BRPI0317738B1

BRPI0317738B1 - Anticorpos anti-ngf ou fragmentos dos mesmos, seu método de fabricação, uso, polinucleotídeo, vetor e micro-organismo transgênico, bem como composição farmacêutica e kit compreendendo os referidos anticorpos ou fragmentos

Info

Publication number: BRPI0317738B1
Application number: BRPI0317738-6A
Authority: BR
Inventors: L. Shelton David; Pons Jaume; Rosenthal Arnon
Original assignee: Rinat Neuroscience Corporation
Priority date: 2002-12-24
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2018-01-16
Also published as: CA2936742A1; IL218087B; CA2921578A1; SI2270048T1; KR101250818B1; HK1110513A1; US7655232B2; HK1076251A1; ES2382918T3; US20070212357A1; IL169221A; US7449616B2; IL263573A; ZA200504866B; US9212222B2; CN101014364B; ES2564752T3; JP2006525955A; AU2003299898B2; EP3539569A1

Abstract

"anticorpos anti-ngf e processos para utilização dos mesmos". a presente invenção refere-se aos anticorpos anti-ngf (tais como anticorpos antagonistas do anti-ngf) e polinucleotídeos codificando os mesmos. a inveção se refere, adicionalmente ao uso de tais anticorpos e/ou polinucleotídeos no tratamento e/ou prevenção de dor, incluindo dor pós cirurgia, dor causada por artrite reumatóide e dor causada por osteoartrite.

Description

(54) Título: ANTICORPOS ANTI-NGF OU FRAGMENTOS DOS MESMOS, SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO, USO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR E MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT COMPREENDENDO OS REFERIDOS ANTICORPOS OU FRAGMENTOS (51) lnt.CI.: C07K 16/22 (30) Prioridade Unionista: 08/10/2003 US 60/510,006, 24/12/2002 US 60/436,905, 28/01/2003 US 60/443,522 (73) Titular(es): RINAT NEUROSCIENCE CORPORATION (72) Inventor(es): DAVID L. SHELTON; JAUME PONS; ARNON ROSENTHAL

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS ANTI-NGF OU FRAGMENTOS DOS MESMOS, SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO, USO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR E MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT

COMPREENDENDO OS REFERIDOS ANTICORPOS OU FRAGMENTOS. Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

Esse pedido reivindica o benefício de prioridade dos pedidos de patente provisórios US número de série 60/436.905, depositado em 24 de dezembro de 2002; número de série 60/443.522, depositado em 28 de janei10 ro de 2003 e número de série 60/510.006, depositado em 8 de outubro de 2003, todos incorporados aqui como referência, em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos anticorpos anti-NGF (tais como anticorpos antagonistas de anti-NGF). A invenção adicionalmente refere15 se ao uso de tais anticorpos no tratamento e/ou prevenção de dor, incluindo dor pós-cirúrgica, dor por artrite reumatóide, e dor por osteoartrite. Antecedentes da Invenção

Fator de crescimento nervoso (NGF) foi a primeira neurotrofina a ser identificada, e seu papel no desenvolvimento e sobrevivência dos neurônios periféricos e centrais foi bem caracterizado. NGF mostrou ser um fator de sobrevivência e manutenção importante no desenvolvimento dos neurônios simpáticos periféricos e neurônios sensores embriônicos e dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo. Smeyne e outros, Nature 368:246-249 (1994) e Crowley e outros, Ce//76:1001-1011 (1994). NGF supra-regula expressão dos neuropep25 tídeos nos neurônios sensores (Lindsay e Harmer, Nature 337:362-364 (1989)) e sua atividade é mediada através de dois receptores de ligação a membrana diferentes, o receptor TrKa e o receptor de neurotrofina comum p75 (algumas vezes denominados receptores de NGF de alta afinidade e baixa afinidade, respectivamente). Chao e outros, Science 232:518-521 (1986). Para revisão com relação ao NGF, vide Huang e outros, Annu. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001); Bibel e outros, Genes Dev. 14:2919-2937 (2000). A estrutura de cristal de NGF e NGF no complexo com o receptor TrKa foi determinada. Vide Nature 254:411 (1991); Nature 401:184-188 (1996).

Petição 870170003621, de 18/01/2017, pág. 8/53

Ϋ Λ -ί*

Ο fator de crescimento nervoso (NGF) foi a primeira neurotrotina., a ser identificada, e seu papel no desenvolvimento e sobrevivência de ambos neurônios periféricos e centrais foi bem caracterizado. NGF mostrou ser um fator de sobrevivência e manutenção importante no desenvolvimento dos neurônios sensores simpático e embriônico e dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal (Smeyne e outros, Nature 368:246-249 (1994) e Crowley e outros, Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF supra-regula a expressão dos neuropeptídeos nos neurônios sensores (Lindsay e outros, Nature 337:362-364 (1989)), e sua atividade é mediada através de dois receptores diferentes de ligação à membrana, o receptor tirosina quinase TrkA e o receptor p75 que está estruturalmente relacionado aos outros elementos da família do receptor de fator de necrose de tumor (Chao e outros, Science 232:518-521 (1986)).

Além de seus efeitos no sistema nervoso, NGF encontra-se crescente mente implicado nos processos fora do sistema nervoso. Por exemplo, NGF mostrou melhorar a permeabilidade vascular (Otten e outros,

Eur J Pharmacol. 106:199-201 (1984)), melhorar as respostas imunes as células T e B (Otten e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)), induzir diferenciação de linfócito e proliferação de célula mastóide e causar a liberação dos sinais biológicos solúveis das células mastóides (Matsuda e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988); Pearce e outros, J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff e outros, Blood 79:26622669 (1992); Horígome e outros, J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)). Embora NGF adicionado exogenamente tenha mostrado ser capaz de possuir todos esses efeitos, é importante observar que raramente foi demostrado que o NGF endógeno é importante em qualquer um desses processos in vivo (Torcia e outros, Cell. 85(3):345-56 (1996)). Portanto, não está claro que efeito pode ser esse, se algum, da inibição da bioatividade do NGF endógeno.

O NGF é produzido por vários tipos de células, incluindo as células mastóides (Leon e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)), Linfócitos B (Torcia e outros, Celi 85:345-356 (1996), ceratinócitos (Di Marco e outros, J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), células musculares lisas (Ueyama e outros, J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), fíbroblastos (Lindholm e

-Λ..

ν^Γ <«·.

outros, Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), células epiteliais bronquianafe^ (Kassel e outros, Clin, Exp. A//ergy 31:1432-40 (2001)), células mesangiais renais (Steiner e outros, Am. J. Physiol. 261 :F792-798 (1991)) e miotubos musculares esqueletais (Schwartz e outros, J Photochem. Photobiol. B66: 195-200 (2002)). Os receptores de NGF foram encontrados em vários tipos de células fora do sistema nervoso. Por exemplo, TrkA foi encontrado nos monócitos humanos, linfócitos Te B e células mastóides.

Uma associação entre os níveis de NGF aumentados em uma variedade de condições inflamatórias foi associada aos pacientes humanos, bem como em vários modelos animais. Esses incluem lúpus eritematoso sistêmico (Bracci-Laudiero e outros, Neuroreport 4:563-565 (1993)), esclerose múltipla (Bracci-Laudiero e outros, Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), psoríase (Raychaudhuri e outros, Acta Derm. I’enereoi. 78:84-86 (1998)), artrite (Falcim e outros, Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), cistite intersticial (Okragly e outros, J. Uroiogy 161:438-441 (1999)) e asma (Braun e outros, Eur. J Immunol. 28:3240-3251 (1998)).

Consistentemente, um nível elevado de NGF nos tecidos periféricos está associado à hiperalgesia e inflamação e foi observado em várias formas de artrite. A sinóvia dos pacientes afetada pela artrite reumatóide expressa altos níveis de NGF, enquanto na sinóvia não inflamada, o NGF foi reportado como sendo não detectável (Aloe e outros, Arch. Rheum. 35:351355 (1992)). Resultados semelhantes foram vistos em ratos com artrite reumatóide induzida experimentalmente (Aloe e outros, Clin. Exp. Rheumatoi. 10:203-204 (1992)). Níveis elevados de NGF foram reportados em camundongos artríticos transgênicos juntamente com um aumento no número de células mastóides (Aloe, e outros, Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)). A Publicação do PCT Número WO 02/096458 descreve o uso de anticorpos anti-NGF de determinadas propriedades no tratamento de vários distúrbios relacionados ao NGF, tais como, condição inflamatória (por exemplo, artrite reumatóide). Foi reportado que um anticorpo anti-NGF purificado injetado no camundongo transgênico artrítico portando o gene do fator-α de necrose de tumor humano (TNF-α), causou redução no número de células

mastóides, bem como uma diminuição nos níveis de histamina e substância P dentro da sinóvia do camundongo com artrite (Aloe e outros, Rheumatol. Int. 14: 249-252 (1995)).. Foi demonstrado que a administração exógena de um anticorpo de NGF reduziu o nível melhorado de TNF-α ocorrendo em camundongos artríticos (Manni e outros, Rheumatol. Int. 18: 97-102 (1998)).

Também, a expressão aumentada de NGF e do receptor de NGF de alta afinidade (TrkA) foi observada em condrócitos de osteoartrite (fannone e outros, Rheumatology 41:1413-1418 (2002)).

Anticorpos antagonistas de anti-NGF de roedores foram reportados. Vide, por exemplo, Hongo e outros, Hybrídoma (2000) 19(3):215-227; Ruberti e outros (1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13(5): 559-568. Contudo, quando os anticorpos dos roedores são usados terapeuticamente nos seres humanos, uma resposta de anticorpo antimurino humano desenvolve-se em números significativos dos indivíduos tratados. Além disso, as funções efetoras dos anticorpos de camundongo provaram ser menos eficientes no contexto humano. Assim, existe uma séria necessidade de anticorpos antagonistas de anti-NGF, incluindo anticorpos antagonistas de anti-NGF humanizados.

Todas as referências, publicações e pedidos de patente descritos aqui são desta forma incorporados como referência em sua totalidade. Breve Sumário da Invenção

A invenção descrita aqui se refere aos anticorpos do fator de crescimento nervoso.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um anticorpo humanizado e amadurecido por afinidade, E3, que liga especificamente o fator de crescimento nervoso de seres humanos e roedores (NGF). As sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de E3 são mostradas nas figuras 1A (SEG ID NO:1) e 1B (SEQ ID NO:2), respectivamente. As porções de CDR do anticorpo E3 (incluindo CDRs Chothia e Kabat) são diagramaticamente ilustradas nas figuras 1A e 1B. As seqüências de aminoácido das cadeias pesada e leve de E3, e das CDRs estendidas, individuais são também mostradas abaixo (Vide, seqüências de anticorpo a seguir).

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Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendo um fragmento ou uma região do anticorpo E3 (denominado intercambialvmente Έ3 aqui). Em uma concretização, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1B, Em outra concretização, o fragmento é uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1A. Ainda em outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3. Ainda em outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1A e 1B.

Em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou ATCC Número PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4894 ou ATCC Número PTA-4893; e (b) uma cadeia pesada que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895 (para conveniência aqui, o(s) polinucleotídeo(s) produzido(s) por uma célula hospedeira depositada é(são) referido(s) como possuindo um número de depósito da ATCC números PTA4894, PTA-4893 e PTA-4895). Em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve de uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4894 ou ATCC Número PTA-4893. Em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de uma cadeia

pesada que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma céluia hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo (a) uma região variável de cadeia leve de uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4894 ou ATCC Número PTA-4893, e (b) uma região variável de cadeia pesada de uma cadeia pesada que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Ainda em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo uma ou mais CDRs codificadas por (a) um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4894; e/ou (b) uma cadeia pesada que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895.

Em algumas concretizações, o anticorpo compreende a região constante lgG2a de cadeia pesada humana. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende a região constante kapa de cadeia leve humana. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte, por exemplo, não desencadeia lise mediada por complemento, ou não estimula citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em outras concretizações, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. immunol. (1999) 29:2613-2624; Número do Pedido PCT PCT/GB99/01441; e/ou Número do Pedido de Patente do Reino Unido 9809951,8. Ainda em outras concretizações, o anticorpo compreende uma região constante de lgG2a de cadeia pesada humana compreendendo as seguintes mutações: A330P331 em S330S331 (numeração do aminoácido com referência à seqüência lgG2a do tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624.

Em outro aspecto, a invenção fornece polípeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) compreendendo qualquer uma ou mais das que se seguem: a) uma ou mais CDRs de anticorpo E3 mostradas nas figuras 1A e ' Λ7

1Β; b) CDR H3 da cadeia pesada de anticorpo E3 mostrada na flgurâP^^c) '' ifíi tf

CDR L3 da cadeia leve de anticorpo E3 mostrada na figura 1B; d) três CDRs da cadeia leve de anticorpo E3 mostradas na figura 1B; e) três CDRs da cadeia pesada de anticorpo E3 mostradas na figura 1A; e f) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada, de anticorpo E3 mostradas nas figuras 1A e 1B. A invenção adicionalmente fornece polipeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) compreendendo qualquer uma ou mais das que se seguem: a) uma ou mais (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis)

CDRs derivadas do anticorpo E3 mostradas nas figuras 1A e 1B; b) uma CDR derivada da CDR H3 da cadeia pesada de anticorpo E3 mostrada na figura 1A; e/ou c) uma CDR derivada de CDR L3 da cadeia leve de anticorpo E3 mostrada na figura 1B. Em algumas concretizações, as CDRs podem ser CDRs Kabat, CDRs Chothia, ou uma combinação de CDRs Kabat e Chothia (denominadas aqui CDRs estendidas ou combinadas. Em algumas concretizações, polipeptídeos (tal como um anticorpo) ligam NGF (tais como NGF humano). Em algumas concretizações, os polipeptídeos compreendem qualquer uma das configurações de CDF (incluindo combinações, variantes, etc.) descritas aqui.

Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo), que compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:9, onde I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é substituído com Ν, T ou S. Para conveniência aqui, substituído(a) ou é nesse contexto ou com referência a um aminoácido se refere as escolhas de aminoácido(s) para uma dada posição. Como está claro, a substituição ou escolha pode ser o aminoácido ilustrado em uma SEQ ID ou figura.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:10, onde M50 é Μ, I, G, Q, S ou L; A62 é A, ou S; e L63 é L ou V.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W;

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onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R,T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; e onde Y110 é Y, K, S, R ou T.

Em outro aspecto, a invenção fornece poli peptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção fornece poli peptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO; 11, onde G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:12, onde S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é Η, N ou Q.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 13, onde 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e onde Y96 é Y ou R.

Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um

anticorpo), que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada naSEQ ID NO:9, onde I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é N, T ou S.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:10, onde M50 é Μ, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; e onde Y110 é Y, K, S, R ou T.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, onde G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:12, onde S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é Η, N ou Q.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 13, onde 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como ,ϋί^:·

um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 14, onde S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 14, onde S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e onde Y96 é Y ou R.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tais como anticorpos, incluindo anticorpos humanizados) que compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a região CDR1 da SEQ ID NO:9, onde I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é N, TouS; a região CDR2 da SEQ ID NO:10, onde M50 é Μ, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e a região CDR3 da SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; onde Y110 é Y, K, S, R ou T. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia pesada compreende a região CDR3 da SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; onde Y110 é qualquer aminoácido. Em outras concretizações, a região variável de cadeia pesada compreende a região CDR3 da SEQ ID NO:11, onde G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) adicionalmente compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma região variável de cadeia leve compreendendo a região CDR1 da SEQ ID NO: 12, onde S26 é S ou F; D28 é D,

S, A ou Ϋ; e H32 é Η, N ou Q; a região CDR2 da SEQ ID NO:13, onde I5Í ~e’ I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e a região CDR3 da SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou Ε; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia leve compreende a região CDR3 da SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou Ε; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e onde Y96 é Y ou R. Em algumas concretizações, o poiipeptídeo (tal como um anticorpo) adicionalmente compreende uma cadeia pesada de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a região CDR1 da SEQ ID NO:9, onde I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é Ν, T ou S; a região CDR2 da SEQ ID NO:10, onde M50 é Μ, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e a região CDR3 da SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; onde Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a região CDR1 da SEQ ID NO:12, onde S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é Η, N ou Q; a região CDR2 da SEQ ID NO:13, onde 151 é I, T, V ou A; e S56 éSouT; ea região CDR3 da SEQ ID NO: 14, onde S91 é S ou Ε; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia leve compreende a região CDR3 da SEQ ID NO: 14, onde S91 é S ou Ε; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e onde Y96 é You R. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia pesada compreende a região CDR3 da SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, Ν, T ou G; onde Y110 é qualquer aminoácido. Em outras concretizações, a região variável de cadeia pesada compreende a região CDR3 da SEQ ID NO:11, onde G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é

S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108VF»'^vW; onde D109 é S, A, C, G, D, N, Tou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas concretizações, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma cadeia leve de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo, incluindo um anticorpo humanizado) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:9, onde I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é Ν, T ou S; uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:10, onde M50 é Μ, l, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; onde Y110 é Y, K, S, R ou T. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; e onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, Aou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, Ν, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido. Em outras concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID ΝΟ.Ί1, onde G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, Ν, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) adicionalmente compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:12, onde S26 éSou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é Η, N ou Q; uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:13, onde 151 é I,

T, V ou A; e S56 é S ou T; e uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou

R. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüênçW ”'' de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou Ε; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e onde Y96 é Y ou R. Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) adicionalmente compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como um anticorpo) que compreendem (a) uma seqüêncía de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:9, onde 134 é S, L, V, A ou I; e N35 é N, T ou S; uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:10, onde M50 é Μ, I, G, Q,

S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; e onde Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma seqüêncía de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:12, onde S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é Η, N ou Q; uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:13, onde 151 é I, Τ, V ou A; e S56 é S ou T; e uma seqüêncía de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou Ε; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüêncía de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou E;

K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e onde Y96 é Y ou

R. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüêncía de aminoácido mostrada na SEQ ID NO;11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é

S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; onde Y110 é qualquer aminoácido.

Em outras concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüêncía de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, onde G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido. Em \ ά14 algumas concretizações, ο polipeptídeo adicionalmente compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeo (tais como anticorpos) compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma região CDR1 da SEQ ID NO:9, onde I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é substituído com N, T ou S; (b) uma região CDR2 da SEQ ID NO:10, onde M50 é I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e (c) uma região CDR3 da SEQ ID NO: 11, onde Y100 é Y, Lou R; onde Y101 éYouW; onde G103 é G, A ou S; onde T104 éTouS; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; e onde Y110 é Y, K, S, R ou T; onde o anticorpo liga NGF.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tais como anticorpos) compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo: (a) uma região CDR1 da SEQ ID NO:12, onde S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é Η, N ou Q; (b) uma região CDR2 da SEQ ID NO: 13, onde 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e (c) uma região CDR3 da SEQ ID NO:14, onde K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R; onde o anticorpo liga NGF.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tais como anticorpos) compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (i) uma região CDR1 da SEQ ID NO:9, onde 134 é substituído com S, L, V, A ou I; e N35 é substituído com N, T ou S; (ii) uma região CDR2 da SEQ ID NO:10, onde M50 é I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e (iii) uma região CDR3 da SEQ ID NO: 11, onde Y100 é Y, L ou R; onde Y101 é Y ou W; onde G103 é G, A ou S; onde T104 é T ou S; onde S105 é S, A ou T; onde Y106 é Y, R, T ou M; onde Y107 é Y ou F; onde F108 é F ou W; onde D109 é D, N ou G; onde Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: (i) uma região CDR1 da SEQ ID NO:12, onde S26 éSouF; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é Η, N ou Q; (ii) uma região CDR2 da SEQ ID NO: 13, onde 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e (iii) uma região CDR3 da SEQ ID NO:14, onde S91 é S ou Ε; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R; onde o anticorpo liga NGF.

A menos que de outra forma observado, escolha (por exemplo, ^?substituição) de um aminoácido em um local é independentemente selecionada da seleção de um aminoácido em qualquer outro local.

Em algumas concretizações, polinucleotídeos (tal como um anticorpo) ligam NGF (tais como NGF humano). Em algumas concretizações, os polipeptídeos compreendem qualquer uma das configurações de CDR (incluindo combinações, variações, etc.) descritas aqui.

Como é evidente da descrição aqui, a numeração da região variável usada aqui é uma numeração sequencial. Um versado na técnica entenderá prontamente que um número dos sistemas de numeração do anticorpo existe (tal como, numeração Kabat ou Chothia) e como converter a numeração sequencial em outro sistema de numeração, tal como, numeração Kabat ou numeração Chothia.

Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreendendo uma sequência de aminoácido (tal como uma seqüência de CDR3) selecionado da SEQ ID NO:46 ou 50. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 6, 7 e 8. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NOS:9,

10, 11, 12, 13, 14e15.

Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreendendo uma seqüência de aminoácido (tal como uma região de CDR, tal como uma região CDRH1 e/ou CDR H2) selecionada das (a) SEQ ID NOS:28 e/ou 29; (b) SEQ ID NOS:30 e/ou 31; (c) SEQ ID NOS:32 e/ou 33; (d) SEQ ID NOS:34 e/ou 35; (e) SEQ ID NOS:36 e/ou 37;

(f) SEQ ID NOS:38 e/ou 39; e (g) SEQ ID NOS:40 e 41. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido (tal como uma região CDR H1) selecionada da SEQ ID NOS: 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido (tais como a região CDR H2) selecionada das SEQ ID NOS:29, 31, 33, 35, 37, 39 e 41. Ainda em outras concretizações, o polipep16

tídeo adicionalmente compreende uma ou mais das seqüências de aminoácido mostradas na SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 6, 7 e 8. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das seqüências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13, 14, e 15.

Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreendendo uma seqüência de aminoácido (tal como uma região de CDR, tal como uma região CDRL1 e/ou CDR L2) selecionada das (a) SEQ ID NOS:18 e/ou 19; (b) SEQ ID NOS:20 e/ou 21; e (c) SEQ ID NOS:22 e/ou 23. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido (tal como a região CDR L1) selecionada das SEQ ID NOS:18, 20 e 22. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido (tal como a região CDR L2) selecionada das SEQ ID NOS: 19, 21 e 23. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das seqüências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das seqüências de aminoácido mostradas na SEQ ID NOS: 9, 10, 11,12, 13, 14, e 15.

Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreendendo uma seqüência de aminoácido (tal como uma região de CDR, tal como uma região de CDR L3 e/ou CDR H3) selecionada das (a) SEQ ID NOS: 51 e/ou 52; (b) SEQ ID NOS: 55 e/ou 56; (c) SEQ ID NOS: 57 e/ou 58; (c) SEQ ID NOS: 59 e/ou 60; (d) SEQ ID NOS: 61 e/ou 62; (e) SEQ ID NOS:63 e/ou 64. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido (tal como uma região CDR L3) selecionada das SEQ ID NOS: 51, 55, 57, 59, 61 e 63. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido (tal como uma região CDR H3) selecionada das SEQ ID NOS: 52, 56, 58, 60, 62 e 64. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adicional mente compreende uma seqüência de aminoácido mostrada em uma ou mais das SEQ ID NOS: 18, 19, 30 e 31. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adi17

.

cionalmente compreende uma ou mais das seqüências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 6, 7 e 8. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das seqüências-de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 9,10,11, 12,13,14, e 15.

Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreendendo uma ou mais de uma seqüência de aminoácidos (tal como uma região de CDR) mostradas na SEQ ID NOS: 61, 63, 18, 19, 30 e 31.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-NGF (tal como um anticorpo antagonista) que liga NGF (tal como NGF humano) com uma alta afinidade. Em algumas concretizações, alta afinidade é (a) ligação de NGF com um K_D inferior a cerca de 2 nM (tal como qualquer um de cerca de 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM ou menos), e/ou um kotr mais lento que cerca de 6 x 10'⁵ s'¹); e/ou (b) inibindo (reduzindo, e/ou bloqueando)sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 15 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM ou menos; e/ou (c) inibindo (reduzindo, e/ou bloqueando)sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM ou menos; e/ou (d) inibindo (reduzindo, e/ou bloqueando) sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 15 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM ou menos; e/ou (e) inibindo (reduzindo, e/ou bloqueando) sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM ou menos; e/ou (f) e/ou ligam NGF com afinidade maior do que o receptor de TrKa.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (tal como

um anticorpo), onde os polipeptídeos (a) ligam NGF (tal como NGF humano) com um Kd inferior a cerca de 2 nM (tal como qualquer um de cerca de 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM ou menos), e/ou um k_Off mais lento que cerca de 6 χ 10'⁵ s'¹); e/ou (b) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um ÍC50 (em presença de cerca de 15 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM ou menos; e/ou (c) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM ou menos; e/ou ligam NGF com afinidade maior do que o receptor de TrKa. Em algumas concretizações, os polipeptídeos (a) ligam NGF com um Kd inferior a cerca de 2 nM; e/ou (b) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 de cerca de 100 pM ou menos, onde o 1C50 é medido em presença de cerca de 15 pM de NGF; e/ou (c) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 de cerca de 10 pM ou menos, onde o IC50 é medido em presença de cerca de 1,5 pM de NGF, onde o IC50 é medido em presença de cerca de 15 pM de NGF. Em algumas concretizações, os polipeptídeos (a) ligam NGF com um K_D inferior a cerca de 100 pM; e/ou (b) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 de cerca de 20 pM ou menos, onde o IC50 é medido em presença de cerca de 15 pM de NGF; e/ou (c) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um 1C50 de cerca de 2 pM ou menos, onde o IC50 é medido em presença de cerca de 1,5 pM de NGF.

Como é evidente da descrição aqui, são especificamente excluídos da invenção as concretizações de polipeptídeo consistindo na seqüência de aminoácido idêntica à seqüência de um aminoácido do anticorpo monoclonal de camundongo, 911. As sequências de CDR estendidas de Mab 911 são mostradas nas figuras 1A e 1B e nas SEQ ID NOS:9-14.

/,

Em algumas concretizações, a invenção fornece qualquer um dos polipeptídeos ou anticorpos, adicionalmente onde o polipeptídeo (tal como um anticorpo) é isolado. Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) é substancialmente purificado. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) é amadurecido por afinidade. Em outras concretizações, o anticorpo é um anticorpo antagonista. Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreende seqüências de estrutura humana. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreende um ou mais resíduos de estrutura não humana. Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) liga NGF (tal como NGF humano) com um K_Dde 2nM ou menos. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma ou mais (tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) substituições de aminoácido humano em relação a uma seqüência de aminoácido não humana (tal como uma sequência de região variável, tal como uma seqüência de CDR, tal como uma seqüência de estrutura). Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende pelo menos 1, pelo menos 2 ou mais, tal que, pelo menos 3, 4, 5, 6 ou mais substituições de aminoácido em relação a uma seqüência de aminoácido de polipeptídeo de origem (tal como uma seqüência de aminoácido 911 de anticorpo, tal como qualquer uma ou mais das SED ID NOs 9-14). Em algumas concretizações, a afinidade de ligação do anticorpo foi alterada (em algumas concretizações, aumentada) em relação à afinidade de anticorpo de origem relativa (tal como Mab 911). Ainda em outras concretizações, a afinidade de ligação do anticorpo é inferior à afinidade de ligação do receptor trkA para NGF (tal como NGF humano). Em algumas concretizações, os polipeptídeos podem ser anticorpos. Em algumas concretizações, os anticorpos são anticorpos humanos. Em outras concretizações, os anticorpos são anticorpos humanizados. Ainda em outras concretizações, os anticorpos são anticorpos monoclonais. Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo amadurecido por afinidade.

A invenção fornece polinucleotídeos (incluindo polinucleotídeo isolado) compreendendo polinucleotídeos codificando qualquer uma das

concretizações acima.

Em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeo codificando um fragmento ou uma região do anticorpo E3 (intercambiavelmente denominada aqui Έ3). Em uma concretização, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1B. Em outra concretização, o fragmento é uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1A. Ainda em outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3. Ainda em outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado nas figuras 1A e 1B.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeo que codifica para o anticorpo E3. Em algumas concretizações, o polinucleotídeo compreende um ou ambos os polinucleotídeos mostrados nas figuras 2 e 3.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia leve E3 com um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou ATCC Número PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia pesada E3 com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Ainda em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou PTA-4894 e (b) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou PTA-4894; e/ou (b) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895.

Em outro aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos codificando qualquer um dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) ou .ο⁴ <co polipeptídeos descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção fornece vectores (incluindo vetores de expressão e clonagem) e células hospedeiras compreendendo quaisquer polinucleotídeos descritos aqui.

Como é evidente da descrição aqui, especificamente incluídos na invenção são as concretizações de polinucleotídeo consistindo em uma seqüência de polinucleotídeo idêntica à seqüência de polinucleotídeo do anticorpo monoclonal de camundongo, 911. As seqüências de CDR estendidas de Mab 911 são mostradas nas figuras 1A e 1B e nas SEQ ID NOS:9-14.

Em outro aspecto, a invenção é uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo codificando uma cadeia leve E3 e um polinucleotídeo codificando cadeia pesada E3, onde o(s) polinucleotídeo(s) codificando cadeia teve E3 possui(em) um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 e/ou ATCC Número PTA-4894, e o polinucleotídeo codificando cadeia pesada E3 possui um número de depósito da ATCC Número PTA4895. Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende polinucleotídeo compreendendo (a) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou PTA-4894 e/ou (b) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende um polinucleotídeo codificando (a) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou PTA-4894; e/ou (b) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Em algumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de mamífero.

Em outro aspecto, a invenção é um complexo de NGF ligado pelo anticorpo E3. Em outro aspecto, o complexo é isolado. Em outro aspecto, o complexo é substancialmente purificado.

Em outro aspecto, a invenção é um complexo de NGF ligado por qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos descritos aqui. Em outro aspecto, o complexo é isolado. Em outro aspecto, o complexo é substancial22 . „ S0'’ \

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Xé>, ' ο * mente purificado.

Em outro aspecto, a invenção é uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos polípeptídeos (incluindo anticorpos tais como anticorpo E3) ou polinucleotídeos descritos aqui, tais como composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo E3 ou um anticorpo compreendendo um fragmento do anticorpo E3, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em outro aspecto, a invenção é um processo de geração de anticorpo E3 compreendendo preparação de uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão que codifica anticorpo E3; cultivo de uma célula hospedeira ou progênie da mesma sob condições que permitem a produção do anticorpo E3; e purificação do anticorpo E3. Em algumas concretizações, o vetor de expressão compreende uma ou ambas as seqüências de polinucleotídeo mostradas nas figuras 2 e 3.

Em outro aspecto, a invenção é um processo de geração de anticorpo E3 compreendendo expressão de um polinucleotídeo codificando cadeia leve E3 e um polinucleotídeo codificando cadeia pesada E3 em uma célula apropriada, onde o polinucleotídeo codificando cadeia leve E3 possui um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 e/ou ATCC Número PTA-4894, e o polinucleotídeo codificando cadeia pesada E3 possui um número de depósito da ATCC Número PTA-4895; geralmente seguido por recuperação e/ou isolamento do anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção fornece processos de geração de qualquer um dos polípeptídeos (tais como anticorpos) descritos aqui por expressão de um ou mais polinucleotídeos codificando o anticorpo (que pode ser expresso separadamente como uma cadeia leve ou pesada ou ambas cadeia leve e pesada podem ser expressas de um vetor) em uma célula apropriada, geralmente seguido pela recuperação e/ou isolamento do anticorpo ou polípeptídeos de interesse.

Em outro aspecto, a invenção é um processo antagonização da atividade biológica de NGF (tal como um NGF humano) usando qualquer um dos peptídeos (incluindo anticorpos, tal como anticorpo E3) descrito aqui.

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Em uma concretização, o processo compreende contato do fator de crescimento nervoso humano com qualquer um dos polipeptídeos (incluindo anticorpo E3) descritos aqui, pelo que a atividade NGF (tal como, atividade do fator de crescimento nervoso humano) é antagonizada, reduzida, bloqueada ou suprimida.

Em outro aspecto, a invenção é um processo de detecção de NGF usando qualquer um dos polipeptídeos (incluindo anticorpos, tais como o anticorpo E3) descritos aqui. A presença de NGF é detectada por detecção de um complexo entre NGF e qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui (tal como anticorpo E3). O termo detecção conforme usado aqui inclui detecção qualitativa e/ou quantitativa (níveis de medição) com ou sem referência a um controle.

Em outro aspecto, a invenção é um processo para tratar dor por administração de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo E3 ou qualquer uma das concretizações de polipeptídeo (incluindo anticorpo) ou polinucleotídeo descritas aqui. Em algumas concretizações, a dor é dor pós-cirúrgica.

Em outro aspecto, a invenção é um processo para prevenir ou tratar dor por artrite reumatóide em um indivíduo por administração de uma quantidade eficaz de anticorpo antagonista de anti-NGF ao indivíduo. Foi mostrado, de acordo com a invenção que um anticorpo antagonista de antiNGF é capaz de inibir ou bloquear uma dor associada à artrite reumatóide. Em algumas concretizações, a dor é aliviada dentro de cerca de 24 horas após administrar o anticorpo antagonista de anti-NGF. Em algumas concretizações, a dor é aliviada dentro de cerca de 4 dias após administrar o anticorpo antagonista de anti-NGF. Em algumas concretizações, a doré aliviada antes da observação ou na ausência de indicação de melhora da condição inflamatória no indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção fornece processos para reduzir a incidência de dor por artrite reumatóide, aliviando a dor por artrite reumatóide, suprimindo a dor por artrite reumatóide, aliviando a dor por artrite reumatóide, e/ou retardando o início, desenvolvimento ou progressão da dor por artrite reumatóide em um indivíduo, o processo compreendendo administração de uma quantidade eficaz de anticorpo antagonista de anti-NGF ao indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção é um processo para prevenir ou tratar dor por osteoartrite em um indivíduo por administração de uma quantidade eficaz de anticorpo antagonista de anti-NGF ao indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção fornece processos para tratamento de caquexia inflamatória (perda de peso) associada à artrite reumatóide em um indivíduo compreendendo administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista de anti-NGF. Em outro aspecto, a invenção fornece processos para reduzir a incidência de dor por osteoartrite, aliviar dor por osteoartrite, supressão da dor por osteoartrite, alívio da dor por osteoartrite, e/ou retardando o início, desenvolvimento ou progressão da dor por osteoartrite em um indivíduo, o processo compreendendo administração de uma quantidade eficaz de anticorpo antagonista de anti-NGF ao indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção fornece kits e composições compreendendo qualquer uma ou mais das composições descritas aqui. Esses kits, geralmente em embalagens apropriadas e providos com instruções apropriadas, são úteis para qualquer um dos processos descritos aqui.

A invenção também fornece qualquer composição e kit descrito para qualquer uso descrito aqui, se no contexto de uso como medicamento e/ou uso para fabricação de um medicamento.

Breve Descrição das Figuras

FIGURA 1A: mostra a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo E3 (rotulada ''6 e 5 + maturação por afinidade H3). As CDRs Chothia e CDRs Kabat são ilustradas por texto sublinhado e texto em negrito e em itálico, respectivamente. Figura 1A também mostra o alinhamento das seqüências de aminoácido da região variável de cadeia pesada que se seguem: (1) CDRs H1 (SEQ. ID NO: 9), H2 (SEQ ID NO: 10) e H3 (seq ID NO: 11) de anticorpo de camundongo 911; (2) VH4-59 seqüência receptora de linha de germe humana (rotulada VH4-59 ou 2”) (SEQ ID NO: 69); (3) as seqüências receptoras enxertadas com as CDRs

estendidas do anticorpo de camundongo 911 (rotulada enxertada com CDR ou 3) (SEQ ID NO: 70); (4) as seqüências receptoras enxertadas com CDR incluindo a substituição V71K (rotulada 3+ uma mutação de estrutura ” ou 4) (SEQ ID NO: 71); (5) o clone contendo CDRs H1 e H2 maturadas por afinidade (rotulada 5 ou ”4+ maturação por afinidade H1, H2)(SEQ ID NO: 72); e anticorpo E3 (conforme descritos acima) (SEQ ID NO: 1).

FIGURA 1B: mostra a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia leve do anticorpo E3 (rotulada 5 ou ”4 + maturação de L3 por afinidade). As CDRs Chothia e CDRs Kabat são ilustradas por texto sublinhado e texto em negrito e em itálico, respectivamente. Figura 1B também mostra o alinhamento de seqüências de amino ácido da região variável de cadeia leve: CDRs L1 (SEQ ID NO: 12); L2 (SEQ ID NO: 13) e L3 (SEQ ID NO: 14) de anticorpo de camundongo 911, (2) 08 seqüência receptora de linha de germe humana (rotulada 08 ou 2) (SEQ ID NO: 73); (3) as seqüências receptoras enxertadas com as CDRs estendidas do anticorpo de camundongo 911 (rotuladas enxertada com CDR ou 3); (SEQ ID NO: 74) (4) as seqüências receptoras enxertadas com CDR (rotulada 3+ maturação de L1, L2 ou 4 por afinidade) (SEQ ID NO: 75); (5) o clone contendo CDRs L1 e L2 maturadas por afinidade (rotulada 5 ou 4+ maturação de L3 por afinidade); e anticorpo E3 (conforme descrito acima) (SEQ ID NO: 2).

FIGURA 2: mostra um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 76) codificando a região variável de cadeia pesada de anticorpo E3.

FIGURA 3: mostra um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 77) codificando a região variável de cadeia leve de anticorpo E3.

FIGURA 4: é um gráfico ilustrando sobrevivência dependente de NGF dos neurônios E13.5 em presença de concentração variada de NGF humana e de rato. O eixo X corresponde a concentração de NGF (ng/mL) e o eixo Y corresponde aos neurônios contados.

FIGURA 5: é um gráfico comparando o efeito de bloqueio de NGF dos vários Fabs em presença tanto de 0,04 ng/mL de NGF humano ãa i'r_Of ζ Γ&./ ítei;

Χα

W_H<

(aproximadamente 1,5 ρΜ; mostrado no painel inferior) quanto 0,4 ng/mL de NGF humano (aproximadamente 15 pM; mostrados no painel superior). Sobrevivência de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 de murino; e Fab H19-L129 e Fab 8L2-6D5 foi avaliada. O IC50 (em pM) foi calculado para cada Fab em cada concentração de NGF, e é mostrado na Tabela 9. Fab E3 bloqueou fortemente a sobrevivência do neurônio trigeminal dependente humano de NGF, com um IC50 de aproximadamente 21 pM em presença de 15 pM de NGF humano, e um 1C50 de aproximadamente 1,2 pM em presença de 1,5 pM de NGF humano. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente a sobrevivência do neurônio trigeminal dependente humano de NGF. Em ambos os painéis, o eixo X corresponde à concentração de anticorpos (nM) e o eixo Y corresponde aos neurônios contados. 1,5 pM de NGF estava em torno do IC50, enquanto 15 pM representou uma concentração de saturação de NGF.

FIGURA 6: é um gráfico comparando o efeito de bloqueio de NGF dos vários Fabs em presença tanto de 0,04 ng/mL de NGF de rato (aproximadamente 1,5 pM; mostrado no painel inferior) quanto 0,4 ng/mL de NGF de rato (aproximadamente 15 pM; mostrados no painel superior). Sobrevivência de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 de murino; e Fab H19-L129 e 8L2-6D5 foi avaliada conforme descrito acima. O IC50 (em pM) foi calculado para cada Fab em cada concentração de NGF, e é mostrado na Tabela 9. Fab E3 bloqueou fortemente a sobrevivência do neurônio trigeminal dependente humano de NGF, com um IC50 de aproximadamente 31,6 pM em presença de 15 pM de NGF de rato, e um IC50 de aproximadamente 1,3 pM em presença de 1,5 pM de NGF de rato. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente sobrevivência do neurônio trigeminal dependente de NGF de rato. 1,5 pM de NGF estava em tomo do IC50, enquanto 15 pM representaram uma concentração de saturação de NGF. Em ambos os painéis, o eixo X corresponde a concentração de anticorpos (nM) e o eixo Y corresponde aos neurônios contados.

FIGURA 7; é um gráfico ilustrando dor em repouso avaliada 24

horas após cirurgia e mostrando que, tratamento com 0,02 mg/kg, 0,1 mg/kg; < 0,6 mg/kg ou 1 mg/kg de anticorpo E3 anti-NGF reduziu a dor. indica uma diferença estatisticamente significativa (p<0,5) do controle negativo.

FIGURA 3: é um gráfico ilustrando dor em repouso avaliada 24 horas após cirurgia e mostrando que, tratamento com 0,5 mg/kg de anticorpo E3 anti-NGF reduziu significativamente (p<0,005) a dor em repouso, quando injetado duas horas após cirurgia.

FIGURA 9: é um gráfico mostrando os resultados da análise BlAcore de uma afinidade de ligação ao NGF humano do anticorpo 911 do camundongo (Fab). Anticorpo 911 do camundongo liga NGF com um KD de 3,7 nM, koff de 8,4x10’⁵s¹ e kon de 2,2x10⁴Ms¹.

FIGURA 10: é um gráfico mostrando os resultados da análise BlAcore de uma afinidade de ligação ao NGF humano de anticorpo E3 (Fab) (referido como 3E Fab). E3 liga NGF humano com um KD de aproximadamente 0,07 nM (e com um Kon de cerca de 6,0 χ 10⁵ M'¹s'¹, e um k_Off de cerca de 4,2x10·® s’¹).

