ES2926375T3

ES2926375T3 - Anticuerpos y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2926375T3
Application number: ES14827379T
Authority: ES
Inventors: Yongmei Chen; James Ernst; Hok Seon Kim; Junichiro Sonoda; Christoph Spiess; Scott Stawicki; Yan Wu
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: PT3086807T; US20150218276A1; BR112016013960B1; EP4219555A1; JP6687533B2; CA2929868A1; PH12016500927A1; EA036107B1; AU2021282496A1; US20250011471A1; JP2017502695A; US20240026033A1; IL245493A0; MX2020009634A; US20220064331A1; CN105939727B; TW201531483A; SG10202007790WA; HRP20221088T1; EP3086807A1

Abstract

El objeto de la presente descripción proporciona anticuerpos que se unen a KLB y FGFR1, y métodos para usar los mismos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación incluye un anticuerpo biespecífico que se une a un epítopo presente en FGFR1 y se une a un epítopo presente en KLB. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos y procedimientos de uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen tanto a beta-Klotho (KLB) como al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFR1) y a procedimientos de uso de los mismos.

Antecedentes

El factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) y su homólogo más cercano FGF19 son miembros de la superfamilia de FGF. La señalización por FGF21 requiere isoformas del receptor de FGF (FGFR) y el correceptor unido a membrana Klotho-beta (Kl B) (Ogawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18): 7432-37 (2007); US2010/0184665). FGF19 también ha demostrado que señaliza a través de isoformas de FGFR complejadas con KLB (Wu et al. J. Biol. Chem. 282(40): 29069-29072 (2007)). De las 7 isoformas primarias de FGFR codificadas por especies de mamífero (1b, 2b, 3b, 1c, 2c, 3c y 4), solo tres isoformas, FGFR1c, 2c y 3c, pueden transducir la señalización tanto por FGF19 como FGF21 cuando se unen al correceptor KLB, que se expresa predominantemente en el hígado, tejido adiposo y páncreas (Goetz y Mohammadi, Nature reviews. Molecular Cell Biology 14, 166-180 (2013)). De estos receptores, FGFR1c parece desempeñar un papel predominante en la mediación del efecto metabólico de FGF21. Sin ceñirse a ninguna teoría particular, se cree que FGF21 actúa induciendo la homodimerización de las isoformas de FGFR en presencia del correceptor unido a membrana KLB. A diferencia de otros ligandos de FGF, FGF21 presenta una afinidad muy baja por cualquier FGFR individual. Sin embargo, la unión de alta afinidad a KLB a través de la región de cola C terminal recluta FGF21 al complejo FGFR/KLB, lo que permite que FGF21 interactúe con los FGFR a pesar de la baja afinidad por los FGFR solos.

Se identificó FGF21 como un potente agente proteico modificador de enfermedad para revertir la obesidad y la diabetes de tipo 2 en modelos de enfermedades animales (Kharitonenkov et al. J. Clin. Invest. 115(6): 1627-35 (2005)). El FGF21 recombinante ha demostrado que reduce los lípidos hepáticos, mejora la sensibilidad a la insulina y normaliza el control glucémico en ratones carentes de señalización por leptina (ob/ob o db/db) o ratones alimentados con una dieta hiperlipídica (HFD). También se han observado una reducción de la glucemia y mejoras en diversos factores de riesgo cardiovascular en macacos de la India obesos y diabéticos tratados diariamente con FGF21 recombinante. Tanto FGF21 como FGF19 han demostrado que activan la función termogénica de los tejidos adiposos (tejidos adiposos marrones y beis; BAT) positivos para la proteína desacoplante 1 (UCP1) en roedores obesos (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Fisher et al., Genes & Development 26, 271-281 (2012)).

Aunque las aplicaciones clínicas de los análogos de FGF21 o FGF19 recombinantes actualmente se están sometiendo a prueba para el tratamiento de la enfermedad metabólica, su desarrollo para la intervención terapéutica ha demostrado ser complicado. Por ejemplo, la semivida en suero de FGF21, ~2 horas en primates no humanos, es demasiado corta para una aplicación clínica práctica y la proteína FGF21 restante en circulación se puede inactivar rápidamente por escisión proteolítica. Se han realizado esfuerzos para mejorar estas propiedades a través de genomanipulación de proteínas, pero dichas modificaciones podrían incrementar la inmunogenicidad y otros efectos adversos específicos de la modificación. Otra complicación significativa es una posibilidad de obtener efectos adversos a largo plazo del tratamiento prolongado mediado por FGF21. Por ejemplo, se ha informado de que FGF21 induce resistencia a la hormona del crecimiento hepática por medio de la inducción de SOCS2, un inhibidor de la señalización por el receptor de la hormona del crecimiento (Inagaki et al., Cell Metab. 8: 77-83 (2008)). En los seres humanos, la resistencia a o carencia de la hormona del crecimiento se asocia con una baja masa ósea en niños y adultos, y la sobreexpresión transgénica de FGF21 o el tratamiento de dos semanas de ratones con FGF21 recombinante da lugar a una pérdida drástica de densidad mineral ósea. Aún no se ha demostrado que los efectos adversos relacionados con los huesos de FGF21 se puedan desvincular de los efectos metabólicos beneficiosos. Además, la sobreproducción transgénica de FGF19 puede dar lugar a carcinogénesis hepatocelular por medio de activación del receptor de FGF (FGFR) 4 (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Tomlinson et al., Endocrinology 143, 1741-1747 (2002); French et al., PLoS One 7, e36713 (2012)).

Los anticuerpos monoclonales (Ab) recombinantes pueden actuar como una poderosa modalidad terapéutica, ya que pueden proporcionar excelente selectividad frente a dianas, perfil farmacocinético y otras propiedades importantes para un agente farmacéutico (Chan y Carter, Nature reviews. Immunology 10, 301-316 (2010)). Por ejemplo, se informó de que un antagonista de anticuerpo específico para FGFR1c induce la pérdida de peso en ratones y monos (documento WO2005/037235) y la activación selectiva mediada por anticuerpos agonistas de FGFR1c es suficiente para recapitular la sensibilización a la insulina por FGF21 en ratones diabéticos (documento WO2012/158704; Wu et al. Science Translational Med. 3(113): 1-10 (2011)). Se han propuesto anticuerpos que se unen al complejo KLB/FGFR1c como activadores/agentes terapéuticos (documentos US 7.537.903; WO2011/071783; WO2012/158704). Otros han investigado dos enfoques alternativos para activar selectivamente el complejo FGFR1c/KLB, tal como un anticuerpo anti-KLB de alta afinidad llamado mimAb1 (Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)) y polipéptido de avímero anti-FGFR1/KLB biespecífico C3201 enlazado a seroalbúmina humana (HSA) (documento US 8.372.952).

Dado el significativo papel de FGF19 y FGF21 en el metabolismo de la glucosa, sigue existiendo la necesidad en la técnica de desarrollar moléculas y procedimientos terapéuticos para modular las actividades mediadas por FGF19 o FGF21.

El documento WO2012/158704 (Genentech Inc) de noviembre de 2012 describe anticuerpos anti-KLB/FGFR1 biespecíficos (página 25, 110-11).

Smith et al. PLOS ONE, vol. 8, número 4, abril de 2013, p. e61432, describe una proteína biespecífica (avímero) que se puede unir a FGFR1c y beta-Klotho que es útil en el tratamiento de la obesidad y diabetes en macacos cangrejeros.

SUMARIO

La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen a KLB, anticuerpos que se unen a FGFR1 y anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a KLB como a FGFR1 y procedimientos de uso de los mismos. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a KLB como a FGFR1, que activan selectivamente el complejo de receptores FGFR1c/KLB e inducen los cambios metabólicos beneficiosos esperados de la actividad similar a FGF21, incluyendo pérdida y mejora en el metabolismo de la glucosa y de los lípidos, sin un impacto significativo en el hígado y sin una pérdida de masa ósea.

En determinados modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo aislado de la presente invención se puede unir tanto a beta-Klotho (KLB) como al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFR1), en el que el anticuerpo se une al dominio C terminal de KLB. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo aislado de la presente divulgación se une tanto a KLB como a FGFRIc. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se une a un fragmento de KLB que incluye la secuencia de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142). En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento de FGFR1 que incluye la secuencia de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) o FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación activa el complejo KLB/FGFR1c. En determinados modos de realización, un anticuerpo de la presente divulgación reduce los niveles de glucemia in vivo. En determinados modos de realización, el anticuerpo no afecta significativamente a la densidad ósea. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no tiene un impacto significativo en el hígado. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo induce la fosforilación de ERK y MEK en el hígado a niveles significativamente menores que los que induce FGF21. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se une a KLB con una Kd de 10-8 M a 10-13 M. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación se puede unir a una proteína FGFR1 con una Kd de 10-8 M a 10-13 M. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación se puede unir a FGFR1c con una Kd de 10-8 M a 10-13 M. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se une a KLB con una Kd de < 10 nM y a FGFR1c con una Kd de >300 nM. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 puede incluir un brazo anti-FGFR1 que tenga una Kd de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 pM.

En determinados modos de realización, un anticuerpo de la presente divulgación se une a un epítopo presente en KLB. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-KLB que se une al mismo epítopo que un anticuerpo mostrado en las figuras 3A y B. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-KLB de la presente divulgación se une al mismo epítopo que el anticuerpo 12A11 o el 8C5. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-KLB se une a un epítopo dentro del dominio C terminal de KLB. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-KLB se une a un fragmento de KLB que consiste en la secuencia de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).

En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación incluye un primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que incluye una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, donde la región variable de la cadena pesada incluye aminoácidos que tienen una secuencia que se expone en SEQ ID NO: 128, y la región variable de la cadena ligera incluye aminoácidos que tienen una secuencia que se expone en SEQ ID NO: 130. En determinados modos de realización, el segundo anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, incluye una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, donde la región variable de la cadena pesada incluye aminoácidos que tienen una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 132, y la región variable de la cadena ligera incluye aminoácidos que tienen una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 134.

En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFRI de la presente divulgación incluye un primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que incluye una región de la cadena pesada y una región de la cadena ligera, donde la región de la cadena pesada incluye aminoácidos que tienen una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 129, y la región de la cadena ligera incluye aminoácidos que tienen una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 131. En determinados modos de realización, el segundo anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, incluye una región de la cadena pesada y una región de la cadena ligera, donde la región de la cadena pesada incluye aminoácidos que tienen una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 133, y la región de la cadena ligera incluye aminoácidos que tienen una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 135.

La presente divulgación proporciona además un anticuerpo anti-KLB que incluye: (a) HVR-H3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 1-15, (b) HVR-L3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 79-93, y (c) HVR-H2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-31.

En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-KLB comprende (a) HVR-H1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-15, (b) HVR-H2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-31, y (c) HVR-H3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32-47.

En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-KLB comprende además (a) HVR-L1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48-62, (b) HVR-L2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 63-78, y (c) HVR-L3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 79-93.

En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-KLB comprende (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90.

En determinados modos de realización, el anticuerpo anti-KLB comprende (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93.

En determinados modos de realización, el anticuerpo anti-KLB comprende (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-KLB que comprende (a) una región variable de la cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (b) una región variable de la cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; y (c) una región variable de la cadena pesada como en (a) y una región variable de la cadena ligera como en (b).

La presente divulgación proporciona además anticuerpos que se unen a FGFR1, por ejemplo, a FGFR1c. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio variable que se une a FGFR1. En determinados modos de realización, el anticuerpo se une a un fragmento de FGFR1 que consiste en la secuencia de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) o FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144). En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138, (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139, (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140, y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 141. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135. En determinados aspectos de la descripción, un anticuerpo de la presente divulgación se une a un fragmento de FGFRIc que consiste en la secuencia de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) o FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

En determinados modos de realización, un anticuerpo de la presente divulgación es un anticuerpo monoclonal. En determinados modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo tiene una función efectora reducida.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de la presente divulgación. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico de la presente divulgación. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar una célula huésped de la presente divulgación de modo que se produzca el anticuerpo. En determinados modos de realización, este procedimiento comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

La presente divulgación proporciona además una formulación farmacéutica que incluye uno o más anticuerpos de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la formulación farmacéutica comprende un agente terapéutico adicional.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo de la invención para su uso como un medicamento. En determinados modos de realización, el anticuerpo es para su uso en el tratamiento de trastornos metabólicos, por ejemplo, obesidad, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD), diabetes de tipo 2, diabetes distinta de tipo 2, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria latente (LAD) y diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY). En determinados modos de realización, el anticuerpo es para su uso en el tratamiento de la diabetes de tipo 2. En determinados modos de realización, el anticuerpo es para su uso en el tratamiento de la obesidad. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo para su uso en el tratamiento del síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Alstrom, síndrome de Cohen, osteodistrofia hereditaria de Albright (pseudohipoparatiroidismo), síndrome de Carpenter, síndrome de MOMO, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome del cromosoma X frágil y síndrome de Borjeson-Forssman-Lehman. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo para su uso en la activación de un complejo de receptores KLB/FGFR1, por ejemplo, un complejo de receptores KLB/FGFR1c.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de un anticuerpo, divulgado en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos metabólicos, por ejemplo, síndrome del ovario poliquístico (SOP), síndrome metabólico (MetS), obesidad, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensión, diabetes de tipo 2, diabetes distinta de tipo 2, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria latente (LAD) y diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY) y envejecimiento y enfermedades relacionadas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y ELA. En determinados modos de realización, el trastorno metabólico es diabetes de tipo 2. En determinados modos de realización, el trastorno metabólico es obesidad. En determinados aspectos de la divulgación, la fabricación es de un medicamento para activar un complejo de receptores KLB/FGFRIc.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en síndrome del ovario poliquístico (SOP), síndrome metabólico (MetS), obesidad, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensión, diabetes de tipo 2, diabetes distinta de tipo 2, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria latente (LAD) y diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY) y envejecimiento y enfermedades relacionadas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y ELA, comprendiendo el procedimiento administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la presente divulgación. En determinados modos de realización, la enfermedad es diabetes, por ejemplo, diabetes de tipo 2. En determinados modos de realización, la enfermedad es obesidad. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad y/o trastorno seleccionado del grupo que consiste en síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Alstrom, síndrome de Cohen, osteodistrofia hereditaria de Albright (pseudohipoparatiroidismo), síndrome de Carpenter, síndrome de MOMO, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome del cromosoma X frágil y síndrome de Borjeson-Forssman-Lehman. En determinados modos de realización, el procedimiento incluye además administrar un agente terapéutico adicional al individuo. En determinados aspectos de la divulgación, un procedimiento que usa uno o más anticuerpos de la presente divulgación no afecta a la función hepática en un individuo. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inducir la pérdida de peso que comprende administrar a un individuo una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la presente divulgación.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento de activación de un complejo de receptores KLB-FGFRic en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente divulgación.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A representa la actividad agonista de los anticuerpos anti-FGFRI y fragmentos de anticuerpo.

La figura 1B representa los resultados de los experimentos de competencia de unión usando anticuerpos anti-FGFR1.

La figura 1C representa residuos de aminoácido en FGFR1 importantes para la unión por anticuerpos anti-FGFR1 de la materia objeto divulgada actualmente. La figura 1C divulga las SEQ ID NO: 159, 159, 143 y 144, respectivamente, en orden de aparición.

La figura 1D representa los resultados de la mutagénesis específica de sitio para determinar los residuos de aminoácido importantes para la unión por anticuerpos anti-FGFR1 de la materia objeto divulgada actualmente. La figura 1E representa los resultados de la mutagénesis específica de sitio para determinar los residuos de aminoácido importantes para la unión por anticuerpos anti-FGFR1 de la materia objeto divulgada actualmente. La figura 1F representa residuos importantes para la unión en un modelo de llenado de espacio de FGFR1. La figura 2A representa las afinidades de dos anticuerpos anti-FGFR1 por FGFR1b y FGFR1c.

