ES2567142T3

ES2567142T3 - Péptidos terapéuticos y de diagnóstico

Info

Publication number: ES2567142T3
Application number: ES07869233.2T
Authority: ES
Inventors: Laura L. Eggink; J. Kenneth Hoober
Original assignee: Susavion Biosciences Inc
Current assignee: Susavion Biosciences Inc
Priority date: 2006-12-13
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2027-12-13
Also published as: EP2097093B1; EP2097093A2; EP2097093A4; JP5421116B2; WO2008076824A3; DK2097093T3; JP2010513310A; WO2008076824A2; US7811995B2; US20080292650A1

Abstract

Un péptido terapéutico que consiste en una construcción y en al menos dos o más brazos, teniendo la construcción un marco central y consistiendo cada brazo en una secuencia unida al marco central a través de una secuencia enlazadora, en el que cada secuencia es la misma o diferente y se selecciona del grupo que consiste en: VGGGS (SEQ ID NO:1), PSSNA (SEQ ID NO:2), HPSLK (SEQ ID NO:3), HPSLG (SEQ ID NO:4), HPSLL (SEQ ID NO:5), HPSLA (SEQ ID NO:6), NPSHPLSG (SEQ ID NO:7) y NPSHPSLG (SEQ ID NO:8).

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

La figura 1 ilustra un modelo de trabajo de la estructura molecular de una realización de una construcción peptídica inmunorreguladora multivalente 10 de acuerdo con la invención La construcción 10 puede sintetizarse con dos, tres, cuatro, ocho o más brazos 1, usando la misma secuencia peptídica central 2 en los cuatro brazos o con dos o más secuencias diferentes. La longitud del espaciador 3 entre el marco central 4 de la construcción y la secuencia peptídica central 2 determina la longitud del brazo 1. Los brazos 1 se ilustra en la figura 1, por ejemplo, puede tener aproximadamente 3 ± 0,5 nm de longitud en función de la conformación, o aproximadamente 7 nm a través de la molécula. Los dominios de la superficie celular de las proteínas receptoras conocidas tienen, correspondientemente, aproximadamente 3 a 4 nm de diámetro. Esta distancia se puede ajustar aumentando o disminuyendo la longitud del enlazador. Por lo tanto, la reticulación de los receptores se puede conseguir con una realización de este tipo. La naturaleza multidimensional de la estructura ilustrada en la figura 1 se obtuvo usando técnicas de modelado molecular estándar.

Ejemplos

Ejemplo 1

Diseño y síntesis de péptidos

Mediante una detección selectiva de las secuencias peptídicas se identificó un conjunto de secuencias de interés. Los péptidos correspondientes se sintetizaron mediante procedimientos en fase sólida usando la protección de la cadena lateral Fmoc estándar. Los péptidos ramificados se construyeron sobre un marco de tri-lisina central, que permite cuatro secuencias idénticas dentro de la misma estructura. Se incluyó una secuencia enlazadora, (Gly)3-Ser (GGGS, SEQ ID NO: 9), para separar la secuencia activa del marco central. Las distancias entre las secuencias activas se pueden ajustar disminuyendo o aumentando la longitud del enlazador, incluyendo, sin limitaciones, la inclusión de dos enlazadores en tándem (GGGSGGGS, SEQ ID NO: 10), o la inserción de cualquier enlazador inerte, incluyendo, sin limitaciones, un polietilenglicol (PEG) de una longitud variable. La estructura ramificada se diseño de modo que tuviera una actividad mejorada mediante la agrupación de receptores (reticulación) en la superficie de las células respondedoras.

Los péptidos se sintetizaron sobre resina de PAL-PEG-poliestireno (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil) y un sintetizador peptídico de flujo continuo Milligen Biosearch 9050+ (Millipore Corporation, Billerica, MA).

El extremo C del marco central normalmente es un resto de lisina (K). No obstante, el extremo C se puede modificar para incluir aminoácidos adicionales en el extremo C, tales como un resto de cisteína, a la que se pueden añadir marcadores tales como grupos fluorescentes, o un resto de ε-biotinil-N-lisina (biotinil-K) útil para los procesos de purificación posteriores. Por consiguiente, la disponibilidad de dichos sitios se puede utilizar con ventaja de muchas formas, incluyendo, sin limitaciones, ayudar en la detección, cuantificación y purificación de los péptidos. Además, se puede insertar un aminoácido tal como β-alanina (βA) o triptófano (W) entre el aminoácido añadido en el extremo y el resto de lisina en el extremo T del marco central a fin de proporcionar un espaciador o un medio para determinar la concentración mediante absorbancia. Ejemplos no limitantes de tales restos de lisina en el extremo C modificados en el marco central incluyen K-βA-C y K-W-biotinil-K, respectivamente. Además, se pueden añadir restos de lisina adicionales a uno o ambos grupos α-y ε-amino de una lisina modificada en el extremo C sobre el marco central para dar, por ejemplo, (K)2K, (K)2K-βA-C o (K)2K-W-biotinil-K, de modo que forman estructuras ramificadas en las que los grupos α-y ε-amino están disponibles para la extensión.

