RS56090B1 - Fgfr1 agonisti i načini primene - Google Patents

Fgfr1 agonisti i načini primene

Info

Publication number
RS56090B1
RS56090B1 RS20170598A RSP20170598A RS56090B1 RS 56090 B1 RS56090 B1 RS 56090B1 RS 20170598 A RS20170598 A RS 20170598A RS P20170598 A RSP20170598 A RS P20170598A RS 56090 B1 RS56090 B1 RS 56090B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
acid sequence
hvr
Prior art date
Application number
RS20170598A
Other languages
English (en)
Inventor
Junichiro Sonoda
Yan Wu
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS56090B1 publication Critical patent/RS56090B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak odnosi se na FGFR1 agoniste i postupke za primenu istih.
OSNOVA
Nemogućnost kontrolisanja nivoa glukoze u krvi leži u osnovi različitih metaboličkih stanja. Dijabetes je hiperglikemijski sindrom koji nastaje usled poremećaja lučenja insulina u odgovoru na glukozu (dijabetes tip 1 i tip 2) i smanjene efikasnosti insulina u stimulisanju preuzimanja glukoze od strane skeletnih mišića i obustavljanju proizvodnje glukoze u jetri (dijabetes tip 2). Dijabetes je veoma rasprostranjena bolest i, mada su dostupne terapeutske opcije za neke dijabetičare, hitno su potrebne dodatne terapije.
Faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21) je član endokrine potporodice FGF, koja obuhvata FGF 19 i FGF 23, i identifikovan je kao potencijalni agens za modifikovanje bolesti koji može da izazove preokret kod gojaznosti, kao i hepatosteatoze i hiperglikemije izazvane gojaznošću (pogledajte npr. Kharitonenkov and Larsen, Trends Endocrinol. Metab. 22(3):81-6 (2011); Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. 115: 1627-35 (2005); WO 2010/042747). Endokrini protein FGF21 vezuje se za tri FGF receptora (FGFR 1-3), i poboljšava otpornost na insulin i dijabetes tip 2 preko tih receptora, zajedno sa njihovim koreceptorom vezanim za membranu beta-Kloto. Međutim, njegov razvoj ometa loša farmakokinetika i loše razumevanje biološkog mehanizma njegovog dejstva. Za lečenje dijabetesa su takođe predložena anti-FGFR1 antagonistička antitela (WO 2005/037235). Međutim, nije otkriveno koji od tri FGFR posreduje u blagotvornoj metaboličkoj aktivnosti FGF21.
WO 2005/066211 se odnosi na agonistička i antagonistička antitela usmerena na FGFR1, FGFR2, FGFR3 i FGFR4 za terapeutske intervencije.
WO 2001/004160 opisuje antiidiotipska antitela FGF-a koja se vezuju za FGFR1 i imaju agonističku aktivnost.
Sun et al, American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism, Vol 292, No 3: E964-E976 (2007) opisuje upotrebu antagonističkih antitela FGFR1 za smanjivanje unosa hrane i izazivanje gubitka težine.
REZIME
Predmet pronalaska je definisan patentnim zahtevima.
Pronalazak se delimično zasniva na otkriću da aktivacija FGFR1 poboljšava dijabetes. Pronalazak daje agonistička anti-FGFR1 antitela i postupke za njihovu primenu.
U jednom aspektu, pronalazak daje postupak za lečenje metaboličke bolesti ili stanja kod pojedinca, uključujući davanje pojedincu efikasne količine agonista protiv receptora-1 faktora rasta fibroblasta (FGFR1), naznačenu time što je metabolička bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od: policističnog sindroma jajnika (PCOS), metaboličkog sindroma (MetS), gojaznosti, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), hiperlipidemije, hipertenzije, dijabetesa tip 2, ne-tip 2 dijabetesa, dijabetesa tip 1, latentnog autoimunog dijabetesa (LAD) i adultnog tipa dijabetesa kod mladih osoba (MODY). U nekim realizacijama, FGFR1 agonist ne aktivira FGFR2 ili FGFR3. FGFR1 agonist je anti-FGFR1 antitelo. U nekim realizacijama, anti-FGFR1 antitelo ima dva mesta vezivanja FGFR1, npr. kompletno antitelo ili F(ab’)2 fragment. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje za peptid br.
26 KLHAVPAAKTVKFKCP (ID BR SEKV: 28) ili peptid br. 28 FKPDHRIGGYKVRY (ID BR SEKV: 29). U nekim realizacijama, antitelo se vezuje i za peptid br. 26 i za peptid br.28. U nekim realizacijama, anti-FGFR1 antitelo se vezuje i za FGFR1b i za FGFR1c. U nekim realizacijama, antitelo je bispecifično antitelo. U nekim realizacijama, bispecifično antitelo se takođe vezuje za beta-Kloto.
U drugom aspektu, pronalazak daje izolovano antitelo koje se vezuje za FGFR1, naznačeno time što je antitelo agonist aktivnosti FGFR1. U nekim realizacijama, antitelo nije agonist FGFR2 ili FGFR3. U nekim realizacijama, antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim realizacijama, antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U nekim realizacijama, antitelo obuhvata (a) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži SSGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 16), SGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 17), EHFDAWVHYYVMDY (ID BR. SEKV: 18), TGTDVMDY (ID BR. SEKV: 19) i GTDVMDY (ID BR. SEKV: 20), (b) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu QQSYTTPPT (ID BR. SEKV: 23), i (c) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži X1X2IX3PX4DGX5TX6YADSVKG, naznačenu time što: X1 je A ili G, X2 je D ili E, X3 je D ili Y, X4 je N ili Y, X5 je A ili D, i X6 je D ili Y (ID BR. SEKV: 24), i X1IX2PX3DGX4TX5YADSVKG, naznačenu time što: X1 je D ili E, X2 je D ili Y, X3 je N ili Y, X4 je A ili D, i X5 je D ili Y (ID BR. SEKV: 25). U nekim realizacijama, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu GFTFX1X2X3X4IX5, naznačenu time što: X1 je S ili T, X2 je N ili S, X3 je N ili T, X4 je W ili Y, X5 je H ili S (ID BR. SEKV: 26), (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži X1X2IX3PX4DGX5TX6YADSVKG, naznačenu time što: X1 je A ili G, X2 je D ili E, X3 je D ili Y, X4 je N ili Y, X5 je A ili D, i X6 je D ili Y (ID BR. SEKV: 24) i X1IX2PX3DGX4TX5YADSVKG, naznačenu time što: X1 je D ili E, X2 je D ili Y, X3 je N ili Y, X4 je A ili D, i X5 je D ili Y (ID BR. SEKV: 25), i (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži SSGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 16), SGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 17), EHFDAWVHYYVMDY (ID BR. SEKV: 18), TGTDVMDY (ID BR. SEKV: 19), i GTDVMDY (ID BR. SEKV: 20). U nekim realizacijama, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu GFTFTSTWIS (ID BR. SEKV: 7), (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži GEIDPYDGDTYYADSVKG (ID BR. SEKV: 10) i EIDPYDGDTYYADSVKG (ID BR. SEKV: 11), i (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži SSGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 16) i SGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 17). U nekim realizacijama, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu GFTFSNNYIH (ID BR. SEKV: 8), (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži ADIYPNDGDTDYADSVKG (ID BR. SEKV: 12) i DIYPNDGDTDYADSVKG (ID BR. SEKV: 13), i (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu EHFDAWVHYYVMDY (ID BR. SEKV: 18). U nekim realizacijama, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu GFTFTSNWIS (ID BR. SEKV: 9), (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži AEIDPYDGATDYADSVKG (ID BR. SEKV: 14) i EIDPYDGATDYADSVKG (ID BR. SEKV: 15), i (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži TGTDVMDY (ID BR. SEKV: 19) i GTDVMDY (ID BR. SEKV: 20). U nekim realizacijama, antitelo dalje obuhvata (a) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu RASQDVSTAVA (ID BR. SEKV: 21), (b) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SASFLYS (ID BR. SEKV: 22); i (c) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu QQSYTTPPT (ID BR. SEKV: 23). U nekim realizacijama, antitelo uključuje VH sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 2, 3 i 4. U nekim realizacijama, antitelo uključuje VL sekvencu ID BR. SEKV: 6. U nekim realizacijama, anti-FGFR1 antitelo ima dva mesta vezivanja FGFR1, npr. kompletno antitelo ili F(ab’)2 fragment. U nekim realizacijama, antitelo iz pronalaska je multispecifično antitelo. U nekim realizacijama, antitelo se takođe vezuje za beta-Kloto. U nekim realizacijama, antitelo je IgG1 antitelo. U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo iz pronalaska. U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu. U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina tako da se proizvodi antitelo. U nekim realizacijama, postupak dalje uključuje izolovanje antitela iz ćelije domaćina.
U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja obuhvata antitelo iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje antitelo iz pronalaska za upotrebu kao lek. U nekim realizacijama, antitelo iz pronalaska je za primenu u lečenju metaboličke bolesti ili stanja izabranog iz grupe koja sadrži policistični sindrom jajnika (PCOS), metabolički sindrom (MetS), gojaznost, nealkoholni steatohepatitis (NASH), nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), hiperlipidemiju, hipertenziju, dijabetes tip 2, ne-tip 2 dijabetes, dijabetes tip 1, latentni autoimuni dijabetes (LAD) i adultni tip dijabetesa kod mladih osoba (MODY). U nekim realizacijama, antitelo iz pronalaska je za primenu u senzibilizaciji pojedinca na insulin.
U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje primenu antitela iz pronalaska u proizvodnji leka. U nekim realizacijama, lek služi za lečenje metaboličke bolesti ili stanja izabranih iz grupe koja se sastoji od: policističnog sindroma jajnika (PCOS), metaboličkog sindroma (MetS), gojaznosti, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), hiperlipidemije, hipertenzije, dijabetesa tip 2, ne-tip 2 dijabetesa, dijabetesa tip 1, latentnog autoimunog dijabetesa (LAD) i adultnog tipa dijabetesa kod mladih osoba (MODY). U nekim realizacijama, lek služi za senzibilizaciju pojedinca na insulin.
U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje dijabetesa kod pojedinca, uključujući davanje pojedincu efikasne količine antitela iz pronalaska. U nekim realizacijama, postupak nadalje obuhvata davanje pojedincu drugog agensa za lečenje dijabetesa, pod uslovom da drugi agens nije insulin. U nekim realizacijama, postupak nadalje obuhvata davanje pojedincu agensa za lečenje kardiovaskularne bolesti.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1A prikazuje ELISA za merenje vezivanja anti-FGFR1 antitela za prečišćene FGFR ECD fragmente.
Slika 1B prikazuje konstante vezivanja za R1MAb1 i R1MAb2 određene površinskom plazmonskom rezonancom.
Slika 1C prikazuje test za GAL-Elk1 luciferazu u L6 ćelijama pacova. Ćelije su kotransficirane ekspresionim vektorima za naznačeni FGFR izooblik, zajedno sa GAL-Elk1, SV40-renilla luciferazom i reporterom luciferaze svica koji daje odgovor na Gal. Transficirane ćelije su inkubirane sa medijumom koji sadrži rastuće koncentracije R1Mab ili kiselog FGF (aFGF: pozitivna kontrola) tokom 6 sati pre luciferaza testa. Transkripciona aktivacija je procenjena preko relativne aktivnosti luciferaze svica normalizovane pomoću aktivnosti renilla luciferaze, i izražena kao relativna jedinica luciferaze (RLU).
Slika 1D prikazuje eksperiment sličan onom na slici 1C, osim što L6 ćelije eksprimiraju i FGFR1c i KLB.
Slika 1E prikazuje eksperiment sličan onome na slici 1C, osim što se koriste HEK293 ćelije.
Slika 1F prikazuje vestern blot analizu 3T3-L1 adipocita tretiranih naznačenim proteinom u koncentraciji 0,5 μg/ml tokom naznačenog vremena.
Slika 1G prikazuje WAT izolovan iz mršavih miševa C57BL/6 u naznačenom vremenu nakon i.p. injekcije 1 mg/kg R1Mab (+) ili kontrolnog IgG (-), i analiziran tehnikom vestern blot.
Slika 2A prikazuje glukozu u krvi (levo) i telesnu težinu (desno) db/db miševa nakon jedne i.p. injekcije (strelica) R1Mab1 ili kontrolnog IgG u naznačenim dozama. Značajna razlika je primećena kod glukoze (u odnosu na kontrolni IgG) između 1. i 30. dana za sve grupe, i kod težine (u odnosu na kontrolni IgG) 8. dana za sve grupe, a između 12. i 18. dana za grupu sa 50 mg/kg. N=6~14, *p<0,05, **p<0,01.
