ES2608673T3

ES2608673T3 - Producción de proteínas y polipéptidos

Info

Publication number: ES2608673T3
Application number: ES10848078.1T
Authority: ES
Inventors: Jan Johansson; Anna Rising; My Hedhammar; Kerstin Nordling
Original assignee: Spiber Technologies AB
Current assignee: Spiber Technologies AB
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2030-10-27
Also published as: US9644012B2; JP5726282B2; AU2010348409A1; CA2792476A1; EP2547771B8; DK3168229T3; DK2547771T3; US20130065278A1; AU2010348409B2; CN102844437B; US20170283474A1; EP2547771B1; EP2547771A4; US10604550B2; JP2013521801A; EP2547771A1; EP3168229A1; CN102844437A; CA2792476C; WO2011115538A1

Abstract

Una proteína de fusión que comprende (i) al menos un resto potenciador de la solubilidad que deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña; y (ii) al menos un resto que es una proteína deseada no espidroína, o polipéptido, seleccionada del grupo que consiste en proteínas y polipéptidos formadores de amiloide, SP-B y variantes de la misma que contienen disulfuro, apolipoproteínas, proteínas y polipéptidos de membrana, fármacos de proteína y polipéptido, proteínas y polipéptidos propensos a la agregación, y proteasas, en donde cada resto potenciador de la solubilidad está unido directa o indirectamente, con secuencias implicadas seleccionadas entre péptidos ligandos y/o restos potenciadores de la solubilidad adicionales, al resto de proteína o polipéptido deseado no espidroína, y en donde cada resto potenciador de la solubilidad tiene al menos un 80% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 6, o al menos un 50% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 8.

Description

Producción de proteínas y polipéptidos

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al campo de la producción de proteínas y polipéptidos, y más específicamente a la producción de proteínas de tela de araña (espidroínas), y de otras proteínas y polipéptidos que no son espidroínas. La presente invención proporciona un método para producir una proteína/polipéptido no espidroína deseada. También se proporcionan nuevos intermedios de proteína de fusión para producción de las proteínas y polipéptidos deseados, así como moléculas de ácido polinucleico que codifican dichos intermedios.

Antecedentes de la invención

La producción de proteínas y polipéptidos a partir de ADN se puede realizar en diversos hospedantes, pero un problema común es la formación de agregados de proteína/polipéptido insolubles. Esto puede dificultar seriamente o incluso impedir la producción de una proteína/polipéptido funcional. Una solución a este problema es expresar la proteína o el polipéptido deseado como una proteína de fusión con una proteína o polipéptido que proporcione la solubilidad requerida. La proteína de fusión puede romperse, y la proteína deseada se puede aislar.

El problema se agrava habitualmente con proteínas y polipéptidos de baja solubilidad, p.ej., proteínas y polipéptidos asociados a membrana. Por ejemplo, la proteína C tensioactiva pulmonar (SP-C; Tabla 6) es una proteína transmembrana que es producida por células alveolares de tipo II y es un constituyente de tensioactivo, necesario para evitar el colapso alveolar al final de la expiración. Los neonatos a menudo sufren insuficiencia respiratoria debido a cantidades insuficientes de tensioactivo. Hoy día esta afección es tratada con preparaciones tensioactivas extraídas de pulmones de animales. La SP-C-33 es una variante de la SP-C, en la que se han intercambiado los residuos de la hélice transmembrana (de forma habitual principalmente valinas) por leucinas. La SP-C-33 retiene la función de la SP-C nativa, incluyendo una inserción apropiada en las membranas, pero es menos propensa a agregarse y por tanto es viable para producir en grandes cantidades el desarrollo de una preparación tensioactiva sintética. Puesto que hasta la fecha la SP-C-33 no ha podido ser producida a partir de ADN, hoy día se fabrica mediante síntesis química.

Otros ejemplos de proteínas y polipéptidos que presentan dificultades cuando son expresados a partir de ADN recombinante son Aβ-péptido, IAPP, PrP, α-sinucleína, calcitonina, prolactina, cistatina, ATF y actina; SP-B, αdefensinas y β-defensinas; apolipoproteínas de clase A-H; LL-37, SP-C, SP-C33Leu, Brichos, GFP, neuroserpina; hormonas, que incluyen EPO y hormona del crecimiento (HC), y factores de crecimiento, que incluyen IGF-I e IGF-II; avidina y estreptavidina; y proteasa 3C.

Hedhammar M. et al., Biochemistry 47: 3407-3417 (2008), discuten las propiedades estructurales de las partes repetitivas y no repetitivas recombinantes de la espidroína ampulada mayor 1 procedente de Euprosthenops australis y las implicaciones en la formación de fibra de tela de araña.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos medios y métodos para la producción de proteínas y polipéptidos, y en particular de proteínas y polipéptidos no espidroína.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevos medios y métodos para la producción de proteínas y polipéptidos, y en particular proteínas y polipéptidos no espidroína, con baja solubilidad en agua, p.ej., proteínas y polipéptidos que sean propensos a agregarse cuando se producen a partir de ADN recombinante, proteínas y polipéptidos de membrana, y proteínas y polipéptidos formadores de amiloide.

Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar medios y métodos alternativos para la producción de fármacos de proteína o polipéptido y de dianas farmacológicas.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos medios y métodos para la producción de proteínas y polipéptidos que contienen disulfuros.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevos medios y métodos para la producción de apolipoproteínas.

Para éstos y otros objetivos que serán evidentes a partir de la siguiente especificación, la presente invención proporciona según un primer aspecto una proteína de fusión que es útil en un método para producir una proteína o polipéptido no espidroína deseada. La proteína de fusión puede ser útil como tal, o puede dividirse para obtener la proteína o polipéptido en forma aislada. Las proteínas de fusión según la invención comprenden (i) al menos un resto potenciador de la solubilidad que deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña; y (ii) al menos un resto que es una proteína o polipéptido deseado no espidroína; en donde cada resto potenciador de la solubilidad está unido directa o indirectamente al resto de proteína o polipéptido deseado no espidroína.

Cada resto potenciador de la solubilidad tiene al menos un 80% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 6 o al menos un 50% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 8. En realizaciones específicas de la proteína de fusión, cada resto potenciador de la solubilidad contiene entre 100 y 160 residuos de aminoácido.

En una realización, la proteína de fusión está sometida a la condición de que cuando la proteína de fusión comprenda un único resto potenciador de la solubilidad que derive del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña, entonces la proteína o polipéptido deseado es una proteína o polipéptido no espidroína.

La proteína o polipéptido deseado es una proteína o polipéptido no espidroína. En algunas realizaciones, la proteína

o polipéptido deseado tiene menos de un 30% de identidad con respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 6-10.

En determinadas realizaciones, la proteína de fusión comprende al menos dos restos potenciadores de la solubilidad, cada uno de los cuales deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña. En realizaciones específicas, la proteína de fusión comprende al menos dos restos potenciadores de la solubilidad consecutivos, cada uno de los cuales deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña.

En algunas realizaciones de la proteína de fusión, al menos un resto potenciador de la solubilidad está ligado directa o indirectamente al extremo amino-terminal o al extremo carboxi-terminal de al menos un resto de la proteína o polipéptido deseado. En realizaciones específicas, al menos un resto potenciador de la solubilidad constituye el extremo amino-terminal y/o el extremo carboxi-terminal de la proteína de fusión.

En una realización, la proteína de fusión comprende además (iii) al menos un sitio de división dispuesto entre al menos un resto de proteína o polipéptido deseado y al menos un resto potenciador de la solubilidad.

En determinadas realizaciones de la proteína de fusión, la proteína o polipéptido deseado deriva de esponjas, ctenóforos (“portadores de peines”), medusas, corales, anémonas, gusanos planos, rotíferos, gusanos redondos, gusanos de cinta, almejas, caracoles, pulpos, gusanos segmentados, crustáceos, insectos, briozoos, braquiópodos, foronídeos, estrellas de mar, erizos de mar, tunicados, lanceolados, vertebrados, que incluyen humanos, plantas, hongos, levaduras, bacterias, arqueobacterias o virus, o es una proteína o polipéptido artificial. En realizaciones específicas, la proteína o polipéptido deseado deriva de moluscos, insectos, vertebrados, que incluyen humanos, plantas, hongos, levaduras, bacterias, arqueobacterias o virus, o es una proteína o polipéptido artificial. En realizaciones específicas adicionales, la proteína o polipéptido deseado deriva de vertebrados, que incluyen humanos, plantas, hongos, levaduras, bacterias, arqueobacterias o virus, o es una proteína o polipéptido artificial.

La proteína o polipéptido deseado se selecciona del grupo que consiste en proteínas y polipéptidos formadores de amiloide, SP-B y variantes de los mismos que contienen disulfuro, apolipoproteínas, proteínas y polipéptidos de membrana, fármacos de proteína y polipéptido y dianas farmacológicas, proteínas y polipéptidos propensos a agregación, y proteasas. En realizaciones específicas de la proteína de fusión, la proteína y polipéptido deseados se seleccionan del grupo que consiste en Aβ-péptido, IAPP, PrP, α-sinucleína, calcitonina, prolactina, cistatina, ATF y actina; SP-B, α-defensinas y β-defensinas; apolipoproteínas de clase A-H; LL-37, SP-C, SP-C33, SP-C33Leu, Brichos, GFP, neuroserpina; hormonas, que incluyen EPO y hormona de crecimiento (HC), y factores de crecimiento, que incluyen IGF-I e IGF-II; avidina y estreptavidina; y proteasa 3C.

Las realizaciones preferidas de la proteína de fusión se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOS 26, 28, 30, 34, 37, 39, 42 y 47, y las proteínas que tienen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% de identidad con respecto a dichas proteínas.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona ácidos polinucleicos aislados que codifican las proteínas de fusión según la invención Las realizaciones preferidas de los ácidos polinucleicos aislados se seleccionan del grupo que consiste en ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS 26, 28, 30, 34, 37, 39, 42 y 47, y las proteínas que tienen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% de identidad con respecto a dichas proteínas; y el grupo de ácidos nucleicos que consiste en las SEQ ID NOS 27, 29, 31, 38, 40, 43 y 48.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un nuevo uso de al menos un resto que se deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña como un resto potenciador de la solubilidad en una proteína de fusión para la producción de una proteína o polipéptido no espidroína deseado. En una realización, la proteína de fusión está sujeta a la condición de que cuando la proteína de fusión comprende un único resto potenciador de la solubilidad que se deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña, entonces la proteína o el polipéptido deseado es una proteína o polipéptido no espidroína. En una realización específica, la proteína o polipéptido deseado es una proteína o polipéptido espidroína. Cada resto potenciador de la solubilidad tiene al menos un 80% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 6, o al menos un 50% de identidad con respecto a la SEQ ID NO: 8.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de fusión, que comprende las etapas de: a) expresar en un hospedante adecuado una proteína de fusión según la invención; y b) obtener una mezcla que contenga la proteína de fusión, y opcionalmente aislar la proteína de fusión.

Según un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un método para producir una proteína o polipéptido no espidroína deseado, que comprende las siguientes etapas: a) expresar en un hospedante adecuado una proteína de fusión según la invención; y b) obtener una mezcla que contenga la proteína o polipéptido de fusión, y opcionalmente aislar la proteína o polipéptido de fusión. En determinadas realizaciones, este método además comprende las siguientes etapas: c) dividir la proteína de fusión para proporcionar la proteína o polipéptido no espidroína deseado; y d) aislar la proteína o polipéptido no espidroína deseado; en donde dicha proteína de fusión comprende: (iii) al menos un sitio de división dispuesto entre al menos un resto de proteína o polipéptido no espidroína deseado y al menos un resto potenciador de la solubilidad.

En determinadas realizaciones de estos métodos, la etapa b) implica además la purificación de la proteína de fusión en un medio de afinidad con un resto NT inmovilizado y/o en un medio de intercambio aniónico. En realizaciones especificadas, la purificación de la proteína de fusión en un medio de afinidad se lleva a cabo en asociación a un medio de afinidad con un resto NT inmovilizado a un pH de 6,3 o inferior, seguido de la disociación del medio de afinidad con un medio de disociación deseado. En realizaciones específicas adicionales, el medio de disociación tiene un pH de 6,4 o superior, un pH de 4,1 o inferior y/o tiene una elevada fuerza iónica. En algunas realizaciones, la purificación de la proteína de fusión en un medio de intercambio aniónico se lleva a cabo en asociación al medio de intercambio aniónico en un pH de 6,4 o superior, seguido de la disociación del medio de intercambio aniónico con un medio de disociación que tiene una elevada fuerza iónica. En algunas realizaciones de estos métodos, la purificación de la proteína de fusión de la etapa b) se produce en una columna, sobre partículas magnéticas con superficies funcionalizadas, o en rellenos con superficies funcionalizadas.