FIGURA 11: é um gráfico ilustrando que o anticorpo E3 bloqueia a interação de NGF com seus receptores, trkA e p75, conforme avaliado por ligação percentual detectada entre NGF e trkA (mostrado em círculos pretos) e NGF e p75 (mostrado em quadrados vazios). O eixo X corresponde a concentração de anticorpo 3E (Fab) e o eixo Y corresponde a ligação de NGF (máxima percentual RU). Concentrações aumentadas de Fab E3 bloquearam a interação de NGF com ambos p75 e trkA, conforme mostrado pelo sinal diminuído (medido em RU). Quando a concentração de anticorpo E3 (Fab) igualou a concentração de NGF, nenhuma ligação de NGF foi observada (conforme mostrado por um sinal de zero).

FIGURA 12: é um gráfico ilustrando a capacidade de bloqueio de NGF humano de anticorpo pleno E3 e Fab E3. Sobrevivência de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo em presença de NGF humano e várias concentrações de Fab E3 e anticorpo E3 foi avaliada. O eixo X corresponde a ligação dos sítios de NGF (nM) e o eixo Y corresponde a contagem normalizada dos neurônios trigeminais (TG). Anticorpo pleno E3 e Fab 3E mostra23

Ϊθίϋ>* r ram níveis semelhantes de inibição de sobrevivência dependente dê^KLGF dos neurônios trigeminais quando a concentração de anticorpo integral e Fab foi normalizada para o número de sítios de ligação NGF (Fab possui um sítio de ligação e o anticorpo integral possui dois sítios de ligação).

FIGURA 13: é um gráfico ilustrando a capacidade de várias concentrações (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, e 0,0 nM) de anticorpo E3 (triângulos cheios; referidos como 3E), anticorpo 911 (círculos cheios), e uma imunoadesina de receptor trkA (quadrados sombreados; referidos como trkA-Fc) para inibir a sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13.5 em presença de 0,4 ng/mL de NGF humano (condições de saturação). O eixo X corresponde a concentração de anticorpo (nM) e a Y concentração corresponde aos neurônios contados. Esses resultados demonstraram que o anticorpo E3 bloqueou NGF significativa mente melhor do que o anticorpo 911 anti-NGF monoclonal de camundongo ou a imunoadesina trkA.

FIGURA 14: é um gráfico ilustrando que o anticorpo E3 antagonista de anti-NGF (denominado 3E na figura) ou Fab 911 não inibiram a sobrevivência neuronal promovida por NT3, NT4/5 e MSP, mesmo em concentração de anticorpos tão alta quanto 200 nM. Os dados apresentaram a sobrevivência percentual média após 48 horas em cultura (± erro padrão médio, n = 3 para cada ponto de dados) em relação à sobrevivência observada no controle positivo para cada experimento (100% de sobrevivência dos neurônios trigeminais desenvolvidos em presença de concentração de saturação de NGF). Várias concentrações, (20 nM, 2 nM ou 0,2 nM) de Fab E3 (denominado 3E na figura) e Fab do anticorpo 911 do camundongo foram usadas sem presença de neurotrofina (denominada controle), 400 pM de NGF (denominado *'NGF-400pM), 10 nM NT3 (denominado ”NT3-10nM) ou 600 pM MSP (denominado MSP-600 pM).

FIGURA 15: é um gráfico ilustrando que o anticorpo E3 antagonista de anti-NGF (Fab ou anticorpo pleno) (denominado ”3E na figura) ou anticorpo 911 do camundongo (Fab ou anticorpo pleno) não inibiu a sobrevivência neuronal promovida por NT3, NT4/5 e MSP, mesmo na concentração

de anticorpos tão alta quanto 200 nM. Várias concentrações (200 nM e 30 nM)^;' de Fab E3 de anticorpo pleno e anticorpo 911 do camundongo e Fab foram usadas em ausência de neutrotrofinas (denominado sem fator), 400 pM de NGF (denominado NGF-400pM), 10 nM NT3 (denominado NT3-10nM) ou 600 pM MSP (denominado MSP-600 pM).

FIGURA 16: é um gráfico ilustrando que o anticorpo E3 antagonista de anti-NGF ou Fab E3 não inibiu a sobrevivência dos neurônios E17 nodosos promovida por BDNF, NT4/5 ou LIF. Anticorpo 911 do antagonista de anti-NGF de camundongo foi também testado, e resultados semelhantes foram observados. Várias concentrações (200 nM ou 80 nM) de anticorpo pleno E3 (denominado 3E na figura), Fab E3, anticorpo pleno 911 ou Fab 911 foram testadas na ausência de neurotrofinas adicionadas (denominado sem fatores), 400 pM BDNF (denominado BDNF-400pM), 400 pM NT4/5 (denominado ”NT4/5-400pM) ou 2,5 nM LIF (denominado LlF-2,5 nM).

FIGURA 17: é um gráfico ilustrando que o anticorpo E3 antagonista de anti-NGF ou Fab E3 não inibiu a sobrevivência dos neurônios E17 nodosos promovida por BDNF, NT4/5 ou LIF. Várias concentrações (200 nM, nM, 2nM) de Fab E3 (denominado 3E na figura) ou Fab 911 foram testadas na ausência das neurotrofinas adicionadas (denominado controle), 400 pM BDNF (denominado BDNF-400pM), 400 pM NT4/5 (denominado NT4/5-400pM) ou 2,5 nM LIF (denominado LIP-2,5 nM).

FIGURA 18: é um gráfico demonstrando resposta nociceptiva em ratos com artrite (modelo de artrite reumatóide) após administração de anticorpos anti-NGF (E3 e 911) no D14 e D19. E3 (1 mg/kg, i.v. no dia 14 e dia 19), 911 (10 mg/kg, i.v. no dia 14 e dia 19) ou indo (indometacina 3 mg/kg, p.o. diariamente por 10 dias) foram administrados aos camundongos com artrite. Valores de intensidade de vocalização são expressos em mV como significando ± s.e.m.

FIGURA 19: é um gráfico demonstrando efeitos dos anticorpos anti-NGF no peso corpóreo na artrite em ratos (modelo de artrite reumatóide) após administração de anticorpos anti-NGF no D14 e D19. E3 (1 mg/kg, i.v. no dia 14 e dia 19), 911 (10 mg/kg, i.v. no dia 14 e dia 19) ou indo (indome30

tacina 3 mg/kg, p.o. diariamente por 10 dias) foram administrados aos mundongos com artrite. Valores do peso corpóreo são expressos em gramas como significando ± s.e.m.

FIGURA 20: é um gráfico demonstrando resposta nociceptiva em ratos com artrite (modelo de artrite reumatóide) após administração de doses diferentes do anticorpo E3 anti-NGF (0,003 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, e 5 mg/kg) no D14 e D18. Valores de intensidade de vocalização são expressos em mV como significando ± s.e.m.

FIGURA 21: é um gráfico demonstrando efeitos do anticorpo E3 anti-NGF na porcentagem em peso no dia 14 (normalizado para Dia 14) em ratos com artrite (modelo de artrite reumatóide) após administração de doses diferentes de anticorpo E3 anti-NGF (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, e 5 mg/kg) no D14eD18.

FIGURA 22: é um gráfico demonstrando efeitos do anticorpo E3 anti-NGF na perda de peso em ratos com artrite (modelo de artrite reumatóide) após administração de doses diferentes de anticorpo E3 anti-NGF (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, e 5 mg/kg) no D14 e D18. Os valores de peso corpóreo foram normalizados para Dia 0.

FIGURA 23: ilustra a seqüência de aminoácido de região variável de cadeia pesada E3 (Figura 23A) e seqüência de aminoácido de região variável de cadeia leve (Figura 23B), conforme numerada usando numeração seqüencial, numeração Kabat e numeração Chotía.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção descrita aqui fornece anticorpos antagonistas de anti-NGF que ligam NGF (tais como NGF humano) com alta afinidade. A invenção adicionalmente fornece anticorpos e polipeptídeos derivados de E3 que ligam NGF, e processos de fabricação e uso desses anticorpos. Em algumas concretizações, a invenção fornece um anticorpo humanizado, E3, que ligase ao fator de crescimento nervoso (NGF), e processos de fabricação e uso desse anticorpo. A invenção também fornece polipeptídeos E3 (incluindo anticorpos) que ligam NGF, e polinucleotídeos codificando anticorpo e/ou polipeptídeo E3.

S(Q

A invenção descrita aqui também fornece processos para prevenção e/ou tratamento de dor por artrite reumatóide em um indivíduo por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista de anti-NGF.

A invenção descrita aqui também fornece processos para prevenção e/ou tratamento de dor por osteoartrite em um indivíduo por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista de anti-NGF.

A invenção também fornece processos para ajuste da afinidade de um anticorpo e processos para caracterização de uma região de CDR. Técnicas Gerais

A prática da invenção empregará, a menos que de outra forma indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia de célula, bioquímica e imunologia, que estão dentro da prática da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook e outros, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Human Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Pienum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Millerand M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel e outros, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis e outros, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan e outros, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shebi¹ *'<:

R*à:

Λλ pherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Câncer: Principies and Practice of Oncology (V.T. DeVita e outros, eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

Definições

Um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação especifica a um alvo, tal como, carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado aqui, o termo engloba, não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, porém também fragmentos dos mesmos (tais como, Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv), cadeias simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda sítio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tais como IgG, IgA ou IgM (ou subclasses das mesmas), e o anticorpo não precisa ser de qualquer classe especifica. Dependendo da seqüência de aminoácido do anticorpo, do domínio constante de suas cadeias, as imunoglobulinas podem ser avaliadas para classes diferentes. Existe cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias dessas classes podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem-conhectdas.

Fv é um fragmento de anticorpo que contém um sítio de reconhecimento e ligação de antígeno completo. Em uma espécie Fv de duas cadeias, essa região consiste em um dímero de domínio variável de cadeia pesada e leve em associação estreita, não covalente. Em uma espécie Fv de cadeia simples, um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia ι?,.,_Ί

leve pode ser covalentemente ligado por um ligante de peptídeo flexívelpfeÊs * que, as cadeias leve e pesada podem associar-se em uma estrutura dimérica análoga àquela em uma espécie Fv de duas cadeias. É nessa configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir uma especificidade de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Contudo, mesmo um domínio de variável simples (ou metade de um Fv compreendendo apenas 3 CDRs específicas para cada antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora geralmente em uma afinidade inferior aquela de todo o sítio de ligação.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas das regiões de articulação de anticorpo.

Um anticorpo monoclonal se refere a população de anticorpos homogênea onde o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (que ocorrem naturalmente e não naturalmente) que estão envolvidos, na ligação seletiva de um antígeno. Uma população de anticorpos monoclonais é altamente especifica, sendo direcionada contra um sítio antigênico simples. O termo anticorpo monoclonal engloba não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de comprimento pleno, porém também fragmentos dos mesmos (tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno de especificidade necessária e a capacidade de ligar-se a um antígeno. Não se pretende estar limitado as considerações de fonte do anticorpo ou a maneira na qual ele é fabricado (por exemplo, por hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animais transgênicos, etc.).

Conforme usado aqui, anticorpo humano significa um anticorpo possuindo seqüência de aminoácido correspondendo àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que foi fabricado usando quaisquer

técnicas de fabricação de anticorpos humanos conhecidas na técnica ou\?< _;descritas aqui. Essa definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humano ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano. Um exemplo é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada de murino. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Em uma concretização, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fagos, onde aquela biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan e outros, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets e outros, 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks e outros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Os anticorpos humanos podem também ser fabricados por introdução dos locos de imunoglobulina humana nos animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógena foram parcial ou completa mente ativados. Esta abordagem é descrita nas Patentes US números 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado por imortalização dos linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo (tais como, linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ser imunizados in vitro). Vide, por exemplo, Coie e outros, Monoclonal Antibodles and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boernere outros, 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e Patente US número 5.750.373.

Anticorpos quiméricos se refere aqueles anticorpos onde uma porção de cada uma das sequências de aminoácido das cadeias leve e pesada é homóloga às seqüêncÍas correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie especifica ou pertencendo a uma classe especifica, embora o segmento restante das cadeias seja homólogo às seqüências correspondentes em outra. Tipicamente, nesses anticorpos quiméricos, a região variável de ambas cadeia leve e pesada mimetiza as regiões variáveis dos anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto as porções constantes são homólogas às seqüências nos anticorpos derivadas de outras.

Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que, por exemplo, as rêçjí^ *^yões variáveis podem convenientemente ser derivadas de fontes conhecidas presentemente, usando hibridomas pontualmente disponíveis ou células B de organismos hospedeiros não-humanos, em combinação com regiões constantes derivadas, por exemplo, de preparações de célula humana. Embora a região variável tenha a vantagem de facilidade de preparação e a especificidade não seja afetada por sua fonte, a região constante sendo humana, é menos provável de promover uma resposta imune de um indivíduo humano quando os anticorpos são injetados do que seria a região constante de uma fonte não humana. Contudo, a definição não está limitada a esse exemplo específico.

Uma região Fc funcional possui pelo menos uma função efetora de uma região Fc de seqüência nativa. Funções efetoras exemplares incluem ligação C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; infra-regulagem dos receptores de superfície da célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliação de tais funções efetoras de anticorpo.

Uma região Fc de seqüência negativa compreende uma seqüência de aminoácido idêntica à seqüência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Uma região Fc variante compreende uma seqüência de aminoácido que difere daquela de uma região de Fc de seqüência nativa, em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda retendo pelo menos uma função efetora da região Fc de seqüência nativa. Preferivelmente, a região Fc variante possui pelo menos uma substituição de aminoácido em relação a uma região Fc de seqüência nativa ou em relação à região Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácido e preferivelmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de se36

qüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo de origem. A região Fc varP° ante aqui preferivelmente possuirá pelo menos cerca de 80% da identidade de seqüência de uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipetpídeo de origem e mais preferivelmente, pelo menos 90% de identidade de seqüência com a mesma, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência com a mesma.

Conforme usado aqui citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” e ADCC se referem a uma reação mediada por célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células extermínadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. Atividade ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando ensaio ADCC in vitro, tal como, aquele descrito na Patente US número 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativa ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquela descrita em Clynes e outros, 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Conforme usado aqui, receptor Fc e FcR descrevem um receptor que liga-se à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que liga-se a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRl, FcyRlI e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente unidas desses receptores. Os receptores FcyRlI incluem FcyRIIA (um receptor de ativação) e FcyRl IB (um receptor de inibição), que possuem sequências de aminoácido semelhantes que diferem primariamente nos domínios citoplásmicos dos mesmos. FcRs são revistas em Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunoi., 9:457-92; Capei e outros, 1994, immunomethods, 4:25-34; e de Haas e outros, 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. FcR também inclui o receptor neuronatal, FcRn, que é responsável pela transferência dos IgGs maternos para o feto (Guyer e outros, 1976, J. Immunoi., \ ν**

117:587;eKime outros, 1994, J. Immunol., 24:249).

Citotoxicidade dependente de complemento e CDC se referem à lise de um alvo em presença do complemento. A via de ativação de complemento é iniciada por ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexado com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro e outros, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado.

Conforme usado aqui, os termos Έ3, 3E e anticorpo E3 são usados intercambiavelmente para se referir a um anticorpo compreendendo as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve mostradas nas figuras 1A (SEQ ID NO:1) e 1B (SEQ ID NO:2), respectivamente. As porções de CDR do anticorpo E3 (incluindo CDRs Chothia e Kabat) são diagramaticamente ilustradas nas figuras 1A e 1B. As figuras 2 e 3 mostram polinucleotídeos codificando cadeias pesada e leve, respectivamente, compreendendo as regiões variáveis de cadeia pesada e leve mostradas nas figuras 1A e 1B, respectivamente. A geração e caracterização de E3 é descrita nos Exemplos. Funções biológicas diferentes são associadas a E3, incluindo, porém não limitado à capacidade ligar-se a NGF e inibir atividade biológica e NGF e/ou via(s) a jusante mediada(s) por sinalização de NGF; e capacidade de inibir sobrevivência dependente de NGF dos neurônios trigeminais E13.5 do camundongo. Conforme discutido aqui, os anticorpos da invenção podem ter uma ou mais dessas características. Em algumas concretizações, o termo Έ3 se refere a imunoglobulina codificada por (a) um polinucleotídeo codificando cadeia leve E3 que possui um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou ATCC Número PTA-4894, e (b) um polinucleotídeo codificando cadeia pesada E3 que possui um número de depósito da ATCC Número PTA-4895.

Conforme usado aqui, ligação imunoespecífica de anticorpos se refere a uma interação de ligação especifica de antígeno que ocorre entre o sítio de combinação de antígeno de um anticorpo e o antígeno específico reconhecido por aquele anticorpo (isto é, o anticorpo reage com a proteína

em um imunoensaio ELISA ou outro e não reage detectavelmente com as . _;proteínas não correlatas).

Um epítopo que liga-se especificamente ou liga-se preferivelmente (usados intercambiavelmente aqui) a um anticorpo ou um polipeptídeo é um termo bem entendido na técnica, e processos para determinar tal ligação especifica ou preferencial são bem-conhecidos na técnica. Uma molécula é dita como exibindo ligação especifica ou ligação preferencial se ela reagir ou associar-se mais freqüentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com afinidade maior a uma célula especifica ou substância do que com as células ou substâncias alternativas. Um anticorpo liga-se especificamente ou liga-se preferivelmente a um alvo se ele liga-se com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com duração maior do que ele liga-se a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que liga-se especifica ou preferivelmente a um epítopo NGF é um anticorpo que liga-se a este epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos NGF ou epítopos não NGF. É também entendido por leitura dessa definição que, por exemplo, um anticorpo (ou fração ou epítopo) que liga-se especifica ou preferivelmente ao primeiro alvo pode ou não ligar-se especifica ou preferivelmente a um segundo alvo. Como tal, ligação especifica ou ligação preferencial não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. De modo geral, porém não necessariamente, referência à ligação significa ligação preferencial.

O termos polipeptídeo, oligopeptídeo, peptídeo e proteína são usados intercambiavelmente aqui para referir-se aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como, conjugação com um componente de marcação. Também encontram-se dentro dessa definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um

¹¹ Rüír.

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V? η -ΧΛ ’ ^Vrrs aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.) bem como outras modificações conhecidas na técnica. Fica entendido que, uma vez que os polipeptídeos dessa invenção tem como base um anticorpo, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas.

Polinucleotídeo, ou ácido nucléico, conforme usado aqui intercambiavelmente, se refere aos polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser dessoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado ao polímero por uma polimerase de DNA ou RNA. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como, nucleotídeos metilados e seus análogos. Caso presente, a modificação à estrutura de nucleotídeo pode ser fornecida antes ou após montagem do polímero. A seqüência de nucfeotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeo. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após pulverização, tal como, por conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, coberturas, substituição de um ou mais dos nucleotídeos ocorrendo naturalmente com um análogo, modificações internucleotídeo, tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) aquelas contendo frações pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, ply-L-lisina, etc.) aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.) aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.) aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléicos anoméricos alfa, etc.) bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Adicionalmente, qualquer um dos grupos hidroxila comumente presente nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão ou ativados para preparar ligações adicionais aos nucleotídeos adicionais ou podem ser conjugados aos supor40 tes sólidos. OH terminal 5’ e 3’ pode ser fosforilado ou substituído com ÍrtÜ?g nas ou gerações de grupos de cobertura orgânica de cerca de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidrólises também podem ser derivadas para grupos de proteção padrão. Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares de ribose ou dessoxirribose, que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2’—O-metil-, 2’-O-alÍI, 2’-flúor- ou 2’-azidoribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como, arabinose, xiloses, ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sebo-heptuloses, análogos acrílicos e análogos de nucleosídeo abásico, tais com, metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, porém não estão limitados às concretizações onde o fosfato é substituído por P(O)S(tioato), P(S)S(ditioato), (O)NR₂(amidato), P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH₂ (formacetal), onde cada R ou R’ é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente aplica-se a todos os polinucleotídeos referidos aqui, incluindo RNA e DNA.

Uma região variável de um anticorpo se refere à região variável da cadeia leve do anticorpo ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinha quanto em combinação. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve consistem, cada, em quatro regiões de estrutura (FR) conectadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade pelas FRs, e com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação de sítios de ligação de antígeno dos anticorpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinação das CDRs: (1) uma abordagem com base na variabilidade da seqüência de espécies cruzadas (isto é, Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5^aed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) uma abordagem com base nos estudos cristalográficos de complexos de antígeno41

anticorpo (Chothia e outros, (1989) Nature 342:877; Al-lazikani e’^?0qtros\^v>· (1997) J, Molec. Biol. 273:927-948)). Conforme usado aqui, uma CDR pode se referir as CDRs definidas tanto por abordagem quanto por combinação de ambas abordagens.

Uma região constante de um anticorpo se refere a uma região constante de cadeia leve do anticorpo ou uma região constante de cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinha ou em combinação.

Conforme usado aqui, os termos fator de crescimento nervoso e NGF se refere ao fator de crescimento nervoso e variantes do mesmo que mantém, pelo menos, parte da atividade biológica de NGF. Conforme usado aqui, NGF inclui todas espécies de mamíferos de NGF de seqüência nativa, incluindo humana, canina, felina, eqüina ou bovina.

Receptor de NGF¹' se refere a um polipeptídeo que é ligado ou ativado por NGF. Os receptores de NGF incluem o receptor de TrkA e o receptor p75 de qualquer espécie de mamífero, incluindo, porém não limitado aos seres humanos, caninos, felinos, eqüinos, primatas ou bovinos.

Conforme usado aqui, anticorpo antagonista de anti-NGF (intercambiavelmente denominado anticorpo anti-NGF) se refere a um anticorpo que é capaz de ligar-se ao NGF e inibir atividade biológica de NGF e/ou via(s) a jusante mediada(s) por sinalização de NGF. Um anticorpo antagonista de anti-NGF engloba anticorpos que bloqueiam, antagonizam, suprimem ou reduzem (incluindo significativamente) a atividade biológica de NGF, incluindo vias a jusante mediadas por sinalização de NGF, tais como, ligação de receptor e/ou fornecimento de uma resposta celular para NGF. Para fins da presente invenção, será explicitamente entendido que o termo anticorpo antagonista de anti-NGF engloba todos os termos identificados anteriormente, títulos e estados funcionais e características, pelo que, o NGF propriamente, uma atividade biológica de NGF (incluindo porém não limitado a sua capacidade de mediar qualquer aspecto da dor pós-cirúrgica) ou as conseqüências da atividade biológica são substancialmente anuladas, diminuídas ou neutralizadas em qualquer grau significante. Em algumas concretizações, um anticorpo antagonista de anti-NGF liga-se ao NGF e impede dimerização de NGF e/ou ligação a um receptor de NGF (tal como, p75 e/õu.. trkA). Em outras concretizações, um anticorpo anti-NGF liga-se a NFG e impede dimerização do receptor trkA e/ou autofosforilação de trkA. Exemplos de anticorpos antagonistas de anti-NGF são providos aqui.

Atividade biológica” de NGF se refere à capacidade de ligação dos receptores de NGF e/ou ativação das vias de sinalização do receptor NGF. Sem limitação, uma atividade biológica inclui qualquer um dos que se seguem: a capacidade de ligar um receptor de NGF (tais como p75 e/ou trkA); a capacidade de promover dimerização do receptor trkA e/ou autofosforilação; a capacidade de ativar uma via de sinalização de receptor de NGF; a capacidade de promover a diferenciação da célula, proliferação, sobrevivência, crescimento e outras alterações na fisiologia da célula, incluindo (no caso dos neurônios, inclusão de neurônio periférico e central) alteração na morfologia neuronal, sinaptogênese, função sináptica, liberação do neurotransmissor e/ou neuropeptídeo e regeneração do dano seguinte; capacidade de promover sobrevivência dos neurônios trigeminais E13.5 do camundongo e capacidade de mediar dor, incluindo dor pós-cirúrgica.

Conforme usado aqui, substanciaimente puro” se refere ao material que é pelo menos 50% puro (isto é, isento de contaminantes), mais preferivelmente peio menos 90% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, mais preferivelmente pelo menos 99% puro.

A célula hospedeira inclui uma célula individual ou cultura de célula que pode ser ou ter sido um recipiente para vetor(es) para incorporação de inserções de polinucleotídeo. As células hospedeiras incluem progênie de uma célula hospedeira simples, e a progênie pode não necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) para a célula de origem original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleottdeo(s) dessa invenção.

Conforme usado aqui, tratamento é uma abordagem para obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. Para fins dessa in43

venção, resultados benéficos ou clínicos desejados incluem, porém não es-^A^S ' tão limitados a um ou mais dos que se seguem: aperfeiçoamento ou alívio de qualquer aspecto de dor, incluindo dor aguda, crônica, inflamatória, neuropática, pós-cirúrgica, dor por artrite reumatóide ou dor por osteoartrite. Para fins dessa invenção, resultados benéficos ou clínicos desejados incluem, porém não estão limitados a um ou mais dos que se seguem: incluindo abrandamento da gravidade, alívio de um ou mais sintomas associados à dor incluindo qualquer aspecto de dor (tal como, encurtamento da duração da dor, redução da sensibilidade à dor ou sensação).

Uma quantidade eficaz de medicamento, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar os resultados benéficos ou desejados incluindo resultados clínicos, tais como, alívio ou redução na sensação da dor. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para fins dessa invenção, uma quantidade eficaz de medicamento, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para tratar, melhorar, reduzir a intensidade e/ou prevenir a dor, incluindo dor pós-cirúrgica, dor por artrite reumatóide e/ou dor por osteoartrite. Em algumas concretizações, a quantidade eficaz pode reduzir a dor em repouso (dor em repouso) ou dor induzida mecanicamente (incluindo dor após movimento) ou ambas, e pode ser administrada antes, durante ou após uma incisão, corte, rasgo ou lesão e/ou antes, durante ou após estímulos dolorosos. Conforme é entendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um medicamento, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser obtida em conjunto com outro medicamento, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma quantidade eficaz pode ser considerada no contexto de administração de um ou mais agentes terapêuticos e um agente simples pode ser considerado como sendo fornecido em uma quantidade eficaz, se em conjunto com um ou mais de outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é obtido.

Redução da incidência de dor significa qualquer redução de gravidade (que pode incluir reduzir a necessidade e/ou quantidade de (por exemplo, exposição a) outras drogas e/ou terapias geralmente usadas nesya -¾ sas condições, incluindo, por exemplo, opiatos), duração e/ou freqüêncíã-^g - v'' (incluindo, por exemplo, retardo ou aumento do período para dor póscirúrgica em um indivíduo). Conforme é entendido pelos versados na técnica, os indivíduos podem variar em termos de resposta ao tratamento e, como tal, por exemplo, um processo de redução da incidência de dor por artrite reumatóide ou dor por osteoartrite em um indivíduo reflete administração de um anticorpo antagonista de anti-NGF com base em uma expectativa razoável de que tal administração pode provavelmente causar tal redução na incidência naquele indivíduo específico.

Melhora de uma dor ou um ou mais sintomas de uma dor (tal como, dor por artrite reumatóide ou dor por osteoartrite) significa um abrandamento ou aperfeiçoamento de um ou mais sintomas de uma dor quando comparados a não administração de um anticorpo antagonista de anti-NGF. Melhora também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.

Alívio de uma dor ou de um ou mais sintomas de uma dor (tal como, dor por artrite reumatóide ou dor por osteoartrite) significa abrandamento da extensão de uma ou mais manifestações clínicas de dor póscirúrgica em um indivíduo ou população de indivíduos tratados com um anticorpo antagonista de anti-NGF, de acordo com a invenção.

Conforme usado aqui, retardo do desenvolvimento de dor significa defender, esconder, retardar, estabilizar e/ou postergar da progressão da dor, tal como, dor pós-cirúrgica, dor por artrite reumatóide ou dor por osteoartrite. Esse retardo pode ser por períodos variados de tempo, dependendo do histórico da doença e/ou indivíduos sendo tratados. Como é evidente a um versado na técnica, um retardo suficiente ou significativo pode, por exemplo, englobar prevenção, pelo que o indivíduo não desenvolve dor. Um processo que retarda o desenvolvimento do sintoma é um processo que reduz a probabilidade de desenvolvimento do sintoma em um dado período de tempo e/ou reduz a extensão dos sintomas em um dado período de tempo, quando comparado ao não uso do processo. Tais comparações são tipicamente baseadas em estudos clínicos, usando um número estatísticaο.** \· οmente significativo de indivíduos.

Dor conforme usado aqui, se refere a dor de qualquer etiologia, incluindo dor aguda e crônica e qualquer dor com um componente inflamatório. Exemplos de dor incluem dor pós-cirúrgica, dor pós-operatória (incluindo dor de dente), enxaqueca, dor de cabeça e neuralgia trigeminal, dor associada à queimadura, ferida ou pedra nos rins, dor associada a trauma (incluindo lesão traumática na cabeça), dor neuropática, dor associada aos distúrbios músculo-esqueletais, tais como, artrite reumatóide, osteoartrite, espondilíte ancilosante, artropatías soro-negativas, (não reumatóides), reumatismo não articular e distúrbios peri-articulares e dor associada ao câncer (incluindo dor por penetração e dor associada ao câncer terminal), neuropatia periférica e neuralgia pós-herpética. Exemplos de dor com um componente inflamatório (além de alguns desses descritos acima) incluem dor reumática, dor associada à mucosite e dismenorréia.

Dor pós-ciúrgica (intercambiavelmente denominada pósincisionar ou dor pós-traumática se refere a dor que surge ou resulta de um trauma externo, tal como, um corte, punção, incisão, rasgo ou ferida no tecido de um indivíduo (incluindo aquela que surge de todos procedimentos cirúrgicos, se invasivos ou não). Conforme usado aqui, dor pós-cirúrgica não inclui dor que ocorre (surge ou origina-se) sem um trauma físico externo. Em algumas concretizações, dor pós-cirúrgica é uma dor interna ou externa (incluindo periférica) e a ferida, corte, trauma, rasgo ou incisão pode ocorrer acidentalmente (como com uma ferida traumática) ou deliberadamente (como com uma incisão cirúrgica). Conforme usado aqui, dor inclui nocicepção e a sensação da dor, e a dor pode ser avaliada objetiva e subjetivamente usando classificações de dor e outros processos bem-conhecidos na técnica. Dor pós-cirúrgica, conforme usado aqui, inclui alodinia (isto é, resposta aumentada a um estímulo normalmente não nocivo) e hiperalgesia (isto é, resposta aumentada a um estímulo nocivo ou desagradável) que pode, por sua vez, ser térmico ou mecânico (tátil) em sua natureza. Em algumas concretizações, a dor é caracterizada por sensibilidade térmica, sensibilidade mecânica e/ou dor em repouso. Em algumas concretizações, a dor pós46 cirúrgica compreende dor induzida mecanicamente ou dor em repouso. Em outras concretizações, a dor pós-cirúrgica compreende dor em repouso. A dor pode ser primária ou secundária, como é bem conhecido na técnica.

Uma amostra biológica engloba vários tipos de amostras obtidas de um indivíduo e pode ser usada em um ensaio de diagnóstico ou monitoramento. A definição engloba sangue e outras amostras de líquido de origem biológica, amostras de tecido sólido, tais como, espécimes de biópsia ou culturas de tecido ou células derivadas dos mesmos e a progênie dos mesmos. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer modo após sua consecução, tais como, por tratamento com reagentes, solubílização ou enriquecimento por determinados componentes, tais como, proteínas ou polinucleotídeos, ou embebimento em uma matriz semisótida ou sólida para fins de seccionamento. O termo amostra biológica engloba uma amostra clínica, e também inclui células em cultura, sobrenadantes de célula, lisados de célula, soro, plasma, fluido biológico e amostras de tecido.

Um indivíduo é um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. Mamíferos incluem, porém não estão limitados aos animais de fazenda (tais como gado), animais para esporte, animais domésticos (tais como, gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos.

Conforme usado aqui, vetor significa um constructo, que é capaz de liberar e preferivelmente expressar, um ou mais genes ou seqüências de interesse em uma céluia hospedeira. Exemplos de vetores incluem, porém não estão limitados aos vetores viróticos, ou vetores de expressão de DNA ou RNA nu, plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados aos agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas e determinadas células eucarióticas, tais como, células produtoras.

Conforme usado aqui, seqüência de controle de expressão significa uma seqüência de ácido nucléico que direciona a tamscrição de um ácido nucléico. Uma seqüência de controle de expressão pode ser um pro47

motor, tal como um promotor constitutivo ou induzível ou um melhorador. A seqüência de controle de expressão é operativamente ligada à seqüência de ácido nucléico a ser transcrita.

Conforme usado aqui, veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e seja não reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, porém não são limitados a quaisquer veículos farmacêuticos padrão, tais como, solução de salmoura tamponada em fosfato, água, emulsões, tais como, emulsão de óleo/água e vários tipos de agentes umectantes. Diluentes preferidos para aerossol ou administração parenteral são salmoura tamponada em fosfato ou salmoura normal (0,9%). Composições compreendendo tais veículos são formuladas por processos convencionais bem-conhecidos (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^a edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^aEd. Mack Publishing, 2000).

O termo IV, conforme usado aqui, se refere à constante de razão de desligamento para dissolução de um anticorpo do complexo de anticorpo/antígeno.

O termo K/, conforme usado aqui, se refere à constante de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno.

Anticorpo E3, Anticorpos Derivados de E3, Composições e Processos de Uso

Composições de E3, Composições Derivadas de E3 e Processos para Fabricação das Composições

Essa invenção engloba composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um anticorpo E3 ou polipeptídeo; e polinucleotídeos compreendendo sequências codificando um anticorpo E3 ou polipeptídeo. Conforme usado aqui, composições compreendem um ou mais anticorpos ou polipeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) que ligamse ao NGF, e/ou um ou mais polinucleotídeos compreendendo seqüências codificando um ou mais anticorpos ou polipeptídeos que ligam-se ao NGF. Essas composições podem compreender, adicionalmente, excipientes apro48 priados, tais como, excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem-conhecidos na técnica.

A invenção também engloba concretizações de anticorpo isolado, polipeptídeo e polinucleotídeo. A invenção também engloba concretizações de anticorpo substancial mente puro, polipeptídeo e polinucleotídeo.

Os anticorpos e polipeptídeos da invenção são caracterizados por qualquer (uma ou mais) das características que se seguem: (a) capacidade de ligar-se ao NGF; (b) capacidade de reduzir e/ou inibir a atividade biológica de NGF e/ou via(s) a jusante mediada(s) por sinalização de NGF; (c) capacidade de reduzir e/ou inibir a sobrevivência dependente de NGF dos neurônios trigeminais de E13.5; (d) ausência de qualquer reatividade cruzada significativa para NT3, NT4/5 e/ou BDNF; (e) capacidade de tratar e/ou prevenir dor (incluindo dor pós-cirúrgica); (f) capacidade de aumentar o espaço de NGF; (g) capacidade de reduzir ou inibir a ativação do receptor de trkA, conforme detectado, por exemplo, usando o ensaio de ativação de receptor de quinase (KIRA) (vide por exemplo, Patente US número 6.027.927).

As propriedades de ligação do anticorpo E3, que liga NGF humano com alta afinidade e cinética de dissociação lenta, em comparação ao anticorpo 911 monoclonal de anti-NGF de murino de origem, são resumidas a seguir. E3 liga NGF humano com uma afinidade de ligação cerca de 50 vezes maior do que o anticorpo 911 de camundongo de origem.

anticorpo	k_D	Koff	Kon
911 (Fab)	3,7 nM	9x10’⁵s¹	2,2x1 OWs¹
E3 (Fab)	0,07 nM	<4x10'⁵s'¹	6x10^sM¹s'¹

O anticorpo E3 e anticorpos correlatos também exibem uma forte capacidade de antagonizar NGF humano, conforme avaliado em ensaios in vitro (vide Exemplos 2 e 3). Por exemplo, o anticorpo E3 antagoniza a sobrevivência dependente de NGF dos neurônios trigeminais E13 de camundongo em um IC50 de cerca de 21 pM, em presença de 15 pM de NGF humano, e cerca de 1,2 pM em presença de 1,5 pM de NGF humano.

Conseqüentemente, em um aspecto, os anticorpos^polipep^' deos da invenção são adicionalmente identificados e caracterizados por: (h) ligação de alta afinidade aos NGF humano com cinética de dissociação lenta (em algumas concretizações, com um K_D inferior a cerca de 2 nM, e/ou um koff mais lento que cerca de 6x10-5 s-1) e/ou (i) capacidade de inibir (bloquear) sobrevivência dependente de NGF dos neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 de cerca de 100 pM ou menos a cerca de 15 pM de NGF (em algumas concretizações, NGF humano) e/ou um IC50 de cerca de 20 pM ou menos a cerca de 1,5 pM de NGF.

Em algumas concretizações, o anticorpo se liga ao NGF humano e não se liga especificamente ao NGF de outras espécies vertebradas (em algumas concretizações, mamíferos). Em algumas concretizações, o anticorpo se liga ao NGF humano, bem como a um ou mais NGF de outras espécies vertebradas (em algumas concretizações, mamíferos). Ainda em outras concretizações, o anticorpo se liga ao NGF e não reage de forma cruzada, significativa mente com outras neurotrofinas (tais como, neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5 e/ou BDNF). Em algumas concretizações, o anticorpo se liga ao NGF, bem como pelo menos uma outra neurotrofina. Em algumas concretizações, o anticorpo se liga às espécies de mamíferos de NGF, tais como, cavalo ou cachorro, porém não se liga significativamente ao NGF de outras espécies de mamíferos.

Em algumas concretizações, a invenção é um anticorpo compreendendo uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC Número PTA-4893 ou ATCC Número PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção representa um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. A presente invenção também engloba várias formulações de E3 e fragmentos de anticorpo equivalentes (por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc.), mutantes de cadeia simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada de

E3 que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno (NGF) de especificidade necessária. Os anticorpos equivalentes de E3, incluindo anticorpo e fragmentos de polipeptídeo (que podem ou não ser anticorpos) de E3 e polipeptídeos compreendendo fragmentos de polipeptídeo de E3 são identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos critérios descritos acima.

Conseqüentemente, a invenção provê qualquer um dos que se seguem ou composições (incluindo composições farmacêuticas) compreendendo quaisquer um dos que se seguem: (a) anticorpo E3; (b) um fragmento ou região do anticorpo E3; (c) uma cadeia leve do anticorpo E3, conforme mostrada nas figuras 1B; (c) uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado nas figuras 1A; (d) uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3; (e) uma ou mais CDR(s) (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo E3 mostradas nas figuras 1A e 1B; (f) CDR H3 da cadeia pesada de anticorpo E3 mostrada na figura 1A; (g) CDR L3 da cadeia leve de anticorpo E3 mostrada na figura 1B; (h) três CDRs da cadeia leve de anticorpo E3 mostrada na figura 1B; (i) três CDRs da cadeia pesada de anticorpo E3 mostrada na figura 1 A; (j) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada, de anticorpo E3 mostrada nas figuras 1A e 1B; e (k) um anticorpo compreendendo qualquer um de (b) a (j). Como é evidente da descrição aqui, são especificamente excluídas da invenção as concretizações de peptídeo consistindo em seqüência de aminoácido idêntica à seqüência de aminoácido do anticorpo monoclonal 911 de camundongo. As seqüêncías de CDR estendidas de Mab 911 são mostradas nas figuras 1A e 1B e nas SEQ ID NOS:9-14.

As porções de CDR do anticorpo E3 (incluindo CDRs Chothia e Kabat) são diagramaticamente ilustradas nas figuras 1A e 1B e consistindo nas seqüêncías de aminoácido que se seguem: (a) CDR 1 de cadeia pesada (CDR H1) GFSLIGYDLN (SEQ ID NO:3); (b) CDR 2 de cadeia pesada (CDR H2) IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID NO:4); (c) CDR 3 de cadeia pesada (CDR H3) GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO:5); (d) CDR 1 de cadeia leve (CDR L1) RASQSISNNLN (SEQ ID NO:6); (e) CDR 2 de cadeia

leve (CDR L2”) YTSRFHS (SEQ ID NO:7); e (f) CDR 3 de cadeia leve^^S DR L3) QQEHTLPYT (SEQ ID NO:8), Determinação de regiões de CDR está bem dentro da prática na técnica. É entendido que em algumas concretizações, CDRs pode ser uma combinação de CDR Kabat e Chothia (também denominadas CDRs combinadas ou CDRs estendidas). Em algumas concretizações, as CDRs compreendem a CDR Kabat. Em outras concretizações, as CDRs são CDR Chothia.

Em algumas concretizações, a invenção provê um anticorpo que compreende, pelo menos uma CDR que é substancialmente homóloga a pelo menos um CDR, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos 5 CDRs de E3 (ou, em algumas concretizações substancialmente homólogas a 6 CDRs de E3 ou derivadas de E3). Outras concretizações incluem anticorpos que possuem pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs que são substancialmente homólogas a pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs de E3 ou derivados de E3. É entendido que, para fins dessa invenção, especificidade de ligação e/ou atividade total (que pode ser em termos de tratamento e/ou prevenindo dor ou inibindo sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo) é geralmente retida, embora a extensão da atividade possa variar em comparação de E3 (pode ser maior ou menor).

A invenção também provê um polipeptídeo (que pode ou não ser um anticorpo) que compreende uma sequência de aminoácido de E3 (mostrada nas figuras 1A e 1B) que possui quaisquer um dos que se seguem: pelo menos 5 aminoácidos contínuos, pelo menos 8 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contínuos de uma seqüência de E3, onde pelo menos 3 dos aminoácidos são de uma região variável de E3, com o entendimento de que as concretizações que consistem na seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de anticorpo 911 monoclonal de camundongo são especificamente excluídas. As seqüências de CDR estendidas de Mab 911 %

- V

Χΰ· são mostradas nas figuras 1A e 1B e nas SEQ ID NOS:9-14. Em uma concretização, a região variável é de uma cadeia leve de E3. Em outra concretização, a região variável é de uma cadeia pesada de E3. Em outra concretização, os 5 (ou mais) aminoácidos contínuos são de uma região determinante de complementariedade (CDR) de E3 mostrada nas figuras 1A e 1B.

