ES2624549T3 - Métodos y medios para obtener fenotipos modificados - Google Patents

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Ming Bo Wang
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Abstract

Un método para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés, que se puede expresar en una célula vegetal, que comprende la etapa de introducir en dicha célula un ADN quimérico, que se integra establemente en el genoma nuclear de dicha célula vegetal, comprendiendo dicho ADN quimérico las siguientes partes enlazadas operativamente: a) un promotor, operativo en dicha célula vegetal; b) una región de ADN que, cuando se transcribe, da una molécula de ARN con una secuencia nucleotídica que comprende i. una secuencia nucleotídica de sentido de menos nucleótidos consecutivos que tiene 100% de identidad de secuencia con al menos parte de una región codificante de dicho ácido nucleico de interés; y ii. una secuencia nucleotídica antisentido que incluye al menos 20 nucleótidos consecutivos, que tiene 100% de identidad de secuencia con el complemento de dichos al menos 20 nucleótidos consecutivos de dicha secuencia nucleotídica de sentido; en donde el ARN es capaz de formar una estructura de ARN de horquilla artificial con un tallo de ARN de doble hebra mediante apareamiento de bases entre las regiones con secuencia nucleotídica de sentido y antisentido de modo que al menos dichos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de sentido se apareen por bases con dichos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia antisentido; en donde dicho ADN quimérico comprende uno o más intrones en dicha región de ADN que, cuando se transcribe, da una molécula de ARN.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y medios para obtener fenotipos modificados Campo de la invencion
La invencion se refiere a metodos para reducir la expresion fenotipica de una secuencia de acido nucleico de interes en celulas vegetales, al proveer simultaneamente a las celulas de genes quimericos que codifican moleculas de ARN de sentido y antisentido que comprenden secuencias nucleotfdicas respectivamente homologas y complementarias a al menos parte de la secuencia nucleotidica del acido nucleico de interes. Las moleculas de ARN de sentido y antisentido se pueden proporcionar como una molecula de ARN, en donde el ARN de sentido y antisentido pueden estar enlazados por una secuencia nucleotfdica espaciadora y son capaces de formar una molecula de ARN de doble hebra. En un aspecto de la invencion, los metodos se dirigen a reducir la infeccion viral, dando como resultado una resistencia a los virus extrema. En otra realizacion, los metodos se dirigen a reducir la expresion fenotipica de un gen endogeno en una celula vegetal. Tambien se proporcionan celulas vegetales que comprenden tales moleculas de ARN. asf como plantas que consisten esencialmente en tales celulas vegetales.
Antecedentes de la invencion
En 1985, Sanford y Johnston propusieron el concepto de resistencia derivada de parasitos. Postularon que productos genicos clave procedentes de un parasito expresados en el hospedador en una forma disfuncional, en exceso o en un estadio de desarrollo incorrecto, deben alterar la funcion del parasito con efecto mmimo sobre el hospedador (Sanford & Johnston, 1985). Usando el bacteriofago QB como un modelo, propusieron que la expresion, en bacterias, de la protema de envuelta del bacteriofago o la replicasa modificada o un ARN antisentido complementario al genoma de QB podnan dar todos resistencia. Tambien propusieron que tales enfoques senan aplicables, en plantas, a virus de plantas y particularmente al uso de una replicasa de virus de planta modificada. La expresion de la protema de envuelta del virus de planta, el virus del mosaico del tabaco (tMv), en tabaco fue la primera validacion practica de este concepto para resistencia a virus de plantas. Este trabajo (Powell-Abel y cols., 1986) mostraba que la expresion de la protema de envuelta del TMV, a partir de un transgen bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, confena a las plantas resistencia a TMV. El mismo grupo (Powell y cols., 1990) mostro que, generalmente, las plantas que expresaban niveles superiores de protema de envuelta eran mas resistentes al tMv que las plantas que expresaban niveles bajos. Desde esta demostracion, ha habido muchos ejemplos de plantas transformadas con genes de protema de envuelta del virus que muestran resistencia (Tabla 1). Tambien ha habido un numero de informes de resistencia a virus de plantas en plantas que expresan replicasa silvestre (Braun y Hemenway, 1992, Brederode y cols., 1995), replicasa truncada (Carr y cols. 1992), replicasa modificada (Longstaff y cols. 1993) o ARN viral antisentido (Kawchuck y cols. 1991).
En 1992, Dougherty y colaboradores usaron diferentes formas del gen de protema de envuelta del virus del grabado del tabaco (TEV) y descubrieron que algunas plantas que contienen genes de protema de envuelta “de sentido” no traducibles y genes de protema de envuelta antisentido mostraban resistencia extrema (ER) al virus (Lindbo & Dougherty, 1992 a,b). Esta resistencia era funcional a nivel de la planta entera y a nivel de celulas individuales. El TEV era incapaz de replicarse en protoplastos derivados de plantas con ER pero se replicaba hasta niveles altos en protoplastos procedentes de tabaco no transgenico. Dougherty y cols. concluyeron que el mecanismo que crea la resistencia extrema para la construccion de sentido no traducible no era el mismo que la estrategia mediada por protemas de envuelta a menudo presentada. Propusieron que el ARNm de la construccion de sentido no traducible se hibridaba con el genoma de sentido mmimo del virus e interfena con la serie de complejos de replicacion sobre le hebra negativa. Sugirieron que se debe evitar el uso de una secuencia viral que pudiera formar un apareamiento intramolecular ya que esto interferina con su capacidad para hibridarse al ARN viral diana.
Tabla 1: Especies de planta que se han manipulado geneticamente para resistencia a virus (de Rebecca Grumet, Hort Science 30[3] 1995)_________________________________________________________________________
Especie
Virus
Tabaco (Nicotiana tabacum L.)
AIMV, ArMV, CMV, PVX, PVY, TEV, TGMV, TMV, TRV, TSV, TSWV
Otras especies de Nicotiana (N. debneyii, N. benthamiana, N. clevelandii)
ACMV, BYMV, CyMV, CyRSV, BCTV, PEBV, PPV, PVS, WMV
Patata (Solanum tuberusom L.)
PI, RV, PVY
Tomate (Lycopersicon esculentum L.)
AIMV, CMV, TMV, TYLCV
Pepino (Cucumis sativus L.)
CMV
Melon (Cucumis melo L.)
CMV, ZYMV
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Especie
Virus
Alfalfa (Medicago sativa L.)
AIMV
Papaya (Carica papaya L.)
PRSV
Mafz (Zea mays L.)
MDMV
Arroz (Oryza sativa L.)
RSV
Colza (Brassica napus L.)
TYMV
El grupo de Dougherty extendio sus investigaciones a plantas que conteman genes de protema de envuelta del virus Y de patata (PVY) de sentido no traducibles. Obtuvieron resultados similares a aquellos con TEV y mostraron que las plantas con ER teman un alto numero de copias del transgen, una transcripcion muy activa de los transgenes y bajos niveles de ARNm en estado estacionario procedente del transgen de PVY (Lindbo y cols. 1993, Smith y cols. 1994). Se propuso el siguiente modelo para este mecanismo de la resistencia: el alto nivel de transcripcion del transgen viral activa un sistema de vigilancia celular postranscripcional basado en el citoplasma que se dirige a los ARN espedficos para la eliminacion. Cuando el transgen codifica un transcrito que comprende secuencias virales, el mecanismo no solo degrada el ARNm del transgen sino tambien las mismas secuencias en el ARN genomico viral. Un punto clave en este modelo es la necesidad de un alto nivel de transcripcion del transgen proporcionado por un alto numero de copias (3-8; Goodwin y cols. 1996). Alternativamente, el umbral del ARN requerido para activar el mecanismo se puede alcanzar mediante un nivel de transcripcion moderado ayudado por el aRn viral procedente de la replicacion en la infeccion inicial. Esto da lugar a un "fenotipo de recuperacion" donde la planta se infecta inicialmente y muestra smtomas, pero a continuacion produce nuevo crecimiento sin smtomas virales y que son extremadamente resistentes a la infeccion.
Esta propuesta era sustanciada por los hallazgos de que la inactivacion genica de transgenes no virales tambien se podna deber a un mecanismo postranscripcional (Ingelbrecht y cols. 1994; de Carvalho Niebel y cols. 1995) que funciona al nivel del ARN.
Se proporciono una relacion entre la inactivacion de genes no virales y esta resistencia derivada del patogeno al inocular plantas transgenicas, en la que se sabfa que un transgen de GUS era inactivado por un mecanismo postranscripcional, con un virus que contiene secuencias de GUS (English y cols. 1996). En esta situacion las plantas eran extremadamente resistentes a la infeccion viral. Sin embargo, las mismas plantas eran sensibles al virus si no conteman secuencias de GUS.
El grado de resistencia viral no siempre esta directamente relacionado con el nivel de transcripcion del transgen viral (Mueller y cols. 1995; English y cols. 1996) sugiriendo que puede haber un mecanismo alternativo para inducir la resistencia. Para ajustarse a estas discrepancias, se ha proporcionado un modelo alternativo en el que el factor crucial que afecta a la resistencia no es el nivel sino la calidad del ARNm del transgen (English y cols. 1996). Segun este modelo, el transgen solo puede inducir resistencia (o inactivacion genica) si se transcribe para producir ARN "aberrante". Ha habido muchos ejemplos de inactivacion genica postranscripcional y metilacion del transgen (Hobbs y cols. 1990; Ingelbrecht y cols. 1994) y tambien se ha encontrado que la metilacion del transgen esta asociada en algunos casos de resistencia viral extrema (Smith y cols. 1994, English 1996). En el modelo propuesto, la metilacion del transgen conduce a la produccion de ARN aberrantes que inducen el sistema de vigilancia de ARN citoplasmico. Baulcombe y English han sugerido que este metodo de induccion puede ser el mismo que el encontrado para la inactivacion de met2 en A. immersus. En este sistema, la transcripcion del ARN de met2 se terminaba en las regiones metiladas del gen endogeno produciendo asf ARN truncados aberrantes. Se sugirio que la metilacion era una consecuencia de la interaccion ectopica entre el transgen y una region homologa de una region correspondiente del gen endogeno (Barry y cols. 1993). La presencia de multiples transgenes creana una probabilidad incrementada de apareamiento ectopico y por lo tanto esta de acuerdo con la correlacion entre el alto numero de copias y la resistencia viral extrema (Mueller y cols., 1995; Goodwin y cols. 1996; Pang y cols., 1996).
Toda esta area se ha revisado recientemente (p. ej. Baulcombe (1996) y Stam y cols. (1997)) y se presentaron varios modelos. Todos los modelos preven un alto grado de especificidad de secuencia debido a que la resistencia es muy espedfica (de la cepa) y por lo tanto apelan a una interaccion por apareamiento de bases con un ARN producido a partir del transgen. Una explicacion para la induccion de la resistencia al virus o la inactivacion genica con transgenes de sentido es que la ARN polimerasa dependiente del ARN de la planta genera ARN complementarios usando el ARNm transgenico como una plantilla (Schiebel y cols. 1993a,b). Este ARN complementario (ARNc) hipotetico no se ha detectado (Baulcombe 1996) pero se espera que los ARNc sean ARN pequenos y heterodispersos en vez de complementos completos (Schiebel 1993ab, Baulcombe 1996) y por lo tanto diffciles de detectar.
Los posibles metodos de accion del ARNc al mediar en la resistencia a virus o la inactivacion genica (segun se propone por Baulcombe, 1996) son:
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1: El ARNc se hibrida con ARNm transgenico o ARN viral y el duplex se convierte en una diana para dsRNasas.
2: El ARNc se hibrida con ARN diana para formar un duplex que puede detener la traduccion y por consiguiente tener un efecto indirecto sobre la estabilidad (Green, 1993).
3: El duplex formado entre el ARNc y el ARN viral provoca la detencion de la traduccion por el hforido de cofactores requeridos para la replicacion viral.
4. La hibridacion de los ARNc afecta al apareamiento de bases intramolecular requerido para la replicacion viral.
Los modelos actuales para resistencia a virus o inactivacion genica implican asf la induccion de un sistema de vigilancia citoplasmico bien mediante altos niveles de transcripcion transgenica o bien mediante la produccion de ARNm aberrante de una sola hebra. Una vez que el sistema se activa, ARN polimerasa dependiente de ARN elabora ARNc a partir del ARNm transgenico. Estos ARNc se hibridan al ARN diana bien directamente afectando a su traducibilidad o estabilidad, o bien marcando el ARN para la degradacion.
Los documentos US 5.190.131 y EP 0 467 349 A1 describen metodos y medios para regular o inhibir la expresion genica en una celula al incorporar o asociarse con el material genetico de la celula una secuencia de acido nucleico no natural que se transcribe para producir un ARNm que es complementario a y capaz de unirse al ARNm producido por el material genetico de esa celula.
El documento EP 0 223 399 A1 describe metodos para efectuar cambios somaticos utiles en plantas al provocar la transcripcion en las celulas vegetales de hebras de ARN negativas que son sustancialmente complementarias a una hebra de ARN diana. La hebra de ARN diana puede ser un transcrito de ARNm creado en la expresion genica, un ARN viral u otro ARN presente en las celulas vegetales. La hebra de ARN negativa es complementaria a al menos una porcion de la hebra de ARN diana para inhibir su actividad in vivo.
El documento EP 0 240 208 describe un metodo para regular la expresion de genes codificados en genomas de celulas vegetales, alcanzado mediante la integracion de un gen bajo el control transcripcional de un promotor que es funcional en el hospedador y en el que la hebra transcrita de ADN es complementaria a la hebra de ADN que se transcribe del gen o los genes endogenos que se quieren regular.
