ES2603352T3

ES2603352T3 - Anticuerpos neutralizantes contra el receptor de prolactina y su uso terapéutico

Info

Publication number: ES2603352T3
Application number: ES10776753.5T
Authority: ES
Inventors: Christiane Otto; Siegmund Wolf; Christoph Freiberg; Axel Harrenga; Simone Greven; Mark Trautwein; Sandra Bruder; Andrea Eicker; Andreas Wilmen
Original assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Current assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2017-02-27
Anticipated expiration: 2030-11-18
Also published as: ZA201204213B; IN2012DN05082A; PE20121360A1; HK1180354A1; MX2012006621A; TWI487536B; AP2012006343A0; CN102858801A; BR112012015852A2; PE20121561A1; CN102741291A; IL220149A; JP6066474B2; ECSP12011966A; AR079351A1; RS55589B1; HRP20161401T1; US20130171147A1; WO2011069799A1; CN102858803A

Abstract

Anticuerpo 005-C04 o variantes maduras definidas del mismo, de acuerdo con la tabla 5 o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que antagonizan la señalización mediada por el receptor de prolactina (PRLR) y que se unen a epítopos del dominio extracelular del receptor de prolactina y variantes polimórficas humanas de los mismos, de modo que la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del receptor de prolactina corresponde a la SEQ ID NO: 70 y la secuencia de ácido nucleico corresponde a la SEQ ID NO: 71, de modo que la SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable del anticuerpo 005-C04 corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a LCDR3, y de modo que a. la SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 104 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o b. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 105 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 139 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o c. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 139 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o d. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 141 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o e. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 106 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 138 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o f. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 106 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o g. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 108 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 137 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o h. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 138 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o i. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 114 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o j. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 104 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o k. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 111 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 139 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a; o l. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 116 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a; o m. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 118 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 138 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o n. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 143 corresponde a la LCDR3; o o. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 145 corresponde a la LCDR3; o p. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 144 corresponde a la LCDR3; o q. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 146 corresponde a la LCDR3; o r. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 110 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o s. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 110 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 139 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o t. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 127 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 141 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o u. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 127 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 141 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o v. SEQ ID NO: 6 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o w. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 117 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o x. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 119 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o y. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 115 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 138 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o z. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 12 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 23 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o aa. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 119 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 139 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o bb. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 116 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o cc. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 107 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 140 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o dd. SEQ ID NO: 103 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 108 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o ee. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable corresponde a HCDR1, la Seq ID NO: 119 corresponde a HCDR2 y la SEC ID Nº 17 corresponde a HCDR3 y la SEC ID Nº 136 de la cadena ligera variable corresponde a LCDR1, la Seq ID NO: 28 corresponde a LCDR2 y la SEC ID Nº 33 corresponde a la LCDR3; o ff. SEQ ID NO: 102 de la cadena pesada variable cor

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

126, 17, y la cadena ligera variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 23, 142, 33; o

ttt. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 105, 17, y la cadena ligera variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 23, 141, 33; o

uuu. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 108, 17, y la cadena ligera variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 23, 138,

33.

En una forma de realización, se describe el anticuerpo humano 005-C04, o su forma madura o anticuerpo quimérico del mismo o el fragmento de unión al antígeno del mismo, donde el anticuerpo

a.: 005-C04 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 46 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 34, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 52 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 40.

b.: 005-C04-10-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido uncleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 375, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 447, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 259, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 187,

c.: 005-C04-11-5 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido uncleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 376, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 448, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 260, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 188,

d.: 005-C04-18-10-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 377, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 449, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 261, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 189,

e.: 005-C04-18-10-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 378, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 450, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 262, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 190,

f.: 005-C04-19-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 379, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 451, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 263, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 191,

g.: 005-C04-2-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 380, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 452, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 264, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 192,

h.: 005-C04-2-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 381, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 453, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 265, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 193,

i.: 005-C04-20-12-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 382, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 454, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 266, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 194,

j.: 005-C04-20-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 383, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 455, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 267, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 195,

k.: 005-C04-21-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido

8 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 384, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 456, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 268, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 196,

l.: 005-C04-21-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 385, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 457, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 269, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 197,

m.: 005-C04-25-6 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 386, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 458, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 270, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 198,

n.: 005-C04-29-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 387, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 459, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 271, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 199,

o.: 005-C04-29-17-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 388, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 460, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 272, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 200,

p.: 005-C04-29-17-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 389, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 461, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 273, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 201,

q.: 005-C04-29-17-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 390, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 462, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 274, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 202,

r.: 005-C04-29-17-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 391, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 463, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 275, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 203,

s.: 005-C04-35-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 392, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 464, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 276, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 204,

t.: 005-C04-36-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 393, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 465, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 277, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 205,

u.: 005-C04-37-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 394, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 466, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 278, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 206,

v.: 005-C04-37-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 395, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 467, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 279, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 207,

w.: 005-C04-4-3-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 396, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 468, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID Nº 280, y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº 208,

9

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

a.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 28, 33, o

b.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 104, 17, 136, 140, 33; o

c.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 105, 17, 136, 139, 33; o

d.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 139, 33; o

e.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 141, 33; o

f.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 106, 17, 136, 138, 33; o

g.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 106, 17, 136, 140, 33; o

h.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 108, 17, 137, 28, 33; o

i.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 138, 33; o

j.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 114, 17, 136, 28, 33; o

k.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 104, 17, 136, 140, 33; o

l.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 111, 17, 136, 139, 33; o

m.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 116, 17, 136, 140, 33; o

n.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 102, 118, 17, 136, 138, 33; o

o.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 28, 143; o

p.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 28, 145; o

q.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 28, 144; o

r.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 6, 12, 17, 23, 28, 146; o

s.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 110, 17, 136, 140, 33; o

t.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 110, 17, 136, 139, 33; o

u.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 127, 17, 136, 141, 33; o

v.: el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID Nº 103, 127, 17, 136, 141, 33; o

14

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

Variantes de los péptidos

Los anticuerpos de la invención no se limitan a las secuencias peptídicas específicas que se proveen en la presente. Por el contrario, la invención también abarca variantes de estos polipéptidos. Con relación a la presente invención y a la tecnología y las referencias disponibles en la actualidad, aquellos versados en la técnica han de poder preparar, evaluar

5 y utilizar variantes funcionales de los anticuerpos que se describen en la presente, pero también han de apreciar que las variantes que puedan unirse al PRLR y lo bloqueen de manera funcional quedarán dentro del alcance de la presente invención.

Una variante puede incluir, p.ej., un anticuerpo que tiene al menos una región de determinación de la complementariedad (CDR) (hipervariable) y/o un dominio/una posición del marco (FR) (variable) alterados respecto de la

10 secuencia peptídica que se describe en la presente. Para ilustran con mayor detalle este concepto, a continuación se proveerá una descripción breve de la estructura de los anticuerpos.

Un anticuerpo está compuesto por dos cadenas peptídicas, cada una de las cuales contiene un dominio constante de la cadena ligera o tres dominios constantes de la cadena pesada y una región variable (VL, VH).En cada caso, esta última está compuesta por cuatro regiones FR (VH: HFR1, HFR2, HFR3, HFR4; VL: LFR1, LFR2, LFR3, LFR4) y tres CDR 15 separadas (VL: LCDR1, LCDR2, LCDR3; VH: HCDR1, HCDR2, HCDR3). El sitio de unión al antígeno está formado por una o más CDR, pero son las regiones FR las que proveen el marco estructural para las CDR, por lo que tienen una función importante en la unión al antígeno. Por medio de la alteración de uno o más residuos de aminoácidos en una región CDR o FR, aquellos versados en la técnica han de poder generar o diversificar de manera convencional las secuencias de los anticuerpos. Estas secuencias pueden analizarse contra el antígeno, por ejemplo, para establecer si

20 presentan propiedades novedosas o mejoradas.

En la figura 12 se proveen esquemas de la numeración de la posición de cada aminoácido en los dominios variables VL y VH. En las tablas 3 (VH) y 4 (VL) se detallan las regiones de las CDR de determinados anticuerpos de la invención y se comparan los aminoácidos en una posición dada. También se los compara con una secuencia de consenso correspondiente o con un “gen maestro”,en cuyo caso las regiones de las CDR están marcadas con una “X”. En las

25 tablas 5 y 6 se detallan las asignaciones de los números de los identificadores de secuencias para los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos y las variantes del PRLR que se proveen en esta invención.

Tabla 3. Secuencias VH

imagen15

Tabla 4. Secuencias VL

19

imagen16

imagen17

21

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

25

imagen22

26 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Aquellos versados en la técnica han de poder usar los datos en las tablas 3, 4 y 5 para diseñar variantes de los péptidos. Es preferible que las variantes se construyan cambiando los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR. Una variante también puede presentar una o más regiones del marco (FR) alteradas. Por ejemplo, puede alterarse un péptido en el dominio de la FR para obtener una desviación respecto de la secuencia de la línea germinal.

Con relación a la comparación de los anticuerpos novedosos con la secuencia de consenso o el “gen maestro” correspondiente, que se ilustra en la figura 12, los residuos candidatos que pueden cambiarse incluyen, por ejemplo, los siguientes:

-el cambio del residuo de lisina (K) en la posición 75 de la VH de 006-H08 (SEQ ID Nº 34) por glutamina (Q),

-el cambio del residuo de leucina (L) en la posición 108 de la VH de 006-H08 (SEQ ID Nº 34) por metionina (M),

-el cambio del residuo de treonina (T) en la posición 110 de la VH de 006-H08 (SEQ ID Nº 34) por isoleucina (I),

-el cambio del residuo de fenilalanina (F) en la posición 67 de la VH de 002-H08 (SEQ ID Nº 36) por leucina (L).

Además, las variantes pueden obtenerse por maduración, es decir, usando un anticuerpo como punto de partida para la optimización, mediante la diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en el anticuerpo, preferiblemente los residuos de aminoácidos en una o más CDR, a lo que sigue el cribado de la colección resultante de variantes del anticuerpo, con el objeto de hallar variantes con propiedades mejoradas. En particular, se prefiere la diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en la LCDR3 de la VL, en la HCDR3 de la VH, en la LCDR1 de la VL y/o en la HCDR2 de la VH. La diversificación puede efectuarse sintetizando una colección de moléculas de ADN con la tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) [Virnekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., y Moroney

S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reacants for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600].