Em outra concretização, a invenção fornece um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido de E3 que possui qualquer um dos que se seguem: pelo menos 5 aminoácidos contínuos, pelo menos 8 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 20 amínoácidos contínuos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contínuos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contínuos de uma seqüência de E3, onde a seqüência de E3 compreende qualquer um ou mais de: resíduo de aminoácido L29 de CDRH1, 150 de CDRH2, W101 de CDRH3, e/ou A103 de CDRH3;

e/ου resíduo de aminoácido S28 de CDRL1, N32 de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E de CDRL3 e/ou H92 de CDRL3, com o entendimento de que as concretizações que consistem na seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de anticorpo monoclonal 911 de camundongo, são especificamente excluídos.

Como é evidente, através dessa descrição, um esquema de numeração de aminoácido seqüencial é usado para referir aos resíduos de aminoácido nas regiões variáveis (isto é, os resíduos de aminoácido em cada região variável são numerados em seqüência). Como é bem conhecido na técnica, os sistemas de numeração Kabat e/ou Chothia são úteis quando comparando dois anticorpos ou polipeptídeos, tais como um anticorpo E3 e uma variante E3 (ou polipeptídeo suspeito de ser uma variante de E3). É bem sabido na técnica como converter numeração seqüência em numeração Chothia e/ou Kabat, caso desejado, por exemplo, para usar na comparação entre E3 e outro polipeptídeo. A figura 23 ilustra as regiões variáveis E3 numeradas usando numeração seqüencial, Chothia e Kabat. Além disso, para facilitar comparação, geralmente, é entendido que os resíduos de estrutura geralmente, porém não sempre, possuem aproximadamente o mesmo nú53 'í' mero de resíduos. Contudo, as CDRs podem variar de tamanho (isto é, é possível ter inserções e/ou deleções de um ou mais resíduos de aminoácido). Quando comparando um anticorpo E3 e uma variante E3 candidata (por exempío, no caso de uma região CDR de uma seqüência candidata que é mais longa na seqüência no anticorpo E3 a qual é alinhada), pode-se seguir as etapas abaixo (embora outros processos sejam conhecidos na técnica). A seqüência de anticorpo candidato é alinhada com as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo E3. O alinhamento pode ser feito manualmente ou por computador, usando programas de computador geralmente aceitos. O alinhamento pode ser facilitado por uso de alguns resíduos de aminoácido que são comuns a maioria das sequências Fab. Por exemplo, as cadeias leve e pesada possuem cada uma, tipicamente, duas cisteínas, que são freqüentemente verificadas em uma posição conservada. É entendido que a seqüência de aminoácido de um anticorpo variante candidato pode ser maior (isto é, possuir resíduos de aminoácido inseridos) ou mais curta (possuir resíduos de aminoácido deletados). Sufixos podem ser adicionados ao número de resíduo para indicar a inserção de resíduos adicionais, por exemplo, resíduo 34 abc. Para seqüências candidatas que, por exemplo, alinham-se com uma seqüência E3 para, por exemplo, resíduos 33 e 35, porém não possuem resíduo entre os mesmos para alinhar com o resíduo 35, o resíduo 35 simplesmente não é classificado como um resíduo. Em outra abordagem, é geralmente bem conhecido que a comparação possa ser feita entre aminoácidos equivalentes estruturais (por exemplo, alguma posição no complexo de antígeno-anticorpo), em comparação às CDRs de comprimentos diferentes. Por exemplo, a numeração Chothia (Al-Lazikani e outros, supra), geralmente (porém não em todos os casos), coloca inserções e deleções nas posições estruturalmente corretas. Equivalência estrutural pode também ser deduzida ou demonstrada usando cristalografia de raio-x ou análise de ciclo mutante dupla (vide Pons e outros (1999) Prot. Sei. 8:958-968).

A afinidade de ligação de um anticorpo anti-NGF em relação ao NGF (tal como hNGF) pode ser de cerca de 0,10 a cerca de 0,80 nM, cerca de 0,15 a cerca de 0,75 nM e cerca de 0,18 a cerca de 0,72 nM. Em aigu-

mas concretizações, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM ou superior a cerca de 40 pM. Em uma concretização, a afinidade de ligação está entre cerca de 2 pM e 22 pM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nnM, cerca de 3,5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2,5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é de cerca de 10 nM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 10 nM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é de cerca de 0,1 nM ou cerca de 0,07 nM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 0,1 nM ou inferior a cerca de 0,07 nM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é qualquer um de cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nnM, cerca de 3,5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2,5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM a qualquer de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM ou cerca de 40 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é de cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nnM, cerca de 3,5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2,5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM. Ainda em outras concretizações, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, ,>áa?z

cerca de 20 pM, cerca de 40 pM ou superior a cerca de 40 pM.

A afinidade de ligação do anticorpo ao NGF pode ser determinada usando processos bem-conhecidos na técnica. Um modo de determinar a afinidade de ligação dos anticorpos ao NGF é por medição da afinidade dos fragmentos Fab monofuncionais do anticorpo, conforme descrito nos Exemplos. Para obter os fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode se clivado com papaína ou expresso recombinantemente. A afinidade de um fragmento anti-NGF Fab de um anticorpo pode ser determinada por ressonância de plasmônio de superfície (sistema de ressonância de plasmônio de superfície (SPR) BIAcore3000®, BlAcore, INC, Piscaway, NJ), conforme descrito nos Exemplos. Esse protocolo é apropriado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo ao NGF de qualquer espécie, incluindo NGF humano, NGF de outro vertebrado (em algumas concretizações, mamíferos) (tais como, NGF de camundongo, NGF de rato, NGF de primata), bem como para uso com outras neurotrofinas, tais como, as neurotrofinas correlatas NT3, NT4/5 e/ou BDNF.

Em algumas concretizações, os anticorpos ou peptídeos da invenção podem inibir (reduzir e/ou bloquear) a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 15 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM ou menos. Em algumas concretizações, os anticorpos ou peptídeos da invenção podem inibir (reduzir e/ou bloquear) sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM ou menos. Em algumas concretizações, os anticorpos ou peptídeos da invenção podem inibir (reduzir e/ou bloquear) sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com um IC50 (em presença de cerca de 15 pM de NGF) de qualquer um de cerca de 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM ou menos. Em algumas concretizações, os anticorpos ou peptídeos da invenção podem inibir (reduzir e/ou bloquear) sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônios

de camundongo com um JC50 (em presença de cerca de 1,5 pM de NGFJdê%_x:; qualquer um de cerca de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM ou menos. Processos para medição da sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13 de camundongos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, no Exemplo 2.

A invenção também fornece processos para fabricação de quaisquer desses anticorpos ou polipeptídeos. Os anticorpos dessa invenção podem ser fabricados por procedimentos conhecidos na técnica, alguns dos quais são ilustrados nos Exemplos. Os polipeptídeos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra dos anticorpos, por processos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão), conforme descrito acima ou por síntese química. Os polipeptídeos de anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos de até cerca de 50 aminoácidos são convenientemente fabricados por síntese química. Os processos de síntese química são conhecidos na técnica e encontram-se comercial mente disponíveis. Por exemplo, um anticorpo E3 podería ser produzido por um sintetizador de polipeptídeo automatizado empregando o processo de fase sólida. Vide também, Patentes US números 5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415. Anticorpos qutméricos ou híbridos podem também ser preparados in vitro usando processos conhecidos de química de proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou por formação de uma ligação de tioéster. Exemplos de reagentes apropriados para essa finalidade incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimÍdato.

Em outra alternativa, os anticorpos podem ser fabricados recombinantemente usando procedimentos que são bem-conhecidos na técnica. Em uma concretização, um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência codificando as regiões de cadeia variável e leve do anticorpo E3 (conforme mostrado nas figuras 1A e 1B) é clonado em um vetor para expressão ou propagação em uma célula hospedeira (por exemplo, células CHO). Em outra concretização, as seqüências de polinucleotídeo mostradas

nas figuras 2 e 3 são clonadas em um ou mais vetores para expressãa'ô’u^ propagação. A seqüência codificando o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. Vetores (incluindo vetores de expressão) e células hospedeiras são adicionalmente descritos aqui. Os processos para expressão recombinante dos anticorpos nas plantas ou leite foram descritos. Vide, por exemplo, Peeters e outros, (2001) Vaccine 19:2756; Lonberg, N. and D. Huszar(1995) Int.Rev.lmmunol 13:65; e Pollock e outros, (1999) J Immunol Methods 231:147. Os processos para fabricação de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, cadeia simples, etc. são conhecidos na técnica.

A invenção também engloba fragmentos de região variável de cadeia simples (scFv) de anticorpos dessa invenção, tais como E3. Fragmentos de região variável de cadeia simples são fabricados por ligação de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada por uso de um peptídeo de ligação curta. Bird e outros, (1988) Science 242:423-426. Um exemplo de um peptídeo de ligação é (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 15), que liga em ponte aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carbóxi de uma região variável e o terminal amino de outra região variável. Ligantes de outras seqüências foram designados e usados (Bird e outros, (1988)). Os ligantes podem, por sua vez, ser modificados por funções adicionais, tais como, anexação das drogas ou anexação aos suportes sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas tanto recombinante quanto sinteticamente. Para produção sintética de scFv, um sintetizador automatizado pode ser usado. Para produção recombinante de scFv, um plasmídeo apropriado contendo polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada, tanto eucariótica, tal como células de levedura, planta, inseto ou de mamíferos, ou procarióticas, tais como, E.coli. Os polinucleotídeos codificando o scFv de interesse podem ser feitos por manipulação de rotina tais como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnicas de purificação de proteína padrão conhecidas na técnica.

Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como, dia58 corpos são também englobados. Diacorpos são anticorpos bivalentes, bies-> ν’ pecíficos, nos quais, os domínios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo simples, porém usando um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desta forma, forçando os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (vide por exemplo,

Holliger, P., e outros, (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R, J., e outros, (1994) Structure 2:1121-1123).

O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico, um anticorpo monoclonal que possui especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Um anticorpo biespecífico pode se preparado usando os anticorpos descritos aqui. Os processos para fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (vide por exemplo, Suresh e outros,

1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradicionalmente, a produção re- . combinante de anticorpos biespecíficos baseou-se na co-expressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina, com as duas cadeias pesadas possuindo especificidades diferentes (Millstein e Cuello, 1983,

Nature 305, 537-539).

De acordo com uma abordagem para fabricação de anticorpos biespecíficos, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades desejadas (sítios de combinação de anticorpo-antígeno) são fundidos às seqüências de domínio constante da imunoglobulina. A fusão preferivelmente é realizada com domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter-se a primeira região constante de cadeia pesada (CH1), contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs codificando as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, caso desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transferidos para um organismo hospedeiro apropriado. Isto fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo nas concretizações, quando razões não iguais de três cadeias de polipeptídeo usadas na cons59

'ζ # trução fornecem os rendimentos ótimos. Contudo, é possível inserir - y¹· qüências de codificação para duas ou três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em altos rendimentos ou quando as razões não têm significado específico.

Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação em uma ramificação, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (provendo uma segunda especificidade de ligação) em outra ramificação. Essa estrutura assimétrica, com uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica, facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas. Esta abordagem é descrita na Publicação PCT número WO 94/04690, publicada em 3 de março de 1994.

Anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anticorpos unidos covalentemente, também encontram-se dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos foram usados para alvejar células do sistema imune em células indesejadas (Patente US número 4.676.980) e para tratamento de infecção por HIV (Publicação de Pedidos PCT números WO 91/00360 e WO 92/200373; EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados usando qualquer processo de reticulação conveniente. Agentes de reticulação apropriados e técnicas são bem-conhecidos na técnica e são descritos na Patente US número 4.676.980.

O anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, por exemplo, conforme conhecido na técnica e conforme descrito aqui.

Os anticorpos podem ser modificados conforme descrito na Publicação PCT número WO 99/58572, publicada em 18 de novembro de 1999.

Esses anticorpos compreendem, além de um domínio de ligação direcionado na molécula alvo, um domínio efetor possuindo uma seqüência de aminoácido substancialmente homóloga à toda ou parte de um domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Esses anticorpos são capazes de ligar-se à molécula alvo, sem desencadear lise dependente de complemento

significativa ou destruição mediada da célula do alvo. Preferivelmente, o dò^K_T;-, mínio efetor é capaz de ligar especificamente FcRn e/ou FcyRllb. Esses tem como base tipicamente os domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Anticorpos modificados dessa maneira são preferidos para uso na terapia de anticorpo crônico, para evitar reações inflamatórias e outras reações adversas à terapia de anticorpo convencional.

A invenção engloba modificações ao anticorpo E3, incluindo anticorpos funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente suas propriedades e variantes que possuem atividade melhorada ou diminuída.

A modificação dos polípeptídeos é prática rotineira na técnica e é adicionalmente exemplificada nos Exemplos. Os exemplos de polípeptídeos modificados incluem polípeptídeos com substituições (incluindo substituições conservadoras) de resíduos de aminoácido, uma ou mais deleções ou adições . de aminoácidos que significativamente não alteram prejudicialmente a atividade funcional ou uso de análogos químicos.

Uma variante de polipeptídeo, conforme usado aqui, é um polipeptídeo que difere de uma proteína nativa em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções, tal que, a imunorreatividade do polipeptídeo não é substancialmente diminuída. Em outras palavras, a capacidade de uma variante de ligar especificamente o antígeno pode ser melhorada ou alterada, em relação à proteína nativa, ou pode ser administrada por menos que 50% e preferivelmente menos que 20% em relação à proteína nativa. As variantes de polipeptídeo exibem pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade (determinada conforme descrito aqui) com os polipeptídeos identificados.

As variantes de seqüência de aminoácido dos anticorpos podem ser preparadas por introdução de alterações de nucleotídeo apropriadas ao DNA do anticorpo ou por síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2 descrita aqui.

Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar ao constructo final, contanto que o constructo final possua as características desejadas. As alterações do aminoácido podem também alterar os processos pós-translacionais do anticorpo, tal como, alteração do número ou posição dos sítios de giicosilação.

Um processo útil para identificação de determinados regiões ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagênese ou modificação é denominado mutagênese de varredura de alanina e é descrito por Cunningham and Wells, 1989, Science, 244:1081-1085. Um resíduo ou grupo de resíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como, arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (mais preferivelmente, alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. Aqueles locais de aminoácido demonstrando sensibilidade funcional às substituições são então refinados por introdução de variantes adicionais ou outras em ou aos sítios de substituição. Assim, embora o sítio para introdução de uma variação de seqüência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação propriamente não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon alvo ou região e as variantes de anticorpo expressas são classificadas quanto à atividade desejada. Mutagênese de varredura de biblioteca, conforme descrito aqui, pode também ser usada para identificar locais em um anticorpo que são apropriados para mutagênese ou modificação.

Inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando em comprimento de um resíduo para polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções de intraseqüência de resíduos de aminoácido simples ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila de terminal N ou o anticorpo fundido a um marcador de epítopo. Outras variantes de inserção de molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida

1½..

ι \r\ de soro do anticorpo.

Variantes de substituição possuem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removida e um resíduo diferente inserido em seu local. Os sítios de interesse maior para mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, porém alterações de FR são também contempladas. Substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1 abaixo do cabeçalho de substituições conservadoras. Se tais substituições resultarem em uma alteração na atividade biológica, então mais alterações substanciais, denominadas substituições exemplares na Tabela 1 ou como descrito adicionalmente a seguir, com referência às ciasses de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos classificados.

Tabela 1: Substituições de Aminoácido

Resíduo Original	Substituições Conservadoras	Substituições Exemplares
Ala (A)	Vai	Vai; Leu; IIe
Arg (R)	Lys	Lys; Gin; Asn
Asn (N)	Gin	Gin; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D)	Glu	Glu; Asn
Cys (C)	Ser	Ser; Ala
Gin (Q)	Asn	Asn; Glu
Glu (E)	Asp	Asp; Gin
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg	Asn; Gin; Lys; Arg
lle(l)	Leu	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina
Leu (L)	He	Norleucina; IIe; Vai; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg	Arg; Gin; Asn
Met (M)	Leu	Leu; Phe; lie
Phe (F)	Tyr	Leu; Vai; He; Ala; Tyr
Pro (P)	Ala	Ala

Tabela 1: -continuação-

Resíduo Original	Substituições Conservadoras	Substituições Exemplares
Ser (S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr; Phe
Tyr(Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Vai (V)	Leu	lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina

Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas por seleção das substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos, com base nas propriedades de cadeia lateral comum:

(1) Hidrófobo: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

(2) Hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr;

(3) Ácido: Asp, Glu;

(4) Básico: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

(5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe.

Substituições não conservadoras são feitas por trocar um elemento dessas classes por um de outras classes.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente com serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir reticulação aberrante. De modo contrário, a(s) ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aperfeiçoar sua estabilidade, especificamente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como, fragmento Fv.

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Modificações do aminoácido podem variar de alteração ou modi-- '· ficação de um ou mais aminoácidos ao reprojeto completo de uma região, tal como a região variável. Alterações na região variável podem alterar a afinidade de ligação e/ou especificidade. Em algumas concretizações, não mais do que uma a cinco substituições de aminoácido conservadoras são feitas dentro de um domínio de CDR. Em outras concretizações, não mais do que uma a três substituições de aminoácido conservadoras são feitas dentro de um domínio de CDR3. Ainda em outras concretizações, o domínio de CDR é

CDRH3 e/ou CDR L3.

As modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não-glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações póstraducionais, tais como, por exemplo, glicosilação com açúcares diferentes, acetilação e fosforilação. Os anticorpos são glicosilados nas posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright e Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). As cadeias laterais de oligossacarídeo das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd e outros, 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe e Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) e a interação intramolecular entre as porções da glicoproteína, o que pode afetar a conformação e superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Hefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Os oligossacarídeos também podem servir para aivejar uma dada glicoproteína para determinadas moléculas com base nas estruturas de reconhecimento específico. A glicosilação dos anticorpos foi reportada como afetando a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Especificamente, as células CHO com expressão regulada de tetraciclina de p(1,4)-N-acetilglícosaminiltransferase III (GnTIll), uma formação de catalisação de glicosiltransferase de GlcNAc de bissecção, foram reportadas como possuindo atividade de ADCC (Umana e outros, 1999, Mature Biotech. 17:176-180).

A glicosilação dos anticorpos é tipicamente tanto ligada em N quanto ligada em O. Ligada em N refere-se à anexação da porção do carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de

V':

tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualq^[ aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para ane-^<í;/V^;·’¹xação enzimática da porção do carboidrato à cadeia lateral de asparagina.

Assim, a presença de cada uma dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. Glicosilação ligada em O refere-se à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxipropila ou 5-hidroxilisina possam também ser usadas.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, tal que, ele contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeo descritas acima (sítios de glicosilação ligados em N). A alteração também pode ser feita por adição ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina para a seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados em O).

O padrão de glicosilação dos anticorpos pode também ser alterado sem alterar a seqüência de nucleotídeo subjacente. A glicosilação depende, amplamente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo.

Uma vez que o tipo de céíula usado para expressão das glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como terapêutica em potencial, é raramente a célula nativa, variações no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (vide, por exemplo, Hse e outros, 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).

Além da escolha das células hospedeiras, os fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem: modo de crescimento, formulação média, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e semelhantes. Vários processos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação obtido em um organismo hospedeiro específico incluindo introdução ou superexpressão de determinadas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeo (Patentes US números 5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). A glicosilação ou determinados tipos de glicosilação, podem ser enzimaticamente removidos da glicoproteína, por exemplo, usando endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula hospe66

deira recombinante pode ser geneticamente modificada para ser defeituosa no processamento de determinados tipos de polissacarídeos. Essas técnicas e outras semelhantes são bem-conhecidas na técnica.

Outros processos de modificação incluem uso de técnicas de acoplamento conhecidas na técnica, incluindo, porém não limitado aos meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. As modificações podem ser usadas, por exemplo, para anexação de rótulos aos imunoensaios. Polipeptídeos E3 modificados são fabricados usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser classificados usando ensaios padrão conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos a seguir e nos Exemplos.

Outras modificações do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados conforme descrito na Publicação PCT número WO 99/58572, publicada em 18 de novembro de 1999. Esses anticorpos compreendem, além de um domínio de ligação direcionado na molécula alvo, um domínio efetor possuindo uma seqüência de aminoácido substancialmente homóloga a todo ou parte de um domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Esses anticorpos são capazes de ligar-se à molécula alvo, sem desencadear líse dependente de complemento significativa, ou destruição do alvo mediada por célula. Em algumas concretizações, o domínio efetor é capaz de ligar especificamente FcRN e/ou FcyRlIb. Esses tipicamente baseiam-se nos domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Os anticorpos modificados dessa maneira são especificamente apropriados para uso na terapia crônica de anticorpo, para evitar reações inflamatórias ou outras reações adversas em relação a terapia convencional dos anticorpos.

A invenção também engloba proteínas de fusão compreendendo um ou mais fragmentos ou regiões de anticorpos (tal como, E3) ou polipeptídeos dessa invenção. Em uma concretização, um polipeptídeo de fusão é provido, compreendendo pelo menos 10 aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na figura 1A. Em outra concretização, o polipeptídeo de fusão compreende uma região variável de cadeia leve e/ou uma região variável de cadeia pesada de E3, conforme mostrado nas figuras 1A e

1Β. Em outra concretização, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou ~ mais CDR(s) de E3. Ainda em outras concretizações, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 e/ou CDR L3 de anticorpo E3. Em outra concretização, o polipeptídeo de fusão compreende qualquer um ou mais de: resíduo de aminoácido L29 de CDRH1, I50 de CDRH2, W101 de CDRH3, e/ou A103 de CDRH3; e/ou resíduo de aminoácido S28 de CDRL1, N32 de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E de CDRL3 e/ou H92 de CDRL3. Para fins dessa invenção, uma proteína de fusão E3 contém um ou mais anticorpos E3 e outra seqüência de aminoácido a qual ela não está anexada na molécula nativa, por exemplo, uma seqüência heteróloga ou uma seqüência homóloga de outra região. Seqüências heterólogas exemplares incluem, porém não estão limitadas a um marcador tal como, marcador FLAG ou um marcador 6His. Os marcadores são bem-conhecidos na técnica.

O polipeptídeo de fusão E3 pode ser criado por processos bem- . conhecidos na técnica, por exemplo, sintética ou recombinantemente. Tipicamente, as proteínas de fusão E3 dessa invenção são fabricadas por preparação de uma expressão de um polinucleotídeo codificando as mesmas, usando processos recombinantes descritos aqui, embora elas também possam ser preparadas por outros meios conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, síntese química.

Essa invenção também fornece composições compreendendo anticorpos E3 ou polipeptídeos conjugados (por exemplo, ligado) a um agente que facilita o acoplamento a um suporte sólido (tal como biotina ou avidina). Para simplificação, será feita referência, de modo geral, a E3 ou anticorpos com o entendimento de que esses processos aplicam-se a qualquer uma das concretizações de ligação ao NGF descritas aqui. Conjugação geralmente refere-se à ligação desses componentes conforme descritos aqui.

A ligação (que é geralmente a fixação desses componentes em associação aproximada, pelo menos para administração) pode ser obtida de vários modos. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível, quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro.

Por exemplo, um grupo nucleófilo, tal como, grupo amina ou sulfidrila, pode

ser capaz de reagir com um grupo contendo carbonila, tal como um anidrido^ u;/ - V^?'^;ou um haleto ácido ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de saída (por exemplo, um haleto) no outro.

Um anticorpo ou polipeptídeo dessa invenção pode ser ligado a um agente de marcação (alternativamente denominado marcador) tal como uma molécula fluorescente, uma molécula radioativa ou quaisquer outros marcadores conhecidos na técnica. Os marcadores são conhecidos na técnica, os quais geralmente fornecem um sinal (tanto direta quanto indiretamente). Consequentemente, a invenção inclui anticorpos e polipeptídeos marcados.

A capacidade dos anticorpos e polipeptídeos dessa invenção, tal como, de ligação ao NGF; redução ou inibição da atividade biológica de NGF; redução e/ou bloqueio de sobrevivência induzida por NGF dos neurônios trigeminais E13.5 de camundongo, pode ser testada usando processos bem-conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos nos Exemplos.

A invenção também provê composições (incluindo composições farmacêuticas) e kits compreendendo anticorpo E3 e, como essa descrição torna claro, quaisquer ou todos os anticorpos e/ou polipeptídeos descritos aqui.

Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras

A invenção também provê polinucleotídeos isolados codificando os anticorpos e polipeptídeos da invenção (incluindo um anticorpo compreendendo as seqüências de polipeptídeo das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada mostradas nas figuras 1A e 1B) e vetores e células hospedeiras compreendendo o polinucleotídeo.

Conseqüentemente, a invenção fornece polinucleotídeos (ou composições, incluindo composições farmacêuticas), compreendendo polinucleotídeos codificando quaisquer um dos que se seguem: (a) anticorpo E3; (b) um fragmento ou uma região do anticorpo E3; (c) uma cadeia leve do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1B; (d) uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1A; (e) uma ou mais região(ões) variável(veis) de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo E3; (f) uma ou mais CDR(s) (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de anti69

íílriL·.’/7

A;·. ç#* corpo E3 mostradas nas figuras 1A e 1B; (g) CDR H3 da cadeia pesada dó^HS anticorpo E3 mostrada na figura 1A; (h) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo E3 mostrada na figura 1B; (i) três CDRs da cadeia leve do anticorpo E3 mostradas na figura 1B; (j) três CDRs da cadeia pesada do anticorpo E3 mostradas na figura 1A; (k) três CDRs da cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, do anticorpo E3 mostradas nas figuras 1A e 1B; ou (I) um anticorpo compreendendo qualquer um de (b) a (k). Em algumas concretizações, o polinucleotídeo compreende tanto um ou ambos polinucleotídeo(s) mostrados nas figuras 2 e 3.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia leve E3 com um número de depósito da ATCC Número PTA-4893 ou ATCC Número PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia pesada E3 com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Ainda em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4894 e (b) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4894; e/ou (b) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito da ATCC Número PTA-4895.

Em outro aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos codificando qualquer um dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) e polipeptídeos descritos aqui. Polinucleotídeos podem ser fabricados por procedimentos conhecidos na técnica.

Em outro aspecto, a invenção fornece composições (tais como composições farmacêuticas) compreendendo quaisquer dos polinucleotídeos da invenção. Em algumas concretizações, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o anticorpo E3 conforme descrito aqui. Em outra concretização, a composição

£ compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos descritos aqui. Ainda em outras concretizações, a composição compreende tanto um ou ambos os polinucleotídeos mostrados nas figuras 2 e 3. Vetores de expressão e administração de composições de polinucleotídeo são adicionalmente descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção provê um processo para fabricação de quaisquer polinucleotídeos descritos aqui.

Os polinucleotídeos complementares a quaisquer de tais seqüências são também englobados pela presente invenção. Os polinucleotídeos podem ser de filamento simples (codificação ou anti-sentido) ou de filamento duplo e podem ser moléculas de DNA (genômica, cDNA ou sintética) ou RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA em uma maneira uma-um, e moléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Sequências de codificação e não-codificação adicionais podem, porém não necessariamente, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, porém não necessariamente, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (isto é, uma seqüência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou podem compreender uma variante de tal seqüência. As variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, tal que, a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não é diminuída, em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado conforme descrito aqui. As variantes exibem, preferivelmente, pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma porção do mesmo.

Duas seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são ditas

como sendo idênticas se a seqüência de nucleotídeos ou aminoacido^ças duas seqüências for a mesma quando alinhada para correspondência máxí- ‘ ma, conforme descrito a seguir. As comparações entre duas seqüências são tipicamente realizadas comparando-se as seqüências em uma janela de comparação, para identificar e comparar regiões locais de similaridade da seqüência. Uma janela de comparação conforme usada aqui, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contínuas, geralmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, onde uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contínuas, após as duas seqüências serem otimamente alinhadas.

Alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no ambiente Lasergene do software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) usando parâmetros padrão. Esse programa concretiza vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências:

Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices fordetecting distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. e Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:726-730.

Preferivelmente, a porcentagem de identidade da seqüência é determinada por comparação de duas seqüências alinhadas otimamente em relação a uma janela de comparação de peio menos 20 posições, onde a porção da seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, fendas) de 20% ou

menos, geralmente 5 a 15 porcento ou 10 a 12 porcento, quando compara-' das às seqüências de referência (que não compreendem adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada por determinação do número de posições nas quais as bases de ácido nucléico idênticas ou resíduos de aminoácido ocorrem em ambas seqüências, para render o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na seqüência de referência (isto é, tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para render a porcentagem de identidade da seqüência.

As variantes podem também ou alternativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo ou uma porção ou complemento do mesmo. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridizar sob condições moderadamente estringentes para uma seqüência de DNA ocorrendo naturalmente, codificando um anticorpo nativo (ou uma seqüência complementar).

Condições moderadamente estringentes apropriadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridizando a 50°C - 65°C, 5 X SSC, por toda a noite; seguido por lavagem dupla a 65°C por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo 0,1% SDS.

Conforme usado aqui, condições altamente estringentes ou condições de estringência alta são aquelas que: (1) empregam resistência iônica baixa e temperatura alta para lavagem, por exemplo, 0,015 M cloreto de sódio/0,0015 M citrato de sódio/0,1% dodecil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam um agente desnaturante durante a hibridização, tal como, formamida, por exemplo, 50% (v/v) formamida com 0,1% albumina de soro bovino/0,1% Ficoll/0,1 % polivinilpirrolidona/50 mM tampão fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) empregam formamida a 50%, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sódio), 50 mM fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% SDS, e 10% sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC * r ύ' ; - '.

(cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% formamida a 55°C, seguido por uma ^vlavagem de alta estringência consistindo em EDTA contendo 0,1 x SSC a 55°C. O versado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc., conforme necessário, para acomodar fatores, tais como, comprimento da sonda e semelhante.

Será apreciado pelos versados na técnica que, como resultado da degeneração do código genético, existem muitas seqüências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo conforme descrito aqui. Alguns desses polinucleotídeos portam homologia mínima em relação à seqüência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Não obstante, os polinucleotídeos que variam devido as diferenças no uso do códon são especifica mente complementados pela presente invenção. Adicionalmente, alelos dos genes compreendendo as seqüências de polinucleotídeo providas aqui estão dentro do escopo da presente invenção. Os alelos são genes endógenos que são alte- . rados como resultado de uma ou mais mutações, tais como, deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e proteína resultantes podem, porém não necessariamente, ter uma estrutura ou função alterada.

Os alelos podem ser identificados usando técnicas padrão (tais como, hibridização, ampliação e/ou comparação de seqüência de base de dados).

Os polinucleotídeos dessa invenção podem ser obtidos usando síntese química, processos recombinantes ou PCR. Os processos de síntese química de polinucleotídeo são bem-conhecidos na técnica e não precisam ser descritos aqui em detalhes. Um versado na técnica pode usar as seqüências providas aqui e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma seqüência de DNA desejada.

Para preparar os polinucleotídeos usando processos recombinantes, um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência desejada pode ser inserido em um vetor apropriado e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada para replicação e ampliação, conforme discutido aqui adicionalmente. Os polinucleotídeos podem ser inseridos nas células hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. As células são transformadas por introdução de um polinucleotídeo exógeno por

AàaPro.

ét\ absorção, endocitose, transfecção, combinação F ou eletroporação diretã>>· í' 33 ” '

Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não-integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado dentro do genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim ampliado pode ser isolado da célula hospedeira por processos bem-conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook e outros (1989).

Alternativamente, PCR permite reprodução das seqüências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e é descrita nas Patentes US números 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis e outros eds., Birkauswer Press, Boston (1994).

O RNA pode ser obtido por uso do DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo o mesmo em uma célula hospedeira apropriada,

Quando a célula replica e o DNA é transcrito no RNA, o RNA pode então ser isolado usando os processos bem-conhecidos dos versados na técnica, conforme estabelecido em Sambrook e outros, (1989), por exemplo.

Vetores de clonagem apropriados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira que se pretende usar, vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidade de auto replicar, podem possuir um alvo simples para uma endonuclease de restrição especifica e/ou podem portar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Exemplos apropriados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago, e vetores de transporte bidirecional, tais como, pSA3 e pAT28. Esses e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis em vendedores comerciais, tais como, BioRad, Strategene e Invitrogen.

Vetores de expressão são geralmente constructos de polinucleotídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção.

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Isso implica no fato de que o vetor de expressão deve ser replicável nas cé—TV#· lulas hospedeiras tanto como epissomas ou como uma parte integrante do DNA cromossômico. Vetores de expressão apropriados incluem, porém não estão limitados aos plasmídeos, vetores viróticos, incluindo adenovírius, vírus adenoassociado, retrovírus, cosmídeos e vetor(es) de expressão descritos na Publicação PCT número WO 87/04462. Os componentes de vetor podem incluir geralmente, porém não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricional apropriados (tais como, promotores, melhoradores e terminadores). Para expressão (isso é, tradução), um ou mais elementos de controle de tradução são também geralmente necessários, tais como, sítios de ligação de ribossoma, sítios de iniciação de tradução e códons de parada.

Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer de vários meios apropriados, incluindo, eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofecção e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como vírus da varíola). A escolha dos vetores de introdução ou polinucleotídeos freqüentemente dependerá dos aspectos da célula hospedeira.

A invenção também provê células hospedeiras compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui. Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usadas com a finalidade de isolar os genes codificando o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitantes de células hospedeiras de mamíferos incluem, porém não estão limitados as células COS, HeLa e CHO. Vide também, Publicação PCT número WO 87/04462. Células hospedeiras de não-mamíferos apropriadas incluem procariotes (tais como, E.coli ou B, subtilfis) e levedura (tal como, S. cerevisae, S. pombe ou K. lactis). Preferivelmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente, 10 vezes maior, mesmo mais £20

preferivelmente 20 vezes maior do que o anticorpo ou proteína endógéftVy^s correspondente, caso presente, nas células hospedeiras. A classificação das células hospedeiras para uma ligação especifica ao NGF é efetuada por um imunoensaio ou FACS. Uma célula superexpressando o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

Processos usando anticorpos E3 e derivados de anticorpo E3

O anticorpo E3 que liga NGF pode ser usado para identificar ou detectar a presença ou ausência de NGF. Para simplificação, será feita referência de modo geral ao E3 ou anticorpos com o entendimento de que esses processos aplicam-se a qualquer uma das concretizações de ligação de NGF (tais como, polipeptídeos) descritas aqui. A detecção geralmente envolve o contato de uma amostra biológica com um anticorpo descrito aqui que se liga ao NGF e a formação de um complexo entre NGF e um anticorpo (por exemplo, E3) que se liga especificamente ao NGF. A formação de tal complexo pode ser in vitro ou in vivo. O termo detecção conforme usado aqui, inclui detecção qualitativa e/ou quantitativa (níveis de medição) com ou sem referência a um controle.

Qualquer um de uma variedade de processos conhecidos pode ser usado para detecção, incluindo, porém não limitado a imunoensaio, usando anticorpo que liga o polipeptídeo, por exemplo, por ensaio ímunossorvente ligado a enzima (ELISA), raidioimunoensaio (RIA) e semelhantes, e ensaio funcional para polipeptídeo codificado, por exemplo, atividade de ligação ou ensaio enzimático. Em algumas concretizações, o anticorpo é marcado detectavelmente.

Usos em Diagnóstico de E3 e Derivados

Os anticorpos e polipeptídeos da invenção podem ser usados na detecção, diagnóstico e monitoramento de uma doença, condição ou distúrbio associado a expressão de NGF alterada ou aberrante (em algumas concretizações, expressão de NGF aumentada ou diminuída (em relação à amostra normal) e/ou expressão não-apropriada, tal como, presença de expressão em tecído(s) e/ou célula(s) que normalmente não possuem expressão de NGF, ou ausência de expressão de NGF em tecido(s) ou céiula(s)

que normalmente possuem expressão de NGF)). Os anticorpos e polipeptf-'- * deos da invenção são adicionaimente úteis para detecção de expressão de NGF, por exemplo, em uma doença associada à sensibilidade alterada ou aberrante ou sensibilidade ao NGF. Em algumas concretizações, a expressão de NGF é detectada em uma amostra de um indivíduo suspeito de possuir uma doença, distúrbio apresentando ou associado a uma sensibilidade alterada ou aberrante ou sensibilidade à expressão de NGF (por exemplo, um câncer onde NGF promova o desenvolvimento e/ou metástase).

Assim, em algumas concretizações, a invenção provê processos compreendendo o contato de um espécime (amostra) de um indivíduo suspeito de possuir expressão alterada ou aberrante de NGF com um anticorpo ou polipeptídeo da invenção e determinando se o nível de NGF difere daquele de um espécime de controle ou comparação. Em algumas concretizações, o indivíduo possui uma arritmia cardíaca, doença de Alzbeimer e/ou disfun- . ção autonômica.

Em outras concretizações, a invenção provê processos compreendendo contato de um espécime (amostra) de um indivíduo e determinando o nível de expressão de NGF. Em algumas concretizações, o indivíduo é suspeito de possuir uma doença, distúrbio apresentando ou associado a uma sensibilidade alterada ou aberrante em relação à expressão de NGF. Em algumas concretizações, o indivíduo possui câncer de pulmão de célula pequena, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma ovariano, carcinoma hepatocelular ou melanoma.

Para aplicações em diagnóstico, o anticorpo tipicamente será marcado com uma porção detectável incluindo, porém não limitada a radioisótopos, marcadores fluorescentes e vários marcadores de enzimasubstrato. Os processos para conjugar marcadores a um anticorpo são conhecidos na técnica. Em outra concretização da invenção, os anticorpos da invenção não precisam ser marcados e a presença dos mesmos pode ser detectada usando um anticorpo marcado que liga-se aos anticorpos da invenção.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em

qualquer processo de ensaio conhecido, tais como, ensaios de ligação petitiva, ensaios de intercalamento direto e indireto e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp, 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Os anticorpos podem também ser usados para ensaios de diagnóstico in vivo, tal como, formação de imagem in vivo. De modo geral, o anticorpo é rotulado com radionuclídeo (tais como, ¹¹¹ln, Tc, ¹⁴C, ¹³¹l, ¹²⁵l ou ³H) de modo que as células ou tecido de interesse possam ser localizados usando imunocintilografia.

O anticorpo também pode ser usado como reagente de coloração em patologia, seguindo técnicas bem-conhecidas na técnica.

Processos de uso de E3 e derivados para fins terapêuticos

O anticorpo E3 é útil para reduzir e/ou bloquear a atividade biológica de NGF. Essa atividade antagonística acredita-se ser útil no tratamento das condições patológicas associadas à produção de NGF endógeno, tal como dor. De modo geral, nestas concretizações, uma quantidade eficaz é administrada a um indivíduo. Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção provê um processo de antagonização da atividade biológica de NGF humano usando qualquer um dos polipeptídeos (incluindo anticorpos, tal como anticorpo E3) descritos aqui. Em uma concretização, o processo compreende contato do fator de crescimento nervoso humano com qualquer um dos polipeptídeos (incluindo anticorpo E3) descritos aqui, pelo que, a atividade do fator de crescimento nervoso humano é antagonizada, bloqueada ou suprimida. Ainda em outra concretização, um indivíduo com dor (tal como, dor pós-cirúrgica ou dor por artrite reumatóide) recebe um tratamento com E3.

Para simplificação, será feita referência de modo geral ao E3 ou anticorpo com o entendimento de que esses processos aplicam-se a qualquer um dos anticorpos de E3 variantes e polipeptídeos descritos aqui.

Várias formulações de E3 ou fragmentos de E3 (por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc.), tais como cadeia simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo e *»* λ qualquer outra configuração modificada de E3 que compreenda um sítíé^e^ reconhecimento de NGF de antígeno de especificidade requerida, podem ser usadas para administração. Em algumas concretizações, os anticorpos E3 ou várias formulações de E3 das mesmas podem ser administradas na forma pura. Em outras concretizações E2 ou várias formulações de E3 (incluindo qualquer concretização de composição descrita aqui) do mesmo e um excipiente farmaceuticamente aceitável são administrados e podem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou agir como um diluente. Excipientes apropriados incluem, porém não estão limitados aos agentes estabilizantes, agentes umectantes e emulsionantes, sais para variação de osmolaridade, agentes de encapsulamento, tampões e intensificadores de penetração na pele. Excipientes, bem como formulações para liberação de medicamentos parenterais ou não-parenterais são estabelecidas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20⁹ Ed. Mack Publishing (2000).

Em algumas concretizações, esses agentes são formulados para administração por injeção (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscularmente, etc.), embora outras formas de administração (por exemplo, oral, mucosal, via inalação, sublingual, etc.) possam também ser usadas. Conseqüentemente, o anticorpo E3 e equivalentes do mesmo são preferivelmente combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como, salmoura, solução de Ringer, solução de dextrose e semelhantes. O regime de dosagem especifica, isto é, dose, tempo e repetição, dependerá do indivíduo específico e do histórico médico do indivíduo. De modo geral qualquer uma das doses que se seguem pode ser usada: uma dose de pelo menos cerca de 50 mg/kg peso corpóreo; peio menos cerca de 10 mg/kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 3 mg/kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 1 mg/kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 750 pg/kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 500 pg/kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 250 pg/kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 100 pg /kg peso

corpóreo; pelo menos cerca de 50 pg /kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 10 pg /kg peso corpóreo; pelo menos cerca de 1 pg/kg peso corpóreo ou menos, é administrada. Para administrações repetidas, por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até uma supressão desejada ou sintoma de alívio ocorrer. Um regime de dosagem exemplar compreende administração de uma dose inicial de cerca de 1 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo anti-NGF ou seguida por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg em semana alternada. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis, dependendo do padrão de diminuição farmacocinética que o médico praticante deseja obter. Considerações empíricas, tais como, meia-vida útil, geralmente contribuirão para a determinação da dosagem. O progresso dessa terapia é facilmente controlado por técnicas e ensaios convencionais.