El documento EP 0 647 715 A1 y las patentes de EE. UU. 5.034.323, 5.231.020 y 5.283.184 describen metodos y medios para producir plantas que exhiben rasgos fenotfpicos deseados, al seleccionar transgenotes que comprenden un segmento de ADN enlazado operativamente a un promotor, en donde los productos de transcripcion del segmento son sustancialmente homologos a transcritos correspondientes de genes endogenos, particularmente genes endogenos de la ruta biosintetica de los flavonoides.
El documento WO 93/23551 describe metodos y medios para la inhibicion de dos o mas genes diana, que comprenden introducir en la planta un solo gen de control que tiene distintas regiones de ADN homologas a cada uno de los genes diana y un promotor operativo en plantas adaptado para transcribir desde tales regiones distintas ARN que inhibe la expresion de cada uno de los genes diana.
El documento WO92/13070 describe un metodo para la regulacion de la traduccion de acidos nucleicos, que presenta una molecula de ARN sensible que codifica un polipeptido e incluye ademas un dominio regulador, una region de sustrato y una secuencia de reconocimiento del ribosoma. Esta molecula de ARN sensible tiene una region inhibidora en el dominio regulador, dominio regulador que es complementario tanto a la region de sustrato de la molecula de ARN sensible como a una region antiinhibidora de un acido nucleico de senal de modo que, en ausencia del acido nucleico de senal, las regiones inhibidora y de sustrato forman un dominio con bases apareadas cuya formacion reduda el nivel de traduccion de una de las regiones codificantes de protema en la molecula de ARN sensible en comparacion con el nivel de traduccion de una region codificante de protema observado en presencia del acido nucleico de senal.
Metzlaff y cols., 1997 describen un modelo para la degradacion de ARN mediada por ARN y la inactivacion de calcona sintasa A en Petunia, que implica ciclos de apareamiento de ARN-ARN entre secuencias complementarias seguidos por escisiones de ARN endonucleolfticas para describir como es probable que se promueva la degradacion de ARN.
Fire y cols., 1998 describen una interferencia genetica espedfica mediante la introduccion experimental de ARN de doble hebra en Caenorhabditis elegans. Se analiza la importancia de estos hallazgos para la genomica funcional (Wagner y Sun, 1998).
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Que y cols., 1998 describen distintos patrones de supresion de pigmentos que se producen por transgenes de calcona sintasa de sentido y antisentido alelicos en flores de petunia y tambien han analizado los patrones de color de las flores en plantas heterocigoticas para alelos de calcona sintasa de sentido y antisentido.
El documento WO 98/05770 divulga ARN antisentido con estructuras secundarias especiales que se pueden usar para inhibir la expresion genica.
El documento WO 94/18337 divulga plantas transformadas que tienen acidos linolenicos incrementados o disminuidos asf como plantas que expresan una acido linoleico desaturasa.
El documento US 5.850.026 divulga un aceite endogeno procedente de semillas de Brassica que contiene, despues de la trituracion y la extraccion, mas de 86% de acido oleico y menos de 2,5% de acido a-linolenico. El aceite tambien contiene menos de 7% de acido linoleico. Las semillas de Brassica son producidas por plantas que contienen inhibicion espedfica para las semillas de la expresion de los genes de oleato desaturasa microsomica y linoleato desaturasa microsomica, en donde la inhibicion se puede crear mediante tecnologfa de cosupresion o antisentido.
El documento US 5.638.637 divulga aceite vegetal de semillas de colza y colza que produce el mismo, teniendo el aceite vegetal un contenido de acido oleico inusualmente alto de 80% a 90% en peso basado en el contenido total de acidos grasos.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona metodos para reducir la expresion fenotipica de un acido nucleico de interes, que se puede expresar en una celula vegetal, particularmente para reducir la expresion fenotfpica de un gen, particularmente un gen endogeno o un transgen extrano, integrado en el genoma de una celula vegetal o para reducir la expresion fenotipica del acido nucleico de interes que esta comprendido en el genoma de un virus infeccioso, que comprende la etapa de introducir, preferiblemente integrar, en el genoma nuclear de la celula vegetal, un ADN quimerico que comprende un promotor, capaz de ser expresado en la celula vegetal, y opcionalmente una region de ADN implicada en la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion y entre medias una region de ADN, que, cuando se transcribe, da una molecula de ARN con una secuencia nucleotfdica que comprende una secuencia nucleotidica de sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos, particularmente al menos aproximadamente 550 nucleotidos consecutivos, que tiene 100% de identidad de secuencia con al menos parte de una region codificante del acido nucleico de interes, y una secuencia nucleotidica antisentido que incluye al menos 20 nucleotidos consecutivos, que tiene 100% de identidad de secuencia con el tramo de 20 nucleotidos del complemento de la secuencia nucleotidica de sentido, en donde el ARN es capaz de formar una estructura de ARN de horquilla artificial con un tallo de ARN de doble hebra mediante apareamiento de bases entre las regiones con secuencia nucleotidica de sentido y antisentido de modo que al menos los 20 nucleotidos consecutivos de la secuencia de sentido se apareen por bases con los 20 nucleotidos consecutivos de la secuencia antisentido, dando como resultado una estructura de horquilla artificial en la que el ADN quimerico comprende uno o mas intrones en la region de ADN que cuando se transcribe da la molecula de ARN. Preferiblemente, el ADN quimerico esta integrado establemente en el genoma del ADN.
La invencion tambien proporciona una celula vegetal, que comprende un acido nucleico de interes que normalmente es capaz de ser expresado fenotfpicamente, que comprende ademas una molecula de ADN quimerico que comprende un promotor, capaz de ser expresado en esa celula vegetal, una region de ADN que, cuando se transcribe, da una molecula de ARN con una secuencia nucleotfdica que comprende una secuencia nucleotfdica de sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos que tiene 100% de identidad de secuencia con al menos parte de la secuencia nucleotfdica del acido nucleico de interes y una secuencia nucleotfdica antisentido que incluye al menos 20 nucleotidos consecutivos, que tiene 100% de identidad de secuencia con el complemento de los al menos 20 nucleotidos consecutivos de la secuencia nucleotfdica de sentido, en donde la molecula de ARN es capaz de formar una region de ARN de doble hebra mediante apareamiento de bases entre las regiones con secuencia nucleotfdica de sentido y antisentido de modo que al menos 20 nucleotidos consecutivos de la secuencia de sentido se aparean por bases con dichos 20 nucleotidos consecutivos de la secuencia antisentido, dando como resultado una estructura de ARN de horquilla, preferiblemente una estructura de horquilla artificial, y una region de ADN implicada en la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion, en donde la expresion fenotfpica del acido nucleico de interes se reduce significativamente y en donde el gen quimerico comprende uno o mas intrones en la region de ADN que, cuando se transcribe, da la molecula de ARN.
Con los objetivos, las ventajas y las caractensticas de la invencion precedentes y otros que se haran evidentes mas adelante, la naturaleza de la invencion se puede entender mas claramente con referencia a la siguiente descripcion detallada de las realizaciones de la invencion y a las reivindicaciones adjuntas.
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Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 representa esquematicamente las diferentes construcciones de sentido y antisentido, as^ como las llamadas construcciones de CoP (par complementario) usadas para obtener resistencia a virus (Fig 1B) o para reducir la expresion fenotipica de un gen Gus transgenico (Fig 1A).
La Figura 2A representa esquematicamente la llamada construccion de mango de sarten o construcciones de CoP usadas para reducir la expresion fenotfpica de un gen de A12 desaturasa en Arabidopsis (Pro Nos: promotor del gen de nopalina sintasa; nptll region codificante de neomicina fosfotransferasa; Term Nos: terminador del gen de nopalina sintasa; FP1: promotor de napina espedfico de semillas truncado; 480 pb: extremo 5' del gen Fad2 de Arabidopsis thaliana en la orientacion de sentido; 623 pb: espaciador; 480 pb: extremo 5' del gen Fad2 de Arabidopsis thaliana en la orientacion antisentido.
La Figura 2B representa esquematicamente una construccion de cosupresion comun para reducir la expresion fenotipica de un gen de A12 desaturasa en Arabidopsis thaliana.
Descripcion detallada
Se describe en la presente una celula vegetal con una molecula de ARN que comprende una estructura de horquilla que incluye una parte de sentido determinada y una parte antisentido determinada. Potencialmente, una molecula de ARN es capaz de formar varias estructuras secundarias, algunas de las cuales pueden contener la horquilla deseada. Se espera que la estructura secundaria real del ARN en la celula tenga la energfa libre mas baja. Segun la invencion, la molecula de ARN que se va a producir en la celula esta disenada de tal modo que al menos en su estado de energfa libre mas baja, que puede asumir dentro de esa celula, comprenda la horquilla deseada.
Segun se usa en la presente, "ARN de horquilla" se refiere a cualquier molecula de ARN de doble hebra autorrenaturalizante. En su representacion mas simple, un ARN de horquilla consiste en un tallo de doble hebra constituido por las hebras de ARN renaturalizantes, conectado por un bucle de ARN de una sola hebra, y tambien se denomina "ARN de mango de sarten". Sin embargo, el termino "ARN de horquilla" tambien esta destinado a abarcar estructuras de ARN secundarias mas complicadas que comprenden secuencias de ARN de doble hebra autorrenaturalizantes, pero tambien protuberancias y bucles internos. La estructura secundaria espedfica adaptada estara determinada por la energfa libre de la molecula de ARN, y se puede predecir para diferentes situaciones usando un software apropiado tal como FOLDRNA (Zuker y Stiegler, 1981).
Segun se usa en la presente, "identidad de secuencia" con respecto a secuencias nucleotfdicas (ADN o ARN) se refiere al numero de posiciones con nucleotidos identicos dividido por el numero de nucleotidos en la mas corta de las dos secuencias. El alineamiento de las dos secuencias nucleotfdicas se realiza mediante el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmann, 1983) usando un tamano de intervalo de 20 nucleotidos, una longitud de palabra de 4 nucleotidos y una penalizacion por hueco de 4. El analisis y la interpretacion asistidos por ordenador de los datos de las secuencias, incluyendo el alineamiento de secuencias como se describe anteriormente, se pueden realizar convenientemente, p. ej., usando los programas de Intelligenetics™ Suite (Intelligenetics Inc., CA). Las secuencias se indican como "esencialmente similares" cuando tal secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 75%, particularmente al menos aproximadamente 80%, mas particularmente al menos aproximadamente 85%, bastante particularmente aproximadamente 90%, especialmente aproximadamente 95%, mas especialmente aproximadamente 100%, bastante especialmente son identicas. Esta claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, la timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.
Segun se usa en la presente, el termino "promotor expresable por plantas" significa una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) la transcripcion en una celula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero tambien cualquier promotor de origen no vegetal que sea capaz de dirigir la transcripcion en una celula vegetal, es decir, ciertos promotores de origen viral o bacteriano tales como el CaMV35S, el promotor del virus del trebol subterraneo No 4 o No 7, o promotores del gen de T-ADN.
El termino "expresion de un gen" se refiere al proceso en el que una region de ADN que esta enlazada operativamente a regiones reguladoras apropiadas, particularmente a un promotor, se transcribe en un ARN que es biologicamente activo, es decir, que bien es capaz de interaccion con otro acido nucleico o bien que es capaz de ser traducido en un polipeptido o una protema. Se dice que un gen codifica un ARN cuando el producto final de la expresion del gen es ARN biologicamente activo, tal como, p. ej., un ARN antisentido, una ribozima o un producto intermedio replicativo. Se dice que un gen codifica una protema cuando el producto final de la expresion del gen es una protema o un polipeptido.
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Un acido nucleico de interes es "capaz de ser expresado" cuando dicho acido nucleico, cuando se introduce en una celula hospedadora adecuada, particularmente en una celula vegetal, se puede transcribir (o replicar) para dar un ARN, y/o traducir para dar un polipeptido o una protema en esa celula hospedadora.
El termino "gen" significa cualquier fragmento de ADN que comprenda una region de ADN (la “region de ADN transcrita") que se transcriba en una molecula de ARN (p. ej., un ARNm) en una celula enlazada operativamente a regiones reguladoras adecuadas, p. ej., un promotor expresable en plantas. Un gen puede comprender asf varios fragmentos de ADN enlazados operativamente tales como un promotor, una secuencia lfder 5', una region codificante y una region 3' que comprende un sitio de poliadenilacion. Un gen vegetal endogeno para una especie vegetal particular (gen vegetal endogeno) es un gen que se encuentra naturalmente en esa especie vegetal o que se puede introducir en esa especie vegetal mediante cruce convencional. Un gen quimerico es cualquier gen que no se encuentre normalmente en una especie vegetal o, alternativamente, cualquier gen en el que el promotor no este asociado en la naturaleza con parte o la totalidad de la region de ADN transcrita o con al menos otra region reguladora del gen.
Segun se usa en la presente, "expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes" se refiere a cualquier rasgo cuantitativo asociado con la expresion molecular de un acido nucleico en una celula hospedadora y asf puede incluir la cantidad de moleculas de ARN transcritas o replicadas, la cantidad de moleculas de ARN modificadas postranscripcionalmente, la cantidad de peptidos o protemas traducidos, la actividad de tales peptidos o protemas.
Un "rasgo fenotipico" asociado con la expresion fenotipica de un acido nucleico de interes se refiere a cualquier rasgo cuantitativo o cualitativo, incluyendo el rasgo mencionado, asf como el efecto directo o indirecto mediado sobre la celula, o el organismo que contiene esa celula, mediante la presencia de las moleculas de ARN, el peptido o la protema, o el peptido o la protema modificados postraduccionalmente. La mera presencia de un acido nucleico en una celula hospedadora no se considera una expresion fenotfpica o un rasgo fenotfpico de ese acido nucleico, aunque se pueda seguir cuantitativamente o cualitativamente. Ejemplos de efectos directos o indirectos mediados en celulas u organismos son, p. ej., rasgos agronomamente o industrialmente utiles, tales como resistencia a una plaga o enfermedad; contenido de aceite superior o modificado, etc.