Variantes de aminoácidos conservativas

Pueden prepararse variantes de los polipéptidos que conservan la estructura molecular general de un anticuerpo con una secuencia peptídica como las que se describen en la presente. Cuando se analizan las propiedades de los aminoácidos individuales, es posible reconocer algunas sustituciones racionales. Las sustituciones de aminoácidos, es decir, las “sustituciones conservativas”, pueden realizarse, p.ej., sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos en cuestión.

Por ejemplo, (a) los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptofano y la metionina; (b) los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la asparragina y la glutamina; (c) los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen la arginina, la lisina y la histidina; y (d) los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Las sustituciones típicamente pueden efectuarse dentro de los grupos (a)-(d). Además, es posible reemplazar glicina por prolina, o viceversa, sobre la base de su capacidad de interrumpir las hélices α. De manera similar, determinados aminoácidos, tales como la alanina, la cisteína, la leucina, la metionina, el ácido glutámico, la glutamina, la histidina y la lisina, pueden hallarse con mayor frecuencia en las hélices α, mientras que la valina, la isoleucina, la fenilalanina, la tirosina, el triptofano y la treonina pueden hallarse con mayor frecuencia en las láminas plegadas β. La glicina, la serina, el ácido aspártico, la asparragina y la prolina pueden hallarse con frecuencia en los giros. A continuación se detallan grupos de sustitución preferidos: (i) S y T; (ii) P y G; y (iii) A, V, L y I. Al tomar en consideración el código genético conocido y las técnicas de ADN recombinante y sintético, aquellos versados en la técnica han de poder construir con facilidad ADN que codifican las variantes de aminoácidos conservativas.

Como se la usa en la presente, la “identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos hace referencia al porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. La “homología de secuencia" hace referencia al porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservativas. Las secuencias de los polipéptidos preferidos de la invención tienen una identidad de secuencia en las regiones de las CDR que es de al menos 60 %, más preferiblemente de al menos 70 % u 80 %, aun más preferiblemente de al menos 90 %, y más preferiblemente de al menos 95 %. Los anticuerpos preferidos también tienen una homo-logía de secuencia en las regiones de las CDR que es de al menos 80 %, más preferiblemente de 90 % y más preferiblemente de 95 %.

Moléculas de ADN de la invención

La presente invención también se refiere a moléculas de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Estas secuencias incluyen, sin limitaciones, las moléculas de ADN que se detallan en SEQ ID Nº 46 y 52 y 375 a 815.

Las moléculas de ADN no se limitan a las secuencias que se describen en la presente, sino que también incluyen

27

imagen23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

También se divulgan moléculas de ácidos nucleicos que hibridan con las moléculas que se detallan en la tabla 5 bajo condiciones de unión y lavado de gran rigurosidad, donde estas moléculas de ácidos nucleicos codifican un anticuerpo o un fragmento funcional de éste, que tienen propiedades como las que se describen en la presente

Las moléculas preferidas (desde la perspectiva del ARNm) son aquellas que tienen al menos 75 % u 80 % (preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % y más preferiblemente al menos 95 %) de identidad de secuencia con una de las moléculas de ADN que se describen en la presente. Las moléculas bloquean la señalización mediada por el receptor de prolactina.

Variantes equivalentes desde el punto de vista funcional

Aún otra clase de variantes de ADN puede describirse en referencia al producto que codifican. Estos genes equivalentes desde el punto de vista funcional se caracterizan porque codifican las mismas secuencias peptídicas que se proveen en SEQ ID Nº 34-45, debido a la degeneración del código genético.

Se reconoce que las variantes de las moléculas de ADN que se proveen en la presente pueden construirse de diversas maneras. Por ejemplo, es posible construirlas como ADN completamente sintético. Los procedimientos para sintetizar de manera eficiente oligonucleótidos con tamaños en el rango de entre 20 y aproximadamente 150 nucleótidos están ampliamente disponibles. Véase Ausubel et al., sección 2.11, suplemento 21 (1993). Los oligonucleótidos superpuestos pueden sintetizarse y ensamblarse de una manera que fue descrita por primera vez por Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); véase también Ausubel et al., supra, sección 8.2. El ADN sintético preferible-mente se sintetiza con la inserción de sitios de restricción convenientes en los extremos 5’ y 3’ del gen, con el propósito de facilitar la clonación en un vector apropiado.

Como se indicó, un procedimiento para generar las variantes comprende comenzar con los ADN que se describen en la presente y luego llevar a cabo una mutagénesis dirigida a un sitio. Véase Ausubel et al., supra, capítulo 8, suplemento 37 (1997). En un procedimiento típico, se clona un ADN blanco en un vehículo basado en un bacteriófago con ADN de cadena simple. El ADN de cadena simple se aísla y se hace hibridar con un oligonucleótido que contiene una o más alteraciones deseadas a nivel de los nucleótidos. Se sintetiza la cadena complementaria y se introduce el fago de cadena doble en un huésped. Parte de la progenie resultante contendrá la mutación deseada, lo cual podrá confirmarse por medio de una secuenciación del ADN. Además, hay diversos procedimientos disponibles que permiten incrementar la probabilidad de que la mutación deseada se halle en los fagos de la progenie. Estos procedimientos son bien conocidos por aquellos versados en la técnica, y hay kits disponibles comercialmente para generar estas mutaciones.

Construcciones de ADN recombinante y su expresión

En la presente invención también se proveen construcciones de ADN recombinantes que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Las construcciones recombinantes de la presente invención se usan en conexión con un vector, tal como un plásmido, un fago o un vector viral, en el cual se inserta una molécula de ADN que codifica un anticuerpo de la invención.

El gen codificado puede producirse con las técnicas que se describen en Sambrook et al., 1989, y Ausubel et al., 1989. Como alternativa, las secuencias de ADN pueden sintetizarse por medios químicos, usando, por ejemplo, sintetizadores. Véanse, por ejemplo, las técnicas que se describen en Oligonucleotide Synthesis (1984, Gait, editor, IRL Press, Oxford), que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad. Aquellos versados en la técnica han de ser capaces de fusionar el ADN que codifica los dominios variables con fragmentos de genes que codifican regiones constantes de diversos isotipos humanos de IgG o derivados de éstos, tanto en formas mutadas como en formas no mutadas. La tecnología de ADN recombinante puede aplicarse para fusionar ambos dominios variables en un formato de una sola cadena, mediante el uso de conec-tores, p.ej., extensiones de quince aminoácidos que contienen tres motivos de glicina-glicina-glicina-glicina-serina. Las construcciones recombinantes de la invención están compuestas por vectores de expresión a partir de los cuales puede expresarse el ARN y/o los productos proteicos codificados por el ADN. El vector también puede comprender secuencias de regulación, incluyendo un promotor unido operativamente al marco abierto de lectura (ORF). El vector también puede comprender una secuencia marcadora de selección. También pueden ser necesarias señales de inicio y secreción específicas para bacterias para que tenga lugar una traducción eficiente de las secuencias insertadas que codifican los genes deseados.

En la presente invención también se proveen células huésped que contienen al menos un ADN de la presente invención. La célula huésped podrá ser virtualmente cualquier célula para la que haya disponibles vectores de expresión. Por ejemplo, podrá tratarse de una célula huésped eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula huésped eucariota inferior, tal como una célula de levadura, y también puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La cons-trucción recombinante podrá introducirse en la célula huésped por medio de una transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE, a través de una transfección mediada por dextrano, por electroporación o por medio de una infección con un fago.

29 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Expresión en bacterias

Los vectores de expresión útiles para su uso en bacterias se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica la proteína deseada, en combinación con señales apropiadas para el inicio y la terminación de la traducción, en un marco de lectura operativo con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores de selección fenotípicos, un origen de replicación para asegurar el mante-nimiento del vector, y de resultar deseable, para proveer la amplificación en el huésped. Los huéspedes procariotas apropiados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.

Los vectores bacterianos pueden estar basados, por ejemplo, en bacteriófagos, en plásmidos o en fagémidos. Estos vectores pueden contener un marcador de selección y un origen de replicación para bacterias derivado de plásmidos disponibles comercialmente, que típicamente contienen elementos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Una vez realizada la transformación de la cepa huésped apropiada y de cultivarla hasta alcanzar la densidad celular apropiada, se desreprime/induce el promotor seleccionado por medios apropiados (p.ej., variaciones en la temperatura o inducción química) y se cultivan las células durante un período adicional. Las células típicamente se cosechan por centrifugación y se destruyen por medios físicos o químicos, y el extracto en bruto resultante se retiene para continuar con la purificación.

En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse numerosos vectores de expresión en función del uso que se desee darle a la proteína expresada. Por ejemplo, cuando se desee producir una gran cantidad de esta proteína para generar anticuerpos o analizar bibliotecas de péptidos, por ejemplo, resultarán deseables aquellos vectores que dirijan la expresión de productos de fusión de proteínas que puedan ser purificados con facilidad en niveles elevados.

Por tanto, un objeto de la presente invención es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los anticuerpos novedosos de la presente invención.

Expresión en mamíferos y purificación

Las secuencias de regulación preferidas para la expresión en células huésped de mamíferos incluyen los elementos virales que dirigen la expresión de proteínas en niveles elevados en las células de mamíferos, tales como los promotores y/o los potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador del CMV), del virus del simio 40 (SV40) (tales como el promotor/potenciador de SV40), de adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío mayor del adenovirus (AdMLP)) y de poliomas. Para hallar una descripción más detallada de los elementos de regulación virales y de las secuencias que los codifican, véanse, por ejemplo, U.S. 5168062, de Stinski, U.S. 4510245, de Bell et al., y U.S. 4968615, de Schaffner et al. Los vectores de expresión recombinantes también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores de selección (véanse, por ejemplo, U.S. 4399216, 4634665 y U.S. 5179017, de Axel et al.). Los marcadores de selección apropiados incluyen genes que le confieren resistencia a drogas, tales como el G418, la higromicina o el metotrexato, a la célula huésped en la que se introduce el vector. Por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia al metotrexato y el gen neo confiere resistencia al G418.

La transfección del vector de expresión a una célula huésped puede realizarse de acuerdo con procedimientos convencionales, tales como la electroporación, la precipitación con fosfato de calcio y la transfección mediada por DEAEdextrano.

