ES2587934T3

ES2587934T3 - Variantes procedentes de ActRIIB y sus usos

Info

Publication number: ES2587934T3
Application number: ES14175663.5T
Authority: ES
Inventors: John Knopf; Ravindra Kumar; Jasbir Seehra
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Current assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2008-02-04
Publication date: 2016-10-27
Anticipated expiration: 2028-02-04
Also published as: KR101801506B1; US7842663B2; TW200846357A; CN105906708A; KR102072897B1; ES2796347T3; NO3053933T3; AU2016208313A1; CN105924517A; HK1186477A1; IL240522B; EP2805967B1; CA2677160C; EA018868B1; TW202104248A; US20200071381A1; AU2008214375A1; CN105906707A; EA025891B1; JP2014098028A

Abstract

Una proteína ActRIIB variante para su uso para promover formación de hueso, promover formación de cartílago, aumentar la mineralización ósea, el tratamiento de la osteoporosis, el tratamiento de fracturas óseas, el tratamiento de defectos del cartílago, o el tratamiento la densidad ósea baja, en la que la proteína ActRIIB variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 2, en la que la proteína comprende un aminoácido ácido en la posición correspondiente a la posición 79 de la SEQ ID NO: 2.

Description

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los tejidos tano mesodérmico como neural (Gamer et al., 1999, Dev Biol., 208:222-32). Se ha demostrado que GDF11 es un regulador negativo de la condrogénesis y la miogénesis en la extremidad del polluelo en desarrollo (Gamer et al., 2001, Dev Biol. 229:407-20). La expresión de GDF11 en músculo también sugiere su papel en la regulación del crecimiento muscular de una forma similar a GDF8. Además, la expresión de GDF11 en cerebro sugiere que GDF11 también puede poseer actividades que se relacionan con la función del sistema nervioso. De forma interesante, se ha encontrado que GDF11 inhibe la neurogénesis en el epitelio olfativo (Wu et al., 2003, Neuron. 37:197-207). Por tanto, GDF11 puede tener aplicaciones in vitro e in vivo en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades musculares y neurodegenerativas (p. ej., esclerosis lateral amiotrófica).

Es bien conocido que la proteína morfogenética ósea (BMP7, por sus siglas en inglés), también llamada proteína osteogénica 1 (OP-1) induce formación de hueso y cartílago. Además, BMP7 regula una amplia gama de procesos fisiológicos. Por ejemplo, BMP7 puede ser el factor osteoinductor responsable del fenómeno de la osteogénesis epitelial. También se ha encontrado que BMP7 juega un papel en la regulación del calcio y en la homeostasis ósea. Al igual que activina, BMP7 se une a los receptores de tipo II, ActRIIA y IIB. Sin embargo, BMP7 y activina reclutan receptores de tipo I distintos en los complejos de receptor heteroméricos. El principal receptor de tipo I de BM7 observado fue ALK2, mientras que activina se unió exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). BMP7 y activina provocaron respuestas biológicas distintas y activaron diferentes vías de Smad (Macias-Silva et al., 1998, J Biol Chem. 273:25628-36).

Ciertos polipéptidos ActRIIB (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles) pueden usase para antagonizar la señalización de ligandos ActRIIB, generalmente en cualquier proceso asociado con actividad de ActRIIB. Opcionalmente, los polipéptidos ActRIIB pueden antagonizar uno o más ligandos de receptores ActRIIB, tales como activina, Nodal, GDF8, GDF11, y BMP7, y pueden ser, por lo tanto, útiles en el tratamiento de trastornos adicionales.

Por lo tanto, pueden usarse polipéptidos ActRIIB para tratar o prevenir enfermedades o afecciones que están asociadas con actividad anómala de un ActRIIB o un ligando ActRIIB. ActRIIB o los ligandos están implicados en la regulación de numerosos procesos biológicos críticos. Debido a sus funciones clave en estos procesos, pueden ser dianas deseables para la intervención terapéutica. Por ejemplo, Pueden usarse polipéptidos ActRIIB (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles) para tratar trastornos o afecciones humanas o animales. Los ejemplos de dichos trastornos o afecciones incluyen, pero no se limitan a, trastornos metabólicos tales como diabetes de tipo 2, alteración de la tolerancia a la glucosa, síndrome metabólico (p. ej., síndrome X) y resistencia a la insulina inducida por traumatismo (p. ej., quemaduras o desequilibrio del nitrógeno); trastornos del tejido adiposo (p. ej., obesidad); trastornos musculares y neuromusculares tales como distrofia muscular (incluyendo la distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrófica (ELA); atrofia muscular; atrofia orgánica; debilidad; síndrome del túnel carpiano; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; y sarcopenia, caquexia y otros síndromes de atrofia muscular progresiva; Otros ejemplos incluyen osteoporosis, especialmente en la tercera edad y/o en mujeres posmenopáusicas; osteoporosis inducida por glucocorticoides; osteopenia; artrosis; y fracturas relacionadas con osteoporosis. Otros ejemplos adicionales incluyen masa ósea baja debida a glucocorticoterapia crónica, insuficiencia gonadal precoz, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa. Estos trastornos y afecciones se discuten más adelante en "Usos terapéuticos de ejemplo"

Los términos que se usan en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se discuten a continuación o en cualquier otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar orientación adicional al facultativo para describir las composiciones y métodos de la invención y cómo hacerlos y usarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término será evidente a partir del contexto específico en el que se usa el término.

"Alrededor de" y "aproximadamente" significarán generalmente un grado de error aceptable para la cantidad determinada dada la naturaleza o precisión de las determinaciones. Típicamente, los grados de error de ejemplo están dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y más preferentemente dentro del 5 % de un valor o intervalo de valores dado.

Como alternativa, y particularmente en los sistemas biológicos, las expresiones "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y más preferentemente dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numéricas que se dan en el presente documento son aproximadas, a menos que se manifieste otra cosa, significando que puede inferirse la expresión "alrededor de" o "aproximadamente" cuando no se manifieste expresamente.

Los métodos que se desvelan en el presente documento pueden incluir etapas de comparar secuencias entre sí, incluyendo la secuencia natural con uno o más mutantes (variantes de secuencia). Dichas comparaciones comprenden típicamente alineamientos de secuencias poliméricas, p. ej., usando programas y/o algoritmos de alineamiento que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, BLAST, FASTA y MEGALIGN, por nombrar unos pocos). El experto en la técnica puede apreciar fácilmente que, en dichos alineamientos, cuando una mutación contiene una inserción o eliminación de un resto, el alineamiento de secuencia introducirá un "hueco" (presentado típicamente por un guion, o "A") en la secuencia polimérica que no contiene el resto insertado o eliminado.

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La divulgación incluye los resultados de un análisis de estructuras compuestas, que se muestra en la figura 13, demostrando que el bolsillo de unión a ligando está definido por los restos Y31, N33, N35, L38 hasta T41; E47, E50, Q53 hasta K55; L57, H58, Y60, S62, K74, W78 hasta N83; Y85, R87, A92, y E94 hasta F101. En estas posiciones, se espera que las mutaciones conservativas se toleren, aunque una mutación K74A se tolera bien, al igual que R40A, K55A, F82A y las mutaciones en la posición L79. R40 es una K in Xenopus, indicando que los aminoácidos básicos en esta posición se tolerarán. Q53 es R ActRIIB bovino y K en ActRIIB de Xenopus y, por tanto, los aminoácidos incluyendo R, K, Q, N y H se tolerarán en esta posición. Por tanto, una fórmula general para una proteína variante ActRIIB activa es una que comprenda los aminoácidos 29-109, pero empiece opcionalmente en una posición que oscila de 20-24 o 22-25 y termina en una posición que oscila de 129-134 y comprende no más de 1, 2, 5, 10 o 15 cambios de aminoácidos conservativos en el bolsillo de unión a ligando, y cero, una o más alteraciones no conservativas en las posiciones 40, 53, 55, 74, 79 y/o 82 en el bolsillo de unión a ligando. Dicha proteína puede conservar más de un 80 %, 90 %, 95 % o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 29-109 de la SEC ID Nº: 2. Los sitios fuera del bolsillo de unión, en los cuales la variabilidad puede tolerarse particularmente bien, incluyen los extremos amino y carboxilo del dominio extracelular (tal como se ha señalado anteriormente), y las posiciones 42-46 y 65-73. Una alteración de asparagina a alanina en la posición 65 (N65A) realmente mejora en la unión a ligando en el entorno de A64 y, por tanto, se espera que no tenga ningún efecto perjudicial sobre la unión a ligando en el entorno de R64. Este cambio probablemente elimina la glucosilación en N65 en el entorno de A64, demostrando, por tanto, que es probable que en esta región se tolere un cambio significativo. Mientras que un cambio R64A se tolera mal, R64K se tolera bien y, por tanto, otro resto básico, tal como H puede tolerarse en la posición 64.

