ES2566430A1

ES2566430A1 - Esteres de di-benzoato y su uso terapéutico como moduladores negativos de canales de potasio KCa2/3

Info

Publication number: ES2566430A1
Application number: ES201431319A
Authority: ES
Inventors: Ralf Köhler; Aida OLIVAN VIGUERA; Ramon BADORREY MIGUEL; Jose Antonio GALVEZ LAFUENTE; Maria Dolores DIAZ DE VILLEGAS SOLANS
Original assignee: INST ARAGONES DE CIENCIAS de la SALUD; INSTITUTO ARAGONES DE CIENCIAS de la SALUD; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Zaragoza; Fundacion Agencia Aragonesa para la Investigacion y el Desarrollo ARAID
Current assignee: INST ARAGONES DE CIENCIAS de la SALUD; INSTITUTO ARAGONES DE CIENCIAS de la SALUD; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Zaragoza; Fundacion Agencia Aragonesa para la Investigacion y el Desarrollo ARAID
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2016-04-12
Anticipated expiration: 2034-09-12
Also published as: ES2566430B1; WO2016038239A1

Abstract

Esteres de di-benzoato y su uso terapéutico como moduladores negativos de canales de potasio KCa2/3. La presente invención se refiere a un grupo de compuestos con un núcleo de éster de benzoato que presentan capacidad de modular los canales de potasio de la familia KCa2/3, por lo que son útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos en los que están implicados estos canales, tales como hiperemia, hipotensión, taquicardia, insuficiencia cardiaca, debilidad muscular, hiperplasia, hipoexcitabilidad neuronal, dolor, angiogénesis y proliferación tumoral, inflamación crónica del intestino, y enfermedades autoinmunes, periféricas o neurológicas relacionadas con una actividad anormal de macrófagos y células T y B.

Description

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Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas estén dentro del alcance de la presente invención. En este sentido, el término “solvato”, tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en la materia.

Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus isómeros, sales, o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable

o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, más preferiblemente superior al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales o solvatos.

A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepción de la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C o un nitrógeno enriquecido en 15N, están dentro del alcance de esta invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) según descrito anteriormente, en una cantidad terapéuticamente efectiva.

Esta composición farmacéutica incluye adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones y son conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de tener un efecto modulador de los canales de KCa2/3, y calculada para producir el efecto deseado in vivo y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.

En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intravenosa, etc.). Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el “Tratado de Farmacia Galénica”, C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5,

S.A. Ediciones, Madrid, u en otros habituales o similares de la Farmacopeas Española y en Estados Unidos.

Otro aspecto de la invención se refiere a un agente anestésico que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) según descrito anteriormente.

Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales farmacéuticamente aceptables y solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o un profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) según descrito anteriormente para la fabricación de un medicamento.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que se selecciona de entre hiperemia, hipotensión, taquicardia, insuficiencia cardiaca, debilidad muscular, hiperplasia, hipoexcitabilidad neuronal, dolor, angiogénesis y proliferación tumoral, inflamación crónica del intestino, y enfermedades autoinmunes, periféricas o neurológicas relacionadas con una actividad anormal de macrófagos y células T y B.

Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno en el que una regulación anormal de los canales de KCa2/3 está implicada y que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) como descrito anteriormente a un paciente que lo necesite. Preferiblemente la enfermedad o trastorno se selecciona de entre hiperemia, hipotensión, taquicardia, insuficiencia cardiaca, debilidad muscular, hiperplasia, hipoexcitabilidad neuronal, dolor, angiogénesis y proliferación tumoral, inflamación crónica del intestino, y enfermedades autoinmunes, periféricas o neurológicas relacionadas con una actividad anormal de macrófagos y células T y B.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra el efecto inhibidor del compuesto (2) sobre canales KCa3.1 (A) y KCa2.3 (B) y el antagonismo de la modulación positiva de la apertura/cierre causada por SKA-31 (C).

FIG. 2. Muestra las grabaciones de tensión isométrica en anillos de arterias coronarias (PCA): compuesto (2) (1 µM) aumenta la tensión inducida por 5-HT (1 µM) en presencia de L-NNA e INDO. El vehículo es DMSO. Los datos se presentan como media ± SEM; n = 8-10; * P<0.05 en test T de Student, con dos colas, pareado.

FIG. 3. Muestra el efecto del compuesto (2) (1 µM) sobre las relajaciones inducidas por BK (1 µM) en presencia de L-NNA e INDO pre-contraídas con 1 µM 5-HT. El vehículo es DMSO. El efecto es más pronunciado a concentraciones bajas de BK. Los datos se muestran como medias ± SEM. * P<0.05, test T de Student con dos colas, pareado.