Las células huésped de mamíferos apropiadas para expresar los anticuerpos, las porciones de unión al antígeno o los derivados de éstos que se proveen en la presente incluyen las células de ovario de hámster chino (células CHO) [incluyendo las células CHO dhfr-, descritas por Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, que se usan con un marcador de selección DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]], las células de mieloma NSO, las células COS y las células SP2. En algunas formas de realización, el vector de expresión está diseñado de manera tal que la proteína expresada es secretada hacia el medio de cultivo en el que se desarrollan las células huésped. Los anticuerpos, las porciones de unión al antígeno o los derivados de éstos pueden recuperarse del medio de cultivo usando procedimientos de purificación de proteínas convencionales.

Los anticuerpos de la invención o los fragmentos de unión al antígeno de éstos pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos recombinantes de acuerdo con procedimientos bien conocidos, incluyendo, sin limitaciones, la precipitación con sulfato de amonio o con etanol, la extracción con ácido, la cromatografía con la proteína A, la cromatografía con la proteína G, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía con fosfo-celulosa, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía por afinidad, la cromatografía con hidroxilapatita y la cromatografía con lectina. Para la purificación, también puede emplearse una cromatografía líquida de alto desempeño (“HPLC”). Véanse, p.ej., Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (19972001), p.ej., los capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada uno de los cuales se incorpora en la presente a modo de referencia en su

30

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

morbilidad elevada. Los efectos colaterales incluyen las hemorragias, la incontinencia, la formación de obstrucciones, la pérdida de eyaculación y las perforaciones en la vejiga.

d) La colocación de stents en la próstata. Se inserta un stent en la parte prostática de la uretra para garantizar un flujo apropiado de orina. Los efectos colaterales más importantes incluyen las incrustaciones, las infecciones en el tracto urinario y la migración del stent. Más aun, es necesario retirar los stents antes de realizar cualquier manipulación transuretral.

Como se describió para la glándula mamaria, la PRL y el PRLR actúan en una vía autocrina/paracrina (J. Clin. Invest.

99:618 pp. 1997) en la próstata.

En estudios clínicos, se ha demostrado que la hiperprolactinemia (y la agromegalia) está asociada al agrandamiento de la próstata y a la acumulación de células inflamadas en el estroma. La hormona de crecimiento humana puede unirse al PRLR humano en presencia de cinc, con lo que podría explicarse por qué la acromegalia puede dar como resultado una hiperplasia prostática benigna. Los niveles de PRL en el suero frecuentemente son elevados en los pacientes con BPH.

Los animales transgénicos donde se sobreexpresa el gen de la PRL de manera ubicua desarrollan una hiperplasia severa en el estroma de la próstata, lo que refleja que la PRL es un factor patofisiológico importante para el desarrollo de la hiperplasia prostática (Endocrinology 138:4410 pp. 1997). Además, la sobreexpresión local de la prolactina en los ratones transgénicos bajo el control del promotor de la probasina específico de la próstata da como resultado una expansión del estroma, una acumulación de células inflamatorias y una displasia epitelial focal, que son las características básicas de la BPH en los seres humanos (Endocrinology 144:2269 pp. 2003).

El PRLR se expresa en niveles elevados en la glándula prostática (ejemplo 3, figura 3). Se observaron variaciones en la expresión de las proteínas del PRLR en tejido de próstata de rata después de eliminar las hormonas y aplicar un tratamiento hormonal (ejemplo 4, figura 4). Además del PRLR, en las células de la próstata también se expresa la prolactina.

Como se describe en el ejemplo 17, a ratones Balb/c macho se les aplicaron isoinjertos de pituitaria bajo la cápsula del riñón. En estos ratones, se desarrolló una hiperplasia prostática benigna. En este modelo, se evaluó el efecto de los anticuerpos neutralizantes contra el receptor de prolactina y de los anticuerpos no específicos sobre la hiperplasia prostática benigna. Los paradigmas analizados se describen en el ejemplo 17. Como se ilustra en la figura 16, los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR inhiben el crecimiento benigno de la próstata, por lo que son apropiados para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna.

Otro objeto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR y de sus fragmentos de unión al antígeno en el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo y de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención en el tratamiento de hiperplasia prostática benigna.

Pérdida de cabello hiperprolactinémica

El tratamiento de la pérdida de cabello aún es una necesidad insatisfecha. El crecimiento del cabello en el cuero cabelludo ocurre en ciclos: la fase anagénica se ca-racteriza por un crecimiento activo del cabello, la fase catagénica se caracteriza por una involución y es seguida por la fase telogénica (de reposo). La fase exogénica (la liberación del cabello muerto) coincide con el final de la fase telogénica. La pérdida de cabello puede ser la consecuencia del crecimiento alterado del cabello en cualquier fase.

La pérdida de cabello telogénica puede tener diversos desencadenantes (el estrés fisiológico y emocional, las afecciones médicas, las deficiencias de hierro y de cinc). Vale destacar que, en sus primeras etapas, la alopecia androgénica se caracteriza por una pérdida de cabello telogénica (Cleveland clinic journal of medicine 2009; 76:361-367). La pérdida de cabello anagénica frecuentemente es la consecuencia de la radiación o de la quimioterapia.

Para el tratamiento de la pérdida de cabello androgénica, suele usarse minoxidil y finasteride. Para la alo-pecia areata, suelen usarse glucocorticoides. En general, todos estos tratamientos tienen efectos colaterales (finasteride: pérdida de libido e impotencia en los hombres, glucocorticoides: diabetes, ganancia de peso, osteoporosis), por lo que todavía no ha sido posible solucionar completamente el problema de la pérdida de cabello.

Se han realizado experimentos de afeitado en roedores adultos para analizar el efecto de los compuestos sobre la pérdida de cabello, mediante el uso del crecimiento de nuevo cabello en el área afeitada como paradigma de lectura (British Journal of dermatology 2008; 159:300-305). El afeitado de los animales adultos (cuyo cabello suele hallarse en la fase telogénica) induce la fase anagénica, que se caracteriza por el crecimiento del cabello.

37 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En los experimentos que se describen en el ejemplo 17 (hiperplasia prostática benigna), se afeitaron animales que habían recibido isoinjertos de pituitaria. Durante estos experimentos, inesperadamente se descubrió que los animales que habían recibido isoinjertos de pituitaria presentaban una inte-rrupción severa en el crecimiento de nuevo cabello en el área afeitada. El tratamiento con los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR estimuló el crecimiento del cabello, lo cual no ocurrió con los anticuerpos no específicos (figura 17).

Esta observación permite demostrar que en la pérdida de cabello hay una señalización elevada mediada por el receptor de prolactina. Para analizar esto con mayor detalle, se realizaron experimentos de afeitado adicionales, análogos a experimentos que habían sido descritos con anterioridad (British Journal of dermatology 2008; 159:300-305). Estos experimentos de afeitado adicionales se describen en el ejemplo 18. Con los experimentos, se demostró que los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR estimulan el crecimiento del cabello en los ratones macho y hembra hiper y normoprolactinémicos.

Los anticuerpos de la presente invención solucionan este problema, ya que constituyen nuevos tratamientos para la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica en las mujeres y en los hombres.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR y de sus fragmentos de unión al antígeno para el tratamiento o la prevención de pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo y de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención para el tratamiento o la prevención de la pérdida de cabello hiperprolactinémica.

Terapia hormonal combinada

Para el tratamiento de los calores en las mujeres posmenopáusicas que aún tienen útero, se usaron combinaciones de estrógeno (estradiol o estrógenos equinos conjugados = CEE) y progestágenos (por ejemplo acetato de medroxiprogesterona (MPA), progesterona, drospirenona, levonorgestrel). Es necesario agregar progestágenos para inhibir la proliferación de las células del epitelio del útero activada por el estradiol. Sin embargo, la adición de las progestágenos incrementa la proliferación de las células del epitelio mamario. Debido a que tanto las células del epitelio mamario normal como las células del epitelio mamario canceroso responden con proliferación ante un tratamiento con estrógeno y progestágeno, se estableció que el riesgo relativo de desarrollar un cáncer de mama aumentaba después de un tratamiento con CEE más MPA (JAMA 233:321-333;2002).

Cuando se los administra mensualmente o bimestralmente a mujeres que están siendo sometidas a una terapia hormonal combinada, los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR inhiben la proliferación de las células del epitelio mamario.

Como se describe en el ejemplo 19, se empleó un modelo en ratón que había sido desarrollado con anterioridad para realizar el análisis cuantitativo de los efectos de la progestágeno en el útero y en las mamas (Endocrinology 149:39523959,2008). Los ratones fueron ovariectomizados y tratados 14 días después con el vehículo o con 100 ng de estradiol más 100 mg/kg de progesterona durante tres semanas, con el objeto de imitar la terapia de reemplazo de hormonas. Los animales fueron tratados una vez por semana con anticuerpos específicos contra el PRLR (10 mg/kg o 30 mg/kg) o con anticuerpos no específicos (30 mg/kg). Se analizaron los efectos de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR sobre la actividad de proliferación en las mamas de los ratones sometidos a la terapia hormonal combinada.

Definiciones

El antígeno blanco, el “PRLR" humano, como se lo usa en la presente, hace referencia a un polipéptido humano que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos en su dominio extracelular que los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 de SEQ ID Nº 70 y las variantes alélicas y/o de separación naturales de ésta. El “ECD del PRLR", como se lo usa en la presente, hace referencia a la porción extracelular del de PRLR que está representada por los aminoácidos mencionados con anterioridad. Además, el PRLR humano blanco también abarca las versiones mutadas del receptor, tales como la mutación de activación I146L, descrita por Paul Kelly (Proc Natl Acad Sci USA, 105(38):14533-14538,2008; y una comunicación oral, Turín, 2007).

Como se la usa en la presente, la frase “cantidad eficaz para el uso terapéutico" hace referencia a una cantidad de un anticuerpo terapéutico o profiláctico que sería apropiada para provocar el efecto o la respuesta terapéutica o profiláctica deseada, lo que incluye el alivio de algunos o la totalidad de los síntomas de la enfermedad o la reducción de la predisposición a la enfermedad, cuando se la administra de acuerdo con el régimen de tratamiento deseado.