ActRIIB está bien conservada a lo largo de casi todos los vertebrados, con grandes tramos del dominio extracelular conservados completamente. Muchos de los ligandos que se unen a ActRIIB también están altamente conservados. Por consiguiente, las comparaciones de secuencias de ActRIIB de diversos organismos vertebrados proporcionan perspectivas sobre los restos que pueden alterarse. Por lo tanto, un variante ActRIIB humano activo puede incluir uno o más aminoácidos en posiciones correspondientes de la secuencia de ActRIIB de otro vertebrado, o puede incluir un resto que es similar al de la secuencia humana o de otro vertebrado. Los siguientes ejemplos ilustran esta estrategia para definir un variante ActRIIB activo. L46 es una valina en ActRIIB de Xenopus, y por eso puede alterarse esta posición y opcionalmente puede alterarse a otro resto hidrófobo, tal como V, I o F, o a un resto apolar tal como A. E52 es una K in Xenopus, indicando que este sitio puede ser tolerante a una amplia variedad de cambios, incluyendo restos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y y probablemente A. T93 es una K in Xenopus, indicando que en esta posición se tolera una amplia variación estructural, favoreciéndose restos polares, tales como S, K, R, E, D, H, G, P, G e Y. F108 es una K in Xenopus, y, por lo tanto, debería tolerarse Y o cualquier otro grupo hidrófobo, tal como I, V o L. E111 es K in Xenopus, indicando que en esta posición se tolerarán restos cargados, incluyendo D, R, K y H, así como Q y N. R112 es K in Xenopus, indicando que en esta posición se toleran restos básicos, incluyendo R y H. A en la posición 119 está relativamente mal conservada y aparece como P en roedores y V en Xenopus, por tanto, en esta posición debería tolerarse esencialmente cualquier aminoácido.

La divulgación demuestra que la adición de un sitio de glucosilación ligada a nitrógeno adicional (N-X-S/T) aumenta la semivida en suero de una proteína de fusión ActRIIB-Fc, en relación con la forma ActRIIB(R64)-Fc. Introduciendo una asparagina en la posición 24 (construcción A24N), se crea una secuencia NXT que confiere una semivida más larga. Otras secuencias NX(T/S) se encuentran en 42-44 (NQS) y 65-67 (NSS), aunque la última puede no glucosilarse de forma eficaz con la R en la posición 64. Pueden introducirse generalmente secuencias N-X-S/T en posiciones fuera del bolsillo de unión a ligando definido en la figura 12. Los sitios particularmente adecuados para la introducción de secuencias N-X-S/T no endógenas incluyen los aminoácidos 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134

: o 129-134. También pueden introducirse secuencias N-X-S/T en el enlazador entre la secuencia ActRIIB y el Fc u otro componente de la fusión. Dicho sitio puede introducirse con un esfuerzo mínimo introduciendo una N en la posición correcta con respecto a una S o T preexistentes, o introduciendo una S o T en una posición correspondiente a una N preexistente. Por tanto, las alteraciones deseables que crearían un sitio de glucosilación ligado a N son: A24N, R64N, S67N (posiblemente combinada con una alteración N65A), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S y R112T. Cualquier S que se predice que se glucosilará puede alterarse a una T sin crear un sitio inmunogénico, a causa de la protección alcanzada por la glucosilación. Del mismo modo, cualquier T que se predice que se glucosilará puede alterarse a una S. Por tanto, se contemplan las alteraciones S67T y S44T. Del mismo modo, en una variante A24N, puede usarse una alteración S26T. Por consiguiente, un variante ActRIIB puede incluir una o más secuencias consenso de glucosilación ligada a N no endógenas.

La posición L79 puede alterarse para conferir propiedades de unión a activina-miostatina (GDF-11) alteradas. L79A

: o L79P reduce la unión a GDF-11 en mayor grado que la unión a activina. L79E o L79D conserva la unión a GDF-11. De manera destacable, las variantes L79E y L79D de acuerdo con la invención tienen unión a activina enormemente reducida. Los experimentos in vivo indican que estos receptores no de activina conservan una capacidad significativa de aumentar la masa muscular pero muestran efectos reducidos sobre otros tejidos. Estos datos demuestran la conveniencia y viabilidad para obtener polipéptidos con efectos reducidos sobre activina.

Las variaciones que se describen pueden combinarse de diversas formas. Además, los resultados del programa de mutagénesis que se describen en el presente documento indican que existen posiciones de aminoácidos en ActRIIB que suele ser beneficioso conservar. Éstas incluyen la posición 64 (aminoácido básico), la posición 80 (aminoácido

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ácido o hidrófobo), la posición 78 (hidrófobo y particularmente triptófano), la posición 37 (ácido y particularmente ácido aspártico o glutámico), la posición 56 (aminoácido básico), la posición 60 (aminoácido hidrófobo, particularmente fenilalanina o tirosina). Por tanto, en cada una de las variantes que se desvelan en el presente documento, la divulgación proporciona un armazón de aminoácidos que pueden conservarse. Otras posiciones que puede ser deseable conservar son las siguientes: posición 52 (aminoácido ácido), posición 55 (aminoácido básico), posición 81 (ácido), 98 (polar o cargado, particularmente E, D, R o K).

Pueden obtenerse fragmentos aislados de los polipéptidos ActRIIB mediante exploración de los polipéptidos producidos de forma recombinante a partir del fragmento correspondiente del ácido nucleico que codifica un polipéptido ActRIIB (p. ej., las SEQ ID NO: 3 y 4). Además, pueden sintetizarse químicamente fragmentos usando técnicas conocidas en la técnica tales como la química t-Boc o f-Moc en fase sólida de Merrifield. Los fragmentos pueden producirse (de forma recombinante o mediante síntesis química) y ensayarse para identificar aquellos fragmentos peptidilo que pueden funcionar, por ejemplo, como antagonistas (inhibidores) o agonistas (activadores) de una proteína ActRIIB o un ligando ActRIIB.

Una variante funcional de los polipéptidos ActRIIB puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3, 4 y 10. En ciertos casos, la variante funcional tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 3, 4 y 10.

En ciertas realizaciones, la presente invención contempla hacer variantes funcionales modificando la estructura de un polipéptido ActRIIB para fines tales como potenciar la eficacia terapéutica, o la estabilidad (p. ej., semivida ex vivo y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). También pueden producirse polipéptidos ActRIIB modificados, por ejemplo, mediante sustitución, eliminación, o adición de aminoácidos. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente (p. ej., mutaciones conservativas) no tendrá un efecto principal sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservativas son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Puede determinarse fácilmente si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ActRIIB resulta en un homólogo funcional evaluando la capacidad del polipéptido ActRIIB variante para producir una respuesta en células de una forma similar al polipéptido ActRIIB natural, o de unirse a uno o más ligandos, tales como activina, GDF-11 o miostatina de una forma similar al natural.

En realizaciones específicas, la presente invención contempla hacer mutaciones en el dominio extracelular (también denominado como dominio de unión a ligando) de un polipéptido ActRIIB de modo que el polipéptido ActRIIB variante (o mutante) tiene actividades de unión a ligando alteradas (p. ej., afinidad de unión o especificidad de unión). En ciertos casos, dichos polipéptidos ActRIIB variantes tienen afinidad de unión alterada (elevada o reducida) por un ligando específico. En otros casos, los polipéptidos ActRIIB variantes tienen especificidad de unión alterado por sus ligandos.

