ES2621208T3 - Métodos para purificar análogos de eritropoyetina que tienen punto isoeléctrico más bajo - Google Patents

Métodos para purificar análogos de eritropoyetina que tienen punto isoeléctrico más bajo Download PDF

Info

Publication number
ES2621208T3
ES2621208T3 ES12841143.6T ES12841143T ES2621208T3 ES 2621208 T3 ES2621208 T3 ES 2621208T3 ES 12841143 T ES12841143 T ES 12841143T ES 2621208 T3 ES2621208 T3 ES 2621208T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
regulator
fraction
erythropoietin
chromatography
anion exchange
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12841143.6T
Other languages
English (en)
Inventor
Yeo-Wook Koh
Sang-Yong Lee
Cook-Hee KIM
Seung-Hui Lee
Ha-Na Kim
Su-Yon Kim
Jin-Hyun SEONG
Yong-Hyun Cho
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chong Kun Dang Corp
Original Assignee
Chong Kun Dang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chong Kun Dang Corp filed Critical Chong Kun Dang Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2621208T3 publication Critical patent/ES2621208T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un método para purificar un análogo de eritropoyetina (EPO) que tiene un punto isoeléctrico por debajo de 4, que es una nueva proteína estimuladora de eritropoyesis (NESP) que tiene cinco cadenas de azúcar enlazadas a N que comprende: (a) Obtener una solución pretratada mediante la eliminación de células animales de una solución de cultivo de las células animales, en donde las células animales expresan el análogo de eritropoyetina que tiene un punto isoeléctrico por debajo de 4; (b) Obtener una primera fracción que comprende el análogo de eritropoyetina sometiendo la solución pretratada a una primera cromatografía de intercambio aniónico, en donde se usa un regulador de pH por debajo de 4,0 como regulador de lavado en la primera cromatografía de intercambio aniónico; (c) Obtener una segunda fracción que comprende el análogo de eritropoyetina sometiendo la primera fracción a cromatografía de hidroxiapatita; y (d) Obtener una tercera fracción que comprende el análogo de eritropoyetina sometiendo la segunda fracción a una segunda cromatografía de intercambio aniónico, en la que se usa un regulador de pH 2,0-4,0 como regulador de lavado en la segunda cromatografía de intercambio aniónico.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Metodos para purificar analogos de eritropoyetina que tienen punto isoelectrico mas bajo Antecedentes de la invencion Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo para purificar un analogo de eritropoyetina que tiene un bajo punto isoelectrico por debajo de 4 mediante la adicion de una cadena de azucar enlazada a N con alta pureza.
Estado de la tecnica
La eritropoyetina es un factor estimulante de la eritropoyesis que promueve la produccion de globulos rojos mediante la estimulacion de celulas madre hematopoyeticas y que facilita su diferenciacion en eritrocitos. La eritropoyetina (o EPO) es una glicoprotema que tiene tres cadenas de azucar enlazadas a N y una cadena de azucar enlazada a O y se usa para tratar la anemia en pacientes con enfermedad renal cronica, cancer y similares. El numero de residuos de acido sialico en las cadenas de azucar de la EPO afecta la semivida y la actividad biologica de la EPO en la sangre. Una isoforma que tiene un mayor numero de residuos de acido sialico tiene una actividad biologica mas alta a medida que se suprime la degradacion de la EPO (Egrie JC y Browne JK., Br. J. Cancer, 2001; 84, 3-10 y Egrie et al., Glycoconj. J., 1993; 10: 263 - 269).
Recientemente, se ha producido una nueva protema estimulante de la eritropoyesis (NESP), que es un analogo de eritropoyetina con un bajo punto isoelectrico, obtenido anadiendo cadenas de azucar enlazadas a N a la eritropoyetina de origen natural mediante modificacion genetica con el fin de aumentar la actividad biologica. La darbepoetina alfa es una NESP actualmente disponible como farmaco (Egrie y Browne, Br. J. Cancer. 84 suplemento 1, 3-10 (2001)). NESP es una glicoprotema que consta de 165 aminoacidos. Mientras que la EPO de origen natural tiene hasta 14 residuos de acido sialico, la NESP tiene hasta 18 o 22 residuos de acido sialico anadiendo cadenas de azucar enlazados a N. El acido sialico es un acido de azucar. A medida que aumenta el numero de residuos de acido sialico como resultado de la adicion de las cadenas de azucar enlazadas a N, la molecula de NESP tiene por lo tanto un punto isoelectrico mas bajo (pi) (Rush RS, et al., Anal. Chem., 1995; 67: 1441-52).
Dado que la NESP obtenida por adicion de los residuos de acido sialico tiene una semivida 3 veces mas larga en suero en comparacion con la eritropoyetina recombinante existente, se puede esperar un efecto terapeutico equivalente con menos administraciones cuando se trata la anemia de pacientes con enfermedad renal cronica. El contenido de acido sialico de la EPO esta directamente relacionado con la duracion de la liberacion del farmaco in vivo y, por lo tanto, se considera una propiedad importante de la glicoprotema. El residuo de acido sialico en el terminal de la cadena de azucar de EpO protege el segundo residuo de galactosa de la cadena de azucar, inhibiendo asf la degradacion del residuo de galactosa por el receptor de hepatocitos, prolongando la semivida de EPO in vivo y mejorando su actividad biologica (Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4202 - 4206 (1974), Lowy et al., Nature 185, 102 - 103 (1960)).
Un metodo para producir EPO usando celulas animales se describe en la siguiente patente. El registro de patente coreano No. 10-0423615 describe un metodo para producir eritropoyetina cultivando celulas productoras de EPO en un matraz o rodillo exento de suero y purificandolas secuencialmente mediante cromatograffa de adsorcion de Sefarosa Azul, cromatograffa hidrofobica, cromatograffa de intercambio anionico y cromatograffa lfquida de alta velocidad. Sin embargo, esta patente no describe un metodo para producir NESP, y el procedimiento de purificacion que implica los cuatro procesos cromatograficos descritos en la patente es complicado.