Lista de secuencias anexas

SEQ ID NO

1: 4Rep

2: 4RepCT

3: NT4Rep

4: NT5Rep

5: NT4RepCTHis

6: NT

7: CT

8: secuencia NT de consenso

9: secuencia CT de consenso

10: secuencia repetitiva de Euprosthenops australis MaSp1

11: secuencia de segmento G de consenso 1

12: secuencia de segmento G de consenso 2

13: secuencia de segmento G de consenso 3

14: NT4Rep (ADN)

15: NT4RepCT (ADN)

16: NT5Rep (ADN)

17: NT4RepCTHis 2

18: NT4RepCTHis 2 (ADN)

19: ZbasicNT4RepCT

20: NT4RepCT

21: HisTrxHisThrNT4RepCT

22: NT4RepCT 2

23: HisNTNT4RepCT

24: HisNTNT4RepCT (ADN)

25: NT8RepCT

26: HisNTMetSP-C33Leu

27: HisNTMetSP-C33Leu (ADN)

28: HisNTNTMetSP-C33Leu

29: HisNTNTMetSP-C33Leu (ADN)

30: HisNTNTMetLL37

31: HisNTNTMetLL37 (ADN)

32: NTHis

33: HisNTNT8RepCT

34: HisNTNTBrichos

35: HisTrxHisSP-C33Leu

36: HisTrxHisSP-C33Leu (ADN)

37: HisTrxNtSP-C33Leu

38: HisTrxNtSP-C33Leu (ADN)

39: 2HisNtNtQGBrichos

40: 2HisNtNtQGBrichos (ADN)

41: Brichos

42: 2HisNtNtQGGFP

43: 2HisNtNtQGGFP (ADN)

44: GFP (Proteína Fluorescente Verde)

45: ZbGFP

46: HisABPGFP

47: 2HisNtNtQGNS

48: 2HisNtNtQGNS (ADN)

49: NS (Neuroserpina)

Breve descripción de las figuras Figura 1: muestra un alineamiento de secuencia de los dominios N-terminales de la espidroína. Figura 2: muestra un alineamiento de secuencia de los dominios C-terminales de la espidroína. Figura 3: muestra geles de electroforesis de proteínas de fusión. Figura 4: muestra un gel de electroforesis de una proteína SP-C33Leu obtenida a partir de una proteína de fusión. Figura 5: muestra la actividad superficial in vitro de suspensiones de tensioactivo que comprenden SP-C33Leu

obtenida de una proteína de fusión. Figura 6: muestra geles de electroforesis de proteínas de fusión SP-C33Leu. Figura 7: muestra un gel de electroforesis de una proteína de fusión Brichos. Figura 8: muestra un gel de electroforesis de una proteína de fusión de GFP y de la GFP obtenida a partir de la

proteína de fusión.

Figura 9: muestra un gel de electroforesis de una proteína de fusión de neuroserpina y de la neuroserpina obtenida a partir de la proteína de fusión.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la producción de proteínas y polipéptidos, y en particular de proteínas y polipéptidos no espidroína. Dependiendo del propósito de dicha producción, el producto final puede variar. Por ejemplo, puede ser deseable obtener la proteína o polipéptido insertado en una membrana lipídica, en disolución o asociada a otras biomoléculas. También cabe destacar que también puede ser altamente deseable obtener la proteína o polipéptido deseado como parte de una proteína de fusión, lo que puede proporcionar un medio adecuado para la purificación y la detección y/o proporcionar propiedades deseables, p.ej., estabilidad y solubilidad.

La presente invención se basa de forma general en el descubrimiento de la utilidad del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña como resto potenciador de la solubilidad en una proteína de fusión que es producida a partir de ADN recombinante. De esta manera, la presente invención proporciona según un primer aspecto una proteína de fusión que comprende (i) al menos un resto potenciador de la solubilidad que se deriva del fragmento NT de una proteína de tela de araña; y (ii) al menos un resto que es una proteína o polipéptido no espidroína deseado. En una realización preferida, la proteína de fusión consiste en (i) al menos un resto potenciador de la solubilidad que deriva del fragmento NT de una proteína de tela de araña; y (ii) al menos un resto que es una proteína o polipéptido no espidroína deseado, que incluye opcionalmente otras características descritas en la presente memoria, p.ej., un péptido ligando y/o un sitio de división entre el resto potenciador de la solubilidad y la proteína o polipéptido deseado. En determinados experimentos, de forma sorprendente, se han obtenido rendimientos elevados de diferentes proteínas de fusión en E. coli. La proteína de fusión puede ser útil como tal en forma aislada, p.ej., para estudios de proteínas, por lo demás agregadas y de baja solubilidad, en forma soluble, o en la cristalización asociada a cristalografía de rayos-X. La proteína de fusión también puede dividirse para liberar la proteína deseada.

El término “proteína de fusión” implica en la presente memoria una proteína que se prepara mediante expresión a partir de un ácido nucleico recombinante, es decir, ADN o ARN que es creado artificialmente combinando dos o más secuencias de ácido nucleico que normalmente no existirían juntas (ingeniería genética). Las proteínas de fusión según la invención son proteínas recombinantes, y por lo tanto no son idénticas a las proteínas naturales. En particular, las espidroínas naturales no son proteína de fusión según la invención, ya que no son expresadas a partir de un ácido nucleico recombinante, como se ha establecido anteriormente. Las secuencias de ácido nucleico combinadas codifican diferentes proteínas, proteínas parciales o polipéptidos con determinadas propiedades funcionales. La proteína de fusión resultante, o la proteína de fusión recombinante, es una proteína individual con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas, proteínas parciales o polipéptidos originales.

En determinadas realizaciones, la proteína de fusión según la invención y los correspondientes genes son quiméricos, es decir, los fragmentos de proteína/gen derivan de al menos dos especies diferentes. El resto potenciador de la solubilidad deriva del fragmento N-terminal de una proteína de tela de araña. Según este aspecto, se prefiere que la proteína o polipéptido deseado no sea una proteína espidroína. Esto implica que la proteína o el polipéptido deseado no deriva del fragmento C-terminal, repetitivo o N-terminal de una proteína de tela de araña.

La proteína de fusión según la invención también puede contener uno o más péptidos ligando. El(los) péptido(s) ligando puede(n) disponerse entre el resto potenciador de la solubilidad y el resto de proteína o polipéptido deseado,

o puede(n) disponerse en cualquier extremo del resto potenciador de la solubilidad y la proteína o polipéptido deseado. Si la proteína de fusión contiene dos o más restos potenciadores de la solubilidad, el(los) péptido(s) ligando también puede(n) disponerse entre dos restos potenciadores de la solubilidad. El(los) ligando(s) puede(n) proporcionar un espaciador entre las unidades funcionales de la proteína de fusión, pero también pueden constituir un medio para la identificación y la purificación de la proteína de fusión, p.ej., una etiqueta His y/o Trx. Si la proteína de fusión contiene dos o más péptidos ligando para la identificación y la purificación de la proteína de fusión, es preferible que estén separados por una secuencia espaciadora, p.ej., His6-espaciador-His6-. El ligando también puede constituir un péptido señal, tal como una partícula de reconocimiento de señal, que dirija la proteína de fusión a la membrana y/o que cause la secreción de la proteína de fusión desde la célula hospedante al medio circundante. La proteína de fusión también puede incluir un sitio de división en su secuencia de aminoácidos, lo que permite la división y la eliminación de el(los) ligando(s) y/o del resto o restos potenciadores de la solubilidad. Los especialistas en la técnica conocen varios sitios de división, p.ej., sitios de división para agentes químicos, tales como CNBr tras residuos de Met e hidroxilamina entre residuos Asn-Gly, sitios de división para proteasas, tales como trombina o proteasa 3C, y secuencias autodivisibles, tales como secuencias autodivisibles de inteína.

Cada resto potenciador de la solubilidad está unido directa o indirectamente al resto de proteína o polipéptido deseado. Un enlace directo implica una unión covalente directa entre los dos restos sin secuencias intervinientes, tales como ligandos. Un enlace indirecto también implica que los dos restos están unidos mediante enlaces covalentes, pero que hay secuencias intervinientes, tales como ligandos y/o uno o más restos potenciadores de la solubilidad adicionales.

El al menos un resto potenciador de la solubilidad puede disponerse en cualquier extremo de la proteína o polipéptido deseado, es decir, se puede disponer C-terminalmente o N-terminalmente. Se prefiere que el al menos

un resto potenciador de la solubilidad se disponga en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido deseado. Si la proteína de fusión contiene uno o más péptidos ligando para identificación y purificación de la proteína de fusión, p.ej., una etiqueta His o Trx, se prefiere que se disponga en el extremo N-terminal de la proteína de fusión. El al menos un resto potenciador de la solubilidad también puede integrarse dentro de la proteína o polipéptido deseado, por ejemplo entre los dominios o partes de una proteína deseada. En una realización preferida, al menos un resto potenciador de la solubilidad constituye el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal de la proteína de fusión, es decir, no hay presente ningún péptido ligando u otra secuencia terminal del resto potenciador de la solubilidad. Una proteína de fusión típica según la invención puede contener 1-6, tal como 1-4, tal como 1-2 restos potenciadores de la solubilidad.

En una realización preferida, la proteína de fusión comprende al menos dos restos potenciadores de la solubilidad, derivando cada uno de ellos del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña. Los restos potenciadores de la solubilidad, preferiblemente dos restos potenciadores de la solubilidad, pueden disponerse consecutivamente en cualquier extremo de la proteína o polipéptido deseado, es decir, disponerse C-terminalmente

o N-terminalmente. Los restos potenciadores de la solubilidad dispuestos consecutivamente también pueden integrarse dentro de la proteína o polipéptido deseado, por ejemplo entre dominios o partes de una proteína deseada. Los restos potenciadores de la solubilidad también pueden disponerse no consecutivamente, tanto en cada extremo de la proteína o polipéptido deseado, es decir, disponerse C-terminalmente y N-terminalmente, como en un extremo de la proteína o polipéptido deseado e integrarse dentro de la proteína o polipéptido deseado. Una proteína de fusión preferida típica según la invención puede contener 2-6, tal como 2-4, restos potenciadores de la solubilidad.

En una realización preferida, la proteína de fusión según la invención tiene al menos un sitio de división dispuesto entre al menos una proteína o polipéptido deseado y al menos un resto potenciador de la solubilidad. Esto permite la división de la proteína de fusión y la purificación de la proteína deseada. Sin embargo, cabe destacar que puede ser deseable obtener la proteína o polipéptido deseado como parte de una proteína de fusión, lo cual puede proporcionar un medio adecuado para la purificación y la detección y/o proporcionar propiedades deseables, p.ej., estabilidad y solubilidad. En este caso, el sitio de división puede omitirse, o el sitio de división puede incluirse pero la etapa de división omitirse.

Una proteína de fusión preferida tiene la forma de un resto potenciador de la solubilidad dispuesto N-terminalmente, acoplado mediante un péptido ligando de 1-30 residuos de aminoácido, tal como 1-10 residuos de aminoácido, a una proteína o polipéptido deseado dispuesto C-terminalmente. El péptido ligando puede contener un sitio de división. Opcionalmente, la proteína de fusión tiene un péptido ligando N-terminal o C-terminal, que puede contener una etiqueta de purificación, tal como una etiqueta His, y un sitio de división.

Otra proteína de fusión preferida tiene la forma de un resto potenciador de la solubilidad dispuesto N-terminalmente acoplado directamente a una proteína o polipéptido dispuesto C-terminalmente. Opcionalmente, la proteína de fusión tiene un péptido ligando N-terminal o C-terminal, que puede contener una etiqueta de purificación, tal como una etiqueta His, y un sitio de división.

Una proteína de fusión preferida tiene la forma de dos restos potenciadores de la solubilidad dispuestos Nterminalmente consecutivos, acoplados mediante un péptido ligando de 1-30 residuos de aminoácido, tal como 1-10 residuos de aminoácido, a una proteína o polipéptido deseado dispuesto C-terminalmente. El péptido ligando puede contener un sitio de división. Opcionalmente, la proteína de fusión tiene un péptido ligando N-terminal o C-terminal, que puede contener una etiqueta de purificación tal como una etiqueta His, y un sitio de división.

Otra proteína de fusión preferida tiene la forma de dos restos potenciadores de la solubilidad dispuestos Nterminalmente consecutivos acoplados directamente a una proteína o polipéptido deseado dispuesto Cterminalmente. Opcionalmente, la proteína de fusión tiene un péptido ligando N-terminal o C-terminal, que puede contener una etiqueta de purificación, tal como una etiqueta His, y un sitio de división.