Em alguns indivíduos, mais de uma dose pode ser necessária. A freqüência da administração pode ser determinada e ajustada no curso da terapia. Por exemplo, a freqüência da administração pode ser determinada ou ajustada com base no tipo e gravidade da dor a ser tratada, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e resposta ao agente e a critério do médico atendente. Tipicamente, o médico administrará um anticorpo antagonista de anti-NGF (tal como E3), até ser alcançada uma dosagem que obtenha o resultado desejado. Em alguns casos, as formulações de liberação contínua prolongada de anticorpos E3 podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para obter a ligação prolongada são conhecidos na técnica.

Em uma concretização, dosagens para anticorpos E3 (ou poiipeptídeos) podem ser determinadas empiricamente nos indivíduos que receberam uma ou mais administrações. Os indivíduos recebem dosagens incrementais de E3. Para avaliar a eficácia de E3 ou outro anticorpo equivalente, marcadores de sintomas da doença (tal como, dor) podem ser monitorados.

A administração de um anticorpo (tal como E3) ou polipeptídeo de acordo com o processo na presente invenção pode ser contínua ou in81

‘ΓΤ’ \ ·’ termitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se a finalidade da administração é terapêutica ou profilática, e outros fatores conhecidos dos versados na técnica. A administração de um anticorpo pode ser essencial mente contínua por um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas, por exemplo, tanto antes, durante ou após desenvolvimento da dor, antes, durante, antes e após, durante e após ou antes, durante e após o desenvolvimento da dor. A administração pode ser antes, durante e/ou após ferida, incisão, trauma, cirurgia, e qualquer outro evento que provavelmente possa trazer dor pós-cirúrgica.

Outras formulações incluem formas de liberação apropriadas conhecidas na técnica incluindo, porém não limitado aos veículos, tais como, lipossoma. Vide, por exemplo, Mahato e outros (1997) Pharm. Res. 14:853859. Preparações lipossômicas incluem, porém não estão limitadas as citofectinas, vesículas multilamelares e vesículas unilamelares.

Em algumas concretizações, mais do que um anticorpo ou polipeptídeo podem estar presentes. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Tais composições podem conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro e pelo menos cinco anticorpos diferentes. Uma mistura de anticorpos, conforme eles são freqüentemente indicados na técnica, pode ser especifica mente útil no tratamento de uma faixa mais ampla de população de indivíduos.

Um polinucleotídeo codificando qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção (tal como um anticorpo E3) pode também ser suado para liberação e expressão de qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção (tal como anticorpo E3) em uma célula desejada. Fica claro que um vetor de expressão pode ser usado para direcionar a expressão de um anticorpo E3 ou polipeptídeo. O vetor de expressão pode ser administrado por qualquer meio conhecido na técnica, tal como, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal, dermal, sublingualmente ou por inalação. Por exemplo, a administração dos vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, pistola de partículas ou

administração cateterizada e administração tópica. Um versado na técrii.ca está familiarizado com a administração dos vetores de expressão para obter ' -ς - ν ’ expressão de uma proteína exógena in vivo. Vide Patentes US números 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471.

Composições terapêuticas ou de ligação que possuem alvo compreendendo um polinucleotídeo codificando qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção (tal como anticorpo E3) podem também ser usadas. Técnicas de ligação de DNA mediadas por receptor são descritas, por exemplo, em Findeis e outros, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou e outros, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transferi. A. Wolff, ed.) (1994); Wu e outros, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu e outros, J. Biol. Chem, (1994) 269:542; Zenke e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.

(USA) (1990) 87:3655; Wu e outros, J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia genética. As faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 pg a cerca de 2 mg, cerca de 5 pg a cerca de 500 pg, e cerca de 20 pg a cerca de 100 pg de DNA também podem ser usadas durante um protocolo de terapia genética. Os polinucleotídeos e polipeptídeos terapêuticos da presente invenção podem ser liberados usando veículos de liberação de gene. O veículo de liberação de gene pode ser de origem virótica ou não-virótica (vide, de modo geral, Jolly, Câncer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). A expressão de tais seqüências de codificação pode ser induzida usando promotores endógenos ou heterólogos de mamíferos. A expressão da seqüência de codificação pode ser constitutiva ou regulada.

Vetores de base virótica para liberação de um polinucleotídeo e expressão desejados em uma célula desejada são bem-conhecidos na técnica. Veículos de base virótica exemplares incluem, porém não estão limitados aos retrovírus recombínantes (vide, por exemplo, Publicações PCT números WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO

93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes US números 5.219.740; 4.777.127; Patente Britânica número 2.200.651; e Patente EP número 0 345 242), vetores a base de alfavírus (por exemplo, vetores do vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírus da encefalite eqüina venezuelano (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e também vetores do vírus adenoassociado (AAV) (vide, por exemplo, Publicações PCT números WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). Administração de um DNA ligado ao adenovírus exterminado conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 também pode ser empregada.

Veículos de liberação não-viróticos e processos também podem ser empregados, incluindo, porém não limitado ao DNA condensado policatiôntco ligado ou não ao adenovírus exterminado sozinho (vide, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante (vide, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células de veículos de liberação de célula eucariótica (vide, por exemplo, Patente US número 5,814,482; Publicações PCT números WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nucléica ou fusão com membranas de célula. O DNA nu pode também ser empregado. Processos de introdução ao DNA nu exemplares são descritos na Publicação PCT número WO 90/11092 e Patente US número 5.580.859. Lipossomas que podem atuar como veículos de liberação de gene são descritos na Patente US número 5.422.120; Publicações PCT números WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e Patente EP número 0 524 968. Abordagens adicionais são descritas em Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 e em Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:1581.

Com relação a todos os processos descritos aqui, a referência aos anticorpos antagonistas de anti-NGF também inclui composições que compreendem um ou mais desses agentes. Essas composições podem compreender, adicionalmente, excipientes apropriados, tais como, excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem-conhecidos

na técnica. A presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros processos de tratamento convencionais.

Processos de Uso de Anticorpo Antagonista de Anti-Ngf para Tratamento ou

Prevenção de Dor por Artrite Reumatóide

Em aiguns aspectos, a invenção fornece processos para tratamento e/ou prevenção de dor por artrite reumatóide em indivíduos incluindo mamíferos, ambos humanos e não-humanos. Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção fornece processos para tratar dor por artrite reumatóide em um indivíduo compreendendo administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista de anti-NGF. Anticorpos antagonistas de antiNGF são conhecidos na técnica e descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção fornece processos para reduzir a incidência, melhorar, suprimir, aliviar, e/ou retardar o início, o desenvolvimento ou o progresso de dor por artrite reumatóide em um indivíduo. Assim, em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF é administrado antes do desenvolvimento da dor ou um episódio de dor em um indivíduo que possui artrite reumatóide.

Em outro aspecto, a invenção fornece processos para tratamento de caquexia inflamatória (perda de peso) associada a artrite reumatóide em um indivíduo compreendendo administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista de anti-NGF (Roubenoff e outros, Arthritis Rheum. 40(3): 534-9 (1997); Roubenoff e outros, J. Clin. Invest. 93(6):2379-86 (1994)).

O diagnóstico ou avaliação da dor por artrite reumatóide é bemestabelecido na técnica. A avaliação pode ser realizada com base em medidas conhecidas na técnica, tais como, caracterização da dor pelo paciente usando várias escalas de dor. Vide, por exemplo, Katz e outros, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni e outros, J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55. Existem também, escalas usadas geralmente para medir o estado da doença, tais como, a American College of Rheumatology (ACR) (Felson e outros, Arthritis and Rheumatism (1993) 36(6):729-740), the Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries e outros, (1982) J. Rheumatol. 9: 789-793), the Paulus Scale (Paulus e outros, Arthritis and Rheumatism

(1990) 33: 477-484), e a Arthritis Impact Measure Scale (AIMS) (Meenarri ' Y‘ outros, Arthritis and Rheumatology (1982) 25: 1048-1053). Anticorpo antagonista de anti-NGF pode ser administrado a um indivíduo através de qualquer via apropriada. Exemplos de vias diferentes de administração são descritos aqui.

O alívio da dor pode ser caracterizado pelo curso de tempo do alívio. Conseqüentemente, em algumas concretizações, o alívio da dor é observado dentro de cerca de 24 horas após administração do anticorpo antagonista de anti-NGF. Em outras concretizações, o alívio da dor é observado dentro de cerca de 36, 48, 60, 72 horas ou 4 dias após administração do anticorpo antagonista de anti-NGF. Ainda em outras concretizações, o alívio da dor é observado antes da observação de indicação de melhora da condição inflamatória associada a artrite reumatóide. Em algumas concretizações, freqüência e/ou intensidade da dor diminuem, e/ou qualidade de vida daque- . les que sofrem da doença é melhorada.

A fabricação e uso dos anticorpos anti-NGF para esses processos é descrita nas seções a seguir (Anticorpo antagonista de anti-NGF; Identificação dos anticorpos antagonistas de anti-NGF”; Administração de um anticorpo antagonista de anti-NGF).

Processos de Uso de Anticorpo Antagonista de Anti-Ngf para Tratamento ou

Prevenção de Dor por Osteoartrite

Em alguns aspectos, a invenção fornece processos para tratamento e/ou prevenção de dor por osteoartrite em indivíduos incluindo mamíferos, ambos humanos e não-humanos. Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção fornece processos para tratar dor por osteoartrite em um indivíduo compreendendo administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista de anti-NGF. Anticorpos antagonistas de anti-NGF são conhecidos na técnica e descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção fornece processos para reduzir a incidência, melhorar, suprimir, aliviar, e/ou retardar o início, o desenvolvimento ou o progresso de dor por osteoartrite em um indivíduo. Assim, em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF é administrado '/•c.

i. i %· antes do desenvolvimento da dor ou um episódio de dor em um indivíduo ' que possui osteoartrite.

O diagnóstico ou avaliação da dor por osteoartrite é bem-estabelecido na técnica. A avaliação pode ser realizada com base em medidas conhecidas na técnica, tais como, caracterização da dor pelo paciente usando várias escalas de dor. Vide, por exemplo, Katz e outros, Surg C//n North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni e outros, J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55. Por exemplo, WOMAC Ambulation Pain Scale (incluindo dor, rigidez e função física), e 100 mm Visual Analogue Scale (VAS) podem ser empregadas para avaliar a dor e a resposta ao tratamento.

Anticorpo antagonista de anti-NGF pode ser administrado a um indivíduo através de qualquer via apropriada. Exemplos de diferentes vias de administração são descritos aqui.

O alívio da dor pode ser caracterizado pelo curso de tempo do alívio, Conseqüentemente, em algumas concretizações, o alívio da dor é observado dentro de cerca de 24 horas após administração do anticorpo antagonista de anti-NGF. Em outras concretizações, o alívio da dor é observado dentro de cerca de 36, 48, 60, 72 horas ou 4 dias após administração do anticorpo antagonista de anti-NGF. Em algumas concretizações, freqüência e/ou intensidade da dor diminuem, e/ou qualidade de vida daqueles que sofrem da doença é melhorada.

A fabricação e uso de anticorpos anti-NGF para esses processos é descrita nas seções a seguir (Anticorpo antagonista de anti-NGF; Identificação de anticorpos antagonistas de anti-NGF; Administração de um anticorpo antagonista de anti-NGF).

Anticorpo antagonista de anti-NGF

Os processos da invenção (relacionados a dor por artrite reumatóide e dor por osteoartrite) usam um anticorpo antagonista de anti-NGF, que se refere a qualquer molécula de anticorpo que bloqueia, suprime ou reduz (incluindo significativamente) a atividade biológica de NGF, incluindo vias a jusante medidas por sinalização de NGF, tais como, ligação de receptor e/ou fornecimento de uma resposta celular para NGF.

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Um anticorpo antagonista de anti-NGF exibirá qualquer uma oú^S ~ ^vmais das características que se seguem: (a) ligação ao NGF e inibição da atividade biológica de NGF ou vias a jusante mediadas por função de sinalização de NGF; (b) prevenção, melhora ou tratamento de qualquer aspecto da dor por artrite reumatóide ou por dor por osteoartrite: (c) bloqueio ou diminuição da ativação do receptor de NGF (incluindo dimerização do receptor TrkA e/ou autofosforilação); (d) aumento do espaço de NGF; (e) inibição (redução) da síntese de NGF, produção ou liberação. Anticorpos antagonistas de anti-NGF são bem-conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Publicações PCT números WO 01/78698, WO 01/64247, Patentes US números 5.844.092, 5.877.016, e 6.153.189; Hongo e outros, Hybridoma, 19:215-227 (2000);

Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993); Números de acesso ao GenBank:

U39608, U39609, L17078 ou L17077.

Para fins dessa invenção, o anticorpo reage com NGF em uma . maneira que existe NGF e/ou as vias a jusante mediadas pela função de sinalização de NGF. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF reconhece NGF humano. Ainda em outras concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF se liga especifica mente ao NGF humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF não se liga especifica mente às neurotrofinas correlatas, tais como, NT-3, NT4/5 e/ou BDNF. Ainda em outras concretizações, o anticorpo anti-NGF é capaz de ligar NGF e inibir eficazmente a ligação de NGF ao seu receptor TrkA e/ou p75 in vivo e/ou eficazmente inibindo NGF de ativar seu receptor TrkA e/ou p75. Ainda em outra concretização, o anticorpo anti-NGF é humanizado (tal como anticorpo E3 descrito aqui). Em algumas concretizações, o anticorpo anti-NGF é humano. Em uma concretização, o anticorpo é um anticorpo humano que reconhece um ou mais epítopos no NGF humano. Em outra concretização, o anticorpo é um anticorpo de camundongo ou rato que reconhece um ou mais epítopos no NGF humano. Em outra concretização, o anticorpo reconhece um ou mais epítopos em um NGF selecionado do grupo consistindo em: primata, canino, felino, equino e bovino. Ainda nas concretizações adicionais, o anticorpo antagonista de anti-NGF liga essencialmente

o mesmo epítopo de NGF 6 como um anticorpo selecionado de qualquer uffi' ·.·^ - V' dos que se seguem: MAb 911, MAb 912 e MAb 938 (vide Hongo e outros, Hybridoma 19:215-227 (2000)). Em outras concretizações, o anticorpo liga o mesmo epítopo como Mab 911. Em outra concretização, o anticorpo compreende uma região constante que é imunologicamente inerte (por exemplo, não desencadeia lise mediada por complemento ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC)). A atividade de ADCC pode ser avaliada usando processos descritos na Patente US número 5.500.362. Em algumas concretizações, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT número PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente U.K 9809951.8.

Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de antiNGF é um anticorpo monoclonal anti-NGF de camundongo humanizado denominado anticorpo Έ3, qualquer um dos anticorpos relacionados a E3 descritos aqui ou quaisquer fragmentos dos mesmo, que são antagonistas de NGF.

Os anticorpos úteis na presente invenção podem englobar anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, de cadeia simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo, anticorpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno de especificidade necessária incluindo variantes de glicosilação dos anticorpos, variantes de seqüência de aminoácido dos anticorpos e anticorpos covalentemente modificados. Os anticorpos podem ser de murino, rato, seres humanos ou de qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados).

A afinidade de ligação de um anticorpo antagonista de anti-NGF ao NGF (tal como hNGF) pode ser de cerca de 0,10 a cerca de 0,80 nM, cerca de 0,15 a cerca de 0,75 nM e cerca de 0,18 a cerca de 0,72 nM. Em uma concretização, a afinidade de ligação está entre cerca de 2 pM e 22 pM.

Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é de cerca de 10 nM. Efn outras concretizações, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 10 nM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é cerca de 0,1 nM ou cerca de 0,07 nM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 0,1 nM ou menos que cerca de 0,07 nM. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é qualquer um de cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM ou cerca de 50 pM a qualquer um de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM ou cerca de 40 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é qualquer um de cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM ou cerca de 50 pM ou menos que cerca de 50 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é inferior a qualquer um de cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM ou cerca de 50 pM. Ainda em outras concretizações, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM ou maior que cerca de 40 pM.

Um modo de determinar a afinidade de ligação dos anticorpos ao NGF é medindo a afinidade de ligação dos fragmentos Fab monoclonais do anticorpo. Para obter os fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode se clivado com papaína ou expresso recombinantemente. A afinidade de um fragmento Fab anti-NGF de um anticorpo pode ser determinada por ressonância de plasmônio de superfície (sistema de ressonância de plasmônio de superfície (SPR) BIAcore3000®, BIAcore, INC, Piscaway, NJ). Chips CMS podem ser ativados com cloridrato de N-etil-N’-(3dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. NGF humano (ou qualquer outro NGF) pode ser diluído em 10 mM de acetato de sódio, pH 4,0 e injetado ao chip ativado em uma concentração de 0,005 mg/mL. Utilizando-se tempo de fluxo variável através dos canais de chip individuais, podem ser obtidas duas faixas de densidade de antígeno: unidades de resposta 100-200 (RU) para estudos de cinética detalhados e 500-600 RU para ensaios de classificação.

O chip pode ser bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração -mostraram que uma mistura de tampão de eluição Pierce (Produto número 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) e 4 M NaCI (2:1) remove eficazmente o Fab ligado enquanto mantém a atividade de hNGF no chip por mais de 200 injeções. O tampão HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCI, 3 mM EDTA, 0,005% Tensoativo P29) é usado como tampão de operação para os ensaios BlAcore. Várias diluições (0,1 - 10 x K_D estimado) de amostras Fab purificadas são injetadas por 1 minuto a 100 pL/min e tempos de dissociação de até 2 horas são permitidos. As concentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e eletroforese SDS-PAGE usando um Fab de concentração conhecida (conforme determinado por análise de aminoácido) como um padrão. As razões de associação cinética (kon) e razões de dissociação (koff) são obtidas simultaneamente por ajuste dos dados a um modelo de ligação 1:1 Langmuir (Karisson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BIAevaluation. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (K_D) são calculados como koff/kon- Esse protocolo é apropriado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo ao NGF de qualquer espécie, incluindo NGF humano, NGF de outro vertebrado (em algumas concretizações, mamíferos) (tais como, NGF de camundongo, NGF de rato, NGF de primata), bem como para uso com outras neurotrofinas, tais como, as neurotrofinas correlatas NT3, NT4/5 e/ou BDNF.

Em algumas concretizações, o anticorpo liga NGF humano, e não liga especifica mente um NGF de outras espécies de vertebrados (em algumas concretizações, mamíferos). Em algumas concretizações, o anticorpo liga NGF humano bem como um ou mais NGF de outras espécies de vertebrados (em algumas concretizações, mamíferos). Ainda em outras concretizações, o anticorpo liga NGF e não reage cruzada e significativamente com outras neurotrofinas (tais como as neurotrofinas correlatas, NT3, NT4/5 e/ou BDNF). Em algumas concretizações, o anticorpo liga NGF, bem como pelo menos outra neurotrofina. Em algumas concretizações, o anticorpo liga-se as espécies de mamíferos de NGF, tais como, cavalo ou cão, porém signifi91 cativa mente não se liga ao NGF de outras espécies de mamíferos.

O(s) epítopo(s) pode(m) ser contínuo(s) ou descontínuo(s). Em uma concretização, o anticorpo ligada essencialmente os mesmos epítopos hNGF que um anticorpo selecionado do grupo consistindo em Mab 911, Mab 912 e Mab 938 conforme descrito em Hongo e outros, Hybridoma, 19:215227 (2000). Em outra concretização, o anticorpo liga essencialmente o mesmo epítopo hNGF como Mab 911. Ainda em outra concretização, o anticorpo liga essencialmente o mesmo epítopo como Mab 909. Hongo e outros, supra. Por exemplo, o epítopo pode compreender um ou mais de: resíduos K32, K34 e E35 dentro da região variável 1 (aminoácidos 23-35) de hNGF; resíduos F79 e T81 dentro da região variável 4 (aminoácidos 81-88) de hNGF; resíduos H84 e K88 dentro da região variável 4; resíduo R103 entre região variável 5 (aminoácidos 94-98) de hNGF e o terminal C (aminoácidos 111-118) de hNGF; resíduo E11 dentro da região pré-variável 1 (aminoácidos 10-23) de hNGF; Y52 entre região variável 2 (aminoácidos 40-49) de hNGF e região variável 3 (aminoácidos 59-66) de hNGF; resíduos L112 e S113 dentro do terminal C de hNGF; resíduos R59 e R69 dentro da região variável 3 de hNGF; ou resíduos V18, V20 e G23 dentro da região pré-variável 1 de hNGF. Além disso, um epítopo pode compreender uma ou mais dentre região variável 1, região variável 3, região variável 4, região variável 5, a região terminal N e/ou terminal C de hNGF. Ainda em outra concretização, o anticorpo reduz, significativamente, a acessibilidade de solvente do resíduo R103 de hNGF. Fica entendido que, embora os epítopos descritos acima relacionem-se ao NGF humano, um versado na técnica pode alinhar as estruturas de NGF humano com o NGF de outras espécies e identificar prováveis contrapartes para esses epítopos.

Em um aspecto, anticorpos (por exemplo, seres humano, humanizado, camundongo, quimérico) que podem exibir NGF podem ser fabricados por uso de imunógenos que expressam seqüência de comprimento pleno ou parcial de NGF. Em outro aspecto, pode ser usado um imunógeno compreendendo uma célula que superexpressa NGF. Outro exemplo de imunógeno que pode ser usado é a proteína de NGF que contém NGF de s >

··' comprimento pleno ou uma porção da proteína NGF.

Os anticorpos antagonistas de anti-NGF podem ser fabricados por qualquer processo conhecido na técnica. A via e programação de imunização do animal hospedeiro são geralmente mantidas com técnicas estabelecidas e convencionais para estimulação e produção do anticorpo, conforme descrito aqui adicionalmente. Técnicas gerais para produção de anticorpos humanos e de camundongo são conhecidos na técnica e são descritas aqui.

É contemplado que qualquer indivíduo mamífero incluindo os seres humanos ou anticorpo que produz células do mesmo pode ser manipulado para servir como base para produção de linhagens de célula de hibridoma de mamíferos, incluindo seres humanos. Tipicamente, o animal hospedeiro é inoculado intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutaneamente, intraplantar e/ou intradermicamente com uma quantidade de imunógeno incluindo conforme descrito aqui.

Os hibridomas podem ser preparados de linfócitos e células de mieloma imortalizadas usando a técnica de hibridização de célula somática geral de Kohler, B. e Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 ou conforme modificada por Buck, D. W. e outros, In Vitro, 18:377-381 (1982). Linhagens de mieloma disponíveis, incluindo, porém não limitadas a X63-Ag8.653 e aquelas do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, podem ser usadas na hibridização. Geralmente, a técnica envolve fusão das células de mieloma e células linfóides usando um fusógeno, tal como polietileno glicol ou por meios elétricos bem-conhecidos dos versados na técnica. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão e desenvolvidas em um meio de crescimento seletivo, tal como, meio hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT), para eliminar células de origem não-hibridizadas. Qualquer meio descrito aqui, suplementado com soro ou não, pode ser usado para cultura de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais. Como outra alternativa à técnica de fusão de célula, células B imortalizadas EBV podem ser usadas para produzir os anticorpos monoclonais anti-NGF da presente invenção. Os hibridomas são expandidos e subclonados, caso desejado, e os sobrenadantes são avaliados quanto a atividade antiimunógeno por procedimentos de * Α ΐϊ '·· tó. .. Odd λ ·*«&

imunoensaio convencionais (por exemplo, radioímunoensaio, imunoensaiõ _:enzimático ou imunoensaio fluorescente).

Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos englobam todos os derivados, células da progênie dos hibridomas de origem que produzem anticorpos monoclonais específicos para NGF ou uma porção do mesmo.

Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser desenvolvidos in vitro ou in vivo usando procedimentos conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou fluidos corpóreos por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como, precipitação por sulfato de amônio, eletroforese de gel, diálise, cromatografia e ultrafiltração, caso desejado. A atividade indesejada, caso presente, pode ser removida, por exemplo, por operar-se a preparação sobre adsorventes fabricados de imunógeno anexados a uma fase sólida e eluindo ou liberando os anticorpos desejados do imunógeno. A imunização de um animal hospedeiro com NGF humano ou um fragmento contendo a seqüência de aminoácido alvo conjugado a uma proteína que é imunogênica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina de lapa de buraco de fechadura, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxíssuccinimida (através de resíduos de lisina), glitaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N = C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes, pode render uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais).

Caso desejado, o anticorpo antagonista anti-NGF (monoclonal ou policlonal) de interesse pode ser seqüenciado e a seqüência de polinucleotídeo pode então ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A seqüência de codificação do anticorpo de interesse pode ser mantida no vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. Em uma alternativa, a seqüência de polinucleotídeo pode ser usada para manipulação genética para humanizar o anticorpo ou para aperfeiçoar a afinidade, ou outras características do an94

ticorpo. Por exempio, a região constante pode ser modificada geneticamente para lembrar mais as regiões constante humanas para evitar resposta imune, se o anticorpo for empregado em experiências clínicas e tratamentos em seres humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a seqüência de anticorpo para obter afinidade maior ao NGF e eficácia maior na inibição de NGF. Ficará aparente a um versado na técnica que uma ou mais alterações de polinucleotídeo podem ser feitas ao anticorpo antagonista de antiNGF e ainda manter sua capacidade de ligação ao NGF.

Existem quatro etapas gerais para humanizar o anticorpo monoclonal. Elas são: (1) determinar o nucleotídeo e a seqüência de aminoácido prevista dos domínios variáveis leve e pesado do anticorpo de partida, (2) designar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região da estrutura do anticorpo usar durante o processo de humanização, (3) as metodologias/técnicas de humanização recentes e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado. Vide, por exemplo, Patentes US números 4.316.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370.

Várias moléculas de anticorpo humanizadas compreendendo um sítio de ligação de antígeno derivado de uma imunoglobulina não humana foram descritas, incluindo anticorpos quiméricos possuindo regiões V de roedor e de roedor modificadas e suas regiões determinantes de complementariedade (CDRs) fundidas aos domínios constantes humanos. Vide, por exemplo, Winter e outros, Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio e outros, Proc. Nat, Acad. Sei. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw e outros, J. Immunol. 138:4534-4538 (1987), e Brown e outros, Câncer Res. 47:3577-3583 (1987). Outras referências descrevem CDRs de roedor enxertadas em uma região de estrutura de suporte humano (FR) antes da fusão com um domínio constante de anticorpo humano apropriado. Vide, por exemplo, Riechmann e outros, Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen e outros, Science 239:1534-1536 (1988) e Jones e outros, Nature 321:522-525 (1986). Outra referência descreve CDRs de roedor suportadas por regiões de estrutura de roedor recombinantemente revestidas superficialmente. Vide, por exemplo, Publicação de

Patente Européia número 0519596. Essas moléculas humanizadas) são projetadas para minimizar resposta imunológica indesejável com relação as moléculas de anticorpo anti-humanas de roedor, que limita a duração e eficácia das aplicações terapêuticas daquelas porções em receptores humanos. Por exemplo, a região constante de anticorpo pode ser modificada geneticamente, tal que, ela é imunologicamente inerte (por exemplo, não desencadeia lise complementar). Vide, por exemplo, Publicação PCT número PCT/GB99/01441; Pedido de Patente U.K. número 9809951.8. Outros processos de humanização dos anticorpos que podem também ser utilizados são descritos por Daugherty e outros, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) e nas Patentes US números 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671; e 6.350.861; e na Publicação PCT Número WO 01/27160.

Ainda em uma alternativa, os anticorpos completamente humanos podem ser obtidos por uso de camundongos comercialmente disponíveis . que foram modificados geneticamente para expressar proteínas de imunoglobulina humanas específicas. Os animais transgênicos que são designados para produzir uma resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos completamente humanos) ou mais robusta podem também ser usados para geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tecnologia são Xenomouse® da Abgenix, inc. (Fremont, CA) e HuMAb-Mouse® e TC Mouse® da Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Em uma alternativa, os anticorpos podem ser fabricados recombinantemente e expressos usando qualquer processo conhecido na técnica. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser fabricados por tecnologia de exibição de fago. Vide, por exemplo, Patentes US números 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; e 6.265.150; e Winter e outros, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago (McCafferty e outros, Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, de repertórios de gene de domínio (V) variável de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo com essa técnica, os genes do domínio V são clonados na estrutura em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como, M13 ou fd e descritos como fragméntps_y <^:./S ** * de anticorpo funcional na superfície da partícula de fago. Uma vez que a partícula füamentosa contém uma cópia de DNA de filamento simples do genoma de fago, seleções com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene codificando o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula Β. A exibição do fago pode ser realizada em vários formatos; para revisão vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para exibição do fago. Clackson e outros, Nature 352:624-628 (1991) isolaram uma fileira diversa de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena coletânea combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados pode ser construído e os anticorpos para uma fileira diversa de antígenos (incluindo os próprios antígenos) podem ser isolados essencial mente seguindo as técnicas descritas por Mark e outros,

J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) ou Griffith e outros, EMBO J. 12:725-734 (1993). Em um sistema de resposta imune natural, os genes do anticorpo acumulam mutações em uma razão alta (hipermutação somática). Algumas das alterações introduzidas conferirão afinidade maior e as células B exibindo imunoglobulina de superfície de afinidade alta são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante o desafio subseqüente do antígeno. Esse processo natural pode ser mimetizado por emprego de técnica conhecida como embaralhamento de cadeia Marks e outros, Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). Nesse processo, a afinidade dos anticorpos humanos primários obtidos por exibição do fago pode ser aperfeiçoada por substituição seqüencial de genes de região V de cadeia pesada e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente (repertórios) de genes de domínio V obtidos de doadores não-imunizados. Essa técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades na faixa pM-nM. Uma estratégia para fabricação de repertórios de anticorpo de fago maiores (também conhecidos como a mãe de todos as bibliotecas) foi descrita por Wate97

’/.-ν rhouse e outros, Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). O embaralhamérife/^ do gene pode também ser usado para derivar anticorpos humanos de anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano possui afinidades semelhantes e especificidades em relação ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com esse processo, que é também referido como impressão de epítopo, o gene do domínio V de cadeia leve e pesada dos anticorpos de roedor obtido pela técnica de exibição de fago é substituído com um repertório de genes do domínio V humano, criando quimeras de roedor-humano. A seleção no antígeno resulta em isolamento das regiões variáveis humanas capaz de restaurar o sítio de ligação de antígeno funcional, isto é, o epítopo governa (imprime) a escolha do parceiro. Quando o processo é preferido a fim de substituir o domínio V de roedor remanescente, um anticorpo humano é obtido (vide Publicação PCT número WO 93/06213, publicada em 1° de abril de 1993). Diferente da humanização tradicional dos anticorpos de roedores . por enxerto de CDR, essa técnica provê anticorpos completamente humanos, que não possuem estrutura ou resíduos de CDR originários do roedor.

Fica aparente que, embora a discussão acima se refira aos anticorpos humanizados, os princípios gerais discutidos são aplicáveis aos anticorpos costumerizados para uso, por exemplo, em cães, gatos, primatas, eqüinos e bovinos. Fica claro, adicionalmente, que um ou mais aspectos de humanização de um anticorpo descritos aqui podem ser combinados, por exemplo, enxerto de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.

Os anticorpos podem ser fabricados recombinantemente primeiro por isolamento dos anticorpos e células de produção de anticorpos dos animais hospedeiros, obtendo a seqüência genética e usando a seqüência genética para expressar o anticorpo recombinantemente nas células hospedeiras (por exemplo, células CHO). Outro processo que pode ser empregado é expressar a seqüência de anticorpo nas plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Os processos para expressão dos anticorpos recombinantemente em plantas ou leite foram descritos. Vide, por exemplo, Peeters, e outros, Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. and D. Huszar int.Rev.lmmunol 13:65 (1995); e Pollock e outros, J Immunol Methods 231:147(1999). Pro98 cessos para fabricação de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia simples, etc. são conhecidos na técnica.

Imunoensaios e técnicas de classificação de citometria de fluxo, tais como, classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) podem também ser empregados para isolar anticorpos que são específicos para

NGF.

Os anticorpos podem ser ligados a muitos veículos diferentes. Os veículos podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de veículos bem-conhecidos incluem polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser tanto solúvel quanto insolúvel para fins da invenção. Os versados na técnica conhecerão outros veículos apropriados para ligação dos anticorpos ou serão capazes de determinar os mesmos, usando experimentação de rotina. Em algumas concretizações, o veículo compreende uma porção que tem como alvo o miocárdio.

A codificação do DNA dos anticorpos monoclonais é prontamente isolada e seqüenciada usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligação especifica aos genes codificando as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células do hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser substituído nos vetores de expressão (tais como, vetores de expressão descritos na Publicação PCT número WO 87/04462), que são então transfectados nas células hospedeiras, tais como, células E.coli, células COS de símios, células ovarianas de hamster chinês (CHO ou células de mieloma que de outra forma não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Vide, por exemplo, Publicação PCT número WO 87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, por substituição da seqüência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humanas no lugar das seqüências homólogas de murino, Morrison e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. 81:6851 (1984) ou por ligação covalente à seqüência de codificação de imunoglobulina ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo de imunoglobulina. Dessa maneira, anticorpos quiméricos ou híbridos são preparados, os quais possuem a especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal de anti-NGF aqui.

Anticorpos antagonistas de anti-NGF podem ser caracterizados usando processos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, um processo é identificar o epítopo ao qual ele se liga ou mapeamento de epítopo. Existem muitos processos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a localização dos epítopos nas proteínas, incluindo solução da estrutura do cristal de um complexo de anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmento de gene e ensaios à base de peptídeo sintético, conforme descritos por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento do epítopo pode ser usado para determinar a seqüência na qual um anticorpo antagonista de anti-NGF se liga. O mapeamento do epítopo é comercialmente disponível de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Baixos). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um estiramento simples de aminoácidos ou um epítopo conformacional, formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que podem não estar contidos necessariamente em um estiramento simples. Peptídeos de vários comprimentos (isto é, pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, recombinantemente) e fundidos para ensaios de ligação com um anticorpo antagonista de anti-NGF. Em outro exemplo, o epítopo ao qual o anticorpo antagonista de anti-NGF se liga pode ser determinado em uma classificação sistemática por uso de peptídeos de sobreposição derivados da seqüência de NFG e determinando a ligação pelo anticorpo antagonista de anti-NGF. De acordo com os ensaios de expressão de fragmento de gene, o quadro de leitura aberto codificando NGF é fragmentado tanto aleatoriamente quanto por constructos genéticos específicos e a reatividade dos fragmentos expressos de NGF com o anticorpo a ser testado é determinada. Os fragmentos de gene podem, por exemplo, ser produzidos por PCR e então

100 ►t >> , Γ transcritos e traduzidos para a proteína in vivo, em presença de aminoácidSetog radioativos. A ligação do anticorpo aos fragmentos de NFG marcados radioativamente é então determinada por imunoprecipitação e eletroforese em gel. Determinados epítopos podem também ser identificados por uso de grandes coletâneas de seqüências de peptídeo aleatórias exibidas na superfície das partículas de fago (coletâneas de fago). Alternativamente, uma coletânea definida de fragmentos de peptídeo de sobreposição pode ser testada quanto à ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples.

Em um exemplo adicional, a mutagênese de um domínio de ligação de antígeno, experimentos de permuta de domínio e mutagênese de varredura de alanina podem ser realizados para identificar os resíduos necessários, suficientes e/ou necessários para ligação do epítopo. Por exemplo, os experimentos de permuta de domínio podem ser realizados usando um NFG mutante, no qual vários fragmentos de polipeptídeo de NGF foram permutados com seqüências de uma proteína proximamente correlata, porém antigenicamente distinta (tal como outro elemento da família da proteína neurotrofina). Avaliando-se a ligação do anticorpo ao NGF mutante, a importância do fragmento de NGF específico para a ligação do anticorpo pode ser avaliada.

Ainda outro processo que pode ser usado para caracterizar um anticorpo antagonista de anti-NGF é usar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos para ligar ao mesmo antígeno, isto é, vários fragmentos no NGF, para determinar e o anticorpo antagonista de anti-NGF liga-se ao mesmo epítopo que os outros anticorpos. Os ensaios de competição são bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Exemplo de anticorpos que podem ser usados nos ensaios de competição para a presente invenção incluem MAb 911, 912, 938, conforme descrito em Hongo e outros, Hybridoma 19:215-227 (2000).

Um vetor de expressão pode ser usado para direcionar expressão de um anticorpo antagonista de anti-NGF. Um versado na técnica está familiarizado com a administração dos vetores de expressão para obter expressão de uma proteína exógena in vivo. Vide, por exemplo, Patentes US números 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471. A administração dos vetores o_Zí <>·

101 . ^-LUsriS*

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¢./de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, admi-' “ ^v nistração oral, pistola de partícula ou administração cateterizada e administração tópica. Em oura concretização, o vetor de expressão é administrado diretamente ao tronco simpático ou gânglio ou dentro de um artéria coronária, átrio, ventrículo ou pericárdio.

A liberação alvejada das composições terapêuticas contendo um vetor de expressão ou polinucleotídeos subgenômicos também pode ser usada. Técnicas de liberação de DNA mediadas por receptor são descritas, por exemplo, em Findeis e outros, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou e outros, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu e outros, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu e outros, J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA (1990) 87:3655; Wu e outros, J. Biol. Chem. (1991) 266:338. As composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia genética. A concentração varia de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 pg a cerca de 2 mg, cerca de 5 pg a cerca de 500 pg, e cerca de 20 pg a cerca de 100 pg de DNA também podem ser usados durante o protocolo de terapia genética. Os polinucleotídeos terapêuticos e polipeptídeos podem ser liberados usando veículos de liberação de gene. O veículo de liberação de gene pode ser de origem virótica ou não virótica (vide, de modo geral, Jolly, Câncer Gene Therapy (1994)

1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). A expressão de tais seqüências de codificação pode ser induzida usando promotores de mamíferos endógenos ou heterólogos. A expressão da seqüência de codificação pode ser tanto constitutiva ou regulada.

Vetores de base virótica para liberação de um polinucleotídeo e expressão desejados em uma célula desejada são bem-conhecidos na técnica. Veículos de base virótica exemplares incluem, porém não estão limitados aos retrovírus recombinantes (vide, por exemplo, Publicações PCT números WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO

102

93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes US números 5.219.740^^^.#'’ 4.777.127; Patente Britânica número 2.200.651; e Patente Européia número 0 345 242), vetores a base de alfavírus (por exemplo, vetores do vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírus da encefalite equina venezuelano (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e também vetores do vírus adenoassociado (AAV) (vide, por exemplo, Publicações PCT números WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938;

WO 95/11984 e WO 95/00655). Administração de um DNA ligado ao adenovírus exterminado conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992)

3:147 também pode ser empregada.

Veículos de liberação não-viróticos e processos também podem ser empregados, incluindo, porém não limitado ao DNA condensado policatiônico ligado ou não ao adenovírus exterminado sozinho (vide, por exemplo,

Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante (vide, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células de veículos de liberação de célula eucariótica (vide, por exemplo, Patente US número 5.814.482; Publicações PCT números WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nucléica ou fusão com membranas de célula. O DNA nu pode também ser empregado. Processos de introdução ao DNA nu exemplares são descritos na Publicação PCT número WO 90/11092 e Patente US número 5.580.859. Lipossomas que podem atuar como veículos de liberação de gene são descritos na Patente US número 5.422.120; Publicações PCT números WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; θ Patente Européia número 0 524 968. Abordagens adicionais são descritas em Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 e em Woffendin, Proc.

Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.

Identificação de Anticorpos Antagonistas de Anti-NGF

Anticorpos antagonistas de anti-NGF podem ser identificados ou caracterizados usando processos conhecidos na técnica, pelo que, redução, melhora ou neutralização da atividade biológica de NGF é detectada e/ou medida. Por exemplo, um ensaio de ativação de receptor de quinase (KIRA)

103 %

.. ·υ&' descrito nas Patentes US números 5.766.863 e 5.891.650 pode ser usaàò^'¹para identificar agentes anti-NGF. Esse ensaio tipo ELISA é apropriado para medição qualitativa ou quantitativa de ativação de quinase por medição da autofosforilação do domínio de quinase de um receptor de proteína tirosina quinase (doravante rPTK), por exemplo, receptor TrkA, bem como para identificação e caracterização dos antagonistas em potencial de um rPTK, por exemplo, TrkA. Um primeiro estágio do ensaio envolve fosforilação do domínio quinase de um receptor de quinase, por exemplo, um receptor TrkA, onde o receptor está presente na membrana da célula de uma célula eucartótica. O receptor pode ser um receptor endógeno ou ácido nucléico codificando o receptor ou um constructo de receptor, podendo ser transformado dentro da célula. Tipicamente, uma primeira fase sólida (por exemplo, um cavidade de uma primeira placa de ensaio) é revestida com uma população substancialmente homogênea de tais células (geralmente uma linhagem de célula de mamífero), de modo que as células aderem à fase sólida. Frequentemente, as células são aderentes e desta forma aderem naturalmente à primeira fase sólida. Se um constructo de receptor for usado, ele compreende geralmente uma fusão de um receptor de quinase e um polipeptídeo flag. O polipeptídeo flag é reconhecido pelo agente de captura, freqüentemente um anticorpo de captura, na parte ELISA do ensaio. Um analito, tal como um anticorpo antagonista de anti-NGF candidato é então adicionado em conjunto com o NGF às cavidades possuindo células aderentes, tal que, o receptor de tirosina quinase (por exemplo, receptor TrkA) é exposto a (ou contatado com) NGF e o analito. Esse ensaio permite identificação dos anticorpos que inibem a ativação de TrkA por seu ligante NGF. Seguindo-se a exposição ao NGF e ao analito, as células aderentes são solubilizadas usando um tampão de lise (que possui um detergente de solubilização) e agitadas brandamente, pelo que, liberando o lisado de célula que pode ser submetido a parte ELISA do ensaio diretamente, sem a necessidade de concentração ou clarificação do lisado da célula.