Slika 2B prikazuje glukozu u krvi kod nasumično hranjenih miševa i miševa koji su preko noći gladovali (gore), i nivoe insulina u serumu nakon noćnog gladovanja, i 30 minuta nakon i.p. injekcije 1 g/kg glukoze (dole). N=6~14, *p<0,05, **p<0,01.
Slika 2C prikazuje glukozu u krvi (levo) i telesnu težinu (desno) Ins2Akita miševa nakon jedne i.p. injekcije R1Mab1 ili kontrolnog IgG u dozi od 3 mg/kg. N=10. *p<0,01.
Slika 2D prikazuje unos hrane (levo), glukozu u krvi (u sredini) i telesnu težinu (desno) db/db miševa nakon jedne i.p. injekcije R1Mab1 ili kontrolnog IgG u dozi od 1 mg/kg. PF: hranjeni istovetno kao grupa koja je primala R1MAb. N=7. #p<0,001 (vs IgG), *p<0,001 (vs PF-IgG).
Slika 2E prikazuje kvantifikaciju insulin pozitivne oblasti u određenim regijama pankreasa. Tkiva su sakupljena 7. dana nakon jedne i.p. injekcije od 3 mg/kg (levo) ili 1 mg/kg (desno) R1MAb1, i obojena za insulin i glukagon. N=4~7. **p<0,002. **p<0,001.
Slika 3A prikazuje aktivaciju MAPK signalizacije u tkivima miša. Navedena tkiva su sakupljena 15 minuta (25 μg/mišu FGF21: gore) ili 1 sat (1 mg/kg R1Mab1: dole) nakon i.p. injekcije date mršavim C57BL/6 miševima, i analizirana su vestern blot tehnikom. PBS (gore) i kontrolni IgG (dole) su korišćeni kao negativna kontrola.
Slike 3B-D prikazuju primere za HE bojenje jetre (B), lipida iz jetre (C) i lipida iz seruma (D). Uzorci su sakupljeni 7. dana nakon jedne i.p. injekcije 1 mg/kg R1MAb1. Kontrolni miševi su istovetno hranjeni radi normalizacije telesne težine. N=7, *p<0,05, **p<0,001.
Slika 3E prikazuje metaboličke parametre ob/ob ili transgenih ap2-SREBP1c (srebp) miševa kojima je injektovan 1 mg/kg Ab. Kontrolne grupe su istovetno hranjene radi normalizacije telesne težine (Sl. S7). Glukoza i insulin za proračun HOMA-IR mereni su 3. dana nakon gladovanja od 3 sata. Test tolerancije na glukozu (GTT) sproveden je davanjem i.p. injekcije 1 g/kg glukoze 4. dana nakon noćnog gladovanja. Težina tkiva je merena 5. dana. N=7, *p<0,05, ***p<0,01.
Slika 3F prikazuje metaboličke parametre ap2-SREBP miševa kojima je subkutano ugrađena osmotska pumpa za infuziju FGF21 (12 ng/dan). Test tolerancije na insulin (ITT) sproveden je davanjem i.p. injekcije 1 U/kg insulina 4. dana. Serum je sakupljen 6. dana. N=6~8.
Slika 4A prikazuje ekspresiju mRNK (crveno: veća ekspresija i plavo: manja ekspresija) u BAT za gene koji pripadaju naznačenom KEGG putu. Uzorci su sakupljeni 4. dana nakon jedne i.p. injekcije 1 mg/kg R1MAb1 ili od istovetno hranjenih miševa sa kontrolnim IgG.
Slika 4B prikazuje ekspresiju mRNK u BAT prema qPCR. N=6, *p<0,05, **p<0,001. Slika 4C prikazuje test za luciferazu u HEK293 ćelijama. Dijagram prikazuje da i FGF21 i R1MAb1 indukuju transkripciju UAS-stimulisanog reporter gena luciferaze u HEK293 ćelijama putem CREB spojenog sa GAL4 DNK vezujućim domenom (GAL-CREB) (dva leva pravougaonika), ili CRE-stimulisanog reporter gena luciferaze (dva desna pravougaonika), na dozno zavistan način. Neke ćelije su takođe kotransficirane da eksprimiraju FGFR1c i KLB (crveno; gornja kriva na dijagramima). Rezultati predstavljaju srednje vrednosti eksperimenata urađenih u triplikatu za aktivnost luciferaze normalizovanu pomoću renilla aktivnosti.
Slika 4D prikazuje WAT izolovan 15 minuta nakon i.v. injekcije 25 μg FGF21 (+) ili PBS (-), i analiziran tehnikom vestern blot.
Slika 4E prikazuje vestern blot analizu diferenciranih primarnih humanih adipocita tretiranih sa FGF21 pri 1 μg/ml tokom 30 minuta.
Slika 4F prikazuje model signalnog puta kojim FGF21 i R1MAb aktiviraju PGC-1alfa program u adipoznim tkivima.
Slika 5 prikazuje heparin-nezavisnu i FGFR1-zavisnu agonističku aktivnost R1MAb1. Test za GAL-Elk1 luciferazu u HEK293 ćelijama. Ćelije su kotransficirane sa ekspresionim vektorima za FGFR1c ili bez njih, kao što je naznačeno, zajedno sa GAL-Elk1, SV40-renilla luciferazom i reporterom luciferaze svica koji daje odgovor na Gal. Transficirane ćelije su inkubirane u medijumu koji sadrži rastuće koncentracije R1Mab1 sa 25 mg/l svinjskog heparina ili bez njega, kao što je naznačeno, tokom 6 sati pre luciferaza testa. Transkripciona aktivacija je procenjena preko relativne aktivnosti luciferaze svica normalizovane pomoću aktivnosti renilla luciferaze, i izražena kao relativna jedinica luciferaze (RLU).
Slika 6A prikazuje unos hrane (levo), telesnu težinu (u sredini) i glukozu u krvi (desno) db/db miševa nakon jedne i.p. injekcije R1Mab2 ili kontrolnog IgG u dozi od 3 mg/kg 0. dana. Kontrolni miševi su istovetno hranjeni (PF) da bi se unos hrane podesio do 11. dana. 11. dana, unos hrane miševa koji su primali R1MAb2 vraćen je na normalu, i tako su svi miševi hranjeni ad libitum posle 11. dana (AL). N=7~12. p<0,001.
Slika 6B prikazuje nivo glukoze u krvi nasumično hranjenih miševa korišćen na slici S2A 26. dana.
Slika 6C prikazuje GTT izveden na tim istim miševima 28. dana.
Slika 6D prikazuje ITT izveden na istim miševima 37. dana.
Slika 7A prikazuje glukozu u krvi (levo) i telesnu težinu (desno) ob/ob miševa nakon jedne i.p. injekcije R1Mab1 ili kontrolnog IgG u dozama od 1 mg/kg 0. dana. Kontrolni miševi su hranjeni istovetno (PF) kao grupa koja je primala R1MAb. N=7. *p<0,05 (u odnosu na PFIgG).
Slika 7B prikazuje glukozu u krvi (levo) i telesnu težinu (desno) C57BL/6 miševa koji su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti (HFD) nakon jedne i.p. injekcije R1Mab1 ili kontrolnog IgG u dozama od 1 mg/kg 0. dana. N=7~9. *p<0,05.
Slika 7C prikazuje GTT na HFD hranjenim miševima korišćenim u S3B 8. dana nakon injekcije Ab. Miševima je i.p. injektovan 1 g/kg glukoze nakon noćnog gladovanja. Prosečne telesne težine su bile 28,6+/-0,6 (R1MAb1) i 32,1+/-0,8 (kontrolni IgG) (p<0,01). N=7.
Slika 7D prikazuje glukozu u krvi (levo) i telesnu težinu (desno) Ins2Akita miševa 5. dana nakon jedne i.p. injekcije R1Mab1 ili kontrolnog IgG u dozi od 1 mg/kg. Kontrolni miševi su istovetno hranjeni (PF-IgG) radi normalizacije telesne težine. *p<0,05.
Slika 8A prikazuje reprezentativno bojenje ostrvaca pankreasa kod db/db miševa analiziranih na slici 4E. Crvena: Insulin, Zelena: Glukagon, Plava: Nukleusi. Zapazite da R1MAb ne utiče na ukupnu morfologiju ostrvaca.
Slika 8B prikazuje distribuciju insulin pozitivne oblasti (%) u svakom ostrvcu u svakoj životinji.
Slika 9A daje šematski prikaz IgG i jednokrakog (OA) IgG. Plava: Teški lanac, Zelena: Laki lanac. Crvena zvezdica ukazuje na približni položaj ostataka koji su mutirani kod DANA mutanta.
Slika 9B prikazuje test luciferaze na bazi GAL-Elk kod HEK293 ćelija koje eksprimiraju FGFR1c za poređenje R1MAb2 i DNK mutanta R1MAb2 (R1MAb2 DANA).
Slika 9C prikazuje glukozu u krvi db/db miševa pre (pre) i 7. dana nakon i.p. injekcije naznačenog Ab u koncentraciji od 1 mg/kg. Kontrolni miševi su istovetno hranjeni radi normalizacije telesne težine.
Slika 9D prikazuje ELISA merenje vezivanja antitela za prečišćene FGFR ECD fragmente. OA-R1MAb1: OA verzija R1MAb1.
Slika 9E prikazuje test luciferaze na bazi GAL-Elk sličan onom na S5B.
Slika 9F prikazuje vestern blot analizu 3T3-L1 adipocita tretiranih naznačenim proteinom u koncentraciji 0,5 μg/ml tokom naznačenog vremena.
Slika 9G prikazuje glukozu u krvi (levo) i telesnu težinu (desno) db/db miševa nakon jedne i.p. injekcije naznačenog Ab 0. dana (strelica). N=7. *p<0,05 (kontrolni IgG u odnosu na 3 mg/kg R1MAb1), **p<0,0005 (kontrolni IgG u odnosu na 3 mg/kg R1MAb1 i kontrolni IgG u odnosu na 1 mg/kg R1MAb1).
Slika 9H prikazuje lipide iz jetre i seruma iz uzoraka sakupljenih 7. dana nakon injekcije Ab. N=7. *p<0,05, **p<0,0005 (u odnosu na kontrolni IgG).
Slika 10 prikazuje ekspresiju mRNK KLB i FGFR izooblika u jetri i WAT. Normalno hranjeni i HFD hranjeni C57BL/6 miševi imali su 25 nedelja. HFD-hranjeni miševi bili su na HFD dijeti 21 nedelju. *p<0,05 ili **p<0,001. N=6.
Slika 11 prikazuje zahtev za normalnu adipoznu funkciju za aktivnost FGF21 i R1MAb. Unos hrane (levo), glukoza u krvi (u sredini) i telesna težina (desno) ob/ob ili ap2-srebp1c transgenih miševa nakon jedne i.p. injekcije R1Mab1 ili kontrolnog IgG u dozama od 1 mg/kg 0. dana. Isti miševi su opisani na Sl.3E. N=7. #p<0,001 (u odnosu na IgG), *p<0,001 (u odnosu na PF-IgG). Merenja nakon lečenja izvršena su 1. dana nakon injekcije.
Slika 12A prikazuje test za luciferazu na bazi ćelija u HEK293. Ćelije su kotransficirane ekspresionim vektorima za naznačene GAL-fuzione proteine, SV40-renilla luciferazu i reporter luciferaze koji daje odgovor na GAL. Neke ćelije su takođe kotransficirane ekspresionim vektorom za KLB, kao što je naznačeno. Transficirane ćelije su inkubirane sa medijumima koji sadrže kondicionirani medijum od HEK293 ćelija transficiranih ekspresionim vektorom za FGF21 ili kontrolnim praznim vektorom, kao što je naznačeno. Nakon 6 sati inkubacije, ćelije su podvrgnute testu za luciferazu. Transkripciona aktivacija je procenjena preko relativne aktivnosti luciferaze svica normalizovane pomoću aktivnosti renilla luciferaze, i izražena kao umnožak indukcije.
Slika 12B prikazuje sličan test luciferaze, gde su neke ćelije kotretirane sa sledećim ligandima nuklearnog receptora: 1MM Wy14643 (PPARα), 5 nM GW101516 (PPARβ), 50 nM rosiglitazona (PPARγ), 50 nM T0901317 (LXRα), 5 nM T3 (TRβ), 30MM CDCA (FXR). Zapazite da FGF21 nije uticao na aktivnost nijednog ovde ispitanog nuklearnog receptora, uz tretman srodnim ligandom ili bez njega.