El resto potenciador de la solubilidad es derivado del fragmento NT de una proteína de tela de araña, o espidroína. Aunque los ejemplos necesariamente se refieren a fragmentos NT específicos, en este caso a proteínas derivadas de la espidroína mayor 1 (MaSp1) de Euprosthenops australis, se considera que el método descrito en la presente memoria es aplicable a cualquier resto de proteína similar. Los términos “espidroínas” y “proteínas de tela de araña” se usan de forma intercambiable a lo largo de toda la descripción, y abarcan todas las proteínas de tela de araña conocidas, que incluyen las proteínas de tela de araña ampuladas mayores, normalmente abreviadas como “MaSp”,

o “ADF” en el caso de Araneus diadematus. Estas proteínas de tela de araña ampuladas mayores generalmente son de dos tipos, 1 y 2. Estos términos incluyen además los nuevos fragmentos NT de proteína según la invención, tal como se definen en las reivindicaciones anexas y en las realizaciones incluidas en la presente memoria, y otras proteínas no naturales con un grado elevado de identidad y/o similitud con respecto a los fragmentos de proteínas NT de tela de araña conocidos.

El resto potenciador de la solubilidad presenta un grado elevado de similitud con respecto a la secuencia de aminoácidos N-terminal (NT) de las proteínas de tela de araña. Tal como se muestran en la Figura 1, esta secuencia de aminoácidos está bien conservada entre diversas especies y con respecto a proteínas de tela de araña,

incluyendo la MaSp1 y la MaSp2. En la Figura 1, los siguientes fragmentos NT de espidroína están alineados, denotados con las entradas de acceso al GenBank, cuando es aplicable:

TABLA 1 – Fragmentos NT de espidroína

Código: Especie y proteína espidroína Nº acceso GenBank

Ea MaSp1: Euprosthenops australis MaSp 1 AM259067

Lg MaSp1: Latrodectus geometricus MaSp 1 ABY67420

Lh MaSp1: Latrodectus hesperus MaSp 1 ABY67414

Nc MaSp1: Nephila clavipes MaSp 1 ACF19411

At MaSp2: Argiope trifasciata MaSp 2 AAZ15371

Lg MaSp2: Latrodectus geometricus MaSp 2 ABY67417

Lh MaSp2: Latrodectus hesperus MaSp 2 ABR68855

Nim MaSp2: Nephila inaurata madagascariensis MaSp 2 AAZ15322

Nc MaSp2: Nephila clavipes MaSp 2 ACF19413

Ab CySp1: Argiope bruennichi espidroína cilindriforme 1 BAE86855

NcI CySp1: Nephila clavata espidroína cilindriforme 1 BAE54451

Lh TuSp1: Latrodectus hesperus espidroína tubuliforme ABD24296

Nc Flag: Nephila clavipes proteína de tela flageliforme AF027972

Nim Flag: Nephila inaurata madagascariensis proteína AF218623

de tela flageliforme: (traducida)

Para cada secuencia solo se muestra la parte correspondiente al dominio N-terminal, omitiendo el péptido señal. Nc flag y Nlm flag están traducidas y editadas de acuerdo a Rising A. et al. Biomacromolecules 7, 3120-3124 (2006)).

No es crítico qué resto potenciador de la solubilidad específico está presente en las proteínas de fusión según la invención, siempre que el resto potenciador de la solubilidad no esté completamente ausente. Por tanto, el resto potenciador de la solubilidad según la invención puede seleccionarse de cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 1, o de secuencias con un alto grado de similitud. Se puede usar una amplia variedad de secuencias potenciadoras de la solubilidad en la proteína de fusión según la invención. En base a las secuencias homólogas de la Figura 1, la siguiente secuencia constituye una secuencia de aminoácidos potenciadora de la solubilidad de consenso:

QANTPWSSPNLADAFINSF(M/L)SA(A/I)SSSGAFSADQLDDMSTIG(D/N/Q)T

LMSAMD(N/S/K)MGRSG(K/R)STKSKLQALNMAFASSMAEIAAAESGG(G/Q)

SVGVKTNAISDALSSAFYQTTGSVNPQFV(N/S)EIRSLI(G/N)M(F/L)(A/S)QAS

ANEV (SEQ ID NO 8).

La secuencia del resto potenciador de la solubilidad según la invención tiene al menos un 50% de identidad, preferiblemente al menos un 60% de identidad, con respecto a la secuencia de aminoácidos de consenso SEQ ID NO 8, que se basa en las secuencias de aminoácido de la Figura 1. En una realización preferida, la secuencia del resto potenciador de la solubilidad según la invención tiene al menos un 65% de identidad, preferiblemente al menos un 70% de identidad, con respecto a la secuencia de aminoácidos de consenso SEQ ID NO 8. En realizaciones preferidas, el resto potenciador de la solubilidad según la invención tiene además un 70%, preferiblemente un 80%, de similitud con respecto a la secuencia de aminoácidos de consenso SEQ ID NO 8.

Un resto potenciador de la solubilidad representativo según la invención es la secuencia de Euprosthenops australis SEQ ID NO 6. Según una realización preferida de la invención, el resto potenciador de la solubilidad tiene al menos un 80% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 6 o a cualquier secuencia de aminoácidos individual de la Figura

1. En realizaciones preferidas de la invención, el resto potenciador de la solubilidad tiene al menos un 90%, tal como al menos un 95% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 6 o a cualquier secuencia de aminoácidos individual de

la Figura 1. En realizaciones preferidas de la invención, el resto potenciador de la solubilidad es idéntico a la SEQ ID NO 6 o a cualquier secuencia de aminoácidos individual de la Figura 1, en particular la Ea MaSp1.

La expresión “% de identidad”, tal como se usa a lo largo de la especificación y las reivindicaciones anexas, se calcula como se indica a continuación. La secuencia de consulta es alineada con la secuencia diana usando el algoritmo CLUSTAL W (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Se realiza una comparación para la ventana correspondiente a la más corta de las secuencias alineadas. Se comparan los residuos de aminoácido de cada posición, y el porcentaje de posiciones de la secuencia de consulta que tienen correspondencias idénticas en la secuencia diana se presenta como % de identidad.

La expresión “% de similitud”, tal como se usa a lo largo de la especificación y de las reivindicaciones anexas, se calcula como se ha descrito para el “% de identidad”, con la excepción de que los residuos hidrofóbicos Ala, Val, Phe, Pro, Leu, Ile, Trp, Met y Cys son similares; los residuos básicos Lys, Arg y His son similares; los residuos ácidos Glu y Asp son similares; y los residuos hidrofílicos no cargados Gln, Asn, Ser, Thr y Tyr son similares. El aminoácido natural restante Gly no es similar a ningún otro aminoácido en este contexto.

A lo largo de la descripción, realizaciones alternativas según la invención cumplen, en lugar del porcentaje de identidad especificado, el porcentaje de similitud correspondiente. Otras realizaciones alternativas cumplen el porcentaje especificado de identidad, así como otro porcentaje de similitud mayor, seleccionado del grupo de porcentajes preferidos de identidad para cada secuencia. Por ejemplo, una secuencia puede ser un 70% similar a otra secuencia; o puede ser un 70% idéntica a otra secuencia; o puede ser un 70% idéntica y un 90% similar a otra secuencia.

El resto potenciador de la solubilidad contiene entre 100 y 160 residuos de aminoácido. Es preferible que el resto potenciador de la solubilidad contenga al menos 100, o más de 110, preferiblemente más de 120, residuos de aminoácido. También se prefiere que el resto potenciador de la solubilidad contenga como mucho 160, o menos de 140 residuos de aminoácido. Un resto potenciador de la solubilidad típico contiene aproximadamente 130-140 residuos de aminoácido.

Según otro aspecto, la proteína o polipéptido deseado según la invención es una proteína o polipéptido no espidroína cuando la proteína de fusión comprende un resto potenciador de la solubilidad que deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña. En una realización preferida, la proteína o polipéptido deseado es una proteína o polipéptido no espidroína. La secuencia de una proteína o polipéptido deseado no espidroína según la invención preferiblemente tiene menos de un 30% de identidad, tal como menos de un 20% de identidad, preferiblemente menos de un 10% de identidad, con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácido de espidroína descritas en la presente memoria, y específicamente con respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 6-10.

En una realización preferida, la proteína o polipéptido deseado no espidroína deriva de esponjas, ctenóforos (“portadores de peines”), medusas, corales, anémonas, gusanos planos, rotíferos, gusanos redondos, gusanos de cinta, almejas, caracoles, pulpos, gusanos segmentados, crustáceos, insectos, briozoos, braquiópodos, foronídeos, estrellas de mar, erizos de mar, tunicados, lanceolados, vertebrados, que incluyen humanos, plantas, hongos, levaduras, bacterias, arqueobacterias o virus, o es una proteína o polipéptido artificial. La palabra “deriva” significa que la secuencia de una proteína o polipéptido deseado no espidroína según la invención tiene preferiblemente al menos un 50% de identidad, preferiblemente la menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80% de identidad, o incluso al menos un 90% de identidad, tal como un 95-100% de identidad, con respecto a una proteína natural correspondiente, y que presente una función mantenida. En una realización preferida, la proteína o polipéptido deseado no espidroína deriva de moluscos, insectos, vertebrados, que incluyen humanos, plantas, hongos, levaduras, bacterias, arqueobacterias o virus, o es una proteína o polipéptido artificial. En una realización preferida, la proteína o polipéptido deseado no espidroína deriva de vertebrados, que incluyen humanos, plantas, hongos, levaduras, bacterias, arqueobacterias o virus, o es una proteína o polipéptido artificial.

En una realización preferida, la proteína o polipéptido deseado no espidroína se selecciona del grupo que consiste en proteína y polipéptidos formadores de amiloide, proteínas y polipéptidos que contienen disulfuros, apolipoproteínas, proteínas y polipéptidos de membrana, fármacos y dianas farmacológicas de proteínas y polipéptidos, proteínas y polipéptidos propensos a la agregación, y proteasas.

Las proteínas y polipéptidos formadores de amiloide según la invención incluyen proteínas y polipéptidos que están asociados a amiloide de enfermedad y funcional. Los ejemplos de proteínas y polipéptidos formadores de amiloide incluyen amiloide beta péptido (Aβ-péptido), polipéptido amiloide de isleta (amilina o IAPP), proteína de prion (PrP), α-sinucleína, calcitonina, prolactina, cistatina, factor natriurético atrial (ATF) y actina. En la Tabla 3 se enumeran ejemplos de proteínas y polipéptidos formadores de amiloide según la invención.

TABLA 3 – Proteínas y polipéptidos formadores de amiloide

Proteína: ID Uniprot

Aβ1-42: P05067

Apolipoproteína SAA: P02735

Cistatina C: P01034

Transtiretina: P02766

Lisozima: P61626

α-sinucleína: P37840

Proteína de prion: P04156

ODAM: A1E959

Lactadherina: Q08431

Tau: P10636

Gelsolina: P06396

ABri, ADan: Q9Y287

Insulina: P01308

Apolipoproteína A-II: P02652

Apolipoproteína A-IV: P06727

Semenogelina I: P04279

Queratoepitelina: Q15582

Lactotransferrina: P02788

Fibrinógeno cadena α: P02671

ANF: P01160

IAPP: P10997

β2-microglobulina: P61769

Calcitonina: P01258

Prolactina: P01236

Apolipoproteína A-I: P02647

CsgA: P28307

Sup35: C7GN25

PmeI17: P40967

HET-s: A8HR89

Ure2p: Q8NIE6

Los ejemplos de proteínas y polipéptidos que contienen disulfuro incluyen proteína tensioactiva B (SP-B) y variantes de la misma, tales como Mini-B, Mini-B27, Mini-BLeu, α-defensinas y β-defensinas. Sin pretender establecer ninguna teoría específica, se contempla que el resto potenciador de la solubilidad promueve la formación deseada de enlaces disulfuro intracadena sobre los enlaces disulfuro intercadena en las defensinas y otras proteínas y

polipéptidos que contienen disulfuros. En la Tabla 4 se enumeran ejemplos de proteínas y polipéptidos que contienen disulfuros según la invención.

TABLA 4 – Proteínas y polipéptidos que contienen disulfuros

Proteína: Secuencia / ID Uniprot

SP-B humana

SP-B de ratón

SP-B de cerdo

SP-B de conejo

SP-B de rata

Mini-B

Mini-BLeu

Mini-B27

1a AA

1b AA

1a LL

1b LL

Proinsulina: P01308

CAR D1 f: P78310

Brichos: SEQ ID NO: 41

a Enlaces Cys8-Cys77, Cys11-Cys71, Cys35-Cys46 y enlace intermolecular Cys48-Cys48 b Enlaces Cys1-Cys33 y C4-C27 c Enlaces Cys1-Cys27 y C4-C21 d Enlace Cys1-Cys33 e Enlace Cys4-Cys27 f Receptor de virus de Coxsackie y de adenovirus

Los ejemplos de apolipoproteínas incluyen apolipoproteínas de clase A-H. En la Tabla 5 se incluyen ejemplos de apolipoproteínas según la invención.

