nucleico en el nucleo o pronucleo de una celula; electroporacion; transferencia por liposomas o transferencia mediada por materiales lipofilos; liberacion de acido nucleico mediado por receptores, aceleracion bioballstica o de partlculas; precipitacion en fosfato calcico y transfeccion mediada por vectores virales.
Por ejemplo, las celulas se pueden transfectar con un compuesto de transferencia liposomica, por ejemplo DOTAP metilsulfato de (N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio, Boehringer - Mannheim) o un equivalente, tal como LIPOFECTINA. La cantidad de acido nucleico usado no es crucial para la practica de la invencion; se pueden conseguir resultados aceptables con 0,1-100 microgramos de acido nucleico/105 celulas. Por ejemplo, se puede usar una proporcion de aproximadamente 0,5 microgramos del vector plasmldico en 3 microgramos de DOTAP por 105 celulas.
Un producto genico de miR o un compuesto inhibidor de la expresion del gen miR tambien se puede administrar a un sujeto mediante cualquier via de administracion enteral o parenteral adecuada. Las vlas de administracion enteral adecuadas para los presentes metodos incluyen, por ejemplo, liberacion oral, rectal o intranasal. Vlas de administracion parenteral adecuadas incluyen, por ejemplo, administracion intravascular (p. ej., inyeccion en bolo intravenoso, infusion intravenosa, inyeccion en bolo intraarterial, infusion intraarterial e instilacion con cateter en la vasculatura); inyeccion pero e intratisular (p. ej., inyeccion peritumoral e inyeccion intratumoral, inyeccion intrarretiniana o inyeccion subrretiniana); inyeccion o deposito subcutaneo, incluida infusion subcutanea (tal como mediante bombas osmoticas); aplicacion directa en el tejido de interes, por ejemplo mediante un cateter u otro dispositivo de colocacion (p. ej., una pastilla o un supositorio o un implante retiniano, que comprende un material poroso, no poroso o gelatinoso); e inhalacion. Vlas de administracion particularmente adecuadas son inyeccion, infusion e inyeccion directa en el tumor.
En los presentes metodos, un producto genico de miR o un compuesto inhibidor de la expresion del producto genico de miR se pueden administrar al sujeto bien como ARN desnudo, en combination con un reactivo de liberacion o como un acido nucleico (p. ej., un plasmido recombinante o un vector viral), que comprende secuencias que expresan el producto genico de miR o compuesto inhibidor de la expresion. Reactivos de liberacion adecuados incluyen, por ejemplo, reactivo lipofilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina, celfectina, policationes (p. ej., polilisina) y liposomas.
En el presente documento se tratan, y/o son bien conocidos en la tecnica, plasmidos recombinantes y vectores virales que comprenden secuencias que expresan los productos genicos de miR o compuestos inhibidores de la expresion del gen miR y tecnicas para liberar dichos plasmidos y vectores en celulas cancerosas.
En una realizacion concreta, se usan liposomas para liberar en un sujeto un producto genico de miR o compuesto inhibidor de gen miR (o acidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican). Los liposomas pueden incrementar la semivida en sangre de los productos genicos o acidos nucleicos. Liposomas adecuados para usar en la invencion se pueden formar a partir de llpidos formadores de veslculas estandar, que, en general, incluyen fosfollpidos neutros o con carga negativa y un esterol, tal como colesterol. La selection de llpidos esta guiada en general por la consideration de factores, tales como el tamano deseado del liposoma y la semivida de los liposomas en la circulation sangulnea. Se conocen diversos metodos para preparar liposomas, tal como se describe en, por ejemplo, Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; y las patentes de eE.UU. n° 4.235.871. 4.501.728. 4.837.028 y 5.019.369, la totalidad de cuyas divulgaciones se incorpora en el presente documento por referencia.
Los liposomas para usar en los presentes metodos pueden comprender una molecula ligando que dirige el liposoma a las celulas cancerosas. Se prefieren los ligandos que se unen a receptores prevalentes en las celulas cancerosas, como los anticuerpos monoclonales que se unen a los antlgenos de celulas tumorales.
Los liposomas para usar en los presentes metodos tambien se pueden modificar de modo que se evite su
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eliminacion por el sistema de macrofagos mononucleares (“SMM”) y el sistema reticuloendotelial (“RES”). Dichos liposomas modificados tienen restos de inhibition de la opsonization sobre la superficie o incorporarlos en la estructura del liposoma. En una realization particularmente preferida, un liposoma de la invention puede comprender tanto restos de opsonization-inhibition como un ligando.
Los restos de inhibicion de la opsonizacion para usar en la preparation de los liposomas de la invencion son, habitualmente, pollmeros hidrofilos grandes que estan unidos a la membrana del liposoma. Como se usa en el presente documento, un resto de inhibicion de la opsonizacion esta “unido” a la membrana de un liposoma cuando esta qulmica o flsicamente unido a la membrana, por ejemplo mediante intercalado de un ancla soluble en llpidos en la propia membrana o mediante union directa a grupos activos de los llpidos de la membrana. Estos pollmeros hidrofilos de inhibicion de la opsonizacion forman una capa de superficie protectora que disminuye significativamente la captation de los liposomas por el SMM y el RES, por ejemplo como se describe en la patente de EE.UU. n° 4.920.016.
Los restos de inhibicion de la opsonizacion adecuados para modificar los liposomas son, preferentemente, pollmeros hidrosolubles con un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 500 a 40.000 dalton y, mas preferentemente, de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 dalton. Dichos pollmeros incluyen derivados de polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG), por ejemplo metoxi PEG o PPG, y estearato de PEG o PPG; pollmeros sinteticos, tales como poliacrilamida o poli-N-vinilpirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas o dendrimericas; acidos poliacrllicos; polialcoholes, por ejemplo alcohol polivinllico y polixilitol a los que los grupos carboxllico o amino esta qulmicamente unidos, as! como gangliosidos, tal como el gangliosido GM1. Los copollmeros de PEG, metoxi PEG o metoxi PPG o derivados de los mismos tambien son adecuados. Ademas, el pollmero de inhibicion de la opsonizacion puede ser un copollmero de bloque de PEG y un acido poliamino, polisacarido, poliamidoamina, polietilenamina o polinucleotido. Los pollmeros de inhibicion de la opsonizacion tambien pueden ser polisacaridos naturales que contienen aminoacidos o acidos carboxllicos, por ejemplo acido galacturonico, acido glucuronico, acido manuronico, acido hialuronico, acido pectico, acido neuramlnico, acido alglnico, carragenina; polisacaridos u oligosacaridos aminados (lineales o ramificados); o polisacaridos u oligosacaridos carboxilados, por ejemplo que han reaccionado con derivados de acidos carbonicos con la union resultante de grupos carboxllicos. Preferentemente, el resto de inhibicion de la opsonizacion es un PEG, PPG o derivados de los mismos. En ocasiones, los liposomas modificados con PEG o derivados de PEG se denominan “liposomas PEGilados”.
El resto de inhibicion de la opsonizacion puede estar unido a la membrana del liposoma mediante una cualquiera de las numerosas tecnicas bien conocidas. Por ejemplo, un ester de N-hidroxisuccinimida de PEG se puede unir a un ancla liposoluble de fosfatidiletanolamina y, despues, se puede unir a una membrana. De forma similar, un pollmero de dextrano se puede derivar con un ancla liposoluble de estearilamina mediante aminacion reductora usando Na(CN)BH3 y una mezcla de disolventes, tal como tetrahidrofurano y agua en una proportion de 30:12 a 60 °C.
Los liposomas modificados con restos de inhibicion de la opsonizacion permanecen en la circulation mucho mas tiempo que los liposomas no modificados. Por este motivo, dichos liposomas se denominan, en ocasiones, liposomas “encubiertos”. Se sabe que los liposomas encubiertos se acumulan en los tejidos alimentados por microvasculatura porosa o "con fugas". Por tanto, el tejido caracterizado por dichos defectos de la microvasculatura, por ejemplo los tumores solidos, acumulan de forma eficiente estos liposomas; vease Gabizon et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53. Ademas, la captacion reducida por el RES disminuye la toxicidad de los liposomas encubiertos impidiendo la acumulacion significativa de los liposomas en el hlgado y el bazo. Por tanto, los liposomas que se modifican con restos de inhibicion de la opsonizacion sin particularmente adecuados para liberar los productos genicos de miR o compuestos inhibidores de la expresion del gen miR (o acidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) en las celulas tumorales.
Los productos genicos de miR o compuestos inhibidores de la expresion de miR se pueden formular como composiciones farmaceuticas, en ocasiones denominadas “medicamentos”, antes de administrarlas a un sujeto de acuerdo con las tecnicas conocidas en la materia. De acuerdo con esto, la invencion abarca composiciones farmaceuticas para tratar un cancer solido. En una realizacion, la composition farmaceutica comprende al menos un producto genico de miR aislado, una variante o fragmento biologicamente activo aislados del mismo y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion concreta, el al menos un producto genico de miR corresponde a un producto genico de miR que tiene un menor nivel de expresion en las celulas de cancer solido respecto a las celulas control adecuadas. En ciertas realizaciones, el producto genico de miR aislado se selecciona del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otras realizaciones, las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden al menos un compuesto inhibidor de la expresion de miR. En una realizacion concreta, el al menos compuesto inhibidor de la expresion del gen miR es especlfico de un gen miR cuya expresion es superior en las celulas de cancer de colon que en las celulas control. En ciertas realizaciones, el compuesto inhibidor de la expresion del gen miR es especlfico de uno o mas productos genicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
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Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se caracterizan como ser al menos esteriles y apirogenos. Como se usa en el presente documento, “composiciones farmaceuticas” incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Los metodos para preparar composiciones farmaceuticas de la invencion estan dentro de la experiencia en la tecnica, como se describe en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1985).
Las presentes composiciones farmaceuticas comprenden al menos un producto genico de miR o compuesto inhibidor de la expresion del gen miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) (p. ej., den 0,1 a 90 % en peso) o una sal fisiologicamente aceptable de los mismos, mezclados con un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden adicionalmente uno o mas agentes anticancerosos (p. ej., agentes quimioterapeuticos). Las formulaciones farmaceuticas de la invencion pueden tambien comprender al menos un producto genico de miR o compuesto inhibidor de la expresion del gen miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que estan encapsuladas por liposomas y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende un gen miR o producto genico de miR que es miR-21.
Vehlculos farmaceuticamente aceptables especialmente adecuados son agua, agua tamponada, solucion salina normal, solucion salina al 0,4 %, glicina al 0,3 %, acido hialuronico y similares.
En una realizacion concreta, las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tambien comprender al menos un producto genico de miR o compuesto inhibidor de la expresion del gen miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que es resistente a la degradacion por nucleasas. Un experto en la tecnica puede sintetizar facilmente acidos nucleicos que son resistentes a nucleasa, incorporando, por ejemplo, uno o mas ribonucleotidos que estan modificados en la posicion 2' en el producto genico de miR. Ribonucleotidos que estan modificados en la posicion 2' incluyen los modificados en la posicion 2' con fluor, amino, alquilo, alcoxi y O-alilo.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tambien comprender excipientes y/o aditivos farmaceuticos convencionales. Excipientes farmaceuticos adecuados incluyen estabilizantes, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, tampones y agentes de ajuste del pH. Aditivos adecuados incluyen, por ejemplo, tampones fisiologicamente biocompatibles (p. ej., trometamina clorhidrato), adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o bisamida-DTPA) o complejos de quelato calcico (tal como, por ejemplo, DTPA calcico, CaNaDTpA- bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o de sodio (p. ej., cloruro calcico, ascorbato calcico, gluconato calcico o lactato calcico). Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden envasarse para usar en forma llquida o pueden estar liofilizadas.
Para las composiciones farmaceuticas solidas de la invencion se pueden usar vehlculos convencionales no toxicos solidos farmaceuticamente aceptables, por ejemplo calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.
Por ejemplo, una composicion farmaceutica solida para administracion oral puede comprender cualquiera de los vehlculos y excipientes indicados anteriormente y 10-95 %, preferentemente 25 %-75 %, del al menos un producto genico de miR o compuesto inhibidor de la expresion del gen miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican). Una composicion farmaceutica para administracion en aerosol (inhalacion) puede comprender de 0,01-20 % en peso, preferentemente 1%-10 % en peso, del al menos un producto genico de miR o compuesto inhibidor de la expresion del gen miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) encapsulados en un liposoma como se ha descrito anteriormente y un propulsor. Tambien se puede incluir un vehlculo segun se desee, por ejemplo lecitina para liberacion intranasal.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden comprender adicionalmente uno o mas agentes antitumorales. En una realizacion concreta, las composiciones comprenden al menos un producto genico de miR o compuesto inhibidor de la expresion del gen miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) y al menos un agente quimioterapeutico. Los agentes quimioterapeuticos que son adecuados para los metodos de la invencion incluyen, entre otros, agentes alquilantes de ADN, agentes antibioticos antitumorales, agentes antimetabolicos, agentes establizantes de la tubulina, agentes desestabilizantes de la tubulina, agentes antagonistas de hormonas, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de la protelna quinasa, inhibidores de la HMG-CoA, inhibidores de CDK, inhibidores de ciclina, inhibidores de caspasa, inhibidores de metaloproteinasas, acidos nucleicos antisentido, ADN de triple helice, aptameros de acidos nucleicos y agentes ecotoxicos, virales y bacterianos modificados a nivel molecular. Ejemplos de agentes adecuados para las composiciones de la presente invencion incluyen, entre otros, citidina arabinosido, metotrexato, vincristina etoposido (VP-16), doxorubicina (adriamicina), cisplatino (CDDP), dexametasona, arglabina, ciclofosfamida, sarcolisina, metilnitrosourea, fluorouracilo, 5-fluorouracilo (5FU), vinblastina, camptotecina, actinomicina D, mitomicina C, peroxido de hidrogeno, oxaliplatino, irinotecan, topotecan, leucovorina, carmustina, estreptozocina, CPT-11, taxol, tamoxifeno, dacarbazina, rituximab, daunorubicina, 1-p-D-arabinofuranosilcitosina, imatinib, fludarabina, docetaxel, FOLFOX4.
En el presente documento tambien se proporcionan metodos de identification de un inhibidor de la tumorigenesis, que comprende proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de
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miR en la celula. En una realizacion, el metodo comprende proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de miR asociado a los menores niveles de expresion en las celulas de cancer. Se proporciona un incremento del nivel del producto genico de miR en la celula despues del agente, con respecto a una celula control adecuada (p. ej., no se proporciona el agente) es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorigenesis. En una realizacion concreta, al menos un producto genico de miR asociado a una disminucion de los niveles de expresion en las celulas de cancer se selecciona del grupo constituido por miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
En otras realizaciones, el metodo comprende proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de miR asociado a los mayores niveles de expresion en las celulas de cancer, Se proporciona un disminucion del nivel del producto genico de miR en la celula despues del agente, con respecto a una celula control adecuada (p. ej., no se proporciona el agente) es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorigenesis. En una realizacion concreta, al menos un producto genico de miR asociado a un aumento de los niveles de expresion en las celulas de cancer se selecciona del grupo constituido por miR20a, miR- 21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.
Agentes adecuados incluyen, entre otros, farmacos (p. ej., moleculas pequenas, peptidos) y macromoleculas biologicas (p. ej., protelnas, acidos nucleicos). El agente se puede producir de forma recombinante, sintetica, o se puede aislar (es decir, purificar) a partir de una fuente natural. Varios metodos para proporcionar dichos agentes a una celula (p. ej., transfeccion) son bien conocidos en la tecnica y diversos de dichos metodos se han descrito anteriormente en el presente documento. Asimismo, en la tecnica se conocen los metodos para detectar la expresion de al menos un producto genico de miR (p. ej., transferencia Northern, hibridacion in situ, RT-PCR, perfil de la expresion). Varios de estos metodos tambien se han descrito en el presente documento en lo que antecede.
A continuacion se ilustrara la invencion mediante los ejemplos no limitantes siguientes.
Ejemplo 1
Los patrones de expresion de microARN estan alterados en los tumores de colon
Se compararon los perfiles de microARN de 84 pares de tejidos tumorales de colon y no tumorales adyacentes usando micromatrices de microARN30. Estos 84 sujetos eran pacientes reclutados del area mayor de Baltimore, Maryland, con una incidencia del adenocarcinoma de colon y se denomina cohorte de ensayo de Maryland (Tabla 1).
Tabla 1. Caracteristicas de la poblacion y tumores
Cohorte de ensayo de Maryland Cohorte de validation de Hong Kong
N= 84 N= 113
Area de reclutamiento
Baltimore, Maryland, EE.UU. Hong Kong, China
Edad en el momento de la inclusion, anos Media ± DT
64,6 ± 10,7 55,8 ± 15
Intervalo
32-87 32-84
Sexo, n° (%) Masculino
66 (79) 56 (50)
Femenino
18 (21) 57 (50)
Raza, N° (%) Blanca
52 (62) 0 (0)
Negra
32 (38) 0 (0)
Asiaticos
0 (0) 113 (100)
Localization del tumor, n° (%) Distal
48 (59) 90 (30)
Proximal
34 (41) 2 (20)
Histologla del adenocarcinoma, n° (%) Adenocarcinoma
75 (89) 105 (93)
Adenocarcinoma mucinoso
8 (10) 7 (6)
Carcinoma adenoescamoso
1 (1) 0 (0)
Celula en anillo de sello y mucinosa
0 (0) 1 (1)
Quimioterapia adyuvante2- n° (%) Recibida
22 (37) 4 (35)
No recibida
37 (63) 73 (65)
Estadio TNM (%) II
29 (34) 37 (33)
III
36 (43) 48 (42)
IV
10 (12) 19 (17)
1 Distal incluye tumores localizados dentro o distales del colon descendente. Los tumores proximales incluyen tumores dentro de o proximales al angulo esplenico. Se conocla la localizacion del tumor de 82 sujetos en la cohorte original y de todos los sujetos de la cohorte de validacion. 2Se conocla Informacion detallada perteneciente a la recepcion de la quimioterapia par 59 sujetos en la cohorte de ensayo y para todos los sujetos en la cohorte de validacion. La quimioterapia estaba basada, principalmente, en fluorouracilo (en forma de 5-fluorouracilo intravenoso o farmacos orales, incluyendo tegafur con uracilo [UFT1) con o sin Levamisol o Leucovorina
5
Los perfiles de microARN de los tumores eran claramente diferentes de los perfiles no tumorales. Se encontro que treinta y siete microARN independientes se expresaban de forma diferente en los tumores ((p < 0,001 con una falsa tasa de descubrimiento < 0,5 %; Tabla 2.
