ES2584068T3

ES2584068T3 - Uso de meteorina para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y dolor fantasma

Info

Publication number: ES2584068T3
Application number: ES11773666.0T
Authority: ES
Inventors: Teit E. Johansen; Lars Ulrik Wahlberg; Jesper Roland JØRGENSEN
Original assignee: NsGene AS
Current assignee: NsGene AS
Priority date: 2010-10-01
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2016-09-23
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: US20150202262A1; CN108079279B; WO2012041328A1; EP2621512A1; HK1186412A1; JP6149226B2; CA2813013A1; CN103269708A; CA2813013C; US8815810B2; US20130303459A1; US20120108518A1; US8404642B2; JP2017052783A; JP2013543378A; AU2011307488A1; US9314502B2; EP2621512B1; JP6247734B2; KR101886029B1

Abstract

Un polipéptido aislado para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: i. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; ii. Una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde la variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3; y iii. Un fragmento biológicamente activo de al menos 50 aminoácidos contiguos de a) o b) donde el fragmento es al menos el 70% idéntico a la SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de meteorina para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y dolor fantasma.

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y dolor fantasma. En una realización preferida, el trastorno a tratar es alodinia e hiperalgesia, más preferentemente alodinia que incluye alodinia térmica y táctil. En otra realización preferida, el trastorno es hiperalgesia térmica.

10

Antecedentes de la invención

Se han explorado muchas terapias para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y dolor fantasma con un grado de éxito variable, incluyendo fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), opioides, anticonvulsivos, antiarrítmicos, antidepresivos tricíclicos y agentes tópicos. Enfoques alternativos incluyen bloqueos 15 anestésicos, administración epidural de esteroides y lesiones neuroquirúrgicas. Sin embargo, todas las terapias presentes tienen una modesta eficacia en la mayoría de los pacientes y son paliativos en lugar de curativos y sus efectos secundarios representan limitaciones significativas.

Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de terapias que traten alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y dolor 20 fantasma eficazmente, preferentemente con solamente efectos secundarios menores que no afecten a la salud general de los pacientes.

Resumen de la invención

25

La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y dolor fantasma. Los métodos usan la proteína meteorina, secuencias de nucleótidos que codifican meteorina, vectores de expresión que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica meteorina, líneas celulares transformadas/transfectadas con el vector de expresión que codifica meteorina, o una cápsula biocompatible que administra meteorina secretada. 30

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

35

i. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;

ii. Una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde la variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEG ID NO: 3; y

iii. Un fragmento biológicamente activo de al menos 50 aminoácidos contiguos de i) o ii) donde el fragmento es al menos el 70% idéntico a la SEQ ID NO: 3. 40

Los inventores han descubierto que la meteorina es capaz de aliviar la alodinia en modelos animales de alodinia tanto térmica como mecánica y el dolor espontáneo (déficit de soporte de peso). De forma importante, los animales no experimentaron ninguna pérdida de peso o signos de toxicidad durante la duración del experimento y no se observaron efectos secundarios dolorosos. Los efectos positivos se han observado independientemente en varios 45 modelos diferentes de alodinia y dolor espontáneo y usando administración tanto sistémica (subcutánea) como local (intratecal).

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicha molécula de ácido 50 nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

i. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;

ii. Una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde 55 la variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3; y

iii. Un fragmento biológicamente activo de al menos 50 aminoácidos contiguos de i) o ii) donde el fragmento es al menos el 70% idéntico a la SEQ ID NO: 3.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma.

En un aspecto adicional más, la invención se refiere a una célula huésped aislada que comprende un vector de 5 expresión de acuerdo con la invención para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma. En particular, la invención se refiere a células huésped útiles para terapia basada en células, terapia basada en células desnudas o terapia con células encapsuladas para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma.

10

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una cápsula biocompatible implantable para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma mediante la administración de meteorina biológicamente activa secretada a un sujeto, comprendiendo dicha cápsula:

i. Una membrana externa biocompatible y un núcleo interno, 15

ii. Comprendiendo dicho núcleo interno células de acuerdo con la invención,

iii. Comprendiendo dichas células un vector de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición que comprende:

20

i. El polipéptido aislado de acuerdo con la invención; o

ii. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la invención; o

iii. El vector de expresión de acuerdo con la invención; o

iv. La línea celular de acuerdo con la invención; o

v. Una cápsula biocompatible implantable de acuerdo con la invención; 25

para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de:

30

i. El polipéptido aislado de acuerdo con la invención;

ii. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la invención;

iii. El vector de expresión de acuerdo con la invención;

iv. La línea celular de acuerdo con la invención; y

v. Una cápsula biocompatible implantable de acuerdo con la invención; 35

en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor 40 espontáneo y/o dolor fantasma en un sujeto que comprende administrar, a dicho sujeto que lo necesita, cantidades terapéuticamente efectivas del polipéptido aislado de acuerdo con la invención.

Descripción de los dibujos

45

Figura 1. Umbral de retirada de la pata trasera ipsolateral ante estimulación mecánica con pelos de von Frey después de lesión del nervio ciático. Nótese que el tratamiento con meteorina alivia de forma dependiente de la dosis la alodinia mecánica. Las flechas indican puntos temporales del tratamiento. Los datos se muestran como la media ± SEM y la puntuación se realizó con enmascaramiento. *p<0,05.

50

Figura 2. Puntuación de respuesta de la pata trasera ipsolateral ante estimulación con frío después de lesión del nervio ciático. 0 es sin respuesta, 1 corresponde a una respuesta similar a un sobresalto observada en ratas normales mientras que 2 y 3 indican reacciones de dolor leve y severo. Nótese que el tratamiento con meteorina alivia de manera dependiente de la dosis la alodinia por frío. Las flechas indican puntos temporales del tratamiento. La puntuación se realizó con enmascaramiento y los datos se muestran como media ± SEM. * p<0,05. 55

Figura 3. Cambios de peso corporal en ratas con lesión en el nervio ciático. Todos los animales ganaron peso de forma normal durante todo el estudio. Las flechas indican puntos temporales del tratamiento. La puntuación se realizó con enmascaramiento y los datos se muestran como media ± SEM. * p<0,05.

Figura 4. Déficits de soporte de peso en ratas después de LCC (Lesión por constricción crónica). Se usó un medidor de incapacidad para valorar la fuerza descendente aplicada por cada extremidad trasera. Antes de la cirugía, no había ningún déficit dado que todos los animales soportaban peso por igual en ambas extremidades traseras. Después de 12 días, inmediatamente antes de que comience el tratamiento, ∼50 g más se colocaron sobre la 5 extremidad contralateral en comparación con la extremidad ipsolateral. Nótese que el tratamiento con meteorina alivia los déficits de soporte de peso. La puntuación se realizó con enmascaramiento y los datos se muestran como media ± SEM. * p<0,05.

Figura 5. Cambios de peso corporal en ratas con LCC. Todos los animales ganaron peso de forma normal durante 10 todo el estudio. Las flechas indican puntos temporales del tratamiento. La puntuación se realizó con enmascaramiento y los datos se muestran como media ± SEM. * p<0,05.

Figura 6. Alineamiento con CLUSTAL W (1.82) de múltiples secuencias de meteorina.

15

Figura 6a: alineamiento de precursores de meteorina de ser humano (SEQ ID NO 2), rata (SEQ ID NO 9) y ratón (SEQ ID NO 5).

Figura 6b: alineamiento de meteorina madura de ser humano (SEQ ID NO 3), rata (SEQ ID NO 10) y ratón (SEQ ID NO 6). 20

Figura 6c: meteorina madura, secuencia consenso (SEQ ID NO 11) generada a partir de residuos totalmente conservados en las secuencias humana, de ratón y de rata. X representa cualquiera de los 21 aminoácidos de origen natural codificados por ADN.

25

Figura 7. Efecto de meteorina sobre hipersensibilidad mecánica en ratas con LCC. Las flechas indican días de tratamiento donde a los animales se les inyectó por vía sistémica con 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg o 1,8 mg/kg de meteorina recombinante o con vehículo como control negativo. Las ratas fueros examinadas para nocicepción alterada usando filamentos de von Frey y los resultados se expresaron como medias ± SEM. * indica una diferencia significativa (p<0,05) en comparación con animales tratados con vehículo. 30

Figura 8. Efecto de meteorina sobre hipersensibilidad térmica en ratas con LCC. Las flechas indican días de tratamiento donde a los animales se les inyectó por vía sistémica con 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg o 1,8 mg/kg de meteorina recombinante o con vehículo como control negativo. Se usó un dispositivo de Hargreaves para valorar la latencia de retirada térmica y los resultados se expresaron como medias ± SEM. * indica una diferencia significativa (p<0,05) 35 entre 1,8 mg/kg de meteorina y animales tratados con vehículo. # indica una diferencia significativa (p<0,05) entre 0,5 mg/kg de meteorina y animales tratados con vehículo. Nótese que la meteorina reducía significativamente y de forma dependiente de la dosis la alodinia térmica.

Figura 9. Efecto de meteorina sobre soporte de peso diferencial en ratas con LCC. Las flechas indican días de 40 tratamiento donde a los animales se les inyectó por vía sistémica con 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg o 1,8 mg/kg de meteorina recombinante o con vehículo como control negativo. El soporte de peso diferencial entre la extremidad lesionada y la no lesionada se determinó usando un medidor de incapacidad y se expresó como % de diferencia. Los datos se muestran como medias ± SEM. * indica una diferencia significativa (p<0,05) entre 1,8 mg/kg de meteorina y animales tratados con vehículo. # indica una diferencia significativa (p<0,05) entre 0,5 mg/kg de meteorina y animales tratados 45 con vehículo. $ indica una diferencia significativa (p<0,05) entre 0,1 mg/kg de meteorina y animales tratados con vehículo. Nótese que la meteorina reducía significativamente y de forma dependiente de la dosis déficits de soporte de peso.

Figura 10. Peso corporal del animal durante el estudio de LCC. Las flechas indican días de tratamiento donde a los 50 animales se les inyectó por vía sistémica con 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg o 1,8 mg/kg de meteorina recombinante o con vehículo como control negativo. No se produjeron cambios de peso corporal en los grupos tratados con meteorina en comparación con vehículo.

Figura 11. Meteorina en suero de rata postadministración sistémica. A los animales se les inyectó por vía sistémica 55 con 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg o 1,8 mg/kg de meteorina recombinante el día 39 (t=0). Se recogieron muestras de suero a las 2, 6, 24 h después de la inyección y la concentración de meteorina se determinó usando ELISA. La meteorina no era detectable en muestras de suero de ratas de control sin exposición previa.

Figura 12. Efecto de meteorina sobre el umbral de retirada de la pata ante estimulación mecánica después de lesión isquémica del nervio ciático. Las flechas indican puntos temporales para inyección intratecal. Los datos se muestran como medias ± SEM. * indica una diferencia significativa (p<0,05) entre vehículo y 6 µg de meteorina mientras que # indica una diferencia significativa (p<0,05) entre vehículo y 2 µg de meteorina.

5

Figura 13. Efecto de meteorina sobre response a estimulación por frío después de lesión isquémica del nervio ciático. Las flechas indican puntos temporales para inyección intratecal. Los datos se muestran como medias ± SEM. * indica una diferencia significativa (p<0,05) entre vehículo y 6 µg de meteorina mientras que # indica una diferencia significativa (p<0,05) entre vehículo y 2 µg de meteorina.

10

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento “una cápsula biocompatible” significa que la cápsula, tras la implantación 15 en un mamífero huésped, no desencadena una respuesta del huésped perjudicial suficiente para dar como resultado el rechazo de la cápsula o para hacerla inoperante, por ejemplo a través de degradación.

Tal como se usa en el presente documento, una “secuencia codificante” es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe y se traduce a un polipéptido. 20

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de control” se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes y no codificantes a las que están ligadas. Las secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión al ribosoma, y secuencia de terminación de la transcripción. Además, “secuencias de control” se refiere a secuencias que controlan el 25 procesamiento del péptido codificado dentro de la secuencia codificante; éstas pueden incluir, aunque no se limitan a, secuencias que controlan la secreción, la escisión por proteasa, y la glucosilación del péptido. La expresión “secuencias de control” pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias compañeras de fusión. 30

“Regulación negativa” de un promotor significa la reducción de la expresión del producto de transgén a un nivel, que puede causar una falta de actividad biológica significativa del producto de transgén después de implantación in vivo. Tal como se usa en el presente documento “un promotor no sujeto a regulación negativa” significa un promotor, que, después de implantación in vivo en un huésped mamífero, impulsa o continúa impulsado la expresión del transgén a 35 un nivel que es biológicamente activo.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “vectores de expresión” se refiere a vectores que son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados de forma operativa. En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están, a menudo, en forma de plásmidos. 40

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “modificación genética” e “ingeniería genética” se refieren a la alteración estable o transitoria del genotipo de una célula mediante introducción intencionada de ADN exógeno. El ADN puede ser sintético, o de origen natural, y puede contener genes, partes de genes, u otras secuencias de ADN útiles. La expresión “modificación genética” no pretende incluir alteraciones de origen natural 45 tales como las que se producen a través de actividad viral natural, recombinación genética natural, o similares.

Tal como se usa en el presente documento, “una cápsula inmunoaislante” significa que la cápsula, tras la implantación en un huésped mamífero, minimiza los efectos perjudiciales del sistema inmunitario del huésped sobre las células dentro de su núcleo. 50

Tal como se usa en el presente documento, “expresión estable a largo plazo de un compuesto biológicamente activo” significa la producción continuada de un compuesto biológicamente activo a un nivel suficiente para mantener su actividad biológica útil durante periodos mayores de un mes, preferentemente mayores de tres meses y de la forma más preferente mayor de seis meses. 55

Por un “promotor de mamífero”, se entiende un promotor capar de funcionar en una célula de mamífero.

Meteorina, tal como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de meteorina sustancialmente purificada obtenida a partir de cualquier especie, particularmente mamífero, que incluye de chimpancé, bovina, ovina, porcina, murina, equina, y preferentemente humana, a partir de cualquier fuente ya sea natural, sintética, semisintética, o recombinante. El término también se refiere a fragmentos biológicamente activos de meteorina obtenidos de cualquiera de estas especies, así como a variantes de secuencia biológicamente activa de éstas y a proteínas sujetas a modificaciones postraducionales. 5

Las características del factor de crecimiento, tal como se usa en el presente documento, definen características relacionadas con la secuencia similares a las de factores de crecimiento clásicos, que son proteínas secretadas que actúan sobre una célula diana a través de un receptor para causar una o más de las siguientes respuestas en la célula diana: crecimiento incluyendo proliferación, diferencia, supervivencia, regeneración, migración, recuperación 10 de función, mejora de soporte trófico a la función tal como soporte neurotrófico.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “enlazado/a de forma operativa” pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la una o más secuencias reguladoras dentro de un vector de expresión recombinante, de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en 15 un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). 20

“Identidad de secuencia”: un nivel elevado de identidad de secuencia indica probabilidad de que la primera secuencia se derive de la segunda secuencia. La identidad de secuencia de aminoácidos requiere secuencias de aminoácidos idénticas entre dos secuencias alineadas. Por lo tanto, una secuencia candidata que comparte el 70% de identidad de aminoácidos con una secuencia de referencia, requiere que, después del alineamiento, el 70% de 25 los aminoácidos en la secuencia candidata sean idénticos a los aminoácidos correspondientes en la secuencia de referencia. La identidad puede determinarse con ayuda de análisis informático, tal como, sin limitaciones, el programa de alineamiento informático ClustalW (Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680), y 30 los parámetros por defecto sugeridos en él. El software ClustalW está disponible como un servicio de ClustalW WWW Service en el European Bioinformatics Institute a partir de http://www.ebi.ac.uk/clustalw. Usando este programa con su configuración por defecto, la parte madura (bioactiva) de un polipéptido de consulta y un polipéptido de referencia se alinean. El número de residuos totalmente conservados se cuente y se divide por la longitud del polipéptido de referencia. 35

El algoritmo ClustalW puede usarse de forma similar para alinear secuencias de nucleótidos. Las identidades de secuencia pueden calcularse de manera similar, tal como se indica para secuencias de aminoácidos.