Segun se usa en la presente, "reduccion de la expresion fenotfpica" se refiere a la comparacion de la expresion fenotfpica del acido nucleico de interes para la celula vegetal en presencia del ARN o los genes quimericos descritos en la presente con la expresion fenotfpica del acido nucleico de interes en ausencia del ARN o los genes quimericos que se describen en la presente. La expresion fenotfpica en presencia del ARN quimerico debe ser asf inferior que la expresion fenotfpica en ausencia del mismo, preferiblemente ser solo aproximadamente 25%, particularmente solo aproximadamente 10%, mas particularmente solo aproximadamente 5% de la expresion fenotfpica en ausencia del ARN quimerico, especialmente la expresion fenotfpica debe ser completamente inhibida para todos los propositos practicos por la presencia del ARN quimerico o el gen quimerico que codifica tal ARN.
Una reduccion de la expresion fenotfpica de un acido nucleico donde el fenotipo es un rasgo cualitativo significa que en presencia del ARN o el gen quimerico de la invencion, el rasgo fenotfpico cambia hasta un estado discreto diferente cuando se compara con una situacion en la que tal ARN o gen esta ausente. Una reduccion de la expresion fenotfpica de un acido nucleico se puede medir asf, entre otras cosas, como una reduccion en la transcripcion de (parte de) ese acido nucleico, una reduccion en la traduccion de (parte de) ese acido nucleico o una reduccion en el efecto que tiene la presencia del ARN o los ARN transcritos o el polipeptido o los polipeptidos traducidos sobre la celula vegetal o la planta, y finalmente conducira a rasgos fenotfpicos alterados. Esta claro que la reduccion en la expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes se puede efectuar mediante o correlacionarse con un incremento en un rasgo fenotfpico.
Segun se usa en la presente, "un acido nucleico de interes" o un "acido nucleico diana" se refiere a cualquier molecula de ARN o secuencia de ADN particular que pueda estar presente en una celula vegetal.
Segun se usa en la presente, "que comprende" se debe interpretar como especificar la presencia de las caractensticas, los numeros enteros, las etapas o los componentes indicados que se mencionen, pero no excluye la presencia o la adicion de uno o mas de las caractensticas, los numeros enteros, las etapas o los componentes, o grupos de los mismos. Asf, p. ej., un acido nucleico o una protema que comprende una secuencia de nucleotidos o aminoacidos puede comprender mas nucleotidos o aminoacidos que los citados realmente, es decir, estar incrustado en un acido nucleico o una protema mayor. Un gen quimerico que comprende una region de ADN que esta funcionalmente o estructuralmente definido puede comprender regiones de aDn adicionales, etc.
Se ha encontrado inesperadamente por los inventores que la introduccion de un gen quimerico capaz de ser transcrito a una molecula de ARN con una secuencia nucleotfdica que comprende la secuencia nucleotfdica tanto de sentido como antisentido de un gen diana, o una parte de la misma, integrada en el genoma nuclear de una celula vegetal, podna reducir eficazmente y espedficamente la expresion fenotfpica de ese gen diana. La reduccion en la expresion fenotfpica era mas eficaz y mas predecible que la observada cuando se introdudan genes quimericos separados en celulas similares con el gen diana, que codifica moleculas de ARN bien de sentido o bien antisentido.
Al mismo tiempo, tambien se ha observado que la introduccion simultanea de genes quimericos separados en una celula que codifica moleculas de ARN con secuencias nucleotidicas que comprenden sentido y antisentido, respectivamente, daba como resultado una resistencia al virus extrema, aunque los genes quimericos se transcribieran desde promotores mas debiles. Se sabe bien que la inactivacion genica y la resistencia al virus 5 pueden estar mediadas por fenomenos similares.
Se divulga en la presente un metodo para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes, que normalmente es capaz de expresarse en una celula vegetal, que comprende las etapas de introducir un ADN quimerico que comprender las siguientes partes enlazadas operativamente:
10 a) un promotor, operativo en esa celula, particularmente un promotor expresable en plantas;
b) una region de ADN capaz de ser transcrita en una molecula de ARN con una secuencia nucleotidica que comprende
i. una secuencia nucleotfdica de sentido de al menos 10 nt, preferiblemente 15 nucleotidos consecutivos, que tiene entre 75 y 100% de identidad de secuencia con al menos parte de la secuencia
15 nucleotidica del acido nucleico de interes; y
ii. una secuencia nucleotfdica antisentido que incluye al menos 10, preferiblemente 15 nucleotidos consecutivos, que tiene entre aproximadamente 75% y aproximadamente 100% de identidad de secuencia con el complemento de los al menos 10, preferiblemente 15 nucleotidos consecutivos, de la secuencia nucleotfdica de sentido;
20 en donde el ARN es capaz de formar un ARN de doble hebra mediante apareamiento de bases entre las
regiones con secuencia nucleotidica de sentido y antisentido dando como resultado una estructura de ARN de horquilla; y
c) una region de ADN implicada en la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion que funciona en las celulas eucarioticas adecuadas, funcionando particularmente en celulas vegetales.
25 En una realizacion preferida de la divulgacion, la molecula de ARN transcrita desde el gen quimerico consiste esencialmente en el ARN de horquilla.
Se cree que el orden de la secuencia nucleotfdica de sentido y antisentido en la molecula de ARN no es cntico.
30 Asf, en otras palabras, el ADN quimerico tiene una region de ADN transcrita que, cuando se transcribe, da una molecula de ARN que comprende una region de ARN capaz de formar una estructura de tallo-bucle artificial, en donde una de las secuencias de ARN renaturalizantes de la estructura de tallo-bucle comprende una secuencia, esencialmente similar a al menos parte de la secuencia nucleotfdica del acido nucleico de interes, y en donde la segunda de las secuencias de ARN renaturalizantes comprende una secuencia esencialmente similar a al menos 35 parte del complemento de al menos parte de la secuencia nucleotidica del acido nucleico de interes.
La molecula de ARN puede comprender varias estructuras de horquilla artificiales, que pueden estar disenadas para reducir la expresion fenotfpica de diferentes acidos nucleicos de interes.
40 En una realizacion preferida, el acido nucleico de interes, cuya expresion fenotfpica es elegida para ser reducida, es un gen incorporado en el genoma de una celula vegetal. Se apreciara que los medios y los metodos de la invencion se pueden usar para la reduccion de la expresion fenotfpica de un gen que pertenece al genoma de la celula segun esta presente en la naturaleza, (un gen endogeno), asf como para la reduccion de la expresion fenotfpica de un gen que no pertenece al genoma de la celula segun esta presente en la naturaleza, pero se ha introducido en esa celula 45 (un transgen). El transgen se puede introducir establemente o transitoriamente, y se puede integrar en el genoma nuclear de la celula, o estar presente sobre un vector de replicacion, tal como un vector viral.
En otra realizacion preferida, el acido nucleico de interes, cuya expresion fenotfpica es elegida para ser reducida, es un acido nucleico viral, particularmente una molecula de ARN viral, capaz de infectar una celula eucariotica, 50 particularmente una celula vegetal. En este caso, el fenotipo que se va a reducir es la replicacion del virus, y finalmente los smtomas de la enfermedad provocados por el virus infeccioso.
Preferiblemente, la secuencia nucleotidica del acido nucleico diana que corresponde a la secuencia nucleotidica de sentido es parte de una region de ADN que se transcribe, particularmente una region de ADN que se transcribe y se 55 traduce (en otras palabras, una region codificante). Se prefiere particularmente que la secuencia diana corresponda
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a uno o mas exones consecutivos, mas particularmente esta situada dentro de un solo exon de una region codificante.
La longitud de la secuencia nucleotidica de sentido puede variar de aproximadamente 20 nucleotidos (nt) hasta una longitud que iguale la longitud (en nucleotidos) del acido nucleico diana. Preferiblemente, la longitud total de la secuencia nucleotidica de sentido es al menos aproximadamente 50 nt, mas particularmente al menos aproximadamente 100 nt, especialmente al menos aproximadamente 150 nt, mas especialmente al menos aproximadamente 200 nt, bastante especialmente al menos aproximadamente 550 nt. Se espera que no haya lfmite superior para la longitud total de la secuencia nucleotfdica de sentido, aparte de la longitud total del acido nucleico diana. Sin embargo, por razones practicas (tales como, p. ej., la estabilidad de los genes quimericos) se espera que la longitud de la secuencia nucleotfdica de sentido no supere 5.000 nt, particularmente no supere 2.500 nt y debe estar limitada a aproximadamente 1.000 nt.
Se apreciara que cuanto mayor sea la longitud total de la secuencia nucleotidica de sentido, menos rigurosos se hacen los requisitos para la identidad de secuencia entre la secuencia nucleotidica de sentido total y la correspondiente secuencia en el gen diana. Preferiblemente, la secuencia nucleotidica de sentido total debe tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 75% con la correspondiente secuencia diana, particularmente al menos aproximadamente 80%, mas particularmente al menos aproximadamente 85%, bastante particularmente aproximadamente 90%, especialmente aproximadamente 95%, mas especialmente aproximadamente 100%, bastante especialmente ser identica a la parte correspondiente del acido nucleico diana. Sin embargo, se prefiere que la secuencia nucleotidica de sentido incluya siempre una secuencia de aproximadamente 20 nt, mas particularmente aproximadamente 50 nt, especialmente aproximadamente 100 nt, bastante especialmente aproximadamente 150 nt con 100% de identidad de secuencia con la parte correspondiente del acido nucleico diana. Preferiblemente, para calcular la identidad de secuencia y disenar la secuencia diana correspondiente, el numero de huecos se debe minimizar, particularmente para las secuencias de sentido mas cortas.
La longitud de la secuencia nucleotidica antisentido esta en gran parte determinada por la longitud de la secuencia nucleotidica de sentido, y preferiblemente corresponded a la longitud de la ultima secuencia. Sin embargo, es posible usar una secuencia antisentido que difiera en longitud en aproximadamente 10%. De forma similar, la secuencia nucleotidica de la region antisentido esta en gran parte determinada por la secuencia nucleotfdica de la region de sentido, y preferiblemente es identica al complemento de la secuencia nucleotfdica de la region de sentido. Particularmente con las regiones antisentido mas largas, sin embargo es posible usar secuencias antisentido con menor identidad de secuencia para el complemento de la secuencia nucleotidica de sentido, preferiblemente con al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia, mas preferiblemente con al menos aproximadamente 80%, particularmente con al menos aproximadamente 85%, mas particularmente con al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, especialmente con al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia nucleotfdica de sentido. No obstante, se prefiere que las secuencias nucleotfdicas antisentido siempre incluyan una secuencia de aproximadamente 20 nt, mas particularmente aproximadamente 50 nt, especialmente aproximadamente 100 nt, bastante especialmente aproximadamente 150 nt con 100% de identidad de secuencia con el complemento de una parte correspondiente de la secuencia nucleotidica de sentido. Esta claro que la longitud del tramo de los nucleotidos consecutivos con 100% de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia nucleotidica de sentido no puede ser mayor que la propia secuencia nucleotidica de sentido. De nuevo, preferiblemente, el numero de huecos se debe minimizar, particularmente para las secuencias antisentido mas cortas. Ademas, tambien se prefiere que la secuencia antisentido tenga entre aproximadamente 75% y 100% de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia diana.
La molecula de ARN que resulta de la transcripcion del ADN quimerico puede comprender una secuencia nucleotidica espaciadora situada entre las secuencia nucleotidica de sentido y antisentido. En ausencia de tal secuencia espaciadora, la molecula de ARN todavfa sera capaz de formar un ARN de doble hebra, particularmente si la secuencia nucleotfdica de sentido y antisentido son mayores de aproximadamente 10 nucleotidos y parte de la secuencia nucleotfdica de sentido y/o antisentido se usa para formar el bucle que permita el apareamiento de bases entre las regiones con secuencia nucleotfdica de sentido y antisentido y la formacion de un aRn de doble hebra. Se espera que no haya lfmites de longitud o requisitos de secuencia asociados con la region espaciadora, con tal de que estos parametros no interfieran con la capacidad de las regiones de ARN con la secuencia nucleotidica de sentido y antisentido para formar un ARN de doble hebra. En una realizacion preferida, la region espaciadora vana en longitud de 4 a aproximadamente 200 pb, pero, como se menciono previamente, puede estar ausente.
En una realizacion preferida, el ARN de horquilla formado por la region de sentido y antisentido y si es apropiado la region espaciadora es un ARN de horquilla artificial. Por "ARN de horquilla artificial" o "estructura de ARN de tallo- horquilla artificial" se entiende que tal ARN de horquilla no esta presente en la naturaleza, debido a que las regiones de sentido y antisentido que se definen no estan presentes en la naturaleza simultaneamente en una molecula de ARN, o las regiones de sentido y antisentido estan separadas por una region espaciadora que es heterologa con respecto al gen diana, particularmente, la secuencia nucleotidica del espaciador tiene una identidad de secuencia de menos de 75% con la secuencia nucleotidica de la secuencia diana, en la posicion 5' o 3' correspondiente de los puntos finales de la secuencia nucleotidica de sentido. Un ARN de horquilla tambien se puede indicar como artificial
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si no esta comprendido dentro de la molecula de ARN con la que esta normalmente asociado. Es concebible usar segun la invencion un ADN quimerico cuya transcripcion de como resultado una estructura de ARN de horquilla con una secuencia nucleotidica presente en la naturaleza (que por lo demas cumple los Kmites que se indican en esta memoria descriptiva) con la condicion de que este ARN de horquilla carezca de las secuencias de ARN circundantes (no implicadas en la formacion de la estructura de horquilla).
