ES2564752T3 - Anticuerpos anti-NGF y procedimientos de uso los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo antagonista anti factor de crecimiento nervioso (NGF) o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento del dolor osteoartrítico en un individuo.

Description

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En otro aspecto, el anticuerpo comprende una o más de una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR) mostrada en SEC ID Nº 61, 63, 18, 19, 30 y 31.

En un aspecto, el anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NGF (tal como NGF humano) con una alta afinidad. En algunas realizaciones, la alta afinidad es (a) unión de NGF con una KD de menos de aproximadamente 2 nM (tal como cualquiera de aproximadamente 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM o menos) y/o una koff más lenta de aproximadamente 6x10-5 s-1); y/o (b) inhibición (reducción y/o bloqueo) de supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de NGF aproximadamente 15 pM) de aproximadamente cualquiera de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM o menos; y/o (c) inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de NGF aproximadamente 1,5 pM) de aproximadamente cualquiera de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM o menos; y/o (d) inhibición (reducción y/o bloqueo) de supervivencia dependiente de NGF de rata de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de NGF aproximadamente 15 pM) de aproximadamente cualquiera de 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM o menos; y/o (e) inhibición (reducción y/o bloqueo) de supervivencia dependiente de NGF de rata de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de NGF aproximadamente 1,5 pM) de aproximadamente cualquiera de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM o menos; y/o (f) unión de NGF con afinidad más alta que el receptor trkA.

En otro aspecto, los anticuerpos (a) se unen a NGF (tal como NGF humano) con una KD de menos de aproximadamente 2 nM (tal como cualquiera de aproximadamente 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM o menos) y/o una koff más lenta de aproximadamente 6x10-5 s-1; y/o (b) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de NGF aproximadamente 15 pM) de aproximadamente cualquiera de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM o menos; y/o (c) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de NGF aproximadamente 1,5 pM) de aproximadamente cualquiera de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM o menos; y/o se unen a NGF con afinidad más alta que el receptor trkA. En algunas realizaciones, los anticuerpos (a) se unen a NGF con una KD de menos de aproximadamente 2 nM; (b) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 100 pM o menos, en la que la CI50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 15 pM; y/o (c) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 10 pM o menos, midiéndose la CI50 en presencia de NGF aproximadamente 1,5 pM, midiéndose la CI50 en presencia de NGF aproximadamente 15 pM. En algunas realizaciones, los anticuerpos (a) se unen a NGF con una KD de menos de aproximadamente 100 pM; (b) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 20 pM o menos, midiéndose la CI50 en presencia de NGF aproximadamente 15 pM; y/o (c) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 2 pM o menos, midiéndose la CI50 en presencia de NGF aproximadamente 1,5 pM.

Como resulta evidente a partir de la descripción del presente documento, se excluyen específicamente de la invención realizaciones de polipéptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de anticuerpo monoclonal de ratón, 911. Las secuencias de CDR extendidas de Mab 911 se muestran en las Figuras 1A y 1B y en SEC ID Nº 9-14.

En algunas realizaciones, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anteriores, adicionalmente estando el anticuerpo aislado. En algunas realizaciones, el anticuerpo está sustancialmente purificado. En otras realizaciones más, el anticuerpo tiene afinidad madurada. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo antagonista. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias marco humanas. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende uno o más restos marco no humanos. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a NGF (tal como NGF humano) con una KD de 2 nM o menos. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una o más (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) sustituciones de aminoácidos humanos en relación con una secuencia de aminoácidos no humana (tal como una secuencia de región variable, tal como una secuencia de CDR, tal como una secuencia marco). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende al menos 1, al menos 2 o más, tal como al menos 3, 4, 5, 6 o más sustituciones de aminoácidos en relación con una secuencia de aminoácidos de polipéptido parental (tal como una secuencia de aminoácidos de anticuerpo 911, tal como una cualquiera o más de SEC ID Nº 9-14). En algunas realizaciones, la afinidad de unión del anticuerpo se ha alterado (en algunas realizaciones se ha aumentado) en relación con la afinidad de un anticuerpo parental (tal como Mab 911). En otras realizaciones más, la afinidad de unión del anticuerpo es más baja que la afinidad de unión del receptor trkA por NGF (tal como NGF humano). En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanos. En otras realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. En otras realizaciones más, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo con afinidad madurada.

La divulgación proporciona polinucleótidos (incluyendo polinucleótido aislado) que comprenden polinucleótidos que codifican cualquiera de las realizaciones anteriores.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica un fragmento o una región del anticuerpo E3 (denominado de forma intercambiable “E3” en el presente documento).

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En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para generar cualquiera de los polipéptidos (tales como anticuerpos) descritos en el presente documento expresando uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo (que puede expresarse de forma separada como una cadena ligera o pesada sencilla, o puede expresarse tanto una cadena ligera como una pesada de un vector) en una célula adecuada, generalmente seguido de recuperación y/o aislamiento del anticuerpo o los polipéptidos de interés.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para antagonizar la actividad biológica de NGF (tal como NGF humano) usando cualquiera de los polipéptidos (incluyendo anticuerpos tales como anticuerpo E3) desvelados en el presente documento. En una realización, el procedimiento comprende poner en contacto el factor de crecimiento nervioso humano con cualquiera de los polipéptidos (incluyendo anticuerpo E3) descritos en el presente documento, por lo que la actividad de NGF (tal como una actividad de factor de crecimiento nervioso humano) se antagoniza, reduce, bloquea o suprime.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para detectar NGF usando cualquiera de los polipéptidos (incluyendo anticuerpos tales como anticuerpo E3) descritos en el presente documento. La presencia de NGF se detecta detectando un complejo entre NGF y cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento (tales como anticuerpo E3). El término “detección” como se usa en el presente documento incluye detección cualitativa y/o cuantitativa (medición de los niveles) con o sin referencia a un control.

En otro aspecto, la invención es una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo E3 o cualquiera de las realizaciones de anticuerpos descritas en el presente documento para su uso en el tratamiento de dolor osteoartrítico.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para prevenir o tratar dolor de artritis reumatoide en un individuo administrando una cantidad eficaz de anticuerpo antagonista anti-NGF al individuo. Se ha mostrado de acuerdo con la divulgación que un anticuerpo antagonista anti-NGF es capaz de inhibir o bloquear el dolor asociado con artritis reumatoide. En algunas realizaciones, el dolor se alivia en un periodo de aproximadamente 24 horas después de la administración del anticuerpo antagonista anti-NGF. En algunas realizaciones, el dolor se alivia en un periodo de aproximadamente 4 días después de administrar el anticuerpo antagonista anti-NGF. En algunas realizaciones, el dolor se alivia antes de observar o en ausencia de un indicio de mejora de la afección inflamatoria en el individuo.

En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para reducir la incidencia de dolor de artritis reumatoide, aliviar el dolor de artritis reumatoide, suprimir el dolor de artritis reumatoide, paliar el dolor de artritis reumatoide y/o retardar la aparición, desarrollo o progresión del dolor de artritis reumatoide en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad eficaz de anticuerpo antagonista anti-NGF al individuo.

En otro aspecto, la invención posibilita el tratamiento del dolor osteoartrítico en un individuo administrando una cantidad eficaz de anticuerpo antagonista anti-NGF al individuo.