El término “sujeto”, usado en el presente documento, se interpreta que significa cualquier mamífero al que se le 40 puede administrar polipéptido o polinucleótido de meteorina, células terapéuticas o cápsulas biocompatibles. Sujetos destinados específicamente para tratamiento con el método de la invención incluyen seres humanos, así como primates no humanos, ovejas, caballos, vacas, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, cobayas, hámsteres, jerbos, ratas y ratones, así como los órganos, tumores, y células derivadas u originarias de estos huéspedes.

45

Tal como se usa en el presente documento, el término “transformación” se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno (es decir, un “transgén”) en una célula huésped. El polinucleótido exógeno se integra dentro del genoma del huésped.

El “tratamiento” puede realizarse de varias maneras diferentes, incluyendo curativo, de mejoría y como profilaxis. El 50 tratamiento curativo generalmente pretende curar una afección clínica, tal como una enfermedad o una infección, que ya está presente en el individuo tratado. Un tratamiento de mejoría generalmente significa tratar para mejorar, en un individuo, una afección clínica existente. El tratamiento profiláctico generalmente pretende prevenir una afección clínica o reducir el riesgo de contraer la afección o reducir el alcance de la afección.

55

Un tratamiento que puede alterar la evolución subyacente de la enfermedad. Afectando al auténtico proceso de la enfermedad, terapia de “modificación de la enfermedad” puede retardar, invertir o prevenir la progresión de los síntomas, o puede cambiar la evolución a largo plazo de la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha estado enlazado. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” pueden usarse de forma intercambiable, dado que el plásmido es la forma de vector usada más habitualmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, 5 tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en replicación), que sirven para funciones equivalentes.

Alodinia

10

Alodinia, que significa “otro dolor”, es un dolor debido a un estímulo que normalmente no provoca dolor y puede ser térmico o mecánico/táctil. Es un dolor a partir de un estímulo que normalmente no causa la sensación de dolor, y puede producirse después de lesión en un sitio. La alodinia es diferentes de hiperalgesia y dolor espontáneo, que se describen en la sección “hiperalgesia” y “dolor espontáneo” respectivamente.

15

Existen diferentes clases o tipos de alodinia:

• Alodinia mecánica (también conocida como alodinia táctil)

○ Alodinia mecánica estática - dolor en respuesta a ligero toque/presión 20

○ Alodinia mecánica dinámica - dolor en respuesta a cepillado

• Alodinia térmica (calor o frío) - dolor a partir de temperaturas cutáneas normalmente suaves en la zona afectada

La alodinia es una característica clínica de muchas afecciones dolorosas, tales como neuropatías, síndrome de dolor 25 regional complejo, neuralgia postherpética, fibromialgia, y migraña. La alodinia también puede ser causada por algunas poblaciones de células madre usadas para tratar daño nervioso incluyendo lesión de la médula espinal. En una realización preferida de la presente invención, la alodinia a tratar es alodinia por frío. En otra realización preferida de la presente invención la alodinia a tratar es alodinia por calor.

30

Los tipos celulares implicados en nocicepción y sensación mecánica son las células responsables de alodinia. En individuos sanos, los nocirreceptores detectan información sobre estrés o daño celular y temperatura en la piel y la transmiten a la médula espinal. Los cuerpos celulares de estas neuronas están en ganglios de la raíz dorsal, estructuras importantes ubicadas a ambos lados de la médula espinal. Los axones pasan, a continuación, a través del cuerno dorsal para establecer conexiones con neuronas secundarias. Las neuronas secundarias cruzan hasta el 35 otro lado (contralateral) de la médula espinal y alcanzan los núcleos del tálamo. A partir de allí, la información es transportada a través de una o más neuronas hasta la corteza somatosensorial del cerebro. Los mecanorreceptores siguen la misma ruta general. Sin embargo, sin embargo no cruzan a nivel de la médula espinal, sino en su lugar en la médula inferior. Además, están agrupados en haces que son espacialmente distintos de los haces nociceptivos.

40

A pesar de esta separación anatómica, los mecanorreceptores pueden incluir en la emisión de nocirreceptores estableciendo conexiones con las mismas interneuronas, cuya activación puede reducir o eliminar completamente la sensación de dolor. Otra manera de modular la transmisión de información de dolor es mediante fibras descendentes desde el cerebro. Estas fibras actúan a través de diferentes interneuronas para bloquear la transmisión de información desde los nocirreceptores hasta neuronas secundarias. 45

Ambos de estos mecanismos para modulación del dolor han estado implicados en la patología de alodinia. Varios estudios sugieren que la lesión a la médula espinal podría causar la pérdida y reorganización de los nocirreceptores, mecanorreceptores e interneuronas, causando la transmisión de información del dolor mediante mecanorreceptores. Un estudio diferente describe el aspecto de fibras descendentes en el sitio de lesión. Todos estos cambios afectan 50 en última instancia a los circuitos dentro de la médula espinal, y el equilibrio alterado de señales probablemente causa la sensación intensa de dolor asociada con alodinia.

Diferentes tipos celulares también se han relacionado con alodinia. Por ejemplo, hay informes de que la microglia en el tálamo podría contribuir a alodinia cambiando las propiedades de los nocirreceptores secundarios. El mismo 55 efecto se consigue en la médula espinal mediante el reclutamiento de células del sistema inmunitario, tales como monocitos/macrófagos y linfocitos T.

Tal como ya se ha mencionado, existen neuronas descendentes que modulan la percepción del dolor. Muchas de estas neuronas se originan en núcleos en el tronco del encéfalo y pasan a través de la zona gris periacueductal (PAG) del mesencéfalo.

El cuerpo posee un mecanismo adicional para controlar el dolor: la liberación de opioides endógenos, especialmente a nivel de la PAG. Existen neuronas que liberan encefalinas, endorfinas, y dimorfinas en la PAG, y de esta manera 5 modulan su capacidad para modular la percepción del dolor. Otras neuronas pueden liberar su opioides endógenos en la fuente del dolor, también. Si esto ocurre, la transmisión de información del dolor desde los nocirreceptores hasta las neuronas secundarias se bloquea, y no se siente ningún dolor. Desafortunadamente, estos mecanismos endógenos a menudo resultan dañados y no son funcionales en personas que padecen alodinia, así que la aplicación de productos farmacéuticos es necesaria. 10

Numerosos compuestos alivian el dolor procedente de alodinia. Algunos son específicos de ciertos tipos de alodinia mientras que otros son generales. Estos incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), opioides y compuestos dirigidos a diferentes canales iónicos.

15

La presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia. Preferentemente la alodinia a tratar es alodinia térmica.

Tal como se documenta mediante el ejemplo 4, se consiguió inversión completa a la función sensorial normal en la mayoría de animales en el grupo que recibe la dosis más elevada de meteorina (1,8 mg/kg). Es concebible, por lo 20 tanto, que la meteorina pueda dar como resultado inversión sustancialmente completa de alodinia en al menos un subconjunto de los sujetos tratados. En una realización preferida, el tratamiento da como resultado una modificación de la enfermedad en al menos un subconjunto de los sujetos tratados.

Hiperalgesia 25

La hiperalgesia es una respuesta extrema a un estímulo que normalmente es percibido como doloroso. El estímulo puede ser mecánico/táctil o térmico.

La hiperalgesia es similar a otras clases de dolor asociadas con daño a los nervios tales como alodinia, y en 30 consecuencia puede responder a tratamiento estándar para esta afección tal como se describe en la sección “alodinia”.

En una realización, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de hiperalgesia. Preferentemente la hiperalgesia a tratar es hiperalgesia térmica. En una realización de la presente invención, la 35 hiperalgesia a tratar es hiperalgesia por frío. En otra realización de la presente invención, la hiperalgesia a tratar es hiperalgesia por calor. Tal como se ha afirmado anteriormente, se consiguió inversión sustancialmente completa de la función sensorial normal en animales que recibían la dosis más elevada de meteorina. Es concebible, por lo tanto, que la meteorina puede dar como resultado la inversión completa de hiperalgesia en al menos un subconjunto de los sujetos tratados. En una realización preferida, el tratamiento da como resultado modificación de la enfermedad en al 40 menos un subconjunto de los sujetos tratados.

Dolor espontáneo

El dolor espontáneo se caracteriza por ser dolor que se produce sin ningún desencadenante. Los síntomas clínicos 45 del dolor espontáneo incluyen sensaciones de sensación parestésica, dolor punzante, escozor, incisivo y paroxístico (similar a choque eléctrico) algunas veces asociado con disestesia y/o parestesia. La disestesia se define como una sensación de tacto desagradable, anormal, y puede considerarse como una clase de dolor que se produce espontáneamente. La parestesia se define como una sensación de hormigueo, pinchazos o entumecimiento de la piel de un sujeto sin efecto físico a largo plazo aparente. Parece probable que el dolor espontáneo esté causado por 50 actividad espontánea de neuronas en la vía aferente.

En una realización, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de dolor espontáneo. Es concebible, por lo tanto, que la meteorina pueda dar como resultado la inversión completa de dolor espontáneo en al menos un subconjunto de los sujetos tratados. En una realización preferida, el tratamiento da como resultado 55 modificación de la enfermedad en al menos un subconjunto de los sujetos tratados.

Dolor fantasma

Las sensaciones de dolor fantasma se describen como percepciones que un sujeto experimenta en relación con una extremidad o un órgano que no es físicamente parte del cuerpo. Las sensaciones de dolor fantasma se registran de la forma más frecuente después de la amputación de un brazo o una pierna, pero también pueden producirse después de la eliminación de una mama o un órgano interno. La sensación de dolor fantasma varía de un individuo a otro. El dolor fantasma puede experimentarse como sensaciones relacionadas con el movimiento, el tacto, la 5 temperatura, la presión y el picor.

En una realización, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de dolor fantasma.

Causas de alodinia e hiperalgesia 10

Alodinia, hiperalgesia y, en general, hipersensibilidad pueden surgir a partir de diversos trastornos, algunos de los cuales se enumeran a continuación.

Clase: Subtipo de causa

Lesión mecánica traumática: Neuropatía por atrapamiento

: Transección del nervio

: Lesión de la médula espinal

: Dolor postquirúrgico

: Dolor del miembro fantasma

: Formación de cicatrices

: Ciática

Metabólicos o nutricionales: Neuropatía alcohólica

: Pelagra

: Beriberi

: Síndrome de ardor en los pies

Vírica: Neuralgia postherpética

: Dolor de HIV/SIDA

Neurotoxicidad: Vincristina

: Cisplatino

: Taxol

: Talio

: Arsénico

: Terapia de radiación

Enfermedad (no vírica): Diabetes Tumores malignos Esclerosis múltiple Neuralgia trigeminal Síndrome de Guillain-Barré Enfermedad de Fabry Enfermedad de Tangier Vasculitis / angiopática Amiloide Idiopática

Isquemia: Síndrome talámico

: Dolor post-accidente cerebrovascular

15

Por lo tanto, en una realización, la invención se refiere un tratamiento de alodinia, hiperalgesia o hipersensibilidad en un sujeto al que se le diagnosticó un trastorno enumerado en la tabla anterior. Preferentemente, la invención se refiere al tratamiento de hipersensibilidad en un sujeto al que se le diagnosticó neuropatía diabética dolorosa, neuralgia postherpética o ciática. Más preferentemente, la invención se refiere al tratamiento de alodinia o hiperalgesia en un sujeto al que se le diagnosticó neuropatía diabética dolorosa, neuralgia postherpética o ciática. En 20 una realización aún más preferida, la invención se refiere al tratamiento de alodinia en un sujeto al que se le diagnosticó neuropatía diabética dolorosa, neuralgia postherpética o ciática.

Meteorina para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma 25

En una realización, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma. En una realización más preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia, hiperalgesia y/o dolor espontáneo. En aún una realización, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de hiperalgesia y/o alodinia.

5

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia. En una realización más preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia mecánica. En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia térmica. En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia por frío. En una realización aún más preferida, la presente invención se 10 refiere al uso de meteorina para el tratamiento de alodinia por calor.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de dolor espontáneo.

15

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de hiperalgesia. En una realización más preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de hiperalgesia mecánica. En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de hiperalgesia térmica. En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de hiperalgesia por frío. En una realización aún más preferida, la presente 20 invención se refiere al uso de meteorina para el tratamiento de hiperalgesia por calor.

Los ejemplos adjuntos (ejemplo 4) demuestran que el efecto de meteorina es de larga duración, en particular en vista de la relativamente corta semi-vida sérica de la meteorina (figura 11). Esto indica que la meteorina no solamente alivia los síntomas de hiperalgesia, hipersensibilidad, alodinia y dolor espontáneo, sino que la meteorina 25 puede ser realmente capaz de modificar la enfermedad o el trastorno subyacente. Por lo tanto, en una realización, el tratamiento es un tratamiento que modifica la enfermedad.

Los ejemplos también demuestran que algunos de los sujetos puestos a prueba experimentaron inversión completa de su disfunción sensorial. Por lo tanto, en una realización, el tratamiento da como resultado inversión completa de 30 disfunción sensorial, preferentemente inversión completa de alodinia, más preferentemente inversión completa de alodinia táctil en al menos un subconjunto de los sujetos tratados. En otra realización preferida, el tratamiento da como resultado sustancialmente inversión completa de hiperalgesia en al menos un subconjunto de los sujetos tratados.

35

Uso de meteorina para el tratamiento de dolor neuropático

El dolor neuropático es una categoría de dolor que incluye varias formas de dolor crónico y que resulta de la disfunción de tejido nervioso en lugar de somático. El dolor neuropático, que es dolor que se deriva de disfunción del sistema nervioso central o periférico, también puede ser consecuencia de daño a los nervios periféricos o a regiones 40 del sistema nervioso central, puede resultar de enfermedad, o puede ser idiopático. Los síntomas del dolor neuropático incluyen sensaciones de escozor, hormigueo, electricidad, sensación parestésica, parestesia, disestesia, rigidez, entumecimiento en las extremidades, sensaciones de distorsión corporal, alodinia (dolor evocado por una estimulación que normalmente es inocua), hiperalgesia (sensibilidad anormal al dolor), hiperpatía (una respuesta exagerada de dolor que persiste largo tiempo después de que los estímulos del dolor cesan), dolor fantasma y dolor 45 espontáneo.