Slika 12C prikazuje vestern blot analizu HEK293 ćelija tretiranih sa 5 μg/ml FGF21 tokom 10 minuta. Neke ćelije su prethodno tretirane inhibitorom za FGFR (100 nM PD173074), mTOR (100 nM rapamicin) MEK1/2 (10 μM U0126), PI3K (μM vortmanin), kao što je naznačeno.
Slika 12D prikazuje nizvodne gene uključene u oksidativni metabolizam u adipoznim tkivima.
Slika 13 prikazuje glukozu u krvi (gore) i telesnu težinu (dole) db/db miševa nakon jedne i.p. injekcije R1Mab2 (oznaka 182.2), RlMAb3 (oznaka 182.5) ili kontrolnog IgG (anti-Her2) u naznačenim dozama. N=6, *p<0,05, **p<0,005, ***p<0,0005. R1MAb3 sadrži VH koji obuhvata ID BR. SEKV: 6 i VH koji obuhvata ID BR. SEKV: 4.
Slika 14A prikazuje kumulativni unos hrane, glukozu u krvi i promenu telesne težine mršavih C57BL/6 miševa nakon jedne intraperitonealne injekcije R1Mab1 ili kontrolnog IgG u dozi od 0,5 mg/kg. Miševima je takođe subkutano ugrađena osmotska mini-pumpa 0. dana, radi kontinualne infuzije (c.i.) rekombinantnog FGF21 u dozi od 1,2 mg/kg/dan ili kontrolnog vehikuluma (PBS). 3.dana, miševi su preko noći gladovali da bi se uradio test tolerancije na glukozu (GTT) 4. dana (strelica).
Slika 14B prikazuje test tolerancije na glukozu izveden sa 2 g/kg glukoze injektovane intraperitonealno 4. dana nakon noćnog gladovanja.
Slika 14C prikazuje analizu seruma miševa prikazanu na Sl. 2C, S10A i S10B. Uzorci seruma su sakupljeni 5. dana nakon 4 h gladovanja. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) za n=6 miševa po grupi; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 u odnosu na PBS (c.i.) IgG kontrola, pomoću dvostranog neuparenog studentovog t testa (n.s. = nije značajno).
Slika 15 prikazuje analizu ekspresije gena pomoću mRNK izolovane iz tkiva jetre miševa korišćenih na Sl. 2C i S10. Uzorci tkiva su izolovani 5. dana nakon 4 h gladovanja. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) za n=6 miševa po grupi; *p<0,05, ***p<0,001 u odnosu na PBS (c.i.) IgG kontrola, pomoću dvostranog neuparenog studentovog t testa (n.s. = nije značajno).
Slika 16 prikazuje analizu ekspresije gena pomoću mRNK izolovane iz braon adipoznog tkiva miševa korišćenih na Sl. 2C, S10 i S11. Uzorci tkiva su izolovani 5. dana nakon 4 h gladovanja. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) za n=6 miševa po grupi; *p<0,05, ***p<0,001 u odnosu na PBS (c.i.) IgG kontrola, pomoću dvostranog neuparenog studentovog t testa (n.s. = nije značajno).
Slika 17A prikazuje rezultate ELISA merenja vezivanja antitela za biotinilovane fragmente peptida.
Slika 17B prikazuje aminokiselinske sekvence FGFR1 (aminokiseline 161-212; ID BR. SEKV: 27), aminokiselinske sekvence peptida br. 26 (ID BR. SEKV: 28) i peptida br. 28 (ID BR. SEKV: 29) zajedno sa aminokiselinama koje odgovaraju peptidu br. 26 iz FGFR2 (ID BR. SEKV: 30), FGFR3 (ID BR. SEKV: 31) i FGFR4 (ID BR. SEKV: 32) i aminokiselinama koje odgovaraju peptidu br.28 iz FGFR2 (ID BR. SEKV: 33), FGFR3 (ID BR. SEKV: 34) i FGFR4 (ID BR. SEKV: 35). Razlike između sekvenci peptida br. 26 i peptida br. 28 u FGFR1 i odgovarajućeg regiona FGFR2-4 su uokvirene.
Slika 17C prikazuje rezultate ELISA merenja vezivanja His-markiranog FGFR1 za FGF2 protein u prisustvu različitih koncentracija R1MAb1 ili kontrolnog IgG. Podaci su izraženi kao % vezivanja FGFR1-His , i predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (n=3).
Slika 17D prikazuje vezivanje jodovanog FGF21 za HEK293 ćelije koje stabilno eksprimiraju i KLB i FGFR1c u prisustvu različitih koncentracija neobeleženog R1MAb1 ili FGF1 (reakcija je takođe sadržala BSA (10 mg/ml) i kontrolni IgG (350 mM) za blokiranje nespecifičnog vezivanja. Podaci su izraženi kao % vezanog FGF21 od ukupnog radioobeleženog FGF21 u reakciji.
DETALJAN OPIS REALIZACIJE PRONALASKA
I. DEFINICIJE
"Akceptorski humani okvir" je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinske sekvence okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisan dole. Akceptorski humani okvir "dobijen od" okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da obuhvati iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim realizacijama, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim realizacijama, VL akceptorski humani okvir je po sekvenci identičan sa sekvencom VL humanog imunoglobulinskog okvira ili sekvencom okvira humanog konsenzusa.
"Afinitet" se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, "afinitet vezivanja" se odnosi na suštinski afinitet prema vezivanju koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može generalno da se predstavi preko konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koje su ovde opisane. Specifična ilustrativna realizacijadata kao primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Termin "anti-FGFR1 agonističko antitelo" odnosi se na antitelo koje može da veže FGFR1 sa dovoljnim afinitetom, tako da se antitelo može koristiti kao terapeutski agens u aktiviranju FGFR1. U jednoj realizaciji, obim vezivanja anti-FGFR1 antitela za nesrodni, ne-FGFR1 protein iznosi manje od oko 10% vezivanja antitela za FGFR1 kao što je izmereno, npr. putem radioimunotesta (RIA). U nekim realizacijama, antitelo koje se vezuje za FGFR1 ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10–8 M ili manje, npr. od 10–8 M do 10–13 M, npr. od 10–9 M do 10–13 M).
Termin "antitelo" ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.
"Fragment antitela" ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
Termin "himerno" antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste
"Klasa" antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu biti dalje podeljene na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, β, ε, γ, odnosno μ.
"Efektorske funkcije" ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelozavisnu ćelijski-posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
"Efikasna količina" agensa, npr, farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je efikasna, u potrebnim dozama i vremenskim periodima, za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Termin “Fc region” ovde je upotrebljen da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednoj realizaciji, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226 ili od Pro230 do karboksilnog kraja teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može ili ne mora biti prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekvence proteina od interesa za imunologiju), 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.1991.
"Okvir" ili "FR" odnosi se na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. U skladu sa tim, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Termini "antitelo pune dužine", "netaknuto antitelo" i "kompletno antitelo" ovde se koriste naizmenično da bi se ukazalo na antitelo koje ima strukturu u suštini sličnu nativnoj strukturi antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
Termini "ćelija domaćin", "linija ćelija domaćina" i "kultura ćelija domaćina" koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju "transformante" i "transformisane ćelije", koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.
"Humano antitelo" je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili je dobijeno iz ne-humanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži nehumane antigen-vezujuće ostatke.
"Okvir humanog konsenzusa" je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL il VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. U jednoj realizaciji, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat et al., gore. U jednoj realizaciji, za VH, podgrupa je podgrupa HI kao u Kabat et al., gore.
"Humanizovano" antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U jednoj realizaciji, humanizovano antitelo će da sadrži u suštini sve ili barem jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima iz ne-humanog antitela, a svi ili suštinski svi FR odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. "Humanizovani oblik" antitela, npr. ne-humanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Termin "hipervarijabilni region" ili "HVR" kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje ("hipervarijabilne petlje"). Generalno, nativna četvorolančana antitela uključuju šest HVR-a, tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). HVR-ovi generalno uključuju ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili "regiona koji određuju komplementarnost" (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri hipervarijabilnih petlji dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987).) Primeri CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 24-34 na L1, 50-56 na L2, 89-97 na L3, 31-35B na H1, 50-65 na H2 i 95-102 na H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR-ovi generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. CDR-ovi takođe sadrže "ostatke koji određuju specifičnost", ili "SDR", koji su ostaci koji stupaju u kontakt sa antigenom. SDR-ovi se nalaze u okviru regiona CDR-ova koji se nazivaju skraćeni-CDR, ili a-CDR. Primeri a-CDR-ova (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 kod L1, 50-55 kod L2, 89-96 kod L3, 31-35B kod H1, 50-58 kod H2 i 95-102 kod H3. (Pogledajte Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su nabrojani prema radu Kabat et al, gore.
"Imunokonjugat" je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterologih molekula.
"Pojedinac" ili "ispitanik" je sisar. Sisari ukjlučuju, ali nisu ograničeni na domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U nekim realizacijama, pojedinac ili ispitanik je čovek.
"Izolovano" antitelo je ono koje je odvojeno od komponenata svog prirodnog okruženja. U nekim realizacijama, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99%, kao što je određeno, na primer, elektroforezom (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografijom (npr. jonoizmenjivačka, ili reversno fazna HPLC). Za pregled postupaka za određivanje čistoće antitela pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
"Izolovana" nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
"Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-FGFR1 antitelo" ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćina.
Termin “monoklonsko antitelo”, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo, dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Kao suprotnost preparatima poliklonskih antitela, koji obično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno prema jednoj determinanti na antigenu. Tako, oznaka “monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi se trebala tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupak displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
"Nativna antitela" ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovih konstantnih domena.
Termin "uputstvo u pakovanju" koristi se da ukaže na uputstvo koje se uobičajeno stavlja u komercijalna pakovanja terapeutskih proizvoda, i koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, načinu primene, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima vezanim za takav terapeutski proizvod.
"Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina" u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti sekvence aminokiselina može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD-a), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan kod Genentech, Inc., South San Francisco, California, ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti sekvence aminokiseline date sekvence aminokiseline A sa datom sekvencom aminokiseline B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence aminokiseline prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Termin "farmaceutska formulacija" odnosi se na preparat, koji je u takvom obliku da omogućuje da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome bi se formulacija primenjivala.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" upućuje na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Termin "Receptor 1 faktora rasta fibroblasta ili FGFR1", kao što se ovde koristi, ukazuje na svaki nativni FGFR1 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodare (npr. miševe i pacove) ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen, "kompletne dužine" FGFR1, kao i svaki oblik FGFR1 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante FGFR1, npr. splajsovane ili alelne varijante. Primer aminokiselinske sekvence humanog FGFR1b, odnosno FGFR2b, prikazan je u nastavku:
NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEF
KPDHRIGGYKYRYATWSHMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPIL QAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKHSGI NSSDAEVLTLFNVTEAQSGEYVCKVSNYIGEANQSAWLTVTRPVAKALEERPAVMTS
(ID BR. SEKV: 1); i
NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEF
KPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPIL QAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGV NTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTS (ID BR. SEKV: 5).
Kao što je ovde korišćen, termin "lečenje" (i njegove gramatičke varijacije, kao "lečen" i "lečiti") ukazuje na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok pojedinca koji je lečen, i može se izvoditi ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali nisu ograničeni na sprečavanje nastupanja ili vraćanja bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kojih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, smanjenje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili smirivanje stanja bolesti i poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, antitela iz pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin "varijabilni region" ili "varijabilni domen" ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koje je uključeno u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH, odnosno VL) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Pogledajte npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., str. 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VH, odnosno VL domena. (Pogledajte npr. Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Termin "vektor", kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao "ekspresioni vektori".
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
U jednom aspektu, pronalazak se delimično zasniva na otkriću anti-FGFR1 agonističkih antitela i terapeutskoj aktivnosti takvih antitela. Antitela iz pronalaska su korisna, npr. za lečenje metaboličkih bolesti, uključujući dijabetes.
A. Primeri za anti-FGFR1 antitela
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za FGFR1. U nekim realizacijama, anti-FGFR1 antitelo se vezuje za FGFR1b i/ili FGFR1c i deluje kao agonist FGFR1 aktivnosti.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-FGFR1 antitelo koje sadrži šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 26; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 25; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 17, ID BR. SEKV: 18 ili ID BR. SEKV: 20; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 21; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 22; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 23.