En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para tratar caquexia inflamatoria (pérdida de peso) asociada con artritis reumatoide en un individuo que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista anti-NGF. En otro aspecto, la invención posibilita la reducción de la incidencia de dolor osteoartrítico, aliviar el dolor osteoartrítico, suprimir el dolor osteoartrítico, paliar el dolor osteoartrítico y/o retardar la aparición, desarrollo o progresión de dolor osteoartrítico en un individuo, administrando una cantidad eficaz de anticuerpo antagonista anti-NGF al individuo.

En otro aspecto, la divulgación proporciona kits y composiciones que comprenden una cualquiera o más de las composiciones descritas en el presente documento. Estos kits, generalmente en envasado adecuado y proporcionados con instrucciones adecuadas, son útiles para cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.

La invención también proporciona cualquiera de las composiciones y los kits descritos bien en el contexto de su uso como medicamento y/o bien en el de su uso para preparación de un medicamento, en el tratamiento del dolor osteoartrítico en un individuo.

Breve descripción de las figuras

FIGURA 1A: muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo E3 (marcado “6” y “5 + H3 de maduración de afinidad”). Las CDR de Chothia y CDR de Kabat se representan por texto subrayado y texto en negrita y en cursiva, respectivamente. La Figura 1A también muestra el alineamiento de las siguientes secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada; (2) secuencia aceptora de línea germinal humana VH4-59 (marcada “VH4-59” o “2”); (3) las secuencias aceptoras con injertos de las CDR extendidas del anticuerpo de ratón 911 (marcado como “injertado con CDR” o “3”); (4) las secuencias aceptoras con injertos de CDR que incluyen la sustitución V71K (marcada ““3 + una mutación de región marco” o “4”); (5) el clon que contiene CDR H1 y H2 (marcado “5” o “4 + H1, H2 con maduración de afinidad”); y anticuerpo E3 (como se ha descrito anteriormente). FIGURA 1B: muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo E3

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(marcado “5” o “4 + L3 con maduración de afinidad”). Las CDR de Chothia y CDR de Kabat se representan por texto subrayado y texto en negrita y cursiva, respectivamente. La Figura 1B también muestra el alineamiento de las siguientes secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera: (2) secuencia aceptora de línea germinal humana 08 (marcada “O8” o “2”); (3) las secuencias aceptoras con injertos de las CDR extendidas del anticuerpo de ratón 911 (marcadas “injerto de CDR” o “3”); (4) las secuencias aceptoras con injertos de CDR (marcadas ““3 + L1, L2 con maduración de afinidad” o “4”); (5) el clon que contiene CDR L1 y L2 con afinidad madurada (marcado “5” o “4 + L3 con maduración de afinidad”); y el anticuerpo E3 (como se ha descrito anteriormente). FIGURA 2: muestra un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo E3. FIGURA 3: muestra un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo E3. FIGURA 4: es una gráfica que representa supervivencia dependiente de NGF de neuronas E13.5 en presencia de diversas concentraciones de NGF humano y de rata. El eje X corresponde a concentración de NGF (ng/ml) y el eje Y corresponde a neuronas contadas. FIGURA 5: es una gráfica que compara el efecto de bloqueo de NGF de diversos Fab en presencia de NGF humano 0,04 ng/ml (aproximadamente 1,5 pM; mostrado en el panel inferior) o NGF humano 0,4 ng/ml (aproximadamente 15 pM; mostrado en el panel superior). Se evaluó la supervivencia de las neuronas trigeminales de ratón E13.5 en diversas concentraciones de Fab E3; Fab 911 murino; y Fab H19-L129 y Fab 8L2-6D5. La CI50 (en pM) se calculó para cada Fab a cada concentración de NGF y se muestra en la Tabla 9. Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF humano, con una CI50 de aproximadamente 21 pM en presencia de NGF humano 15 pM y una CI50 de aproximadamente 1,2 pM en presencia de NGF humano 1,5 pM. Los Fab 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF humano. En ambos paneles, el eje X corresponde a concentración de anticuerpo (nM) y el eje Y corresponde a neuronas contadas. NGF 1,5 pM estaba cerca de la CI50, mientras que 15 pM representaba una concentración saturante de NGF. FIGURA 6: es una gráfica que compara el efecto de bloqueo de NGF de diversos Fab en presencia de NGF de rata 0,04 ng/ml (aproximadamente 1,5 pM; mostrado en el panel inferior) o NGF de rata 0,4 ng/ml (aproximadamente 15 pM; mostrado en el panel superior). Se evaluó la supervivencia de neuronas trigeminales de ratón E13.5 en diversas concentraciones de Fab E3; Fab 911 murino; y Fab H19-L129 y 8L2-6D5 como se ha descrito anteriormente. Se calculó la CI50 (en pM) para cada Fab a cada concentración de NGF y se muestran en la Tabla 9. Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF humano, con una CI50 de aproximadamente 31,6 pM en presencia de NGF de rata 15 pM y una CI50 de aproximadamente 1,3 pM en presencia de NGF de rata 1,5 pM. Los Fab 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF de rata. NGF 1,5 pM era aproximadamente la CI50, mientras que 15 pM representó una concentración de saturación de NGF. En ambos paneles, el eje de las X corresponde a la concentración de anticuerpo (nM) y el eje Y corresponde a neuronas contadas. FIGURA 7: es una gráfica que representa el dolor en reposo evaluado 24 horas después de la cirugía y que muestra que el tratamiento con anticuerpo anti-NGF E3 0,02 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg o 1 mg/kg redujo el dolor. “*” indica una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,5) del control negativo. FIGURA 8: es una gráfica que representa el dolor en reposo evaluado 24 horas después de la cirugía y que muestra que el tratamiento con anticuerpo anti-NGF E3 0,5 mg/kg redujo significativamente (p < 0,005) el dolor en reposo cuando se inyectó dos horas después de la cirugía. FIGURA 9: es una gráfica que muestra los resultados de análisis de BIAcore de la afinidad de unión con NGF humano del anticuerpo de ratón 911 (Fab). El anticuerpo de ratón 911 se unió a NGF con una KD de 3,7 nM, koff de 8,4 x 10-5 s-1 y kon de 2,2 x 104 Ms-1 . FIGURA 10: es una gráfica que muestra los resultados de análisis de BIAcore de la afinidad de unión por NGF humano del anticuerpo E3 (Fab) (denominado “Fab 3E”). E3 se unió a NGF humano con una KD de aproximadamente 0,07 nM (y con una kon de aproximadamente 6,0 x 145 M-1 s-1 y una koff de aproximadamente 4,2 x 10-5 s-1). FIGURA 11: es una gráfica que representa que el anticuerpo E3 bloquea la interacción de NGF con sus receptores, trkA y p75, según se evalúa por porcentaje de unión detectado entre NGF y trkA (mostrado en círculos negros) y NGF y p75 (mostrado como cuadrados vacíos). El eje X corresponde a la concentración de anticuerpo 3E (Fab) y el eje Y corresponde a unión de NGF (porcentaje de UR máximo). Concentraciones aumentadas de Fab E3 bloquearon la interacción de NGF tanto con p75 como con trkA, como se muestra por la reducción de la señal (medida en UR). Cuando la concentración de anticuerpo E3 (Fab) se igualó con la concentración de NGF no se observó unión de NGF (como se muestra por una señal de cero). FIGURA 12: es una gráfica que representa la capacidad de bloqueo de NGF humano del anticuerpo completo E3 y Fab E3. Se evaluaron la supervivencia de neuronas trigeminales de ratón E13.5 en presencia de NGF humano y diversas concentraciones de Fab E3 y anticuerpo E3. El eje X corresponde a sitios de unión a NGF (nM) y el eje Y corresponde a conteo normalizado de neuronas trigeminales (TG). El anticuerpo completo 3E y Fab E3 mostraron niveles similares de inhibición de supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales cuando la concentración de anticuerpo completo y Fab se normalizaron al número de sitios de unión a NGF (Fab tiene un sitio de unión y el anticuerpo completo tiene dos sitios de unión). FIGURA 13: es una gráfica que representa la capacidad de diversas concentraciones (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032,

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La invención desvelada en el presente documento también posibilita el tratamiento de dolor osteoartrítico en un individuo mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo antagonista anti NGF.

