JPH08511167A

JPH08511167A - ケモカインの生物学的活性の強化法

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Publication number: JPH08511167A
Application number: JP7501970A
Authority: JP
Inventors: ペラス，ルイス・エム; バートネイガー，プラディップ・クーマー; キング，アンドリュー・ガリソン; バルカレック，ジョアンナ・マリア
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 1996-11-26
Anticipated expiration: 2022-11-14
Also published as: DK0713495T3; ATE253637T1; EP1378522A2; DE69433301T2; DE69433301D1; JP4006021B2; US6399053B1; EP1378522A3; ES2210255T3; PT713495E; WO1994029341A1; EP0713495A1; US20040057925A1; EP0713495B1; EP0713495A4; US6080398A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＫＣ、ｇｒｏ−α、ｇｒｏ−βおよびｇｒｏ−γ蛋白質の生物学的活性の増加方法、完全長蛋白質よりも少なくとも１対する高い生物学的活性を有することを特徴とする切形修飾蛋白質、および該化合物を含有する医薬組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ケモカインの生物学的活性の強化法発明の分野本発明は、一般に、ある種の蛋白質およびある種の蛋白質、さらに詳細には、ケモカインの生物学的活性の改良法に関する。発明の背景インタークリンまたはケモカイン種のすべての構成員は、２つのジスルフィド結合を形成する４個のシステイン残基を有する塩基性ヘパリン結合ポリペプチドである。機能的に特徴化されているこれらの蛋白質はすべて前炎症および／または回復促進機能に関係すると考えられる。したがって、これらの分子は骨髄移植および感染症、癌、骨髄造血機能不全、宿主対移植片疾患、および自己免疫病の治療において治療上有効性を有することが期待される。ケモカイン種はそのアミノ酸配列および染色体の位置により２つの亜種に分けることができる。α亜種の構成員は、初めの２個のシステインがわずか１個のアミノ酸により分離されているので、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」亜種と命名する。この亜種のヒト遺伝子はＩＬ−８、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、およびＩＰ−１０を包含し；ネズミ対応物は、ＫＣおよびマクロファージ炎症蛋白質２（ＭＩＰ−２）を包含する。ケモカインβ亜種において、最初の２個のシステインは隣接する位置にある（「Ｃ−Ｃ」亜種）。この亜種は、ヒトＭＣＡＦ、ＬＤ−７８、ＡＣＴ−２およびＲＡＮＴＥＳを包含する。ネズミ対応物は、ＪＥ、ＴＣＡ−３、ＭＩＰ−１α、およびＭＩＰ−１βである［ジェイ・ジェイ・オッペンハイム（J.J.Oppenheim）ら、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Annu.Rev.Immunol.）、９：６１７−６４８（１９９１）］。ネズミＫＣ遺伝子産物［オクエンド（Oquendo）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、２６４：４２３３（１９８９）］は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）により誘発され、ヒトＭＧＳＡ／ｇｒｏα遺伝子のネズミ相同体（ｍＭＩＰ−２と６３．０％アミノ酸相同）であると考えられる。ＫＣはＣＯＳ−１細胞において発現され、分泌された蛋白質をコードすることが示されている［オクエンド、前掲］。ＭＩＰの二種の形態がマウス由来のマクロファージ腫瘍細胞の培養物中に見つかった：ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２。ネズミＭＩＰ−２（ｍＭＩＰ−２）は、そのｃＤＮＡがまたクローンされ、配列決定されている誘発可能な蛋白質である［国際特許出願公開第ＷＯ９０／０２７６２（１９９０年３月２２日）］。ネズミＭＩＰ−２はヒト多形核球（ＰＭＮ）に対して有効な走化活性を有し、リソチームのＰＭＮ脱顆粒を誘発するが、β−グルクロニダーゼのＰＭＮ脱顆粒を誘発しないことが示されている［ウォルプ（Wolpe）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（J.Exp.Med.）、１６７：５７０（１９８７）］。さらに、ｍＭＩＰ−２はＣＦＵ−ＧＭに対して骨髄造血促進活性を有することが示されている［ブロクスマイヤー（Broxmeyer）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（J.Exp.Med.）、１７０：１５８３（１９８９）］。この因子のヒトの対応物は、２種類の、ＭＩＰ−２αおよびＭＩＰ−２β（各々、ｇｒｏ−βおよびｇｒｏ−γとも称する）からなることが判明した。ヒトｇｒｏ−βのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は国際特許出願公開第ＷＯ９２／００３２７号（１９９２年１月９日）に示されており；ヒトｇｒｏ−γのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は国際特許出願公開第ＷＯ９２／００３２６号（１９９２年１月９日）に示されている。これらの配列は、各々、７３個のアミノ酸成熟蛋白質をコードすると予想された。ＭＧＳＡまたはｇｒｏ−α［リッチモンド（Richmondo）ら、ＥＭＢＯＪ．７：２０２５（１９８８）］はヒト黒色腫細胞により分泌される有効なマイトジェン活性を有する成長因子であり、ヒトｇｒｏ遺伝子の産物である［アニソビッチ（Anisowicz）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、８４：７１８８（１９８７）］。当該分野において治療または医薬製品としての有効な使用を可能にし、治療効果を得るのに必要な蛋白質の量を最少にして、毒性を低くするためのこれらの成熟蛋白質の生物学的活性の強化法が必要とされている。発明の要約一態様において、本発明はＫＣ蛋白質、ヒトｇｒｏ−α、ｇｒｏ−β、およびｇｒｏ−γを包含する修飾ケモカインであって、成熟蛋白質のアミノ末端にある約２ないし約８個のアミノ酸の間の切断および成熟蛋白質よりも少なくとも１対数高い生物学的活性により特徴付けられる修飾蛋白質を提供する。別の態様において、本発明は、成熟蛋白質のカルボキシ末端にある約２ないし約１０個のアミノ酸の間の切断および成熟蛋白質よりも少なくとも１対数高い生物学的活性により特徴付けられる修飾ケモカインを提供する。さらに別の態様において、本発明は２またはそれ以上の本発明の修飾蛋白質を組み合わせてなる多量体蛋白質を提供する。これらの多量体は、好ましくは、同じ修飾蛋白質の複数のコピー、例えば切断ＫＣ蛋白質の二量体を含む。しかし、本発明の２またはそれ以上の異なる修飾蛋白質の多量体形態も本発明に含まれるものである。本発明の修飾蛋白質の多量体形態および他の公知の成熟蛋白質も本発明に含まれる。さらに別の態様において、本発明は前記した蛋白質を修飾および／または切断することによるケモカインの生物学的活性の強化法を提供する。さらに別の態様において、本発明は本発明の修飾多量体蛋白質を含有する医薬および診断用組成物、ならびに治療における該組成物の投与法を提供する。さらに別の態様において、本発明は本発明の修飾ケモカインに選択的に結合する能力を特徴とする抗体を提供する。さらに別の態様において、本発明は本発明の抗体の使用を通してin vivoにおける造血相乗因子（ＨＳＦ）に対して選択された造血刺激剤の効果のモニター法を提供する。さらに別の態様において、本発明は（ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）₂−Ｓｕｂ −（Ｌｙｓ）₂［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］を投与することによるin vivoでのＨＳＦ誘発法を提供する。本発明の他の態様および利点を以下の好ましい具体例の詳細な記載においてさらに記載する。図面の簡単な記載図１は成熟した天然ネズミＫＣ蛋白質の公開アミノ酸配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］を示す。図２は成熟したｇｒｏ−アルファヒト蛋白質の公開アミノ酸配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］を示す。図３は成熟したヒトｇｒｏ−β蛋白質の公開アミノ酸配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：３］を示す。図４は成熟したヒトｇｒｏ−γ蛋白質の公開アミノ酸配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：４］を示す。図５は以下の実施例２において記載するプラスミドｐｅａｌ−ｍｋｃ３８（− ４）のＤＮＡ地図である。図６は以下の実施例６において記載するプラスミドｐｅａｌ−ｈｇｒｏβ（− ４）のＤＮＡ地図である。図７は実施例１７において記載するin vivoでのＨＳＦ誘発の速度論を説明する。図８は実施例１７において記載する（ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）₂−Ｓｕｂ −（Ｌｙｓ）₂［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］の注射後の血清ＨＳＦレベルの用量依存応答を説明する。図９は実施例１７において記載する（ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）₂−Ｓｕｂ −（Ｌｙｓ）₂［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］の腹腔内（ｉ.ｐ.）ｖｓ.経口（ｐ. ｏ.）投与後６時間でのＨＳＦの用量依存応答を説明する。発明の詳細な記載本発明は、炎症性応答、造血および骨髄造血に付随する修飾蛋白質、特にケモカインであって、対応する非修飾または非切断成熟天然蛋白質と比べて強化された生物学的活性を有することを特徴とする修飾蛋白質を提供する。本明細書において定義するように、「造血相乗因子」または「ＨＳＦ」は天然に存在するケモカインおよび本発明の修飾ケモカインを含む一連の蛋白質をいい、これは他の造血因子、例えばコロニー剌激因子（実施例８参照）と共にin viv oおよびin vitro投与した場合、または天然に循環するＣＳＦと結合した場合、造血剌激において相乗活性を有することを特徴とする。「ケモカイン」なる語は、「インタークリン」ともいい、とりわけ通常当該分野にてＫＣ蛋白質、ｇｒｏ −β、ｇｒｏ−α、およびｇｒｏ−γと称される蛋白質を包含し、これらはすべて哺乳動物の起源である。前記の４個の成熟ケモカインのアミノ酸配列［ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１−４］を図１ないし図４に示す。成熟蛋白質の生物学的活性を有するこれらの蛋白質の類似体または誘導体もこの定義に含まれる。本明細書において定義するように、このような類似体および誘導体は、成熟蛋白質の公知のアミノ配列においてなされる変更により特徴付けられる修飾蛋白質、例えばＳＥＱＩＤＮＯＳ：１−４に示される蛋白質を包含する。このような類似体は、８個またはそれ以下のアミノ酸残基、好ましくは約５個またはそれ以下のアミノ酸残基によって成熟蛋白質と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする。蛋白質のアミノ酸配列の違いが保存的なアミノ酸置換のみであるのが好ましい。保存的なアミノ酸置換はアミノ酸が置換されるアミノ酸と実質的に同じ電荷を有し、置換が蛋白質の局所的構造配置またはその生物学的活性に著しい影響を及ぼさない場合に起こる。また、蛋白質の安定性を変えるかまたは望ましい宿主細胞中に発現されるようにする配列中のアミノ酸の欠失または導入などの変化が好ましい。本明細書において用いる場合、「強化された生物学的活性」は、実施例８のＨＳＦ検定において完全長の成熟蛋白質において観察される活性よりも少なくとも１対数高い、すなわち１０倍高いことをいう。加えて、この語は成熟蛋白質に特徴的でない生物学的活性、例えばＫＣに関しては完全長成熟蛋白質が不活性であり、修飾蛋白質が著しい活性を有することを意味する。本発明は修飾デスアミノケモカインを提供する。「デスアミノ」なる語は、約２ないし約８、好ましくは約５ないし約８個の間のアミノ酸が成熟蛋白質のアミノ末端より除去されるように修飾されたケモカインまたは蛋白質をいうのに用いる。所望により、特に組み換え発現された場合、本発明のデスアミノケモカインは所望により挿入されたＮ−末端Ｍｅｔを含んでもよい。宿主細胞による発現の間に、この任意のＭｅｔは切断されるかもしれない。また、所望であるならば、このアミノ酸を酵素消化法または他の公知手段により切断してもよい。この態様の一具体例において、本発明は成熟ＫＣ蛋白質に比べて切断されたアミノ（またはＮ）末端を有することを特徴とするデスアミノＫＣ蛋白質を提供する。修飾蛋白質は図１の成熟ＫＣ蛋白質［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］の２から８番目のアミノ酸残基間の位置で切断することができる。好ましくは、このデスアミノＫＣはＳＥＱＩＤＮＯ：１の成熟ＫＣ蛋白質の５〜７２アミノ酸を含有する。すなわち、図示したＫＣ蛋白質のアミノ末端の最初の４個のアミノ酸残基がこの蛋白質において欠失している。