Ademas, se describe el uso de cromatograffa de inmunoadsorcion en los registros de patente coreana Nos. 100153808 y 10-0900013, el uso de cromatograffa de afinidad en los registros de patente coreana Nos. 10-0390325 y 10-0423615 y el uso de cromatograffa de fase inversa en los registros de patente coreana Nos. 10-0065197 y 100423615, la publicacion de patente coreana No. 10-2004-0065567 y el registro de patente coreana No. 10-0900033. Ademas, se describe el uso de la cromatograffa hidrofoba en los registros de patente coreana Nos. 10-0344059 y 10-0567448, y el uso de la cromatograffa de intercambio ionico por lotes en el registro de patente coreana No. 100297927. Por ultimo, se describe el uso de cromatograffa de hidroxiapatita en los registros de patente coreana Nos. 10-0390325 y 10-0900013 y en la patente estadounidense No. 7.619.073. Aunque las tecnicas anteriormente descritas describen la purificacion de EPO, no describen la purificacion de NESP que tiene un punto isoelectrico mas bajo que el de la EPO.
Mientras tanto, la patente estadounidense No. 7.217.689 que describe material de NESP, describe el uso de cromatograffa de intercambio anionico en los Ejemplos.
El documento WO2010/008823 A2 describe el uso de cromatograffa de intercambio anionico o adsorcion junto con cromatograffa de intercambio cationico para la purificacion de NESP. En particular, esta publicacion propone un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
metodo para separar isoformas que tienen mas residuos de acido sialico a traves de cromatograffa de intercambio cationico.
El documento WO2005/121173 A1 describe un metodo para el enriquecimiento de EPO en una mezcla de protemas, que comprende las siguientes etapas a)-c) llevadas a cabo en el orden dado: a) una primera cromatograffa de intercambio anionico; b) una cromatograffa de afinidad, una cromatograffa de interaccion hidrofoba y una cromatograffa de hidroxiapatita, en donde las etapas de purificacion cromatografica dentro de la etapa b) pueden llevarse a cabo en cualquier orden; y c) una segunda cromatograffa de intercambio anionico. El documento WO2005 /121173 A1 utiliza necesariamente al menos 5 etapas de cromatograffa seleccionadas de entre cromatograffa de intercambio anionico, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de interaccion hidrofoba, y cromatograffa de hidroxiapatita, que deben realizarse en orden.
El documento WO2011/024024 A1 describe un procedimiento para recuperar la darbepoetina alfa recombinante (que tiene 5 cadenas de azucar enlazadas a N) a partir de sobrenadantes de cultivo celular. Tambien se describe en el documento WO2011/024024 A1 un metodo de recuperacion que contiene las siguientes etapas obligatorias de cromatograffa: (i) una etapa de cromatograffa de intercambio anionico (pH del regulador 6,8-7,2) seguida por (ii) una cromatograffa de intercambio cationico debil (pH del regulador 6,8-7,2) en el modo de flujo seguido por (iii) una cromatograffa de intercambio cationico fuerte (pH del regulador 3,6-4,5) en modo de enlace y de elucion. El documento WO2011/024024 A1 no contiene ninguna descripcion de una etapa de cromatograffa de hidroxiapatita.
La tesis de Stefan Nahrgang (No. 2608 (2002-01-01)), denominada "Influencia de la lmea celular y de las condiciones del proceso sobre la glicosilacion de protemas recombinantes" describe entre otras cosas la purificacion de formas altamente sialiladas y biologicamente activas de EPO (u otras protemas recombinantes sialiladas) y sugiere que dichas formas de EPO pueden purificarse eficazmente a partir de sobrenadantes utilizando ya sea AEX (cromatograffa de intercambio anionico), HAC (cromatograffa de hidroxiapatita) o una combinacion de estos metodos. Nahrgang (2002) sugiere tambien que se puede usar una combinacion de cromatograffa de intercambio anionico y cromatograffa de hidroxiapatita para purificar la EPO altamente sialilada. Nahrgang (2002) no tiene ninguna descripcion de (i) un metodo que tenga entre otras cosas tres etapas de cromatograffa espedficas y consecutivas en las que se usan reguladores con valores de pH relativamente bajos en la cromatograffa de aniones o de (ii) analogos de EPO que tienen cuatro o mas cadenas de azucar enlazadas a N sometido al proceso de purificacion.
Como se describe, el metodo de purificacion en las patentes existentes relativas a la EPO implica el uso de columnas inaplicables en la produccion a escala industrial o los complicados procesos de purificacion de cuatro o mas etapas. Ademas, el metodo no es aplicable para NESP que tiene un punto isoelectrico mas bajo debido al cambio en las propiedades fisicoqmmicas por la adicion de cadenas de azucar. La unica patente publicada recientemente relativa a la purificacion de NESP implica cuatro etapas, y su proceso principal de separacion de isoformas que tienen mas residuos de acido sialico usa cromatograffa de intercambio cationico. Por el contrario, en la presente invencion se utiliza cromatograffa de intercambio anionico que es capaz de separar mas precisamente las isoformas que tienen mas residuos de acido sialico. Ademas, el presente procedimiento de purificacion consiste en procesos cromatograficos mas sencillos de tres etapas, y permite la purificacion de analogos de eritropoyetina que tienen un bajo punto isoelectrico mas rapido a menor coste.
Descripcion de la invencion
Problema tecnico
Los presentes inventores han hecho esfuerzos para desarrollar un metodo para purificar los analogos de eritropoyetina con alta pureza que tienen un punto isoelectrico mas bajo que la eritropoyetina de origen natural de la solucion de cultivo de celulas animales. Como resultado, se ha desarrollado un nuevo protocolo de purificacion para los analogos de eritropoyetina (darbepoetina alfa) que tienen un bajo punto isoelectrico expresado en celulas animales y que demostro que los analogos de eritropoyetina que tienen un bajo punto isoelectrico por debajo de 4 pueden ser purificados convenientemente, en forma rapida y eficaz con alta pureza utilizando el protocolo de purificacion.
Por lo tanto, es un objetivo de esta invencion proporcionar un metodo para purificar un analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 y una estructura de azucar complicada.
Otros objetivos y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la descripcion detallada a seguir junto con las reivindicaciones y dibujos adjuntos.