Aunque se prefiere que la molecula de ARN que comprende el ARN de horquilla no comprenda ademas una secuencia intronica, esta claro que los genes de ADN quimericos que codifican tales ARN pueden comprender en su region transcrita uno o mas intrones.
De hecho, los inventores han encontrado inesperadamente que la inclusion de una secuencia intronica en los genes de ADN quimericos que codifican una molecula de ARN que comprende el ARN de horquilla, preferiblemente en la region espaciadora, y preferiblemente en orientacion de sentido, potencia la eficacia de la reduccion de la expresion del acido nucleico diana. La potenciacion en la eficacia se puede expresar como un incremento en la frecuencia de plantas en las que se produce inactivacion o como un incremento en el nivel de reduccion del rasgo fenotfpico. En una realizacion particularmente preferida, el intron es esencialmente identico en secuencia al intron 2 de piruvato ortofosfato dicinasa 2 de Flaveria trinervia, mas particularmente, comprende la secuencia de SEQ ID N° 7.
Se ha observado que contrariamente a los metodos que usan secuencias nucleotfdicas bien antisentido o bien de sentido solas para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico diana (que generalmente depende de la dosificacion de la molecula de sentido o antisentido, y asf los genes quimericos que codifican las moleculas de sentido y antisentido necesitan estar bajo el control de promotores relativamente fuertes), el metodo divulgado en la presente no conffa en la presencia de tales regiones promotoras fuertes para conducir la produccion transcripcional del ARN que comprende la region tanto de sentido con antisentido. En otras palabras, una gama entera de promotores, particularmente promotores expresables en plantas, esta disponible para dirigir la transcripcion de los genes quimericos de la invencion. Estos incluye, pero no se limitan a, promotores fuertes tales como promotores CaMV35S (p. ej., Harpster y cols., 1988). A la luz de la existencia de formas variantes del promotor CaMV35S, como es sabido por los expertos, el objetivo de la invencion se puede alcanzar igualmente al emplear estos promotores de CaMV35S alternativos y variantes. Tambien esta claro que otros promotores expresables en plantas, particularmente promotores constitutivos, tales como los promotores de opina sintasa de los plasmidos Ti o Ri de Agrobacterium, particularmente un promotor de nopalina sintasa, o promotores del virus del trebol subterraneo, se podnan usar para obtener efectos similares. Tambien se contemplan por la invencion genes quimericos para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico en una celula, que estan bajo el control de promotores espedficos de ARN polimerasa del bacteriofago de una sola unidad, tales como un promotor espedfico de T7 o T3, con la condicion de que las celulas hospedadoras tambien comprendan la ARN polimerasa correspondiente en una forma activa.
Un objetivo adicional de la invencion es proporcionar metodos para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico en celulas vegetales espedficas al poner los genes quimericos de la invencion bajo el control de promotores espedficos de tejidos o espedficos de organos. Tales promotores espedficos de tejidos o espedficos de organos son muy conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, promotores espedficos de semillas (p. ej., documento WO89/03887), promotores espedficos de primordios de organos (An y cols., 1996), promotores espedficos del tallo (Keller y cols., 1988), promotores espedficos de las hojas (Hudspeth y cols.,1989), promotores espedficos del mesofilo (tales como los promotores de Rubisco inducibles por luz), promotores espedficos de las rafces (Keller y cols., 1989), promotores espedficos de tuberculos (Keil y cols., 1989), promotores espedficos del tejido vascular (Peleman y cols., 1989), promotores selectivos de los estambres (documentos WO 89/10396, WO 92/13956), promotores espedficos de la zona de dehiscencia (documento WO 97/13865) y similares.
En otra realizacion de la invencion, la expresion de un gen quimerico para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico diana puede ser controlada a voluntad mediante la aplicacion de un inductor qmmico apropiado, al enlazar operativamente la region de ADN transcrita de los genes quimericos de la invencion a un promotor cuya expresion es inducida por un compuesto qmmico, tal como el promotor del gen divulgado en la Publicacion de Patente Europea ("EP") 0332104, o el promotor del gen divulgado en el documento WO 90/08826.
El gen o los genes quimericos para la reduccion de la expresion fenotfpica de un acido nucleico diana de interes en una celula bien se pueden introducir transitoriamente o bien se pueden integrar establemente en el genoma nuclear de la celula. En una realizacion, el gen quimerico se situa en un vector viral, que es capaz de replicarse en la celula vegetal (veanse, p. ej., los documentos Wo 95/34668 y WO 93/03161).
El ADN recombinante que comprende el gen quimerico para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes en una celula hospedadora puede estar acompanado por un gen marcador quimerico, particularmente cuando se preve la integracion estable del transgen en el genoma de la celula hospedadora. El gen marcador quimerico puede comprender un ADN marcador que esta enlazado operativamente en su extremo 5' a un promotor, que funciona en la celula hospedadora de interes, particularmente un promotor expresable en plantas, preferiblemente un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMV 35S, o un promotor inducible por luz tal como el promotor del gen que codifica la subunidad pequena de Rubisco; y enlazado operativamente en su extremo 3' a senales de formacion y poliadenilacion del extremo 3' por transcripcion de plantas adecuadas. Se espera que la
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eleccion del ADN marcador no sea cntica, y se puede usar cualquier ADN marcador adecuado. Por ejemplo, un ADN marcador puede codificar una protema que proporcione un color distinguible a la celula vegetal transformada, tal como el gen A1 (Meyer y cols., 1987), puede proporcionar resistencia a herbicidas a la celula vegetal transformada, tal como el gen bar, que codifica la resistencia a fosfinotricina (documento EP 0.242.246), puede proporcionar resistencia a antibioticos a las celulas transformadas, tal como el gen aac(6), que codifica la resistencia a gentamicina (documento WO94/01560).
Un ADN recombinante que comprende un gen quimerico para reducir la expresion fenotfpica de un gen de interes se puede incorporar establemente en el genoma nuclear de una celula de una planta. La transferencia genica se puede llevar a cabo con un vector que es un plasmido Ti desarmado, que comprende un gen quimerico de la invencion, y soportado por Agrobacterium. Esta transformacion se puede llevar a cabo usando los procedimientos descritos, por ejemplo, en el documento EP 0 116 718.
Alternativamente, se puede usar cualquier tipo de vector para transformar la celula vegetal, aplicando metodos tales como transferencia genica directa (segun se describe, por ejemplo, en el documento EP 0 233 247), transformacion mediada por polen (segun se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0 270 356, WO85/01856 y US 4,684,611), transformacion mediada por virus de ARN de planta (segun se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0 067 553 y US 4.407.956), transformacion mediada por liposomas (segun se describe, por ejemplo, en el documento US 4.536.475), y similares.
Tambien son adecuados otros metodos, tales como bombardeo con microproyectiles segun se describe para el mafz por Fromm y cols. (1990) y Gordon-Kamm y cols. (1990). Celulas de plantas monocotiledoneas, tales como los principales cereales, tambien se pueden transformar usando tejido embrionario compacto herido y/o degradado con enzimas capaz de formar callo embriogenico compacto, o embriones inmaduros heridos y/o degradados segun se describe en el documento WO92/09696. La celula vegetal transformada resultante se puede usar a continuacion para regenerar una planta transformada de un modo convencional.
La planta transformada obtenida se puede usar en un esquema de cruce convencional para producir mas plantas transformadas con las mismas caractensticas o para introducir el gen quimerico para la reduccion de la expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes de la invencion en otras variedades de la misma especie de planta o una relacionada, o en plantas tubridas. Las semillas obtenidas de las plantas transformadas contienen los genes quimericos de la invencion como una insercion genomica estable.
Un objetivo adicional de la invencion es proporcionar celulas vegetales y plantas que comprenden los genes quimericos para la reduccion de la expresion fenotfpica de un acido nucleico diana segun se describe en la invencion.
Se apreciara que los metodos y los medios descritos en la memoria descriptiva tambien se pueden aplicar en metodos de cribado de alto rendimiento (HTS), para la identificacion o confirmacion de fenotipos asociados con la expresion de una secuencia de acido nucleico con la funcion todavfa no identificada en una celula vegetal.
Tal metodo comprende las etapas de
1. seleccionar una secuencia diana dentro de la secuencia de acido nucleico de interes con funcion/fenotipo no identificados o no confirmados cuando se expresa. Preferiblemente, si el acido nucleico tiene marcos de lectura abiertos putativos, la secuencia diana debe comprender al menos parte de uno de estos marcos de lectura abiertos. La longitud de la secuencia nucleotfdica diana puede variar de aproximadamente 10 nucleotidos hasta una longitud que iguale la longitud (en nucleotidos) del acido nucleico de interes con funcion no identificada.
2. disenar una molecula de ARN que comprende una secuencia nucleotfdica de sentido y una secuencia nucleotfdica antisentido segun la invencion.
3. introducir la molecula de ARN que comprende las secuencias nucleotfdicas tanto de sentido como antisentido disenada sobre la base de la secuencia diana en una celula vegetal adecuada, que comprende el acido nucleico con la secuencia nucleotfdica con fenotipo todavfa no identificado. El ARN se puede introducir por medio de un ADN quimerico que comprende un promotor operativo en la celula hospedadora de interes, particularmente un promotor expresable en plantas, y una region de ADN que funciona como una senal de formacion y poliadenilacion del extremo 3' (terminador) adecuada que funciona en la celula hospedadora, con una region de ADN intercalada que se puede transcribir para dar la molecula de ARN que comprende la secuencia nucleotfdica de sentido y antisentido. El ADN quimerico bien se puede introducir transitoriamente o bien se puede integrar en el genoma nuclear. El ADN quimerico tambien se puede proporcionar en un vector viral (veanse, p. ej., los documentos WO 95/34668 y WO 93/03161)
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4. observar el fenotipo mediante un metodo adecuado. Dependiendo del fenotipo esperado, puede ser suficiente observar o medir el fenotipo de una sola celula, pero tambien se puede requerir cultivar las celulas para obtener un nivel multicelular (organizado), o incluso para regenerar un organismo transgenico, particularmente una planta transgenica.
En su realizacion mas sencilla, la molecula de ARN que comprende las secuencias nucleotfdicas tanto de sentido como antisentido para al menos parte de un acido nucleico de interes, adecuada para los metodos de la invencion, se puede obtener al clonar dos copias de una region de ADN con la secuencia diana seleccionada en una orientacion repetida invertida (preferiblemente separada por una region de ADN corta que no contiene una senal de terminacion de la transcripcion, y codifica la secuencia espaciadora) bajo un promotor adecuado. Este ADN quimerico se introduce en la celula hospedadora.
Los metodos y los medios descritos en la presente se pueden usar asf para reducir la expresion fenotipica de un acido nucleico en una celula vegetal o una planta, para obtener resistencia a la rotura (documento WO 97/13865), para obtener patrones de color de las flores modificados (documentos EP 522 880, US 5.231.020), para obtener plantas resistentes a los nematodos (documentos WO 92/21757, WO 93/10251, WO 94/17194), para retrasar la maduracion de los frutos (documentos WO 91/16440, WO 91/05865, WO 91/16426, WO 92/17596, WO 93/07275, WO 92/04456, US 5.545.366), para obtener androesterilidad (documentos WO 94/29465, WO89/10396, WO 92/18625), para reducir la presencia de metabolitos (secundarios) no deseados en organismos, tales como glucosinolatos (documento WO97/16559) o el contenido de clorofila (EP 779 364) en plantas, para modificar el perfil de metabolitos sintetizados en una celula u organismo eucariotico mediante ingeniena metabolica, p. ej. al reducir la expresion de genes particulares implicados en el metabolismo de los carbohidratos (documentos WO 92/11375, WO 92/11376, US 5.365.016, WO 95/07355) o la biosmtesis de lfpidos (documentos WO 94/18337, US 5.530.192), para retrasar la senescencia (documento WO 95/07993), para alterar la lignificacion en plantas (documentos WO 93/05159, WO 93/05160), para alterar la calidad de las fibras en el algodon (documento US 5.597.718), para incrementar la resistencia a las magulladuras en patatas al reducir la polifenoloxidasa (documento WO 94/03607), etc.
Los metodos de la invencion conduciran a mejores resultados y/o mayores eficacias en comparacion con los metodos que usan secuencias nucleotidicas de sentido o antisentido convencionales y se cree que otros mecanismos espedficos de las secuencias que regulan la expresion fenotfpica de acidos nucleicos diana podnan estar implicados y/o ser activados por la presencia de las moleculas de ARN de doble hebra descritas en esta memoria descriptiva.
Se ha descrito una aplicacion particular para la reduccion de la expresion fenotfpica de un transgen en una celula vegetal, entre otros, mediante metodos de sentido o antisentido, para la restauracion de la androfertilidad, obteniendose la ultima mediante la introduccion de un transgen que comprende un ADN de androesterilidad (documentos WO 94/09143, WO 91/02069). El acido nucleico de interes es espedficamente el ADN de androesterilidad. De nuevo, los procedimientos y los productos descritos en esta invencion se pueden aplicar a estos metodos a fin de llegar a una restauracion mas eficaz de la androfertilidad.
