ES2628385T3 - Agonistas de FGFR1 y procedimientos de uso - Google Patents

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ES2628385T3 ES12722058.0T ES12722058T ES2628385T3 ES 2628385 T3 ES2628385 T3 ES 2628385T3 ES 12722058 T ES12722058 T ES 12722058T ES 2628385 T3 ES2628385 T3 ES 2628385T3
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Abstract

Un anticuerpo agonista anti-receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR1) que se une al péptido n.º 26 KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28) o al péptido n.º 28 FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29).

Description

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DESCRIPCION
Agonistas de FGFR1 y procedimientos de uso CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a agonistas de FGFR1 y a procedimientos de uso de los mismos.
ANTECEDENTES
La incapacidad de controlar los niveles de glucosa en sangre subyace a diversas afecciones metabolicas. La diabetes es un sindrome hiperglucemico que resulta de un defecto en la secrecion de insulina en respuesta a la glucosa (diabetes de tipo 1 y de tipo 2) y de una menor eficacia de la insulina en la estimulacion de la captacion de glucosa en el musculo esqueletico y en la restriccion de la produccion de glucosa hepatica (diabetes de tipo 2). La diabetes es una enfermedad altamente frecuente y, aunque hay opciones terapeuticas disponibles para algunos diabeticos, existe una urgente necesidad de tratamientos adicionales.
El factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) es un miembro de la subfamilia de los FGF endocrinos, que incluye FGF19 y FGF23, y se ha identificado como un posible agente modificador de la enfermedad para revertir la obesidad y la esteatosis hepatica inducida por obesidad y la hiperglucemia (vease, por ejemplo, Kharitonenkov y Larsen, Trends Endocrinol. Metab. 22(3):81-6 (2011); Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. 115: 1627-35 (2005); documento WO 2010/042747). La proteina endocrina FGF21 se une a tres receptores de FGF (FGFR 1-3) y mejora la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2 por estos receptores, junto con su correceptor unido a membrana beta-Klotho. Sin embargo, su desarrollo se ha visto obstaculizado por su mala farmacocinetica y la escasa comprension del mecanismo biologico de accion. Tambien se han propuesto anticuerpos antagonistas anti-FGFR1 para el tratamiento de la diabetes (documento WO 2005/037235). Sin embargo, no se ha descubierto cual de los tres FGFR media la actividad metabolica beneficiosa de FGF21.
El documento WO 2005/066211 se refiere a anticuerpos agonistas y antagonistas dirigidos contra FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4 para intervenciones terapeuticas.
El documento WO 2001/004160 describe anticuerpos anti-idiotipicos de la union del FGF a FGFR1 que tienen actividad agonista.
Sun et al., American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism, Vol. 292, n.° 3: E964-E976 (2007) describe el uso de anticuerpos antagonistas de FGFR1 para reducir la ingesta de alimentos y provocar perdida de peso.
SUMARIO
La materia de la invencion se define por las reivindicaciones.
La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que la activacion del FGFR1 mejora la diabetes. La invencion proporciona anticuerpos anti-FGFR1 agonistas y procedimientos de uso de los mismos.
En un aspecto, la invencion proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agonista anti-receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR1), en el que la enfermedad metabolica se selecciona del grupo que consiste en: el sindrome del ovario poliquistico (SOP), el sindrome metabolico (SM), la obesidad, la esteatosis hepatica no alcoholica (EHNA), la enfermedad del higado graso no alcoholico (EHGNA), la hiperlipidemia, la hipertension, la diabetes de tipo 2, la diabetes no de tipo 2, la diabetes de tipo 1, la diabetes autoinmune latente (DAL) y la diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY por sus siglas en ingles). En algunos modos de realizacion, el agonista de FGFR1 no activa FGFR2 o FGFR3. El agonista de FGFR1 es un anticuerpo anti-FGFR1. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo anti-FGFR1 tiene dos sitios de union a FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento F(ab')2. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo se une al peptido n.° 26 KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28) o al peptido n.2 28 FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo se une tanto al peptido n.° 26 como al peptido n.° 28. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo anti-FGFR1 se une tanto a FGFR1b como a FGFR1c. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo biespecifico tambien se une a beta-Klotho.
En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une a FGFR1, en el que el anticuerpo es un agonista de la actividad del FGFR1. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo no es un agonista de FGFR2 o de FGFR3. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende (a) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que
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consiste en SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16), SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17), EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18), TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) y GTDVMDY (SEQ ID NO: 20), (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoacidos QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 23) y (c) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en X1X2IX3PX4DGX5TX6YADSVKG, en la que X1 es A o G, X2 es D o E, X3 es D o Y, X4 es N o Y, X5 es A o D y X6 es D o Y (SEQ ID NO: 24) y X1IX2PX3DGX4TX5YADSVKG, en la que X1 es D o E, X2 es D o Y, X3 es N o Y, X4 es A o D y X5 es D o Y (SeQ ID NO: 25). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFX1X2X3X4IX5, en la que X1 es S o T, X2 es N o S, X3 es N o T, X4 es W o Y, X5 es H o S (SEQ ID NO: 26), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en
X1X2IX3PX4DGX5TX6YADSVKG, en la que X1 es A o G, X2 es D o E, X3 es D o Y, X4 es N o Y, X5 es A o D y X6 es D o Y (SEQ ID NO: 24) y X1IX2PX3DGX4TX5YADSVKG, en la que X1 es D o E, X2 es D o Y, X3 es N o Y, X4 es A o D y X5 es D o Y (SEQ ID NO: 25) y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16), SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17), EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18), TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) y GTDVMDY (SEQ ID NO: 20). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFTSTWIS (SEQ ID NO: 7), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en GEIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 10) y EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11) y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en
SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16) y SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFSNNYIH (SEQ ID NO: 8), (b)
HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en
ADIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 12) y DIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 13) y (c) HVR-H3 que
comprende la secuencia de aminoacidos EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFTSNWIS (SEQ ID NO: 9), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en AEIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 14) y EIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 15) y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) y GTDVMDY (SEQ ID NO: 20). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende ademas (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoacidos RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 21), (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoacidos SASFLYS (SEQ ID NO: 22) y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoacidos QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 23). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende una secuencia VH seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3 y 4. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo comprende una secuencia VL de la SEQ ID NO: 6.
En algunos modos de realizacion, el anticuerpo anti-FGFR1 tiene dos sitios de union a FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento F(ab')2. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo de la invencion es un anticuerpo multiespecifico. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo tambien se une a beta- Klotho. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de la invencion. En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona una celula huesped que comprende el acido nucleico. En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona un procedimiento de produccion de un anticuerpo, que comprende cultivar la celula huesped de modo que se produzca el anticuerpo. En algunos modos de realizacion, el procedimiento comprende ademas recuperar el anticuerpo de la celula huesped.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona una formulacion farmaceutica que comprende un anticuerpo de la invencion y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona un anticuerpo de la invencion para su uso como medicamento. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo de la invencion es para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica seleccionada del grupo que consiste en: el sindrome del ovario poliquistico (SOP), el sindrome metabolico (SM), la obesidad, la esteatosis hepatica no alcoholica (EHNA), la enfermedad del higado graso no alcoholico (EHGNA), la hiperlipidemia, la hipertension, la diabetes de tipo 2, la diabetes no de tipo 2, la diabetes de tipo 1, la diabetes autoinmune latente (DAL) y la diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo de la invencion es para su uso en la sensibilizacion de un sujeto a la insulina.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona el uso de un anticuerpo de la invencion en la fabricacion de un medicamento. En algunos modos de realizacion, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica seleccionada del grupo que consiste en: el sindrome del ovario poliquistico (SOP), el sindrome metabolico (SM), la obesidad, la esteatosis hepatica no alcoholica (EHNA), la enfermedad del higado graso no alcoholico (EHGNA), la hiperlipidemia, la hipertension, la diabetes de tipo 2, la diabetes no de tipo 2, la diabetes de tipo 1, la diabetes autoinmune latente (DAL) y la diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY). En algunos modos de realizacion, el medicamento es para la sensibilizacion de un sujeto a la insulina.
En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona un procedimiento de tratamiento de la diabetes en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invencion. En algunos modos
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de realizacion, el procedimiento comprende ademas administrar al sujeto otro agente para tratar la diabetes, siempre que el otro agente no sea insulina. En algunos modos de realizacion, el procedimiento comprende ademas administrar al sujeto un agente para tratar enfermedades cardiovasculares.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La figura 1A muestra un ELISA que mide la union de los anticuerpos anti-FGFRI a fragmentos ECD de FGFR purificados.
La figura 1B muestra las constantes de union por resonancia de plasmon superficial para R1 MAb1 y R1 MAb2.
La figura 1C muestra un ensayo de luciferasa de GAL-Elk1 en celulas L6 de rata. Las celulas se cotransfectaron con un vector de expresion para la isoforma de FGFR indicada junto con GAL-Elk1, SV40-luciferasa de Renilla e indicador de luciferasa de luciernaga sensible a Gal. Las celulas transfectadas se incubaron con medio que contenia concentraciones crecientes de R1 Mab o FGF acido (aFGF: control positivo) durante 6 horas antes de los ensayos de luciferasa. La activacion transcripcional se evaluo por la actividad de luciferasa de luciernaga relativa normalizada para la actividad de luciferasa de Renilla y se expreso como unidades relativas de luciferasa (URL).
La figura 1D muestra un experimento similar al 1C excepto porque las celulas L6 expresaban tanto FGFR1c como KLB.
La figura 1E muestra un experimento similar al 1C excepto porque se usaron celulas HEK293.
La figura 1F muestra el analisis por Western blot de adipocitos 3T3-L1 tratados con la proteina indicada a 0,5 pg/ml durante el tiempo indicado.
La figura 1G muestra WAT recogido de ratones C57BL/6 sin grasa en el momento indicado despues de la inyeccion i.p. a 1 mpk de R1 Mab (+) o IgG de control (-) y sometido a analisis por Western blot.
La figura 2A muestra el nivel de glucosa en sangre (a la izquierda) y el peso corporal (a la derecha) de ratones db/db despues de una unica inyeccion i.p. (flecha) de R1Mab1 o IgG de control a las dosis indicadas. Se observo significacion estadistica en la glucosa (frente a la IgG de control) entre los dias 1 y 30 para todos los grupos y en el peso (frente a la IgG de control) en el dia 8 para todos los grupos y entre los dias 12 y 18 para el grupo de 50 mpk. N = 6~14, *p < 0,05, **p < 0,01.
La figura 2B muestra el nivel de glucosa en sangre en ratones alimentados al azar y en ayunas durante la noche (parte superior) y los niveles de insulina en suero despues de ayuno durante la noche y 30 minutos despues de la inyeccion i.p. de 1 g/kg de glucosa (parte inferior). N = 6~ 14, *p < 0,05, **p < 0,01.
La figura 2C muestra el nivel de glucosa en sangre (a la izquierda) y el peso corporal (a la derecha) de ratones Ins2Akita despues de una unica inyeccion i.p. de R1 Mab1 o IgG de control a 3 mpk. N = 10. *p < 0,01.
La figura 2D muestra la ingesta de alimentos (a la izquierda), el nivel de glucosa en sangre (en el centro) y el peso corporal (a la derecha) de ratones db/db despues de una unica inyeccion i.p. de R1 Mab1 o IgG de control a dosis de 1 mpk. PF: alimentados en paralelo al grupo tratado con R1MAb. N = 7. #p < 0,001 (frente a IgG), *p <0,001 (frente a PF-IgG).
La figura 2E muestra la cuantificacion de area positiva a la insulina en secciones pancreaticas fijadas. Los tejidos se recogieron en el dia 7 despues de la inyeccion i.p. unica de 3 mpk (a la izquierda) o 1 mpk (a la derecha) de R1 MAb1 y se tineron para la insulina y el glucagon. N = 4~7. **p < 0,002. ***p < 0,001.
La figura 3A muestra la activacion de la senalizacion de MAPK en tejidos de raton. Los tejidos indicados se recogieron a los 15 minutos (25 pg/FGF21 de raton: parte superior) o 1 hora (1 mpk de R1Mab1: parte inferior) despues de la inyeccion i.p. a los ratones C57BL/6 sin grasa y se sometieron a analisis por Western blot. Se uso PBS (parte superior) e IgG de control (parte inferior) como control negativo.
Las figuras 3B-D muestran la tincion representativa con H y E del higado (B), los lipidos hepaticos (C) y los lipidos en suero (D). Las muestras se recogieron en el dia 7 despues de la inyeccion i.p. unica de 1 mpk de R1MAb1. Los ratones de control se alimentaron en paralelo para normalizar el peso corporal. N = 7, *p < 0,05, **p < 0,001.
La figura 3E muestra los parametros metabolicos de ratones ob/ob o ap2-SREBP1c (srebp) transgenicos a los que se les inyecto 1 mpk de Ab. Los grupos de control se alimentaron en paralelo para normalizar el peso corporal (figura S7). El nivel de glucosa e insulina para el calculo de HOMA-IR se midio en el dia 3 despues de 3 horas de ayuno. La PTG se llevo a cabo con inyeccion i.p. de glucosa a 1 g/kg en el dia 4 despues de ayuno durante la noche. El peso del tejido se midio en el dia 5. N = 7, *p < 0,05, ***p < 0,01.
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La figura 3F muestra los parametros metabolicos de ratones ap2-SREBP a los que se les implanto por via subcutanea una bomba osmotica para infundir FGF21 (12 ng/dia). La PTI con inyeccion i.p. de insulina a 1 U/kg se llevo a cabo en el dia 4. El suero se recogio en el dia 6. N = 6~8.
La figura 4A muestra la expresion de ARNm (rojo: mayor expresion y azul: menor expresion) en BAT para los genes que pertenecen a la ruta de KEGG indicada. Las muestras se recogieron en el dia 4 despues de la inyeccion i.p. unica de 1 mpk de R1 MAb1 o de ratones alimentados en paralelo a los que se les inyecto IgG de control.
La figura 4B muestra la expresion de ARNm en BAT por qPCR. N = 6, *p < 0,05, **p < 0,001.
La figura 4C muestra un ensayo de luciferasa en celulas HEK293. El grafico muestra que tanto FGF21 como R1MAb1 inducen la transcripcion de un gen indicador de luciferasa dirigido por UAS en celulas HEK293 a traves de CREB fusionado al dominio de union a ADN de GAL4 (GAL-CREB) (los dos paneles de la izquierda) o de un gen indicador de luciferasa dirigido por CRE (los dos paneles de la derecha), de una manera dependiente de la dosis. Algunas celulas tambien se cotransfectaron para expresar FGFR1c y KLB (rojo; curva superior en los graficos). Los resultados representan el promedio de los experimentos por triplicado para la actividad de luciferasa normalizada para la actividad de Renilla.
La figura 4D muestra WAT recogido 15 minutos despues de inyeccion i.v. con 25 pg de FGF21 (+) o PBS (-) y sometido a analisis por Western blot.
La figura 4E muestra el analisis por Western blot de adipocitos humanos primarios diferenciados tratados con FGF21 a 1 pg/ml durante 30 minutos.
La figura 4F muestra un modelo para la ruta de senalizacion a traves de la que FGF21 y R1 MAb activan el programa de PGC-1alfa en los tejidos adiposos.
La figura 5 muestra la actividad agonista independiente de heparina y dependiente de FGFR1 de R1MAb1. Ensayo de luciferasa de GAL-Elk1 en celulas HEK293. Las celulas se cotransfectaron con o sin un vector de expresion para FGFR1c como se indica, junto con GAL-Elk1, SV40-luciferasa de Renilla e indicador de luciferasa de luciernaga sensible a Gal. Las celulas transfectadas se incubaron en medio que contenia concentraciones crecientes de R1Mab1 con o sin 25 mg/l de heparina porcina como se indica durante 6 horas antes de los ensayos de luciferasa. La activacion transcripcional se evaluo por la actividad de luciferasa de luciernaga relativa normalizada para la actividad de luciferasa de Renilla y se expreso como unidades relativas de luciferasa (URL).