Por ejemplo, la divulgación proporciona polipéptidos ActRIIB variantes que se unen de forma preferente a GDF8/GDF11 en relación con las activinas. La divulgación establece además la conveniencia de dichos polipéptidos para reducir efectos fuera de diana, aunque dichas variantes selectivas pueden ser menos deseables para el tratamiento de enfermedades graves en las que pueden necesitarse ganancias de masa muscular muy grandes para el efecto terapéutico y en las que es aceptable un cierto nivel de efectos fuera de diana. Por ejemplo, restos de aminoácidos de la proteína ActRIIB, tales como E39, K55, Y60, K74, W78, D80, y F101, están en el bolsillo de unión a ligando y median unión a sus ligandos tales como activina y GDF8. Por tanto, un dominio de unión a ligando alterado (p. ej., dominio de unión a GDF8) de un receptor ActRIIB, puede comprender una o más mutaciones en esos restos de aminoácidos. Opcionalmente, el dominio de unión a ligando alterado puede tener una selectividad aumentada por un ligando tal como GDF8 en relación con un dominio de unión a ligando natural de un receptor ActRIIB. A modo de ilustración, estas mutaciones aumentan la selectividad del dominio de unión a ligando alterado por GDF8 sobre activina. Opcionalmente, el dominio de unión a ligando alterado tiene una proporción de Kd para la unión de activina con respecto a la Kd para la unión a GDF8 que es de al menos 2, 5, 10, o incluso 100 veces mayor en relación con la proporción para la unión al dominio de unión a ligando natural. Opcionalmente, el dominio de unión a ligando alterado tiene una proporción de CI50 para inhibir activina con respecto a la CI50 para inhibir GDF8 que es de al menos 2, 5, 10, o incluso 100 veces mayor en relación con el dominio de unión a ligando natural. Opcionalmente, el dominio de unión a ligando alterado inhibe GDF8 con una CI50 al menos 2, 5, 10, o incluso 100 veces menor que la CI50 para inhibir activina.

Como ejemplo específico, el resto de aminoácido Asp cargado positivamente del dominio de unión a ligando de ActRIIB puede mutarse a un resto de aminoácido diferente de modo que el polipéptido ActRIIB variante se une de forma preferente a GDF8, pero no a activina. Preferentemente, el resto D80 se cambia a un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: un resto del aminoácido no cargado, un resto del aminoácido negativo, un resto del aminoácido hidrófobo, De acuerdo con la invención, el resto hidrófobo, L79, puede alterarse a los aminoácidos ácidos ácido aspártico o ácido glutámico para reducir enormemente la unión a activina mientras que se conserva la unión a GDF11. Tal como reconocerá un experto en la técnica, la mayoría de las mutaciones, variantes

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dar lugar a efectos biológicos más transitorios y, cuando forma parte de un sistema de expresión inducible, puede permitir un control más estrecho de los niveles de polipéptido ActRIIB recombinante dentro de la célula.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos ActRIIB útiles de la invención pueden comprender adicionalmente modificaciones postraduccionales además de cualquiera que esté presente de forma natural en los polipéptidos ActRIIB. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación Como resultado, los polipéptidos ACTRIIB modificados pueden contener elementos no aminoácidos, tales como polietilenglicoles, lípidos, poli o monosacáridos y fosfatos. Pueden ensayarse efectos de dichos elementos no aminoácidos sobre la funcionalidad de un polipéptido ACTRIIB tal como se describe en el presente documento para otras variantes de polipéptido ActRIIB. Cuando un polipéptido ActRIIB se produce en las células mediante escisión de una forma naciente del polipéptido ActRIIB, el procesamiento postraduccional también puede ser importante para el plegamiento y/o función correctos de la proteína. Diferentes células (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales y pueden elegirse para garantizar la modificación y procesamiento correctos de los polipéptidos ActRIIB.

Las variantes funcionales o las formas modificadas de los polipéptidos ActRIIB pueden incluir proteínas de fusión que tienen al menos una porción de los polipéptidos ActRIIB y uno o más dominios de fusión. Los ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S-transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., un Fc), proteína de unión a maltosa (MBP, por sus siglas en inglés), o seroalbúmina humana. Puede seleccionarse un dominio de fusión para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Para el fin de purificación por afinidad, se usan matrices pertinentes para cromatografía de afinidad, tales como resinas de glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Muchas de dichas matrices están disponibles en forma de "kit", tal como el sistema de purificación Pharmacia GST y el sistema QIAexpress™ system (Qiagen), útil con moléculas asociadas de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, puede seleccionarse un dominio de fusión para facilitar la detección de los polipéptidos ActRIIB. Los ejemplos de dichos dominios de detección incluyen las diferentes proteínas fluorescentes

(p. ej., GFP) así como "marcadores de epítopo", que suelen ser secuencias de péptido cortas para las cuales hay un anticuerpo específico disponible. Los marcadores de epítopo bien conocidos para los cuales hay anticuerpos monoclonales específicos fácilmente disponibles incluyen marcadores FLAG, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión de proteasa, tal como para factor Xa o trombina, que permite a la proteasa pertinente digerir las proteínas de fusión y liberar así las proteínas recombinantes de ellos. Las proteínas pueden aislarse después a partir del dominio de fusión mediante separación cromatográfica posterior. En ciertas realizaciones preferidas, un polipéptido ActRIIB se fusiona con un dominio que estabiliza el polipéptido ActRIIB in vivo (un dominio "estabilizador"). Por "estabilizador" se quiere decir cualquier cosa que aumente la semivida en suero, independientemente de si esto es por destrucción reducida, aclaramiento reducido por el riñón, u otro efecto farmacocinético. Se sabe que las fusiones con la porción Fc de una inmunoglobulina confieren propiedades farmacocinéticas deseables en una amplia gama de proteínas. Del mismo modo, las fusiones con seroalbúmina humana pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusión que pueden seleccionarse incluyen dominios multimerizantes (p. ej., dimerizantes, tetramerizantes) y dominios funcionales (que confieren una función biológica adicional, tal como estimulación adicional del crecimiento muscular).

Como ejemplo específico, en el presente documento se desvela una proteína de fusión como un antagonista de GDF8 que comprende un dominio extracelular (p. ej., de unión a GDF8) fusionado a un dominio Fc (p. ej., la SEQ ID NO: 13).

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Preferentemente, el dominio Fc tiene una o más mutaciones en restos tales como Asp-265, lisina 322, y Asn-434. En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (p. ej., la mutación Asp-265) tiene capacidad reducida de unión al receptor Fcγ en relación con un dominio Fc natural. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (p. ej., la mutación Asp-434) tiene capacidad aumentada de unión al receptor Fc relacionado con el MHC de clase I (FcRN) en relación con un dominio Fc natural.

Se entiende que elementos diferentes de las proteínas de fusión pueden disponerse de cualquier manera que sea consecuente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIB puede situarse en posición Cterminal a un dominio heterólogo o, como alternativa, un dominio heterólogo puede situarse en posición C-terminal a un polipéptido ActRIIB. El del polipéptido ActRIIB y el dominio heterólogo no necesitan estar adyacentes en una

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proteína de fusión, y pueden incluirse dominios o secuencias de aminoácidos adicionales en posición C-o N-terminal a cada dominio o entre los dominios.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos ActRIIB útiles en la presente invención contienen una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos ACTRIIB. Por ejemplo, dichas modificaciones potencian la semivida in vitro de los polipéptidos ACTRIIB, potencian la semivida circulatoria de los polipéptidos ActRIIB o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos ActRIIB. Dichas modificaciones estabilizadoras incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un polipéptido ActRIIB y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glucosilación (incluyendo, por ejemplo, adición de un sitio de glucosilación a un polipéptido ActRIIB), y modificaciones del resto de carbohidrato (incluyendo, por ejemplo, eliminación de restos de carbohidrato de un polipéptido ActRIIB). En el caso de proteínas de fusión, un polipéptido ActRIIB se fusiona a un dominio estabilizador tal como una molécula de IgG (p. ej., un dominio Fc). Tal como se usa en el presente documento, la expresión "dominio estabilizador" no solo se refiere a un dominio de fusión (p. ej., Fc), como en el caso de proteínas de fusión, sino que también incluye modificaciones no proteicas tales como un resto de carbohidrato, o un polímero no proteico, tal como polietilenglicol.

En el presente documento se desvelan formas aisladas y/o purificadas de los polipéptidos de ActRIIB, que están aisladas de, o sustancialmente libres de otra forma de, otras proteínas.

Los polipéptidos ACTRIIB útiles de la invención pueden producirse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos ActRIIB pueden sintetizarse usando técnicas de química de proteínas convencionales tales como las descritas en Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) y Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User’s Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992). Además, hay sintetizadores de péptidos automatizados disponibles comercialmente (p. ej., Advanced ChemTech Model 396; MilligenBiosearch 9600). Como alternativa, los polipéptidos ACTRIIB, fragmentos o variantes de los mismos pueden producirse de forma recombinante usando diversos sistemas de expresión (p. ej., E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, baculovirus) tal como es bien conocido en la técnica (véase también a continuación). En una realización adicional, los polipéptidos ActRIIB pueden producirse mediante digestión de polipéptidos ActRIIB de origen natural o de longitud completa producidos de forma recombinante usando, por ejemplo, una proteasa, p. ej., tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina, o enzima convertidora de aminoácidos básicos apareados (PACE, por sus siglas en inglés). Puede usarse análisis informático (usando un programa informático disponible comercialmente, p. ej., MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar sitios de escisión proteolítica. Como alternativa, dichos polipéptidos ActRIIB pueden producirse a partir de polipéptidos ActRIIB de origen natural o de longitud completa producidos de forma recombinante tales como técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mediante escisión química (p. ej., bromuro de cianógeno, hidroxilamina).

3. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos ActRIIB

En el presente documento se desvelan ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos ActRIIB (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles), incluyendo cualquiera de las variantes que se desvelan en el presente documento. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 4 codifica un polipéptido precursor ACTRIIB de origen natural, mientras que la SEQ ID NO: 3 codifica un polipéptido ActRIIB soluble. Los ácidos nucleicos objeto pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, en métodos para hacer polipéptidos ActRIIB o como agentes terapéuticos directos (p. ej., en una estrategia de terapia génica).

Se entiende además que los ácidos nucleicos objeto que codifican polipéptidos ACTRIIB incluyen ácidos nucleicos que son variantes de la SEQ ID NO: 3. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, tales como las variantes alélicas; y, por tanto, incluirán secuencias codificantes que difieren de la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante designada en la SEQ ID NO: 4.

En el presente documento se desvelan secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que son al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEC ID Nº: 3. Alguien con experiencia habitual en la técnica apreciará que también se desvelan las secuencias de ácido nucleico complementarias a la SEC ID Nº:3 y las variantes de la SEC ID Nº: 3. Las secuencias de ácido nucleico pueden aislarse, recombinarse y/o fusionarse con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una biblioteca de ADN.

Otros ácidos nucleicos también incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de nucleótidos designada en la SEQ ID NO: 3, la secuencia complementaria de la SEC ID Nº: 3, o fragmentos de las mismas. Tal como se ha discutido anteriormente, alguien con experiencia habitual en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN pueden variarse. Alguien con experiencia habitual en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN pueden variarse. Por ejemplo, se podría realizar la hibridación en cloruro sódico/citrato sódico (SSC, por sus siglas en inglés) 6,0 x a alrededor de 45 ºC seguida de un lavado de SSC

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de células eucariotas. Algunos de estos vectores están modificados con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y selección de resistencia farmacológica en células tanto procariotas como eucariotas. Como alternativa, pueden usarse derivados de virus tales como papilomavirus bovino (PVB-1) o el virus de Epstein-Barr (derivados de pHEBo, pREP y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Pueden encontrarse ejemplos de otros sistemas de expresión virales (incluyendo retrovirales) a continuación en la descripción de los sistemas de dispensación de terapia génica. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de los organismos anfitriones son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, así como para procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) capítulos 16 y 17. En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUWI) y vectores derivados de pBlueBac (tales como el pBlueBac III que contiene β-gal).

Un vector se diseñará preferentemente para la producción de los polipéptidos ActRIIB objeto en células CHO, tal como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), los vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y los vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Tal como será evidente, las construcciones génicas objeto pueden usarse para causar la expresión de los polipéptidos ActRIIB objeto en células propagadas en cultivo, p. ej., para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión o proteínas variantes, para purificación.

En el presente documento se desvela una célula anfitriona transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante (p. ej., la SEQ ID NO: 4) para uno o más de los polipéptidos ActRIIB objeto. La célula anfitriona puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIB útil de la invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (p. ej., usando un sistema de expresión de baculovirus), levadura, o células de mamíferos. Los expertos en la técnica conocen otras células anfitrionas adecuadas.

Por consiguiente, se desvelan métodos para producir los polipéptidos ActRIIB objeto. Por ejemplo, una célula anfitriona transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido ActRIIB puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido ActRIIB. El polipéptido ActRIIB puede segregarse y aislarse a partir de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido ActRIIB. Como alternativa, el polipéptido ActRIIB puede retenerse en el citoplasma o en una fracción de membrana y las células recogerse, lisarse y aislarse la proteína. Un cultivo celular incluye células anfitrionas, medios y otros subproductos. Los medios de cultivo adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Los polipéptido ActRIIB objeto pueden aislarse a partir de medio de cultivo celular, células anfitrionas, o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos ActRIIB. El polipéptido ActRIIB puede ser una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación.

Un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia de sitio de escisión de poli-(His)/enterocinasa en el extremo N de la porción deseada del polipéptido ACTRIIB recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad usando una resina metálica de Ni2+. La secuencia líder de purificación puede eliminarse posteriormente mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido ActRIIB purificado (p. ej., véase Hochuli, et al., (1987) J. Chromatography 411:177; y Janknecht et al., PNAS EE.UU. 88:8972).

Las técnicas para hacer genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptido se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando extremos romos o escalonados para el ligamiento, digestión con enzima de restricción para proporcionar los extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable y ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, puede llevarse a cabo amplificación por PCR de fragmentos de gen usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden aparearse posteriormente para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

4. Anticuerpos

También se desvelan en el presente documento anticuerpos. Un anticuerpo que es reactivo de forma específica con un polipéptido ActRIIB (p. ej., un polipéptido ActRIIB soluble) y que se une de forma competitiva con el polipéptido ACTRIIB puede usarse como antagonista de actividades del polipéptido ACTRIIB. Por ejemplo, usando inmunógenos procedentes de un polipéptido ActRIIB, pueden hacerse antisueros o anticuerpos monoclonales antiproteína/antipéptido mediante protocolos convencionales (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual

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del mismo como antígeno. Los anticuerpos de este tipo pueden usarse, p. ej., para detectar polipéptidos ACTRIIB en muestras biológicas y/o supervisar niveles de polipéptido ActRIIB soluble en un individuo. En ciertos casos, un anticuerpo que se une de forma específica a un polipéptido ActRIIB soluble puede usarse para modular actividad de un polipéptido ActRIIB y/o un ligando ActRIIB, regulando así (promoviendo o inhibiendo) el crecimiento de tejidos, tales como hueso, cartílago, músculo, grasa y neuronas.

5. Ensayos de exploración

Los polipéptidos ActRIIB objeto (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles) pueden usarse para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de los polipéptidos ActRIIB. Los compuestos identificados a través de esta exploración pueden ensayarse en tejidos tales como hueso, cartílago, músculo, grasa y/o neuronas, para valorar su capacidad para modular crecimiento tisular in vitro. Opcionalmente, estos compuestos pueden ensayarse además en modelos animales para valorar su capacidad para modular crecimiento tisular in vivo.

Existen numerosas estrategias de exploración de agentes terapéuticos para modular crecimiento tisular dirigiéndose hacia polipéptidos ACTRIIB. En ciertas realizaciones, puede llevarse a cabo exploración de alto rendimiento de compuestos para identificar agentes que perturban efectos mediados por ActRIIB sobre el crecimiento del hueso, cartílago, músculo, grasa y/o neuronas. El ensayo puede llevarse a cabo para explorar e identificar compuestos que inhiben o reducen de forma específica la unión de un polipéptido ACTRIIB a su molécula asociada de unión, tal como un ligando ActRIIB (p. ej., activina, Nodal, GDF8, GDF11 o BMP7). Como alternativa, el ensayo puede usarse para identificar compuestos que potencian la unión de un polipéptido ActRIIB a su proteína de unión tal como un ligando ActRIIB. Los compuestos pueden identificarse mediante su capacidad para interaccionar con un polipéptido ActRIIB.

Serán suficientes una variedad de formatos de ensayo y, a la luz de la presente divulgación, alguien con experiencia habitual en la técnica comprenderá, no obstante, los que no se describen expresamente en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento, los compuestos (agentes) de ensayo de la invención pueden crearse mediante cualquier método químico combinatorio. Como alternativa, los compuestos objeto pueden ser biomoléculas de origen natural sintetizadas in vivo o in vitro. Pueden producirse compuestos (agentes) para ensayar su capacidad de actuar como moduladores de crecimiento tisular, por ejemplo, mediante bacterias, levadura, vegetales u otros organismos (p. ej., productos naturales), producirse químicamente (p. ej., moléculas pequeñas, incluyendo peptidomiméticos), o producirse de forma recombinante. Los compuestos de ensayo que se contemplan en el presente documento incluyen moléculas orgánicas no peptidilo, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácido nucleico. El agente de ensayo puede ser una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular de menos de alrededor de 2.000 daltons.