Los metodos y medios descritos en la presente, particularmente los que implican moleculas de ARN que comprenden un ARN de horquilla y los genes quimericos codificantes, han resultado ser particularmente adecuados para la modificacion de la composicion del contenido de aceite en plantas, particularmente en semillas. Plantas particularmente preferidas son plantas de cultivo usadas para la produccion de aceite tales como, pero no limitadas a, colza (Brassica juncea, napus, rapa, oleracea, campestris), mafz, algodon, cacahuete, girasol, semillas de ricino, lino, coco, linaza, soja. Genes diana preferidos son los genes de desaturasa, particularmente genes que codifican A12 desaturasa tales como los codificados por los genes Fad2, especialmente los genes cuya secuencia nucleotidica se puede encontrar en la base de datos Genbank bajo en numero de registro AF123460 (de Brassica carinata), AF12042841 (Brassica rapa), L26296 (Arabidopsis thaliana) o A65102 (Corylus avellana). Esta claro que esta totalmente al alcance del experto en la tecnica obtener genes homologos a los genes fad2 divulgados procedentes de otras especies, p. ej. mediante tecnicas de hibridacion y/o PCR.
Variantes preferidas para la configuracion de secuencias nucleotfdicas de sentido y antisentido, particularmente en lo relativo a la longitud y la secuencia, son como las mencionadas en otras partes de esta memoria descriptiva. Ademas, variantes preferidas para genes quimericos que codifican moleculas de ARN que contienen horquillas, particularmente en lo relativo a elementos promotores, son como se describe, en otras partes de esta memoria descriptiva. Para esta solicitud, se prefiere particularmente que los promotores sean promotores espedficos de celulas.
Se divulga en la presente que la molecula de ARN que comprende el ARN de horquilla comprende asf parte de un ORF que codifica A12 desaturasa en orientacion de sentido y una parte similar en orientacion antisentido, preferiblemente separadas por una secuencia espaciadora. En una variante particularmente preferida el ARN de horquilla artificial (o su gen quimerico codificante) comprende la secuencia nucleotfdica de SEQ ID N° 6 o una secuencia nucleotfdica construida de forma similar basada en los susodichos genes fad2 de Brassica.
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Preferiblemente, el gen quimerico que codifica el ARN de horquilla artificial se transcribe bajo el control de un promotor espedfico de semillas, particularmente bajo el control del promotor FPI segun se describe en otras partes en esta solicitud.
Una reduccion de la expresion del gen de A12 desaturasa en plantas que contienen aceite conduce a un incremento en el acido oleico y una disminucion concomitante en el acido linolenico y el acido linoleico. Se encuentra una frecuencia superior de plantas con aceite en las que es significativo el incremento en acido oleico y la disminucion concomitante en el acido linolenico y linoleico usando los medios y los metodos de la invencion que en plantas transgenicas que alojan construcciones de cosupresion comunes. Por otra parte, los niveles absolutos de incremento, y respectivamente disminucion, son superiores, y respectivamente inferiores, que en plantas transgenicas que alojan construcciones de cosupresion comunes.
Usando los medios y los metodos descritos en la presente, es asf posible obtener plantas y semillas, que comprenden un aceite del cual la composicion despues de la trituracion y la extraccion tiene un contenido incrementado de acido oleico (expresado como un porcentaje de la composicion de acidos grasos total), particularmente un incremento de tres veces, cuando se comparan con plantas de control.
Se espera que usando los metodos y los medios descritos en la presente, se pueda obtener una planta de Brassica transgenica, cuyas semillas comprenden un aceite en el que el contenido de acido oleico supera el 90% del contenido de acidos grasos total.
Los metodos y los medios de la invencion seran especialmente adecuados para obtener resistencia a virus, particularmente resistencia a virus extrema, en celulas u organismos eucarioticos, particularmente en celulas vegetales y plantas. Una lista no limitativa de virus para plantas contra los que se puede obtener resistencia se representa en la tabla I.
Los metodos y los medios de la invencion permiten ademas el uso de genes virales, hasta ahora no usados para obtener plantas resistentes a virus, ademas de los genes de protema de envuelta o genes de replicasa usados comunmente. Tales genes virales diferentes incluyen genes codificados por proteasas (Pro), genes que codifican protema ligada al genoma (Vpg), genes que codifican cuerpos de inclusion citoplasmicos (CI) como secuencias de acido nucleico diana para obtener plantas resistentes a virus.
Esta claro que la invencion sera especialmente adecuada para la reduccion de la expresion fenotfpica de genes pertenecientes a familias multigenicas.
Tambien esta claro que los metodos y los medios de la invencion son adecuados para la reduccion de la expresion fenotfpica de un acido nucleico en todas las celulas vegetales de todas las plantas, ya sean plantas monocotiledoneas o dicotiledoneas, particularmente plantas de cultivo tales como, pero no limitadas a, mafz, arroz, trigo, cebada, cana de azucar, algodon, colza, soja, hortalizas (incluyendo achicoria, brasicaceas, lechuga, tomate), tabaco, patata, remolacha azucarera, pero tambien plantas usadas en horticultura, floricultura o silvicultura. Los medios y los metodos de la invencion seran particularmente adecuados para plantas que tienen genomas complejos, tales como plantas poliploides.
Se espera que las moleculas de ARN quimericas producidas mediante la transcripcion de los genes quimericos descritos en la presente se puedan extender sistemicamente a traves de un planta, y asf sea posible reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico en celulas de un vastago no transgenico de una planta injertado en un pie transgenico que comprende los genes quimericos de la invencion (o viceversa), un metodo que puede ser importante en horticultura, viticultura o produccion de frutas.
Los siguientes Ejemplos no limitativos describen la construccion de genes quimericos para la reduccion de la expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes en una celula vegetal y el uso de tales genes. A menos que se indique otra cosa en los Ejemplos, todas las tecnicas de ADN recombinante se llevan a cabo segun protocolos estandar como los descritos en Sambrook y cols. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los Volumenes 1 y 2 de Ausubel y cols. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE. UU. de A. Materiales y metodos estandar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.
A lo largo de la descripcion y los Ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:
SEQ ID N° 1: secuencia del fragmento del virus Y de la patata del gen Nia usado para la construccion de diversas construcciones de sentido y antisentido, para obtener resistencia al virus.
SEQ ID N° 2: secuencia de la region codificante de la construccion de CoP de Gusd del Ejemplo 1.
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SEQ ID N° 3 secuencia de una region no traducida 5' (5'UTR) modificada procedente del virus del mosaico de la canuela
SEQ ID N° 4 secuencia del promotor No 4 del virus del trebol subterraneo con potenciador S7.
SEQ ID N° 5 secuencia del potenciador-promotor No 4 doble del virus del trebol subterraneo.
SEQ ID N° 6 secuencia de la construccion de CoP para la inhibicion de la expresion del gen de A12desaturasa.
SEQ ID N° 7 secuencia del intron 2 de piruvato ortofosfato dicinasa de Flaveria trinervia.
El siguiente texto libre se incluye en la lista de secuencias:
<223> fragmento del ORF de NIa
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: region codificante de la construccion de CoP de Gusd <223> region codificante de Gus deficiente
<223> antisentido con respecto al extremo 5' de la region codificante de Gus
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: 5'UTR del virus del mosaico de la canuela
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Promotor S4 del virus de trebol subterraneo con potenciador S7
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Promotor S4 del virus de trebol subterraneo con potenciador S4
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: secuencia codificante de la construccion de CoP de desaturasa
<223> correspondiente al extremo 5' de la region codificante de delta12-desaturasa (fad2), en la orientacion de
sentido
<223> correspondiente al extremo 5' de la region codificante de delta12-desaturasa (fad2), en la orientacion antisentido
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: intron 2 de la piruvato ortofosfato dicinasa de Flaveria trinervia
Los siguientes ejemplos se presentan a fin de ilustrar mas a fondo las realizaciones preferidas de la invencion. Sin embargo, no se debe considerar de ningun modo que limiten el amplio alcance de la invencion.
Ejemplo 1
Procedimientos experimentales Construccion genica
Se usaron metodos de clonacion genica estandar (Sambrook y cols. 1989) para elaborar los genes quimericos. Una representacion esquematica de las construcciones usadas se muestra en las Figuras 1A y 1B.
Los componentes para estas construcciones eran:
* Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor procedente del aislado Cabb-JI (35S) (Harpster y cols., 1988)
* Terminador de octopina sintasa (ocs-t) (MacDonald y cols., 1991)
* Promotor del virus del trebol subterraneo No 4 (S4) (documento WO 9606932)
* Terminador del virus del trebol subterraneo No 4 (s4t) (documento WO 9606932)
* Potenciador-promotor doble del virus del trebol subterraneo No 4 (S4S4) (SEQ ID N° 5)
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* Promotor del virus del trebol subterraneo No 4 con el potenciador S7 (S7S4) (SEQ ID N° 4)
* Promotor de ubiquitina de mafz (Ubi) (Christensen y Quail, 1996)
* Terminador del gen de morfologfa tumoral 1 de Agrobacterium (tm1') (Zheng y cols., 1991)
* el gen Nia de una cepa australiana del virus Y de la patata (Nia) (SEQ ID N° 1)
* un ADN que codifica un marco de lectura abierto de p-glucuronidasa disfuncional (Gusd) (SEQ ID N° 2 desde el nucleotido 1 hasta el nucleotido 1581)
* una region no traducida 5' (5'UTR) modificada del virus del mosaico de la canota (JGMV5') (SEQ ID N° 3).
Esta contiene una insercion de un sitio NcoI en el codon de iniciacion ATG seguida por tres codones de terminacion en el marco, y un sitio PstI (para la insercion del intron como en las construcciones 4 y 5 de la Figura 1A). En las construcciones vectoriales 2 y 6 de la Figura 1A, el marco de lectura abierto de Gusd se inserta en el sitio NcoI, retirando los codones de terminacion; en todas las otras construcciones de la Fig 1A, se inserta aguas abajo del sitio PstI.
* un intron de catalasa de semillas de ricino (Ohta y cols., 1990) segun se modifica por Wang y cols.(1997) ("intron").
Los genes quimericos se construyeron ensamblando operativamente las diferentes partes segun se indica esquematicamente en la Figura 1A o la Figura 1B e insertando los genes quimericos obtenidos en los vectores de T- ADN vectores pART27 y pART7 (Gleave, 1992) entre el lfmite izquierdo del T-ADN y el gen neo quimerico expresable en plantas.
El ADN que codifica un marco de lectura abierto de p-glucuronidasa disfuncional (GUSd) se obtuvo al suprimir de una region codificante de gus la secuencia entre los dos sitios de restriccion EcoRV. Para la construccion del gen quimerico que codifica la molecula de ARN que comprende la secuencia nucleotidica tanto de sentido como antisentido para un gen de p-glucuronidasa, se anadio una secuencia al gen Gusd para permitir el apareamiento de bases del extremo 5' a lo largo de 558 bases dando como resultado una secuencia como la representada en SEQ ID N° 2. Esta secuencia se clono entre el promotor de ubiquitina de mafz y el terminador tm1' y se inserto en un vector de T-ADN.
Se construyeron vectores de T-ADN que comprendfan un primer y un segundo gen quimerico de resistencia a virus, en donde el primer gen quimerico consistfa en:
1. una secuencia promotora CaMV 35S, acoplada a
2. en la orientacion de sentido, la secuencia nucleotfdica procedente de PVY que codifica bien
• protema Vpg (vease, p. ej., en N° de Registro de Genbank Z29526 desde el nucleotido 1013 hasta el nucleotido 1583), bien
• parte de la protema CI (vease, p. ej., el N° de Registro del Genbank M95491 desde el nucleotido 3688 hasta el nucleotido 4215) o bien
• proteasa (Pro) (vease, p. ej., el N° de Registro de EMBL D00441 desde el nucleotido 5714 hasta el nucleotido 7009), seguida por
3. el terminador S4 del virus del mosaico del trebol subterraneo, segun se describe anteriormente.
El segundo gen quimerico consiste en
1. un promotor S4 como el descrito anteriormente, acoplado a
2. en la orientacion antisentido, la secuencia nucleotidica procedente de PVY que codifica bien
• protema Vpg, bien
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• protema CI o bien
• proteasa, seguido por
3. el terminador de octopina sintasa que se describe anteriormente.
Las secuencias de sentido y antisentido dentro de un vector de T-ADN se derivaron de la misma region codificante de PVY.
Ademas, se construyeron vectores de T-ADN para el uso en la alteracion de la composicion de acidos grasos de un aceite (vease la Fig 2), que comprenden
1. un promotor FP1 (promotor de napina espedfico de semillas truncado, que contiene las secuencias entre -309 y +1, segun se describe en Stalberg y cols; enlazado a
2. la secuencia nucleotfdica of SEQ ID N° 6, que comprende los 480 pb situados 5' en el ORF que codifica la A12 desaturasa de Arabidopsis thaliana (Fad2) en la orientacion de sentido y en la orientacion antisentido, enlazada mediante una secuencia espaciadora de 623 pb; seguida por
3. el terminador procedente del gen de nopalina sintasa.
Ademas, se construyeron vectores de T-ADN para evaluar la influencia de una presencia de una secuencia intronica en los genes quimericos que codifican construcciones de CoP. A este fin, se elaboraron construcciones que comprendfan:
1. un promotor CamV35S, seguido por
2. el ORF que codifica proteasa procedente de PVY (vease anteriormente) en la orientacion de sentido;
3. la secuencia de SEQ ID No 7 (que codifica el intron 2 de piruvato ortofosfato dicinasa de Flaveria trinervia)
4. el ORF que codifica proteasa procedente de PVY en la orientacion antisentido; y
5. el terminador del gen de octopina sintasa.
Transformacion de plantas
El tejido de Nicotiana tabacum (W38) se transformo y se regenero en plantas enteras esencialmente como se describe por Landsman y cols. (1988). El arroz (Oryza sativa) se transformo esencialmente como se describe por Wang y cols. (1997).