La figura 6A muestra la ingesta de alimentos (a la izquierda), el peso corporal (en el centro) y el nivel de glucosa en sangre (a la derecha) de ratones db/db despues de una unica inyeccion i.p. de R1 Mab2 o IgG de control a dosis de 3 mpk en el dia 0. Los ratones de control se alimentaron en paralelo (PF) para ajustar la ingesta de alimentos hasta el dia 11. En el dia 11, la ingesta de alimentos de los ratones tratados con R1 MAb2 volvio a la normalidad y, por tanto, todos los ratones se alimentaron a demanda despues del dia 11 (AL). N = 7~12. p < 0,001.
La figura 6B muestra el nivel de glucosa en sangre de los ratones alimentados al azar usados en la figura S2A en el dia 26.
La figura 6C muestra la PTG llevada a cabo usando los mismos ratones en el dia 28.
La figura 6D muestra la PTI llevada a cabo usando los mismos ratones en el dia 37.
La figura 7A muestra el nivel de glucosa en sangre (a la izquierda) y el peso corporal (a la derecha) de ratones ob/ob despues de una unica inyeccion i.p. de R1 Mab1 o IgG de control a dosis de 1 mpk en el dia 0. Los ratones de control se alimentaron en paralelo (PF) al grupo tratado con R1 MAb. N = 7. *p < 0,05 (frente a PF-IgG).
La figura 7B muestra el nivel de glucosa en sangre (a la izquierda) y el peso corporal (a la derecha) de ratones C57BL/6 alimentados con HFD despues de unica inyeccion i.p. de R1 Mab1 o IgG de control a 1 mpk en el dia 0. N = 7~9. *p < 0,05.
La figura 7C muestra la PTG llevada a cabo en ratones alimentados con HFD usados en S3B en el dia 8 despues de la inyeccion de Ab. Lo ratones recibieron la inyeccion i.p. de 1 g/kg de glucosa despues de ayuno durante la noche. Las medias de los pesos corporales fueron 28,6 +/- 0,6 (R1 MAb1) y 32,1 +/- 0,8 (IgG de control) (p < 0,01). N = 7.
La figura 7D muestra el nivel de glucosa en sangre (a la izquierda) y el peso corporal (a la derecha) de ratones Ins2Akita en el dia 5 despues de la inyeccion i.p. unica de R1Mab1 o IgG de control a 1 mpk. Los ratones de control se alimentaron en paralelo (PF-IgG) para normalizar el peso corporal. *p < 0,05.
La figura 8A muestra la tincion representativa de los islotes de Langerhans de los ratones db/db analizados en la figura 4E. Rojo: insulina, verde: glucagon, azul: nucleos. Debe observarse que R1MAb no afecto a la morfologia
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general de los islotes.
La figura 8B muestra la distribucion del area positiva a la insulina (%) en cada islote de cada animal.
La figura 9A muestra una representacion esquematica de la IgG y la IgG de un brazo (OA). Azul: cadena pesada, verde: cadena ligera. El asterisco rojo indica la posicion aproximada de los restos mutados en el mutante DANA.
La figura 9B muestra un ensayo de luciferasa basado en GAL-Elk en celulas HEK293 que expresan FGFRIc para comparar R1 MAb2 y el mutante de ADN de R1 MAb2 (R1 MAb2 DANA).
La figura 9C muestra el nivel de glucosa en sangre de ratones db/db antes (pre) y el dia 7 despues de la inyeccion i.p. del Ab indicado a 1 mpk. Los ratones de control se alimentaron en paralelo para normalizar el peso corporal.
La figura 9D muestra un ELISA que mide la union del anticuerpo a fragmentos ECD de FGFR purificados. OA- R1 MAb1: version OA de R1 MAb1.
La figura 9E muestra un ensayo de luciferasa basado en GAL-Elk similar a S5B.
La figura 9F muestra el analisis por Western blot de adipocitos 3T3-L1 tratados con la proteina indicada a 0,5 gg/ml durante el tiempo indicado.
La figura 9G muestra el nivel de glucosa en sangre (a la izquierda) y el peso corporal (a la derecha) de ratones db/db despues de una unica inyeccion i.p. del Ab indicado en el dia 0 (flecha). N = 7. *p < 0,05 (IgG de control frente a 3 mpk de R1MAb1), **p < 0,0005 (IgG de control frente a 3 mpk de R1MAb1 e IgG de control frente a 1 mpk de R1MAb1).
La figura 9H muestra los lipidos hepaticos y sericos de muestras recogidas en el dia 7 despues de la inyeccion del Ab. N = 7. *p < 0,05, **p < 0,0005 (frente a la IgG de control).
La figura 10 muestra la expresion de ARNm de KLB y las isoformas de FGFR en el higado y el WAT. Los ratones C57BL/6 alimentados con pienso y alimentados con HFD tenian 25 semanas de edad. Los ratones alimentados con HFD estuvieron con HFD durante 21 semanas. *p < 0,05 o **p < 0,001. N = 6.
La figura 11 muestra los requisitos para la funcion adiposa normal para la actividad de FGF21 y R1 MAb. La ingesta de alimentos (a la izquierda), el nivel de glucosa en sangre (en el centro) y el peso corporal (a la derecha) de ratones ob/ob o ap2-srebp1c transgenicos despues de una unica inyeccion i.p. de R1 Mab1 o IgG de control a dosis de 1 mpk en el dia 0. Los mismos ratones descritos en la figura 3E. N = 7. #p < 0,001 (frente a IgG), *p <0,001 (frente a PF- IgG). La medicion posterior al tratamiento se hizo en el 1 dia despues de la inyeccion.
La figura 12A muestra un ensayo de luciferasa basado en celulas en HEK293. Las celulas se cotransfectaron con un vector de expresion para una de las proteinas de fusion con GAL indicadas, SV40-luciferasa de Renilla e indicador de luciferasa sensible a GAL. Algunas celulas tambien se cotransfectaron con el vector de expresion para KLB como se indica. Las celulas transfectadas se incubaron con medio que contenia medio acondicionado de celulas HEK293 transfectadas con el vector de expresion para FGF21 o vector vacio de control como se indica. Despues de 6 horas de incubacion, las celulas se sometieron a ensayos de luciferasa. La activacion transcripcional se evaluo por la actividad de luciferasa de luciernaga relativa normalizada para la actividad de luciferasa de Renilla y se expreso como induccion factorial.
La figura 12B muestra un ensayo de luciferasa similar en el que algunas celulas se cotrataron con el siguiente ligando de receptor nuclear: Wy14643 (PPARa) 1 mM, GW101516 (PPARp) 5 nM, rosiglitazona (PPARy) 50 nM, T0901317 (LXRa) 50 nM, T3 (TRp) 5 nM, CDCA (FXR) 30 mM. Debe observarse que el FGF21 no afectaba a la actividad de ninguno de los receptores nucleares sometidos a prueba en esta ocasion con o sin tratamiento con ligando afin.
La figura 12C muestra el analisis por Western blot de celulas HEK293 tratadas con FGF21 a 5 gg/ml durante 10 minutos. Algunas celulas se pretrataron con un inhibidor de FGFR (PD173074 100 nM), mTOR (rapamicina 100 nM) MEK1/2 (U0126 10 gM), PI3K (wortmanina 1 gM) como se indica.
La figura 12D muestra los genes corriente abajo que participan en el metabolismo oxidativo en tejidos adiposos.
La figura 13 muestra el nivel de glucosa en sangre (parte superior) y el peso corporal (parte inferior) de ratones db/db despues de una unica inyeccion i.p. de R1MAb2 (marcado como 182.2), R1MAb3 (marcado como 182.5) o IgG de control (anti-Her2) a las dosis indicadas. N = 6, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. El R1MAb3 comprende VH que comprende la SEQ ID NO: 6 y VH que comprende la SeQ iD NO: 4.
La figura 14A muestra la ingesta acumulativa de alimentos, el nivel de glucosa en sangre y el cambio del peso
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corporal de ratones C57BL/6 sin grasa despues de una unica inyeccion intraperitoneal de R1MAb1 o IgG de control a 0,5 mpk. A los ratones tambien se les implanto por via subcutanea una minibomba osmotica en el dia 0 para infundir de forma continua (i.c.) FGF21 recombinante a 1,2 mpk/dia o vehiculo (PBS) como control. En el dia 3, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche para llevar a cabo la prueba de tolerancia a la glucosa (PTG) en el dia 4 (flecha).
La figura 14B muestra las pruebas de tolerancia a la glucosa llevadas a cabo con 2 g/kg de glucosa inyectada por via intraperitoneal en el dia 4 despues de ayuno durante la noche.
La figura 14C muestra el analisis serologico de los ratones mostrados en las figuras 2C, S10A y S10B. Las muestras de suero se recogieron en el dia 5 despues de 4 h de ayuno. Los datos representan la media ± EEM con n = 6 ratones por grupo; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 frente a PBS (i.c.) + IgG de control, por la prueba de la t de Student bilateral para datos independientes (n.s. = no significativo).
La figura 15 muestra el analisis de la expresion genica usando ARNm aislado de tejido hepatico de los ratones usados en las figuras 2C y S10. Las muestras de tejido se aislaron en el dia 5 despues de 4 h de ayuno. Los datos representan la media ± eEm con n = 6 ratones por grupo; *p < 0,05, ***p < 0,001 frente a PBS (i.c.) + IgG de control, por la prueba de la t de Student bilateral para datos independientes (n.s. = no significativo).
La figura 16 muestra el analisis de la expresion genica usando ARNm aislado de tejido adiposo pardo de los ratones usados en las figuras 2C, S10 y S11. Las muestras de tejido se aislaron en el dia 5 despues de 4 h de ayuno. Los datos representan la media ± EEM con n = 6 ratones por grupo; *p < 0,05, ***p < 0,001 frente a PBS (i.c.) + IgG de control, por la prueba de la t de Student bilateral para datos independientes (n.s. = no significativo).
La figura 17A muestra los resultados del ELISA que mide la union del anticuerpo a fragmentos de peptidos biotinilados.
La figura 17B muestra las secuencias de aminoacidos de FGFR1 (aminoacidos 161-212; SEQ ID NO: 27), las secuencias de aminoacidos del peptido n.° 26 (SEQ ID NO: 28) y el peptido n.° 28 (SEQ ID NO: 29), junto con los aminoacidos correspondientes al peptido n.° 26 de FGFR2 (SEQ ID NO: 30), FGFR3 (SEQ ID NO: 31) y FGFR4 (SEQ ID NO: 32) y los aminoacidos correspondientes al peptido n.° 28 de FGFR2 (SEQ ID NO: 33), FGFR3 (SEQ ID NO: 34) y FGFR4 (SEQ ID NO: 35). Las diferencias entre las secuencias del peptido n.° 26 y el peptido n.° 28 en FGFR1 y la region correspondiente de FGFR2-4 estan en un recuadro.
La figura 17C muestra los resultados del ELISA que mide la union de FGFR1 marcado con His a la proteina FGF2 en presencia de diversas concentraciones de R1 MAb1 o IgG de control. Los datos se expresan como % de union de FGFR1-His y representan las medias ± EEM (n = 3).
La figura 17D muestra la union de FGF21 yodado a celulas HEK293 que expresan de forma estable tanto KLB como FGFR1c en presencia de diversas concentraciones de R1MAb1 no marcado o FGF21 (la reaccion tambien contenia BSA (10 mg/ml) e IgG de control (350 mM) para bloquear la union no especifica. Los datos se expresan como % de FGF21 unido del total de FGF21 radiomarcado en la reaccion.
DESCRIPCION DETALLADA DE LOS MODOS DE REALIZACION DE LA INVENCION
I. DEFINICIONES
Una "secuencia estructural humana aceptora" para los fines del presente documento es una secuencia estructural que comprende la secuencia de aminoacidos de una secuencia estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una secuencia estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una secuencia estructural de la inmunoglobulina humana o una secuencia estructural consenso humana, como se define a continuacion. Una secuencia estructural humana aceptora "derivada de" una secuencia estructural de inmunoglobulina humana o una secuencia estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoacidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoacidos. En algunos modos de realizacion, el numero de cambios de aminoacido es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realizacion, la secuencia estructural humana aceptora de VL es identica en secuencia a la secuencia estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia estructural consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un unico sitio de union de una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) y su ligando de union (por ejemplo, un antigeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de union" se refiere a la afinidad de union intrinseca que refleja una interaccion 1:1 entre los miembros de un par de union (por ejemplo, anticuerpo y antigeno). La afinidad de una molecula X por su ligando Y, en general, se puede representar por la constante de disociacion (Kd). La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la tecnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realizacion ilustrativos y ejemplares especificos para medir la afinidad de union
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se describen a continuacion.
La expresion "anticuerpo agonista anti-FGFR1" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a FGFR1 con una afinidad suficiente para que el anticuerpo sea util como agente en la activacion de FGFR1. En un modo de realizacion, el grado de union de un anticuerpo anti-FGFR1 a una proteina no relacionada distinta de FGFR1, es inferior a aproximadamente un 10 % de la union del anticuerpo a FGFR1 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo que se une a FGFR1 tiene una constante de disociacion (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
El termino "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido mas amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos incluyendo, pero no limitadas a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad de union a antigeno deseada.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molecula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antigeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El termino anticuerpo "quimerico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o region constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir, ademas, en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, p, £, y y J, respectivamente.
Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biologicas atribuibles a la region Fc de un anticuerpo, que varian con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: la union a C1q y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); la union al receptor de Fc; la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC); la fagocitosis; la regulacion por disminucion de receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B) y la activacion de linfocitos B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulacion farmaceutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico o profilactico deseado.
El termino "region Fc" en el presente documento se usa para definir una region C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una parte de la region constante. El termino incluye las regiones Fc de secuencia nativa y regiones variantes Fc. En un modo de realizacion, una region Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el carboxilo terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la region Fc puede estar o no estar presente. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeracion de los restos de aminoacido en la region Fc o la region constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeracion de la UE, tambien llamado el indice de la UE, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1991.
"Region estructural" o "FR" se refiere a restos del dominio variable distintos de los restos de la region hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR, en general, aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1- H1 (L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
La expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una region Fc como se define en el presente documento.
La expresiones "celula huesped", "linea celular huesped" y "cultivo de celulas huesped" se usan de manera intercambiable y se refieren a celulas en las que se ha introducido el acido nucleico exogeno, incluyendo la descendencia de dichas celulas. Las celulas huesped incluyen "transformantes" y "celulas transformadas", que incluyen la celula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del numero de pases. La descendencia puede no ser completamente identica en el contenido de acido nucleico a una celula precursora, pero puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma funcion o actividad biologica que la cribada o seleccionada en la celula originalmente transformada tambien se incluye en el presente
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documento.
Un "anticuerpo humano" es el que posee una secuencia de aminoacidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una celula humana o derivado de una fuente que no es humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especificamente un anticuerpo humanizado que comprende restos de union a antigeno que no son humanos.
Un "secuencia estructural consenso humana" es una secuencia estructural que representa los restos de aminoacido que aparecen mas habitualmente en una seleccion de secuencias estructurales de VL o VH de la inmunoglobulina humana. En general, la seleccion de las secuencias VL o VH de la inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, publicacion NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3. En un modo de realizacion, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realizacion, para el VH, el subgrupo es el subgrupo HI como en Kabat et al., supra.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimerico que comprende restos de aminoacido de HVR no humanas y restos de aminoacido de FR humanas. En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos los dominios variables, al menos uno y tipicamente dos, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las FR son las de un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una region constante del anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanizacion.