Los compuestos de ensayo pueden proporcionarse como entidades individuales discretas, o proporcionarse en bibliotecas de mayor complejidad, tales como las hechas mediante química combinatoria. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de compuestos de ensayo al sistema de ensayo puede ser, bien en forma aislada o bien como mezclas de compuestos, especialmente en etapas de exploración iniciales. Opcionalmente, los compuestos pueden derivatizarse opcionalmente con otros compuestos y tener grupos derivatizantes que facilitan el aislamiento de los compuestos. Los ejemplos no limitantes de grupos derivatizantes incluyen biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, polihistidina, perlas magnéticas, glutatión S-transferasa (GST), reticulantes fotoactivables o cualquier combinación de los mismos.

En numerosos programas de exploración de fármacos que ensayan bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento a fin de aumentar al máximo el número de compuestos seguidos en un periodo de tiempo dado. Los ensayos que se llevan a cabo en sistemas acelulares, tales como los que pueden proceder de proteínas purificadas o semipurificadas, suelen preferirse como exploraciones "primarias" ya que pueden generarse para permitir el desarrollo rápido y la detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de ensayo. Además, los efectos de toxicidad celular o biodisponibilidad del compuesto de ensayo pueden ignorarse generalmente en el sistema in vitro, centrándose el ensayo, en cambio, principalmente en el efecto del fármaco sobre la diana molecular, que puede hacerse manifiesto en una alteración de la afinidad de unión entre un polipéptido ActRIIB y su proteína de unión (p. ej., un ligando ActRIIB).

Meramente para ilustrar, en un ensayo de exploración de ejemplo de la presente invención, el compuesto de interés se pone en contacto con un polipéptido ActRIIB aislado y purificado que habitualmente es capaz de unirse a un ligando ActRIIB, según sea apropiado para la intención del ensayo. A la mezcla del compuesto y el polipéptido ActRIIB se añade después una composición que contiene un ligando ActRIIB. La detección y cuantificación de complejos ActRIIB/ligando ActRIIB proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto para inhibir (o potenciar) la formación de complejo entre el polipéptido ActRIIB y su proteína de unión. La eficacia del compuesto puede valorarse generando curvas de dosis respuesta a partir de datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de ensayo. Además, también puede realizarse un ensayo de control para proporcionar un valor de referencia para la comparación. Por ejemplo, en un ensayo de control, el ligando ActRIIB aislado y purificado se

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Pueden proporcionarse métodos y agentes para modular (estimular o inhibir) formación de hueso e incrementar la masa ósea. Por lo tanto, cualquier compuesto identificado pueden ensayarse en células o tejidos completos, in vitro

o in vivo, para confirmar su capacidad para modular crecimiento de hueso o cartílago. Pueden utilizarse diversos métodos conocidos en la técnica para este fin.

Por ejemplo, el efecto de los polipéptidos ActRIIB o los compuestos de ensayo sobre el crecimiento de hueso o cartílago puede determinarse midiendo inducción de Msx2 o diferenciación de células osteoprogenitoras en osteoblastos en ensayos basados en células (véase, p. ej., Daluiski et al., Nat Genet. 2001,27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9). Otro ejemplo de ensayos basados en células incluye analizar la actividad osteogénica de los polipéptidos ActRIIB y los compuestos de ensayo en células progenitoras mesenquimales y osteoblásticas. A modo de ilustración, se construyeron adenovirus recombinantes que expresaban un polipéptido ActRIIB para infectar células C3H10T1/2 progenitoras mesenquimales pluripotentes, células C2C12 preosteoblástsicas y células TE-85 osteoblásticas. La actividad osteogénica se determina después midiendo la inducción de fosfatasa alcalina, osteocalcina y matriz de mineralización (véase, p. ej., Cheng et al., J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A (8):1544-52).

También se contemplan ensayos in vivo para medir crecimiento de hueso o cartílago. Por ejemplo, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001) desvela un modelo osteoporótico de rata en el cual se estudia reparación ósea durante el periodo temprano tras la fractura. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999) también desvela un modelo osteoporótico de rata en el cual se estudia reparación ósea durante el periodo tardío tras la fractura. Estas referencias desvelan un modelo de rata para el estudio sobre la fractura del hueso osteoporótico. La presente divulgación hace uso de ensayos de consolidación de fractura que son conocidos en la técnica. Estos ensayos incluyen técnica de fractura, análisis histológicos y análisis biomecánicos, que se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 6.521.750, que desvela protocolos experimentales para causar, así como para medir, el grado de fracturas y el proceso de reparación.

En el presente documento se desvelan métodos y agentes para controlar la ganancia de peso y la obesidad. A nivel celular, la proliferación y diferenciación adipocítica es crítica en el desarrollo de la obesidad, lo cual conduce a la generación de células de grasa (adipocitos). Por lo tanto, cualquier compuesto identificado pueden ensayarse en células o tejidos completos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad para modular adipogénesis midiendo proliferación o diferenciación adipocítica. Pueden utilizarse diversos métodos conocidos en la técnica para este fin. Por ejemplo, el efecto de un polipéptido ActRIIB (p. ej., un polipéptido ActRIIB soluble) o compuestos de ensayo sobre la adipogénesis puede determinarse midiendo diferenciación de preadipocitos 3T3-L1 a adipocitos maduros en ensayos basados en células, tales como, observando la acumulación de triacilglicerol en tinción de vesículas con rojo oleoso O y mediante la aparición de ciertos marcadores adipocíticos tales como (aP2/422) y PPARγ2. Véase, por ejemplo, Reusch et al., 2000, Mol Cell Biol. 20:1008-20; Deng et al., 2000, Endocrinology. 141:2370-6; Bell et al., 2000, Obes Res. 8:249-54. Otro ejemplo de ensayos basados en células incluyen analizar el papel de polipéptidos ActRIIB y compuestos de ensayo en la proliferación de adipocitos o células precursoras de adipocitos (p. ej., células 3T3-L1), tales como, supervisando células positivas a bromodesoxiuridina (BrdU). Véase, por ejemplo, Pico et al., 1998, Mol Cell Biochem. 189:1-7; Masuno et al., 2003, Toxicol Sci. 75:314-20.

Se entiende que los ensayos de exploración que se describen en el presente documento son pertinentes no solo para los polipéptidos ActRIIB y variantes de los polipéptidos ActRIIB objeto, sino también para cualesquiera compuestos de ensayo incluyendo agonistas y antagonistas de los polipéptidos ActRIIB. Además, estos ensayos de exploración son útiles para los fines de verificación de dianas farmacológicas y control de calidad.

6. Usos terapéuticos

En la presente invención, la proteína ActRIIB variante es para su uso para promover formación de hueso, aumentar la mineralización ósea, el tratamiento de la osteoporosis y el tratamiento de las fracturas óseas, el tratamiento de defectos del cartílago o el tratamiento de la densidad ósea baja.

Pueden usarse polipéptidos ActRIIB para tratar o prevenir una enfermedad o afección que está asociada con actividad anómala de un polipéptido ActRIIB y/o un ligando ActRIIB (p.ej., GDF8), Estas enfermedades, trastornos o afecciones se denominan en general en el presente documento como "afecciones asociadas con ActRIIB". En el presente documento se desvelan métodos de tratamiento o prevención en un individuo que lo necesite a través de la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido ActRIIB tal como se ha descrito anteriormente. Estos métodos se dirigen particularmente al tratamiento terapéutico o profiláctico de animales y, más particularmente, seres humanos.

Tal como se usa en el presente documento, un producto terapéutico que "previene" un trastorno o afección se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la aparición del trastorno o afección en la muestra tratada en relación con una muestra del control no tratada, o retrasa el comienzo o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o afección en relación con la muestra del control no tratada. El término "tratar" tal como se usa en el presente documento incluye profilaxis de la citada afección o mejoría o eliminación de la afección una vez que se ha establecido.

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La masa muscular aumentada inducida por polipéptido ActRIIB podría beneficiar también a los que padecen enfermedades de atrofia muscular progresiva. Gonzalez-Cadavid et al. (citado anteriormente) publicaron que la expresión de GDF8 se correlaciona de forma inversa con la masa libre de grasa en seres humanos y que la expresión aumentada del gen GDF8 está asociada con la pérdida de peso en hombres son síndrome de emaciación por SIDA. Inhibiendo la función de GDF8 en los pacientes de SIDA, al menos ciertos síntomas de SIDA pueden aliviarse, si no eliminarse completamente, mejorando significativamente, por tanto, la calidad de vida en los pacientes de SIDA.