驚くべきことに、本発明者らはこのデスアミノＫＣが造血相乗因子検定（実施例８参照）において、不活性（〜０単位／ｍｇ）である非修飾完全長成熟ＫＣ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］と異なり、少なくとも１０¹⁴単位／ｍｇの生物学的活性を有することにより特徴付けられることを見いだした。精製した場合、この修飾ケモカインはさらに高い生物学的活性を特徴とすると考えられる。デスアミノＫＣの構造、合成および検定を以下の実施例に詳細に記載する。本発明の別の修飾ケモカインはデスアミノｇｒｏ−β（ＭＩＰ−２αともいう）蛋白質である。この蛋白質は図３［ＳＥＱＩＤＮＯ：３］の２および８の位置のアミノ酸の間にある切断された成熟ｇｒｏ−β蛋白質のアミノ酸配列からなる。好ましい具体例において、本発明のデスアミノ蛋白質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３の成熟ｇｒｏ−βのアミノ酸５ないし７３に及ぶ蛋白質配列を有する。本発明者らは、驚くべきことに、このデスアミノ−ｇｒｏ−βが非修飾完全長ヒトｇｒｏ−βよりも少なくとも約２対数高い生物学的活性を有することを特徴とすることを見いだした。本発明の別の具体例は、デスアミノｇｒｏ−γ（ＭＩＰ−２βともいう）蛋白質である。この蛋白質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の２および８の位置のアミノ酸の間にあるＮ末端で切断された成熟ｇｒｏ−γ蛋白質のアミノ酸配列からなる。好ましい具体例において、本発明の修飾蛋白質は、成熟ｇｒｏ−γ［ＳＥＱＩＤＮＯ：４］のアミノ酸５ないし７３に及ぶ蛋白質配列を有する。本発明者らはこのデスアミノｇｒｏ−γが実施例８の検定において完全長成熟ｇｒｏ−γ よりも少なくとも２対数大きな生物学的活性を有することを見いだした。さらに精製すると、さらに大きな生物学的活性が観察されると考えられる。本発明の別の修飾蛋白質の例は、デスアミノｇｒｏ−α蛋白質（ＭＧＳＡともいう）である。この蛋白質は、図２［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］の２および８の位置のアミノ酸の間にあるそのＮ末端で切断された成熟ｇｒｏ−αのアミノ酸配列からなる。好ましい具体例において、本発明の修飾蛋白質はＳＥＱＩＤＮＯ：２の成熟ｇｒｏ−αのアミノ酸５から７３に及ぶ蛋白質配列を有する。修飾後、これらの他のｇｒｏ蛋白質に関して観察されるのと同様の活性における増加がデスアミノｇｒｏ−αに関しても期待される。本発明はまた、修飾デスカルボキシケモカインまたは他の蛋白質を提供する。このようなデスカルボキシケモカインは、そのカルボキシ末端から約２から約１０アミノ酸が欠失した完全長成熟ケモカインからなる。所望により、発現の目的で蛋白質中に挿入されてもよいＮ−末端メチオニンは、所望により、宿主細胞による蛋白質のプロセッシングの間に、または公知の技術を用いて合成的に切断してもよい。この具体例は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の約５８および約７０のアミノ酸の間の位置でそのカルボキシ末端が切断された成熟ＫＣ蛋白質のアミノ酸配列を有するＫＣ蛋白質である。好ましい具体例において、デスカルボキシＫＣ蛋白質は、成熟ＫＣ蛋白質［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］の１ないし６８のアミノ酸残基からなり、成熟蛋白質のカルボキシ末端の４個のアミノ酸残基が欠如している。同様のデスカルボキシ蛋白質はｇｒｏα、ｇｒｏβおよびｇｒｏγ蛋白質で構築することができる。他のデスアミノおよびデスカルボキシケモカインもまた各々の非変更成熟ケモカインと比べて強化された生物学的活性を示す。このようなケモカインの例は、 α亜種ケモカイン、例えばＩＬ−８／ＮＡＰ−１、ＰＦ−４およびＩＰ−１０、 β−亜種ケモカイン、例えばＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１、ＬＤ−７８、ＰＡＴ４６４、ＧＯＳ１０−１、ＡＣＴ−２、ＰＡＴ７４４／Ｇ２６、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ−３０９、および前記の蛋白質を包含する。これらの蛋白質はすべて文献に記載されており、当該分野における当業者にとって公知である。さらに、以下により詳細に記載するように、本発明の修飾蛋白質は、修飾および／または切断蛋白質の多量体形態、例えば二量体、三量体、四量体および他の凝集形態を包含する。このような多量体形態は合成または組み換え発現により調製でき、以下に詳述するように合成および組み換え技術の組み合わせにより産生されるケモカインを包含しうる。多量体は発現により自然に形成され、このような複数の形態を構築することができる。本発明の修飾ケモカインの多量体形態は同じ修飾ケモカインの多量体を含んでもよいと考えられる。本発明の別の多量体は異なる修飾蛋白質の凝集により形成される。さらに別の本発明の多量体は本発明の修飾ケモカインおよび公知の完全長成熟ケモカインの凝集により形成される。好ましくは、本発明の二量体または多量体は少なくとも１個の本発明のデスカルボキシまたはデスアミノケモカイン蛋白質および同型の生物学的活性を有することを特徴とする少なくとも１個の他のケモカインまたは他の蛋白質を含有する。この他の蛋白質は、別のデスアミノまたはデスカルボキシケモカイン、または他の公知の蛋白質である。例えば、本発明の望ましい二量体は、２個の本発明のデスアミノＫＣ蛋白質からなる。他の望ましい本発明の二量体は、２個の本発明のデスカルボキシ−ＫＣ蛋白質、本発明のデスアミノ−ＫＣおよびデスカルボキシ−ＫＣ、または２個の本発明のデスアミノｇｒｏ−β蛋白質である。あるいは、本発明の他の二量体は、非修飾成熟ＫＣ蛋白質と組み合わせた本発明のデスアミノＫＣ蛋白質または本発明のデスカルボキシ−ＫＣ蛋白質であってもよい。同様に、このような二量体の組み合わせは、デスカルボキシｇｒｏ−α、ｇｒｏ−β、ｇｒｏ−γ、または他の本発明のケモカインで形成されてもよい。例えば、本発明のデスアミノｇｒｏ −β蛋白質は、本発明の非修飾成熟ｇｒｏ−β蛋白質と二量体を形成してもよい。当業者は本発明の修飾ケモカインを用いて望ましい他の多量体を得ることができる。多量体、並びに他の本発明の修飾蛋白質は公知の成熟蛋白質と異なり、強化された生物学的活性を特徴とする。強化された生物学的活性は、治療的使用について明らかな利点、すなわち、所望の治療結果を得るのに投与される蛋白質が少なくてよいという利点を提供する。このような低用量は毒性の低下、およびコストの低下をもたらす。このように、本発明は選択されたケモカイン、例えば、ＫＣ、ｇｒｏ−α、ｇｒｏ−β、およびｇｒｏ−γの生物学的活性の強化法を提供する。この方法は本明細書において記載するように自然にあるいは組み換え技法により産生された成熟蛋白質を修飾することからなる。この方法は、また、その多量体凝集体の調製からなっていてもよい。この方法の他の具体例に従って、修飾蛋白質または多量体を以下のよにして合成してもよい。有利には、この方法は本発明のデスアミノおよびデスカルボキシケモカインを公知の技術に従って調製することからなる。例えば、これらのペプチドは、メリフィールド（Merrifield）の固相技法（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J.Am.Chem.Soc.）、８５：２１４９（１９６４））により調製され、あるいは当該分野で公知の溶液法を採用してもよい。一般に、ジェイ・エム・スチュワートおよびジェイ・ディー・ヤング（J.M.StewartおよびJ.D.You ng）、「固相ペプチド合成」（Solid Phase Peptide Synthesis）、ピアース・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Company）、ロックフォード、ＩＬ（１９８４）またはエム・ボダンスキー、ワイ・エイ・クラウサーおよびエム・エイ・オンデッティ（M.Bodansky、Y.A.KlauserおよびM.A.Ondetti）、「ペプチド合成」（Pepetide Synthesis）、ジョン・ウィリー＆サンズ・インコーポレイション（John Wiley ＆ Sons,Inc.）、New York、ＮＹ（１９７６））に記載されているようなペプチド合成法を用い、本発明のペプチドを製造してもよい。各アミノ酸またはペプチドを、適宜、ペプチド業界で公知のように保護する。例えば、α−フルオロエニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）またはｔ− ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基が、特にα−位にあるアミノ基の保護に好ましい。適当に置換したカルボベンズオキシ基をリシンのε−アミノ基、およびベンジル基をＡｓｐおよびＧｌｕの各βおよびγカルボキシ基に用いてもよい。カルボベンズオキシ保護基の適当な置換は、クロロ、ブロモ、ニトロまたはメチルに関してはオルトおよび／またはパラ置換であり、保護基の反応性を変更するのに用いる。ｔ−Ｂｏｃ基を除いては、保護基は、もっとも好都合には、穏やかな酸処理によっては除去されないものである。これらの保護基は、当該分野にて公知の接触水素添加、液体アンモニア中ナトリウムまたはＨＦ処理などの方法により除去される。固相合成法を用いた場合、ペプチドはカルボキシ末端から始めて、ペプチドのアミノ末端へ向けて連続して構築される。固相合成は、保護アミノ酸のＣ末端を適当な樹脂、例えばベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）、米国特許第４２４４９４６号に記載されているようなメチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ）またはクロロメチル樹脂（ＣＭＲ）またはフェニル酸アミノメチル樹脂（ＰＡＭ）などに共有結合させることにより開始する。生成物ペプチドのカルボキシ末端をカルボキシアミドにする場合、ＢＨＡまたはＭＢＨＡ支持樹脂を用いる。生成物ペプチドのカルボキシ末端をカルボキシ基にする場合、一般に、ＡＣＭＲまたはＰＡＭ樹脂を用いるが、これを用いてカルボキシアミドまたはエステルを得ることもできる。 α−アミノ基上の保護基は穏やかな酸処理（すなわちトリフルオロ酢酸）により除去される。当該分野にて公知の適当な脱保護、中和およびカップリングサイクルを用いて、所望のペプチドが形成されるまで中間体を単離せずに連続してアミノ酸を添加する。ついで、完成したペプチドを支持樹脂からいずれかの順序で脱遮断および／または分離する。樹脂支持のペプチドをＨＦまたはＨＢｒ／酢酸で処理して樹脂からペプチドを分離し、カルボン酸またはカルボキシアミドのカルボキシ末端アミノ酸を得る。エステルが望ましい場合、ＣＭＲまたはＰａｍ樹脂を適当なアルコール、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチルまたはベンジルアルコールを用い、トリエチルアミドの存在下で処理して、ペプチドを樹脂から切断し、直接エステルを得る。本発明のペプチドのエステルはまた常法によりカルボン酸前駆体から調製してもよい。典型的には、カルボン酸を酸触媒の存在下でアルコールで処理する。また、カルボン酸を活性化アシル中間体、例えば酸ハロゲン化物に変換し、アルコールで、好ましくは塩基の存在下に処理する。ペプチドを支持樹脂から切断する好ましい方法は、樹脂支持のペプチドを適当なカチオンスカベンジャー、例えばアニソールまたはジメトキシベンゼンの存在下に無水ＨＦで処理することである。この方法は同時に硫黄を保護するチオアルキル基以外のすべての保護基を除去し、ペプチドを樹脂から分離する。このようにしてＣＭＲおよびＰａｍ樹脂から加水分解されたペプチドはカルボン酸であり、ＢＨＡ樹脂から分離されたものはカルボキシアミドとして得られる。ペプチドの末端アミノ基の修飾は、当該分野で周知の方法によるアルキル化またはアシル化により達成される。これらの修飾は、ペプチドに組み込まれる前のアミノ酸に関して、あるいは合成し、末端アミノ基が遊離した後であれば、保護基が除去される前のペプチドに関して行われる。典型的には、アシル化は対応するアルキルまたはアリール酸の、アシルハロゲン化物、無水物または活性化エステルを用いて遊離アミノ基に対して第三アミンの存在下で行う。モノアルキル化はシアノボロ水素化リチウムまたはナトリウムなどの穏やかな還元剤の存在下、適当な脂肪性アルデヒドまたはケトンでアミノ基を還元アルキル化に付すことにより最も好都合に行われる。ジアルキル化はアミノ基を過剰のアルキルハライドで塩基の存在下で処理することにより行う。ペプチドの溶液合成は、アミド結合に関して用いられる常法に従って行われる。典型的には、遊離カルボキシル基を有する保護ｔ−Ｂｏｃアミノ酸を、遊離アミノ基を有する保護アミノ酸と、適当なカップリング剤、例えばＮ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて、所望により１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）またはジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの触媒の存在下で結合させる。他の方法、例えば保護ｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸の遊離カルボキシルの活性化エステル、無水物または酸ハロゲン化物を形成させ、続いて、所望により塩基の存在下、保護アミノ酸の遊離アミンと反応させることも適当な方法である。例えば、保護Ｂｏｃ−アミノ酸またはペプチドを無水溶媒、例えば塩化メチレンまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で、Ｎ−メチルモルホリン、ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）またはトリアルキルアミンなどの塩基の存在下でのクロロギ酸イソブチルで処理して「活性化無水物」を形成し、これを続いて別の保護アミノ酸またはペプチドの遊離アミンと反応させる。これらの方法により形成されたペプチドを通常の技術を用いてアミノまたはカルボキシ末端で選択的に脱保護し、類似する技術を用いて他のペプチドまたはアミノ酸と結合させる。