Tabla 2 - MicroARN que se expresan de forma ^ diferencial en los tumores
Sonda
miR maduro Valor p1 TDF2 N° de cambios Localizacion en el cromosoma
hsa-mir-21Nol
miR-21 < 1 E-07 < 1 E-07 1,7 17q23,2
hsa-mir-021-prec-17Nol
miR-21 < 1 E-07 < 1 E-07 1,8 17q23,2
hsa-mir-092-prec-13=092-1No2
miR-92 < 1 E-07 < 1 E-07 1,4 13g31,3
hsa-mir-222-precNo2
miR-222 1,40 E-06 9,05 E-05 1,2 Xp11,3
hsa-mir-181b-2No1
miR-181b 1,90 E-06 8,74 E-05 1,2 9q33,3
hsa-mir-210-prec
miR-210 1,12 E-05 0,00032 1,2 11 p15,5
hsa-mir-020-prec
miR-20a 2,53 E-05 0,00057 1,5 13q31,3
hsa-mir-106-prec-X
miR-106a 3,30 E-05 0,00058 1,4 X26,2
hsa-mir-106aNol
miR-106a 3,51 E-05 0,00058 1,4 X26,2
hsa-mir-093-prec-7,1 =093-1
miR-93 3,52 E-05 0,00058 1,2 7q22,1
nsa-mir-335No2
miR-335 3,55 E-05 0,00058 1,2 7q32,2.
hsa-mir-222-precNol
miR-222 4,27 E-05 0,00065 1,2 Xpll,3
hsa-mir-338Nol
miR-338 5,78 E-05 0,00074 1,1 17q25,3
hsa-mir-133bNo2
miR-133b 6,50 E-05 0,00079 1,1 6p12,2
hsa-mir-092-prec-X=092-2
miR-92 7,95 E-05 0,00083 1,4 Xq26,2
hsa-mir-346Nol
miR-346 8,42 E-05 0,00084 1,2 10q23,2
hsa-mir-106bNol
miR-106b 0,0002091 0,00178 1,2 7q22,1
hsa-mir-135-2-prec
miR-153a 0,0002363 0,00194 1,1 12q23,1
hsa-mir-219-lNo2
miR-219 0,0002515 0,00199 1,3 9q34,11
hsa-mir-34aNol
miR-34a 0,000265 0,00203 1,1 lp36,22
hsa-mir-099b-prec-19NO1
1miR-99b 0,0003758 0,00259 1,1 19q13,41
hsa-mir-185-preeNO2
miR-185 0,0003827 0,00259 1,2 22q11,21
hsa-mir-223-prec
miR-223 0,0004038 0,00265 1,4 Xq12
hsa-mir-211-preoNo2
miR-211 0,0004338 0,00277 1,1 15q13,3
hsa-mir-135-1-prec
miR-135a 0,0004648 0,00287 1,1 3p21,1
hsa-mir-127-prec
miR-127 0,0004748 0,00287 1,1 14q32,31
hsa-mir-203-precNol
miR-203 0,0004993 0,00294 1,4 14q3233
hsa-mir-212-precNol
miR-212 0,0006339 0,00364 1,1 17p13,3
hsa-mir-095-prec-4
miR-95 0,0006996 0,00392 1,2 4p16,1
hsa-mir-017-precNo2
miR-17-5p 0,0007252 0,00392 1,3 13q31,3
MicroARN con expresion reducida en tumores
Sonda
miR maduro Valor p1 TDF2 N° de cambios Localizacion en el cromosoma
hsa-mir-342No2
miR-342 4,00 E-06 0,00015 0,9 14q32,2
hsa-mir-192-2/3Nol
miR-192 8,74 E-06 0,00029 0,7 11q13,1
hsa-mir-1-2No2
miR-1 2,22 E-05 0,00057 0,9 18g11,2
hsa-mir-34bNo2
miR-34b 4,78 E-05 0,00069 0,8 11q23,1
hsa-mir-215-precNol
miR-215 5,26 E-05 0,00071 0,7 1q41
hsa-mir-192Nol
miR-192 7,36 E-05 0,00081 0,7 11q13,1
hsa-mir-301 No2
miR-301 7,44 E-05 0,00081 0,7 17q23,2
5
10
15
20
25
30
hsa-miR-324-SpNo2
miR-324-5p 1,00E-04 0,00096 0,9 17 p13,1
hsa-mir-030a-precNo2
miR-30a-3p 0,0001933 0,00171 0,9 6q13
hsa-mir-1-1 No2
miR-1 0,0002906 0,00216 0,9 20q13,33
hsa-mir-34cNo2
miR-34c 0,0007334 0,00392 0,9 11q23,1
hsa-mir-331 No2
miR-331 0,0008555 0,00446 0,9 12q22
hsa-mir-148bNo2
miR-148b 0,0008726 0,00446 0,9 12q 13,13
1Los valores P indicados son el resultado de un analisis de comparacion de clase pareado de los patrones de expresion de microARN de 84 pares de adenocarcinomas de colon y tejido no tumoral.
2TDF = Tasa de descubrimientos falsos
Veintiseis microARN se expresaron a niveles mas altos en tumores con miR-21 enriquecidos como maximo a 1,8 veces, los perfiles de microARN global distinguen entre tejido tumoral y no tumoral pareado con una precision del 89% usando los 3 vecinos mas cercanos o algoritmos de prediction de clase centroide mas cercanos (validation cruzada por 10 repetida 100 veces), lo que sugiere un cambio sistematico en los patrones de expresion de microARN durante la formation del tumor.
Los inventores eligieron miR-20a, miR-21, miR-106a, miR-181b and miR-203 para la validacion a base de sus diferencias de expresion entre tejidos tumoral y no tumoral pareado combinado con su asociacion a una supervivencia mala. Para la validacion, los inventores midieron los niveles de expresion de estos microARN con RT- PCRc en tejido tumoral y no tumoral pareado de una cohorte independiente. La cohorte de validacion consiste en 113 pacientes reclutados de Hong Kong, China con cancer de colon incidente (Tabla 1).
MiR-20a (2,3 veces), miR-21 (2,8 veces), miR106a (2,4 veces), miR-18 Ib (1,4 veces) y miR-203 (1,8 veces) se expresaron todos ellos a niveles mas altos en los tumores (p < 0,001, prueba de Wilcoxon de pares igualados) (Tabla 3a).
Tabla 3 - Expresion de microARN en tumores frente a tejido no tumoral pareado
Tabla 3a-Cohorte de validacion de Hong Kong
N° de cambios
microARN
AACt1 DT (AACt) tumores2 Valor p3
miR-20a
1,18 0,97 2,3 veces p < 0,001
miR-21
1,47 1,20 2,8 veces p < 0,001
miR-106a
1,25 0,94 2,4 veces p < 0,001
miR-181 b
0,47 1,03 1,4 veces p < 0,001
miR-203
0,83 1,40 1,8 veces p < 0,001
Tabla 3 b- Expresion de microARN en adenoma frente a tejido no adenoma pareado
Promedio N° de cambios
microR
AA Ct1 DT(AACt) adenomas2 Valor p3
miR-20a
-0,11 0,97 0,9 veces p = 0,82
miR-21
0,64 0,90 1,6 veces p = 0,006
miR-106a
0,28 1,22 1,2 veces p = 0,19
miR-181b
0,30 1,24 1,2 veces p = 0,27
miR-203
0,77 1,98 1,7 veces p = 0,14
1Promedio (ACt del tumor - ACt no tumoral pareado) o promedio (ACt de adenoma - ACt de no adenoma pareado) de RT-PCRc. 2Calculado mediante 2AA
3Prueba de
Wilcoxon de pares igualados. DT = Desviacion estandar. Los numeros en negrita son
estadlsticamente significativos. Para las comparaciones tumor/no tumor se usaron 113 pares para miR-20a and
miR-203, mientras que se usaron 111 pares de tejido para miR-21, miR-106a y miR-181b Para todas las comparaciones de adenoma/no adenoma se usaron 18 pares de tejido.
La mayorla de los tumores (89 % para miR-20a, 87 % para miR-21, 90 % para miR-106a, 71 % para miR-181b y 74 % para miR-203) tenia una expresion mas alta de estos microARN que el tejido no tumoral pareado. Los patrones de expresion para estos cinco microARN distinguen el estado de tumor frente a no tumor pareado con una precision del 96 % o 98 % basandose en 3 vecinos mas cercanos o algoritmos centroides mas proximos, respectivamente (validacion cruzada por 10, repetida 100 veces).
Los inventores usaron hibridacion in situ para visualizar la expresion de miR-21 en tejido tumoral y no tumoral adyacente (vease las Figuras 1a-f).
MiR-21 se expresa a niveles altos en los nucleos y el citoplasma de celulas epiteliales colonicas en tejido tumoral humano en comparacion con el tejido no tumoral adyacente. Estos resultados son compatibles como la RT-PCRc y los datos de micromatriz y avalan la existencia de un papel de los microARN en la carcinogenesis.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
miR-21 se expresa a niveles mas altos en adenomas de colon
Los adenomas representan un estadio precursor de los adenocarcinomas de colon3. Los inventores analizaron los niveles de expresion de miR-20a, miR21, miR-106a, miR-181b y miR-203 mediante RT-PCRc en 18 pares de adenoma y tejido no adenoma adyacente. Aunque cuatro de cinco microARN mostraron mayores niveles en el tejido de adenoma, solo miR-21 estaba significativamente enriquecido 1,6 veces mas (p = 0,006, prueba de Wilcoxon de pares igualados) (vease la Tabla 3b).
El tejido de adenoma expreso niveles mas altos de miR-21 en 15/18 pares igualados. Los estadios mas avanzados de tumores expresan niveles mas altos de miR-21. Los sujetos se estratificaron basandose en el diagnostico de adenoma y la estadificacion TNM, en los que el adenoma se considero en mas avanzado y el estadio IV de TNM el mas avanzado. Los adenomas expresaron niveles mas bajos de expresion de miR-21 que los tumores de la cohorte de validation (p < 0,001, prueba de Mann-Whitney). Los tumores mas avanzados expresaron niveles mas altos de expresion de miR-21 (prueba de la tendencia, p < 0,001) (vease la Figura 1g).
Esta tendencia tambien se observo usando datos de micromatrices de microARN de la cohorte del ensayo de Maryland (p = 0,04) (vease la Figura 2).
La expresion alta de miR-21 predice un mal pronostico en dos cohortes independientes
Los inventores analizaron las proporciones individuales de expresion de micro ARN en tumores/no tumores (T/N) para determinar si alguna estaba asociada a un mal pronostico. Las proporciones de expresion de microARN T/N se clasificaron como altas basandose en su tercil mas alto. Los inventores investigaron cualquier microARN en el que proporciones elevadas de T/N estaban asociadas a la supervivencia del cancer (p < 0,05). A partir de estos, se seleccionaron microARN expresados de forma diferencial en los tumores (p < 0,001). Cinco microARN satisficieron estos criterios. El analisis de Kaplan-Meier indico que proporciones elevadas de T/N para miR-20a (p = 0,02), miR- 21 (p = 0,004), miR-106a (p = 0,01), miR-181b (p = 0,04) y miR-203 (p = 0,004) estaban cada una asociadas a una mala supervivencia. Estos cinco microARN se seleccionaron para su analisis posterior.
Los adenocarcinomas del 89-93 % de los sujetos en este estudio tenlan una histologla tlpica. Una minorla de los tumores tenlan histologlas de adenocarcinoma mucinoso, carcinoma adenoescamoso o carcinoma de Celula en anillo de sello (vease la Tabla 1). Diferentes subtipos de adenocarcinomas se pueden asociar a diferentes desenlaces, incluido el pronostico de la supervivencia31. Para eliminar la potencial confusion asociada a la histologla, los inventores excluyeron a todos los sujetos con adenocarcinomas mucinosos, carcinomas adenoescamosos y carcinomas de celulas en anillo de sello del analisis inicial.
Las asociaciones de las proporciones T/N a una supervivencia mala podrlan deberse a niveles de expresion de microARN en el tejido tumoral y el tejido no tumoroso adyacente o una combination de ambos. Para distinguir estas posibilidades, los inventores analizaron la asociacion de la expresion de microARN en tumores y no tumores pareados por separado. Los niveles de expresion alta en tumores (en el tercil mas alto) para miR-20a, miR-21, miR106a, miR-181b y miR-203 estaban asociados a una mala supervivencia en la cohorte de ensayo de Maryland (vease la Figura 3a, tambien de datos no mostrados). No se observo ninguna asociacion significativa a expresion de microARN en tejido no tumoroso para cualquiera de los cinco microARN.
Se uso analisis de riesgos proporcionales de Cox univariables y multivariables para evaluar la asociacion de los niveles de expresion tumoral a pronostico en individuos con adenocarcinoma tlpico (Tabla 4a).
Tabla 4 - Analisis de riesgos proporcionales de Cox univariables y multivariables de los niveles de expresion de mlR- 21 y la supervivencia global del cancer en sujetos con adenocarcinoma de colon1___________________________
Tabla 4a
Cohorte de ensayo de Maryland
Analisis univariable Analisis multivariable2
Caracterlstica
HR (IC del 95 %) Valor p HR (IC del 95 %) Valor p
Expresion de nniR-21 3 N=71
Baja
1,0 1,0
Alta
2,5 (1,2 - 5,2) 0,01 2,9 (1,4-6,1) 0,004
Estadio TNM
l-ll
1,0 1,0
III-IV
3,5 (1,6 - 7,9) 0,002 3,4 (1,5-7,8) 0,004
Edad en el momento de la inclusion <50
1,0
>50
0,7 (0,2 - 2,3) 0,52
Sexo
Femenino
1,0
Masculino
1,4 (0,5 - 3,9) 0,57
5
10
15
20
25
Raza
Blanca
1,0
Negra
1,0 (0,5 - 2,1) 0,97
Localizacion del tumor
Distal
1,0
Proximal
0,6(0,3 - 1,4) 0,26
Tabla 4b
Cohorte de validacion de Hong Kong
Analisis univariable Analisis multivariable2
Caracterlstica
HR (IC del 95 %) Valor p HR (IC del 95 %) Valor p
Expresion de miR-213
n=103
Baja
1,0 1,0
Alta
2,4 (L4 - 3,9) 0,002 2,4 (1,4-4,1) 0,002
Estadio TNM
I-II
1,0 1,0
III-IV
4,7 (2,4 - 9,5) < 0,001 4,7 (2,4-9,5) < 0,001
Edad en el momento de la inclusion
1,0
< 50
>50
1,5 (0,9 - 2,6) 0,14
Sexo
Femenino
1,0
Masculino
1,4 (0,8 - 2,3) 0,29
Localizacion del tumor
Distal
1,0
Proximal
0,7 (0,3 - 1,4) 0,27
La expresion de microARN se midio con micromatrices de miARN para la cohorte de Maryland y con RT-PCRc con la cohorte de Hong Kong. 1 Los casos con adenocarcinoma mucinoso, carcinoma adenoescamoso o carcinomas de celulas en anillo de sello se excluyeron de este analisis. 2El analisis multivariable uso adicion y elimination escalonada de las covariables cllnicas que se habla encontrado que estaban asociadas a la supervivencia en modelos univariables (p < 0,10) y los modelos finales solo incluyen las covariables asociadas significativamente a la supervivencia (estadlstica de Wald p < 0,05). 3La expresion alta en los tumores para todos los miARN se definio basandose en el tercil mas alto.
Los individuos que expresan niveles altos de miR-21 tenlan un riesgo significativamente mayor de morir por cancer de colon en los analisis tanto univariable (HR = 2,5 [1,2 - 5,2], p = 0,01) como multivariable (HR = 2,9 [1,4 - 6,1], p = 0,004).
Para validar estos hallazgos, los inventores usaron una RT-PCRc para medir los niveles de expresion tumoral y no tumoral para estos cinco microARN en la cohorte de validacion de Hong Kong y se analizaron las asociaciones con el pronostico. Una expresion tumoral alta de miR-21 predice un mal pronostico en la cohorte de validacion de Hong Kong (p = 0,001, prueba del orden logarltmico de Kaplan-Meier) mientras que la expresion en tejido no tumoral no lo hace (vease la Figura 3b).
Los inventores no encontraron asociaciones estadlsticamente significativas con el pronostico y la expresion de miR- 20a, miR-106a, 181b o miR-203 en esta cohorte,
La expresion elevada de miR-21 en tumores no se asocio significativamente con la edad, el sexo, la histologla del tumor o la localization del tumor (prueba exacta de Fisher) en la cohorte de validacion de Hong Kong. Todas las covariables se analizaron mediante analisis de riesgos proporcionales de Cox (Tabla 4b).
La expresion alta de miR-21 en tumores (HR = 2,4 [1,4 - 3,9], p = 0,002) y la estadificacion TNM (HR = 4,7 [2,4-9,5], p < 0,001) se asociaron significativamente a la supervivencia en modelos univariables. El analisis multivariable de regresion de Cox demostro que la expresion elevada de miR-21 en tumores predice un mal pronostico de la supervivencia (HR = 2,4 [1,4-4,1], p = 0,002) independiente de otras covariables cllnicas, consistente con los hallazgos de los inventores en la cohorte de ensayo de Maryland.
Los inventores repitieron el analisis incluyendo a todos los sujetos con independencia de la histologla del tumor. En ambas cohortes, la asociacion a una expresion alta de miR-21 y el pronostico permanecio (vease la Figura 5, vease la Tabla 5).
Tabla 5 - Analisis de riesgos proporcionales de Cox univariables y multivariables de los niveles de expresion de mlR-
21 y la supervivencia global del cancer en sujetos con todos los sujetos
Tabla 5a
Cohorte de ensayo de Maryland
Analisis univariable Analisis multivariable
Caracterlstica
HR (IC del 95 %) Valor p HR (IC del 95 %) Valor p
Expresion de miR-21
N = 79
Baja
1,0 1,0
Alta
2,0 (1,1 - 4,0) 0,04 2,1 (1,1-4,0) 0,03
Estadio TNM
l-ll
1,0 1,0
III-IV
3,2 (1,5 - 6,9) 0,002 3,2 (1,5-6,8) 0,003
Edad en el momento de la inclusion
< 50
1,0
> 50
0,7 (0,2 - 2,4) 0,59
Sexo
Femenino
1,0
Masculino
1,6 (0,7 - 4,2) 0,33
Raza
Blanca
1,0
Negra
1,0 (0,5 - 2,0) 0,99
Localizacion del tumor
Distal
1,0
Proximal
0,8(0,3 - 2,1 0,65
Histologla del adenocarcinoma
1,0
Mucinoso o Adenoescamoso
0,7 (0,3 - 2,1) 0,57
Tabla 5b
Cohorte de validacion de Hong Kong
Analisis univariable Analisis multivariable2
Caracterlstica
HR (IC del 95 %) Valor p HR (IC del 95 %) Valor p
Expresion de miR-213 n = 111
Baja
1,0 1,0
Alta
2,3 (1,4 - 3,9) 0,002 2,3 (1,4-3,9) 0,002
Estadio TNM
I-II
1,0 1,0
III-IV
4,9 (2,5 - 97) < 0,001 4,9 (2,5-98) < 0,001
Edad en el momento de la inclusion
< 50
1,0
> 50
1,4 (0,8 - 2,4) 0,20
Sexo
Femenino
1,0
Masculino
1,3 (0,8 - 2,3) 0,27
Localizacion del tumor
Distal
1,0
Proximal
0,7 (0,3 - 1,4) 0,27
Histologla del adenocarcinoma
1,0
Mucinoso o Adenoescamoso
1,2 (0,4 - 3,3) 0,74
La expresion de microARN se midio con micromatrices de miARN para la cohorte de Maryland y con RT- PCRc con las cohortes de Hong Kong. 1Todos los individuos se incluyeron en este analisis con independencia de la histologla del tumor. El analisis multivariable uso adicion y eliminacion escalonada de las covariables cllnicas que se habla encontrado que estaban asociadas a la supervivencia en modelos univariables (p < 0,10) y los modelos finales solo incluyen las covariables asociadas significativamente a la supervivencia (estadlstica de Wald p < 0,05). 3La expresion alta en los tumores para todos los miARN se definio basandose en el tercil mas alto.
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Niveles de expresion de miR-21 y respuesta al tratamiento
La identificacion de biomarcadores asociados a una respuesta a la quimioterapia adyuvante permitira a los medicos predecir mejor los beneficios del tratamiento. Con este fin, los inventores analizaron asociaciones con la expresion de miR-21 y la respuesta a la quimioterapia adyuvante en pacientes de cancer en estadio II y III. Se disponla de Information sobre la administration de quimioterapia adyuvante de 47 o 65 sujetos en estadio II o III en la cohorte de ensayo de Maryland y para todos los sujetos en la cohorte de validation de Hong Kong.
En ambas cohortes, los reglmenes quimioterapeuticos estaban basadas, principalmente, en fluorouracilo (en formas de 5-fluorouracilo intravenoso o farmacos orales, incluyendo tegafur con uracilo [UFT]) con o sin Levamisol o Leucovorina. Solo los sujetos con histologla tlpica de adenocarcinoma se usaron para este analisis, dejando 20 de 42 individuos en estadio II/III que recibieron quimioterapia en la cohorte de Maryland. Para aquellos que recibieron quimioterapia, una expresion alta de miR-21 en tumores predijo una supervivencia global peor (p = 0,01, prueba del orden logarltmico de Kaplan-Meier) dando soporte preliminar de que una expresion alta de miR-21 esta asociada a una peor respuesta a la quimioterapia adyuvante.
Para la cohorte de validacion de Hong Kong, para este analisis se usaron 77 individuos con cancer en estadio II/III con histologla tlpica de adenocarcinoma. Los sujetos en estadio II/III que recibieron quimioterapia adyuvante tenlan un pronostico de supervivencia mejor que los que no la recibieron (p = 0,02, prueba del orden logarltmico de Kaplan- Meier). Entre estos sujetos que recibieron quimioterapia (n=36), una expresion alta de miR-21 en tumores se asocio con una respuesta peor al tratamiento (p = 0,03, prueba del orden logarltmico de Kaplan-Meier) coherente con las observaciones en la cohorte de Maryland (vease la Figura 5a).