Las actuales terapias para la gestión del dolor neuropático son de beneficio limitado para muchos pacientes, e implican efectos secundarios indeseables o toxicidades limitantes de la dosis. Además, las terapias actuales son sintomáticas, no modificadoras de la enfermedad. Sigue existiendo una necesidad de terapias mejoradas para la 50 gestión y el tratamiento del dolor neuropático, especialmente aquellas que tienen la capacidad de modificar la enfermedad.

En una serie de estudios en animales los inventores de la presente invención han observado que la administración de dosis de meteorina causa una mejoría de larga duración en alodinia táctil y térmica, así como dolor espontáneo. 55 En varios casos, el efecto terapéutico aún es detectable en los animales una semana después de la administración de la última dosis. En otros casos, el efecto terapéutico aún es detectable y significativamente diferente del tratamiento de control durante hasta dos o incluso tres semanas después de la última dosis.

En los casos observados, el polipéptido de meteorina ha sido administrado como inyecciones subcutáneas o intratecales cada segundo o tercer día durante 9 u 11 días. La meteorina es indetectable en el suero de animales 24 horas después de la inyección subcutánea. Por lo tanto, cualquier acumulación de meteorina con los esquemas de administración observados usados es improbable. El efecto de larga duración de la meteorina puede estar causado por cambios epigenéticos o mediante reparación de los daños a los nervios en los animales. La reparación puede 5 ser a través de recuperación de la función, neurogenésis o diferenciación de precursores neuronales.

En cualquier caso, es altamente sorprendente que un efecto terapéutico pueda observarse un tiempo tan largo después del cese del tratamiento. En fármacos aprobados para el dolor neuropático, tales como gabapentina, inhibidores de la recaptación de serotonina-norepinefrina, antidepresivos tricíclicos, analgésicos, cannabinoides, y 10 opiodes, el efecto terapéutico no se observa un tiempo tan largo después de la administración de la última dosis. Por ejemplo, en el caso de opioides, la eficacia está supeditada al fármaco que está presente en suero sanguíneo. Cuando el nivel en suero sanguíneo del fármaco cae por debajo de cierto umbral, no se observa ningún efecto terapéutico.

15

Como los inventores de la presente invención han demostrado, la meteorina administrada a intervalos de dosificación largos es eficaz en el tratamiento de diferentes síntomas de diferentes tipos de dolor neuropático incluyendo alodinia térmica y táctil y dolor espontáneo, los inventores de la presente invención contemplan que el dolor neuropático en general puede ser tratado administrando polipéptido de meteorina a intervalos de dosificación relativamente largos. 20

Por un intervalo de dosificación relativamente largo se pretende al menos 2 días entre dosificaciones, tal como al menos 3 días entre dosificaciones, por ejemplo 2 dosificaciones por semana. Más preferentemente, el intervalo de dosificación largo es de al menos una semana, tales como al menos 2 semanas, más preferentemente al menos 3 semanas, tal como al menos 4 semanas, o al menos un mes. 25

Expresado de una manera diferente, los intervalos de dosificación son tan largos que, después de una dosificación de polipéptido de meteorina, el polipéptido ya no es detectable en el suero del sujeto a tratar cuando se administra la siguiente dosificación. En otra realización, el nivel en suero sanguíneo está por debajo de 10 ng/ml, tal como por debajo de 5 ng/ml, más preferentemente por debajo de 1 ng/ml, tal como por debajo de 0,5 ng/ml, por ejemplo por 30 debajo de 0,1 ng/ml.

En algunas realizaciones, el intervalo de dosificación largo viene precedido por administración inicial más frecuente de meteorina, por ejemplo, dos veces al día, una vez al día, una vez cada día, una vez cada tres días, o una vez cada cuatro días. Esta pauta posológica inicial puede mantenerse por ejemplo, durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 21 35 días, o más. Una vez completada esta pauta posológica, la meteorina puede administrarse con menos frecuencia, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere al uso de meteorina en un método de tratamiento de dolor neuropático en un sujeto humano que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad 40 terapéuticamente efectiva de un polipéptido neurotrófico que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde dicha administración es tres veces por semana o de forma más infrecuente.

Preferentemente, la administración es administración semanal o más infrecuente. Aún más preferentemente la 45 administración es administración quincenal o más infrecuente.

En una realización, el efecto terapéutico dicho tratamiento mejora al menos un síntoma de dolor neuropático durante todo el periodo entre administraciones del polipéptido. El al menos un síntoma puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo, dolor fantasma, sensaciones de escozor, hormigueo, 50 electricidad, sensación parestésica, parestesia, disestesia, rigidez, entumecimiento en las extremidades, sensaciones de distorsión corporal e hiperpatía (una respuesta exagerada de dolor que persiste largo tiempo después de que los estímulos del dolor cesan). Preferentemente el al menos un síntoma se selecciona de entre alodinia, hiperalgesia y dolor espontáneo. Más preferentemente alodinia.

55

Preferentemente, dicho tratamiento no mantiene niveles medibles de dicho polipéptido en el suero de dicho sujeto durante todo el periodo entre administraciones del polipéptido.

Preferentemente, el nivel de dicho polipéptido en el suero de dicho sujeto cae por debajo de 10 ng/ml, tal como por debajo de 5 ng/ml, más preferentemente por debajo de 1 ng/ml, tal como por debajo de 0,5 ng/ml, por ejemplo por debajo de 0,1 ng/ml entre administraciones del polipéptido.

En otro aspecto relacionado, se divulga un método de tratamiento dolor neuropático en un sujeto humano que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido neurotrófico 5 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde dicho tratamiento no mantiene niveles medibles de dicho polipéptido en el suero de dicho sujeto durante todo el intervalo entre administraciones del polipéptido.

La invención también se refiere al uso del polipéptido de la invención en dichos métodos de tratamiento de dolor 10 neuropático y al uso de los polipéptidos de la invención en la fabricación de un medicamento para dicho tratamiento de dolor neuropático.

Preferentemente, el nivel de dicho polipéptido en el suero de dicho sujeto cae por debajo de 10 ng/ml, tal como por debajo de 5 ng/ml, más preferentemente por debajo de 1 ng/ml, tal como por debajo de 0,5 ng/ml, por ejemplo por 15 debajo de 0,1 ng/ml entre administraciones del polipéptido.

Para estos aspectos de la invención que se refieren al tratamiento del dolor neuropático usando intervalos de dosificación largos, el polipéptido neurotrófico preferentemente tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, más preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al 20 menos el 95%, más preferentemente al menos el 98%.

En una realización, el polipéptido neurotrófico comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO: 11.

Preferentemente el polipéptido neurotrófico tiene residuos de cisteína en las posiciones 7, 28, 59, 95, 148, 151, 161, 25 219, 243 y 265 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

Meteorina

La presente invención se refiere al uso de polipéptidos que son identificados como proteína meteorina y 30 polinucleótidos que codifican dicha proteína, en el tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma. La administración está, en una realización, contemplada para ser mediante uso de una cápsula para administración de una meteorina biológicamente activa secretada y/o un homólogo de la misma a un sujeto. La proteína meteorina ha sido identificada en seres humanos (SEQ ID No. 2), ratón (SEQ ID No. 5) y rata (SEQ ID No. 8) y diversas otras especies. 35

La meteorina humana existe como un precursor de 293 aminoácidos, que puede ser procesado para dar origen a al menos un péptido biológicamente activo. La meteorina se expresa a niveles elevados en el sistema nervioso y el ojo, y en particular subrregiones del cerebro. Los precursores de meteorina de ratón (SEQ ID No 5) y rata (SEQ ID No 8) consisten en 291 aminoácidos, y los % de identidad con la proteína meteorina humana (SEQ ID NO: 2) son 80,3 y 40 80,2, respectivamente (véase la figura 6).

La meteorina humana contiene una secuencia de péptido señal N-terminal de 23 aminoácidos, que se escinde en el motivo de secuencia ARA-GY. Este sitio de escisión del péptido señal es predicho mediante el método SignalP. El extremo N de meteorina de ratón ha sido verificado mediante secuenciación N-terminal (Jorgensen et al., 45 Characterization of meteorin - An evolutionary conserved neurotrophic factor, J mol Neurosci septiembre de 2009; 39 (1-2): 104-116).

La tabla 1 muestra el % de identidad de secuencia entre meteorina humana de longitud completa frente a secuencias de ratón y de rata. Véase el alineamiento en la figura 6a. 50

Secuencia: % id

ser humano: -

ratón: 80,3

rata: 80,2

La tabla 2 muestra el % de identidad de secuencia entre meteorina humana frente a secuencias de ratón y de rata después de la eliminación del péptido señal N-terminal. Véase el alineamiento en la figura 6b.

Secuencia: % id

ser humano: -

ratón: 81,9

rata: 79,6

Basándose en los residuos totalmente conservados, puede derivarse una secuencia consenso para meteorina madura (figura 6c), donde X se selecciona independientemente de entre cualquiera de los 21 aminoácidos de origen natural codificados por ADN. En una realización preferida, una meteorina variante comprende la secuencia consenso. 5

El efecto terapéutico de meteorina puede estar mediado a través de un efecto neurotrófico, un efecto sobre el crecimiento incluyendo proliferación, regeneración, recuperación de la función, mejora de la función, supervivencia, migración y/o diferenciación de células diana.

10

Una función biológica de la meteorina es la capacidad de inducir crecimiento de neuritas en cultivos de ganglios de la raíz dorsal disociados (DRG) tal como se describe en Jørgensen et al., Characterization of meteorin - An evolutionary conserved neurotrophic factor, J mol Neurosci septiembre de 2009; 39 (1-2): 104-116 y Nishino et al., “Meteorin: a secret3ed protein that regulates glial cell differentitaion and promotes axonal extension”, EMBO J., 23(9): 1998-2008 (2004). 15

Debido a la alta conservación de las cisteínas, se espera que estos residuos jueguen un importante papel en la estructura secundaria y terciaria de la proteína bioactiva. Una o más de las cisteínas pueden participar en la formación de puentes de cisteína intra- y/o intermoleculares.

20

Se ha demostrado que la meteorina tiene un efecto estimulante sobre el porcentaje de neuronas generadas por una línea de células madre neurales humanas (hNS1, anteriormente llamadas HNSC.100) y la meteorina también tiene un efecto estimulante sobre la generación de neuronas en un cultivo primario de células estriatales de rata (véase el documento WO 2005/095450).

25

Administración y formulación

Los polipéptidos de meteorina pueden administrarse de cualquier manera, que sea médicamente aceptable. Esto puede incluir inyecciones, mediante vías parenterales tal como intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, intratecal, intracerebroventricular, 30 intercerebral, u otras así como nasal, o tópica. La administración de liberación lenta también está incluida específicamente en la invención, mediante medios tales como inyecciones “depot” o implantes erosionables.

La administración de meteorina de acuerdo con esta invención puede conseguirse usando cualquier medio de administración adecuado, incluyendo: 35

inyección, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intraarterial, por vía intramuscular, por vía intratecal o a otro sitio adecuado;

bomba (véase, por ejemplo, Annals of Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer, 41: 1270 (1993); Cancer Research, 44: 1698 (1984)), 40

microencapsulación (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4.352.883; 4.353.888; y 5.084.350,

implantes poliméricos de liberación lenta (véase, por ejemplo, Sabel, Patente de Estados Unidos 4.883.666,

células encapsuladas (véase, la sección “Cápsula biocompatible”),

injertos celulares no encapsulados (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.082.670 y 5.618.531; e

inhalación. 45

La administración puede ser mediante inyecciones periódicas de una embolada de la preparación, o puede hacerse más continua mediante administración intravenosa o intraperitoneal a partir de un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa IV) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, un órgano bioartificial, una cápsula biocompatible de células productoras de meteorina, o una colonia de células productoras de meteorina implantadas). 50 Véase, por ejemplo, los documento US 4.407.957, 5.798.113 y 5.800.828.

La administración localizada puede ser mediante medios tales como administración mediante un catéter a una o más arterias. En una realización de la presente invención, la administración localizada comprende administración usando células encapsuladas (tal como se describe en la sección “cápsula biocompatible”). Un tipo adicional de 55 administración localizada comprende administración local de vectores de terapia génica, que son inyectados normalmente.

En una realización preferida de la presente invención, la administración es inyección parenteral, preferentemente inyección subcutánea o inyección intratecal.

Aunque es posible que los compuestos de la presente invención se administren como el producto químico en bruto, 5 se prefiere presentarlos en forma de una formulación farmacéutica. Las formulaciones farmacéuticas pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo tal como se describe en el documento Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2005, Lippincott, Williams & Wilkins.

La expresión “transportador farmacéuticamente aceptable” significa uno o más ingredientes orgánicos o inorgánicos, 10 naturales o sintéticos, con el que el polipéptido de meteorina se combina para facilitar su aplicación. Un transportador adecuado incluye solución salina estéril aunque otras soluciones estériles y suspensiones estériles isotónicas acuosas y no acuosas que se sabe que son farmacéuticamente aceptables son conocidas para los expertos en la materia.

15

Los compuestos de la presente invención pueden formularse para administración parenteral y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas llenadas previamente, infusión de pequeño volumen o en recipientes multidosis, opcionalmente con un conservante añadido. Las composiciones pueden asumir formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos u acuosos, por ejemplo soluciones en polietilenglicol acuoso. Los ejemplos de transportadores, diluyentes, disolventes o vehículos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, 20 aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva), y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y puede contener agentes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes o de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo, obtenido mediante aislamiento aséptico de un sólido estéril o mediante liofilización a partir de solución para constitución antes de uso con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril. 25

Una “cantidad efectiva” se refiere a esa cantidad que es capaz de mejorar o retardar la progresión de la afección patológica, degenerativa o dañina. Una cantidad efectiva puede determinarse de forma individual y se basará, en parte, en la consideración de los síntomas a tratar y los resultados buscados. Una cantidad efectiva puede ser determinada por un experto en la materia empleando dichos factores y sin usar más que experimentación rutinaria. 30

Un sistema de liposomas puede ser cualquier variedad de vesículas unilaminares, vesículas multilaminares, vesículas plurilaminares estables, y pueden prepararse y administrarse de acuerdo con métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo de acuerdo con las enseñanzas de las patentes de Estados Unidos 5.169.637, 4.762.915, 5.000.958 o 5.185.154. Además, puede ser deseable expresar los nuevos polipéptidos de 35 esta invención, así como otros polipéptidos seleccionados, como lipoproteínas, para potenciar su unión a liposomas. Una proteína meteorina recombinante se purifica, por ejemplo, a partir de células CHO mediante cromatografía por inmunoafinidad o cualquier otro método conveniente, a continuación se mezcla con liposomas y se incorpora en ellos con alta eficiencia. La proteína encapsulada en liposoma puede ponerse a prueba in vitro para cualquier efecto sobre estimulación del crecimiento celular. 40

Donde se desea administración de liberación lenta de un polipéptido de meteorina en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración de un polipéptido de meteorina, se contempla la microencapsulación de un polipéptido de meteorina. La microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida se ha realizado con éxito con hormona 45 del crecimiento humana (rhGH), interferón-(rhIFN-), interleuquina-2, y MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, “Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”, en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds.; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y patente de Estados Unidos N.º 5.654.010. 50

Las formulaciones de liberación lenta de estas proteínas se desarrollaron usando polímero de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos lácticos y glicólicos, pueden aclararse rápidamente dentro del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse desde meses a años dependiendo de su peso 55 molecular y composición. Lewis, “Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”, en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), págs. 1-41.