O lisado de célula assim preparado então está pronto para ser submetido ao estágio ELISA do ensaio. Como uma primeira etapa no estágio

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ELISA, uma segunda fase sólida (geralmente uma cavidade de uma placa ‘ de microtitulação ELISA) é revestida com um agente de captura (freqüentemente um anticorpo de captura) que liga-se especificamente ao receptor de tirosina quinase ou, no caso de um constructo de receptor, ao polipeptídeo flag. O revestimento da segunda fase sólida é realizado, de modo que o agente de captura seja aderido à segunda fase sólida. O agente de captura é geralmente um anticorpo monoclonal, porém, conforme descrito nos exemplos aqui, anticorpos policlonais podem também ser usados. O iisado de célula obtido é então exposto ou contatado com o agente de captura aderente, de modo que o receptor ou constructo de receptor possa aderir a (ou ser capturado na) segunda fase sólida. A etapa de lavagem é então realizada, de modo a remover o Iisado de célula não-ligado, deixando o receptor ou constructo de receptor capturado. O receptor capturado ou de aderência ou constructo de receptor é então exposto ou colocado em contato com um anticorpo antifosfotirosina que identifica os resíduos de tirosina fosforilados no receptor de tirosina quinase. Em uma concretização, o anticorpo antifosfotirosina é conjugado (direta ou indiretamente) a uma enzima que catalisa uma alteração de cor de um reagente de cor não-radioativo. Conseqüentemente, a fosforilação do receptor pode ser medida por uma alteração de cor subseqüente do reagente. A enzima pode ser ligada diretamente ao anticorpo antifosfotirosina diretamente ou uma molécula de conjugação (por exemplo, biotina) pode ser conjugada ao anticorpo antifosfotirosina e a enzima pode ser subsequentemente ligada ao anticorpo antifosfotirosina, através da molécula de conjugação. Finalmente, a ligação do anticorpo antifosfotirosina ao receptor capturado ou constructo de receptor é medida, por exemplo, por uma alteração de cor no reagente de cor.

O anticorpo antagonista de anti-NGF pode também ser identificado por incubação de um agente candidato com NGF e monitoramento de qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) ligação ao NGF e inibição da atividade biológica de NGF ou vias a jusante mediadas por função de sinalização de NGF; (b) inibição, bloqueio ou diminuição da ativação do receptor de NGF (incluindo dimerização do receptor TrkA e/ou autofosfo105

rilação); (c) aumento do espaço de NGF; (d) tratamento ou prevenção dé · qualquer aspecto de dor por artrite reumatóide ou dor por osteoartrite; (e) inibição (redução) da síntese de NGF, produção ou liberação. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF é identificado por incubação de um agente candidato com NGF e monitoramento da ligação e/ou redução ou neutralização de uma atividade biológica do NGF. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipeptídeo(s) de NGF purificado(s) ou com células expressando naturalmente ou transfectadas para expressar polipeptídeo(s) de NGF. Em uma concretização, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitivo, onde a capacidade de um anticorpo candidato de competir com um antagonista anti-NGF para ligação NGF é avaliada. O ensaio pode ser realizado de várias formas, incluindo o formato ELISA. Em outras concretizações, um anticorpo antagonista de anti-NGF é identificado por incubação de um agente candidato com NGF e monitoramento da ligação e inibição do receptor trkA, dimerização e/ou autofosforilação.

Seguindo-se a identificação iniciai, a atividade de um anticorpo antagonista de anti-NGF candidato pode ser adicionalmente confirmada e refinada por bioensaios, conhecidos para testar as atividades biológicas alvejadas. Alternativamente, os bioensaios podem ser usados para classificar diretamente os candidatos. Por exemplo, NGF promove várias alterações morfologicamente reconhecíveis nas células sensíveis. Essas incluem, porém não estão limitadas a promoção da diferenciação das células PC12 e melhora do desenvolvimento de neurites dessas células (Greene e outros, Proc Natl Acad Sei USA. 73(7):2424-8, 1976), promoção do supercrescimento da neurite de explantes de gânglios simpáticos e sensoriais sensíveis (Levi-Montalcini, R. e Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48:534569, 1968) e promoção da sobrevivência de neurônios dependentes de NGF, tais como, gânglio da espinha dorsal embriônica, gânglio trigeminal ou neurônios de gânglio simpático (por exemplo, Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977); Buchman & Davies, Deveíopment 118:989-1001 (1993). Assim, o ensaio para inibição da atividade biológica de NGF engloba cultura de células sensíveis a NGF com NGF mais um analito, tal como, anticorpo

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106 '-'Px' ,· 'í* antagonista de anti-NGF candidato. Após um tempo apropriado, a resposta¹¹ ¹da célula será analisada (diferenciação da célula, crescimento da neurite ou sobrevivência da célula).

A capacidade de um anticorpo antagonista de anti-NGF candidato de bloquear ou neutralizar uma atividade biológica de NGF pode também ser avaliada por monitoramento da capacidade do agente candidato de inibir sobrevivência mediada por NGF no bioensaio de sobrevivênia de gânglios de espinha dorsal de ratos embriônicos, conforme descrito em Hongo e outros, Hybridoma 19:215-227 (2000).

Administração de um Anticorpo Antagonista de Anti-NGF

O anticorpo antagonista de anti-NGF pode ser administrado a um indivíduo (para artrite reumatóide e osteoartrite) através de qualquer via apropriada. Deve ficar claro a um versado na técnica que os exemplos descritos aqui não pretendem limitar, porém ilustrar as técnicas disponíveis. Conseqüentemente, em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF é administrado ao indivíduo de acordo com processos conhecidos, tais como, administração intravenosas, por exemplo, como um bólus ou por infusão contínua por um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intra-articular, sublingual, intrasinovial, via insuflação, intratecal, oral, inalação ou tópica. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa ou localizada. Nebulizadores disponíveis comercialmente para formulações líquidas, incluindo nebulizadores de jato e nebulizadores ultra-sônicos são úteis para administração. As formulações líquidas podem ser diretamente nebulizadas e pó liofilizado pode ser nebulizado após reconstituição. Alternativamente, anticorpo antagonista de anti-NGF pode ser formulado em forma de aerossol usando formulação de fluorcarboneto e um inalador de dose medida ou inalado como um pó liofilizado e triturado.

Em uma concretização, um anticorpo antagonista de anti-NGF é administrado através de técnicas de ligação em local alvejado ou específicas para o local. Exemplos de técnicas de liberação local alvejado ou específicas para o local incluem várias fontes de depósito implantável de anticorA da fy-

107 po antagonista de anti-NGF ou cateteres de ligação locai, tais como, catétères de infusão e cateter residente, ou um cateter de agulha, enxertos sintéticos, ataduras adventícias, desvios e stents ou outros dispositivos implantáveis, veículos específicos para local, injeção direta ou aplicação direta. Vide, por exemplo, Publicação PCT Número WO 00/53211 e Patente US número

5.981.568.

Várias formulações de um anticorpo antagonista de anti-NGF podem ser usadas para administração. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF pode ser administrado puro. Em algumas concretizações, anticorpo antagonista de anti-NGF e um excipiente farmaceuticamente aceitável podem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou agir como um diluente. Excipientes apropriados incluem, porém não estão limitados aos agentes estabilizantes, agentes umectantes e emulsionantes, sais para variação de osmolaridade, agentes de encapsuiamento, tampões e melhoradores.de penetração na pele. Excipientes, bem como formulações para liberação de drogas parenterais ou não-parenterais são estabelecidas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Em algumas concretizações, esses agentes são formulados para administração por injeção (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscularmente, etc.). Conseqüentemente, esses agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente aceitavéis, tais como, salmoura, solução de Ringer, solução de dextrose e semelhantes. O regime de dosagem especifica, isto é, dose, tempo e repetição, dependerá do indivíduo específico e do histórico médico do indivíduo.

Um anticorpo anti-NGF pode ser administrado usando qualquer processo apropriado incluindo por injeção (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscularmente, etc.). Anticorpos anti-NGF podem também ser administrados através de inalação, conforme descrito aqui.

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108

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De modo geral, para administração de anticorpos anti-NGF, uma dosagem - ~ candidata inicial pode ser de cerca de 2 mg/kg. Para fins da presente invenção, uma dosagem diária, típica, pode variar de cerca de qualquer de 1 pg/kg a 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, um anticorpo anti-NGF pode ser administrado a cerca de 1 pg/kg, cerca de 10 pg/kg, cerca de 20 pg/kg, cerca de 50 pg/kg, cerca de 100 pg/kg, cerca de 200 pg/kg, cerca de 500 pg/kg, cerca de 1 mg/kg ou cerca de 2 mg/kg. Para administrações repetidas, por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até uma supressão desejada ou sintoma de alívio ocorrer ou até níveis terapêuticos suficientes serem objetivos para reduzir a dor.

Um regime de dosagem exemplar compreende administração de uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo anti-NGF ou seguida por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg em semana alternada. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis, dependendo do padrão de diminuição farmacocinética que o médico praticante deseja obter. Por exemplo, em algumas concretizações, a dosagem de uma-quatro vezes por semana é contemplada. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o(s) antagonista(s) de NGF usado(s)) pode variar com o tempo.

Para a finalidade da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo antagonista de anti-NGF dependerá do anticorpo antagonista de anti-NGF (ou composições dos mesmos) empregado, do tipo e gravidade da dor a ser tratada, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e resposta ao agente e a critério do médico atendente. Tipicamente, o médico administrará um anticorpo antagonista de anti-NGF, até ser alcançada uma dosagem que obtenha o resultado desejado. A dose e/ou freqüência podem variar no curso do tratamento.

Considerações empíricas, tais como, meia-vida útil, geralmente contribuirão para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que

109 ,/ .k;'· são compatíveis com o sistema imune humano, tais como, anticorpos humanizados ou anticorpos completamente humanos podem ser usados para prolongar a vida útil do anticorpo e para prevenir que o anticorpo seja atacado peío sistema imune do hospedeiro. A freqüência da administração pode ser determinada e ajustada no curso da terapia e é geralmente, porém não necessariamente, baseada no tratamento e/ou supressão e/ou melhorada e/ou retardo da dor. Alternativamente, formulações de liberação contínua, prolongada dos anticorpos antagonistas de anti-NGF podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para obter liberação prolongada são conhecidos na técnica.

Em uma concretização, dosagens do anticorpo antagonista de anti-NGF podem ser determinadas empiricamente nos indivíduos que receberam uma ou mais administrações de um anticorpo antagonista de antiNGF. Os indivíduos recebem dosagens incrementais de anticorpo antagonista de anti-NGF. Para avaliar a eficácia do anticorpo antagonista de anti-NGF, um indicador de dor pode ser seguido.

A administração de um anticorpo antagonista de anti-NGF de acordo com o processo na presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se a finalidade da administração é terapêutica ou profilática, e outros fatores conhecidos dos versados na técnica. A administração de um anticorpo antagonista de anti-NGF pode ser essencialmente contínua por um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas, por exemplo, tanto antes, durante ou após desenvolvimento da dor, antes, durante, antes e após, durante e após ou antes durante e após o desenvolvimento da dor.

Em algumas concretizações, mais de um anticorpo antagonista de anti-NGF podem estar presentes. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro e pelo menos cinco ou mais anticorpos antagonistas de anti-NGF podem estar presentes. Geralmente, aqueles anticorpos antagonistas de anti-NGF possuem atividades complementares que não afetam adversamente uma à outra.

110

Formulações terapêuticas do anticorpo antagonista de anti-NGF usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo possuindo o grau desejado de pureza com veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizadores são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas e podem compreender tampões, tais como, fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; tais como, cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como, cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou fenílico; alquil parabenos, tais como, metil ou propril parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menor que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como, albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros htdrófilos, tais como, polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacartdeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como, EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como, sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônícos, tais como, TWEEN®, PLURONIC® ou políetilenoglicol (PEG).

Lipossomas contendo o anticorpo antagonista de anti-NGF são preparados por processos conhecidos na técnica, tais como os descritos em Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985); Hwang e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); e Patentes US números 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação melhorado são descritos na Patente US número 5.013.556. Lipossomas especificamente preferidos podem ser gerados por processo de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidileolina, coiesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extruS-Λ

111 dados através de filtros de tamanho de poro definido para renderem lipossomas possuindo diâmetro desejado.

Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de liberação de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semi-impermeáveis de polímeros hidrófobos contendo o anticorpo, as matrizes estando na forma de artigos conformados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou 'poli (álcool vinílico), polilactídeos (Patente US número 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etíl-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tais como, LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lácticoácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato acetato de sacarose e ácido polÍ-D-(-)-3-hídroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéril. Composições terapêuticas de anticorpo antagonista de anti-NGF são geralmente colocadas em um recipiente possuindo um orifício de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco possuindo um parador penetrável por uma agulha de injeção hipodérmica.

As composições de acordo com a presente invenção podem estar nas formas de dosagem unitária, tais como, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões ou supositórios, para adminis\ ύ,Λ

112

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tração oral, parenteral ou retal ou administração por inalação ou insuflação.^^^?^

Para preparar as composições tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico, por exemplo, ingredientes para formação de comprimidos convencionais, tais como, amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio ou gomas e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção ou um sal não-tóxico farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando se refere a essas composições de pré-formulação como homogêneas, isto significa que o ingrediente ativo é disperso igualmente através de toda a composição, de modo que a composição pode ser prontamente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes tais como, comprimidos, pílulas e cápsulas.

Essa composição de pré-formulação sólida é então subdividida em formas de dosagem unitária do tipo descrito acima contendo 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou de outra forma compostos para prover uma forma e dosagem que fornece vantagem de ação prolongada.

Por exemplo, o comprimento ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e um componente de dosagem externa, o último estando na forma de um invólucro sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir a desintegração no estômago e permitir que o componente interno passe intacto para o duodeno ou tenha a liberação retardada. Vários materiais podem ser usados para tais camadas entéricas ou revestimentos, tais como, materiais incluindo vários ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais, tais como, goma laca, álcool cetílico e acetato de celulose.

Agentes ativos em superfície apropriados incluem, especificamente, agentes não-iônicos, tais como, polioxietilenossorbitanos (por exemplo,

Tween® 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo,

Span® 20, 40, 60, 80 ou 85). Composições com um agente ativo em superfície convenientemente compreenderão entre 0,05 e 5% de agente ativo em

113

superfície, e podem estar entre 0,1 e 2,5%. Será apreciado que outros gredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, caso necessário.

Emulsões apropriadas podem ser preparadas usando emulsões graxas disponíveis comercialmente, tais como, Intralipid®, Liposyn®, Infonutrol®, Lipofundin® e Lipiphysan®. O ingrediente ativo pode ser tanto dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada ou alternativamente pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho e óleo de amêndoa) e a emulsão formada por mistura com um fosfolipídeo (por exemplo, fosfolipídeos de ovo, fosfolipídeos de soja ou lecitina de soja) e água. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, glicerol e glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. Emulsões apropriadas tipicamente conterão até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão graxa pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 μιτι, especificamente 0,1 e 0,5 pm, e possuem um pH na faixa de 5,5 a 8,0.

As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas por mistura de um anticorpo de fator de crescimento nervoso com Intralipid® ou os componentes do mesmo (óleo de soja, fosfolipídeos de ovo, glicerol e água).

As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos, farmaceuticamente aceitáveis ou misturas dos mesmos e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis, conforme estabelecido acima. Em algumas concretizações, as composições são administradas por via oral, nasal ou respiratória para efeito local ou sistêmico. As composições nos solventes farmaceuticamente aceitáveis, preferivelmente estéreis podem ser nebuiizadas por uso de gases. Soluções nebulizadas podem ser diretamente respiradas do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser anexado a uma máscara facial, tenda ou máquina de respiração por pressão positiva intermitente. As composições de solução, suspensão ou pó podem ser administradas, preferivelmente, oral ou nasal114

mente, de dispositivos que liberam a formulação de um modo apropriado.,

A eficácia do tratamento pode ser avaliada por processos bemconhecidos na técnica.

Kits Compreendendo Anticorpos e Polinucleotídeos da Invenção

A invenção também fornece kits compreendendo anticorpos ou polipeptídeos para uso em detecção e/ou terapia. Conseqüentemente, em algumas concretizações, os kits compreendem um anticorpo E3. Em algumas concretizações, o kit compreende qualquer anticorpo ou polipetídeo descrito aqui.

Em outros aspectos, os kits podem ser usados para qualquer um dos processos descritos aqui incluindo, por exemplo, para tratar um indivíduo com dor (incluindo dor pós-cirúrgica, dor por artrite reumatóide, e dor por osteoartrite). Os kits dessa invenção estão em embalagens apropriadas e podem prover, opcionalmente, componentes adicionais, tais como, tampões e instruções para uso do anticorpo em qualquer um dos processos descritos aqui. Em algumas concretizações, os kits incluem instruções para tratamento da dor. Em algumas concretizações, o kit compreende um anticorpo antagonista de anti-NGF descrito aqui e instruções para tratamento e/ou prevenção de dor por artrite reumatóide em um indivíduo. Em outras concretizações, o kit compreende um anticorpo antagonista de anti-NGF descrito aqui e instruções para tratamento e/ou prevenção de dor por osteoartrite em um indivíduo. Em algumas das concretizações, o anticorpo antagonista de anti-NGF é anticorpo E3.

Em outro aspecto, a invenção provê kits compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo E3 conforme descrito aqui. Em algumas concretizações, os kits compreendem adicionalmente instruções para uso do polinucleotídeo em qualquer um dos processos descritos aqui. Processos para Ajuste da Afinidade de um Anticorpo e Processos para Caracterização de uma CDR

Foi desenvolvido um novo processo para caracterização de uma CDR de um anticorpo e/ou alteração (tal como aperfeiçoando) da afinidade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, denominado mutagênese de varredura de biblioteca. Geralmente, a mutagênese de varredura . '«ί·

115 , '3 *4

de biblioteca trabalha como se segue. Uma ou mais posições de aminoácido ^óna CDR são substituídas por dois ou mais (tais como, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) aminoácidos usando processos reconhecidos na técnica. Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas concretizações, uma para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com complexidade de dois ou mais elementos (se dois ou mais aminoácidos forem substituídos em cada posição). De modo geral, a biblioteca também inclui um clone compreendendo o aminoácido nativo (não-substituído). Um número pequeno de clones, por exemplo, cerca de 2080 clones (dependendo da complexidade da biblioteca) de cada biblioteca são classificados quanto à afinidade de ligação ao polipeptídeo alvo e candidatos com ligação aumentada, à mesma, ou diminuída ou sem ligação são identificados. Os processos para determinação da afinidade de ligação são bem-conhecidos na técnica. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é determinada usando análise de ressonância de plasmônio de superfície BIAcore, que detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou mais. BIAcore é especificamente útil quando o anticorpo de partida já se liga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo, um Kd de cerca de 10 nM ou menor. Varredura usando ressonância de plasmônio de superfície BIAcore é descrita nos Exemplos aqui.

Em outras concretizações, a afinidade de ligação é determinada usando Biossensor Kinexa, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio ORIGEN (IGEN), saturação de fluorescência, transferência de fluorescência e/ou exibição de levedura. Em outras concretizações, a afinidade de ligação é classificada usando um bioensaio apropriado.

Em algumas concretizações, cada posição de aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas concretizações, uma por vez) com todos vinte aminoácidos naturais usando processos de mutagênese reconhecidos na técnica (alguns dos quais são descritos aqui). Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas concretizações, uma para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de 20 elementos (se todos os 20 aminoácidos forem substituídos em cada posição).

116

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Em algumas concretizações, a biblioteca a ser classificada com-’ ' * preende substituições em duas ou mais posições, que podem estar na mesma CDR ou em duas ou mais CDRs. Assim, em algumas concretizações, a biblioteca compreende substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs. Ainda em outras concretizações, a biblioteca compreende substituição nas 3, 4, 5 ou mais posições, as posições encontradas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. Em algumas concretizações, a substituição é preparada usando códons de baixa redundância. Vide, por exemplo, a Tabela 2 de Balint e outros, (1993) Gene 137(1): 109-18).

Em algumas concretizações, a CDR é CDR H3 e/ou CDRL3. Em outras concretizações, a CDR é uma ou mais de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e/ou CDRH3. Em algumas concretizações, a CDR é uma CDR Kabat, uma CDR Chotia ou uma CDR estendida.

Candidatos com ligação aperfeiçoada podem ser seqüenciados, desta forma identificando um mutante de substituição de CDR que resulta em afinidade aperfeiçoada (também denominada uma substituição aperfeiçoada”). Por exemplo, conforme demonstrado no Exemplo 1, o uso desse processo permitiu identificação de uma substituição simples que aperfeiçoou a ligação, mesmo quando outras 18 substituições estimadas na mesma posição de aminoácido não resultaram em ligação (isto é, perda da função do anticorpo). Candidatos que se ligam podem também ser seqüenciados, desta forma identificando uma substituição de CDR que mantém a ligação.

Em algumas concretizações, são conduzidas rodadas múltiplas de classificação. Por exemplo, candidatos (cada um compreendendo uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições de uma ou mais CDRs) com ligação aperfeiçoada são também úteis para o projeto de uma segunda biblioteca contendo pelo menos o aminoácido original e o substituído em cada posição de CDR aperfeiçoada (isto é, posição do aminoácido na CDR onde um mutante de substituição mostrou ligação aperfeiçoada). Preparação e classificação ou seleção dessa biblioteca são discutidas a seguir.

A mutagênese de classificação da biblioteca também provê um dispositivo para caracterização de uma CDR, na medida que a freqüência

117 dos clones com ligação aperfeiçoada, a mesma ligação, ligação diminuída ou nenhuma ligação também provê informações relacionadas à importância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do complexo anticorpoantígeno. Por exemplo, se uma posição do CDR mantém ligação quando alterada para todos 20 aminoácidos, aquela posição é identificada como uma posição que provavelmente não será necessária para ligação do antígeno. De modo contrário, se uma posição de CDR retém ligação apenas em uma pequena porcentagem de substituições, aquela posição é identificada como uma posição que é importante para a função CDR. Assim, os processos de mutagênese de classificação de biblioteca geram informações relacionadas às posições nas CDRs que podem ser alteradas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos 20 aminoácidos), e posições nas CDRs que não podem ser alteradas ou que podem ser alteradas apenas para poucos aminoácidos. Esse aspecto é discutido e exemplificado no Exemplo 1.

Em algumas concretizações, candidatos com afinidade aperfeiçoada são combinados em uma segunda biblioteca, que inclui o aminoácido aperfeiçoado, o aminoácido original naquela posição e podem também incluir substituições adicionais naquela posição, dependendo da complexidade da biblioteca que é desejada ou permitida usando o processo de classificação e seleção desejado. Além disso, caso desejado, a posição do aminoácido adjacente pode ser aleatorizada para pelo menos dois ou mais aminoácidos. A aleatorização dos aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade conformacional adicional na CDR de mutante, que pode, por sua vez, permitir ou facilitar a introdução de um número grande de mutações de aperfeiçoamento. Em algumas concretizações, a biblioteca também compreende substituição nas posições que não mostram afinidade aperfeiçoada na primeira rodada de classificação.

A segunda biblioteca é classificada ou selecionada quanto aos elementos da biblioteca com afinidade de ligação aperfeiçoada e/ou alterada usando qualquer processo conhecido na técnica, incluindo classificação usando análise de ressonância de plasmônio de superfície BlAcore e seleção usando qualquer processo conhecido na técnica para seleção, incluindo exí118

bição de fago, exibição de levedura e exibição de ribossoma.

Vantagens dos processos para ajuste da afinidade de um anticorpo e caracterização de uma CDR

Os processos são úteis para pré-classificar as posições de aminoácido da CDR a fim de identificar as substituições de aminoácido que aperfeiçoam a ligação ou mantém a mesma. A pré-identificação de resíduos importantes, substituição que aperfeiçoa ligações e/ou substituições que mantêm a função do anticorpo permitem um projeto eficiente e classificação de uma biblioteca de maturação por afinidade.

O presente processo é também útil para caracterização de uma CDR e provê informações compreensivas com relação à importância de cada posição de aminoácido em uma CDR para ligação ao antígeno. O presente processo também pode ser usado para identificar substituições que aperfeiçoam a ligação.

O uso de pequenas bibliotecas, nas quais cada posição pode ser aleatorizada (em algumas concretizações, uma por vez) permite a classificação de mutantes de substituição usando processos sensíveis tais como, BlAcore que fornecem informação cinética detalhada. Processos de classificação geralmente não são práticos quando bibliotecas maiores são classificadas. Ao invés disso, processos de seleção, tais como, exibição de fago, exibição de levedura e exibição de ribossoma são geralmente usados para identificar clones que mantém a ligação. A exibição de fago e ensaios ELISA pode depender muito da concentração da amostra de proteína preparada do clone e assim tende a ser muito inclinada na direção dos clones que possuem expressão aumentada, estabilidade aumentada ou toxicidade diminuída, ao invés de identificar clones com afinidade de ligação aumentada. Além disso, as diferenças no nível de expressão dos clones podem mascarar pequenos aperfeiçoamentos na afinidade de ligação. Essas desvantagens são especificamente fortes quando um anticorpo com afinidade de ligação alta é usado como o material de partida, uma vez que níveis muito baixos do antígeno devem ser usados para que a classificação seja suficientemente estringente.

Em contraste, os processos da invenção, tais como, aleatoriza119

ção em cada posição (em algumas concretizações, uma posição a cada vez) permitem introdução e caracterização do efeito de substituição, por exemplo, de todos 20 aminoácidos em uma dada posição. Essa análise provê informações de como muitas substituições em uma dada posição são toleradas (isto é, mantém a ligação do anticorpo), que por sua vez, provê informações relacionadas à importância de cada aminoácido para cada função do anticorpo. Adicionalmente, substituições que resultam em ligação aperfeiçoada podem ser identificadas, mesmo sob circunstâncias nas quais muitas ou a maioria das substituições em uma dada posição rendem anticorpos não funcionais (não-limitantes). Em contraste, mutagênese de varredura de alanina, que é geralmente usada para identificar posições de CDR importantes, provê informações relacionadas a condição da substituição da alanina permitir ou impedir ligação. Geralmente, posições nas quais uma substituição de alanina impede ligação são removidas da biblioteca de maturação por afinidade. Em muitos casos, contudo, a alanina pode ser um substituto fraco na posição da CDR.

Os presentes processos também permitem identificação e caracterização do efeito de mutações de CDR simples. Em contraste, os processos tais como, exibição de fago introduzem e selecionam muitas mutações simultaneamente, e assim aumentam potencialmente o risco de que mutações positivas sejam mascaradas pela presença de uma mutação prejudicial presente em um clone específico.

Os presentes processos também são úteis para aperfeiçoar a afinidade, enquanto mantêm a especificidade de ligação do anticorpo original (de partida) à medida que os presentes processos permitem identificação de pequenos números de mutações (por exemplo, 1,2, 3, 4 ou 5 mutações em uma CDR simples) o que resulta em afinidade de ligação aperfeiçoada. Em contraste, os processos tais como, exibição de fago tipicamente aperfeiçoam a afinidade de ligação usando mutações múltiplas de uma vez, o que pode resultar em deslocamento de especificidade do anticorpo e/ou aumento indesejado de reatividade cruzada.

Os exemplos que se seguem são providos para ilustrar, porém não limitar a invenção.

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Exemplos ' ..

Exemplo 1: Humanização e maturação por afinidade de anticorpo 911 antagonista de anti-NGF de camundongo A. Processos Gerais

Os processos gerais que se seguem foram usados nesse exemplo. Geração de Biblioteca

Bibliotecas foram geradas por mutagênese de cassete de PCR com degeneração de oligonucleotídeos conforme descrito em Kay e outros (1996), Phage display of peptides and proteins : a laboratory manual, San Diego, Academic Press (vide, páginas pg 277-291). O códon de dopagem NNK foi usado para aleatorizar uma posição de aminoácido para incluir 20 possíveis aminoácidos. Para aleatorizar uma posição de aminoácido de modo a incluir apenas um subconjunto de aminoácidos com propriedades específicas, os códons de dopagem foram usados conforme descrito em Balint e outros, (1993) Gene 137(1):109-18). Mutagênese direcionada para o local foi realizada usando PCR recombinante, conforme descrito em Innis e outros, (1990) PCR protocols: A guide to methods and applications (vide, pp. 177-183).

Preparação de Fab em Pequena Escala

Expressão em pequena escala em placas de 96 cavidades foi otimizada para classificação de bibliotecas Fab. Partindo de E.coli transformado com uma biblioteca Fab, colônias foram coletadas para inocular ambas uma placa master (ágar LB + Ampicilina (50 pg/ml) + 2% Glicose) e uma placa de trabalho (2 ml/cavidade, 96 cavidades/placa contendo 1,5 mL de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + 2% Glicose). Ambas as placas foram desenvolvidas a 30°C por 8-12 horas. A placa master foi armazenada a 4°C e as células da placa de trabalho foram peletizadas a 5000 rpm e ressuspensas com 1 mL de LB+Ampicilina (50 pg/ml)+ 1 mM IPTG para induzir expressão de Fabs. As células foram colhidas por centrifugação após tempo de expressão de 5 horas a 30°C, então ressuspensas em 500 pL de tampão HBS-EP (100 mM tampão HEPES pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,005% P20, 3 mM EDTA). Lise de células ressuspensas HBS-EP foi obtida por um ciclo de congelamento (80°C) então descongelamento a 37°C. Os lisados de célula foram centrifu121

gados a 5000 rpm por 30 minutos para separar os fragmentos das célula dos 7S ’ sobrenadantes contendo Fabs. Os sobrenadantes foram então injetados no aparelho de ressonância de plasmônio BIAcore para obter informações de afinidade para cada Fab. Os clones expressando Fabs foram resgatados da placa master para seqüência de DNA e para produção de Fab em grande escala e caracterização detalhada conforme descrito a seguir.

Preparação de Fab em Grande Escala

Para obter parâmetros de cinética detalhados, Fabs foram expressos e purificados de grandes culturas. Os frascos Erlenmeyer contendo 200 mL de LB+Ampicilina (50 ng/ml) + 2% Glicose foram inoculados com 5 mL de cultura por toda a noite de um clone de E.coli expressando Fab selecionado.

Os clones foram incubados a 30°C, até um OD₅₅onm de 1,0 ser obtido e então induzidos por substituição dos meios por 200 ml, de LB+Ampicilina (50 μρ/ηιΐ) + 1 mM IPTG. Após um tempo de expressão de 5 horas a 30°C, as células foram peietizadas por centrifugação, então ressuspensas em 10 mL PBS (pH 8). A lise das células foi obtida por dois ciclos de congelamento/descongelamento (a -80°C e 37°C, respectivamente). Os sobrenadantes dos lisados das células foram carregados em colunas Ni-NTA superfluxo sepharose (Qíagen, Valencia. CA) equilibradas com PBS, pH 8, então lavados com 5 volumes de coluna de PBS, pH 8. Fabs individuais eluíram em diferentes frações com PBS (pH 8) + 300 mM Imidazol. As frações contendo Fabs foram agrupadas e dializadas em PBS, então quantificadas por ELISA antes para caracterização de afinidade.

Preparação de Anticorpo Pleno

Para expressão de anticorpos plenos, regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram clonadas em 2 vetores de expressão de mamífero (Eb.911.E3 ou Eb.pur.911.3E para cadeia leve e Db.911.3E para cadeia pesada; descritos aqui) e transfectadas usando lipofectemina em 293 célula HEK para expressão transiente. Os anticorpos foram purificados usando proteína A usando processos padrão.

Ensaio Biacore

Afinidades de Fabs anti-NGF e anticorpos monoclonais foram

122 determinadas usando sistema de ressonância de plasmônio de superfície'**^v ' (SPR) BIAcore3000® (BIAcore, INC, Piscaway NJ). Chips CM5 foram ativados com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.

NGF humano foi diluído em 10 mM de acetato de sódio, pH 4,0 e injetado no chip ativado em uma concentração de 0,005 mg/mL. Utilizando-se tempo de fluxo variável através dos canais de chip individuais, podem ser obtidas duas faixas de densidade de antígeno: unidades de resposta 100-200 (RU) para estudos de cinética detalhados e 500-600 RU para ensaios de classificação.

O chip foi bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração mostraram que uma mistura de tampão de eluição Pierce (Produto número 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) e 4 M NaCI (2:1) removeu eficazmente o Fab ligado enquanto mantendo a atividade de hNGF no chip por mais de 200 injeções. O tampão HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCI, 3 mM EDTA, 0,005% Tensoativo P29) é usado como tampão de operação para os ensaios BIAcore.

Ensaio de Classificação

Um ensaio BIAcore de classificação foi otimizado para determinar a afinidade dos clones Fab das bibliotecas. Sobrenadantes de lisados de cultura pequenos foram injetados em 50 μΙ/min por 2 minutos. Tempos de dissociação de 10 a 15 minutos foram permitidos para determinação de uma razão de dissociação exponencial simples (k_off) usando software BIAevaluation. As amostras que mostram razões de k_Off na mesma faixa que o gabarito usado para criar a biblioteca (clone 8L2-6D5, k_Off 1x10'³ s'¹) foram injetadas para confirmação e dissociação, tempos de até 45 minutos foram utilizados para obter valores de koff melhores. Os clones mostrando valores de koff aperfeiçoados (mais lentos) foram expressos em grande escala e parâmetros cinéticos plenos, k_on θ koff, foram determinados na proteína purificada. O ensaio foi capaz de detectar diferenças na afinidade que eram aproximadamente de duas vezes ou maiores.

Ensaio de Determinação de Afinidade

Diluições em série (0,1-10 x Kd estimado) de amostras de Fab

123

purificadas foram injetadas por 1 minuto a 100 pL/min e tempos de dissocia^ ^{: v}ção de até 2 horas foram permitidos. As concentrações das proteínas Fab foram determinadas por ELISA e/ou eletroforese SDS-PAGE usando como padrão um Fab de concentração conhecida (conforme determinado por análise de aminoácido). Razões de associação cinética (Ko_n) e razões de dissociação (Koff) foram obtidas simultaneamente por ajuste dos dados para modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BIAevaluation. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foram calculados como koff/kon5, Humanização e maturação por afinidade de anticorpo 911 antagonista de anti-NGF de camundoncjo

O anticorpo antagonista de anti-NGF de camundongo, 911 (Vide Hongo e outros, (2000) Hybridoma 19(3):215-227) foi selecionado para humanização e maturação por afinidade. Mab 911 liga NGF humano e de rato com alta afinidade e não exibe reatividade cruzada significativa com as neurotrofinas NT3, NT4/5 ou BDNF. Vide Hongo, id. A afinidade do fragmento Fab clivado por papaína do Mab 911 de camundongo foi determinada usando análise BIAcore conforme descrito acima. O fragmento Fab clivado por papaína de Mab 911 de camundongo ligou-se ao NGF humano com um K_Dde aproximadamente 10 nM.

Humanização e maturação por afinidade foi conduzida nas várias etapas que se seguem:

(1) Preparação de gabarito enxertado com CDR.

As CDRs estendidas de cadeia leve de anticorpo 911 (isto é, incluindo ambas regiões CDR de Kabat e Chotia) foram enxertadas nas seqüências receptoras de linhagem de germe humanas 08 com JK2 e as CDRs estendidas de cadeia pesada de anticorpo 911 foram enxertadas em uma seqüência receptora de linhagem de germe humana VH4-59 com JH4.

As seqüências de aminoácidos das seqüências receptoras de linhagem de germe humanas são mostradas nas figuras 1A e 1B. A numeração do aminoácido é seqüencial. Usando as estruturas de proteína citadas acima, as . V ·.

124 λ’

seqüências de DNA foram designadas para genes sintéticos codificando estrutura humana com CDRs murinas. Esses domínios variáveis pesados e leves humanizados foram denominados respectivamente hVH e hVL Os códons foram otimizados para uso em E.coli e hamster. Vários oligonucleotídeos de sobreposição (69-90 bases em comprimento) estendendo o comprimento pleno de hVL e hVH com dois tniciadores de flanqueamento curto para cada cadeia foram usados para sintetizar separadamente dois genes por PCR recursiva, essencialmente conforme descrito em Prodromou e outros, (1992) Protein Eng 5(8): 827-9. Os fragmentos de DNA resultantes do comprimento correto foram purificados com gel e então clonados em um plasmídeo de expressão bicistrônico E.coli (resistente a ampicilina). A expressão dos anticorpos estava sob controle de um promotor lacZ induzível IPTG semelhante àquele descrito em Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Vide Vector pComb3X, na pg 2,10), contudo, as modificações incluíram adição e expressão dos seguintes domínios adicionais: o domínio constante de cadeia leve Kapa humano (vide GenBank, número de acesso CAA09181) e o domínio de constante CHI de imunoglobulina humana lgG2a (GenBank, número de acesso P01859).

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis do anticorpo enxertado com CDR (também denominado gabarito), denominado 8L24D5, são também mostradas nas figuras 1A e 1B. A afinidade de 8L2-4D5 foi determinada usando análise BIAcore conforme descrito acima. 8L2-4D5 liga NGF humano com um K_D de aproximadamente 38 nM.

(2) Introdução de uma mutação de ponto na seqüência de estrutura.

A substituição V71K foi introduzida na cadeia pesada enxertada com CDR usando mutagênese dirigida ao local de PCR recombinante conforme descrito em Innis e outros, (1995) PCR strategies. San Diego, Academic Press. Essa substituição substituiu o resíduo de estrutura humana pelo resíduo de estrutura de camundongo correspondente. O anticorpo resultante foi denominado 8L2-6D5, e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de 8L2-6D5 é mostrada na figura 1A. A afinidade de 8L2-6D5 foi

125

determinada usando análise BIAcore conforme descrito acima, O fragmento Fab de 8L2-6D5 liga NGF humano com um Kd de aproximadamente 15 nM, 8L2-6D5 foi escolhido como gabarito para maturação por afinidade.

(3) Humanização e maturação por afinidade de CDRs L1, L2, H1 e H2.

CDRs L1, L2, H1 e H2 foram submetidas a humanização e maturação por afinidade. As posições de aminoácidos nas CDRs L1, L2, H1, e H2 foram identificadas, não sendo essenciais para a estrutura das CDRs com base na estrutura canônica Chothia (vide Al-Lazikani e outros, (1997) J. Mol. Bioi. 273(4):927-48); e submetidas a randomização como se segue. Duas bibliotecas foram preparadas contendo as mutações de cadeia leve ou as mutações de cadeia pesada mostradas na Tabela 2, e as CDR L3 ou CDR H3 enxertadas (camundongo) respectivamente, usando mutagênese de cassete de PCR com oligonucieotídeos degenerados conforme descrito em Kay e outros, (1996), Phage display of peptides and proteins : a laboratory manual, San Diego, Academic Press, usando códons de dopagem conforme descrito em Balint e outros, (1993) Gene 137(1):109-18). Geralmente, os resíduos de aminoácido foram alterados para resíduos que são mais comuns nos anticorpos humanos, com base nos alinhamentos das seqüências de aminoácido de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo 911 com seqüências de anticorpo de linhagem de germe humano. O resíduo de aminoácido do tipo selvagem (não substituído) foi também representado na biblioteca com a exceção do resíduo 50 da CDR H2, uma metionina, peío que a metionina do tipo selvagem não foi representada na biblioteca. Os resíduos de metionina são submetidos a oxidação; assim era esperado o aperfeiçoamento da estabilidade do anticorpo resultante. As bibliotecas de Fabs foram clonadas no vetor pComb3X mais as regiões CH1 e Ck humanas, conforme descrito acima.

Tabela 2:

7. Biblioteca de cadeia pesada H1/H2-.

CDR-H1

I34 foi alterado para F, L, V, S, P, T, A ou I N35 foi alterado para N, T, S ou Y

126

CDR-H2

Μ50 foi alterado para todos 20 aminoácidos naturais A62 foi alterado para A ou S L63 foi alterado para L ou V

2, Biblioteca de cadeia leve L1/2

CDR-L1

S26 foi alterado para S, A, V ou F D28 foi alterado para D, A, S ou Y H32 foi alterado para Η, Ν, K, D, E, Q ou Y

CDR-L2

Y50 foi alterado para Y, D, A ou S 151 foi alterado para I, T, A ou V F54 foi alterado para F ou L S56 foi alterado para S e T

Para experimentos de classificação por afinidade, cada biblioteca foi adicionalmente emparelhada com a cadeia pesada ou leve enxertada com CDR (por exemplo, a biblioteca H1/H2 foi emparelhada com cadeia leve enxertada com CDR), o anticorpo foi expresso, e afinidade ao NGF humano de clones do indivíduo foi classificada usando o sistema de ressonância de plasmônio de superfície (SPR) BIACORE (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante e conforme descrito acima. k_off, ko_n e K_D foram determinadas. Clones do anticorpo foram classificados com base nas razões de koff, uma vez que, geralmente a maior variação na afinidade é vista nas razões koff, e adicionalmente porque as razões k_Off independem da concentração de anticorpos.

A seqüência de clones se ligaram foi determinada e a seqüência de clones se ligaram é mostrada na Tabela 3.