En esta cohorte, todos los sujetos en estadio II que recibieron quimioterapia adyuvante (n = 11) sobrevivieron (vease la Figura 5b) para los sujetos en estadio III que recibieron quimioterapia adyuvante (n = 25), una expresion alta de miR-21 se asocio con una supervivencia mala (p = 0,02, prueba del orden logarltmico de Kaplan-Meier) (vease la Figura 5c).
El analisis multivariable de regresion de Cox se uso para analizar estas observaciones para mostrar que una expresion alta de miR-2 predijo un pronostico malo (HR = 3,1 [1,5 - 6,1]; p = 0,001) y haber recibido quimioterapia era predictivo de mejores desenlaces de supervivencia (HR = 0,3 [0,1 - 0,5]; p < 0,001) con independencia de otras covariables cllnicas (Tabla 6a).
Tabla 6 - Analisis de riesgos proporcionales de Cox univariables y multivariables de los niveles de expresion de mIR- 21, haber recibido quimioterapia adyuvante y la supervivencia del cancer en sujetos en estadio I/III1 con
adenocarcinoma
Tabla 6a
Cohorte de ensayo de Maryland
Analisis univariable Analisis multivariable2
Caracterlstica
HR (IC del 95 %) Valor p HR (IC del 95 %) p-
Expresion de miR-213
N=77
Baja
1,0 1,0
Alta
2,6 (1,3 - 5,1) 0,005 3,1 (1:5 - 6,1) 0,001
No recibio quimioterapia adyuvante
1,0 1,0
Recibida
04. (0,2 - 0,8) 0,01 0,3 (0,1 - 0,5) < 0,001
Estadio TNM
II
1,0 1,0
III
2,8(1,3 - 6,0) 0,008 5,4 (2,4 - 12) < 0,001
Localization del tumor
1,0
Distal
1,0
Proximal
0,3(0,1 - 1,0) 0,04 0,2 (0,1 - 0,8) 0,02
Edad en el momento de la inclusion
< 50
1,0
>50
1,6 (0,8 - 3,1) 0,20
Sexo
Femenino
1,0
Masculino
1,2 (0,6 - 2,3) 0,61
Tabla 6b
Cohorte de validacion de Hong Kong
Analisis univariable Analisis multivariable2
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40
Caracterlstica
HR (IC del 95 %) Valor p HR (IC del 95 %) Valor p
Expresion de miR-213
N=119
Baja
1,0 1,0
Alta
2,6 (1,5 - 4,5) 0,001 3,0 (1,7 - 5,4) < 0,001
No recibio quimioterapia adyuvante
1,0 1,0
Recibida
07. (0,4 - 1,2) 0,21 0,4 (0,2 - 0,8) 0,004
Estadio TNM
1,0 1,0
III
3,2 (1,7 - 6,1) 0,001 5,2 (2,6 - 11) < 0,001
Localizacion del tumor
1,0
Distal
1,0
Proximal
0,4(0,2 - 0,8) 0,02 0,3 (0,1 - 0,7) 0,007
Edad en el momento de la inclusion
< 50
1,0
>50
1,4 (0,7 - 2,5) 0,32
Sexo
Femenino
1,0
Masculino
1,3 (0,7 - 2,2) 0,44
La expresion de miARN se midio con RT-PCRc. 1TLos sujetos en estadio TNM II/III con adenocarcinoma de histologla tlpica se incluyeron en este analisis. 2El analisis multivariable uso adicion y eliminacion escalonada de las covariables cllnicas que se habla encontrado que estaban asociadas a la supervivencia en modelos univariables (p < 0,10) y los modelos finales solo incluyen las covariables asociadas significativamente a la supervivencia (estadlstica de Wald p < 0,05). 3La expresion alta en los tumores para todos los miARN se definio basandose en el tercil mas alto. La raza no se asocio con un mal pronostico.
El analisis con la recalda del cancer como criterio de valoracion en lugar de la muerte por cancer tuvo como resultado asociaciones similares con una expresion alta de miR-21 en tumores, lo que predice una recurrencia de la enfermedad mas rapida (datos no mostrados),
Un analisis con ambas cohortes combinadas tuvo como resultado asociaciones similares. El analisis de Kaplan- Meier demostro que la expresion alta de miR-21 predijo un mal pronostico en sujetos en estadio II (p = 0,02) o estadio III (p = 0,004) (vease la Figura 6).
La expresion alta de miR-21 predijo una respuesta mala a la quimioterapia en sujetos en estadio II/III (p = 0,003) o en estadio III solo (p = 0,007). La regresion de Cox multivariable demostro que la expresion alta de miR-21 predijo un mal pronostico (HR = 3,0 [1,7-5,4]; p < 0,001) y el tratamiento con quimioterapia adyuvante predijo una supervivencia mejor (HR = 0,4 [0,2-0,8]; p = 0,004) con independencia de otras covariables cllnicas (Tablea 6b).
ANALISIS
Los inventores analizaron perfiles de microARN en tejidos de cancer de colon usando dos cohortes independientes. Treinta y siete microARN se expresaron de forma diferencial en tejidos tumorales mediante analisis en micromatriz de microARN. Los patrones de expresion de los cinco microARN analizados se validaron en la cohorte de Hong Kong. La potencia discriminatoria de cinco microARN para diferenciar entre tejido tumoral y no tumoral indica que se producen cambios predecibles y sistematicos de los patrones de expresion de microARN durante la tumorigenesis y probablemente sean representativos de la mayorla de los adenocarcinomas de colon esporadicos.
Se descubrio que todos los MiR-20a, miR-21, miR-106a, miR-181b y miR-203 se expresaban a niveles mas altos en tumores de colon. Estos cambios en los patrones de expresion de microARN se pueden asociar simplemente a cancer de colon o ser causales de la progresion histologica a cancer. Existen fuertes indicios que sugieren que los cambios en los patrones de expresion de microARN estimulan la formacion de tumores, especialmente para miR- 20a y miR-21. MiR-20a forma parte del grupo de microARN policistronico miR-17-92 32
La sobreexpresion de este grupo potencia la proliferacion celular in vitro33 y acelera la formacion de tumores en modelos animales16. La expresion reforzada del grupo miR-17-92 produce un aumento del tamano del tumor y vascularizacion tumoral en ratones al regular negativamente la protelna antiangiogenica Tspl 24. Los signos experimentales tambien sugieren que el aumento de la expresion de miR-21 estimula el desarrollo de tumores. MiR- 21 se expresa a niveles altos en la mayorla de los tumores solidos 1934. La sobreexpresion de miR-21 actua como
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factor antiapoptotico en celulas de glioblastoma humano13. La inhibicion de miR-21 inhibe el crecimiento celular in vitro e inhibe el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto en raton mediante una regulacion por disminucion indirecta del factor antiapoptotico Bcl-235. En los estudios en llneas celulares humanas se ha demostrado que miR- 21 tambien se puede dirigir a los genes supresores tumorales PTEN36 y TPMl37 .Todos estos datos en conjunto avalan la existencia de un papel causal de la expresion alterada de microARN durante la tumorigenesis.
Los adenomas representan un estadio precursor del adenocarcinoma. Los adenomas expresan niveles altos de miR- 21. Si la mayor expresion de miR-21 estimula la progresion a tumor de colon, el incremento de la expresion en adenomas puede ser un acontecimiento celular temprano en la progresion a cancer. La inhibicion de la actividad de miR-21 puede ayudar a prevenir la estimulacion tumoral en poblaciones en riesgo alto de cancer de colon, tales como individuos con poliposis adenomatosa familiar38.
Por tanto, en el presente documento se presentan signos que demuestran una asociacion con patrones de expresion de microARN con pronostico de cancer de colon y respuesta a quimioterapia adyuvante. Los tumores mas avanzados expresan niveles mas altos de miR-21. En la cohorte del ensayo de MARYLAND y la cohorte de validacion de Hong Kong, por separado, se observo una solida asociacion con la expresion alta de miR-21 en tumores y una supervivencia mala.
En cada cohorte, estas asociaciones eran independientes de todas las demas covariables cllnicas, lo que indica que la expresion de miR-21 puede ser un indicador pronostico util, ademas de la estadificacion TNM y otros parametros cllnicos, para ayudar a identificar pacientes en riesgo mas alto de cancer terminal. Estas observaciones se realizaron en dos cohortes independientes con composiciones geograficas y raciales muy diferentes. Por tanto, es probable que nuestras observaciones sean ampliamente aplicables a otras poblaciones.
La expresion alta de miR-21 en tumores estaba asociada a una mala respuesta a la quimioterapia adyuvante en ambas cohortes. Estos resultados pueden ayudar a predecir los beneficios del tratamiento en individuos cuyo estado de expresion de miR-21 se conoce. Ademas, si la expresion alta de miR-21 tiene una relacion causal con la supervivencia mala de los pacientes de cancer de colon, los antagomires 2939 u otras terapeuticas antisentido dirigidas a miR-21 pueden tener beneficios terapeuticos en los sujetos con tumores de expresion alta de miR-21. Estos se pueden usar ademas de los tratamientos actuales para mejorar los desenlaces de supervivencia.
Los inventores en el presente documento han hallado diferencias sistematicas en loso patrones de expresion de microARN entre tumores de colon y tejido no tumoral pareado. La expresion alta de miR-21 en tumores predice un desenlace de supervivencia malo y mala respuesta a la quimioterapia adyuvante en dos cohortes independientes, con independencia de la estadificacion y otras covariables cllnicas, lo que sugiere que puede ser un biomarcador diagnostico util para los adenocarcinomas de colon y el pronostico de supervivencia, incluida la respuesta al tratamiento.
METODOS
Recoleccion de muestras y aislamiento de ARN
Pres de tumor de colon primario y tejido no tumoral adyacente se obtuvieron de 84 pacientes reclutados del Centro Medico de la Universidad de Maryland entre 1993 y 2002, y de 113 pacientes reclutados del Queen Mary Hospital de Hong Kong entre 1991 y 2000. Se han obtenido informaciones detalladas de cada donante de tejido, incluyendo edad, sexo, estadificacion cllnica, localizacion del tumor, tiempos de supervivencia desde el diagnostico y recepcion de quimioterapia adyuvante. La histopatologla del tumor se clasifico acorde a la clasificacion de sistemas tumorales de la Organizacion Mundial de la Salud1. El tejido de adenoma se obtuvo de la Red Cooperativo de Tejidos Humanos. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revision Institucional de los Institutos Nacionales de Salud, la Junta de Revision Institucional de la Universidad de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster y la Junta de Revision Institucional para Investigacion con sujetos humanos en la Universidad de Maryland.
Aislamiento de ARN y generacion de perfiles de microARN:
El ARN se extrajo del tejido usando metodos estandar TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad). El perfil de la micromatriz del microARN se realizo como se ha descrito anteriormente30. En resumen, 5 lag del ARN total se marco e hibrido con cada micromatriz de microARN que contenla cuadruplicados de aproximadamente 400 sondas para microARN humanas. Los portaobjetos se analizaron usando un analizador PerkinElmar ScanArray LX5K, se realizo RT-PCRc de los microARN usando ensayos Taqman MicroARN (Applied Biosystems, Foster City) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el sistema de RT-PCR 7500 en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City). U6B fue el control de la normalizacion para todos los experimentos de RT-PCRc. Todos los ensayos se realizaron por duplicado (miR-20a, miR-203) o por triplicado (miR-21, miR-106a, miR-181b). La RT-PCRc. Para miR-21, miR-106a and miR-181b se realizo con AJS, enmascarado para los desenlaces de supervivencia y los datos cllnicos para los miembros de la cohorte de validacion en ese momento.
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Analisis en micromatriz:
Los datos tratados en esta publicacion se han depositado en el Gene Expression Omnibus de os NCBI (GEO,
http://www.ncbi.nlm.nih.aov/laeo/) y son accesibles a traves de la serie GEO con numero de acceso GSE7828. Los datos de mciromatrices normalizados por LOESS se importaron a las herramientas de matriz de BRB 3,5,0 (
http://linus.nci.nih.aov/.BRB-ArrayTools.html) y todos los posteriores analisis de micromatriz se realizaron con este software.
Se realizaron analisis en micromatriz. Las sondas con perdida de valores > 20 % de las matrices se eliminaron del analisis, dejando 230 sondas. Los analisis de comparacion de clase pareados identificaron microARN expresados de forma diferencial en los tumores (p < 0,001).
Para buscar inicialmente microARN asociados a una supervivencia mala, las proporciones de expresion de microARN en tumor/no tumor (T/N) se analizaron en la cohorte de Maryland usando datos de micromatriz. Las proporciones de expresion de TN para microARN se crearon restando el log2 de los valores de expresion en tejido no tumoral del log2 de los valores de expresion en tumores. Los microARN con perdidas >25 % de proporciones de T/N se eliminaron dejando 208. Las proporciones de expresion en T/N se dicotomizaron con el tercil mas alto clasificado como alta y los 2 terciles mas bajos clasificados como baja (vease Metodos complementarios). El valor de corte alto/bajo se uso universalmente a lo largo de este estudio. Los niveles de expresion de microARN en tumor y en tejido no tumoral se normalizaron por lotes basandose en la fecha de los experimentos en micromatrices para todos los analisis de asociaciones con la supervivencia.
Hibridacion in situ:_
La hibridacion In situ (HIS) se realizo con sondas para miR-21 humano, mixto y U6 (Exiqon, Woburn)con una version modificada del protocolo del fabricante para tejido incluido en parafina fijado con formalina (FFPE) redactado por Kloosterman (
http://www.exiaon.com/uploads/.LNA 52- FFPE miRNA in situi.rotocol.pdf) en tejido de colon humano. Entre las modificaciones incluyeron el uso de anticuerpo policlonal de conejo anti-DIG/conjugado con HTP y el sistema DakoCytomation GenPoint Tyramide Signal Amplication System (DakoCytomation, Carpinteria) y el sustrato VECTOR® NovaRed™ (Vector Laboratories, Burlingame). Las imagenes se tomaron en un microscopio Olympus BX40 usando la camara digital Olympus DP70 y el software de control (Olympus, Champaign).
Analisis estadfstico:
Se realizaron analisis estadlsticos. Se usaron pruebas de pares igualados de Wilcoxon para analizar diferencias en la expresion de microARN entre tumores y tejido no tumoral pareado, as! como diferencias entre adenoma y tejido no adenomatoso pareado para todos los datos de RT-PCRc. Todas las pruebas de tendencia indicadas son pruebas no parametricas para la tendencia a traves de grupos ordenados. Todos los analisis de Kaplan-Meier se realizaron con WINSTAT 2001 (R. Fitch Software). EL analisis de regresion de Cox multivariable se realizo usando Intercooled Stata 9,2 (StataCorp LP, College Station). Los modelos multivariables finales se basaron en la adicion escalonada y se ha hallado que la eliminacion de las covariables cllnicas estaba asociada a una mala supervivencia en modelos univariables (p < 0,10). Se uso una estadlstica de Wald de p < 0,05 como criterios para la inclusion en los modelos multivariables finales. Todos los valores p indicados fueron bilaterales. Los cocientes de riesgos instantaneos se indican con los intervalos de confianza del 95% entre parentesis. Los graficos de expresion se realizaron usando Graphpad Prism 4,0 (Graphpad Software Inc., San Diego).
Analisis adicionales con micromatrices
Las micromatrices usadas para este analisis eran micromatrices de microARN pin-spotted (del Ohio State University Comprehensive Cancer Center, version 2,0). Las intensidades de cada punto eran la mediana de las intensidades de primer plano. Cada una de las 170 micromatrices usadas para este estudio contenla 11.520 puntos. Todos los puntos en los que la intensidad de primer plano era inferior a la de fondo se reasignaron como NA (NA marca los puntos con falta de datos). Todos los puntos marcados como deficientes por el analizador tambien se volvieron a asignar como NA. Todos los puntos en blanco (sin oligo) con una intensidad de primer plano alta volvieron a asignar como NA. Cada oligo para microARN se representa mediante puntos cuadruplicados en estas matrices como dos pares distantes de dos puntos adyacentes. Si habla 0 o 1 NA para un oligo cuadruple y la media de los pares oligo distantes diferlan en > 1 sobre la escala de log2, todos los puntos por cuadruplicado se reasignaron como NA. Si habla 2 o 1 NA para un oligo cuadruple y las dos intensidades de punto no NA diferlan en > 1 sobre la escala de log2, todos los puntos por cuadruplicado se reasignaron como NA. Si habla 3 puntos NA para un cuadruple, el punto final se reasigno como NA. En total, 1.082.689 de 1.958.400 puntos se reasignaron como NA usando estos metodos. La normalizacion LOESS (Locally Weighted Scatterplot Smoothing) se realizo usando el paquete de software R. Todos los datos se importaron despues en la version de las herramientas de matrices BRB 3,5,0 para analisis y se realizo la media de todos los puntos duplicados. Inicialmente habla 85 pares (tumor y tejido no tumoral pareado) de matrices usadas. Un caso identificado inicialmente como un paciente de carcinoma de colon incidente se encontro mas tarde que se habla diagnosticado como carcinoma in situ y se elimino del analisis, dejando la poblacion de estudio con 84 sujetos. Las listas de microARN se filtraron para incluir unicamente a los 389 conjuntos de sondas
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hsa-miR humanas. Se filtraron adicionalmente para eliminar todos los conjuntos de sondas que careclan de mas del 25% de las matrices, dejando 230 conjuntos de sondas de microARN humanas. Se uso analisis de comparacion de clase pareados para identificar microARN expresados de forma diferencial entre los tumores y los tejidos no tumorales pareados. Para dos microARN (miR-181b ymiR-338), dos sondas independientes de medicion dio cada una resultados contradictorios, mostrando una sonda una expresion mas alta en tumores y una sonda una expresion mas baja en tumores por cada microARN. Para cada una se desecho el resultado menos significativo, que designo tanto a miR-18 lb como a miR-388 como enriquecidos en tumores. Adicionalmente, la RT-PCRc confirmo que miR- 181b estaba enriquecido en los tumores.
Inicialmente, los inventores usaron perfiles de expresion en tumores/no tumores (T/N) para cada microARN para buscar microARN asociados a una supervivencia mala. Para este analisis, los inventores decidieron dicotomizar todos los datos de expresion con un valor de corte alto y bajo universal para buscar asociaciones con una supervivencia mala. Para determinar que valor de corte alto / bajo universal usar, los inventores dicotomizaron los datos de expresion en T/N de tres formas distintas y determinaron que metodo daba el mayor numero de resultados significativos en la cohorte de ensayo. La expresion alto se clasifico basandose en un valor mas alto que la mediana, el tercil mas alto o el cuartil mas alto y los inventores analizaron las asociaciones con estos valores de corte con una supervivencia mala usando analisis de regresion de Cox univariable. De los 37 microARN que se expresaron de forma diferencial en los tumores, la expresion alta de cuatro se asociaron a una supervivencia mala basandose en un valor mas alto que la mediana, cinco basandose en el tercil mas alto y dos basandose en el cuartel mas alto (p < 0,05, datos no mostrados). La dicotomizacion basada en el tercil mas alto dio que la mayorla de los microARN estaban asociados a una supervivencia mala basandose en estos criterios en la cohorte de ensayo de Maryland; por tanto, la clasificacion basada en el tercil mas alto se uso de forma uniforme a lo largo de este estudio para analizar las asociaciones entre los niveles de expresion de microARN y un mal pronostico en la cohorte de ensayo de Maryland y la cohorte de validacion de Hong Kong.
Los inventores usaron micromatrices de microARN para comparar los niveles de expresion de miR-21 en tumores con un pronostico. La sonda de micromatriz usada para este analisis fue hsa-miR-21-precl7Nol. Este analisis requirio la normalization por lotes de los datos basada en la fecha del experimento de micromatriz. Para normalizar por fecha, las matrices que expresan el 1/3 mas alto de un microARN dado se clasificaron como altas para cada dla, por separado. Se realizo el perfil de hasta doce pares de tejido un dla dado. Para cualquier dla en el que se realizaron menos de 10 pares de micromatrices, las matrices realizadas dichos dlas se desecharon, lo que tuvo como resultado la perdida de 5 pares de matrices. Despues, estos datos se combinaron juntos para el analisis de las asociaciones con desenlaces de supervivencia. Los inventores comprobaron y no hallaron diferencias significativas en la distribucion por frecuencia de la edad, el sexo, la raza, la localization del tumor, el estadio TNM o la supervivencia del cancer entre grupos clasificada basandose en la fecha del experimento de la micromatriz (prueba exacta de Fisher).