La expresion "region hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable del anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden, en general, restos de aminoacido de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR), siendo las ultimas las de mayor variabilidad de secuencia y/o estando implicadas en el reconocimiento del antigeno. Los bucles hipervariables ejemplares se encuentran en los residuos de aminoacido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se encuentran en los restos de aminoacido 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Con la excepcion de la CDR1 de la VH, las CDR, en general, comprenden los restos de aminoacido que forman los bucles hipervariables. Las CDR comprenden tambien "restos determinantes de especificidad", o "SDR", que son los restos que entran en contacto con el antigeno. Los SDR estan contenidos dentro de las regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas, o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a- CDR-H3) se producen en los restos de aminoacido 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Vease Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique lo contrario, los restos de HVR y otros restos en el dominio variable (por ejemplo, los restos FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o mas moleculas heterologas.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamifero. Los mamiferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertos modos de realizacion, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realizacion, un anticuerpo se purifica hasta mas de un 95 % o 99 % de pureza determinada, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoelectrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatografia (por ejemplo, intercambio ionico o HPLC de fase inversa). Para una recapitulacion de los procedimientos para evaluar la pureza de los anticuerpos, vease, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un acido nucleico "aislado" se refiere a una molecula de acido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un acido nucleico aislado incluye una molecula de acido nucleico contenida en celulas que contienen normalmente la molecula de acido nucleico, pero la molecula de acido nucleico esta presente de forma extracromosomica o en una ubicacion cromosomica que es diferente de su localizacion cromosomica natural.
"Acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-FGFR1" se refiere a una o mas moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha molecula o moleculas de acido nucleico en un unico vector o en vectores separados, y dicha molecula o moleculas
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de acido nucleico presentes en una o mas ubicaciones de una celula huesped.
La expresion "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman parte de la poblacion son identicos y/o se unen al mismo epitopo, excepto las posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones que se producen de forma natural o que surgen durante la produccion de un anticuerpo monoclonal, que son variantes, en general, que estan presentes en cantidades pequenas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que tipicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparacion de anticuerpos monoclonales esta dirigido contra un unico determinante de un antigeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo que se obtiene de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la produccion del anticuerpo por ningun procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invencion se pueden preparar por diversas tecnicas incluyendo, pero no limitadas al procedimiento de hibridomas, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentacion en fagos y procedimientos que utilizan animales transgenicos que contienen la totalidad o parte de los locus de la inmunoglobulina humana; dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales se describen en el presente documento.
"Anticuerpos nativos" se refieren a moleculas de inmunoglobulina que se producen de forma natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glucoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras identicas y dos cadenas pesadas identicas que estan unidas con enlaces disulfuro. Desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, cada cadena pesada tiene una region variable (VH), tambien llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Asimismo, desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, cada cadena ligera tiene una region variable (VL), tambien llamada dominio variable ligero o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), basados en la secuencia de aminoacidos de su dominio constante.
El termino "prospecto" se usa para hacer referencia a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapeuticos, que contienen informacion sobre las indicaciones, uso, dosis, administracion, tratamiento de combinacion, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapeuticos.
"Porcentaje (%) de identidad de una secuencia de aminoacidos" con respecto a una secuencia de polipeptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoacido de una secuencia candidata que son identicos a los restos de aminoacido de la secuencia de polipeptido de referencia, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el maximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitucion conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineacion con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos se puede conseguir de diversas formas que pertenecen a la experiencia de la tecnica, por ejemplo, usando un programa informatico disponible al publico, tal como el programa informatico BLAST, BLAST-2, AliGn o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la tecnica pueden determinar los parametros apropiados para la alineacion de secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineacion maxima sobre la longitud completa de las secuencias que se estan comparando. Para los fines del presente documento, sin embargo, los valores de porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos se generan utilizando el programa informatico de comparacion de secuencias ALIGN-2. El programa informatico de comparacion de secuencias ALIGN-2 lo creo Genentech, Inc., y el codigo fuente se ha presentado con la documentacion de usuario en la oficina de propiedad intelectual de EE. UU., Washington DC, 20559, en la que se ha registrado con el n.° de registro de propiedad intelectual de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 esta disponible al publico de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede recopilar a partir del codigo fuente. El programa ALIGN-2 se debe recopilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parametros de comparacion de secuencias los establece el programa ALIGN-2 y no varian.
En situaciones en las que se usa ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoacidos, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoacidos de una secuencia de aminoacidos dada A respecto a, con o frente a, una secuencia de aminoacidos dada B (que, de forma alternativa, puede expresarse como una secuencia de aminoacidos dada A que tiene o que comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos respecto a, con o frente a, una secuencia de aminoacidos dada B) se calcula de la siguiente manera:
100 veces la fraccion X/Y
en la que X es el numero de restos de aminoacido valorados como emparejamientos identicos por el programa de alineacion de secuencias ALIGN-2 en esa alineacion del programa de A y B, y en la que Y es el numero total de restos de aminoacido en B. Se apreciara que cuando la longitud de la secuencia de aminoacidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoacidos B, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoacidos de A a B no sera igual al porcentaje de identidad de la secuencia de aminoacidos de B a A. A menos que se indique especificamente lo contrario, todos los valores de porcentaje de identidad de una secuencia de aminoacidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el parrafo inmediatamente anterior usando el programa
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informatico ALIGN-2.
La expresion "formulacion farmaceutica" se refiere a una preparacion que esta en tal forma que permite la actividad biologica de un principio activo contenido en la misma para ser eficaz, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente toxicos para un sujeto al que se administraria la formulacion.
Un "vehiculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente de una formulacion farmaceutica, distinto de un principio activo, que no es toxico para un sujeto. Un vehiculo farmaceuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampon, un excipiente, un estabilizante o un conservante.
La expresion "receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos o FGFR1", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier FGFR1 nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamiferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. La expresion engloba el FGFR1 no procesado "de longitud completa", asi como cualquier forma del FGFR1 que resulta del procesamiento en la celula. La expresion tambien engloba variantes naturales de FGFR1, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alelicas. La secuencia de aminoacidos del FGFR1b y el FGFR2b humanos ejemplares, respectivamente, se muestra a continuacion:
NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKYRYATWSHMDSVV PSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKI GPDNLPYVQILKHSGINSSDAEVLTLFNVTEAQSGEYVCKVSNYIGEANQSAWLTVTRPVAKALEERPAVMTS (SEQ ID NO: 1); y
NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVV PSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKI GPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTS (SEQ ID NO: 5).
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervencion clinica en un intento por alterar el curso natural del sujeto que se esta tratando, y que se puede realizar como profilaxis o durante la evolucion de una patologia clinica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevencion de la aparicion o recidiva de la enfermedad, alivio de los sintomas, disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, disminucion de la tasa de progresion de la enfermedad, mejora o paliacion del estado de la enfermedad y mejora del pronostico. En algunos modos de realizacion, los anticuerpos de la invencion se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresion de una enfermedad.
La expresion "region variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera del anticuerpo que participa en la union del anticuerpo al antigeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (Vh y Vl, respectivamente) de un anticuerpo nativo, en general, tienen estructuras similares, donde cada dominio esta compuesto por cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Vease, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., pagina 91 (2007).) Un unico dominio Vh o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de union al antigeno. Ademas, los anticuerpos que se unen un antigeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antigeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Vease, por ejemplo, Chen et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El termino "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de propagar otro acido nucleico al que esta vinculado. El termino incluye el vector como una estructura de acido nucleico autorreplicante, asi como el vector incorporado en el genoma de una celula huesped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de los acidos nucleicos a los que estan unidos de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresion".
II. COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS
En un aspecto, la invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de anticuerpos agonistas anti-FGFR1 y la actividad terapeutica de dichos anticuerpos. Los anticuerpos de la invencion son utiles, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades metabolicas, incluyendo la diabetes.
A. Anticuerpos anti-FGFR1 ejemplares
En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos aislados que se unen a FGFR1. En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo anti-FGFR1 se une a FGFR1b y/o FGFR1c y actua de agonista de la actividad de FGFR1.
En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo anti-FGFR1 que comprende seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26; (b) HVR-H2 que comprende la
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secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 25; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID nO: 20; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 21; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 22 y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 23.
En algunos modos de realizacion, un anticuerpo anti-FGFR1 puede ser totalmente humano, humanizado o no humano. En un modo de realizacion, un anticuerpo anti-FGFR1 comprende las HVR como en cualquiera de los modos de realizacion anteriores, y comprende ademas una secuencia estructural humana aceptora, por ejemplo, una secuencia estructural de inmunoglobulina humana o una secuencia estructural consenso humana.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR1 comprende la secuencia del dominio variable de la cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 2, 3 o 4 siguientes:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTWISWVPGKGLEWVGEIDPYDGDTYYADSVKGRFTISADTSKNLQ MNSLRAEDTAVYYCASSGYGGSDYAMDYWGQ (SEQ ID NO: 2),
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNNYIHWVPGKGLEWVADIYPNDGDTDYADSVKGRFTISADTSKNLQ MNSLRAEDTAVYYCAREHFDAWVHYYVMDYWGQ (SEQ ID NO: 3), y
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNWISWVPGKGLEWVAEIDPYDGATDY
ADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCATGTDVMDYWGQ (SEQ ID NO: 4). Opcionalmente, el anticuerpo anti-FGFR1 comprende la secuencia VH de la SEQ ID NO: 2, 3 o 4, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR1, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6 siguiente:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 6). Opcionalmente, el anticuerpo anti-FGFR1 comprende la secuencia VL de la SEQ ID NO: 6, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR1, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los modos de realizacion proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realizacion proporcionados anteriormente. En un modo de realizacion, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL de la SEQ ID NO: 2, 3 o 4 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En un aspecto adicional de la invencion, un anticuerpo anti-FGFR1 de acuerdo con cualquiera de los modos de realizacion anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimerico, humanizado o humano. En un modo de realizacion, un anticuerpo anti-FGFR1 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otro modo de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-FGFR1 de acuerdo con cualquiera de los modos de realizacion anteriores puede incorporar cualquiera de las caracteristicas, individualmente o en combinacion, que se describen en las secciones 1-7 a continuacion:
1. Afinidad de anticuerpos
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociacion (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
En un modo de realizacion, la Kd se mide por un ensayo de union a antigeno radiomarcado (RIA) realizado con la version Fab de un anticuerpo de interes y su antigeno como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de union en solucion de los Fab por el antigeno se mide equilibrando el Fab con una concentracion minima de antigeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoracion de antigeno no marcado, capturando despues el antigeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (vease, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de multiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbumina bovina a un 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezcla [125I]-antigeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interes (por ejemplo, coherente con la evaluacion del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interes entonces se incuba durante la noche; sin embargo, la incubacion puede continuar durante un periodo mas largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuacion, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubacion a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Despues se retira la solucion y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-
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20®) a un 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se anaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan un 20 % o menos de la union maxima se eligen para su uso en ensayos de union competitiva.
De acuerdo con otro modo de realizacion, la Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmon superficial usando un dispositivo BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antigeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, los chips de biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-
dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyeccion a una caudal de 5 pl/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteina acoplada. Despues de la inyeccion del antigeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para mediciones cineticas, se inyectan diluciones en serie de factor dos de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TwEEN-20™) (PBST) a un 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Las tasas de asociacion (kon) y las tasas de disociacion (koff) se calculan usando un modelo simple de union uno-a- uno de Langmuir (programa informatico de evaluacion BIACORE® version 3.2) por ajuste de forma simultanea de los sensogramas de asociacion y disociacion. La constante de disociacion en equilibrio (Kd) se calcula como la proporcion koff/kon. Vease, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociacion excede 106 M-1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmon superficial anterior, entonces la tasa de asociacion se puede determinar usando una tecnica de extincion de la fluorescencia que mide el incremento o la disminucion de la intensidad de la emision de fluorescencia (excitacion = 295 nm; emision = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25 °C de un anticuerpo anti-antigeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antigeno medidas en un espectrometro, tal como un espectrofotometro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotometro 8000-series SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuacion. Para una recapitulacion de algunos fragmentos de anticuerpo, vease Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una recapitulacion de los fragmentos scFv, vease, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer- Verlag, Nueva York), pag. 269-315 (1994); vease tambien el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un analisis de los fragmentos Fab y F (ab')2 que comprenden los restos del epitopo de union al receptor de rescate y que tienen semivida in vivo aumentada, vease la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de union a antigeno que pueden ser bivalentes o biespecificos. Vease, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos tambien se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un unico dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una parte del dominio variable de la cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo de un unico dominio es un anticuerpo de un unico dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar por diversas tecnicas incluyendo, pero no limitadas a la digestion proteolitica de un anticuerpo intacto, asi como la produccion por celulas huesped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fagos), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quimericos y humanizados