Como la pérdida de función de GDF8 (un ligando de ActRIIB) también está asociada con pérdida de grasa sin disminución de la ingesta de nutrientes (Zimmers et al., citado anteriormente; McPherron and Lee, citado anteriormente), los polipéptidos ActRIIB objeto pueden usarse además como agente terapéutica para retrasar o prevenir el desarrollo de obesidad y diabetes de tipo II. Esta estrategia está confirmada y respaldada por los datos que se muestran en el presente documento, por medio de los cuales se demostró que una proteína ActRIIB-Fc mejora el estado metabólico en ratones obesos.

El síndrome de anorexia-caquexia por cáncer está entre los aspectos del cáncer más debilitantes y potencialmente mortales. La pérdida progresiva de peso en el síndrome de anorexia-caquexia por cáncer es un aspecto común de muchos tipos de cáncer y es responsable, no solo de una mala calidad de vida y mala respuesta a la quimioterapia, sino también de un periodo de supervivencia más corto del que se encuentra en pacientes con tumores comparables pero sin pérdida de peso. Asociada con anorexia, consunción de grasa y tejido muscular, sufrimiento psicológico y una menor calidad de vida, la caquexia surge a partir de una interacción compleja entre el cáncer y el anfitrión. Es una de las causas de muerte más comunes entre los pacientes de cáncer y está presente en el 80 % en el momento de la muerte. Es un ejemplo complejo de caos metabólico que afecta al metabolismo de proteínas, carbohidratos, y grasas. Los tumores producen anomalías tanto directas como indirectas, resultando en anorexia y pérdida de peso. Actualmente, no existe tratamiento para controlar o invertir el proceso. El síndrome de anorexia-caquexia afecta a la producción de citocinas, liberación de factores movilizadores de lípidos e inductores de proteolisis y alteraciones en el metabolismo intermedio. Aunque la anorexia es común, una ingesta de alimento reducida sola es incapaz de justificar los cambios en la composición corporal que se observan en los pacientes de cáncer y el aumento de la ingesta de nutrientes es incapaz de invertir el síndrome de emaciación. Debe sospecharse caquexia en pacientes con cáncer si se produce una pérdida de peso involuntaria de más del cinco por ciento del peso premórbido dentro de un periodo de seis meses.

Como se encontró que la sobreexpresión sistémica de GDF8 induce una profunda pérdida de músculo y grasa análoga a la que se observa en los síndromes de caquexia humanos (Zimmers et al., citado anteriormente), pueden usarse beneficiosamente los polipéptidos ACTRIIB objeto como composiciones farmacéuticas para prevenir, tratar, o aliviar los síntomas del síndrome de caquexia, en el que se desea crecimiento muscular.

La presente invención proporciona una proteína ActRIIB variante para su uso en métodos para inducir formación de hueso y/o cartílago, prevenir la pérdida ósea, aumentar la mineralización ósea o prevenir la desmineralización del hueso Por ejemplo, la proteína ActRIIB variante puede usarse en el tratamiento de la osteoporosis y en la consolidación de fracturas óseas y defectos del cartílago en seres humanos y otros animales. Los polipéptidos ActRIIB pueden ser útiles en pacientes que están diagnosticados de densidad ósea baja subclínica, como una medida protectora contra el desarrollo de osteoporosis.

En una realización específica, la presente invención encuentra utilidad clínica en la consolidación de fracturas óseas y en defectos del cartílago en seres humanos y otros animales. La invención también puede tener uso profiláctico en la reducción de fracturas tanto cerradas como abiertas y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación ósea de novo inducida por un agente osteogénico contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismos, o inducidos por resección quirúrgica y también es útil en cirugía plástica cosmética. Además, los métodos y composiciones que se discuten en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la periodontitis y en otros procesos de reparación dental. En ciertos casos, los polipéptidos ActRIIB objeto pueden proporcionar un entorno para atraer células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. La invención también se relaciona con el tratamiento de la osteoporosis y la reparación de defectos del cartílago. Además, los polipéptidos ActRIIB pueden usarse en la prevención/inversión de la artrosis.

La invención puede relacionarse con la reparación de fracturas y otras afecciones relacionadas con defectos del hueso y/o el cartílago o periodontitis.

En el presente documento se desvelan métodos y composiciones terapéuticas para la cicatrización de heridas y la reparación tisular. Los tipos de heridas incluyen, pero no se limitan a, quemaduras, incisiones y úlceras. Véase, p. ej., el documento WO84/01106. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de los polipéptidos ActRIIB que se desvelan en el presente documento en mezcla con un vehículo, portador o matriz farmacéuticamente aceptables.

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Los métodos y composiciones que se desvelan en el presente documento pueden aplicarse a afecciones causantes de pérdida ósea tales como osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Cushing, tirotoxicosis, estado diarreico crónico o malabsorción, acidosis tubular renal, o anorexia nerviosa. Muchas personas saben que ser mujer, tener un peso corporal bajo y llevar un estilo de vida sedentario son factores de riesgo para la osteoporosis (pérdida de densidad mineral ósea, que conduce a riesgo de fractura). Sin embargo, la osteoporosis también puede resultar de uso a largo plazo de ciertos medicamentos. La osteoporosis resultante de fármacos u otra afección clínica se conoce como osteoporosis secundaria. En una afección conocida como enfermedad de Cushing, la cantidad excesiva de cortisol producida por el organismo resulta en osteoporosis y fracturas. Los medicamentos más comunes asociados con osteoporosis secundaria son los corticosteroides, una clase de fármacos que actúan como el cortisol, una hormona producida de forma natural por las glándulas adrenales. Aunque se necesitan niveles adecuados de hormonas tiroideas (que produce la glándula tiroides) para el desarrollo del esqueleto, el exceso de hormona tiroidea puede reducir la masa ósea a lo largo del tiempo. Los antiácidos que contienen aluminio pueden conducir a pérdida ósea cuando los toman en dosis altas personas con problemas renales, particularmente las sometidas a diálisis. Otros medicamentos que pueden causar osteoporosis secundaria incluyen fenitoína (Dilantin) y barbitúricos que se usan para prevenir crisis epilépticas; metotrexato (Rheumatrex, Immunex; Folex PFS), un fármaco para ciertas formas de artritis, cáncer, y trastornos inmunitarios; ciclosporina (Sandimmun, Neoral), un fármaco usado para tratar algunas enfermedades autoinmunes y para deprimir el sistema inmunitario en pacientes de trasplantes de órganos; agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (Lupron, Zoladex), usados para tratar el cáncer de próstata y la endometriosis; heparina (Calciparine, Liquaemin), un medicamento anticoagulante; y colestiramina (Questran) y colestipol (Colestid), usados para tratar el colesterol alto. La enfermedad gingival causa pérdida ósea porque las bacterias perjudiciales de nuestra boca fuerzan a nuestros organismos a defenderse contra ellas. Las bacterias producen toxinas y enzimas bajo la línea gingival, causando una infección crónica.

En el presente documento se desvelan métodos y agentes terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos asociados con crecimiento óseo anómalo o no deseado. Por ejemplo, en los pacientes que tienen la enfermedad conocida como fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) crece un "segundo esqueleto" anómalo que evita cualquier movimiento. Además, el crecimiento óseo anómalo puede producirse tras cirugía de reemplazo de cadera y, por tanto, echar a perder el resultado quirúrgico. Este es un ejemplo más común de crecimiento óseo patológico y una situación en la que los métodos y composiciones objeto pueden ser terapéuticamente útiles. Los mismos métodos y composiciones pueden ser también útiles para tratar otras formas de crecimiento óseo anómalo (p. ej., crecimiento patológico de hueso tras un traumatismo, quemaduras o lesión de la médula espinal) y para tratar o prevenir las afecciones indeseables asociadas con el crecimiento óseo anómalo que se observa en relación con cáncer de próstata metastásico u osteosarcoma. Los ejemplos de estos agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos ActRIIB que antagonizan la función de un ligando ActRIIB (p. ej., BMP7), compuestos que alteran la interacción entre un ActRIIB y su ligando (p. ej., BMP7) y anticuerpos que se unen de forma específica a un receptor ActRIIB de modo que un ligando ActRIIB (p. ej., BMP7) no puede unirse al receptor ActRIIB.

En el presente documento se desvelan composiciones y métodos para regular el contenido de grasa corporal en un animal y para tratar o prevenir afecciones relacionadas con éste y, particularmente, afecciones que dañan la salud relacionadas con éste. Regular (controlar) el peso corporal puede referirse a reducir o aumentar el peso corporal, reducir o aumentar la velocidad de ganancia de peso, o aumentar o reducir la velocidad de pérdida de peso y también incluye mantener activamente, o no cambiar significativamente el peso corporal (p. ej., contra influencias externas o internas que podrían aumentar o disminuir de otra forma el peso corporal). En el presente documento se desvela la regulación del peso corporal mediante la administración a un animal (p. ej., un ser humano) que lo necesite de un polipéptido ActRIIB.