La divulgación también proporciona procedimientos para prevenir y/o tratar dolor de artritis reumatoide en un individuo por administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo antagonista anti-NGF.

La divulgación también proporciona procedimientos para ajustar la afinidad de un anticuerpo y procedimientos para caracterizar una región CDR.

Técnicas generales

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook y col., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffths, y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis y col., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan y col., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley y Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita y col., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

Definiciones

Un “anticuerpo” es una molécula de inmunoglobulina capaz de unión específica con una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígenos, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término abarca no solamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadena sencilla (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígenos. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o subclase de la misma), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse inmunoglobulinas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras subunitarias y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

“Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. En una especie de Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de Fv de cadena sencilla, un dominio variable de cadena pesada y uno de ligera pueden estar ligados covalentemente por un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura dimérica análoga a la de una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración en la que interaccionan tres CDR de cada dominio variable para definir una especificidad de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Sin embargo, incluso un dominio variable sencillo (o la mitad de un Fv que comprende solamente 3 CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque generalmente a una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de fragmentos Fab por la adición de unos pocos restos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de las regiones bisagra de anticuerpo.

Un “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de anticuerpos homogénea en la que el anticuerpo monoclonal está comprendido por aminoácidos (de origen natural y de origen no natural) que están implicados en la unión selectiva de un antígeno. Una población de anticuerpos monoclonales es altamente específica, dirigiéndose contra un sitio antigénico sencillo. La expresión “anticuerpo monoclonal” abarca no solamente anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos

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(PBMC) y linfocitos NK. Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el desvelado en Clynes y col., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Como se usa en el presente documento, “receptor de Fc” y “FcR” describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcRI, FcRII y FcRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcRII incluyen FcRIIA (un “receptor de activación”) y FcRIIB (un “receptor de inhibición”) que tiene secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de las mismas. Se revisan FcR en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel y col., 1994, Immunomethods, 4:25-34; y de Haas y col., 1995, J. Lab Clin. Med. 126:330-41. “FcR” también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y col., 1976, J. Immunol., 117:587; y Kim y col., 1994, J. Immunol., 24:249).

“Citotoxicidad dependiente de complemento” y “CDC” se refiere a la lisis de una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) con una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) en complejo con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Como se usa en el presente documento, los términos “E3”, “3E” y “anticuerpo E3” se usan de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera mostradas en las Figuras 1A (SEC ID Nº: 1) y 1B (SEC ID Nº: 2), respectivamente. Las partes de CDR del anticuerpo E3 (incluyendo CDR de Chothia y Kabat) se representan en diagramas en las Figuras 1A y 1B. Las Figuras 2 y 3 muestran polinucleótidos que codifican cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, que comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera mostradas en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. La generación y caracterización de E3 se describe en los ejemplos. Se asocian funciones biológicas diferentes con E3, incluyendo, pero sin limitación, la capacidad para unirse a NGF e inhibir la actividad biológica de NGF y/o ruta o rutas corriente abajo mediadas por señalización de NGF; y la capacidad para inhibir supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales E13.5 de ratón. Como se analiza en el presente documento, los anticuerpos de la invención pueden tener una cualquiera o más de estas características. En algunas realizaciones, el término “E3” se refiere a la inmunoglobulina codificada por (a) un polinucleótido que codifica cadena ligera de E3 que tiene un número de depósito de ATCC Nº PTA-4893 o ATCC Nº PTA-4894 y (b) un polinucleótido que codifica cadena pesada de E3 que tiene un número de depósito de ATCC Nº PTA-4895.

Como se usa en el presente documento, la unión “inmunoespecífica” de anticuerpos se refiere a la interacción de unión específica de antígeno que se produce entre el sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo y el antígeno específico reconocido por ese anticuerpo (es decir, el anticuerpo reacciona con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas).

Un epítopo que “se une específicamente” o “se une preferentemente” (usados de forma intercambiable en el presente documento) con un anticuerpo o un polipéptido es una expresión bien entendida en la técnica, y también se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar tal unión específica o preferente. Se dice que una molécula muestra “unión específica” o “unión preferente” si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una sustancia o célula particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo “se une específicamente” o “se une preferentemente” con una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferentemente con un epítopo de NGF es un anticuerpo que se une este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otros epítopos de NGF o epítopos no de NGF. También se entiende leyendo esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específica o preferentemente a una primera diana puede unirse o no específica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, la “unión específica” o “unión preferente” no requiere necesariamente (aunque pueda incluir) unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión preferente.

Los términos “polipéptido”, “oligopéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de la presente invención se basan en un anticuerpo, los polipéptidos pueden aparecer como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

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“Polinucleótido” o “ácido nucleico”, como se usa de forma intercambiable en el presente documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, puede transmitirse modificación a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de polimerización, tal como por conjugación con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “extremos”, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, con engarces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con engarces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), las que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), las que contienen alquilantes, con engarces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los azúcares puede reemplazarse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos de protección convencionales o activarse para preparar engarces adicionales a nucleótidos adicionales o pueden conjugarse con soportes sólidos. El OH 5’ y 3’ terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de protección orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos de protección convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen en general en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2’-O-metil, 2’O-alil, 2’-fluoro o 2’-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares -anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metil ribósido. Uno o más engarces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero sin limitación, realizaciones en las que el fosfato se reemplaza por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), “(O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR’, CO o CH2 (“formacetal”), en los que cada R o R’ es de forma independiente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un engarce éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los engarces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.

Una “región variable” de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera de anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, sola o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat y col. Sequences of Protein of Immunological Interest, (5ª ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia y col (1989) Nature 342:877; Al-lazikani y col (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Como se usa en el presente documento, una CDR puede referirse a CDR definidas por uno de los enfoques o por una combinación de ambos enfoques.

Una “región constante” de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, sola o en combinación.

Como se usa en el presente documento, la expresión “factor de crecimiento nervioso” y “NGF” se refiere al factor de crecimiento nervioso y variantes del mismo que conservan al menos parte de la actividad biológica de NGF. Como se usa en el presente documento, NGF incluye todas las especies de mamífero de NGF de secuencia nativa, incluyendo humano, canino, felino, equino o bovino.

El “receptor de NGF” se refiere a un polipéptido que se une a o se activa por NGF. Los receptores de NGF incluyen el receptor TrkA y el receptor p75 de cualquier especie de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, humano, canino, felino, equino, primate o bovino.