FIG. 4. Muestra el efecto del compuesto (2) sobre la relajación inducida por bradiquinina (BK) en PCA fuertemente precontraídas con U46619 (0,2 µM) en presencia de L-NNA e INDO. Los datos se presentan como media ± SEM (n=5-6 para cada uno); **P<0.01; Test T de Student.

FIG. 5. Muestra los efectos cardiovasculares sistémicos del compuesto (2) en ratones. A) Medidas telemétricas durante 24 horas de la presión sanguínea arterial media (PAM) tras inyecciones intraperitoneales de 30 mg/kg (n=4) del compuesto (2) o vehículo (n=6) en ratones normales wt. B) Disminución de la frecuencia cardiaca (FC) con 30mg/kg del compuesto (2) en ratones wt. C) PAM después de inyección de compuesto (2) en ratones KCa3.1-/- y comparación con los datos de wt. D) Ratones KCa3.1-/- no disminuyen la frecuencia cardiaca (FC) con el compuesto (2) como pasa en ratones wt. Los datos se presentan como media + SEM; * P<0.05; Test T de Student. E) 3 mg/kg (n=4) produce una menor disminución de la frecuencia cardiaca (FC) y F) 100 mg/kg (n=4) produce una disminución similar como 30 mg/kg.

FIG. 6. Muestra la mejora de actividad física de ratón en el test de zona abierta 1 hora después de la inyección i.p. del compuesto (2) (30 mg/kg). A) aumento de velocidad al correr, B) aumento de la distancia recorrida, C) aumento del número de veces que se produce comportamiento explorativo rampante.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1: síntesis de los compuestos de fórmula (I) de la invención.

Síntesis de mono- y di-benzoatos: el monobenzoato precursor (1) se obtuvo por reacción de bromuro de bencilo con ácido 3-fluoro-4-hidroxibenzoico. Los dibenzoatos (2), (3), (4), (7), (8), (9) y (10), así como el (6) que no cae dentro de la fórmula (I), se obtuvieron por reacción del correspondiente bis(bromometil) derivado con ácido 3fluoro-4-hidroxibenzoico. El dibenzoato (5), no incluido en la fórmula (I), se obtuvo por reacción de 1,3-bis(bromometil)benceno con ácido 3-fluoro-4-acetamidobenzoico. El ácido 3-fluoro-4-acetoamidobenzoico se obtuvo por acetilación del ácido 4-amino-3fluorobenzoico. El 3,4-bis(bromometil)tiofeno se obtuvo por bromación de 3,4bis(hidroximetil)tiofeno.

Síntesis del ácido 4-acetamido-3-fluorobenzoico

Una mezcla del ácido 4-amino-3-fluorobenzoico (233 mg, 1,5 mmol) y anhídrido acético (459 mg, 425 µl, 4,5 mmol) en piridina anhidra (7 ml) se calentó a 60ºC durante toda la noche. Entonces, la mezcla se concentró a vacío, se añadió agua (6 mL) y entonces la solución acuosa se acidificó con HCl 2N hasta pH=1. El producto precipitó y se filtró y se secó, dando lugar a 281 mg (95%) del compuesto ácido 4-acetamido-3fluorobenzoico como un sólido ligeramente parduzco. 1H NMR (CD3OD, 400MHz) δ

2.20 (s, 3H), 7.74 (dd, 1H, J = 11.5, J = 1.8), 7.80 (ddd, 1H, J = 8.5, J = 1.8, J = 0.9),

8.20 (dd, 1H, J = 8.1, J = 8.1).

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3,4-bis(3-fluoro-4-hidroxibenzoiloximetil)tiofeno (9)

De acuerdo con el procedimiento general, el compuesto (9) se obtuvo como un sólido blanco con un 33% de rendimiento. M.p. 215–216 °C; 1H NMR (CD3OD, 400MHz) δ

5.36 (s, 4H), 6.81-6.86 (m, 2H), 7.51-7.59 (m, 6H).

2,5-bis(3-fluoro-4-hidroxibenzoiloximetil)tiofeno (10)

De acuerdo con el procedimiento general, el compuesto (10) se obtuvo como un sólido ligeramente parduzco con un 25% de rendimiento. M.p. 185–186 °C; 1H NMR (CD3OD, 400MHz) δ 5.42 (s, 4H), 6.91-6.97 (m, 2H), 7.07 (s, 2H), 7.62-7.70 (m, 4H).