En una realización de la presente invención, se contempla una composición que comprende meteorina. La composición puede comprender un polipéptido aislado tal como se describe en el presente documento, un ácido nucleico aislado tal como se describe en el presente documento, un vector de expresión que codifica meteorina tal como se describe en el presente documento, una línea celular que expresa meteorina tal como se describe en el presente documento o una cápsula biocompatible que secreta meteorina tal como se describe en el presente 5 documento.

Dosificaciones

Se contemplan diversos regímenes posológicos para administración sistémica. En una realización, métodos de 10 administración a un sujeto de una formulación que comprende un polipéptido de meteorina incluyen administrar meteorina a una dosificación de entre 1 µg/kg y 10.000 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra realización, la dosificación está entre 1 µg/kg y 7.500 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización adicional, la dosificación está entre 1 µg/kg y 5.000 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización diferente, la dosificación está entre 1 µg/kg y 2.000 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra realización 15 más, la dosificación está entre 1 µg/kg y 1.000 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra realización más, la dosificación está entre 1 µg/kg y 700 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización más preferible, la dosificación está entre 5 µg/kg y 500 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización la más preferible, la dosificación está entre 10 µg/kg y 100 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una realización preferida el sujeto a tratar es humano. 20

Orientación sobre dosificaciones y métodos de administración particulares se proporciona en la bibliografía; véase, por ejemplo, los documentos WO 02/78730 y WO 07/100898. Orientación sobre el cálculo de las dosificaciones equivalentes humanas basándose en dosificaciones usadas en experimentos en animales se proporciona en Reagan-Shaw et al., FASEB J, 22, 659-661 (2007). 25

La dosis administrada debe ajustarse cuidadosamente a la edad, el peso y la afección del individuo que está siendo tratado, así como la vía de administración, forma farmacéutica y régimen posológico, y el resultado deseado, y la dosificación exacta deben ser determinados por el facultativo.

30

En una realización de la presente invención, la administración se repite a diario. En otra realización, la administración se repite al menos 1-3 veces por semana, tales como 2-5 veces por semana, tales como 3-6 veces por semana, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, o una vez cada 7 días.

35

En otras realizaciones, la meteorina se administra a un intervalo de dosificación relativamente largo. Un intervalo de dosificación relativamente largo pretende incluir al menos 2 días entre dosificaciones, tales como al menos 3 días entre dosificaciones, por ejemplo 2 dosificaciones por semana. Más preferentemente el intervalo de dosificación largo es al menos una semana, tal como al menos 2 semanas, más preferentemente al menos 3 semanas, tal como al menos 4 semanas, o al menos un mes. 40

Expresado de diferente manera, los intervalos de dosificación son tal largos so que después de una dosificación del polipéptido de meteorina, el polipéptido ya no es detectable en el suero del sujeto a tratar cuando se administra la siguiente dosificación. En otra realización, el nivel en suero sanguíneo está por debajo de 10 ng/ml, tal como por debajo de 5 ng/ml, más preferentemente por debajo de 1 ng/ml, tal como por debajo de 0,5 ng/ml, por ejemplo por 45 debajo de 0,1 ng/ml.

En algunas realizaciones, la administración inicial de meteorina es, por ejemplo, dos veces al día, a diario, una vez cada dos días, una vez cada tres días, o una vez cada cuatro días. Esta pauta posológica puede mantenerse por ejemplo, durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 21 días, o más. Una vez completada esta pauta posológica, la meteorina 50 puede administrarse con menor frecuencia, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente.

Polipéptidos de meteorina

Además de meteorina de longitud completa, meteorina sustancialmente de longitud completa y de prometeorina, la 55 presente invención proporciona variantes biológicamente activas de los polipéptidos. Un polipéptido o fragmento de meteorina es biológicamente activo si muestra una actividad biológica de meteorina de origen natural, tal como se describe en el presente documento, tal como ser neurotrófico. Debe entenderse que la invención se refiere a meteorina tal como se define en el presente documento.

La invención se refiere a una molécula de polipéptido aislada para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: 5

a) la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 3, 6 y 9;

b) una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 3, 6 y 9, donde la variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No.; y 10

c) un fragmento biológicamente activo de al menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) o b) donde el fragmento es al menos el 70% idéntico a dicha SEQ ID NO.

En una realización, la invención se refiere a un polipéptido aislado seleccionada de entre el grupo que consiste en:

15

i) AA30-AA288 de la SEQ ID No 2, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA25-AA293 de la SEQ ID No 2;

ii) AA28-AA286 de la SEQ ID No 8 y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA23-AA291 de la SEQ ID No 8;

iii) AA31-AA289 de la SEQ ID No 5 y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia 20 nativa en uno o ambos extremos, hasta AA26-AA294 de la SEQ ID No 5; y

iv) variantes de dichos polipéptidos, donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia seleccionada se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no más de 20 de los residuos de aminoácidos en la secuencia se cambien de este modo.

25

La actividad biológica preferentemente es actividad neurotrófica. Las variantes neurotróficamente activas pueden definirse con referencia al uno o más de los otros ensayos neurotróficos in vitro y/o in vivo descritos anteriormente en el documento WO 2005/095450, en particular el ensayo DRG.

Una actividad biológica preferida es la capacidad de desencadenar sustancialmente la misma respuesta que en el 30 ensayo DRG descrito en Jørgensen et al., Characterization of meteorin - An evolutionary conserved neurotrophic factor, J mol Neurosci septiembre de 2009; 39 (1-2): 104-116. En este ensayo, células DRG se cultivan en presencia de la secuencia codificante de meteorina humana de longitud completa (SEQ ID NO 3). Por sustancialmente la misma respuesta en el ensayo DRG, se entiende que el crecimiento de neuritas a partir de células DRG es al menos el 20% del número obtenido en el ensayo DRG descrito en Jorgensen et al., Characterization of meteorin - An 35 evolutionary conserved neurotrophic factor, J mol Neurosci septiembre de 2009; 39 (1-2): 104-116, más preferentemente al menos el 30%, más preferentemente al menos el 40%, más preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos el 60%, más preferentemente al menos el 70%, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90%. La actividad biológica de un fragmento o variante de meteorina también puede ser mayor que la de la 40 meteorina de origen natural (SEQ ID NO 3).

Las variantes pueden diferir de meteorina de origen natural en la secuencia de aminoácidos o en maneras que no implican la secuencia, o de ambas maneras. Las variantes de la secuencia de aminoácidos (“variantes de secuencia”) se producen cuando uno o más aminoácidos en meteorina de origen natural se sustituye por un 45 aminoácido natural diferente, un derivado de aminoácido o aminoácido no nativo. Variantes particularmente preferidas incluyen meteorina de origen natural, o fragmentos biológicamente activos de meteorina de origen natural, cuyas secuencias difieren de la secuencia de tipo silvestre en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas y/o semiconservativas, que normalmente tienen una influencia mínima sobre la estructura secundaria y terciaria y la naturaleza hidrófoba de la proteína o péptido. Las variantes también pueden tener secuencias, que difieren en una o 50 más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos no conservativas, que no suprimen la actividad biológica de meteorina. El alineamiento de Clustal W en la figura 6 puede usarse para predecir qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse sin afectar sustancialmente a la actividad biológica de la proteína. En una realización preferida, una secuencia de meteorina variante comprende la secuencia consenso que tiene la SEQ ID NO 11.

55

Las sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación “fuerte”) se considerarán sustituciones conservativas dentro del significado de la presente invención -S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W. Las sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación “débil”) se considerarán sustituciones semiconservativas dentro del significado de la presente invención -C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.

Otras variantes dentro de la invención son aquellas con modificaciones que incrementan la estabilidad del péptido. Dichas variantes pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que sustituyen a los enlaces peptídicos) en la secuencia peptídica. También se incluyen: variantes que incluyen residuos diferentes de L-5 aminoácidos de origen natural, tales como D-aminoácidos o aminoácidos de origen no natural o sintéticos tales como beta o gamma aminoácidos y variantes cíclicas. La incorporación de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos en el polipéptido puede incrementar su resistencia a proteasas. Véase, por ejemplo, el documento US 5.219.990. Las variantes de splicing se incluyen específicamente en la invención.

10

Cuando el resultado de una sustitución dada no puede predecirse con certidumbre, los derivados pueden ensayarse fácilmente de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento para determinar la presencia o ausencia de actividad neurotrófica, preferentemente usando el ensayo DRG descrito en Jørgensen et al., Characterization of meteorin - An evolutionary conserved neurotrophic factor, J mol Neurosci septiembre de 2009; 39 (1-2): 104-116. 15

En una realización, el polipéptido es una variante alélica de origen natural de la secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 3, 6 y 9. Este polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que es la traducción de una secuencia de ácido nucleico que difiere en un único nucleótido de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 1, 4 y 7. 20

Un polipéptido variante, tal como se describe en el presente documento, en una realización comprende un polipéptido donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia seleccionada se cambia para proporcionar una sustitución conservativa.

25

Variantes dentro del alcance de la invención en una realización incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 70 por ciento de identidad con meteorina humana, murina o de rata (SEQ ID NO: 3, 6 y 9). Más preferentemente, la identidad de secuencia es al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos el 98%. 30

En una realización preferida, la identidad de secuencia de la meteorina variante se determina con referencia a un polipéptido de meteorina humana (SEQ ID No 3).

En una realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen al 35 menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 3, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos el 98%.

En una realización, variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que 40 tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 6, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos el 98%.

En una realización, variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que 45 tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 9, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos el 98%.

En una realización, variantes de meteorina preferidas incluyen proteínas que comprenden 50-270 aminoácidos, más 50 preferentemente 75-270 aminoácidos, más preferentemente 90-270 aminoácidos, más preferentemente 100-270 aminoácidos, más preferentemente 125-270 aminoácidos, más preferentemente 150-270 aminoácidos, más preferentemente 175-270 aminoácidos, más preferentemente 200-270 aminoácidos, más preferentemente 225-270 aminoácidos, más preferentemente 250-270 aminoácidos.

55

En una realización, una meteorina variante en posiciones correspondientes comprende los residuos marcados en la figura 6 como completamente conservados (*), más preferentemente una meteorina variante también comprende en posiciones correspondientes los residuos marcados en la figura 6 como conservados fuertemente (: los grupos conservados fuertemente incluyen: S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W), más preferentemente una meteorina variante también comprende en posiciones correspondientes los residuos marcados en la figura 6 como menos conservados (. los grupos menos conservados incluyen: C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y). En particular, se contempla que las cisteínas conservadas deben estar ubicadas en posiciones correspondientes en una meteorina variante. Por lo tanto, en una realización, una secuencia de meteorina variante tiene residuos de cisteína en las posiciones 7, 28, 59, 95, 5 148, 151, 161, 219, 243 y 265 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

En una realización, el polipéptido neurotrófico comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO: 11. La secuencia consenso comprende los residuos de aminoácidos conservados en meteorina humana de ratón y de rata, tal como se muestra en la figura 6. Preferentemente, el polipéptido neurotrófico tiene residuos de cisteína en las posiciones 7, 10 28, 59, 95, 148, 151, 161, 219, 243 y 265 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

Las modificaciones no de secuencia pueden incluir, por ejemplo, derivatización química in vivo o in vitro de partes de meteorina de origen natural, así como acetilación, metilación, fosforilación, carboxilación, PEG-ilación, o glucosilación. Al igual que es posible reemplazar sustituyentes de la proteína, también es posible sustituir grupos 15 funcionales, que están unidos a la proteína, por grupos caracterizados por características similares. Dichas modificaciones no alteran la secuencia primaria. Éstas serán inicialmente conservativas, es decir, el grupo de sustitución tendrá aproximadamente el mismo tamaño, forma, hidrofobicidad y carga que el grupo original.

Muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden estar modificados en un polipéptido dado, 20 mediante procesos naturales tales como glucosilación y otras modificaciones postraduccionales, o mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en polipéptidos de la presente invención están, por nombrar unos pocos ilustrativos, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de una fracción hemo, fijación covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, fijación covalente de un lípido o derivado de lípido, fijación 25 covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucación, glucosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN transferente a proteínas tal como arginilación, y ubiquitinación. 30

Dichas modificaciones son bien conocidas para los expertos en la materia y se han descrito con gran detalle en la bibliografía científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glucosilación, fijación de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en la mayoría de los textos básicos, tales como, por ejemplo, I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular 35 Properties, 2ª Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993. Muchas revisiones detalladas están disponibles sobre este tema, tales como, por ejemplo, las proporcionadas por Wold, F., en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990 y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992. 40

Además, la proteína puede comprender una marca proteica para permitir la posterior purificación y opcionalmente eliminación de la marca usando una endopeptidasa. La marca también puede comprender un sitio de escisión de proteasa para facilitar la posterior eliminación de la marca. Ejemplos no limitantes de marcas de afinidad incluyen una marca de polihis, una marca GST, una marca HA, una marca Flag, una marca C-myc, una marca HSV, una 45 marca V5, una marca de proteína de unión a maltosa, una marca de dominio de unión a celulosa. Preferentemente para producción y purificación, la marca es una marca polihis. Preferentemente, la marca es la parte C-terminal de la proteína.

La secuencia señal nativa de meteorina también puede sustituirse para incrementar la secreción de la proteína en 50 producción recombinante en otros tipos celulares de mamífero.

Las modificaciones pueden producirse en cualquier lugar en un polipéptido, que incluyen la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, mediante una modificación covalente, es común en polipéptidos de 55 origen natural y sintéticos y dichas modificaciones pueden estar presentes en polipéptidos de la presente invención, también. Por ejemplo, el residuo amino terminal de polipéptidos preparados en E. coli, antes del procesamiento proteolítico, de forma casi invariable será N-formilmetionina.