U nekim realizacijama, anti-FGFR1 antitelo može biti kompletno humano, humanizovano ili ne-humano. U jednoj realizaciji, anti-FGFR1 antitelo sadrži HVR-ove kao u svakom od prethodnih realizacija, i dalje sadrži akceptorski humani okvir, npr. okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa.
U drugom aspektu, anti-FGFR1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) ID BR. SEKV: 2, 3 ili 4 kao što sledi: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTWISWVPGKGLEWVGEIDPYDGDTYYA DSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCASSGYGGSDYAMDYWGQ (ID BR. SEKV: 2), EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNNYIHWVPGKGLEWVADIYPNDGDTDYA DSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCAREHFDAWVHYYVMDYWGQ (ID BR. SEKV: 3), i EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNWISWVPGKGLEWVAEIDPYDGATDY ADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCATGTDVMDYWGQ (ID BR. SEKV: 4). Opciono, anti-FGFR1 antitelo sadrži VH sekvencu u ID BR. SEKV: 2, 3 ili 4, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence.
U drugom aspektu, dato je anti-FGFR1 antitelo, naznačeno time što antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 6 kao u nastavku:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLY SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR (ID BR. SEKV: 6). Opciono, anti-FGFR1 antitelo sadrži VL sekvencu u ID BR. SEKV: 6, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence.
U drugom aspektu, dato je anti-FGFR1 antitelo, naznačeno time što antitelo sadrži VH kao u svim gore navedenim realizacijama, i VL kao u svim gore navedenim realizacijama. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži VH i VL sekvence u ID BR. SEKV: 2, 3 ili 4, odnosno ID BR. SEKV: 6, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci.
U daljem aspektu pronalaska, anti-FGFR1 antitelo prema bilo kom od gornjih realizacija je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednoj realizaciji, anti-FGFR1 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2 fragment. U drugoj realizaciji, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto IgG1 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela kao što je ovde definisano.
U daljem aspektu, anti-FGFR1 antitelo prema bilo kom od gornjih realizacija može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-7 u nastavku:
1. Afinitet antitela
U nekim realizacijama, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10-8 M ili manje, npr. od 10-8 M do 10-13 M, npr. od 10-9 M do 10-13 M).
U jednoj realizaciji, Kd se meri putem testa za vezivanje radioaktivno obeleženog antigena (RIA) koji se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovim antigenom, kao što je opisano u narednom testu. Afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigene određen je uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (125I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (pogledajte npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)). Da bi se utvrdili uslovi za test, MICROTITER® ploče sa bunarima (Thermo Scientific) su preko noći prevučene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6) i nakon toga su blokirane 2% (w/v) albuminom goveđeg seruma u PBS-u tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23°C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [125I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u radu Presta et al., Cancer Res.
57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab se onda inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr. jedan sat). Rastvor se zatim ukloni i ploča se ispere osam puta 0,1% polisorbatom 20 (TWEEN-20®) u PBS-u. Kada se ploče osuše, doda se 150 μl po bunaru fluorescentnog agensa (MICROSCINT-20™; Packard), i ploče se prebroje na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom 10 minuta. Koncentracije svakog Fab koje daje maksimalno vezivanje manje ili jednako 20% izabrane su za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.
Prema drugoj realizaciji, Kd se određuje testom površinske plazmonske rezonance pomoću BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa čipovima imobilisanog antigena CM5 na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorski čipovi od karboksimetilovanog dekstrana (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu proizvođača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/minutu da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neproreagovale grupe. Za kinetička merenja, dve serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) su injektovane u PBS-u sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) su izračunate pomoću jednostavnog jedan-na jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) istovremenim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) je izračunata kao odnos koff/kon. Pogledajte, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 106 M-1 s-1 prema gore opisanom testu plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili serija 8000 SLM-AMINCO™ spektrofotometra (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.
2. Fragmenti antitela
Kod pojedinih realizacija, ovde dato antitelo je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore izd., (Springer-Verlag, New York), str. 269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.
5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2 fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.
5,869,046.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.
9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u članku Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim realizacijama, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent No. 6,248,516 B1).
Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim realizacijama, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u U.S. Patentu br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži ne-humani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili ne-humanog primata, kao što je majmun) i humanog konstantnog regiona. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo "sa zamenjenom klasom", kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U nekim realizacijama, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, ne-humano antitelo je humanizovano da smanji imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog ne-humanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim realizacijama, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima ne-humanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovo dobijanje dali su, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr. u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (opisuje SDR (a-CDR) kalemljenje); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (opisuje “površinske promene"); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (opisuje “mešanje FR"); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisuje pristup “vođene selekcije” kod mešanja FR).
Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: okvirne regione izabrane postupkom "najboljeg slaganja" (pogledajte, npr. Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); okvirne regione dobijene od sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (pogledajte, npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili okvirne regione humanog embriona (pogledajte, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione dobijene pregledanjem FR biblioteka (pogledajte, npr. Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Humana antitela
U pojedinim realizacijama, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su generalno opisana u: van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Humana antitela mogu se dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigen. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su generalno inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. Patent br.6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologiju; U.S. Patent br. 5,770,429 koji opisuje HuMab® tehnologiju; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju, i U.S. Patent Application Publication br. US 2007/0061900, koja opisuje VelociMouse® tehnologiju). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koja stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela mogu se takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Pogledajte, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela i njihova primena), str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije takođe su opisali Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (Trioma tehnologija) je takođe opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela dobijena iz biblioteke
Antitela iz pronalaska mogu da se izoluju pregledanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka displeja faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka daju, npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., izd., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a dalje su opisane, npr. u McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, izd., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, ili kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata, ili kao Fab fragmenata. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br.5,750,373, i US Patent Publication br.2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
U pojedinim realizacijama, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. U pojedinim realizacijama, jedna od specifičnosti vezivanja je za FGFR1 a druga je za bilo koji drugi antigen, npr. beta-Kloto. U pojedinim realizacijama, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa FGFR1. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za proizvodnju multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (pogledajte Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), i inženjerstvo “dugme u rupici” (pogledajte, npr. U.S. Patent br. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju dizajniranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); ukrštanja dva ili više antitela ili fragmenata (pogledajte, npr. US Patent br.
4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); korišćenjem leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (pogledajte, npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); korišćenje tehnologije "dijatela" za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (pogledajte, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenje jednolančanih Fv (sFv) dimera (pogledajte, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i dobijanje trispecifičnih antitela kako opisuju, npr. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući "antitela hobotnice", ovde su takođe obuhvaćena (pogledajte, npr. US 2006/0025576A1).
Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje "dvojno delujući FAb" ili "DAF", koji sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za FGFR1, kao i za drugi, različit antigen, npr. klotoBeta (pogledajte US 2008/0069820, na primer).
7. Varijante antitela
U pojedinim realizacijama, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanja iz, i/ili ubacivanja u, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija uklanjanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen-vezujuće.
a) Varijante supstitucije, ubacivanja i uklanjanja
U pojedinim realizacijama, date su varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom "konzervativne supstitucije". Veće izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom "primeri supstitucija", i kako su dalje opisani ispod u odnosu na klase bočnih nizova aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvod pregledan na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA 1:
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog niza:
(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom. Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati znatno zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutiran, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na "vrućim tačkama" HVR, tj. na ostacima koje kodiraju kodoni koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (pogledajte, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili SDR-a (a-CDR), pri čemu se rezultujuća varijanta VH ili VL ispituje na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka su opisali, npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., izd., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim realizacijama afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr.4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom ciljane mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često cilj CDR-H3 i CDR-L3.
U pojedinim realizacijama, supstitucije, ubacivanja ili uklanjanja mogu se desiti u jednom ili više HVR-ova, dokle god takve izmene znatno ne smanje sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne smanjuju afinitet vezivanja mogu se načiniti u HVR-ima. Takve izmene mogu biti izvan HVR "vrućih tačaka" ili SDR-ova. U pojedinim realizacijama varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisan postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove "ciljana mutageneza sa alaninom", i opisali su je Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja unutar sekvence jednog ostatka amino kiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih ubacivanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C- krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
b) Varijante glikozilacije
U pojedinim realizacijama, ovde dato antitelo je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen do koga je antitelo glikozilovano. Adicija ili uklanjanje mesta glikozilacije antitela može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.
Kada antitelo uključuje Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Pogledajte npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharidi mogu da uključuju različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u "osnovi" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim realizacijama, modifikacije oligosaharida u antitelu iz pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim osobinama.
U jednoj realizaciji, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Pogledajte, npr. US Patent Publication br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za "defukozilovane" ili "sa manjkom fukoze" varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl br. US 2003/0157108 A1, Prsta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., naročito primer 11), i nokaut ćelijskih linija, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (pogledajte, npr. Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO 2003/085107).
Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektiran pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent br.
6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Varijante antitela sa barem jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region su takođe date. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Varijante Fc regiona
U pojedinim realizacijama, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region ovde datog antitela, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.
U pojedinim realizacijama, pronalazak razmatra varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što je komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti radi potvrđivanja smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelu nedostaje FcγR vezivanje (stoga mu verovatno nedostaje ADCC aktivnost), ali zadržava FcRn sposobnost vezivanja. Primarne ćelije za posredovanje kod ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. FcR ekspresija na hematopoetskim ćelijama sažeta je u Tabeli 3 na strani 464, Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br. 5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); U.S. Patentu br. 5,821,337 (pogledajte Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, za testove mogu da se koriste neradioaktivni postupci (pogledajte, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes et al. u Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998). C1q vezujući testovi mogu takođe da se izvedu da bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i stoga nema CDC aktivnost. Pogledajte, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (pogledajte, npr. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više Fc regiona ostataka 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više mesta aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvanog "DANA" Fc mutanta sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (US Patent br.7,332,581).
Pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR-ove su opisane. (Pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
U pojedinim realizacijama, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na mestima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U pojedinim realizacijama, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie et al. J. Immunol.
164: 4178-4184 (2000).
Antitela sa povećanim poluživotom i poboljšanim vezivanjem na neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).
Pogledajte takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br.
5,648,260; U.S. Patent br. 5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera varijanti Fc regiona.
d) Varijante antitela projektovane sa cisteinom
U pojedinim realizacijama, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. "tioMAb", kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjen ostacima cisteina. U naročitim realizacijama, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu.
Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je u nastavku opisano. U pojedinim realizacijama, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabat numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona.
Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br. 7,521,541.
e) Derivati antitela
U pojedinim realizacijama, ovde dato antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i koji su dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na hidrosolubilne polimere. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (ili homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše
Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, i može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira, i ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, ali se ne ograničavajući na naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugoj realizaciji, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednoj realizaciji, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.
B. Rekombinantni postupci i smeše
Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i smeša, npr., kako je opisano u U.S. Patentu br. 4,816,567. U jednoj realizaciji, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovde opisano anti-FGFR1 antitelo. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećoj realizaciji obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljoj realizaciji, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednoj takvoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira amino kiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednoj realizaciji, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednoj realizaciji, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-FGFR1 antitela, naznačen time što postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju anti-FGFR1 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu selektivno da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo obuhvataju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, pogledajte, npr. U.S. Patente br.
5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (Pogledajte isto tako, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, gde je opisana ekspresija fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije "humanizovani", što dovodi do proizvodnje antitela sa delimičnim ili potpunim humanim glikozilacionim obrascem. Pogledajte: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), i Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
Pogodne ćelije domaćina za eksprimiranje glikozilovanog antitela, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte, npr. US Patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija sisara su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); linija bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije kao što je opisano, npr. u: Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (TM4 ćelije su opisane, npr., u: Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre Buf pacova (BRL 3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr., u: Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982); MRC5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne linije ćelija domaćina sisara uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled nekih linija ćelija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte, npr. u literaturi Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).
C. Testovi
Anti FGFR1 antitela koja su ovde data mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, antitelo iz pronalaska se ispituje na antigen vezujuću aktivnost, npr. poznatim postupcima, kao što je ELISA, vestern blot, itd.
2. Testovi aktivnosti
U jednom aspektu, dati su testovi za identifikovanje anti-FGFR1 antitela koja imaju agonističku aktivnost. Na primer, biološka aktivnost može da uključi sposobnost aktiviranja signalne transdukcije određenih puteva koji se mogu meriti, npr. određivanjem nivoa fosfo-FRS2a, fosfo-MEK, fosfo-ERK/MAPK, fosfo-STAT3 ili korišćenjem testova na bazi GAL-Elk1 luciferaze koji su ovde opisani (pogledajte takođe, npr. Wu et al. J. Biol. Chem.