Solucion tecnica
En un aspecto de esta invencion, se proporciona un metodo para purificar un analogo de eritropoyetina (EPO) que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4, que comprende:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(a) Obtener de una solucion pretratada mediante la remocion de celulas animales de una solucion de cultivo de las celulas animales, en donde las celulas animales expresan un analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4;
(b) Obtener una primera fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina sometiendo la solucion pretratada a una primera cromatograffa de intercambio ionico;
(c) Obtener una segunda fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina sometiendo la primera fraccion a cromatograffa de adsorcion; y
(d) Obtener una tercera fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina sometiendo la segunda fraccion a una segunda cromatograffa de intercambio ionico.
Los presentes inventores han hecho esfuerzos para desarrollar un metodo para purificar analogos de eritropoyetina con alta pureza que tienen un punto isoelectrico mas bajo que la eritropoyetina de origen natural a partir de la solucion de cultivo de celulas animales. Como resultado, se ha desarrollado un nuevo protocolo de purificacion para los analogos de eritropoyetina que tienen un bajo punto isoelectrico expresado en celulas animales y han demostrado que los analogos de eritropoyetina que tienen un bajo punto isoelectrico por debajo de 4 pueden purificarse conveniente, en forma rapida y eficaz, con alta pureza utilizando el protocolo de purificacion.
Cada etapa del presente metodo para purificar un analogo de eritropoyetina se describira en detalle.
Etapa (a): Obtencion de la solucion pretratada a partir de una solucion de cultivo de celulas animales que expresan un analogo de eritropoyetina
De acuerdo con la presente invencion, en primer lugar, se obtiene una solucion pretratada a partir de una solucion de cultivo de celulas animales que expresan un analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 eliminando las celulas animales de la solucion de cultivo.
Las celulas animales que expresan un analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 utiles en la presente invencion incluyen preferiblemente celulas de mairnferos, roedores, aves o de insectos, mas preferiblemente celulas de ovario de hamster chino (CHO), VERO, HeLa, WI38, de rinon de hamster bebe (BHK), COS o celulas de rinon de canino Madin-Darby (MdCk), mas preferiblemente celulas CHO, VERO, HeLa o MdcK, mas preferiblemente celulas CHO.
El analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 comprende una o mas mutaciones en la secuencia de aminoacidos de la eritropoyetina natural. El analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico bajo puede prepararse por mutagenesis tal como mediante adicion, supresion o sustitucion de un residuo de aminoacido. A traves de esto, pueden aumentarse o alterarse los sitios de glicosilacion. El analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico bajo tiene mas cadenas de carbohidratos que la eritropoyetina natural, y tiene al menos una cadena de azucar adicional. Aunque el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico bajo exhibe un contenido de acido sialico mas alto que la eritropoyetina natural debido a la cadena de azucar adicional, la estructura bidimensional o tridimensional de la protema que es importante en su actividad biologica, no se altera por ello.
Aunque la eritropoyetina natural que tiene tres cadenas de azucar enlazadas a N comprende hasta 14 residuos de acido sialico, el analogo de eritropoyetina que tiene al menos una cadena de azucar adicional enlazada a N puede comprender mas residuos de acido sialico. Dado que el acido sialico es un acido de azucar cargado negativamente, el analogo de eritropoyetina que tiene al menos cuatro cadenas de azucar enlazadas a N tiene un punto isoelectrico por debajo de 4, mientras que la eritropoyetina natural que tiene tres cadenas de azucar enlazadas a N tiene un punto isoelectrico de 4 o superior. Por consiguiente, el analogo de eritropoyetina es relativamente mas diffcil de preparar que la eritropoyetina.
Por ejemplo, el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 de la presente invencion es uno en el que al menos un sitio de glicosilacion adicional en una o mas posiciones seleccionadas entre 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 y 138 posiciones de la secuencia de EPO (por ejemplo, la secuencia del GenBank M11319). Mas preferiblemente, el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 es una nueva protema estimulante de eritropoyesis (NESP) que comprende las mutaciones A30N, h32T, P87V, W88N y P90T.
Las celulas animales que expresan el analogo de eritropoyetina pueden cultivarse de acuerdo con diversos metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, puede emplearse un metodo de cultivo alimentado por lotes, de cultivo repetido alimentado por lotes o de cultivo continuo, conocidos como los metodos para cultivar celulas CHO. Mas preferiblemente, puede emplearse un cultivo repetido alimentado por lotes.
El cultivo de celulas animales necesita ser tratado previamente ya que normalmente comprende diversos constituyentes (impurezas) tales como protemas, sacaridos, grasas, etc.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "pretratamiento" se refiere a un proceso de eliminacion de impurezas antes de realizar la cromatograffa en columna con el fin de mejorar la eficacia de purificacion del metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion.
De acuerdo con una realizacion preferida, en la etapa de pretratamiento (a), las celulas animales se remueven de la solucion de cultivo de celulas animales mediante (i) filtracion a traves de un filtro de profundidad y un filtro de membrana seguido de ultrafiltracion o (ii) centrifugacion seguida por ultrafiltracion.
El pretratamiento que utiliza el filtro de profundidad se puede realizar de acuerdo con diversos metodos conocidos en la tecnica. El filtro de profundidad se utiliza para eliminar las parffculas mas grandes que un tamano predeterminado de la solucion de cultivo. A diferencia del filtro de membrana, el filtro de profundidad elimina las parffculas de la solucion de cultivo capturandolas en matrices. Tfpicamente, el filtro de profundidad comprende un medio fibroso tal como celulosa, fibra de vidrio o polipropileno. El pretratamiento usando el filtro de membrana puede realizarse segun diversos metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el pretratamiento puede realizarse usando diversas membranas que tienen poros que tienen un tamano predeterminado.
Un filtrado obtenido realizando la filtracion a traves del filtro de profundidad y del filtro de membrana se somete a ultrafiltracion. La ultrafiltracion se realiza utilizando una membrana de ultrafiltracion que tiene un corte de peso molecular apropiado (MWCO). Por ejemplo, la ultrafiltracion se puede realizar usando una membrana de ultrafiltracion que tiene un corte de peso molecular de 5-30 kDa. La ultrafiltracion puede proporcionar un efecto de concentracion, asf como de filtracion.
Alternativamente, el pretratamiento puede realizarse centrifugando el cultivo celular y realizando despues la ultrafiltracion. La centrifugacion se puede realizar a 2.000-5.000 rpm.