TABLA 5 – Apolipoproteínas

Proteína: Secuencia / ID Uniprot

Apolipoproteína B-100: P04114

Apolipoproteína C-1: P02654

Apolipoproteína D: P05090

Apolipoproteína E: P02649

Los ejemplos de proteínas y polipéptidos de membrana incluyen receptores asociados a membrana, que incluyen receptores de citocina, KL4, LL-37, proteína tensioactiva C (SP-C) y variantes de la misma, tales como SP-C(Leu),

5 SP-C33, SP-C30 y SP-C33Leu. Otros ejemplos específicos incluyen las proteínas SP-C33Leu fusionada a Mini-B, Mini-BLeu, 1a AA, 1b AA, 0 AAAA, 1a LL, 1b LL, 0 LLLL ó SP-B, opcionalmente a través de un ligando, p.ej., Glyn, Leun, Gly-Alan o similar. La SP-C33Leu puede estar dispuesta N-terminalmente o, preferiblemente, C-terminalmente respecto a la proteína Mini-B, Mini-BLeu, 1a AA, 1b AA, 0 AAAA, 1a LL, 1b LL, 0 LLLL ó SP-B. En la Tabla 6 se incluyen ejemplos de proteínas y polipéptidos de membrana según la invención.

10 TABLA 6 – Proteínas y polipéptidos de membrana

Proteína: Secuencia / ID Uniprot

SP-C: FGIPCCPVHLKRLLIVVVVVVLIVVVIVGALLMGL *

SP-C(Leu): FGIPSSPVHLKRKLLLLLLLLILLLILGALLMGL

SP-C33: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL

SP-C30: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL

SP-C33(Leu): IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL

LL-37: LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES

KL4: KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK

* Cys-5 y Cys-6 de la SP-C nativa están palmitoilados

Proteína: ID Uniprot

Receptor de hormona de crecimiento: P10912

Receptor 35 acoplado a proteína G: Q9HC97

Receptor de insulina: P06213

Receptor de hormona de liberación de gonadotropina: P30968

Receptor de lipoproteína de densidad muy baja: P98155

Receptor beta de TFG, tipo 1: P36897

Receptor D2 de prostaglandina: Q13258

Receptor de tirosina-proteína quinasa erbB-2 (HER2): P04626

Receptor de tirosina-proteína quinasa erbB-4 (HER4): Q15303

Receptor de tirosina-proteína quinasa erbB-3 (HER3): P21860

Acuaporina-1: P29972

Acuaporina-2: P41181

Proteína de canal de cloruro CIC-Ka: P51800

Proteína de canal de cloruro CIC-Kb: P51801

Proteína de membrana integral DGCR2/IDD: P98153

Receptor de interleucina 9: Q01113

Los ejemplos de proteínas y polipéptidos fármacos y dianas farmacológicas incluyen hormonas que se producen recombinantemente, que incluyen hormonas de péptido y de proteína, tales como eritropoyetina (EPO) y hormona del crecimiento (HC), citocinas, factores de crecimiento, tales como los factores de crecimiento de tipo insulina (IGF-I 5 e IGF-II), KL4, LL-37, proteína tensioactiva C (SP-C) y sus variantes, tales como SP-C(Leu), SP-C33, SP-C30 y SP-C33Leu. Otros ejemplos específicos incluyen SP-C33Leu fusionada a proteínas Mini-B, Mini-BLeu, 1a AA, 1b AA, 0 AAAA, 1a LL, 1b LL, 0 LLLL o SP-B, opcionalmente a través de un ligando, p.ej., Glyn, Leun, Gly-Alan o similares. La SP-C33Leu se puede disponer N-terminal o, preferiblemente, C-terminal con respecto a la proteína Mini-B, Mini-BLeu, 1a AA, 1b AA, 0 AAAA, 1a LL, 1b LL, 0 LLLL o SP-B. En la Tabla 7 se presentan ejemplos de proteínas y

10 polipéptidos fármacos o dianas farmacológicas según la invención.

TABLA 7 – Proteínas y polipéptidos fármacos y dianas farmacológicas

Proteína: Secuencia / ID Uniprot

Factor de crecimiento de tipo insulina IA: P01243

Factor de crecimiento de tipo insulina IB: P05019

Hormona de crecimiento 1, variante 1: Q6IYF1

Hormona de crecimiento 1, variante 2: Q6IYF0

Hormona de crecimiento 2, variante 2: B1A4H7

Insulina: P01308

Eritropoyetina: P01588

Factor de coagulación VIII: P00451

Factor de coagulación IX: P00740

Protrombina: P00734

Albúmina de suero: P02768

Antitrombina III: P01008

Interferón alfa: P01563

Somatotropina: P01241

Alérgeno de polen mayor Bet v 1-A: P15494

OspA (Piscirickettsia salmonis): Q5BMB7

Variante de antígeno de 17 kDa de OspA (P. salmonis): Q9F9K8

Factor de crecimiento transformante beta-1: P01137

Factor de crecimiento transformante beta-2: P61812

Factor de crecimiento transformante beta-3: P10600

Interleucina 1 beta: P01584

Interleucina 1 alfa: P01583

Interleucina 2: P60568

Interleucina 3: P08700

Interleucina 4: P05112

Interleucina 5: P05113

Interleucina 6: P05231

Interleucina 7: P13232

Interleucina 8: P10145

Interleucina 9: P15248

Interleucina 10: P22301

Interleucina 12 subunidad alfa: P29459

Interleucina 12 subunidad beta: P29460

Interleucina 18: Q14116

Interleucina 21: Q9HBE4

Linfopoyetina estromal tímica: Q969D9

Brichos: SEQ ID NO: 41

Neuroserpina: SEQ ID NO: 49

Proteína: Secuencia

SP-C: FGIPCCPVHLKRLLIVVVVVVLIVVVIVGALLMGL a

SP-C(Leu): FGIPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL

SP-C33: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL

SP-C30: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL

SP-C33(Leu): IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL

LL-37: LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES

KL4: KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK

1a AA: CWLARALIKRIQALIPKGGRLLPQLVARLVLRCS b

1b AA: AWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRAS c

0 AAAA: AWLARALIKRIQALIPKGGRLLPQLVARLVLRAS

1a LL: CWLLRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVLRLVLRCS b

1b LL: LWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRLS c

0 LLLL: LWLLRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVLRLVLRLS

a Cys5 y Cys6 de la SP-C nativa están palmitoilados b Enlace Cys1-Cys33 c Enlace Cys4-Cys27

Los ejemplos de proteínas y polipéptidos propensos a la agregación incluyen avidina, estreptavidina y partes de unión a ligando extracelulares de receptores de citocina. En la Tabla 8 se presentan proteínas y polipéptidos propensos a la agregación según la invención.

TABLA 8 – Proteínas y polipéptidos propensos a la agregación

Proteína: ID Uniprot / otra referencia

Estreptavidina, Streptomyces avidinii: P22629

Estreptavidina, Streptomyces lavendulae: B8YQ01

Estreptavidina V1, Streptomyces venezuelae: Q53532

Estreptavidina V2, Streptomyces venezuelae: Q53533

Estreptavidina putativa, Burkholderia mallei (cepa SAVP1): A1V7Z0

Estreptavidina putativa, Burkholderia thailandensis: Q2T1V4

Estreptavidina putativa, Burkholderia mallei: Q62EP2

Estreptavidina de núcleo: GenBank: CAA77107.1

M4 (muteína cuádruple de estreptavidina): J Biol Chem 280(24): 2322523231 (2005)

Avidina, Gallus gallus: P02701 GenBank: CAC34569.1

Actina: P68133

Receptor de interleucina 6 subunidad alfa: P08887

Receptor de interleucina 6 subunidad beta: P40189

Receptor de interleucina 2 subunidad alfa: P01589

Receptor de interleucina 2 subunidad beta: P14784

Receptor de citocina común subunidad gamma: P31785

Proteína Fluorescente Verde (GFP): SEQ ID NO: 44

Los ejemplos de proteasas incluyen la proteasa 3C de virus de coxsackie o de rinovirus humano. En la Tabla 9 se presentan otros ejemplos de proteasas según la invención.

5 TABLA 9 – Proteasas

Proteasa: Clase Nº de acceso

Tripsina (bovina): serina P00760

Quimotripsina (bovina): serina P00766

Elastasa (porcina): serina P00772

Endoproteinasa Arg-C (glándula maxilar de ratón): serina

Endoproteinasa Glu-C (proteasa V8) (Staphylococcus aureus): serina P04188

Enzima liberadora de ácido acilamino (porcina): serina P19205

Carboxipeptidasa (Penicillium janthinellum): serina P43946

Proteinasa K (Tritirachium album): serina P06873

Subtilisina (Bacillus subtilis): serina P04189

P029122

Carboxipeptidasa Y (levadura): serina P00729

Endoproteinasa Lys-C (Lysobacter enzymogenes): serina S77957

Enteropeptidasa (humana): serina P98073

Protrombina: serina P00734

Factor X: serina P00742

Pepsina: aspártico P00791 P00790

Catepsina D (humana): aspártico P07339

Proteasa de VIH-1: aspártico Q9YQ34

Catepsina C: cisteína

Clostripaína (endoproteinasa-Arg-C) (Clostridium histolyticum): cisteína P09870

Papaína (Carica papaya): cisteína P00784

Proteasa 3C: cisteína Q04107

Virus del grabado del tabaco (TEV): cisteína Q0GDU8

Termolisina (Bacillus thermo-proteolyticus): metalo P00800

Endoproteinasa Asp-N (Pseudomonas fragi): metalo Q9R4J4

Carboxipeptidasa A (bovina): metalo P00730

Carboxipeptidasa B (porcina): metalo P00732

Proteasa IgA: metalo Q97QP7

En realizaciones preferidas de la invención, la proteína deseada no espidroína se selecciona entre proteína tensioactiva B (SP-B) y sus variantes, tales como Mini-B, Mini-B27, Mini-BLeu, KL4, LL-37, y proteína tensioactiva C (SP-C) y sus variantes, tales como SP-C(Leu), SP-C33, SP-C30 y SP-C33Leu. Otras proteínas no espidroína

5 preferidas según la invención son neuroserpina, GFP y las proteínas 1a AA, 1b AA, 0 AAAA, 1a LL, 1b LL y 0 LLLL.

En determinadas realizaciones preferidas de la invención, la proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS 26, 28, 30, 34, 37, 39, 42 y 47; y proteínas que tienen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% de identidad con respecto a dichas proteínas.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido polinucleico aislado que codifica una proteína de

10 fusión según la invención. En una realización preferida, el ácido polinucleico aislado se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS 27, 29, 31, 38, 40 y 48. En otra realización preferida, el ácido polinucleico aislado se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS 14-16, 18 y 24.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un nuevo uso de al menos un resto que se deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña como un resto potenciador de la solubilidad en una

15 proteína de fusión para la producción de una proteína o polipéptido deseado no espidroína. Cuando la proteína de fusión comprende un único resto potenciador de la solubilidad que deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña, entonces una alternativa preferida es que la proteína deseada sea una proteína o polipéptido no espidroína. La proteína o polipéptido deseado es una proteína o polipéptido no espidroína.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de fusión. La primera

20 etapa implica la expresión en un hospedante adecuado de una proteína de fusión según la invención. Los hospedantes adecuados son bien conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen, p.ej., bacterias y células eucarióticas, tales como levaduras, líneas celulares de insecto y líneas celulares de mamífero. Típicamente, esta etapa implica la expresión de una molécula de ácido polinucleico que codifica la proteína de fusión en E. coli.

La segunda etapa del método implica la obtención de una mezcla que contenga la proteína de fusión. La mezcla puede obtenerse por ejemplo lisando o rompiendo mecánicamente las células hospedantes. La mezcla también puede obtenerse recolectando el medio de cultivo celular, si la proteína de fusión es secretada por la célula hospedante. La proteína obtenida de esta manera puede ser aislada usando procedimientos estándar. Si se desea, esta mezcla puede someterse a centrifugación, y se puede recolectar la fracción apropiada (precipitado o sobrenadante). La mezcla que contiene la proteína de fusión también puede someterse a filtración en gel, cromatografía, p.ej., cromatografía de intercambio aniónico, diálisis, separación de fases o filtración para producir la separación. Opcionalmente, se eliminan activamente los lipopolisacáridos y otros pirógenos en esta etapa. Si se desea, los péptidos ligando pueden eliminarse mediante división en esta etapa.

En una realización preferida, la mezcla obtenida comprende la proteína de fusión disuelta en un medio líquido, típicamente un tampón de sales o un medio de cultivo celular. En una realización preferida, la mezcla tiene un pH inferior a 6,3 y preferiblemente inferior a 6, lo que promueve la conformación de dominios NT solubles. En otra realización preferida, la mezcla tiene un pH superior a 6,4, y preferiblemente superior a 7, lo que evita o disminuye la formación de dominios NT solubles. Un pH superior a 6,4, tal como superior a 7, puede ser particularmente útil para mejorar la solubilidad de las proteínas de fusión según la invención, en donde la proteína/polipéptido deseado deriva de una proteína espidroína o en donde la proteína/polipéptido deseado es una proteína/polipéptido formador de amiloide o propenso a la agregación.