ペプチドを完成させた後、保護基を前記のようにして、例えばパラジウムまたは白金触媒の存在下での水素添加、液体アンモニア中ナトリウム、フッ化水素酸またはアルカリでの処理により除去する。最終ペプチドが脱保護された後に該ペプチドが塩基性基を有する場合、酸付加塩を調製してもよい。ペプチドの酸付加塩は適当な溶媒中標準的方法で親化合物およびわずかに過剰の酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、コハク酸またはメタンスルホン酸から調製する。酢酸塩形態が特に有用である。最終ペプチドが酸性基を含有する場合、カチオン塩を調製してもよい。典型的には、親化合物を少し過剰のアルカリ試薬、例えば適当なカチオンを含有する水酸化物、カルボネートまたはアルコキシドで処理する。Ｎa⁺、Ｋ⁺、Ｃa⁺⁺ およびＮＨ₄ ⁺のようなカチオンは医薬上許容される塩中に存在するカチオンの例である。Ｎa⁺およびＮＨ₄ ⁺が特に好ましい。しかし、好ましい方法においては、完全長の成熟ケモカインを適当な酵素で消化して本発明の修飾蛋白質を産生する。現在、好ましい酵素はＤＰＰ−ＩＶであり、これはエンザイム・プロダクツ・システム・インコーポレイション（Enzyme Products Systems,Inc.）より市販されている。本発明のデスアミノおよびデスカルボキシケモカインはまた、当該分野で公知の他の技術、例えば遺伝子工学技術により産生できる。例えば、サムブルック（ Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（ Molecular Cloning，ａ Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）参照のこと。例えば、イー・コリ（E.coli）、バチルス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、哺乳動物、昆虫および酵素細胞などを含む所望の微生物または細胞中の選択された蛋白質のクローニングおよび発現のシステムは公知であり、私的および公的研究所および寄託所によりおよび商業的販売社より入手可能である。現在、本発明ニースカルボキシおよびデスアミノケモカインの最も好ましい産生法は修飾ケモカインを直接的に組み換え発現させる方法である。例えば、デスカルボキシまたはデスアミノネズミＫＣ蛋白質は、選択された宿主中、蛋白質の複製および発現を指向しうる調節配列の制御の下、ＤＮＡコーディング配列を通常のプラスミド発現ベクター中に挿入することにより組み換え発現することができる。例えば、以下の実施例２および３の記載を参照のこと。デスアミノおよび／またはデスカルボキシｇｒｏα、ｇｒｏβ、およびｇｒｏ γの組み換え発現は類似の技術を用いて得ることができる。これらのケモカインに関する好ましい発現系のうちには、昆虫および酵母細胞を含む真核細胞もまた含まれる。しかし、ＫＣに関して最も好ましい発現系は細菌系である。これらの蛋白質はグリコシル化されないので、細菌中での翻訳および発現に伴う構造の問題はないと考えられる。次に、細胞中に産生されるかまたは培地中に分泌される本発明の修飾ケモカインは、細胞溶解操作およびゲルクロマトグラフィーなどの通常の技術を用いて精製できる。これらの本発明のデスアミノおよびデスカルボキシケモカインは、モノマー形態にて合成して得られたものを含め、自然に、二量体、三量体、および他の凝集体に合することが望ましい。例えば、本発明のモノマーデスカルボキシ−ＫＣ蛋白質を、本発明の修飾ケモカインのコーディング配列を含有する１またはそれ以上のベクターでトランスフェクションされた選択された宿主細胞中で共同発現させてもよい。また、本発明のモノマーデスカルボキシ−ＫＣ蛋白質の２またはそれ以上のコピーは、単一のベクター上にあるか、または宿主細胞のクロモソーム中に組み込まれていてもよい。好ましくは、宿主細胞は細菌また哺乳動物である。このように、本発明の他の具体例として、本発明の修飾ケモカインをコードする核酸配列は通常通り得られるかまたはケモカインのアミノ酸配列の知識を有する当業者により設計される。このような核酸配列は、選択された発現系、例えば細菌、酵母などの好ましいコドンを有するように設計できる。同様に、発現プラスミドをコードするヌクレオチド配列はプラスミドの発現およびその中に発現される修飾ケモカイン蛋白質の選択に応じて通常通り得ることができる。これらの蛋白質をコードするヌクレオチド配列もまた任意の開始Ｍｅｔコドンを含有してもよい。他の態様において、本発明はさらに炎症、発熱、ウイルス性、真菌性、および細菌性感染症、癌、骨髄造血不全、造血障害、および自己免疫病の治療において有用な医薬組成物を提供する。これらの組成物は治療上有効量の本発明の修飾ケモカインおよび許容できる医薬担体を含有する。本明細書にいて用いる場合、「医薬」なる語は、獣医学的応用を包含するものである。治療的用途としての本発明の修飾ケモカインは、デスアミノＫＣ、デスカルボキシ−ＫＣ、デスアミノｇｒｏ−β、ｇｒｏ−α、またはｇｒｏ−γ、あるいはデスカルボキシｇｒｏ−β、ｇｒｏ−α、またはｇｒｏ−γ、これらを含む多量体、およびその組み合わせを包含するが、限定されない。本発明の修飾ケモカインは、医薬組成物に処方でき、成熟蛋白質に関して記載されたのと同様にして投与される［例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９０／０２７６２（１９９０年３月２２日）参照］。本発明の医薬組成物の調製および用途における違いは、成熟蛋白質を用いて同じ治療効果を得るのに、より少ない量の蛋白質でその効果を得ることができることにある。「治療上有効量」なる語は、モノマーまたは、好ましくは、多量体形態のいずれであっても、選択された症状を緩和するのに有用な修飾ケモカインの量を意味する。一般に、本発明のデスアミノまたはデスカルボキシケモカインは、約０．０１ｎｇ／ｋｇ（体重）ないし約１ｇ／ｋｇの間の量、好ましくは約０．０１ｎｇ／ｋｇないし１００μｇ／ｋｇ／用量の量で投与される。好ましくは、これらの医薬組成物は注射によりヒトまたは他の哺乳動物に投与される。しかし、投与はいずれか適当な内部経路により、必要ならば、例えば１日ないし約３週間の間、毎日１ないし３回繰り返してもよい。適当な医薬担体は当業者には公知であり、容易に選択される。現在、好ましい担体はセイラインである。所望により、本発明の医薬検定は他の活性成分を含んでもよいかまたは、他の治療薬と組み合わせて投与される。適当な任意の成分または他の治療薬はこの性質の症状の治療に通常用いられるもの、例えば、とりわけ他の抗炎症薬、利尿剤、および免疫抑制剤を包含する。望ましくは、これらの本発明の修飾ケモカインはコロニー刺激因子と組み合わせて投与するのに特に適している。このように、本発明はまた、炎症、自己免疫障害、および造血および／または骨髄細胞の生産および／または分化が低いことを特徴とする症状の改良された治療法を提供する。この方法では、選択された哺乳動物に本発明の医薬組成物を投与することを包含する。この組成物はコロニー剌激因子と一緒に投与されるかまたはコロニー剌激因子を含有することが好ましい。適当なコロニー剌激因子源は周知であり、例えば、天然、合成および組み換えＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ −ＣＳＦおよびＩＬ−３を包含する。他の好ましい具体例において、本発明のデスカルボキシまたはデスアミノケモカインは、in vivoにて投与でき、選択された患者に見られる天然のコロニー剌激因子と相乗的に作用する。一の好ましい具体例において、本発明のデスカルボキシまたはデスアミノケモカインは、前記したこのような症状の治療にて認証されているが、残念ながら非常に毒性の高いＧＭ−ＣＳＦと組み合わせた内部使用に特に適している。デスアミノｇｒｏ−βなどの本発明の修飾ケモカインをＣＳＦと組み合わせて使用（この組み合わせは相乗性を有すことが観察されている）することにより、患者に投与されるＣＳＦの用量が低くなり、その結果ＧＭ−ＣＳＦの毒性が低くなる。他の態様において、本発明は本発明の修飾ケモカインに対する抗体を提供する。このような抗体は、本発明の修飾ケモカインに優先的に結合すること、すなわち、非修飾または完全長ケモカインに対して識別能を有することを特徴とする。これらの抗体は、モノクローナル［ダブリュー・ディー・ヒューズ（W.D.Huse）ら、サイエンス（Science）、２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；コーラーおよびミルシュタイン（KohlerおよびMilstein）］またはポリクローナル抗体の産生に関する通常の技術を用いて得られる。本発明の抗体は哺乳動物の血流中の造血相乗因子（ＨＳＦ）のレベルを測定する診断薬として有用であると考えられる。本発明はさらに哺乳動物におけるＨＳＦ誘発能により特徴付けられる選択された試薬の循環レベルおよび／または効能のモニター法を提供する。このようなＨＳＦ−誘発剤は、共同出願番号第０７／８１９０２４号（カナダ特許第２０２０８３８号に対応）および米国特許第４９８７１２２号に開示されているような造血誘発化合物を含むが、これに限定されない。これらのペプチドは、式（Ｉ）：［式中、Ｙ₁およびＹ₂は、独立して、ＣＨ₂またはＳであり；ｘは０、１、２、３、または４であり；ｍは０、１、または２であり；ｎは０、１、または２であり；Ａはピログルタミン酸、プロリン、グルタミン、チロシン、グルタミン酸、２− チオフェンカルボン酸、ピコリン酸、シクロヘキサンカルボン酸、テトラヒドロ −２−フロ酸、テトラヒドロ−３−フロ酸、２−オキソ−４−チアゾリジン、シクロペンタン、３−チオフェンカルボン酸、（Ｓ）−（＋）−５−オキソ−２− テトラヒドロフラン−カルボン酸、およびピペコリン酸であり；Ｂはセリン、グルタミン酸、チロシンまたはアスパラギン酸であり；Ｃはグルタミン酸、チロシンまたはアスパラギン酸であり；Ｄはリシン、アルギニン、チロシン、Ｎ−メチルアルギニン、アスパラギン酸、オルニチンまたはジアミノヘキシン酸；またはそのカルボキシアミドもしくはヒドロキシメチル誘導体であり；Ｅはグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンまたはペプチド結合であり；Ｆはチロシンまたはペプチド結合を意味する；ただし、Ｙ₁およびＹ₂がＳである場合、ｘは２、３または４であり、ｍおよびｎは１であるか；Ｙ₁およびＹ₂がＣＨ₂である場合、ｘは０、１または２であり、ｍおよびｎは０であるか；Ｙ₁がＳであり、Ｙ₂がＣＨ₂である場合、ｘは０であり、ｎは１であるか；またはＹ₂がＳであり、Ｙ₁がＣＨ₂である場合、ｘは０であり、ｍは１である）で示される化合物であるかまたはその医薬上許容される塩である。本発明の化合物の医薬上許容される塩複合体もまた本発明に含まれる。式（Ｉ）において、Ａはピログルタミン酸、プロリン、グルタミン、チロシンまたはグルタミン酸に対応するアミノ酸残基の末端アミノ基からなることに留意しなければならない。同様に、Ｄはリシン、アルギニン、チロシン、Ｎ−メチルアルギニン、ジアミノヘキシン酸またはそのカルボキシアミドまたはヒドロキシメチル誘導体に対応するアミノ酸残基の末端カルボキシル基からなる。当該分野で通常用いられる略号および記号を本明細書においてペプチドを記載するのに用いる。アミノ酸はその通常の３文字表記により略記する。ｐＧｌｕ＝ピログルタミン酸Ｐｉｃ＝ピコリン酸Ｐｐｃ＝ピペコリン酸Ｐｐｇ＝プロパルギルグリシンＯｒｎ＝オルニチンｐ−（ＮＨ₂）Ｐｈｅ＝パラ−アミノフェニルアラニンＨｎａ＝２,６−ジアミノ−４−ヘキシン酸Ｃｈｃ＝シクロヘキサンカルボン酸Ｔｆｃ＝テトラヒドロ−２−フロン酸Ｏｔｚ＝２−オキソ−４−チアゾリジンＣｐａ＝シクロペンタンＴｐｃ＝３−チオフェンカルボン酸Ｓ−Ｏｔｆ＝（Ｓ）−（＋）−５−オキソ−２−テトラヒドロフラン −カルボン酸ｔ−ＢＯＣ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルＢｚ＝ベンジルＣ１−Ｚ＝ｐ−クロロカルボベンジルオキシカルボニル（Ｚ＝カルボベンジルオキシカルボニル）ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミンＥＤＣ＝（Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨｎａ＝ジアミノヘキシン酸ＨＯＢＴ＝ヒドロキシベンゾトリアゾールＮＭＰ＝Ｎ−メチル−２−ピロリジンＮ−ＭｅＡｒｇ＝Ｎ−メチルアルギニンＰｒｃ＝ビスＢＯＣ−Ｓ,Ｓ'−１,３−プロパンジイルシステインＥｔｃ＝ビスＢＯＣ−Ｓ,Ｓ'−１,２−エタンジイルシステインＢｕｃ＝ビスＢＯＣ−Ｓ,Ｓ'−１,４−ブタンジイルシステインＲ−Ｏｔｆ＝（Ｒ）−（−）−５−オキソ−２−テトラヒドロフラン −カルボン酸通常の表記にしたがって、アミノ末端は左側に、カルボキシ末端は右側にする。すべてのキラルアミノ酸はＤまたはＬ絶対配置である。すべての光学異性体が含まれる。アミノ末端はアシル化により保護されていてもよい。このような保護基は、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）、ＣＨ₃ＣＯおよびＡｒ−ＣＯ（Ａｒ＝ベンジル、またはフェニル）である。Ｃ−末端は、天然のアミノ酸のように、カルボキシであってもよく、またはカルボキシアミド−Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂またはヒドロキシメチル（−ＣＨ₂−ＯＨ）である。好ましい化合物は：Ａがピログルタミン酸、ピコリン酸、プロリン、チロシン、またはピペコリン酸であり；Ｂがグルタミン酸、セリン、アスパラギン酸またはチロシンであり；Ｃがアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンまたはリシンであり；Ｄがリシン、またはそのカルボキシアミド誘導体、アルギニン、Ｎ−メチルアルギニン、２，６−ジアミノ−４−ヘキシン酸、アスパラギン酸またはオルニチンであり；Ｅが結合であり；Ｙ₁およびＹ₂がＣＨ₂であり；ｘが０または２であり；ｍおよびｎが０である化合物である。さらに好ましい化合物は：Ａがピログルタミン酸、プロリンまたはピコリン酸であり；Ｂがグルタミン酸、アスパラギン酸またはセリンであり；Ｃがアスパラギン酸またはグルタミン酸であり；Ｄがリシン、またはそのカルボキシアミド誘導体であり；Ｅが結合であり；Ｙ₁およびＹ₂がＣＨ₂であり；ｘが０または２であり；キラルアミノ酸がＬ絶対配置の化合物である。