Las modificaciones que se producen en un polipéptido a menudo estarán en función de cómo se prepara. Para polipéptidos preparados expresando un gen clonado en un huésped, por ejemplo, la naturaleza y la medida de las modificaciones estarán determinadas en gran parte por la capacidad de modificación postraduccional de la célula huésped y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, la glucosilación a menudo no se produce en huéspedes bacterianos tales como E. coli. Por consiguiente, cuando se 5 desea glucosilación, un polipéptido debe expresarse en un huésped de glucosilación, generalmente una célula eucariota. Las células de insecto a menudo llevan a cabo las mismas glucosilaciones postraduccionales que las células de mamífero y, por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión en células de insecto para expresar de forma eficiente proteínas de mamífero que tienen patrones de glucosilación nativos, inter alia. Consideraciones similares se aplican a otras modificaciones. 10

Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o un grado variable en varios sitios en un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones.

En general, tal como se usa en el presente documento, el término polipéptido abarca todas de dichas 15 modificaciones, particularmente aquellas que están presentes en polipéptidos sintetizados expresando un polinucleótido en una célula huésped.

Secuencias de nucleótidos de meteorina

20

La invención proporciona uso médico de ADN genómico y cADN que codifica meteorina, incluyendo por ejemplo la secuencia de nucleótidos de cADN humano (SEQ ID No. 1 y 10), las secuencias de cADN de ratón (SEQ ID NO 4) y las secuencias de cADN de rata (SEQ ID No. 7).

Variantes de estas secuencias también están incluidas dentro del alcance de la presente invención. 25

La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: 30

i. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;

ii. Una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde la variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3; y

iii. Un fragmento biológicamente activo de al menos 50 aminoácidos contiguos de i) o ii) donde el fragmento es al 35 menos el 70% idéntico a la SEQ ID NO: 3.

En una realización, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma que codifica un polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: 40

ii) AA28-AA286 de la SEQ ID No 8 y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA23-AA291 de la SEQ ID No 8; 45

iii) AA31-AA289 de la SEQ ID No 5 y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA26-AA294 de la SEQ ID No 5; y

iv) variantes de dichos polipéptidos, donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia seleccionada se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no más de 20 de los residuos de aminoácidos en la secuencia se cambien de este modo. 50

La molécula de ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de una variante de ácido nucleico alélica de origen natural.

La molécula de ácido nucleico de la invención puede codificar un polipéptido variante, donde el polipéptido variante 55 tiene la secuencia polipetídica de una variante de polipéptido de origen natural.

En una realización, la molécula de ácido nucleico difiere en un único nucleótidos respecto a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 1, 4, 7 y 10.

Preferentemente, el polipéptido codificado tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID No. 3 preferentemente al menos el 65% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 70% de identidad de secuencia, más preferentemente, el 75% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 80% de identidad de secuencia, más preferentemente al 5 menos el 85% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 90% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia, más preferentemente donde el polipéptido tiene una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en dichas SEQ ID No. Dichas secuencias constituyen meteorina humana.

10

En una realización preferida, el polipéptido codificado comprende la secuencia consenso que tiene la SEQ ID NO: 11.

En una realización preferida, el polipéptido codificado tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID No. 3, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al 15 menos el 95%, más preferentemente al menos el 98%, más preferentemente donde dicho polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID No. 3.

En un aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste en 20

a) la secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 1, 4, 7 y 10;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 1, 4, 7 y 10; y

c) una secuencia de ácido nucleico de al menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de 25 entre el grupo que consiste en las SEQ ID No. 1, 4, 7 y 10;

En una realización, el polinucleótido aislado de la invención tiene al menos el 60, más preferentemente al menos el 65%, más preferentemente al menos el 70%, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 85%, más preferido al menos el 90%, más preferido al menos el 95%, más 30 preferido al menos el 98% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 1.

En una realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene al menos el 50%, preferentemente al menos el 60%, más preferentemente al menos el 70%, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente 35 al menos el 80%, preferentemente al menos el 85%, más preferido al menos el 90%, más preferido al menos el 95%, más preferido al menos el 98% de identidad de secuencia con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 10.

En una realización, variantes de polinucleótido aisladas preferidas de la invención comprenden 150-900 ácidos 40 nucleicos, más preferentemente 175-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 200-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 225-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 250-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 300-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 350-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 400-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 450-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 500-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 550-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 600-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 45 650-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 700-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 750-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 800-900 ácidos nucleicos, más preferentemente 850-900 ácidos nucleicos.

Un grupo preferido de polinucleótidos aislados incluye las SEQ ID No 1 y 10, que son secuencias de cADN de meteorina humana. En general, la secuencia de cADN es mucho más corta que las secuencias genómicas y se 50 inserta mucho más fácilmente en un vector de expresión apropiado y se transduce/transfecta en una célula de producción o una célula humana in vivo o ex vivo.

Además, las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen secuencias, que son derivados de estas secuencias. La invención también incluye vectores, liposomas y otros vehículos transportadores, que abarcan una 55 de estas secuencias o un derivado de una de estas secuencias. La invención también incluye proteínas transcritas y traducidas a partir de cADN de meteorina, preferentemente cADN de meteorina humana, incluyendo aunque sin limitarse a meteorina humana y derivados y variantes.

Moléculas de ácido nucleico con optimización de codones para expresión potenciada en células huésped seleccionadas, incluyendo aunque sin limitarse a E. coli, especies de levadura, hámster chino, cría de hámster, insecto, hongo, y ser humano también están contempladas.

Ácidos nucleicos variantes pueden prepararse mediante métodos de mutagénesis del estado de la técnica. Los 5 métodos para mezclar secuencias codificantes de ser humano con las de ratón, rata o chimpancé también están contemplados.

Ácidos nucleicos variantes preparados intercambiando aminoácidos presentes en meteorina humana con el aminoácido presente en meteorina de ratón o de rata en la posición correspondiente, si este aminoácido es diferente 10 del presente en meteorina humana.

Vectores virales

En sentido amplio, la terapia génica busca transferir nuevo material genético a las células de un paciente con un 15 beneficio terapéutico resultante para el paciente. Dichos beneficios incluyen tratamiento o profilaxis de una amplia gama de enfermedades, trastornos y otras afecciones.

Los enfoques de terapia génica ex vivo implican modificación de células aisladas (incluyendo aunque sin limitarse a células madre, células precursoras neurales y de la glia, y células madre fetales), que a continuación se infunden, 20 injertan o trasplantan de otro modo en el paciente. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.º 4.868.116, 5.399.346 y 5.460.959. La terapia génica in vivo busca dirigirse directamente al tejido del paciente huésped in vivo.

Virus útiles como vectores de transferencia génica incluyen papovavirus, adenovirus, virus vaccinia, virus 25 adenoasociado, herpesvirus y retrovirus. Los retrovirus adecuados incluyen el grupo que consiste en HIV, SIV, FIV, EIAV, MoMLV. Un grupo adicional de retrovirus adecuados incluye el grupo que consiste en HIV, SIV, FIV, EAIV, CIV. Otro grupo de vectores virales preferidos incluye el grupo que consiste en alfavirus, adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, HSV, coronavirus, virus del papiloma bovino, Mo-MLV, preferentemente virus adenoasociado. 30

Los virus preferidos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso son lentivirus y virus adenoasociados. Ambos tipos de virus pueden integrarse en el genoma sin divisiones celulares, y ambos tipos han sido puestos a prueba en estudios en animales preclínicos para indicaciones del sistema nervioso, en particular el sistema nervioso central. 35

Métodos para la preparación de AAV se describen en la técnica, por ejemplo US 5.677.158. Los documentos US 6.309.634 y US 6.683.058 describen ejemplos de administración de AAV al sistema nervioso central.

Preferentemente, un vector de lentivirus es una partícula de lentivirus defectuosa en replicación. Dicha partícula de 40 lentivirus puede producirse a partir de un vector lentiviral que comprende una LTR lentiviral en 5’, un sitio de unión de tARN, una señal de empaquetamiento, un promotor enlazado de forma operativa a una señal de polinucleótidos que codifica dicha proteína de fusión, un origen de síntesis de ADN de segunda cadena y una LTR lentiviral en 3’. Métodos para la preparación y la administración in vivo de lentivirus a células neurales se describen en el documento US 20020037281 (Methods for transducing neural cells using lentiviral vectors). 45

Los vectores retrovirales son los vectores usados más comúnmente en ensayos clínicos en ser humano, dado que portan 7-8 kb y dado que tienen la capacidad de infectar células y tienen su material genético integrado de forma estable en la célula huésped con alta eficiencia. Véase, por ejemplo, los documentos WO 95/30761; WO 95/24929. Los oncovirinae requieren al menos una ronda de proliferación de células dianas para transferencia e integración de 50 secuencias de ácido nucleico exógenas en el paciente. Los vectores retrovirales se integran aleatoriamente en el genoma del paciente. Los retrovirus pueden usarse para dirigirse a células madre del sistema nervioso dado que muy pocas divisiones celulares tienen lugar en otras células del sistema nervioso (en particular el SNC).

Se ha descrito tres clases de partículas retrovirales; ecotrópicas, que pueden infectar células murinas de forma 55 eficiente, y anfotróficas, que pueden infectar células de muchas especies. La tercera clase incluye retrovirus xenotróficos que pueden infectar células de especies diferentes de las especies que produjeron el virus. Su capacidad para integrarse solamente en el genoma de células en división ha hecho a los retrovirus atractivos para marcar linajes celulares en estudios en desarrollo y para administrar genes terapéuticos o inductores de apoptosis a cánceres o tumores.

Para uso en pacientes humanos, los vectores retrovirales deben ser defectuosos en replicación. Esto impide la generación adicional de partículas retrovirales infecciosas en el tejido diana--en su lugar, el vector defectuoso en replicación se convierte en un transgén “cautivo” estable incorporado en el genoma de la célula diana. Normalmente 5 en vectores defectuosos en replicación, los genes gag, env y pol han sido delecionados (junto con la mayoría del resto del genoma viral). ADN heterólogo se inserta en lugar de los genes virales delecionados. Los genes heterólogos pueden estar bajo el control del promotor heterólogo endógeno, otro promotor heterólogo activo en la célula diana, o la LTR 5’ retroviral (la LTR viral es activa en diversos tejidos). Normalmente, los vectores retrovirales tienen una capacidad transgénica de aproximadamente 7-8 kb. 10

Los vectores retrovirales defectuosos en replicación requieren provisión de las proteínas virales necesarias para la replicación y el ensamblaje en trans, a partir de, por ejemplo, líneas celulares de empaquetamiento diseñadas. Es importante que las células de empaquetamiento no liberen virus competentes en replicación y/o virus auxiliares. Esto se ha conseguido expresando proteínas virales de ARN que carecen de la señal ψ, y que expresan los genes 15 gag/pol y el gen env a partir de unidades transcripcionales diferentes. Además, en algunos retrovirus de 2ª y 3ª generación, las LTR en 5’ han sido sustituidas por promotores no virales que controlan la expresión de estos genes, y el promotor 3' ha sido minimizado para contener solamente el promotor proximal. Estos diseños minimizan la posibilidad de recombinación que causa producción de vectores competentes en replicación o virus auxiliares.

20

Vectores de expresión

La construcción de vectores para la expresión recombinante de polipéptidos de meteorina para uso en la invención puede conseguirse usando técnicas convencionales que no requieren explicación detallada a un experto en la materia. Para revisión, sin embargo, los expertos en la materia pueden desear consultar el documento Maniatis et 25 al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982). Pueden usarse vectores de expresión para generar células productoras para producción recombinante de polipéptidos de meteorina para uso médico, y para generar células terapéuticas que secreten polipéptidos de meteorina para terapia desnuda o encapsulada.

30

En resumen, la construcción de vectores de expresión recombinantes emplea técnicas de ligamiento estándar. Para análisis para confirmar las secuencias correctas en vectores construidos, los genes se secuencian usando, por ejemplo, el método de Messing, et al., (Nucleic Acids Res., 9: 309-, 1981), el método de Maxam, et al., (Methods in Enzymology, 65: 499, 1980), u otros métodos adecuados que serán conocidos por los expertos en la materia.

35

La separación por tamaño de fragmentos escindidos se realiza usando electroforesis en gel convencional tal como se describe, por ejemplo, por Maniatis, et al., (Molecular Cloning, págs. 133-134, 1982).

Para la generación de vectores de expresión eficientes, estos deben contener secuencias reguladoras necesarias para la expresión del gen codificado en el marco de lectura correcto. La expresión de un gen está controlada a 40 niveles de transcripción, traducción o postraducción. El inicio de la transcripción es un evento temprano y crítico en la expresión génica. Esto depende de las secuencias promotora y potenciadora y está influido por factores celulares específicos que interactúan con estas secuencias. La unidad transcripcional de muchos genes consiste en los elementos promotor y en algunos casos potenciador o regulador (Banerji et al., Cell 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); y Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)). Para retrovirus, 45 elementos de control implicados en la replicación del genoma retroviral residen en la repetición terminal larga (LTR) (Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)). Las LTR de virus de leucemia murina de Moloney (MLV) y virus del sarcoma de Rous (RSV) contienen secuencias promotora y potenciadora (Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855 (1983); Capecchi et al., en: Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman and Shenk, eds., págs. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 50 1991). Otros potentes promotores incluyen los derivados de citomegalovirus (CMV) y otros promotores virales de tipo silvestre.

Las regiones promotora y potenciadora de una serie de promotores no virales también se han descrito (Schmidt et al., Nature 314: 285 (1985); Rossi y deCrombrugghe, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84: 5590-5594 (1987)). Métodos 55 para mantener e incrementar la expresión de transgenes en células quiescentes incluyen el uso de promotores incluyendo colágeno de tipo I (1 y 2) (Prockop y Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311: 376 (1984); Smith y Niles, Biochem. 19: 1820 (1980); de Wet et al., J. Biol. Chem., 258: 14385 (1983)), promotores de SV40 y LTR.

De acuerdo con una realización de la invención, el promotor es un promotor constitutivo seleccionado de entre el grupo que consiste en: promotor de ubiquitina, promotor de CMV, promotor JeT (US 6.555.674), promotor de SV40, promotor del factor 1 alfa de elongación (EF1-alpha), RSV, CAG. Ejemplos de promotores inducibles/reprimibles incluyen: Tet-On, Tet-Off, promotor inducible por rapamicina, Mx1, Mo-MLV-LTR, progesterona, RU486.

5

Un grupo de promotores preferidos incluyen CAG, CMV, UbiC humana, JeT, SV40, RSV, promotor regulable por Tet, Mo-MLV-LTR, Mx1, Mt1 y EF-1alfa.

Además de usar promotores virales y no virales para impulsar la expresión transgénica, puede usarse una secuencia potenciadora para incrementar el nivel de expresión transgénica. Los potenciadores pueden incrementar la actividad 10 transcripcional no solamente de su gen nativo sino también de algunos genes extraños (Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 70: 2702 (1973)). Por ejemplo, en la presente invención, pueden usarse secuencias potenciadoras e colágeno con el promotor de colágeno 2 (I) para incrementar la expresión transgénica. Además, el elemento potenciador descubierto en virus SV40 puede usarse para incrementar la expresión transgénica. Esta secuencia potenciadora consiste en una repetición de 72 pares de bases tal como se describe por Gruss et al., Proc. Natl. 15 Acad. Sci. USA 78:943 (1981); Benoist y Chambon, Nature 290: 304 (1981), y Fromm y Berg, J. Mol. Appl. Genetics, 1: 457 (1982), todos los cuales se incorporan como referencia en el presente documento. Estas secuencias de repetición pueden incrementar la transcripción de muchos genes virales y celulares diferentes cuando están presentes en serie con diversos promotores (Moreau et al., Nucleic Acids Res. 9: 6047 (1981).