Según un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un método para producir una proteína o polipéptido deseado. La primera etapa implica la expresión en un hospedante adecuado de una proteína de fusión según la invención. Los hospedantes adecuados son bien conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen, p.ej., bacterias y células eucarióticas, tales como levaduras, líneas celulares de insecto y líneas celulares de mamífero. Típicamente, esta etapa implica la expresión de una molécula de ácido polinucleico que codifica la proteína de fusión en E. coli.

La segunda etapa del método implica la obtención de una mezcla que contiene la proteína de fusión. La mezcla puede obtenerse, por ejemplo, lisando o rompiendo mecánicamente, p.ej., sonicando, las células hospedantes. La mezcla también puede obtenerse recolectando el medio de cultivo celular, si la proteína de fusión es secretada por la célula hospedante. La proteína obtenida de esta manera puede ser aislada usando procedimientos estándar. Si se desea, esta mezcla puede someterse a centrifugación, y se puede recolectar la fracción apropiada (precipitado o sobrenadante). La mezcla que contiene la proteína de fusión también puede someterse a filtración en gel, cromatografía, p.ej., cromatografía de intercambio aniónico, diálisis, separación de fases o filtración para producir la separación. Opcionalmente, se eliminan activamente los lipopolisacáridos y otros pirógenos en esta etapa. Si se desea, los péptidos ligando pueden eliminarse mediante división en esta etapa. Como se ha establecido antes, ésta puede ser la forma más adecuada de la proteína o polipéptido deseado, es decir, como parte de una proteína de fusión. Puede proporcionar un medio adecuado para la purificación y la detección y/o proporcionar propiedades deseables, p.ej., estabilidad y en particular solubilidad.

En una realización preferida, el método también puede comprender la etapa de dividir la proteína de fusión para proporcionar la proteína o polipéptido deseado. En esta realización, la proteína de fusión comprende al menos un sitio de división dispuesto entre al menos un resto de proteína o polipéptido y al menos un resto potenciador de la solubilidad. En una proteína de fusión típica, esto implica la presencia de un único sitio de división entre el resto o restos potenciadores de la solubilidad y la proteína o polipéptido deseado. La división puede lograrse usando procedimientos estándar, por ejemplo mediante división con bromuro de cianógeno (CNBr) detrás de residuos Met, división mediante hidroxilamina entre residuos Asn y Gly, división mediante proteasa 3C entre residuos Gln y Gly en sitios -XLETLFQGX-, y en diversos otros sitios de proteasa que son bien conocidos por el especialista en la técnica.

La proteína o polipéptido deseado así obtenido puede aislarse usando procedimientos estándar. Si se desea, esta mezcla puede someterse a centrifugación, y se puede recolectar la fracción apropiada (precipitado o sobrenadante). La mezcla que contiene la proteína de fusión también puede someterse a filtración en gel, cromatografía, p.ej., cromatografía de intercambio aniónico, diálisis, separación de fases o filtración para producir la separación. Opcionalmente, se eliminan activamente los lipopolisacáridos y otros pirógenos en esta etapa. Si se desea, los péptidos ligando pueden eliminarse mediante división en esta etapa.

En una realización preferida, la mezcla obtenida comprende la proteína de fusión disuelta en un medio líquido, típicamente un tampón de sales o un medio de cultivo celular. En una realización preferida, la mezcla tiene un pH inferior a 6,3 y preferiblemente inferior a 6, tal como en el intervalo 4,2-6,3 ó 4,2-6, lo cual promueve la conformación de dominios NT solubles. En otra realización preferida, la mezcla tiene un pH superior a 6,4, y preferiblemente superior a 7, lo que evita o disminuye la formación de dominios NT solubles. Un pH por encima de 6,4, tal como superior a 7, puede ser particularmente útil para mejorar la solubilidad de proteínas de fusión según la invención en donde la proteína/polipéptido deriva de una proteína espidroína o en donde la proteína/polipéptido deseado es una proteína/polipéptido formador de amiloide o propenso a la agregación.

Por tanto, la proteína de fusión típicamente se obtiene como una disolución en un medio líquido. Con los términos “soluble” y “en disolución” se pretende indicar que la proteína de fusión no está agregada de forma visible y no precipita en el disolvente a 60 000xg. El medio líquido puede ser cualquier medio adecuado, tal como un medio

acuoso, preferiblemente un medio fisiológico, típicamente un medio acuoso tamponado, tal como tampón Tris-HCl 10-50 mM o tampón de fosfato. El medio líquido preferiblemente tiene un pH de 6,4 o superior, tal como 7 o superior, y/o una composición iónica que evita la polimerización del resto potenciador de la solubilidad. Es decir, el medio líquido típicamente presenta un pH de 6,4 o superior, tal como 7 o superior, o una composición iónica que evita la polimerización del resto potenciador de la solubilidad, o ambos.

Las composiciones iónicas que evitan la polimerización del resto potenciador de la solubilidad pueden ser preparadas fácilmente por un especialista en la técnica. Una composición iónica preferida que evita la polimerización del resto potenciador de la solubilidad tiene una fuerza iónica de más de 300 mM. Los ejemplos específicos de composiciones iónicas que evitan la polimerización del resto potenciador de la solubilidad incluyen NaCl por encima de 300 mM, fosfato 100 mM y combinaciones de dichos iones que presenten el efecto preventivo deseado sobre la polimerización del resto potenciador de la solubilidad, p.ej., una combinación de fosfato 10 mM y de NaCl 300 mM.

Se ha descubierto de manera sorprendente que la presencia de un resto potenciador de la solubilidad mejora la estabilidad de la disolución y evita la formación de polímeros en estas condiciones. Esto puede ser ventajoso cuando la polimerización inmediata puede ser indeseable, p.ej., durante la purificación de la proteína, en la preparación de lotes grandes, o cuando es necesario optimizar otras condiciones. Se prefiere que el pH del medio líquido se ajuste a 6,7 ó superior, tal como 7,0 ó superior, para alcanzar una elevada solubilidad de la proteína de fusión. También puede ser ventajoso que el pH del medio líquido se ajuste al rango de 6,4-6,8, lo que proporciona una solubilidad suficiente de la proteína de tela de araña y facilita el posterior ajuste de pH a 6,3 ó inferior.

Otro aspecto de la invención se basa en la observación de que el dominio NT forma grandes estructuras solubles cuando el pH se reduce desde aproximadamente 7 a 6, o más específicamente desde por encima de 6,4 hasta por debajo de 6,3. La formación de dichas estructuras se produce más eficientemente a un pH por encima de 4,2, es decir en el rango de 4,2-6,3, tal como 4,2-6. Esta propiedad puede ajustarse para purificación por afinidad, p.ej., si se inmoviliza NT en una columna. Esta estrategia permite la liberación de proteínas ligadas por un cambio de pH dentro de un intervalo fisiológicamente relevante, ya que la estructura se resolverá cuando el pH sea elevado, desde aproximadamente 6 a 7.

En una realización preferida de los métodos según la invención, la etapa de aislar la proteína de fusión implica la purificación de la proteína de fusión en un medio de afinidad, tal como una columna de afinidad, con un resto NT inmovilizado y/o en un medio de intercambio aniónico, tal como una columna de intercambio aniónico. La purificación de la proteína de fusión en un medio de afinidad se lleva a cabo preferiblemente en asociación a un medio de afinidad con un resto NT inmovilizado a un pH de 6,3 o inferior, preferiblemente en el rango de 4,2-6,3, seguido de la disociación desde el medio de afinidad con un medio de disociación deseado, p.ej., que tenga un pH de 6,4 o superior, un pH de 4,1 o inferior y/o que tenga una elevada fuerza iónica. La purificación de la proteína de fusión en un medio de intercambio aniónico se lleva a cabo de forma preferible en asociación al medio de intercambio aniónico a un pH de 6,4 o superior, seguida de la disociación desde el medio de intercambio aniónico con un medio de disociación que tenga una elevada fortaleza iónica. Si se desea, la purificación de la proteína de fusión en un medio de afinidad, tal como una columna de afinidad, con un resto NT inmovilizado, se puede combinar con la purificación en un medio de intercambio aniónico, tal como una columna de intercambio aniónico. Un medio de disociación que tiene una elevada fortaleza iónica típicamente presenta una fortaleza iónica de más de 300 mM, tal como NaCl por encima de 300 mM.

Estos dos procedimientos basados en afinidad utilizan las propiedades inherentes del resto potenciador de la solubilidad según la invención. De particular interés es la fuerte tendencia de los fragmentos de proteína NT espidroína a asociarse a un pH inferior a 6,3, en particular en el rango de 4,2-6,3. Esto puede utilizarse de forma ventajosa como una potente herramienta de purificación por afinidad, que permite la purificación en una etapa de proteínas de fusión según la invención a partir de mezclas complejas. Aunque la cromatografía es preferible, obviamente se pueden utilizar otros métodos de purificación basados en afinidad, tales como partículas magnéticas con superficies funcionalizadas o filtros con superficies funcionalizadas.

La presente invención se ilustrará adicionalmente a continuación a través de los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1 – Producción de una proteína de fusión SP-C33Leu

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica NT-MetSP-C33Leu como una fusión a His6 (SEQ ID NOS: 26-27). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron durante otras 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM, pH 8.

Se añadió lisozima, y las células se incubaron durante 30 minutos en hielo. Se añadió Tween a una concentración final de 0,7%. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA sepharose, equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, que

contenía un 0,7% de Tween. La columna se lavó con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, que contenía un 0,7% de Tween, y la proteína ligada se eluyó con tampón de Tris-HCl 20 mM, imidazol 300 mM, pH 8, que contenía un 0,7% de Tween.

El eluato se sometió a SDS-PAGE en un gel de Tris-Glicina al 12% en condiciones reductoras. En la Figura 3A se indica con una flecha una banda principal correspondiente a la proteína de fusión. El rendimiento se determinó por mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 64 mg/L. Se concluye que una proteína de fusión que contiene un único resto NT da como resultado un rendimiento sorprendentemente elevado en presencia de detergente en el lisato celular.

Ejemplo 2 – Producción de una proteína de fusión SP-C33Leu

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica NT2-MetSP-C33Leu (es decir, NTNTMetSP-C33Leu) como una fusión a His6 (SEQ ID NOS: 28-29). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merk Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron durante otras 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM, pH 8.

Se añadió lisozima, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. El Tween fue añadido, o no, hasta una concentración final de 0,7%. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA sepharose, equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, ± 0,7% de Tween. La columna se lavó con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, ± 0,7% de Tween, y la proteína ligada se eluyó con tampón de Tris-HCl 20 mM, imidazol 300 mM, pH 8, ± 0,7% de Tween.

El eluato se sometió a SDS-PAGE en un gel de Tris-Glicina al 12% en condiciones reductoras. En la Figura 3B se indica con una flecha una banda principal correspondiente a la proteína de fusión. El rendimiento se determinó por mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 40 mg/L en ausencia de Tween, y de 68 mg/L en presencia de Tween al 0,7%. Se concluye que una proteína de fusión que contiene dos restos NT consecutivos da como resultado un rendimiento sorprendentemente elevado en ausencia de detergente en el lisato celular, y un rendimiento incluso más elevado en presencia de detergente en el lisato celular.

Ejemplo 3 – Producción de proteínas de fusión SP-C33Leu

Se construyeron vectores de expresión que comprenden un gen que codifica NT-MetSP-C33Leu, NT2-MetSP-C33Leu y NT-MetSP-C33Leu-NT, respectivamente. Los vectores se usaron para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merk Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron durante otras 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM, pH 8.

Se añadió lisozima, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. El Tween fue añadido, o no, hasta una concentración final de 0,7%. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. Los lisatos celulares se centrifugaron a 20 000 x g durante 30 minutos.

Ejemplo 4 – Preparación de NT-Sepharose

Se usa una construcción CysHis6T para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merk Biosciences). Las células son cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contiene kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), e incubadas adicionalmente durante hasta 4 horas a temperatura ambiente. Después, las células son recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM, pH 8, suplementado con lisozima y DNasa I. Tras completar la lisis, los sobrenadantes de 15000g son cargados en una columna empaquetada con Ni sepharose (GE Healthcare). La columna se lava intensivamente, y a continuación las proteínas ligadas son eluídas con imidazol 100-300 mM. Las fracciones que contienen las proteínas diana son agrupadas y dializadas contra Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. La proteína Cys-His6-NT purificada es acoplada a tiol Sepharose activada usando un protocolo estándar (GE Healthcare).

Ejemplo 5 – Purificación de proteínas de fusión usando NT Sepharose

Los lisatos procedentes del Ejemplo 3 se cargan en una columna empaquetada con NT sepharose, se pre-equilibran con NaPi 20 mM, pH 6. La columna se lava intensamente con NaPi 20 mM, pH 6, y después se eluyen las proteínas ligadas con NaPi 20 mM, pH 7. Se agrupan las fracciones que contienen las proteínas diana. Las muestras de proteína se separan en geles de SDS-PAGE y a continuación se tiñen con Azul Coomassie Brillante R-250. Se determina el contenido de proteína a partir de la absorbancia a 280 nm.