Sobretransformacion de arroz
Embriones maduros procedentes de una planta de arroz que expresa actividad de GUS e higromicina fosfotransferasa (HPT) se cortaron de semillas maduras y se pusieron sobre medio inductor de callos durante 7 semanas. Se recuperaron callos de estos cultivos, se incubaron con agrobacterias que conteman diversas construcciones vectoriales binarias durante 2 dfas, a continuacion se pusieron sobre medio callificante que contema higromicina, bialafos y Timentin™. Durante las cuatro semanas siguientes se desarrollaron callos resistentes a higromicina y bialafos. Estas lmeas callosas se mantuvieron sobre medios que conteman higromicina y bialafos durante 2 meses mas antes de ensayarse con respecto a la actividad de GUS.
Ensayo de GUS
Los callos de arroz se probaron con respecto a la actividad de GUS usando el colorante histoqmmico X-glucuronido o el sustrato fluorogenico glucuronido de 4-metil-umbeliferona (MUG) esencialmente como se describe por Jefferson y cols. (1987).
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Ejemplo 1. Comparacion de genes quimericos que comprenden la secuencia solo antisentido, solo de sentido o tanto de sentido como antisentido (par complementario (CoP)) para la reduccion en la expresion fenotfpica de un gen de p-glucuronidasa integrado. (Comparativo)
Tejido de arroz transgenico que expresa p-glucuronidasa (GUS) a partir de un solo transgen (y resistencia a higromicina a partir de un gen hph) (lmeas VlO-28 y V10-67) se sobretransformo usando vectores que conteman el gen bar que confiere resistencia a fosfinotricina y diversas construcciones de sentido, antisentido y CoP (vease la Figura 1A) derivadas de un gen GUS lisiado (GuSd). El tejido sobretransformado se mantuvo en un medio de seleccion de higromicina y bialafos durante 3 semanas y a continuacion se analizo con respecto a la actividad de GUS. Se uso un gen GUS lisiado de modo que la expresion a partir de este gen no se superpusiera a la actividad de GUS endogena.
Las cifras de la Tabla 2 representan la velocidad de produccion de MU medida mediante absorcion a 455 nm, con excitacion a 365 nm de 1,5 |jg de protema total en un volumen de reaccion de 200 jl. La velocidad se midio a lo largo de 30 min. a 37°C. La lectura para callos de arroz no transgenico era 0,162. Las cifras entre parentesis que siguen a la descripcion de la construccion introducida se refieren a la Figura 1A.
Los resultados (Tabla 2) mostraban que la sobretransformacion con el vector binario que contiene el gen bar sin el gen GUSd no tema un efecto inactivador sobre la actividad de GUS endogena. La sobretransformacion con GUSd en una orientacion de sentido o antisentido, con o sin un intron o un codon de terminacion temprano, mostraba algun grado de reduccion (en aproximadamente ~25% de los callos analizados) de la actividad de GUS endogena (veanse las dos ultimas filas de la Tabla 2 que representan el porcentaje de callos analizados con una lectura de ensayo de MUG de menos de 2,000). Sin embargo, la sobretransformacion con una construccion de CoP daba en de aproximadamente 75% a 100% de los callos analizados una reduccion de la actividad de GUS endogena. Esta construccion de CoP se diseno de modo que el extremo 3' del ARNm producido pudiera formar un duplex con el extremo 5' del transcrito para dar una estructura de "mango de sarten".
Estos datos muestran que se puede elaborar un par complementario usando un transcrito autorrenaturalizante, que este diseno es mucho mas eficaz que una construccion de sentido o antisentido convencional y que el enfoque se puede usar para reducir la expresion fenotfpica de genes presentes en una celula vegetal.
Tabla 2. Ensayo de MUG de Callos de Arroz Sobretransformado
Casete vectorial (1) Sentido (2) Sentido + terminacion (3) Sentido + terminacion + intron (4) Antisentido + terminacion + intron (5) CoP repetida invertida (6)
V10- 28
121,0 97,45 38,43 38,88 0,290 0,565
45,58 6,637 64,16 115,5 0,572 0,316
99,28 71,60 149,2 133,0 37,2 0,351
26,17 0,224 0,955 98,46 53,94 0.210
92,21 0,321 68,32 0,502 105,5 0,701
108,8 5,290 105,6 39,35 56,73 0,733
6,432 0,9460 136,6 1,545 60,36 2,103
90,80 32,44 140,4 10,36 71,12 119,8
98,24 128,8 62,38 111,6 13,17 0,717
93,76 31,28 17,79 14,42 0,424 0,398
5,023 88,06 26,98 0,315
40,27 52,28 115,5 0.270
36,40 30,26 149,7 16,78
53,24 107,5 66,75 67,28
29,97 26,75 145,8 0.217
89,06 105,1 0,534 0,208
0,256 135,1 9,4
68,23 95,04 35,33
5,481 71,5
Casete vectorial (1) Sentido (2) Sentido + terminacion (3) Sentido + terminacion + intron (4) Antisentido + terminacion + intron (5) CoP repetida invertida (6)
V10- 67
318,8 93,43 0,199 31,82 1,395 0,472
109,5 73,19 0,197 58,08 152,4 0.256
30,35 128,1 0,157 56,32 67,42 0.296
40,04 1,506 128 44,62 12,11 0,452
228 140,6 130,3 0,454 0,668 0,422
23,05 1,275 196,2 17,32 23,34 0,196
241,2 0,272 12,43 73,2 76,10 0.294
118,5 0,209 140,0 20,32 130,1 0,172
11,27 42,05 90,13 107,4 0,841 0,436
110,6 117,5 157,4 0,453 66,12 0,398
19,29 118,9 0,518 87,81 136,9 0.242
121,0 21,44 0,231 0,299 67,92
115,1 155,0 116,1 0,206 50,32
77,1 190,9 43,18 12,47 170,3
106,1 0,773 31,06 0,213 108,9
73,12 0,146 11,15 1,241
29,97 19,22 4,092
50,11 169,6
80,34 76,88
117,8 22,08
159,1 91,6
67,52 7,855
92,32 69,76
27,97 0,822
V10- 28
0% 21% 10% 10,5% 22% 75%
V10- 67
0% 37,5% 33% 29,5% 21% 100%
Ejemplo 2. Comparacion de la eficacia de usar genes quimericos que comprenden solamente genes antisentido, solamente genes de sentido o ambos genes simultaneamente para obtener resistencia a virus en plantas transgenicas (Comparativo).
Se elaboraron construcciones genicas usando la secuencia que codifica proteasa de PVY (SEQ ID N° 1) en una 5 orientacion de sentido, una orientacion antisentido y en una orientacion de par complementary (CoP), donde el T- ADN comprendfa genes quimericos tanto de sentido como antisentido, cada uno bajo el control de su propio promotor. En las tres disposiciones, se uso el promotor CaMV35S. Se elaboraron cinco versiones diferentes de construcciones de CoP en las que el segundo promotor era bien el promotor CaMV35S, bien el promotor S4, bien el promotor S4 doble, bien el promotor S4 potenciado con S7, o bien el promotor rolC espedfico de la vasculatura 10 (vease la Figura 1 B).
Estas construcciones se transformaron en tabaco (a traves de transferencia de ADN mediada por Agrobacterium) y se recuperaron aproximadamente 25 plantas transformadas independientemente por construccion de gen quimerico. Las plantas transgenicas se transfirieron a tierra y se mantuvieron en el invernadero. Aproximadamente 1 mes 15 despues de trasplantar a la tierra, las plantas fueron inoculadas manualmente con virus Y de patata, usando metodos de aplicacion estandar. Dos y cuatro semanas mas tarde las plantas se puntuaron con respecto a los smtomas del virus. Los resultados (Tabla 3) mostraban que despues de 1 mes, 2 de 27 plantas que comprendfan
5
10
15
20
25
30
solamente el gen de sentido y 1 de 25 plantas que comprendfan solamente el gen antisentido no mostraban smtomas.
En contraste, respectivamente, 11 de 24 (construccion 35S-Nia/S4-Nia antisentido), 7 de 25 (construccion 35S- Nia/RolC-Nia antisentido), 10 de 27 (construccion 35S-Nia/35S-Nia antisentido), 7 de 26 (construccion 35S- Nia/S4S4-Nia antisentido) y 7 de 25 (construccion 35S-Nia/S7S4-Nia antisentido) plantas que conteman los genes tanto de sentido como antisentido no mostraban smtomas. Se considero que las plantas que no mostraban smtomas mostraban resistencia extrema a PVY. Continuaban sin mostrar smtomas durante 2 meses mas de comprobacion (indicado como resistencia (ER) en la Tabla 3). Algunas otras plantas, particularmente las que conteman construcciones de CoP, mostraban un retraso y una restriccion de los smtomas. No mostraban smtomas 2 semanas despues de la inoculacion pero mostraban algunas pequenas lesiones en algunas plantas despues de 4 semanas. Estas plantas estaban claramente mucho menos afectadas por PVY que los tabacos no transgenicos o sensibles y se puntuaron como resistentes (indicado como ER* en la Tabla 3).
Tabla 3 Resistencia a infeccion por PVY de plantas de tabaco transgenicas que comprenden bien la construccion de proteasa de PVY quimerica de sentido, bien la construccion de proteasa de PVY quimerica antisentido bien ambas (diferentes construcciones de CoP)._________________________________________________________________
Gen de sentido
Gen antisentido Plantas con resistencia extrema (ER) Plantas "resistentes" (ER*) Numero total de plantas transgenicas
35S-Nia
2 2 27
35S-Nia antisentido 1 0 25
35S-Nia
35S-Nia antisentido 10 2 27
35S-Nia
S4-Nia antisentido 11 2 24
35S-Nia
RolC-Nia antisentido 7 3 25
35S-Nia
S4S4-Nia antisentido 7 7 26
35S-Nia
S7S4-Nia antisentido 7 4 25
Los datos muestran que usar construcciones de CoP da como resultado una frecuencia muy superior de plantas transgenicas con resistencia extrema y resistencia que al usar construcciones bien de sentido o bien antisentido solas.
Posteriormente, se determino el numero de copias de los transgenes en las plantas transgenicas resistentes a virus. Por lo tanto, se extrajo ADN de todas las plantas transgenicas que mostraban resistencia extrema o resistencia. Tambien se extrajo ADN de cinco plantas sensibles para cada construccion. El ADN se examino con respecto al numero de copias usando analisis Southern. Los datos (Tabla 4) mostraban que los genomas de algunas de las plantas con CoP que mostraban resistencia extrema, particularmente las plantas 35S-Nia/S4-Nia antisentido, solo conteman una unica copia de la construccion genica.
Tabla 4. Numero de copias de transgenes que comprenden la construccion de proteasa de PVY quimerica de sentido, la construccion de proteasa de PVY quimerica antisentido, o ambas (diferentes construcciones de CoP) en plantas con resistencia extrema, resistentes y sensibles.
Gen de sentido
Gen antisentido Plantas con resistencia extrema (ER) Plantas "resistentes" (ER*) Plantas sensibles
35S-Nia
6 1 1/1/1/1/1
35S-Nia antisentido 4 - 1/8/0/2/1
35S-Nia
35S-Nia antisentido 3/1/2/3/6/3/2/4/2/3 1/1 1/2/2/6/1
35S-Nia
S4-Nia antisentido 2/4/1/3/2/4/6/1/1/3/1 2/6 5/8/2/3
35S-Nia
RolC-Nia antisentido 6/7/6/7/7/7/6 2/1 2/2/2/1/2
35S-Nia
S4S4-Nia antisentido 1/2/4/5/2/2/2 1/1/2/1/1/1/1 1/1/7/1/1
5
10
15
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25
30
35
Gen de sentido
Gen antisentido Plantas con resistencia extrema (ER) Plantas "resistentes" (ER*) Plantas sensibles
35S-Nia
S7S4-Nia antisentido 2/4/12/5/2/2/7 3/2/1/2 1/1/3/1/1
Ejemplo 3 Herencia de la resistencia extrema en plantas procedentes del Ejemplo 2. (Comparativo)
Plantas procedentes del ejemplo 2 se dejaron autofertilizar y sus semillas se recogieron. Semillas que se originaban de plantas que mostraban resistencia extrema y bajo numero de copias de transgenes para las construcciones de CoP 35S-Nia/S4-Nia antisentido y 35S-Nia/35S-Nia y semillas procedentes de las plantas de sentido y antisentido que mostraban resistencia extrema se germinaron y se desarrollaron en el invernadero. Tambien se desarrollaron plantas a partir de semillas recogidas de dos lmeas con CoP sensibles, dos lmeas solamente con gen de sentido sensibles y dos lmeas solamente con gen antisentido sensibles. Veinte plantas de cada lmea se seleccionaron con respecto a la uniformidad global de tamano y el estadio de desarrollo, se pusieron en macetas individuales, se dejo que se recuperaran durante una semana y a continuacion se inocularon con PVY. Las plantas se puntuaron con respecto a smtomas virales 2, 4 y 7 semanas despues de la inoculacion. Los resultados (Tabla 5) mostraban que las ocho lmeas de planta de 35S-Nia/S4-Nia antisentido y 35S-Nia/35S-Nia antisentido que conteman una o dos copias genicas mostraban una relacion de segregacion de aproximadamente 3:1 de resistencia extrema : sensible. La descendencia de la lmea solamente con el gen antisentido que habfa dado resistencia extrema en To y la descendencia de la planta de sentido extremadamente resistente que contema una copia genica daban relaciones de segregacion anormales (2:18; ER:sensible). La descendencia de la planta de sentido que daba resistencia extrema y contema 6 copias genicas daba una relacion ~ 3:1 (ER:sensible). Toda la descendencia de las plantas To sensibles mostraba una sensibilidad completa a PVY.
Estos datos muestran que la resistencia extrema de construcciones de CoP da una expresion estable de la resistencia que se hereda de un modo mendeliano. Esto tambien indica que, en estas lmeas, los loci del CoP de PVY son ~100% eficaces para conferir resistencia extrema mientras los loci transgenicos en la lmea antisentido y una de las dos lmeas de sentido son solo parcialmente eficaces para conferir resistencia extrema.