Síntesis de bis(4-acetamido-3-fluorobenzoato) de 1,3-fenilenbis(metileno) (5)

Una mezcla de 1,3-bis(bromometil)benceno (132 mg, 0,5 mmol), ácido 4-acetamido-3fluorobenzoico (217 mg, 1,1 mmol) y K2CO3 (173 mg, 1,25 mmol) en DMF anhidra (7ml) se calentó durante toda la noche a 105ºC bajo atmósfera de argón. Después la mezcla se enfrió, y se le añadieron una disolución acuosa saturada de NaHCO3 (3mL), disolución acuosa saturada de NaCl (5 mL) y AcOEt (25 mL). Se filtró a través de Celite®, se decantó y la fase acuosa se extrajo con AcOEt (2 x 10 mL). Los extractos orgánicos se secaron con MgSO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El crudo de reacción se recristalizó de metanol y se obtuvo 123 mg (50%) del compuesto

(5) como un sólido parduzco. M.p. 190–191 °C; 1H NMR (CD3OD, 400MHz) δ 2.14 (s, 6H), 5.36 (s, 4H), 7.42-7.45 (m, 3H), 7.56 (bs, 1H), 7.70-7.80 (m, 4H), 8.23 (dd, 2H, J = 8.1, J = 8.1), 10.03 (bs, 2H).

Ejemplo 2: determinación del efecto bloqueante del canal KCa de los compuestos de la invención.

Modelos celulares usados: Las células hKCa3.1-HEK293, las células hKv1.2-B82, las células rKv1.3-L929, las células hKv7.4-HEK293, las células hERG-HEK293, las células hKCa2.3-COS7, los fibroblastos 3T3 (3T3-L1, ref# CL-173, ATCC, Rockville, MD), las células de glioblastoma U251, y las células endoteliales primarias de arteria coronaria porcina (PCAEC), se cultivaron en medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bobino y 1% penicilina/estreptomicina (todo ello de la compañía Biochrom KG, Berlín, Alemania). Previamente a la realización de los ensayos “patch-clamp” las células fueron tripsinizadas, sembradas sobre vidrios cubre

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rKv1.3 Comp. (2) NT 93 ± 14 NT

hKv7.4 Comp. (2) NT 98 ± 7 NT

hERG Comp. (2) NT 99 ± 2 NT

hKIR Comp. (2) NT 102 ± 10 NT NT, no testado; los datos se presentan como media ± SEM, n ≥ 3. * Datos

de experimentos en el modo “inside-out”, el resto de datos procedentes de experimentos en el modo “whole-cell”.

Tabla 2: Resultados de la medida de selectividad.

Según los resultados en la tabla 1 y en las Fig. 1A y B (curvas de concentraciónrespuesta), se demuestra que los compuestos (2), (3) y (4) inhiben los canales de tipo 5 KCa2 aunque, el compuesto (2) no bloquea una serie de otros canales de potasio no relacionados con KCa2/3. Se puede concluir que el compuesto (2) inhibe el canal humano clonado KCa3.1 con una IC50 de 17 nM y el canal humano clonado KCa2.3 con una IC50 de 2 nM. Como queda demostrado en la Fig. 1C, los efectos bloqueadores a concentraciones nanomolares bajas se revirtieron con el modulador

10 positivo de la apertura/cierre del canal, SKA-31, a 1µM. Estos efectos opuestos del compuesto (2) y SKA-31 (neutralizando el efecto del otro) indican que el compuesto (2) funciona como modulador negativo de la apertura/cierre del canal.

Ejemplo 3: efecto de los compuestos de la invención sobre la 15 relajación/contracción del músculo liso.

Modelo de miografía in vitro: Para la miografía isométrica sobre anillos de arterias coronarias porcinas los anillos se montaban sobre un transductor de fuerza isométrico (Pioden UF1, Graham Bell House, Canterbury, UK). El baño, conteniendo un tampón 20 de Krebs (37ºC; equilibrado con un 95% O2 / 5% CO2) consistía de (en mM): NaCl 120, NaHCO3 24,5, CaCl2 2,4, KCl 4,7, MgSO4 1,2, KH2PO4 1 y glucosa 5,6, pH 7,4. Los anillos fueron pre-estirados a una tensión inicial de 1 g (10 mN). Se registraron