A traves de esta etapa de pretratamiento se puede reducir el volumen de la solucion de cultivo de celulas animales que comprende el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4, y se puede disminuir la carga de la columna cromatografica eliminando diversas impurezas presentes en la solucion de cultivo.
Etapa (b): Obtencion de la primera fraccion primero por cromatograffa de intercambio ionico
La solucion pretratada obtenida a partir de la etapa de pretratamiento se somete a una primera cromatograffa de intercambio anionico para obtener una primera fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina.
La primera cromatograffa de intercambio anionico puede realizarse usando diversas tecnicas de cromatograffa de intercambio anionico conocidas en la tecnica. Mas preferiblemente, se puede emplear una cromatograffa de intercambio anionico fuertemente basica.
Una resina de intercambio anionico util en la presente invencion tiene grupos funcionales cargados positivamente unidos covalentemente a la resina. Preferiblemente, el grupo funcional cargado positivamente de la resina de intercambio anionico es amina o amino, mas preferiblemente amina primaria, amina secundaria, amina terciaria o amina cuaternaria, lo mas preferiblemente amina cuaternaria. Ejemplos del grupo funcional cargado positivamente de la resina de intercambio anionico incluyen amina cuaternaria (por ejemplo, trimetilaminometilo y trietilaminoetilo), aminoetilo, dietilaminoetilo y p-aminobencilo.
En la presente invencion se pueden usar poliestireno, poliacrilato, celulosa, Sefacel, dextrano, agarosa o Toyopearl, preferiblemente celulosa, dextrano o agarosa, lo mas preferiblemente agarosa como soporte de la resina de intercambio anionico. Ademas, en la presente invencion, se puede utilizar Sefarosa Q o Sefarosa DEAE, preferiblemente Sefarosa Q como agente de intercambio anionico.
En la primera etapa de cromatograffa de intercambio anionico de la presente invencion, puede usarse cualquier regulador que tenga una potencia como regulador. Por ejemplo, pueden usarse acetato de sodio, fosfato de sodio, glicina-HCl o Tris.
Pueden usarse diversos reguladores, en particular Tris, como regulador de equilibrio, y el pH puede ser 6-8, preferiblemente 7,0-7,6. Como regulador de lavado, puede usarse un regulador (preferiblemente, regulador de acetato) de pH inferior a 4,0. Mas preferiblemente, se puede usar un regulador de pH 3,0-6,0, incluso mas preferiblemente 4,0-4,5.
Pueden usarse diversos reguladores que contienen una sal adecuada (preferiblemente, cloruro de sodio) como regulador de elucion. En particular, se puede usar Tris, y el pH puede ser de 6-8, preferiblemente de 7,0-7,6.
El pH y/o la fuerza ionica apropiados para eluir el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 de un agente de intercambio anionico fuertemente basico se puede determinar empfficamente y puede variar dependiendo de diversos factores (por ejemplo, el tipo de agente de intercambio anionico fuertemente basico,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
temperatura, etc.). La fuerza ionica del regulador de elucion puede proporcionarse mediante diversas sales. Por ejemplo, se puede usar cloruro de sodio para proporcionar la fuerza ionica.
Con referencia a los Ejemplos de esta invencion, la etapa (b) puede describirse como sigue: Una columna (BPG 100/500, GE Healthcare) empacada con 800 mL de resina Sefarosa Q FF (GE Healthcare), que es una especie de resina de intercambio anionico fuertemente basica, se equilibra utilizando un regulador de equilibrio (por ejemplo, regulador Tris 10 mM, pH 7,4). A continuacion, la solucion pretratada obtenida en la etapa (a) se anade a la columna Sefarosa Q y se eliminan las impurezas por lavado, de modo que la mayor parte de la sustancia unida a la resina es el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4. De acuerdo con una realizacion preferida, se usa regulador de acetato 100 mM (pH 4,0) como regulador de lavado. El analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 puede eluirse usando regulador Tris que contiene cloruro de sodio. La concentracion de cloruro de sodio puede ser preferiblemente de 50-500 mM, mas preferiblemente de 100-400 mM, mas preferiblemente de 200-300 mM.
En la etapa (b), la solucion pretratada obtenida en la etapa (a) se somete a una primera cromatograffa de intercambio ionico para obtener la primera fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina.
Etapa (c): Obtencion de la segunda fraccion mediante cromatograffa de adsorcion
La primera fraccion obtenida de la primera etapa de cromatograffa de intercambio ionico se somete a cromatograffa de adsorcion para obtener una segunda fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina.
Durante la cromatograffa de adsorcion, la separacion de la muestra se produce entre una fase movil que es lfquida y una fase estacionaria (resina adsorbente) que es solida debido a la diferencia de adsortividad.
La fase estacionaria que puede usarse en la cromatograffa de adsorcion de la presente invencion incluye preferiblemente sflice, alumina, oxido de magnesio y fosfato de calcio (preferiblemente, hidroxiapatita), pero no se limita a los mismos. Mas preferiblemente, la fase estacionaria puede ser fosfato de calcio, lo mas preferiblemente hidroxiapatita. La hidroxiapatita tiene excelente poder de resolucion y separacion. Cuando se usa hidroxiapatita como fase estacionaria, se puede usar regulador de fosfato como fase movil.
Cuando se usa hidroxiapatita, se puede usar regulador de fosfato como regulador de equilibrado, y el pH puede ser de 6-8, preferiblemente de 6,0-7,0. Se puede usar regulador de fosfato que comprende una sal apropiada (preferiblemente cloruro de sodio) como regulador de elucion, y el pH puede ser de 6-8, espedficamente de 6,0 - 7,0.
Con respecto a los Ejemplos de esta invencion, la etapa (c) puede describirse de la siguiente forma: Se equilibra una columna empacada con resina de hidroxiapatita (tipo I o II, 20-40 pm) utilizando un regulador de equilibrado (por ejemplo, regulador de fosfato 20 mM, pH 6,0 - 7,0). A continuacion, se anade la primera fraccion obtenida en la etapa (b) a la columna de hidroxiapatita y se obtiene el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 no adsorbido como una fraccion no adsorbida. Las impurezas de protema adsorbidas por la resina de hidroxiapatita se pueden eluir usando un regulador de elucion (por ejemplo, regulador de fosfato 500 mM, pH 6,07,0).