Analisis estadfsticos
Se uso regresion de riesgos proporcionales de Cox para analizar el efecto de los niveles de expresion de mir-21 y otra variable cllnica sobre la supervivencia del paciente. Las variables cllnicas incluidas fueron la edad, el sexo, la raza, la localizacion del tumor, la histologla del tumor, la reception de terapia adyuvante y la estadificacion TNM. Para estos modelos, los inventores eligieron dicotomizar la edad como edad > 50 anos frente a edad < 50 dado que la edad de selection recomendada para el cancer de colon es la de 50; la localizacion del tumor se definio como proximal si el tumor estaba localizado dentro o cerca del angulo esplenico y distal si el tumor estaba localizado dentro o lejos del colon descendente; la estadificacion TNM se dicotomizo a base de enfermedad metastasica frente a no metastasica, lo que tiene como resultado estadio I-II frente a III-IV. Un paciente en la cohorte de Maryland murio el dla de la cirugla, lo que dio como resultado un tiempo de supervivencia de 0 meses. Este caso se incluyo en el analisis de Kaplan-Meier y se elimino del analisis de regresion de Cox, dando la diferencia en los casos entre la expresion de miR-21 en los tumores para la Figure 2 (n = 72) y el numero de casos en el analisis de regresion de Cox de la Tabla 4 (n = 71). La regresion de Cox univariable se realizo con cada covariable cllnica para analizar la influencia de cada una sobre la supervivencia del paciente. Los modelos multivariables finales se basaron en la adicion escalonada y se ha hallado que la elimination de las covariables cllnicas estaba asociada a una mala supervivencia en modelos univariables (p < 0,10). Se uso una estadlstica de Wald de p < 0,05 como criterios para la inclusion en los modelos multivariables finales. Se uso una estadlstica de Wald de p < 0,05 como criterios para la inclusion en los modelos multivariables finales. EL modelo de regresion de Cox mas parsimonioso se uso para el modelo multivariable final.
Ejemplo 2. RESULTADOS INICIALES
Los MiARN se expresan de forma diferencial en los tumores de colon
Los inventores analizaron los perfiles de microARN de 85 pares de tejidos de colon cancerosos y no cancerosos adyacentes usando micromatrices de microARN. Los inventores encontraron que los perfiles de expresion de miARN de los tumores eran bastante diferentes de los de los tejidos normales, lo que sugiere que los miARN pueden desempenar papeles significativos en la carcinogenesis de colon. Los analisis de comparacion de clase pareados
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identificaron 27 miARN independientes expresados de forma diferencial en estos tumores (Tabla 7).
Tabla 7 - 27 miARN se expresaron de forma diferencial en tumores de colon en comparacion con tejido normal pareado. Usando analisis de comparaciones de clase pareados en herramientas de matrices BRN se encontro que 27 miARN se expresaban de forma diferencial en tumores.3,4 Se uso un valor de significacion de p < 0,001 como criterios para la expresion diferencial, que tuvo como resultado una tasa de descubrimientos falsos estimada de 0,08 %. Aumento se refiere a miARN expresados a niveles mas altos en tumores, mientras que disminucion indica que
los niveles de miARN eran menores en los tumores.
Tabla 7
microARN Regulado por aumento/disminucion Valor p
1
miR-331 Disminucion 1,00 E-07
2
miR-21 Aumento 1,00 E,07
3
miR-34b Disminucion 2,00 E-07
4
miR-342 Disminucion 2,00 E-07
5
miR-215 Disminucion 2,20 E-05
6
miR-3 71 Disminucion 7,00 E-07
7
miR-373 Disminucion 6,30 E-06
8
miR-192 Disminucion 7,70 E-06
9
miR-148b Disminucion 1,03 E-05
10
miR-138 Disminucion 1,49 E-05
11
miR-301 Disminucion 1,85 E-05
12
miR-338 Disminucion 2,63 E-05
13
miR-153 Disminucion 2,67 E-05
14
miR-129 Disminucion 3,20 E-05
15
miR-222 Aumento 9,08 E-05
16
miR-346 Aumento 0,000126
17
miR-204 Aumento 0,000244
18
miR-181 b Aumento 0,000263
19
let-7a-2 Disminucion 0,000272
20
miR-106a Aumento 0,000305
21
miR-093 Aumento 0,000334
22
miR-34c Disminucion 0,003441
23
miR-219 Aumento 0,000352
24
miR-019b Aumento 0,000364
25
miR-210 Aumento 0,000389
26
miR-185 Aumento 0,000516
27
miR-1 Disminucion 0,00064
La tasa de falsos descubrimientos, para constituir las pruebas de multiples comparaciones, fue de aproximadamente un 0,8%, lo que indica que la mayorla, si no todos estos miARN, se expresan de forma diferencial y no es el resultado de las pruebas de multiples comparaciones. Se descubrio que once miARn tenlan niveles de expresion elevados en tumores, mientras que se descubrio que16 miARN estaban reducidos en los tumores. Adicionalmente, se podlan usar perfiles de miARN para predecir si el tejido era o no tumoral o no tumoral con una precision del 92%. Basandose en 2.000 permutaciones aleatorias, la probabilidad que estas predicciones se produzcan al azar era extremadamente baja (p < 0,0005). Estos resultados muestran que hay diferencias sistematicas en los perfiles de expresion de miARn entre los tumores y el tejido normal, lo que indica que los perfiles de expresion de miARN se alteran durante la carcinogenesis de colon.
Los perfiles de expresion globales de miARN predicen el pronostico de supervivencia del cancer de colon
Los inventores determinaron si los perfiles de expresion de miARN predicen la supervivencia de los pacientes. Para este analisis, los inventores calcularon las proporciones de expresion de miARN en tumor frente a tejido normal (proporciones T/N) para cada miARN para cada individuo. El agrupamiento jerarquico sin supervision de todas las proporciones T/N de miARN agrupo a los individuos en dos grupos marcados de forma arbitraria en grupo A y grupo B (Figura 7).
Estos dos grupos difieren significativamente tanto en la estadificacion cllnica (p = 0,009; figura 1b) como en el pronostico de la supervivencia (p = 0,026; figura 7c).
Esto indico que los perfiles de miARN globales eran predictivos de la estadificacion cllnica y, de forma mas importante, del pronostico de la supervivencia.
El analisis de regresion de Cox univariable y multivariable se uso para cuestionar esta relacion con mas detalle
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(Tabla 8).
Tabla 8 Analisis de regresion de Cox de los perfiles globales de miARN
Los analisis de regresion de Cox univariables (anteriormente) y multivariables (mas adelante) se realizaron para mostrar que los individuos clasificados en el grupo B de miARN tenian un riesgo mayor de morir por cancer de colon, Ni la edad, ni el sexo ni la raza fueron contribuyentes significativos del riesgo de supervivencia. Para los fines de estos analisis, la edad se dicotomizo en mayor o menor de 50 anos y la raza se dicotomizo en afroamericanos (AA) y caucasicos.
Analisis univariable
Variable
HR (IC del 95 %) Valor p
Grupo B/A
2,6 (1,0 - 6,3) 0,042
edad >50/edad < 50
0,62 (0,14 - -2,7) 0,53
Varon/muier
1,4 (0,48 - 4,0) 0,54
AA/Caucasico
1,1 (0,83 - 2,3) 0,83
Grupo B/A
2,7 (1,1 - 6,8) 0,034
edad >50/edad < 50
0,49 (0,11 - -2,2) 0,35
Varon/muier
1,5 (0,52 - 4,4) 0,45
AA/Caucasico
1,0 (0,45 - 2,2) 0,99
Los individuos del grupo B tenian un riesgo significativamente mayor de morir por cancer de colon (cociente de riesgos instantaneos [HR] = 2,6 (p = 0,04). El riesgo permanecio significativamente alto despues de ajustar por edad, etnicidad y sexo (HR = 2,7; p = 0,03). Estos resultados demuestran el potencial de usar perfiles de miARN de tumores de colon para predecir el pronostico. Estos resultados sugieren que los miARN tambien pueden desempenar un papel en la carcinogenesis del colon.
Los perfiles de miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-16h, miR-203, let-7tg, miR-29a, miR-103-2 y miR-10a predicen el pronostico del cancer de colon.
Los inventores identificaron miARN cuyos niveles de expresion eran predictivos del pronostico del cancer de colon, Los inventores usaron graficos de supervivencia de Kaplan Meier y analisis de regresion de Cox multivariable con las proporciones de T/N para identificar los patrones de expresion de miARN que se asociaban a un pronostico de mala supervivencia. Se usaron las herramientas de matrices BRB para identificar las proporciones de T/N correlacionadas con una supervivencia mala (datos no mostrados), Los inventores escogieron analizar estos miARN con mayor detalle. Los inventores tambien analizaron cualquier miARn expresado de forma diferencial en los tumores (p < 0,01). Las proporciones de T/N para cada individuo se dicotomizaron basandose en la mediana o al cuartil mas alto de las proporciones de T/N Los inventores tambien eliminaron cualquier miARN de estos analisis en el que faltaban proporciones T/N en mas de 18 individuos. Los inventores identificaron al menos 9 miARN, incluyendo miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-16h, miR-203, let-7tg, miR-29a, miR-103-2 y miR-10a cuyas proporciones T/N predicen el pronostico del cancer de colon (Figura 8, Tabla 9).
Analisis de regresion de Cox de las proporciones T/N para miARN individuales
Los analisis de regresion de Cox univariables y multivariables) se realizaron para mostrar que las proporciones T/N de miARN individuales se podian usar para clasificar a los individuos en riesgo mayor de morir por cancer de colon. Las proporciones T/N para estos 9 de miARN eran predictores significativos del pronostico de supervivencia independientes de la estadificacion TNM, la edad, el sexo y la raza. Observese que las distinciones alta/baja para miR-16b, miR-21, miR-29a, miR-103-2, miR- 106a y miR-203 se clasificaron basandose en la mediana de los valores de la proporcion T/N mientras que let-7g, miR-10a and miR-1815 se clasificaron basandose en las proporciones T/N del cuartil mas alto.
Tabla 9: Analisis de regresion de Cox de las proporciones T/N para miARN individuales
Variable
HR (IC del 95 %) p = n
Analisis univariable
Alta/baja de miR-21
3,0 (11,3 - 7,0) 0,01 80
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-21
2,8 (1,2 - 6,8) 0,02
edad >50/edad < 50
0,46 (0,10 - 2,1) 0,32
Varon/mujer
3,1(0,9-11,0) 0,07
AA/Caucasico
1,2 (0,5 - 2,7) 0,66
Estadio III-IV/Estadio I-III
4,4 (1,6 - 11,9) 0,004
Analisis univariable
Alta/baja de miR-181b
3,4(1,6 - 7,5) 0,002 78
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-181b
3,3 (1,3 - 8,2) 0,01
edad >50/edad < 50
0,39 (0,08 - 1,8) 0,23
Varon/mujer
2,2 (0,7 - 7,2) 0,17
AA/Caucasico
1,1 (0,5 - 2,5) 0,82
Estadio III-IV/Estadio I-III
3,1 (1,2 - 8,1) 0,02
Analisis univariable
Alta/baja de let-7g
2,7(1,3 - 5,9) 0,01 84
Analisis multivariable
Alta/baja de let-7q
2,5 (1,1 - 5,5) 0,03
edad >50/edad < 50
0,5 (0,1 - 2,4) 0,39
Varon/mujer
1,5 (0,5 - 4,4) 0,50
AA/Caucasico
1,3 (0,6 - 2,9) 0,50
Estadio III-IV/Estadio I-II
3,6 (1,4 - 9,2) 0,006.
Variable
HR (IC del 95 %) P = n
Analisis univariable
Alta/baja de miR-103-2
2,5 (1,1 - 5,6) 0,03 81
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-103-2
3,1 (1,3 - 7,5) 0,01
edad >50/edad < 50
0,5 (0,1 - 2,2) 0,36
Varon/mujer
1,6 (0,6 - 4,9) 0,38
AA/Caucasico
0,8 (0,4 - 1,9) 0,69
Estadio III-IV/Estadio I-III
4,4 (1,7 - 11,1) 0,002
Variable
HR (IC del 95 %) _P^___ n
Analisis univariable
Alta/baja de miR-16b
4,6(1,7 - 12,5) 0,003 69
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-16b
5,1 (1,8 - 15,9) 0,003
edad >50/edad < 50
0,4 (0,08 - 1,7) 0,20
Varon/mujer
3,2 (0,8 - 1,7) 0,12
AA/Caucasico
0,9 (1,9 - 22,4) 0,003
Estadio III-IV/ Estadio / Estadio I-III
6,5 (1,9 - 22,4 0,003
Variable
HR (IC del 95 %) P = n
Analisis univariable
Alta/baja de miR-106a
2,6 (1,1 - 6,1) 0,01 82
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-106a
2,4 (1,0 - 5,7) 0,05
edad >50/edad < 50
0,54 (0,11 - -2,5) 0,44
Varon/mujer
1,8 (0,5 - 6,5) 0,34
AA/Caucasico
1,1 (0,5 - 2,5) 0,84
Estadio III-IV/Estadio I-III
5,4 (1,8 - 16,0) 0,002
Variable
HR (IC del 95 %) P = n
Analisis univariable
Alta/baja de miR-203
3,8 (1,4 - 10,5) 0,01 57
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-203
3,2 (1,1 - 9,4) 0,03
edad >50/edad < 50
1,0 (0,1 --8,1) 0,97
Varon/mujer
1,4 (0,4 - 5,1) 0,61
AA/Caucasico
0,9 (0,4 - 2,3) 0,83
Estadio III-IV/Estadio I-III
3,9 (1,3 - 11,8) 0,02
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Variable
HR (IC del 95 %) p = n
Analisis univariable
Alta/baia de miR-29a
3,1 (1,3 - 7,3) 0,01 77
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-29a
3,2 (1,3 - 7,9) 0,01
edad >50/edad < 50
0,5 (0,1 - -2,2) 0,35
Varon/muier
2,2 (0,6 - 7,4) 0,22
AA/Caucasico
0,9 (0,4 - 2,1) 0,76
Estadio III-IV/Estadio I-U
4,5 (1,7 - 12,2) 0,003
Variable
HR (IC del 95 %) p = n
Analisis univariable
Alta/baja de miR-10a
2,7 (1,3 - 5,7) 0,01 84
Analisis multivariable
Alta/baja de miR-10a
3,5 ( 1,5 - 7,8) 0,003
edad >50/edad < 50
0,4 (0,1 - -1,9) 0,26
Varon/muier
1,7 (0,6 - 5,0) 0,34
AA/Caucasico
1,0 (0,45 - 2,3) 0,98
Estadio III-IV/Estadio I-III
4,9 (1,9 - 12,2) 0,001
La expresion de miR-21 esta elevada en los tumores (Tabla 7). Las proporciones T/N de miR-21 tambien estan asociadas tambien a la estadificacion clmica y el pronostico de supervivencia para los pacientes de cancer de colon (Tabla 9, Figura 8a).
Habia una tendencia de que los individuos con estadificacion TNM mas avanzada tienen proporciones T/N mas altas (p = 0,034). Las proporciones de T/N se dicotomizaron basandose en la mediana de los valores para cada uno de los 80 individuos con datos. Los individuos con proporciones de expresion T/N de miR-21 altas tenian un pronostico de la supervivencia peor basandose en el analisis de Kaplan Meier (p = 0,004), lo que sugiere que los tumores que expresan niveles altos de miR-21 predicen un mal pronostico. Estos resultados se analizaron adicionalmente con analisis de regresion de Cox.
Los individuos con proporciones de T/N altas de miR-21 estaban en riesgo mas alto con analisis tanto univariable (HR = 3,0; p = 0,01) como multivariable (HR = 2,8; p = 0,02) ajustando por edad, sexo, raza y estadificacion TNM (Tabla 9).
Este resultado ha sugerido que los niveles de expresion de miR-21 pueden ser utiles como metodos de prediccion de pronostico y puede proporcionar un valor mas predictivo del pronostico de la supervivencia que la estadificacion TNM sola. Se ha descubierto que Mir-21 se expresa de forma diferencial en muchos tipos de tumores12-18
En los estudios tambien se demostro que niveles altos de miR-21 puede conducir a una inhibicion de la apoptosis en celulas de glioblastoma5 mientras que la inhibicion de miR-21 puede conducir a un incremento de la proliferacion en celulas HeLa19.
Los inventores en el presente documento descubrieron que miR-21 ahora se cree que contribuye a la carcinogenesis de colon de un modo similar.
Los inventores han hallado que las proporciones T/N de miR-106a elevadas en los tumores (Tabla 7) y de miR-106a estan asociadas al pronostico de la supervivencia (Tabla 9, Figura 8b).
MiR-106a es un miembro de una clase de miARN paralogos que incluyen miR-17, miR-20, miR-106a, y miR-106h20. Estos miARN son muy similares entre si en cuanto a que difieren en unicamente 1-2 nucleotidos. Debido a su similitud, es probable que todos ellos tengan dianas similares. De forma interesante, los cuatro de estos miARN muestran patrones de expresion similares y asociaciones con el pronostico (datos no mostrados). En el presente documento, los inventores han presentados asociaciones para miR-106a, pero no descartan formalmente la posibilidad de cualquiera o todos de los demas paralogos de miARN contribuyen a esta asociacion. Las proporciones de T/N de MiR-106a se dicotomizaron basandose en la mediana de los valores para cada uno de los 82 individuos con datos. Los individuos con proporciones T/N de expresion de miR-106a altas tenian un pronostico de la supervivencia peor basandose en el analisis de Kaplan Meier (p = 0,013; Figura 8b).
Esto sugiere que los tumores que expresan niveles altos de miR-106a son predictivos de un mal pronostico de supervivencia. Los individuos con proporciones de T/N altas de miR-106a estaban en riesgo mas alto con analisis tanto univariable (FIR = 2,6; p = 0,01) como multivariable (HR = 2,4; p = 0,05) ajustando por edad, sexo, raza y estadificacion TNM (Tabla 7). Por tanto, miR-106a puede ser un predictor pronostico util del pronostico de cancer de
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colon independiente de la estadificacion TNM. De forma interesante, se ha demostrado que el gen supresor de tumor retinoblastoma, es una diana funcional de miR-106a12, lo que soporta un mecanismo de como miR-106a puede contribuir mecanicamente a la carcinogenesis del colon.
La sobreexpresion del grupo miR-17-92, que contiene paralogos de miR-106a, tuvo como resultado un desarrollo acelerado del tumor en ratones10. Esto muestra, experimentalmente, que los miARN de la familia de miR-106a son capaces de afectar a la carcinogenesis, o que refuerza ademas la hipotesis de que miR-106a puede contribuir a la carcinogenesis y a la progresion del tumor.
Los patrones de expresion de siete miARN adicionales se asociaron a la estadificacion cllnica y un mal pronostico de supervivencia (Tabla 9, Figuras 8c-8i).
Existe una tendencia de que los individuos con un diagnostico de estadificacion TNM mas avanzado tenlan proporciones T/N mas altas para /et-7a (p = 0,010), miR-10a (p = 0,008), miR-16h (p = 0,048), miR-29a (p = 0,005), miR-103-2 (p = 0,033), miR-181h (p = 0,016) y miR-203 (p = 0,016) (Figura 8).
Las proporciones T/N se dicotomizaron basandose en la mediana miR-16h, miR-29a, miR-103-2, miR-203) o el cuartil mas alto (let-7g, miR-10a, miR-181h) y el analisis de Kaplan Meier revelo que las proporciones T/N altas para cada uno eran predictivas de un mal pronostico de la supervivencia (Figura 8c-8i).
El analisis de regresion de Cox invariable y multivariables confirmo que las proporciones T/N altas de uno cualquiera de estos miARN eran predictivas de un mal pronostico de cancer de colon con independencia de la estadificacion TNM (Tabla 9). Los modelos de regresion de Cox multivariables que se ajustaron por edad, sexo, raza y estadificacion TNM mostraron proporciones T/N altas para miR-16b (HR = 5,1; p = 0,003), Jet-7g (HR = 2,5; p = 0,03), miR-10a (HR = 3,4; p = 0,003), miR-29a (HR = 3,2; p = 0,01), miR-103-2 (HR = 3,1; p = 0,01), miR-181h (HR = 3,2; p = 0,01), y miR-203 (HR = 3,2; p = 0,03) cada una predictiva de un mal pronostico de supervivencia. Estos resultados sugerlan que los pacientes con tumores que expresaron niveles altos de cualquiera de estos miARN tienen un riesgo mayor de morir por cancer de colon. Por tanto, los niveles de expresion de cualquiera de estos miARN pueden ser biomarcadores utiles que pueden ayudar a predecir los riesgos de supervivencia para pacientes de cancer de colon con independencia de la estadificacion.