Tabla 5.
35S Nia de sentido y S4 Nia antisentido 35S Nia de sentido y S4 Nia antisentido 35S Nia de sentido 35S Nia antisentido
N° Copias T1 ER:S N° Copias T1 ER:S N° Copias T1 ER:S N° Copias T1 ER:S
Planta ER
1 1 15:5 1 16:4 6 17:3 4 2:18
2 1 12:8 2 15:5 1 2:18
3 1 14:6 2 16:4
4 1 15:5 2 16:4
Planta
Sensible
1 8 0:20 1 0:20 1 0:20 1 0:20
2 2 0:20 1 0:20 1 0:20 8 0:20
Ejemplo 4: Tabaco transgenico extremadamente resistente a virus con diferentes componentes (gen de sentido y gen antisentido) en diferentes loci dentro de la planta transgenica. (Comparativo)
Plantas sensibles a PVY que conteman el transgen de sentido (que conteman copias de transgen individuales; vease la Tabla 6) se cruzaron con plantas sensibles a PVY que conteman el transgen antisentido (que tambien se habfa analizado con respecto al numero de copias mediante analisis Southern; vease la Tabla 6). Veinte de los descendientes resultantes por cruce se propagaron en el invernadero, a continuacion se inocularon con PVY y se almacenaron para la infeccion viral segun se describe en el Ejemplo 2. Se esperana que la descendencia de los cruces (entre genes individuales/plantas que contienen loci) estuviera en la siguiente relacion: % gen de sentido solo, % gen antisentido solo, % que comprende los genes tanto de sentido como antisentido y % que no comprende ningun gen. Los resultados (Tabla 4) muestran que, con una excepcion, una proporcion de la descendencia de todos los cruces satisfactorios mostraba resistencia extrema, mientras que ninguno de los descendientes de plantas de
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20
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40
sentido autofecundadas o plantas antisentido autofecundadas mostraba resistencia extrema. El cruce que no daba una descendencia extremadamente resistente se derivaba de la planta parental Antisentido 2 (As2) que contema 8 copias del gen antisentido. Las veinte plantas descendientes de los cruces Sentido 1 (S1)(macho) x Antisentido 1 (As1) (hembra) y Sentido 3 (S3) (hembra) x Antisentido 4 (As4) (macho) se examinaron mediante analisis Southern. Los resultados mostraban que en ambos cruces las plantas que mostraban resistencia extrema (o en un caso resistencia) conteman los genes tanto de sentido como antisentido, mientras que las plantas sin transgenes (nulas), o los genes de sentido o antisentido solos, eran todos sensibles a PVY. Para confirmar adicionalmente esta correlacion absoluta entre la presencia de un par complementario (genes de sentido con antisentido) dentro de una planta y la resistencia extrema, todas las plantas descendientes que mostraban resistencia extrema se analizaron mediante transferencias Southern. Los resultados mostraban que cualquier planta extremadamente resistente o resistente contema genes tanto de sentido como antisentido.
Estos datos muestran que un par complementario da resistencia o resistencia extrema incluso cuando los genes que codifican los genes de sentido y antisentido no estan situados simultaneamente en el genoma. El "fenomeno del par complementario" no se debe simplemente a una dosificacion incrementada del transgen ya que se esperana que % de la descendencia autofecundada fuera homocigotica y asf tener el doble de dosificacion genica, y sin embargo era sensible.
Tabla 6: Resistencia a PVY de las plantas descendientes que resultan de cruces entre plantas de tabaco transgenicas sensibles que comprenden el gen 35S-Nia de sentido (lmeas S) y plantas de tabaco transgenicas sensibles que comprenden el gen 35S-Nia antisentido (lmeas As)._________________________________________
Progenitor masculino
Progenitor femenino Plantas extremadamente resistentes (ER) Plantas "resistentes" (ER*)
S1
As1 8
S1
As4 6 5
S2
As4 1 3
S3
As4 3 3
S4
As1 7 1
S3
As5 1 2
S4
As2 0
S4
As4 2 0
S5
As4 9 4
S5
As5 2 3
As4
As4
0
As5
As5
0
S2
S2
0
S4
S4
0
Las plantas extremadamente resistentes no mostraban smtomas de infeccion por PVY despues de 7 semanas. Las plantas resistentes mostraban lesiones muy pequenas 7 semanas despues de la infeccion por PVY.
S1, S2, S3, S4 y S5 son plantas de tabaco transgenicas sensibles a PVY que comprenden la construccion genica 35S-Nia de sentido que tienen todas una copia del transgen integrada.
As1, As2, As4 and As5 son plantas de tabaco transgenicas sensibles a PVY que comprenden la construccion genica 35S-Nia antisentido que tienen respectivamente 1, 8, 2 y 1 copias del transgen integradas.
Ejemplo 5. Evaluacion del uso de diferentes genes virales como secuencias de acido nucleico diana en la obtencion de genes extremadamente resistentes a virus. (Comparativo)
Los vectores de T-ADN que comprenden los genes de resistencia a virus quimericos primero y segundo basados en secuencias derivadas de la region codificante para proteasa, las protemas Vpg o CI procedentes de PVY que se describen en esta solicitud, se usaron para obtener plantas de tabaco transformadas, que posteriormente se estimularon con PVY.
Los resultados se resumen en la siguiente tabla:
5
10
15
20
25
Construccion
Numero de plantas inmunes / Numero de plantas transgenicas independientes
Replica 1
Replica 2
35S-Pro sentido /S4-Pro antisentido
11/24 7/25
35S-Vpg sentido /S4-Vpg antisentido
8/20 6/18
35S-CI sentido /S4-CI antisentido
2/23 1/20
Ejemplo 6. Inactivacion potenciada por intron
Los vectores de T-ADN que comprenden los genes quimericos que codifican las construcciones de CoP en las que se ha insertado un intron (intron 2 de piruvato ortofosfato dicinasa de Flaveria trinervia) bien en la orientacion de sentido o bien el la orientacion antisentido, entre las secuencias de sentido y antisentido correspondientes al ORF que codifica proteasa procedente de PVY (segun se describe en otras partes en esta solicitud) se usaron para obtener plantas de tabaco transformadas, que se estimularon posteriormente con PVY. Los resultados se resumen en la siguiente tabla:
Tabla 8.
Construccion
Numero de plantas inmunes / Numero de plantas transgenicas independientes
35S-Pro(sentido)-intron(sentido)-Pro(antisentido)- Ocs-t
22/24
35S-Pro(sentido)-intron(antisentido)- Pro(antisentido)-Ocs-t
21/24
Ejemplo 7. Modificacion del perfil de aceite usando construcciones de CoP en Arabidopsis. (Comparativo)
Vectores T-ADN para modificar la composicion de acidos grasos en aceite, extrafdo de semillas trituradas como se describe en otras partes de esta solicitud, se usaron para introducir el gen quimerico que codifica la construccion de CoP para reducir la expresion (vease la Fig 2A; SEQ ID N° 6) del gen de A12 desaturasa (Fad2) en Arabidopsis thaliana.
Para la comparacion de la eficacia, se generaron plantas transgenicas de Arabidopsis en las que la expresion del gen Fad2 se reducfa mediante una construccion de cosupresion planeada, que comprendfa el promotor espedfico de semillas FPI acoplado al ORF completo procedente del gen de A12 desaturasa (Fad2) en Arabidopsis thaliana y el promotor de nopalina sintasa (vease la Fig 2B).
Como plantas de control, se usaron Arabidopsis transgenicas transformadas mediante construcciones de T-ADN no relacionadas.
Las semillas se recogieron, se trituraron y se extrajeron y se determino el porcentaje de los principales acidos grasos en el aceite mediante metodos disponibles en la tecnica. Los resultados, que son la media de dos lecturas, se resumen en la Tabla 9.
23
Muestra
Nombres de los Picos------->
Nombre
Minstico Palmftico Palmitoleico Estearico Oleico Linoleico Linolenico 20:0 20:1 22:0 22:1 24:0 C18:1/(C18:2 + C18:3)
Horquilla 1.1
0,00 6,06 0,52 3,21 56,65 7,50 6,82 1,46 16,02 0,00 1,76 0,00 3,95
Horquilla 1.2
0,12 6,86 0,39 3,40 51,28 10,00 8,73 1,64 15,60 0,00 1,97 0,00 2,74
Horquilla 1.3
0,11 8,47 0,50 3,49 21,64 28,99 18,51 2,02 14,19 0,00 2,09 0,00 0,46
Horquilla 1.4
0,00 6,14 0,50 3,37 51,70 9,77 8,02 1,73 16,04 0,00 2,05 0,67 2,91
Horquilla 2.1
0,06 5,19 0,43 3,33 54,84 5,52 7,76 1,77 18,50 0,34 1,83 0,45 4,13
Horquilla 2.2
0,04 7,67 0,46 3,75 19,60 28,29 18,64 2,55 15,96 0,19 2,28 0,56 0,42
Horquilla 3.1
0,00 7,99 0,53 3,62 19,52 28,41 19,24 2,32 15,14 0,00 2,23 0,99 0,41
Horquilla 3.2
0,09 7,00 0,54 3,69 49,02 11,03 9,64 1,71 14,94 0,00 1,72 0,62 2,37
Horquilla 3.3
0,00 5,68 0,49 3,98 46,19 12,82 9,71 2,10 16,70 0,00 1,94 0,39 2,05
Horquilla 3.4
0,17 7,19 0,77 3,69 45,90 11,86 10,65 1,84 15,39 0,00 1,90 0,65 2,04
Horquilla 3.5
0,00 6,45 0,48 3,26 51,76 8,13 10,04 1,51 16,08 0,00 1,92 0,36 2,85
Horquilla 3.6
0,08 7,51 0,23 3,59 19,97 29,13 20,12 2,15 14,54 0,29 2,02 0,36 0,41
Horquilla 3.7
0,14 7,20 0,78 2,90 26,37 24,81 17,18 1,92 15,50 0,36 2,30 0,53 0,63
Horquilla 3.8
0,11 6,34 0,46 3,23 38,58 15,25 13,54 1,89 16,91 0,00 2,36 1,34 1,34
Horquilla 3.9
0,00 6,47 0,49 3,32 47,59 11,44 9,63 1,68 15,96 0,00 1,88 1,55 2,26
Horquilla 3.10
0,00 6,77 0,56 3,48 53,30 7,57 9,34 1,55 15,65 0,00 1,79 0,00 3,15
Horquilla 3.11
0,00 7,05 0,59 3,61 53,62 8,87 8,36 1,55 14,35 0,00 1,99 0,00 3,11
Horquilla 3.12
0,05 8,32 0,36 3,85 18,48 29,24 19,94 2,48 14,75 0,00 2,28 0,26 0,38
Horquilla 4.1
0,09 6,97 0,59 3,61 53,64 8,40 8,44 1,60 15,00 0,00 1,66 0,00 3,19
Horquilla 4.2
0,07 6,81 0,22 3,27 55,06 9,16 8,71 1,26 13,63 0,19 1,33 0,30 3,08
Horquilla 4.3
0,04 6,81 0,50 3,47 46,21 10,67 11,52 1,81 16,50 0,00 1,88 0,58 2,08
Horquilla 5.1
0,00 8,30 0,23 3,71 17,72 28,92 20,63 2,38 14,77 0,00 2,41 0,92 0,36
Horquilla 5.2
0,19 7,15 1,55 3,56 44,58 11,44 11,59 1,77 15,67 0,00 1,84 0,65 1,94
Horquilla 5.3
0,10 6,49 0,40 3,72 54,19 7,01 7,89 1,74 15,91 0,00 1,92 0,62 3,64
Horquilla 5.5
0,12 6,58 0,51 3,84 54,48 6,16 7,23 1,77 16,50 0,42 1,90 0,48 4,07
24
Muestra
Nombres de los Picos------->
Nombre
Minstico Palmftico Palmitoleico Estearico Oleico Linoleico Linolenico 20:0 20:1 22:0 22:1 24:0 C18:1/(C18:2 + C18:3)
Horquilla 5. 6
0,00 6,67 0,50 3,66 46,32 11,56 10,48 1,83 15,99 0,00 2,15 0,84 2,10
Horquilla 5.7
0,00 5,50 0,51 3,58 57,33 4,75 5,91 1,75 18,03 0,00 1,88 0,76 5,38
Horquilla 5.8
0,16 6,55 1,53 3,54 48,52 9,91 8,97 1,78 16,39 0,00 1,84 0,81 2,57
Horquilla 6.1
0,10 6,35 0,57 3,48 59,00 4,77 6,26 1,48 15,95 0,00 1,80 0,25 5,35
Horquilla 6.2
0,10 7,98 0,37 4,06 20,96 29,01 18,69 2,38 13,63 0,20 2,03 0,60 0,44
Horquilla 6.5
0,08 6,21 0,63 3,61 60,05 5,07 5,27 1,55 15,20 0,00 1,69 0,66 5,81
Columbia pBin 19 control
0,08 8,81 0,47 3,51 17,07 30,31 20,94 1,78 14,56 0,00 2,17 0,28 0,33
Cosupresion 1.1
0,08 8,16 0,62 3,71 26,16 23,77 18,15 2,06 14,65 0,17 1,89 0,57 0,62
Cosupresion 1.2
0,00 8,49 0,53 3,65 17,90 29,93 20,36 2,34 14,25 0,00 2,33 0,23 0,36
Cosupresion 1.3
0,07 6,65 0,40 3,42 38,34 15,25 14,16 1,91 17,19 0,31 1,94 0,35 1,30
Cosupresion 1.4
0,00 8,22 0,57 3,82 18,27 28,82 19,63 2,56 14,83 0,00 2,46 0,83 0,38
Cosupresion 1.5
0,00 7,51 0,52 3,84 34,59 17,90 14,64 2,18 16,27 0,00 2,02 0,54 1,06
Cosupresion 1.6
0,07 7,44 0,47 3,16 23,97 27,32 17,29 2,03 15,52 0,18 2,22 0,33 0,54
Cosupresion 2.1
0,07 7,46 0,43 3,00 23,91 27,21 17,79 1,84 15,27 0,30 2,14 0,58 0,53
Cosupresion 2.2
0,00 8,19 0,55 4,22 18,59 28,31 18,80 2,77 15,51 0,00 2,46 0,58 0,39
Cosupresion 2.3
0,00 8,71 0,47 3,48 19,21 30,06 19,49 2,03 13,78 0,00 2,15 0,63 0,39
Cosupresion 3.1
0,06 7,57 0,50 3,83 32,24 20,00 15,66 2,06 15,65 0,34 1,85 0,23 0,90
Cosupresion 4.1
0,00 7,29 0,43 3,55 30,26 21,17 17,06 2,01 16,08 0,00 1,92 0,25 0,79
Cosupresion 4.2
0,08 8,02 0,53 3,62 33,04 20,04 15,68 1,80 14,72 0,00 1,88 0,58 0,92
Cosupresion 4.3
0,07 8,35 0,54 3,85 30,02 21,72 16,78 2,01 14,25 0,00 1,92 0,49 0,78
Cosupresion 4.4
0,06 6,98 0,53 3,62 43,38 13,24 12,77 1,74 15,37 0,30 1,67 0,33 1,67
Cosupresion 4.5
0,13 7,84 0,52 3,76 33,76 18,16 16,21 1,89 14,96 0,35 1,85 0,57 0,98
Cosupresion 4.6
0,11 8,18 0,32 3,58 19,72 29,19 20,26 2,04 13,92 0,29 1,84 0,55 0,40
Cosupresion 4.7
0,11 7,88 0,39 3,75 27,40 22,85 17,44 2,08 15,29 0,00 2,04 0,76 0,68
Cosupresion 4.8