特に好ましいのは以下のとおりである： (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ｓｕｂ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］ (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：６］ (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ)₂Ｓｕｂ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：７］ (ｐＧｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ)₂Ｓｕｂ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：８］ (Ｐｉｃ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ｓｕｂ（Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：９］ (Ｌ−Ｐｐｃ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ｓｕｂ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１０］ (ｐＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ)₂Ｓｕｂ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１１］ (ｐＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１２］ (ｐＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｌｙｓ−ＮＨ₂)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１３］ (Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｌｙｓ)₂［ＳＥＱＩＤＮＯ：１４］ (Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｌｙｓ−ＮＨ₂)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１５］ (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｔｙｒ−Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１６］ (Ｐｉｃ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１７］ (ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ｓｕｂ(Ｌｙｓ−ＮＨ₂)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１８］ (Ｐｉｃ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ａｄｐ(Ｌｙｓ−ＮＨ₂)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１９］前記ペプチドのうち、(ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］がもっとも好ましい。これらのペプチドは前記の固相または溶液相技術により調製される。本発明のこの方法は、予めＨＳＦ誘発剤を投与した哺乳動物由来の体液のサンプルを本発明の抗体と接触させることからなる。好ましい体液は、血液、血漿および血清である。しかし、他の適当なサンプルは容易に決定できる。抗体を用いてＨＳＦのレベルを測定する。ＨＳＦ誘発剤投与後の循環ＨＳＦレベルをベースラインレベルまたはＨＳＦ誘発剤投与前の循環ＨＳＦレベルと比較する。誘発されたＨＳＦレベルの測定結果より、選択された試薬の薬効を決定し、必要に応じて処理をモニターし調節できる。例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗−デスアミノ−ｇｒｏ−α抗体を、例えば(ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂により誘発されたＨＳＦのレベルを検出する検定において試薬として用いるのが望ましい。適当な検定様式は当該分野で周知である。しかしながら、現在、好ましい様式は、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）である。本発明の抗体は個々の標識と結合し、１個以上の抗体を診断法において用いる場合、該標識は検出可能なシグナルを産生するように相互作用性であるのが望ましい。最も望ましくは、標識は視覚的に、例えば比色により検出できるものである。本発明の診断法において有用な抗体への結合に関する検出可能な標識も診断検定の分野における当業者により容易に選択できる。視覚的に検出可能な標識は、シグナルの迅速性およびその解読の容易性により臨床的応用において好ましく用いられる。比色検出については、種々の酵素系が当該分野において記載されており、適切に操作される。比色酵素系は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を包含する。他の関連する酵素系は当業者に公知であり、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼとの関連でヘキシオキナーゼが含まれる。また、生発光または化学発光は、それぞれ、ルシフェラーゼおよび基質ＮＡＤＨおよびＦＭＮと一緒にＮＡＤオキシドリダクターゼおよびルミノールおよび基質ペルオキシドと一緒にペルオキシダーゼを用いて検出できる。用いることができる他の通常の標識系は蛍光化合物、放射性化合物または元素、または免疫電極を包含する。これらおよび他の適切な標識系およびこれらを抗体またはペプチドとカップリングさせる方法は当業者には公知である。本発明はまた血流中のＨＳＦの循環レベルをモニターできるようにする診断キットを提供する。このようなキットは、十分な量の少なくとも１つの本発明の修飾ケモカインまたは少なくとも１つの本発明の抗体を有し、このような成分は検定の実施に必要である。かかる検定は一般的であり、必要な試薬およびこのようなキットの他の成分は当業者には周知である。本発明により、例えば(ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］を投与することによりin vivoでＨＳＦを誘発させる方法も提供される。一般に、本明細書において記載するこのまたは他の選択されたペプチドを、一日当たり体重７０ｋｇに付き０.５ｎｇないし１ｍｇの範囲、好ましくは５〜５００ｎｇの範囲の用量で注射するか、または５０ｎｇないし５ｍｇ、例えば０.０１ｍｇないし１ｍｇの範囲の用量で経口投与する；注入または類似の技術により投与する場合、用量は体重７０ｋｇにつき０.００５ｎｇないし１ｍｇの範囲、例えば約０.０３ｎｇを６日間にわたって投与する。ペプチド濃度が患者の細胞外液中約１０^-15Ｍないし１０^-5Ｍの濃度になるようにするのが望ましい。有利には、ペプチドを医薬組成物中の活性成分または生理学的に相溶性のその塩として投与する。ペプチドまたは塩を医薬担体または賦形剤と組合わせてもよい。本発明の組成物は、例えば経口、経鼻、非経口または経直腸投与に適した形態にて投与してもよい。適当な担体および賦形剤は周知であり、当業者により容易に決定できる。ペプチドを含有する投与単位は、好ましくは０.１〜１００ｍｇ、例えば１〜５０ｍｇの式（Ｉ）のペプチドまたはその塩を含有する。以下の実施例で本発明の修飾および切断ケモカインの好ましい製法を説明する。これらのケモカインの強化された生物活性をこれらが由来のケモカインと比較した比較例も示す。実施例９ないし１６は本発明の方法において用いるペプチドの合成法を説明する。これらの実施例において、すべての温度は摂氏である。アミノ酸分析は、ジオネックス・オートイオン１００（Dionex Autoion 100）で行った。ペプチド含量分析はアミノ酸分析に基づく。ＦＡＢ質量分析は、高速原子衝撃を用いるＶＧＺＡＢ質量分析器で行った。これらの実施例は単なる例示であって、本発明の範囲をなんら限定するものではない。実施例１−デスアミノＫＣの合成修飾ネズミＫＣ蛋白質、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される成熟ＫＣ蛋白質のアミノ酸配列＃５〜７２の合成に用いる方法は、以下のとおりである。ＫＣ蛋白質配列を全自動式蛋白質合成器（アプライド・バイオシステムズ・モデル・４３０Ａ（Applied Biosytems Model 430 A）に適合する固相法を用いて合成した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＰＡＭ樹脂（０.７５ｇ、０.５ミリモル）を反応容器に装填し、製造業者の指示に従い、目的とする蛋白質を２ミリモルのＮ^a−ｔ−Ｂｏｃアミノ酸を用いて合成した。カップリング反応を２回行い、つづいて無水酢酸でＮ−キャップに付した。立体障害のある残基は３回目にカップリングされた。以下の側鎖保護基を用いた：ベンジル（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ）；４−メチルベンジル（Ｃｙｓ）；トルエンスルホニル（Ａｒｇ）；２−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｌｙｓ）；ジニトロフェニル（Ｈｉｓ）；シクロヘキシル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）。ある種の困難な配列のカップリング収率をカイザーテストによりモニター観察した。合成完了後、蛋白質−樹脂をＤＣＭで洗浄し、乾燥した。蛋白質−樹脂の一部（０.２ｇ、０.０１７ミリモル）をＤＭＦ−ＢＭＥ−ＤＩＥＡ（７５：２０：５）で４×３０分処理して、Ｈｉｓ残基を脱保護し、ＤＭＦおよびＤＣＭでよく洗浄した後、ＤＣＭ中５０％ＴＦＡで２０分間処理することによりＮ^a−ｔ−Ｂｏｃ基を除去した。蛋白質をさらに脱保護し、−５℃で１時間、アニソール（０.５ｍｌ）、ジメチルスルフィド（０.５ｍｌ）およびｐ−チオクレソール（０.１ｇ）の存在下でＨＦ（５ｍｌ）を用いて樹脂から切断した。ＨＦを蒸発させ、蛋白質−樹脂の混合物を５％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）含有のエーテルで洗浄した。６ＭグアニジンＨＣｌ／０.１ＭＨＯＡｃ（３０ｍｌ）を用いて蛋白質を樹脂から抽出した。粗蛋白質の一部（１.７５ｍｌ、〜６.６ｍｇ）をまず分取用サイズ排除カラム（Beckman ＴＳＫ３０００ＳＷ）上でリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）緩衝液を用いて、流速２ｍｌ／分で、次にＣ−１８Ｖｙｄａｃ分取用カラム上で、アセトニトリル−水（０.１％ＴＦＡ）緩衝液系を用いて、流速５ｍｌ／分で精製した。０.３６ｍｇの精製蛋白質を得た。アミノ酸分析および高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢＳ−ＭＳ）により構造を確認した。ＦＡＢ−ＭＳ：［ＭＨ＋］ｍ／ｚ：７４５７.４ａ.ｍ.ｕ.、ＭＨ＋は正に荷電した質量イオンを表わす：ｍ／ｚは質量／電荷であり、ａ.ｍ.ｕ.は原子質量単位である。アミノ酸分析：化学的に合成したおよび自然の精製完全長ＫＣは共に相乗因子として不活性である。本発明に従って化学的に合成した調製デスアミノＫＣは有効な相乗因子である。実施例２−ネズミデスアミノＫＣの発現用のプラスミド構築物完全長ネズミＫＣをコードする一部のｃＤＮＡクローンをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、ロックビル、メリーランド州（ＡＴＣＣＮｏ.３７５９１）から入手した。４２２ｂｐのＴｆｉＩ−ＨｉｎｃIIフラグメント（ｂｐ１２５〜５５３）をこのｃＤＮＡクローンから単離した。（すべての塩基対およびアミノ酸番号は、ジンバンク（登録ｂｐ７４〜１２４からなるリンカーを、常套手段に従って、３’末端をＴｆｉＩでオーバーハングし、５’末端をＨｉｎｄIIIでオーバーハングして合成した。ＮｄｅＩ部位を５’末端に組み込んで、ＫＣ生成物でのフレームにあるＭｅｔコドンを生成した。リンカーおよびＫＣフラグメントを、ＨｉｎｄIIIおよびＨｉｎｃIIで切断したｐＵＣ１８［ＡＴＣＣ１５７５２−Ｂ１］と結紮して、ｐＭＫＣを得た。ｐＭＫＣはＮ末端Ｍｅｔを添加した完全成熟ＫＣ遺伝子生成物（ａａ２５〜９６）をコードする。ＫＣおよびその誘導体のすべてのイー・コリ発現を、プラスミドｐＥＡ１９１ｋｎ［スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham）］を用いて行った。ｐＥＡ１９１ｋｎは（１）Ａｍｐ耐性遺伝子の一部を除去し、これをカナマイシン耐性遺伝子と置換し、（２）λｒｅｘＢ遺伝子を挿入し、これを操作してＰ_Lプロモーターの上流にある内因性ＮｄｅＩ部位を除去することにより得られるｐＳＫＦ３０１［シャッツマン（Shatzman）ら、「エクスプレッション・ユージング・ベクターズ・ウィズ・ファージ・ラムダ・レギュレイトリー・シーケンシズ（"Expression Using Vectors with Phage λ Reguratory Sequences"、カーレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）、エフ・エイ・アウスベル（F.A. Ausubel）ら編、ｐｐ１６.３.１−１６.３.１１（１９９０）］の誘導体である。完全長成熟ＫＣ（Ｎ−末端Ｍｅｔを加えた）の発現については、Ｎ−末端Ｍｅｔを加えたアミノ酸２５−終止コドンをコードするＮｄｅＩ−ＳｓｐＩフラグメントをｐＭＫＣから単離し、ＮｄｅＩおよびＨｐａＩで切断したｐＥＡ１８１ｋｎ中にサブクローンした。