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimerico. Algunos anticuerpos quimericos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimerico comprende una region variable no humana (por ejemplo, una region variable derivada de un raton, rata, hamster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una region constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimerico es un anticuerpo de "clase cambiada" en el que la clase o subclase se ha modificado con respecto a la del anticuerpo precursor. Los anticuerpos quimericos incluyen fragmentos de union a antigeno de los mismos.
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo quimerico es un anticuerpo humanizado. Tipicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad para los seres humanos, a la vez que se conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano precursor. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o mas dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o partes de las mismas) derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o partes de las mismas) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un
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anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una parte de una region constante humana. En algunos modos de realizacion, algunos restos de la FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen por los restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los restos de la HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparacion de los mismos se recapitulan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y se describen tambien, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); en las patentes de EE. UU. n.2 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "revestimiento"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describe la estrategia de "seleccion guiada" para el reordenamiento de FR).
Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanizacion incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (vease, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de la regiones variables de la cadena ligera y pesada (vease, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (somaticamente mutadas) humanas o regiones estructurales de la linea germinal humana (vease, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de bibliotecas de FR (vease, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611 -22618 (1996)).
4. Anticuerpos humanos
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversos procedimientos conocidos en la tecnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunogeno a un animal transgenico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposicion antigenica. Dichos animales tipicamente contienen todo o una parte de los locus de las inmunoglobulinas humanas, que remplazan a los locus de las inmunoglobulinas endogenas o que estan presentes de forma extracromosomica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgenicos, los locus de las inmunoglobulinas endogenas en general se han inactivado. Para una recapitulacion de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgenicos, vease Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Veanse tambien, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnologia XEnOmOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnologia HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnologia KM Mouse® y publicacion de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnologia VelociMouse®. Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, por combinacion con una region constante humana diferente.
Los anticuerpos humanos tambien se pueden preparar por procedimientos basados en hibridomas. Se han descrito las lineas celulares de mieloma humano y heteromieloma de raton-humano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos. (Vease, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pag. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados a traves de la tecnologia de hibridomas de linfocitos B humanos tambien se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la produccion de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de lineas celulares de hibridomas) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (que describe hibridomas humanos-humanos). La tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia de triomas) tambien se describe en Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Los anticuerpos humanos tambien se pueden generar aislando las secuencias del dominio variable del clon Fv seleccionadas de bibliotecas de presentacion en fago derivadas de seres humanos. Dichas secuencias del dominio variable se pueden combinar entonces con un dominio constante humano deseado. Las tecnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuacion.
5. Anticuerpos derivados de bibliotecas
Los anticuerpos de la invencion se pueden aislar por cribado de bibliotecas combinatorias de anticuerpos con la
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actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen diversos procedimientos en la tecnica para generar bibliotecas de presentacion en fagos y cribar dichas bibliotecas de anticuerpos que poseen las caracteristicas de union deseadas. Dichos procedimientos se recapitulan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen tambien, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119132 (2004).
En ciertos procedimientos de presentacion en fagos, los repertorios de los genes VH y VL se clonan por separado por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que despues se pueden cribar para los fagos que se unen a los antigenos como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos tipicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad contra el inmunogeno sin la necesidad de construir hibridomas. De forma alternativa, el repertorio virgen se puede clonar (por ejemplo, de ser humano) para proporcionar una unica fuente de anticuerpos contra una amplia gama de antigeno no propios y tambien autoantigenos sin ninguna inmunizacion como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Por ultimo, las bibliotecas virgenes tambien se pueden preparar de manera sintetica clonando segmentos de genes V no reordenados a partir de celulas madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen bibliotecas de anticuerpos humanos en fagos incluyen, por ejemplo: patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en el presente documento.
6. Anticuerpos multiespecificos
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecifico, por ejemplo, un anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos multiespecificos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de union para al menos dos sitios diferentes. En ciertos modos de realizacion, una de las especificidades de union es para FGFR1 y la otra es para cualquier otro antigeno, por ejemplo, beta-Klotho. En ciertos modos de realizacion, los anticuerpos biespecificos se pueden unir a dos epitopos diferentes de FGFR1. Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las tecnicas para preparar anticuerpos multiespecificos incluyen, pero no se limitan a, coexpresion recombinante de pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (vease Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) y la tecnologia de "boton en ojal" (knob-in-hole) (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecificos tambien se pueden preparar modificando los efectos de orientacion por interaccion electrostatica para preparar moleculas heterodimericas de Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); entrecruzando dos o mas anticuerpos o fragmentos (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecificos (vease, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); usando la tecnologia de "diacuerpo" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecificos (vease, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dimeros de Fv (sFv) de cadena sencilla (vease, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecificos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Los anticuerpos modificados con tres o mas sitios de union a antigenos funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo" tambien se incluyen en el presente documento (vease, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).
El anticuerpo o fragmento del presente documento tambien incluye un "Fab de doble accion" o "DAF" que comprende un sitio de union a antigeno que se une al FGFR1, asi como otro antigeno diferente, por ejemplo, klothoBeta (vease, el documento US 2008/0069820, por ejemplo).
7. Variantes de anticuerpos
En ciertos modos de realizacion, se contemplan variantes de secuencia de aminoacidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoacidos de un anticuerpo se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleotidos que codifica el anticuerpo, o por
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sfntesis de peptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoacidos del anticuerpo. Se puede hacer cualquier combinacion de delecion, insercion y sustitucion para llegar a la construccion final, siempre que la construccion final posea las caracteristicas deseadas, por ejemplo, union al antigeno.
a) Variantes de sustitucion, insercion y delecion
En ciertos modos de realizacion, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o mas sustituciones de aminoacidos. Los sitios de interes para la mutagenesis de sustitucion incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones conservativas". Se proporcionan cambios mas sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y como se describe adicionalmente a continuacion en referencia a las clases de cadena lateral de los aminoacidos. Las sustituciones de aminoacidos se pueden introducir en un anticuerpo de interes y los productos se pueden cribar para una actividad deseada, por ejemplo, union a antigeno conservada/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.
TABLA 1
Resto original
Sustituciones ejemplares Sustituciones preferentes
Ala (A)
Val; Leu; Ile Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D)
Glu; Asn Glu
Cys (C)
Ser; Ala Ser
Gln (Q)
Asn; Glu Asn
Glu (E)
Asp; Gln Asp
Gly (G)
Ala Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucina Leu
Leu (L)
norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P)
Ala Ala
Ser (S)
Thr Thr
Thr (T)
Val; Ser Ser
Trp (W)
Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucina Leu
Los aminoacidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) acidos: Asp, Glu;
(4) basicos: His, Lys, Arg;
(5) restos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromaticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicaran el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitucion implica sustituir uno o mas restos de la region hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para su estudio posterior tendran modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biologicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) respecto al anticuerpo precursor y/o habran conservado sustancialmente ciertas propiedades biologicas del anticuerpo precursor. Una variante de sustitucion ejemplar es un anticuerpo de afinidad madurada, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando tecnicas de maduracion de la afinidad basadasen presentacion en fagos tales como las descritas en el presente
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documento. Brevemente, uno o mas restos de la HVR se mutan y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para una actividad biologica particular (por ejemplo, afinidad de union).
Las alteraciones (por ejemplo, sustituciones) se pueden hacer en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden hacer en "puntos calientes" de la HVR, es decir, los restos codificados por codones que se someten a mutacion de alta frecuencia durante el proceso de maduracion somatica (vease, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) y/o las SDR (a-CDR), con el VH o VL variante resultante cuya afinidad de union se esta analizando. La maduracion de la afinidad construyendo y volviendo a seleccionar bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ (2001)). En algunos modos de realizacion de maduracion de la afinidad, la diversidad se introduce en los genes variables elegidos para la maduracion por cualquiera de diversos procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagenesis dirigida por oligonucleotidos). Se crea entonces una segunda biblioteca. La biblioteca se criba a continuacion para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica estrategias dirigidas a HVR, en las que varios restos de la HVR (por ejemplo, 4-6 restos a la vez) se introducen aleatoriamente. Los restos de la HVR implicados en la union al antigeno se pueden identificar especificamente, por ejemplo, usando mutagenesis por barrido de alanina o modelado. A menudo se actua en particular sobre la CDR-H3 y la CDR-L3.
En ciertos modos de realizacion, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones en una o mas HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antigeno. Por ejemplo, pueden hacerse alteraciones conservativas (por ejemplo, sustituciones conservativas como se proporciona en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de union en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de la HVR o las SDR. En ciertos modos de realizacion de las secuencias VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR esta inalterada o contiene no mas de una, dos o tres sustituciones de aminoacido.
Un procedimiento util para la identificacion de restos o regiones de un anticuerpo que pueden ser dianas para la mutagenesis se denomina "mutagenesis por barrido de alanina" como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) se identifican y se remplazan por un aminoacido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interaccion del anticuerpo con el antigeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoacidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, se analiza una estructura cristalina de un complejo antigeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Dichos restos de contacto y los restos adyacentes pueden ser la diana o se pueden eliminar como candidatos para la sustitucion. Las variantes se pueden cribar para determinar si presentan las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoacidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varian en longitud de un resto a polipeptidos que contienen cien o mas restos, asi como inserciones dentro la secuencia de restos de aminoacido individuales o multiples restos de aminoacido. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N-terminal. Otras variantes de insercion de la molecula de anticuerpo incluyen la fusion en el extremo N o C-terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipeptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
b) Variantes de glucosilacion
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o disminuir el grado de glucosilacion del anticuerpo. La adicion o delecion de sitios de glucosilacion a un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoacidos de manera que se crea o se elimina uno o mas sitios de glucosilacion.
Cuando el anticuerpo comprende una region Fc, el carbohidrato unido al mismo se puede alterar. Los anticuerpos nativos producidos por celulas de mamifero tipicamente comprenden un oligosacarido ramificado, biantenario que, en general, esta unido por enlace del N con Asn297 del dominio CH2 de la region Fc. Vease, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacarido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N- acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y acido sialico, asi como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura biantenaria de oligosacarido. En algunos modos de realizacion, las modificaciones del oligosacarido en un anticuerpo de la invencion se pueden hacer para crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.
En un modo de realizacion, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una region Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azucar en Asn297, respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras de manosa complejas, hibridas y de alto contenido) que se mide por espectrometria de masas MALDI-TOF, como se describe
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en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al resto de asparagina situado en aproximadamente la posicion 297 en la region Fc (numeracion de la UE de los restos de la region Fc); sin embargo, la Asn297 tambien puede estar situada aproximadamente ± 3 aminoacidos en direccion 5' o en direccion 3' de la posicion 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a pequenas variaciones de secuencia en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilacion pueden tener una funcion de ADCC mejorada. Veanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "deficitarios en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de lineas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen celulas Lec13 CHO deficitarias en fucosilacion de proteinas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y documento Wo 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y lineas celulares con inactivaciones genicas, tales como celulas CHO con inactivacion del gen de la alfa-1,6- fucosiltransferasa, FUT8 (vease, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y documento WO 2003/085107).