En el presente documento se desvelan métodos y compuestos para reducir el peso corporal y/o reducir la ganancia de peso en un animal y, más particularmente, para tratar o mejorar la obesidad en pacientes en riesgo de o que padecen obesidad. También se desvelan en el presente documento métodos y compuestos para tratar a un animal que es incapaz de ganar o mantener el peso (p. ej., un animal con un síndrome de emaciación). Dichos métodos son eficaces para aumentar el peso y/o masa corporal, o para reducir la pérdida de peso y/o masa, o para mejorar afecciones asociadas con o causadas por masa y/o peso corporal indeseablemente bajos (p. ej., no saludables).

Otras afecciones, incluyendo colesterol alto, que pueden tratarse con proteínas ACTRIIB se describen en los Ejemplos.

7. Composiciones farmacéuticas

En ciertas realizaciones, los polipéptidos ActRIIB útiles en la presente invención se formulan con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, puede administrarse un polipéptido ACTRIIB solo o como un componente de una formulación farmacéutica (composición terapéutica). Los compuestos objeto pueden formulase para su administración en cualquier forma conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria.

En ciertas realizaciones, la composición puede administrarse por vía tópica, sistémica, o local como un implante para un dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para su uso en esta invención es, por supuesto, una forma libre de pirógeno, fisiológicamente aceptable. Además, la composición puede, deseablemente,

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Las proteínas ActRIIb-hFc y ActRIIb-mFc se expresaron en líneas celulares de CHO. Se consideraron tres secuencias líder diferentes:

(i) Melitina de abeja melífera (HBML): MKFLVNVALVFMWYISYIYA (SEQ ID NO: 7). 5

(ii) Activador tisular del plasminógeno (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 8).

(iii) Nativa: MGAAAICLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 9). 10 La forma seleccionada emplea la líder de TPA y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos no procesada:

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Este polipéptido está codificado por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 10):

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La secuenciación N-terminal del material producido por la célula CHO reveló una secuencia principal de -GRGEAE (SEQ ID NO: 11). De manera notable, otras construcciones publicadas en la bibliografía empiezan con una

20 secuencia -SGR...

La purificación pudo lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía en sefarosa Q, cromatografía en fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La

25 purificación pudo completarse con filtración viral e intercambio de tampón.

Las proteínas de fusión ActRIIb-Fc también se expresaron en células HEK293 y células COS. Aunque el material de todas las líneas celulares y condiciones de cultivo razonables proporcionó proteína con actividad de construcción muscular in vivo, se observó variabilidad de la potencia, relacionada quizá con la selección de la línea celular y/o las

30 condiciones de cultivo.

Ejemplo 2: Generación de mutantes ActRIIb-Fc

Los solicitantes generaron una serie de mutaciones en el dominio extracelular de ActRIIB y produjeron estas proteínas mutantes como proteínas de fusión solubles entre el ActRIIB extracelular y el dominio Fc. La proteína de fusión ActRIIB-Fc original tiene la secuencia (porción Fc subrayada) de SEQ ID NO: 12:

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10 Se introdujeron diversas mutaciones, incluyendo truncamientos N y C terminales, en la proteína ActRIIB-Fc original. Basándose en los datos que se presentan en el ejemplo 1, se espera que estas construcciones, si se expresan con una líder de TPA, carecerán de la serina N-terminal. Las mutaciones se generaron en el dominio extracelular de ActRIIB mediante mutagénesis por PCR. Después de la PCR, los fragmentos se purificaron a través de una columna Qiagen, se digirieron con SfoI y AgeI y se purificaron en gel. Estos fragmentos se ligaron en el vector de expresión

15 pAID4 (véase el documento WO2006/012627) de modo que tras el ligamiento creó una quimera de fusión con IgG1 humana. Tras la transformación en E. coli DH5 alfa, se recogieron las colonias y se aislaron los ADN. Para las construcciones murinas (mFc), se sustituyó una IgG2a murina por la IgG1 humana. Se verificó la secuencia de todos los mutantes.

20 Todos los mutantes se produjeron en células HEK293T mediante transfección transitoria. En resumen, las células HEK293T se ajustaron en un agitador orbital de 500 ml a 6x105 células/ml en medio Freestyle (Invitrogen), en 250 ml de volumen, y se cultivaron durante toda la noche. Al día siguiente, estas células se trataron con complejo ADN:PEI

(1:1) a 0,5 μg/ml de concentración final de ADN. Después de 4 h, se añadieron 250 ml de medio y las células se cultivaron durante 7 días. El medio acondicionado se recogió precipitando las células y se concentró.

25 Los mutantes se purificaron usando una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, columna de proteína A y se eluyeron con tampón glicina a pH bajo (3,0). Después de la neutralización, éstas se dializaron contra PBS.

También se produjeron mutantes en células CHO mediante metodología similar.

30 Los mutantes se analizaron en ensayos y/o bioensayos de unión descritos a continuación. En algunos casos, los ensayos se realizaron con medio acondicionado en lugar de proteínas purificadas.

Ejemplo 3. Bioensayo para la señalización mediada por GDF-11 y activina.

35 Se usó un ensayo de gen indicador A-204 para evaluar los efectos de las proteínas ActRIIB Fc sobre la señalización por GDF-11 y activina A. Línea celular: Rabdomiosarcoma humano (procedente de músculo). Vector indicador: pGL3(CAGA)12 (descrito en Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100.). Véase la figura 5. El motivo CAGA12 está presente en los genes con respuesta a TGF-Beta (gen PAI-1), de modo que este vector es de uso general para

40 factores de señalización a través de Smad2 y 3.

Día 1: División de las células A-204 en placa de 48 pocillos.

Día 2: Las células A-204 se transfectan con 10 μg pGL3(CAGA)12 o pGL3(CAGA)12 (10 μg)+ pRLCMV (1 μg) y 45 Fugene.

Día 3: Adición de factores (diluidos en medio + BSA al 0,1 %). Es necesario preincubar los inhibidores con factores durante 1 h antes de añadirlos a las células. 6 horas después, las células se aclaran con PBS y las células se lisan.

50 Esto se sigue de un ensayo de luciferasa. En ausencia de cualquier inhibidor, activina A mostró 10 veces la estimulación de la expresión del gen indicador y una DE50∼2 ng/ml. GDF-11:estimulación de 16 veces, DE50:∼1.5 ng/ml.

ActRIIB(R64,20-134) es un potente inhibidor de la actividad de activina, GDF-8 y GDF-11 en este ensayo. También 55 se analizaron variantes en este ensayo.

Ejemplo 4. Inhibición de GDF-11 de truncamientos N-terminales y C-terminales

Se generaron truncamientos en el extremo N y el extremo C de la porción ActRIIB-Fc (R64, 20-134) de ActRIIB y se analizó su actividad como inhibidores de GDF-11 y activina. Las actividades se muestran a continuación (determinadas en medios acondicionados):

Truncamientos C-terminales de ActRIIb-hFc:

CI50 (ng/ml)

GDF-11: Activina

ActRIIb-hFc (R64, 20-134): 145 22

ActRIIb-hFc (R64, 20-132): 87 32

ActRIIb-hFc (R64, 20-131): 120 44

ActRIIb-hFc (R64, 20-128): 130 158

10 Como puede observarse, los truncamientos de tres (que terminan en...PPT), seis (que terminan en...YEP) o más aminoácidos en el extremo C causan un descenso de tres veces o más de la actividad de la molécula. El truncamiento de los 15 aminoácidos finales de la porción ActRIIB causa una pérdida de actividad mayor (véase el documento WO2006/012627).

15 Se hicieron truncamientos amino terminales en el entorno de una proteína ActRTIIb-hFc (R64 20-131). Las actividades se muestran a continuación (determinadas en medios acondicionados):

Truncamientos N-terminales de ActRIIb-hFc:

CI50 (ng/ml)

GDF-11: Activina

ActRIIb-hFc (R64, 20-131) (GRG...): 183 201

ActRIIb-hFc (R64, 21-131) (RGE...): 121 325

ActRIIb-hFc (R64,22-131) (GBA...): 71 100

ActRIIb-hFc (R64,23-131) (EAE...): 60 43

ActRIIb-hFc (R64, 24-131) (AET...): 69 105

20 Por consiguiente, los truncamientos de dos, tres o cuatro aminoácidos del extremo N condujeron a la producción de una proteína más activa que las versiones con el dominio extracelular completo. Los experimentos adicionales muestran que un truncamiento de cinco aminoácidos, ActRIIb-hFc (R64, 25-131) tiene una actividad equivalente a la de la forma no truncada y eliminaciones adicionales en el extremo N continúan degradando la actividad de la

25 proteína Por lo tanto, las construcciones óptimas tendrán un extremo C que termina entre los aminoácidos 133-134 de la SEQ ID NO: 4 y un extremo N que empieza en los aminoácidos 22-24 de la SEQ ID NO: 4. Un extremo N correspondiente a los aminoácidos 21 o 25 dará una actividad que es similar a la de la construcción ActRIIb-hFc (R64,20-134).