20

Secuencias que potencias la expresión adicionales incluyen, aunque no se limitan a, elemento de regulación postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck, WPRE, SP163, potenciador de CMV, y aislador de [beta]-globina de pollo y otros aisladores.

Líneas celulares 25

En un aspecto, la invención se refiere a células madre aisladas modificadas genéticamente con el vector de acuerdo con la invención.

La invención también se refiere a células adecuadas para bioadministración de meteorina mediante células 30 desnudas o encapsuladas, que están genéticamente modificadas para sobreexpresar meteorina, y que pueden trasplantarse al paciente para administrar polipéptido de meteorina bioactivo localmente. Dichas células pueden denominarse ampliamente como células terapéuticas.

Para terapia génica ex vivo, el grupo preferido de células incluye células neuronales, células precursoras neuronales, 35 células progenitoras neuronales, células madre neuronales, células madre gliales humanas, células precursoras humanas, células madre y células fetales.

Para encapsulación, las células preferidas incluyen células epiteliales pigmentadas retinianas, que incluyen células ARPE-19; fibroblastos inmortalizados humanos; y astrocitos inmortalizados humanos. 40

La línea celular ARPE-19 es una línea celular plataforma superior para tecnología de administración basada en células encapsuladas y también es útil para tecnología de administración basada en células no encapsuladas. La línea celular ARPE-19 es robusta (es decir, la línea celular es viable en condiciones astringentes, tales como implantación en el sistema nervioso central o el entorno intraocular). Las células ARPE-19 pueden modificarse 45 genéticamente para secretar una sustancia de interés terapéutico. Las células ARPE-19 tienen una esperanza de vida relativamente larga. Las células ARPE-19 son de origen humano. Además, las células ARPE-19 encapsuladas tienen una buena viabilidad en dispositivos in vivo. Las células ARPE-19 pueden administrar una cantidad eficaz de factor de crecimiento. Las células ARPE-19 desencadenan una reacción inmunitaria en el huésped despreciable. Además, las células ARPE-19 son no tumorígenas. Métodos para el cultivo y la encapsulación de células ARPE-19 50 se describen en el documento US 6.361.771.

En otra realización, la línea celular terapéutica se selecciona de entre el grupo que consiste en: líneas celulares de fibroblastos humanos, líneas celulares de astrocitos humanos, línea celular mesencefálica humana y línea celular endotelial humana, preferentemente inmortalizada con TERT, SV40T o vmyc. 55

Matriz extracelular

La presente invención comprende además cultivar células que producen meteorina in vitro sobre una matriz extracelular antes de la implantación en el sistema nervioso de mamífero. La preadhesión de células a microtransporadores antes de la implantación se diseña para potenciar la viabilidad a largo plazo de las células trasplantadas y proporcionar un beneficio funcional a largo plazo.

Los materiales de los que la matriz extracelular puede estar compuesta incluyen aquellos materiales a los que las 5 células se adhieren después de incubación in vitro, y sobre los cuales las células pueden crecer, y que pueden implantarse en el cuerpo del mamífero sin producir una reacción tóxica, o una reacción inflamatoria que destruiría las células implantadas o interferiría de otro modo en su actividad biológica o terapéutica. Dichos materiales pueden ser sustancias químicas sintéticas o naturales, o sustancias que tienen un origen biológico.

10

Los materiales de la matriz incluyen, aunque no se limitan a, vidrio y otros óxidos de silicio, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno, poliuretano, polialginato, polisulfona, alcohol polivinílico, polímeros de acrilonitrilo, poliacrilamida, policarbonato, polipentent, nylon, amilasas, gelatina natural y modificada y colágeno natural y modificado, polisacáridos naturales y modificados, incluyendo dextranos y celulosas (por ejemplo, nitrocelulosa), agar y magnetita. Pueden usarse materiales reabsorbibles o no reabsorbibles. También se pretenden 15 materiales de la matriz extracelular, que son bien conocidos en la técnica. Los materiales de la matriz extracelular pueden obtenerse comercialmente o prepararse cultivando células que secretan dicha matriz, eliminando las células secretoras, y permitiendo que las células que van a ser trasplantadas interactúen con y se adhieran a la matriz. El material de la matriz sobre el que crecen las células a implantar, o con el que las células se mezclan, puede ser un producto autóctono de células RPE. Por lo tanto, por ejemplo, el material de la matriz pueden ser material de la 20 matriz extracelular o de la membrana basal, que es producido y secretado por células RPE a implantar.

Para mejorar la adhesión, la supervivencia y la función celular, la matriz sólida puede estar revestida opcionalmente sobre su superficie externa con factores conocidos en la técnica para promover la adhesión, crecimiento o supervivencia celular. Dichos factores incluyen moléculas de adhesión celular, matriz extracelular, tal como, por 25 ejemplo, fibronectina, laminina, colágeno, elastina, glucosaminoglucanos, o proteoglucanos o factores de crecimiento.

Como alternativa, si la matriz sólida a la que las células implantadas se fijan está construida de material poroso, el factor o factores que promueven el crecimiento o la supervivencia pueden incorporarse en el material de la matriz, 30 desde el que se liberarían lentamente después de la implantación in vivo.

La configuración del soporte es preferentemente esférica, como en una perla, pero puede ser cilíndrica, elíptica, una lámina o tira plana, una forma de aguja o alfiler, y similares. Una forma preferida de matriz de soporte es una perla de vidrio. Otra perla preferida es una perla de poliestireno. 35

Los tamaños de perla pueden variar entre aproximadamente 10 µm y 1 mm de diámetro, preferentemente de aproximadamente 90 µm a aproximadamente 150 µm. Para una descripción de diversas perlas microtransportadoras, véase, por ejemplo, isher Biotech Source 87-88, Fisher Scientific Co., 1987, págs. 72-75; Sigma Cell Culture Catalog, Sigma Chemical Co., St, Louis, 1991, págs. 162-163; Ventrex Product Catalog, Ventrex 40 Laboratories, 1989; estas referencias se incorporan por la presente como referencia. El límite superior del tamaño de la perla puede venir dictado por la estimulación por la perla de reacciones no deseadas del huésped, que pueden interferir en la función de las células trasplantadas o causar daños al tejido circundante. El límite superior del tamaño de la perla también puede venir dictado por la vía de administración. Dichas limitaciones son fácilmente determinables por un experto en la materia. 45

Cápsula biocompatible

En un aspecto, la invención se refiere a una cápsula biocompatible que contiene células huésped aisladas modificadas genéticamente con el vector de acuerdo con la invención. 50

La terapia de bioadministración de células encapsuladas se basa en el concepto de aislar células del sistema inmunitario del huésped receptor rodeando a las células con un material biocompatible semipermeable antes de la implantación dentro del huésped. La invención incluye una cápsula en la que las células se encapsulan en una cápsula inmunoaislante. Las células se inmunoaíslan del huésped encerrándolas dentro de cápsulas poliméricas 55 implantables formadas por una membrana microporosa. Este enfoque impide el contacto célula a célula entre tejidos del huésped e implantados, eliminando el reconocimiento del antígeno a través de presentación directa.

La cápsula celular, en lo sucesivo denominada la cápsula, tiene una membrana que está diseñada a medida para controlar la difusión de moléculas, tales como hormonas de factor de crecimiento, neurotransmisores, péptidos, anticuerpos y complementos, basándose en su peso molecular (Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)). Usando técnicas de encapsulación, las células pueden trasplantarse en un huésped sin rechazo inmunitario, con o sin uso de fármacos inmunosupresores. Las cápsulas poliméricas biocompatibles útiles habitualmente contienen un núcleo que contiene células, suspendidas en un medio líquido o 5 inmovilizadas dentro de una matriz de inmovilización, y una región circundante o periférica de matriz o membrana permeoselectiva (“envoltura”) que no contiene células aisladas, que es biocompatible, y que es suficiente para proteger a las células en el núcleo de un ataque inmunológico perjudicial. La encapsulación obstaculiza que elementos del sistema inmunitario entren en la cápsula, protegiendo de este modo a las células encapsuladas de la destrucción inmunitaria. La naturaleza semipermeable de la membrana de la cápsula también permite que la 10 molécula biológicamente activa de interés se difunda fácilmente desde la cápsula al interior del tejido huésped circundante y permita que los nutrientes se difundan fácilmente al interior de la cápsula y soporten a las células encapsuladas. La cápsula puede estar hecha de un material biocompatible. Un “material biocompatible” es un material que, después de la implantación en un huésped, no desencadena una respuesta del huésped perjudicial suficiente para dar como resultado el rechazo de la cápsula o para hacerla inoperante, por ejemplo a través de 15 degradación. El material biocompatible es relativamente impermeable a moléculas grandes, tales como componentes del sistema inmunitario del huésped, pero es permeable a moléculas pequeñas, tales como insulina, factores de crecimiento y nutrientes, mientras que permiten que los residuos metabólicos se eliminen. Diversos materiales biocompatibles son adecuados para la administración de factores de crecimiento mediante la composición de la invención. Se conocen numerosos materiales biocompatibles, que tienen diversas morfologías de la superficie 20 externa y otras características mecánicas y estructurales. Preferentemente, la cápsula de esta invención será similar a las descritas por los documentos WO 92/19195, WO 95/05452 o WO 2005/095450, incorporados como referencia; o las patentes de Estados Unidos N.º 5.639.275; 5.653.975; 4.892.538; 5.156.844; 5.283.187; o la patente de Estados Unidos N.º 5.550.050, incorporadas como referencia.

25

Dichas cápsulas permiten el paso de metabolitos, nutrientes y sustancias terapéuticas mientras minimizan los efectos perjudiciales del sistema inmunitario del huésped. Los componentes del material biocompatible pueden incluir una membrana semipermeable circundante y el armazón de soporte celular interno. Preferentemente, las células recombinantes se siembran sobre el armazón, que está encapsulado por la membrana permeoselectiva. El armazón de soporte celular filamentoso puede estar hecho de cualquier material biocompatible seleccionado de 30 entre el grupo que consiste en acrílico, poliéster, polietileno, poliacetonitrilo polipropileno, tereftalato de polietileno, nylon, poliamidas, poliuretanos, polibutéster, seda, algodón, quitina, carbono, o metales biocompatibles. Además, pueden usarse estructuras de fibras unidas para implantación celular (patente de Estados Unidos N.º 5.512.600). Los polímeros biodegradables incluyen los compuestos por ácido poli(láctico) PLA, ácido poli(láctico-coglicólico) PLGA, y ácido poli(glicólico) PGA y sus equivalentes. Los armazones de espuma se han usado para proporcionar 35 superficies sobre las que células trasplantadas pueden adherirse (documentos WO 2005/095450 y WO 98/05304). Se han usado tubos de malla tejida como injertos vasculares (WO 99/52573). Adicionalmente, el núcleo puede estar compuesto por una matriz inmovilizada formada a partir de un hidrogel, que estabiliza la posición de las células. Un hidrogel es una red tridimensional de polímeros hidrófilos reticulados en forma de un gel, sustancialmente compuesto por agua. 40

La envoltura preferentemente tiene un límite de peso molecular, definido como ese peso molecular, donde la membrana (la envoltura) rechazará el 90% de los solutos, de menos de 1000 kD, más preferentemente entre 50-700 kD, más preferentemente entre 70-300 kD, más preferentemente entre 70-150 kD, tal como entre 70 y 130 kD. El límite de peso molecular debe seleccionarse para garantizar que la molécula bioactiva pueda escapar de la cápsula 45 mientras se protege a las células encapsuladas del sistema inmunitario del paciente.

El grosor de la envoltura normalmente está en el intervalo de 2 a 200 micrómetros, más preferentemente de 50 a 150 micrómetros. La envoltura debe tener un grosor para dar a la cápsula suficiente resistencia para mantener a las células encapsuladas y debe mantenerse, con esto en mente, lo más fina posible para ocupar el menor espacio 50 posible.

Diversos polímeros y mezclas de polímeros pueden usarse para fabricar la membrana semipermeable circundante, que incluye poliacrilatos (incluyendo copolímeros acrílicos), polivinilidenos, copolímeros de cloruro de polivinilo, poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisulfonas (incluyendo 55 poliétersulfonas), polifosfacenos, poliacrilonitrilos, poli(acrilonitrilo/cloruro de covinilo), así como derivados, copolímeros y mezclas de los mismos. Preferentemente, la membrana semipermeable circundante es una membrana de fibra hueca semipermeable biocompatible. Dichas membranas, y métodos para fabricarlas son divulgados por las patentes de Estados Unidos N.º 5.284.761 y 5.158.881. La membrana semipermeable circundante puede estar formada a partir de una fibra hueca de poliétersulfona, tal como las descritas por la patente de Estados Unidos N.º 4.976.859 o la patente de Estados Unidos N.º 4.968.733. Un material de membrana semipermeable circundante alternativo es poli(acrilonitrilo/cloruro de covinilo) (Pan-PVC).

La cápsula puede ser de cualquier configuración apropiada para mantener la actividad biológica y proporcionar 5 acceso para la administración del proceso o la función, incluyendo por ejemplo, cilíndrica, rectangular, en forma de disco, en forma de parche, ovoide, estrellada o esférica. Además, la cápsula puede estar bobinada o enrollada en una estructura similar a una malla o anidada. Si la cápsula se va a recuperar después de que se ha implantado, no se prefieren configuraciones, que tienden a causar migración de las cápsulas desde el sitio de implantación, tales como cápsulas esféricas lo suficientemente pequeñas para desplazarse en los vasos sanguíneos del huésped 10 receptor. Ciertas formas, tales como rectángulos, parches, discos, cilindros y láminas planas ofrecen una mayor integridad estructural y son preferibles donde se desea recuperación. Una forma particularmente preferida es en forma de cilindro, dado que dicha forma se produce fácilmente a partir de fibras huecas que pueden producirse de forma industrial.

15

Una macrocápsula en el presente contexto es una cápsula que tiene un volumen de al menos 1 µl, tal como de 1 a 10 µl.

Cuando se usan macrocápsulas, preferentemente al menos 103 células se encapsulan, tal como entre 103 y 108 células se encapsulan, de la forma más preferente de 105 a 107 células se encapsulan en cada dispositivo. Por 20 supuesto, el número de células en cada cápsula depende del tamaño de la cápsula. Por norma general, en una cápsula con espuma (descrita a continuación) los inventores de la presente invención han descubierto que cargar entre 10.000 y 100.000 células por µl de cápsula (volumen calculado como el volumen interno incluyendo la espuma) da como resultado un buen llenado de la cápsula, más preferentemente de 25.000 a 50.000 células por µl, más preferentemente de 30.000 a 40.000 células por µl. El número de células a cargar también depende del tamaño de 25 las células.