Como se usa en el presente documento, un “anticuerpo antagonista anti-NGF” (denominado de forma intercambiable “anticuerpo anti-NGF”) se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a NGF e inhibir la actividad biológica de NGF y/o ruta o rutas corriente abajo mediadas por señalización de NGF. Un anticuerpo antagonista anti-NGF abarca anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluyendo de forma significativa) la actividad biológica de NGF, incluyendo rutas corriente abajo mediadas por señalización de NGF, tales como unión del receptor y/o inducción de una respuesta celular a NGF. Para el fin de la presente invención, se entenderá explícitamente que la expresión “anticuerpo antagonista anti-NGF” abarca todas las expresiones, títulos y estados funcionales y características identificados previamente por los que el NGF en sí mismo, una actividad biológica de NGF (incluyendo pero sin limitación su capacidad para mediar cualquier aspecto del dolor postquirúrgico) o las consecuencias de la actividad biológica, se anulan, reducen o neutralizan sustancialmente en cualquier grado

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significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NGF y evita la dimerización de NGF y/o unión a un receptor de NGF (tal como p75 y/o trkA). En otras realizaciones, un anticuerpo anti-NGF se une a NGF y evita la dimerización del receptor trkA y/o autofosforilación de trkA. Se proporcionan en el presente documento ejemplos de anticuerpos antagonistas anti-NGF.

“Actividad biológica” de NGF se refiere en general a la capacidad para unirse a receptores de NGF y/o activar rutas de señalización de receptor de NGF. Sin limitación, una actividad biológica incluye una cualquiera o más de las siguientes: la capacidad para unirse a un receptor de NGF (tal como p75 y/o trkA); la capacidad para promover la dimerización del receptor trkA y/o autofosforilación; la capacidad para activar una ruta de señalización del receptor de NGF; la capacidad para promover la diferenciación, proliferación, supervivencia, crecimiento celular y otros cambios en la fisiología celular, incluyendo (en el caso de neuronas, incluyendo neurona periférica y central) cambio en la morfología neuronal, sinaptogénesis, función sináptica, liberación de neurotransmisor y/o neuropéptido y regeneración después de daño; la capacidad para promover la supervivencia de neuronas trigeminales E13.5 de ratón; y la capacidad para mediar en el dolor, incluyendo dolor postquirúrgico.

Como se usa en el presente documento, “sustancialmente puro” se refiere a material que es al menos 50 % puro (es decir, sin contaminantes), más preferentemente al menos 90 % puro, más preferentemente al menos 95 % puro, más preferentemente al menos 98 % puro, más preferentemente al menos 99 % puro.

Una “célula huésped” incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido receptor de vector o vectores para la incorporación de insertos polinucleotídicos. Las células huésped incluyen descendencia de una célula huésped sencilla, y la descendencia puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula parental original debido a mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, “tratamiento” es un enfoque para obtener resultados clínicos deseados o beneficiosos. Para fines de la presente invención, los resultados beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: mejora o alivio de cualquier aspecto del dolor, incluyendo dolor agudo, crónico, inflamatorio, neuropático, postquirúrgico, dolor de artritis reumatoide o dolor osteoartrítico. Para fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: incluyendo reducir la gravedad, alivio de uno o más síntomas asociados con dolor incluyendo cualquier aspecto del dolor (tales como acortamiento de la duración del dolor, reducción de la sensibilidad o sensación de dolor).

Una “cantidad eficaz” de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados incluyendo resultados clínicos tales como alivio o reducción de la sensación de dolor. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones. Para fines de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para tratar, aliviar, reducir la intensidad de y/o evitar el dolor, incluyendo dolor postquirúrgico, dolor de artritis reumatoide y/o dolor osteoartrítico. En algunas realizaciones, la “cantidad eficaz” puede reducir el dolor en reposo (dolor de reposo)

o dolor inducido mecánicamente (incluyendo dolor después de movimiento) o ambos, y puede administrarse antes, durante o después de una incisión, corte, desgarro o lesión y/o antes, durante o después del estímulo doloroso. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no conseguirse junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, una “cantidad eficaz” puede considerarse en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un agente sencillo se proporciona en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes adicionales, puede conseguirse o se consigue un resultado deseable.

“Reducir la incidencia” de dolor significa cualquiera de reducir la gravedad (que puede incluir reducir la necesidad de y/o cantidad de (por ejemplo, exposición a) otros fármacos y/o terapias usados generalmente para estas afecciones, incluyendo, por ejemplo, opiáceos), duración y/o frecuencia (incluyendo, por ejemplo, retardar o aumentar el tiempo hasta dolor postquirúrgico en un individuo). Como se entiende por el experto en la materia, los individuos pueden variar con respecto a su respuesta a tratamiento y, como tales, por ejemplo, un “procedimiento para reducir la incidencia del dolor de artritis reumatoide o dolor osteoartrítico en un individuo” refleja administrar el anticuerpo antagonista anti-NGF basándose en una expectativa razonable de que dicha administración pueda provocar probablemente una reducción tal de la incidencia en ese individuo particular.

“Aliviar” un dolor o uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor de artritis reumatoide o dolor osteoartrítico) significa una reducción o mejora de uno o más síntomas de un dolor en comparación con no administrar un anticuerpo antagonista anti-NGF. “Aliviar” también incluye acortamiento o reducción de la duración de un síntoma.

“Paliar” un dolor o uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor de artritis reumatoide o dolor osteoartrítico) significa reducir el alcance de una o más manifestaciones clínicas no deseables de dolor postquirúrgico en un individuo o población de individuos tratados con un anticuerpo antagonista anti-NGF de acuerdo con la invención.

Como se usa en el presente documento, “retardar” el desarrollo del dolor significa aplazar, impedir, ralentizar,

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retardar, estabilizar y/o posponer la progresión de dolor, tal como dolor post-quirúrgico, dolor de artritis reumatoide o dolor osteoartrítico. Este retardo puede ser de diversas longitudes de tiempo, dependiendo del historial de la enfermedad y/o los individuos que se tratan. Como resulta evidente para un experto en la materia, un retardo suficiente o significativo puede, de hecho, abarcar prevención, por que el individuo no desarrolla dolor. Un procedimiento que “retarda” el desarrollo del síntoma es un procedimiento que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un periodo de tiempo dado y reduce el alcance de los síntomas en un periodo de tiempo dado, en comparación con no usar el procedimiento. Tales comparaciones se basan típicamente en estudios clínicos, usando un número estadísticamente significativo de sujetos.

“Dolor” como se usa en el presente documento se refiere a dolor de cualquier etiología, incluyendo dolor agudo y crónico, y cualquier dolor con un componente inflamatorio. Los ejemplos de dolor incluyen dolor post-quirúrgico, dolor post-operatorio (incluyendo dolor dental), migraña, cefalea y neuralgia del trigémino, dolor asociado con quemadura, herida o piedra en el riñón, dolor asociado con traumatismo (incluyendo lesión traumática de la cabeza), dolor neuropático, dolor asociado con trastornos musculo esqueléticos tales como artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis anquilosante, artropatías seronegativas (no reumatoides), reumatismo no articular y trastornos periarticulares, y dolor asociado con cáncer (incluyendo “dolor inter-recurrente” y dolor asociado con cáncer terminal), neuropatía periférica y neuralgia post-herpética. Los ejemplos de dolor con un componente inflamatorio (además de los descritos anteriormente) incluyen dolor reumático, dolor asociado con mucositis y dismenorrea.