Los restos de lisina utilizados en los puntos de ramificación se pueden incorporar con protección Fmoc sobre los grupos α-y ε-amino, de modo que ambos pasan a estar disponibles para la formación del enlace amida después de la reacción de desprotección estándar con piperidina. En algunas realizaciones, por ejemplo, se puede incorporar un marcador fluorescente adecuado, incluyendo, sin limitaciones, un grupo dansilo incorporado mediante reacción con el grupo tiol sobre la cisteína en el extremo C usando ácido 5-((((2-yodoacetil)amino)etil)amino)naftalen-1-sulfónico (1,5-IAEDANS) tras un protocolo estándar para sondas reactivas con tiol (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Del mismo modo, en estas u otras realizaciones, la biotina puede estar unida a la lisina a través de un enlace amida al grupo amino de la cadena lateral que, debido a su alta afinidad con la estreptavidina, proporciona un medio para recuperar el péptido con las proteínas asociadas a partir de mezclas de reacción con el fin de estudiar la interacción del péptido con los componentes celulares.

Tras la escisión del lecho de la resina, el producto se puede purificar mediante HPLC en una columna preparativa Jupiter Proteo C12 (21,2 mm x 250 mm) (Phenomenex, Inc., Torrance, CA) usando un gradiente de 8 % a 18 % de acetonitrilo en agua que contiene ácido trifluoroacético (TFA) 10 mM. La pureza del producto peptídico final se confirmó mediante espectroscopia de masas realizada utilizando un espectrómetro de masas Voyager DE STR (Applied Biosystems, Foster City, CA). El péptido purificado mediante HPLC se puede secar al vacío, se disuelven en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a pH 7,2 y se pasa a través de una columna de filtración en gel de Sephadex G-15 o G-25 (1 x 48 cm para muestras pequeñas) para separar el TFA del péptido. Después, la columna se puede eluir con PNS estéril.

Como alternativa, el producto puede purificarse mediante otras técnicas, incluyendo, sin limitaciones, el uso de una cromatografía de intercambio iónico de cartucho de fase inversa C18 y cromatografía de filtración en gel para eliminar

7

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En otro experimento, la adición de un péptido a cultivos de una línea de células T (MT2) inhibió la replicación del VIH del 10 % al 25 %, dependiendo del péptido. La adición de antisuero en estos experimentos no mostró un efecto sinérgico (datos no mostrados).

Por lo tanto, la sinergia demostrada en las figuras 4A-D y las figuras 5A-B indica un papel del péptido que puede se puede separar de su potencial de acción sobre los linfocitos. Claramente, el efecto de los péptidos puede ser más que un simple efecto aditivo del péptido más anticuerpos, y muy probablemente sea el resultado de la activación de los fagocitos. Sin tal activación, no se esperaría que el complejo virus-anticuerpo sea eliminado de forma eficaz mediante fagocitosis mediada por Fc por estas células.