La dosificación puede estar controlada modificando las dimensiones (longitud, diámetro) de la cápsula y/o implantando un menor o mayor número de cápsulas, preferentemente entre 1 y 10 cápsulas por pacientes.

30

El armazón puede estar revestido con moléculas de la matriz extracelular (MEC). Los ejemplos adecuados de moléculas de la matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágeno, laminina y fibronectina. La superficie del armazón también puede modificarse tratando con irradiación con plasma para otorgar carga para potenciar la adhesión de células.

35

Puede usarse cualquier método adecuado de sellado de las cápsulas, incluyendo el uso de adhesivos poliméricos o engarce, anudamiento y termosellado. Además, cualquier métodos de sellado “en seco” adecuado también puede usarse, tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 5.653.687.

Los dispositivos de células encapsuladas se implantan de acuerdo con técnicas conocidas. Muchos sitios de 40 implantación están contemplados para los dispositivos y métodos de esta invención. Estos sitios de implantación incluyen, aunque no se limitan a, el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal (véase los documentos, US 5.106.627, 5.156.844 y 5.554.148), y los humores acuoso y vítreo del ojo (véase el documento WO 97/34586).

45

La cápsula divulgada puede incluir una atadura integral que se extiende desde la cápsula y que es de una longitud suficiente para alcanzar al menos desde el sitio de tratamiento hasta las inmediaciones del sitio de inserción, facilitando de este modo la fijación de la cápsula en el sitio de inserción, por ejemplo a la superficie externa del cráneo. El sitio de inserción queda cubierto posteriormente por la piel.

50

Para facilitar la retirada de la cápsula del tejido, por ejemplo cuando el tratamiento llega a su fin, o si la cápsula debe ser sustituida, la transición entre la cápsula y la atadura podría ser suave y sin proyecciones de cualquier clase, o la dimensión podría incrementarse desde la cápsula hacia la atadura. Esto, obviamente, crea un borde entre las dos partes pero, dado que la relativamente pequeña cápsula forma el extremo distal del sistema de terapia, es decir el extremo que está hacia el cuerpo, puede prevenirse daño secundario durante la retirada de la cápsula. Si la cápsula 55 y la atadura son tubulares con formas de sección transversal circulares, el tamaño radial de la cápsula puede ser, por lo tanto, preferentemente más pequeño que el tamaño radial de la atadura, y la cápsula y la atadura pueden unirse preferentemente de forma coaxial entre sí. Preferentemente, la cápsula de esta invención será similar en diseño a las descritas por los documentos WO 2006/122551 y WO 2005/095450.

Las cápsulas pueden llenarse usando una jeringa o como alternativa, puede usarse llenado automatizado o semiautomatizado, tal como se describe en el documento WO2007/048413.

Ejemplos 5

Ejemplo 1

Purificación de proteínas

10

Meteorina de ratón (N.º de entrada de Uniprot Q8C1Q4; SEQ ID NO: 5) (aa22-291 (SEQ ID NO: 6) con un péptido señal de hCD33) se clonó en un vector de expresión. El vector se transfectó en la línea celular de mieloma de ratón NS0 mediante electroporación. Clones estables se aislaron y se cribaron para expresión de mMeteorina mediante análisis de Western usando anticuerpo policlonal Gt x mMETRN (AF3475). Medio acondicionado procedente de cultivos que contienen meteorina de ratón se concentró, se suplementó con MOPS 20 mM, el pH se ajustó a 6,5, y 15 se filtró a través de un filtro de 0,2 um. La muestra se aplicó a una resina de cromatografía de intercambio aniónico, se equilibró en MOPS 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 6,5. Las fracciones que contenían meteorina de ratón se suplementaron con NaCl 2 M, el pH se ajustó a 7,0, y a continuación se aplicó a una resina de fenilsefarosa. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente decreciente de NaCl. Las fracciones enriquecidas en meteorina de ratón se reunieron, se concentraron y se cargaron en una columna de filtración en gel Superdex y a continuación se 20 equilibraron en PBS. La meteorina de ratón se eluyó como una proteína de aproximadamente 30 kDa de peso molecular. Las fracciones de interés se reunieron, se concentraron, se dializó contra PBS y se almacenó a -80ºC.

Ejemplo 2

25

Lesión del nervio ciático inducida fotoquímicamente

El efecto de meteorina administrada por vía sistémica (sc) se investigó en ratas con lesión en el nervio ciático inducida fotoquímicamente que se sabe que desarrollan alodinia para estimulación tanto mecánica como con frío en el plazo de una semana después de la lesión (Kupers,R., Yu,W., Persson,J.K., Xu,X.J., y Wiesenfeld-Hallin,Z. 30 (1998); Photochemically-induced ischemia of the rat sciatic nerve produces a dose-dependent and highly reproducible mechanical, heat and cold allodynia, and signs of dolor espontáneo. Pain 76, 45-59).

En resumen, después de lesión fotoinducida unilateral del nervio ciático, los animales se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n=8 por grupo) y se les inyectó solución salina como control negativo o meteorina a tres 35 concentraciones diferentes (0,05, 0,2 y 0,8 mg/kg). Cada rata recibió seis inyecciones durante un periodo de dos semanas comenzando después de siete días cuando se desarrolló una alodinia estable. Las valoraciones comportamentales se llevaron a cabo antes de cada inyección durante el periodo de tratamiento y durante dos semanas adicionales.

40

A partir de la figura 1, es evidente que solución salina y meteorina a la dosis baja (0,05 mg/kg) no afectaban a la respuesta a estimulación mecánica de la pata trasera ipsolateral. 0,2 mg/kg de meteorina redujeron la alodinia mecánica moderadamente pero este grupo no era estadísticamente diferente del grupo de control con solución salina. En contraste, la inyección repetida de 0,8 mg/kg de meteorina produjo un alivio significativo y marcado de alodinia mecánica. Después del cese del tratamiento el día 21, este grupo permanecía significativamente diferente 45 del vehículo durante al menos una semana. Con el tiempo, la alodinia mecánica se restableció gradualmente.

La respuesta al frío se evalúo pulverizando brevemente cloruro de etilo sobre la superficie plantar de la pata trasera y puntuando el comportamiento del animal en consecuencia. La figura 2 muestra que el tratamiento con 0,8 mg/kg de meteorina aliviaba potencialmente la estimulación de alodinia por frío y que los 0,2 mg/kg también tienen un 50 efecto positivo significativo. Después del cese del tratamiento, el grupo tratado con 0,8 mg/kg de meteorina permaneció significativamente diferente del vehículo durante al menos una semana y había una tendencia hacia la mejoría incluso después de dos semanas. La alodinia por frío se restablecía gradualmente con el tiempo pero esto no era completo al final del experimento. No había ningún efecto de 0,05 mg/kg de meteorina que era similar al grupo de control durante todo el estudio. 55

De forma importante, todos los animales ganaron peso de forma normal durante todo el estudio y no se observaron efectos secundarios (figura 3).

En conclusión, la meteorina reducía de forma dependiente de la dosis la alodinia tanto mecánica como por frío y el efecto duraba durante al menos una semana después del cese del tratamiento. Dos semanas después del cese del tratamiento, la hipersensibilidad parecía restablecerse gradualmente. No se observaron efectos secundarios.

Ejemplo 3 5

Lesión por constricción crónica (LCC)

El efecto de meteorina se investigó adicionalmente en la bien establecido modelo de lesión por constricción crónica (LCC) (Bennett, G.J., y Xie,Y.K. (1988); A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain 10 sensation like those seen in man. Pain 33, 87-107). En resumen, doce días después de la lesión, cuando se estableció una alodinia mecánica estable, los animales recibieron seis inyecciones subcutáneas de meteorina (0,1, 0,5, 2,0 mg/kg) o vehículo distribuidas durante las siguientes dos semanas (n=7-8 por grupo). Se siguió el comportamiento del animal durante todo el estudio hasta tres semanas después de la última inyección.

15

El soporte de peso se evalúo inmediatamente antes y después del tratamiento como un marcador sustituto para dolor espontáneo. Antes del tratamiento (día 12), todos los grupos presentaban un déficit de lado a lado de aproximadamente 50 g que se redujo a 10-15 g para los grupos tratados con meteorina. Después del cese del tratamiento, el efecto se redujo gradualmente y no había ninguna diferencia significativa entre los grupo después de tres semanas. 20

La alodinia mecánica también se evaluó en los animales con LCC. El umbral de retirada de la pata inicial promedio con estimulación mecánica con pelos de von Frey calibrados era de 15 g que se redujo gradualmente a 2 g el día 12 donde comenzó el tratamiento. Aunque el grupo de vehículo permanecía hipersensible durante todo el estudio (~2 g), la meteorina aliviaba eficazmente la alodinia mecánica a todas las dosis puestas a prueba (8-11 g). Después del 25 cese del tratamiento, los animales en el grupo de tratamiento con meteorina seguía siendo significativamente diferente del grupo de control durante aproximadamente una semana, pero la alodinia se restableció gradualmente y no había ninguna diferencia entre grupos después de tres semanas. Para evaluar la magnitud del efecto, a los animales en el grupo de control se les administró una dosis elevada de gabapentina (200 mg/kg) para comparación. Una hora después del tratamiento con gabapentina, el umbral para estimulación mecánica era 9,7 ± 1,9 g en 30 comparación con 1,9 ± 0,7 g antes del tratamiento. Está claro que la meteorina y la gabapentina son eficaces de manera similar pero, de forma importante, mientras que la gabapentina es un analgésico, la meteorina tiene efectos de larga duración y que potencialmente modifican la enfermedad.

Las inyecciones con meteorina no causaron pérdida de peso o diferencias comportamentales generales entre 35 animales de control y tratados.

Ejemplo 4

Lesión por constricción crónica (LCC) 40

Objetivo

Este estudio se diseñó para investigar la eficacia de meteorina recombinante administrada por vía subcutánea (s.c) para aliviar alodinia y dolor espontáneo en ratas producidos por lesión por constricción crónica (LCC) (Bennett y Xie, 45 “A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man”, 1988, Pain 33; págs. 87-107).

Métodos

50

Meteorina recombinante. Meteorina de ratón recombinante (N.º de entrada de Uniprot Q8C1Q4) se produjo tal como se ha descrito en otro lugar en esta solicitud.

Cirugía: 30 ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 250-280 g se sometieron a cirugía para producir una constricción crónica del nervio ciático izquierdo usando cuatro ligaduras flojas de sutura de cagut 4-0 crómico 55 (modelo de LCC) (Bennett y Xie, “A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man”, 1988, Pain 33; págs. 87-107). Las ratas se anestesiaron mediante inhalación de isofluorano gaseoso. Las ratas recibieron una incisión cutánea justamente caudal al bíceps femoral al nivel de la mitad del muslo en la extremidad trasera izquierda. A continuación se realizó una pequeña incisión en la capa de músculo subyacente y se separó suavemente usando hemostatos teniendo cuidado de no alterar el nervio ciático. El nervio ciático a continuación se identificó, se liberó de tejido adherente y se elevó ligeramente usando pinzas en ángulo de 45°. Cuatro trozos de material de sutura de cagut 4-0 crómico (lavado previamente en solución salina estéril) se colocaron bajo el nervio y a continuación cada una se ató de forma floja alrededor del nervio en un nudo cuadrado. Los nudos estaban separados por 1 mm. Estas ligaduras flojas permitían una constricción crónica del nervio sin 5 cortar el suministro de sangre. Las capas de músculo se cerraron con mediante sutura 4-0 Vicryl y la piel se cerró con grapas para heridas.

Agrupamiento y análisis comportamental: el día 0 del experimento, todas las ratas se pusieron a prueba para alodinia mecánica usando filamentos de von Frey, alodinia térmica usando el método de Hargreaves y soporte de 10 peso sobre las extremidades traseras usando un medidor de incapacidad. Se seleccionaron 24 ratas para continuar en el estudio y después se dividieron en cuatro grupos de tratamiento (n=6). A los animales se les inyectó cinco veces s.c. con vehículo, 0,1, 0,5 o 1,8 mg/kg de proteína meteorina los días postquirúrgicos 10, 12, 14, 17 y 19. Los animales se pusieron a prueba además para alodinia mecánica y térmica así como incapacidad los días 10, 12, 14, 17, 19, 21, 26, 32 y 39 postcirugía. De forma importante, se realizó el análisis comportamental antes de la inyección 15 de meteorina para excluir efectos analgésicos inmediatos y para centrarse en potenciales efectos de modificación de la enfermedad de larga duración. Los animales se observaron y se siguió el peso corporal durante todo el estudio. El experimentador desconocía las condiciones del tratamiento y no se retiró ningún animal del estudio.

Ensayo para meteorina en suero: después del análisis comportamental el día postquirúrgico 39, a los animales se 20 les administrados dosis a 0,1, 0,5 y 2 mg/kg de meteorina y se recogieron muestras de suero de rata a las 2, 6, 24 h después de la administración del fármaco. También se recogió suero a partir de ratas de control no tratadas. Había dos ratas para cada punto temporal. Todas las muestras de suero de rata se ensayaron mediante ELISA de meteorina de ratón (R&D Systems, DY3475).

25

Resultados

Alodinia y dolor espontáneo experimentales se indujeron en ratas mediante LCC (Bennett y Xie, 1988) y la alodinia táctil se evaluó usando pelos de Von Frey (figura 7). Las ratas tenían un umbral de retirada inicial de aproximadamente 15 g que se redujo a 1,5 g 10 días después del LCC. Es evidente que el tratamiento con 30 meteorina reducía rápidamente la alodinia y la fuerza resistida por ratas tratadas con 1,8 mg/kg de meteorina era significativa a día 17, 19, 21, 26 y 32 en comparación con ratas tratadas con vehículo. Por lo tanto, la diferencia significativa se mantuvo al menos 13 días después del cese del tratamiento y también se observó una tendencia hacia alodinia reducida después de 20 días. La mayoría de los animales en el grupo tratado con 1,8 mg/kg de meteorina revertía a 15 g pero un animal no respondió, lo que explica el error estándar incrementando en este grupo 35 particular.

Con respecto a la sensibilidad térmica (figura 8), las ratas presentaban una latencia de retirada inicial de 16,5 segundos que se redujo a aproximadamente 7 segundos 10 días después de LCC, lo que significaba una alodinia térmica. Los animales tratados con vehículo permanecían hipersensibles durante todo el estudio, mientras que el 40 tratamiento con meteorina a 1,8 mg/kg dio como resultado rápidamente una disminución significativa de la latencia de retirada de la pata desde el día 14 que duró durante el resto del experimento incluyendo al menos tres semanas después del cese del tratamiento. De forma interesante, en lugar de volver al nivel de alodinia del grupo de vehículo, la latencia de retirada de la pata se nivelaba a los 10,5 segundos para este grupo de meteorina. La dosis de 0,5 mg/kg de meteorina también dio como resultado una latencia de retirada de la pata reducida, que se volvía 45 significativa los días 19 y 21. También había una tendencia hacia alodinia reducida con 0,1 mg/kg de meteorina, aunque esto no alcanzaba niveles estadísticamente significativos. En resumen, la meteorina reducía de forma dependiente de la dosis la alodinia térmica con efectos significativos en el periodo de tratamiento y más allá.