La figura 2B representa la unión de un anticuerpo anti-FGFR1 a diversos FGFR.

La figura 2C representa un anticuerpo anti-FGFR1 que actuó como agonista específico para FGFR1 en el ensayo de luciferasa basado en GAL-ELK1 (factor de transcripción similar a ETS 1) en células L6.

La figura 2D representa que un anticuerpo anti-FGFR1 actuó como agonista específico para FGFR1 en el ensayo de luciferasa basado en GAL-ELK1 en células HEK293.

La figura 2E representa que un anticuerpo anti-FGFR1 normalizó los niveles de glucemia cuando se inyectó en ratones diabéticos ob/ob.

La figura 3A representa las secuencias de la región variable de la cadena ligera para 17 anticuerpos anti-KLB. Las secuencias de CDR L1 son, en orden, SEQ ID NO: 48-62; las secuencias de ^cD^rL2 son, en orden, SEQ ID NO: 63-78; y las secuencias de CDH L3 son, en orden, SEQ ID NO: 79-93. Las secuencias de la región variable de la cadena ligera son, en orden, las SEQ ID NO: 111-127.

La figura 3B representa las secuencias de la región variable de la cadena pesada para 17 anticuerpos anti-KLB. Las secuencias de CDR H1 para los anticuerpos son, en orden (11F1-8C5), SEQ ID NO: 1-15; las secuencias de CDR H2 son, en orden, Se Q ID NO: 16-31; las secuencias de CDR H3 son, en orden, SEQ ID NO: 32-47. Las secuencias de la región variable de la cadena pesada para los anticuerpos son, en orden, las SEQ ID NO: 94-110. La figura 4 representa la mediana del cambio observado en el gráfico de FACS a 0,8 |jg/ml midiendo la unión de diversos anticuerpos anti-KLB a células 293 que expresan hKLB.

La figura 5 representa la unión relativa de diversos anticuerpos anti-KLB a la proteína DEC de hKLB-HIS.

La figura 6A es un diagrama esquemático que representa los anticuerpos de la materia objeto divulgada actualmente y un modelo para la formación del complejo Ab biespecífico para KLB/FGFR1c para la activación de señales.

La figura 6B representa un modelo para la formación del complejo FGFR1c-KLB-FGF21 para la activación de señales.

La figura 6C muestra un ensayo de luciferasa con GAL-ELK1 de actividad del FGF21 y del anticuerpo biespecífico (BsAb) 17 usando células HEK293 carentes de FGFR1. Las células se transfectaron para expresar los receptores indicados.

La figura 6D representa un análisis de inmunoelectrotransferencia de adipocitos humanos primarios tratados con la proteína indicada (FGF21 (100 nM) o IgG (33 nM)) durante 1 h. Las muestras se duplicaron para cada tratamiento. La figura 7A representa la inducción por diversos anticuerpos biespecíficos con brazos anti-FGFR1 y anti-KLB en un ensayo de luciferasa basado en GAL-ELK1. Cabe señalar que los Ab biespecíficos con brazo de R1MAb1 presentaron una actividad independiente de KLB significativa, supuestamente debido a la actividad agonista de Fab de R1MAb1. No se observó dicha actividad con Ab biespecíficos con el brazo de R1MAb2 o de R1MAb3. La figura 7B representa que la inducción de señalización por diversos anticuerpos biespecíficos con brazos anti-FGFR1 y anti-KLB es dependiente tanto de FGFR1c como de KLB.

La figura 7C representa un anticuerpo biespecífico con brazos anti-FGFRI y anti-KLB que inducía la actividad luciferasa de manera dependiente de la dosis en células que expresaban hFGFR1c y hKLB recombinantes, pero no en células sin expresión de KLB.

La figura 8A es una representación esquemática de tres variantes de anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1c. Azul: humano y rojo: ratón. La posición aproximada de la cadena de oligosacáridos en N297 en (1) se indica por A Las versiones sin efector ((2) y (3)) carecen de las cadenas de oligosacáridos debido a la mutación N297G. Los asteriscos en (2) indican la posición aproximada de la mutación D265A. También se muestra la orientación de botón frente a ojal. (1) representa BsAb10; (2) representa BsAb20; y (3) representa BsAb17.

La figura 8B representa un ensayo MSD pERK en adipocitos humanos primarios tratados con BsAb10 y sus derivados, IgG de control o FGF21 durante 10 min. Los datos representan medias ± EEM (N=3). bFKBI (1) representa BsAb10; bFKB1 (2) representa BsAb20; y bFKB1 (3) representa BsAb17.

La figura 9A representa un ensayo de luciferasa con GAL-ELK1 en células de mioblasto L6 de rata. Las células se cotransfectaron con un vector de expresión para los receptores indicados. Las células transfectadas se incubaron con diversas concentraciones de BsAb10 o un control positivo, FGF21, FGF19 o R1MAb1, durante 6 h antes de los ensayos de luciferasa.

La figura 9B representa ensayos de luciferasa con GAL-ELK1 similares como se muestra en la figura 9A. Las células L6 transfectadas se trataron con combinaciones de FGF21 y BsAb17 como se indica. N=4.

La figura 9C representa ensayos de luciferasa con GAL-ELK1 similares como se muestra en la figura 9A. Las células L6 transfectadas se trataron con combinaciones de FGF21 y BsAb17 como se indica. N=4.

La figura 9D representa la unión de un anticuerpo anti-FGFR1 y los anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1, BsAB9 y BsAb10, a células que expresan KLB, FGFR1c o ambos.

La figura 10A representa la unión de un anticuerpo biespecífico con brazos anti-FGFR1 y anti-KLB y un anticuerpo anti-FGFR1 a células que expresan FGFR1c, k Lb o ambos.

La figura 10B representa la Kd de BsAb10 para su unión a células HEK293 que expresan diversas combinaciones de KLB/FGFR1 humano y murino.

La figura 11 representa el análisis de unión de BsAb10 o complejos BsAb10/KLB preformados a 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM a la proteína de fusión DEC de FGFR1-Fc que se inmovilizó en el chip. Para generar complejos BsAb10/KLB preformados, se preincubaron BsAb10 y la proteína DEC de KLB recombinante a una proporción de 1:1. Cabe señalar que la tasa de disociación fue más lenta con el complejo BsAb10/KLB que con BsAb10 solo, pero solo cuando se capturó FGFR1c, pero no FGFR1b, en el chip, lo que indicaba la formación de un complejo ternario.

La figura 12A es una representación esquemática del diseño del experimento de TR-FRET.

La figura 12B representa la intensidad de TR-FRET en células COS7 que expresan la proteína FGFR1c marcada con SNAP marcada con o sin KLB sin marca a los 15 minutos después de la adición de los ligandos indicados. Se usaron BsAb17, FGF21, FGF1 y FGF2 a 67 nM, 50 nM, 62,5 nM, 12 nM, respectivamente. Los datos representan la intensidad de FRET a 665 nm dividida por la emisión del donante a 620 nm (proporción de FRET), y medias ± EEM de tres experimentos independientes (N=3). p<0,05 (*), <0,01 (**), <0,0001 (***) frente al control de PBS.

La figura 13A representa los resultados de los experimentos para determinar qué parte de KLB era importante para la unión por dos anticuerpos anti-KLB. En la parte superior se muestra una representación esquemática de la estructura de la proteína KLB. Cada barra representa KLB humano, KLA humano, KLB de conejo, KLB de rata, KLB de ratón o construcciones quiméricas como se codifica por colores. A la derecha, se muestra la unión de KLBmAb1 y KLBmAb2 de control en base a FACS con células HEK293 que expresan de forma transitoria cada construcción. Cabe señalar que KLBmAb1 no se une a KLB de conejo, pero el reemplazo de un fragmento de 34 aminoácidos (aminoácidos 805-838) por la secuencia humana correspondiente confiere la unión.

La figura 13B representa la secuencia de aminoácidos del segmento de posiciones 857-890 de una proteína KLB humana con una secuencia señal (que corresponde a la secuencia de aminoácidos en las posiciones 805-838 de una proteína KLB que no incluye ninguna secuencia señal) y secuencias correspondientes en diversas especies indicadas. La figura 13B divulga las SEQ ID NO: 160-164, respectivamente, en orden de aparición.

La figura 14A representa la unión de FGF21 y FGF19 al complejo BsAb10/KLB por RPS. Se capturó BsAb10 en el chip y se inyectaron secuencialmente proteína DEC de KLB y proteína FGF (a 0,2, 0,8 o 2 |^j M).

La figura 14B representa los resultados de un ensayo de luciferasa con GAL-ELK1 en células de mioblasto L6 de rata. Las células se cotransfectaron con un vector de expresión tanto para FGFR4 como para KLB. Las células transfectadas se incubaron con diversas concentraciones de las proteínas indicadas durante 6 h antes de los ensayos de luciferasa.

La figura 14C representa una inmunoelectrotransferencia que se realizó para supervisar la fosforilación de ERK en células de hepatoma H4IIE. Cabe señalar que BsAb17 no bloqueó la capacidad de FGF19 de activar el complejo FGFR4/KLB (figura 14B) o de inducir la fosforilación de ERK en células de hepatoma H4IIE (figura 14C).

La figura 15A representa los niveles de glucemia (día 7), el % de cambio de peso corporal (día 7) y la ingesta de alimento diaria (día 0-3) de ratones C57BL/6 magros y db/db (n=7) después de una inyección intraperitoneal (i.p.) única de BsAb17 o IgG de control a 3 mg/kg (magros) o 5 mg/kg (db/db).

La figura 15B representa el peso corporal y los niveles de glucemia de ratones con obesidad inducida por dieta (DIO), que recibieron inyecciones i.p. de la IgG indicada (BsAb20) a 3 mg/kg el día 0 y 6 (flechas). N=9.

La figura 15C representa los resultados de la prueba de tolerancia a la glucosa con los mismos ratones y anticuerpo usado en 15B el día 14.

La figura 15D representa la cantidad de triglicéridos hepáticos y marcadores en suero en animales mostrados en 15B-C el día 17.

La figura 15E representa la utilización de glucosa en todo el cuerpo, medida durante pinzamientos hiperinsulinémicos-normoglucémicos con ratones con DIO 5 días después de una inyección i.p. única de la IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (N=12). El eje horizontal representa los niveles de insulina en suero. Las flechas indican la dirección de los cambios desde los estados basal al estimulado por insulina. p<0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) frente al control.

La figura 15F representa la producción de glucosa endógena, medida durante pinzamientos hiperinsulinémicos-normoglucémicos con ratones con DIO 5 días después de una inyección i.p. única de la IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (N=12). El eje horizontal representa los niveles de insulina en suero. Las flechas indican la dirección de los cambios desde los estados basal al estimulado por insulina. p<0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) frente al control.

La figura 15G representa la absorción de glucosa tisular estimulada por insulina, medida durante pinzamientos hiperinsulinémicos-normoglucémicos con ratones con DIO 5 días después de una inyección i.p. única de la IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (N=12). p<0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) frente al control.

La figura 16A muestra la secuencia de aminoácidos N terminal de la proteína KFB de ratón (SEQ ID NO: 165), y se muestra la correspondiente secuencia de aminoácidos codificada por el alelo Klb en los ratones con desactivación génica (SEQ ID NO: 166). Una mutación de aminoácido en el gen Klb da como resultado un cambio del marco después del segundo aminoácido en el alelo con desactivación génica, como se muestra con letras rojas.

La figura 16B muestra la expresión de la proteína KLB en tejido adiposo blanco epididimario en ratones naturales (+/+) y con desactivación génica para KLB (-/-).

La figura 16C muestra que KLB es importante para que BsAb20 afecte al metabolismo de la glucosa. Prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) en ratones con DIO que recibieron cuatro inyecciones semanales de BsAb20 o IgG de control a 3 mpk. La GTT se realizó el día 23, tres días después de la última inyección. Los ratones recibieron una HFD durante 20 semanas antes de la GTT. *p<0,05.

La figura 16D representa los parámetros en suero en ratones con DIO el día 7 después de una inyección i.p. de un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 o R1MAb1 a 50 mg/kg o vehículo. N=6.

La figura 17 representa la cantidad de FGF23 y fósforo inorgánico en el suero de ratones con DIO el día 7 después de la inyección i.p. de BsAb17 a 50 mg/kg. N=6. ***p<0,0005.

La figura 18A representa la cantidad de fluctuación de glucosa en sangre arterial durante el experimento de pinzamiento. Los ratones con DIO recibieron BsAb17 o IgG de control a 10 mg/kg 5 días antes del experimento de pinzamiento.

La figura 18B representa el peso corporal el día del experimento de pinzamiento.

La figura 18C representa la tasa de infusión de glucosa durante el experimento de pinzamiento. p<0,05 (*), <0,001 (**) frente al control.

La figura 19A representa el gasto energético (EE) (izquierda) y el cociente respiratorio (RQ) (derecha) de ratones con DIO que recibieron una inyección i.p. única de 10 mg/kg de IgG en el momento indicado a 21-22 °C. N=7.

La figura 19B representa el EE (parte superior) y el RQ (parte inferior) de ratones magros que recibieron una inyección i.p. única de 10 mg/kg de IgG en el momento indicado. Los ratones se mantuvieron a 21-22 °C, a continuación, la temperatura de la jaula se cambió a la termoneutralidad (29-30 °C) 6 días después de la inyección de IgG. N=6~7.

La figura 19C representa la absorción de fludesoxiglucosa (FDG) tisular en ratones con DIO 40 h después de una inyección i.p. única de la IgG indicada a 10 mg/kg. N=8. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de que se midiera la absorción de FDG.

La figura 19D representa el análisis de inmunoelectrotransferencia de ingWAT extraído el día 7 después de una inyección i.p. única (BsAb17 o IgG de control a 10 mg/kg) e implantación quirúrgica de una bomba osmótica (CL316.243 (0,75 nmol/h) o vehículo).

La figura 19E representa la expresión de ARNm de Ucp1 en adipocitos subcutáneos humanos primarios tratados con la proteína indicada a 30 nM durante 48 h. N=3.

La figura 19F representa la temperatura corporal central de ratones con DIO que recibieron 10 mg/kg de BsAb17 o IgG de control. N=7~8.

La figura 19G representa el perfil de expresión génica en iBAT de ratones con DIO que recibieron, dos veces al día, una única dosis de 10 mg/kg de IgG y FGF21 a 2 mg/kg/día o PBS de control durante 5 días. Se enumeraron todos los genes que eran significativamente diferentes entre BsAb17 y el control, o entre FGF21 y el control.

La figura 19H representa el EE (izquierda) y el RQ (derecha) de ratones magros que recibieron una inyección i.p. única de un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 o IgG de control a 10 mg/kg e implantación quirúrgica de una bomba osmótica (CL-316.243 a 0,5 nmol/h o vehículo) el día 0. Se muestran los valores medios durante el periodo de 24 h indicado.

La figura 20A representa la cantidad de VO2 (parte superior), VCO2 (parte central) y los recuentos de actividad total de ratones con DIO descritos en la figura 19A. Los valores de VO2 y VCO2 se normalizan por los valores de peso corporal medidos en los momentos indicados por #. Los ratones con DIO recibieron 10 mg/kg de BsAb17 o IgG de control.

La figura 20B representa la cantidad de VO2 (parte superior), VCO2 (parte central) y los recuentos de actividad total de ratones con DIO descritos en la figura 19B. Los valores de VO2 y VCO2 se normalizan por los valores de peso corporal medidos en los momentos indicados por #. Los ratones con DIO recibieron 10 mg/kg de BsAb17 o IgG de control.

La figura 21A representa el valor de EE promedio en calorimetría indirecta. La magnitud del incremento promedio se muestra bajo los gráficos. DIO a 21 °C: valor promedio de EE durante D3-D6 después de la inyección de IgG en el experimento mostrado en la fig. 19A. Magro a 21 °C: valor promedio de EE durante D3-D6 después de la inyección de IgG en el experimento mostrado en la fig. 19B. Magro después de cambio a 30 °C: valores promedio de EE durante D6-D9 después de la inyección de IgG (es decir, 3 días después del cambio de temperatura) en el experimento mostrado en la fig. 19B. DIO a 30 °C: valor promedio de EE durante D3-D6 después de la inyección de IgG en ratones con DIO aclimatados a la termoneutralidad.