Etapa (d): Obtencion de la tercera fraccion por la segunda cromatograffa de intercambio ionico
La segunda fraccion obtenida de la etapa de cromatograffa de adsorcion se somete a una segunda cromatograffa de intercambio anionico para obtener una tercera fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina.
La segunda cromatograffa de intercambio anionico se puede realizar utilizando diversas tecnicas de cromatograffa de intercambio anionico conocidas en la tecnica. Preferiblemente, se puede emplear una cromatograffa de intercambio anionico fuertemente basica.
Una resina de intercambio anionico en la presente invencion puede tener grupos funcionales cargados positivamente. Preferiblemente, el grupo funcional cargado positivamente de la resina de intercambio anionico es amina o amino, mas preferiblemente amina primaria, amina secundaria, amina terciaria o amina cuaternaria, lo mas preferiblemente amina cuaternaria.
En la presente invencion, se puede usar poliestireno, poliacrilato, poliestireno/divinilbenceno, celulosa, Sefacel, dextrano, agarosa o Toyopearl, preferiblemente agarosa o poliestireno/divinilbenceno como soporte de la resina de intercambio anionico.
En la presente invencion, se puede usar Sefarosa Q, Sefarosa DEAE, SOURCE 15Q, SOURCE 30Q, Capto DEAE o Capto Q, preferiblemente SOURCE 15 Q o SOURCE 30 Q, como un agente de intercambio anionico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En la segunda etapa de cromatograffa de intercambio anionico de la presente invencion, puede usarse cualquier regulador que tenga una potencia reguladora. Por ejemplo, pueden usarse acetato de sodio, fosfato de sodio, glicina-HCl o Tris.
Pueden usarse diversos reguladores, en particular regulador de acetato, como regulador de equilibrado, y el pH puede ser de 3-6, preferiblemente de 4-5. Como regulador de lavado, puede usarse un regulador (preferiblemente, regulador de glicina) de pH 2,0-4,0, mas preferiblemente 3,0-4,0. Pueden usarse diversos reguladores, particularmente regulador de fosfato, que contiene una sal adecuada (preferiblemente, cloruro de sodio) como regulador de elucion, y el pH puede ser de 6-8, preferiblemente de 7,0-7,6. La concentracion de la sal, particularmente de cloruro de sodio, contenida en el regulador de elucion puede ser preferiblemente 100-500 mM.
Con respecto a los Ejemplos de esta invencion, la etapa (d) puede ser descrita de la siguiente forma: Una columna (XK 50/30, GE Healthcare) empacada con 800 mL de resina Sefarosa Q SOURCE 15Q o 30Q (GE Healthcare), que es una clase de resina de intercambio anionico fuertemente basica, se equilibra usando un regulador de equilibrado (por ejemplo, regulador de fosfato 20 mM, pH 6,0-7,0). A continuacion, se anade la segunda fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina obtenido de la etapa de cromatograffa de adsorcion a la columna SOURCE 15Q o 30Q, y la resina se lava usando un primer regulador de lavado (por ejemplo, regulador acetato 20 mM, pH 4,0-5,0) y un segundo regulador de lavado (por ejemplo, regulador de glicina 20 mM, pH 2,2-2,4).
De acuerdo con una realizacion preferida, la etapa (c) y la etapa (d) se realizan como un unico proceso. Dado que la segunda fraccion no requiere tratamiento antes de la etapa (d), las columnas de la etapa (c) y la etapa (d) pueden conectarse directamente. En este caso, el tiempo gastado para la etapa (c) y la etapa (d) puede reducirse y la segunda fraccion y la tercera fraccion se pueden obtener en poco tiempo.
De acuerdo con la presente invencion, pueden eliminarse eficazmente las isoformas de protemas excluyendo el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de en la etapa (d). Dado que la pequena cantidad de impurezas de protema no adsorbidas en la etapa (c) se eliminan eficazmente en la etapa (d), la fraccion que contiene el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 puede obtenerse con alta pureza.
El presente metodo es muy eficaz para la purificacion del analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4, preferiblemente un factor estimulador de eritropoyesis que tiene cuatro o mas cadenas de azucar enlazadas a N, lo mas preferiblemente una NESP.
Efectos beneficiosos
Las caractensticas y ventajas de la presente invencion se resumen de la siguiente manera:
(a) La presente invencion proporciona un nuevo metodo para purificar analogos de eritropoyetina (EPO) que tienen un punto isoelectrico por debajo de 4.
(b) Mientras que la EPO de origen natural que tiene tres cadenas de azucar enlazadas a N comprende hasta 14 residuos de acido sialico, el analogo de eritropoyetina que tiene cuatro o mas cadenas de azucar enlazadas a N puede comprender mas residuos de acido sialico. El analogo de eritropoyetina que tiene cuatro o mas cadenas de azucar enlazadas a N tiene un punto isoelectrico por debajo de 4, mientras que la eritropoyetina natural que tiene tres cadenas de azucar enlazadas a N tiene un punto isoelectrico de 4 o superior. Por consiguiente, el analogo de eritropoyetina es relativamente mas diffcil de preparar que la eritropoyetina. Las dificultades para producir el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico bajo causado por sus propiedades fisicoqmmicas se resuelven en la presente invencion. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo que permite la produccion del analogo de eritropoyetina que tiene un bajo punto isoelectrico a escala industrial.
(c) La presente invencion proporciona un metodo de purificacion, por lo que las impurezas proteicas pueden eliminarse eficazmente a traves de tres etapas de cromatograffa y el analogo de eritropoyetina puede obtenerse con alta pureza.
(d) Dado que la cromatograffa de adsorcion y las segundas etapas de cromatograffa de intercambio ionico del presente metodo de purificacion pueden realizarse como un solo procedimiento, se puede reducir el tiempo requerido para la purificacion.
Descripcion de los dibujos
La Fig. 1 ilustra brevemente un metodo preferido para purificar un analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 a partir de una solucion de cultivo de celulas animales de acuerdo con la presente invencion.
La Fig. 2 muestra un cromatograma de una primera fraccion que comprende un analogo de eritropoyetina que tiene
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
un punto isoelectrico por debajo de 4 obtenido por una primera cromatograffa de intercambio ionico en un metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion. La flecha indica el pico del cromatograma de la protema objetivo.