30 Ejemplo 5. Variantes ActRIIb-Fc, actividad basada en células

La actividad de las proteínas ActRIIB-Fc se analizó en un ensayo basado en células, tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 1, a continuación. Algunas variantes se analizaron en diferentes construcciones de truncamiento C-terminal. Tal como se ha discutido anteriormente, los truncamientos de 35 cinco o quince aminoácidos causaron reducción de la actividad. De manera destacable, las variantes L79D y L79E mostraron una pérdida sustancial de unión a activina mientras que conservan casi toda la inhibición natural de GDF

11.

Unión de ActRIIB-Fc soluble a GDF-11 y activina A:

Variaciones de ActRIIb-Fc: Porción de ActRIIB (corresponde a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 4) Actividad de inhibición de GDF11 Actividad de inhibición de activina

64R: 20-134 +++ (KI aprox. 10-8 M) +++ (KI aprox. 10-8 M )

64A: 20-134 + (KI aprox. 10-6 M) + (KI aprox. 10-6 MI)

64R: 20-129 +++ +++

64R K74A: 20-134 ++++ ++++

64R A24N: 20-134 +++ +++

64R A24N: 20-119 ++ ++

64R A24N K74A: 20-119 + +

R64 L79P: 20-134 + +

R64 L79P K74A: 20-134 + +

R64 L79D: 20-134 +++ +

R64 L79E: 20-134 +++ +

R64K: 20-134 +++ +++

R64K: 20-129 +++ +++

R64 P129S P130A: 20-134 +++ +++

R64N: 20-134 + +

+ Actividad deficiente (KI de aproximadamente 1x10-6) ++ Actividad moderada (KI de aproximadamente 1x10-7) +++ Actividad buena (natural) (KI de aproximadamente1x10-8) ++++ Actividad mayor que la natural

Se ha valorado la semivida sérica en ratas de algunas variantes. ActRIIB(R64 20-134)-Fc tiene una semivida sérica

5 de aproximadamente 70 horas. ActRIIB(R64 A24N 20-134)-Fc tiene una semivida sérica de aproximadamente 100150 horas. La variante A24N tiene actividades en el ensayo basado en células (anterior) y en ensayos in vivo (a continuación) que son equivalentes a la molécula natural. Sumado a la semivida más larga, esto significa que, a lo largo del tiempo, una variante A24N dará mayor efecto por unidad de proteína que la molécula natural.

10 De manera destacable, la introducción de aminoácidos ácidos (ácido aspártico o glutámico) en la posición 79 disminuyó selectivamente la unión a activina mientras que se conservó la unión a GDF11/GDF8. Tal como se discute a continuación, las proteínas ActRIIB-Fc naturales parecen tener efectos sobre tejidos distintos al músculo, algunos de los cuales pueden ser indeseables. Tal como se desvela en el presente documento, se espera que estos efectos estén relacionados con los diversos ligandos diferentes que se unen y son inhibidos por ActRIIB-Fc, incluyendo,

15 quizá, activina. Los datos iniciales indican que, en ratones, las variantes L79E y L79D tienen efectos reducidos sobre tejidos distintos del músculo mientras que conservan sus efectos sobre el músculo. Aunque las variaciones de este tipo pueden verse como variantes de ActRIIB, cabe destacar que estas proteínas ya no funcionan realmente como receptores de activina y, por tanto, el nombre "ActRIIB" es apropiado solo como indicador de la procedencia de estos polipéptidos. Aunque los restos ácidos en la posición 79 disminuyen la unión a activina mientras que conservan la

20 unión a GDF11, otras alteraciones en esta posición no tienen este efecto. Un cambio L79A aumenta la unión en relación con la unión a GDF11. Un cambio L79P disminuye la unión tanto a activina como a GDF11.

Ejemplo 6. Unión a GDF-11 y activina A

25 La unión de ciertas proteínas ActRIIB-Fc a ligandos se analizó en un ensayo BiaCore™.

Las variantes ActRIIB-Fc o la proteína natural se capturaron sobre el sistema usando un anticuerpo anti-hFc. Los ligandos se inyectaron y se hicieron fluir sobre las proteínas receptoras capturadas. Los resultados se resumen en las tablas, a continuación.

30 Variantes IIB de especificidad de unión a ligando

GDF11

Proteína: Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)

ActRIIB-hFc (R64 20-134): 1,34 e-6 1,13 e-4 8,42 e-11

ActRIIB-hFc (R64, A24N 20-134): 1,21 e-6 6,35e-5 5,19 e-11

ActRIIB-hFc (R64, L79D 20-134): 6,7 e-5 4,39 e-4 6,55 e-10

ActRIIB-hFc (R64, L79E 20-134): 3,8 e-5 2,74 e-4 7,16 e-10

ActRIIB-hFc (R64K 20-134): 6,77 e-5 2,41 e-5 3,56 e-11

GDF8

Proteína: Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)

ActRIIB-hFc (R64 20-134): 3,69 e-5 3,45 e-5 9,35 e-11

GDF11

Proteína: Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)

ActRIIB-hFc (R64, A24N 20-134)

ActRl3B-hFc (R64, L79D 20-134): 3,85 e-5 8,3 e-4 2,15 e-9

ActRIIB-hFc (R64, L79E 20-134): 3,74 e-5 9 e-4 2,41 e-9

ActRIIB-hFc (R64K 20-134): 2,25 e-5 4,71 e-5 2,1 e-10

ActRIIB-hFc (R64K 20-129): 9,74 e-4 2,09 e-4 2,15 e-9

ActRIIB-hFc (R64, P129S, P130R 20-134): 1,08 e-5 1,8 e-4 1,67 e-9

ActRIIB-hFc (R64, K74A 20-134): 2,8 e-5 2,03 e-5 7,18 e-11

Activina A

Proteína: Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)

ActRIIB-hFc (R64 20-134): 5,94 e6 1,59 e-4 2,68 e-11

ActRIIB-hFc (R64, A24N 20-134): 3,34 e6 3,46 e-4 1,04 e-10

ActRIIB-hFc (R64, L79D 20-134): Unión baja

ActRIIB-hFc (R64, L79E 20-134): Unión baja

ActRIIB-hFc (R64K 20-134) 6,82e6: 3,25 e-4 4,76 e-11

ActRIIB-hFc (R64K 20-129): 7,46 e6 6,28 e-4 8,41 e-11

ActRIIB-hFc (R64, P129S, P130R 20-134): 5,02 e6 4,17 e-4 8,31 e-11

Estos datos confirman los datos de los ensayos basados en células, demostrando que la variante A24N conserva una actividad de unión a ligando que es similar a la de la molécula ActRIIb-hFc (R64 20-134) y que las moléculas L79D o L79E conserva la unión a miostatina y GDF11 pero muestra una unión marcadamente disminuida (no

5 cuantificable) a activina A.

Se han generado y analizado otras variantes, tal como se publica en el documento WO2006/012627, usando ligandos acoplados al dispositivo y haciendo fluir el receptor sobre los ligandos acoplado. A continuación se reproduce una tabla de datos con respecto a estas variantes:

10 Unión de variantes ActRIIB-Fc solubles a GDF-11 y activina A (ensayo BiaCore):

ActRIIB: ActA GDF11

WT (64A): KD= 1,8 e-7M (+) KD= 2,6 e-7M (+)

WT (64R): na KD= 8,6 e-8M (+++)

+ cola 15: KD ∼2,6 e-8M (+++) KD=1,9 e-8M (++++)

E37A: * *

R40A: - -

D54A: - *

K55A: ++ *

R56A: * *

K74A: KD= 4,35 e-9M ++++ KD= 5,3 e-9M +++++

K74Y: * -

K74F: * -

K74I: * -

W78A: * *

L79A: + *

D80K: * *

D80R: * *

D80A: * *

D80F: * *

D80G: * *

D80M: * *

D80N: * *

D80I: * --

F82A: ++ -

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Claims

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