„s*

Tabela 3: Seqüências de aminoácido L1 e L2, seqüências de aminoácido H1 e H2 e dados de cinética para clones que se ligac\i .o xi

CD

T3

CO

Φ c

o o

to o

TJ

Φ

Ό

CO *2 ç

M— co o

CL o

ICO o

to co _ço o

o ç

CF)

Φ co

E co

127

	o X c *	25	T”		5“	00 v-	20 r
	ü= V	c? Φ t— * *	V Φ ΙΌ M⁷	T Φ CD 't	5,6e-4 i-	M- 1 Φ r-7	8,2e-4
	CDRL2 seqüência AA	YISRFHS (SEQ ID NO:13)	YTSRFHS (SEQIDNO:19)	YTSRFHS (SEQIDN0:21)	YVSRFHS (SEQ ID NO:23)	YISRFHT (SEQ ID NO:25)	YASRFHS (SEQ ID NO:27)
	CDRL1 seqüência AA	RASQDISNHLN (SEQ ID NO:12)	RASQSISNNLN (SEQIDN0:18)	RASQYISNHLN (SEQ ID NO:20)	RASQSISNQLN (SEQ ID NO:22)	RAFQAISNQLN (SEQ ID NO:24)	RAFQSISNQLN (SEQ ID NO:26)
Dados de cinética dos mutantes de CDR 1-2	Clones de biblioteca de cadeia leve emparelhados com cadeia pesada 8L2	8L2-6D5 (controle)	L129	L208	L97	L81	9Ί

128

	O 2 X c +	25		CO	9,5	LO of	10,5
	!t= V	CO 1 Q> V	Xt 1 Φ CO	2,4e-4	3,8e-4	3,8e-4	<b CN
	CDRH2 sequência AA	MIWGDGTTDYNSAL (SEQ ID NO:10)	IIWGDGTTDYNSAL (SEQ ID NO:29)	IIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID NO:31)	GIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID NO:33)	GIWGDGTTDYNSSV (SEQ ID NO:35) ____—--i	GIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID NO:37)
	CDRH1 seqüêncía AA	GFSLIGYDIN (SEQ ID NO:9)	GFSLIGYDSN (SEQ ID NO:28)	GFSLIGYDLN (SEQ ID NO:30)	GFSLIGYDVT (SEQ ID NO:32)	GFSLIGYDVT (SEQ ID NO:34)	GFSLIGYDAT (SEQ ID NO:36)
Dados de cinética dos mutantes de CDR 1-2	Clones de biblioteca de cadeia pesada emparelhados com cadeia leve 6D5	8L2-6D5 (controle)	H109	H19	CN CN CN X	H225	H18

x > V-rí' ί.!

129 ο

ICO

Ο co =5 c

c o

o co _co

-Q

CO

	10,2	13,5	15,2 i i i	18,7
	tf· t CD τ— tf	tf l CD M· LO	Tf 1 CD 4 CO	tf CD LO
	IIWGDGTTDYNSSV (SEQ ID NO:39)	QIWGDGTTDYNSSV (SEQ IDN0:41)	GIWGDGTTDYNSSV (SEQ ID NO:43)	SIWGDGTTDYNSAL (SEQ ID NO:45)
	GFSLIGYDVS (SEQ ID NO:38)	GFSLIGYDIS (SEQ ID NQ:40)	GFSLIGYDAS (SEQ ID NO:42)	GFSLIGYDST (SEQ ID NO:44)
Dados de cinética dos mutantes de CDR 1-2	6H	H227	H17	H28

ω o

σ

CO

N

ΊΖ

O ra φ

co £

£ £

’C

O) o

c

X co o

cr

Φ £

>

TO

ÍQ

E co

E

QJ

C mCD 'tf

CZ) <

o ><

CO o

Ό c

ZJ cr co o

T3

CO

CZ)

Z3

CD

E

Λ

130

CDRs contendo as substituições que se seguem mantiveram a ligação:

CDR-H1

I34: S, L, V, l e A ligados.

N35: Ν, T e S ligados.

CDR-H2

M50: Μ, I, G, Q, S, L ligados.

A62: A e S ligados.

L63: L e V ligados.

CDR-L1

S26: S e F ligados.

D28: D, S, A, Y ligados.

H32: Η, N, Q ligados.

CDR-L2

Y50: Y ligado.

151: I, Τ, V, A, ligados.

F54 : F ligado.

S56: S e T ligados

CDRs contendo as substituições que se seguem foram selecionadas geralmente com base na afinidade de ligação e combinadas em um clone simples, denominado H19-L129:

CDR-H1:134L: N35N (sem alteração)

CDR-H2: M50I; A62A (sem alteração); L63V

CDR-L1: S26S (sem alteração); D28S; H32N

CDR-L2: Y50Y (sem alteração); 151T; F54F (sem alteração); S56S (sem alteração)

Essas mutações foram combinadas (por ampliação das cadeias H e L por PCR, corte dos produtos de PCR e vetor (pRN8) com enzima de restrição e realizando uma ligação de 3 fragmentos) em um clone simples, denominado H19-L129, que também incluídas as CDRs enxertadas H3 e L3. A seqüência das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de H19-L129 é mostrada nas figuras 1A e 1B, e a Tabela 4 mostra a seqüência de amino131

ácidos das CDRs L1, L2, H1 e H2. H19-L129 liga NGF com um KD de aproximadamente 1 nM, conforme determinado usando análise BlAcore conforme descrito aqui.

Tabela 4: Seqüência de aminoácidos de CDRs H1, H2, L1 e L2 e dados de cinética para clone combinado H19-L129.

Combinação do clone: mutações nas CDRsH1,H2, L1,L2	CDRL1 CDRH1 seqüência AA	CDRL2 CDRH2 seqüência AA	koft (s-1)	*Kd (nM)
H19-L129	CDR-L1: RASQSISNNLN (SEQ ID NO:18) CDRH1: GFSLIGYDLN (SEQ ID NO:30)	CDRL2: YTSRFHS (SEQ 1DNO:19) CDR-H2: IIWGDGTTDYNSAV (SEQ IDNO:31)	1.1e-4	3,5

*KD calculado usando ko_n 4e4 M“¹s'¹ (4) Maturação por afinidade de H3 e L3 CDRs. Maturação por afinidade das CDRs H3 e L3 foi realizada em duas etapas. Primeiro, em um processo denominado mutagênese de varredura de biblioteca, cada resíduo de aminoácido em H3 e L3 foi individualmente pré-classificado, a fim de identificar a posição dos aminoácidos na qual a mutação resultou em afinidade de ligação aumentada ao NGF humano. Com base nos resultados da mutagênese de varredura de biblioteca (também denominada análise de aleatorização de biblioteca pequena) um subconjunto de posições de aminoácido em H3 e L3 foi selecionado para a preparação da biblioteca de maturação por afinidade e a biblioteca de maturação por afinidade foi classificada quanto a afinidade ao NGF humano usando análise BlAcore, conforme descrito aqui. É apreciado que essas técnicas podem ser aplicadas geralmente.

(a) Mutagênese de varredura e biblioteca

Cada posição de aminoácido nas CDRs H3 e L3 foi individualmente pré-classificada quanto as substituições que resultaram em afinidade de ligação aumentada ao NGF humano. A freqüência de substituições de aminoácido em qualquer posição dada que resultaram em ligação aperfeiço132

υada, a mesma ligação, ligação piorou nenhuma ligação forneceram informações relacionadas às posições nas CDRs que podem ser alteradas em muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos 20 aminoácidos), e posições nas CDRs que não alteraram ou que podem ser alteradas apenas em alguns aminoácidos. Substituições de aminoácido que resultaram em afinidade de ligação aumentada foram também identificadas. Com base nos resultados dessa classificação, um subconjunto de posições de aminoácidos nas CDRs H3 e L3 foi selecionado para preparação de uma biblioteca de maturação por afinidade.

Bibliotecas de Fab individuais foram preparadas, onde cada aminoácido das CDRs L3 e H3 foi aleatorizado para todos 20 aminoácidos, um por vez, resultando em várias pequenas bibliotecas (5 bibliotecas para a cadeia leve e 13 bibliotecas para a cadeia pesada) cada uma com complexidade de possibilidades de 20 aminoácidos em cada posição de aminoácido. Em todos casos, o aminoácido nativo (isto é, não alterado) foi representado na biblioteca. Bibliotecas foram preparadas por mutagênese de cassete de PCR com oligonucleotídeos degenerados, conforme descrito em Kay e outros, (1996), Phage display of Peptides and Proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, usando o códon de dopagem NNK para aleatorizar uma posição de aminoácido para incluir 20 possíveis aminoácidos. O 3L2-6D5 (o anticorpo enxertado com, possuindo uma mutação de estrutura V71K) serviu como gabarito para construção da biblioteca, em razão da baixa afinidade do anticorpo enxertado com CDR permitindo detecção mais fácil das diferenças de afinidade nos mutantes H3 e L3 durante a classificação. Assim, cada elemento da biblioteca continha uma CDR3 (tanto H3 quanto L3) com uma substituição de aminoácido e 5 CDRs enxertadas.

20-80 clones de cada biblioteca pequena foram classificados usando análise BlAcore conforme descrito aqui. As amostras foram analisadas simultaneamente por análise BlAcore quanto a afinidade de ligação ao NGF em um canal do chip BlAcore e quanto a presença de Fab por ligação a um anticorpo penta-marcador his em outro canal do chip sensor, para detectar seu marcador his no terminal C da cadeia pesada. Os clones que expressa133

- ..

ram proteína foram classificados como possuindo a mesma afinidade, afinidade pior, afinidade melhor ou nenhuma afinidade, usando Koff para classificação: Os resultados dessa análise são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5. Clones que expressaram proteína foram classificados como pos5 suindo a mesma afinidade, afinidade pior, afinidade melhor ou sem ligação, com base em koff.

mutação	melhor 1e-3<	A mesma > 1e-3, 2e-3<	Pior	Porcentagem de AAs que mantêm capacidade de ligação
>2e-3	Sem ligação
Cadeia leve
L S91X	13%	40%	20%	26%	50%
L_K92X		100%			-100%
L T93X		93%	7%		93%
L_L94X		40%	60%		40%
L Y96X		13%	80%	7%	13%

Cadeia pesada

H G98X	50%	37%	13%	50%
H G99X		46%	54%		46%
Η Y100X		26%		73%	26%
Η Y101X	6%		12%	82%	6%
H Y102X		7%	25	68%	7%
H_G103X	4%	21%	16%	58%	25%
H T104X		20%	30%	50%	20%
H S105X	10%	25%	26%	39%	35%
FLY106X		75%	25%		75%
H_Y107X		8%	46%	46%	8%
H_F108X		23%	27%	50%	23%
H_D109X		29%	46%	25%	29%
H_Y110X		90%	5%	5%	90%

A seqüência de todos os clones com afinidade aperfeiçoada foi determinada, revelando freqüência e identidade de substituições de aminoá134

cido que resultaram em afinidade aumentada. Além disso, alguns clones que mantiveram uma afinidade semelhante a do clone 812-6D5 foram selecionados do cada biblioteca, a fim de determinar substituições de seqüência de aminoácido que foram permitidas em uma dada posição, mesmo que a substi5 tuição não necessariamente aumentasse a afinidade de ligação. Os resultados dessa análise estão resumidos na Tabela 6.

Tabela 6.

Mutações de CDR H3 (gabarito 8L2-6D5, incluindo seqüência de aminoácido de CDR-H3 de anticorpo 911 GGYYYGTSYYFDY (SEQIDNO:11)	ko«(s-1) 1E-3	K_D* (nM) 25
Y100L	1,2E-3	30
Y100R	1,1 E-3	27
Y101W	5,6E-4	14
G103A	1,6E-4	4
T104S	2,2E-3	55
S105A	5,1 E-4	13
S105T	6,4E-4	16
Y106R	1.6E-3	40
Y106T	2,0E-3	50
Y106M	2,7E-3	67
Y107F	1,4E-3	35
F108W	1,22E-3	30
D109N	1,5E-3	37
D109G	1E-3	25

135

Tabela 6. -continuação-

Mutações de CDR H3 (gabarito 8L2-6D5, incluindo seqüência de aminoácido de CDR-H3 de anticorpo 911 GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID NO:11)	k_Off (s-1) 1E-3	Kd (nM) 25
Y110K	1,4E-3	35
Y110S	1,5E-3	37
Y110R	1,6E-3	40
Y110T	1,7E-3	42
Mutações de CDR L3	k_off (s-1)	Kd (nM)
(gabarito 8L2-6D5, incluindo seqüência de aminoácido de CDR-L3 do tipo selvagem (não substituída): QQSKTLPYT (SEQ ID NO:14)	1E-3	25
S91E	2,5E-4	6
Y96R	1.7E-3	42

*KD calculado usando k_on 4e4 M“¹s'¹

Várias mutações resultaram em afinidade de ligação aumentada. Pelo menos as seguintes mutações resultaram em afinidade de ligação sig5 nificativa mente aumentada em comparação com o gabarito 8L2-6D5: (H_Y1O1W (Seqüência de CDR GGYWYGTSYYFDY (SEQ ID NO:46)); H_S105A (Seqüência de CDR GGYYYGTAYYFDY (SEQ ID NO:47)); H_S105T (Seqüência de CDR GGYYYGTTYYFDY (SEQ ID NO:48)); H_G103A (Seqüência de CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID NO:49); e

L_S91E (Seqüência de CDR QQEKTLPYT (SEQ ID NO:50)).

Os resultados desse experimento foram usados para guiar a seleção de posições de aminoácidos para geração da biblioteca de maturação

136 por afinidade.

Esse experimento também forneceu informações relacionadas a freqüência de substituições de aminoácido em qualquer posição dada que resultaram em ligação aperfeiçoada, a mesma ligação, ligação pior ou nenhuma ligação conforme mostrado na Tabela 5. Essa informação permitiu identificação das posições de aminoácidos nas CDRs que poderíam ser alteradas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos 20 aminoácidos), e posições nas CDRs que seriam alteradas para alguns aminoácidos ou muito pouco aminoácidos (em algumas concretizações, nenhum aminoácidos). Esses resultados também demonstraram substituições de aminoácido que aumentaram a afinidade de ligação.

(b) Maturação por afinidade

Em seguida, os resultados da análise de aleatorização de biblioteca pequena (acima) foram usados para selecionar resíduos para produção de bibliotecas H3 e L3 para maturação por afinidade das CDRs H3 e L3. Resíduos Y101 e G103 da CDR H3 e resíduos S91 e K92 da CDR L3 foram selecionados para produção das bibliotecas de H3 e L3 para maturação por afinidade das CDRs H3 e L3.

Essa biblioteca combinou mutações em H3 e L3 ao mesmo tempo no clone 8L2-6D5 enxertado com CDR, e separadamente na base de H19-L129, e tinha uma diversidade de 80 clones diferentes. A tabela 7 mostra os resíduos de aminoácido selecionados para substituição e os aminoácidos que foram substituídos em cada posição.

Tabela 7. Resíduos de aminoácidos em H3 e L3 selecionados para substituição e os aminoácidos que foram substituídos em cada posição CDR-H3:

Y101 foi alterado para Y e W, C. (Observe que C foi incluído uma vez que o uso de códon TRS em um oligonucleotídeo degenerado também gerou o códon C).

G103 foi alterado para A ,P, S

CDR-L3:

S91 foi alterado para E.

137

Κ92 foi alterado para todos os vinte aminoácidos. A, R, K, e H ligados.

Cada polipeptídeo foi expresso como um Fab, e afinidade ao NGF humano dos 96 clones individuais para cada biblioteca usando análise

BIAcore de acordo com as instruções do fabricante e descrito acima. Os resultados dessa análise são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8.

Mutações de COMBINAÇÃO de CDR L3 H3	koff(s-1)	K_D*(nM)
(8L2-6D5 gabarito)	1E-3	25
L_S91E; L_K92A (Seqüência de CDR QQEATLPYT (SEQ ID NO:51)) H_Y101W; H_G103A (Seqüência de CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO:52))	5.5E-4	13
L_S91E; L_K92R (Seqüência de CDR QQERTLPYT (SEQ ID NO:53)) H_Y101W; H__G103A (Seqüência de CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO:54))	1,0E-4	25
Mutações de COMBINAÇÃO DE CDR L3 H3	koff(s-1)	K_D* (nM)
(H19-L129 gabarito, H1H2L1L2 maturado)	1,1e-4
L_S91E; L_K92H (Seqüência de CDR QQEHTLPYT (SEQ ID NO:55)) H_Y101W; H_G103A (Seqüência de CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO:56)) (CLONE E3)	1.2E-5	0,3
L_S91E; L_K92S (Seqüência de CDR QQESTLPYT (SEQ ID NO:57)) H_Y101W; H_G103S (Seqüência de CDR GGYWYSTSYYFDY (SEQ ID NO:58))	4,7E-5	1,1

138

Tabela 8,-continuação-

Mutações de COMBINAÇÃO de CDR L3 H3	koff (s-1)	K_D* (nM)
(8L2-6D5 gabarito)	1E-3	25
L_S91E; L_K92K (Seqüência de CDR QQEKTLPYT (SEQ ID NO:59)) H_Y101Y; H_G103A (Seqüência de CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID NO:60))	2E-5	0,5
L.S91E; L_K92R (Seqüência de CDR QQERTLPYT (SEQ ID NO:61)) H_Y101W; H_G103A (Seqüência de CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO:62)) (CLONE 3C)	1,4E-5	0,35
L_S91E; L_K92R (Seqüência de CDR QQERTLPYT (SEQ ID NO:63)) H_Y101Y; H_G103A (Seqüência de CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID NO:64))	1,5E-5	0,37

*KD calculado usando kon 4e4 M¹s¹

Com base na afinidade de ligação, os melhores clones, E3 (intercambiavelmente denominado 3E) e 3C, foram selecionados para carac5 terização adicional. E3 compreendia as seguintes substituições de CDR: CDR-H3: Y101W, G103A; e CDR-L3: S91E. K92H, que foram combinadas em um clone simples que também incluía as seguintes mutações L1, L2, H1 e H2:

CDR-H1: I34L:

CDR-H2: M50I; L63V;

CDR-L1: D28S; H32N;

CDR-L2: I51T.

A seqüência da regiões variáveis de cadeia pesada e cadela leve de E3 é mostrada nas figuras 1A e 1B. 3C compreendia as substituições que se seguem de CDR: CDR-L3: S91E; K92R; CDRH3: Y101W; G103A,

139

que foram combinadas em um clone simples que também incluiu as mutações L1, L2, H1 e H2 descritas para o clone 3E.

As seqüências 3E e 3C foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos para produção de Fab e anticorpo pleno e expressas nas células HEK293 e purificadas usando Ni-NTA ou cromatografia de proteína A, A proteína pura foi quantificada acuradamente por análise de aminoácido.

As afinidades de ligação ao NGF humano de Fabs E3 e 3C foram medidas usando análise BlAcore de acordo com as instruções do fabricante e conforme descrito acima, exceto que 100 RU NGF foi usado no chip para impedir efeito de religação. Em resumo, várias concentrações de anticorpos (Fabs) foram injetadas por 2 minutos em um chip CM5 com 100 RU de NGF humano imobilizado no mesmo e permitiram dissociação por 1.800 segundos.

Anticorpo 911 do camundongo (Fab) foi analisado como um controle. Data foi analisado usando software BIAevaluation seguindo as instruções do fabricante. Os resultados da análise dos anticorpos E3 e 911 são mostrados nas figuras 9 e 10. E3 liga NGF humano com um KD de aproximadamente 0,07 nM (e com Kon de cerca de 6,0e5 M-1s-1, e k_off de cerca de 4,2e-5 s-1). 3C liga NGF humano com um KD de aproximadamente 0,35 nM (com Koff de cerca de 1,4E-5). Em contraste, o anticorpo 911 do camundongo liga NGF com KD de 3,7 nM, k_offde 8,4x10V e ko„de 2,2x1 OW.

Anticorpo E3 (intercambiavelmente denominado 3E) foi selecionado para análise adicional com base na afinidade de ligação alta. Para testar a capacidade de E3 de prevenir a interação de NGF com os receptores de NGF trkA e p75, 2,5 nM de NGF humano foi pré-misturado e incubado por uma hora com 0 a 50 nM de anticorpo E3 (Fab). Após a incubação, as amostras foram submetidas a 10 μΙ/minuto em um chip BlAcore CM5 contendo 260 RU de p75 (canal 2) e 600 RU de trkA (canal 3), e porcentagem de ligação foi determinada. Os resultados dessa análise são mostrados na figura 11. Concentrações aumentadas de Fab E3 bloquearam a interação de NGF com ambos p75 e trkA, conforme mostrado pelo sinal diminuído (medido em RU), indicando que Fab E3 bloqueia a interação de NGF humano com

140

ambos trkA e p75. Quando a concentração de anticorpo E3 (Fab) é igualada a concentração de NGF (concentração de NGF em cerca de 2,5 nM), nenhuma ligação de NGF foi observada (conforme mostrado por um sinal de zero). O fato de que a ligação de receptor -NGF a zero por cento ocorreu quando a concentração de NGF era igual a concentração do anticorpo 3E, sugeriu que 2,5 nM NGF foi pelo menos dez vezes maior do que KD de E3 para NGF e em equilíbrio.

Exemplo 2: Avaliação da capacidade de bloqueio de NGF dos anticorpos de anti-NGF usando ensaio de sobrevivência de neurônio trigeminai E13.5de camundongo

A capacidade de Fab E3 ou anticorpo pleno E3 de bloquear a atividade de NGF foi avaliada por medição da capacidade do anticorpo para inibir sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo in vitro. O gânglio trigeminal é compreendido de neurônios sensores cutâneos que enervam a região facial. A sobrevivência dos neurônios trigeminais E13.5 de camundongo é um ensaio sensitivo para avaliar a atividade de bloqueio de NGF dos anticorpos antagonistas de anti-NGF porque é necessário que NGF suporte a sobrevivência desses neurônios. Por exemplo, em concentrações de saturação de NGF, a sobrevivência está próxima de 100% por 48 horas em cultura. Em contraste, menos que 5% dos neurônios sobrevivem por 48 horas na ausência de NGF.

O ensaio de sobrevivência foi conduzido como se segue: camundongos fêmea Swíss Webster grávidas em tempo combinado sofreram eutanásia por inalação de CO₂. As trompas uterinas foram removidas e os embriões em estágio embriônico E13.5 foram extraídos e decapitados. Os gânglios trigeminais foram dissecados usando agulhas de tungstênio eletroliticamente afiadas. Os gânglios foram tripsinizados, mecanicamente dissociados e colocados em placas a uma densidade de 200-300 células por cavidade em meio isento de soro, definido, em placas de 96 cavidades revestidas com poli-L-ornitina e laminina.

A atividade de bloqueio dos Fabs anti-NGF ou anticorpos foi avaliada por adição aos neurônios trigeminais, de doses variadas de anticor141

Α y '<>« V pos anti-NGF Mab 911 (Fab), 8L2-6D5; H19-L129; E3 e 3C; e NGF humafófrffs ou de rato nas seguintes concentrações: 0,4 ng/mL (-15 pM; essa concentração representou uma concentração de saturação de NGF para sobrevivência) e 0,04 ng/mL (-1,5 pM; essa concentração está em tomo do IC50).

Após 48 horas em cultura, as células foram submetidas a um protocolo imunocitoquímico automatizado realizado em uma estação de trabalho de manuseio de líquido Biomek FX (Beckman Coulter) como se segue: fixação usando aldeído fórmico a 4%; sacarose a 5% e PBS; permeabilização usando Triton a 0,3% X-100 em PBS); bloqueio dos sítios de ligação não específicos usando soro de cabra normal a 5%, 0,11% BSA em PBS e incubação sequencial com anticorpos primário e secundário para detectar os neurônios. O anticorpo primário era um anticorpo policlonal de coelho contra o produto de gene de proteína 89,5 (PGP9,5, Chemicon), um marcador fenotípico neuronal estabelecido. O anticorpo secundário era Alexa Fluor 488 anticoelho de cabra (Molecular Probes) em conjunto com o corante nuclear Hoechst 33342 (Molecular Probes) para marcar os núcleos de todas as células presentes na cultura. A aquisição da imagem e análise da imagem foram realizados em um imageador Discovery-I/Genll (Universal Imaging Corporation). As imagens foram automaticamente adquiridas em dois comprimentos de onda para Alexa Fluor 488 e Hoechst 33342, com uma coloração nuclear sendo usada como ponto de referência para o sistema de autofoco a base de imagem do Imageador, uma vez que a coloração nuclear está presente em todos as cavidades. Objetivos apropriados e número de sítios imageados por cavidade foram selecionados para cobrir toda a superfície de cada cavidade.

Análise de imagem automatizada foi elaborada para contagem do número de neurônios presentes em cada cavidade após 48 horas em cultura com base na sua coloração especifica com o anticorpo anti-PGP9.5. O limiar da imagem e aplicação de morfologia e intensidade de fluorescência com base no filtro de seletividade resultaram em uma contagem acurada dos neurônios por cavidade.

Os resultados desse experimento demonstraram que Fab E3 bloqueou atividade de NGF com uma alta afinidade. Os resultados são mos142

trados nas figuras 4-6, e Tabela 9.

Figura 4 é um gráfico mostrando sobrevivência dependente de NGF dos neurônios E13.5 em presença de concentração variada de NGF humano e de rato.

Figura 5 é um gráfico comparando o efeito de bloqueio de NGF dos vários Fabs em presença tanto de 0,04 ng/mL de NGF humano (aproximadamente 1,5 pM; mostrado no painel inferior) quanto de 0,4 ng/mL de NGF humano (aproximadamente 15 pM; mostrado no painel superior). 1,5 pM de NGF estava em torno de EC50 de promoção de sobrevivência de NGF, enquanto 15 pM representaram uma concentração de saturação de NGF. Sobrevivência de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 de murino; e Fab H19-L129 e Fab 8L2-6D5 foi avaliada conforme descrito acima. O IC50 (em pM) foi calculado para cada Fab em cada concentração de NGF, e é mostrado na Tabeia 9. Fab E3 bloqueou fortemente a sobrevivência do neurônio trigeminal dependente humano de NGF, com um IC50 de aproximadamente 21 pM em presença de 15 pM de NGF humano, e um IC50 de aproximadamente 1,2 pM em presença de 1,5 pM de NGF humano. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente a sobrevivência do neurônio trigeminal dependente de NGF humano.

A figura 6 é um gráfico comparando o efeito de bloqueio de NGF dos vários Fabs em presença tanto de 0,04 ng/mL de NGF de rato (aproximadamente 1,5 pM; mostrado no painel inferior) quanto de 0,4 ng/mL de NGF de rato (aproximadamente 15 pM; mostrado no painel superior). 1,5 pM de NGF estava em torno de EC50, enquanto 15 pM representaram uma concentração de saturação de NGF. Sobrevivência de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 de murino; e Fab H19-L129 e 8L2-6D5 foi avaliada conforme descrito acima. O EC50 (em pM) foi calculado para cada Fab em cada concentração de NGF, e é mostrado na Tabela 9. Fab E3 bloqueou fortemente a sobrevivência do neurônio trigeminal dependente de NGF humano, com um IC50 de aproximadamente 31,6 pM em presença de 15 pM de NGF de rato, e um IC50 de

143 aproximadamente 1,3 pM em presença de 1,5 pM de NGF de rato. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente a sobrevivência do neurônio trigeminal dependente de NGF de rato.

Tabela 9:

NGF humano	IC50 (em presença de 15 pMdeNGF)	IC50 (em presença de 1,5 pM de NGF)

	pM	pM
8L2-6D5 Fab	1580,5	461,8
H19-L129 Fab	60,1	9,6
3E Fab	<21,0	<1,2
3C Fab	80,9	5,6
911 Fab	322,3	63,5

NGF de rato	IC50(15pM de NGF)	IC50(1,5 pM de NGF)

	pM	pM
8L2-6D5 Fab	730,3	169,4
H19-L129 Fab	31,0	6,0
3E Fab	<8,3	<1,3
3C Fab	31,6	6,0
911 Fab	161,0	34,6

Em um experimento diferente, foi comparado a capacidade de anticorpo pleno E3 e Fab 3E de inibir sobrevivência dependente de NGF dos neurônios E13.5 em presença de 0,4 ng/mL (concentração de saturação) de NGF humano. Os resultados da análise são mostrados na figura 12. Anticorpo pleno E3 e Fab 3E mostraram níveis semelhantes de inibição de sobrevivência dependente de NGF quando as concentrações do anticorpo e Fab totais foram normalizadas para o número de sítios de ligação NGF (Fab possui um sítio de ligação e o anticorpo total possui dois sítios de ligação). Esses resultados demonstraram que não houve um efeito ávido devido a liga10

144

ção de um anticorpo pleno ao dímero de NGF.

Em outros experimentos, foi comparado a capacidade de várias concentrações (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, e 0,0 nM) de anticorpo E3, anticorpo 911, e uma imunoadesina de receptor trkA (consistindo em domínio extracelular do receptor de NGF trkA fundido com o domínio Fc de imunoglobulina, CH2-CH3) para inibir a sobrevivência dependente de NGF dos neurônios E13.5 em presença de 0,4 ng/mL (condições de saturação). Esses resultados são mostrados na figura 13. Esses resultados demonstraram que o anticorpo E3 bloqueou NGF melhor do que o anticorpo 911 ou a imunoadesina trkA.

Exemplo 3: Avaliação da especificidade do anticorpo E3 de antiNGF usando ensaios de sobrevivência de neurônio trigeminal e nodosos

A capacidade do anticorpo E3 de bloquear especificamente a atividade de NGF foi avaliada por medição da capacidade do anticorpo de inibir sobrevivência dos neurônios trigeminais de camundongo E17/18 in vitro, em presença de concentrações de saturação de NGF, a neurotrofina NT3 relacionada a NGF, ou o fator neurotrófico não relacionado a NGF, proteína de estimulação de macrófago (MSP). A sobrevivência dos neurônios trigeminais E17/18 é um ensaio de sensibilidade para avaliar a atividade de bloqueio de NGF dos anticorpos antagonistas de anti-NGF uma vez que é necessário que NGF suporte a sobrevivência desses neurônios em concentrações maiores que o nível de NGF necessário para suportar a sobrevivência dos neurônios E13.5 TG). A sobrevivência desses neurônios é também suportada por NT3 ou MSP; portanto, a sobrevivência desses neurônios é também um ensaio de sensibilidade para avaliar se o anticorpo antagonista de anti-NGF também bloqueou NT3 ou MSP.

A capacidade do anticorpo E3 de bloquear especifica mente a atividade de NGF foi também avaliada por medição da capacidade do anticorpo de inibir a sobrevivência dos neurônios E17 nodosos do camundongo, em presença de concentrações de saturação de BDNF ou NT4/5. A sobrevivência dos neurônios nodosos é sustentada por BDNF ou NT4/5; portanto, a sobrevivência desses neurônios é um ensaio de sensibilidade para avaliar a

145

capacidade de bloqueio de BDNF ou NT4/5 do anticorpo antagonista de antiNGF.

O ensaio de sobrevivência foi conduzido como se segue: camundongos fêmea Swiss Webster grávidas em tempo combinado sofreram eutanásia por inalação de CO₂. As trompas uterinas foram removidas e os embriões (com 17 ou 18 dias de vida) foram extraídos e decapitados. Os gânglios trigeminaís e nodosos foram dissecados e limpos. Os gânglios foram então tripsinizados, mecanicamente dissociados e colocados em placas a uma densidade de 100-300 células por cavidade em meio isento de soro, definido, em placas de 4 cavidades (Greiner) revestidas com poli-L-ornitina e laminina.

Neurônios trigeminais E17/18 foram desenvolvidos tanto sem fatores neurotróficos adicionados (controle negativo) quanto em presença de concentrações de saturação de NGF humano (400pM e 15pM) (controle positivo); NT3 (400 pM); ou MSP (600pM). Culturas em duplicata foram elaboradas que incluíram concentrações variadas de E3 e Fabs 911 e anticorpos plenos. Concentração de Fab e anticorpos plenos foi indicada pelo local de ligação (por exemplo, um anticorpo pleno contém dois locais de ligação, enquanto a Fab contém um local de ligação).

Os neurônios E17 nodosos foram desenvolvidos tanto na ausência de fatores neurotróficos adicionais (controle negativo) quanto e, concentrações de saturação de BDNF (400 pM) (controle positivo) ou NT4/5 (400pM) ou ILF fator de crescimento não relacionado a NGF (fator inibidor de interleucina). Altas concentrações de neurotrofinas foram usadas, uma vez que o objetivo desse experimento era de testar a especificidade dos anticorpos. Culturas em duplicata foram elaboradas que incluíram variação novamente com e sem a adição de anticorpos E3 e 911. Após 48 horas em cultura o número total de neurônios sobrevivendo em cada cavidade sob cada condição foi determinado por contagem manual usando um microscópio de fasecontraste.

Os resultados desses experimentos demonstraram que Anticorpos E3 e 911 bloquearam completamente os efeitos de promoção de sobre\ ϊ..

146

vivência de NGF nos neurônios trigeminais E18. Em contraste, os anticorpos E3 e 911 não tiveram efeito na sobrevivência dos neurônios trigeminais promovida por NT3 ou MSP ou sobrevivência dos neurônios nodosos promovida por BDNF ou NT4/5 ou LIF. Esses resultados demonstraram que anticorpo E3 possuía especificidade seletiva para NGF, como não foi detectada interação entre essas anticorpos e outras neurotrofinas relacionadas a NGF (NT3, NT4/5, BDNF) em concentrações 1000 vezes a 10.000-vezes maiores do que a concentração eficaz para bloqueio de NGF. Adicionalmente, esses resultados demonstraram que a morte neuronal vista nas culturas suplementadas com NGF de neurônios dependentes de NGF além do anticorpo ou Fab E3 foi devido à interação especifica entre esses anticorpos e NGF e não devido ao efeito tóxico generalizado. Anticorpo 911 do antagonista de antiNGF de camundongo foi também testado e resultados semelhantes foram observados. Observe que, devido as altas concentrações de neurotrofinas usadas, ambos o anticorpo E3 e 911 estão muito próximo de suas condições de titulação e esperou-se que ligassem NGF em níveis semelhantes em razão de que diferenças na afinidade de ligação daqueles anticorpos ao NGF seriam menos aparentes sob aquelas condições.

Os resultados desses experimentos são mostrados nas figuras 14, 15, 16 e 17. Os dados mostrados significam o percentual de sobrevivência após 48 horas em cultura (± erro médio padrão, n=3 para cada ponto de dados) em relação a sobrevivência observada no controle positivo para cada experimento (por exemplo, 100% sobrevivência dos neurônios trigeminais desenvolvidos em presença de concentração de saturação de NGF, e 100% sobrevivência de neurônios nodosos desenvolvidos em presença de concentração BDNF de saturação, respectivamente). As figuras 14 e 15 são gráficos mostrando que o anticorpo E3 ou Fab E3 antagonista de anti-NGF não inibiu a sobrevivência promovida por NT3 e MSP, mesmo em concentrações de anticorpos tão altas quanto 200 nM. Em contraste, 20nM de anticorpo E3 ou Fab3F e Fab 911 bloquearam totalmente a sobrevivência promovida de NGF. Anticorpo 911 de antagonista de anti-NGF de camundongo foi também testado e resultados semelhantes foram observados. Especificamente, a

147 *** íUb

......aJ^ figura 14 é um gráfico mostrando a comparação do efeito das várias concen- ‘ trações (20 nM, 2 nM ou 0,2 nM) de Fab E3 (denominado 3E na figura) e anticorpo Fab 911 na sobrevivência dos neurônios trigeminais E18, sem neurotrofina adicionada (denominada controle), 400 pM de NGF (denominado NGF-400pM), 10 nM NT3 (denominado NT3-10nM) ou 600 pM MSP (denominado MSP-600 pM). A figura 15 é um gráfico ilustrando a comparação do efeito de várias concentrações (200 nM e S0 nM) de E3 Fab e anticorpo pleno e anticorpo 911 de camundongo, anticorpo pleno e Fab de sobrevivência de neurônios trigeminais E17 em ausência de neutrotrofinas (denominado sem fator), 400 pM de NGF (denominado NGF-400pM), 10 nM NT3 (denominado ”NT3-10nM) ou 600 pM MSP (denominado MSP-600 pM).

As figuras 16-17 são gráficos mostrando que o anticorpo E3 ou Fab E3 antagonista de anti-NGF não inibiu a sobrevivência dos neurônios E17 nodosos promovida por BDNF, NT4/5 ou LIF. Anticorpo 911 do antagonista de anti-NGF de camundongo foi também testado, e resultados semelhantes foram observados. Especificamente, a figura 16 é um gráfico mostrando a comparação do efeito das várias concentrações (200 nM ou 80 nM) de anticorpo pleno E3 (denominado 3E na figura), Fab E3, anticorpo pleno 911 ou Fab 911 na sobrevivência de neurônios E17 nodosos foram testadas na ausência de neurotrofinas adicionadas (denominado sem fatores), 400 pM BDNF (denominado ”BDNF-400pM), 400 pM NT4/5 (denominado NT4/5-400pM) ou 2,5 nM LIF (denominado LlF-2,5 nM). A figura 17 é um gráfico mostrando a comparação do efeito das várias concentrações (200 nM, 20 nM, 2nM) de Fab E3 (denominado 3E na figura) ou Fab 911 na sobrevivência dos neurônios E17 nodosos na ausência das neurotrofinas adicionadas (denominado controle), 400 pM BDNF (denominado BDNF400pM), 400 pM NT4/5 (denominado ”NT4/5-400pM) ou 2,5 nM LIF (denominado LIP-2,5 nM).

Exemplo 4: Preparação de vetores de expressão de mamífero e expressão de anticorpo E3 nas células de mamíferos

Três vetores de expressão de mamífero foram designados e construídos para uso na expressão do anticorpo E3 nas células de mamífe148

ros.

O vector Db.911.3E é um vetor de expressão compreendendo a região variável de cadeia pesada do anticorpo E3 e a região constante lgG2a humana e é apropriado para expressão transiente ou estável da cadeia pesada. Db.911.3E consiste em seqüências de nucleotídeo correspondendo às regiões que se seguem: a região promotora de citomegalovírus de murino (nucleotídeos 1-612); um íntron sintético (nucleotídeos 619-1507); a região de codificação de DHFR (nucleotídeos 707-1267); peptídeo de sinal de hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1525-1602); região variável de cadeia pesada de anticorpo 3E (nucleotídeos 1603-1965); região constante lgG2a de cadeia pesada humana contendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração do aminoácido com referência a seqüência lgG2a do tipo selvagem; vide Eur, J. Immunol. (1999) 29:26132624); sinal de poliadenilação tardia SV40 (nucleotídeos 2974-3217); região melhoradora de SV40 (nucleotídeos 3218-3463); região de fago f1 (nucleotídeos 3551-4006) e região de codificação de beta lactamase (AmpR) (nucleotídeos 4443-5300). Db.911.3E foi depositado no ATCC em 8 de janeiro de 2003, e recebeu do ATCC o número de acesso PTA-4895.

O vetor Eb.911.3E é um vetor de expressão compreendendo a região variável de cadeia leve do anticorpo E3 e a região constante de cadeia kapa humana, e é apropriado para expressão transiente da cadeia leve. Eb.911.3E consiste em seqüências de nucleotídeo correspondendo às seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus murino (nucleotídeos 1-612); íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619-1142); peptídeo de sinal de hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1173-1150); região variável de cadeia leve de anticorpo E3 (nucleotídeos 1251-1571); região constante de cadeia kapa humana (nucleotídeos 1572-1892); sinal de poliadenilação tardia SV40 (nucleotídeos 1910-2153); região melhora de SV40 (nucleotídeos 2154-2399); região de fago f1 (nucleotídeos 2487-2942) e região de codificação de beta lactamase (AmpR) (nucleotídeos 3379-4236). Eb.911.3E foi depositado no ATCC no dia 8 de janeiro de 2003 e recebeu no ATCC o número de acesso PTA-4893.

«η

149 ν’-Jsν χπς - V

Ο vetor Eb.pur.911.3Ε é um vetor de expressão compreendendo a região variável de cadeia leve do anticorpo E3 e a região constante kapa humana e é apropriado para expressão estável da cadeia leve. Eb.pur.911.3E consiste nas seqüências de nucleotídeo correspondendo às seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus murino (nucleotídeos 1-612); íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619-1758); gene pac (puromycinR) região de codificação (nucleotídeos 739-1235); região hsp70 5’UTR humana (nucleotídeos 1771-1973); peptídeo de sinal de hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1985-2062); região variável de cadeia leve de anticorpo E3 (nucleotídeos 2063-2383); região constante de cadeia kapa humana (nucleotídeos 2384-2704); sinal de poliadenilação tardia SV40 (nucleotídeos 2722-2965); região melhoradora de SV40 (nucleotídeos 29663211); região de fago f1 (nucleotídeos 3299-3654) e região de codificação de beta lactamase (AmpR) (nucleotídeos 4191-5048). Eb.pur.911.E3 foi depositado no ATCC em 8 de janeiro de 2003 e recebeu do ATCC o número de acesso PTA-4894.

Expressão de célula transiente foi realizada como se segue: células

CHO e HEK293T em placas de 150 mm foram co-transfectadas transientemente com 25 pg de cada plasmídeo (isto é, um plasmídeo contendo a cadeia pesada e um plasmídeo contendo a cadeia leve). DNA foi misturado com 100 μΙ_ de lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os complexos de DNA-lipídeo foram deixados contatar as células em meio DMEM/F12 sem soro ou antibióticos por 5 horas. Seguindo-se essa incubação, o meio foi alterado por expressão para OptiMEM (Invitrogen) sem quaisquer aditivos por dois dias. Os sobrenadantes de célula contendo anticorpo foram colhidos seqüencialmente até quatro vezes com substituição do meio subsequente. Os sobrenadantes foram purificados por cromatografia de afinidade usando resina de Proteína A MapSelect (Amersham biosciences 17-5199-02). O anticorpo foi ligado à resina de proteína A em 0,3M glicina, 0,6M tampão de NaCI a pH 8, então eluido com 0,1 M de tampão citrato em pH 3. As frações contendo anticorpo foram imediatamente neutralizadas com 1M tampão Tris em pH 8,0. As frações de anticor150

po foram então dializadas e concentradas em PBS.