Ejemplo 6 – Purificación de proteínas de fusión en intercambiador aniónico

Los lisatos celulares procedentes del Ejemplo 3 son cargados en una columna HiTrap Q FF (GE Healthcare), se preequilibran con NaP 20 mM, pH 6,5. La columna se lava intensivamente y a continuación las proteínas ligadas son eluídas con un gradiente lineal de NaCl hasta 1 M. Las fracciones que contienen las proteínas diana son agrupadas. Las muestras de proteína se separan en geles de SDS-PAGE y a continuación se tiñen con Azul Coomassie Brillante R-250. Se determina el contenido de proteína a partir de la absorbancia a 280 nm.

Ejemplo 7 – División y aislamiento de la proteína deseada

Las proteínas de fusión de los Ejemplos 3, 5 y 6 se disuelven en ácido fórmico al 70% en agua, suplementado con 0,1 g/mL de CNBr y se dejan reposar a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de eso se secan las mezclas y se separan en el sistema bifásico cloroformo/metanol/agua, 8:4:3, en volumen. La SP-C33Leu se obtiene en la fase orgánica y puede purificarse posteriormente de forma opcional mediante HPLC de fase inversa usando una columna C18. La actividad de la SP-C33Leu mezclada con fosfolípidos sintéticos se puede evaluar in vitro o in vivo, tal como se describe, p.ej., en J. Johansson et al., J. Appl. Physiol. 95, 2055-2063 (2003).

Ejemplo 8 – Producción de proteína de fusión LL-37

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica NT2-LL37 (es decir, NTNT-LL37) como una fusión a His6 (SEQ ID NOS: 30-31). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merk Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,91, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron durante otras 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM, pH 8.

Se añadió lisozima, y las células se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en una columna de Ni-NTA sepharose, equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 250 mM. La columna se lavó con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 250 mM, y la proteína ligada se eluyó con tampón de Tris-HCl 20 mM, imidazol 300 mM, pH 8.

Ejemplo 9 – Producción de NT-REP4-CT

Se construyó un vector de expresión para producir NT-REP4-CT como fusión N-terminal a His6 (SEQ ID NOS 17-18). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de ~1, inducidas con isopropil-β-Dtiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron hasta 4 horas más a temperatura ambiente. Después de eso, las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) suplementado con lisozima y DNasa I.

Tras completar la lisis, los sobrenadantes de 15000g fueron cargados en una columna empaquetada con Ni sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensivamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían las proteínas diana fueron agrupadas y dializadas contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

Las muestras de proteína se separaron mediante SDS-PAGE y a continuación se tiñeron con Azul Coomassie Brillante R-250. La proteína NT-REP4-CT resultante se concentró mediante ultrafiltración usando un filtro de celulosa con un corte de masa molecular de 5 kDa (Millipore).

Ejemplo 10 – Producción de NT-REP4-CT

Se construyó un vector de expresión para producir NT-REP4-CT como fusión C-terminal a Zbasic (SEQ ID NO 19). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de ~1, inducidas con isopropil-β-Dtiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron hasta 2-4 horas más a temperatura ambiente. Después de eso, las células fueron recolectadas y resuspendidas en fosfato Na 50 mM (pH 7,5) suplementado con lisozima y DNasa I.

Tras completar la lisis, los sobrenadantes de 15000g fueron cargados en un intercambiador catiónico (HiTrap S, GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensivamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con un gradiente contra NaCl 500 mM. Las fracciones que contenían las proteínas diana fueron agrupadas y dializadas contra fosfato Na 50 mM (pH 7,5). La proteína NT-REP4-CT (SEQ ID NO 20) fue liberada de las etiquetas Zbasic mediante división proteolítica usando una relación de proteasa 3C:proteína de fusión de 1:50 (p/p) a 4ºC durante una noche. Para eliminar la etiqueta Zbasic liberada, la mezcla de división se cargó en un segundo intercambiador catiónico, y se recogió el flujo de salida.

Ejemplo 11 – Producción de NT-REP4-CT

Se construyó un vector de expresión para producir NT-REP4-CT como fusión C-terminal a HisTrxHis (SEQ ID NO 21). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de ~1, inducidas con isopropil-β

D-tiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron hasta 2-4 horas más a temperatura ambiente. Después de eso, las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) suplementado con lisozima y DNasa I.

Tras completar la lisis, los sobrenadantes de 15000g fueron cargados en una columna empaquetada con Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensivamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con un gradiente contra NaCl 500 mM. Las fracciones que contenían las proteínas diana fueron agrupadas y dializadas contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). La proteína NT-REP4-CT (SEQ ID NO 22) fue liberada de las etiquetas HisTrxHis mediante división proteolítica usando una relación de trombina:proteína de fusión de 1:1000 (p/p) a 4ºC durante una noche. Para eliminar la HisTrxHis liberada, la mezcla de división se cargó en una segunda columna Ni-Sepharose, y se recogió el flujo de salida.

Ejemplo 12 – Producción de NT2-REP4-CT

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica NT2-REP4-CT (es decir, NTNT-REP4-CT) como fusión a His6 (SEQ ID NOS: 23-24). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), e incubadas durante 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0.

Se añadió lisozima y DNasa, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en una columna de Ni-NTA sepharose, equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8. La columna se lavó con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, y la proteína ligada se eluyó con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, imidazol 300 mM.

El eluato se sometió a SDS-PAGE en un gel de Tris-Glicina al 12% en condiciones reductoras. En la Figura 3C una flecha indica una banda principal correspondiente a la proteína de fusión. El rendimiento se determinó como mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo en matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 30 mg/L. Se concluyó que las proteínas espidroína en miniatura pueden ser expresadas de forma ventajosa como fusiones con dos restos NT.

Ejemplo 13 – Producción de NT-REP4-CT, NT2-REP4-CT y NT-REP8-CT

Se construyen vectores de expresión que comprende un gen que codifica NT-REP4-CT (SEQ ID NOS: 20 y 22), NT2REP4-CT (SEQ ID NO: 23) y NT-REP8-CT (SEQ ID NO: 25), respectivamente. Los vectores se usan para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merk Biosciences) que son cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contiene kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), y se incuban durante otras 3 horas a 25ºC. Las células se recolectan mediante centrifugación y se resuspenden en Tris-HCl 20 mM, pH 8.

Se añade lisozima y las células se incuban durante 30 minutos en hielo. Se añade Tween, o no, hasta una concentración final de 0,7%. Los lisatos celulares son centrifugados a 20 000 x g durante 30 minutos. Se carga una porción de sobrenadante en una columna de intercambio aniónico de acuerdo al Ejemplo 6.

Se prepara un medio de afinidad NT como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se carga otra porción del sobrenadante en una columna de afinidad NT de acuerdo al Ejemplo 5.

Los eluatos de la columna de intercambio aniónico y de la columna de afinidad NT son sometidos a electroforesis de gel.

Ejemplo 14 – Producción de NTHis, NT2-REP8-CT y NT2-Brichos

A) NTHis

Se construyó un vector de expresión para producir NT como fusión N-terminal a His6 (SEQ ID NO 32). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de ~1, inducidas con isopropil-β-Dtiogalactopiranósido (IPTG), y se incubaron adicionalmente durante hasta 4 horas a temperatura ambiente. Después de eso, las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) suplementado con lisozima y DNasa I.

Tras completar la lisis, los sobrenadantes de 15000g fueron cargados en una columna empaquetada con Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían las proteínas diana fueron agrupadas y dializadas contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). Las muestras de proteína fueron separadas mediante SDS-PAGE y teñidas a continuación con Azul Coomassie Brillante R-250. La proteína NT resultante (SEQ ID NO 32) se concentró mediante ultrafiltración usando un filtro de celulosa con un corte de masa molecular de 5 kDa (Millipore). El rendimiento fue de 112 mg/litro de matraz agitado cultivado hasta una DO600 de 1.

B) NT2-REP8-CT

Se construyó un vector de expresión para producir NT2-REP8-CT (NTNT8REPCT) como fusión N-terminal a His6 (SEQ ID NO: 33). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de ~1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), e incubadas adicionalmente durante hasta 4 horas a temperatura ambiente. Después de eso, las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) suplementado con lisozima y DNasa I. Las muestras de proteína fueron separadas mediante SDS-PAGE y teñidas a continuación con Azul Coomassie Brillante R-250.

Tras completar la lisis, los sobrenadantes de 15000g son cargados en una columna empaquetada con Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lava intensamente antes de que las proteínas ligadas sean eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contienen las proteínas diana son agrupadas y dializadas contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). Las muestras de proteína son separadas mediante SDS-PAGE y teñidas a continuación con Azul Coomassie Brillante R-250.

C) NT2-Brichos

Se construyó un vector de expresión para producir NT2-Brichos (NT-NT-Brichos) como fusión N-terminal a His6 (SEQ ID NO: 34). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de ~1, inducidas con isopropil-βD-tiogalactopiranósido (IPTG), e incubadas adicionalmente durante hasta 4 horas a temperatura ambiente. Después de eso, las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) suplementado con lisozima y DNasa I. Además, las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado.

Tras completar la lisis, los sobrenadantes de 15000g fueron cargados en una columna empaquetada con Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían las proteínas diana fueron agrupadas y dializadas contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). Las muestras de proteína fueron separadas mediante SDS-PAGE y teñidas a continuación con Azul Coomassie Brillante R-250. La proteína NT2-Brichos resultante (SEQ ID NO 34) se concentró mediante ultrafiltración usando un filtro de celulosa con un corte de masa molecular de 5 kDa (Millipore). El rendimiento fue de 20 mg/litro de matraz agitado cultivado hasta una DO600 de 1.

Ejemplo 15 – NT para captura reversible dependiente del pH

Propósito: usar NT (y NTNT) inmovilizado covalentemente para capturar de forma reversible proteínas de fusión NT.

Estrategia: investigar la conformación dependiente del pH de proteínas de fusión NT (y NTNT) en fibras (y película) con NT (y NTNT) ligado covalentemente. Como control se usan fibras y películas sin NT.

A) Fibras

Se sumergieron fibras (~0,5 cm de longitud, ~50 µg) de NT-REP4-CT (SEQ ID NO 20), NT2-REP4-CT (SEQ ID NO 23) y REP4-CT (SEQ ID NO 2, control) en 100 µL de disolución de 5 mg/mL de NTHis soluble (SEQ ID NO 32) o NT2-Brichos (SEQ ID NO 34) a pH 8 durante 10 minutos. El pH se redujo mediante la adición de 400 µL de tampón de fosfato sódico (NaP) a pH 6 y se incubó durante 10 minutos para permitir la incorporación de NT soluble a la fibra. Las fibras fueron transferidas a 500 µL de NaP a pH 6, y se lavaron dos veces. Finalmente, las fibras fueron transferidas a 500 µL de NaP a pH 7, y se incubaron 10 minutos para permitir la liberación de NT soluble. Se realizó lo mismo en presencia de NaCl 300 mM en todos los tampones de NaP pH 6. Las muestras de las diferentes disoluciones fueron analizadas en SDS-PAGE.

Usando las fibras NT2-REP4-CT y NT-REP4-CT, se capturaron a pH 6 tanto NTHis como NT2-Brichos. Tras aumentar el pH a 7, se volvió a liberar tanto NTHis como NT2-Brichos y se pudieron detectar en SDS-PAGE. La adición de NaCl 300 mM disminuyó la captura a pH 6.

B) Película:

Se prepararon películas de NT-REP4-CT (SEQ ID NO 20) y REP4-CT (SEQ ID NO 2, control) moldeando 50 µL de una disolución de proteína de 3 mg/mL en un pocillo de plástico y dejando secar durante la noche. Al siguiente día, se añadieron 100 µL de disolución de 5 mg/mL de NTHis soluble (SEQ ID NO 32) a pH 8 a los pocillos con película, y se dejó reposar durante 10 minutos. A continuación se redujo el pH hasta 6 mediante la adición de 400 µL de NaP y se incubó durante 10 minutos para permitir la incorporación de NT soluble a la película. Después se lavaron las películas dos veces con 500 µL de NaP a pH 6. Para la liberación de NTHis soluble, se añadieron 500 µL de NaP a pH 7 y se incubó durante 10 minutos. Se realizó lo mismo en presencia de NaCl 300 mM en todos los tampones de NaP pH 6. Se analizaron muestras de las diferentes disoluciones en SDS-PAGE.

El análisis en SDS-PAGE mostró que una película de NT-REP4-CT permitió la captura de NTHis a pH 6 y su liberación al aumentar el pH a 7.

Ejemplo 16 – NT para formación reversible dependiente de pH de proteínas de fusión

Propósito: usar NT como etiqueta reversible que permita el análisis de la interacción entre restos de proteína, p.ej., analizar la interacción de Brichos con dianas con estructuras de lámina beta, p.ej., proteína tensioactiva C (SP-C).