La Fig. 3 muestra un cromatograma de una segunda fraccion que comprende un analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 obtenido por cromatograffa de adsorcion en un metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion. La flecha indica el pico del cromatograma de la protema objetivo.
La Fig. 4 muestra un resultado de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio y tincion de Coomassie de fracciones obtenidas por un metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion. La flecha indica las bandas de la protema objetivo y una NESP estandar.
Carril 1: estandar de peso molecular (Bio-Rad)
Carril 2: solucion de cultivo de celulas animales (filtrada por ultrafiltracion)
Carril 3: primera fraccion obtenida a partir de la primera cromatograffa de intercambio ionico Carril 4: segunda fraccion obtenida a partir de la cromatograffa de adsorcion Carril 5: tercera fraccion obtenida a partir de la segunda cromatograffa de intercambio ionico Carril 6: NESP estandar.
La Fig. 5 muestra un resultado del enfoque isoelectrico y tincion de Coomassie de una tercera fraccion obtenida en la etapa final de un metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion.
Carril 1: fraccion sometida a una segunda cromatograffa de intercambio ionico
Carril 2: fraccion purificada de lavado de pH obtenida a partir de la segunda cromatograffa de intercambio ionico Carril 3: fraccion purificada obtenida a partir de la segunda cromatograffa de intercambio ionico Carril 4: NESP estandar.
La Fig. 6 muestra un cromatograma de una tercera fraccion que comprende un analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4 obtenido por una segunda cromatograffa de intercambio anionico en un metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion. La flecha indica el pico del cromatograma de la protema objetivo.
La Fig. 7 muestra un cromatograma de NESP obtenido por cromatograffa de exclusion por tamano en un metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion. La flecha indica el pico del cromatograma de la protema objetivo. La Fig. 8 muestra un resultado del enfoque isoelectrico y tincion de Coomassie de una fraccion obtenida por cromatograffa de adsorcion y una segunda cromatograffa de intercambio ionico en un metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion.
Carril 1: NESP estandar
Carril 2: Fraccion purificada obtenida a partir de una segunda cromatograffa de intercambio ionico
Las Figs. 9a-9d muestran cromatogramas de exclusion por tamano que muestran la pureza de las fracciones obtenidas a partir de cada etapa del presente metodo de purificacion.
Modo para la invencion
A continuacion, se describira ahora la presente invencion en forma mas detallada mediante ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Cultivo de celulas que producen analogos de eritropoyetina
Las celulas CHO que producen una glicoprotema con cinco aminoacidos (A30N, H32T, P87V, W88N y P90T) de EPO sustituida se cultivaron en un recipiente de 50 litros. Las celulas se cultivaron mediante cultivo repetido alimentado por lotes, que es uno de los metodos para cultivar celulas CHO, bien conocido en la tecnica. Se utilizo un medio qmmicamente definido o un medio exento de suero tal como el medio SFM4CHO disponible a traves de HyClone. La solucion de cultivo se recupero despues de una fase de produccion de aproximadamente 5 dfas. La concentracion celular era de 8 x 106 celulas/mL o superior y la viabilidad celular era de al menos del 95%.
Ejemplo 2: Microfiltracion y ultrafiltracion
Las celulas y los desechos celulares se retiraron de la solucion de cultivo de celulas animales obtenidas en el Ejemplo 1 usando un filtro de profundidad (Millipore) y un filtro de membrana (Sartorius, 0,2 pm), respectivamente. Posteriormente, el filtrado resultante de la microfiltracion se hizo pasar a traves de una membrana de ultrafiltracion (Millipore, MWCO: 5-30 kDa) con el fin de eliminar sales y sacaridos menores que 5-30 kDa. La diafiltracion y la concentracion se realizaron usando regulador Tris que tema un volumen de 10 veces el volumen inicialmente concentrado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 3: primera cromatograffa de intercambio anionico
La cromatograffa de intercambio anionico se realizo usando el sistema AKTApilot (GE, EE.UU.), y se uso una columna BPG 100/500 (GE) empacada con 800 mL de resina Sefarosa Q FF (GE). La columna se equilibro utilizando regulador Tris 10 mM de pH 7,4 con una velocidad de flujo de 300 mL/min. La columna se lavo usando regulador de acetato 100 mM de pH 4,0 como regulador de lavado, y la proterna adsorbida en el gel de Sefarosa Q FF se eluyo usando un regulador de equilibrado que conterna cloruro de sodio 300 mM. El primer cromatograma de intercambio anionico resultante se muestra en la Fig. 2.
Ejemplo 4: cromatograffa de adsorcion
Se realizo la cromatograffa de adsorcion usando el sistema AKTApurifier, y se uso una columna XK 50/30 empacada con 430 mL de resina de hidroxiapatita tipo I o II (20-40 pm, Bio-Rad). La columna se equilibro utilizando regulador de fosfato 20 mM de pH 6,0-7,0 a una velocidad de flujo de 20 mL/min. La fraccion obtenida a partir de la primera cromatograffa de intercambio anionico se hizo pasar a traves de la columna, por lo que se recupero el analogo de eritropoyetina como una fraccion no adsorbida. La columna se lavo entonces usando regulador fosfato 500 mM de pH 6,0-7,0 como regulador de lavado para eliminar las impurezas proteicas que quedaban en la columna. Para una segunda cromatograffa de intercambio ionico eficaz, se realizo una ultrafiltracion (MWCO 5-30 kDa) antes de realizar la cromatograffa de adsorcion. El cromatograma de adsorcion resultante se muestra en la Fig. 3.