A las variantes de anticuerpos ademas se les pueden proporcionar oligosacaridos bisegementados, por ejemplo, en las que un oligosacarido biantenario unido a la region Fc del anticuerpo esta bisegmentado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener fucosilacion reducida y/o funcion de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y documento US 2005/0123546 (Umana et al.). Tambien se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un resto de galactosa en el oligosacarido unido a la region Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener funcion de CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Variantes de la region Fc
En ciertos modos de realizacion, se puede introducir una o mas modificaciones de aminoacidos en la region Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la region Fc. La variante de la region Fc puede comprender una secuencia de la region Fc humana (por ejemplo, una region Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificacion de aminoacido (por ejemplo, una sustitucion) en una o mas posiciones de aminoacido.
En ciertos modos de realizacion, la invencion contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, que hacen que sea un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo, ciertas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC ) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reduccion/disminucion de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de union al receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de union a FcyR (por tanto es probable que carezca de actividad de ADCC), pero conserva la capacidad de union a FcRn. Las celulas primarias para mediar la ADCC, las celulas NK, expresan Fc y RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc y RI, Fc y RII y Fc y RIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molecula de interes en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (vease, por ejemplo Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337 (vease Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radiactivos (vease, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometria de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WISCONSIN)). Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos citoliticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molecula de interes se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Tambien se pueden llevar a cabo ensayos de union a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad de CDC. Vease, por ejemplo, el ELISA de union a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activacion del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (vease, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). La union a FcRn y las determinaciones de aclaramiento in vivo/semivida se pueden realizar tambien usando procedimientos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con funcion efectora reducida incluyen los que tienen sustitucion de uno o mas de los restos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 de la region Fc (patente de EE.UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o mas de las posiciones de aminoacido 265, 269, 270, 297 y 327,
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incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con la sustitucion de los restos 265 y 297 a alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
Se describen ciertas variantes de anticuerpo con union mejorada o disminuida a los FcR. (Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
En ciertos modos de realizacion, una variante de anticuerpo comprende una region Fc con una o mas sustituciones de aminoacido que mejoran la ADCC, por ejemplo, las sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la region Fc (numeracion de restos de la UE).
En algunos modos de realizacion, las alteraciones se hacen en la region Fc, que dan como resultado una union a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) modificadas (es decir, mejoradas o disminuidas), por ejemplo, como se describe en la patente de Ee. UU. n.° 6.194.551, documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas aumentas y union mejorada al receptor neonatal de Fc (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento Us 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esos anticuerpos comprenden una region Fc con una o mas sustituciones en la misma que mejoran la union de la region Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen las que tienen sustituciones en uno o mas restos de la region Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitucion del resto 434 de la region Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).
Vease tambien Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente de EE. UU. n.° 5.648.260; patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y documento WO 94/29351 en relacion con otros ejemplos de variantes de la region Fc.
d) Variantes de anticuerpo modificadas con cisteina
En ciertos modos de realizacion, puede ser deseable crear anticuerpos modificados con cisteina, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o mas restos de un anticuerpo se sustituyen con restos de cisteina. En modos de realizacion particulares, los restos sustituidos estan en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo esos restos con cisteina, los grupos tiol reactivos se colocan de este modo en los sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de farmaco o restos de farmaco enlazadores, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertos modos de realizacion, uno cualquiera o mas de los siguientes restos se puede sustituir con cisteina: V205 (numeracion de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeracion de la UE) de la cadena pesada; y S400 (numeracion de la UE) de la region Fc de la cadena pesada.
Los anticuerpos modificados con cisteina se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
e) Derivados de anticuerpo
En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar adicionalmente para que contenga restos no proteicos adicionales que son conocidos en la tecnica y estan facilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatizacion del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polimeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polimeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolimeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinilico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolimero de etileno/anhidrido maleico, poliaminoacidos (homopolimeros o copolimeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolimeros de propropilenglicol, copolimeros de oxido de polipropileno/oxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinilico) y mezclas de los mismos.
El propionaldehido de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricacion debido a su estabilidad en agua. El polimero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. El numero de polimeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une mas de un polimero, pueden ser moleculas iguales o diferentes. En general, el numero y/o tipo de polimeros usados para la derivatizacion se puede determinar basandose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones del anticuerpo particular a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usara en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otro modo de realizacion, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteico que se puede calentar de forma selectiva por la exposicion a la radiacion. En un modo de realizacion, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiacion puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, las longitudes de onda que no danan las celulas normales, pero que calientan el resto no proteico hasta una temperatura a la que se eliminan las celulas proximales al
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anticuerpo-resto no proteico.
B. Procedimientos y composiciones recombinantes
Los anticuerpos se pueden producir por procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. En un modo de realizacion, se proporciona un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-FGFRI descrito en el presente documento. Dicho acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoacidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo). En otro modo de realizacion se proporciona uno o mas vectores (por ejemplo, vectores de expresion) que comprenden dicho acido nucleico. En otro modo de realizacion, se proporciona una celula huesped que comprende dicho acido nucleico. En uno de dichos modos de realizacion, una celula huesped contiene (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoacidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende el VH del anticuerpo. En un modo de realizacion, la celula huesped es eucariota, por ejemplo, una celula de ovario de hamster chino (CHO) o una celula linfoide (por ejemplo, celula Y0, NS0, Sp20). En un modo de realizacion, se proporciona un procedimiento de obtencion de un anticuerpo anti-FGFR1, en el que dicho procedimiento comprende cultivar una celula huesped que comprende un acido nucleico que codifica el anticuerpo, proporcionado previamente, en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la celula huesped (o del medio de cultivo de las celulas huesped).
Para la produccion recombinante de un anticuerpo anti-FGFR1, se aisla un acido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, y se inserta en uno o mas vectores para la posterior clonacion y/o expresion en una celula huesped. Dicho acido nucleico se puede aislar y secuenciar facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos, que son capaces de unirse especificamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).
Las celulas huesped adecuadas para la clonacion o la expresion de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las celulas procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no se necesitan la glucosilacion ni la funcion efectora de Fc. Para la expresion de fragmentos y polipeptidos de anticuerpo en bacterias, veanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Vease tambien Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pag. 245-254, que describe la expresion de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Despues de la expresion, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de celulas bacterianas en una fraccion soluble y se puede seguir purificando.
Ademas de los procariotas, los microbios eucariotas, por ejemplo, los hongos filamentosos y las levaduras, son huespedes adecuados de clonacion o expresion para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras, cuyas rutas de glucosilacion se han "humanizado", lo que da como resultado la produccion de un anticuerpo con un patron de glucosilacion parcial o totalmente humano. Vease Gerngross, Nat. Biotech. 22:14091414 (2004) y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las celulas huesped adecuadas para la expresion de anticuerpos glucosilados tambien derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de celulas de invertebrados incluyen celulas de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar en combinacion con celulas de insectos, particularmente para la transfeccion de celulas de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de celulas de plantas tambien se pueden usar como huespedes. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.2 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnologia PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgenicas).
Las celulas de vertebrados tambien se pueden usar como huespedes. Pueden ser utiles, por ejemplo, lineas celulares de mamifero que estan adaptadas a crecer en suspension. Otros ejemplos de lineas de celulas huesped de mamifero utiles son la linea CV1 de rinon de mono transformada con SV40 (COS-7); la linea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, (1977)); las celulas de rinon de cria de hamster (BHK); las celulas de Sertoli de raton (celulas TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, (1980)); las celulas de rinon de mono (CV1); las celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76); las celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); las celulas de rinon canino (MDCK); las celulas de higado de rata bufalo (BRL 3A); las celulas de pulmon humano (W138); las celulas de higado humano (Hep G2); las celulas de tumor de mama murino (MMT 060562); las celulas TRI como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); las celulas MRC5 y las celulas FS4. Otras lineas de celulas huesped de mamifero utiles incluyen las celulas de ovario de hamster chino (CHO), incluyendo celulas DHFR CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) y lineas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una recapitulacion de algunas lineas de celulas huesped de mamifero adecuadas para
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la produccion de anticuerpos, vease, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pag. 255-268 (2003).
C. Ensayos
Los anticuerpos anti-FGFRI proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades ffsicas/qufmicas y/o sus actividades biologicas por diversos ensayos conocidos en la tecnica.
1. Ensayos de union y otros ensayos
En un aspecto, un anticuerpo de la invencion se analiza para determinar su actividad de union al antigeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos tales como ELISA, Western blot, etc.
2. Ensayos de actividad
En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-FGFRI que tienen actividad agonista. Por ejemplo, la actividad biologica puede incluir la capacidad de activar la transduccion de senales de rutas particulares que se pueden medir, por ejemplo, determinando los niveles de fosfo-FRS2a, fosfo-MEK, fosfo-ERK/MAPK, fosfo- STAT3 o usando los ensayos de luciferasa basados en GAL-Elk1 descritos en el presente documento (vease tambien, por ejemplo, Wu et al. J. Biol. Chem. 5; 282 (40):29069-72 (2007) y Wu et al. PLoS One 18;6(3):e17868 (2011)). Tambien se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biologica in vivo y/o in vitro.
D. Inmunoconjugados
La invencion tambien proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-FGFR1 del presente documento conjugado a uno o mas agentes citotoxicos, tales como agentes quimioterapeuticos o farmacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas de proteina, toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos) o isotopos radiactivos.
En un modo de realizacion, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo y farmaco (ADC) en el que un anticuerpo esta conjugado a uno o mas farmacos, incluyendo pero no limitados a, un maitansinoide (veanse las patentes de EE. UU. n.° 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como restos del farmaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (vease la patente de EE. UU. n.° 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298.); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (vease la patente de EE. UU. n.2 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701,5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (vease Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4.336-4343 (2002) y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno y CC1065.
En otro modo de realizacion, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimaticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, pero no limitada a, la cadena A de la toxina difterica, fragmentos activos que no se unen de la toxina difterica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa- sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPE y PAPS), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otro modo de realizacion, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un atomo radiactivo para formar un radioconjugado. Estan disponibles diversos isotopos radiactivos para la produccion de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isotopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la deteccion, puede comprender un atomo radiactivo para estudios de centellografia, por ejemplo, Tc99m o I123, o un marcador de espin para las pruebas de imagen por resonancia magnetica nuclear (RMN) (tambien conocida como resonancia magnetica, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrogeno-15, oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotoxico se pueden preparar usando diversos agentes de acoplamiento de proteinas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1 - carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehido), compuestos bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis- diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de
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ricina se puede preparar como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil- 3-metildietilen triaminopentaacetico (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugacion de radionucleotidos al anticuerpo. Vease el documento WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberacion del farmaco citotoxico en la celula. Por ejemplo, se puede usar un enlazador inestable en medio acido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotoinestable, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente de eE. UU. n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o ADC del presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, conjugados preparados con reactivos de reticulacion, incluyendo, pero sin limitacion, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo- SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estan disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).