Se mezcla NT2-Brichos (SEQ ID NO 34) con NT2-MetSP-C33Leu (SEQ ID NO 28) o NTHis (SEQ ID NO 32) hasta un volumen total de 100 µL a pH 8. Se añade tampón de NaP (400 µL) para generar un pH final de 6, y la mezcla se incuba durante 20 minutos para permitir la formación de NT. Entonces se eleva nuevamente el pH hasta pH 7 para permitir la reversión de la formación de NT. Se analizan muestras de las diferentes disoluciones en gel nativo y en cromatografía de exclusión de tamaño (SEC).

Ejemplo 17 – División de Nt-MetSP-C33Leu y aislamiento de SP-C33Leu

Se disolvieron aproximadamente 58 mg de HisNT-MetSP-C33Leu liofilizada (SEQ ID NO: 26) obtenida en el Ejemplo 1 en 3 mL de ácido fórmico al 70% en agua sometiendo a vórtice y sonicación. A dicha disolución se añadieron 200 µL de CNBr 5 M en acetonitrilo, y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 24 h. Después de eso, los disolventes fueron evaporados en una corriente de nitrógeno, y el residuo se lavó tres veces mediante solubilización en ácido fórmico al 70% en agua y secado en atmósfera de nitrógeno.

A continuación se añadió al residuo seco 4,56 mL de cloroformo/metanol/agua (8:4:3, en volumen), tras lo cual la mezcla se llevó a vórtice y se centrifugó. Se retiró la fase superior y se añadió 1 mL de cloroformo/metanol/agua (8:4:3, en volumen) a la fase inferior, y se repitió el vórtice, la centrifugación y la eliminación de la fase superior. Las dos fases superiores se combinaron y se secaron a vacío. La fase inferior se secó en atmósfera de nitrógeno.

El contenido de la fase inferior (calle izquierda) y superior (calle derecha) se analizó mediante SDS-PAGE (Figura 4). Esto demostró que la fase inferior contiene una banda principal con una masa molecular estimada que coincide bien con la de SP-C33Leu. La identidad de SP-C33Leu se confirmó mediante espectrometría de masas ESI y secuenciamiento de aminoácidos, que mostró una masa monoisotópica de 3594,6 Da (calculada 3594,4) y la secuencia de aminoácidos esperada.

Ejemplo 18 – Análisis de actividad superficial de la mezcla SP-C33Leu/fosfolípido

Se disolvió 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)/1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPG) (68:31, p/p) en cloroformo:metanol (1:1, v/v) y se mezcló con SP-C33Leu (obtenida en el Ejemplo 17) en el mismo disolvente. El contenido de péptido en las preparaciones fue del 2% referido al peso de fosfolípido. Los disolventes fueron evaporados con nitrógeno, y las preparaciones fueron resuspendidas en disolución salina hasta una concentración final de fosfolípido de 10 mg/mL mediante rotación lenta a 37ºC.

Se midió la tensión superficial por triplicado en un alveolo mediante surfactómetro de burbuja cautiva (CBS) (Schurch S et al., J. Appl. Physiol. 67: 2389-2396, 1989). En el CBS, están presentes el tensioactivo y una burbuja de aire que representa el alveolo pulmonar en una cámara cerrada hermética. Para evaluar la actividad superficial en circunstancias dinámicas, la cámara es comprimida y se puede calcular la tensión superficial estudiando la forma y la relación altura/anchura de la burbuja.

En el experimento, se insertaron 2 µL de la preparación tensioactiva de SP-C33Leu (10 mg/mL) en la cámara de ensayo rellena de sacarosa. Tras la inserción, se creó una burbuja de aire y se midió la tensión superficial durante cinco minutos de adsorción. En los siguientes experimentos cíclicos cuasi-estáticos, la burbuja se comprimió por etapas desde el volumen inicial hasta alcanzar una tensión superficial inferior a 5 mN/m, alternativamente hasta una compresión de área máxima del 50%, y después se expandió durante cinco ciclos.

Los resultados se muestran en la Figura 5, en donde se presentan el primer y el quinto ciclo de un ejemplo representativo de las tres medidas realizadas. La actividad superficial de la mezcla SP-C33Leu/DPPC/POPG (Figura 5) fue muy similar a la de la SP-C33 sintética en la misma mezcla de fosfolípidos, véase p.ej., Johansson et al, J. Appl. Physiol., 95: 2055-2063 (2003).

Ejemplo 19 – Producción de una proteína de fusión SP-C33Leu

A) sin NT (ejemplo comparativo)

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica Tiorredoxina(TRX)-SP-C33Leu como fusión a 2xHis6 (SEQ ID NOS: 35-36). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), e incubadas durante 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

Se añadió lisozima, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. Se añadió Tween hasta una concentración final de 0,7%. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en una columna empaquetada de Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia), equilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8) + 0,7% de Tween. La columna se lavó intensamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con imidazol 300 mM + 0,7% de Tween.

La proteína diana se eluyó con imidazol 300 mM + 0,75 de Tween y se analizó mediante SDS-PAGE (Figura 6A). El eluato contenía una cantidad pequeña e impura de proteína diana.

B) con NT

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica TRX-NT-SP-C33Leu como fusión a 2xHis6 (SEQ ID NOS: 37-38). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con IPTG, e incubadas adicionalmente durante 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

Se añadió lisozima, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. Se añadió Tween hasta una concentración final de 0,7%. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en una columna empaquetada de Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia), equilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8) + 0,7% de Tween. La columna se lavó intensamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con imidazol 300 mM + 0,7% de Tween. Las fracciones que contenían las proteínas de fusión se agruparon y se dializaron contra agua desionizada.

El eluato se sometió a SDS-PAGE en un gel de Tris-Glicina al 12% en condiciones reductoras. En la Figura 6B una flecha indica una banda principal que corresponde a la proteína. El rendimiento se determinó como mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 30 mg/L.

Ejemplo 20 – Producción de Brichos

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica NT2-Brichos (es decir, NTNT-Brichos) como fusión a His6LinkHis6 (SEQ ID NOS: 39-40). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con IPTG, e incubadas adicionalmente durante 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

Se añadió lisozima, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en una columna empaquetada de Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían las proteínas de fusión se agruparon y se dializaron contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

El eluato se sometió a SDS-PAGE en un gel de Tris-Glicina al 12% en condiciones reductoras. En la Figura 7 una flecha indica una banda principal que corresponde a la proteína de fusión. El rendimiento se determinó como mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 28 mg/L de la proteína de fusión.

La proteína Brichos (SEQ ID NO: 41) se libera de las etiquetas 2His6NT2 mediante ruptura proteolítica usando una relación de proteasa 3C:proteína de fusión de 1:100 (p/p) a 4ºC. Para eliminar la etiqueta 2His6NT2, la mezcla de división se carga en una segunda Ni-Sepharose, y se recoge el flujo de salida.

Ejemplo 21 – Producción de Proteína Fluorescente Verde (GFP)

La GFP utilizada en este ejemplo es una variante S147P, ver Kimata, Y et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.

232: 69-73 (1997).

A) con NT

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica NT2-GFP (es decir, NTNT-GFP) como fusión a His6LinkHis6 (SEQ ID NOS: 42-43). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con IPTG, e incubadas adicionalmente durante 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

Se añadió lisozima, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en una columna empaquetada de Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensamente antes de que las proteínas ligadas fueran eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían las proteínas de fusión se agruparon y se dializaron contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). La proteína GFP (SEQ ID NO: 44) se liberó de las etiquetas 2His6NT2 mediante ruptura proteolítica usando una relación de proteasa 3C:proteína de fusión de 1:100 (p/p) a 4ºC. Para eliminar la etiqueta 2His6NT2, la mezcla de división se cargó en una segunda Ni-Sepharose, y se recogió el flujo de salida.

Los eluatos se sometieron a SDS-PAGE en un gel de Tris-Glicina al 12% en condiciones reductoras (Figura 8). En la Figura 8 las flechas indican bandas principales correspondientes a la proteína de fusión (primer eluato, calle izquierda) y la proteína diana (segundo eluato, calle derecha). El rendimiento se determinó como mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 44 mg/L de la proteína de fusión y de 16 mg/L de la proteína diana.

La GFP purificada era altamente fluorescente, lo que confirma el plegamiento correcto (barril beta con enlace a hélice alfa) que es obligado para la formación autocatalítica del cromóforo.

B) con otras etiquetas de purificación: Zb y His6ABP (ejemplo comparativo)

Se cultivaron células BL21(DE3) que albergan los vectores (pT7ZbGFP, pT7His6ABPGFP) durante una noche a 37ºC en medio de caldo de soja tríptico suplementado con kanamicina. A la mañana siguiente los cultivos fueron inoculados en 100 mL de medio fresco en matraces de agitación de 1 litro y se cultivaron hasta alcanzar una DO600 de 1. A continuación se indujo la producción de proteína mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 1 mM, y la producción continuó durante 18 h. Las células fueron recolectadas y resuspendidas en tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,5). Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 3 minutos, alternando 1 segundo encendido y 1 segundo apagado. El lisato celular se centrifugó a 10 000 x g durante 20 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en columnas.

La proteína de fusión ZbGFP (SEQ ID NO: 45) se purificó en columnas HiTrap S HP de 1 mL en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, y se eluyó con el mismo tampón suplementado con NaCl 160 mM.

La proteína de fusión His6ABPGFP (SEQ ID NO: 46) se purificó en columnas Talon de 1 mL en fosfato sódico 50 mM, pH 8, y se eluyó con el mismo tampón suplementado con ácido acético 30 mM y acetato sódico 70 mM, lo que proporciona un pH de 5,0.

Los eluatos fueron sometidos a SDS-PAGE en un gel de gradiente 10-20% en condiciones reductoras. El rendimiento se determinó como mg de proteína purificada/1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 10 mg/L para ZbGFP y de 7 mg/L para His6ABPGFP.

Ejemplo 22 – Producción de neuroserpina

Se construyó un vector de expresión que comprende un gen que codifica NT2-Neuroserpina (es decir, NTNT-Neuroserpina) como fusión a His6LinkHis6 (SEQ ID NOS: 47-48). El vector se usó para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merck Biosciences) que fueron cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con IPTG, e incubadas adicionalmente durante 3 horas a 25ºC. Las células fueron recolectadas y resuspendidas en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

Se añadió lisozima, y las células fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. Las células fueron perturbadas mediante sonicación en hielo durante 5 minutos, alternando 2 segundos encendido y 2 segundos apagado. El lisato celular se centrifugó a 20 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargaron en una columna empaquetada con Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La columna se lavó intensamente antes de que las proteínas de fusión fueran eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían las proteínas de fusión se agruparon y se dializaron contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

La proteína neuroserpina (SEQ ID NO: 49) se liberó de las etiquetas 2His6NT2 mediante ruptura proteolítica usando una relación de proteasa 3C:proteína de fusión de 1:100 (p/p) a 4ºC. Para eliminar la etiqueta 2His6NT2, la mezcla de división se cargó en una segunda Ni-Sepharose, y se recogió el flujo de salida.

Los eluatos se sometieron a SDS-PAGE en un gel de Tris-Glicina al 12% en condiciones reductoras (Figura 9). En la Figura 9 las flechas indican bandas principales correspondientes a la proteína de fusión (primer eluato, calle izquierda) y la proteína diana (segundo eluato, calle derecha). El rendimiento se determinó como mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1. El rendimiento fue de 8 mg/L de la proteína de fusión y de 4 mg/L de la proteína diana. A modo de comparación, el rendimiento de expresión de neuroserpina con etiqueta His6 fue de 1,7 mg/L (Belorgey et al. Eur. J. Biochem. 271(16): 3360-3367 (2004)).

Se determinó que la tasa de inhibición de tPa (activador de plasminógeno de tejido) por la neuroserpina expresada era igual que la publicada previamente (Belorgey et al., J. Biol. Chem. 277, 17367-17373 (2002)).

Ejemplo 23 – Producción de proteínas de fusión de proteasa 3C

Se construyen vectores de expresión que comprenden un gen que codifica His6NT-3C y His6LinkHis6NTNT3C,

5 respectivamente (Gräslund T. et al., Protein Expr. Purif. 9(1): 125-132 (1997); Cordingley M.G. et al., J. Virol. 63(12): 5037-5045 (1989)). Los vectores se usan para transformar células BL21(DE3) de Escherichia coli (Merk Biosciences) que son cultivadas a 30ºC en medio Luria-Bertani que contiene kanamicina hasta una DO600 de 0,9-1, inducidas con IPTG, y se incuban durante otras 3 horas a 25ºC. Las células se recolectan y se resuspenden en Tris-HCl 20 mM (pH 8).