La figura 21B representa los cambios en EE en ratones con DIO a la termoneutralidad. Los ratones con DIO se aclimataron a la termoneutralidad durante 2 semanas antes de la inyección i.p. única (flecha) de BsAb17 o IgG de control a 10 mg/kg. N=3~4.

La figura 21C representa el EE promedio y el RQ en ratones con DIO a temperatura de laboratorio normal (21 °C) durante D3-5 después de la implantación quirúrgica de una bomba osmótica e inyección de fármaco. El D0, los ratones recibieron una inyección i.p. de BsAb17 o IgG de control a 10 mg/kg. El grupo de FGF21 también recibió una inyección i.p. de 2 mg/kg de FGF21 en bolo el D0. A cada ratón también se le implantó por vía subcutánea una bomba osmótica para infundir FGF21 a 60 pg/día o control de PBS el D0. N=8~9. ** p<0,005.

La figura 22 representa los datos mostrados en la fig. 19F representados nuevamente para mostrar la diferencia ajustada en la temperatura corporal central durante el transcurso del estudio entre ratones con DIO que recibieron 10 mg/kg de BsAb17 o IgG de control. La línea negra es la diferencia estimada y las líneas azules son los intervalos de confianza puntuales a un 95 % de la diferencia. Se administró IgG el día 13 (flecha). N=7~8.

La figura 23 representa la fosforilación de ERK y MEK inducida por FGF21 y BsAb20 en un grado similar en la grasa epididimaria, grasa inguinal y grasa parda interescapular y el páncreas. Los tejidos se extrajeron 1 h (hígado, páncreas y tejido adiposo blanco epididimario (eWAT)) o 2 h (iBAT o ingWAT) después de una inyección i.p. de ratones C57BL/6 magros a 10 mg/kg (BsAb20) o 1 mg/kg (FGF21). Las ERK y MEK totales sirven como controles de carga.

La figura 24A representa los cambios de peso corporal y los niveles de adiponectina de PMA en suero en ratones con DIO (N=6) que recibieron una inyección i.p. única de BsAb17 a la dosis indicada (mg/kg).

La figura 24B representa los cambios de peso corporal y los niveles de adiponectina de PMA en suero en macacos cangrejeros (N=3) que recibieron una inyección i.v. única de BsAb17 a la dosis indicada (mg/kg).

La figura 24C representa el EE de ratones con DIO (izquierda: wt y derecha: con desactivación génica para adipoq) que recibieron una inyección i.p. única de la IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (flecha). N=5~6.

La figura 24D representa los diversos parámetros metabólicos en ratones con DIO wt (+/+) y con desactivación génica para adipoq (-/-), que recibieron una inyección i.p. única de la IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg. N=6. ABC: área bajo la curva en Gt T o ITT (T=0~2 h). p<0,1 (#), <0,05 (*), <0,005 (**) frente a control.

La figura 25 representa el ARN total que se preparó a partir de los ratones descritos en la fig.19G usando qPCR.

La figura 26 representa el nivel de fosforilación de ERK por BsAb17 en tejidos de ratón. Los tejidos se extrajeron 1 h después de una inyección i.p. de ratones C57BL/6 magros a 10 mg/kg de BsAb17 o IgG de control y se sometieron a inmunohistoquímica usando un anticuerpo específico para ERK fosforilada. Se muestran imágenes representativas de 2 animales para cada grupo. (1) páncreas, (2) corte cerebral frontal que contiene núcleos supraquiasmáticos (flecha), (3) corte cerebral frontal que contiene el área postrema (colección triangular de células teñidas) y el canal central (flecha) y (4) corte cerebral frontal que contiene la eminencia mediana (flecha). Cabe señalar que la señal inducida por BsAb17 fue evidente en las células acinares pancreáticas, pero no en cualquiera de los cortes cerebrales examinados.

La figura 27 representa la normalización de la proliferación de hepatocitos inducida por HFD por BsAb20. Incorporación de BrdU hepática en ratones con DIO tratados con BsAb20 (1 o 3 mg/kg/semana) o IgG de control (3 mg/kg/semana) durante 8 semanas o ratones C57BL/6 magros de control. * p<0,05 frente a ratones con DIO tratados con IgG (n =5~8).

La figura 28A es una representación esquemática del experimento mostrado en la figura 28B. Los ratones con DIO recibieron BsAb20 (1 o 3 mg/kg/semana) o IgG de control (1 mg/kg/semana) durante 6 semanas como se indica. Los ratones C57BL/6 magros de control no recibieron tratamiento.

La figura 28B representa el fenotipo óseo después del tratamiento con BsAb20. El fémur y la tibia se disecaron y se sometieron a análisis de |jCT. (N=7~8). Cabe señalar que no se observó ningún efecto negativo en diversos parámetros óseos en huesos trabeculares y corticales con la posible excepción del espesor del hueso cortical, que mostró una tendencia decreciente con tratamiento con 3 mg/kg/semana de BsAb20, aunque no se alcanzó la significación estadística. Puesto que se ha informado de una reducción del espesor del hueso cortical sin un efecto en la densidad del hueso trabecular en ratones con restricción calórica (11), el efecto observado se puede relacionar con la pérdida de peso. p<0,001 (***), <0,01 (**), <0,05 (*), <0,1 (#), <0,2 ($) frente a ratones con DIO tratados con IgG de control. N=7~8.

La figura 29 representa los niveles de corticosterona en ratones después del tratamiento con BsAb17. Los niveles de corticosterona en suero se midieron en el tiempo de sincronizador biológico (ZT)=3 después de sacrificarlos por decapitación. Los ratones magros de control (CTRL) no recibieron ningún tratamiento. Se inyectó i.p. lipopolisacárido (LPS) en ratones magros a 1 mg/kg a las 3 h antes de sacrificarlos (ZT=0) como control positivo (12). Se inyectó i.p. IgG en ratones con DIO a 5 o 25 mg/kg 5 días antes de sacrificarlos como se indica. El análisis estadístico indicado se realizó sin el grupo con LPS. N=12.

La figura 30 muestra la unión de diversos anticuerpos biespecíficos diferentes con brazos anti-FGFR1 y anti-KLB a células que expresan FGFR1c o FGFR1c y KLB.

La figura 31 representa la unión de los derivados de YW182.5 e YW182.5 a las proteínas FGFR1 por ELISA.

Descripción detallada

Para mayor claridad, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la materia objeto divulgada actualmente se divide en las siguientes subsecciones:

I. definiciones;

II. anticuerpos;

III. procedimientos de uso;

IV. formulaciones farmacéuticas; y

V. artículos de fabricación.

I. Definiciones

Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En determinados aspectos de la divulgación, el número de cambios aminoacídicos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En determinados aspectos de la divulgación, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o secuencia de la región estructural consenso humana.

"Afinidad" se refiere a la intensidad de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y, en general, se puede representar por la constante de disociación (Kd). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los aspectos ilustrativos y ejemplares específicos de la divulgación para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.

Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

"Klotho-beta", "KLB" y "beta-Klotho", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier beta-Klotho natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba KLB no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de KLB que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de ^kL^b, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Un ejemplo no limitante de una secuencia de aminoácidos de KLB humano seleccionada como diana por un anticuerpo de la presente divulgación, excluyendo la secuencia señal, es como sigue:

FSGDGRA1WSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWG1GTGALQVEGSWKKDG KGPSIWDHFIHTHFKNVSSTNGSSDSYIFFEKDLSAFDFIGVSFYQFSISWPRLFP DGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKND THDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLA A VYTVGHNLIKAHS KVWHN YNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDI FKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTAD FFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNW1KLEYNNPR1L1AENGWFT DSRVKTEDTTA1YMMKNFLSQVLQA1RLDE1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYT IRRGLFYVDFNS KQKERKPKS S AH YYKQHRENGFS LKESTPD VQGQFPCDFS

WG VTES VLKPES V ASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEG VRLKTRPAQCTD FVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSE GLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQEL GDLVKLWmNEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPS QRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFE1AWFAEPLFKTGDYPA AMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLA GSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLA VIPW GVRKLLRW VRRNY GDMDIYITAS GIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYL1DKVR1KGYYAFKLAEEKSKPRF GFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPL IFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (SEQ |D N0 145)

En determinados aspectos de la divulgación, una proteína KLB puede incluir una secuencia señal N terminal que tenga la secuencia de aminoácidos MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLORSVILSALILLRAVTG(^{seq id NO:}157).

El término "dominio C terminal de KLB" se refiere al dominio similar a glucosidasa carboxiterminal de KLB. Por ejemplo, el dominio C terminal de la proteína KLB ejemplar mostrada en SEQ ID NO: 145 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

FPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTR PAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYY RCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAG LCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYD RQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKT GDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFV MHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDM DIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEE KSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSR (SE^{q id}N0: -ⁱ55).

Los términos "anticuerpo anti-KLB" y "un anticuerpo que se une a KLB" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a KLB con afinidad suficiente, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al seleccionar como diana KLB. En un aspecto de la divulgación, el grado de unión de un anticuerpo anti-KLB a una proteína distinta de KLB no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a KLB como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo que se une a KLB tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |^jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, <0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-KLB se une a un epítopo de KLB que se conserva entre KLB de diferentes especies. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-KLB se une a un epítopo en KLB que está en la parte C terminal de la proteína.

El término "receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1" o "FGFR1", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier FGFR1 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba FGFR1 no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de FGFR1 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de FGFR1, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas, incluyendo FGFRIc. A continuación, se muestra un ejemplo no limitante de un aminoácido de FGFR1c humano:

MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHP

GDLLQLRCRLRDDVQS1NWLRDGVQLAESNRTR1TGEEVEVQDSVPADSGLY

ACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPVAPY

WTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGY

KVRYATWS11MDSVVPSDKGNYTCIVENEYGS1NHTYQLDVVERSPHRPILQA

GLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSK1GPDNLPYVQ1LK

TAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEE

RPAVMTSPLYLEniYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMAVHKL

AKS1PLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPR

WELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEA1GLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDAT

EKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNUNLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQ

ARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKC1HRDLAA

RNVFVTEDNVMKIADFGLARD1HHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYT

HQSDVWSFGVFLWEEFTLGGSPYPGVPVEELFKLFKEGHRMDKPSNCTNELY

MMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPD

TRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGG LKRR (SEQ |D NQ.146)

El término "anticuerpo anti-FGFR1c" se refiere a un anticuerpo que se puede unir a FGFR1c con afinidad suficiente, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al seleccionar como diana FGFR1c. En un aspecto de la divulgación, el grado de unión de un anticuerpo anti-FGFR1c a una proteína distinta de FGFR1c no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a FGFR1c como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo que se une a FGFRIc tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 M, < 100 mM, < 10 mM, < 1 mM, < 100 |^j M, < 10 |^j M, < 1|^j M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM. En determinados aspectos de la divulgación, la Kd de un anticuerpo que se une a FGFR1c, divulgado en el presente documento, puede ser de 10-3 M o menos, o 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-FGFR1c se une a un epítopo de FGFR1c que se conserva entre FGFR1c de diferentes especies.

Se usa el término "anticuerpo" en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que compite en cuanto a su unión" con un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más, y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. Un ensayo de competencia ejemplar se describe en "Antibodies", Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, ^y, y M, respectivamente.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211,I131,I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Por ejemplo, y no a modo de limitación, una "cantidad eficaz" se puede referir a una cantidad de un anticuerpo, divulgado en el presente documento, que puede de aliviar, minimizar y/o prevenir los síntomas de la enfermedad y/o trastorno, prolongar la supervivencia y/o prolongar el periodo hasta la recidiva de la enfermedad y/o trastorno.

Se usa el término "región Fc" en el presente documento para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En determinados aspectos divulgación, una región Fc con las cadenas pesadas de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la que se criba o selecciona en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos de aminoácido que aparecen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural del VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias del VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En determinados aspectos de la divulgación, para el Vl , el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En determinados aspectos de la divulgación, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos en contacto con el antígeno ("contactos con el antígeno"). A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de ^fR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:

(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) CDR que se producen en los residuos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) contactos con el antígeno que se producen en los residuos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

En determinados aspectos de la divulgación, los residuos de HVR comprenden los identificados en la figura 3A o figura 3B o en cualquier parte de la memoria descriptiva.

Un "inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo, pero sin limitarse a, un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados aspectos de la divulgación, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En determinados aspectos de la divulgación, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo" (incluyendo referencias a un anticuerpo específico, por ejemplo, un anticuerpo anti-KLB) se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades despreciables. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la materia objeto divulgada actualmente se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de a Dn recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo, (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.

Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están enlazadas por puentes disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (^k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase", como se usa en el presente documento, se refiere a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. Se debe compilar el programa ALIGN-2 para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Se establecen todos los parámetros de comparación de secuencias por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para su profilaxis o bien durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos de la presente divulgación se pueden usar para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural, en general, tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un dominio VH o Vl único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

II. Anticuerpos

En un aspecto, la invención se basa, en parte, en el descubrimiento de anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a KLB como a FGFR1c y que activan selectivamente el complejo de receptores FGFR1c/KLB e inducen los cambios metabólicos beneficiosos esperados de la actividad similar a FGF21, incluyendo pérdida y mejora en el metabolismo de la glucosa y de los lípidos, sin un impacto significativo en el hígado y sin pérdida de masa ósea.

En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos que se unen a KLB. La presente divulgación proporciona además anticuerpos anti-FGFR1, por ejemplo, anticuerpos anti-FGFR1c. La presente divulgación proporciona además anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a KLB como a FGFR1 (denominados en el presente documento anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1). En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación se une tanto a KLB como a FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos de la presente divulgación incluyen anticuerpos que no bloquean la unión y/o interacción de los ligandos de ^fG^f, por ejemplo, FGF19 y FGF21, al complejo KLB/FGFR1c.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no tiene un impacto significativo en el hígado, por ejemplo, en la función hepática. Sin limitarse a una teoría particular, un anticuerpo de la presente divulgación no da como resultado la activación del complejo de receptores FGFR1c/KLB en el hígado. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no modula la actividad de un complejo de receptores FGFR/KLB en el hígado en comparación con la modulación de un complejo de receptores FGFR/KLB en el hígado por una proteína FGF21. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no da como resultado la inhibición del complejo FGFR4/KLB y/o no da como resultado la elevación de enzimas hepáticas, tales como, pero sin limitarse a, ALT, AST, ALP y GLDH. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no funciona como agonista del complejo FGFR2c/KLB y/o del complejo FGFR3c/KLB en el hígado, lo que puede dar lugar a la señalización de MAPK activada y/o expresión alterada de Spry4 y Dusp6 en el hígado. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no da como resultado la activación de la señalización de MAPK en el hígado en comparación con la activación de la señalización de MAPK por una proteína FGF21. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no funciona como agonista del complejo FGFR4/KLB en el hígado.

En determinados modos de realización, se puede humanizar un anticuerpo de la presente divulgación. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación comprende una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En determinados modos de realización, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1-7, detalladas a continuación.

Los anticuerpos de la presente divulgación son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de trastornos metabólicos. Los ejemplos no limitantes de trastornos metabólicos incluyen síndrome del ovario poliquístico (SOP), síndrome metabólico (MetS), obesidad, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensión, diabetes de tipo 2, diabetes distinta de tipo 2, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria latente (LAD), diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY) y envejecimiento y enfermedades relacionadas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y ELA.