E. Procedimientos y composiciones para el diagnostico y la deteccion
En ciertos modos de realizacion, cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR1 proporcionados en el presente documento es util para detectar la presencia de FGFR1 en una muestra biologica. El termino "detectar" como se usa en el presente documento engloba la deteccion cuantitativa o cualitativa. En ciertos modos de realizacion, una muestra biologica comprende una celula o tejido, tal como tejido adiposo pardo, tejido pancreatico, tejido hepatico, tejido adiposo blanco y tejido tumoral.
En un modo de realizacion, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR1 para su uso en un procedimiento de diagnostico o deteccion. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de FGFR1 en una muestra biologica. En ciertos modos de realizacion, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo anti-FGFR1 como se describe en el presente documento en condiciones que permitan la union del anticuerpo anti-FGFR1 a FGFR1, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-FGFR1 y FGFR1. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En un modo de realizacion, un anticuerpo anti-FGFR1 se usa para seleccionar los sujetos elegibles para tratamiento con un anticuerpo anti-FGFR1, por ejemplo, cuando el FGFR1 es un biomarcador para la seleccion de pacientes.
En ciertos modos de realizacion, se proporcionan anticuerpos anti-FGFR1 marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromoforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radiactivos), asi como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a traves de una reaccion enzimatica o interaccion molecular. Los
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marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisotopos P, C, I, H y I, fluoroforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana (patente de EE.UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rabano (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacaridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterociclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peroxido de hidrogeno para oxidar un precursor colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espin, marcadores de bacteriofagos, radicales libres estables y similares.
F. Formulaciones farmaceuticas
Las formulaciones farmaceuticas de un anticuerpo anti-FGFR1 como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o mas vehiculos farmaceuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edicion, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables, en general, no son toxicos para los destinatarios a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencilico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteinas, tales como seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteina) y/o tensioactivos no ionicos tales como polietilenglicol (PEG).
Los vehiculos farmaceuticamente aceptables ejemplares del presente documento incluyen, ademas, agentes de dispersion intersticial del farmaco tales como glucoproteinas de hialuronidasa neutra-activa soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteinas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina
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con una o mas glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo las ultimas formulaciones un tampon histidina-acetato.
La formulacion del presente documento tambien puede contener mas de un principio activo segun sea necesario para la indicacion particular que se este tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre si. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar, ademas, un analogo de glp-1, una amilina sintetica, un antagonista del receptor de glucagon (por ejemplo, un anticuerpo anti- GCGR) o leptina. Dichos ingredientes activos estan presentes adecuadamente en combinacion en cantidades que son eficaces para el proposito pretendido.
Los ingredientes activos se pueden atrapar en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edicion, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de articulos conformados, por ejemplo, peliculas o microcapsulas.
Las formulaciones a usar para la administracion in vivo en general son esteriles. La esterilidad se puede conseguir facilmente, por ejemplo, por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.
G. Procedimientos y composiciones terapeuticas
Cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR1 agonistas proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapeuticos.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR1 agonista para su uso como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR1 agonista para su uso en el tratamiento de una enfermedad metabolica. En ciertos modos de realizacion, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR1 agonista para su uso en un procedimiento de tratamiento. En ciertos modos de realizacion, la invencion proporciona un anticuerpo anti-FGFR1 agonista para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad metabolica, que comprende administrar al sujeto de una cantidad eficaz del anticuerpo anti-FGFR1. En un modo de realizacion de este tipo, el procedimiento comprende ademas administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un agente terapeutico adicional, por ejemplo, un analogo de glp-1, una amilina sintetica, un antagonista del receptor de glucagon (por ejemplo, un anticuerpo anti-GCGR) o leptina. Un "sujeto" de acuerdo con cualquiera de los modos de realizacion anteriores es preferentemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la invencion proporciona el uso de un anticuerpo anti-FGFR1 agonista en la fabricacion o preparacion de un medicamento. En un modo de realizacion, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad metabolica. En un modo de realizacion adicional, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad metabolica, que comprende administrar a un sujeto que tiene la enfermedad una cantidad eficaz del medicamento. En un modo de realizacion de este tipo, el procedimiento comprende ademas administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un agente terapeutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuacion. Un "sujeto" de acuerdo con cualquiera de los modos de realizacion anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invencion proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad metabolica. En un modo de realizacion, el procedimiento comprende administrar a un sujeto que tiene dicha enfermedad metabolica una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGFR1 agonista. En un modo de realizacion de este tipo, el procedimiento comprende ademas administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un agente terapeutico adicional, como se describe a continuacion. Un "sujeto" de acuerdo con cualquiera de los modos de realizacion anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invencion proporciona formulaciones farmaceuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR1 agonistas proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapeuticos anteriores. En un modo de realizacion, una formulacion farmaceutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR1 agonistas proporcionados en el presente documento y un vehiculo farmaceuticamente aceptable. En otro modo de realizacion, una formulacion farmaceutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR1 agonistas proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapeutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuacion.
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Los anticuerpos de la invencion se pueden usar solos o en combinacion con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo de la invencion se puede coadministrar con al menos un agente terapeutico adicional. En ciertos modos de realizacion, un agente terapeutico adicional es un analogo de glp-1, una amilina sintetica, un antagonista del receptor de glucagon (por ejemplo, un anticuerpo anti-GCGR) o leptina.
Dichos tratamientos de combinacion indicados anteriormente abarcan la administracion combinada (en la que dos o mas agentes terapeuticos se incluyen en la misma formulacion o en formulaciones separadas) y la administracion separada, en cuyo caso, la administracion del anticuerpo de la invencion se puede producir antes, simultaneamente y/o despues de la administracion del agente y/o adyuvante terapeutico adicional.
Un anticuerpo de la invencion (y cualquier agente terapeutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo la administracion parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, administracion intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutanea. La dosificacion se puede realizar por cualquier via adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administracion es breve o cronica. En el presente documento se contemplan varios programas de dosificacion incluyendo, pero no limitados a, administraciones individuales o multiples en varios puntos temporales, la administracion en bolo y la infusion pulsada.
Los anticuerpos de la invencion se formularan, dosificaran y administraran de una manera coherente con la buena practica medica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamifero particular a tratar, la afeccion clinica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administracion del agente, el procedimiento de administracion, la programacion de la administracion y otros factores conocidos por los medicos. El anticuerpo no lo necesita, pero opcionalmente se formula, con uno o mas agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestion. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulacion, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosis y por las vias de administracion que se describen en el presente documento, o de aproximadamente un 1 a un 99 % de las dosis descritas en el presente documento, o en cualquier dosis y por cualquier via que se determine empfricamente/clfnicamente como apropiada.
Para la prevencion o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la invencion (cuando se usa solo o en combinacion con uno o mas agentes terapeuticos adicionales) dependera del tipo de enfermedad a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapeuticos, del tratamiento previo, de la historia clinica del paciente y de su respuesta al anticuerpo y del criterio del medico tratante. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis inicial candidata para la administracion al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o mas administraciones separadas o mediante infusion continua. Una dosis diaria tipica podria variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios dias o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento se mantendra, en general, hasta que se produzca una supresion deseada de los sintomas de la enfermedad. Una dosis de ejemplo del anticuerpo estaria en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, se pueden administrar al paciente una o mas dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinacion de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial mas alta, seguida de una o mas dosis mas bajas. Sin embargo, otros regimenes de dosificacion pueden ser utiles. El progreso de este tratamiento se monitoriza facilmente por tecnicas y ensayos convencionales.
H. Articulos de fabricacion
En otro aspecto de la invencion, se proporciona un articulo de fabricacion que contiene materiales utiles para el tratamiento, la prevencion y/o el diagnostico de los trastornos descritos anteriormente. El articulo de fabricacion comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado al recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solucion i.v., etc. Los recipientes pueden formarse a partir de diversos materiales, tales como vidrio o plastico. El recipiente contiene una composicion que es, por si misma o en combinacion con otra composicion, eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afeccion y que puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja hipodermica). Al menos un agente activo de la composicion es un anticuerpo de la invencion. La etiqueta o prospecto indica que la composicion se usa para tratar la afeccion de eleccion. Por otra parte, el articulo de fabricacion puede comprender (a) un primer recipiente con una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un anticuerpo de la invencion; y (b) un segundo recipiente con una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un agente citotoxico o terapeutico con otro modo de accion. El articulo de fabricacion en este modo de realizacion de la invencion puede comprender ademas un prospecto que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afeccion particular. De forma
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alternativa, o adicionalmente, el articulo de fabricacion puede comprender ademas un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable, tal como agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. Puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
III. EJEMPLOS
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invencion. Se entiende que se pueden poner en practica otros modos de realizacion diversos, dada la descripcion general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1. Generacion y caracterizacion de anticuerpos agonistas anti-FGFRI.
Se generaron anticuerpos monoclonales especificos para FGFR1 usando la tecnologia de presentacion en fagos e IgD2-D3 marcada con His de FGFR1 b y c humanos como antigenos. Se usaron bibliotecas de anticuerpos humanos en fagos con diversidad de sintesis en las regiones determinantes de complementariedad seleccionadas (H1, H2, H3, L3), que imitan la diversidad natural del repertorio de IgG humana para la seleccion. Los fragmentos Fab se presentaron bivalentemente en la superficie de particulas del bacteriofago M13 (Lee et al., J. Immunol. Methods 284:119-32 (2004)). El protocolo de seleccion se ha descrito anteriormente (Liang et al., J. Mol. Biol. 366:815-29 (2007)). Despues de cribar muchos clones de multiples bibliotecas, se identificaron anticuerpos unicos y especificos de los fagos que se unen a ambas isoformas b y c de FGFR1 por ELISA de fagos. Para analizar la union de los anticuerpos a los FGFR humanos, se empleo el protocolo de ELISA convencional usando 2 pg/ml de proteinas quimericas ECD de FGFR1-Fc humano.
Tambien se midieron las afinidades de union de los anticuerpos anti-FGFR1 a FGFR1 por Biacore/SPR usando un instrumento BIAcore™ T100 como se ha descrito (Liang et al., supra) con las siguientes modificaciones. En primer lugar, el anticuerpo de raton anti-Fc humano se recubrio sobre un chip CM5 de dextrano carboximetilado BIAcore™ usando acoplamiento directo para liberar los grupos amino siguiendo un procedimiento descrito por el fabricante. A continuacion, el anticuerpo se capturo en los chips biosensores CM5 para conseguir aproximadamente 200 unidades de respuesta (UR). Las mediciones de union se realizaron usando un tampon de migracion compuesto de HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,005 % (tampon HBS-P). Se inyecto una serie de diluciones de factor 2 de la proteina ECD de FGFR1-His en un intervalo de 1,550 nM en tampon HBS-P a un caudal de 30 pl/minuto a 25 °C. Las tasas de asociacion (Kon, por mol/s) y las tasas de disociacion (Koff, por s) se calcularon usando un modelo simple de union uno-a-uno de Langmuir (programa informatico de evaluacion BIAcore™ version 3.2). La constante de disociacion en equilibrio (Kd) se calculo como la proporcion koff/kon.
Dos de los anticuerpos anti-FGFR1 que se identificaron como se describe anteriormente en experimentos independientes (denominados en este caso R1MAb1 y R1MAb2) se unen a FGFR1b y FGFR1c con una afinidad similar, pero no a ninguna otra isoforma de FGFR (figura 1A y B). Su actividad de senalizacion se sometio a prueba usando un ensayo de luciferasa basado Gal-Elk1 en celulas L6 de rata que carecen de FGFR endogenos, pero se han transfectado para que expresen cada isoforma de FGFR (y KLB segun lo necesario). Estos anticuerpos eran agonistas inesperadamente potentes: ambos R1MAb inducian actividad de luciferasa de una manera dependiente de la dosis, pero solamente cuando las celulas expresan FGFR1b o FGFR1c recombinante, lo que indica que los R1MAb actuan como agonistas especificos para FGFR1 (figura 1C). En este formato de ensayo, los R1MAb no afectaban de forma apreciable la actividad de FGF basico (bFGF), un ligando clasico de FGFR1 (figura 1D). Sin embargo, los R1MAb y el FGF21 mostraron un efecto aditivo cuando las celulas expresaban FGFR1c y KLB (figura 1D). El fragmento F(ab')2, pero no el Fab de R1MAb2 mostro actividad agonista dependiente de FGFR1, lo que sugiere que los R1MAb ejercen su actividad agonista promoviendo la homodimerizacion de FGFR1 (figura 1E). Previamente, se habia informado de un agonista artificial de la dimerizacion de FGFR que contiene un peptido de union a FGFR1 y el dominio de cremallera de leucina de c-jun. Esta molecula llamada C19jun tambien se une a la heparina a traves del dominio c-jun y requiere heparina para la activacion de FGFR1 (Ballinger et al., Nature Biotechnol. 17: 1199-1204 (1999)). Por el contrario, la heparina no afecto a la actividad agonista de R1MAb1 en el ensayo de luciferasa (figura 5). La actividad agonista independiente de heparina del R1MAb1 se confirmo ademas examinando la fosforilacion de ERK y MEK1/2, componentes de senalizacion corriente abajo de FGFR, en adipocitos 3T3-L1 murinos cultivados (figura 1F) o en WAT de ratones C57BL/6 a los que se les habia inyectado por via intraperitoneal R1MAb (figura 1G).
Se han realizado experimentos para localizar el epitopo FGFR1 al que se unen R1MAb1 y R1MAb2. Se sintetizaron 30 partes representadas de los peptidos de la secuencia de FGFR1 con una marca de biotina amino-terminal y se usaron para los ensayos de union ELISA. Estas secuencias de los peptidos fueron las siguientes: n.° 1: SSSEEKETDNTKPNPVAPY (SEQ ID NO: 36); n.2 2: PVAPYWTSPEKMEKKLHAV (SEQ ID NO: 37); n.2 3:

KLHAVPAAKTVKFKCPSSG (SEQ ID NO: 38); n.2 4: CPSSGTPNPTLRWLKNGKE (SEQ ID NO: 39); n.2 5:

KNGKEFKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 40); n.2 6: YKVRYATWSIIMDSVVPSD (SEQ ID NO: 41); n.2 7:

VVPSDKGNYTCIVENEYGS (SEQ ID NO: 42); n.2 8: NEYGSINHTYQLDVVERSP (SEQ ID NO: 43); n.2 9:
VERSPHRPILQAGLPANKT (SEQ ID NO: 44); n.2 10: PANKTVALGSNVEFMCKVY (SEQ ID NO: 45); n.2 11: MCKVYSDPQPHIQWLKHIE (SEQ ID NO: 46); n.2 12: LKHIEVNGSKIGPDNLPYV (SEQ ID NO: 47); n.2 13:
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NLPYVQILKTAGVNTTDKE (SEQ ID NO: 48); n.2 14: TTDKEMEVLHLRNVSFEDA (SEQ ID NO: 49); n.2 15:

SFEDAGEYTCLAGNSIGLS (SEQ ID NO: 50); n.2 16: SIGLSHHSAWLTVLEALEE (SEQ ID NO: 51); n.2 17:

YWTSPEKMEKKLHAVPAAK (SEQ ID NO: 52); n.2 18: EKMEKKLHAVPAAKTVKFK (SEQ ID NO: 53); n.2 19: PAAKTVKFKCPSSGTPNPT (SEQ ID NO: 54); n.2 20: KFKCPSSGTPNPTLRWLKN (SEQ ID NO: 55); n.2 21:

GTPNPTLRWLKNGKEFKPD (SEQ ID NO: 56); n.2 22: TLRWLKNGKEFKPDHRIGG (SEQ ID NO: 57); n.2 23:

FKPDHRIGGYKVRYATWSI (SEQ ID NO: 58); n.2 24: HRIGGYKVRYATWSHMDS (SEQ ID NO: 59); n.2 25:
LHAVPAAKTVKFKCPSS (SEQ ID NO: 60); n.2 26: KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28); n.2 27: AVPAAKTVKFKCPSSG (SEQ ID NO: 61); n.2 28: FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29); n.2 29: KPDHRIGGYKVR (SEQ ID NO: 62); n.° 30: GTPNPTLRWLKN (SEQ ID NO: 63). Como se muestra en la figura 17A, tanto para R1MAb1 como para R1MAb2 los peptidos mas cortos que demostraron una union significativa fueron los peptidos n.2 26 y n.2 28.
Ejemplo 2. Los R1MAb demuestran actividad antidiabetica sostenida.
Se analizo si los anticuerpos anti-FGFR1 de la invencion tendrian actividad antidiabetica usando modelos de raton de diabetes. Todos los ratones se adquirieron de Jackson Laboratory y se mantuvieron en una instalacion para animales libre de patogenos a 21 °C en un ciclo estandar de 12 horas de luz/12 h de oscuridad con acceso al pienso (un pienso estandar para roedores (LabDiet 5010, 12,7 % de calorias procedentes de la grasa) o una dieta de alto contenido de grasa, alto contenido de carbohidratos (Harlan Teklad TD.03584, 58,4 % de calorias procedentes de la grasa) y agua ad libitum. Los ratones db/db en el fondo C57BLKS/J eran hembras y otros ratones eran todos machos. Todos los ratones inyectados tenian aproximadamente 9-11 semanas de edad, excepto los ratones AP2- SREBP1c que tenian 8 meses (figura 3E) o 4 meses (figura 3F). Para la infusion continua de proteina FGF21, se implanto por via subcutanea una bomba osmotica (Alzet® 2001). Los niveles de glucosa se midieron usando el glucometro OneTouch® Ultra®. Para el analisis de lipidos hepaticos, el lipido se extrajo de acuerdo con el procedimiento de Folch y se resuspendio en PBS que contenia Triton X-100 al 5 %. Se determino el colesterol total, los trigliceridos, el p-hidroxibutirato (Thermo DMA) y los acidos grasos no esterificados (Roche) usando reacciones enzimaticas. Los niveles de insulina en suero se determinaron por ELISA (Crystal Chem).
Se analizo la actividad agonista de los R1MAb in vitro e in vivo, inyectando a ratones db/db resistentes a la leptina e hiperglucemiantes 3, 10 y 50 mg/kg (mpk) de R1MAb1. Se observo que los niveles de glucosa en sangre se normalizaron durante mas de una semana a las tres dosis, y el efecto reductor de la glucosa observado fue inesperadamente fuerte y duradero, permaneciendo los niveles de glucosa inferiores a los de los ratones de control durante mas de 30 dias despues de una unica inyeccion (figura 2A). Esto se asocio con una disminucion transitoria, pero significativa en el peso corporal (figura 2A). El efecto de disminucion de la glucosa probablemente se debio a una mejora en la sensibilidad a la insulina, ya que el nivel de insulina en suero tambien se redujo drasticamente al inyectar el R1MAb1 (figura 2B). Se observo una reduccion inducida por R1MAb similar en los niveles de glucosa en sangre con R1MAb2 (figura 6) y en tres modelos adicionales de raton con una resistencia a la insulina pronunciada, los ratones ob/ob deficitarios en leptina, los ratones alimentados con una dieta alta en grasas (HFD) y los ratones Ins2Akita (Hong et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 293:E1687-96 (2007)) (figura 2C y 7). Los experimentos de alimentacion paralela mostraron que la perdida de peso inducida por R1 MAb en ratones db/db e Ins2Akita se debe a una reduccion en la ingesta de alimentos; sin embargo, la reduccion observada en la glucosa en sangre es en gran medida independiente de la ingesta de alimentos (figura 2D y 6-7). En el pancreas, la inyeccion de R1MAb1 aumento el area positiva a insulina por cada islote en comparacion con los ratones de control alimentados o no en paralelo (figura 2E y 8). El FGFR1 se expresa en celulas p pancreaticas (Hart et al., Nature 408:864-68 (2000)) y FGF21 promueve la funcion de las celulas p ex vivo (Wente et al., Diabetes 55: 2470-78 (2006)); por tanto, la activacion de FGFR1 en las celulas p podria contribuir directamente a un aumento del nivel de insulina pancreatica. Estos datos demuestran que la activacion de FGFR1 (pero no de FGFR2 o FGFR3) es suficiente para recapitular las actividades antidiabeticas y antilipidemicas de FGF21 recombinante.
Para analizar la importancia de las funcionalidades de IgG para las actividades de los R1MAb, se utilizaron dos tipos de modificaciones. Una mutacion doble (D265A/N297A; DANA) en la region Fc anula la union a los Fc y R y el reclutamiento de celulas efectoras inmunitarias por una molecula de IgG (Gong et al., 2005). Ni la actividad agonista ni la antidiabetica de R1MAb2 se vio afectada por la introduccion de las mutaciones DANA; por lo tanto, la funcion efectora no desempena una funcion en la actividad antidiabetica de R1MAb2 (figura 9A-C). Sin embargo, una version modificada de un brazo (OA) de R1Mab1 (Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997)), que carece de uno de los fragmentos Fab (OA-R1MAb1) (figura 9A y D) mostro actividad agonista disminuida (figura 9E y F) y no pudo reducir el nivel de glucosa en sangre, el peso corporal ni los niveles en higado y en suero de los lipidos en ratones db/db (figura 9G y H), lo que indica que tanto las actividades agonistas como las antidiabeticas de los R1MAb dependen de la bivalencia del Ab (aunque tambien se sometieron a prueba anticuerpos biespecificos con un brazo anti-FGFR1 solamente (por ejemplo, con un brazo anti-beta-Klotho) y confirman que conservan los atributos beneficiosos de los R1MAb anti-FGFR1 bivalentes). Estas correlaciones sugieren firmemente que la activacion inducida por R1MAb de la ruta de senalizacion corriente abajo de FGFR1 probablemente media sus efectos antidiabeticos.
Los mAb han surgido como una poderosa modalidad terapeutica para el tratamiento de varias enfermedades humanas. La demostracion de las potentes actividades antihiperglucemiantes e hipolipemiantes del MAb agonista
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anti-FGFRI abre un nuevo camino hacia el desarrollo de mAb terapeuticos dirigidos a FGFR1 o el complejo receptor que contiene FGFR 1 para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 y otros trastornos cronicos relacionadas con la obesidad. Actuar sobre FGFR1 con MAb ofrece varias propiedades favorables con respecto al tratamiento con FGF21 recombinante. En primer lugar, por su naturaleza, los MAb proporcionan una farmacocinetica predecible, modulable y muy superior a la del FGF21 o cualquier otra proteina terapeutica que no sea un anticuerpo. De hecho, se ha demostrado que una unica inyeccion i.p. a 1-3 mpk de R1MAb1 o R1MAb2 en ratones db/db da lugar a una mejora notablemente sostenida de la hiperglucemia durante mas de 30 dias (figura 2 y 5). Nunca se ha publicado un efecto glucemico de tan larga duracion para ninguno de los agentes antidiabeticos descritos previamente.
Ejemplo 3. Importancia de los tejidos adiposos en la accion diabetica de R1 MAb y FGF21.
Se ha sugerido el FGF21 recombinante para mejorar la sensibilidad a la insulina a traves de los tejidos adiposos y el higado (Berglund et al., Endocrinology 150:4084-93 (2009); Li et al., FEBS Letters 583:3230-34 (2009)). La inyeccion de FGF21 en ratones inducia fosforilacion de MEK y ERK en cuatro tipos de tejido que expresan KLB, el higado, el tejido adiposo blanco (WAT), el tejido adiposo pardo (BAT) y el pancreas, como se informo previamente (figura 3A, parte superior) (Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282: 26687-95 (2007); Xu et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 297(5): E1105-14 (2009)). Por el contrario, la inyeccion de R1MAb1 da lugar a la fosforilacion de los mismos efectores corriente abajo en los tejidos adiposos y el pancreas, pero no en el higado (figura 4A, parte inferior), de forma coherente con la muy baja expresion del ARNm de FGFR1 en el higado (figura 10) (Fon Tacer et al., Mol. Endocrinol. 24(10): 2050-64 (2010)). De hecho, una comparacion paralela de la expresion genica hepatica revelo que la expresion de dos genes diana de FGF21 identificados previamente (receptor de leptina (LepR) y el supresor de la senalizacion de citocinas 2 (SOCS2); Coskun et al., Endocrinology 149:6018-27 (2008), Inagaki et al., Cell Metabolism. 8:77-83 (2008)) se inducia con FGF21 pero no con R1MAb1 (figura 15). Por otra parte, la expresion hepatica de los genes regulados por la insulina conocidos (acetil-CoA carboxilasa 1 (ACC1), acido graso sintasa (FAS), elongasa de acidos grasos de cadena larga de la familia 6 (Elovl6), proteina de union al factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) (IGFBP)-1, fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK)) se altero de manera similar tanto con FGF21 como con R1MAb1, lo que sugiere que estos genes podrian estar regulados indirectamente a traves de cambios hormonales (por ejemplo, insulina) o metabolicos. El R1MAb1 disminuyo notablemente los niveles de lipidos hepaticos y en suero cuando se inyecto a ratones db/db en el dia 7 despues de la inyeccion unica, presumiblemente debido a efectos de reparto de los lipidos por los tejidos adiposos (figura 3B-D). La inyeccion de R1MAb1 no indujo fosforilacion de MEK o ERK en el pulmon y la prostata (figura 3A), dos tipos de tejidos que expresan FGFR1, propensos al cancer. Estas observaciones, en conjunto, sugieren que los tejidos adiposos, pero no el higado, son fundamentales para la actividad metabolica comun de R1 MAb y FGF21.
Para investigar mas este punto, se usaron ratones transgenicos aP2-srebp1c lipoatroficos, que presentan resistencia a la insulina severa, deficiencia de leptina y hepatomegalia, debido a la ausencia de tejido adiposo blanco y la funcion comprometida del tejido adiposo pardo (figura 3E, 11) (Shimomura et al., Genes Dev. 12:3182-94 (1998); Shimomura et al., Nature 401:73-76 (1999)). En consonancia con la idea de que se requiere una funcion normal del tejido adiposo para la actividad metabolica de R1MAb1, una unica inyeccion i.p. a 1 mpk mejoro la HOMA-IR y la tolerancia a la glucosa solamente en los ratones ob/ob de control, pero no en los ratones ap2-srebplc (figura 3E). La ingesta de alimentos se redujo por inyeccion de R1MAb1 tanto en ratones ob/ob como en ratones transgenicos ap2- srebplc, en comparacion con los ratones alimentados en paralelo a los que se les inyecto la IgG de control (figura 3E). Ademas, la infusion continua de FGF21 recombinante tampoco logro mejorar la tolerancia a la insulina en ratones ap2-srebplc, aunque se observo un aumento significativo en el p-hidroxibutirato en suero (es decir, cuerpos cetonicos) y una disminucion del colesterol (figura 3F).
Ejemplo 4. Activacion de PGC1 -alfa en tejido adiposo pardo por R1 MAb.
Se ha sugerido recientemente que el FGF21 activa la proteina del receptor nuclear coactivador transcripcional PGC- 1a en los tejidos adiposos y el higado para inducir la expresion de los genes corriente abajo asociados con el metabolismo oxidativo (Chau et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 107:12553-58 (2010); Hondares et al., Cell Metabolism 11:206-12 (2010); Potthoff et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 30;106(26): 10853-8 (2009)). De hecho, cuando se inyecto en ratones ob/ob, el R1MAb1 aumento significativamente la expresion en el BAT de genes implicados en la fosforilacion oxidativa y el metabolismo de acidos grasos segun lo revelado por el analisis de micromatriz de ADN, seguido de un analisis de enriquecimiento para un gen establecido (figura 4A). El R1MAb1 (y FGF21) tambien aumento la expresion de PGC-1a, PGC-1p y sus dianas principales CIDEA y UCP1 en los tejidos adiposos pardos (medida por qPCR; figuras 4B y 16).
La transcripcion de PGC-1a se regula a traves de elementos de respuesta a AMPc (CRE) en la region promotora y el factor de transcripcion CREB que se une a los CRE (Herzig et al., Nature 413:179-83 (2001); Karamitri et al., J. Biol. Chem. 284:20738-52 (2009); Muraoka et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E1430-39 (2009); Shi et al., J. Biol. Chem. (2005)). En un cribado para identificar factores de transcripcion relacionados con el metabolismo que puede activar FGF21 en celulas HEK293 que expresan KLB, se descubrio que la proteina de fusion GAL-CREB se puede activar por FGF21 (figura S8A-B). Posteriormente, se descubrio que tanto FGF21 como R1MAb1 pueden activar el indicador GAL-CREB, asi como el indicador CRE-luciferasa de una manera dependiente de la dosis en celulas HEK293 (figura 4C). En consonancia con la idea de que CREB funciona como un efector corriente abajo,
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FGF21 aumento la fosforilacion de CREB y p90RSK, una cinasa de CREB anterior regulada por ERK, en los tejidos adiposos blancos de raton (figura 4D), adipocitos primarios humanos diferenciados (figura 4E) y celulas HEK293 (figura 12C). Por tanto, la activacion de CREB por FGF21 y RIMAb probablemente contribuye a la induccion de PGC-1alfa y un conjunto de genes corriente abajo implicados en el metabolismo oxidativo en los tejidos adiposos (figura 4F y 12D). Ademas de la regulacion transcripcional sugerida, se ha informado de que FGF21 activa PGC-1a de forma postraduccional a traves de la activacion de AMPK (Chau et al., supra), aunque no se ha podido observar la evidencia de la activacion de AMPK in vitro o in vivo por R1 MAb (datos no mostrados). En conjunto, los presentes resultados apoyan la funcion de PGC-1a en los tejidos adiposos en la mediacion de los efectos hipolipemiantes y antidiabeticos de FGF21 y R1 MAb.
Ejemplo 5. Prueba de anticuerpos biespecificos anti-FGFR1/anti-beta-Klotho
Otra diferencia importante entre los R1MAb y el FGF21 es la especificidad del receptor diana. FGF21 puede actuar sobre FGFR1c, 2c y 3c, pero sus efectos probablemente estan limitados a tejidos que expresan KLB (es decir, higado, tejido adiposo y pancreas) (Fon Tacer et al., supra, Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282:26687-95 (2007); Ogawa et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 104:7432-37 (2007)). Por el contrario, los tejidos diana de los presentes R1 MAb estan determinados por la expresion de FGFR1 y la distribucion tisular de la molecula de anticuerpo, pero es poco probable que esten limitados por la expresion de kLb. De hecho, se observo hipofosfatemia leve en los ratones tratados con R1MAb1, lo que sugiere la activacion de la ruta de FGF23/Klotho en el rinon. En consecuencia, se generaron anticuerpos biespecificos anti-KLB/FGFR1 usando la presentacion en fagos o la tecnologia de hibridoma (ratones BALBc inmunizados con celulas HEK293 que expresan FGFR1c y KLB) para generar distintos anticuerpos anti-KLB y la tecnologia de boton en ojal (Merchant et al. Nature Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)). Se analizo la capacidad de estos anticuerpos biespecificos de activar la expresion de GAL-Elk1 y se confirmo que estos anticuerpos dependen de la presencia tanto de beta-Klotho como de FGFR1 para la activacion de las senales corriente abajo. Tambien se confirmo que uno de los anticuerpos podria aumentar la fosforilacion de los intermedios de senalizacion corriente abajo, MEK y ERK / en adipocitos humanos primarios diferenciados. Uno de los anticuerpos biespecificos reacciona de forma cruzada con las proteinas murinas y se uso este anticuerpo para someter a prueba la actividad in vivo de un anticuerpo biespecifico. Se ha observado que este anticuerpo biespecifico reduce los niveles de glucosa en sangre sin elevar el nivel de FGF23 en suero, mientras que el anticuerpo de control anti-FGFR1 (monoespecifico) correspondiente reduce los niveles de glucosa en sangre en un grado similar, pero eleva los niveles de FGF23 en suero significativamente.
A continuacion se sometio a prueba la capacidad de estos anticuerpos biespecificos de proporcionar los beneficios metabolicos de los anticuerpos agonistas anti-FGFR1. Se generaron ratones transgenicos que expresaban beta- Klotho humano (el R1MAb1 y el R1MAb2 reconocen cada uno el FGFR1 murino) y se confirmo que los anticuerpos biespecificos anti-KLB/FGFR1 descritos anteriormente mejoran la tolerancia a la glucosa en modelos de raton, por ejemplo, ratones transgenicos hKLB alimentados con dieta alta en grasas. Tambien se generaron anticuerpos anti- beta-Klotho que reaccionan con la proteina en otros modelos de animales (por ejemplo rata, conejo, macaco cangrejero y macaco Rhesus) y se analizo de manera similar la capacidad de los anticuerpos biespecificos construidos con estos y los anticuerpos anti-FGFR1 de proporcionar beneficios metabolicos.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> GENENTECH, INC. ET AL.
<120> AGONISTAS DE FGFR1 Y PROCEDIMIENTOS DE USO
<130> P4653R1WO
<140>
<141 >
<150> 61/536.936 <151 >
<150> 61/486.731 <151>
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1