5;282(40):29069-72 (2007) i Wu et al. PLoS One 18;6(3):e17868 (2011)). Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su data.
D: Imunokonjugati
Pronalazak takođe daje imunokonjugate, uključujući anti-FGFR1 antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
U jednoj realizaciji, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo vezano za jedan ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na maitansinoid (pogledajte U.S. Patent br. 5,208,020, 5,416,064 i European Patent EP 0425 235 B1); auristatin kao što su funkcionalni ostaci leka monometilauristatin DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte U.S. Patent br. 5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte U.S. Patent br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledajte Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); i U.S. Patent br. 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
U drugoj realizaciji, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, vezano za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPE i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugoj realizaciji, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, vezano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti kao što opisuju Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za vezivanje radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO 94/11026. Linker može biti "raskidivi linker" koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker sa disulfidom (Chari et al., Cancer Res.52:127-131 (1992); U.S. Patent br.5,208,020) mogu da se primene.
Imunokonjugati ADC-a koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju koji uključuju, ali nisu ograničeni na BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).
E. Postupci i smeše za dijagnostiku i detektovanje
U pojedinim realizacijama, svako od anti-FGFR1 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje FGFR1 u biološkim uzorcima. Termin "detekcija" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu i kvalitativnu detekciju. U pojedinim realizacijama, biološki uzorak obuhvata ćeliju ili tkivo, kao što je braon adipozno tkivo, tkivo pankreasa, tkivo jetre, belo adipozno tkivo i tumorsko tkivo.
U jednoj realizaciji, dato je anti-FGFR1 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U daljem aspektu, dat je postupak za detekciju prisustva FGFR1 u biološkom uzorku. U pojedinim realizacijama, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-FGFR1 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-FGFR1 antitela sa FGFR1, i detektovanje da li je nastao kompleks između anti-FGFR1 antitela i FGFR1. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednoj realizaciji, anti-FGFR1 antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-FGFR1 antitelom, npr. kada je FGFR1 biomarker za izbor pacijenata.
U pojedinim realizacijama, data su obeležena anti-FGFR1 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili grupe koje se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i grupe, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope 32P, 14C, 1251, 3H i 131I, fluorofore kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.
F. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije anti-FGFR1 antitela kako su ovde opisane pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u formi liofilizovanih formulacija ili tečnih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što su fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-crezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG).
Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisuje US Patent Publication br.2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela su opisani u US Patentu br.6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO 2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacije ovde mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dodatno obezbedi glp-1 analog, sintetički amulin, antagonist receptora glukagona (npr. anti-GCGR antitelo), ili leptin. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izd, Osol, A. izd. (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
G. Postupci lečenja i smeše
Svako od agonističkih anti-FGFR1 antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u terapeutskim postupcima.
U jednom aspektu, dato je agonističko anti-FGFR1 antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, dato je agonističko anti-FGFR1 antitelo za lečenje metaboličke bolesti. U pojedinim realizacijama, dato je agonističko anti-FGFR1 antitelo za upotrebu u postupcima lečenja. U pojedinim realizacijama, pronalazak daje agonističko anti-FGFR1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima metaboličku bolest, koja obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-FGFR1 antitela. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. analoga glp-1, sintetičkog amulina, antagonista receptora glukagona (npr. anti-GCGR antitela), ili leptina. "Pojedinac" prema svakom od gornjih realizacija je poželjno čovek.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu agonističkog anti-FGFR1 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednoj realizaciji, lek je za terapiju metaboličke bolesti. U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku lečenja metaboličke bolesti koja uključuje davanje pojedincu koji ima bolest efikasne količine leka. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano. "Pojedinac" prema svakom od gornjih realizacija može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje postupak za lečenje metaboličke bolesti. U jednoj realizaciji, postupak uključuje davanje pojedincu koji ima takvu metaboličku bolest efikasne količine agonističkog anti-FGFR1 antitela. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je dole opisano. "Pojedinac" prema svakom od gornjih realizacija može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje obuhvataju bilo koje od ovde datih agonističkih anti-FGFR1 antitela, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gornjih terapeutskih postupaka. U jednoj realizaciji, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih agonističkih anti-FGFR1 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugoj realizaciji, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih agonističkih anti-FGFR1 antitela, i barem još jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Antitela iz pronalaska mogu se koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo iz pronalaska može biti primenjeno uz barem jedan dodatni terapeutski agens. U pojedinim realizacijama, dodatni terapeutski agens je glp-1 analog, sintetički amilin, antagonist receptora glukagona (npr. anti-GCGR antitelo), ili leptin.
Takve kombinovane terapije pomenute gore obuhvataju kombinovanu primenu (gde su uključena dva terapeutska agensa ili više njih, u istoj ili odvojenim formulacijama), i odvojenu primenu, u kojem slučaju primena antitela iz pronalaska može da bude pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno i/ili nakon njegove primene.
Antitelo iz pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili subkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim pogodnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili subkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrane različite šeme doziranja koje uključuju, ali nisu ograničene na jednu primenu ili višestruke primene u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela iz pronalaska bi bila formulisana, dozirana i primenjena na način usklađen sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju naročit poremećaj koji se leči, naročitog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke sredstva, postupak primene, raspored primene, i druge faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora, ali može opciono da bude formulisano sa jednim ili više agenasa koji se sada koriste za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvog drugog agensa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, i drugih faktora o kojima je gore bilo reči. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim putevima primene kao što je ovde opisano, ili oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i bilo kojim načinom primene koji je empirijski/klinički određen kao odgovarajući.
Za sprečavanje ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, ozbiljnosti i toka bolesti, od toga da li se antitelo primenjuje u preventivne ili u terapeutske svrhe, od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, i procene nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednom ili tokom nekoliko tretmana. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg-10 mg/kg) antitela je kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, ili, na primer, putem jedne ili više primena, ili kontinualnom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Za ponovljenu primenu tokom više dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti produženo do postizanja željenog potiskivanja simptoma bolesti. Primer doze antitela biće u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili ma koje kombinacije ovih) može da se primeni na pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti početna viša doza, za kojom sledi jedna ili više, nižih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredovanje ove terapije se lako prati klasičnim tehnikama i testovima.
H. Proizvodi
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđeni su proizvodi koji sadrže materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu gore opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor, ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u smeši je antitelo iz pronalaska. Etiketa ili uputstvo ukazuju da se smeša koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvu ambalažu koja sadrži smešu, naznačenu time što smeša sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugu ambalažu koja sadrži smešu, naznačenu time što smeša sadrži drugi citotoksični ili neki drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji pronalaska može dalje da sadrži uputstvo koje ukazuje da smeše mogu da se koriste za lečenje naročitog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
III. PRIMERI
U nastavku su dati primeri postupaka i smeša iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjene razna druge realizacije, na osnovu opisa koje su gore dati.
Primer 1. Generisanje i karakterizacija antitela anti-FGFR1 agonista.
Proizveli smo monoklonska antitela specifična za FGFR1 pomoću tehnologije displeja faga i His-markiranih IgD2-D3 humanog FGFR1b i c kao antigena. Biblioteke faga humanih antitela sa sintetičkim raznovrsnostima u izabranim komplementarno određujućim regionima (H1, H2, H3, L3), koje imitiraju prirodnu raznovrsnost repertoara humanog IgG korišćene su za selekciju. Fragmenti Fab su bivalentno izloženi na površini čestica M13 bakteriofaga (Lee et al., J. Immunol. Methods 284:119-32 (2004)). Protokol za selekciju je opisan ranije (Liang et al., J. Mol. Biol. 366:815-29 (2007)). Nakon pregledanja mnogih klonova iz više biblioteka, jedinstvena i specifična fag antitela koja se vezuju i za b i za c izooblike FGFR1 su identifikovane fag ELISA testom. Za ispitivanje vezivanja antitela za humane FGFR, korišćen je klasični ELISA protokol uz primenu 2 μg/ml FGFR1 ECD-humanih Fc himernih proteina.
Takođe smo određivali afinitete vezivanja anti-FGFR1 antitela za FGFR1, pomoću Biacore/SPR, na instrumentu BIAcore™ T100 kao što je opisano (Liang et al, kao gore), uz sledeće modifikacije. Mišje anti-humano Fc antitelo je prvo naneto na čip BIAcore™ karboksimetilovani dekstran CM5 putem direktnog vezivanja za slobodne amino grupe, prema postupku koji je opisao proizvođač. Antitelo je zatim hvatano na biosenzorskim čipovima CM5 da se dobije oko 200 jedinica odgovora (RU). Merenja vezivanja su izvršena propuštanjem pufera sastavljenog od 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% surfaktanta P20 (HBS-P pufer). Dve serije razblaženja FGFR1 ECD-His proteina injektovane su u opsegu od 1,550 nM u HBS-P puferu pri protoku od 30 μll/minutu na 25°C. Brzine asocijacije (Kon, po mol/s) i brzine disocijacije (Koff, po s) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIAcore™ Evaluation Software verzija 3.2). Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd, po mol) izračunata je kao odnos Koff / Kon.
Dva od anti-FGFR1 antitela koja su identifikovana kao što je gore opisano u nezavisnim eksperimentima (ovde označena kao R1MAb1 i R1MAb2) vezuju se za FGFR1b i FGFR1c sa sličnim afinitetom, ali se ne vezuju za druge izooblike FGFR (Sl. 1A i B). Njihova signalna aktivnost je ispitana pomoću testa luciferaze bazirane na Gal-Elk1 u L6 ćelijama pacova koje nemaju endogene FGFR, nego su transficirane da eksprimiraju svaki izooblik FGFR (i KLB, po potrebi). Ova antitela su neočekivano moćni agonisti: oba R1MAb indukovala su aktivnost luciferaze na dozno zavisan način, ali samo kada ćelije eksprimiraju rekombinantni FGFR1b ili FGFR1c, ukazujući da R1MAb deluju kao specifični agonisti za FGFR1 (Sl. 1C). U ovom formatu testa, R1MAb-i ne utiču naročito na aktivnost baznog FGF (bFGF), klasičnog FGFR1 liganda (Sl. 1D). Međutim, R1MAb-i i FGF21 pokazali su aditivni efekat kada ćelije eksprimiraju FGFR1c i KLB (Sl. 1D). F(ab’)2, ali ne i Fab fragment R1MAb2 pokazao je FGFR1-zavisnu agonističku aktivnost, ukazujući da R1MAb vrše svoju agonističku aktivnost promovisanjem homodimerizacije FGFR1 (Sl. 1E). Ranije su prijavljeni veštački FGFR dimerizujući agonisti koji sadrže FGFR1-vezujući peptid i domen c-jun leucinskog zatvarača. Ovaj molekul, nazvan C19jun, takođe se vezuje za heparin preko c-jun domena, i potreban mu je heparin za FGFR1 aktivaciju (Ballinger et al., Nature Biotechnol. 17: 1199-1204 (1999)). Nasuprot tome, heparin ne utiče na agonističku aktivnost R1MAb1 u testu luciferaze (Sl. 5).
Agonistička aktivnost R1MAb1 nezavisna od heparina dalje je potvrđena ispitivanjem fosforilacije ERK i MEK1/2, signalnih komponenti nizvodno od FGFR-ova, u uzgajanim mišjim 3T3-L1 adipocitima (Sl. 1F) ili u WAT-u C57BL/6 miševa kojima je intraperitonealno injektovan R1MAb (Sl.1G).