A. Anticuerpos anti-KLB ejemplares

En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a una proteína KLB. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-KLB de la presente divulgación se une al dominio C terminal de KLB. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-KLB de la presente divulgación se une a un fragmento de KLB que comprende la secuencia de aminoácidos

SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYrTAS (SEQ ID NO: 142). En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-KLB, por ejemplo, 8C5, descrito en el presente documento.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-KLB de la presente divulgación comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, por ejemplo, 12 o 15; (b) HVR-H2, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 16-31, por ejemplo, 28 o 31; (c) HVR-H3, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 32-47, por ejemplo, 44 o 47; (d) HVR-L1, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 48-62, por ejemplo, 49 o 62; (e) HVR-L2, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 63-78, por ejemplo, 75 o 78; y (f) HVR-L3, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 79-93, por ejemplo, 90 o 93.

En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-KLB que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2, que comprende la SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3, que comprende la SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1, que comprende la SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2, que comprende la SEQ ID NO: 75; y (f) HVR-L3, que comprende la SEQ ID NO: 90. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-KLB que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, que comprende la SEQ ID NO 31; (c) HVR-H3, que comprende la SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1, que comprende la SEQ ID NO 62; (e) HVR-L2, que comprende la s Eq ID NO: 78; y (f) HVR-L3, que comprende la SEQ ID NO: 93.

La presente divulgación proporciona además un anticuerpo anti-KLB que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128. En determinados aspectos de la divulgación, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se divulga a continuación), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-KLB que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a KLB. En determinados aspectos de la divulgación, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 128. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). De forma alternativa o adicionalmente, el anticuerpo anti-KLB comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 128, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia como se divulga a continuación. En determinados aspectos de la divulgación, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-KLB, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130. En determinados aspectos de la divulgación, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-KLB que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a KLB. En determinados aspectos de la divulgación, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 130. En determinados aspectos de la divulgación, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). De forma alternativa o adicionalmente, el anticuerpo anti-KLB comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 130, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En determinados aspectos de la divulgación, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (b) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; y (c) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93.

La presente divulgación proporciona además un anticuerpo anti-KLB, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 130, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-KLB se une a un fragmento de KLB que consiste en la secuencia de aminoácidos

SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYrTAS (SEQ ID NO: 142).

B. Anticuerpos anti-FGFRI ejemplares

En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a una proteína FGFR1. En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-FGFR1 de la presente divulgación se une a FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-FGFR1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la SEQ ID NO: 136; (b) HVR-H2, que comprende la SEQ ID NO: 137; (c) HVR-H3, que comprende la SEQ ID NO: 138; (d) HVR-L1, que comprende la SEQ ID NO: 139; (e) HVR-L2, que comprende la SEQ ID NO: 140; y (f) HVR-L3, que comprende la SEQ ID NO: 141.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-FGFR1 de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132. En determinados aspectos de la divulgación, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR1 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a FGFR1. En determinados aspectos de la divulgación, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 132. En determinados aspectos de la divulgación, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). De forma alternativa o adicionalmente, el anticuerpo anti-FGFR1 comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 132, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En determinados aspectos de la divulgación, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, y (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138.

La presente divulgación proporciona además un anticuerpo anti-FGFR1, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En determinados aspectos de la divulgación, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR1 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a FGFR1. En determinados aspectos de la divulgación, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 134. En determinados aspectos de la divulgación, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). De forma alternativa o adicionalmente, el anticuerpo anti-FGFR1 comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 134, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un aspecto particular de la divulgación, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139; (b) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140; y (c) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 141.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR1, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En determinados modos de realización, el anticuerpo anti-FGFR1 comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 134, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo frente a FGFR1 de la presente divulgación se une a un fragmento de FGFRIc que consiste en la secuencia de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) o FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

C. Anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFRI ejemplares

La presente divulgación proporciona además anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a KLB como a FGFR1 (es decir, anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1). Un anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión diferentes, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.922.845 y 5.837.243; Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246-1252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54; Keler (1997) Cáncer Res.

57:4008-4014. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la materia objeto divulgada actualmente proporciona anticuerpos biespecíficos que tienen un sitio de unión (por ejemplo, un sitio de unión a antígeno) para un primer epítopo presente en KLB y un segundo sitio de unión para un segundo epítopo presente en FGFR1. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo donde un brazo se une a KLB y comprende cualquiera de las secuencias de anticuerpo anti-KLB descritas en el presente documento y el segundo brazo se une a FGFR1 y comprende cualquiera de las secuencias de anticuerpo anti-FGFR1 descritas en el presente documento. En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación tiene un sitio de unión para un primer epítopo presente en KLB y un segundo sitio de unión para un segundo epítopo presente en FGFR1c.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado en el presente documento se refiere a un anticuerpo que modula la actividad del complejo KLB/FGFR1c. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 biespecífico puede funcionar como agonista y activar el complejo KLB/FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 es un anticuerpo que incrementa la actividad del complejo KLB/FGFR1c en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 %. En determinados aspectos de la divulgación, el anti-KLB/anti-FGFR1 biespecífico puede ser un anticuerpo que dé como resultado la fosforilación de las dianas en dirección 3' del complejo K^lB/FGFR1^c, por ejemplo, MAPK y/o ERK.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado en el presente documento se refiere a un anticuerpo que modula la actividad del complejo KLB/FGFR1c y no bloquea la interacción y/o unión de los ligandos de FGF natural, por ejemplo, FGF19 y FGF21, al complejo KLB/FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado en el presente documento se refiere a un anticuerpo que no bloquea la actividad y/o unión de ligandos de FGF natural a un receptor de FGF en ausencia de KLB. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación no bloquea la interacción de los ligandos de FGF natural con el complejo FGFR1/KLA y/o FGFR1 solo. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado en el presente documento se refiere a un anticuerpo que no bloquea la actividad y/o unión de ligandos de FGF natural a KLB en ausencia de FGFR1. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación no bloquea la interacción de los ligandos de FGF natural con el complejo FGFR4/KLB, el complejo FGFR2c/KLB y/o el complejo FGFR3c/KLB.

En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c, o una porción de unión a antígeno del mismo, incluye una región de la cadena pesada y de la cadena ligera. En determinados aspectos de la divulgación, la cadena pesada de longitud completa incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 129. En determinados aspectos de la divulgación, la cadena ligera de longitud completa incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 131. En determinados modos de realización, la cadena pesada de longitud completa incluye aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 129. En determinados modos de realización, la cadena ligera de longitud completa incluye aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 131.

En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c, o una porción de unión a antígeno del mismo, incluye una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. En determinados aspectos de la divulgación, la región variable de la cadena pesada incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 128. En determinados aspectos de la divulgación, la región variable de la cadena ligera incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 130. En determinados modos de realización, la región variable de la cadena pesada incluye aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 128. En determinados modos de realización, la región variable de la cadena ligera incluye aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 130.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, por ejemplo, 12 o 15; (b) HVR-H2, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 16-31, por ejemplo, 28 o 31; (c) HVR-H3, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 32-47, por ejemplo, 44 o 47; (d) HVR-L1, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 48-62, por ejemplo, 49 o 62; (e) HVR-L2, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 63-78, por ejemplo, 75 o 78; y (f) HVR-L3, que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 79-93, por ejemplo, 90 o 93.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c, comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2, que comprende la SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3, que comprende la SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1, que comprende la SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2, que comprende la SEQ ID NO: 75; y (f) HVR-L3, que comprende la SEQ ID NO: 90. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-KLB que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, que comprende la SEQ ID NO: 31; (c) HVR-H3, que comprende la SEQ iD NO: 47; (d) HVR-L1, que comprende la s Eq ID NO: 62; (e) HVR-L2, que comprende la SEQ ID NO: 78; y (f) HVR-L3, que comprende la SEQ ID NO: 93.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c, incluye una región variable de la cadena pesada que comprende dominios con CDR1, CDR2 y CDR3, y una región variable de la cadena ligera que comprende dominios con CDR1, CDR2 y CDR3. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR1 de la región variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1-15. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR2 de la región variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 16-31. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR3 de la región variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 32-47. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR1 de la región variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 48-62. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR2 de la región variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 63-78. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR3 de la región variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 79-93.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c, incluye una región variable de la cadena pesada que comprende dominios con CDR1, CDR2 y CDR3, y una región variable de la cadena ligera que comprende dominios con CDR1, CDR2 y CDR3. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR1 de la región variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1-15. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR2 de la región variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 16-31. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR3 de la región variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 32-47. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR1 de la región variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 48-62. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR2 de la región variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 63-78. En determinados aspectos de la divulgación, el dominio con CDR3 de la región variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 79-93.

En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c, incluye una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 15; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 31; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 47; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 62; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 78; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 93.

En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 incluye un primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, e incluye un segundo anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, donde el primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo presente en KLB, y el segundo anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo presente en FGFR1, por ejemplo, FGFR1c. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, puede incluir una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera; y el segundo anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, puede incluir una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. En determinados aspectos de la divulgación, la región variable de la cadena pesada del primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 128. En determinados aspectos de la divulgación, la región variable de la cadena ligera del primer anticuerpo, o porciones de unión a antígeno del mismo, incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 130. En determinados aspectos de la divulgación, la región variable de la cadena pesada del segundo anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 132. En determinados aspectos de la divulgación, la región variable de la cadena ligera del segundo anticuerpo, o porciones de unión a antígeno del mismo, incluye aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 134.

En determinados aspectos de la divulgación, en el presente documento se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-KLB. Por ejemplo, en determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-KLB que comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 128 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 130. En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une a un fragmento de KLB que consiste en la secuencia de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).

En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une a un fragmento de KLB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 142.

En determinados aspectos de la divulgación, en el presente documento se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-KLB. Por ejemplo, en determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-KLB que comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa de SEQ ID NO: 129 y una secuencia de cadena ligera de longitud completa de SEQ ID NO: 131.

En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-FGFR1 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, en determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-FGFR1 que comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 132 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 134. En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une a un fragmento de FGFRIc que comprende la secuencia de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) o FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-FGFR1 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, en determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFRI que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-FGFR1 que comprende la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 133 y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 135.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación se une a un fragmento de FGFR1c que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 143.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación se une a un fragmento de FGFR1c que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 144.

En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une a un fragmento de KLB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 142, y se une a un fragmento de FGFR1c que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 143 o 144.

En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se une a un fragmento de KLB que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 142 y se une a un fragmento de FGFR1c que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 143 o 144.

1. Afinidad del anticuerpo

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación puede tener una constante de disociación (Kd) de < 1 M, < 100 mM, < 10 mM, < 1 mM, < 100 |jM, < 10 |jM, < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación puede tener una Kd de aproximadamente 10-3 o menos, o 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 puede incluir un brazo anti-FGFR1 que tenga una Kd de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 ^jiM. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 con un brazo para FGFR1 que tiene una baja afinidad puede mitigar el riesgo de que el anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 se una estrechamente a FGFR1 en ausencia de KLB y prevenga la unión y/o activación de FGFR1 por otros ligandos de FGF, tales como, pero sin limitarse a, FGF1, FGF2, FGF8 y FGF23. En determinados aspectos de la divulgación, un brazo para FGFR1 con baja afinidad puede permitir la presencia de mayores niveles de impurezas de anti-FGFR1, tales como, pero sin limitarse a, semianticuerpos botón anti-FGFR1, dímeros de anti-FGFR1 no covalentes, dímeros de anti-FGFR1 covalentes y especies de peso molecular alto, sin dar como resultado efectos secundarios clínicamente significativos. Por ejemplo, en determinados aspectos de la divulgación, aproximadamente un 2 % de especies de peso molecular alto y un 1,5 % de semianticuerpo anti-FGFR1 pueden estar presentes en una preparación de un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación sin dar como resultado efectos biológicos adversos.

En determinados aspectos de la divulgación, se puede medir la Kd por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En determinados aspectos de la divulgación, se puede realizar un RIA con una versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, y no a modo de limitación, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando, a continuación, el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol.

293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). A continuación, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se hayan secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que den menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

En determinados aspectos de la divulgación, se puede medir la Kd usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial en BIACORE®. Por ejemplo, y no a modo de limitación, se realiza un ensayo usando un BiAc ORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips Cm 5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En determinados aspectos de la divulgación, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, Biacore, Inc.) con clorhidrato de N-et¡l-W-(3-d¡met¡laminoprop¡l)-carbod¡¡m¡da (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 |jg/ml (~0,2 |jM) antes de su inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie en dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 |jl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kd¡s) usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se puede calcular como la proporción kd¡s/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación sobrepasa 106 M'1 s_1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Fragmentos de anticuerpo

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de ^eE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un diacuerpo. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161;

Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo de dominio único. Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

3. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados modos de realización, un anticuerpo de la presente divulgación es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo quimérico de la presente divulgación comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo "con clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase de la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico de la presente divulgación puede ser un anticuerpo humanizado. Típicamente, se humaniza un anticuerpo no humano para reducir la inmunogenicidad con respecto a los seres humanos, mientras que se retienen la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En determinados aspectos de la divulgación, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de la región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "barajado de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el barajado de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la estirpe germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

4. Anticuerpos humanos

En determinados modos de realización, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se haya modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena, en general, se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429, que describe la tecnología HUMAB®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®. Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas de células de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias del dominio variable del clon de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias del dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

5. Anticuerpos derivados de colecciones

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden aislar cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). En determinados aspectos de la divulgación, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos de genes V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contengan secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos con anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

6. Anticuerpos multiespecíficos

En determinados modos de realización, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. En determinados aspectos de la divulgación, una de las especificidades de unión es para un epítopo presente en KLB y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinados aspectos de la divulgación, una de las especificidades de unión es para un epítopo presente en FGFR1 y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico de la presente divulgación se puede unir a un epítopo en KLB y se puede unir a un epítopo en FGFR1. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico de la presente divulgación se puede unir a un epítopo en KLB y se puede unir a un epítopo en FGFR1c. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tengan diferentes especificidades (véanse Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), el documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas en Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

7. Variantes de anticuerpo

La materia objeto divulgada actualmente proporciona además variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos divulgados. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que el anticuerpo final, es decir, modificado, posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados aspectos de la divulgación, las variantes de anticuerpo pueden tener una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Los ejemplos no limitantes de sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan ejemplos no limitantes de cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejoradas.

Tabla 1

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

En determinados aspectos de la divulgación, las sustituciones no conservadoras pueden conllevar intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

En determinados aspectos de la divulgación, un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano. En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrá(n) modificaciones, por ejemplo, mejoras, en determinadas propiedades biológicas, tales como, pero sin limitarse a, afinidad, incrementada, inmunogenicidad reducida en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) retenido sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Un ejemplo no limitante de una variante de sustitución es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración en afinidad basadas en presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fago y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, la afinidad de unión).

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de ^hV^r, es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o residuos que se ponen en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración en afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En determinados aspectos de la divulgación de la maduración en afinidad, se puede introducir diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, barajado de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado por barrido de alanina. A menudo se seleccionan como diana, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) en las HVR que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados aspectos de la divulgación de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar como diana para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se remplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones aminoacídicas que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos se pueden seleccionar como diana o eliminar como candidatos para la sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amínico y/o carboxílico que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, tratamiento enzimático con profármaco dirigido por anticuerpos (ADEPT)) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.

b) Variantes de glucosilación

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación se puede alterar para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o retire uno o más sitios de glucosilación.

En determinados aspectos de la divulgación, cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato fijado a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija, en general, por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En determinados aspectos de la divulgación, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la presente divulgación para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 65 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 % y valores intermedios.

En determinados aspectos de la divulgación, la cantidad de fucosa se puede determinar calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras fijadas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración Eu de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004).

Se pueden producir anticuerpos desfucosilados en cualquier línea celular que sea carente de fucosilación de proteínas. Los ejemplos no limitantes de líneas celulares incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); la sol. de pat. de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento W o 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con desactivación génica, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con desactivación génica (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpo con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Se describen ejemplos no limitantes de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

c) Variantes de la región Fc

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando, de este modo, una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprenda una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.

En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, que le convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo sea importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) sean innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carezca de unión a F^cyR (de ahí que probablemente carezca de actividad ADCC), pero retenga su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc.

Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivo (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CYTOTOX 96® (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y, de ahí, que carezca de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos ^wO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar la unión a FcRn y determinaciones del aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)). En determinados aspectos de la divulgación, se realizan alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o bien disminuidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

En determinados aspectos de la divulgación, una variante de anticuerpo de la presente divulgación comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).

En determinados aspectos de la divulgación, la alteración realizada en la región Fc de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, divulgado en el presente documento, puede producir un anticuerpo variante con una semivida incrementada y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).

Véanse también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de EE. UU. n.° 5.648.260; la patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.

d) Variantes de anticuerpo genomanipulado con cisteína

En determinados aspectos de la divulgación, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En aspectos particulares de la divulgación, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc con las cadenas pesadas. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.

e) Derivados de anticuerpo

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación se puede modificar además para que contenga motivos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar, y, si se fija más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones, que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, independientemente de si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a la radiación. En un aspecto de la divulgación, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). En determinados aspectos de la divulgación, la radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan el resto no proteínico a una temperatura en la que se destruyen las células proximales al anticuerpo-resto no proteínico.

D. Procedimientos de producción de anticuerpos

Los anticuerpos divulgados en el presente documento se pueden producir usando cualquier técnica disponible o conocida en la técnica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los anticuerpos se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. Los procedimientos detallados para generar anticuerpos se describen en los ejemplos a continuación.

La materia objeto divulgada actualmente proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo divulgado en el presente documento. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar una secuencia de aminoácidos que incluya el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprenda el VH del anticuerpo, por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo. En determinados modos de realización, el ácido nucleico aislado puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifique una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 128, y/o una secuencia de nucleótidos que codifique una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 130.

En determinados aspectos de la divulgación, el ácido nucleico puede estar presente en uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión. Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, donde se pueden fijar segmentos de ADN adicionales al genoma vírico. Determinados vectores se pueden replicar de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y, de este modo, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores, vectores de expresión, pueden dirigir la expresión de los genes a los que se enlazan de forma funcional. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están, a menudo, en forma de plásmidos (vectores). Sin embargo, se pretende que la materia objeto divulgada incluya dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en la replicación) que desempeñan funciones equivalentes.

En determinados aspectos de la divulgación, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la presente divulgación y/o los uno o más vectores que incluyen el ácido nucleico se puede introducir en una célula huésped. En determinados aspectos de la divulgación, la introducción de un ácido nucleico en una célula se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento conocido en la técnica que incluye, pero sin limitarse a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. En determinados aspectos de la divulgación, una célula huésped puede incluir, por ejemplo, se ha transformada con: (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En determinados aspectos de la divulgación, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).

En determinados modos de realización, los procedimientos de preparación de un anticuerpo anti-KLB o anti-FGFRIc pueden incluir cultivar una célula huésped, en la que se ha introducido un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped y/o del medio de cultivo de célula huésped. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se recupera de la célula huésped a través de técnicas de cromatografía.

Para la producción recombinante de un anticuerpo de la presente divulgación, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se puede aislar e insertar en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se puedan unir específicamente a genes que codifiquen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan ni glucosilación ni función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de su expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos y levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras en las que sus vías de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se pueden derivar de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

En determinados aspectos de la divulgación, los cultivos de células vegetales se pueden utilizar como células huésped. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

En determinados aspectos de la divulgación, las células de vertebrado también se pueden usar como huéspedes. Por ejemplo, y no a modo de limitación, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adapten a su cultivo en suspensión. Los ejemplos no limitantes de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293, como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A): células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TR1, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

En determinados aspectos de la divulgación, las técnicas para preparar anticuerpos biespecíficos y/o multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tengan diferentes especificidades (véanse Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), la solicitud de patente PCT n.° WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos biespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas en Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente divulgación también se pueden preparar usando técnicas químicas (véanse, por ejemplo, Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), técnicas de "polidoma" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 4.474.893) o técnicas de ADN recombinante. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la materia objeto divulgada actualmente también se pueden preparar conjugando las especificidades de unión para los constituyentes, por ejemplo, especificidades de unión para un primer epítopo y para un segundo epítopo, usando procedimientos conocidos en la técnica y como se describe en el presente documento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica y multiespecífica se puede generar por separado y, a continuación, conjugar entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos no limitantes de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véanse, por ejemplo, Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 82:8648). Otros procedimientos incluyen los descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985), n.° 78, 118-132; Brennan (1985) Science 229:81-83), Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Cuando las especificidades de unión son anticuerpos (por ejemplo, dos anticuerpos humanizados), se pueden conjugar por medio de enlaces sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En determinados aspectos de la divulgación, la región bisagra se puede modificar para que contenga un número impar de residuos de sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

En determinados aspectos de la divulgación, ambas especificidades de unión de un anticuerpo biespecífico se pueden codificar en el mismo vector y expresar y ensamblar en la misma célula huésped. Este procedimiento es, en particular, útil cuando la molécula biespecífica y multiespecífica es una proteína de fusión MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico de la presente divulgación puede ser una molécula monocatenaria, tal como un anticuerpo biespecífico monocatenario, una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda un anticuerpo monocatenario y un determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas también pueden ser moléculas monocatenarias o pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los procedimientos para preparar moléculas bi- y multiespecíficas se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.260.203; patente de EE. UU. n.° 5.455.030; patente de EE. UU. n.° 4.881.175; patente de EE. UU. n.° 5.132.405; patente de EE. UU. n.° 5.091.513; patente de EE. UU. n.° 5.476.786; patente de EE. UU. n.° 5.013.653; patente de EE. UU. n.° 5.258.498; y patente de EE. UU. n.° 5.482.858. Los anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales (por ejemplo, sitios de unión a epítopo), incluyendo los "anticuerpos pulpo", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

La presente divulgación proporciona además anticuerpos triespecíficos, por ejemplo, trifuncionales. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo triespecífico de la presente divulgación se puede unir a y/o interactuar con un epítopo presente en KLB, un epítopo presente en FGFR1 y un epítopo o antígeno presente en una tercera proteína, tal como, pero sin limitarse a, PCSK9, GCGR, AdipoR, ZnT8, ApoL1, MSTN, InsR o FABP4.

En determinados aspectos de la divulgación, se puede usar un sistema animal para producir un anticuerpo de la presente divulgación. Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para su fusión son conocidos en la técnica. También son conocidos compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).

E. Ensayos

Los anticuerpos de la presente divulgación proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica y proporcionados en el presente documento.

1. Ensayos de unión y otros ensayos

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación se puede someter a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno por procedimientos conocidos, tales como ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un radioinmunoanálisis (RIA) o un ensayo de inmunoelectrotransferencia. Cada uno de estos ensayos, en general, detecta la presencia de complejos proteína-anticuerpo de particular interés empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos KLB-anticuerpo se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconozca y se una específicamente a los complejos anticuerpo-KLB. De forma alternativa, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar de forma radioactiva y usar en un radioinmunoanálisis (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo, 1986). El isótopo radioactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador Geiger o un contador de centelleo o por autorradiografía.

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compita con un anticuerpo anti-KLB de la presente divulgación, por ejemplo, 12A11 u 8C5, en cuanto a su unión a KLB. En determinados aspectos de la divulgación, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que está unido por 12A11 o 8C5. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

En un ejemplo no limitante de un ensayo de competencia, el KLB inmovilizado se puede incubar en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a KLB (por ejemplo, 12A11 o 8C5) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo en cuanto a su unión a KLB. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba KLB inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de su incubación, en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a KLB, se retira el anticuerpo no unido en exceso y se mide la cantidad de marcador asociado con KLB inmovilizado. Si se reduce sustancialmente la cantidad de marcador asociado con KLB inmovilizado en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo en cuanto a su unión a KLB. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Ensayos de actividad

La presente divulgación proporciona ensayos para identificar anticuerpos anti-KLB de los mismos que tengan actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, activar un complejo de receptores KLB/FGFR1c. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro. En determinados aspectos de la divulgación, los ensayos pueden incluir unir anticuerpos de la presente divulgación a células, por ejemplo, células 293T que expresan KLB, y analizar la actividad y/o estados de fosforilación de una o más dianas en dirección 3' del complejo de receptores KLB-FGFR1c, por ejemplo, ERK. En determinados aspectos de la divulgación, el ensayo puede incluir la administración de un anticuerpo de la presente divulgación a un sujeto, por ejemplo, un animal no humano, y el análisis del efecto que tiene el anticuerpo sobre el nivel de glucosa en el sujeto.

F. Inmunoconjugados

La materia objeto divulgada actualmente proporciona además inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo, divulgado en el presente documento, conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión a antígeno de la materia objeto divulgada se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más de otras moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión.

En determinados aspectos de la divulgación, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo, pero sin limitarse a, un maitansinoide (véanse las patentes de e E. UU. n.os 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0425235); una auristatina, tal como los restos de fármaco de monometilauristatina DE y d F (MMAE y MMAF) (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., CancerRes. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina, tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En determinados aspectos de la divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En determinados aspectos de la divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Está disponible una variedad de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos no limitantes incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, puede incluir un átomo radioactivo para estudios de centellografía, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Se pueden preparar conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contenga disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).

Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).

111. Procedimientos de uso

La materia objeto divulgada actualmente proporciona además procedimientos para usar los anticuerpos divulgados, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, los procedimientos están dirigidos a usos terapéuticos de los anticuerpos divulgados actualmente. En determinados aspectos de la divulgación, los procedimientos están dirigidos al uso de los anticuerpos divulgados en procedimientos de diagnóstico.

A. Procedimientos de diagnóstico y detección

En determinados aspectos de la divulgación, cualquier anticuerpo divulgado en el presente documento que tenga especificidad por KLB, por ejemplo, un anticuerpo anti-KLB y/o un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, divulgado anteriormente, puede ser útil para detectar la presencia de KLB en una muestra biológica. En otro aspecto, la materia objeto divulgada actualmente proporciona procedimientos para diagnosticar y/o detectar una enfermedad usando un anticuerpo anti-KLB o un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, divulgado en el presente documento. El término "detectar", como se usa en el presente documento, engloba la detección cuantitativa y/o cualitativa.

En determinados aspectos no limitantes de la divulgación, una muestra biológica incluye, pero no se limita a, una muestra clínica, una o más células, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares y muestras de tejido. La fuente de la muestra puede ser un tejido sólido (por ejemplo, de un órgano recién extraído, congelado y/o conservado, una muestra de tejido, biopsia o aspirado) o células del individuo. En determinados aspectos de la divulgación, una muestra biológica puede incluir una o más células y/o tejido de un hígado, por ejemplo, de un hígado de un sujeto.

En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo anti-KLB para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de KLB en una muestra biológica. En determinados aspectos de la divulgación, el procedimiento de diagnóstico o detección incluye poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que se une a un epítopo presente en KLB, como se describe en el presente documento, en condiciones que permitan la unión del anticuerpo a KLB, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo y KLB. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo, por ejemplo, inmunofluorescencia o inmunoelectrotransferencia. En determinados aspectos de la divulgación, se usa un anticuerpo anti-KLB para seleccionar sujetos idóneos para el tratamiento con un anticuerpo anti-KLB, por ejemplo, donde KLB es un biomarcador para la selección de pacientes.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para su uso en los procedimientos divulgados, no tiene un impacto significativo en el hígado, por ejemplo, en la función hepática. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no modula la actividad de un complejo de receptores FGFR/KLB en el hígado en comparación con la modulación de un complejo de receptores FGFR/KLB en el hígado por una proteína FGF21. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no da como resultado la inhibición del complejo FGFR4/KLB y/o no da como resultado la elevación de enzimas hepáticas, tales como, pero sin limitarse a, ALT, AST, ALP y GLD^h. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no funciona como agonista del complejo FGFR2c/KLB y/o del complejo FGFR3c/KLB en el hígado, lo que puede dar lugar a la señalización de MAPK activada y/o expresión alterada de Spry4 y Dusp6 en el hígado. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no da como resultado la activación de la señalización de MAPK en el hígado en comparación con la activación de la señalización de MAPK por una proteína FGF21. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación no funciona como agonista del complejo FGFR4/KLB en el hígado.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para su uso en los procedimientos divulgados, incluye anticuerpos que no bloquean la unión y/o interacción de los ligandos de FGF, por ejemplo, FGF19 y FGF21, al complejo ^kL^b/FGFR1^c. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado en el presente documento se refiere a un anticuerpo que modula la actividad del complejo KLB/FGFR1c y no bloquea la interacción y/o unión de los ligandos de FGF natural, por ejemplo, FGF19 y FGF21, al complejo KLB/FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado en el presente documento se refiere a un anticuerpo que no bloquea la unión y/o actividad de los ligandos de FGF natural a un receptor de FGF en ausencia de KLB. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación no bloquea la interacción de los ligandos de FGF natural con el complejo FGFR1/KLA o FGFR1 solo. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado en el presente documento se refiere a un anticuerpo que no bloquea la unión y/o actividad de ligandos de FGF natural a KLB en ausencia de FGFR1. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 de la presente divulgación no bloquea la interacción de los ligandos de FGF natural con el complejo FGFR4/KLB, el complejo FGFR2c/KLB y/o el complejo FGFR3c/KLB.

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden marcar anticuerpos anti-KLB, anti-FGFR1c y/o anti-KLB/anti-FGFR1, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1c, para su uso en los procedimientos divulgados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente, tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos, así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los ejemplos no limitantes de marcadores incluyen los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (véase la patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

B. Procedimientos terapéuticos

En determinados modos de realización, se pueden usar uno o más anticuerpos de la materia objeto divulgada actualmente para tratar una enfermedad y/o trastorno en un sujeto. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, la enfermedad puede ser un trastorno metabólico. Los ejemplos no limitantes de trastornos metabólicos incluyen síndrome del ovario poliquístico (SOP), síndrome metabólico (MetS), obesidad, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensión, diabetes de tipo 2, diabetes distinta de tipo 2, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria latente (LAD) y diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY). En determinados modos de realización, el trastorno metabólico es diabetes de tipo 2. En determinados modos de realización, el trastorno metabólico es obesidad.

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden usar uno o más anticuerpos de la materia objeto divulgada actualmente para tratar el síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Alstrom, síndrome de Cohen, osteodistrofia hereditaria de Albright (pseudohipoparatiroidismo), síndrome de Carpenter, síndrome de MOMO, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome del cromosoma X frágil y síndrome de Borjeson-Forssman-Lehman. En determinados aspectos de la divulgación, se pueden usar uno o más anticuerpos de la materia objeto divulgada actualmente para tratar el envejecimiento y enfermedades relacionadas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y ELA.

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden usar uno o más anticuerpos de la materia objeto divulgada actualmente para tratar una cardiopatía, apoplejía, ataques cardíacos, hiperinsulinemia, tensión arterial alta, arteriopatía coronaria, migrañas o cefaleas directamente relacionados con la obesidad o hipertensión craneal, insuficiencia cardíaca congestiva, neoplasia, dislipidemia, anemia, colecistopatía, artrosis, artritis degenerativa, discopatía degenerativa, artropatía degenerativa, artroplastia, artropatía degenerativa acelerada, asma, neumonía recurrente, pleuritis recurrente, bronquitis recurrente, restricción pulmonar, reflujo gastroesofágico (RGE), exceso de vello facial y corporal (hirsutismo), erupciones cutáneas, infecciones crónicas de la piel, sudoración excesiva, candidiasis frecuentes, incontinencia urinaria de esfuerzo, desarreglos menstruales, anomalías hormonales, ovarios poliquísticos, infertilidad, carcinoma (por ejemplo, de mama, colon y cáncer de útero), apnea del sueño, pseudotumor cerebral, depresión, disfunción psicológica/sexual, discriminación social y muerte prematura.