Exemplo 5: Anticorpo E3 anti-NGF é eficaz no tratamento de dor pós-cirúrgica

Foi usado um modelo de dor que imita a dor pós cirúrgica para avaliar a eficácia do tratamento com anticorpo E3. O anticorpo E3 compreendida a região constante lgG2a de cadeia pesada humana, contendo as mutações que se seguem: A330P331 e, S330S331 (numeração do aminoácido com referência à seqüência lgG2a do tipo selvagem; vide Eur. J. immunol. (1999) 29:2613-2624); a região constante kapa de cadeia leve humana; e as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve mostradas nas Tabelas 1A e 1B.

Animais. Ratos Sprague Dawley machos pesando entre 220-240 gramas foram adquiridos da Harlan (Wisconsin) e aclimatados as instalações de animais por uma semana antes da cirurgia.

Cirurgia. A cirurgia baseou-se no procedimento descrito por Brennan e outros, Pain 64:493-501 (1996). Os animais foram anestesiados com isofiurano a 2% em mistura de ar que foi mantida durante a cirurgia através de um cone nasal. A superfície plantar da pata traseira direita foi preparada com uma almofada de iodo povidona e uma incisão longitudinal central de 1-cm foi feita através da pele e aponeurose, começando a 0,5 cm da borda do que seria o calcanhar e estendendo-se na direção dos dedos. As medições foram feitas com uma régua com os pés mantidos em uma posição flexionada, O músculo plantaris foi elevado usando fórceps curvo e recebeu incisão longitudinal. O músculo recebeu incisão através de sua profundidade plena, entre a origem e a inserção. O sangramento foi controlado completamente através da cirurgia, por pressão aplicada através de uma almofada de gaze. A ferida foi fechada com suturas de colchão (filamento preto 5-0 etilon). Essas suturas receberam nós 5-6 vezes, com o primeiro nó frouxamente atado. O local da ferida foi limpo com solução de bacitracina. Os animais se recuperaram e repousaram em gaiolas limpas por duas horas ou mais antes de começar o teste comportamental.

Avaliação da dor em repouso. Uma marca de dor cumulativa foi

151 t-iA- t y-\ t^?' usada para avaliar a dor relacionada a sustentação do peso. Os animài^vfQ* ^j· % ram colocados em uma malha plástica (grade de 8 mm²) em gaiolas plásticas limpas que foram elevadas em uma plataforma (altura: 45,72 cm (18)) permitindo inspeção do lado inferior de suas patas. Após um período de aclimatação de 20 minutos, a sustentação do peso foi avaliada em uma escala de 0 a 2. Uma marca de 0 foi fornecida se a pata estivesse descorada ou pressionada contra a malha, indicando sustentação de todo o peso. Uma marca de 1 foi fornecida se a pata estivesse apoiada com a pele apenas tocando a malha, sem descoramento ou indentação da pele. Uma marca de 2 foi fornecida se a pata estivesse completamente suspensa da malha. A retração da pata foi considerada um 2, se o rato ainda estivesse em repouso. Cada animal foi observado por 1 minuto a cada 5 minutos, por 30 minutos. A soma de 6 marcas (0-12) obtidas durante meia hora foi usada para avaliar a dor no pé que sofreu o corte. A freqüência das marcas de 2 foi também calculada e usada para avaliar a incidência de dor severa ou defesa total da pata pelo animal. Cada animal foi testado 24 horas antes da cirurgia (linha de base) e 2 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas pós cirurgia. Os resultados desse experimento são mostrados na figura 1, que ilustra a marca de dor em repouso cumulativa observada nos animais tratados com 35 mg/kg de anticorpo 911 de camundongo anti-NGF. Esses resultados mostraram que o tratamento com anticorpo anti-NGF reduziu significativamente a dor em repouso pós-cirúrgica. A sustentação do peso foi uma boa correlação de quão disposto o animal estava para usar o membro e portanto foi uma média eficaz de alívio da dor.

O anticorpo E3 foi injetado intraperitonealmente (i.p.) em várias concentrações de anticorpo (0,004, 0,01, 0,02, 0,1, 0,6, e 1 mg por kg de peso do animal) em 15 horas pré-incisão. O grupo de controle negativo não recebeu anticorpo, porém foi injetado i.p. com uma solução de salmoura. Fentanila a 0,01 mg/kg foi injetada i.p. como um controle positivo 30 minutos antes do teste e 24 horas após cirurgia. Cada experimento envolveu 8 animais (n = 8 por grupo) para cada condição e o grupo de controle tinha 56 animais. A cirurgia foi realizada e uma marca de dor cumulativa foi medida

152 conforme descrito acima. A dor em repouso foi avaliada vinte e quatro horas após a cirurgia.

Conforme mostrado na figura 7, anticorpo E3 anti-NGF humanizado reduziu significativamente a dor em repouso (p < 0,05) após cirurgia quando administrado a 0,02 mg/kg para 1 mg/kg de dosagem. Um *” indica uma diferença significativa de controle ( p < 0,05). O tratamento com 0,02 mg/kg aliviou o comportamento de dor pelo menos tão eficazmente quanto o tratamento com 0,01 mg/kg de fentanila. Essa dose de fentanila é 10 vezes a dose humana normal desse potente opóide.

Em outro experimento, a eficácia do anticorpo E3 na redução da dor pós cirúrgica, quando administrado pós cirurgicamente foi testada. O anticorpo E3 (0,5 mg/kg) foi injetado intravenosamente (i.v.) duas horas a pós a cirurgia. O grupo de controle não recebeu anticorpo, porém foi injetado com uma solução de salmoura. A cirurgia foi efetuada e dor em repouso expressa como uma marca de dor cumulativa foi avaliada 24 horas após a cirurgia. Conforme mostrado na figura 8, o tratamento com anticorpo anti-NGF reduziu significativamente a dor em repouso em vinte e quatro horas após a incisão, quando o anticorpo foi administrado 2 horas após a incisão. Esses resultados demonstraram que o anticorpo E3 aliviou efetivamente a dor pós cirúrgica quando administrado após cirurgia.

Exemplo 6: Avaliação dos efeitos analgésicos do anticorpo 911 antagonista de anti-NGF em um modelo de rato de artrite reumatóide

Os efeitos analgésicos do anticorpo anti-NGF, 911 (vide Hongo e outros, Hybridoma 19(3):215-227 (2000)) em artrite crônica induzida (CFA) por adjuvante de Freund completo em ratos foram investigados usando o teste de vocalização, em comparação com indometacina usada como substância de referência.

Cinqüenta (50) ratos Lewis machos (LEWIS LEW / Cri Ico) (Charles River Bélgica) pesando 150 g a 220 g no começo da fase experimental foram incluídos nesse estudo. Todos animais foram sustentados for pelo menos 5 dias antes do experimento, e foram alojados em uma temperatura (19,5-24,5°C), umidade relativa (45-65%) e compartimento controlado de ¹

153 d?

cicio de 12 horas de luz/escuro com acesso a vontade a água dé^^r^r filtrada e ração de laboratório em péletes padrão (U.A.R., França) através de todo o estudo. Os animais foram individualmente identificados na cauda.

No dia 0 (DO), artrite foi induzida nos ratos por injeção intradérmica na cauda de 0,05 ml de uma suspensão de Mycobacteríum butyricum (Difco, USA) em óleo mineral (10 mg/ml). No dia 14 (D14), ratos com artrite foram incluídos no estudo de acordo com sua capacidade de vocalizar mediante flexão gentil da pata traseira e por seus índices de artrite, avaliados usando uma marca de inflamação para cada pata traseira e dianteira (vide Kuzuna e outros, Chem. Pharm. Su//.(Tóquio) 23:1184-1191 (1975); Pearson e outros, Artrite Rheum. 2:440-459 (1959)). Animais foram classificados com base nos critérios que se seguem: Marca 0: aspecto normal; Marca 1: eritema; Marca 2: eritema com edema leve; Marca 3: inflamação forte sem anquilose; Marca 4: anquilose. Apenas os animais capazes de vocalizar mediante flexão gentil e apresentando uma marca de 2 ou 3 foram incluídos no estudo.

Quatro grupos de 10 ratos cada foram incluídos no estudo. Para o grupo 1 (veículo), no dia 14 (D14), após seleção, os ratos foram intravenosamente administrados com veículo (salmoura). No dia 18 (D18), a intensidade nociceptiva foi avaliada por flexão gentil da pata traseira e a intensidade do nível de vocalização foi gravada para cada animal. Para o grupo 2 (4 dias), no D14, após seleção, os ratos foram intravenosamente administrados com 911 (10 mg/kg). No dia 18 (D18), a intensidade nociceptiva foi avaliada por flexão gentil da pata traseira e a intensidade do nível de vocalização foi gravada para cada animal. Para o grupo 3 (24 horas), no dia 17 após injeção de CFA, ratos foram intravenosamente administrados com 911 (10 mg/kg). A intensidade nociceptiva foi avaliada por flexão gentil da pata traseira 24 horas mais tarde, e a intensidade do nível de vocalização foi gravada para cada animal. Para o grupo 4 (indometacina), no dia 18 (D18), a intensidade nociceptiva foi avaliada por flexão gentil da pata traseira uma hora após administração oral de indometacina (10 mg/kg). A intensidade do nível de vocalização foi também gravada para cada animal. As substâncias de teste foram administradas em um modo aleatório e cego por via intravenosa em um vo. c.

154 lume de 5 ml/kg, considerando-se que a indometacina foi administrada por via oral em um volume de 10 ml/kg.

Os efeitos analgésicos de anticorpo anti-NGF 911 são mostrados na Tabela 10. Os resultados foram expressos para cada grupo como a intensidade nociceptiva avaliou a intensidade do nível de vocalização gravada para cada animal em mV (média ± SEM), e a porcentagem de variação da intensidade nociceptiva calculada do valor médio do grupo tratado com veículo. Significado estatístico entre os grupos tratados e o grupo veículo foi determinado com um teste de Dunnett usando a variação residual após uma análise de uma só direção de variação (P< 0,05).

Tabela 10. Efeitos analgésicos de 911 em artrite crônica induzida com adjuvante de Freund em ratos

Substancias (Dia de dosagem)	Veículo (D14)	911 (D14)	911(D17)	indometacina (D18)
Dose (mg/kg)		10	10	10
Intensidade nociceptiva (mV)	971,0 ±116,2	234,7 ±34,4*	247,2 ±41,8*	145,8 ±29,9*
% de variação		-76	-75	-85

Resultados são expressos como significando ± sem n=10 ratos por grupo

Dta 0 (D0): Indução de artrite crônica por administração de CFA

Veículo: salmoura

911 (10 mg/kg) foi intravenosamente administrado no D14ou D17 e medição da dor foi realizada no D18. Indometacina (10 mg/kg) foi fornecida oralmente no D18 e medição da dor foi realizada uma hora após dosagem.

Teste de Dunnett: * indica uma diferença significativa em comparação ao grupo tratado com veículo para P<0,05

Conforme mostrado na Tabela 10, anticorpo 911 anti-NGF reduziu significativamente a dor em um modelo de rato com artrite reumatóide 24 horas ou 4 dias após a administração simples do anticorpo.

Exemplo 7; Efeitos farmacológicos do anticorpo E3 e 911 antagonista de anti-NGF em um modelo de rato com artrite reumatóide

155 **>'λ

Efeitos farmacológicos (efeitos antiinflamatório e analgésico) dò anticorpo E3 e 911 antagonista de anti-NGF foram investigados em um modelo de artrite crônica induzida (CFA) por adjuvante de Freund completo em ratos em comparação com indometacina usada como uma substância de controle positivo interna. Efeitos analgésicos de E3 e 911 foram avaliados por medição da resposta nociceptiva. Os efeitos antiinflamatórios foram avaliados por volume da pata, índice de artrite (marca de inflamação), peso corpóreo e das patas traseiras. Os níveis de citocina da pata (IL-6, IL-1 β, TNF-α e TGF-βΙ), circulação de TGF-βΙ no soro, concentrações plasmáticas de E3 e 911, parâmetros biológicos e radiografias de raios x foram realizados ao final do experimento.

Protocolo Experimental

1. Projeto de Estudo ratos Lewis machos (LEWIS Lew / Ico) (Charles River Laboratories- Bélgica) com 5-semanas de vida foram incluídos nesse estudo. Eles foram alojados em um compartimento com uma temperatura (19,5-24,5°C) e umidade relativa (45-65%) controladas e com um ciclo de 12 horas de luz/escuridão, acesso a vontade a água de torneira filtrada e ração de laboratório em péietes padrão (SAFE, França) através de todo o estudo. Quando da chegada as instalações dos animais, eles foram alojados 5 por gaiola e um período de aclimatação de 10 dias foi observado antes de qualquer teste. Os animais foram identificados individualmente na cauda.

Cinco grupos de 10 animais (ratos Lewis machos com 5-semanas de vida-LEWIS Lew/lco, de Charles River Laboratories - Bélgica) foram incluídos nesse estudo: Grupo 1: nenhum rato com artrite / salmoura (veículo), bolo i.v., n=10; Grupo 2: ratos com artrite / salmoura (veículo), bolo i.v., n=10; Grupo 3: ratos com artrite / Indometacina 3 mg/kg, p.o diariamente por 10 dias, n=10; Grupo 4 : ratos com artrite / E3, 1 mg/kg, bolo i.v., n=10; Grupo 5 : ratos com artrite /911, 10 mg/kg, bolo i.v., n=10. As doses foram expressas em termos de substância ativa livre (mg/kg). E3 e 911 foram extemporaneamente preparados em salmoura da solução de estoque para a concentração desejada. E3 1 mg/kg: 3,41 mL da solução de estoque (0,88

156

mg/ml) q.s.p, 15 mL de salmoura. 911 10 mg/kg: 12 mL da solução de estoque (2,5 mg/ml) q.s.p. 15 mL de salmoura. Todas soluções diluídas (antes de injeção i.v.) foram esterilizadas usando uma unidade de filtro estéril de 0,20 pm. Valores de pH e osmolaridade das soluções diluídas foram medidos antes de cada injeção i.v. Antes da primeira i.v., osmolaridades (mosm/L) para salmoura, E3, e 911 foram de 278, 269, e 308 respectivamente; pH para salmoura, E3, e 911 foram de 5,93, 6,76, 6,71 respectivamente. Antes da segunda i.v., osmolaridades (mosm/L) para salmoura, E3, e 911 foram de 280, 270, e 309 respectiva mente; pH para salmoura, E3, e 911 foram de 5,86, 6,72, e 6,59 respectivamente.

E3 ou 911 ou salmoura foram administrados por injeção de bolo

1. v. no dia 14 e dia 19 após indução de artrite em uma ordem codificada e aleatória com a volume de 5 mL/kg. O grupo não artrítico recebeu por injeção de bolo i.v. de salmoura no dia 14 e dia 19 um volume de 5 mL/kg. Indometacina foi extemporaneamente preparada em 1% metilcelulose. Indometacina foi administrada por via oral (p.o.) uma vez ao dia por 10 dias do Dia 14 ao Dia 23 após indução de artrite em uma ordem codificada e aleatória com a volume de 10 mL/kg.

2. Indução de artrite

No dia 0 (D 0), artrite foi induzida em 70 ratos por injeção intradérmica na cauda de 0,05 ml de uma suspensão de Mycobacterium butyricum. Um grupo de 10 ratos não recebeu qualquer injeção intradérmica (nenhum rato com artrite). No dia 14 (D 14), os ratos com artrite foram incluídos no estudo usando os seguintes critérios: todos ratos incluídos mostraram um aumento no volume médio da pata (média do volume da pata esquerda e direita) de pelo menos 0,30 ml em comparação ao volume médio da pata (média do volume da pata esquerda e direita) no grupo não artrítico (medição do volume da pata conforme descrito abaixo); todos ratos incluídos mostraram uma vocalização mediante flexão gentil (medição da resposta nociceptiva conforme descrito abaixo); e todos ratos incluídos mostrara uma marca de índice de artrite de 2-3 em cada pata traseira (medição do índice de artrite conforme descrito abaixo) (os animais com uma marca de 0,1 ou 4

157

.... Q&

foram descartados).

3. Peso corpóreo

Os animais foram pesados uma vez ao dia do Dia 0 ao Dia 24 (exceto durante os finais de semana antes do tratamento: D 1, D 2, D 8, D 9, D10). Todas medições foram realizadas entre 9:00 e 12:00 horas exceto no D 14 (7:30 - 9:00 horas) e D 24 (7:30 - 8:00 horas).

3. Medição do volume da pata

O volume das patas traseiras direita e esquerda de cada rato (ratos artríticos e não artríticos) foi medido usando um pletismômetro. As medições foram realizadas nos tempos que se seguem (após indução de artrite): Dia 14 (antes da administração i.v. ou p.o. do bolo); e Dia 24 (5 dias após a última injeção de bolo i.v. ou 24 horas após a última administração p.o.). Todas medições foram realizadas entre 9:00 e 12:00 horas, todos os dados foram coletados e armazenados pelo software WinDas.

4. índice de artrite índice de artrite foi avaliado usando uma marca de inflamação para cada pata traseira e dianteira (ratos com artrite): Marca 0: aspecto normal; Marca 1: eritema; Marca 2: eritema com edema ieve; Marca 3: inflamação forte sem anquiiose; Marca 4: anquilose. Essa avaliação foi realizada nos tempos que se seguem (após indução de artrite): Dia 14 (antes da administração do bolo i.v. ou p.o.); e Dia 24 (5 dias após a última injeção de bolo i.v. ou 24 horas após a última administração p.o.). Todas medições foram realizadas entre 14:00 e 15:00 horas (D 14), 8:00 e 9:00 horas (D 24). Todos os dados foram coletados e armazenados pelo software WinDas.

5. Medição de resposta nociceptiva (teste de vocalização)

A resposta nociceptiva foi avaliada por flexão gentil das patas traseiras direita e esquerda repetidamente 2 vezes nos intervalos de 4 a 5 segundos com um dedo do operador (ratos com artrite). A intensidade do nível de vocalização foi gravada para cada animal para cada pata traseira (2 vezes: na pata traseira direita: s1 e s3; 2 vezes: na pata traseira esquerda: s2 e s4). Essa avaliação foi realizada nos tempos que se seguem (após indução de artrite): Dia 14 (antes da administração do bolo i.v. ou p.o.); Dia 18

158

(antes da segunda injeção de bolo i.v. ou 1 hora após administração p.oJí^SS ’ Dia 24 (5 dias após a última injeção de bolo i.v. ou 24 horas após a última administração p.o.). Todas medições foram realizadas entre 9:00 e 12:00 horas exceto no D 14 (7:30 - 9:00 horas) e D 24 (7:30 - 9: 00 horas).

6. Coleta de sangue para medição de concentração de E3 ou 911 e circulação de TFF-B1 e parâmetros heroatológicos

No dia 24 (após medições de volume da pata e índice de artrite e teste de vocalização), sob anestesia geral usando isoflurano (em uma mistura de oxigênio e óxido nitroso), as amostras de sangue (cerca de 800-1000 pl) foram coletadas por ação capilar com uma micropipeta do sino retroorbital.

Medição da concentração de E3 ou 911 (grupos 2, 4 e 5): Uma parte da amostra de sangue foi coletada em tubos contendo Li-Heparina (mantida no gelo) e centrifugada a 2.500-3.000 g por 10 minutos. Amostras de plasma (pelo menos 100 pL) foram obtidas, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. Uma amostra foi ligeiramente hemolizada (rato artrítico tratado com veículo N- 36).

Medição de TFG-βΙ na circulação (grupos 1-2-3-4-5): Uma parte da amostra sangüínea foi coletada em micro tubos para preparação de soro a temperatura ambiente. Seguindo-se a coieta da amostra, o sangue foi misturado e deixado coagular por 30 minutos antes da centrifugação. Os tubos foram centrifugados a cerca de 6.000 g por 3 minutos. Cada amostra de soro (pelo menos 100 μΙ_, exceto para rato N² 52 e N² 53) foi aliquotada e armazenada a -20°C até a ativação da amostra para análise de TGF-βΙ. Essas alíquotas (50 frascos) foram mantidas por um período de 6 meses começando ao final do estudo. Algumas amostras foram ligeiramente hemolizadas (rato não artrítico tratado com veículo: N^s 2, N- 5, N² 9, N² 10; rato artrítico tratado com veículo: N² 53, N² 63; Rato artrítico tratado com E3 N² 31, N² 51; rato artrítico tratado com 911: N² 52, 62, N² 64). Os níveis de TGF-βΙ foram medidos usando kit ELISA TGF-βΙ humano (ref. DB100, Batéladas 212258 e 213610, R&D Systems - França).

Coleta de sangue para parâmetros hematológicos (grupos 1-2-34-5:50 frascos): Uma parte da amostra de sangue foi coleada em tubos con159

9yÃ·· tendo K3-EDTA (pelo menos 100 μΙ_). A determinação dos parâmetros fói realizada no dia da coleta e as amostras não foram armazenadas. Os parâmetros hematológicos incluindo hemácias, leucócitos, plaquetas, hemoglobina, hematócrito foram medidos com um contador hematológico de células (D 24). Alguns parâmetros hematológicos não foram medidos devido às amostras coaguladas (rato não artrítico tratado com veículo: N² 10; Ratos com artrite tratados com E3: N² 59, N² 67; ratos com artrite tratados com 911: N² 16).

7. Níveis de cítocinas nas patas

No dia 24 (5 dias após a última injeção de bolo i.v. ou 24 horas após a última administração p.o.) (após radiografias de raios x), cada pata do animal (ratos artríticos e não artríticos) foi pesado e foi coletado em um frasco de polietileno marcado. As amostras de tecido foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C.

Preparação de homogenatos de junta: Patas traseiras congeladas foram pulverizadas usando um Blo-Pulverizador. As patas traseiras energizadas foram então colocadas em um tubo centrífugo cônico de 50 mL contendo 3 mL de PBS suplementado com 50 pL de coquetel antiprotease e homogeneizado em gelo usando homogeneizador Ultra-Turrax (50% da velocidade máxima). Os homogenatos foram então centrifugados a 2.000 x g por 15 minutos a 4°C e os sobrenadantes foram filtrados através de filtras Sartorius 0,2 pm, aliquotados e armazenados a -80°C até o uso.

Medição do nível de citocina: Os níveis de citocina de TNF-α (Kit TNF-α ELISA de rato, referência RTA00, Batelada 213718, R&D Systems, França), Kit ELISA IL-1 β de Rato IL-1p, ref. RLBOO, Batelada 212435, R&D Systems, França), Kit ELISA IL-6 de rato IL-6, ref. R6000, Batelada 211773, 214008 e 214362, R&D Systems, França), e kit ELISA TGF-1 β Humano TGF-βΙ ref. DB100, Batelada 212258 e 213610, R&D Systems, França) foram determinados em duplicata, de acordo com as instruções do fabricante. As alíquotas dos homogenatos de pata traseira foram armazenadas a -80°C.

8. Análise de raios x

No dia 24, após coleta de sangue, os animais foram sacrificados e radiografias de raios x (patas traseiras) foram obtidas para avaliação das

160

lesões na junta. Análise de raios x foi focada nas erosões articlares, espaçõ' articlar, anormalidades periósteas em ambas patas traseiras. Todas as radiografias foram analisadas para verificação de sete itens diferentes: dano ao tecido liso, deformidade, desmineralização, espaço da junta, erosões, osteogênese e reação perióstea. Para cada animal, os primeiros seis itens foram analisados independentemente, olhando a pata traseira prior. A reação perióstea foi analisada verificando a cauda. Para cada item, as marcas vão de 0 (normal) a 4 (lesão máxima). Portanto, a marca total vai de 0 a 28. A interpretação radiográfica foi feita pelo mesmo leitor sem conhecimento de nada sobre os animais (tratados ou não tratados).

9. Observações

Um animal (Ν^Ώ 65) morreu no D 23 após administração de indometacina (antes da administração no D 23) devido a causa não conhecida.

10. Análise e expressão dos resultados

Todos os resultados foram reportados como significando ± S.E.M. de 10 ratos em cada grupo em cada ponto de tempo. Volume da pata foi expresso em mL calculado do valor médio do volume de pata direito e esquerdo. O índice de artrite foi calculado da soma da marca obtida para cada uma das 4 patas. A resposta nociceptiva foi avaliada pela intensidade do nível de vocalização gravado para cada animal (média de 4 valores: 2 vezes/pata) em mV. A porcentagem de inibição da resposta nociceptiva foi calculada do valor médio do grupo artrítico tratado com veículo [(valor médio de grupo artrítico tratado com veículo-valor médio de grupo artrítico tratado/valor médio de grupo artrítico tratado com veículo)*100]. Peso corpóreo foi expresso em gramas. O peso das patas traseiras (esquerda e direita) foi expresso em gramas. Níveis de citocina (IL-6, IL-1 β, TNF-α e TGF-βΙ) de cada pata traseira foi expresso em pg/mL. Os níveis de circulação de TGFβ1 foram expressos em pg/ml. O índice radiológico para cada parâmetro (desmineralização, erosões, reação perióstea, lesão ao tecido liso, espaço da junta, deformação osteogênese) e índice radiológico total (marca total) foram calculados da soma das marcas obtidas de cada parâmetro. Os significados intergrupo dos desvios entre os valores do grupo tratado com veículo

161 (ratos artríticos) e grupo tratado com veículo (ratos não artríticos) forarfí ^S-^ liados pelo teste t de Student ou Teste de Soma de Classificação MannWhitney, quando o teste de variação igual ou normalidade falha. Os significados intergrupo dos desvios entre os valores do grupo tratado com veículo (ratos com artrite) e grupos tratados com E3 e 911 e indometacina foram avaliados por análise de uma só direção, de variação ANOVA seguido pelo teste de Dunnett não emparelhado. Uma probabilidade de P<0,05 foi considerada como significativa. Todas as análises estatísticas foram realizadas por software Sigmastat®.

Resultados

1. Resposta nociceptiva (teste de vocalização)

Conforme mostrado na Tabela 11 e Figura 18, no D 14, a resposta nociceptiva foi 4147 ± 331, 4386 ± 235, 4644 ± 367 e 4468 ±143 nos grupos artríticos tratados com veículo, indometacina, E3- e 911, respectiva15 mente, indometacina diminuiu forte e significativamente a resposta nociceptiva após 3 mg/kg/dia p.o. (por 10 dias) em cerca de -3768 mV (porcentagem de inibição: 71%) e -4353 mV (porcentagem de inibição: 74%) nos D 18 e D 24, respectivamente em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (D 18: 1511 ± 398 vs 5279 ± 326 mV; D 24: 1552 ± 508 vs 5905 ± 345 mV).

E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) diminuiu forte e significativa mente a resposta nociceptiva em cerca de -4167 mV (porcentagem de inibição: 79%) e 5905 mV (porcentagem de inibição: 100%) nos D 18 e D 24, respectivamente em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (D 18: 1112 ± 401 vs 5279 ± 326 mV; D 24: 0 ± 0 vs 5905 ± 345 mV). 911 (10 mg/kg i.v. 2 dias nos D 14 e D 19) diminuiu forte e significativamente a resposta nociceptiva em cerca de -3932 (porcentagem de inibição: 74%) e -5358 mV (porcentagem de inibição: 91%) nos D 18 e D 24, respectivamente em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (D 18: 1347 ± 492 vs 5279 ± 326 mV; D 24: 547 ± 307 vs 5905 ± 345 mV).

/t,..

162

Tabela 11. Efeitos de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias: D 14-D 19) com rev? lação a resposta nociceptiva na artrite reumatóide em ratos

Dia	D14	D 18	D 24
	Veículo i.v.	4147 ±331	5279 ±326	5905 ±345
	E3	4644	1112	0
	1 mg/kg i.v.	±367	±401 *	±0 *
	porcentagem de inibição	0	79	100
Ratos com artrite	911	4468	1347	547
	10 mg/kg i.v.	±143	±492 *	±307 *
	porcentagem de inibição	0	74	91
	Indometacina	4386	1511	1552
	3 mg/kg p.o. (mais de 10 dias)	±235	±398 *	±508
	porcentagem de inibição	0	71	74

Valores são expressos em mV como significando ± S.E.M n = 10 animais por grupo exceto no D 24 para Indometacina (n = 9) Teste t 5 de Dunnett: * P < 0,05 vs ratos com artrite tratados com veículo

2. Peso corpóreo

Conforme mostrado na Tabela 12 e Figura 19, uma diminuição marcante no ganho de peso corpóreo foi observada em ratos com artrite em

163

comparação aos ratos não artríticos dos D 0 a D 14 devido ao estabelecimento da artrite. No D 14 (dia de seleção) os ratos com artrite exibiram uma diminuição significativa no peso em comparação aos ratos não artríticos (269 ± 2 vs 217 ± 4 g) (teste t de Student P<0,05). Contudo, nenhuma diferença significativa no peso (D 14) foi detectada em todos grupos artríticos (teste t de Dunnett P> 0,05). O peso corpóreo diminuiu moderada e significativamente no grupo tratado com indometacina (3 mg/kg/dia por 10 dias) do D 17 ao D 24 com um máximo de cerca de 43 g no D 24 em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (261 ±5 vs 218 ± 3 g). Após tratamento com

E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19), o peso corpóreo diminuiu moderada e significativamente do D 17 ao D 24 com um máximo de cerca de 46 g no D 24 em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (264 ± 5 g vs 218 ± 3 g). Após tratamento com 911 (10 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19), o peso corpóreo diminuiu moderada e significativamente do D 18 ao D 24 com um má15 ximo de cerca de 47g no D 24 em comparação ao artrítico tratado com veículo (265 ± 7 vs 218 ± 3 g).

Tabela 12. Efeitos de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias: D 14-D 19) no peso corpóreo na artrite reumatóide em ratos

Dia	D0	D3	D4	D5	D6	D7	D11	D12	D13	D14
Ratos	veículo i.v.	197	215	222	232	236	244	272	277	282	289
Não		±2	±2	±2	±2	±2	±2	±2	±2	±2	+2
Artríticos
	veículo i.v.	199	214	221	230	236	241	229	223	218	217
		±2	±2	±2	±2	±2	±3	±6	±5	±5	±4
	E3	206	222	230	241	243	249	242	237	230	225
	1 mg/kg i.v.	±4	±3	±3	±3	±3	±3	±6	±6	±5	±5
Ratos	911	201	211	218	227	231	239	234	228	221	218
Artríticos	10 mg/kg i.v.	±2	±5	±5	±5	±5	±5	±8	±7	±7	±6

164

Dia	D15	D16	D17	D18	D19	D20	D21	D22	D23	D24
Ratos	veículo i.v.	285	291	297	302	307	308	312	316	321	326
Não		±2	±2	±2	±3	±3	±3	±3	±3	±3	±3
Artríticos
	veículo i.v.	213	212	211	210	208	210	212	214	216	218
		±4	±4	±3	±3	±3	±3	±3	±3	±3	±3
	E3	223	224	227	232	235	238	245	250	257	264
	1 mg/kg i.v.	±5	±5	±4	±4	±4	±4	±4	±5	±5	±5
				jc	*	*	*		*	*	k
Ratos	911	217	221	226	229	233	239	246	253	258	265
Artríticos	10 mg/kg i.v.	±5	±5	±5	±5	±6	±6	±6	±6	±6	±7
					*	*	*	*	*	*	*
	Indometaci-	230	230	231	234	236	241	246	248	253	261
	na
	3 mg/kg p.o.	±4	±5	±4	±4	±4	±4	±4	±5	±5	±5
	mais de 10			*	*	*	*	*	*	*	*
	dias

Valores são expressos em gramas como significando ± S.E.M. n = 10 animais por grupo exceto nos D 23 e D 24 (n = 9) para Indometacina Teste t de Dunnett: * P < 0,05 ι/s ratos com artrite tratados com veículo

3. Volume da pata

No D 14, a randomização foi realizada a fim de obter grupos homogêneos em termos de volume da pata. Conforme mostrado na Tabela 13, no D 14, o volume da pata traseira (média do volume das patas direita e

165 ο

esquerda) foi significativamente maior no grupo artrítico que no grupo artrítico (2,10 ± 0,05 vs 1,44 ± 0,02 mL (teste t de Student P<0,05)). Indometacina (3 mg/kg/dia p.o. por 10 dias) diminuiu significativamente o volume da pata em cerca de -0,75 mL (D 24) em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (1,59 ± 0,03 mL vs 2,34 ± 0,08 mL). E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) aumentou ligeira e significativamente o volume da pata em cerca de 0,37 mL em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (2,71 ± 0,09 mL vs 2,34 ± 0,08 mL). 911 (10 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) aumentou ligeira e significativamente o volume da pata em cerca de 0,36 mL em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (2,70 ± 0,11 mL vs 2,34 ± 0,08 mL).

Tabela 13. Efeitos de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias: D 14-D 19) em relação ao volume da pata na artrite reumatóide em ratos

Dia D14 D24

Ratos Não artríticos	veículo i.v.	1,44 ±0,02	1,47 ±0,02
	veículo i.v.	2,10 ±0,05	2,34 ±0,08
	E3	2,06	2,71
	1 mg/kg i.v.	±0,03	±0,09 *
Ratos	911	2,02	2,70
Artríticos	10 mg/kg i.v.	±0,07	±0,11 A
	Indometacina	2,08	1,59
	3 mg/kg p.o. mais de 10 dias	±0,06	±0,03 *

Valores são expressos em mL como significando ± S.E.M.

166

4644 n = 10 animais por grupo exceto no D 24 para Indometacina (n = 9) ^νςΑ _v

Teste t de Dunnett: * P < 0,05 vs ratos com artrite tratados com veículo

4. índice de artrite /<

55’

Conforme mostrado na Tabela 14, no D 14, o índice de artrite foi

10,1 ± 0,8, 8,7 ± 0,6, 10,2 ± 0,4 e 9,4 ± 0,7 e em grupos artríticos tratados com veículo, indometacina, E3 e grupos artríticos tratados com 911, respectivamente. Indometacina diminuiu forte e significativamente o índice de artrite após 3 mg/kg/dia p.o. (por 10 dias) por um máximo de cerca de -8,0 em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (2,7 ± 0,7 vs 10,7 ± 0,6).

E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) não afetou o índice de artrite em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (11,4 ± 0,4 vs 10,7 ± 0,6). 911 (10 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) não afetou o índice de artrite em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (10,9 ± 0,7 vs 10,7 ± 0,6).

Tabela 14. Efeitos de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias: D 14-D 19) com re15 lação ao índice de artrite na artrite reumatóide em ratos

Dia D14 D24

	veículo i.v.	10,1 ±0,8	10,7 ±0,6
	E3	10,2	11,4
	1 mg/kg i.v.	±0,4	±0,4
Ratos	911	9,4	10,9
Artríticos	10 mg/kg i.v.	±0,7	±0,7
	Indometacina	8,7	2,7
	3 mg/kg p.o.	±0,6	±0,7
	mais de 10 dias		*

Valores são expressos como significando ± S.E.M. (marca)

167 η = 10 animais por grupo exceto para Indometacina (n = 9)

Teste t de Dunnett: * P < 0,05 vs ratos com artrite tratados com veículo

5. Níveis de citocinas nas patas

Conforme mostrado na Tabela 15, no D 24, os níveis de citocina das patas esquerda e direita foram aumentaram no grupo artrítico tratado com veículo por um máximo de cerca de 3,5 (IL-1 β), 4 (TNF-α) e 1,8 (TGFβ1) dobraram em comparação ao grupo não artrítico tratado com veículo. Nenhuma diferença significativa foi observada para os níveis IL-6, nas patas direita e esquerda, entre os dois grupos. Os níveis de citocinas do grupo artrítico foram semelhantes nas patas da esquerda e direita: 259,7 ± 38,5 vs 219,2 + 32,4, 4802,8 ± 365,5 vs 4007,1 ± 380,4, 17,8 ± 1,6 vs 18,6 ± 1,9 e 9735,0 ± 1219,8 vs 9161,4 ± 846,1 pg/ml para IL-6, 1L-1 β, TNF-α e TGF-βΙ respectivamente. Indometacina diminuiu ligeira, porém significativamente o nível de TGF-βΙ nível na pata direita após 3 mg/kg/dia p.o. (por 10 dias) em cerca de 1,3 vezes, em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (7057,4 ± 335,6 vs 9161,4 ± 846,1), consequentemente não modificou os níveis de IL-6, TNF-α ou IL-1 β. Um efeito semelhante porém não significativo foi observado na parta esquerda. E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) não afetou os níveis de IL-6, IL-Ιβ, TNF-α ou TGF-βΙ, em ambas as patas, em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo. 911 (10 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) aumentou o nível de IL-Τβ na pata direita em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (6215,3 ± 666,7 vs 4007,1 ± 380,4). Isso não afetou outros níveis de citocina em ambas as patas.

Tabela 15. Efeito de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias nos D 14 e D 19) com relação aos níveis de citocina nas patas dos ratos com artrite reumatóide

168 «A kUO í

% ·£ •'_;A

Níveis de citocinas nas patas esquerdas

'..ÍU»

Ratos não artríticos	Ratos artríticos
veículo i.v.	veículo i.v.	E3 1 mg/kg i.v.	911 10 mg/kg i.v.	Indometacina 3 mg/kg p.o.
	298,6	259,7	234,4	262,5	249,7
IL-6	±35,6	±38,5	±35,2	±42,5	±60,4
	1383,0	4802,8	5060,0	5500,8	4029,1
ΙΙ_-1β	±57,9	±365,5	±473,5	±625,3	±449,9
	4,3	17,8	23,6	29,9	29,9
TNF-ct	±2,9	±1,6	±2,5	±4,8	±3,6
	5264,7	9735,0	9796,7	11053,5	7708,2
TGF-βΙ	±209,2	±1219,8	±491,2	±713,3	±293,9

Níveis de citocinas das patas direitas

Ratos não artríticos	Ratos artríticos
veículo i.v.	veículo i.v.	E3 1 mg/kg i.v.	911 10 mg/kg i.v.	Indometacina 3 mg/kg p.o.
	286,4	219,2	214,6	284,9	295,9
IL-6	±76,1	±32,4	±47,2	±38,9	±47,8
	1342,1	4007,1	4853,5	6215,3	3884,4
IL-Ιβ	±86,1	±380,4	±605,0	±666,7	±534,4
	15,7	18,6	21,5	33,4	30,6
TNF-ct	±4,8	±1,9	±2,5	±5,7	±5,7
	5024,8	9161,4	9362,7	10861,2	7057,4
TGF-βΙ	±148,4	±846,1	±423,4	±604,6	±335,6 *

Valores são expressos em pg/ml, como significando ± S.E.M.

169

Ά _ζ.<ΐ η = 10 animais por grupo exceto para não artrítico/veículo (pata direita), affcfttíco/veículo (pata esquerda) e Indometacina (n = 9)

Teste tdeDunnett:*P<0,05vs ratos com artrite tratados com veículo

6. Medição de circulação de TGF-βΙ

Conforme mostrado na Tabela 16, no D 24, o nível do soro TGFβ1 foi aumentado no grupo artrítico tratado com veículo em comparação ao grupo não artrítico tratado com veículo (81715,7 ± 1984,1 vs 60269,9 ± 2142,8). Indometacina diminuiu significativamente o nível de TGF-βΙ no soro após 3 mg/kg/dia p.o. (por 10 dias) em cerca de 1 vez e meia, em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (57222,2 ± 3194,1 vs 81715,7 ± 1984,1). E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) e 911 (10 mg/kg í.v. nos D 14 e D 19) diminuíram significativamente o nível de TGF-βΙ no soro, de modo que o nível de citocina nos grupos tratados com E3 e 911 era comparável aquele observado no grupo não artrítico tratado com veículo (69408,8 ± 3926,7 e 67214,5 ± 3649,4 respectiva mente, vs 60269,9 ±2142,8).

Tabela 16. Efeito de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias nos D 14 e D 19) com relação aos níveis de TGF-βΙ no soro em ratos com artrite reumatóide

Ratos não artríticos	Ratos artríticos
Veículo i.v.	Veículo i.v.	E3 1 mg/kg i.v.	911 10 mg/kg i.v.	Indometacina 3 mg/kg p.o.
60269,9	81715,7	69408,8	67214,5	57222,2
TGF-βΙ ±2142,8	±1984,1	±3926,7 *	±3649,4 *	±3194,1 *

Valores são expressos em pg/ml, como significando ± S.E.M.

n = 10 animais por grupo exceto para não artrítico/veículo (pata direita), artrítico/veículo (pata esquerda) e Indometacina (n = 9)

Teste t de Dunnett: * P < 0,05 vs ratos com artrite tratados com veículo

7. Parâmetros Hematológicos

Conforme mostrado na Tabela 17, os parâmetros hematológicos, tais como, leucócitos e plaquetas foram maiores em ratos artríticos tratados com veículo em comparação aos ratos não artríticos tratados com veículo

170 (teste t de Student P<0,05), consequentemente as hemácias, hemoglobina e hematócritos (teste t de Student P>0,05) não alteraram. Indometacina não afetou os parâmetros sanguíneos após 3 mg/kg/dia p.o. (por 10 dias) em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo. E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e

D 19) não afetou os parâmetros sangüíneos em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo. 911 (10 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) não afetou os parâmetros sangüíneos em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo. Tabela 17. Efeitos de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias nos D 14 e D 19) com relação aos parâmetros sangüíneos na artrite reumatóide em ratos (Medição no D 24)

Dia	Leucócitos 10³/mm³	Hemácias 10⁶/mm³	Hemoglobina g/dl	Hematócritos %	Plaquetas 10³/mm³
Ratos	veículo i.v.	8,7	7,98	15,1	42,6	322
Não		±0,9	±0,31	±0,7	±1,6	±89
Artríticos		n = 9	n-9	n = 9	n ~ 9	n = 9
	veículo i.v.	19,0	7,54	13,2	37,4	10,43
		±0,9	±0,31	±0,7	±1,6	±89
		n = 10	n = 10	n = 10	n = 10	n = 10
	E3	19,1	7,74	12,9	38,5	827
	1 mg/kg i.v.	±1,2	±0,17	±0,3	±1,0	±77
		n = 7	n = 8	n = 8	n = 8	n - 8
Ratos
Artríticos	911	22,6	7,30	12,1	36,5	799
	10 mg/kg i.v.	±2,9	±0,40	±0,7	±2,1	±121
		n~8	n-9	n = 9	n = 9	n=9
	Indometa- cina	21,7	6,93	11,8	35,0	705
	3 mg/kg p.o.	±2,5	±0,31	±0,6	±1,5	±111
	mais de 10	n = 9	n = 9	n = 9	n = 9	n=9

dias

Valores são expressos como significando ± S.E.M. Anova: P> 0,05 vs ratos com artrite tratados com veículo

171 is?