“Dolor post-quirúrgico” (denominado de forma intercambiable “post-incisional” o “dolor post-traumático”) se refiere a dolor que surge o resulta de un traumatismo externo tal como un corte, punción, incisión, desgarro o herida en tejido de un individuo (incluyendo el que surge de todos los procedimientos quirúrgicos, bien invasivos o bien no invasivos). Como se usa en el presente documento, el dolor post-quirúrgico no incluye dolor que aparezca (surja o se origine) sin un traumatismo físico externo. En algunas realizaciones, el dolor post-quirúrgico es dolor interno o externo (incluyendo periférico) y la herida, corte, traumatismo, desgarro o incisión puede producirse accidentalmente (como con una herida traumática) o deliberadamente (como con una incisión quirúrgica). Como se usa en el presente documento, “dolor” incluye nocicepción y la sensación de dolor, y el dolor puede evaluarse de forma objetiva y subjetiva, usando puntuaciones de dolor y otros procedimientos bien conocidos en la técnica. El dolor post-quirúrgico, como se usa en el presente documento, incluye alodinia (es decir, aumento de la respuesta a un estímulo normalmente no nocivo) e hiperalgesia (es decir, aumento de la respuesta a un estímulo normalmente nocivo o desagradable), que puede, a su vez, ser de naturaleza térmica o mecánica (táctil). En algunas realizaciones, el dolor se caracteriza por sensibilidad térmica, sensibilidad mecánica y/o dolor en reposo. En algunas realizaciones, el dolor post-quirúrgico comprende dolor inducido de forma mecánica o dolor en reposo. En otras realizaciones, el dolor post-quirúrgico comprende dolor en reposo. El dolor puede ser dolor primario o secundario, como se conoce bien en la técnica.

Una “muestra biológica” abarca una diversidad de tipos de muestras obtenidos de un individuo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o de control. La definición abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólidas tales como una muestra de ensayo de biopsia o cultivos tisulares o células derivadas de los mismos, y la descendencia de los mismos. La definición también incluye muestras que se han manipulado de cualquier manera después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o inclusión en una matriz sólida o semi-sólida para fines de sección. La expresión “muestra biológica” abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras tisulares.

Un “individuo” es un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja (tales como vacas), animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.

Como se usa en el presente documento, “vector” significa una construcción, que es capaz de suministrar, y preferentemente expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, vectores plasmídicos, cosmídicos o de fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas tales como células productoras.

Como se usa en el presente documento, “secuencia de control de la expresión” significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión se liga operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir.

Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier material que, cuando se combina con un principio activo, permite que el ingrediente conserve actividad biológica y no es sensible al sistema inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Son diluyentes preferidos para aerosol o administración parenteral, solución salina tamponada con fosfato o solución salina normal (0,9 %). Las composiciones que

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polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de ATCC Nº PTA-4893 o ATCC Nº PTA-4894. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que se codifica por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de ATCC Nº PTA-4895. La presente invención también abarca diversas formulaciones de E3 y fragmentos de anticuerpo equivalentes (por ejemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc.), cadena sencilla (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de E3 que comprenda un sitio de reconocimiento de antígenos (NGF) de la especificidad requerida. Los anticuerpos equivalentes de E3, incluyendo fragmentos polipeptídicos (que pueden o no ser anticuerpos) y de anticuerpos de E3, y polipéptidos que comprenden fragmentos polipeptídicos de E3 se identifican y caracterizan por cualquiera (uno o más) de los criterios descritos anteriormente.

En consecuencia, la invención proporciona cualquiera de los siguientes, o composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de los siguientes: (a) anticuerpo E3; (b) un fragmento o una región del anticuerpo E3; (c) una cadena ligera del anticuerpo E3 como se muestra en la Figura 1B; (c) una cadena pesada del anticuerpo E3 como se muestra en la Figura 1A; (d) una o más regiones variables de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo E3; (e) una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR) del anticuerpo E3 mostradas en las Figuras 1A y 1B; (f) CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostrada en la Figura 1A; (g) CDR L3 de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostrada en la Figura 1B; (h) tres CDR de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostradas en la Figura 1B; (i) tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostradas en la Figura 1A; (j) tres CDR de la cadena ligera y tres CDR de la cadena pesada, del anticuerpo E3 mostradas en las Figuras 1A y 1B; y (k) un anticuerpo que comprende uno cualquiera de (b) a (j). Como resulta evidente a partir de la descripción del presente documento, se excluyen específicamente de la invención realizaciones de polipéptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de ratón 911. Las secuencias de CDR extendidas de Mab 911 se muestran en las Figuras 1A y 1B, y en SEC ID Nº 9

14.

Las partes de CDR del anticuerpo E3 (incluyendo CDR de Chothia y Kabat) se representan en forma de diagrama en las Figuras 1A y 1B, y consisten en las secuencias de aminoácidos: (a) CDR 1 de cadena pesada (“CDR H1”) GFSLIGYDLN (SEC ID Nº 3); (b) CDR 2 de cadena pesada (“CDR H2”) IIWGDGTTDYNSAVKS (SEC ID Nº 4); (c) CDR 3 de cadena pesada (“CDR H3”) GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº 5); (d) CDR 1 de cadena ligera (“CDR L1”) RASQSISNNLN (SEC ID Nº 6); (e) CDR 2 de cadena ligera (“CDR L2”) YTSRFHS (SEC ID Nº 7); y (f) CDR 3 de cadena ligera (“CDR L3”) QQEHTLPYT (SEC ID Nº 8). La determinación de regiones CDR está dentro de la experiencia de la técnica. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR de Kabat y de Chothia (también denominadas “CDR combinadas” o “CDR extendidas”). En algunas realizaciones, las CDR comprenden las CDR de Kabat. En otras realizaciones las CDR son las CDR de Chothia.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una CDR que es sustancialmente homóloga de al menos una CDR, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos 5 CDR de E3 (o, en algunas realizaciones sustancialmente homóloga de las 6 CDR de E3, o derivada de E3). Otras realizaciones incluyen anticuerpos que tienen al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR que son sustancialmente homólogas de al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de E3 o derivadas de E3. Se entiende que, para fines de la presente invención, la especificidad de unión y/o actividad global (que puede estar en términos de tratamiento y/o prevención del dolor o inhibición de la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales de ratón E13.5) se conserva en general, aunque el alcance de la actividad puede variar en comparación con E3 (puede ser mayor o menor).

La invención también proporciona un polipéptido (que puede ser o no un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos de E3 (mostrada en las Figuras 1A y 1B) que tiene cualquiera de los siguientes: al menos 5 aminoácidos contiguos, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos, de una secuencia de E3, en la que al menos 3 de los aminoácidos son de una región variable de E3, con el entendimiento de que se excluyen específicamente las realizaciones que consisten en la secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de anticuerpo monoclonal de ratón 911. Las secuencias de CDR extendidas de Mab 911 se muestran en las Figuras 1A y 1B, y en SEC ID Nº 9-14. En una realización, la región variable es de una cadena ligera de E3. En otra realización, la región variable es de una cadena pesada de E3. En otra realización, los 5 (o más) aminoácidos contiguos son de una región determinante de complementariedad (CDR) de E3 mostrada en las Figuras 1A y 1B.

En otra realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de E3 que tiene cualquiera de los siguientes: al menos 5 aminoácidos contiguos, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos, de una secuencia de E3, en los que en la secuencia de E3 comprende uno cualquiera o más de: resto de aminoácido L29 de CDRH1, I50 de CDRH2, W101 de CDRH3 y/o A103 de CDRH3; y/o resto de aminoácido S28 de CDRL1, N32 de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E de CDRL3 y/o H92

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adecuado que contenga polinucleótido que codifique el scFv en una célula huésped adecuada, eucariota, tal como células de levadura, vegetales, de insecto o de mamífero, o procariota, tal como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés pueden prepararse por manipulaciones rutinarias tales como ligación de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse usando técnicas de purificación de proteínas convencionales conocidas en la materia.