Ejemplo 5: segunda cromatograffa de intercambio anionico
La segunda cromatograffa de intercambio anionico se realizo usando el sistema AKTApurifier, y se uso una columna XK 50/30 empacada con 200 mL de resina SOURCE 15Q o 30Q (GE). La columna se equilibro utilizando regulador acetato 20 mM de pH 4,0-5,0 a una velocidad de flujo de 25 mL/min. La columna se lavo usando regulador de glicina 20 mM de pH 2,2-2,4 como regulador de lavado, y se eluyo la proterna adsorbida en el gel SOURCE 15Q o 30Q usando regulador de fosfato que conterna 100-500 mM de cloruro de sodio. Con respecto a cada una de las fracciones, se analizaron la presencia de impurezas (Fig. 4) y la isoforma del analogo de eritropoyetina (Fig. 5) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio y tincion de Coomassie, y por enfoque isoelectrico y tincion de Coomassie. Se demostro que la fraccion final mostro un patron de banda de proterna similar a la NESP estandar en el analisis de isoformas. El segundo cromatograma de intercambio anionico resultante se muestra en la Fig. 6. Ademas, la pureza de las protemas purificadas obtenidas a partir del segundo cromatograma de intercambio anionico se analizo por cromatograffa de exclusion por tamano. La pureza era al menos del 98% como se muestra en la Fig. 7.
Ejemplo 6: Rendimiento simultaneo de la cromatograffa de adsorcion y la segunda cromatograffa de intercambio ionico
La cromatograffa de adsorcion y la segunda cromatograffa de intercambio anionico se realizaron simultaneamente usando el sistema AKTApurifier. Se conectaron una columna XK 50/30 (GE) empacada con 430 mL de resina de hidroxiapatita y una columna XK 50/30 (GE) empacada con 200 mL de resina SOURCE 15Q o 30Q a traves de un conector y se equilibraron las columnas usando regulador de fosfato 20 mM de pH 6,0-7,0 (regulador de equilibrado) a una velocidad de flujo de 20 mL/min. A continuacion, se paso la fraccion obtenida de la primera cromatograffa de intercambio anionico a traves de una membrana de ultrafiltracion (MWCO: 5-30 kDa) y se anadio el filtrado resultante a la columna conectada a la misma. A continuacion, se eliminaron las impurezas proteicas no adsorbidas en la columna inyectando un regulador de equilibrio a una velocidad de flujo de 20 mL/min. Despues del lavado, se retiro la columna de hidroxiapatita y solo se monto la columna SOURCE en el sistema AKTApurifier. A continuacion, se eluyo la proterna objetivo de la misma forma que se describe en el Ejemplo 5. La isoforma del producto final de purificacion se analizo mediante enfoque isoelectrico y tincion de Coomassie (Fig. 8). Como resultado, se demostro que no habfa diferencia en la pureza del producto final entre el metodo en el que se llevaron a cabo la cromatograffa de adsorcion y la segunda cromatograffa de intercambio ionico independientemente y una en la que la cromatograffa de adsorcion y la segunda cromatograffa de intercambio ionico se realizaron secuencialmente como un solo proceso. Ademas, se demostro que la fraccion final mostraba un patron de banda proteica similar a la NESP estandar.
Ejemplo 7: Analisis de las fracciones de cada etapa
Cada fraccion y patron de peso molecular se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio y gradiente de 4-12% (SDS-PAGE) durante 1 hora bajo un voltaje constante de 150 V. Despues de la electroforesis, se tino el gel durante 30 minutos con tincion de Coomassie.
Se sometieron a electroforesis 10 pg de cada fraccion en un gel de enfoque isoelectrico (IEF) al 2-5% por cada hora bajo cuatro etapas de voltaje constante de 100 V, 200 V, 400 V y 550 V. Despues de las electroforesis, se tino el gel durante 30 minutos con tincion de Coomassie.
Ejemplo 8: Establecimiento de un proceso de purificacion a escala piloto
Se establecio un proceso de purificacion a escala piloto utilizando el metodo de purificacion de la presente invencion. El rendimiento de cada etapa de purificacion y el rendimiento final se presentan en la Tabla 1. Se demostro que se 5 podfa lograr un alto rendimiento, aunque se eliminaron las isoformas que teman un alto punto isoelectrico para mejorar la pureza y calidad como medicamento.
[Tabla 1]
Etapa de purificacion
Volumen (mL) Concentracion (mg/mL) Contenido de protema (mg) Pureza (%) Contenido (mg) Rendimiento total (%)
Concentrado de cultivo
6780 0,5 3390,0 22,4 759,4 -
Primera cromatograffa anionica
2466 0,3 813,8 60,1 489,1 60,1
Cromatograffa de adsorcion
4695 0,1 469,5 94,0 441,3 54,2
Segunda cromatograffa anionica
424 0,4 148,4 99,0 146,9 18,1
10

Claims (4)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para purificar un analogo de eritropoyetina (EPO) que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4, que es una nueva protema estimuladora de eritropoyesis (NESP) que tiene cinco cadenas de azucar enlazadas a N que comprende:
    (a) Obtener una solucion pretratada mediante la eliminacion de celulas animales de una solucion de cultivo de las celulas animales, en donde las celulas animales expresan el analogo de eritropoyetina que tiene un punto isoelectrico por debajo de 4;
    (b) Obtener una primera fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina sometiendo la solucion pretratada a una primera cromatograffa de intercambio anionico, en donde se usa un regulador de pH por debajo de 4,0 como regulador de lavado en la primera cromatograffa de intercambio anionico;
    (c) Obtener una segunda fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina sometiendo la primera fraccion a cromatograffa de hidroxiapatita; y
    (d) Obtener una tercera fraccion que comprende el analogo de eritropoyetina sometiendo la segunda fraccion a una segunda cromatograffa de intercambio anionico, en la que se usa un regulador de pH 2,0-4,0 como regulador de lavado en la segunda cromatograffa de intercambio anionico.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las celulas animales que expresan el analogo de eritropoyetina comprenden celulas de ovario de hamster chino (CHO), VERO, HeLa, W138, de rinon de hamster bebe (BHK), COS o de rinon de perro Madin-Darby (MDCK).
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la etapa (a) se realiza mediante (i) filtracion a traves de un filtro de profundidad y un filtro de membrana seguido de ultrafiltracion o (ii) centrifugacion seguida de ultrafiltracion.
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la etapa (c) y la etapa (d) se realizan como un unico proceso.