得られたクローンをｐＥＡ１／ｍｋｃ１９（ｗｔ）と称した。デスアミノ形のＫＣを得るために、３２２ｂＰのＰｓｔＩ−ＳｓｐＩフラグメント（ｂｐ１１２〜４３４）をｐＭＫＣ（前記）から単離した。ｂｐ８６〜１１１からなるリンカーを、３’末端をＰｓｔＩで融和的にオーバーハングし、５’ 末端をＮｃｏＩでオーバーハングして合成した。ＮｄｅＩ部位を５’末端に組み込み、ＫＣ遺伝子生成物でのフレームにあるＮ−末端Ｍｅｔを得た。フラグメントおよびリンカーをｐＥＡ１８１ｋｎに結紮し、ＮｃｏＩおよびＨｐａＩで切断した。デスアミノＫＣ遺伝子がＮＳＩ遺伝性生成物と融合して得られるクローンをｐＥＡ１−ＮＳ１／ｍｋｃ２１（−４）と称した。融合したＮＳ１部分を除去するために、ｐＥＡ１−ＮＳ１／ｍｋｃ２１（−４）をＮｄｅＩで切断し、再び結紮した。得られたクローンをｐＥＡ／ｍｋｃ３８（−４）と称した。ｐＥＡ／ｍｋｃ１８（ｗｔ）およびｐＥＡ／ｍｋｃ３９（−４）はナリジクス酸で誘発されて、各々、完全長（Ｎ−末端Ｍｅｔを添加したアミノ酸２５）およびデスアミノ（Ｎ−末端Ｍｅｔを有するアミノ酸２９）を発現した。誘発のために、プラスミド構築物で形質転換したイー・コリＡＲ１２０細胞［スミスクライン・ビーチャム（Smith Kline Beecham）］を、旋回式振盪器中、３７℃で２５０〜３００ｒｐｍでＡＤ₆₅₀＝０.４〜０.６まで増殖させた。６０ｍｇ／ｍＬナリジクス酸（１ＮＮａＯＨ中）の体積の１０００分の１を添加して、最終濃度を６０μｇ／ｍＬにした。培養物を４〜５時間増殖させ、収穫した。細胞を溶解させ、粗溶解産物を以下の造血相乗因子（ＨＳＦ）活性についての実施例８の記載に従って試験した。実施例３−イー・コリにおけるネズミデスアミノＫＣの発現ネズミ完全長およびデスアミノＫＣを前記実施例２の記載に従ってサブクローンしてｐＥＡ１８１ｋｎにし、これを誘発可能なＰ_Lプロモーターの制御下にバクテリオファージλから発現させた。デスアミノ構築物、ｐＥＡ１／ｍｋｃ３８（−４）をナリジクス酸で誘発し、６９アミノ酸蛋白質（アミノ末端にメチオニンを添加した成熟ＫＣのアミノ酸２９〜９６）を産生させた。デスアミノＫＣ生成物は可溶性で、以下の実施例８に記載した造血相乗活性分析において粗細菌溶解産物として分析した場合、相乗活性を示す。ｐＥＡ１／ｍｋｃ１８（ｗｔ）のナリジクス酸誘発により産生された７３アミノ酸蛋白質もまた可溶性であるが、ＤＰＰＩＶで消化して切形の蛋白質としなければ相乗活性を示さない。ＧＭ−ＣＳＦ（２０Ｕ）と合したデスアミノ−ＫＣは、約１０¹⁴Ｕの活性に相当する、約４０〜５０コロニーの細胞を生じさせた。実施例４−デスカルボキシ−ＫＣの合成天然完全長およびデスアミノＫＣ形態をネズミ繊維芽細胞系、Ｃ６［スミスクライン・ビーチャム］上清からヘパリン−アガロースアフィニティークロマトグラフィー、続いて逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。デスカルボキシ−ＫＣを調製するために、前記のように精製した天然完全長ＫＣをカルボキシペプチダーゼＹで消化して、理論的に完全長ＫＣ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］のアミノ酸１〜６８であるデスカルボキシ−ＫＣを形成させた。天然完全長ＫＣと対照的に、このデスカルボキシ−ＫＣは相乗因子として活性である。実施例５−デスアミノ−ｇｒｏ−βの調製組み換え完全長ｇｒｏ−β（所望により、市販品から得られる）をＤＰＰＩＶ酵素［エンザイム・プロダクト・システムズ・インコーポレイション（Enzyme Product Systems,Inc.）］で消化して、完全長ヒトｇｒｏ−β［ＳＥＱＩＤＮＯ：３］のアミノ酸５〜６８に及ぶ、デスアミノｇｒｏ−β蛋白質を形成させた。完全長ｇｒｏβは造血相乗活性検定において相乗活性を示さない（０単位／ｍｇ）。溶解産物をＤＰＰＩＶで消化し、切形の蛋白質を産生することで、溶解産物において著しいレベルの相乗活性が得られる；実施例８の試験において、短期間だけ消化した場合、特にこの活性は約１０⁸単位である。消化の期間を長くするとより高い活性が期待できる。実施例６−ヒトデスアミノｇｒｏβの発現用のプラスミド構築物以下の記載において、ヒトｇｒｏβについてのすべてのアミノ酸および塩基対番号は、ジンバンクにて得られる配列（受入番号Ｍ５７７３１）をいう。完全長の成熟ヒトｇｒｏβ蛋白質をコードする遺伝子（アミノ酸３４〜１０６、ｂｐ１７２〜３９３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対応するＮ−末端メチオニンを添加）を合成し、ｐＣＲ２０００［スミスクライン・ビーチャム］にサブクローンした。得られたクローンをｐＨｇｒｏβと称した。５’ＮｄｅＩおよび３’Ｈｐａｌ部位が合成遺伝子中に含まれ、その後のサブクローニングを簡素化した。イー・コリ発現について、完全な成熟蛋白質（Ｎ−末端Ｍｅｔを添加）をコードするＮｄｅＩ−ＨｐａＩフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＨｐａＩで切断された、前記したｐＥＡ１８１Ｋｎ中にサブクローンした。得られたクローンをｐＥＡ１／ｈｇｒｏβ（ｗｔ）と称した。このクローンは、前記したようにナリジクス酸で誘発され、完全長の成熟ｇｒｏβ蛋白質（Ｎ−末端Ｍｅｔを添加）に対応する７４アミノ酸生成物を産生することができる。デスアミノ形のヒトｇｒｏβを以下のようにして構築した。１７６ｂｐのＰｓｔＩ−ＨｐａＩフラグメントをｐＨｇｒｏβから単離し、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩリンカー（Ｎ−末端メチオニンを添加した、アミノ酸３９〜４９をコードする）でＮｄｅＩ／ＨｐａＩ切断ｐＥＡ１８１ｋｎ中に結紮した。得られたクローンをｐＥＡ１−Ｈｇｒｏβ（−４）と称する。図６はこのプラスミドのＤＮＡ地図である。ｐＥＡ１−ｈｇｒｏβ（−４）を前記のようにナリジクス酸で誘発し、活性蛋白質のアミノ末端で４個のアミノ酸で切断される、７０アミノ酸のｇｒｏβ蛋白質を産生した（Ｎ−末端Ｍｅｔを添加したアミノ酸３９〜１０６）。実施例７−イー・コリにおけるヒトデスアミノｇｒｏ−βの発現ヒトｇｒｏβ（ＭＩＰ２α）遺伝子を合成し、実施例において前記した、イー・コリ発現ベクターｐＥＡ１８１ｋｎｚにサブクローンし、ここでこれを誘発可能なバクテリオファージλ由来のＰ_Lプロモーターの制御下に発現させる。ナリジクス酸での誘発に付し、７４アミノ酸蛋白質を得た（Ｎ−末端メチオニを添加したアミノ酸３５−終止コドン）。この組み換えｇｒｏβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸５〜７３）は、実施例８の検定において１０¹⁴単位の活性を有することが判明した。実施例８−造血相乗因子活性検定すべての修飾ケモカインを以下の従来の検定法にてスクリーンし、その修飾ケモカインかコロニー刺激因子（ＣＳＦ）に関する相乗活性により特徴付けられるかどうか、すなわち、ケモカインとコロニー刺激因子の組み合わせが２つの蛋白質の相加効果を越えるかどうかを決定する。ネズミ骨髄細胞を収穫し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有するＲＰＭＩ１６４９に懸濁させた。骨髄細胞を最適下限濃度の組み換えネズミ顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−ＣＳＦ（２０Ｕ／ｍｌ）および試験化合物の希釈体と一緒に標準的ネズミＣＦＵ−ＧＭ軟寒天検定にて培養する。所望により、別のＣＳＦ源としてＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−３（低Ｏ₂条件）を用いることができる。２０単位のＧＭ−ＣＳＦと一緒に培養した骨髄細胞は、約２０〜３０コロニーの細胞の増殖をもたらす（基底値）。通常どおり、１単位（Ｕ）は基底値より約１コロニー多いことに相当する。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ（２０Ｕ／ｍｌ）と結合したデスアミノ−ＫＣは、約４０〜５０コロニーの細胞をもたらし、これを約１０¹⁴Ｕ／ｍｇの比活性に翻訳した。合成ｇｒｏα（アミノ酸５〜７３）もまた１０¹⁴Ｕ／ｍｇの比活性を有することを特徴とする。不純物を含有している可能性のある市販のケモカインを用いた場合でも、本発明の方法により活性が増加する。例えば、以下の結果は、短縮した消化期間で得られた。市販のｇｒｏβ ２×１０⁴Ｕ＋ＤＰＰＩＶ消化１×１０⁶Ｕ市販のｇｒｏγ ２×１０³Ｕ＋ＤＰＰＩＶ消化５×１０⁵Ｕ消化期間を長くし、合成的に生成されたケモカインで活性がより劇的に増加すると考えられる。実施例９− (ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｐｉｍ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２０］の調製０.５ｇのｔ−ＴＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＯＣＨ₂−Ｐａｍ樹脂（０.６３ミリモル／ｇ）をベックマン９９０Ｂ合成器の反応容器内に入れた。脱保護工程で、ｔ−Ｂｏｃ基を、塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）中４０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて除去し、ＣＨ₂Ｃ₁₂でリンスした。トリフルオロ酢酸塩を１０％ＤＩＥＡ／ＣＨ₂Ｃ₁₂で中和した。２ｍＭ（７８０ｍｇ）のジ−Ｂｏｃ−２,６ −ジアミノピメリン酸を２ｍＭのＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いてカップリングした。カップリングを、１５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂および１０ｍｌのＤＭＦの混合液中、室温で２時間行った。カイザー（Kaiser）試験を用いてカップリングをモニターした。残存する遊離カルボキシル基を、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（２５ｍｌ）（１５／１０）中、３ｍＭのＨ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ・ＨＣｌ（１．６５ｇ）、３ｍＭのＤＣＣおよび３ｍＭのＨＯＢＴを用いて２回アミド化した。２時間カップリングした後、樹脂を１５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で２回、１５ｍｌのＤＭＦで２回、１５ｍｌのＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１）で２回、最後に１５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で２回洗浄した。４０％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いてｔ−Ｂｏｃを除去し、１０％ＤＩＥＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いて中和した後、２ｍＭ（０.６４６ｇ）のＢｏｃ−Ａｓｐ（Ｂｚｌ）および２ｍＭのＤＣＣおよび２ｍＭのＨＯＢＴを添加し、２５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（１５／１０）中にて２時間カップリングした。ついで、該樹脂をすでに記載したように洗浄工程に付した。２ｍＭ（０.６４６ｇ）のＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｂｚｌ）、２ｍＭのＤＣＣおよび２ｍＭのＨＯＢＴを２５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（１５／１０）中でカップリングする前に、脱保護工程および中和工程を繰り返した。洗浄、脱保護および中和工程に付した後、樹脂を洗浄工程に付す前に、２ｍＭ（０.２５８ｇ）のｐＧｌｕ、２ｍＭのＤＣＣおよび２ｍＭのＨＯＢＴをＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（１５／１０）（２５ｍｌ）中に２時間カップリングさせた。カップリングの完了をカイザー試験によりモニターし、各工程では１回のカップリングのみが必要であった。合成完了後、樹脂を乾燥させ、秤量した。収量：１.２ｇ。ペプチド樹脂（１.２ｇ）を開裂装置中に入れ、１０ｍｌのフッ化水素酸（ＨＦ）および１ｍｌのアニソールを用いて−１５℃で２時間切断した。真空下でＨＦを除去した後、樹脂およびペプチドの混合物をエーテルでよく洗浄し、ペプチドを氷酢酸（３０ｍｌ）で抽出した。大部分の酸をローターバップ（rotavap）上で抽出物から除去し、残渣を水中に希釈し、凍結乾燥した。酢酸抽出物は８１０ｇの粗ペプチドを有した。酢酸抽出から得られた粗ペプチド（８０ｍｇ）を分取用Ｃ−１８カラムを用いてさらに精製した。これを予め平衡化した（０.１％ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ）カラムを通した。ペプチドを、線状勾配の８０％アセトニトリル、２０％Ｈ₂Ｏおよび０.１％ＴＦＡを用いて溶出した。３種の異性体が同時に溶出された（８.５２分）。これらの異性体を、Ｃ−１８カラム上、３０％（ＣＨ₃ＣＮ中０.１％ＴＦＡ）および７０％（Ｈ₂Ｏ中０.１％ＴＦＡ）ないし８０％（ＣＨ₃ＣＮ中０.１％ＴＦＡ）および２０％（Ｈ₂Ｏ中０.１％ＴＦＡ）を用い、３５分間にわたって、流速１.５ｍｌ／分で分離した。以下のフラクションが溶出された：フラクション１：１８.６９分フラクション２：１９.６８分フラクション３：２２.９５分アミノ酸分析により以下の結果が得られた：アミノ酸分析測定値Ｇｌｕ１.９９Ａｓｐ１.０Ｌｙｓ１.０５ビスアミノピメリン酸Ｎ.Ｄ．質量分析＝１１５７.５（Ｍ＋Ｈ）⁺ 実施例１０− (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｌａｎ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２１］の調製［Ｌａｎ＝ランチオニン（ＳＣＨ₂ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ）］０.