Como se lo usa en la presente, se dice que un anticuerpo “se une específicamente” a un antígeno (en este caso, el PRLR), que “presenta especificidad” por él o que lo “reconoce específicamente” cuando dicho anticuerpo es capaz de discriminar entre dicho antígeno y uno o más antígenos de referencia, ya que la especificidad de la unión no es una

38

imagen30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de las cisteínas en las posiciones 127, 232 y 233 por serina (Allen et al., Biochemistry, 2009, 48 (17), pp. 3755–3766). Un formato alternativo con una función efectora reducida puede ser el formato IgG2m4, que deriva de una IgG2 que contiene cuatro cambios por residuos de aminoácidos específicos de la IgG4 (An et al., mAbs 1(6), 2009). Es posible producir fragmentos de anticuerpos con técnicas de ADN recombinante o mediante la escisión enzimática o química de los anticuerpos intactos, lo cual se describirá con mayor detalle más adelante. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos monoclonales incluyen los anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados y humanos, así como las inmunoglobulinas humanas modificadas, las proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulinas, las muteínas o los derivados de éstas, cada uno de los cuales se describirá con mayor detalle más adelante. También se contemplan los multímeros o los agregados de moléculas intactas y de fragmentos de éstas, incluyendo los anticuerpos modificados por medios químicos.

El término “anticuerpo monoclonal", como se lo usa en la presente, hace referencia a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, una población de anticuerpos individuales que son idénticos, excepto por las posibles mutaciones naturales que pudiera haber presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra determinantes (epitopes) diferentes, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque son sintetizados en un cultivo homogéneo, es decir, no están contaminados con otras inmunoglobulinas, que podrían tener especificidades y características diferentes.

El adjetivo “monoclonal" indica el carácter del anticuerpo: se lo ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. No restringe la producción del anticuerpo a un procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que pueden usarse pueden elaborarse con el procedimiento de los hibridomas, que fue descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495, 1975, o pueden elaborarse con procedimientos de ADN recombinante (véase, p.ej., la Patente de los EEUU Nº 4816567). Los “anticuerpos monoclonales" también pueden ser, p.ej., anticuerpos recombinantes, quiméricos, humanizados o humanos modificados, así como fragmentos de anticuerpos.

Una “inmunoglobulina" o un “anticuerpo nativo" hacen referencia a una glicoproteína tetramérica. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, donde cada par tiene una cadena “liviana" (de aproximadamente 25 KDa) y una cadena “pesada" (de aproximadamente 50-70 KDa). La porción del extremo amino de cada cadena incluye una región “variable" de aproximadamente entre 100 y 110 aminoácidos, o más, que es la responsable primaria del reconocimiento del antígeno. La porción del extremo carboxilo de cada cadena define una región constante que es la responsable primaria de la función efectora. Las inmunoglobulinas pueden separarse en distintas clases en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Las cadenas pesadas se clasifican como mu (µ), delta (∆), gamma (γ), alfa (α) y épsilon (ε) y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Además, varias de éstas pueden ser divididas en subclases o isotipos, p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los distintos isotipos pueden tener funciones efectoras diferentes; p.ej., los isotipos IgG1 e IgG3 frecuentemente presentan actividad de ADCC. Las cadenas livianas humanas se clasifican como cadenas livianas kappa (K) y lambda (λ). Dentro de las cadenas livianas y pesadas, las re-giones variables y constantes están unidas por una región “J", de aproximadamente 12 aminoácidos o más, donde la cadena pesada también incluye una región “D" de aproximadamente 10 aminoácidos o más. Véase en general Fundamental Immunology, capítulo 7 (Paul, W., editor, 2ª edición, Raven Press, N.Y. (1989)).

Un “fragmento funcional” o un “fragmento de unión al antígeno” de un anticuerpo/una inmunoglobulina se definen en la presente como un fragmento de anticuerpo/inmunoglobulina (p.ej., una región variable de una IgG) que retiene la región de unión al antígeno. La “región de unión al antígeno” de un anticuerpo típicamente se halla en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo, es decir, las regiones CDR 1, 2 y/o 3. Sin embargo, las regiones variables “del marco” también pueden cumplir una función importante en la unión al antígeno, p.ej., al proveer un andamiaje para las CDR. Preferiblemente, la “región de unión al antígeno” comprende al menos los residuos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena ligera variable (VL) y los residuos de aminoácidos 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH), más preferiblemente los residuos de aminoácidos 3 a 107 de la VL y los residuos de aminoácidos 4 a 111 de la VH, y en particular, particularmente las cadenas VL y VH completas [los aminoácidos en las posiciones 1-109 de la VL y en las posiciones 1-113 de la VH; la numeración de las posiciones de los aminoácidos se realiza de acuerdo con la base de datos de Kabat (Johnson y Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218)]. Una clase preferida de inmunoglobulinas que pueden usarse en la presente invención es la de la IgG.

El término “región hipervariable" hace referencia a los residuos de aminoácidos de los dominios variables VH y VL de un anticuerpo o de un fragmento funcional de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de la “región de determinación de la complementariedad" o CDR [es decir, los residuos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 88-97 (LCDR3) en el dominio variable de la cadena ligera y los

40

imagen31

imagen32

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Immunol. Methods (2001) 254:67, y la Patente de los EEUU Nº 6300064. Para hallar una revisión de las técnicas de presentación en fagos, véase WO08/022295 (Novartis).

Como alternativa, un anticuerpo de esta invención puede provenir de animales. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo human modificado, como se resume en WO08/022295 (Novartis). El anticuerpo puede provenir de animales transgénicos [véase también WO08/022295 (Novartis)].

Como se las usa en la presente, las distintas “formas” de un antígeno, por ejemplo, el PRLR, se definen en la presente como las distintas moléculas proteicas que son el resultado de distintas modificaciones que ocurren durante la traducción y después de la traducción, tales como, sin limitaciones, las diferencias en la separación del transcripto primario del receptor de prolactina, las diferencias en la glicosilación y las diferencias en la escisión proteolítica posterior a la traducción.

Como se lo usa en la presente, el término “epitope” incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse de manera específica a una inmunoglobulina o a un receptor en una célula T. Los determinantes epitópicos usualmente consisten en agrupamientos que presentan actividad química superficial, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y frecuentemente tienen características específicas en su estructura tridimensional, así como características de carga específicas. Se dice que dos anticuerpos “se unen al mismo epitope” cuando se demuestra que un anticuerpo compite con el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitiva, que puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquiera de los procedimientos que son bien conocidos en la técnica, y cuando preferiblemente los dos anticuerpos se unen a la totalidad de los aminoácidos del epitope.

Los términos “anticuerpos maduros” y “fragmentos de unión al antígeno maduros”, p.ej., las variantes de los fragmentos Fab maduros, incluyen los derivados de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que presentan una unión más fuerte a un antígeno dado, tal como el dominio extracelular del PRLR, es decir, que se unen a él con una mayor afinidad. La maduración es el proceso en el que se identifica una pequeña cantidad de mutaciones dentro de las seis CDR de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que dan como resultado este incremento en la afinidad. El proceso de maduración es la combinación de procedimientos de biología molecular que permiten introducir mutaciones en el anticuerpo y analizar e identificar los miembros de unión mejorados.

Procedimientos terapéuticos

Los procedimientos terapéuticos comprenden administrarle al sujeto que necesita el tratamiento una cantidad eficaz para el uso terapéutico de un anticuerpo contemplado en la invención. En la presente, una “cantidad eficaz para el uso terapéutico” se define como una cantidad de un anticuerpo que es suficiente para bloquear la proliferación de las células positivas para el PRLR en el área tratada del sujeto, que puede administrarse como una sola dosis o de acuerdo con un régimen de múltiples dosis, por sí sola o en combinación con otros agentes. Esto puede dar como resultado el alivio de una condición adversa, pero la cantidad debe ser tolerable desde el punto de vista toxicológico. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano (por ejemplo, un conejo, una rata, un ratón, un mono u otro primate de un orden inferior).

Es posible administrar un anticuerpo de la invención de manera concurrente con medicamentos conocidos, y en algunas instancias, es posible modificar el propio anticuerpo. Por ejemplo, sería posible conjugar el anticuerpo con una inmunotoxina o un radioisótopo para potencialmente incrementar aun más la eficacia. Los anticuerpos de la invención pueden usarse como herramienta terapéutica o de diagnóstico en una variedad de situaciones donde el PRLR se exprese en un nivel indeseablemente elevado. Los trastornos y las afecciones que son particularmente susceptibles al tratamiento con los anticuerpos de la invención son la endometriosis, la adenomiosis, la anticoncepción de la fertilidad femenina no hormonal, la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia, la inhibición de la lactancia, la hiperplasia prostática benigna, los fibroides, la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica. También se incluye el tratamiento concu-rrente en una terapia hormonal combinada, con el fin de inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario.

Para tratar cualquiera de los trastornos precedentes, las composiciones farmacéuticas que han de usarse de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional, mediante el uso de uno o más vehículos o excipientes aceptables para aplicaciones fisiológicas. Un anticuerpo de la invención puede administrarse por cualquier medio apropiado, que puede variar en función del tipo de trastorno que se desea tratar. Las rutas de administración posibles incluyen las vías parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea), intrapulmonar e intranasal, y si resulta deseable para un tratamiento de inmunosupresión local, la administración intralesional. Además, un anticuerpo de la invención puede administrarse a través de una infusión en pulsos, p.ej., con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosis se administra por inyección, más preferiblemente por inyección intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte del carácter breve o crónico de la administración. La cantidad que ha de administrarse depende de una variedad de factores, tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo y la administración concurrente de otras drogas. Aquellos versados en la técnica han de reconocer que la ruta de

43 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

administración variará en función del trastorno o la afección que se desee tratar.

La determinación de una cantidad eficaz para el uso terapéutico del polipéptido novedoso de acuerdo con esta invención dependerá en gran medida de las características del paciente particular, de la ruta de administración y de la naturaleza del trastorno que se desee tratar. Pueden hallarse lineamientos generales, p.ej., en las publica-ciones de la Conferencia Internacional para la Armonización y en Remington’s Pharmaceutical Sciences, capítulos 27 y 28, pp. 484-528 (18ª edición, Alfonso R. Gennaro, editor, Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Más específicamente, la determinación de la cantidad eficaz para el uso terapéutico dependerá de factores como la toxicidad y la eficacia del medicamento. La toxicidad puede determinarse con procedimientos bien conocidos en la técnica, que pueden hallarse en las referencias precedentes. La eficacia puede determinarse empleando los mismos lineamientos, en conexión con los procedimientos que se describirán en los ejemplos más adelante.