ES12841143.6T 2011-10-18 2012-09-28 Métodos para purificar análogos de eritropoyetina que tienen punto isoeléctrico más bajo Active ES2621208T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20110106230 2011-10-18
KR1020110106230A KR101443257B1 (ko) 2011-10-18 2011-10-18 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법
PCT/KR2012/007959 WO2013058485A1 (en) 2011-10-18 2012-09-28 Methods for purifying erythropoietin analogs having lower isoelectric point

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2621208T3 true ES2621208T3 (es) 2017-07-03

Family

ID=48141095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12841143.6T Active ES2621208T3 (es) 2011-10-18 2012-09-28 Métodos para purificar análogos de eritropoyetina que tienen punto isoeléctrico más bajo

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9994627B2 (es)
EP (1) EP2768846B1 (es)
JP (1) JP6049740B2 (es)
KR (1) KR101443257B1 (es)
ES (1) ES2621208T3 (es)
WO (1) WO2013058485A1 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0915394A2 (pt) * 2008-06-24 2017-06-27 Dr Reddys Laboratories Inc purificação de citoquinas modificadas
WO2014204023A1 (ko) * 2013-06-17 2014-12-24 씨제이헬스케어 주식회사 신규한 다베포에틴 알파의 정제 방법
KR101414897B1 (ko) 2013-11-29 2014-07-04 씨제이헬스케어 주식회사 다베포에틴 알파의 정제 방법
JP6906497B2 (ja) 2016-03-09 2021-07-21 Ｊｃｒファーマ株式会社 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法
JP6258536B1 (ja) * 2017-03-03 2018-01-10 協和発酵キリン株式会社 ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法
KR20240064367A (ko) 2022-11-04 2024-05-13 주식회사 대웅제약 TGF-β3 단백질의 정제방법

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0794475B2 (ja) * 1983-08-16 1995-10-11 雪印乳業株式会社 純粋なエリスロポエチンの製造法
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
JPH01165393A (ja) * 1987-12-21 1989-06-29 Sumitomo Chem Co Ltd 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法
US7217689B1 (en) 1989-10-13 2007-05-15 Amgen Inc. Glycosylation analogs of erythropoietin
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
CN1057534C (zh) * 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
KR0153808B1 (ko) 1994-12-06 1998-10-15 김정순 단일클론항체를 이용한 재조합 인간 에리스로포이에틴의 정제 방법
IL118201A (en) * 1995-05-11 2004-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof
WO1999028346A1 (de) 1997-12-03 1999-06-10 Roche Diagnostics Gmbh Erythropoietin mit hoher spezifischer aktivität
BR9917606A (pt) * 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
KR100297927B1 (ko) 1998-12-11 2001-10-29 손 경 식 인간에리스로포이에틴의정제방법
KR100344059B1 (ko) 1999-12-20 2002-07-24 동아제약 주식회사 재조합 인간 에리트로포이에틴의 정제 방법
PT1274728E (pt) * 2000-04-21 2008-06-20 Amgen Inc Métodos e composições para a prevenção e tratamento de anemia
KR100423615B1 (ko) 2001-05-16 2004-03-22 주식회사유한양행 인간 에리트로포이에틴의 제조방법
EP1453857B1 (en) 2001-11-28 2014-08-13 Sandoz AG Chromatographic purification of recombinant human erythropoietin
DE60228460D1 (de) * 2002-12-13 2008-10-02 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Erythropoietin
KR100567448B1 (ko) 2003-11-05 2006-04-04 주식회사 인투젠 형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통한 인체단백질의 정제방법
DE102004027816A1 (de) 2004-06-08 2006-01-05 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin
KR20080026113A (ko) * 2005-05-24 2008-03-24 아베스타 겐그레인 테크놀로지스 피브이티 리미티드 적혈구생성 자극 단백질의 생산을 위한 재조합 방법
KR100900033B1 (ko) 2007-11-21 2009-06-01 한국생명공학연구원 인간 에리스로포이에틴의 정제방법
KR100900013B1 (ko) 2007-12-04 2009-05-29 씨제이제일제당 (주) 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법
CN106928346B (zh) * 2008-05-28 2021-09-07 普罗瑟拉生物公司 来自血液的间-α抑制物蛋白的制备和组合物
BRPI0915394A2 (pt) * 2008-06-24 2017-06-27 Dr Reddys Laboratories Inc purificação de citoquinas modificadas
WO2011024024A1 (en) 2009-08-28 2011-03-03 Avesthagen Limited A process for recovering darbepoeitin alfa isoforms
EA022396B1 (ru) * 2009-09-23 2015-12-30 Ратиофарм Гмбх Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013058485A1 (en) 2013-04-25
KR101443257B1 (ko) 2014-09-19
EP2768846A1 (en) 2014-08-27
JP6049740B2 (ja) 2016-12-21
US9994627B2 (en) 2018-06-12
EP2768846B1 (en) 2016-12-28
US20140243510A1 (en) 2014-08-28
EP2768846A4 (en) 2015-05-06
KR20130042107A (ko) 2013-04-26
JP2014532080A (ja) 2014-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2621208T3 (es) Métodos para purificar análogos de eritropoyetina que tienen punto isoeléctrico más bajo
ES2564790T3 (es) Producción mejorada de glicoproteínas usando manganeso
ES2690213T3 (es) Un método de purificación de anticuerpos
ES2353798T3 (es) Nuevos procedimientos de purificación del factor ix.
ES2534936T3 (es) Método para producir y purificar una sialiltransferasa soluble activa
ES2312219T3 (es) Metodos para purificar eritropoyetina humana recombinante de sobrenadantes de cultivo celular.
ES2657377T3 (es) Etanercept plegado correctamente con alta pureza y excelente rendimiento
ES2768261T3 (es) Métodos para la purificación se arilsulfatasa A
EA022396B1 (ru) Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин
ES2325771T3 (es) Procedimiento de purificacion de eritropoyetina.
US10723775B2 (en) Method for purifying darbepoetin alfa
CN102056940A (zh) 纯化促红细胞生成素的方法
KR101877352B1 (ko) 세포 배양물 유래 알파1 프로테아제 억제제의 정제
US9902753B2 (en) Method of purifying a long-acting human growth hormone
WO2011156369A2 (en) Purification of modified cytokines
ES3040791T3 (en) Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein
JP6906497B2 (ja) 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法
KR101475484B1 (ko) 골형성 단백질 4의 정제방법
EP3153522A1 (en) Process for the purification of erythropoietin and darbepoetin alfa
HK1223633B (en) Method for purifying darbepoetin alfa
US20170101437A1 (en) Process for purification of darbepoetin alfa