５ｇのｔ−ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＣＨ₂−ＰＡＭ（０.６３ミリモル／ｇ）をベックマン９９０Ｂ合成器の反応容器内に入れる。ｔ−ＢＯＣ基を、塩化メチレン中４０％ＴＦＡを用いて除去する。トリフルオロ酢酸塩を１０％ＤＩＥＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で中和する。２ｍＭのビスＢｏｃランチオニンを、１５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂および１０ｍｌのＤＭＦ中の４ｍＭのＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いて室温でカップリングする。カイザー試験を用いてカップリングをモニターする。残存する遊離カルボキシル基を、２５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（１５／１０）中の３ｍＭのＨ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ・ＨＣｌ；および３ｍＭのＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いてアミド化する。カップリング樹脂をＣＨ₂Ｃｌ₂、３０％ＭｅＯＨ−ＣＨ₂Ｃｌ₂、およびＣＨ₂Ｃｌ₂（２５ｍｌ×３）でよく洗浄し、目的のペプチド中に残存するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ｐＧｌｕ）について、脱保護、中和およびカップリングのサイクルを繰り返す。４ｍＭの各アミノ酸、ＤＣＣおよびＨＯＢＴを各カップリングに用いる。各カップリングをカイザー試験によりモニターする。合成完了後、樹脂を乾燥し、秤量する。ペプチド樹脂を開裂装置中に入れ、１０ｍｌのフッ化水素酸（ＨＦ）および１ｍｌのアニソールを用いて−１５℃で２時間切断させる。ＨＦを除去した後、樹脂をエーテルでよく洗浄し、ペプチドを氷酢酸（３０ｍｌ）で抽出する。酢酸の大部分をローターバップで除去し、残渣を水中に希釈し、凍結乾燥する。ＨＰＬＣで精製後、ペプチドを得る。実施例１１− (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｐｉｍ−(Ａｒｇ−ＣＯＮＨ₂)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２２］の調製０.５ｇのＢＯＣ−ＴｏｓＡｒｇ−ＢＨＡ樹脂（０.５ミリモル／ｇ）をベックマン９９０Ｂ合成器の反応容器内に入れる。ＢＯＣ基を、塩化メチレン中４０％ＴＦＡを用いて除去する。トリフルオロ酢酸塩を１０％ＤＩＥＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ により中和する。１ｍＭのビスＢｏｃピメリン酸を、１５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂および１０ｍｌのＤＭＦ中の２ｍＭのＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いて室温でカップリングする。カイザー試験を用いてカップリングをモニターする。残存する遊離カルボキシル基を、２５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ（１５／１０）中の３ｍＭのＨ −Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ・ＨＣｌ；および３ｍＭのＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いてアミド化する。カップリングした後、樹脂をＣＨ₂Ｃｌ₂、３０％ＭｅＯＨ−ＣＨ₂Ｃｌ₂、およびＣＨ₂Ｃｌ₂（２５ｍｌ×３）で洗浄する。脱保護、中和およびカップリングのサイクルを、目的のペプチド中に残存するアミノ酸（Ａｓｐ、ＧｌｕおよびｐＧｌｕ）について繰り返す。３ｍＭのアミノ酸、ＤＣＣおよびＨＯＢＴを各カップリングに用いる。各カップリングをカイザー試験によりモニターする。合成完了後、樹脂を乾燥し、秤量する。ペプチド樹脂を開裂装置中に入れ、１０ｍｌのフッ化水素酸（ＨＦ）および１ｍｌのアニソールを用いて−１５℃で２時間切断する。ＨＦを除去した後、樹脂をエーテルでよく洗浄し、ペプチドを氷酢酸（３０ｍｌ）で抽出する。酢酸の大部分をローターバップ上で除去し、残渣を水中に希釈し、凍結乾燥する。ＨＰＬＣによる精製後、ペプチドを得る。実施例１２− チロシン含有類似体の合成 (Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２３］； (ｐＧｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２４］； (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２５］； (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２６］２ｇのＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｏ−樹脂（ペニンスラ・ラボ（Peninsul a Labs）、置換０.４９ｍＭ／ｇ）を手動式振盪容器内に入れた。脱保護および中和段階後、２ｍＭ（８０８ｍｇ）のジ−ＢＯＣジアミノスベリン酸を２５ｍｌの５０％Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）中の４ｍＭ（８２４ｍｇ）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４ｍＭ（６１２ｍｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）を用いて樹脂にカップリングした。反応を一夜進行させ、続いて１０ｍＭ（４.０６ｇ）のＨ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ・ＨＣｌ、１０ｍＭ（１.２９ｇ）のジイソプロピエチルアミン（ＤＩＥＡ）、１０ｍＭ（２.０６ｇ）のＤＣＣおよび１０ｍＭ（１.５３ｇ）のＨＯＢＴを添加した。２時間後、未反応アミノ基をＮＭＰ／ＤＣＭ（１：１）中１０％無水酢酸を用いてキャップした。得られたＢＯＣ−Ｓｕｂ−Ｌｙｓ−樹脂の約３分の一を別の反応容器に移した。樹脂の主要フラクションをフラクションＩとし、副フラクションをフラクションIIと称する。標準的脱保護、中和およびカップリングのサイクルを用いてＢＯＣ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＢｚ）、ＢＯＣ−Ｂｌｕ（ＯＢｚ）、およびｐ− ＧｌｕをフラクションII中の樹脂にカップリングさせた。５ｍＭのアミノ酸、ＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いた。カップリングを２５ｍｌのＮＭＰ／ＤＣＭ（１／１）中で行い、カイザー試験を用いて完了をモニターした。５ｍＭのＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＢｚ）をフラクションＩ中の樹脂にカップリングした。得られたＢＯＣ−Ａｓｐ−（ＯＢｚ）Ｓｕｂ−Ｌｙｘ（Ｃｌ−Ｚ）樹脂の４分の１を別の容器に移した（フラクションIII）。残存する樹脂をフラクションＩＶと称する。標準的脱保護、中和およびカップリングのサイクルを用いて、ＢＯＣ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）、およびｐ−ＧｌｕをフラクションIII中の樹脂にカップリングさせた。５ｍＭのアミノ酸、ＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いた。カップリングを２５ｍｌのＮＭＰ／ＤＣＭ（１／１）中で行い、カイザー試験を用いて完了をモニターした。５ｍＭのＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）を主フラクション（フラクションＩＶ）中の樹脂にカップリングした。この樹脂の３分の１を別の容器に移し、５ｍＭのｐ−Ｇｌｕをこのフラクション（フラクションＶＩ）にカップリングし、ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｕｂ−Ｌｙｓ−樹脂を合成した。５ｍＭのＢＯＣ−Ｔｒｙ（Ｂｒ−Ｚ）を主フラクション（フラクションＶ）にカップリングし、樹脂をさらに半分に分けた。樹脂の２分の１をそのまま保存し、樹脂（フラクションＶＩＩ）の残りの半分に５ｍＭのｐ−Ｇｌｕをカップリングしてｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｕｂ−Ｌｙｓ−樹脂を合成した。これらの樹脂ペプチドを脱保護し、ＨＦ／アニソールを用いて０℃で１時間切断した。粗ペプチド（約１００ｍｇ）をＣ−１８ＶＹＤＡＣ２.５ｃｍ× ３０ｃｍ分取用カラム上で、水／０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、およびアセトニトリル／０.０１％ＴＦＡの緩衝液系を用いて精製した。実施例１３− (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ｐｒｃ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２７］の調製ａ．ビスＢＯＣ−Ｓ,Ｓ'−１−３−プロパンジイルシステインの合成３ｍｌのメタノールを乾燥アンモニアで飽和させ、メタノール（０.５ｍｌ）中のＢＯＣ−システイン（０.５ｇ）を添加し、続いて１,３−ジブロモプロパン（０.３５ｍｌ）を添加した。１０分後、さらにメタノール（０.５ｍｌ）中のＢＯＣ−システイン（０.５ｇ）を添加した。４.５時間後、溶媒を蒸発させ、油状残渣を水中に溶かした。溶液のpＨを９に調節し、該溶液をエーテルで抽出した。水層をpＨ２の酸性にし、酢酸エチルで抽出した。有機層を乾燥し、蒸発させて１.１２ｇのビスＢＯＣ−Ｓ,Ｓ−１,３−プロパンジイルシステインを得た。アミノ酸をさらに精製せずに用いた。ＦＡＢ／ＭＳＭ＋Ｈ＝４６９。ｂ．(ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂Ｐｒｃ(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２７］の調製ＢＯＣ−Ｌｙｓ樹脂（０.５３ｇ、置換０.６３ｍＭ／ｇ）を手動式振盪器中に入れ、脱保護および中和のサイクルの後、ビスＢＯＣ−Ｓ,Ｓ'−１,３−プロパンジイルシステイン（２９０ｍｇ、０.６ｍＭ）をＮＭＰ／ＤＣＭ（１／１）（１０ｍｌ）中の１ｍＭ（２０６ｍｇ）ＤＣＣおよび１ｍＭ（１５３ｍｇ）ＨＯＢＴを用いてカップリングした。２時間後、樹脂をＮＭＰおよびＤＣＭで洗浄し、２ｍＭ（７６５ｍｇ）のＨ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ・ＨＣｌを添加し、つづいてＮＭＰ／ＤＣＭ（１／１）（４ｍｌ）中の１.５ｍＭ（３９０ｍｇ）のＤＣＣおよび１.５ｍＭ（２３０ｍｇ）のＨＯＢＴを添加する。１８時間後、樹脂をＮＭＰおよびＤＣＭ（２０ｍｌ）を用いて洗浄した。ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＢｚ）、ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）およびｐ−Ｇｌｕのカップリングのために標準的脱保護、中和およびカップリングのサイクルを繰り返した。１ｍＭのアミノ酸、ＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いた。カップリングを５ｍｌのＮＭＰ／ＤＣＭ（１／１）中で行った。カップリングの完了をカイザー試験でモニターした。得られた樹脂ペプチド（４１６ｍｇ）を脱保護し、０.５ｍｌのアニソールおよび８ｍｌのＨＦを用いて０℃で２時間切断する。ＨＦを蒸発させ、ペプチド樹脂混合物をエーテルで洗浄し、氷酢酸で抽出した。凍結乾燥後、１３０ｍｇの粗ペプチドを得た。粗ペプチド（６１.５ｍｇ）を、Ｃ１８ＶＹＤＡＣ分取用カラム上、アセトニトリル−水（０.１％ＴＦＡ）緩衝液系を用いて精製した。１６.５ｍｇの純粋ペプチドを得た。ＦＡＢ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ１２４９.３アミノ酸分析Ａｓｐ２.０（２）Ｇｌｕ４.２８（４）Ｄｐｃ１.１４Ｌｙｓ１.９６（２）実施例１４− 以下の化合物の合成： ((ｄ)−ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２８］； (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：７］； (ｐＧｌｕ−(ｄ)−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２９］； (ｐＧｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：８］；０.５ｇのｔ−ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃｌ-Ｚ）−ＯＣＨ₂−Ｐａｍ樹脂（０.６３ミリモル／ｇ）を手動式振盪容器内に入れた。脱保護の工程において、ＢＯＣ基を塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）中４０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて除去した。トリフルオロ酢酸塩を１０％ＤＩＥＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂により中和した。脱保護および中和工程の後、ジ−ＢＯＣ−２,６−ジアミノスベリン酸（０.１６ｍＭ、６６.２ｍｇ）を０.３１５ｍＭのＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いてカップリングした。