La firma de la expresion de MiRNA de 9 miARN predice el pronostico de la supervivencia:
Los inventores usaron las proporciones T/N para los 9 miARN mencionados anteriormente para desarrollar una firma de miARN que se pueda usar para predecir el pronostico del cancer de colon, Los individuos que carecen de mas de 2 de 9 de estos valores se excluyeron de este analisis. El agrupamiento jerarquico de las proporciones T/N de los 9 miARN tuvo como resultado agrupamiento de los 78 pacientes restantes en dos grupos (Figura 9a).
Estos grupos tenlan pronosticos de supervivencia significativamente diferentes (Figura 9b; p = 0,004). Los analisis de regresion de Cox univariables (HR = 3,2, p = 0,008) y multivariables (HR = 2,8; p = 0,04) demostraron que la firma de miARN estaba asociada a un mal pronostico de supervivencia independiente de la estadificacion TNM (Tabla 10).
Tabla 10 Analisis de regresion de Cox de la firma de microARN
Analisis univariable
Variable
HR (IC del 95 %) Valor p
Grupo B/A de 9 miR
3,2 (1,4 - 7,8) 0,008
Multivariable ajustando por edad, sexo y raza
Variable
HR (IC del 95 %) Valor p
Grupo B/A de 9 miR
2,8 (1,0 - 7,4) 0,043
edad >50/edad < 50
0,4 (0,08 - -1,8) 0,23
Varon/mujer
1,9 (0,6 - 6,6) 0,29
AA/Caucasico
0,9 (1,4 - 10,7) 0,82
Estadio III-IV/Estadio I-III
3,9 (1,4 - 10,7) 0,007
Los analisis de regresion de Cox univariables (anteriormente) y multivariables (ajustando por edad, sexo, raza y estadificacion mas adelante), se realizaron para mostrar que los individuos clasificados en el grupo B usando la 9 firma de miARN tenlan un riesgo mayor de morir por cancer de colon, Ni la edad, ni el sexo ni la raza contribuyeron significativamente al riesgo de supervivencia. Este riesgo asociado a la asignacion de grupo es independiente de la estadificacion.
Estos resultados demuestran que las formas de miARN se pueden usar como biomarcadores para predecir el pronostico de la supervivencia de los pacientes con cancer de colon,
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Discusion
Los miARN individuales se expresan de forma diferencial en tumores de colon12’13 lo que sugiere que una expresion alterada de estos miARN puede formar parte de los cambios celulares responsables de la carcinogenesis del colon. Ademas de estos hallazgos, los inventores han mostrado en el presente documento que los perfiles de expresion de miARN estan asociados a estadificacion del cancer de colon y el pronostico. Por tanto, los miARN, analizados individualmente o como parte de una firma de miARN, se pueden usar como biomarcadores que permitiran a los medicos predecir el riesgo de supervivencia del paciente con mayor precision.
Las fuertes asociaciones con las proporciones T/N de los miARN con el pronostico de la supervivencia sugieren que la expresion alterada de miARN puede formar parte de la via causal en la carcinogenesis del colon y la progresion. Si la expresion alterada de cualquiera de estos miARN es causal para la carcinogenesis, puede ser posible disenar productos farmaceuticos de tipo antagomir que se puedan usar para tratar el cancer. Usando perfiles de miARN y terapeuticas basadas en miARN, puede ser posible disenar estrategias de tratamientos farmacologicos basados en cual de estos nueve miARN esta alterado. Adicionalmente, estas estrategias pueden ser utiles en la prevencion del cancer de colon en personas con alto riesgo debido a riesgos heredados geneticamente o por antecedentes de cancer.
Ejemplo 3
Metodos, reactivos y kits para diagnosticar, estadificar, pronosticar, monitorizar y tratar enfermedades relacionadas con el cancer de colon
En una realizacion se proporciona un metodos diagnostico de evaluacion de si un paciente tuene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o tiene un riesgo mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad relacionada con el cancer de colon, que comprende las etapas de comparar el nivel de expresion de un marcador en una muestra de un paciente y el nivel normal de expresion del marcador en un control, por ejemplo una muestra de un paciente sin una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Un nivel de expresion significativamente mayor del marcador en la muestra del paciente en comparacion con el nivel normal es una indicacion de que el paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon o tiene un riesgo mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Los marcadores se seleccionan de un modo tal que el valor predictivo positivo de los metodos es de al menos aproximadamente un 10% y, en determinadas realizaciones no limitantes, de aproximadamente un 25%, aproximadamente un 50% o aproximadamente un 90%. Tambien se prefiere usar en los metodos marcadores que se expresan de forma diferencial en comparacion con las celulas normales por al menos dos veces, en al menos aproximadamente el 20% y, en determinadas realizaciones no limitantes, aproximadamente un 50% o aproximadamente un 75%.
En un metodo diagnostico de evaluar si un paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon (p. ej., nueva deteccion (“cribado”), detection de recurrencias, pruebas de reflejo), el metodo comprende comparar: a) el nivel de expresion de un marcador en la muestra de un paciente y b) el nivel normal de expresion del marcador en una muestra control de una enfermedad no relacionada con cancer de colon. Un nivel de expresion significativamente mayor del marcador en la muestra del paciente en comparacion con el nivel normal es una indicacion de que el paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Tambien se proporcionan metodos diagnosticos para evaluar la eficacia de un tratamiento para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente. Dichos metodos comprenden comparar: a) expresion de un marcador en una primera muestra obtenida del paciente antes de proporcionar al menos una portion del tratamiento al paciente, y b) expresion del marcador en una segunda muestra obtenida del paciente despues de proporcionar la porcion del tratamiento. Un nivel de expresion significativamente menor del marcador en la segunda muestra respecto a la de la primera muestra es una indicacion de que el tratamiento es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en el paciente.
Se apreciara que en estos metodos el “tratamiento” puede ser cualquier tratamiento para tratar una enfermedad relacionada con el cancer de colon en el paciente que incluye, entre otros, composiciones farmaceuticas, terapia genica y terapia biologica tal como la administration de anticuerpos y quimiocinas. Por tanto, los metodos descritos en el presente documento se pueden usar para evaluar un paciente antes, durante y despues del tratamiento, por ejemplo para evaluar la reduction del estado de enfermedad.
En determinados aspectos, los metodos diagnosticos estan dirigidos al tratamiento que usa un agente qulmico o biologico. Estos metodos comprenden comparar: a) la expresion de un marcador en una primera muestra obtenida del paciente y mantenida en presencia del agente qulmico o biologico, y b) la expresion del marcador en una segunda muestra obtenida del paciente y mantenida en ausencia del agente. Un nivel de expresion significativamente menor del marcador en la segunda muestra respecto a la de la primera muestra es una indicacion de que el agente es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en el paciente. En una
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realizacion, la primera y la segunda muestra pueden ser porciones de una unica muestra obtenida del paciente o porciones de muestras combinadas obtenidas del paciente.
Tambien se proporciona un metodo de monitorizacion para evaluar la progresion de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente, comprendiendo el metodo: a) detectar en la muestra de un paciente en un primer punto de tiempo la expresion de un marcador; b) repetir la etapa a) en un punto de tiempo posterior en el tiempo; y c) comparar el nivel de expresion detectado en las etapas a) y b) y, de este modo, monitorizar la progresion de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en el paciente. Un nivel de expresion significativamente mayor del marcador en la muestra en el posterior punto de tiempo del de la muestra en el primer punto de tiempo es una indication de que la enfermedad relacionada con el cancer de colon ha progresado, mientras que un nivel de expresion significativamente menor es una indicacion de que la enfermedad relacionada con el cancer de colon ha remitido.
Tambien se proporciona un metodo diagnostico para determinar su una enfermedad relacionada con el cancer de colon ha empeorado o es probable que empeore en el futuro, comprendiendo el metodo comparar: a) el nivel de expresion de un marcador en la muestra de un paciente y b) el nivel normal de expresion del marcador en una muestra control. Un nivel de expresion significativamente mayor en la muestra del paciente en comparacion con el nivel normal es una indicacion de que la enfermedad relacionada con el cancer de colon ha empeorado o es probable que empeore en el futuro.
Tambien se proporciona un metodo de ensayo para seleccionar una composition para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente. Este metodo comprende las etapas de: a) obtener una muestra que comprende celulas del paciente; b) mantener separados allcuotas de a muestra en presencia de una pluralidad de composiciones de ensayo; c) comparar la expresion de un marcador en cada uno de los allcuotas; y d) seleccionar una de las composiciones de ensayo que reduce significativamente el nivel de expresion del marcador en la allcuota que contiene la composicion de ensayo, respecto a los niveles de expresion del marcador en presencia de las demas composiciones de ensayo.
Adicionalmente se proporciona un metodo de ensayo de evaluation del potencial danino de un compuesto a la hora de causar una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Este metodo comprende las etapas de: a) mantener allcuotas de las celulas separados en presencia y en ausencia del compuesto; y b) comparar la expresion de un marcador en cada uno de los allcuotas. Un nivel significativamente mayor de expresion del marcador en un allcuota mantenido en presencia del compuesto con respecto al del allcuota mantenido en ausencia del compuesto es una indicacion de que el compuesto posea dicho potencial danino.
Ademas, se proporciona un metodo de inhibicion de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente. Este metodo comprende las etapas de: a) obtener una muestra que comprende celulas del paciente; b) mantener separados allcuotas de a muestra en presencia de una pluralidad de composiciones de ensayo; c) comparar la expresion de un marcador en cada uno de los allcuotas; y d) administrar al paciente al menos una de las composiciones que reduce significativamente el nivel de expresion del marcador en la allcuota que contiene la composicion de ensayo, respecto a los niveles de expresion del marcador en presencia de las demas composiciones.
El nivel de expresion de un marcador en una muestra se puede evaluar mediante, por ejemplo, detection de la presencia en la muestra de: la correspondiente protelna marcadora o un fragmento de la protelna (p. ej.,, usando un reactivo, tal como un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario, que se une especlficamente a la protelna o fragmento proteico), el correspondiente acido nucleico marcador (p. ej., un transcrito nucleotldico o un complemento del mismo) o un fragmento del acido nucleico (p. ej., poniendo en contacto los polinucleotidos transcritos obtenidos de la muestra con un sustrato que tiene fijado al mismo uno o mas acidos nucleicos que tienen la totalidad o un segmento de la secuencia de acido nucleico o una complementaria del mismo) un metabolito que se produce directamente (es decir, se cataliza) o indirectamente mediante la correspondiente protelna marcadora.
Cualquiera de los metodos mencionados anteriormente se puede realizar usando al menos uno o una pluralidad (p. ej., 2, 3, 5 o 10 o mas) de marcadores de enfermedad relacionada con el cancer de colon, que incluye marcadores de enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En dichos metodos, el nivel de expresion en la muestra de cada uno de una pluralidad de marcadores, al menos uno de los cuales es un marcador, se compara con el nivel de expresion normal de cada uno de la pluralidad de marcadores en las muestras del mismo tipo obtenidas de seres humanos control no afectados por una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Un nivel de expresion significativamente alterado (es decir, aumentado o disminuido como se especifica en los metodos descritos en lo que antecede usando un unico marcador) en la muestra de uno o mas marcadores, o alguna combination de los mismos, respecto al correspondiente nivel normal o control del marcador, es una indicacion de que el paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Para todos los metodos mencionados anteriormente, el o los marcadores se seleccionan de un modo tal que el valor predictivo positivo del metodo es de al menos aproximadamente un 10%.
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En otro aspecto, se proporcionan varios kits diagnosticos y de ensayo. En una realizacion, un kit es util para evaluar si un paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon. El kit comprende un reactivo para evaluar la expresion de un marcador. En otra realizacion, un kit es util para evaluar la idoneidad de un agente qulmico o biologico para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente. Dicho kit comprende un reactivo para evaluar la expresion de un marcador y tambien puede comprender uno o mas de estos agentes.
En una realizacion adicional, los kits son utiles para evaluar la presencia de celulas de enfermedad relacionada con el cancer de colon o tratar enfermedades relacionadas con el cancer de colon. Dichos kits comprenden un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une especlficamente a una protelna marcadora o a un fragmento de la protelna. Dichos kits pueden tambien comprender una pluralidad de anticuerpos, derivados de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en los que la pluralidad de dichos agentes anticuerpos se une especlficamente a una protelna marcadora o a un fragmento de la protelna.
En una realizacion adicional, los kits son utiles para evaluar la presencia de celulas de enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el kit comprende una sonda de acido nucleico que se une especlficamente a un acido nucleico marcador o a un fragmento del acido nucleico. El kit puede tambien comprender una pluralidad de sondas, en el que cada una de las sondas se une especlficamente a un acido nucleico marcador o a un fragmento del acido nucleico.
En un aspecto adicional, se proporcionan metodos para tratar a un paciente afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon o en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Dichos metodos pueden comprender reducir la expresion y/o interferir con la funcion biologica de un marcador. En una realizacion, el metodo comprende proporcionar al paciente un oligonucleotido antisentido o un polinucleotido complementario de un acido nucleico marcador o un segmento de los mismos. Por ejemplo, se puede proporcionar al paciente un polinucleotido antisentido mediante la liberation de un vector que exprese un polinucleotido antisentido de un acido nucleico marcador o un fragmento del mismo. En otra realizacion, el metodo comprende proporcionar al paciente un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une especlficamente a una protelna marcadora o a un fragmento de la protelna.
En un aspecto amplio, se proporciona un metodo para producir un modelo animal no humano para evaluar al menos una enfermedad relacionada con el cancer de colon. El metodo incluye exponer al animal a dosis repetidas de al menos una sustancia qulmica que se cree que produce cancer de colon. En determinados aspectos, el metodo incluye ademas recoger una o mas muestras seleccionadas del animal y comparar la muestra recogida con uno o mas indicios de posible inicio o desarrollo de cancer de colon.
En un aspecto amplio se proporciona un metodo de producir el modelo animal, que incluye: mantener al animal en un entorno especlfico sin sustancias qulmicas y sensibilizar al animal con al menos una sustancia qulmica que produce cancer de colon. En determinadas realizaciones, al menos una parte del colon del animal esta sensibilizado por multiples exposiciones secuenciales.
En otro aspecto amplio, se proporciona un metodo de cribado de un agente para determinar la eficacia frente a al menos una enfermedad relacionada con el cancer de colon. El metodo incluye, generalmente: administrar al animal al menos un agente, determinar si el agente reduce o agrava uno o mas slntomas de la enfermedad relacionada con el cancer de colon, correlacionar una reduction en uno o mas slntomas con la eficacia del agente contra la enfermedad relacionada con el cancer de colon o correlacionar una falta de reduccion de uno o mas slntomas con la falta de eficacia del agente.
El modelo animal es util para evaluar una o mas vlas metabolicas que contribuyen a al menos uno de inicio, progresion, gravedad, patologla, agresividad, grado, actividad, discapacidad, mortalidad, morbididad, subclasificacion de la enfermedad u otras caracterlsticas patogenicas o patologicas subyacentes de al menos una enfermedad relacionada con el cancer de colon. El analisis puede ser uno o mas de: agrupacion jerarquica, construction de una red de formas, analisis proteomico por espectroscopia de masas, resonancia por plasmon superficial, modelado estadlstico lineal, analisis discriminante parcial de mlnimos cuadrados y analisis de regresion lineal multiple.
En un aspecto concreto, el modelo animal se evalua para al menos una enfermedad relacionada con el cancer de colon examinando un nivel de expresion de uno o mas marcadores o un equivalente funcional del mismo.
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que un experto en la tecnica (p. ej., en cultivo celular, genetica molecular, qulmica de acido nucleico, tecnicas de hibridacion y bioqulmica) entiende habitualmente. Se usan tecnicas estandar para metodos moleculares, geneticas y bioqulmicas que estan dentro de la experiencia en la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la literatura. Vease, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumenes I y II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Mullis et al., la patente de EE.UU. N° 4.683.195;
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Nucleic Acid Hybridization (Hames & Higgins eds., 1984); Transcription And Translation (Hames & Higgins eds., 1984); Culture Of Animal Cells (R, I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller y Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al., eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes I-IV (Weir y Blackwell, eds., 1986); The Laboratory Rat, editor jefe: Mark A. Suckow; autores: Sharp y LaRegina. CRC Press, Boston, 1988) y metodos qulmicos.
En el presente documento se describen marcadores recien descubiertos asociados a un estado inducido por cancer de colon de varias celulas. Se ha descubierto que un nivel de expresion mas alto de lo normal de cualquiera de estos marcadores o una combinacion de estos marcadores se correlaciona con la presencia de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente. Se proporcionan metodos para detectar la presencia de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en una muestra; la ausencia de en una muestra; el estadio de una enfermedad relacionada con el cancer de colon y otras caracterlsticas de una enfermedad relacionada con el cancer de colon que son relevantes para la evaluacion, prevention, diagnostico, caracterizacion y tratamiento de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente. Tambien se proporcionan metodos de tratar una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Definiciones. Como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes terminos tienen los significados indicados en esta section.
Los artlculos “un” y “una” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o mas de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artlculo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o mas de un elemento.
Un “marcador” es un gen o protelna cuyo nivel de expresion alterado en un tejido o celula con respecto a su nivel de expresion en tejido o celulas normales o sanos se asocia a un estado de enfermedad.
El nivel de expresion "normal" de un marcador es el nivel de expresion del marcador en celulas del sistema del colon de un sujeto o paciente humano no afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Una “sobreexpresion” o “nivel de expresion significativamente mas alto” de un marcador hace referencia a un nivel de expresion en una muestra de ensayo que es mayor que el error estandar del ensayo usado para evaluar la expresion, y en determinadas realizaciones, al menos dos veces, y en otras realizaciones, tres, cuatro, cinco o diez veces el nivel de expresion del marcador en una muestra control (p. ej., la muestra de un sujeto sano que no tiene el marcador asociado a la enfermedad) y en determinadas realizaciones, el nivel de expresion promedio del marcador en varias muestras control.
Un “nivel de expresion significativamente menor” de un marcador hace referencia a un nivel de expresion en una muestra de ensayo que es al menos dos veces, y en determinadas realizaciones, al menos tres, cuatro, cinco o diez veces menor que el nivel de expresion del marcador en una muestra control (p. ej., la muestra de un sujeto sano que no tiene el marcador asociado a la enfermedad) y en determinadas realizaciones, el nivel de expresion promedio del marcador en varias muestras control.
Un kit es cualquier fabrication (p. ej., un envase o contenedor) que comprende al menos un reactivo, por ejemplo una sonda para detectar especlficamente la expresion de un marcador. El kit puede promocionarse, distribuirse o comercializarse como una unidad para realizar los metodos de la presente invention.
“Protelnas” abarcan protelnas marcadoras y sus fragmentos, protelnas marcadoras variantes y sus fragmentos, peptidos y polipeptidos que comprenden un segmento del marcador de al menos 15 aminoacidos o una protelna marcadora variante y protelnas de fusion que comprenden un marcador protelna marcadora variante o un segmento de al menos 15 aminoacidos de un marcador o protelna marcadora variante.
Las composiciones, kits y metodos descritos en el presente documento tienen los usos siguientes, entre otros: 1) evaluar si un paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon; 2) evaluar el estadio de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente humano; 3) evaluar el grado de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 4) evaluar la naturaleza de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 5) evaluar el potencial de desarrollar una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 6) evaluar el tipo histologico de las celulas asociadas a una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 7) fabricar anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos que son utiles para tratar una enfermedad relacionada con el cancer de colon y/o evaluar si un paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon; 8) evaluar la presencia de celulas de una enfermedad relacionada con el cancer de colon; 9) evaluar la eficacia de uno o mas compuestos de ensayo para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 10) evaluar la eficacia de un tratamiento para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 11) monitorizar la progresion de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 12) seleccionar una composition
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o tratamiento para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 13) tratar a un paciente afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon; 14) inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente; 15) evaluar el potencial danino de un compuesto de ensayo; 16) prevenir el inicio de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Metodos de cribado
Los modelos animales creados por los metodos descritos en el presente documento permitiran el cribado de agentes terapeuticos utiles para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con el cancer de colon. De acuerdo con lo anterior, los metodos son utiles para identificar agentes terapeuticos para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Los metodos comprenden administrar un agente candidato a un modelo animal mediante los metodos descritos en el presente documento, evaluar al menos una respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon en el modelo animal en comparacion con un modelo animal control al que no se ha administrado el agente candidato. Si al menos una respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon es reduccion de slntomas o retraso del inicio, el agente candidato es un agente para tratar o prevenir la enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Los agentes candidatos pueden ser agentes farmacologicos ya conocidos en la tecnica o pueden ser agentes de los que se desconocla anteriormente que tenlan alguna actividad farmacologica. Los agentes pueden ser de origen natural o se pueden disenar en el laboratorio. Pueden aislarse de microorganismos, animales o plantas, o pueden producirse de forma recombinante o sintetizarse mediante cualquier metodo qulmico adecuado. Pueden ser moleculas pequenas, acidos nucleicos, protelnas, peptidos peptidomimeticos. En determinadas realizaciones, los agentes candidatos son compuestos organicos pequenos que tienen un peso molecular de mas de 50 y menos de aproximadamente 2.500 dalton. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interaction estructural con protelnas. Los agentes candidatos tambien se encuentran entre biomoleculas que incluyen, entre otras: peptidos, sacaridos, acidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, analogos estructurales o combinaciones de los mismos.
Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes, incluidas bibliotecas de compuestos sinteticos o naturales. Por ejemplo, existen numerosos medios disponibles para la slntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos organicos y biomoleculas, incluida la expresion de oligonucleotidos y oligopeptidos aleatorizados. Como alternativa, se dispone de bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fungicos, plantas y animales, o se producen facilmente. Adicionalmente, las bibliotecas producidas de forma natural o sintetica y los compuestos se modifican facilmente por medios qulmicos, flsicos y bioqulmicos convencionales, y se pueden usar para producir bibliotecas combinatorias. En determinadas realizaciones, los agentes candidatos se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos enfoques en metodos de biblioteca combinatoria conocidos en la tecnica, incluidos, a modo de ejemplos no limitantes: bibliotecas biologicas, bibliotecas de fase solida o de fase en solution paralela; metodos de biblioteca sintetica que requiere desconvolucion; el metodo de biblioteca de “una perla un compuesto”, y metodos con bibliotecas sinteticas usando selection por cromatografla de afinidad.
En determinadas realizaciones adicionales, determinados agentes farmacologicos se pueden someter a modificaciones qulmicas dirigidas o aleatorias, tales como acilacion, alquilacion, esterification, amidificacion etc., para producir analogos estructurales.
Los mismos metodos para identificar agentes terapeuticos para tratar una enfermedad relacionada con el cancer de colon tambien se pueden usar para validar compuestos/agentes principales generados de estudios in vitro.
El agente candidato puede ser un agente que regula por aumento o por disminucion una o mas vlas de respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon. En determinadas realizaciones, el agente candidato puede ser un antagonista que afecta a dicha via.
Metodos para trata una enfermedad relacionada con el cancer de colon
En el presente documento se proporcionan metodos para tratar, inhibir, aliviar o invertir una respuesta a una enfermedad relacionada con el cancer de colon. En los metodos descritos en el presente documento, un agente que interfiere con una cascada de serialization se administra a un individuo que lo necesita, tal como, entre otros, pacientes de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en los que dichas complicaciones todavla no son evidentes y aquellos que ya tienen al menos una respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En el primer caso, dicho tratamiento es util para prevenir la aparicion de dicha respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon y/o reducir la extension en la que se produce. En el ultimo caso, dicho tratamiento es util para reducir la extension a la cual se produce dicha respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon, prevenir su desarrollo adicional o invertir la respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon.
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En determinadas realizaciones, el agente que interfiere con la cascada de respuesta a la enfermedad relacionada con el cancer de colon puede ser un anticuerpo especlfico para dicha respuesta.
Expresion de un marcador
La expresion de un marcador se puede inhibir de varias formas, incluyendo, a modo de ejemplo no limitante, un oligonucleotido antisentido se puede proporcionar a las celulas de la enfermedad relacionada con el cancer de colon con el fin de inhibir la transcripcion, la traduccion, o ambos, del o los marcadores. Como alternativa, se puede proporcionar a la celula un polinucleotido que codifica un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une especlficamente a una protelna marcadora y operablemente unido a una region promotora/reguladora adecuada, con el fin de generar anticuerpos intracelulares que inhiban la funcion o la actividad de la protelna. La expresion y/o la funcion de un marcador tambien se puede inhibir tratando la celula de enfermedad relacionada con el cancer de colon con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une especlficamente a una protelna marcadora. Usando los metodos descritos en el presente documento, varias moleculas, en particular moleculas suficientemente pequenas que son capaces de atravesar la membrana celular, se pueden someter a cribado con el fin de identificar moleculas que inhiben la expresion de un marcador o inhiben la funcion de una protelna marcadora. El compuesto identificado de este modo se puede proporcionar al paciente con el fin de inhibir celulas de enfermedad relacionada con el cancer de colon del paciente.
En las composiciones, kits y metodos descritos en el presente documento se puede usar cualquier marcador o combinacion de marcadores, as! como cualquier marcador determinado en combinacion con los marcadores, En general, es deseable usar marcadores para los que la diferencia entre el nivel de expresion del marcador en las celulas de enfermedad relacionada con el cancer de colon del paciente y el nivel de expresion del mismo marcador en las celulas normales del sistema del colon sea lo mas grande posible. Aunque esta diferencia puede ser tan pequena como el llmite de deteccion del metodo para evaluar la expresion del marcador, es deseable que la diferencia sera al menos mayor que el error estandar del metodo de evaluacion y, en determinadas realizaciones, una diferencia de al menos 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 100-, 500-, 1.000 veces o mas el nivel de expresion del mismo marcador en tejido normal.
Se reconoce que determinadas protelnas marcadoras se secretan al espacio extracelular que rodea a las celulas. Estos marcadores se usan en determinadas realizaciones de las composiciones, kits y metodos, debido al hecho de que dichas protelnas marcadoras se pueden detectar en una muestra de fluido corporal asociada a cancer de colon, que puede recogerse mas facilmente de un paciente humano que una muestra de biopsia tisular. Ademas, las
tecnicas in vivo para detectar una protelna marcadora incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado
dirigido contra la protelna. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y localization en un sujeto se puede detectar mediante tecnicas de imagen estandar.
Con el fin de determinar si cualquier protelna marcadora es una protelna secretada, la protelna marcadora se expresa en, por ejemplo, una celula de mamlfero, tal como una llnea de colon humano, el fluido extracelular se recoge y se evalua la presencia o ausencia de la protelna en el fluido extracelular (p. ej., usando un anticuerpo marcado que se une especlficamente a la protelna).
Se apreciara que las muestras de los pacientes que contienen celulas de colon se pueden usar en los metodos descritos en el presente documento. En estas realizaciones, el nivel de expresion del marcador se puede evaluar evaluando la cantidad (p. ej., la cantidad o concentration absoluta) del marcador en una muestra. La muestra celular puede, por supuesto, someterse a diversas tecnicas posrecoleccion, preparativas y de almacenamiento (p. ej.,
extraction de acido nucleico y/o protelna, fijacion, conservation, congelation, ultrafiltracion, concentracion,
evaporation, centrifugation etc.) antes de evaluar la cantidad del marcador en la muestra.
Tambien se apreciara que los marcadores se pueden desprender de las celulas al sistema digestivo, la corriente sangulnea y/o los espacios intersticiales. Los marcadores desprendidos se pueden analizar mediante, por ejemplo, analisis del suero o el plasma.
Las composiciones, kits y metodos se pueden usar para detectar la expresion de protelnas marcadoras que tienen al menos una portion que se muestra sobre la superficie de las celulas que las expresan. Por ejemplo, los metodos inmunologicos se pueden usar para detectar dichas protelnas sobre celulas enteras, o se pueden usar metodos de analisis de la secuencia por ordenador para predecir la presencia de al menos un dominio extracelular (es decir, que incluye protelnas secretadas y protelnas que tienen al menos un dominio en la superficie celular). La expresion de una protelna marcadora que tiene al menos una porcion que se expresa en la superficie de una celula que expresa, se puede detectar sin lisar necesariamente la celula (p. ej., usando un anticuerpo marcado que se une especlficamente a un dominio de superficie celular de la protelna).
La expresion de un marcador se puede evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de metodos para detectar la expresion de un acido nucleico o protelna transcritos. Ejemplos no imitantes de dichos metodos incluyen metodos inmunologicos para la deteccion de protelnas secretadas, de superficie celular, citoplasmaticas o nucleares, metodos de purification de protelnas, funcion proteica o ensayos de actividad, metodos de hibridacion de
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acido nucleico, metodos de transcripcion inversa de acido nucleico y metodos de amplificacion de acido nucleico.
En una realizacion concreta, la expresion de un marcador se evalua usando un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo radiomarcado, marcado con cromoforo, marcado con fluoroforo o marcado con enzima), un derivado de anticuerpo (p. ej., un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la protelna o ligando de un par protelna-ligando) o un fragmento de anticuerpo (p. je., un anticuerpo de una sola cadena, un dominio hipervariable del anticuerpo aislado, etc.) que se une especlficamente a una protelna marcadora o fragmento de la misma, incluyendo una protelna marcadora que ha sufrido toda o una parte de su modificacion postraduccional normal.
En otra realizacion concreta, la expresion de un marcador se evalua preparando ARNm/ADNc (es decir, un polinucleotido transcrito) de las celulas en una muestra de paciente e hibridando el ARNm/ADNc con un polinucleotido de referencia que es un complementario de un acido nucleico marcador o un fragmento del mismo. El ADNc se puede amplificar, opcionalmente, usando cualquiera de varios metodos de reaccion en cadena de la polimerasa antes de hibridar con el polinucleotido de referencia, preferentemente no se amplifica. La expresion de uno o mas marcadores puede detectarse tambien usando PCR cuantitativa para evaluar el nivel de expresion del o los marcadores. Como alternativa, se puede usar cualquiera de los muchos metodos de detection de mutaciones, variantes (p. ej., polimorfismos de nucleotido unico, deleciones etc,) de un marcador para detectar la aparicion de un marcador en un paciente.
En una realizacion relacionada, una mezcla de polinucleotidos transcritos obtenidos de la muestra se pone en contacto con un sustrato al que se ha fijado un polinucleotido complementario u homologo a al menos una portion (p. ej., al menos, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, o mas residuos nucleotldicos) de un acido nucleico marcador. Si los polinucleotidos complementarios u homologos se detectan de forma diferencial sobre el sustrato (p. ej., se pueden detectar usando diferentes cromoforos o fluoroforos, o fijarse a diferentes posiciones seleccionadas), los niveles de expresion de una pluralidad de marcadores se pueden evaluar de forma simultanea usando un unico sustrato (p. ej., una micromatriz de “circuito genico” de polinucleotidos fijados en determinadas posiciones). Cuando se usa un metodo de evaluation de la expresion de marcadores que implica hibridacion de un acido nucleico con otro, se desea que la hibridacion se realice en condiciones de hibridacion rigurosas.
En determinadas realizaciones, los ensayos con biomarcadores se pueden realizar usando espectrometrla de masas o resonancia de plasmon superficial. En varias realizaciones, el metodo de identification de un agente activo contra una enfermedad relacionada con el cancer de colon puede incluir a) proporcionar una muestra de celulas que contiene uno o mas marcadores o derivados de los mismos; b) preparar un extracto de dichas celulas; c) mezclar dicho extracto con una sonda de acido nucleico marcada que contiene un sitio de union para el marcador; y d) determinar la formation de un complejo entre el marcador y la sondad e acido nucleico en presencia o ausencia del agente de ensayo. La etapa de determination puede incluir someter dicha mezcla de sondas de acido nucleico/extracto a un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforetica.
En determinadas realizaciones, la etapa de determinacion comprende un ensayo seleccionado de un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), ensayos basados en fluorescencia y ensayos de ultraalto rendimiento, por ejemplo ensayos de resonancia en plasmon superficial (SPR) o espectroscopia de correlation con fluorescencia. En dichas realizaciones, el sensor SPR es util para la observation directa en tiempo real de interacciones biomoleculares, ya que SPR es sensible a los cambios del Indice de refraction en un minuto en una superficie metalica-dielectrica. La SPR es una tecnica de superficie que es sensible a los cambios al 105 a 10-6 de Indice de refraccion (IF) dentro de aproximadamente 200 nm de la interfaz sensor/muestra de SPR. Por tanto, la espectroscopia SPR es util para monitorizar el crecimiento de pellculas organicas finas depositadas sobre la capa sensora.
Dado que las composiciones, kits y metodos dependen de la deteccion de una diferencia en los niveles de expresion de uno o mas marcadores, se desea que el nivel de expresion del marcador sea significativamente mayor que el llmite de deteccion mlnimo del metodo usado para evaluar la expresion en al menos una de las celulas normales y celulas afectadas por cancer de colon,
Se entiende que por cribado de rutina de muestras adicionales de pacientes usando uno o mas de los marcadores se iniciara que determinados de los marcadores esta sobreexpresados en celulas de varios tipos, incluidas de enfermedades especlficas relacionadas con cancer de colon.
Ademas, dado que se correlaciona un mayor numero de muestras de pacientes se evaluan segun la expresion de los marcadores y los desenlaces de los pacientes individuales de los que se obtuvieron las muestras, tambien se confirmara que la expresion alterada de determinados marcadores se correlaciona estrechamente con una enfermedad relacionada con el cancer de colon y que la expresion alterada de otros marcadores se correlaciona estrechamente con otras enfermedades. Por tanto, las composiciones, kits y metodos son utiles para caracterizar uno o mas del estadio, grado, tipo histologico y naturaleza de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en los pacientes.
Cuando las composiciones, kits y metodos se usan para caracterizad uno o mas del estadio, grado, tipo histologico y
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naturaleza de una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente, se desea que el marcador o panel de marcadores se selecciona de un modo tal que se obtenga un resultado positivo en al menos aproximadamente el 20% y, en determinadas realizaciones, al menos aproximadamente el 40 %, 60 %, u 80 %, y en sustancialmente todos los pacientes afectados por una enfermedad relacionada con el cancer de colon del correspondiente estadio, grado, tipo histologico o naturaleza. El marcador o panel de marcadores de la invencion se puede seleccionar de un modo tal que se obtenga un valor predictivo positivo de mas de aproximadamente 10% para la poblacion general (en un ejemplo no limitante, acoplado con una especificidad del ensayo superior al 84%).
Cuando en las composiciones, kits y metodos se usa una pluralidad de marcadores, el nivel de expresion de cada marcador en una muestra de un paciente se puede comparar con el nivel de expresion normal de cada uno de la pluralidad de marcadores en muestras que no son de cancer de colon del mismo tipo, bien en una mezcla de reaccion sencilla (es decir, usando reactivos tales como sondas fluorescentes diferentes, para cada marcador) o mezclas de reaccion individuales correspondientes a uno o mas de los marcadores. En una realizacion, un nivel de expresion significativamente mayor de mas de uno de la pluralidad de marcadores en la muestra respecto a los niveles normales correspondientes es una indication de que el paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Cuando se usa una pluralidad de marcadores se pueden usar 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 30, o 50 o mas marcadores individuales; en determinadas realizaciones, puede desearse el uso de menos marcadores.
Con el fin de maximizar la sensibilidad de las composiciones, kits y metodos (es decir, mediante interferencia atribuible a las celulas procedentes de sistema no colonico en una muestra de un paciente), es deseable que el marcador usado en el mismo sea un marcador que tenga una distribucion tisular restringida, por ejemplo que normalmente no se expresa en un tejido que no pertenece al sistema colonico.
Se reconoce que las composiciones, kits y metodos seran de utilidad concreta para pacientes que tienen un riesgo potenciado de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer de colon y sus asesores medicos. Los pacientes que se ha reconocido que tienen un riesgo potenciado de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer de colon incluyen, por ejemplo, pacientes que tienen antecedentes familiares de una enfermedad relacionada con cancer de colon.
El nivel de expresion de un marcador en tejido de sistema colonico humano normal se puede evaluar de varias formas. En una realizacion, este nivel de expresion normal se evalua evaluando el nivel de expresion del marcador en una portion de celulas del sistema colonico que parecen normales y comparando este nivel de expresion normal con el nivel de expresion en una porcion de celulas del sistema colonico que se sospecha que son anormales. Como alternativa, y particularmente cuando aparece mas information como resultado de realizacion rutinaria de los metodos descritos en el presente documento, se pueden usar los valores promedio en la poblacion para la expresion normal de los marcadores. En otras realizaciones, el nivel de expresion 'normal' de un marcador se puede determinar evaluando la expresion del marcador en la muestra de un paciente obtenida de un paciente no afectado por cancer de colon, de la muestra de un paciente obtenida de un paciente antes del inicio sospechado de una enfermedad relacionada con cancer de colon en el paciente, de muestras de pacientes archivadas y similares.
En el presente documento tambien se proporcionan composiciones, kits y metodos para evaluar la presencia de celulas de enfermedad relacionada con cancer de colon en una muestra (p. ej., una muestra de tejido archivada o una muestra obtenida de un paciente). Estas composiciones, kits y metodos son sustancialmente iguales a los descritos anteriormente a exception de que, cuando es necesario, las composiciones, kits y metodos se adaptan para usar con muestras distintas a las muestras de pacientes. Por ejemplo, cuando la muestra a usar es una muestra de tejido humano incluida en parafina y archivada, puede ser necesario ajustar la proportion de compuestos en las composiciones, en los kits o en los metodos usados para evaluar los niveles de expresion del marcador en la muestra.
Kits y reactivos
Los kits son utiles para evaluar la presencia de celulas de enfermedad relacionada con el cancer de colon (p. ej., en una muestra tal como una muestra de un paciente). El kit comprende una pluralidad de reactivos cada uno de los cuales es capaz de unirse especlficamente con un acido nucleico o protelna marcadores. Reactivos adecuados para unirse con una protelna marcadora incluye anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y similares. Reactivos adecuado para unirse a un acido nucleico marcador (p. ej., un ADN genomico, un ARNm, un ARNm de corte y empalme, un ADNc o similares) incluyen acidos nucleicos complementarios. Por ejemplo, los reactivos de acido nucleico pueden incluir oligonucleotidos (marcados o no marcados) fijados a un sustrato, oligonucleotidos marcados no unidos a un sustrato, pares de cebadores de PCR, sondas balizas moleculares y similares.
Los kits pueden comprender, opcionalmente, componentes adicionales utiles para realizar los metodos descritos en el presente documento. A modo de ejemplo, el kit puede comprender fluidos (p. ej., tampon SSC) adecuados para hibridar con acidos nucleicos complementarios o para unir un anticuerpo con una protelna con la que se une especlficamente, uno o mas compartimentos de la muestra, un material de instrucciones que describe el
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funcionamiento del metodo, una muestra de celulas normales del sistema colonico, una muestra de celulas de enfermedad relacionada con el cancer de colon y similares.
Metodo de produccion de anticuerpos
En el presente documento tambien se proporciona un metodo de fabricar un hibridoma aislado que produce un anticuerpo util para evaluar si un paciente esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon. En este metodo se sintetiza o alsla una protelna o peptido que comprende todo o un segmento de una protelna marcadora (p. ej., mediante purification de una celula en la que se expresa o mediante transcription y traduction de un acido nucleico que codifica la protelna o peptido in vivo o in vitro). Por ejemplo, un vertebrado, un mamlfero tal como un raton, rata, conejo u oveja, se inmuniza usando la protelna o peptido. El vertebrado puede inmunizarse, opcionalmente (y preferentemente) al menos una vez mas con la protelna o peptido de modo que el vertebrado exhiba una solida respuesta inmunitaria a la protelna o peptido. Se alslan esplenocitos del vertebrado inmunizado y se fusionan con una llnea celular inmortalizada para formar hibridomas usando cualquiera de varios metodos. Los hibridomas formados de este modo se someten a cribado usando metodos estandar para identificar uno o mas hibridomas que producen un anticuerpo que se une especlficamente a la protelna marcadora o a un fragmento de la misma. En el presente documento tambien se proporcionan hibridomas fabricados mediante este metodo y anticuerpos fabricados usando dichos hibridomas.
Metodo de evaluacion de la eficacia
En el presente documento tambien se proporciona un metodo de evaluacion de la eficacia de un compuesto de ensayo para inhibir celulas de una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Como se ha descrito con anterioridad, las diferencias en el nivel de expresion de los marcadores se correlacionan con el estado anormal de las celulas del sistema colonico. Aunque se reconoce que es probable que los cambios en los niveles de expresion de determinados marcadores sean el resultad del estado anormal de las celulas del sistema colonico, tambien se reconoce que los cambios en los niveles de expresion de otros de los marcadores inducen, mantienen y estimulan el estado anormal de dichas celulas. Por tanto, los compuestos que inhiben una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente hara que el nivel de expresion de uno o mas de los marcadores cambie hasta un nivel mas cercano al nivel de expresion normal para dicho marcador (es decir, el nivel de expresion ara el marcador en las celulas normales del sistema colonico).