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Leu Gin Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn 115 120 125

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30

Trp lie Ser Trp Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu lie 35 40 45
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Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

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Gly
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<220>
<221 > VARIANTE <222> (6)..(6)
<223> /remplazar="Ser"
<220>
<221 > VARIANTE <222> (7)..(7)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<223> /remplazar="Thr"
<220>
<221 > VARIANTE <222> (8)..(8)
<223> /remplazar="Tyr"
<220>
<221 > VARIANTE <222> (5)..(8)
<223> /nota="Los restos indicados en la secuencia no tienen preferencia con respecto a las anotaciones para dichas posiciones"
<220>
<221 > VARIANTE <222> (10)..(10)
<223> /remplazar="Ser"
<220>
<221 > misc_feature <222> (10)..(10)
<223> /nota="El resto indicado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a la anotacion para dicha posicion" <400> 26
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn Trp lie His 15 10
<210> 27
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
imagen3
<210> 28 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico" <400> 28
Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro 15 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 29 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221 > fuente
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<400> 29
Phe Lys Pro Asp His Arg lie Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr 15 10
<210> 30 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221 > fuente
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<400> 30
Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro 15 10 15
<210> 31 <211> 16 <212> PRT
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<221 > fuente
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<400> 31
Lys Leu Leu Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro 15 10 15
<210> 32 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 32
Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro 15 10 15
<210> 33 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<400> 33
Phe Lys Gin Glu His Arg lie Gly Gly Tyr Lys Val Arg Asn 15 10
<210> 34 <211 > 14 <212> PRT
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<221> fuente
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<400> 34
Phe Arg Gly Glu His Arg lie Gly Gly lie Lys Leu Arg His 15 10
<210> 35 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 35
Phe His Gly Glu Asn Arg lie Gly Gly lie Arg Leu Arg His 15 10
<210> 36 <211 > 19 <212> PRT
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<221> fuente
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<400> 36
Ser Ser Ser Glu Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr Lys Pro Asn Pro Val 15 10 15
Ala Pro Tyr
<210> 37 <211 > 19 <212> PRT
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<221> fuente
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu 15 10 15
His Ala Val
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<221> fuente
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Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro 15 10 15
Ser Ser Gly
<210> 39 <211 > 19 <212> PRT
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<221> fuente
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<400> 39
Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn 15 10 15
Gly Lys Glu
<210> 40 <211 > 19 <212> PRT
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<221> fuente
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<400> 40
Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg lie Gly Gly Tyr Lys 15 10 15
Val Arg Tyr
<210> 41 <211 > 19 <212> PRT
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<221> fuente
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
<400> 41
Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser lie lie Met Asp Ser Val Val 15 10 15
Pro Ser Asp
<210> 42 <211> 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico" <400> 42
Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys lie Val Glu Asn Glu 15 10 15
Tyr Gly Ser
<210> 43 <211> 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221 > fuente
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<400> 43
Asn Glu Tyr Gly Ser lie Asn His Thr Tyr Gin Leu Asp Val Val Glu 15 10 15
Arg Ser Pro
<210> 44 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 44
Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro lie Leu Gin Ala Gly Leu Pro Ala 15 10 15
Asn Lys Thr
<210> 45 <211> 19 <212> PRT
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 45
Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys 15 10 15
Lys Val Tyr
<210> 46 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 46
Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gin Pro His lie Gin Trp Leu Lys 15 10 15
His lie Glu
<210> 47 <211 > 19 <212> PRT
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<221> fuente
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<400> 47
Leu Lys His lie Glu Val Asn Gly Ser Lys lie Gly Pro Asp Asn Leu 15 10 15
Pro Tyr Val
<210> 48 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
Asn Leu Pro Tyr Val Gin lie Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Thr Thr 15 10 15
Asp Lys Glu
<210> 49 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 49
Thr Thr Asp Lys Glu Met Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe 15 10 15
Glu Asp Ala
<210> 50 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 50
Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser lie 15 10 15
Gly Leu Ser
<210>51 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico" <400> 51
Ser lie Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Glu Ala 15 10 15
Leu Glu Glu
<210> 52 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 52
Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro 15 10 15
Ala Ala Lys
<210> 53 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 53
Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val 15 10 15
Lys Phe Lys
<210> 54 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 54
Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro 15 10 15
Asn Pro Thr
<210> 55 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 55
Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp 15 10 15
Leu Lys Asn
<210> 56
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 56
Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe 15 10 15
Lys Pro Asp
<210> 57 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico" <400> 57
Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg 15 10 15
He Gly Gly
<210> 58 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico" <400> 58
Phe Lys Pro Asp His Arg lie Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr 15 10 15
Trp Ser lie
<210> 59 <211 > 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico" <400> 59
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
His Arg lie Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser lie lie 15 10 15
Met Asp Ser
<210> 60 <211 > 17 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 60
Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser 15 10 15
Ser
<210>61 <211 > 16 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico" <400> 61
Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly 15 10 15
<210> 62 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 62
Lys Pro Asp His Arg lie Gly Gly Tyr Lys Val Arg 15 10
<210> 63 <211 > 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripcion de secuencia artificial: peptido sintetico"
<400> 63
Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn 15 10

Claims (23)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo agonista anti-receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR1) que se une al peptido n.2 26 KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28) o al peptido n.2 28 FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29).
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo no es un agonista de FGFR2 o de FGFR3.
  3. 3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  4. 4. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico.
  5. 5. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 -4, que es un anticuerpo IgG1.
  6. 6. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-5, en el que anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFX1X2X3X4IX5, en la que X1 es S o T, X2 es N o S, X3 es N o T, X4 es W o Y, X5 es H o S (SEQ ID NO: 26), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en X1X2IX3PX4DGX5TX6YADSVKG, en la que X1 es A o G, X2 es D o E, X3 es D o Y, X4 es N o Y, X5 es A o D y X6 es D o Y (SEQ ID NO: 24) y X1IX2PX3DGX4TX5YADSVKG, en la que X1 es D o E, X2 es D o Y, X3 es N o Y, X4 es A o D y X5 es D o Y (SEQ ID NO: 25), (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16), SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO:
    17) , EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18), TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) y GTDVMDY (SEQ ID NO: 20), (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoacidos RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 21), (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoacidos SASFLYS (SEQ ID NO: 22) y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoacidos QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 23).
  7. 7. El anticuerpo de la reivindicacion 6, en el que anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFTSTWIS (SEQ ID NO: 7), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en GEIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 10) y EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11) y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16) y SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17).
  8. 8. El anticuerpo de la reivindicacion 6, en el que anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFSNNYIH (SEQ ID NO: 8), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en ADIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 12) y DIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 13) y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoacidos EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO:
    18) .
  9. 9. El anticuerpo de la reivindicacion 6, en el que anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFTSNWIS (SEQ ID NO: 9), (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en AEIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 14) y EIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 15) y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) y GTDVMDY (SEQ ID NO: 20).
  10. 10. El anticuerpo de la reivindicacion 6, que comprende una secuencia VH seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3 y 4; y una secuencia Vl de la SEQ ID NO: 6.
  11. 11. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-10, en el que el anticuerpo anti-FGFR1 se une tanto a FGFR1b como a FGFR1c.
  12. 12. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo multiespecifico.
  13. 13. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico.
  14. 14. El anticuerpo de la reivindicacion 13, en el que el anticuerpo tambien se une a beta-Klotho.
  15. 15. Acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de las reivindicaciones 1 -14.
  16. 16. Una celula huesped que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 15.
  17. 17. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo, que comprende cultivar la celula huesped de la reivindicacion 16 de modo que se produzca el anticuerpo.
  18. 18. El procedimiento de la reivindicacion 17, que comprende ademas recuperar el anticuerpo de la celula huesped.
  19. 19. Una formulacion farmaceutica que comprende un anticuerpo de las reivindicaciones 1-14 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
  20. 20. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-14 para su uso como medicamento.
    5
  21. 21. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-14, donde el anticuerpo se administra con otro agente para tratar la diabetes, siempre que el otro agente no sea insulina.
  22. 22. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-14, donde el anticuerpo se administra con un agente para tratar 10 enfermedades cardiovasculares.
  23. 23. El anticuerpo agonista contra FGFR1 de las reivindicaciones 1-14 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicho anticuerpo agonista, en el que la enfermedad metabolica se selecciona del grupo que consiste en: el sindrome del
    15 ovario poliquistico (SOP), el sindrome metabolico (SM), la obesidad, la esteatosis hepatica no alcoholica (EHNA), la enfermedad del higado graso no alcoholico (EHGNA), la hiperlipidemia, la hipertension, la diabetes de tipo 2, la diabetes no de tipo 2, la diabetes de tipo 1, la diabetes autoinmune latente (DAL) y la diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY), en el que el anticuerpo agonista contra FGFR1 no activa FGFR2 o FGFR3.
    20
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