カップリングは、５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂および５ｍｌのＤＭＦの混合液中、室温で４日間行った。カイザー試験をカップリングをモニターするのに用いた。未反応アミノ基を１０％無水酢酸／ＤＭＦ溶液を用いてキャップした。ついで、標準的脱保護、中和およびカップリングのサイクルを行い、目的とする配列を構築した。３ｍＭのアミノ酸、ＤＣＣおよびＨＯＢＴを用いた。カップリングの時間は４時間であった。カップリングの完了をカイザー試験によりモニターし、各工程では１回のカップリングのみを要した。ペプチド樹脂を開裂装置に入れ、１０ｍｌのフッ化水素酸（ＨＦ）および１ｍｌのアニソールを用いて−１５℃で２時間切断した。真空下でＨＦを除去した後、樹脂およびペプチドの混合物をエーテルでよく洗浄し、ペプチドを０.１％ＴＦＡに抽出し、凍結乾燥した。精製および特性化：粗ペプチドを分取用Ｃ−１８カラムを用いて精製した。カラムを９９.９％水および０.１％ＴＦＡ中で予め平衡化し、ペプチドを８０％アセトニトリル、２０％水および０.１％ＴＦＡの線状勾配を用いて溶出した。ペプチドをアミノ酸組成について分析した。分子量をＦＡＢＭＳを用いて測定した。ＦＡＢおよびアミノ酸分析：ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋Ｈ１１７１.５）アミノ酸分析：Ａｓｐ１.９８（２）、Ｇｌｕ４.６（４）およびＬｙｓ２（２）ＨＰＬＣ純度＞９５％実施例１５− (Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ)₂−Ａｄｐ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：１４］の調製ａ．ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−樹脂の合成Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）［１６.６ｇ、４０ミリモル］をＭｅＯＨ中１０％Ｈ₂Ｏ（１５０ｍｌ）中に溶解した。溶液を１ＭＣｓＣＯ₃溶液（４０ｍｌ）を用いて中和した。中和した溶液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られたセシウム塩をＤＭＦで希釈し、ＤＭＦをロータリーエバポレーターを用いて除去した。この工程を２回以上繰り返した。塩を真空下で４時間乾燥した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）のセシウム塩をＤＭＦ（１２０ｍｌ）で希釈した。これに、クロロメチル樹脂を添加した。反応混合物を４０℃で４８時間攪拌した。樹脂を室温まで冷却し、漏斗を通して濾過し、以下のように逐次洗浄した：５００ｍｌＤＭＦ；５００ｍｌＤＭＦ：Ｈ₂Ｏ（１：１）；５００ｍｌＤＭＦ；５００ｍｌＭｅＯＨおよび１０００ｍｌＣＨ₂Ｃｌ₂。樹脂を真空下で乾燥した。所望のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−樹脂を回収した。ｂ．Ｂｏｃ−Ａｓｐ(ＯＢｚ)₂−Ａｄｐ−［Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)］₂樹脂の合成Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）樹脂を反応容器中に入れ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中に懸濁させた。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）樹脂のＢｏｃ保護を、該樹脂をＣＨ₂Ｃｌ₂中５０％ＴＦＡ（４０ｍｌ）で５分間、続いて別の５０％ＴＦＡ洗浄液（４０ｍｌ）で３０分間洗浄することにより除去した。ついで、該樹脂を４０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で３回洗浄した。得られたＴＦＡ塩を４０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％ＤＩＥＡで１分間２回処理し、４０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で１回、４０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％ＤＩＥＡでもう一度洗浄した。樹脂をＣＨ₂Ｃｌ₂でよく洗浄した（６×４０ｍｌ）。Ｎ,Ｎ'−ジ−Ｂｏｃジアミノアジピン酸（Ｂｏｃ−Ａｄｐ−ＯＨ）をＮＨ₂− Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−樹脂にカップリングさせる場合、樹脂を手動式振盪容器中１００ｍｌの塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）中に懸濁させた。別の５０ｍｌフラスコ中、Ｂｏｃ−Ａｄｐ−ＯＨおよびＨＯＢＴを５ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）および２０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解した。溶液を氷浴を用いて０℃に冷却した。この溶液にＤＣＣを添加し、反応混合物を０℃で１５分間攪拌した。得られたジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾過により除去し、予め形成された活性エステルをＮＨ₂−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−樹脂懸濁液に添加した。反応をカイザー試験（ニンヒドリン）を用いてモニターした。９６時間後、ジペプチド樹脂をＣＨ₂Ｃｌ₂（３×４０ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（６×４０ｍｌ）で洗浄した。仕後処理後、ニンヒドリン試験により、負の対照と比べて淡青色溶液を得た。ついで、該樹脂をＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％無水酢酸（１回）で１０分間、最後にＣＨ₂ Ｃｌ₂（６×４０ｍｌ）で洗浄した。ｃ．［Ｂｏｃ−Ａｓｐ(ＯＢｚ)］₂−Ａｄｐ−［Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)］₂−樹脂の合成ＴＦＡ脱保護および中和工程を繰り返して、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚ）カップリングについてのジペプチド樹脂を調製した。このアミノ酸をカップリングする場合、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚ）、およびＨＯＢＴを用いた。負のニンヒドリン試験によりわかるように２４時間後にカップリングは完了した。このトリペプチドを用いて異なるアミノ酸を位置２（Ｂ）に有する他のペプチドを調製した。０.５ｇの［ＢＯＣ−Ａｓｐ(ＯＢｚ)］₂−Ａｄｐ−［Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)］₂− 樹脂を(Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ)₂−Ａｄｐ−(Ｌｙｓ)₂［ＳＥＱＩＤＮＯ：１４］の合成に用いた。脱保護、中和およびカップリングのサイクルをＢＯＣ− Ｓｅｒ（Ｂｚ）−ＯＨおよびピコニン酸について繰り返した。１.８ｍＭのアミノ酸、ＤＣＣおよびＨＯＢＴをカップリングにて用いた。カップリングを１０ｍｌのＤＭＦ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中で行った。ペプチド樹脂を切断し、粗ペプチドを得た。粗ペプチドをＣ−１８ＶＹＤＡＣ分取用カラム上で、アセトニトリル／水／ＴＦＡ緩衝液系を用いて精製した。１３ミリグラムの純粋ペプチドを得た。ＦＡＢ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ１０４７.４）アミノ酸分析：ＡＳＰ２.００（２）、Ｓｅｒ１.６２（２）、Ｌｙｓ１.８１（２）（ＰｉｃおよびＡｄｐは分析せず）。ＨＰＬＣ純度＞９５％実施例１６− (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］の調製ａ．ＢＯＣ−ＳＵＢ−Ｌｙｓ−（ε−Ｚ）−ＣＯＯＢｚの合成ビス−ＢＯＣ（１,１）ジアミノスベリン酸（Ｓｕｂ）をアール・ナットの方法［R.Nutt's method、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org .Chem.）、４５：３０７８（１９８０）］を用いて合成した。２ｍＭのＢｏｃ−Ｓｕｂ（８０８ｍｇ）、４ｍＭのＬｙｓ−（ε−Ｚ）−ＣＯＯＢｚ・ＨＣｌ（１.５６ｇ）および４ｍＭのＨＯＢＴ（０.６１３ｇ）を塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）（１０ｍｌ）中に溶解し、該溶液を氷／アセトン浴を用いて−１５℃に冷却した。４ｍＭ（０.６９２ｍｌ）のジイソプロピエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加し、続いて０.７７２ｇ（４ｍＭ）の水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加した。１時間攪拌した後、混合物を室温にまで加温した。３時間後、塩化メチレンを蒸発させ、残渣を２００ｍｌの酢酸エチル中に溶かした。溶液を最初１ＮＨＣｌで、次に１ＮＮａＯＨ、飽和ＮａＣｌ溶液および水で洗浄した。洗浄を３回繰り返し、各洗浄液は約１００ｍｌであった。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。１.８６ｇのＢＯＣ−Ｓｕｂ−（ε −Ｚ）Ｌｙｓ−ＣＯＯＢｚ（収率７９％）を得、さらに精製することなく用いた。ｂ．ＢＯＣＡｓｐ−(β−ＯＢｚ)ＳｕｂＬｙｓ−(ε−Ｚ)−ＣＯＯＢｚの合成ＢＯＣ−Ｓｕｂ−Ｌｙｓ(ε−Ｚ)−ＣＯＯＢｚ（１.８ｇ）を４ＮＨＣｌ− ジオキサン中に半時間の間溶かし、ついで蒸発乾固させた。残渣をエーテルで洗浄し、一夜乾燥させた。塩酸塩を３０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解し、ＢＯＣＡｓｐ−（β−ＯＢｚ）（１.２９２ｇ）を添加した。溶液を−１５℃に冷却し、０. ６１３ｇのＨＯＢＴ、０.５５４ｍｌのＤＩＥＡおよび０.７７２ｇのＥＤＣを添加した。２時間攪拌した後、混合物を室温まで加温した。１８時間（一夜）経過後、反応混合物を後処理した。ＣＨ₂Ｃｌ₂を蒸発させ、残渣を２００ｍｌの酢酸エチル中に溶解した。溶液を１ＮＨＣｌ、１ＮＮａＯＨ、飽和ＮａＣｌ溶液および水（洗浄を３回繰り返し、各洗浄液は約１００ｍｌである）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させた。ＢＯＣ−Ａｓｐ−(β−ＯＢｚ)−Ｓｕｂ−Ｌｙｓ−(ε−Ｚ)ＣＯＯＢｚ（１.９ｇ、収率７３％）を得た。このペプチドをさらに精製することなく用いた。ｃ．ＢＯＣ−Ｇｌｕ−(γ−ＯＢｚ)Ａｓｐ−(β−ＯＢｚ)Ｓｕｂ−Ｌｙｓ−( ε−Ｚ)ＣＯＯＢｚの合成ＢＯＣ−(β−ＯＢｚ)Ａｓｐ−Ｓｕｂ−(ε−Ｚ)Ｌｙｓ−ＣＯＯＢｚ（１.８ｇ）を１５ｍｌの４ＮＨＣｌジオキサン中に溶解した。１５分後、溶媒を除去し、残渣をエーテルで洗浄し、乾燥した。塩酸塩を１５ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解した。溶液を−１５℃に冷却し、４ｍＭ（１.３３８ｇ）のＢＯＣ−Ｇｌｕ（γ−ＯＢｚ）、０.２０４ｍｌのＤＩＥＡ、０.７７２ｇのＥＤＣおよび０.６１２ｇのＨＯＢＴを添加した。混合物を一夜攪拌し、その間、徐々に室温にまで加温した。反応混合物を１リットルの冷飽和ＮａＣｌ溶液中１０％Ｎａ₂ＣＯ₃を入れたフラスコに添加した。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、真空乾燥した。ＢＯＣ−(γ−ＯＢｚ)Ｇｌｕ−(β−ＯＢｚ)Ａｓｐ−Ｓｕｂ−(ε−Ｚ) Ｌｙｓ−ＣＯＯＢｚ（１.３ｇ）を得、さらに精製することなく用いた。収率：６８％。ｄ．ｐＧｌｕ−(γ−ＯＢｚ)Ｇｌｕ−(β−ＯＢｚ)Ａｓｐ−Ｓｕｂ−(ε−Ｚ) Ｌｙｓ−ＣＯＯＢｚの合成ＢＯＣ−(γ−ＯＢｚ)Ｇｌｕ−(β−ＯＢｚ)Ａｓｐ−Ｓｕｂ−(ε−Ｚ)Ｌｙｓ −ＣＯＯＢｚ（１.２ｇ）を１５ｍｌの４ＮＨＣｌジオキサン中に溶解した。１５分後、溶媒を除去し、残渣をエーテルで洗浄し、乾燥した。塩酸塩を１５ｍｌのＮＭＰ中に溶かした。溶液を−１５℃に冷却し、４ｍＭ（０.５１６ｇ）のｐｙｒｏ−Ｇｌｕ（ｐ−Ｇｌｕ）、０.１０６ｍｌのＤＩＥＡ、０.７７２ｇのＥＤＣおよび０.６１２ｇのＨＯＢＴを添加した。混合物を一夜攪拌し、その間、徐々に室温まで加温した。反応混合物を１リットルの冷飽和ＮａＣｌ溶液中１０％Ｎａ₂ＣＯ₃を入れたフラスコに添加した。沈殿を濾過し、水で洗浄し、真空乾燥した。ｐＧｌｕ−（γ−ＯＢｚ）Ｇｌｕ−（β−ＯＢｚ）Ａｓｐ−Ｓｕｂ−（ ε−Ｚ）Ｌｙｓ−ＣＯＯＢｚ（０.８０３ｇ）を得、さらに精製することなく用いた。収率：６９％。ｅ．ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｕｂ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨの合成ｐＧｌｕ−(γ−ＯＢｚ)Ｇｌｕ−(β−ＯＢｚ)Ａｓｐ−Ｓｕｂ−(ε−Ｚ)Ｌｙｓ−ＣＯＯＢｚ（０.２００ｇ）を５ｍｌのＨＦ／１.５ｍｌアニソールを用いて０℃で脱保護した。ＨＦを除去し、ペプチドをエーテルと０.１Ｎ酢酸の間に分配する。水層を洗浄し、凍結乾燥する。ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｕｂ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ（０.０８９ｇ）を得る。２０ｍｇのこのペプチドをＣ１８分取用ＶＹＤＡＣカラム上、イソクラティック条件（１０％アセトニトリル、９０％水および０.