En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno metabólico, por ejemplo, SOP, MetS, obesidad, NASH, NAFLD, hiperlipidemia, hipertensión, diabetes de tipo 2, diabetes distinta de tipo 2, diabetes de tipo 1, LAD, MODY y envejecimiento y enfermedades relacionadas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y ELA, que incluye administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo, divulgado en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/FGFR1, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno descrito anteriormente, que incluye administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo.

En determinados modos de realización, el procedimiento puede incluir además administrar al sujeto de una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. Se describen a continuación ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un segundo agente terapéutico.

En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona además un procedimiento para inducir la pérdida de peso que comprende administrar a un individuo una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la presente divulgación, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/FGFR1.

Un "individuo", "paciente" o "sujeto", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados aspectos de la divulgación, el individuo o sujeto es un ser humano.

La materia objeto divulgada actualmente proporciona además un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para su uso en la activación de un complejo de correceptores KLB/FGFR1c, por ejemplo, en un sujeto. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 puede ser un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para su uso en un procedimiento de activación de un complejo de correceptores KLB/FGFR1c en un sujeto. En determinados aspectos de la divulgación, el procedimiento incluye administrar al sujeto un anticuerpo eficaz para activar un complejo de receptores KLB/FGFR1c.

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un anticuerpo de la presente divulgación se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. En determinados aspectos de la divulgación, el segundo agente terapéutico o adicional puede incluir un agente antidiabético, un agente antiobesidad o un medicamento para afecciones metabólicas, tal como, pero sin limitarse a, medicamentos antihipertensivos y estatinas. Los ejemplos no limitantes de un segundo agente terapéutico o adicional incluyen metformina, pioglitazona, DPP4i, análogos de GLP1, sulfonilurea, insulina, análogos de leptina y lorcaserina (por ejemplo, BELVIQ®).

La presente divulgación proporciona además el uso de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, en la fabricación o preparación de un medicamento. En determinados aspectos de la divulgación, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno metabólico, como se divulga anteriormente. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona el uso de un anticuerpo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad. En determinados aspectos de la divulgación, la presente divulgación proporciona el uso de un anticuerpo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, el medicamento es para activar un complejo de correceptores KLB/FGFR1c. En determinados aspectos de la divulgación, el medicamento se puede usar en un procedimiento de activación de un complejo de correceptores KLB/FGFR1c en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad del medicamento eficaz para activar un complejo de receptores KLB/FGFR1c.

En determinados modos de realización, un anticuerpo para su uso en los procedimientos terapéuticos divulgados puede estar presente en una composición farmacéutica. En determinados modos de realización, la composición farmacéutica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la composición farmacéutica puede incluir uno o más de los anticuerpos de la presente divulgación.

Adicionalmente o de forma alternativa, la composición farmacéutica puede incluir un segundo agente terapéutico. Cuando uno o más de los anticuerpos divulgados se administran con otro agente terapéutico, los uno o más anticuerpos y el otro agente terapéutico se pueden administrar en cualquier orden o simultáneamente. Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, caso en que la administración del anticuerpo de la presente divulgación se puede producir antes de, simultáneamente a y/o tras la administración del agente o agentes terapéutico(s) adicional(es). En un aspecto de la divulgación, la administración de un anticuerpo de la presente divulgación y la administración de un agente terapéutico adicional se producen dentro de aproximadamente un mes, o dentro de aproximadamente una, dos o tres semanas, o dentro de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí.

Un anticuerpo de la presente divulgación (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo, en parte, de si la administración es breve o prolongada. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

Los anticuerpos de la presente divulgación se formularán, dosificarán y administrarán de una forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos de cabecera. No es necesario, pero el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y por las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la presente divulgación (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y evolución de la enfermedad, ya sea si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, del tratamiento previo, de la anamnesis del paciente y de la respuesta al anticuerpo y del criterio del médico especialista. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación se puede administrar según sea necesario. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se puede administrar al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, el anticuerpo y/o formulación farmacéutica contiene un anticuerpo, como se divulga en el presente documento, que se puede administrar a un sujeto dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o una vez al año.

En determinados aspectos de la divulgación, dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En determinados aspectos de la divulgación, la dosificación diaria puede ser mayor de aproximadamente 100 mg/kg. En determinados aspectos de la divulgación, la dosificación se puede ajustar para lograr una concentración de anticuerpos en plasma de 1-1000 jg/m l y, en algunos procedimientos, de 25-300 jg/ml.

Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se podría mantener, en general, hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En determinados aspectos divulgación, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). De forma alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación mantenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia pueden variar en base a la semivida del anticuerpo en el paciente. En determinados aspectos de la divulgación, dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo).

Se puede administrar una mayor dosis de carga inicial, seguido de una o más dosis menores.

En determinados aspectos de la divulgación, el procedimiento puede incluir además supervisar al sujeto y determinar la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, el progreso de este tratamiento se puede supervisar fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

IV. Formulaciones farmacéuticas

La materia objeto divulgada actualmente proporciona además formulaciones farmacéuticas que contienen uno o más anticuerpos, como se describe en el presente documento, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones farmacéuticas pueden incluir una combinación de múltiples (por ejemplo, dos o más) anticuerpos y/o porciones de unión a antígeno de los mismos de la materia objeto divulgada actualmente. En determinados aspectos de la divulgación, una composición farmacéutica de la presente divulgación puede incluir uno o más anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1.

En determinados modos de realización, las formulaciones farmacéuticas divulgadas se pueden preparar combinando un anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, las formulaciones de anticuerpo liofilizadas se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. En determinados aspectos de la divulgación, las formulaciones de anticuerpo acuosas pueden incluir las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.

En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo puede tener una pureza mayor de aproximadamente un 80 %, mayor de aproximadamente un 90 %, mayor de aproximadamente un 91 %, mayor de aproximadamente un 92 %, mayor de aproximadamente un 93 %, mayor de aproximadamente un 94 %, mayor de aproximadamente un 95 %, mayor de aproximadamente un 96 %, mayor de aproximadamente un 97 %, mayor de aproximadamente un 98 %, mayor de aproximadamente un 99 %, mayor de aproximadamente un 99,1 %, mayor de aproximadamente un 99,2 %, mayor de aproximadamente un 99,3 %, mayor de aproximadamente un 99,4 %, mayor de aproximadamente un 99,5 %, mayor de aproximadamente un 99,6 %, mayor de aproximadamente un 99,7 %, mayor de aproximadamente un 99,8 % o mayor de aproximadamente un 99,9 %.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol;

3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; glúcidos, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión intersticial de fármacos, tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

El vehículo puede ser adecuado para su administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, raquídea o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, se puede recubrir de un material para proteger al compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también se pueden administrar en politerapia, es decir, combinadas con otros agentes. En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también pueden contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, por ejemplo, aquellos con actividades complementarias que no se vean afectados de forma adversa entre sí. En determinados modos de realización, la formulación farmacéutica puede incluir un segundo ingrediente activo para tratar la misma enfermedad tratada por el primer agente terapéutico. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la formulación de la presente divulgación también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectados de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un segundo agente terapéutico útil para el tratamiento de la misma enfermedad. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Una composición de la presente divulgación se puede administrar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. La vía y/o modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protejan al compuesto frente a la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones se describen, por ejemplo, por Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones farmacéuticas se fabrican en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.

También se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida que contengan un anticuerpo divulgado. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En determinados aspectos de la divulgación, los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Para administrar un anticuerpo de la presente divulgación por determinadas vías de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones de CGF de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación en el momento de uso de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles, sustancialmente isotónicas y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando uno o más anticuerpos divulgados en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido de microfiltración de esterilización, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son el secado a vacío y la criodesecación (liofilización), que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada de forma estéril del mismo.

Las composiciones terapéuticas también se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición terapéutica de la presente divulgación se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos divulgados, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos útiles en la presente divulgación incluyen: la patente de EE. UU. n.° 4.487.603, que divulga una bomba de microinfusión implantable para distribuir medicamento a una tasa controlada; la patente de EE. UU. n.° 4.486.194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente de EE. UU. n.° 4.447.233, que divulga una bomba de infusión de medicamento para administrar medicamento a una tasa de infusión precisa; la patente de EE. UU. n.° 4.447.224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; la patente de EE. UU. n.° 4.439.196, que divulga un sistema osmótico de administración de fármaco que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la patente de EE. UU. n.° 4.475.196, que divulga un sistema osmótico de administración de fármaco. Son conocidos muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo.

Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones de la presente divulgación incluyen aquellas adecuadas para su administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de anticuerpo, que se puede combinar con un material vehículo para producir una forma farmacéutica única, varía dependiendo del sujeto que se trata y el modo de administración particular. La cantidad del anticuerpo que se puede combinar con un material vehículo para producir una forma farmacéutica única, en general, es la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, de un cien por ciento, esta cantidad varía de aproximadamente un 0,01 por ciento a aproximadamente un noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, de aproximadamente un 0,1 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento o de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento.

Las formas farmacéuticas para la administración tópica o transdérmica de las composiciones de la presente divulgación incluyen polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches y medicamentos inhalatorios. El compuesto activo se puede mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propulsor que se pueda requerir.

Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" significan modos de administración distinta de administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e intraesternal.

Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar por procedimientos de esterilización, supra, y por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como glúcidos, cloruro de sodio y similares, en las composiciones. Además, se puede producir la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En determinados aspectos de la divulgación, cuando los anticuerpos de la presente divulgación se administran como productos farmacéuticos a seres humanos y animales, se pueden administrar solos o como una composición farmacéutica que contenga, por ejemplo, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 99,5 % (o de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 90 %) de un anticuerpo, descrito en el presente documento, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

V. Artículos de fabricación

La materia objeto divulgada actualmente se refiere además a artículos de fabricación que contienen materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente.

En determinados aspectos de la divulgación, el artículo de fabricación incluye un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los ejemplos no limitantes de recipientes adecuados incluyen frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente puede contener una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica).

En determinados aspectos de la divulgación, al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la materia objeto divulgada actualmente. La ficha técnica o prospecto del envase puede indicar que la composición se usa para tratar la afección de elección.

En determinados aspectos de la divulgación, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la presente divulgación; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. En determinados aspectos de la divulgación, el artículo de fabricación puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular.

De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede tener además un recipiente adicional, por ejemplo, un segundo o tercer recipiente, que incluya un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como, pero sin limitarse a, agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El artículo de fabricación puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos de la materia objeto divulgada actualmente y no se deben considerar como limitaciones en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1: caracterización de anticuerpos agonistas anti-FGFRI

Tres anticuerpos anti-FGFR1 derivados de fago, YW182.2 (también denominado en el presente documento "R1MAb1"), YW182.3 (también denominado en el presente documento "R1MAb2") e YW182.5 (también denominado en el presente documento "R1MAb3") se describieron previamente (documento WO 2012/158704)). Cada uno de los tres anticuerpos actúa como un potente agonista selectivo de FGFR1 y presentó propiedades de sensibilización a la insulina en ratones.

Para comprender además esta actividad agonista, se sometió a prueba la capacidad de los fragmentos Fab de estos anticuerpos de antagonizar FGFR1c. Las células HEK293 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suero fetal bovino (FBS) al 10 % y se transfectaron de forma transitoria con vectores de expresión que codificaban la luciferasa de renilla (pRL-SV40, Promega), FGFR1c, un activador transcripcional (pFA2-Elk1 o pFA2-CREB, Stratagene) y un indicador de luciferasa de luciérnaga promovido por sitios de unión a GAL4 (pFR-1uc, Stratagene), usando el reactivo de transfección FUGENE® HD (Roche). Al día siguiente, las células transfectadas se cultivaron durante 6-8 h adicionales en medios libres de suero e IgG YW182.5 y cada YW182.2, YW182.3 e YW182.5 se sometió a prueba a concentraciones crecientes. La actividad luciferasa celular se determinó usando el sistema de ensayo de luciferasa DUAL-GLO® (Promega) y el lector multimarcador ENVISION® (PerkinElmer). La actividad luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad luciferasa de renilla coexpresada. De forma sorprendente, Fab de YW182.2, pero no Fab de YW182.3 o el Fab de YW182.5, presentó actividad agonista (fig. 1A).

La fig. 1B representa los experimentos de competencia de unión que se realizaron para explorar el fundamento en cuanto a la diferencia en la activación por FGFR1 por un Fab de YW182.2 y un Fab de YW182.3. YW182.2 se caracterizó además en comparación con YW182.3, que tiene una alta afinidad, y en comparación con el anticuerpo anti-FGFR1 de menor afinidad, YW182.5. Tanto YW182.2 como YW182.3 compitieron con YW182.5 en cuanto a su unión al dominio extracelular (DEC) de FGFR1, lo que indica que los 3 anticuerpos reconocen una región solapante de FGFR1. Sin embargo, como se muestra en la fig. 1B, la afinidad relativa de YW182.5 fue significativamente más débil (CI50 > 30 veces) que la de YW182.2 e YW182.3.

La fig. 2A representa las afinidades de unión de los anticuerpos anti-FGFR1, YW182.2 e YW182.3, con respecto a FGFR1b y FGFR1c. Se determinó la afinidad de los anticuerpos anti-FGFR1 para evaluar si las diferencias en la afinidad de los anticuerpos anti-FGFR1 explican las diferencias observadas en la actividad agonista. Las afinidades de unión de los Fab a FGFR1b o FGFR1c usando un instrumento BIACORE® T100 se realizaron como se describe en Liang et al. J. Mol. Biol. 366(3): 815-29 (2007), con las siguientes modificaciones. En primer lugar, el anticuerpo anti-Fc humana de ratón se recubrió sobre un chip CM5 con dextrano carboximetilado de BIAcore usando acoplamiento directo para liberar grupos amino siguiendo un procedimiento descrito por el fabricante. A continuación, se capturó YW182.2 o YW182.3 en chips de biosensor CM5 para lograr aproximadamente 200 unidades de respuesta (UR). Las mediciones de unión se realizaron usando un tampón de migración compuesto de HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,005 % (tampón ^hB^s-P). Se inyectó una serie de diluciones de 2 veces de la proteína DEC de FGFR1c-His en un intervalo de 1,5-50 nM en tampón HBS P a un caudal de 30 ^l/minuto a 25 °C. Las tasas de asociación (Kas, por mol/s) y las tasas de disociación (Kdis, por s) se calcularon usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de Biacore, versión 3.2). Se calculó la constante de disociación en equilibrio (Kd, por mol) como la proporción de kdis/kas. Como se muestra en la fig. 2A, se observó que las afinidades de YW182.2 e YW182.3 eran muy similares, lo que indica que la afinidad no podría explicar la diferencia entre las actividades agonistas de los dos anticuerpos.

La fig. 2B muestra la capacidad de YW182.5 (R1MAb3) de interactuar específicamente con FGFR1. Al igual que YW182.2 e YW182.3, YW182.5 mostró unión específica a FGFR1 por ELISA (fig. 2B).

La fig. 2C representa la actividad agonista de YW182.5 para diversos FGFR en células L6 usando un ensayo de luciferasa basado en GAL-ELK1 (factor de transcripción similar a ETS 1). Para el ensayo de luciferasa, se transfectaron de forma transitoria células HEK293T o L6 de rata con vectores de expresión que codificaban receptores apropiados bajo el promotor de CMV, luciferasa de renilla (pRL-SV40, Promega), fusión de activador transcripcional de GAL-ELK1 (pFA2-ELK1, Agilent) y un indicador de luciferasa de luciérnaga promovido por sitios de unión a GAL4 (pFR-luc, Agilent), usando el reactivo de transfección FuGENE HD (Promega). Al día siguiente, las células transfectadas se cultivaron durante 6-8 horas adicionales en medios basado en DMEM libres de suero que contenían ligandos de proteína apropiados a diversas concentraciones. La actividad luciferasa celular se determinó usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega) y el lector multimarcador EnVision (PerkinElmer). La actividad luciferasa de luciérnaga se normalizó con respecto a la actividad luciferasa de renilla coexpresada y se mostró como media ± EEM. De forma similar a YW182.2 e YW182.3, YW182.5 actuó como agonista específico para FGFR1 en células F6 (fig. 2C).