10 Se añade lisozima y DNasa, y las células se incuban durante 30 minutos en hielo. Las células son perturbadas mediante sonicación en hielo durante 3 minutos, alternando 1 segundo encendido y un 1 segundo apagado. El lisato celular se centrifuga a 15 000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se cargan en una columna empaquetada con Ni-Sepharose (GE Healthcare, Uppsala, Suecia), equilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). La columna se lava intensivamente antes de que las proteínas ligadas sean eluídas con imidazol 300 mM. Las fracciones que contienen

15 las proteínas de fusión se agrupan y se dializan contra agua desionizada. El eluato es sometido a SDS-PAGE en condiciones reductoras. El rendimiento se determina como mg de proteína purificada a partir de 1 litro de cultivo de matraz agitado desarrollado hasta una DO600 de 1.

Listado de secuencias

<110> Spiber Technologies AB 5 <120> PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Y POLIPÉPTIDOSS

<130> PC-21046889

<150> EP 10156927 10 <151>

<150> PCT/SE2010/050439

<151> 15 <160> 49

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 20 <211> 149

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 1 25

<210> 2

<211> 265 30 <212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(167)

<223>: fragmento REP 5

<220>

<221> DOMINIO

<222> (168)..(265)

<223>: fragmento CT 10

<400> 2

<210> 3

<211> 296 5 <212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<220>

<221>: DOMINIO 10 <222> (1)..(137)

<223> fragmento NT

<220>

<221>: DOMINIO 15 <222> (138)..(296)

<223> fragmento REP

<400> 3

<210> 4

<211> 340 5 <212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<220>

<221>: DOMINIO 10 <222> (1)..(137)

<223> fragmento NT

<220>

<221>: DOMINIO 15 <222> (138)..(340)

<223> fragmento REP

<400> 4

<210> 5

<211> 424 5 <212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<220>

<221>: DOMINIO 10 <222> (1)..(136)

<223> fragmento NT

<220>

<221>: DOMINIO 15 <222> (137)..(313)

<223> fragmento REP

<220>

<221>: DOMINIO 20 <222> (314)..(411)

<223> fragmento CT

<220>

<221>: DOMINIO 25 <222> (412)..(424)

<223> His tag

<400> 5

<210> 6

<211> 137 5 <212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<220>

<221> VARIANTE 10 <222> (6)..(6)

<223> deleción (deltaHis)

<400> 6

<210> 7

<211> 98

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 7

<210> 8

<211> 131

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de consenso derivada de fragmentos de espidroína NT

20 <220>

<221> VARIANTE

<222> (20)..(20)

<223> Leu

25 <220>

<221> VARIANTE

<222> (42)..(42)

<223> Asn

30 <220>

<221> VARIANTE

<222> (42)..(42)

<223> Gln

<220>

<221>: VARIANTE 5 <222> (50)..(50)

<223> Ser

<220>

<221>: VARIANTE 10 <222> (50)..(50)

<223> Lys

<220>

<221>: VARIANTE 15 <222> (56)..(56)

<223> Arg

<220>

<221>: VARIANTE 20 <222> (84)..(84)

<223> Leu

<220>

<221>: VARIANTE 25 <222> (114)..(114)

<223> Ser

<220>

<221>: VARIANTE 30 <222> (121)..(121)

<223> Asn

<220>

<221>: VARIANTE 35 <222> (123)..(123)

<223> Leu

<220>

<221>: VARIANTE 40 <222> (124)..(124)

<223> Ser

<400> 8

<210> 9

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Secuencia de consenso derivada de proteínas conocidas MaSp1 y MaSp2 10

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(71)

<223>: Longitud de secuencia presente en variantes de especies conocidas 15

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7)..(7)

<223>: Glu 20

<400> 9

<210> 10

<211> 1110

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

5 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (7)..(19)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (20)..(42)

<220>

<221> REPETICIÓN 15 <222> (43)..(56)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (57)..(70)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (71)..(83)

25 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (84)..(106)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (107)..(120)

<220>

<221> REPETICIÓN 35 <222> (121)..(134)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (135)..(147)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (148)..(170)

45 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (171)..(183)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (184)..(197)

<220>

<221> REPETICIÓN 55 <222> (198)..(211)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (212)..(234)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (235)..(248)

65 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (249)..(265)

<220>

<221> REPETICIÓN 5 <222> (266)..(279)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (280)..(293)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (294)..(306)

15 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (307)..(329)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (330)..(342)

<220>

<221> REPETICIÓN 25 <222> (343)..(356)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (357)..(370)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (371)..(393)

35 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (394)..(406)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (407)..(420)

<220>

<221> REPETICIÓN 45 <222> (421)..(434)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (435)..(457)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (458)..(470)

55 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (471)..(488)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (489)..(502)

<220>

<221> REPETICIÓN 65 <222> (503)..(516)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (517)..(529)

5 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (530)..(552)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (553)..(566)

<220>

<221> REPETICIÓN 15 <222> (567)..(580)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (581)..(594)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (595)..(617)

25 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (618)..(630)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (631)..(647)

<220>

<221> REPETICIÓN 35 <222> (648)..(661)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (662)..(675)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (676)..(688)

45 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (689)..(711)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (712)..(725)

<220>

<221> REPETICIÓN 55 <222> (726)..(739)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (740)..(752)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (753)..(775)

65 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (776)..(789)

<220>

<221> REPETICIÓN 5 <222> (790)..(803)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (804)..(816)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (817)..(839)

15 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (840)..(853)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (854)..(867)

<220>

<221> REPETICIÓN 25 <222> (868)..(880)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (881)..(903)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (904)..(917)

35 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (918)..(931)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (932)..(945)

<220>

<221> REPETICIÓN 45 <222> (946)..(968)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (969)..(981)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (982)..(998)

55 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (999)..(1013)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1014)..(1027)

<220>

<221> REPETICIÓN 65 <222> (1028)..(1042)

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1043)..(1059)

5 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1060)..(1073)

<220> 10 <221> REPETICIÓN

<222> (1074)..(1092)

<400> 10

<210> 11

<211> 23 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Consensus sequence derived from internal REPETICIÓNs of Euprosthenops australis MaSp1 10

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4)..(4)

<223>: Ser 15

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)..(8)

<223>: Tyr 20

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223>: Gln 25

<400> 11

<210> 12 5 <211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Secuencia de consenso derivada de repeticiones internas de Euprosthenops australis MaSp1

<220>

<221> VARIANTE

<222>: (9)..(9) 15 <223> Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222>: (14)..(14) 20 <223> Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222>: (16)..(16) 25 <223> Gly

<400> 12

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 35

<220>

<223> Secuencia de consenso derivada de repeticiones internas de Euprosthenops australis MaSp1

<220>: 40 <221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> Gln

<220>: 45 <221> VARIANTE

<222> (6)..(6)

<223> Arg

<220>: 50 <221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> Ser

<220>: 55 <221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> Val

<400> 13

5 <210> 14

<211> 888

<212> ADN

<213> Euprosthenops australis

10 <400> 14

<210> 15 15 <211> 1272

<212> ADN

<213> Euprosthenops australis

<400> 15 20

<210> 16

<211> 1020

<212> ADN

<213> Euprosthenops australis

<400> 16

<210> 17

<211> 422

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 17

<210> 18

<211> 1266

<212> ADN

<213> Euprosthenops australis

<400> 18

5 <210> 19

<211> 491

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

10 <400> 19

<210> 20

<211> 411

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 20

<210> 21

<211> 551

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 21

<210> 22

<211> 412

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 22

<210> 23

<211> 534

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 23

<210> 24

<211> 1602

<212> ADN

<213> Euprosthenops australis

<400> 24

<210> 25

<211> 514

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 25

<210> 26

<211> 176 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 26 <210> 27

<211> 528 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 27

<210> 28

<211> 309

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

5

<220>

<223> Proteína de fusión

<400> 28

10

<210> 29

<211> 927 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 29 <210> 30

<211> 313 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 30 <210> 31

<211> 939 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 31

<210> 32

<211> 158

<212> PRT

<213> Euprosthenops australis

<400> 32

<210> 33

<211> 646

<212> PRT 15 <213> Euprosthenops australis

<400> 33

<210> 34

<211> 387 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 34

<210> 35

<211> 178 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 35

<210> 36

<211> 537

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión

<400> 36

10

<210> 37

<211> 313

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> Proteína de fusión

<400> 37

20

<210> 38

<211> 939 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 38 <210> 39

<211> 410 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 39

<210> 40

<211> 1233 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 40

<210> 41

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

10

<210> 42

<211> 537

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> Proteína de fusión

<400> 42

20

<210> 43

<211> 1620 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 43

<210> 44

<211> 243

<212> PRT

<213> Aequorea victoria

<400> 44

5 <210> 45

<211> 307

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Proteína de fusión

<400> 45

<210> 46

<211> 368 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 46 <210> 47

<211> 692 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 47

<210> 48

<211> 2085 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión 10

<400> 48

<210> 49

<211> 398

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende

(i)

al menos un resto potenciador de la solubilidad que deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña; y

(ii)

al menos un resto que es una proteína deseada no espidroína, o polipéptido, seleccionada del grupo que consiste en proteínas y polipéptidos formadores de amiloide, SP-B y variantes de la misma que contienen disulfuro, apolipoproteínas, proteínas y polipéptidos de membrana, fármacos de proteína y polipéptido, proteínas y polipéptidos propensos a la agregación, y proteasas,

en donde cada resto potenciador de la solubilidad está unido directa o indirectamente, con secuencias implicadas seleccionadas entre péptidos ligandos y/o restos potenciadores de la solubilidad adicionales, al resto de proteína o polipéptido deseado no espidroína, y en donde cada resto potenciador de la solubilidad tiene al menos un 80% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 6, o al menos un 50% de identidad con respecto a la SEQ ID NO 8.
2.

Una proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde la proteína o polipéptido deseado no espidroína tiene menos de un 30% de identidad con respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 6-10.
3.

Una proteína de fusión según cualquier reivindicación precedente, en donde cada resto potenciador de la solubilidad contiene entre 100 y 160 residuos de aminoácido.
4.

Una proteína de fusión según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína de fusión comprende al menos dos restos potenciadores de la solubilidad, cada uno de los cuales deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña.
5.

Una proteína de fusión según cualquier reivindicación precedente, que además comprende

(iii) al menos un sitio de división dispuesto entre al menos un resto de proteína o polipéptido deseado no espidroína y al menos un resto potenciador de la solubilidad.
6.

Una proteína de fusión según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína o polipéptido deseado no espidroína se selecciona del grupo que consiste en Aβ-péptido, IAPP, PrP, α-sinucleína, calcitonina, prolactina, cistatina, ATF y actina; SP-B y variantes de la misma, mini-BLeu, α-defensinas y β-defensinas; apolipoproteínas de clase A-H; LL-37, SP-C y variantes de la misma, SP-C33, SP-C33Leu, Brichos, GFP, neuroserpina; hormonas, que incluyen EPO y hormona del crecimiento (HC), y factores de crecimiento, que incluyen IGF-I e IGF-II; avidina y estreptavidina; y proteasa 3C.
7.

Una proteína de fusión según la reivindicación 6, en donde la proteína o polipéptido deseado no espidroína se selecciona de SP-B y variantes de la misma, y SP-C y variantes de la misma.
8.

Una proteína de fusión según la reivindicación 7, en donde la proteína o polipéptido deseado no espidroína es mini-BLeu.
9.

Una proteína de fusión según la reivindicación 7, en donde la proteína o polipéptido deseado no espidroína es SP-C33Leu.
10.

Una proteína de fusión según cualquier reivindicación precedente, seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS 26, 28, 30, 34, 37, 39, 42 y 47; y de proteínas que tengan al menos un 80% de identidad con respecto a cualquiera de dichas proteínas.
11.

Un ácido nucleico aislado seleccionado del grupo que consiste en ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión según cualquier reivindicación precedente y las SEQ ID NOS 27, 29, 31, 38, 40, 43 y 48.
12.

El uso de al menos un resto que se deriva del fragmento N-terminal (NT) de una proteína de tela de araña como resto potenciador de la solubilidad en una proteína de fusión para la producción de una proteína o polipéptido deseado no espidroína; en donde cada resto potenciador de la solubilidad tiene una identidad de al menos el 80% con respecto a la SEQ ID NO 6, o una identidad de al menos el 50% con respecto a la SEQ ID NO 8.
13.

Un método para la producción de una proteína de fusión o de una proteína o polipéptido deseado no espidroína, que comprende las siguientes etapas:

a) expresar en un hospedante adecuado una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10; y

b) obtener una mezcla que contenga la proteína de fusión, y opcionalmente aislar la proteína de fusión.
14.

Un método para la producción de una proteína o polipéptido deseado no espidroína según la reivindicación 13, en donde la proteína de fusión comprende además (iii) al menos un sitio de división dispuesto entre al menos un resto de proteína o polipéptido deseado no espidroína y al menos un resto potenciador de la solubilidad; y

en donde dicho método comprende además las siguientes etapas: c) dividir la proteína de fusión para proporcionar la proteína o polipéptido deseado no espidroína; y d) aislar la proteína o polipéptido deseado no espidroína.
15.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en donde la etapa b) implica además la purificación de la proteína de fusión en un medio de afinidad con un resto NT inmovilizado y/o un medio de intercambio aniónico.