cambios en la fuerza empleando un programa Mac Lab System/8e (AD Instruments Inc, Milford, MA, USA) con una frecuencia de muestreo de 0,5 segundos. Para analizar las relajaciones de tipo EDH, el tampón del baño contenía el bloqueador de la NOsintasa, Nω-nitro-L-arginina (L-NNA, 300 µM), y el bloqueador de la ciclooxigenasa, indometacina (10 µM). Los anillos fueron pre-contraídos con el análogo del vasospásmico tromboxano, U46619 (0,2 µM) en presencia del compuesto (2) o su vehículo, DMSO, seguidos de una relajación con bradiquinina (BK, 1µM). Posteriormente, los anillos fueron totalmente contraídos con tampón de KCl (60 mM) durante 10 minutos, seguido de la adición de nitroprusiato de sodio (10 µM) para producir una relajación independiente del endotelio. Las soluciones stock del compuesto (2), de indometacina, y de U46619, fueron hechas en DMSO, y se añadieron al baño las cantidades correspondientes de estas disoluciones. Otros compuestos estaban disueltos en agua Milli-Q. Para el análisis de los datos se determinaron las relajaciones como porcentaje de cambio de las pre-contracciones de forma relativa al estado totalmente relajado (en ausencia de agentes que causen contracción).

Como demuestran los resultados de las grabaciones de tensión isométrica en anillos de arterias coronarias porcinas mostrados en la Fig 2, el compuesto (2) a 1 µM aumenta la tensión inducida por 5-HT (1 µM) en presencia de L-NNA e INDO. Usando este modelo ex vivo de regulación de tono de arteria coronaria, se demuestra que (2) es activo en un sistema complejo de regulación vascular y se demuestra también la capacidad de (2) para aumentar el tono arterial causado por un agonista fisiológico.

Como muestra la Fig. 3, el compuesto (2) a 1 µM inhibe las relajaciones inducidas por BK en presencia de L-NNA e INDO en anillos pre-contraídos por 5-HT. El efecto es más pronunciado a concentraciones bajas de BK. El vehículo es DMSO.

La Fig. 4 muestra el efecto inhibidor del compuesto (2) a 1 µM sobre la relajación inducida por BK en anillos fuertemente pre-contraídos con U46619 (0,2 µM) en presencia de L-NNA e INDO.

En conclusión, se ha demostrado que el compuesto (2) es eficaz como inductor de la vasorrelajación debida a un agonista como bradikinina en un modelo ex vivo relevante.

Con esto se demuestra la utilidad de éste y otros compuestos de la invención para reducir una hiperemia inducida por un agonista endotelial.

Ejemplo 4: efecto del compuesto (2) sobre la presión sanguínea y frecuencia cardiaca.

Se llevaron a cabo experimentos de telemetría que siguieron las directrices de ARRIVE y fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de los Animales del IACS. En resumen, se implantaron transductores de presión TA11PA-C10 (Data Sciences International (DSI), St. Paul, Minnesota, USA) en la arteria carótida izquierda de 4 ratones hembra wt (“wild type”, 19.9 ± 0.4 g) y 3 ratones hembra KCa3.1-/- (29.2 ± 2.0 g), bajo anestesia profunda. Durante 10 días se esperó a que los ratones se recuperaran de la intervención y alcanzasen ritmos circadianos normales. Los ratones tenían libre acceso a agua corriente y pienso estándar. Los datos de la telemetría se registraron durante un minuto cada 10 minutos durante 24 horas, y posteriormente se hizo la media de todos ellos. El análisis de los datos se llevó a cabo empleando el software DSI. El compuesto o el vehículo (aceite de cacahuete) se inyectó durante la tercera hora de la fase oscura (la fase de actividad) y se recogieron los datos de la telemetría tras 20 o 30 minutos de la inyección. Para minimizar el estrés y el daño causado por las inyecciones intraperitoneales (i.p.) los ratones se anestesiaron momentáneamente mediante inhalación de isofluorano.

Para inyecciones intraperitoneales, se disolvió la cantidad necesaria de compuesto (2) en aceite de cacahuete caliente (Sigma-Aldrich) para alcanzar dosis de 3, 30 o 100 mg/kg. El volumen de inyección fue de aproximadamente 600 ml.

Como ejemplo de utilidad de compuesto (2) en la manipulación de la regulación cardiovascular sistémica en vivo, se procedió a inyectar el compuesto (2) por vía intraperitoneal (i.p.) en ratones en dosis de 3, 30 y 100 mg/kg. Se consiguió reducir la frecuencia cardiaca (FC) mientras la presión sanguínea se mantuvo constante tal y como se muestra en la Fig. 5. Esto es la respuesta fisiológica y anticipada causada por un compuesto que promueve vasoconstricción periférica en un sistema cardiovascular normal. Esto es indicativo de un aumento de la resistencia total periférica por vasoconstricción arterial periférica y como reflejo, una reducción de frecuencia

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Claims

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