\ ó?

~ *~'H$

7. Peso das Patas Traseiras

Conforme mostrado na Tabela 18, o peso das patas traseiras esquerda e direita foi maior nos ratos artríticos tratados com veículo que nos ratos não artríticos tratados com (3,43 ± 0,11 vs 1,98 ± 0,01 e 3,32 + 0,12 vs

1,99 ± 0,02 g, respectivamente) (teste t de Student ou Mann-Withney

P<0,05). Indometacina diminuiu significativamente o peso das patas traseiras após 3 mg/kg/dia p.o. (por 10 dias) em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (pata traseira esquerda: 2,23 ± 0,04 vs 3,43 ± 0,11 g; pata traseira direita: 2,20 ± 0,05 vs 3,32 ±0,12 g). E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) aumentou apenas signíficativamente o peso da pata traseira esquerda em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (pata traseira esquerda: 3,86 ± 0,14 vs 3,43 + 0,11 g; pata traseira direita: 3,72 ±0,13 vs3,32 ± 0,12 g). 911 (10 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) aumentou apenas significativamente o peso da pata traseira direita em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (pata traseira esquerda: 3,73 ± 0,12 vs 3,43 ± 0,11 g; pata traseira direita: 3,83 ± 0,15 vs 3,32 ± 0,12 g).

Tabela 18. Efeitos de E3 e 911 após injeção i.v. (2 dias nos D 14 e D 19) com relação ao peso das patas traseiras na artrite reumatóide em ratos (Medição no D 24)

	Pata esquerda	Pata direita
Ratos Não	veículo i.v	1,98	1,99
Artríticos		±0,01	±0,02
	veículo i.v.	3,43 ±0,11	3,32 ±0,12
	E3	3,86	3,72
	1 mg/kg i.v.	±0,14	±0,13
Ratos	911	3,73	3,83
Artríticos	10 mg/kg i.v.	±0,12	±0,15
	Indometacina	2,23	2,20
	3 mg/kg p.o.	±0,04	±0,05
	mais de 10 dias	*	*

172 <>

Valores são expressos em gramas como significando ± S.E.M. n - 10 ahi-YZS mais por grupo exceto para Indometacina (n = 9)

Teste t de Dunnett: * P< 0,05 vs ratos com artrite tratados com veículo

8. Análises de raios x „ν,·^Λ

Conforme mostrado na Tabela 19, uma marca total de 0,0 + 0,0 foi observada nos ratos não artríticos tratados com veículo. Os ratos artríticos tratados com veículo possuem uma marca total de 15,1 ± 1,3 com marcas maiores para desmineralização (2,4 + 0,3), erosões (2,7 ± 0,3), lesão ao tecido liso (3,1 ± 0,2) e junta de espaço (3,3 ± 0,2), uma marca moderada para reação perióstea (1,0 ± 0,3), osteogênese (0,8 ± 0,2) e deformidade (1,8 ± 0,2). Indometacina (3 mg/kg/dia p.o. por 10 dias) diminuiu forte e significativamente a marca total em cerca de 10,7 em comparação aos ratos com artrite tratados com veículo (4,4 ± 0,9 vs 15,1 ± 1,3). E3 (1 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) não afetou a marca total em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (14,2 ± 1,3 vs 15,1 ± 1,3). 911 (10 mg/kg i.v. nos D 14 e D 19) não afetou a total marca em comparação ao grupo artrítico tratado com veículo (15,4 ± 1,0 vs 15,1 ±1,3).

173

I

Ξ3

Φ

L_

Φ ’ΰ

Έ

Φ

C

X ω

ο φ

Ό ω

δ φ

Ε <φ φ

CL

C0

Ο φ

ο ιφ

Ο _Φ

Φ

Ε ο

ο σ?

Ω ω

ο c

co φ

C\l

Ο

ΙΦ

Ο

Έ' co <5

CL

Φ σι

Φ co

LU φ

Ό

C0 ο

§

LLI σ>

φ φ

η φ

ω ο

Ε ο

φ ρ

^:ο

Η—’ ίϋ

Ε

Valores são expressos como significando ± S.E.M (marca), n = 10 animais por grupo exceto para Indometacina (n = 9)

Teste t de Dunnett: * P < 0,05 vs ratos com artrite tratados com veículo

ΙΟ

174

Conclusão

Sob condições experimentais descritas acima, E3 (1 mg/kg i.v. 2 dias: D 14 - D 19) e 911 (10 mg/kg i.v. 2 dias: D 14 - D 19) mostrou efeitos analgésicos fortes, porém não mostrou efeitos antiinfiamatórios significativos nesse modelo de artrite.

Exemplo 8 - Efe/tos de doses diferentes de anticorpo E3 anti-NGF em um modelo de rato de artrite reumatóide

A capacidade de E3 para produzir redução na dor dos ratos artríticos foi adicionalmente investigada por exame da relação de resposta de dose entre administração de E3 e redução de dor. Os ratos foram tratados com adjuvante para induzir artrite, conforme descrito acima. Dez ratos não injetados com adjuvante foram usados como controles não artríticos. Quatorze dias após injeção do adjuvante, os animais foram qualificados no estudo com base nos critérios citados acima, aleatorizados em oito grupos de dez ratos e tratados quanto a intensidade de sua resposta de vocalização. Eles foram então dosados no dia 14 com salmoura ou 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg ou 5 mg/kg de anticorpo E3 conforme descrito acima. Os animais foram testados quanto sua resposta de vocalização nos dias 16, 18, 20, e 24. Os animais foram redosados com salmoura ou a mesma dose de E3 no dia 18 após o teste de vocalização. Os animais foram também pesados cada dia, começando no dia 14. Assim, os animais foram dosados duas vezes com uma dose dada de anticorpo ou salmoura nos dias 14 e 18, e avaliados quanto a dor cinco vezes, nos dias 14, 16, 18, 20 e 24. Data são mostrados na Tabelas 20-22 e nas figuras 20-22.

Tabela 20. Efeitos de doses diferentes de E3 na resposta nociceptiva (intensidade de vocalização) em ratos com artrite reumatóide. Valores de intensidade de vocalização são expressos em mV como significando ± s.e.m.

Λ

média s.e.m	1129,25 143,06	981,75 71,00	1007,28 66,50	963,18 62,12	1159,30 132,76	1191,58 123,44	1067,00 69,73	896,25 57,53

média s.e.m	1042.85 130.51	825.60 57.94	576.88 49.71	448.43 81.01	283.71 60.00	151.85 26.08	98.62 29.17	79.18 27.30

média s,e.m	968.10 117.85	427.43 48.55	334.45 35.10	292.52 52.36	262.96 62.32	194.19 53.56	174.13 88.61	200.42 120.15

média s.e.m	942.18 100.69	448.00 33.73	313.13 61.98	209.48 24.43	79.74 33.18	66.27 31.34	71.23 42.37	63.57 23.47

média s.e.m	913.68 131.29	724.50 115.90	596.38 44.76	513.60 63.67	432.45 70.38	176.32 66.61	19.21 10.14	12.35 12.35

O efeito do tratamento dos animais com várias doses de anticorpo E3 anti-NGF em vocalização induzida por dor (dados mostrados na Tabela 20) foi estatisticamente analisada por uso de ANOVA de duas direções para comparar os resultados obtidos em pares entre animais artríticos tratados com veículo e aqueles tratados com uma dose dada do anticorpo E3. Houve um efeito significativamente aumentado em todos os níveis de E3 (p<0,0001). Mesmo na dose mais baixa testada (0,003 mg/kg de E3), a diferença na vocalização foi significativa (p<0,0001).

Conforme mostrado na Tabela 20 e Figura 20, de acordo com os experimentos acima, tratamento com anticorpo E3 em 1 mg/kg mostrou um alívio rápido e forte da dor. Dentro de dois dias (o ponto de tempo no princípio testado) a intensidade da vocalização sentida por 90%. O tratamento com concentrações menores de E3 também forneceu forte alívio da dor, embora em doses mais baixas, o alívio da dor demorasse mais um pouco para se manifestar. É provável que a diminuição aparente na eficácia no dia 24 de todas, exceto nas doses mais altas testadas seja devido à diminuição no nível real do nível secundário de E3 no plasma por uma resposta imune dos ratos. Fica claro que doses tão baixas quanto de 0,003 mg/kg forneçam alívio de dor pelo menos parcial nesse modelo.

Tabela 21. Efeitos de doses diferentes de E3 no peso corpóreo em ratos com artrite reumatóide (normalizado no dia 14).

176

Dia 14	Não Artrítico	Veículo	0.003 mg/kg	0.01 mg/kg	0.03 rng/-kg_:;.
Média 100.00	S.E.M 0.00	Média 100.00	S.E.M 0.00	Média 100.00	S.E.M 0.00	Média 100.00	S.E.M 0.00	Média 100.00	S.E.M 0.00
15	99.53	0.30	99.14	0.37	99.20	0.48	99.18	0.43	100.34	0.36
16	102.52	0.45	99.57	0.60	99.58	0.79	99.33	0.72	100.89	0.57
17	103.31	0.41	99.50	0.64	100.46	0.77	99.69	0.73	101.80	0.82
18	106.11	0.72	100.26	0.93	100.90	1.19	100.69	0.72	102.70	0.92
20	109.62	0.85	101.46	1.22	102.26	1.58	102.70	1.07	104.51	0.75
21	110.52	0.93	102.73	1.49	103.16	1.87	102.63	1.18	105.08	0.98
23	114.28	1.19	104.54	1.92	106.09	1.67	104.41	1.33	106.14	1.06
24	115.44	1.15	105.12	1.92	106.16	1.90	104.23	1.46	106.23	1.26

	0.1 mg/kg	0.3 mg/kg	1.0 mg/kg	5.0 mg/kg
Dia	Média	S.E.M	Média	S.E.M	Média	S.E.M	Média	S.E.M
14	100.00	0.00	100.00	0.00	100.00	0.00	100.00	0.00
15	99.83	0.59	101.05	0.38	100.53	0.37	101.61	0.41
16	101.07	0.82	102.88	0.50	102.95	0.56	104.09	0.60
17	101.89	1.12	104.76	0.70	105.74	0.76	106.85	0.79
18	103.69	1.47	107.11	0.78	108.46	0.82	109.53	1.00
20	107.36	1.78	111.26	0.77	113.57	0.83	115.32	1.11
21	108.50	2.01	113.31	0.87	116.71	0.92	119.11	1.21
23	109.25	2.15	115.59	1.38	123.35	1.13	126.36	1.94
24	108.77	2.08	115.58	1.43	124.41	1.00	127.25	1.79

Tabela 22. Efeitos de doses diferentes de E3 no peso corpóreo em ratos com artrite reumatóide (normalizado no dia 0).

	Não Artrítico	veículo	0.003 mg/kg	0.01	0.03 π	ig/kg
Dia	Média	S.E.M	Média	S.E.M	Média	S.E.M	Mean	S.E.M	Mean	S.E.M
n	mn nn	n nn	mn nn	nnn..	mn nn	o nn	mn nn	nnn	1PP nn	n nn
1	100.45	0.19	98.34	0.48	98.37	0.35	98.86	0.33	98.67	0.34
9	105 Q4	n ii	1Π1 75.	n 71.	....109.47	Π 59 ...	1Π9 61	Q4O	. m9 05	.n.59
3	109.29	0.33	105.04	1.04	106.54	0.99	106.29	0.60	105.31	0.85
Δ	119 11	n 46	1(iq 14	1 15	nono	.. n 79 .	noni	Π41	inq 94	nR9
7	124.15	0.70	119.90	1.39	121.29	1.32	121.59	0.72	117.15	1.36
fl	197 R9	n nn	199 9R	1 59	194 44	1 d9	194 47 .	1 94	11659	1 R9
9	132.40	0.80	125.50	1.59	125.91	1.69	125.82	1.95	118.60	2.62
m	195 qi	n rr	.199 51	--1JZ7	199.9Π ..	9 47	199 R7	9 59	-11526	9 19
11	140.42	1.13	119.82	1.98	119.55	2.76	121.20	2.99	112.94	3.48
14	159 69	1 79	111 79	.1 4n	i i i.5n.	.. 1 R7.	111 nn	1 65	1AR 97	9 75
15	151.87.	1.87	110.82	1.41	110.63	2.05	110.85	1.44	108.68	2.45
1R	15R 47	9 95	111 99	1 74	ui n«	. 9 99	nn qr	.1 9.1..	«o 91	9 1R
17	157.65	2.08	111.24	1.62	112.06	2.36	111.42	1.66	110.16	2.03
1R	1R1 QR	9 71	119 1R	9 91	119 RH	9 7R	119 54	1 64	111 14	9 11
20	167.36	2.93	113.49	2.37	114.17	3.24	114.82	2.12	113.17	2.49
91	1RR 71	ί n7	114 99	9 R9	.115 95	R RR	114 76	9.3n	119 Rn	9 RR
23	174.51	3.54	116.96	3.02	118.48	3.49	116.76	2.51	114.93	2.62
24	176.27	3.50	117.63	3.13	118.58	3.71	116.56	2.57	114.99	2.51

177

Dia 0	0.1 mg/kg	0.3 mg/kg	1.0 mg/kg	5.0 mg/kg
Média 100.00	S.E.M 0.00	Mean 100.00	S.E.M 0.00	Mean 100.00	S.E.M 0.00	Mean 100.00	S.E.M 0.00
1	99.31	0.61	99.26	0.28	98.81	0.27	98.25	0.58
2	102.87	0.73	102.98	0.43	103.18	0.50	101.82	0.53
3	106.26	0.82	106.95	0.50	106.52	0.55	105.47	0.58
4	110.20	0.64	110.50	0.58	110.52	0.67	109.29	0.58
7	120.50	1.20	120.03	0.82	121.54	1.15	119.77	1.19
δ	123.48	1.58	121.38	1.31	124.28	1.59	121.96	1.72
9	125.46	2.47	121.57	2.09	125.60	2.23	123.04	2.42
10	123.95	3.38	118.27	3.07	124.11	2.97	120.00	2.81
11	121.98	3.93	116.02	3.32	121.27	3.42	117.97	2.98
14	113.90	2.14	108.43	1.94	111.72	2.27	111.58	2.59
15	113.66	1.91	109.59	2.12	112.30	2.23	113.33	2.37
16	115.06	2.00	111.54	2.02	115.00	2.36	116.06	2.30
17	115.99	2.18	113.57	2.04	118.08	2.32	119,14	2.42
18	118.01	2.29	116.13	2.14	121.16	2.55	122.14	2.61
20	122.17	2.57	120.62	2.20	126.90	2.87	128.60	2.77
21	123.49	2.90	122.88	2.49	130.41	2.98	132.82	2.84
23	124.35	3.02	125.36	2.83	137.81	3.09	140.79	2.83
24	123.77	2.80	125.33	2.75	138.93	2.76	141.77	2.61

O efeito de tratar os animais com várias doses de anticorpo E3 anti-NGF com relação ao peso corpóreo foi estatisticamente analisado por uso de ANOVA de duas vias para comparar os resultados obtidos no emparelhamento entre os animais artríticos tratados com veículo com aqueles tratados com uma dose dada de anticorpo E3. O uso de os dados normalizados para peso no dia 14 (Tabela 21), doses de 0,03 mg/kg de E3 resultou em uma alteração significativa no peso corpóreo(p<0,005). No todo, a dose maior de E3, a diferença entre animais artríticos tratados e não tratados foi significativa (p = ou < 0,0001). O uso de dados normalizados para peso no dia 0 (tabela 22), dose de 0,03 mg/kg de E3 resultou em uma alteração significativa no peso corpóreo (p<0,002). No todo, dose maior de E3, a diferença entre os animais artríticos tratados e não tratados foi significativa (p<0,0001).

Novamente, de acordo com estudos anteriores, os ratos tratados com E3 mostraram menos perda de peso aparente que os ratos artríticos tratados (Tabela 22 e figura 22). De fato, os ratos tratados com doses altas de anticorpo E3 foram recuperando a perda de peso anterior e real mente ganharam peso mais rápido do que seus grupos não artríticos (Tabela 21 e figura 21).

Depósito de Material Biológico

Os materiais que se seguem foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia,

USA (ATCC):	178	Ά &
Material		Número de acesso	Data de depósito
Eb.911.3E	Cadeia leve E3	PTA-4893	8 de janeiro de 2003
Eb.pur.911.3E	Cadeia leve E3	PTA-4894	8 de janeiro de 2003
Db.911.3E	Cadeia pesada E3	PTA-4895	8 de janeiro de 2003

178

O vetor Eb.911.3E é um polinucleotídeo codificando a região variável de cadeia leve E3; o vetor Eb.pur.911.3E é um polinucleotídeo codificando região variável de cadeia leve E3, e vetor Db.911.3E é um polinucleotídeo codificando a região variável de cadeia pesada E3.

Esse depósito foi feito de acordo com as provisões do Tratado de Budapeste com relação ao Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para a finalidade do Procedimento de Patente e as Normalizações de acordo com o mesmo (Tratado de Budapeste). Isso assegura manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data de depósito. O depósito estará disponível na ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre Rinat Neuroscience Corp. e a ATCC, o que assegura disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura de depósito ao público, mediante emissão da patente US pertinente ou abertura ao público de qualquer pedido de patente US ou estrangeiro, o que vier primeiro, e assegura disponibilidade da progênie a um interessado pelo Comissário de Patentes e Marcas Registradas dos US a ser titularizado de acordo com a 35 USC Seção 122 e às normas do Comissário, de acordo com o mesmo (incluindo 37 CFR Seção 1.14 com referência especifica ao 886 OG 638).

A cessionária do presente pedido concordou que se a cultura de materiais quando do depósito morresse ou se perdesse ou fosse destruída quando cultivada sob condições apropriadas, os materiais prontamente seriam substituídos por meio de notificação. A disponibilidade do material depositado não deve ser tida como uma licença à prática da invenção contrariando os direitos concedidos de acordo com a autoridade de qualquer governo

179

de acordo com suas leis de patente.

Seqüências de Anticorpo

Região variável de cadeia pesada (CDRs Kabat estão sublinhadas: CDRs Chothia estão negrítadas e em itálico).

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYPL/WVIRQPPGKGLEWIG//IVGPG7TP yjVSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYlVYArSYYFPYWGQG TLVTVS (SEQ1DNO:1)

Região variável de cadeia leve (CDRs Kabat estão sublinhadas: CDRs Chothia estão negrítadas e em itálico).

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS/SAWLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFfíSG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC^QEH7LPY7FGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO:2)

CDRs estendidas de cadeia pesada E3 CDRH1: GFSLIGYDLN (SEQ !D NO:3)

CDRH2: IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID NO:4)

CDRH3: GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO:5)

CDRs estendidas de E3 de cadeia leve CDRL1: RASQSISNNLN (SEQ ID NO:6)

CDRL2: YTSRFHS (SEQ ID NO:7)

CDRL3: QQEHTLPYT (SEQ ID NO:8)

CDRs estendidas de anticorpo 911 monoclonal de camundongo CDRs estendidas de 911 de cadeia pesada CDRH1 : GFSLIGYDIN (SEQ ID NO:9)

CDRH2 : MIWGDGTTDYNSALKS (SEQ ID NO: 10)

CDRH3: GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID NO:11)

CDRs estendidas de 911 de cadeia leve CDRL1: RASQDISNHLN (SEQ ID NO:12)

CDRL2: YISRFHS (SEQ ID NO:13)

CDRL3: QQSKTLPYT (SEQ ID NO:14)

Seqüência de aminoácido de E3 de cadeia pesada (plena)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTT

DYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYW

180

GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC

CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYV

DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK

TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

GK(SEQ IDNO:16)

Seqüência de aminoácido de 3E de cadeia teve (anticorpo pleno)

DIQMTGSPSSLSASVGDRVriTCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSG

VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSV

FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS

TYSLSSTLTLSKADYEKHXVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:17)

Seqüência de nucleotídeo 3E de cadeia pesada (anticorpo pleno)

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCC

TGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACT

GGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGG

TGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAA

AGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGG

ACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTAC

TACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCAC

CAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAG

AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGA

CCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGC

TGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCAT

CCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGC

AACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACC

TTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGC

CAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTG

GACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAG

TGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCAC

CTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGA

AAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAA

181

GACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTG CCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACGTGTCTGGT GAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAG CCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTT

CTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACG TGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAG AGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA(SEQ ID NO: 65)

Seqüência de nucleotídeo de 3E de domínio variável de cadeia pesada CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCC

TGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACT GGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGG TGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAA AGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGG ACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTAC

TACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:66)

Seqüência de nucleotídeo de 3E de cadeia leve (anticorpo pleno)

GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCG

CGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTA

TCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCT TCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTC ACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAA CAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAA ACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTTCCTCCATCTGATGAGCAGTT

GAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGA GGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCA CCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTG

AGTGCTAAfSEQ ID NO:67)

Seqüência de nucleotídeo de 3E de domínio de cadeia leve GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCGTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCG

182

cgtcaccatcacctgccgcgcatctcagtccattagcaataatctgaactggW^ *

TCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCT

TCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTC

ACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAA

CAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAA

ACGC(SEQ ID NO:68)

Fica entendido que os exemplos e concretizações descritos aqui são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações podem ser sugeridas aos versados na técnica e devem estar incluídas dentro do espírito e escopo desse pedido.

183 uU

LISTAGEM DE SEQÜENCIA <110> Rinat Neuroscience Corp. SHELTON, David L.

PONS, Jaume ROSENTHAL, Arnon <12O> ANTICORPOS ANTI-NGF, MÉTODO PARA FABRICAÇAO E USO DOS MESMOS, BEM COMO SEUS POLINUCLEOTÍDEOS, VETOR E CÉLULA HOSPEDEIRA <130> 514712001442 <140> BR PI03177386 <14l> 2003-12-24 <150> PCT/US2003/041252 <151> 2003-12-24 <150> US 60/510,006 <151> 2003-10-08 <150> US 60/443,522 <151> 2003-01-28 <150> US 60/436,905 <151> 2002-12-24 <160> 77 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT ^<2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 1

Gin

Vai

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Giy

Leu

Vai

Lys

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Vai

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr

20

25

30

Asp

Leu

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Tle

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Vai

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Vai

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Vai

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Vai

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gly

Tyr

Trp

Tyr

Ala

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Vai

Thr

Vai

Ser

115

120

<210> 2 <211> 109 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético

184

<400> 2

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Vai

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Vai

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Asn

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Thr

Ser

Arg

Phe

His

Ser

Gly

Vai

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Glu

His

Thr

Leu

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105 <210> 3 <211> 10 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

^<223> Constructo Sintético <400> 3

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Asn 15 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213>

Seqüência Artificial <22Q>

<223>

Constructo Sintético <400> 4

Ile Xle Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai Lys Ser 15 10 15 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 5

185

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr 1 5

Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 10

<210> 6 <211> 11 <212> PRT <213>

Seqüência Artificial <22O>

<223> Constructo Sintético <400> 6

Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Asn Asn Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial = <220>

^<223> Constructo Sintético^: <400> 7

Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial 3 <220>

^<223> Constructo Sintético <400> 8

Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ile Asn 15 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus

186 &L <400> 10

Met Ile Trp Gly Asp Gly Thr 1 5

Thr Asp

Tyr Asn Ser Ala Leu 10

Lys Ser 15 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr 1 5

Ser Tyr

Tyr Phe Asp Tyr 10 <210>

<211>

<212>

<213>

PRT

Mus musculus <400> 12

Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn His Leu Asn 15 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13

Tyr Ile Ser Arg Phe His Ser 1 5 <210>

<211>

<212>

<213>

PRT

Mus musculus <400> 14

Gin Gin Ser Lys Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 15 <211> 15 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

187

<210> 16 <211> 447 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 16

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Glv Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr 20 25 30

Asp Leu Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai Lys

55 60

Ser Arg Vai Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu

70 75 80

Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

90 95

Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai

180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys

210 215 220

Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser

290 295 300

Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

188

»-* Riás:

385

390

395

400

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Vai

Asp

Lys

Ser

Arg

405

410

415

Trp

Gin

Gly

Asn

Vai

Phe

Ser

Cys

Ser

Vai

Met

His

Glu

Ala

Leu

420

425

430

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

435

440

445

£?

<210> 17 <211> 214 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <220>

<221> VARIANT <222> 190 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 17

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Vai

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Vai

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Asn

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Thr

Ser

Arg

Phe

His

Ser

Gly

Vai

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Giy

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Glu

His

Thr

Leu

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Vai

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Vai

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Vai

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Vai

Gin

Trp

Lys

Vai

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Vai

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Xaa

Vai

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Vai

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Vai

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 <210> 18 <211> 11 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético

189 <400> 18

Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Asn Asn Leu Asn 15 10

<210> 19 <211> 7 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 19

Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser 1 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <2i3> seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 20

Arg Ala Ser Gin Tyr Ile Ser Asn His Leu Asn 15 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <^213> Seqüência Artificiai <220>

<223> Constructo Sintético <400> 21

Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <^2i3> seqüência Artificial <220>

^<223> constructo Sintético <400> 22

Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Asn Gin Leu Asn 15 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT

190

<^213> seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 23

Tyr Vai Ser Arg Phe His Ser 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223>

Constructo Sintético <400> 24

Arg Ala Phe Gin Ala Ile Ser Asn Gin Leu Asn 15 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT ^<2l3> seqüência Artificia!

<220>

^<223> Constructo Sintético <400> 25

Tyr Ile Ser Arg Phe His Thr 1 5 <210> 26 <211> 11 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 26

Arg Ala Phe Gin Ser Ile Ser Asn 1 5

Gin Leu Asn 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 27

Tyr Ala Ser Arg Phe His Ser

191 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 28

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ser Asn 15 10 <210>

<211>

<212>

<213>

PRT

Seqüência Artificial <220>

^<223^> Constructo Sintético <400> 29

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp 1 5

Tyr Asn Ser Ala Leu 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 30

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 31 <211> 14 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 31

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai 15 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

...

192 <223> Constructo Sintético <400> 32

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Vai Thr 15 10 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 33

Gly Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai 15 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 34

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Vai Thr 15 10

<210> 35 <211> 14 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

^<223> Constructo Sintético <400> 35

Gly Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Vai 15 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213>

Seqüência Artificial <220>

^<223> Constructo Sintético <400> 36

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ala Thr 15 10 <210> 37

193

<211> 14 <212> PRT ^<213> Seqüêncía Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 37

Gly Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai 15 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213>

Seqüêncía Artificial <220>

^<223> Qonstructo Sintético <400> 38

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Vai Ser 15 10 <210> 39 <211> 14 <212> PRT ^<213> Seqüêncía Artificial <220>

^<223> Constructo Sintético <400> 39

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Vai 15 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT ^<2i3^> . seqüêncía Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 40

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ile Ser 15 10 <210> 41 <211> 14 <212> PRT ^<213> Sequência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 41

194

O— *J^X'

Gin Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp 1 5

Tyr Asn Ser Ser 10

Vai

V jZ-p··

<210> 42 <211> 10 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 42

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ala Ser 15 10 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 43

Gly Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Vai 15 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 44

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <2i^3> seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 45

Ser Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu 15 10 <210> 46 <211> 13 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial ⁵

195

<220>

<223> Constructo Sintético <400> 46

Gly Gly Tyr Trp Tyr Gly Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 47 <211> 13 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

^<223^> Constructo Sintético <400> 47

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <2^].3^> Seqüência Artificiai <220>

<223> Constructo Sintético <40O> 43

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 49

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 50 <211> 9 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 50

Gin Gin Glu Lys Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5

196 <210 51 <211> 9 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 51

Gin Gin Glu Ala Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5

<210> 52 <211> 13 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 52

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

^<223> constructo Sintético <400 53

Gin Gin Glu Arg Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 54

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 55 <211> 9 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400 55

197

Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 56

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210>

<211>

<212>

<213>

PRT

Seqüência Artificial <220>

^<223^> constructo Sintético <400> 57

Gin Gin Glu Ser Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 58

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ser Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 59 <211> 9 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificiai <220>

<223> Constructo Sintético <400> 59

Gin Gin Glu Lys Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 60 <211> 13 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial

198

<223> Constructo Sintético <400> 60

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 61 <211> 9 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

^<223> Constructo Sintético <400> 61

Gin Gin Glu Arg Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 62 <211> 13 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificiai <220>

<223> Constructo Sintético <400> 62

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 63 <211> 9 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 63

Gin Gin Glu Arg Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 64 <211> 13 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 64

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 65

199

<211> 1344 , _; <212> DNA <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 65 caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttccgagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctgggtt ctcacttatc ggctatgatc ttaactggat ccgacagcct 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggatt atctggggtg atggaaccac agactataat 180 tcagctgtca aatcccgcgt caccatctca aaagacacct ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggttat 300 tggtacgcca ctagctacta ctttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atctgtcttc ccactggccc catgctcccg cagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tcccagaacc tgtgaccgtg 480 tcctggaact ctggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtcc 540 tcaggtctct actccctcag cagcgtggtg accgtgccat ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagcca agcaacacca aggtcgacaa gaccgtggag 660 agaaagtgtt gtgtggagtg tccaccttgt ccagcccctc cagtggccgg accatccgtg 720 ttcctgttcc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatct ccagaacccc agaggtgacc 780 tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtgc agttcaactg gtatgtggac 840 ggagtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg agcagttcaa ctccaccttc 900 agagtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgccaccat ccagagagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc catccgacat cgccgtggag 1140 tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctccaat gctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260 aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ctccaggaaa gtaa 1344 <210> 66 <211> 363 <212> DNA <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 66 caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttccgagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctgggtt ctcacttatc ggctatgatc ttaactggat ccgacagcct 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggatt atctggggtg atggaaccac agactataat 180 tcagctgtca aatcccgcgt caccatctca aaagacacct ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggttat 300 tggtacgcca ctagctacta ctttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 67 <211> 645 <212> DNA <2i3> s_eqQência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 67 gatatccaga tgacacagtc cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggtga ccgcgtcacc 60 atcacctgcc gcgcatctca gtccattagc aataatctga actggtatca gcagaagcca 120 ggcaaagccc caaaactcct gatctactac acctcacgct tccactcagg tgtcccatca 180

200 cgcttcagtg gaagatattg ggcaccaagc tctgatgagc ccacgcgagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagttctc gcagtggctc ccacttatta tggagatcaa agttgaaatc ccaaagtaca cagagcagga cagactacga cagtcacaaa tggtacagat ctgccaacag acgcactgtg cggaactgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaaacacmaa gagcttcaac ttcaccttca gagcataccc gctgcaccat tctgttgtgt gataacgccc agcacctaca gtctacgcct cgcggtgagt ccattagcag ttccatatac ctgtcttcat gcctgctgaa tccaatccgg gcctcagcag gcgaagtcac gctaa cctgcaacca cttcggtcaa ctttcctcca taacttctat taactcccag caccctgacc ccatcagggc

300

360

420

480

540

600

645 <210> 68 <211> 324 <212> DNA <2i3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 68 gatatccaga tgacacagtc cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggtga ccgcgtcacc 60 atcacctgcc gcgcatctca gtccattagc aataatctga actggtatca gcagaagcca 120 ggcaaagccc caaaactcct gatctactac acctcacgct tccactcagg tgtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggctc tggtacagat ttcaccttca ccattagcag cctgcaacca 240 gaagatattg ccacttatta ctgccaacag gagcataccc ttccatatac cttcggtcaa 300 ggcaccaagc tggagatcaa acgc 324

<210>	69
<211>	98
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	69

Gin Vai Gin Leu Gin

Glu

Ser

Gly Pro

Gly Leu 10

Vai

Lys

Pro

Ser 15

Glu

1

5

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Vai

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Vai

Thr

Ile

Ser

Vai

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Vai

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Vai

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gly

<210> 70 <211> 120 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 70

Gin

Vai

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Vai

Lys

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Vai

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr

20

25

30

201

Asp

Ile

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Met

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Vai

Thr

Ile

Ser

Vai

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Vai

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Vai

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg Gly

Gly

Tyr

Gly

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin Gly

Thr

Leu

Vai

Thr

Vai

Ser

115

120

<210> 71 <211> 120 <212> PRT <2ΐ3> Seqüência Artificial ^;<220>

<223> Constructo Sintético <400> 71

Gin

Vai

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Vai

Lys

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Vai

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ile

Gly

Tyr

20

25

30

Asp

Ile

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Met

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Vai

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Vai

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Vai

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gly

Tyr

Gly

Thr

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Vai

Thr

Vai

Ser

115

120 <210> 72 <211> 120 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 72

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr 20 25 30

Asp Leu Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai Lys 50 55 60

Ser Arg Vai Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu

70 75 80

Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

202

			85					90		95
Arg	Gly Gly	Tyr	Tyr	Tyr	Gly	Thr	Ser	Tyr Tyr Phe	Asp Tyr	Trp
		100					105		110
Gin	Gly Thr	Leu	Vai	Thr	Vai	Ser
	115					120

<210> 73 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Vai

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Vai

Thr

Ile

Thr

Cys

Gin

Ala

Ser

Gin

Asp

Ile

Ser

Asn

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Thr

Gly

Vai

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Tyr

Asp

Asn

Leu

Pro

85

90

95

<210> 74 <211> 109 <212> PRT ^<213> Seqüência Artificial ² <220>

<223> Constructo Sintético t <400> 74

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Vai

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Vai

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asp

Ile

Ser

Asn

His

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ile

Ser

Arg

Phe

His

Ser

Gly

Vai

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

cys

Gin

Ser

Lys

Thr

Leu

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

<210> 75 <211> 109 <212> PRT <2ΐ3> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético

203

<400> 75 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Vai

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Asn

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Thr

Ser

Arg

Phe

His

Ser

Gly

Vai

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Lys

Thr

Leu

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

<210> 76 <211> 1429 <212> DNA ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <400> 76 atggccaccg actccagaac ctcctggctg ctgacagtgt ccctgctgtg tctgctgtgg 60 ccacaggagg ccagcgctca ggtgcagctg caggagtctg gcccaggact ggtgaagcct 120 tccgagaccc tgtccctcac ctgcactgtc tctgggttct cacttatcgg ctatgatctt 180 aactggatcc gacagcctcc agggaaggga ctggagtgga ttgggattat ctggggtgat 240 ggaaccacag actataattc agctgtcaaa tcccgcgtca ccatctcaaa agacacctcc 300 aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgaccgccg cggacacggc cgtgtattac 360 tgtgcgagag gaggttattg gtacgccact agctactact ttgactactg gggccagggc 420 accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat ctgtcttccc actggcccca 480 tgctcccgca gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540 ccagaacctg tgaccgtgtc ctggaactct ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 ccagctgtcc tgcagtcctc aggtctctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccatcc 660 agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagccaag caacaccaag 720 gtcgacaaga ccgtggagag aaagtgttgt gtggagtgtc caccttgtcc agcccctcca 780 gtggccggac catccgtgtt cctgttccct ccaaagccaa aggacaccct gatgatctcc 840 agaaccccag aggtgacctg tgtggtggtg gacgtgtccc acgaggaccc agaggtgcag 900 ttcaactggt atgtggacgg agtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc aagagaggag 960 cagttcaact ccaccttcag agtggtgagc gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg 1020 aacggaaagg agtataagtg taaggtgtcc aacaagggac tgccatccag catcgagaag 1080 accatctcca agaccaaggg acagccaaga gagccacagg tgtataccct gccaccatcc 1140 agagaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tggtgaaggg attctatcca 1200 tccgacatcg ccgtggagtg ggagtccaac ggacagccag agaacaacta taagaccacc 1260 cctccaatgc tggactccga cggatccttc ttcctgtatt ccaagctgac cgtggacaag 1320 tccagatggc agcagggaaa cgtgttctct tgttccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1380 cactataccc agaagagcct gtccctgtct ccaggaaagt aattctaga 1429 <210> 77 <211> 729 <212> DNA ^<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Constructo Sintético <220>

204

<22i> Região de interesse biológico <222> 646 <223> m = A ou C <400> 77 atggccaccg actccagaac ctcctggctg ctgacagtgt ccctgctgtg tctgctgtgg 60 ccacaggagg ccagcgctga tatccagatg acacagtccc catcctccct gtctgcctct 120 gtgggtgacc gcgtcaccat cacctgccgc gcatctcagt ccattagcaa taatctgaac 180 tggtatcagc agaagccagg caaagcccca aaactcctga tctactacac ctcacgcttc 240 cactcaggtg tcccatcacg cttcagtggc agtggctctg gtacagattt caccttcacc 300 attagcagcc tgcaaccaga agatattgcc acttattact gccaacagga gcataccctt 360 ccatatacct tcggtcaagg caccaagctg gagatcaaac gcactgtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct ttcctccatc tgatgagcag ttgaaatccg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc acgcgaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatccggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgaccct gagcaaagca gactacgaga aacacmaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagttctcca gtcacaaaga gcttcaaccg cggtgagtgc 720 taattctag 729

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo antifator de crescimento nervoso (NGF) ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) três CDRs de uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID

5 NO:1;e (b) três CDRs de uma região variável de cadeia leve de SEQ ID

NO:2.
2. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as CDRs são CDRs de Kabat,

10 CDRs de Chothia, ou uma combinação de CDRs de Kabat e Chothia.
3. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo:

(a) uma região CDR1 mostrada em SEQ ID NO:3;

15 (b) uma região CDR2 mostrada em SEQ ID NO:4; e (c) uma região CDR3 mostrada em SEQ ID NO:5.
4. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo:

20 (a) uma região CDR1 mostrada em SEQ ID NO:6;

(b) uma região CDR2 mostrada em SEQ ID NO:7; e (c) uma região CDR3 mostrada em SEQ ID NO:8.
5. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que

25 compreende ainda uma região constante lgG2a de cadeia pesada humana.
6. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região constante kappa de cadeia leve humana.
7. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a 30 reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a região constante lgG2a de cadeia pesada humana é modificada.
8. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a

Petição 870170060507, de 21/08/2017, pág. 4/11 reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região constante lgG2a de cadeia pesada humana compreende as mutações A330P331 para S330S331, numeração de aminoácidos referente à sequência selvagem de lgG2a.
9. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com

5 qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que liga a

NGF com K_D de 2 nM ou menor.
10. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

10 sequência de SEQ ID NO:1; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO:2.
11. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende:

15 (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16; e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQIDNO:17.
12. Anticorpo antifator de crescimento nervoso (NGF) ou fragmento

20 do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo:

(i) uma região CDR1 de SEQ ID NO:3;

(ii) uma região CDR2 de SEQ ID NO:4; e (iii) uma região CDR3 de SEQ ID NO:5.

25 (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo:

(i) uma região CDR1 de SEQ ID NO:6;

(ii) uma região CDR2 de SEQ ID NO:7; e (iii) uma região CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:57, 59e61.

30
13. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região constante lgG2a de cadeia pesada humana.

Petição 870170060507, de 21/08/2017, pág. 5/11
14. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região constante kappa de cadeia leve humana.
15. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a 5 reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a região constante lgG2a de cadeia pesada humana é modificada.
16. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a região constante lgG2a de cadeia pesada humana compreende as mutações A330P331 para S330S331,

10 numeração de aminoácidos referente à sequência selvagem de lgG2a.
17. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que liga a NGF com K_D de 2 nM ou menor.
18. Anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo de acordo com 15 qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que liga a

NGF de roedor.
19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (a) um anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e
20 (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

20. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
21. Método para fabricação do anticorpo anti-NGF ou fragmento do 25 mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende expressão de um polinucleotídeo codificando o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 em uma célula hospedeira não humana in vitro.
22. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que 30 compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

Petição 870170060507, de 21/08/2017, pág. 6/11

23. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 65. 24. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 66. 25. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22,

caracterizado pelo fato de compreende a sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 67.

10 26. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 68.

27. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeo

15 mostrada em SEQ ID NO: 66 e a sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 68.

28. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

20 29. Micro-organismo transgênico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

30. Uso do anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo como
25 definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de dor.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs:1 e 2.
30 32. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF compreendendo as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs:1 e 2, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um

Petição 870170060507, de 21/08/2017, pág. 7/11 medicamento para tratamento para dores provocadas por artrite reumatóide em um indivíduo.

33. Uso de uma quantidade eficaz do anticorpo antagonista antiNGF compreendendo as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID

5 NOs:1 e 2, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar caquexia inflamatória associada à artrite reumatóide em um indivíduo.

Petição 870170060507, de 21/08/2017, pág. 8/11

1/28

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