La actividad agonista de YW182.5 se sometió a prueba además en células HEK293 usando el ensayo de luciferasa basado en GAF-EFK1 descrito anteriormente. Como se muestra en la fig. 2D, YW182.5 también actuó como agonista específico para FGFR1c en el ensayo de luciferasa basado en GAF-ELK1 en células HEK293.

La fig. 2E muestra el efecto de YW182.5 sobre los niveles de glucemia en un modelo de ratón diabético. Para determinar los niveles de glucemia, se adquirieron ratones de Jackson Laboratory y se mantuvieron en una instalación para animales libre de patógenos a 21 °C en un ciclo estándar de 12 h de luz/12 h de oscuridad con acceso a comida (LABDIET® 5010) y agua a voluntad. Los ratones db/db en el fondo de C57BLKS/J eran hembras y todos los demás ratones eran machos. Para la alimentación con una dieta hiperlipídica, se usó una dieta hiperlipídica y con alto contenido de carbohidratos (Harlan Teklad TD.03584, un 58,4 % de calorías procedentes de grasa). Los niveles de calcio y fosfato inorgánico en suero se determinaron por el analizador químico COBAS INTEGRA® 400 (Roche). Los niveles de FGF23 en suero se determinaron por ELISA (Immutopics). Los niveles de glucemia se determinaron por un glucosímetro CONTOUR® (Bayer). Para el análisis de lípidos hepáticos se usó un kit de cuantificación de triglicéridos (MBL International). El colesterol total, triglicéridos, fü-hidroxibutirato (Thermo DMA) y ácido graso libre (Roche) en suero se determinaron por ensayos colorimétricos. Se usó ELISA para determinar los niveles de insulina en suero (Crystal Chem), FGF23 en suero (Immutopics), adiponectina de PMA de ratón en suero (Alpco) y adiponectina de PMA de mono en suero (R&D Systems). La corticosterona se midió por radioinmunoanálisis (Vanderbilt Hormone Assay & Analytical Services Core). Todos los ratones usados para la inyección tenían alrededor de 2-4 meses de edad, excepto los ratones carentes de klb, que se usaron en determinados experimentos a los 7-8 meses. De forma similar a YW182.2 e YW182.3, YW182.5 normalizó los niveles de glucemia cuando se inyectó en ratones diabéticos ob/ob (fig. 2E).

Ejemplo 2: cartografía de epítopos de anticuerpos anti-FGFRI

El DEC de FGFR1 consiste en tres dominios similares a Ig llamados de D1 a D3. Como se muestra en la fig. 1C, dos péptidos no solapantes (P26: KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) y P28: FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144) están presentes dentro del dominio D2 de FGFR1 y se identificaron previamente para unirse tanto a YW182.2 como a YW182.3 (documento WO 2012/158704).

Para identificar qué residuos en estos péptidos son los más responsables de la unión a anticuerpo, se expresaron proteínas FGFR1 de longitud completa con diversas sustituciones con alanina dentro de las regiones de epítopo identificadas en células HEK293 y se sometieron a prueba para determinar la unión a anticuerpo por inmunoelectrotransferencia. Como se muestra en la fig. 1D, la sustitución con alanina en K175, K177, Y205, ^r208 eliminó la unión de YW182.2 e YW182.5, sin afectar a la expresión como se somete a prueba por anti-FGFR1 frente al dominio D1 (anti-D1). Se anuló la unión de YW182.3 por R208A, pero no por las sustituciones en K175, K177oY205.

La capacidad de los anticuerpos de activar los mutantes de sustitución con alanina de FGFR1 in vivo se sometió a prueba usando el ensayo con GAL-ELK1 descrito anteriormente. Se descubrió que la activación se correlacionó bien con las propiedades de unión de estos mutantes a cada anticuerpo anti-FGFR1 (fig. 1E). Estos resultados sugieren que se requiere un conjunto similar de aminoácidos dentro del dominio D2 para la unión de YW182.2 e YW182.5 aunque con una afinidad diferente, mientras que un conjunto distinto de aminoácidos en la misma región es importante para la unión de YW182.3.

Las estructuras cristalinas del complejo DEC de FGFR/FGF 2:2 se han descrito previamente (Plotnikov et al. Cell 98(5): 641-50 (1999)). En las estructuras DEC de FGFR1c/FGF22:2 homodiméricas, un dominio D2 interactúa con otro dominio D2, uniéndose cada FGF2 a ambos dominios D2 desde dos lados para estabilizar el dímero de D2 (fig.

1F). En estas estructuras, las sustituciones con alanina importantes para la unión de YW182.2 e YW182.5 (K175, K177, Y205 y R208) están situadas en el interior del dímero de d 2. Puesto que Fab de YW182.2 actúa como agonista, esto sugirió que Fab de YW182.2 se puede unir simultáneamente a dos dominios D2 desde el lado para estabilizar el dímero de D2, actuando esencialmente como un mimético molecular de los ligandos de FGF. En base al análisis de sustitución con alanina, Fab de YW182.5 se podría unir de forma similar excepto en que la afinidad es mucho menor que Fab de YW182.2.

Ejemplo 3: aislamiento y caracterización de anticuerpos anti-KLB

Se inmunizaron ratones Balb/c con células HEK293 que expresaban de forma estable la proteína hFGFR1c y hKLB. Los bazos se extrajeron después de 12 semanas y se generaron hibridomas. Los hibridomas que producen anticuerpos anti-hKLB se identificaron por análisis de FACS usando las células HEK293 usadas para la inmunización. En resumen, las células 293 que expresaban hKLB solo, hFGFR1 solo, o ambos, se tiñeron con sobrenadante de hibridoma diluido y anticuerpo anti-IgG de ratón caprino conjugado con PE (Jackson Labs) en tampón para FACS (BSA al 0,5 % en PBS). Se usó el mismo tampón para FACS para lavar las células teñidas. Las células teñidas se analizaron por FACScan (Becton Dickinson) y el programa informático de análisis FlowJo FACS (Tree Star). El ADNc que codificaba la cadena pesada y la cadena ligera de IgG se clonó en vectores de expresión. Todas las moléculas de anticuerpo monoclonal recombinante se produjeron en células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas de forma transitoria y se purificaron usando cromatografía en columna convencional.

Se identificaron aproximadamente 20 hibridomas diferentes que producían anticuerpos anti-KLB. Las secuencias de cadena ligera y de cadena pesada de CDR para 16 de estos anticuerpos anti-KLB se muestran en las tablas 2 y 3. Las secuencias de cadena ligera de 16 de estos anticuerpos anti-KLB, junto con 8C5, se muestran en la fig. 3A (11F1,6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1,5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 y 8C5; SEQ ID NO: 111-127, respectivamente).

Las secuencias de cadena pesada de 16 de estos anticuerpos anti-KLB, junto con 8C5, se muestran en la fig. 3B (11F1,6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1,5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 y 8C5; SEQ ID NO: 94-110, respectivamente).

Tabla 2. Secuencias de CDR H para anticuerpos monoclonales anti-KLB murino.

Tabla 3. Secuencias de CDR L para anticuerpos monoclonales anti-KLB murino.

La mayoría de los anticuerpos anti-KLB derivados de hibridoma junto con un anticuerpo derivado de fago (designado como Ph#5, que se obtuvo por adsorción de fagos usando la proteína recombinante DEC de hKLB-HIS (R&D Systems)) se clasificaron en base a la mediana del cambio observado en el gráfico de FACS a 0,8 |jg/ml midiendo la unión de los anticuerpos a las células 293 que expresaban hKLB (figura 4).

Además, algunos de los anticuerpos se clasificaron por ELISA. Para estos experimentos, se usaron anticuerpos anti-KFB que eran IgG recombinante quimérica con regiones variables murinas y regiones constantes de hIgGI para medir la unión a la proteína DEC de hKLB-HIS. La unión relativa de los anticuerpos sometidos a prueba fue similar, excepto para 14E6, que pareció unirse mejor en las condiciones de ELISA que en el análisis de FACS (figura 5).

Ejemplo 4: unión a KLB de anticuerpos anti-KLB

Para someter a prueba la competencia entre diversos anticuerpos anti-KFB, se usó ELISA. En algunos experimentos, los anticuerpos IgG purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma correspondientes a 6D12, 8C5 y 11F1 se biotinilaron usando el kit de biotinilación en fase sólida EZ-link NHS-PEO (Pierce). La unión a la proteína DEC de KLB-HIS se sometió a prueba usando estreptavidina conjugada a HRP en presencia de diversas concentraciones de anti-KFB derivado de hibridoma. En algunos experimentos, se sometió a prueba la unión de IgG humana recombinante a la proteína DEC de KLB-HIS usando anti-IgG humana conjugada a HRP (Jackson ImmunoResearch Inc.) en presencia de diversas concentraciones de anti-KLB derivado de hibridoma. Se observó que ninguno de 11F1, 11D4, 8E1 y 46C3 compite con 6D12 en cuanto a su unión (otros no se sometieron a prueba frente a 6D12). Los anticuerpos anti-KLB14E6 y 12A11 compiten en cuanto a su unión con 8C5, pero 11D4 y 14C10 no (otros no se sometieron a prueba frente a 8C5), y 11D4 compite en cuanto a su unión con 11F1, pero 6D12, 8E1 y 46C3 (otros no se sometieron a prueba frente a 11F1).

Ejemplo 5: reactividad cruzada entre especies de anticuerpos anti-KLB

La reactividad cruzada entre especies de los anticuerpos anti-KLB divulgados se analizó por análisis de FACS usando ADNc de KFB de ratón, rata, conejo, macaco cangrejero y macaco de la India clonado en vectores de expresión de mamífero pRK transfectados de forma transitoria en células HEK293T. Las secuencias polipeptídicas del dominio extracelular de KLB que se expresaron son como sigue:

Ratón:

FSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGS

W KTDGRGPS1WDRYV Y SHLRG VNGTDRSTDS Y1FLEKDLLALDFLG VSFYQFS ISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEE YGGWKNATM1DLFNDYATYCFQTFGDRVKYW1T1HNPYLVAWHGFGTGMH APGEKGNLTAVYTVGHNL1KAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLS1TLGSHW1E PNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANP1HGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEK EEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQIL

1SENGWFTDSY1KTEDTTA1YMMKNFLNQVLQA1KFDE1RVFGYTAWTLLDGF EWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQ11QDNGFPLKESTPDMK GRFPCDFS WG VTES VLKPEFTV S S PQFTDPHLY VWN VTGNRLLYRVEG VRLK TRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHY QFALDWTSILPTGNLS KVNRQ VLRY YRC V VS EGLKLGVFPM VTLYHPTHS HLGLPLPLLS SGGWLNMNTAKAFQD Y AELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHL YDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFE1AWFADPL FKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTR FV1HKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRD RDIYITANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEE KSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLISSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCT1CSFL V (SEQ ID NO: 158).

Rata (+N-ter FLAG):

DYKDDDDKLEFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPGQLFLYDTFPKNFSWG

VGTGAFQVEGSWKADGRGPS1WDRYVDSHLRGVNSTDRSTDSYVFLEKDLL ALDFLGVSFYQFS1SWPRLFPNGTVAAVNAKGLQYYRALLDSLVLRNIEPIVTL YHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWmHNPYL VAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQK GWLSITLGSHW1EPNRTENMEDV1NCQHSMSSVLGWFANP1HGDGDYPEFMK TSSV1PEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVL NWIKLEYDNPRILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIQV FGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDN GFPLQESTPDMKGQFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGN RLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTG NLSKINRQVLRYYRCVVSEGLKLGISPMVTLYHPTHSHLGLPMPLLSSGGWLN TNTAKAFQDYAGLCFKELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNL MIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHSDWAEPANPYVESHWKAAERFL QFEIAWFADPLFKTGDYPLAMKEYIASKKQRGLSSSVLPRFTLKESRLVKGTID FYALNHFTTRFV1HKQLNTNCSVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGMRKL LGWIRRNYRDMDIYVTANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLDDKVK IKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSVQFYSKLISSSGFSSENRSPACGQP PEDTECAICSFLT ^{(s e q id NO: 147).}

Conejo (+N-ter FLAG):

DYKDDDDKLDFPGDGRAVWSQNPNLSPVNESQLFLYDTFPKNFFWGV

GTGAFQVEGSWKKDGKGLSVWDHFIATHLNVSSRDGSSDSYIFLEKDLSALD FLGVSFYQFSISWPRLFPDGTVAVANAKGLQYYNRLLDSLLLRNIEPVVTLYH WDLPWALQEKYGGWKNETLIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWIT1HNPYLVA WHGYGTGLHAPGEKGNVAAVYTVGHNLLKAHSKVWHNYNRNFRPHQKGW LSITLGSHWIEPNRAESIVDELKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEVMTKKL LSVLPAFSEAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLRQVL NWIKLEYGNPRILIAENGWFTDSYVQTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIRLDGV RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYNTRRGLFYVDFNSEQRERRPKSSAHYYKQVI GENGFTLREATPDLQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNA TGNRMLHRVEGVRLKTRPAQCTDFITIKKQLEMLARMKVTHFRFALDWASV LPTGNLSEVNRQALRYYRCVVTEGLKLNISPMVTLYYPTHAHLGLPAPLLHSG GWLDPSTAKAFRDYAGLCFRELGDLVKLWmNEPNRLSDVYNRTSNDTYQA AHNLLIAHAIVWHLYDRQYRPSQRGALSLSLHSDWAEPANPYVASHWQAAE RFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPVAMREYIASKTRRGLSSSVLPRFSDAERRLVK GAADFYALNHFTTRFVMHEQQNGSRYDSDRDVQFLQDITRLASPSRLAVMP WGEGKLLRWMRNNYGDLDVYITANGIDDQALQNDQLRQYYLEKYVQEALK AYLIDKIKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKLITSNGFPSEN GGPRCNQTQGNPECTVCLLLL ^{(SEQ id NO: 148)}

Macaco cangrejero (+N-ter FLAG):

D YKDDDDKLEFS GDGR A VW S KNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWG V

GTGAFQVEGSWKKDGKGPSIWDHFVHTHFKNVSSTNGSSDSYIFFEKDFSAF DF1GVSFYQFS1SWPRLFPDG1VTVANAKGLQYYNTLLDSLVLRN1EP1VTLYH WDFPEAFQEKY GG W KNDTIIDIFND Y ATYCFQTFGDRVK YWIT1HNPYEVAW HGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNL1KAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLS 1TLGSHW1EPNRSENTMD1LKCQQSMVSVLGWFASP1HGDGDYPEGMKKKLLS IFPFFS EAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPENTM AKMGQN VS ENERE AFNWI KLEYNNPRILIAENGWFTDSHVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFG YTAWSLLDGFEWQDAYT1RRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQ11RENGFS LKEATPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPYLYVWNATGNRLL HRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNL S A VNRQALRY YRC V VS EGLKLGIS AM VTLYYPTH AHLGLPEPLLH AGGWLNP STVEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLV AHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFE IAWFAEPLFKTGDYPAAMREY1ASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFC ALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRD1QFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLR W VRRN Y GDMDIYIT ASGIDDQALEDDRLRKY YLEKYLQEVLKA YLIDKVRIK GYY AFKLAEEKS KPRFGFFTSDFKAKS SIQFYNKMISSSGFPS ENSSS RCSQTQ KNTECTVCLFLA ^{(s e q id NO: 149).}

Macaco de la India (+N-ter FLAG):

DYKDDDDKLEFSGDGRAVWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGV

GTGALQVEGSWKKDGKGPS1WDHFVHTHLKNVSSTNGSSDSY1FLEKDLSAL DF1GVSFYQFS1SWPRLFPDG1VTVANAKGLQYYNALLDSLVLRN1EPIVTLYH WDLPLALQEKYGGWKNDTIID1FND Y ATYCFQTFGDRVK Y WIT1HNPYLVAW HGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLS ITLGSHWIEPNRSENTMDILKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMKKKLL SILPLFSEAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALN WIKLEYNNPQIL1AENGWFTDSHVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVF GYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQnRENG FSLKEATPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPYLYVWNATGNR LLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTG NLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHAGGWL NPSTVEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNL LVAHALAWRLYDRQFRPSQRG A VSLSLH ADW AEPANPY ADS HWRA AERFL QFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMRE YIAS KHRRGLS S S ALPRLTEAERRLLKGTV DFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDrTRLSSPTRLAVIPWGVRK LLRWVRRNYGDMDIY1TASGIDDQALEDDRLRKYYLEKYLQEVLKAYLIDKV RIKGYY AFKLAEEKS KPRFGFFTS DFKAKSSIQFYNKMIS S S GFPSENSSSRCS Q

^{t q k n t e c t v c l f l v}(SEQ|DNO:150)

Como se muestra en la tabla 4, se descubrió que la mayoría de los anticuerpos, por ejemplo, 6D12, 11D4 y 8E1, se unían a KLB de conejo, macaco cangrejero y macaco de la India y se descubrió que aproximadamente la mitad de los anticuerpos anti-KLB, por ejemplo, 8C5, 14E6 y 14C6, se unían a KLB de ratón y rata.