También se abarcan otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que se expresan dominios VH y VL en una cadena polipeptídica sencilla, pero usando un engarce que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y col. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA

90: 6444-6448; Poljak, R. J., y col. (1994) Structure 2: 1121-1123).

El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoclonal que tiene especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Un anticuerpo biespecífico puede prepararse usando los anticuerpos desvelados en el presente documento. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo Suresh y col., 1986, Methods in Enzymology 121: 210). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basó en la co-expresión de dos pares de cadena ligeracadena pesada de inmunoglobulina, teniendo las dos cadenas pesadas diferentes especificidades (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acuerdo con un enfoque para preparar anticuerpos biespecíficos, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente está con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene sitio necesario para unión a cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son de importancia particular.

En un enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporcionan una segunda especificidad de unión) en la otra rama. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina solo en una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas. Este enfoque se describe en la Publicación de PCT Nº WO 94/04690, publicada el 3 de marzo de 1994.

Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente, también están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos se han usado para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980) y para tratamiento de infección por VIH (publicación de solicitud de PCT Nº WO 91/00360 y WO 92/200373; documento EP 03089). Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Se conocen bien en la materia agentes y técnicas de reticulación adecuados, y se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, como se conoce en la técnica, y como se describe en el presente documento.

Los anticuerpos pueden modificarse como se describe en la Publicación de PCT Nº WO 99/58572, publicada el 18 de noviembre de 1999. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula diana, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga de todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Estos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula diana sin desencadenar lisis dependiente de complementos significativa o destrucción mediada por células de la diana. Preferentemente, el dominio efector es capaz de unirse específicamente a FcRn y/o FcRIIb. Estos se basan típicamente en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humanos. Se prefieren anticuerpos modificados de esta manera para su uso en terapia de anticuerpos crónica, para evitar reacciones inflamatorias u otras adversas a terapia de anticuerpos convencional.

La invención abarca modificaciones del anticuerpo E3, incluyendo anticuerpos funcionalmente equivalentes que no afectan de forma significativa a sus propiedades y variantes que tienen actividad potenciada o reducida. La modificación de polipéptidos es práctica rutinaria en la técnica y se ejemplifica adicionalmente en los Ejemplos. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones (incluyendo sustituciones conservativas) de restos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian de

23

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5

10

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30

35

(continuación)

His (H)

Arg Asn; Gln; Lys; Arg

Ile (I)

Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina

Leu (L)

Ile Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe

Lys (K)

Arg Arg; Gln; Asn

Met (M)

Leu Leu; Phe; Ile

Phe (F)

Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr

Pro (P)

Ala Ala

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Ser Ser

Trp (W)

Tyr Tyr; Phe

Tyr (Y)

Phe Trp; Phe; Thr; Ser

Val (V)

Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina

Se consiguen modificaciones sustanciales de las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades de cadena lateral comunes:

(1)

Hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2)

Hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;

(3)

Ácidos: Asp, Glu;

(4)

Básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5)

Restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

(6)

Aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Se realizan sustituciones no conservativas intercambiando un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo, también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar reticulación aberrante. Por el contrario, puede añadirse enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv.

Las modificaciones de aminoácidos pueden variar de cambiar o modificar uno o más aminoácidos a rediseño completo de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unión y/o especificidad. En alguna realización, se realizan no más de una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de un dominio CDR. En otras realizaciones, se realizan no más de una a tres sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de un dominio CDR3. En otras realizaciones más, el dominio CDR es CDRH3 y y/o CDR L3.

Las modificaciones también incluyen polipéptidos glucosilados y no glucosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones post-traduccionales, tales como, por ejemplo, glucosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos se glucosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15: 26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd y col., 1996, Mol. Immunol. 32: 1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) y la interacción intramolecular entre partes de la glucoproteína, que puede afectar a la conformación y superficie tridimensional presentada de la glucoproteína (Hefferis y Lund, mencionado anteriormente; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7: 409-416). Los oligosacáridos también pueden actuar para dirigir una glucoproteína dada a ciertas moléculas basándose en estructuras de reconocimiento específicas. También se ha indicado que la glucosilación de anticuerpo afecta a citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, se ha indicado que células CHO con expresión regulada por tetraciclina de  (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc de bisección, han mejorado la actividad de ADCC (Umana y col., 1999, Mature Biotech. 17: 176-180).

25

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(continuación)

L97

RASQSISNQLN (SEC ID Nº:22) YVSRFHS (SEC ID Nº 23) 5,6e4 14

L81

RAFQAISNQLN (SEC ID Nº 24) YISRFHT (SEC ID Nº 25) 7,4e4 18

L6

RAFQSISNQLN (SEC ID Nº 26) YASRFHS (SEC ID Nº 27) 8,2e4 20

8L2-6D5 (control)

GFSLIGYDIN (SEQ ID Nº 9) MIWGDGTTDYNSAL (SEC ID Nº 10) 1e-3 25

H109

GFSLIGYDSN (SEC ID Nº 28) IIWGDGTTDYNSAL (SEC ID Nº 29) 1,6e4 4

H19

GFSLIGYDLN (SEC ID Nº 30) IIWGDGTTDYNSAV (SEC ID Nº 31) 2,4e4 6

H222

GFSLIGYDVT (SEC ID Nº 32) GIWGDGTTDYNSAV (SEC ID Nº 33) 3,8e4 9,5

H225

GFSLIGYDVT (SEC ID Nº 34) GIWGDGTTDYNSSV (SEC ID Nº 35) 3,8e4 9,5

H18

GFSLIGYDAT (SEC ID Nº 36) GIWGDGTTDYNSAV (SEC ID Nº 37) 4,2e4 10,5

H9

GFSLIGYDVS (SEC ID Nº 38) IIWGDGTTDYNSSV (SEC ID Nº 39) 4,1e4 10,2

H227

GFSLIGYDIS (SEC ID Nº 40) QIWGDGTTDYNSSV (SEC ID Nº 41) 5,4e4 13,5

H17

GFSLIGYDAS (SEC ID Nº 42) GIWGDGTTDYNSSV (SEC ID Nº 43) 6,1e4 15,2

H28

GFSLIGYDST (SEC ID Nº 44) SIWGDGTTDYNSAL (SEC ID Nº 45) 7,5e4 18,7

Los aminoácidos en negrita se seleccionaron de forma aleatoria como se ha indicado anteriormente *KD calculada usando kon 4e4 M-1s-1 **Por conveniencia, “e” como se usa en el presente documento indica “x10”. Por lo tanto, 4e4 significa de forma intercambiable 4x104 .

Las CDR que contenían las siguientes sustituciones conservaron la unión: CDR-H1

134: S, L, V, I y A unido. 5 N35: N, T y S unido.

CDR-H2

M50: M, I, G, Q, S L unido. A62: A y S unido. L63: L y V unido.

10 CDR-L1

S26: S y F unido. D28: D, S, A, Y unido. H32: H, N, Q unido.

50

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Tabla 6.