Izveli smo eksperimente za mapiranje FGFR1 epitopa vezanog od strane R1MAb1 i R1MAb2. Sintetisali smo 30 peptida koji su predstavljali delove FGFR1 sekvence sa biotinskim markerom na amino-kraju, i koristili smo ih za ELISA vezujuće testove. Te sekvence peptida su bile sledeće: Br. 1: SSSEEKETDNTKPNPVAPY (ID BR. SEKV: 36); Br. 2: PVAPYWTSPEKMEKKLHAV (ID BR. SEKV: 37); Br. 3: KLHAVPAAKTVKFKCPSSG (ID BR. SEKV: 38); Br. 4: CPSSGTPNPTLRWLKNGKE (ID BR. SEKV: 39); Br. 5: KNGKEFKPDHRIGGYKVRY (ID BR. SEKV: 40); Br. 6: YKVRYATWSIIMDSVVPSD (ID BR. SEKV: 41); Br. 7: VVPSDKGNYTCIVENEYGS (ID BR. SEKV: 42); Br. 8: NEYGSINHTYQLDVVERSP (ID BR. SEKV: 43); Br. 9: VERSPHRPILQAGLPANKT (ID BR. SEKV: 44); Br. 10: PANKTVALGSNVEFMCKVY (ID BR. SEKV: 45); Br. 11: MCKVYSDPQPHIQWLKHIE (ID BR. SEKV: 46); Br. 12: LKHIEVNGSKIGPDNLPYV (ID BR. SEKV: 47); Br. 13: NLPYVQILKTAGVNTTDKE (ID BR. SEKV: 48); Br. 14: TTDKEMEVLHLRNVSFEDA (ID BR. SEKV: 49); Br. 15: SFEDAGEYTCLAGNSIGLS (ID BR. SEKV: 50); Br. 16: SIGLSHHSAWLTVLEALEE (ID BR. SEKV: 51); Br. 17: YWTSPEKMEKKLHAVPAAK (ID BR. SEKV: 52); Br. 18: EKMEKKLHAVPAAKTVKFK (ID BR. SEKV: 53); Br. 19: PAAKTVKFKCPSSGTPNPT (ID BR. SEKV: 54); Br. 20: KFKCPSSGTPNPTLRWLKN (ID BR. SEKV: 55); Br. 21: GTPNPTLRWLKNGKEFKPD (ID BR. SEKV: 56); Br. 22: TLRWLKNGKEFKPDHRIGG (ID BR. SEKV: 57); Br. 23: FKPDHRIGGYKVRYATWSI (ID BR. SEKV: 58); Br. 24: HRIGGYKVRYATWSHMDS (ID BR. SEKV: 59); Br. 25: LHAVPAAKTVKFKCPSS (ID BR. SEKV: 60); Br. 26: KLHAVPAAKTVKFKCP (ID BR. SEKV: 28); Br. 27: AVPAAKTVKFKCPSSG (ID BR. SEKV: 61); Br.28: FKPDHRIGGYKVRY (ID BR. SEKV: 29); Br.29: KPDHRIGGYKVR (ID BR. SEKV: 62); Br. 30: GTPNPTLRWLKN (ID BR. SEKV: 63). Kao što je prikazano na slici 17A i za R1MAb1 i za R1MAb2, najkraći peptidi za koje su oni prikazali značajno vezivanje bili su peptidi br.26 i br.28.
Primer 2. R1MAb su pokazali produženu antidijabetičku aktivnost.
Ispitali smo da li anti FGFR1 antitela iz pronalaska imaju antidijabetičku aktivnost na modelima miševa za dijabetes. Svi miševi su nabavljeni od Jackson Laboratory i održavani su u prostorijama za životinje bez patogena, na 21°C pod standardnim režimom 12 h svetlo/12 h mrak, uz pristup hrani (standardna hrana za glodare (Labdiet 5010, 12,7% kalorija od masti), ili dijeta sa velikim sadržajem masti i velikim sadržajem ugljenih hidrata (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% kalorija od masti) i vodi ad libitum. db/db miševi sa C57BLKS/J poreklom bili su ženke, a drugi miševi su bili svi mužjaci. Svi miševi su korišćeni za injekcije sa oko 9-11 nedelja starosti, osim ap2-SREBP1c miševa koji su bili stari 8 meseci (Sl.3E) ili 4 meseca stari (Sl. 3F). Za kontinualnu infuziju FGF21 proteina, subkutano je ugrađena osmotska pumpa (Alzet® 2001). Nivoi glukoze su mereni pomoću glukometra OneTouch® Ultra®. Za analizu lipida iz jetre, lipid je ekstrahovan prema Folhovom postupku, i ponovo suspendovan u PBS-u koji sadrži 5% Triton X-100. Ukupni holesterol, trigliceridi, β-hidroksibutilat (Thermo DMA) i neesterifikovana masna kiselina (Roche) određeni su pomoću enzimskih reakcija. Nivoi insulina u serumu određeni su ELISA testom (Crystal Chem).
Ispitali smo agonističku aktivnost R1MAb-ova in vitro i in vivo, injektovanjem hiperglikemičnih db/db miševa otpornih na leptin sa 3, 10, i 50 mg/kg (mpk) R1MAb1. Primetili smo da su nivoi glukoze u krvi normalizovani za preko nedelju dana kod sve tri doze, i primećeni efekat snižavanja glukoze bio je neočekivano jak i dugotrajan, pri čemu su nivoi glukoze ostajali niži nego kod kontrolnih miševa tokom više od 30 dana nakon jedne injekcije (Sl.2A). To je bilo praćeno prolaznim, ali značajnim sniženjem telesne težine (Sl. 2A). Efekat snižavanja glukoze verovatno je posledica poboljšanja osetljivosti na insulin, jer je nivo insulina u serumu takođe dramatično snižen pomoću injekcije R1MAb1 (Sl. 2B). Primetili smo slično, pod uticajem R1MAb, sniženje nivoa glukoze u krvi sa R1MAb2 (Sl. 6), i kod tri dodatna mišja modela sa zapaženom otpornošću na insulin, ob/ob miševi sa nedostatkom leptina, miševi na dijeti bogatoj mastima (HFD) i Ins2Akita miševi (Hong et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 293:E1687-96 (2007)) (Sl. 2C i 7). Eksperimenti sa istovetno hranjenim životinjama su pokazali da je gubitak težine pod uticajem R1MAb, kod db/db i Ins2Akita miševa, posledica smanjenog unosa hrane; međutim, primećeno sniženje glukoze u krvi uglavnom ne zavisi od unosa hrane (Sl.2D i 6-7). U pankreasu, R1MAb1 injekcija je povećala insulin pozitivnu oblast po svakom ostrvcu u poređenju sa istovetno hranjenim i neistovetno hranjenim kontrolnim miševima (Sl. 2E i 8). FGFR1 je eksprimiran u β ćelijama pankreasa (Hart et al., Nature 408:864-68 (2000)) i FGF21 podstiče funkciju β ćelija ex vivo (Wente et al., Diabetes 55:2470-78 (2006)); tako aktivacija FGFR1 u β ćelijama može direktno da doprinese povećanim nivoima insulina u pankreasu. Ti podaci pokazuju da je aktivacija FGFR1 (ali ne FGFR2 ili FGFR3) dovoljna za rekapitulaciju anti-dijabetičkih i anti-lipidemičkih aktivnosti rekombinantnog FGF21.
Da bismo analizirali značaj IgG funkcionalnosti za aktivnosti R1MAb-a, koristili smo dve vrste modifikacija. Dvojna mutacija (D265A/N297A; DANA) u Fc regionu ukida vezivanje za FcyR-e i regrutovanje imunih efektorskih ćelija od strane molekula IgG (Gong et al., 2005). Uvođenje DANA mutacija nije uticalo ni na agonističku ni anti-dijabetičku aktivnost R1MAb2; stoga efektorska funkcija nema ulogu u anti-dijabetičkoj aktivnosti R1MAb2 (Sl. 9A-C). Međutim, konstruisana jednokraka (OA) verzija R1Mab1 (Atwell et al., J. Mol. Biol.270:26-35 (1997)), bez jednog od Fab fragmenata (OA-R1MAb1) (Sl. 9A i D) pokazala je smanjenu agonističku aktivnost (Sl. 9E i F) i nije uspela da snizi glukozu u krvi, telesnu težinu, i nivoe lipida u jetri i serumu db/db miševa (Sl. 9G i H), ukazujući da i agonistička i antidijabetička aktivnost R1MAb-ova zavise od bivalentnosti antitela (mada takođe ispitujemo bispecifična antitela sa samo jednim anti-FGFR1 krakom (npr. sa anti-beta-Kloto krakom) i potvrđujemo da ona zadržavaju korisne osobine bivalentnih anti-FGFR1 R1MAb-a). Ti odnosi snažno ukazuju da aktivacija pod uticajem R1MAb signalnih puteva nizvodno od FGFR1 verovatno prenosi svoje anti-dijabetičke efekte.
MAb-ovi su postali moćna terapeutska varijanta za lečenje većeg broja humanih bolesti. Naše prikazivanje moćne anti-hiperglikemijske aktivnosti i snižavanja nivoa lipida koje ima anti-FGFR1 agonističko MAb otvaraju nove mogućnosti za razvoj terapeutskih MAb-ova sa ciljanjem na FGFR1 ili kompleks receptora koji sadrži FGFR1, za lečenje dijabetesa tip 2 i drugih hroničnih poremećaja vezanih za gojaznost. Dejstvo ciljano na FGFR1, na bazi MAb-a, nudi nekoliko prednosti u odnosu na terapiju rekombinantnim FGFR1. Prvo, po svojoj prirodi, MAb-ovi obezbeđuju predvidljivu, prilagodljivu i daleko superiorniju farmakokinetiku u poređenju sa FGF21 ili bilo kojim drugim terapeutskim proteinom koji nije antitelo. Zaista, pokazali smo da jedna i.p. injekcija od 1-3 mg/kg R1MAb1 ili R1MAb2 data db/db miševima dovodi do značajno produženog poboljšanja hiperglikemije tokom više od 30 dana (Sl. 2 i 5). Takav dugotrajni glikemijski efekat nikad nije prijavljen ni za jedan prethodno opisani antidijabetički agens.
Primer 3. Značaj adipoznih tkiva u dijabetičkom delovanju R1MAb i FGF21.
Nagovešteno je da rekombinantni FGF21 poboljšava osetljivost na insulin putem adipoznih tkiva i jetre (Berglund et al., Endocrinology 150:4084-93 (2009); Li et al., FEBS Letters 583:3230-34 (2009)). Injekcija FGF21 miševima indukovala je MEK i ERK fosforilaciju u četiri vrste tkiva koja eksprimiraju KLB, jetri, belom adipoznom tkivu (WAT), braon adipoznom tkivu (BAT) i pankreasu, kao što je ranije prijavljeno (Sl.3A, gore) (Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282: 26687-95 (2007); Xu et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.297(5): E1105-14 (2009)). Nasuprot tome, injekcija R1MAb1 dovodi do fosforilacije istih nizvodnih efektora u adipoznim tkivima i pankreasu, ali ne i u jetri (Sl. 4A, dole), što je u skladu sa veoma malom ekspresijom FGFR1 mRNK u jetri (Sl. 10) (Fon Tacer et al., Mol. Endocrinol. 24(10): 2050-64 (2010)). Zaista, upoređivanje ekspresije hepatičnog gena otkrilo je da ekspresiju dva prethodno identifikovana gena sa ciljanim FGF21 (leptinski receptor (LepR) i supresor 2 citokinske signalizacije (SOCS2); Coskun et al., Endocrinology 149:6018-27 (2008), Inagaki et al., Cell Metabolism 8:77-83 (2008)) indukuje FGF21, ali ne i R1MAb1 (Sl. 15). Sa druge strane, hepatična ekspresija poznatih gena koje reguliše insulin (acetil-CoA karboksilaza 1 (ACC1), sintaza masnih kiselina (FAS), elongaza 6 iz porodice masnih kiselina dugog niza (Elovl6), vezujući protein za faktor rasta sličan insulinu (IGF) (IGFBP)-1, fosfoenolpiruvat karboksikinaza (PEPCK)) na sličan način je izmenjena od strane i FGF21 i R1MAb1, što ukazuje da ti geni mogu biti indirektno regulisani putem hormonskih (npr. insulin) ili metaboličkih promena. R1MAb1 je upadljivo snizio lipide u jetri i serumu kada je injektovan u db/db miševe 7. dana nakon jedne injekcije, pretpostavlja se usled preraspodele lipida u adipoznim tkivima (Sl.3B-D). Injekcija R1MAb1 nije indukovala fosforilaciju MEK ili ERK u plućima i prostati (Sl. 3A), dve vrste tkiva sklonih kanceru koja eksprimiraju FGFR1. Ova zapažanja zajedno sugerišu da adipozna tkiva, ali ne i jetra, predstavljaju centar uobičajene metaboličke aktivnosti R1MAb i FGF21.
Da bismo ovo dalje istražili, koristili smo lipoatrofične ap2-srebp1c transgene miševe, koji pokazuju ozbiljnu rezistenciju na insulin, nedostatak leptina i hepatomegaliju, usled nedostatka belih adipoznih tkiva i oštećene funkcije braon adipoznog tkiva (Sl. 3E, 11) (Shimomura et al., Genes Dev.12:3182-94 (1998); Shimomura et al., Nature 401:73-76 (1999)). U skladu sa idejom da je normalna funkcija adipoznog tkiva potrebna za metaboličku aktivnost R1MAb1, jedna i.p. injekcija od 1 mg/kg poboljšala je HOMA-IR i toleranciju na glukozu samo kod kontrolnih ob/ob miševa, ali ne i kod ap2-srebplc miševa (Sl. 3E). Unos hrane je smanjen R1MAb1 injekcijom i kod ob/ob miševa i kod ap2-srebplc transgenih miševa, u poređenju sa istovetno hranjenim miševima kojima je injektovan kontrolni IgG (Sl. 3E). Pored toga, kontinualna infuzija rekombinantnog FGF21 takođe nije uspela da poboljša toleranciju na insulin kod ap2-srebplc miševa, mada je primećen znatan porast β-hidroksibutirata u serumu (tj. ketonsko telo) i smanjenje holesterola (Sl.3F).