0,13 7,56 0,41 3,46 32,27 20,50 15,45 1,90 15,47 0,00 2,02 0,83 0,90
Cosupresion 4.9
0,09 7,46 0,29 3,75 36,11 16,96 15,74 1,92 15,38 0,31 1,74 0,25 1,10
25
Muestra
Nombres de los Picos------->
Nombre
Minstico Palmftico Palmitoleico Estearico Oleico Linoleico Linolenico 20:0 20:1 22:0 22:1 24:0 C18:1/(C18:2 + C18:3)
Cosupresion 5.1
0,10 7,68 0,34 3,88 36,00 16,77 15,38 1,90 15,44 0,32 1,82 0,36 1,12
Cosupresion 5.2
0,08 7,56 0,25 3,58 26,10 25,11 17,79 1,96 15,03 0,30 1,72 0,54 0,61
Cosupresion 5.3
0,08 7,38 0,20 3,56 42,24 13,33 13,32 1,76 15,19 0,16 1,61 1,18 1,59
Cosupresion 6.1
0,08 8,04 0,50 3,68 31,37 20,29 17,17 1,84 14,31 0,00 1,76 0,95 0,84
Cosupresion 6.2
0,00 8,50 0,51 3,91 18,59 29,33 19,66 2,46 14,75 0,00 2,28 0,00 0,38
Control c24 pGNAP-p450
0,07 8,30 0,10 4,78 19,68 25,91 20,56 2,97 15,29 0,31 1,79 0,24 0,42
El analisis de los resultados indica que las plantas transgenicas que alojan una construccion de CoP (indicada como "horquilla x.x" en la tabla) tienen una frecuencia superior de plantas con aceite en las que el incremento en el acido oleico y la disminucion concomitante en el acido linolenico y linoleico es significativa que en plantas transgenicas que alojan construccion de cosupresion. Por otra parte, los niveles absolutos de incremento, y respectivamente 5 disminucion, son superiores, y respectivamente inferiores, que en plantas transgenicas que alojan construcciones de cosupresion
Ejemplo 7. Modificacion del perfil de aceite usando construcciones de CoP en Brassica. (Comparativo)
El vector T-ADN que aloja el gen quimerico que codifica la construccion de CoP descrito en el Ejemplo 6 se introduce en colza Brassica.
10
Semillas recogidas de especies de Brassica transgenicas se trituran y se extrae el aceite y se analiza la composicion de los acidos grasos.
El aceite procedente de especies de Brassica transgenicas que alojan la construccion de CoP tiene un contenido de 15 acido oleico significativamente incrementado y un contenido de acido linoleico y linolenico disminuido. Un vector de T-ADN que aloja un gen quimerico que codifica una construccion de CoP similar al descrito en el Ejemplo 6, pero en el que la secuencia de la region de sentido y antisentido correspondiente al ORF que codifica A12 desaturasa se basa en un ORF homologo procedente de especies de Brassica, se construye y se introduce en colza Brassica.
20 La secuencia de ORF de especies de Brassica homologos a ORF que codifica A12 desaturasa procedente de Arabidopsis esta disponible de la base de datos Genbank bajo los n° de Registro AF042841 y AF124360.
Semillas recogidas de la especie de Brassica transgenica se trituran y se extrae el aceite y se analiza la composicion de los acidos grasos en el aceite. El aceite procedente de una especie de Brassica transgenica que aloja la 25 construccion CoP tiene un contenido de acido oleico significativamente incrementado y un contenido de acido linoleico y linolenico disminuido.
Ejemplo 8. Supresion de un gen de resistencia a roya endogeno en lino. (Comparativo)
Se elaboro una construccion de CoP para la supresion del gen de resistencia a roya endogeno, que consistfa en 1. un promotor CaMV35S; enlazado operativamente a
30 2. parte de un gen de resistencia a roya endogeno (n) procedente de lino (aproximadamente 1500 pb de
longitud) en la orientacion de sentido; ligada a
3. una parte similar del gen de resistencia a roya endogeno procedente de lino (aproximadamente 1450 pb de longitud) en la orientacion antisentido de modo que se genere una repeticion invertida perfecta sin secuencia espaciadora en la que cada repeticion tiene una longitud de aproximadamente 1450 pb; seguida por
35 4. un terminador nos.
Se elaboraron construcciones antisentido planificadas usando un fragmento similar al descrito bajo 3 anteriormente insertado entre un promotor CaMV35S y un terminador nos.
Plantas de lino que conteman el gen n (que da resistencia a una cepa de roya del lino) se transformaron mediante 40 estas construcciones de CoP y antisentido. Si se produce la supresion, las plantas se hadan sensibles a la cepa de roya. Si la construccion no tiene efecto, las plantas transformadas permanecen resistentes a la cepa de roya.
Resultados
ngc-b sentido/antisentido 3 suprimidas de 7
ngc-b antisentido 0 suprimidas de 12
45 Aunque la invencion se ha descrito e ilustrado en la presente mediante referencias a material, procedimientos y ejemplos espedficos diversos, se entiende que la invencion no se restringe al material, las combinaciones de material y los procedimientos particulares seleccionados con ese proposito. Se pueden suponer numerosas variaciones de estos detalles y seran apreciadas por los expertos en la tecnica.
5
10
15
20
25
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20
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Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes, que se puede expresar en una celula vegetal, que comprende la etapa de introducir en dicha celula un ADN quimerico, que se integra establemente en el genoma nuclear de dicha celula vegetal, comprendiendo dicho ADN quimerico las siguientes partes enlazadas operativamente:
    a) un promotor, operativo en dicha celula vegetal;
    b) una region de ADN que, cuando se transcribe, da una molecula de ARN con una secuencia nucleotidica que comprende
    i. una secuencia nucleotidica de sentido de menos 20 nucleotidos consecutivos que tiene 100% de identidad de secuencia con al menos parte de una region codificante de dicho acido nucleico de interes;
    y
    ii. una secuencia nucleotfdica antisentido que incluye al menos 20 nucleotidos consecutivos, que tiene 100% de identidad de secuencia con el complemento de dichos al menos 20 nucleotidos consecutivos de dicha secuencia nucleotidica de sentido;
    en donde el ARN es capaz de formar una estructura de ARN de horquilla artificial con un tallo de ARN de doble hebra mediante apareamiento de bases entre las regiones con secuencia nucleotidica de sentido y antisentido de modo que al menos dichos 20 nucleotidos consecutivos de la secuencia de sentido se apareen por bases con dichos 20 nucleotidos consecutivos de la secuencia antisentido;
    en donde dicho ADN quimerico comprende uno o mas intrones en dicha region de ADN que, cuando se transcribe, da una molecula de aRn.
  2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que el ADN quimerico comprende ademas una region de ADN implicada en la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion.
  3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha molecula de ARN comprende ademas una secuencia nucleotidica espaciadora situada entre dicha secuencia nucleotidica de sentido y dicha secuencia nucleotidica antisentido.
  4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia nucleotfdica espaciadora comprende un intron.
  5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia nucleotidica antisentido tiene una longitud total correspondiente a la de la secuencia nucleotidica de sentido.
  6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia nucleotidica antisentido difiere en longitud de la secuencia nucleotidica de sentido en aproximadamente 10%.
  7. 7. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha secuencia nucleotfdica de sentido tiene una longitud total de al menos 50 nucleotidos.
  8. 8. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la molecula de ARN consiste en el ARN de horquilla.
  9. 9. El metodo segun la reivindicacion 1 o 3, en el que dicho gen es un gen endogeno.
  10. 10. El metodo segun la reivindicacion 1 o 3, en el que dicho gen es un transgen extrano.
  11. 11. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho acido nucleico de interes esta comprendido en el genoma de un virus infeccioso.
  12. 12. El metodo segun la reivindicacion 11, en el que dicho virus infeccioso es un virus de ARN.
  13. 13. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha celula vegetal esta comprendida dentro de una planta.
  14. 14. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que la planta es una planta de cultivo o una hortaliza.
  15. 15. Metodo segun la reivindicacion 14, en el que la planta es mafz, arroz, trigo, cebada, cana de azucar, algodon, colza, soja, achicoria, brasicaceas, lechuga, tomate, tabaco, patata o remolacha azucarera.
    5
    10
    15
    20
    25
  16. 16. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la expresion fenotipica reducida se usa para obtener resistencia a la rotura, para obtener patrones de color de las flores modificados, para obtener plantas resistentes a nematodos, para retrasar la maduracion de los frutos, para obtener androesterilidad, para reducir la presencia de metabolites secundarios en plantas, para modificar el perfil de metabolites sintetizados en una celula vegetal mediante ingeniena metabolica, para retrasar la senescencia, para alterar la lignificacion, para alterar la calidad de las fibras en el algodon, para incrementar la resistencia a las magulladuras en patatas al reducir la polifenoloxidasa, para obtener resistencia a virus o para obtener resistencia a enfermedades o plagas.
  17. 17. Una celula vegetal que comprende un acido nucleico de interes, que se puede expresar fenotfpicamente, que comprende ademas una molecula de ADN quimerico integrada establemente en el genoma nuclear de dicha celula vegetal, comprendiendo dicha molecula de ADN quimerico las siguientes partes enlazadas operativamente:
    a) un promotor, operativo en dicha celula vegetal;
    b) una region de ADN que, cuando se transcribe, da una molecula de ARN con al menos una region de ARN con una secuencia nucleotfdica que comprende
    i) una secuencia nucleotfdica de sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos que tiene 100% de identidad de secuencia con al menos parte de una region codificante del acido nucleico de interes; y
    ii) una secuencia nucleotfdica antisentido que incluye al menos 20 nucleotidos consecutivos, que tiene 100% de identidad de secuencia con el complemento de dichos al menos 20 nucleotidos consecutivos de dicha secuencia nucleotidica de sentido;
    en la que el ARN es capaz de formar una estructura de ARN de horquilla artificial con un tallo de ARN de doble hebra mediante apareamiento de bases entre las regiones con secuencia nucleotidica de sentido y antisentido, y
    en la que dicho gen quimerico comprende uno o mas intrones en dicha region de ADN que, cuando se transcribe, da una molecula de ARN.
  18. 18. Una celula segun la reivindicacion 17, en la que la molecula de ADN quimerico comprende ademas una region de ADN implicada en la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion.
    imagen1
    Ubi-P tmV h i—n a
    JGMV 5' Ubi-P
    Gusd tml'
    t---------------►L221
    ETi
    ■ intron Codones de terminacion
    JGMV 5 Ubi-P
    Gusd tml' --------►£=]
  19. 5. c
    JGMV 5' Ubi-P
    Gusd tmV
    I , ,
    /nfron
    Codones de terminacion
    JGMV 5'
    Ubi-P | Gusd tml' —
    JGMV 5 Ubi-P
    Gusd Gus5' tml'
    -j—►-«—j-a
    CoP
    Codones de terminacion
    Representation esquematica de los genes quimericos usados en el Ejemplo 1
    Fig. 1A
    Nib
    ocs-f I
    ■M-----
    ocs-t I
    S4*f
    S4 h
    1 ocs-t |
    {RofC\+-
    1 ocs-t t
    | 35S [-*■
    oct-t |
    X %
    [S7S4W-
    _► gen Nib de sentido — gen Nib antisentido
    ocs-t
    Representation esquematica de tos genes quimericos usados en los Ejemplos 2 y 4
    Fig.lB
    imagen2
    Construccion de horquilla
    Term Nos
    480 pb
    Pro Nos
    FP1 480 p
    NPTI!
    \\\\\
    Term Nos
    Fig.2A
    Construccion de cosupresion
    Term Nos
    FAD2
    NPT it
    FP
    Pro Nos
    \ \
    Term Nos
    Fig.2B
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