Mutaciones de CDR H3 (molde 8L2-6D5, que incluye la secuencia de aminoácidos CDR-H3 del anticuerpo 911: GGYYYGTSYYFDY (SEC ID Nº 11))

koff(s-1) 1E-3 KD’(nM) 25

Y100L

1,2E-3 30

Y100R

1,1E-3 27

Y101W

5,6E-4 14

G103A

1,6E-4 4

T104S

2,2E-3 55

S105A

5,1E-4 13

S105T

6,4E-4 16

Y106R

1,6E-3 40

Y106T

2,0E-3 50

Y106M

2,7E-3 67

Y107F

1,4E-3 35

F108W

1,22E-3 30

D109N

1,5E-3 37

D109G

1E-3 25

Y110K

1,4E-3 35

Y110S

1,5E-3 37

Y110R

1,6E-3 40

Y110T

1,7E-3 42

S91E

2,5E-4 6

Y96R

1,7E-3 42

*KD calculada usando kon 4e4 M-1s -1

Varias mutaciones dieron como resultado afinidad de unión aumentada. Al menos las siguientes mutaciones dieron como resultado afinidad de unión significativamente aumentada en comparación con el molde 8L2-6D5: (H_Y101W (secuencia de CDR GGYWYGTSYYFDY (SEC ID Nº 46)); H_S105A (secuencia de CDR GGYYYGTAYYFDY (SEC

5 ID Nº 47)); H_S105T (secuencia de CDR GGYYYGTTYYFDY (SEC ID Nº 48)); H_G103A (secuencia de CDR GGYYYATSYYFDY (SEC ID Nº 49); y L_S91E (secuencia de CDR QQEKTLPYT (SEC ID Nº 50)).

Los resultados de este experimento se usaron para guiar la selección de posiciones de aminoácidos para generación de las bibliotecas de maduración de afinidad.

Este experimento también proporcionó información con respecto a la frecuencia de sustituciones de aminoácidos en

10 cualquier posición dada que dieron como resultado unión mejorada, la misma unión, peor unión o ninguna unión, como se muestra en la Tabla 5. Esta información permitió la identificación de posiciones de aminoácidos en las CDR que podrían cambiarse a muchos aminoácidos diferentes (incluyendo los 20 aminoácidos) y posiciones en las CDR que podrían cambiarse a unos pocos aminoácidos o muy pocos aminoácidos (en algunas realizaciones, ningún aminoácido). Estos resultados también demostraron sustituciones de aminoácidos que aumentaron la afinidad de

15 unión.

(b) Maduración de afinidad

A continuación, los resultados del análisis de selección aleatoria de bibliotecas pequeñas (anteriormente) se usaron para seleccionar restos para producción de las bibliotecas H3 y L3 para maduración de afinidad de las CDR H3 y L3.

53

Los restos Y101 y G103 de CDR H3 y restos S91 y K92 de CDR L3 se seleccionaron para producción de las bibliotecas H3 y L3 para maduración de afinidad de las CDR H3 y L3.

Está biblioteca combinó mutaciones en H3 y L3 a la vez en el clon con injerto de CDR 8L2-6D5, y de forma separada en el fondo de H19-L129, y tuvo una diversidad de 80 clones diferentes. La Tabla 7 muestra los restos de 5 aminoácidos seleccionados para sustitución y los aminoácidos que se sustituyeron en cada posición.

Tabla 7. Restos de aminoácidos en H3 y L3 seleccionados para sustitución y los aminoácidos que se sustituyeron en cada posición

CDR-H3:

Y101 se cambió a Y y W, C. (obsérvese que se incluyó C porque el uso de codón TRS en un oligonucleótido degenerado también generaba codón C).

G103 se cambió a A, P, S

CDR-L3:

S91 se cambió a E.

K92 se cambió a los veinte aminoácidos. A, R, K y H unidos.

Cada polipéptido se expresó como un Fab y la afinidad por NGF humano de 96 clones individuales se exploró para cada biblioteca usando análisis de BIACORE de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se ha descrito

10 anteriormente. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8.

Mutaciones de COMBINACIÓN de CDR L3 H3 (molde 8L2-6D5)

koff (s-1) 1E-3 KD* (nM) 25

L_S91E; L_K92A(secuencia de CDR QQEATLPYT (SEC ID Nº 51))H_Y101W; H_G103A(secuencia de CDR GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº 52))

5,5E-4 13

L_S91E; L_K92R(secuencia de CDR QQERTLPYT (SEC ID Nº 53))H_Y101W; H_G103A(secuencia de CDR GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº 54))

1,0E-4 25

Mutaciones de COMBINACIÓN de CDR L3 H3 (molde H19-L129, H1H2L1L2 madurado)

koff (s1)1,1e-4 KD* (nM)

L_S91E; L_K92H(secuencia de CDR QQEHTLPYT (SEC ID Nº 55))H_Y101W; H_G103A(secuencia de CDR GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº 56))(CLONE E3)

1,2E-5 0,3

L_S91E; L_K92S(secuencia de CDR QQESTLPYT (SEC ID Nº 57))H_Y101W; H_G103S(secuencia de CDR GGYWYSTSYYFDY (SEC ID Nº 58))

4,7E-5 1,1

L-S91E; L_K92K(secuencia de CDR QQEKTLPYT (SEC ID Nº 59)) H_Y101Y; H_G103A(secuencia de CDR GGYYYATSYYFDY (SEC ID Nº 60))

2E-5 0,5

L_S91E; L_K92R(secuencia de CDR QQERTLPYT (SEC ID Nº 61))H_Y101W; H_G103A(secuencia de CDR GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº 62))(CLONE 3C)

1,4E-5 0,35

L_S91E; L_K92R(secuencia de CDR QQERTLPYT (SEC ID Nº 63))H_Y101Y; H_G103A(secuencia de CDR GGYYYATSYYFDY (SEC ID Nº 64))

1,5E-5 0,37

*KD calculada usando kon 4e4 M-1s -1

54

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más temprano ensayado) la intensidad de vocalización cayó en 90 %. El tratamiento con concentraciones más bajas de E3 también proporcionó alivio robusto del dolor, aunque a dosis más bajas el alivio del dolor tardó algo más en manifestarse. Es probable que la reducción aparente de la eficacia el día 24 de todas las dosis excepto la más alta ensayadas se deba a un aumento del nivel real de E3 en plasma secundario a una respuesta inmune por las ratas objeto. Resulta evidente que dosis tan bajas como 0,003 mg/kg proporcionan al menos alivio parcial del dolor en este modelo.

Tabla 21. Efectos de diferentes dosis de E3 en el peso corporal en ratas artríticas reumatoides (normalizado al día 14).

Día 14

No Artríticas Media E.T.M 100,00 0,00 Vehículo Media E.T.M 100,00 0,00 0,003 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 0,01 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 0,03 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00

15 16

99,53 0,30 102,52 0,45 99,14 0,37 99,57 0,60 99,20 0,48 99,58 0,79 99,18 0,43 99,33 0,72 100,34 0,36 100,89 0,57

17 18

103,31 0,41 106,11 0,72 99,50 0,64 100,26 0,93 100,46 0,77 100,90 1,19 99,69 0,73 100,69 0,72 101,80 0,82 102,70 0,92

20 21

109,62 0,85 110,52 0,93 101,46 1,22 102,73 1,49 102,26 1,58 103,16 1,87 102,70 1,07 102,63 1,18 104,51 0,75 105,08 0,98

23 24

114,28 1,19 115,44 1,15 104,54 1,92 105,12 1,92 106,09 1,67 106,16 1,90 104,41 1,33 104,23 1,46 106,14 1,06 106,23 1,26

Día 14

0,1 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 0,3 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 1,0 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 5,0 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00

15 16

99,83 0,59 101,07 0,82 101,05 0,38 102,88 0,50 100,53 0,37 102,95 0,56 101,61 0,41 104,09 0,60

17 18

101,89 1,12 103,69 1,47 104,76 0,70 107,11 0,78 105,74 0,76 108,46 0,82 106,85 0,79 109,53 1,00

20 21

107,36 1,78 108,50 2,01 111,26 0,77 113,31 0,87 113,57 0,83 116,71 0,92 115,32 1,11 119,11 1,21

23

109,25 2,15 115,59 1,38 123,35 1,13 126,36 1,94

24

108,77 2,08 115,58 1,43 124,41 1,00 127,25 1,79

72

Tabla 22. Efectos de diferentes dosis de E3 en el peso corporal en ratas artríticas reumatoides (normalizado al día 0).