Primer 4. PGC1-alfa aktivacija u braon adipozi od strane R1MAb.
Nedavno je nagovešteno da FGF21 aktivira transkripcioni koaktivator nuklearnog receptora PGC-1α protein u adipoznim tkivima i jetri da indukuje ekspresiju nizvodnih gena poveznih sa oksidativnim metabolizmom (Chau et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 107:12553-58 (2010); Hondares et al., Cell Metabolism 11:206-12 (2010); Potthoff et al. Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 30;106(26): 10853-8 (2009)). Zaista, kada se injektuje u ob/ob miševe, R1MAb1 značajno povećava BAT ekspresiju gena uključenih u OXPHOS i metabolizam masnih kiselina, kako pokazuje analiza DNK mikročipa, praćena analizom funkcionalnog obogaćenja (Sl. 4A). R1MAb1 (i FGF21) takođe su povećali ekspresiju PGC-1α, PGC-1β, i njihovih glavnih ciljeva CIDEA i UCP1 u braon adipoznim tkivima (mereno pomoću qPCR; Sl.4B i 16).
Transkripcija PGC-1α se reguliše putem cAMP elemenata odgovora (CRE) u promoterskom regionu i CREB transkripcionog faktora koji se vezuje za CRE-e (Herzig et al., Nature 413:179-83 (2001); Karamitri et al., J. Biol. Chem. 284:20738-52 (2009); Muraoka et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E1430-39 (2009); Shi et al., J. Biol. Chem. (2005)). Prilikom pregledanja radi identifikacije transkripcionih faktora vezanih za metabolizam koje može da aktivira FGF21 u HEK293 ćelijama koje eksprimiraju KLB, našli smo da GAL-CREB fuzioni protein može da bude aktiviran od strane FGF21 (Sl. S8A-B). Zatim smo našli da i FGF21 i R1MAb1 mogu da aktiviraju GAL-CREB reporter, kao i reporter CRE-luciferaze na dozno zavisan način u HEK293 ćelijama (Sl.4C). U skladu sa idejom da CREB funkcioniše kao nizvodni efektor, FGF21 je povećao fosforilaciju CREB i p90RSK, uzvodne CREB kinaze koju reguliše ERK, u belim adipoznim tkivima miša (Sl. 4D), diferenciranim humanim primarnim adipocitima (Sl. 4E) i HEK293 ćelijama (Sl. 12C). Tako, CREB aktivacija od strane FGF21 i R1MAb verovatno doprinosi indukciji PGC-1alfa i grupe nizvodnih gena koji učestvuju u oksidativnom metabolizmu u adipoznim tkivima (Sl. 4F i 12D). Pored transkripcione regulacije koja je ovde predložena, prijavljeno je da FGF21 post-translaciono aktivira PGC-1α putem aktivacije AMPK (Chau et al., iznad), mada nismo uspeli da nađemo dokaz da R1MAb aktivira AMPK in vitro ili in vivo (podaci nisu prikazani). Ukupno, naši rezultati podržavaju ulogu PGC-1α u adipoznim tkivima u prenošenju anti-lipidnih i anti-dijabetičkih efekata FGF21 i R1MAb.
Primer 5. Ispitivanje bispecifičnih anti-FGFR1/anti-beta-Kloto antitela
Druga bitna razlika između naših R1MAb-ova i FGF21 je specifičnost ciljnog receptora. FGF21 može da deluje na FGFR1c, 2c i 3c, ali su njegovi efekti verovatno ograničeni na tkiva koja eksprimiraju KLB (tj. jetru, adipozu i pankreas) (Fon Tacer et al., kao gore, Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282:26687-95 (2007); Ogawaet al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 104:7432-37 (2007)). Nasuprot tome, ciljna tkiva naših R1MAb-ova su određena ekspresijom FGFR1 i distribucijom u tkivu molekula antitela, ali verovatno nisu ograničena ekspresijom KLB. Zaista, primetili smo blagu hipofosfatemiju kod miševa lečenih sa R1MAb1, što ukazuje na aktivaciju FGF23/Kloto puta u bubregu. U skladu sa tim, stvorili smo bispecifična anti-KLB/FGFR1 bispecifična antitela pomoću displeja faga ili tehnologije hibridoma (BALBc miševi imunizovani HEK293 ćelijama koje eksprimiraju FGFR1c i KLB) kako bi generisali odvojena anti-KLB antitela i tehnologije dugme u rupici (Merchant et al. Nature Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)). Ispitali smo sposobnost tih biospecifičnih antitela da aktiviraju GAL-Elk1 ekspresiju i potvrdili da ta antitela zavise od prisustva i beta-Kloto i FGFR1 za nizvodnu signalnu aktivaciju. Takođe smo potvrdili da jedno od antitela može da poveća fosforilaciju nizvodnih signalnih intermedijera, MEK i ERK 1⁄2 u diferenciranim primarnim humanim adipocitima. Jedno od bispecifičnih antitela unakrsno reaguje sa mišjim proteinima i mi smo upotrebili to antitelo da ispitamo in vivo aktivnost bispecifičnog antitela. Primetili smo da je ovo bispecifično antitelo snizilo nivoe glukoze u krvi bez povećanja FGF23 u serumu, dok je odgovarajuće kontrolno anti-FGFR1 (monospecifično) antitelo snizilo nivoe glukoze u krvi u sličnom obimu, ali je značajno povećalo nivoe FGF23 u serumu.
Nadalje smo ispitali sposobnost tih bispecifičnih antitela da obezbede metaboličke prednosti anti-FGFR1 agonističkih antitela. Generisali smo transgene miševe koji eksprimiraju humani beta-Kloto (i R1MAb1 i R1MAb2 prepoznaju mišji FGFR1) i potvrdili da gore opisana anti-KLB/FGFR1 bispecifična antitela poboljšavaju toleranciju na glukozu na modelima miševa, npr. hKLB transgenih miševa na dijeti bogatoj mastima. Takođe smo napravili anti-beta-Kloto antitela koja reaguju sa proteinom u drugim životinjskim modelima (npr. pacov, zec, makaki i rezus majmuni) i na sličan način ispitali sposobnost bispecifičnih antitela konstruisanih sa tim, i sa anti-FGFR1 antitelima, da bi se obezbedile metaboličke prednosti.

Claims (23)

Patentni zahtevi
1. Agonističko antitelo protiv receptora 1 fibroblastnog faktora rasta (FGFR1) koje se vezuje za peptid br. 26 KLHAVPAAKTVKFKCP (ID BR SEKV: 28) ili peptid br. 28 FKPDHRIGGYKVRY (ID BR SEKV: 29).
2. Antitelo iz patentnog zahteva 1, naznačeno time, što antitelo nije agonist FGFR2 ili FGFR3.
3. Antitelo iz patentnih zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što je antitelo monoklonsko antitelo.
4. Antitelo iz patentnih zahteva 1-3, naznačeno, time što je antitelo humano, humanizovano ili himerno antitelo.
5. Antitelo iz patentnih zahteva 1-4, naznačeno time, što je to IgG1 antitelo.
6. Antitelo iz patentnih zahteva 1-5, naznačeno time, što antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu GFTFX1X2X3X4IX5, naznačeno time, što je to: X1 je S ili T, X2 je N ili S, X3 je N ili T, X4 je W ili Y, X5 je H ili S (ID BR. SEKV: 26), (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži X1X2IX3PX4DGX5TX6YADSVKG, naznačeno time, što je to: X1 je A ili G, X2 je D ili E, X3 je D ili Y, X4 je N ili Y, X5 je A ili D, i X6 je D ili Y (ID BR. SEKV: 24) i X1IX2PX3DGX4TX5YADSVKG, naznačeno time, što je to: X1 je D ili E, X2 je D ili Y, X3 je N ili Y, X4 je A ili D, i X5 je D ili Y (ID BR. SEKV: 25), (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži SSGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 16), SGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 17), EHFDAWVHYYVMDY (ID BR. SEKV: 18), TGTDVMDY (ID BR. SEKV: 19), i GTDVMDY (ID BR. SEKV: 20) (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQDVSTAVA (ID BR. SEKV: 21), (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SASFLYS (ID BR. SEKV: 22); i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu QQSYTTPPT (ID BR. SEKV: 23).
7. Antitelo iz patentnog zahteva 6, naznačeno time, što antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu GFTFTSTWIS (ID BR. SEKV: 7), (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine GEIDPYDGDTYYADSVKG (ID BR. SEKV: 10) i EIDPYDGDTYYADSVKG (ID BR. SEKV: 11), i (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži SSGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 16) i SGYGGSDYAMDY (ID BR. SEKV: 17).
8. Antitelo iz patentnog zahteva 6, naznačeno time, što antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu GFTFSNNYIH (ID BR. SEKV: 8), (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži ADIYPNDGDTDYADSVKG (ID BR. SEKV: 12) i DIYPNDGDTDYADSVKG (ID BR. SEKV: 13), i (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu EHFDAWVHYYVMDY (ID BR. SEKV: 18).
9. Antitelo iz patentnog zahteva 6, naznačeno time, što antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu GFTFTSNWIS (ID BR. SEKV: 9), (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži AEIDPYDGATDYADSVKG (ID BR. SEKV: 14) i EIDPYDGATDYADSVKG (ID BR. SEKV: 15), i (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži TGTDVMDY (ID BR. SEKV: 19) i GTDVMDY (ID BR. SEKV: 20).
10. Antitelo iz patentnog zahteva 6, naznačeno time, što obuhvata VH sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 2, 3 i 4; i VL sekvencu ID BR. SEKV: 6.
11. Antitelo iz patentnih zahteva 1-10, naznačeno time, što se anti-FGFR1 antitelo vezuje i za FGFR1b i za FGFR1c.
12. Antitelo iz patentnih zahteva 1-11, naznačeno time, što antitelo je multispecifično antitelo.
13. Antitelo iz patentnih zahteva 1-12, naznačeno time, što antitelo je bispecifično antitelo.
14. Antitelo iz patentnog zahteva 13, naznačeno time, što se antitelo takođe vezuje za beta-Kloto.
15. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo iz patentnih zahteva 1-14.
16. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 15.
17. Postupak za proizvodnju antitela, koje obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 16, tako da se dobija antitelo.
18. Postupak iz patentnog zahteva 17, koja dalje uključuje izolovanje antitela iz ćelije domaćina.
19. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo iz patentnih zahteva 1-14, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
20. Antitelo iz patentnih zahteva 1-14, za upotrebu kao lek.
21. Antitelo iz patentnih zahteva 1-14, pri čemu se antitelo primenjuje sa drugim agensom za lečenje dijabetesa, pod uslovom da drugi agens nije insulin.
22. Antitelo iz patentnih zahteva 1-14, pri čemu se antitelo primenjuje sa agensom za lečenje kardiovaskularne bolesti.
23. Agonističko antitelo FGFR1 iz patentnih zahteva 1-14 za upotrebu u lečenju metaboličke bolesti ili stanja kod pojedinca, uljučuje davanje pojedincu efikasne količine pomenutog agonističkog antitela, pri čemu metabolička bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od: policističnog sindroma jajnika (PCOS), metaboličkog sindroma (MetS), gojaznosti, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), hiperlipidemije, hipertenzije, dijabetesa tip 2, ne-tip 2 dijabetesa, dijabetesa tip 1, latentnog autoimunog dijabetesa (LAD) i adultnog tipa dijabetesa kod mladih osoba (MODY), pri čemu što FGRF1 agonističko antitelo ne aktivira FGFR2 ili FGFR3.