Ejemplo 3

Inducción de la liberación de citocinas

Para determinar si la inhibición de la replicación del VIH por el péptido puede ser el resultado de la inducción de la liberación de citocinas, PBMC cultivadas se trataron con una realización del péptido de la presente invención y, después de 4 horas de incubación, se recogió el medio y se analizaron los cambios en el cantidades de 40 citocinas diferentes. La construcción peptídica HPSLK (SEQ ID NO: 3) 28 mostrada en la figura 2B se añadió a una concentración de 100 nM en cada uno de los ensayos. Los cultivos de PBMC se establecieron como se describe en el ejemplo 1 con células de Cellular Technologies, Ltd. (Shaker Heights, OH). Aproximadamente 3 millones de células de PBMC humanas congeladas se descongelaron a 37 ºC y se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml, en el que lentamente se añaden 8 ml de medio de lavado. Después, se añaden 8 ml adicionales de medio de lavado y se agita para mezclar. Después, las células se centrifugan a 330 g durante 10 minutos, se retira el sobrenadante y el sedimento se resuspende en 10 ml de medio de lavado y se centrifuga como se ha indicado anteriormente. A continuación, las células lavadas se resuspenden en medio RPMI-1640 que contiene 10 % de FBS a aproximadamente 6 millones de células por ml y se añaden 100 µl de la suspensión en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incuban durante la noche a 37 ºC en CO2 humidificado al 5 %. Después de 24 horas, el medio se reemplaza con 200 µl de medio RPMI-1640 recién preparado que contiene 10 % de FBS y se incuba a 37 ºC en CO2 humidificado al 5 % durante 2 días. Para los datos mostrados en la Tabla 1, a continuación, se añadió la parte alícuota de péptido a las muestras por duplicado a una concentración final de 100 nM y se incubó a 37 ºC en CO2 humidificado al 5 % durante 4 horas. Para otros experimentos (datos no incluidos), la incubación se continuó durante 24 horas. A continuación se retira el medio y se almacena a -80 ºC. Las muestras se analizan para determinar la producción de citocinas. Un conjunto de células control no se trata con un agente experimental. Un segundo conjunto de células control se trata con LPS, un agente de uso habitual para inducir la producción de diversas citocinas inflamatorias. El control positivo para la inflamación es esencial para asegurar que los péptidos no producen una respuesta inflamatoria no regulada.

El medio de cultivo se retira para el análisis de los niveles de citocinas con procedimientos desarrollados por RayBiotech, Inc. (Norcross, GA). En esta tecnología, las matrices de membrana de los anticuerpos contra citocinas se incuban con muestras de medios. Después del lavado, se incuba la matriz con un cóctel de todos los anticuerpos marcados con biotina. Después, se eliminan de la membrana los anticuerpos no unidos mediante lavado y se incuban con estreptavidina marcada con un colorante fluorescente. Después de un lavado final, las matrices de membrana se leen en un detector de fluorescencia.

Los péptidos no produjeron citotoxicidad, tal como se analizó mediante un procedimiento de doble colorante en el que el naranja de acridina brilla de color verde en las células viables y el bromuro de etidio brilla en rojo en las células muertas. La toxicidad del péptido in vivo se analiza mediante la inyección de un péptido en animales. Los péptidos se pueden administrar de varias formas, incluyendo, sin limitaciones, mediante inyección (por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal), tópica (transmucosa, transbucal o transdérmica) y/o por vía oral (líquido, comprimido o cápsula). En estudios preliminares con ratones no se han observado efectos adversos del péptido (datos no mostrados). Por el contrario, los animales tratados parecen exhibir mayor bienestar, lo que podría ser un efecto secundario beneficioso de la inmunidad mejorada en sujetos por lo demás sanos.

La tabla 1 contiene datos que muestran las citocinas que se liberan a una velocidad significativamente más alta durante una incubación de 4 horas de PBMC con la construcción peptídica ramificada 28 en presencia de suero; que la construcción 28, cuya estructura se ilustra en la figura 2B, contenía la secuencia del péptido central HPSLK (SEQ ID NO: 3) (SynGia™6B). Entre estas citocinas se encuentran la IL-2, la IL-4, la IL-16, la IL-17, el TNF-β y el TIMP-2. Varias citocinas, en particular la IL-16, la IL-17, el TNF-β y el TIMP-2, muestran incrementos de más de dos sobre las muestras control no tratadas.

10

TABLA 1

Concentración relativa de citocinas tras la incubación de PBMC en suero con la construcción peptídica SynGia™6B que contiene la secuencia central HPSLK (SEQ ID NO:3)

Citocina: HPSLK (SEQ ID NO:3) Sin tratar LPS

Aumentada:

Eotaxina-2: 562 194 221

ICAM-1: 87 57 53

I-309: 101 26 39

IL -2: 131 86 80

IL -3: 168 130 132

IL -4: 64 30 49

IL -6: 202 98 4375

IL -16: 10 1 2

IL -17: 27 5 11

TNF-β: 117 38 95

TIMP-2: 230 58 92

sTNF RI: 83 42 58

sTNF RII: 30 9 27

Disminuida:

IL-1a: 169 225 246

IL -13: 105 138 126

IL -11: 0 17 27

IL-12p40: 17 108 46

IL-12p70: 32 90 89

Como se muestra en el ejemplo en la tabla 1, el péptido estimuló la liberación de varias citocinas importantes. La IL2 activa los linfocitos T, B y las células citolíticas naturales y se usa terapéuticamente. La IL-4 estimula la 5 proliferación y la diferenciación de los linfocitos B e inhibe la producción de citocinas inflamatorias, tales como la IL1, la IL-6 y el TNF-α, y debería atenuar la secreción del TNF-α a medida que el tratamiento continúa. Adicionalmente, la estimulación de la secreción del sTNF RI y el sTNF RII, las formas solubles del receptor del TNFα, una citocina inflamatoria, debería mitigar sus efectos perjudiciales. Por lo tanto, puede producirse una respuesta inflamatoria al tratamiento con el péptido, aunque transitoria. La estimulación de la liberación de citocinas altamente 10 inflamatorias, tales como la IL-1β y la IL-6, fue mínima. Por ejemplo, en el experimento mostrado en la Tabla 1, la liberación de IL-6 fue de 202 (unidades arbitrarias) en la muestra experimental, 98 en la muestra no tratada, pero

4.375 en la muestra tratada con LPS. La IL-16 es secretada por los linfocitos CD8 (+), es un ligando natural del CD4 y suprime la replicación del VIH. La IL-17 es producida por los linfocitos T CD4 activados (+), aumenta la expresión de ICAM-1, IL-6, IL-8 y G-CSF, y es un mediador de la angiogénesis.

15 Es de particular importancia el hecho de que el péptido no estimuló la liberación de IL-10, una citocina correlacionada con la supresión del sistema inmunológico TH1 en los individuos infectados por el VIH.

Este patrón de liberación de citocinas, con la indicación de la activación de macrófagos, ofrece la promesa real de que los péptidos de la presente invención serán particularmente adecuados para el tratamiento de infecciones por VIH y otras enfermedades infecciosas. En otras realizaciones de la invención se puede estimular la liberación de

20 otras citocinas beneficiosas, tales como la IL-8 y la IL-15 por las PBMC. En una realización se pueden estimular, por ejemplo, las citocinas IL-8, IL-15, IL-16, RANTES o combinaciones de las mismas. 11

Por lo tanto, la mezcla de citocinas liberadas por las PBMC en respuesta a los péptidos descritos en la presente memoria debería proporcionar, de forma aislada o en combinación con otros tratamientos, una terapia efectiva contra las infecciones por el VIH. El tratamiento con los péptidos de la presente invención deberá inducir la activación de las células del sistema inmunológico in vivo y proporcionar una elevación endógena sostenida de

5 citocinas beneficiosas, en contraste con la rápida desaparición de estas proteínas cuando se administran de forma exógena. Además, los péptidos de la presente invención también pueden estimular la liberación de TNF-α, un marcador de la activación de los macrófagos de tipo TH2. Aunque la IL-8 y el TNF-α son inflamatorios, su secreción es una función normal de la actividad de los monocitos/macrófagos y se puede calibrar por la cantidad de péptido administrado.

10 Otra aplicación importante de la presente invención puede ser el uso de los péptidos como los microbicidas, que son preparaciones que se pueden formular para la administración transmucosa, incluyendo, sin limitaciones, cremas, películas o supositorios que se pueden aplicar en diversas combinaciones dentro de la vagina o del recto para proteger contra infecciones de transmisión sexual, incluido el VIH. Entre las infecciones microbianas adecuadas para el tratamiento según la invención se incluyen, sin limitaciones, infecciones bacterianas, virales, por protozoos y

15 fúngicas.

Además de su potencial terapéutico para el tratamiento, la tecnología de la presente invención se puede utilizar para otras aplicaciones, incluyendo la aplicación como un ensayo preliminar in vitro antes de la terapia. El sistema inmunológico de una persona infectada por el VIH aparentemente es incapaz de mantener una defensa a largo plazo contra la infección. Las causas de escape del virus del sistema inmunológico podría ser (1) el resultado de 20 mutaciones en el genoma viral que hacen que el virus carezca de epítopo y, por lo tanto, no sea susceptible a la unión por un anticuerpo, o (2) las células fagocíticas que son responsables de la eliminación del complejo virusanticuerpo son quiescentes. Para discriminar entre estas posibilidades, las muestras de sangre de un individuo infectado con un virus como el VIH podrían incubarse con y sin la adición de un péptido de la presente invención. En el primer caso, la actividad sinérgica de los péptidos no se logrará cuando los epítopos virales a los que se unen los

25 anticuerpos no están presentes. Sin embargo, en este último caso, los péptidos podrían activar los fagocitos y lograr la eliminación del virus. De cualquier manera, de este modo se dispondría de los resultados para permitir la decisión de si proceder o no con el tratamiento y los resultados descritos en este documento demuestran la viabilidad de este ensayo.

12

Claims

imagen1