Composiciones farmacéuticas y administración

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que pueden comprender anticuerpos contra el PRLR, solos o en combinación con al menos un agente adicional, tal como un compuesto estabilizador, que pueden administrarse en cualquier vehículo farmacéutico estéril biocompatible, incluyendo, sin limitaciones, la solución salina, la dextrosa y el agua. Cualquiera de estas moléculas podrá administrársele a un paciente por sí sola o en combinación con otros agentes, drogas u hormonas, en composiciones farmacéu-ticas donde se la mezcle con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una forma de realización de la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable es inerte desde el punto de vista farmacéutico.

La presente invención también se refiere a la administración de las composiciones farmacéuticas. Esta administración se efectúa por vía parenteral. Los procedimientos para efec-tuar la administración parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial (directamente en el tumor), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina o intranasal. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas podrán contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprendan excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos, con el fin de obtener preparaciones que puedan usarse en aplicaciones farmacéuticas. Pueden hallarse detalles adicionales sobre la formulación y la administración en la última edición de Remington’s Pharmaceutical Sciences (editado por Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen las soluciones acuosas de los compuestos activos. Para la inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores compatibles con aplicaciones fisiológicas, tales como la solución de Hank, la solución de Ringer o la solución salina amortiguada de uso fisiológico. Las suspensiones acuosas inyectables podrán contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetil celulosa de sodio, el sorbitol o el dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas inyectables apropiadas. Los solventes o los vehículos lipofílicos apropiados incluyen los aceites grasos, tales como el aceite de sésamo, los ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como el oleato de etilo o los triglicéridos, o los liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes apropiados para incrementar la solubilidad de los compuestos, con el objeto de facilitar la preparación de soluciones altamente concentradas.

Para la administración tópica o nasal, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera particular que se desea atravesar. Estos penetrantes generalmente son conocidos en la técnica.

La administración parenteral también comprende procedimientos de administración parenteral que también incluyen la administración intraarterial, intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, vaginal o intranasal.

Kits

La invención también se refiere a lotes farmacéuticos y kits comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención que se mencionaron con anterioridad. En estos recipientes podrá haber una indicación donde se señale la aprobación de la manufactura, el uso y la comercialización del producto para la administración a los seres humanos por la agencia gubernamental correspondiente, responsable de la regulación de la manufactura, el uso y la comercialización de fármacos o productos biológicos.

En otra forma de realización, los kits pueden contener secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Preferiblemente, las secuencias de ADN que codifican estos anticuerpos se proveen en un plásmido apropiado para transfectar y expresar en una célula huésped. El plásmido puede contener un promotor (frecuentemente un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped. El plásmido también puede contener sitios de restricción para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN en el plásmido, con el propósito de producir diversos

44 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

anticuerpos. Los plásmidos también pueden contener otros ele-mentos para facilitar la clonación y la expresión de las proteínas codificadas. Estos elementos son bien conocidos por aquellos versados en la técnica e incluyen, p.ej., marcadores de selección, codones de terminación y semejantes.

Manufactura y almacenamiento

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención podrán manufacturarse de una manera que sea conocida en la técnica, p.ej., con procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, captura o liofilización.

La composición farmacéutica puede proveerse como un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, con 0,1 %-2 % de sacarosa y 2 %-7 % de manitol, con un pH en el rango de entre 4,5 y 5,5, que puede combinarse con un amortiguador antes de usarlo.

Una vez completa la elaboración de las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo aceptable, es posible colocarlas en un recipiente apropiado, con instrucciones para el tratamiento de una afección indicada. Para administrar los anticuerpos contra el PRLR, en estas instrucciones puede detallarse la cantidad, la frecuencia y el procedimiento de administración.

Dosis con eficacia terapéutica

Las composiciones farmacéuticas que son apropiadas para su uso en la presente invención incluyen aquellas composiciones donde los ingredientes activos están presentes en una cantidad eficaz para el propósito deseado, es decir, el tratamiento de un estado de enfermedad particular caracterizado por la expresión del PRLR. La determinación de una dosis eficaz está dentro del alcance de aquellos versados en la técnica.

Para cualquier compuesto, la dosis con eficacia terapéutica puede estimarse inicialmente en ensayos en cultivos celulares, por ejemplo, en células de linfoma, o en modelos en animales, usualmente ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o simios. También puede usarse un modelo en un animal para determinar el rango de concentración y la ruta de administración deseados. Posteriormente, esta información puede usarse para determinar las dosis y las rutas útiles para la administración en seres humanos.

La dosis con eficacia terapéutica hace referencia a la cantidad de una proteína, de un anticuerpo contra ella o de un antagonista o un inhibidor de dicha proteína que permite mejorar los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de estos compuestos pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmacéuticos convencionales, en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, a través de la DE50 (la dosis con eficacia terapéutica en 50 % de la población) y la DL50 (la dosis letal para 50 % de la población). La proporción entre las dosis correspondientes a los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, que puede expresarse como la proporción DE50/DL50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos en los ensayos en cultivos celulares y en los estudios en animales se usan para formular un rango de dosificación para el uso en los seres humanos. La dosis de estos compuestos preferiblemente se halla en un rango de concentraciones en la circulación que incluyen la DE50, y se caracteriza por una toxicidad escasa o nula. Dentro de este rango, la dosis puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada, de la sensibilidad del paciente y de la ruta de administración.

La dosis exacta es seleccionada por el médico individual, en función del paciente que desea tratar. La dosis y la administración se ajustan para proveer niveles de la unidad activa que son suficientes para mantener el efecto deseado. Otros factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la rigurosidad del estado de enfermedad, por ejemplo, el tamaño y la localización de las lesiones en el endometrio, la edad, el peso y el género del paciente, la dieta, la duración y la frecuencia de la administración, las combinaciones de drogas, la sensibilidad a la reacción y la y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse con una frecuencia de 3 ó 4 días, una vez por semana, una vez por quincena o una vez por mes, dependiendo de la vida media y la tasa de eliminación de la formulación particular.

Las dosis normales pueden variar entre 0,1 y 100000 microgramos, hasta la dosis total, de aproximadamente 2 g, dependiendo de la ruta de administración. En la literatura pueden hallarse lineamientos relacionados con las dosis y los procedimientos de administración particulares. Véanse US. 4657760, US 5206344 o US 5225212. Aquellos versados en la técnica han de poder emplear distintas formulaciones para los polinucleótidos y para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la administración de los polinucleótidos o los polipéptidos será específica para las células, las afecciones, las localizaciones u otros factores particulares. Las actividades preferidas para un anticuerpo radiomarcado pueden variar entre 0,1 y 10 mCi/mg de proteínas (Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275s-3280s, 1999; Wong et al., Clin. Cancer Res. 6:3855-3863, 2000; Wagner et al., J. Nuclear Med. 43:267-272, 2002).

La presente invención se describirá con mayor detalle en los ejemplos más adelante. Los ejemplos se proveen

45 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

exclusivamente para ilustrar la invención en referencia a formas de realización específicas. Si bien en estos ejemplos se ilustran determinados aspectos específicos de la invención, los ejemplos no han de constituir limitaciones para el alcance de la presente invención.

Todos los ejemplos fueron puestos en práctica de acuerdo con procedimientos convencionales, que han de ser bien conocidos y de uso convencional para aquellos versados en la técnica, excepto donde se indique lo contrario y se provea una descripción detallada. Los procedimientos convencionales de biología molecular que se describirán en los ejemplos más adelante pueden ponerse en práctica como se describe en los manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Descripción de las figuras

Figura 1. Expresión del ARNm de la prolactina (PRL-ARNm) (determinada con un análisis de PCR en tiempo real de TaqMan) en endometrio humano y en lesiones (tejido ectópico) de mujeres saludables y de mujeres que sufren endometriosis.

Figura 2. Expresión del ARNm del receptor de prolactina (PRLR-ARNm) (determinada con un análisis de PCR en tiempo real de TaqMan) en endometrio humano y en lesiones (tejido ectópico) de mujeres saludables y de mujeres que sufren endometriosis.

Figura 3. Análisis de transferencia Northern de la expresión del gen de la PRLR en tejidos de rata. La expresión del gen de la PRLR fue elevada en la placenta y en la próstata.

Figura 4. Análisis de transferencia Northern de la expresión del PRLR en próstatas de rata tratadas con distintas hormonas. El tratamiento con estradiol de las ratas intactas y la castración dieron como resultado una regulación positiva de la proteína del PRLR en las próstatas de las ratas, mientras que el tratamiento con dihidrotestosterona de las ratas intactas no afectó la expresión del PRLR en la próstata, en comparación con el tratamiento de los animales intactos con el vehículo.

Figura 5. Inhibición de la proliferación de las células Ba/F (= Baf, donde se expresaba de manera estable el PRLR humano) activada con prolactina por los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR y por los anticuerpos no específicos control. Se determinaron los siguientes valores de la IC50 para los anticuerpos en el formato de IgG1: 005-C04 (círculos cerrados): 1,29 µg/ml = 8,6 nM; 006-H08 (círculos abiertos): 0,15 µg/ml = 1 nM; HE06.642 (triángulos cerrados): 0,34 µg/ml = 2,2 nM; 002-H06 (triángulos abiertos): 0,54 µg/ml = 3,6 nM; 002-H08 (cuadrados cerrados): 0,72 µg/ml = 4,8 nM. El anticuerpo no específico control (cuadrados abiertos) no inhibió la proliferación de las células.

Figura 6. Inhibición de la proliferación de las células de linfoma de rata (células NB2) inducida con prolactina por los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR y por los anticuerpos no específicos control. Se determinaron los siguientes valores de la IC50: XHA 06.642 (círculos cerrados): 10 µg/ml = 67 nM; XHA 06.983 (círculos abiertos). No se observaron efectos sobre la proliferación de las células de linfoma de rata. El anticuerpo no específico control (triángulos cerrados) no presentó efectos en una dosis de 10 µg/ml.