Por tanto, este metodo comprende comparar la expresion de un marcador en una primera muestra de celula de colon y mantenida en presencia del compuesto de ensayo y la expresion del marcador en una segunda muestra de celula de colon y mantenida en ausencia del compuesto de ensayo. Una expresion reducida significativamente de un marcador en presencia del compuesto de ensayo es una indication de que el compuesto de ensayo inhibe una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Las muestras de celulas de colon pueden ser, por ejemplo, allcuotas de una unica muestra de celulas de colon normales obtenidas de un paciente, muestras combinadas de celulas de colon normales obtenidas de un paciente, celulas de una llnea celular de colon normal, allcuotas de una unica muestra de celulas de una enfermedad relacionada con el cancer de colon obtenidas de un paciente, muestras combinadas de celulas una enfermedad relacionada con el cancer de colon obtenidas de un paciente, celulas de una llnea celular de una enfermedad relacionada con el cancer de colon o similares.
En una realization, las muestras son celulas de una enfermedad relacionada con el cancer de colon obtenidas de un paciente y una pluralidad de compuestos que se cree que son eficaces para inhibir varias enfermedades relacionadas con el cancer de colon se analizan con el fin de identificar el compuesto que es probable que inhiba mejor la enfermedad relacionada con el cancer de colon en el paciente.
Asimismo, el metodo puede usarse para evaluar la eficacia de un tratamiento para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en un paciente. En este metodo se evalua el nivel de expresion de uno o mas marcadores en un par de muestras (una sometida al tratamiento, la otra no sometida al tratamiento). Al igual que con el metodo de evaluacion de la eficacia de compuestos de ensayo, si el tratamiento indique un nivel de expresion significativamente menor de un marcador, el tratamiento es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Como anteriormente, si en este metodo se usan muestras de un paciente determinado, se pueden evaluar tratamientos alternativos in vitro para seleccionar un tratamiento que con mucha probabilidad sea eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon en el paciente.
Como se ha descrito con anterioridad, el estado anormal de celulas de colon humanas se correlaciona con los cambios en los niveles de expresion de los marcadores. Tambien se proporciona un metodo para evaluar el potencial danino de un compuesto de ensayo. Este metodo comprende mantener allcuotas separados de celulas de colon humanas en presencia o ausencia del compuesto de ensayo. La expresion de un marcador en cada uno de los allcuotas se compara. Un nivel significativamente mayor de expresion de un marcador en un allcuota mantenido en presencia del compuesto de ensayo (con respecto al allcuota mantenido en ausencia del compuesto de ensayo) es una indicacion de que el compuesto de ensayo posee un potencial danino. El potencial danino de varios compuestos de ensayo se puede evaluar comparando el grado de potenciacion o inhibition del nivel de expresion de los marcadores relevantes, comparando el numero de marcadores para los cuales el nivel de expresion esta potenciado
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o inhibido, o mediante comparacion de ambos.
Varios aspectos se describen con mas detalle en las subsecciones siguientes.
Protefnas y anticuerpos aislados
Un aspecto pertenece a las protelnas marcadoras aisladas y a porciones biologicamente activas de las mismas, as! como fragmentos polipeptldicos adecuados para usar como inmunogenos para producir anticuerpos dirigidos contra una protelna marcadora o un fragmento de la misma. En una realizacion, la protelna marcadora nativa se puede aislar de celulas o tejidos mediante un esquema de purificacion adecuado usando tecnicas estandar de purification de protelnas. En otra realizacion, una protelna o peptido que comprende la totalidad o un segmento de la protelna marcadora se produce mediante tecnicas de ADN recombinante. De forma alternativa a la expresion recombinante, dicha protelna o peptido se pueden sintetizar qulmicamente usando tecnicas de slntesis peptldica estandar.
Una protelna “aislada” o “purificada” o una portion biologicamente activa de la misma esta sustancialmente libre de material celular o de otras protelnas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que la protelna deriva o sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros productos qulmicos cuando se sintetiza qulmicamente. La expresion “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de protelna en las que la protelna esta separada de los componentes celulares de las celulas de las que se alsla o produce de forma recombinante. Por tanto, la protelna sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones protelna que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de protelna heterologa (tambien denominada en el presente documento "protelna contaminante”).
Cuando la protelna o la o una porcion biologicamente activa de la misma se producen de forma recombinante, estan, preferentemente, sustancialmente libres de medio de cultivo, es decir el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparation de protelna. Cuando la protelna se produce mediante slntesis qulmica, preferentemente esta sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros productos qulmicos, es decir esta separado de los precursores qulmicos u otros productos qulmicos que estan implicados en la slntesis de protelnas. De acuerdo con esto, dichas preparaciones de la protelna tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (en peso seco) de precursores qulmicos u otros compuestos distintos al polipeptido de interes.
Porciones biologicamente activas de una protelna marcadora incluyen polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente identicas o derivadas de la secuencia de aminoacidos de la protelna marcadora, que incluyen menos aminoacidos que la protelna de longitud completa y exhiben al menos una actividad de la correspondiente protelna de longitud completa. Normalmente, las porciones biologicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la correspondiente protelna de longitud completa. Una porcion biologicamente activa de una protelna marcadora puede ser un polipeptido que tiene, por ejemplo, una longitud de 10, 25, 50, 100 o mas aminoacidos. Ademas, otras porciones biologicamente activas en las que otras regiones de la protelna marcadora estan delecionadas se pueden preparar mediante tecnicas recombinantes y evaluar para determinar una o mas de las actividades funcionales de la forma nativa de la protelna marcadora. En determinadas realizaciones, las protelnas utiles son sustancialmente identicas (p. ej., al menos aproximadamente 40% y, en determinadas realizaciones 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o 99 %) con una de estas secuencias y conservan la actividad funcional de la correspondiente protelna marcadora de origen natural aunque difieren en la secuencia de aminoacidos debido a variation alelicas natural o a mutagenesis.
Ademas, se puede usar bibliotecas de segmentos de una protelna marcadora para generar una poblacion variada de polipeptidos para cribado y la posterior selection de protelnas marcadoras variantes o segmentos de las mismas.
Medicina predictiva
En el presente documento tambien se proporciona usos de los modelos animales y marcadores en el campo de la medicina predictiva en la que se usan ensayos diagnosticos, ensayos pronosticos, farmacogenomica y monitorizacion de ensayos cllnicos para fines pronosticos (predictivos) para tratar de este modo a un individuo de forma profilactica. De acuerdo con lo anterior, en el presente documento tambien se proporcionan ensayos diagnosticos para determinar el nivel de expresion de una o mas protelnas o acidos nucleicos marcadores con el fin de determinar si un individuo esta en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Dichos ensayos se pueden usar para fines pronosticos o predictivos para tratar de este modo a un individuo de forma profilactica antes del inicio de la enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En otro aspecto, los metodos son utiles para al menos un cribado periodico del mismo individuo para ver si dicho individuo ha estado expuesto a sustancias qulmicas o toxinas que cambian sus patrones de expresion.
Otro aspecto mas pertenece a la monitorizacion de la influencia de los agentes (p. ej., farmacos u otros compuestos administrados bien para inhibir una enfermedad relacionada con el cancer de colon o para tratar o prevenir cualquiera de los demas trastornos (p. ej., con el fin de entender cualquier efecto del sistema que dicho tratamiento
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pueda tener) sobre la expresion o actividad de un marcador en ensayos cllnicos.
Farmacogenomica
Los marcadores tambien sin utiles como marcadores farmacogenomicos. Como se usa en el presente documento, un “marcador farmacogenomico” es un marcador bioqulmico objetivo cuyo nivel de expresion se correlaciona con una respuesta de farmaco cllnico especlfica o con la sensibilidad en un paciente. La presencia o la cantidad de expresion del marcador farmacogenomico esta relacionada con la respuesta predicha del paciente y, mas particularmente, del tumor del paciente al tratamiento con un farmaco especlfico o clase de farmacos. Evaluando la presencia o la cantidad de expresion de uno o mas marcadores farmacogenomicos en un paciente, se puede seleccionar un tratamiento farmacologico que sea muy adecuado para el paciente o que se ha predicho que tiene un mayor grado de exito.
Monitorizacion de ensayos cifnicos
La monitorizacion de la influencia de agentes (p. ej., compuestos farmacologicos) sobre el nivel de expresion de un marcador se puede aplicar no solo a el cribado basico de farmacos sino tambien en ensayos cllnicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente para afectar a la expresion de un marcador se puede monitorizar en ensayos cllnicos de sujetos que reciben tratamiento para una enfermedad relacionada con cancer de colon.
En una realizacion no limitante, la presente invention proporciona un metodo para monitorizar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (p. ej., un agonista, antagonista, peptidomimetico, protelna, peptido, acido nucleico, molecula pequena u otro candidato a farmaco) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra pre- administracion del sujeto antes de la administration del agente; (ii) detectar el nivel de expresion de uno o mas marcadores seleccionados en la muestra previa a la administracion; (iii) obtener una o mas muestras posteriores a la administracion del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresion del o los marcadores en las muestras despues de la administracion; (v) comparar el nivel de expresion del o los marcadores en la muestra previa a la administracion con el nivel de expresion del o los marcadores en la muestra o muestras posteriores a la administracion y (vi) alterar la administracion del agente al sujeto en consecuencia.
Por ejemplo, el incremento de la expresion del o los genes marcadores durante el curso del tratamiento puede indicar dosificacion ineficaz y el deseo de incrementar la dosis. Por el contrario, la disminucion de la expresion del o los genes marcadores puede indicar un tratamiento eficaz y la no necesidad de cambiar la dosis.
Medios iegibies en aparato electronico, sistemas, matrices y metodos de usar ios mismos
Como se usa en el presente documento, “medio legible en aparato electronico” significa cualquier medio adecuado para almacenar, contener o retener datos o information que se puede leer y a la que se puede acceder directamente con un aparato electronico. Dichos medios pueden incluir, entre otros: medios de almacenamiento magnetico, tales como disquetes, medios de almacenamiento en disco duro y cintas magneticas; medios de almacenamiento optico tales como discos compactos; medios de almacenamiento electronicos tales como RAM, ROM, EPROM, EEPROM y similares, y discos duros generales e hlbridos de estas categorlas tales como medios de almacenamiento magnetico/optico. El medio esta adaptado o configurado para tener registrado en su interior un marcador como se ha descrito en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, con la expresion “aparato electronico” se pretende incluir cualquier aparato de computation o metodo adecuado u otro dispositivo configurado o adaptado para almacenar datos o informacion. Ejemplos de aparatos electronicos adecuados para usar con la presente invencion incluyen aparatos de computacion autonomos, redes, incluidas una red de area local (LAN), una red de area amplia (WAN), Internet, Intranet) y Extranet; dispositivos electronicos tales como agendas digitales personales (PDA), moviles, buscadores y similares; y sistemas de procesamiento locales y distribuidos.
Como se usa en el presente documento, “registrado” hace referencia a un proceso para almacenar o codificar informacion sobre el medio de lectura del aparato electronico. Los expertos en la tecnica pueden adoptar facilmente cualquier metodo de registro de informacion en medios para generar materiales que comprendan los marcadores descritos en el presente documento.
Se pueden usar varios programas de software y formatos para almacenar la informacion del marcador de la presente invencion en el medio legible en aparato electronico. Se puede usar cualquier numero de formatos de estructuracion del procesador de datos (p. ej., archivo de texto o base de datos) con el fin de obtener o crear un medio en el que se hayan registrado los marcadores. Proporcionando los marcadores en forma legible, se puede acceder de forma rutinaria a la informacion sobre la secuencia marcadora para varios fines. Por ejemplo, un experto en la tecnica puede usar las secuencias de nucleotidos o de aminoacidos en forma legible para comparar una secuencia diana o motivo estructural diana con la informacion de la secuencia almacenada dentro del medio de conservation de los datos. Los medios de busqueda se usan para identificar fragmentos o regiones de las secuencias que equivalen a una secuencia diana o motivo diana concretos.
Por tanto, en el presente documento tambien se proporciona un medio para conservar las instrucciones para realizar
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un metodo para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una predisposicion a una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el metodo comprende las etapas de determinar la presencia o ausencia de un marcador y basandose en la presencia o ausencia del marcador, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una predisposicion a una enfermedad relacionada con el cancer de colon y/o recomendar un tratamiento concreto para una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una afeccion previa a una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En el presente documento tambien se proporciona un sistema electronico y/o una red, un metodo para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una predisposicion a una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en el que el metodo comprende las etapas de determinar la presencia o ausencia del marcador y basandose en la presencia o ausencia del marcador, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una predisposicion a una enfermedad relacionada con el cancer de colon y/o recomendar un tratamiento concreto para una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una afeccion previa a una enfermedad relacionada con el cancer de colon. El metodo puede comprender ademas la etapa de recibir informacion fenotlpica asociada al sujeto y/o adquirir de una red informacion fenotlpica asociada al sujeto.
En el presente documento tambien se proporciona una red, un metodo para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una predisposicion a una enfermedad relacionada con el cancer de colon con un marcador, comprendiendo el metodo las etapas de recibir informacion asociada al marcador, recibir informacion fenotlpica asociada al sujeto, adquirir informacion de la red correspondiente al marcador y/o a la enfermedad relacionada con el cancer de colon y basandose en uno o mas de la informacion fenotlpica, el marcador, y la informacion adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una afeccion previa a una enfermedad relacionada con cancer de colon. El metodo puede comprender ademas la etapa de recomendar un tratamiento concreto para la enfermedad relacionada con el cancer de colon o una afeccion previa a una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En el presente documento tambien se proporciona un metodo de negocio para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una predisposicion a una enfermedad relacionada con el cancer de colon con un marcador, comprendiendo el metodo las etapas de recibir informacion asociada al marcador, recibir informacion fenotlpica asociada al sujeto, adquirir informacion de la red correspondiente al marcador y/o a la enfermedad relacionada con el cancer de colon y basandose en uno o mas de la informacion fenotlpica, el marcador, y la informacion adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cancer de colon o una afeccion previa a una enfermedad relacionada con cancer de colon. El metodo puede comprender ademas la etapa de recomendar un tratamiento concreto para la enfermedad relacionada con el cancer de colon o una afeccion previa a una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
En el presente documento tambien se proporciona una matriz que se puede usar para analizar la expresion de uno o mas genes en la matriz. En una realizacion, la matriz se puede usar para analizar la expresion genica en un tejido para determinar la especificidad tisular de los genes en la matriz. De este modo se puede analizar la expresion de aproximadamente 7.000 o mas genes de forma simultanea. Esto permite desarrollar un perfil que muestre una baterla de genes expresados especlficamente en uno o mas tejidos.
Ademas de esta determination cualitativa, en el presente documento se proporciona la cuantificacion de la expresion genica. Por tanto, se puede determinar no solo la especificidad tisular sino tambien el nivel de expresion de una baterla de genes en el tejido. Por tanto, los genes se pueden agrupar basandose en su expresion tisular per se y el nivel de expresion en dicho tejido. Esto es util para, por ejemplo, determinar la relation de la expresion genica entre tejidos. Por tanto, se puede perturbar un tejido y se puede determinar el efecto sobre la expresion genica en un segundo tejido. En este contexto, se puede determinar el efecto de un tipo celular sobre otro tipo celular en respuesta a un estlmulo biologico.
Dicha determinacion es util para, por ejemplo, conocer el efecto de las interacciones celula-celula a nivel de expresion genica. Si un agente se administra terapeuticamente para tratar un tipo celular pero tiene un efecto indeseable sobre otro tipo celular, el metodo comprende un ensayo para determinar la base molecular del efecto indeseable y, por tanto, proporciona la oportunidad de coadministrar un agente que contrarreste, o de otro modo que trate, el efecto indeseable. De un modo similar, dentro de un unico tipo celular se pueden determinar los efectos biologicos no deseables a nivel molecular. Por tanto, se pueden determinar los efectos de un agente sobre la expresion de otro dirigido al gen diana y se pueden contrarrestar.
En otra realizacion, la matriz se puede usar para monitorizar el curso del tiempo de expresion de uno o mas genes en la matriz. Esto se puede producir en varios contextos biologicos, como se divulga en el presente documento, por ejemplo el desarrollo de una enfermedad relacionada con el cancer de colon, la progresion de una enfermedad relacionada con el cancer de colon y procesos, tales como la transformation celular, asociados a una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
La matriz tambien es util para determinar el efecto de la expresion de un gen o de la expresion de otros genes en la
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misma celula o en celulas diferentes. Esto proporciona, por ejemplo, una seleccion de dianas moleculares alternativas para intervention terapeutica si no se puede regular la diana ultima o corriente abajo.
La matriz tambien es util para determinar patrones de expresion diferenciales de uno o mas genes en celulas normales y anormales. Esto proporciona una baterla de genes que podrlan servir como diana molecular para diagnostico o intervencion terapeutica.
Marcadores sustitutos
Los marcadores pueden servir como marcadores sustitutos de uno o mas trastornos o estados de enfermedad o para afecciones con conducen a un estado de enfermedad relacionada con el cancer de colon. Como se usa en el presente documento, un “marcador sustituto” es un marcador bioqulmico objetivo que se correlaciona con la ausencia o presencia de una enfermedad o trastorno, o con la progresion de una enfermedad o trastorno. La presencia o cantidad de dichos marcadores es independiente de la enfermedad. Por tanto, estos marcadores pueden servir para indicar si un ciclo concreto de tratamiento es eficaz en la remision de un estado de enfermedad o trastorno. Los marcadores sustitutos son de uso concreto cuando la presencia o extension del estado de enfermedad o trastorno es diflcil, de evaluar con las metodologlas estandar o cuando se desea una evaluation de la progresion de una enfermedad antes de alcanzar un criterio de valoracion cllnico potencialmente peligroso.
Los marcadores tambien sin utiles como marcadores farmacodinamicos. Como se usa en el presente documento, un “marcador farmacodinamico” es un marcador bioqulmico objetivo que se correlaciona especlficamente con los efectos del os farmacos. La presencia o cantidad de un marcador farmacodinamico no esta relacionada con el estado de enfermedad o trastorno para el cual se esta administrando el farmaco; por tanto, la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la presencia o actividad del farmaco en un sujeto. Por ejemplo, un marcador farmacodinamico puede ser indicativo de la concentration del farmaco en un tejido biologico, en cuanto a que el marcador se expresa o transcribe o no se expresa ni transcribe en dicho tejido en relation con el nivel del farmaco. De este modo, la distribution o captation del farmaco se puede monitorizar mediante el marcador farmacodinamico. De un modo similar, la presencia o cantidad del marcador farmacodinamico puede estar relacionada con la presencia o cantidad del producto metabolico de un farmaco, de modo que la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la tasa de degradation relativa del farmaco in vivo.
Los marcadores farmacodinamicos son de uso concreto en el aumento de la sensibilidad de la detection de los efectos del farmaco, en particular cuando el farmaco se administra a dosis bajas. Dado que incluso una cantidad pequena de un farmaco puede ser suficiente para activar multiples ciclos de transcription o expresion del marcador, el marcador amplificado puede estar en una cantidad que se puede detectar mas facilmente que el propio farmaco. Asimismo, el marcador puede detectarse con mayor facilidad debido a la naturaleza del propio marcador; por ejemplo, usando los metodos descritos en el presente documento se pueden usar anticuerpos en un sistema de deteccion basada en la inmunidad para un marcador proteico o se pueden usar sondas radiomarcadas especlficas del marcador para detectar un marcador de ARNm. Ademas, el uso de un marcador farmacodinamico puede ofrecer una prediction basada en el mecanismo del riego debido al tratamiento farmacologico mas alla de la serie de posibles observaciones directas.
Protocolos para analisis
El metodo de analisis de enfermedades relacionadas con el cancer de colon comprende, por ejemplo, medir el nivel de expresion de cada marcador genico en una muestra biologica de un sujeto en el tiempo y comparar el nivel con el del gen marcador en una muestra biologica control.
Cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento y el nivel de expresion se expresa de forma diferencial (por ejemplo, mayor o menor que en el control), se considera que el sujeto esta afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Cuando el nivel de expresion del gen marcador entra dentro del intervalo permisible, es improbable que el sujeto este afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
El valor estandar para el control se puede predeterminar midiendo el nivel de expresion del gen marcador en el control con el fin de comparar los niveles de expresion. Por ejemplo, el valor estandar se puede determinar basandose en el nivel de expresion del gen marcador mencionado anteriormente en el control. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el intervalo permisible se toma como ± 2S.D basandose en el valor estandar. Una vez determinado el valor estandar, el metodo de analisis se puede realizar midiendo solo el nivel de expresion en una muestra biologica de un sujeto y comparando el valor con el valor estandar determinado para el control.
Los niveles de expresion de genes marcadores incluyen la transcripcion de los genes marcadores en ARNm y la traduction en protelnas. Por tanto, un metodo de analisis para una enfermedad relacionada con el cancer de colon se realiza basandose en una comparacion de la intensidad de la expresion de ARNm correspondiente a los genes marcadores o el nivel de expresion de protelnas codificadas por los genes marcadores.
La medicion de los niveles de expresion de genes marcadores en el analisis de una enfermedad relacionada con el
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cancer de colon se puede llevar a cabo de acuerdo con varios metodos de analisis genico. Especlficamente se puede usar, por ejemplo, una tecnica de hibridacion usando acidos nucleicos que hibridan con estos genes como sondas o una tecnica de amplificacion genica usando ADN que hibrida con los genes marcadores como cebadores.
Las sondas o cebadores usados para el analisis se pueden disenar basandose en las secuencias nucleotldicas de los genes marcadores. Los numeros de identificacion para las secuencias nucleotldicas de los respectivos genes marcadores se describen en el presente documento.
Ademas, debe entenderse que los genes de animales superiores generalmente acompanan al polimorfismo en una frecuencia elevada. Tambien hay muchas moleculas que producen isoformas que comprenden secuencias de aminoacidos mutuamente diferentes durante el proceso de corte y empalme. Cualquier gen asociado a una enfermedad relacionada con el cancer de colon que tiene una actividad similar a la de un gen marcador esta incluido en los genes marcadores, incluso si tiene diferencias en la secuencia nucleotldica debido al polimorfismo o ser una isoforma.
Tambien debe entenderse que los genes marcadores pueden incluir homologos de otras especies ademas del ser humano. Por tanto, a menos que se especifique lo contrario, la expresion “gen marcador” hace referencia a un homologo del gen marcador unico de la especie o a un gen marcador extrano que se ha introducido en un individuo.
Asimismo, entenderse que un “homologo de un gen marcador” hace referencia a un gen derivado de una especie distinta al ser humano, que puede hibridar con el gen marcador humano como sonda en condiciones rigurosas. Dichas condiciones rigurosas son conocidas para el experto en la tecnica, que puede seleccionar una condition adecuada para producir una rigurosidad igual experimental o emplricamente.
Un polinucleotido que comprende la secuencia nucleotldica de un gen marcador o una secuencia nucleotldica que es complementaria a la hebra complementaria de la secuencia nucleotldica de un gen marcado y tiene al menos 15 nucleotidos, se puede usar como cebador o sonda. Por tanto, una “hebra complementaria” significa una hebra de ADN bicatenario con respecto a la otra hebra y que esta compuesta por los pares de bases A:T (U para ARN) y G:C.
Ademas, "complementario" no solo significa aquellos que son completamente complementarios a una region de al menos 15 nucleotidos seguidos sino tambien aquellos que tienen una homologla de la secuencia nucleotldica de al menos un 40% en ciertos casos, un 50% en ciertos casos, un 60 % in en ciertos casos, un 70 % en ciertos casos, al menos un 80 %, 90 % y 95 % o superior. El grado de homologla entre las secuencias nucleotldicas se puede determinar mediante un algoritmo, BLAST etc.
Estos polinucleotidos son utiles como sonda para detectar un gen marcador o como cebador para amplificar un gen marcador. Cuando se usa como cebador, el polinucleotido comprende normalmente de 15 pb a 100 pb y. en determinadas realizaciones, de 15 pb a 35 pb de nucleotidos. Cuando se usa como sonda, un ADN comprende la totalidad de la secuencia nucleotldica del gen marcador (o la hebra complementaria de la misma) o una secuencia parcial de la misma que tiene al menos 15 pb de nucleotidos. Cuando se usa como cebador, la region 3' debe ser complementaria al gen marcador, mientras que la region 5' se puede unir a una secuencia de reconocimiento para una enzima de restriction o una marca.
Los “polinucleotidos” pueden ser ADN o ARN. Estos polinucleotidos pueden ser de origen natural o sintetico. Asimismo, el ADN usado como sonda para hibridacion normalmente esta marcado. Los expertos en la tecnica entienden facilmente dichos metodos de marcaje. En el presente documento, el termino “oligonucleotido” significa un polinucleotido con un grado relativamente bajo de polimerizacion. Los oligonucleotidos estan incluidos en los polinucleotidos.
Los analisis para una enfermedad relacionada con el cancer de colon usando tecnicas de hibridacion se pueden realizar usando, por ejemplo, hibridacion de tipo Northern, hibridacion por transferencia de puntos o la tecnica de la micromatriz de ADN. Ademas, se pueden usar tecnicas de amplificacion genica, como el metodo de RT-PCR. Usando el metodo de monitorizacion por amplificacion mediante PCR durante la etapa de amplificacion genica en la RT-PCR, se puede conseguir un analisis mas cuantitativo de la expresion de un gen marcador.
En el metodo de monitorizacion por amplificacion mediante PCR, la diana de detection (ADN o transcrito inverso del ARN) hibrida con las sondas marcadas con un pigmento fluorescente y un inactivador que absorbe la fluorescencia. Cuando la PCR procede y la Taq polimerasa degrada la sonda con su actividad exonucleasa 5'-3', el pigmento fluorescente y el inactivador se alejan uno de otro y se detecta la fluorescencia. La fluorescencia se detecta en tiempo real. Midiendo de forma simultanea una muestra estandar en la que se conoce el numero de copias de una diana, es posible determinar el numero de copias de la diana en la muestra sujeto con el numero de ciclo en el que la amplificacion por PCR es lineal. Asimismo, un experto en la tecnica reconoce que el metodo de monitorizacion por amplificacion con PCR se puede llevar a cabo usando cualquier metodo adecuado.
El metodo de analisis para una enfermedad relacionada con el cancer de colon tambien se puede llevar a cabo detectando una protelna codificada por un gen marcador. En lo sucesivo en el presente documento, una protelna
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codificada por un gen marcador se describe como “protelna marcadora”. Para estos metodos de ensayo, por ejemplo el metodo de transferencia Western, el metodo de inmunoprecipitacion y el metodo de ELISA se pueden emplear usando un anticuerpo que se une a cada protelna marcadora.
Los anticuerpos usados en la deteccion que se unen a la protelna marcadora se pueden producir mediante cualquier tecnica adecuada. Asimismo, con el fin de detectar una protelna marcadora, tal como un anticuerpo, se pueden marcar adecuadamente. Como alternativa, en lugar de marcar el anticuerpo, una sustancia que se une especlficamente al anticuerpo, por ejemplo protelna A o protelna G, puede estar marcada para detectar la protelna marcadora de forma indirecta. Mas especlficamente, dicho metodo de deteccion puede incluir el metodo de ELISA.
Una protelna o un peptido parcial de la misma usada como antlgeno se puede obtener, por ejemplo, insertando un gen marcador o una porcion del mismo en un vector de expresion, introduciendo la construccion en una celula huesped adecuada para producir un transformante, cultivar el transformante para expresar la protelna recombinante, y purificar la protelna recombinante expresada del cultivo o del sobrenadante del cultivo. Como alternativa, la secuencia de aminoacidos codificada por un gen o un oligopeptido que comprende una porcion de la secuencia de aminoacidos codificada por un ADNc de longitud completa se sintetizan qulmicamente para usar como inmunogeno.
Ademas, un analisis para una enfermedad relacionada con el cancer de colon se puede realizar usando un Indice no solo el nivel de expresion de un gen marcador sino tambien la actividad de una protelna marcadora en una muestra biologica. La actividad de una protelna marcadora significa la actividad intrlnseca de la protelna. Se pueden usar varios metodos para medir la actividad de cada protelna.
Incluso si no se ha diagnosticado a un paciente como afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon en una prueba de rutina a pesar de los slntomas indicativos de estas enfermedades, si dicho pacientes sufre una enfermedad relacionada con el cancer de colon o no se puede determinar facilmente realizando una prueba de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento.
Mas especlficamente, en determinadas realizaciones, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, un incremento o disminucion del nivel de expresion del gen marcador en un paciente cuyos slntomas sugieren al menos una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con el cancer de colon indica que los slntomas estan causadas principalmente por una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Ademas, las pruebas son utiles para determinar si una enfermedad relacionada con el cancer de colon esta mejorando en un paciente. En otras palabras, los metodos descritos en el presente documento se pueden usar para juzgar el efecto terapeutico de un tratamiento para una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Adicionalmente, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, un incremento o disminucion del nivel de expresion del gen marcador en un paciente con u diagnostico de afectado por una enfermedad relacionada con el cancer de colon implica que la enfermedad ha progresado mas.
La gravedad y/o susceptibilidad a una enfermedad relacionada con el cancer de colon tambien se puede determinar basandose en la diferencia en los niveles de expresion. Por ejemplo, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, el grado de incremento del nivel de expresion del gen marcador se correlaciona con la presencia y/o gravedad de una enfermedad relacionada con el cancer de colon.
Modelos animales
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan modelos animales para una enfermedad relacionada con el cancer de colon, en los que el nivel de expresion de uno o mas genes marcadores o una funcionalidad genica equivalente al gen marcador ha estado elevado en el modelo animal. Un “gen funcionalmente equivalente”, como se usa en el presente documento, generalmente es un gen que codifica una protelna que tiene una actividad similar a una actividad conocida de una protelna codificada por el gen marcador. Un ejemplo representativo de un gen funcionalmente equivalente incluye un homologo de un gen marcador de un animal sujeto, que es intrlnseco del animal.
El modelo animal para una enfermedad relacionada con el cancer de colon es util para detectar cambios fisiologicos debidos a una enfermedad relacionada con el cancer de colon, En ciertas realizaciones, el modelo animal es util para revelar funciones adicionales de genes marcadores y para evaluar farmacos cuyas dianas son los genes marcadores.
En una realizacion, un modelo animal para una enfermedad relacionada con el cancer de colon se puede crear controlando el nivel de expresion de un gen homologo o administrar un gen homologo. El metodo puede incluir crear un modelo animal para una enfermedad relacionada con el cancer de colon controlando el nivel de expresion de un gen seleccionado del grupo de genes descritos en el presente documento. En otra realizacion, el metodo puede incluir crear un modelo animal para una enfermedad relacionada con el cancer de colon administrando la protelna codificada por un gen descrito en el presente documento o administrando un anticuerpo frente a la protelna. Debe entenderse que en otras realizaciones determinadas, el marcador puede estar sobreexpresado de modo que el
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marcador se puede medir usando los metodos adecuados.
En otra realizacion, un modelo animal para una enfermedad relacionada con el cancer de colon se puede crear introduciendo un gen seleccionado de dichos grupos de genes o administrando una protelna codificada por dicho gen.
En otra realizacion, un modelo animal para una enfermedad relacionada con el cancer de colon se puede inducir suprimiendo la expresion de un gen seleccionado de dichos grupos de genes o la actividad de una protelna codificada por dicho gen. Un acido nucleico antisentido, una ribozima o un ARNi se pueden usar para suprimir la expresion. La actividad de una protelna se puede controlar con eficacia administrando una sustancia que inhibe la actividad, tal como un anticuerpo.
El modelo animal es util para aclarar el mecanismo subyacente a una enfermedad relacionada con el cancer de colon y tambien para analizar la seguridad de los compuestos obtenidos mediante cribado. Por ejemplo, cuando un modelo animal desarrolla los slntomas de una enfermedad relacionada con el cancer de colon o cuando un valor medido implicado en una determinada enfermedad relacionada con el cancer de colon se altera en el animal, se puede construir un sistema de cribado para explorar compuestos que tienen actividad para aliviar la enfermedad.
Como se usa en el presente documento, la expresion “un incremento en el nivel de expresion” hace referencia a uno cualquiera de los siguientes: cuando un gen marcador introducido como gen extrano se expresa artificialmente, cuando la transcripcion de un gen marcador intrlnseco al animal sujeto y la traduccion del mismo en la protelna estan potenciados o cuando la hidrolisis de la protelna, que es el producto de la traduccion, esta suprimida. Como se usa en el presente documento, la expresion “una disminucion en el nivel de expresion” se refiere al estado en el cual transcripcion de un gen marcador del animal sujeto y la traduccion del mismo en la protelna estan inhibidos o el estado en el que la hidrolisis de la protelna, que es el producto de la traduccion, esta potenciada. El nivel de expresion de un gen se puede determinar mediante, por ejemplo, una diferencia en la intensidad de la senal en un circuito de ADN. Ademas, la actividad del producto de la traduccion, la protelna, se puede determinar comparando con la del estado normal.
Tambien entra dentro del alcance contemplado que el modelo animal puede incluir animales transgenicos, incluidos, por ejemplo, animales en los que se ha introducido un gen marcador y se ha expresado artificialmente, animales defectivos en el gen marcador y animales defectivos en los que otro gen se ha sustituido por otro gen marcador. Un animal transgenico en el que se ha introducido un acido nucleico antisentido o un gen marcador, una ribozima, un polinucleotido que tiene un efecto de ARNi o un ADN que funciona como acido nucleico senuelo o similar, se puede usar como animal transgenico. Dichos animales transgenicos tambien incluyen, por ejemplo, animales en los que la actividad de una protelna marcadora se ha potenciado o suprimido introduciendo una o mas mutaciones en la region de codificacion del gen o la secuencia de aminoacidos se ha modificado para convertirse en resistente o susceptible a la hidrolisis. Las mutaciones en una secuencia de aminoacidos incluyen sustituciones, deleciones, inserciones y adiciones.
Ademas, la propia expresion de un gen marcador se puede controlar introduciendo una o mas mutaciones en la region reguladora de la transcripcion del gen. Los expertos en la tecnica entienden dicha sustituciones de aminoacidos. Asimismo, el numero de aminoacidos que estan mutados no esta particularmente restringido, siempre que se mantenga la actividad. Normalmente esta en 50 aminoacidos, en ciertas realizaciones no limitantes e 30 aminoacidos, en n10 aminoacidos o en 3 aminoacidos. El sitio de la mutacion puede ser cualquier sitio, siempre que se mantenga la actividad.
En otro aspecto mas, en el presente documento se proporcionan metodos de cribado para compuestos candidatos a agentes terapeuticos para tratar una enfermedad relacionada con el cancer de colon. Uno o mas genes marcadores se seleccionan del grupo de genes descrito en el presente documento. Un agente terapeutico para una enfermedad relacionada con el cancer de colon se puede obtener seleccionando un compuesto capaz de aumentar o disminuir el nivel de expresion del o los genes marcadores.
Debe entenderse que la expresion “un compuesto que aumenta nivel de expresion de un gen” hace referencia a un compuesto que estimula una cualquiera de las etapas de transcripcion genica, traduccion genica o expresion de una actividad proteica. Por otro lado, la expresion “un compuesto que disminuye el nivel de expresion de un gen”, como se usa en el presente documento, hace referencia a un compuesto que inhibe una cualquiera de estas etapas.
En aspectos concretos, el metodo de cribado de un agente terapeutico para una enfermedad relacionada con el cancer de colon se puede llevar a cabo in vivo o Vitro. Este metodo de cribado se puede realizar mediante, por ejemplo, (1) administracion de un compuesto candidato a un sujeto animal; (2) medir el nivel de expresion de uno o mas genes marcadores en una muestra biologica del sujeto animal, o (3) seleccionar un compuesto que aumente o disminuya el nivel de expresion de uno o mas genes marcadores en comparacion con lo observado en un control con el que no se ha puesto en contacto el compuesto candidato
En otro aspecto mas, en el presente documento se proporciona un metodo para evaluar la eficacia de un compuesto candidato para un agente farmaceutico a nivel de expresion de uno o mas genes marcadores poniendo en contacto
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un sujeto animal con el compuesto candidato y monitorizar el efecto del compuesto sobre el nivel de expresion del o los mas genes marcadores en una muestra biologica derivada del sujeto animal. La variacion del nivel de expresion del o los genes marcadores en una muestra biologica del sujeto animal se puede monitorizar usando la misma tecnica que se uso en el metodo de analisis descrito anteriormente. Ademas, basandose en la evaluacion, un compuesto candidato para un agente farmaceutico se puede seleccionar mediante cribado.
Todas las patentes, solicitudes de patente y referencias citadas en el presente documento se incorporan en su totalidad por referencia. Aunque los expertos en la materia han descrito e ilustrado con suficiente detalle la invencion para prepararla y usarla, deberan ser evidentes diversas alternativas, modificaciones y mejoras sin desviarse del esplritu y alcance de la invencion. Un experto en la materia aprecia facilmente que la presente invencion esta bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener las finalidades y ventajas mencionadas, as! como las inherentes en la misma.
Los metodos y reactivos descritos en el presente documento son representativos de las realizaciones preferidas, son ejemplos y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invencion. Los expertos en la tecnica conoceran modificaciones y otros usos. Estas modificaciones entran dentro del esplritu de a invencion y se definen mediante el alcance de las reivindicaciones. Tambien sera evidente para el experto en la tecnica que se pueden realizar varias sustituciones y modificaciones en la invencion divulgada en el presente documento sin desviarse del alcance y el esplritu de la invencion.
Debe entenderse que aunque la presente invencion se ha divulgado especlficamente mediante realizaciones preferidas y caracterlsticas opcionales, los expertos en la materia pueden realizar modificaciones y variaciones de los conceptos divulgados en el presente documento y que dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de la presente invencion, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
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Claims (6)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para determinar un mal pronostico en pacientes con adenocarcinoma de colon en estadio III que estan recibiendo o han recibido quimioterapia basada en fluorouracilo, que comprende:
    medir el nivel de al menos un producto genico de miR-21 en una muestra de ensayo de un paciente con adenocarcinoma de colon,
    determinar un mal pronostico en el paciente con adenocarcinoma de colon cuando hay incremento en al menos el nivel del producto genico de miR-21 en la muestra de ensayo con respecto al nivel de un correspondiente producto genico de miR-21 en una muestra control.
  2. 2. Un metodo de diagnostico in vitro de la presencia de adenocarcinoma de colon en estadio III en un paciente con adenocarcinoma de colon, que comprende:
    determinar un nivel de expresion de al menos un marcador en una muestra de un paciente que tiene adenocarcinoma de colon; incluyendo el al menos un marcador al menos un producto genico de miR-21; comparar el nivel de expresion determinado en la etapa (1) con un nivel de expresion de control del marcador en una muestra de un sujeto que no tiene adenocarcinoma de colon; y
    juzgar que el paciente tiene adenocarcinoma de colon en estadio III cuando el resultado de la comparacion en la etapa (2) indica que: el nivel de expresion del al menos miR-21 en el sujeto de ensayo es mayor que en el control.
  3. 3. Un metodo de diagnostico de si un sujeto tiene una respuesta mala a la quimioterapia adyuvante en un paciente con adenocarcinoma de colon en estadio III, que comprende:
    transcripcion inversa de ARN desde una muestra de ensayo obtenida de un paciente con adenocarcinoma para proporcionar un grupo de oligodesoxinucleotidos diana;
    hibridar los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende sondas oligonucleotldicas especlficas de miRNA-21 para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra de ensayo; y comparar el perfil de hibridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a partir de una muestra control, en donde un incremento en la senal del miR-21 es indicativo de que el sujeto tiene una mala respuesta a la quimioterapia adyuvante en el paciente con adenocarcinoma de colon.
  4. 4. Un metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra es un tejido asociado a cancer de colon.
  5. 5. Un metodo de la reivindicacion 1, en el que la quimioterapia se selecciona de: 5-fluorouracilo; tegafur con uracilo; farmaco de fluorouracilo; farmaco de fluorouracilo-regimen de levamisol; y farmaco de fluorouracilo-regimen de leucovorina.
  6. 6. Un metodo de la reivindicacion 3, en el que la quimioterapia se selecciona de: 5-fluorouracilo; tegafur con uracilo; farmaco de fluorouracilo; farmaco de fluorouracilo-regimen de levamisol; y farmaco de fluorouracilo-regimen de leucovorina.
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