１％トリフルオロ酢酸、流速５.６ｍｌ／分）を用いて精製する。ＦＡＢ質量分析：Ｍ＋Ｈ＝１１７１.４。アミノ酸分析：Ａｓｐ（１.０）、Ｇｌｕ（２.１９）、Ｌｙｓ（１.０１）、Ｓｕｂ測定せず。ＨＰＬＣ：保持時間Ｃ１８ＶＹＤＡＣ０.２３ｘ２５ｍｍ分析カラム７.０１分［流速１.５ｍｌ勾配０％から８０％Ｂ、Ａ＝水中０.１％ＴＦＡおよびＢ＝アセトニトリル中０. １％ＴＦＡ）。実施例１７− (ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ−(Ｌｙｓ)₂ ［ＳＥＱＩＤＮＯ：５］Ｃ５７ブラック６［ジャクソン・ラボラトリース（Jackson Laboratories）］マウスを０.０１、０.１、０.５、１、５、１０または１００ｎｇ／ｍＬの一回の腹腔内注射または経口用量のペプチド(ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ)₂−Ｓｕｂ −(Ｌｙｓ)₂で処置した。リン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）を対照に供した。約６時間経過後、マウスから血清を収集し、ＰＢＳ中１：２に希釈し、ついで３０Ｋ膜を通した。溶出液を３００００分子量排除膜［アミコン（Amicon）；３０Ｋ −Ｅ］を通し、次に実施例８のＨＳＦ検定にて用いた。結果を図７、８および９図に示す。図からわかるようにＰＢＳ処理（対照）マウスはいずれも血清中ＨＳＦが検出可能なレベルではなかった。処理マウスにおいては、ＨＳＦレベルは用量依存性であった。これらの「ＨＳＦレベル」は臨床試験において代用薬マーカーとして用いられるであろう。ＨＳＦ検定から得られる粗サンプルを精製し、配列決定した。分析を行い、生物学的に活性なピークが本発明の切形ＫＣであり、不活性ピークが完全長ＫＣであることがわかった。本発明の多くの修正および変形は本願明細書に包含されるものであり、当業者には明らかであると考えられる。本発明の組成物および方法に対するこのような修正および変形も、後記請求の範囲内に包含されるものと考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ 15/09 ＺＮＡＡＢＹＧ０１Ｎ 33/53 ＡＤＳ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者バートネイガー，プラディップ・クーマーアメリカ合衆国ペンシルベニア州19341、エクストン、サウス・ボールダーストン・ドライブ300番 (72)発明者キング，アンドリュー・ガリソンアメリカ合衆国ペンシルベニア州19422、ブルー・ベル、シルバン・ドライブ1649番 (72)発明者バルカレック，ジョアンナ・マリアアメリカ合衆国ペンシルベニア州19004、バラ・シンウィド、ブリン・モール・アベニュー405番

Claims

【特許請求の範囲】１．成熟ケモカインのアミノ末端で約２ないし約８個の間のアミノ酸が切断され、成熟ケモカインより少なくとも１対数高い生物学的活性であることを特徴とする修飾ケモカイン。２．成熟ケモカインがＫＣ、ｇｒｏ−β、ｇｒｏ−γおよびｇｒｏ−αからなる群より選択され、哺乳動物起源である請求項１記載の蛋白質。３．ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸残基＃２ないし８の間の位置で切断されたアミノ末端を有する成熟ＫＣ蛋白質のアミノ酸配列からなるケモカインであって、該ケモカインが生物学的活性を有することを特徴とする請求項１記載の修飾ケモカイン。４．本質的にＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸５〜７２からなる請求項３記載の修飾ケモカイン。５．ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸位置２および８の間のＮ末端で切断された成熟ｇｒｏ−β蛋白質のアミノ酸配列からなる請求項１記載の修飾ケモカイン。６．本質的にＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸５ないし７３からなる請求項５記載の修飾ケモカイン。７．ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸位置２および８の間のＮ末端で切断された成熟ｇｒｏ−α蛋白質のアミノ酸配列からなる請求項１記載の修飾ケモカイン。８．本質的にＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸５ないし７３からなる請求項７記載の修飾ケモカイン。９．ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸位置２および８の間のＮ末端で切断された成熟ｇｒｏ−γ蛋白質のアミノ酸配列からなる請求項１記載の修飾ケモカイン。 10．本質的にＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸５ないし７３からなる請求項９記載の修飾ケモカイン。 11．成熟ケモカインのカルボキシ末端で約２ないし約８個の間のアミノ酸が切断され、成熟ケモカインより少なくとも１対数高い生物学的活性であることを特徴とする修飾ケモカイン。 12．ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸残基＃５８から７０の間の位置で切断されたカルボキシ末端を有する成熟ＫＣ蛋白質のアミノ酸配列からなるケモカインであって、生物学的活性を有することを特徴とする請求項１１記載の修飾ケモカイン。 13．本質的にＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸１ないし６８からなる請求項１２記載の修飾ケモカイン。 14．（ａ）成熟ケモカインのアミノ末端で約２ないし約８個の間のアミノ酸が切断され、成熟ケモカインよりも少なくとも１対数高い生物学的活性を有することを特徴とする修飾ケモカイン；および（ｂ）成熟ケモカインのカルボキシ末端で約２ないし約１０個の間のアミノ酸が切断され、成熟ケモカインよりも少なくとも１対数高い生物学的活性を有することを特徴とする修飾ケモカイン；からなる群より選択される１またはそれ以上の修飾ケモカインを組み合わせてなる多量体蛋白質。 15．同じ修飾ケモカインの複数のコピーからなる請求項１４記載の蛋白質。 16．少なくとも２種の異なる修飾ケモカインからなる請求項１４記載の蛋白質。 17．別のケモカインが成熟ケモカインからなる請求項１４記載の蛋白質。 18．（ａ）成熟蛋白質のアミノ末端で約２ないし約８個の間のアミノ酸が切断され、少なくとも成熟蛋白質の生物学的活性を有することにより特徴付けられる修飾ケモカイン；（ｂ）成熟ケモカインのカルボキシ末端で約２ないし約１０個の間のアミノ酸が切断され、少なくとも成熟蛋白質の生物学的活性を有することを特徴とする修飾ケモカイン；および（ｃ）少なくとも１種の（ａ）または（ｂ）蛋白質からなり、所望により別のケモカインが組み合わされていてもよい、多量体蛋白質；からなる群より選択される修飾ケモカインをコードする配列からなる核酸配列。 19．宿主細胞中にて複製および発現の方向能を有する選択された調節配列の制御下にある請求項１８に記載の核酸配列からなるプラスミド。 20．請求項１９に記載のプラスミドでトランスフェクションされた宿主細胞。 21．請求項２０に記載の宿主細胞を培養し、細胞または細胞培養物からケモカインを単離することからなる修飾ケモカインの産生法。 22．（ａ）約２ないし約８個の成熟ケモカインアミノ酸残基を成熟蛋白質のアミノ末端から除去すること；および（ｂ）約２ないし約１０個の成熟ケモカインアミノ酸残基を成熟蛋白質のカルボキシ末端から除去すること；からなる工程の少なくとも１工程を行うことによるケモカインの生物学的活性の強化法。 23．適当な医薬担体中、（ａ）成熟蛋白質のアミノ末端で約２ないし約８個の間のアミノ酸が切断され、完全長成熟ケモカインよりも少なくとも１対数高い生物学的活性を有することを特徴とする修飾ケモカイン；（ｂ）成熟蛋白質のカルボキシ末端で約２ないし約１０個の間のアミノ酸が切断され、少なくとも完全長成熟ケモカインの生物学的活性を有することを特徴とする修飾ケモカイン；および（ｃ）少なくとも１種のケモカイン（ａ）または（ｂ）からなり、所望により別のケモカインが組み合わされていてもよい多量体蛋白質；からなる群より選択される修飾ケモカインを配合してなるる医薬組成物。 24．炎症性症状の治療法であって、該症状を特徴とする哺乳動物対象に有効量の請求項２３に記載の医薬組成物を投与することからなる方法。 25．哺乳動物における骨髄細胞の増殖および／または分化の刺激方法であって、請求項１または１１に記載の修飾ケモカインを該哺乳動物に投与することからなる方法。 26．哺乳動物における造血前駆体細胞の成熟を刺激する改良方法であって、請求項１または１１に記載の修飾ケモカインを該哺乳動物に投与することからなる改良方法。 27．哺乳動物における骨髄細胞の増殖および／または分化を剌激する改良方法であって、ＧＭ−ＣＳＦおよび請求項１または１１に記載の修飾ケモカインを該哺乳動物に投与することからなり、該混合物が相乗効果を有することを特徴とする改良方法。 28．請求項１に記載の修飾ケモカインに対して選択的に結合しうる抗体。 29．請求項１１に記載の修飾ケモカインに対して選択的に結合しうる抗体。 30．哺乳動物における造血相乗因子の誘発能を有することを特徴とする選択された薬剤の循環レベルのモニター方法であって、哺乳動物由来の血液試料を請求項２８または２９に記載の抗体と接触させ、循環ＨＳＦレベルを測定し、該薬剤投与後の循環ＨＳＦレベルを、該薬剤投与前の循環ＨＳＦレベルと比較することからなる方法。 31．抗体が所望により検出可能な標識と結合してもよい請求項３０記載の方法。 32． In vivoにおける造血相乗因子の誘発方法であって、次式：［式中、Ｙ₁およびＹ₂は、独立して、ＣＨ₂またはＳであり；ｘは０、１、２、３または４であり；ｍは０、１または２であり；ｎは０、１または２であり；Ａはピログルタミン酸、プロリン、グルタミン、チロシン、グルタミン酸、２ −チオフェンカルボン酸、ピコリン酸、シクロヘキサンカルボン酸、テトラヒドロ−２−フロ酸、テトラヒドロ−３−フロ酸、２−オキソ−４−チアゾリジン、シクロペンタン、３−チオフェンカルボン酸、５−オキソ−２−テトラヒドロフランカルボン酸またはピペコリン酸であり；Ｂはセリン、グルタミン酸、チロシンまたはアスパラギン酸であり；Ｃはグルタミン酸、チロシンまたはアスパラギン酸であり；Ｄはリシン、アルギニン、チロシン、Ｎ−メチルアルギニン、アスパラギン酸、オルニチンまたはジアミノヘキシン酸；またはそのカルボキシアミドもしくはヒドロキシメチル誘導体であり；Ｅはグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンまたはペプチド結合であり；Ｆはチロシンまたはペプチド結合を意味する；ただし、Ｙ₁およびＹ₂がＳである場合、ｘは２、３または４であって、ｍおよびｎは１であるか；Ｙ₁およびＹ₂がＣＨ₂である場合、ｘは０、１または２であって、ｍおよびｎは０であるか；Ｙ₁がＳであり、Ｙ₂がＣＨ₂である場合、ｘは０であり、ｎは１であるか；またはＹ₂がＳであり、Ｙ₁がＣＨ₂である場合、ｘは０であり、ｍは１である］で示される化合物またはその医薬上許容される塩を、選択される哺乳動物に投与することからなる方法。 33．ペプチドが (ｐＧlu−Ｇlu−Ａsp)₂Ｓub(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ．５ (ｐＧlu−Ｇlu−Ａsp)₂Ａdp(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：６ (ｐＧlu−Ｇlu−Ｇlu)₂Ｓub(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：７ (ｐＧlu−Ａsp−Ａsp)₂Ｓub(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：８ (Ｐic−Ｇlu−Ａsp)₂Ｓub(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：９ (Ｌ−Ｐpc−Ｇlu−Ａsp)₂Ｓub(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１０ (ｐＧlu−Ｓer−Ａsp)₂Ｓub(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１１ (ｐＧlu−Ｓer−Ａsp)₂Ａdp(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１２ (ｐＧlu−Ｓer−Ａsp)₂Ａdp(Ｌys−ＮＨ₂)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１３ (Ｐic-Ｓer-Ａsp)₂Ａdp(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１４ (Ｐic−Ｓer−Ａsp)₂Ａdp(Ｌys−ＮＨ₂)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１５ (ｐＧlu−Ｇlu−Ａsp)₂Ａdp(Ｔyr−Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１６ (Ｐic−Ｇlu−Ａsp)₂Ａdp(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１７ (ｐ−Ｇlu−Ｇlu−Ａsp)₂Ｓub(Ｌys−ＮＨ₂)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１８ (Ｐic−Ｇlu−Ａsp)₂Ａdp(Ｌys−ＮＨ₂)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：１９からなる群より選択される請求項３２記載の方法。 34．ペプチドを約０．０１ｎｇ／ｋｇないし１ｇ／ｋｇの間の量で投与する請求項３２に記載方法。 35．ペプチドが(ｐＧlu−Ｇlu−Ａsp)₂Ｓub(Ｌys)₂ ＳＥＱＩＤＮＯ：５である請求項３３記載の方法。