Figura 7. Inhibición de fosforilación de STAT5 estimulada con prolactina en las células T47D por los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR y por el anticuerpo no específico control. El anticuerpo no específico control (FITC) no inhibe la fosforilación de STAT5 en las células T47D. En contraste, los anticuerpos XHA 06.642, 005-C04 (= IgG1 005-C04) y 006-H08 (= IgG1 006-H08) inhiben la fosforilación de STAT5 en las células T47D de una manera dependiente de la dosis.

Figura 8. Efectos de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR y de anticuerpos no específicos control sobre la actividad del gen indicador de luciferasa activado con prolactina, en células HEK293 transfectadas de manera estable con el receptor de prolactina humano (hPRLR) donde se expresaba de manera transitoria el gen de la luciferasa bajo el control de elementos de respuesta hormonal lactogénicos (LHRE). Se determinaron los siguientes valores de la IC50 para los anticuerpos en el formato de IgG1: 006-H08 (círculos cerrados): 0,83 µg/ml = 5,5 nM; HE06.642 (círculos abiertos): 0,63 µg/ml = 4,2 nM. El anticuerpo no específico control (triángulos cerrados) no inhibió la actividad de la luciferasa.

Figura 9. Efectos de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR y de anticuerpos no específicos control sobre la actividad del gen indicador de luciferasa activada con prolactina, en células HEK293 transfectadas de manera estable con el receptor de prolactina murino (mPRLR) donde se expresaba

46

imagen33

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

dosis de las glándulas mamarias, que se ve reflejada en la aparición de islotes grasos (flechas negras), como resultado de un tratamiento con el anticuerpo neutralizador IgG2a 005-C04.

Figura 14D. Expresión de las proteínas de la leche en las glándulas mamarias de madres en lactancia. La expresión de las proteínas de la leche beta caseína (Csn-2), la proteína ácida del suero (WAP) e IGF-1 se reduce de una manera depen-diente de la dosis en las madres tratadas con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG2a 005-C04, pero no en las madres tratadas con anticuerpos no específicos. La expresión genética se normalizó en función de la expresión de la proteína capaz de unirse a la caja TATA (TBP).

Figura 15A. Formación de ramas laterales y de estructuras similares a alvéolos en un modelo de una enfermedad mamaria benigna hiperprolactinémica en ratones. El anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG1 005-C04 (= 005-C04) inhibió las ramificaciones laterales y la formación de estructuras similares a alvéolos en dosis de 10 y 30 mg/kg en los ratones que habían recibido isoinjertos de pituitaria.

Figura 15B. Extensión de la hiperplasia epitelial y de la proliferación de las células epiteliales en un modelo de una enfermedad mamaria benigna hiperprolactinémica en ratones. Algunas células positivas para BrdU están marcadas con flechas blancas. El anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG1 005-C04 (= 005-C04) bloquea la hiperplasia epitelial y la proliferación de las células epiteliales en la glándula mamaria.

Figura 15C. Extensión de la fosforilación de STAT5 en un modelo de una enfermedad mamaria benigna hiperprolactinémica en ratones. Algunas células positivas para fosfo-STAT5 están marcadas con flechas blancas. El anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG1 005-C04 (= 005-C04) bloquea completamente la fosforilación de STAT5 cuando se lo aplica en una dosis de 30 mg/kg.

Figura 16. Inhibición del crecimiento de la próstata por el anticuerpo neutralizador contra el PRLR 005-C04, que contiene dominios constantes de la IgG2a murina (= IgG2a 005-C04). El isoinjerto de pituitaria estimula el crecimiento de la próstata, en comparación con los ratones sometidos a una operación simulada. El tratamiento con los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR, en dosis de 10 mg/kg y en dosis de 30 mg/kg, inhibe el crecimiento de la próstata (***p<0,005 en comparación con los ratones sin tratar, sometidos a una operación simulada).

Figura 17. Los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR estimulan el crecimiento del cabello en presencia de hiperprolactinemia. Se tomaron fotografías tres semanas después de realizar isoinjertos de pituitaria en los ratones macho que se usaron en los experimentos que se describen en el ejemplo 17 y en la figura 16 (que también fueron afeitados). La hiperprolactinemia inhibe el crecimiento de nuevo cabello en las áreas afeitadas. Los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos, estimulan el crecimiento de nuevo cabello bajo condiciones de hiperprolactinémica en dosis de 10 y 30 mg/kg de 005-C04 (= IgG2a 005-C04).

Figura 18. Los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos, estimulan el cre-cimiento de nuevo cabello en las áreas afeitadas de ratones macho y hembra hiperprolactinémicos y normoprolactinémicos (ejemplo 18). Puede concluirse que los anti-cuerpos neutralizantes contra el PRLR son apropiados para tratar la pérdida de cabello bajo condiciones normoprolactinémicas e hiperprolactinémicas en los hombres (figura 18B) y en las mujeres (figura 18A).

Figura 19. Los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos control, inhiben la proliferación celular incrementada en la glándula mamaria después de una terapia hormonal combinada, es decir, una terapia con una combinación de estrógeno y progestágeno.

Se evaluó la cantidad absoluta de células epiteliales de los conductos en proliferación en 4 secciones transversales de la glándula mamaria. En la figura, se ilustran las medianas como barras horizontales. La proliferación de las células epiteliales en los ratones ovariectomizados tratados con el vehículo es bastante baja (con una mediana de 0). El tratamiento con estradiol da como resultado una cierta estimulación de la proliferación de las células epiteliales (con una mediana de 9). Se observa una proliferación máxima de las células del epitelio mamario al aplicarse un tratamiento con estrógeno y progesterona (con una mediana de 144). El tratamiento con el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 005-C04 (con una mediana de 84 después de un tratamiento con 10 mg/kg de 005-C04 y una mediana de 27 después de un tratamiento con 30 mg/kg de 005-C04), pero no con el anticuerpo no específico control (con una mediana de 154), da como resultado una disminución dependiente de la dosis en la proliferación de las células del epitelio mamario, prácticamente hasta alcanzar los niveles obtenidos al aplicar estradiol solo. Por consiguiente, los anticuerpos

48

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

imagen47

de FCS 10 %. Luego, las células se sembraron en placas de 96 cavidades en medio libre de FCS a una densidad de 10000 células por cavidad. Las células se estimularon con prolactina humana 10 ng/ml en presencia o ausencia de dosis crecientes de anticuerpos neutralizantes contra el PRLR o anticuerpos control durante 2 días. Luego se evaluó la proliferación celular usando un Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega). Las curvas dosisrespuesta y valores de IC50 se describen en la figura 6. El anticuerpo no específico y anticuerpo XHA06.983, no se unieron al PRLR de rata, no bloquearon la proliferación de células Nb2-11. XHA06.642 que se une a PRLR de rata bloqueó la proliferación de células Nb2-11.

Ejemplo 7

Inhibición de la fosforilación de STAT5 inducida con prolactina en células T47D por anticuerpos neutralizantes contra el receptor de prolactina

Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR en una lectura adicional, se usó la inhibición de la fosforilación de STAT5 en células T47D humanas tratadas con prolactina. Las células T47D se hicieron crecer en RPMI que contenía FCS 10 % y glutamina 2 mM. Las células se sembraron en placas de 24 cavidades a una densidad de 0,5 x 105 células por cavidad. El día siguiente, las células se ayunaron durante 1 hora en RPMI libre de suero. Luego se incubaron las células con o sin dosis diversas de anticuerpos neutralizantes contra el PRLR o anticuerpo control no específico en ausencia o presencia de prolactina humana 20 ng/ml durante 30 minutos. Luego se lavaron las células y se lisaron en 70 µl de solución amortiguadora de lisis. Los lisados se centrifugaron y el sobrenadante se congeló a -80ºC. Los extractos se analizaron usando transferencia Western (anticuerpo anti-pSTAT5A/B de Upstate 07-586, diluido 1:1000). Como control de carga, las membranas libradas de anticuerpos se incubaron con anticuerpos anti-beta tubulina (ab7287, diluido 1:500).

Los resultados se ilustran en la figura 7. Con excepción del anticuerpo no específico FITC, todos los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR bloquearon la fosforilación de STAT5 en células T47D de humano de forma dependiente de la dosis. Todos los anticuerpos ensayados se unieron al PRLR humano con alta afinidad.

Ejemplo 8

Inhibición de la actividad del gen reportero luciferasa en células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR humano – análisis de anticuerpos neutralizantes contra el receptor de prolactina y anticuerpos no específicos control

Para analizar adicionalmente la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR, se usó un ensayo de gen reportero. Las células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR humano se transfectaron transitoriamente con el gen reportero luciferasa bajo el control de LHRE (elementos de respuesta a hormona lactogénica), durante 7 horas. Luego, las células se sembraron a una densidad de 20000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades (suero tratado con carbón 0,5 %, DMEM). El día siguiente se agregaron 300 ng/ml de prolactina humana con y sin dosis crecientes de anticuerpos neutralizantes contra el PRLR o anticuerpos control. 24 horas más tarde, se determinó luciferasa. Los resultados se describen en la figura 8. En contraste con el anticuerpo no específico, 006-H08 y HE06.642 inhibieron la actividad luciferasa en células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR humano.

Ejemplo 9

Inhibición de la actividad del gen reportero luciferasa en células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR murino – análisis de anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina y anticuerpos no específicos control

Para analizar adicionalmente la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR en el receptor de prolactina murino, se usó un ensayo de gen reportero. Las células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR murino se transfectaron transitoriamente con un gen reportero luciferasa bajo el control de LHRE (elementos de respuesta a hormona lactogénica) durante 7 horas. Luego, las células se sembraron a una densidad de 20000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades (suero tratado con carbón 0,5 %, DMEM). El día siguiente se agregaron 200 ng/ml de prolactina humana con y sin dosis crecientes de anticuerpos neutralizantes contra el PRLR o anticuerpos control. 24 horas más tarde, se determinó la actividad luciferasa. Los resultados se describen en la figura 9. Mientras el anticuerpo 005-C04 (triángulos cerrados) exhiben alta actividad (valor IC50 = 3 nM), el anticuerpo HE06.642 (círculos cerrados) no mostraron actividad hasta 330 nM. El anticuerpo control no específico (círculos abiertos) es completamente inactivo. En contraste al anticuerpo HE06.642 de Novartis, el anticuerpo 005-C04 tiene la capacidad de bloquear la señalización mediada por PRLR murino.