En la criba inicial posquirúrgica, a las ratas se les distribuyó un peso igual entre ambas de sus extremidades traseras 50 (figura 9). Sin embargo, después de la lesión LCC, había aproximadamente un 60% menos de peso aplicado a la extremidad trasera ipsolateral que se toma como marcador sustituto para el dolor espontáneo. El déficit de soporte de peso del 60% se mantuvo en el grupo de vehículo durante todo el estudio. En contraste, tanto 0,5 como 1,8 mg/kg de meteorina reducían rápidamente el déficit de soporte de peso y, en ambos casos, el efecto positivo permanecía significativamente mejorado durante al menos tres semanas después del cese del tratamiento. Un 55 efecto estadísticamente significativo también se observó con la meteorina a dosis baja el día 19. En general, desde el día 26 hasta el final del experimento, el déficit de soporte de peso se asentó en todos los grupos tratados con meteorina a niveles estables menores que el grupo de vehículo. Donde el grupo de control de vehículo permanecía por encima del 60%, los déficits de soporte de peso promedio para los grupos tratados con meteorina se asentaban alrededor del 55%, 48% y 40% respectivamente para 0,1, 0,5 y 1,8 mg/kg de meteorina.

No se observaron efectos secundarios inmediatos y todos los animales ganaron peso de forma normal durante todo el estudio (figura 10).

5

Después de la última prueba comportamental el día 39, a los animales se les administraron dosis de 0,1, 0,5 y 1,8 mg/kg de meteorina y se recogieron muestras de suero 2, 6 y 24 horas después para evaluación farmacocinética (figura 11). La meteorina era apenas detectable en suero después de la inyección de 0,1 mg/kg pero se observó una buena relación entre dosis y concentración sérica entre las dos dosis más elevadas. Está claro, además, a partir de la figura 11 que la meteorina ya no es detectable en suero 24 horas después de la inyección. En relación con esto, 10 es interesante que los efectos beneficiosos observados duran varias semanas después de la última inyección donde la meteorina ya no está presente en el suero (figura 7, 8 y 9). Además, en lugar de retornar al nivel inicial de hipersensibilidad, el tratamiento con meteorina causa un nuevo nivel menos hipersensible. Tomado todo junto, es probable que la meteorina tenga propiedades que modifican la enfermedad. Por lo tanto, el efecto de larga duración puede reflejar la normalización o restauración de la función neuronal. 15

Conclusión

La administración de meteorina a animales que se prepararon quirúrgicamente para mostrar un síndrome similar a alodinia y dolor espontáneo dio como resultado reducción profunda de alodinia y dolor espontáneo inferida por una 20 reducción de alodinia tanto térmica como táctil y una normalización de soporte de peso diferencial. Incluso aunque la meteorina está ausente del suero 24 horas después de las inyecciones, los efectos positivos duran durante varias semanas, demostrando de este modo propiedades que modifican la enfermedad.

Ejemplo 5: lesión del nervio ciático inducida fotoquímicamente, administración intratecal 25

Métodos

Cirugía. Ratas Sprague-Dawley macho (Harlan, países Bajos) que pesaban 380-450 g se equiparon con un catéter intratecal crónico con la punta en la intumescencia lumbar (Storkson, R.V., Kjorsvik, A., Tjolsen, A., y Hole, K. (1996). 30 Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat. J. Neurosci. Methods 65, 167-172). De tres a cinco días después de la implantación del catéter, se produjo lesión isquémica del nervio ciático usando un método fotoquímico (Kupers, R., Yu, W., Persson, J.K., Xu, X.J., y Wiesenfeld-Hallin, Z. (1998); Pain 76, 45-59). En resumen, bajo anestesia general (hidrato de cloral 300 mg/kg), el nervio ciático izquierdo se expuso a nivel de la mitad del muslo y se irradiaron durante 1,5 min con un láser de argón que funcionaba a 514 nm a una potencia promedio de 35 0,17 W. Eritrosina B (32,5 mg/kg disuelta en solución al 0,9%) se inyectó por vía intravenosa a través de la vena caudal justo antes de la irradiación. Esta operación conduce una hipersensibilidad altamente reproducible en el plazo de 7 días.

Evaluación de la alodinia. Para la evaluación de la alodinia mecánica, un conjunto de monofilamentos de nylon 40 calibrados (pelos de von Frey, Stoelting, IL) se aplicó a la piel glabra de las patas con fuerza creciente hasta que el animal retira la extremidad. Cada monofilamento se aplicó 5 veces y se determinó el umbral de retirada como la fuerza a la que el animal retira la pata a partir de al menos 3 de 5 estímulos consecutivos. La respuesta a frío se puso a prueba con cloruro de etilo, que se pulverizó brevemente (<1 s) sobre la superficie plantar de la pata trasera. La respuesta se puntuó de la siguiente manera: 0 = sin respuesta, 1 = respuesta similar a un espasmo, sin retirada 45 de la pata trasera (normal), 2 = breve retirada de la pata trasera estimulada (dolor leve), 3 = retirada sostenida o repetida de la pata trasera estimulada, breve lamido o sacudida (dolor severo). Todas las pruebas fueron realizadas por un experimentador que desconocía las condiciones experimentales.

Configuración experimental. Las respuestas iniciales se evaluaron después de la implantación del catéter y de nuevo 50 antes de la irradiación del nervio ciático. Las ratas que desarrollaron alodinia para estimulación mecánica y por frío 7 días después de la lesión del nervio se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (N=8) a los que se administró vehículo como control negativo y tres dosis de meteorina recombinante (0,5, 2 y 6 ug) a un volumen de 10 µl por vía intratecal. Cada rata recibió seis inyecciones durante un periodo de dos semanas (el día 7, 9, 11, 14, 16 y 18 contando a partir del momento de la lesión al nervio). Las pruebas comportamentales se realizaron antes de la 55 inyección intratecal en días de tratamiento respectivos y además los días 21, 25, 28 y 35 después del cese del tratamiento.

Resultados

Tal como se ve en la figura 12, el umbral de retirada de la pata inicial para estimulación mecánica era de aproximadamente 50 g. 7 días después de lesión del nervio ciático inducida fotoquímicamente, las ratas desarrollaron alodinia mecánica significativa evidente como un umbral de retirada de la pata reducido de aproximadamente 8 g. Las ratas se dividieron a continuación aleatoriamente en cuatro grupos que recibían 5 posteriormente vehículo o meteorina como seis inyecciones intratecales en el espacio de dos semanas. Con respecto a la meteorina, las ratas recibieron 0,5 µg, 2 µg o 6 µg. Está claro que la inyección intratecal de meteorina reducía de forma significativa y dependient5e de la dosis la alodinia mecánica (figura 12). La alodinia mecánica se restablecía gradualmente en el plazo de una semana después del cese del tratamiento. La inyección intratecal de vehículo no afectó a la hipersensibilidad mecánica durante todo el experimento. 10

Tal como se ve en la figura 13, la respuesta al frío inicial es 1 que corresponde a una respuesta similar a un espasmo normal. 7 días después de lesión del nervio ciático inducida fotoquímicamente, las ratas desarrollaron una alodinia por frío marcada evidente como reacción de dolor leve. El tratamiento con 2 µg y 6 µg de meteorina invirtió rápidamente la alodinia por frío y los animales presentaron una respuesta cercana a la normal al frío en el periodo de 15 tratamiento. Un efecto positivo significativo de 6 µg de meteorina también se observó tres días después del cese del tratamiento. Sin embargo, la alodinia por frío se restableció completamente una semana después de que el tratamiento terminó. El vehículo no tenía ningún efecto sobre la alodinia por frío.

Conclusión 20

La inyección intratecal repetida de meteorina reduce significativamente la alodinia mecánica y por frío en ratas después de la lesión isquémica del nervio ciático.

Ejemplo 6: Lista de secuencias 25

SEQ ID NO 1: cADN de meteorina humana

SEQ ID NO 2: secuencia de aminoácidos de longitud completa de meteorina humana

30

SEQ ID NO 3: secuencia de aminoácidos de meteorina humana sin péptido señal

SEQ ID NO 4: cADN de meteorina de ratón

SEQ ID NO 5: secuencia de aminoácidos de longitud completa de meteorina de ratón 35

SEQ ID NO 6: secuencia de aminoácidos de meteorina de ratón sin péptido señal

SEQ ID NO 7: cADN de meteorina de rata

40

SEQ ID NO 8: secuencia de aminoácidos de longitud completa de meteorina de rata

SEQ ID NO 9: secuencia de aminoácidos de meteorina de rata sin péptido señal

SEQ ID NO 10: secuencia de ADN optimizada con codón humana 45

SEQ ID NO 11: meteorina madura, secuencia consenso

cADN de meteorina humana (1109 pb; CDS=118-999) (SEQ ID NO 1)

50

>gi|34147349|ref|NM_024042.2| Homo sapiens, proteína hipotética MGC2601 (MGC2601), mARN

Secuencia de aminoácidos de longitud completa de meteorina humana (SEO ID NO 2)

>|P|00031531.1 REFSEQ_NP:NP_076947 TREMBL:Q9UJH9 ENSEMBL:ENSP00000219542 Tax_Id=9606 5 C380A1.2.1 (Nueva proteína)

Meteorina humana, proteína sin péptido señal (SEQ ID NO 3) 10

cADN de meteorina de ratón, 1363 pb, CDS 84..959 (SEQ ID NO 4)

15

NM_133719. Meteorina de Mus musculus.[gi:56550040]

Secuencia de aminoácidos de longitud completa de meteorina de ratón (SEQ ID NO 5)

ref|NP_598480.1| meteorina [Mus musculus] 5

Proteína meteorina de ratón sin péptido señal (SEQ ID NO 6)

10

cADN de meteorina de rata (1026 pb; CDS=1-876) (SEQ ID NO 7)

>gi|34870570|ref|XM_213261.2| proteína de Rattus norvegicus similar a 1810034B16Rik (LOC287151), mARN 15

Secuencia de aminoácidos de longitud completa de meteorina de rata (SEQ ID NO 8)

>IPI00369281.1 |REFSEQ_XP:XP-213261|ENSEMBL:ENSRNOP00000026676 5

Meteorina de rata, proteína sin péptido señal (SEQ ID No 9)

10

Secuencia de nucleótidos de meteorina con optimización de codones presente en construcciones pCAn.Meteorin y pT2.CAn.Meteorin (SEQ ID NO 10)

15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: 5

i. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;

ii. Una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde la variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3; y

iii. Un fragmento biológicamente activo de al menos 50 aminoácidos contiguos de a) o b) donde el fragmento es 10 al menos el 70% idéntico a la SEQ ID NO: 3.
2. El polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho polipéptido tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más 15 preferentemente el 90%, más preferentemente el 95%, más preferentemente el 98%.
3. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido neurotrófico comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO: 11.

20
4. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido neurotrófico tiene residuos de cisteína en posiciones 7, 28, 59, 95, 148, 151, 161, 219, 243 y 265 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
5. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho 25 tratamiento da como resultado sustancialmente inversión completa de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo o dolor fantasma en al menos un subconjunto de los sujetos tratados.
6. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho polipéptido es para uso en un método de tratamiento de alodinia y/o hiperalgesia. 30
7. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha alodinia es alodinia térmica, tal como alodinia por frío o por calor, o alodinia mecánica.
8. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho 35 tratamiento es para dolor espontáneo.
9. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha hiperalgesia es hiperalgesia térmica, tal como hiperalgesia por frío o por calor, o hiperalgesia mecánica.

40
10. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto a tratar no experimenta pérdida de peso.
11. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto a tratar es un mamífero, preferentemente un primate, más preferentemente un ser humano. 45
12. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido se administra mediante administración sistémica, tal como mediante inyección parenteral, preferentemente inyección subcutánea o inyección intratecal.

50
13. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento se administra en dosis de 1 µg/kg - 10.000 µg/kg, tal como 1 µg/kg - 7.500 µg/kg, tal como 1 µg/kg - 5.000 µg/kg, tal como 1 µg/kg - 2.000 µg/kg, tal como 1 µg/kg - 1.000 µg/kg, tal como 1 µg/kg - 700 µg/kg, tal como 5 µg/kg-500 µg/kg, tal como de 10 µg/kg a 100 µg/kg de peso corporal.

55
14. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha administración se repite diariamente.
15. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha administración se repite al menos 1-3 veces por semana, tal como 2-5 veces por semana, tal como 3-6 veces por semana.
16. Una molécula de ácido nucleico aislada para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia 5 de ácido nucleico que codifica un polipéptido, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
17. Un vector para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma, comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. 10
18. Una línea celular aislada para uso en un método de tratamiento de alodinia, hiperalgesia y/o dolor espontáneo, transformada o transducida con el vector de la reivindicación 17.
19. Una cápsula biocompatible implantable para uso en un método de tratamiento de alodinia, 15 hiperalgesia, dolor espontáneo y/o dolor fantasma mediante administración de meteorina biológicamente activa secretada a un sujeto, comprendiendo dicha cápsula:

i. Una membrana externa biocompatible y un núcleo interno,

ii. comprendiendo dicho núcleo interno células de acuerdo con la reivindicación 18. 20
20. Un polipéptido de meteorina neurotrófico para uso en un método de tratamiento dolor neuropático en un sujeto humano que lo necesita, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido neurotrófico que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, donde dicha administración es tres veces por 25 semana o de forma más infrecuente.
21. El polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 20, donde dicha administración es administración semanal o más infrecuente.

30
22. El polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 20, donde dicha administración es administración quincenal o más infrecuente.
23. El polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 20, donde el efecto terapéutico de dicho tratamiento mejora al menos un síntoma de dolor neuropático durante todo el periodo entre administraciones del 35 polipéptido.
24. El polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicho síntoma se selecciona de entre el grupo que consiste en alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo, dolor fantasma, sensaciones de escozor, hormigueo, electricidad, sensación parestésica, parestesia, disestesia, rigidez, entumecimiento en las extremidades, 40 sensaciones de distorsión corporal, e hiperpatía.
25. El polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 20, donde dicho tratamiento no mantiene niveles medibles de dicho polipéptido en el suero de dicho sujeto durante todo el periodo entre administraciones del polipéptido. 45
26. El polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 25, donde los niveles de dicho polipéptido en el suero de dicho sujeto caen por debajo de 10 ng/ml entre administraciones del polipéptido.
27. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, donde dicho 50 polipéptido tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente el 90%, más preferentemente el 95%, más preferentemente el 98%.
28. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 20 a 27, donde el 55 polipéptido neurotrófico comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO: 11.
29. El polipéptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 20 a 28, donde el polipéptido neurotrófico tiene residuos de cisteína en posiciones 7, 28, 59, 95, 148, 151, 161, 219, 243 y 265 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.