Día 0

No Artríticas Media E.T.M 100,00 0,00 Vehículo Media E.T.M 100,00 0,00 0,003 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 0,01 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 0,03 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00

1 2

100,45 0,19 105,94 0,33 98,34 0,48 101,75 0,71 98,37 0,35 102,47 0,59 98,86 0,33 102,61 0,40 98,67 0,34 102,05 0,53

3 4

109,29 0,33 113,13 0,46 105,04 1,04 109,14 1,15 106,54 0,99 110,09 0,72 106,29 0,60 110,61 0,41 105,31 0,85 109,24 0,82

7 8

124,15 0,70 127,82 0,80 119,90 1,39 123,38 1,52 121,29 1,32 124,44 1,43 121,59 0,72 124,47 1,24 117,15 1,36 118,52 1,89

9 10

132,40 0,80 135,91 0,83 125,50 1,59 123,51 1,77 125,91 1,69 123,30 2,47 125,82 1,95 123,87 2,59 118,60 2,62 115,26 3,19

11 14

140,42 1,13 152,59 1,72 119,82 1,98 111,79 1,40 119,55 2,76 111,50 1,87 121,20 2,99 111,80 1,65 112,94 3,48 108,37 2,75

15 16

151,87 1,87 156,47 2,25 110,82 1,41 111,33 1,74 110,63 2,05 111,08 2,32 110,85 1,44 110,98 1,31 108,68 2,45 109,21 2,16

17 18

157,65 2,08 161,98 2,71 111,24 1,62 112,16 2,21 112,06 2,36 112,60 2,78 111,42 1,66 112,54 1,64 110,16 2,03 111,14 2,11

20 21

167,36 2,93 168,73 3,07 113,49 2,37 114,93 2,62 114,17 3,24 115,25 3,68 114,82 2,12 114,76 2,30 113,17 2,49 113,80 2,68

23 24

174,51 3,54 176,27 3,50 116,96 3,02 117,63 3,13 118,48 3,49 118,58 3,71 116,76 2,51 116,56 2,57 114,93 2,62 114,99 2,51

Día 0

0,1 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 0,3 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 1,0 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00 5,0 mg/kg Media E.T.M 100,00 0,00

1 2

99,31 0,61 102,87 0,73 99,26 0,28 102,98 0,43 98,81 0,27 103,18 0,50 98,25 0,58 101,82 0,53

3 4

106,26 0,82 110,20 0,64 106,95 0,50 110,50 0,58 106,52 0,55 110,52 0,67 105,47 0,58 109,29 0,58

7 8

120,50 1,20 123,48 1,58 120,03 0,82 121,38 1,31 121,54 1,15 124,28 1,59 119,77 1,19 121,96 1,72

9 10

125,46 2,47 123,95 3,38 121,57 2,09 118,27 3,07 125,60 2,23 124,11 2,97 123,04 2,42 120,00 2,81

73 5

10

15

20

25

(continuación)

0,1 mg/kg

0,3 mg/kg 1,0 mg/kg 5,0 mg/kg

Día

Media E.T.M Media E.T.M Media E.T.M Media E.T.M

11

121,98 3,93 116,02 , 3,32 121,27 3,42 117,97 2,98

14

113,90 2,14 108,43 1,94 111,72 2,27 111,58 2,59

15

113,66 1,91 109,59 2,12 112,30 2,23 113,33 2,37

16

115,06 2,00 111,54 2,02 115,00 2,36 116,06 2,30

17

115,99 2,18 113,57 2,04 118,08 2,32 119,14 2,42

18

118,01 2,29 116,13 2,14 121,16 2,55 122,14 2,61

20

122,17 2,57 120,62 2,20 126,90 2,87 128,60 2,77

21

123,49 2,90 122,88 2,49 130,41 2,98 132,82 2,84

23

124,35 3,02 125,36 2,83 137,81 3,09 140,79 2,83

24

123,77 2,80 125,33 2,75 138,93 2,76 141,77 2,61

El efecto de tratar los animales con diversas dosis de anticuerpo anti-NGF E3 en el peso corporal se analizó estadísticamente usando ANOVA de dos vías para comparar los resultados obtenidos en parejas entre animales artríticos tratados con vehículo y los tratados con una dosis dada de anticuerpo E3. Usando datos normalizados al peso el día 14 (Tabla 21), las dosis de E3 de 0,03 mg/kg dieron como resultado un cambio significativo de peso corporal (p<0,005). A todas las dosis más altas de E3, la diferencia entre animales artríticos tratados y no tratados fue significativa (p= o <0,0001). Usando datos normalizados al peso el día 0 (Tabla 22), la dosis de E3 de 0,03 mg/kg dio como resultado un cambio significativo del peso corporal (p<0,002). A todas las dosis más altas de E3, la diferencia entre animales artríticos tratados y no tratados fue significativa (p<0,0001).

De nuevo de acuerdo con estudios anteriores, las ratas tratadas con E3 mostraron menor pérdida de peso aparente que las ratas artríticas tratadas con solución salina (Tabla 22 y Figura 22). De hecho, las ratas tratadas con dosis altas de anticuerpo E3 se estaban recuperando de la pérdida de peso anterior y estaban de hecho ganando peso más rápidamente que sus cohortes no artríticas (Tabla 21 y Figura 21).

Depósito de material biológico

Los siguientes materiales se han depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, Estados Unidos (ATCC):

Material

Nº de Acceso de ATCC Fecha del Depósito

Eb.911.3E

E3 cadena ligera PTA-4893 8 de enero de 2003

Eb.pur.911.3E

E3 cadena ligera PTA-4894 8 de enero de 2003

Db.911.3E

E3 cadena pesada PTA-4895 8 de enero de 2003

El vector Eb.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera de E3; el vector Eb.pur.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera de E3 y el vector Db.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de cadena pesada de E3.

Este depósito se realizó según las Cláusulas del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Patentes y las Regulaciones del mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. El depósito se pondrá a disposición por ATCC según los términos del Tratado de Budapest y sujeto a un acuerdo entre Rinat Neuro-science Corp. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la descendencia del cultivo del depósito al público tras emisión de la patente de Estados Unidos pertinente o tras abrir al público cualquier solicitud de patente de Estados Unidos o extranjera, lo que suceda primero, y asegura la disponibilidad de la descendencia a quién determine el Comisionado de Patentes y Marcas de Estados Unidos que está autorizado a ello de acuerdo con 38 USC Sección 122 y las normas del Comisionado de acuerdo con la misma (incluyendo 37 CFR Sección 1.14 con referencia particular a 886 OG 638).

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Claims (1)

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