Ejemplo 10

Inhibición de la proliferación inducida con prolactina de células BaF3 (transfectadas de manera estable con el receptor de

63

prolactina murino) por anticuerpos neutralizantes contra el receptor de prolactina y anticuerpos no específicos control

Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR, se usó la inhibición de la proliferación celular actividad por prolactina de células Ba/F3. Las células se transfectaron de manera estable con el PRLR murino y se cultivaron de rutina en RPMI que contenía glutamina 2 mM en presencia de FCS 10 % y 10 ng/ml de prolactina humana. Luego de seis horas de ayuno en medio libre de prolactina que contenía FCS 1 %, las células se sembraron en placas de 96 cavidades a una densidad de 10000 células por cavidad. Las células se estimularon con prolactina 40 ng/ml y se coincubaron con dosis crecientes de anticuerpos neutralizantes contra el PRLR durante dos días. Se analizó la proliferación celular usando un Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega). Se generaron curvas dosis-respuesta para la inhibición del crecimiento celular estimulado por prolactina y se calcularon los valores de IC50. Como control negativo, se usó estimulación con un anticuerpo control no específico.

Las curvas dosis respuesta y valores de IC50 se describen en la figura 10. El anticuerpo control no específico (círculos cerrados) fue inactivo con el PRLR murino. Solamente hubo una inhibición limitada de la activación del PRLR murino por los anticuerpos HE06.642, 001-E06 y 001-D07. Solamente el anticuerpo 005-C04 bloqueó completamente la activación del PRLR murino.

Ejemplo 11

Efecto anticonceptivo de anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina IgG1 005-C04 en ratones

Para ensayar la influencia de anticuerpos neutralizantes contra el receptor de prolactina en la fertilidad de ratones, se aparearon ratones hembra de 12 semanas de y ratones NMRI machos durante 7 días (entre día 0 y día 7). Los ratones hembra se trataron los días -3, 0, 3 y 6 con una inyección intraperitoneal de solución salina amortiguada con fosfato, del anticuerpo control no específico IgG1 (anti-FITC, 10 mg/kg) o del anticuerpo neutralizador IgG1 005-C04 (= IgG1 005-C04), en concentraciones de 10 ó 30 mg por kilo de peso corporal, disueltos en solución salina amortiguada con fosfato. Se usaron 10 hembras en cada grupo experimental. Cada macho se apareó con dos hembras, una de las hembras fue de un grupo control negativo tratado con solución salina amortiguada con fosfato o anticuerpo no específico, la otra hembra se trató con anticuerpo neutralizador específico. Los apareamientos, donde el macho no produjo al menos una hembra preñada, se excluyeron de la evaluación de los datos. Los parámetros leídos fueron tamaño promedio de camada y tasa de preñez (medido en %) calculado como número de camadas por grupo experimental dividido el número de camadas posibles teóricas en ese grupo. Los resultados se describen en la figura 11.

En la figura 11A se ilustran las tasas de preñez obtenidas. A continuación se detallan las tasas de preñez.

 87,5 % en el grupo de ratones tratados con solución salina amortiguada con fosfato,

 75 % en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo control no específico (10 mg/kg),

 100 % en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG1 005-C04 (10 mg/kg), y

 0 % en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG1 005-C04 (30 mg/kg).

En la figura 11B se ilustran los tamaños de camada observados para los distintos grupos experimentales. A continuación se detallan los tamaños de camada.

 10,9 ratones por camada en el grupo de ratones tratados con solución salina amortiguada con fosfato,

 12.3 ratones por camada en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo control no específico (10 mg/kg),

 13 ratones por camada en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG1 005-C04 (10 mg/kg), y

 0 ratones por camada en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG1 005-C04 (30 mg/kg).

Los resultados de este estudio de apareamiento permiten demostrar que el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina IgG1-005-C04 previno completamente la preñez en ratones cuando se ensayó con 30 mg/kg de peso corporal.

Ejemplo 12

64

imagen48

5

10

15

20

25

30

35

PRLR humano. Esta observación es consistente con el hallazgo informado en el ejemplo 9 sobre la eficacia perdida de HE06.642 en el ensayo de gen reportero luciferasa dependiente del PRLR murino. A pesar de que 005-C04 y HE06.642 se unieron competitivamente a PRLR humano, las distintas propiedades de unión de ambos anticuerpos con respecto al PRLR murino indica diferencias en sus especificidades por epitope.

Ejemplo 14

Actividad inhibitoria de anticuerpos Fab y scFv en cascadas de señalización celular

Para caracterizar funcionalmente la actividad de Fab y scFv, se analizaron los resultados obtenidos con la cascada de señalización activada por el PRLR, la inhibición de la fosforilación del PRLR propiamente dicho y de los reguladores de la transcripción ERK1/2 y STAT5 en células T47D humanas tratadas con prolactina. Las células T47D se hicieron crecer en RPMI que contenía L-glutamina 2 mM, FBS 10 % tratado con carbón e insulina-transferrina-selenio-A (Gibco). Las células se sembraron en placas de 6 cavidades o placas de 96 cavidades, en una densidad de 1,5 x 106 células por cavidad. El siguiente día, se renovó el medio de crecimiento. En el tercer día, las células se ayunaron durante 1 hora en RPMI libre de suero. Luego, las células se incubaron con y sin diversas dosis de anticuerpos neutralizantes contra el PRLR o anticuerpo control no específico en presencia de prolactina humana 500 ng/ml durante 5 min. Luego, las células se lavaron y se lisaron en solución amortiguadora de lisis. Los lisados se centrifugaron y los sobrenadantes se congelaron a -80ºC. Se ensayaron las muestras mediante ELISA de acuerdo al conjunto de componentes DuoSet IC “Human Phospho-Prolactin R” (R&D Systems) para medida de fosforilación del PRLR, de acuerdo al conjunto de componentes PathScan Phospho-STAT5 (Tyr694) Sandwich ELISA (Cell Signaling Technology; #7113) para medida de fosforilación de STAT5 y de acuerdo al conjunto de componentes Phospho-ERK1/ERK2 (R&D Systems) para medida de fosforilación de ERK1/2. La Tabla 8 provee un resumen acerca de la actividad antagonista de una selección de los descubrimientos realizados mediante el análisis en el formato Fab o scFv, con una dosis fija de 7,5 µg por ml.

Tabla 8. Actividad antagonista de una selección de los descubrimientos realizados en el análisis de la fosforilación del PRLR, de ERK1/2 y de STAT5, según lo determinado por ELISA, sobre lisados celulares de la línea celular de cáncer de mama humano T47D

Anticuerpo: % de inhibición de la fosforilación, con una dosis fija del anticuerpo (7,5 µg/ml)

PRLR: ERK1/2 STAT5

006-H08*: 100 100 100

002-H06°: 92 86 72

002-H08°: 100 100 98

006-H07*: 88 85 73

001-E06°: 63 45 36

Control negativo: 2 9 0

* formato scFv, ° formato Fab

Ejemplo 15

La neutralización de los anticuerpos PRLR inhibe la lactancia en ratones

Se aparearon hembras NMRI adultas con machos NMRI. En el día posparto 1, se ajustó el tamaño de la cría a 8 ratones por madre en lactancia. Se determinó en forma diaria el peso de la descendencia en la mañana comenzando en el día posparto 1. Las madres en lactancia permanecieron ya sea sin tratamiento (círculos cerrados en la figura 14A,B) o bien se trataron por vía intraperitoneal con anticuerpo no específico (10 mg/kg de peso corporal; círculos abiertos en la figura 14A,B), o bien con anticuerpo neutralizador contra el PRLR 005-C04 conteniendo dominios constantes IgG2a murinos (= IgG2a 005-C04; 10 mg/kg, triángulos cerrados en la figura 14A, B) o con anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG2a 005-C04 (30 mg/kg, triángulos abiertos en la figura 14A, B). El tamaño de grupo fue de entre 5 y 6 madres en lactancia por grupo experimental. Se trataron las madres con anticuerpos control específicos o no específicos en el día posparto 1, 3, 6, 9, 10 y 12 (indicado con flechas en la figura 14A, B). Los resultados se exhiben en la figura 14. En la figura 14A se ilustra, para cada día posparto, la ganancia de peso de cría por día expresada como porcentaje del respectivo peso de

66

imagen49

isoinjerto de pituitaria y que se trataron con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR con una dosis de 10 ó 30 mg/kg de peso corporal. Algunas de las células positivas a BrdU, que reflejan células en fase S del ciclo celular que se están por dividir, están indicadas mediante flechas blancas en la figura 15B. Los ratones tratados con el anticuerpo neutralizador IgG1 005-C04 (30 mg/kg de peso corporal) mostraron inhibición casi completa de la proliferación celular epitelial en las glándulas mamarias. Algunas de las células positivas para fosfo-STAT5 se indican mediante flechas blancas en la figura 15C. El tratamiento con 30 mg/kg de IgG1 005-C04 conduce a una inhibición completa de la fosforilación de STAT5, lo que indica un bloqueo completo de la señalización mediada por PRLR.

Los resultados de la figura 15A, B y C demostraron que los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR son apropiados para el tratamiento de mastopatía, una enfermedad proliferativa benigna de la glándula mamaria. Los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR inhiben la proliferación de células epiteliales mamarias y la activación de fosfo-STAT5.

Ejemplo 17

Tratamiento de hiperplasia prostática benigna con anticuerpos neutralizantes contra el PRLR

Se estableció una hiperplasia prostática benigna en ratones Balb/c macho mediante injerto de dos pituitarias debajo de la cápsula renal a la edad de 8 semanas. Un grupo control permaneció sin operar. Los ratones que recibieron isoinjerto de pituitarias permanecieron sin tratar o recibieron inyecciones intraperitoneales de ya sea un anticuerpo no específico (10 mg/kg), o bien del anticuerpo neutralizador contra el PRLR 005-C04 con dominios constantes de IgG2a murina (= IgG2a 005-C04) a dosis de 10 y 30 mg/kg de peso corporal. Las inyecciones del anticuerpo se llevaron a cabo a partir del día del trasplante de pituitaria (= día 0), así como el día 3, el día 7, el día 11, el día 15, el día 18, el día 22 y el día 25 después del trasplante de pituitaria. Se sacrificaron los ratones en el día 28. Se determinó el peso relativo de la próstata ventral. Los resultados se ilustran en la figura 16. El isoinjerto de pituitaria resultó en un incremento del peso de próstata relativo. El tratamiento con 10 mg/kg y 30 mg/kg de anticuerpo neutralizador contra el PRLR IgG2a 005-C04 redujo el peso de la próstata mientras que el tratamiento con anticuerpo control no específico no tuvo ningún efecto. Los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR son por lo tanto apropiados para el tratamiento de hiperplasia prostática benigna.