RS20170598A 2011-05-16 2012-05-15 Fgfr1 agonisti i načini primene RS56090B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161486731P 2011-05-16 2011-05-16
US201161536936P 2011-09-20 2011-09-20
EP12722058.0A EP2710035B1 (en) 2011-05-16 2012-05-15 Fgfr1 agonists and methods of use
PCT/US2012/037964 WO2012158704A1 (en) 2011-05-16 2012-05-15 Fgfr1 agonists and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56090B1 true RS56090B1 (sr) 2017-10-31

Family

ID=46124784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170598A RS56090B1 (sr) 2011-05-16 2012-05-15 Fgfr1 agonisti i načini primene

Country Status (33)

Country Link
US (6) US9085626B2 (sr)
EP (2) EP2710035B1 (sr)
JP (2) JP5836481B2 (sr)
KR (1) KR101623246B1 (sr)
CN (1) CN103596980B (sr)
AR (1) AR090017A1 (sr)
AU (1) AU2012255881C1 (sr)
BR (1) BR112013026266A2 (sr)
CA (1) CA2834879C (sr)
CL (1) CL2013003296A1 (sr)
CO (1) CO6781536A2 (sr)
CR (1) CR20130587A (sr)
CY (1) CY1119098T1 (sr)
DK (1) DK2710035T3 (sr)
EA (1) EA030462B1 (sr)
EC (1) ECSP13013022A (sr)
ES (1) ES2628385T3 (sr)
HR (1) HRP20170815T1 (sr)
HU (1) HUE033584T2 (sr)
IL (1) IL228740A (sr)
LT (1) LT2710035T (sr)
MX (3) MX339662B (sr)
MY (1) MY175338A (sr)
PE (1) PE20140995A1 (sr)
PH (1) PH12013502294A1 (sr)
PL (1) PL2710035T3 (sr)
PT (1) PT2710035T (sr)
RS (1) RS56090B1 (sr)
SG (1) SG194917A1 (sr)
SI (1) SI2710035T1 (sr)
TW (1) TWI547500B (sr)
WO (1) WO2012158704A1 (sr)
ZA (1) ZA201307364B (sr)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012088266A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Incyte Corporation Substituted imidazopyridazines and benzimidazoles as inhibitors of fgfr3
KR101623246B1 (ko) 2011-05-16 2016-05-20 제넨테크, 인크. Fgfr1 효능제 및 사용 방법
US9574002B2 (en) * 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
WO2013006486A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
LT3495367T (lt) 2012-06-13 2021-02-25 Incyte Holdings Corporation Pakeistieji tricikliniai junginiai, kaip fgfr inhibitoriai
WO2014026125A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Incyte Corporation Pyrazine derivatives as fgfr inhibitors
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
WO2014085365A2 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9266892B2 (en) 2012-12-19 2016-02-23 Incyte Holdings Corporation Fused pyrazoles as FGFR inhibitors
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
IL292303A (en) 2012-12-27 2022-06-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Methods for modulating bile acid homeostatsis and treatment of bile acid disorders and disease
KR101874501B1 (ko) * 2013-03-15 2018-07-05 익스프레션 패톨로지, 인크. 암 요법을 지시하는 srm 검정
LT2986610T (lt) 2013-04-19 2018-04-10 Incyte Holdings Corporation Bicikliniai heterociklai, kaip fgfr inhibitoriai
SG11201602870YA (en) 2013-10-28 2016-05-30 Ngm Biopharmaceuticals Inc Cancer models and associated methods
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
PL3097122T3 (pl) 2014-01-24 2020-10-19 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Przeciwciała wiążące domenę 2 beta klotho oraz sposoby ich stosowania
WO2015148708A1 (en) * 2014-03-25 2015-10-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fgf21 receptor agonists and uses thereof
WO2015183890A2 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US10851105B2 (en) 2014-10-22 2020-12-01 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
WO2016065106A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising peptide variants and methods of use thereof
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
WO2016134294A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr4 inhibitors
SG11201706287PA (en) 2015-02-20 2017-09-28 Incyte Corp Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
EP3070103A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-21 Institut Hospitalier Universitaire De Strasbourg Anti-Claudin 1 monoclonal antibodies for the prevention and treatment of hepatocellular carcinoma
US10800843B2 (en) 2015-07-29 2020-10-13 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Beta klotho-binding proteins
WO2017021893A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Novartis Ag Methods of treating fgf21-associated disorders
WO2017053842A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Genentech, Inc. Methods for the treatment of epilepsy
CN108602884B (zh) 2015-11-08 2024-06-25 豪夫迈·罗氏有限公司 筛选多特异性抗体的方法
AU2016353988B2 (en) 2015-11-09 2019-09-26 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
CN105273063B (zh) * 2015-11-30 2018-06-12 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 调节fgfr1活性的多肽及其应用
CN108602890A (zh) 2015-12-11 2018-09-28 瑞泽恩制药公司 用于减少或预防对egfr和/或erbb3阻滞剂具有抗性的肿瘤生长的方法
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
WO2018032638A1 (zh) 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
WO2018039557A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
US10759850B2 (en) 2016-11-01 2020-09-01 Berg Llc Filamin A binding proteins and uses thereof
WO2018095932A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Merck Patent Gmbh Monoclonal antibody directed to fgfr1
EP3580237B1 (en) * 2017-02-08 2025-05-14 Novartis AG Fgf21 mimetic antibodies and uses thereof
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
ES3061844T3 (en) 2018-05-04 2026-04-07 Incyte Corp Salts of an fgfr inhibitor
MX2020011718A (es) 2018-05-04 2021-02-15 Incyte Corp Formas solidas de un inhibidor de receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (fgfr) y procesos para prepararlas.
US11628162B2 (en) 2019-03-08 2023-04-18 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an FGFR inhibitor
US11591329B2 (en) 2019-07-09 2023-02-28 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US12122767B2 (en) 2019-10-01 2024-10-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
TWI891666B (zh) 2019-10-14 2025-08-01 美商英塞特公司 作為ｆｇｆｒ抑制劑之雙環雜環
US11566028B2 (en) 2019-10-16 2023-01-31 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
CA3157075A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. N-terminal scfv multispecific binding molecules
WO2021113462A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Incyte Corporation Derivatives of an fgfr inhibitor
CA3163875A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
US12012409B2 (en) 2020-01-15 2024-06-18 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
TW202304459A (zh) 2021-04-12 2023-02-01 美商英塞特公司 包含ｆｇｆｒ抑制劑及ｎｅｃｔｉｎ－４靶向劑之組合療法
EP4334353A1 (en) 2021-05-04 2024-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses
JP2024522189A (ja) 2021-06-09 2024-06-11 インサイト・コーポレイション Ｆｇｆｒ阻害剤としての三環式ヘテロ環
EP4352060A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
EP4361175A4 (en) * 2021-06-21 2025-07-02 Sekisui Chemical Co Ltd TYROSINE KINASE RECEPTOR AGONIST, CELL CULTURE MEDIUM COMPOSITION AND UNDIFFERENTIATED MAINTENANCE COMPOSITION
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025242726A1 (en) * 2024-05-21 2025-11-27 Onconick Ltd. Antibody binding to FGFR1 and conjugates comprising the same

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
DE69303494T2 (de) 1992-11-13 1997-01-16 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
KR100940380B1 (ko) 1999-01-15 2010-02-02 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PT1176195E (pt) 1999-04-09 2013-07-18 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico
FR2796073B1 (fr) * 1999-07-07 2003-08-29 Centre Nat Rech Scient Anticorps anti-idiotypiques des facteurs de croissance des fibroblastes et leur utilisation comme medicaments
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
AU2001252940A1 (en) * 2000-03-22 2001-10-03 Amgen Inc. Fibroblast growth factor receptor-like molecules and uses thereof
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
NZ524230A (en) 2000-08-29 2006-05-26 Genentech Inc Identification of tumor antigens the expression of which is selectively enhanced by retinoid treatment
KR100865801B1 (ko) 2000-08-29 2008-10-28 제넨테크, 인크. 암 치료의 효능을 증진시키는 방법
DK2314686T4 (da) 2000-10-06 2023-08-21 Kyowa Kirin Co Ltd Celler, der danner antistofsammensætninger
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
NZ581474A (en) 2001-08-03 2011-04-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
KR100988949B1 (ko) 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JP2005530687A (ja) * 2002-01-31 2005-10-13 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ Ｆｇｆｒアゴニスト
EP1502603A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk AN ANTIBODY COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT FOR PATIENTS WITH Fc gamma RIIIa POLYMORPHISM
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20050282733A1 (en) 2002-06-27 2005-12-22 Prins Johannes B Differentiation modulating agents and uses therefor
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1944320A1 (en) 2002-12-16 2008-07-16 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
EP2060270A3 (en) 2003-10-16 2009-12-09 Imclone LLC Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment thereof
JP2005170923A (ja) 2003-10-21 2005-06-30 Konica Minolta Medical & Graphic Inc リポソーム含有ｘ線造影剤およびその製造方法
PT1692182E (pt) 2003-11-05 2010-05-13 Roche Glycart Ag Anticorpos de cd20 com uma afinidade de ligação acrescida ao receptor fc e uma função efectora acrescida
EP3434275A1 (en) 2003-11-06 2019-01-30 Seattle Genetics, Inc. Assay for cancer cells based on the use of auristatin conjugates with antibodies
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
WO2005066211A2 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
CA2561686C (en) 2004-03-31 2014-12-02 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
US7622445B2 (en) 2004-09-02 2009-11-24 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1831371A2 (en) 2004-12-14 2007-09-12 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006130527A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
JP5187837B2 (ja) * 2007-04-06 2013-04-24 独立行政法人産業技術総合研究所 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CA2689242C (en) * 2007-05-29 2015-07-07 Kohzoh Imai Agent and method for treatment of cancer
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EA032727B1 (ru) 2008-10-10 2019-07-31 Амген Инк. Мутантный резистентный к протеолизу полипептид fgf21 и его применение
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
KR101623246B1 (ko) 2011-05-16 2016-05-20 제넨테크, 인크. Fgfr1 효능제 및 사용 방법

Also Published As

Publication number Publication date
EA030462B1 (ru) 2018-08-31
SI2710035T1 (sl) 2017-07-31
US20150376283A1 (en) 2015-12-31
EP2710035B1 (en) 2017-04-12
JP5836481B2 (ja) 2015-12-24
US20120294861A1 (en) 2012-11-22
PH12013502294A1 (en) 2014-01-27
ES2628385T3 (es) 2017-08-02
DK2710035T3 (en) 2017-06-19
TWI547500B (zh) 2016-09-01
HUE033584T2 (hu) 2017-12-28
CN103596980A (zh) 2014-02-19
AR090017A1 (es) 2014-10-15
PL2710035T3 (pl) 2017-09-29
US20240076388A1 (en) 2024-03-07
ZA201307364B (en) 2015-01-28
EP3219730A1 (en) 2017-09-20
PE20140995A1 (es) 2014-08-23
MX2019014654A (es) 2020-02-07
US9085626B2 (en) 2015-07-21
JP2014523866A (ja) 2014-09-18
SG194917A1 (en) 2013-12-30
JP2016029084A (ja) 2016-03-03
US20200140557A1 (en) 2020-05-07
CL2013003296A1 (es) 2014-07-25
CA2834879A1 (en) 2012-11-22
MY175338A (en) 2020-06-19
KR20140012150A (ko) 2014-01-29
CA2834879C (en) 2019-10-22
CR20130587A (es) 2013-12-09
US9845359B2 (en) 2017-12-19
CY1119098T1 (el) 2018-02-14
KR101623246B1 (ko) 2016-05-20
AU2012255881C1 (en) 2015-11-26
ECSP13013022A (es) 2014-01-31
TW201300411A (zh) 2013-01-01
EA201391540A1 (ru) 2014-03-31
MX339662B (es) 2016-06-03
CN103596980B (zh) 2017-08-08
CO6781536A2 (es) 2013-10-31
HRP20170815T1 (hr) 2017-08-25
IL228740A (en) 2017-04-30
NZ616206A (en) 2015-04-24
LT2710035T (lt) 2017-06-26
AU2012255881A1 (en) 2013-11-21
EP2710035A1 (en) 2014-03-26
MX2013013291A (es) 2013-12-02
WO2012158704A1 (en) 2012-11-22
MX370233B (es) 2019-12-06
AU2012255881B2 (en) 2015-08-13
US20180100018A1 (en) 2018-04-12
US20210087283A1 (en) 2021-03-25
PT2710035T (pt) 2017-06-05
BR112013026266A2 (pt) 2020-11-10
IL228740A0 (en) 2013-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240076388A1 (en) Fgfr1 agonists and methods of use
US20240026033A1 (en) Antibodies and methods of use
AU2015218428A1 (en) FGFR1 agonists and methods of use
NZ616206B2 (en) Fgfr1 agonists and methods of use
HK1192257B (zh) Fgfr1激动剂及使用方法
HK1192257A (en) Fgfr1 agonists and methods of use
HK1224927B (zh) 抗体及其使用方法