En el día 18 después del isoinjerto de pituitaria se hizo evidente que disminuyó el crecimiento de cabello en los animales que recibieron el isoinjerto de pituitarias. Los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR estimularon el crecimiento de cabello bajo las condiciones de hiperprolactinemia. En la figura 17 se proveen fotografías representativas. Por lo tanto los anticuerpos neutralizantes contra el PRLR pueden usarse para el tratamiento de pérdida de cabello por hiperprolactinemia.

Ejemplo 18

Efecto de anticuerpos neutralizantes contra el PRLR sobre el crecimiento del cabello

Se sacó cabello dorsal de ratones C57BL/6 machos y hembras de 8 semanas de edad usando afeitadoras eléctricas como se describió previamente (British Journal of Dermatology 2008;159:300-305). Se indujo hiperprolactinemia en algunos grupos mediante isoinjerto de pituitaria bajo la cápsula renal, los animales de los grupos restantes fueron normoprolactinémicos. Se trataron los animales con anticuerpos PRLR específicos (IgG2a 005-C04) o anticuerpos no específicos control (30 mg/kg, por vía intraperitoneal) una vez por semana (comenzando en el día 0 que es el día del isoinjerto de pituitaria). Se llevaron a cabo subsiguientes inyecciones de anticuerpo en los días 7 y 14. Después de tres semanas, se observó el recrecimiento de cabello como manchas oscuras sobre la piel afeitada, de color rosa blanquecino, y se midió el porcentaje de área afeitada que se volvió oscura. Los ratones hembra se sacrificaron 15 días después de afeitar y los ratones macho se sacrificaron 18 días después de afeitar.

Se usaron los siguientes grupos experimentales (el tamaño de grupo fue de 6 ratones):

1.: hembras afeitadas;

2.: hembras afeitadas con isoinjerto de pituitaria;

3.: hembras afeitadas con isoinjerto de pituitaria + 30 mg/kg del anticuerpo no específico IgG2a 005-C04 una vez por semana;

4.: hembras afeitadas con isoinjerto de pituitaria + 30 mg/kg de anticuerpo específico una vez por semana;

5.: hembras afeitadas + 30 mg/kg del anticuerpo no específico una vez por semana;

6.: hembras afeitadas + 30 mg/kg de anticuerpo específico una vez por semana;

68

imagen50

imagen51

imagen52

Claims

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

e.

005-C04-18-10-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 378 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 190, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 450 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 262,

f.

005-C04-19-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 379 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 191, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 451 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 263,

g.

005-C04-2-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 380 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 192, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 452 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 264,

h.

005-C04-2-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 381 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 193, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 453 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 265,

i.

005-C04-20-12-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 382 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 194, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 454 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 266,

j.

005-C04-20-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 383 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 195, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 455 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 267,

k.

005-C04-21-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 384 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 196, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 456 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 268,

l.

005-C04-21-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 385 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 197, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 457 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 269,

m.

005-C04-25-6 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 386 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 198, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 458 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 270,

n.

005-C04-29-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 387 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 199, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 459 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 271,

o.

005-C04-29-17-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 388 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 200, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 460 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 272,

p.

005-C04-29-17-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 389 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 201, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 461 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 273,

q.

005-C04-29-17-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 390 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 202, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ

ID NO: 462 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 274,

r.

005-C04-29-17-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 391 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 203, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 463 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 275,

s.

005-C04-35-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 392 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 204, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 464 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 276,

t.

005-C04-36-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 393 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 205, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 465 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 277,

u.

005-C04-37-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 394 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 206, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 466 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 278,

v.

005-C04-37-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 395 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 207, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 467 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 279,

w.

005-C04-4-3-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 396 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 208, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 468 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 280,

x.

005-C04-40-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 397 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 209, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 469 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 281,

y.

005-C04-41-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 398 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 210, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 470 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 282,

z.

005-C04-42-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 399 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 211, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 471 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 283,

aa. 005-C04-44-25-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 400 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 212, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 472 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 284,

bb. 005-C04-45-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 401 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 213, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 473 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 285,

cc. 005-C04-46-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 402 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 214, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 474 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 286,

dd. 005-C04-46-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 403 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 215, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 475 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 287,

ee. 005-C04-47-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 404 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 216, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 476 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 288,

ff. 005-C04-48-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 405 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 217, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 477 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 289,

gg. 005-C04-5-5 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 406 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 218, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 478 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 290,

hh. 005-C04-50-28-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 407 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 219, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 479 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 291,

ii. 005-C04-50-28-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 408 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 220, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 480 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 292,

jj. 005-C04-51-29-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 409 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 221, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 481 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 293,

kk. 005-C04-52-29-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 410 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 222, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 482 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 294,

ll. 005-C04-52-29-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 411 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 223, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 483 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 295,

mm. 005-C04-53-31-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 412 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 224, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 484 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 296,

nn. 005-C04-55-32-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 413 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 225, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 485 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 297,

oo. 005-C04-58-33-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 414 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 226, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 486 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 298,

pp. 005-C04-8-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 415 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 227, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 487 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 299,

qq. 005-C04-8-6 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 416 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 228, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 488 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 300,

rr. 005-C04-9-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 417 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 229, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 489 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 301,

ss. 005-C04-L2-1-11-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 418 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 230, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 490 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 302,

tt. 005-C04-L2-1-11-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 419 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 231, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 491 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 303,

uu. 005-C04-L2-1-12-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 420 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 232, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 492 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 304,

vv. 005-C04-L2-1-12-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 421 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 233, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 493 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 305,

ww. 005-C04-L2-1-16-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 422 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 234, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 494 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 306,

xx. 005-C04-L2-1-16-5 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 423 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 235, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 495 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 307,

yy. 005-C04-L2-1-2-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 424 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 236, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 496 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 308,

zz. 005-C04-L2-1-20-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 425 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 237, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 497 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 309,

aaa. 005-C04-L2-1-20-1 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 426 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 238, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 498 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 310,

bbb. 005-C04-L2-1-21-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 427 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 239, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 499 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 311,

ccc. 005-C04-L2-1-23-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 428 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 240, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 500 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 312,

ddd. 005-C04-L2-1-25-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 429 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 241, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 501 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 313,

eee. 005-C04-L2-1-25-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 430 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 242, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 502 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 314,

fff. 005-C04-L2-1-25-5 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 431 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 243, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 503 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 315,

ggg. 005-C04-L2-1-25-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 432 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 244, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 504 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 316,

hhh. 005-C04-L2-1-28-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 433 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 245, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 505 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 317,

iii. 005-C04-L2-1-3-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 434 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 246, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 506 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 318,

jjj. 005-C04-L2-1-31-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 435 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 247, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 507 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 319,

kkk. 005-C04-L2-1-31-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 436 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 248, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 508 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 320,

lll. 005-C04-L2-1-32-4 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 437 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 249, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 509 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 321.

mmm. 005-C04-L2-1-33-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 438 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 250, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 510 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 322,

nnn. 005-C04-L2-1-36-6 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 439 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 251, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 511 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 323,

ooo. 005-C04-L2-1-38-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 440 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 252, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 512 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 324,

ppp. 005-C04-L2-1-4-5 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 441 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 253, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 513 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 325,

qqq. 005-C04-L2-1-40-2 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 442 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 254, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 514 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 326,

rrr. 005-C04-L2-1-40-7 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 443 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 255, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 515 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 327,

sss. 005-C04-L2-1-42-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 444 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 256, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 516 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 328,

ttt. 005-C04-L2-1-47-0 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 445 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 257, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 517 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 329,

uuu. 005-C04-L2-1-48-3 comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 446 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 258, y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 518 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 330.
3.

Un anticuerpo y un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, de modo que el anticuerpo consiste en una región de unión al antígeno que se une específicamente a, o que presenta una afinidad elevada por, una o más regiones del PRLR, cuya secuencia de aminoácidos est’a representada por la SEQ ID Nº 70 70 y variantes polimórficas humanas de la SEQ ID Nº 70, en los aminoácidos entre las posiciones 1 a 210, de modo que la afinidad es de al menos 30 nM, más preferiblemente con una afinidad menor que aproximadamente 10 nM o aún más preferiblemente con una afinidad menor que 1 nM.
4.

El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la constante pesada es una IgG1, una IgG2, una IgG3 o una IgG4 modificada o no modificada.
5.

Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6.

Un vector de expresión que comprende una secuencia del ácido nucleico de la reivindicación 5.
7.

Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6 o una molécula de ácido nucleico de 5, en la que la célula huésped es una célula huésped eucariota superior, una célula huésped eucariota inferior o una célula procariota.
8.

La célula huésped de la reivindicación 7, en la que la célula huésped eucariota superior es una célula de mamífero.
9.

La célula huésped de la reivindicación 7, en la que la célula huésped eucariota inferior es una célula de levadura.
10.

La célula huésped de la reivindicación 7, en la que la célula procariota es una célula bacteriana.
11.

Un procedimiento de uso de la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para la producción de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-10 en condiciones apropiadas y recuperar dicho anticuerpo.
12.

Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que ha sido purificado hasta alcanzar una homogeneidad de al menos 95 % en peso.
13.

Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como medicamento.
14.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con

las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, que comprende receptores y auxiliares.
15.

Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la endometriosis y de la adenomiosis (endometriosis interna).

5 16. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como medicamento para el tratamiento de la enfermedad mamaria benigna y de la mastalgia.
17. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como medicamento para la inhibición de la lactancia.
18. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como 10 medicamento para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna.
19.

Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como medicamento para el tratamiento de la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica.
20.

Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende anticuerpos contra el PRLR o fragmentos de unión al antígeno o variantes maduras de los mismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1

15 a 4, para su uso mediante administración parenteral, de modo que los procedimientos para efectuar la administración parenteral incluyen administración tópica, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, vaginal o intranasal.
21. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende anticuerpos contra el PRLR o

fragmentos de unión al antígeno o variantes maduras de los mismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 20 a 4, para su uso como medicamento, en combinación con al menos un agente adicional.