Tabla 4. Unión de anticuerpos anti-KLB murino a KLB de diferentes especies.

Ejemplo 6: cartografía de epítopos de anticuerpos anti-KLB

Para determinar si los anticuerpos anti-KLB no se unen al dominio extracelular (DEC) de alfa-Klotho (hKLA) humano, se usó una construcción que tenía la siguiente secuencia:

secuencia polipeptídica predicha expresada (con FLAG C terminal (intracelular)):

EPGDGAQTWARFSRPPAPEAAGLFQGTFPDGFLWAVGSAAYQTEGG

WQQHGKGAS1WDT FT H H PLAPPGDS R N AS LPLGAPSPLQPATGD V AS DS Y N N VFRDTEALRELGVTHYRFS1SWARVLPNGSAGVPNREGLRYYRRLLERLRELG VQPVVTFYHWDEPQREQDAYGGWANRAEADHFRDYAEFCFRHFGGQVKY

WmDNPYVVAWHG YATGREAPGIRGSPRFG YLV AHNEEFAH AKVWHFYNT SFRPTQGGQVSIALSSHWINPRRMTDHSIKECQKSFDFVFGWFAKPVFIDGDY PESMKNNLSSILPDFTESEKKFIKGTADFFALCFGPTLSFQLLDPHMKFRQLESP NLRQLLSWIDLEFNHPQIF1VENGWFVSGTTKRDDAKYMYYLKKF1METLKA] KLDGV D VIGYTA WSLMDGFEWHRGYS1R RGLFYVDFLSQD K M LLPKSS ALFY QKLIEKNGFPPFPENQPFEGTFPCDFAWGVVDNYIQVDTTFSQFTDLNVYFWD VHHSKRFIKVDGVVTKKRKSYCVDFAAIQPQIAFFQEMHVTHFRFSFDWAFIF PLGNQSQVNHT1LQYYRCMASELVRVN1TPVVALWQPMAPNQGLPRLLARQG AWENPYTALAFAEYARLCFQELGHHVKLWITMNEPYTRNMTYSAGHNLLKA HALAWHVYNEKFRHAQNGKISIALQADW1EPACPFSQKDKEVAERVLEFD1G WLAEPIFGSGDYPWVMRDWLNQRNNFLLPYFTEDEKKLIQGTFDFLALSHYT TILVDSEKEDPIKYNDYFEVQEMTDITWFNSPSQVAVVPWGLRKVFNWFKFK YGDLPMYnSNGEDDGFHAEDDQFRVYYMQNYINEALKAHIFDGINLCGYFAY SFNDRTAPRFGLYRYAADQFEPKASMKHYRKIIDSNGFPGPETLERFCPEEFTV CTECSFFHTRKSFLAFIAFFFFASIISLSFIFYYSKKGRRSYKFEDYKDDDDK

(SEQ ID NO: 151).

Tanto KLA como KLB tienen dos dominios similares a glucosidasa, uno N terminal y otro C terminal. Para identificar la región de KLB reconocida por los anticuerpos anti-KLB, se clonaron hKLB, hKLA y una construcción quimérica que comprendía el dominio similar a glucosidasa N terminal de hKLA y el dominio similar a glucosidasa C terminal de hKLB en un vector de expresión de mamífero pCMV-Tag4A (Agilent). Los dominios N y C terminal de hKLA y hKLB corresponden a secuencias de SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 145, respectivamente, como se muestra en la tabla 5. Los dominios N terminales de hKLA y hKLB se dividieron en 5 segmentos y los dominios C terminales se dividieron en 5 segmentos en base a la homología de secuencia entre las dos proteínas.

Tabla 5. Subsecuencia de KLA y KLB.

Se realizó un análisis de FACS con los anticuerpos de la presente divulgación y se observó que aproximadamente la mitad de los anticuerpos reconocían el dominio similar a glucosidasa N terminal de hKLB, mientras que otros reconocían el dominio similar a glucosidasa C terminal (tabla 6). Como se muestra en la tabla 6, dos de los anticuerpos que reconocieron el dominio N terminal de hKLB se unieron a una porción del dominio que comprendía el segmento 1, mientras que los demás solo requirieron los segmentos 2-5 para su unión.

Tabla 6. Cartografía de unión de anticuerpos anti-KLB murino.

Ejemplo 7: identificación de anticuerpos biespecíficos que activan específicamente el complejo FGFRIc/KLB

En base a la capacidad de los R1MAb de activar FGFR1 como un Fab, se produjo una molécula que incorpora el anclaje de un R1MAb de menor afinidad a un anticuerpo anti-KLB de mayor afinidad para generar un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 (fig. 6A; documento WO2012/158704).

Sin ceñirse a ninguna teoría particular, se propone que la activación mediada por FGF21 funciona a través del reclutamiento de FGF21 al complejo FGFR1c/KLB a través de la cola de unión a KLB C terminal, mientras que los determinantes para la especificidad de FGFR residen en la región N terminal, que probablemente se une a FGFR por medio de una interacción de baja afinidad (véase la fig. 6B) (Yie et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)). Por lo tanto, el anclaje de un R1MAb1 de afinidad reducida a un anticuerpo anti-KLB de alta afinidad como un anticuerpo biespecífico podría proporcionar un agonista de FGFR1 dependiente de KLB. Sin ceñirse a ninguna teoría particular, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que incluye un brazo para FGFR1 que tiene una baja afinidad puede mitigar el riesgo de que el anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 se una estrechamente a FGFR1 en ausencia de KLB y prevenga la unión y/o activación de FGFR1 por otros ligandos de FGF (por ejemplo, FGF1, FGF2, FGF8 y FGF23). Además, un brazo para FGFR1 con baja afinidad puede permitir la presencia de mayores niveles de impurezas de anti-FGFR1, tales como, pero sin limitarse a, semianticuerpos botón anti-FGFR1, dímeros de anti-FGFR1 no covalentes, dímeros de anti-FGFR1 covalentes y especies de peso molecular alto, sin dar como resultado efectos secundarios clínicamente significativos.

Como se usa en el presente documento, bFKBI, en general, se refiere a cualquiera de los varios anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1 divulgados en el presente documento. Los detalles relacionados con los anticuerpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1 específicos divulgados en las figuras se describen a continuación. Las células HEK293 se cotransfectaron con una mezcla de cuatro vectores de expresión que codificaban las cadenas pesada y ligera de anti-FGFR1 (YW182.2 (R1MAb1) e YW182.3 (R1MAb2)) y los anticuerpos anti-KLB descritos anteriormente. La cadena pesada de anti-FGFR1 y anti-KLB se marcaron respectivamente con el péptido Flag y Oct-histidina de modo que la IgG heterodimérica se pudiera purificar por purificación por afinidad secuencial a partir del medio acondicionado. A continuación, se analizaron las IgG heterodiméricas parcialmente purificadas en un ensayo de luciferasa basado en GAL-ELK1 para identificar los agonistas dependientes de KLB. Para minimizar el emparejamiento erróneo de las cadenas pesada y ligera, el anti-FGFR1 se expresó con la región constante de Fab humano y el anti-KLB se expresó con la región constante de Fab de ratón. Las IgG biespecíficas marcadas inicialmente se sometieron a prueba en forma bruta usando 28 combinaciones de 3 MAb anti-R1 y 18 Ab anti-KLB (tabla 7).

La fig. 7A muestra datos de inducción para determinadas combinaciones biespecíficas de YW182.2 (R1MAb1), YW182.3 (R1 MAb2) e YW182.5 (R1 MAb3) con 18C5, 12A11 y 14E6 en un ensayo de luciferasa con GAL-ELK1. En la mayoría de los casos, se observó que los anticuerpos biespecíficos activaban la señalización significativamente mejor en las células que coexpresaban FGFR1c y KLB en comparación con las células que expresaban solo FGFR1c, pero no KLB.

En base a la actividad de estos anticuerpos en estos experimentos iniciales, se usaron 8 Ab anti-KLB representativos (Ph#5, 8C5, 12A11, 14C10, 6D12, 11D4, 6C1 y, como control negativo, 14E6) para producir anticuerpos biespecíficos sin marca con YW182.5 (usando una tecnología de botón-ojal descrita previamente para su caracterización adicional (supra, y, por ejemplo, Atwell, et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)). Como se muestra en la fig. 8A, se produjeron anticuerpos biespecíficos con la región constante de IgG1 humana (natural, con función efectora (1)) y con la región constante de IgG1 humana con mutación N297G para eliminar la función efectora (3) o la región constante de ratón con mutaciones dobles [D265G/N297G] (DANG) para eliminar la función efectora (2).

La tabla 7 a continuación enumera diversos anticuerpos biespecíficos que se prepararon usando la tecnología de botón en ojal.

Tabla 7. Anticuerpos anti-KLB/anti-FGFR1 biespecíficos.

El control de isotipo IgG usado fue anti-ambrosía (IgG2a murina) o trastuzumab anti-Her2 humano (IgG1 humana). Los fragmentos Fab se expresaron en E. co liy se purificaron usando cromatografía en columna convencional. El FGF21 recombinante era de R&D Systems (2539-FG/CF), excepto para el ensayo de unión celular a radioligando, que se realizó con FGF21 yodado de Phoenix Pharmaceuticals y FGF21 no marcado producido internamente. Cada una de las combinaciones biespecíficas (excepto para el control negativo) mostró señalización dependiente tanto de FGFR1c como de KLB. Los datos para determinadas combinaciones se muestran en la fig. 7B. Además, la combinación de los brazos anti-KLB con el brazo de YW182.5 (R1 MAb3) mostró una menor señalización de fondo en las células que expresaban FGFR1c, pero no KLB.

Como se muestra en la fig. 6C, se sometió a prueba la actividad de un anticuerpo anti-KLB/anti-FGFR1c (BsAb17) en células HEK293 carentes de FGFR1 que expresaban diversos receptores. Las células HEK293T carentes de FGFR1 se generaron usando el procedimiento CRISPR-cas9 usando ARN guías. Se observó que el anticuerpo anti-KLB/anti-FGFR1c inducía actividad luciferasa en células que coexpresaban hFGFR1c y hKLB recombinantes (fig. 6C).

Se observaron resultados similares para otros anticuerpos anti-KLB/anti-FGFR1c. Como se muestra en la fig. 7C, cuando se somete a prueba en un ensayo de luciferasa basado en GAL-ELK1 en células HEK293 que expresan FGFR1c con o sin ^kL^b, múltiples combinaciones de anticuerpos biespecíficos de brazos anti-FGFR1 y anti-KLB, por ejemplo, BsAb5, 6, 7, 8, 9, 10, indujeron actividad luciferasa de una manera dependiente de la dosis en células que expresaban hFGFR1c y hKLB recombinantes, pero no en células sin expresión de KLB. Estos resultados indican que estos anticuerpos biespecíficos actúan como agonistas de FGFR dependientes de KLB, al igual que FGF21.

También se sometió a prueba la sinergia de un anticuerpo anti-KLB/anti-FGFR1c (BsAb17) con FGF21. Como se muestra en la fig. 9B, no se observó ninguna sinergia entre BsAb17 y FGF21 cuando la concentración de FGF21 se incrementó gradualmente y la concentración de BsAb17 permaneció sin cambios.

Además, como la concentración del anticuerpo anti-KLB/anti-FGFR1c (BsAb17) se incrementó gradualmente y la concentración de FGF21 permaneció sin cambios, no se observó ninguna sinergia entre BsAb17 y FGF21 (fig. 9C).

La afinidad de unión en solución (Kd) de dos de los anticuerpos biespecíficos, BsAb10 y BsAb9, (junto con hFGF21) a células HEK293 que expresan KLB de ser humano, macaco cangrejero y ratones, FGFR1c humano, o tanto hFGFR1c como hKLB, se midió por un ensayo de unión a ligando radiomarcado. Para el ensayo de unión celular a radioligando, se colocaron células HEK293 que coexpresaban de forma estable KLB y/o FGFR1c en una placa de 96 pocillos a una densidad de 100.000 a 200000 células por 0,2 ml en tampón de unión (DMEM con seroalbúmina bovina (BSA) al 1 %, HEPES 50 mM, pH 7,2, acida de sodio al 0,1 % e IgG humana 350 mM). Se añadieron a las células mezclas de reacción de competencia de 50 |jl que contenían una concentración fija de FGF21 yodado (Phoenix Pharmaceuticals) o BsAb yodado, y concentraciones diluidas en serie de FGF21 no marcado (Genentech) o BsAb no marcado. Las reacciones de competencia con las células se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Después de una incubación de 2 h, las reacciones de competencia se transfirieron a una placa de filtro Millipore Multiscreen y se lavaron cuatro veces con tampón de unión para separar el anticuerpo o FGF21 libre del yodado unido. Se contaron los filtros en un contador gamma Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Los datos de unión se evaluaron usando el programa informático New Ligand (Genentech), que usa el algoritmo de ajuste de Munson y Rodbard (Munson y Rodbard Anal. Biochem. 107, 220-239 (1980)) para determinar la afinidad de unión.

Como se muestra en la tabla 8, ambos anticuerpos presentaron una buena reactividad con respecto a las células que expresaban solo KLB (en un patrón entre especies consecuente con el observado previamente), pero ambos se unieron mucho más débilmente a las células que expresaban solo hFGFR1c y más fuertemente a las células que expresaban tanto hKLB como hFGFRIc.

Tabla 8. Unión de anticuerpos anti-KLB biespecíficos a KLB/FGFR1 de diferentes especies.

La fig. 9D muestra la afinidad de BsAb10 y BsAb9 con respecto a las células HEK293 que expresan de forma estable hKLB, hFGFR1c, o ambos, en comparación con un anticuerpo con dos brazos de unión anti-FGFR1 correspondientes (YW182.5) usando análisis de FACS. Se obtuvieron resultados similares a los indicados anteriormente (fig. 9D).

Se realizaron otros experimentos con un anticuerpo biespecífico, BsAb10, que tiene YW182.5 como brazo anti-FGFR1 y 8C5 como brazo anti-KLB, y derivados de BsAb10 (BsAb11-20). Como se muestra en la figura 6C, los receptores murinos se expresaron en células HEK293 y mostraron que BsAb17 también inducía actividad luciferasa en estas células, lo que confirma la reactividad cruzada entre especies de este Ab.

Luego, se sometió a prueba BsAb10 en células de mioblasto L6 de rata que carecían de KLB y FGFR endógenos, pero se transfectaron para que expresaran hKLB y cada una de las 5 isoformas de hFGFR (fig. 9A). Se descubrió que BsAb10 induce actividad luciferasa solo en células que expresan tanto FGFR1c como KLB, lo que indica que BsAb10 actúa como agonista específico para el complejo FGFR1c/KLB pero no para KLB en complejo con otros FGFR (fig. 9A). FGF21 y FGF19 se usaron como controles para demostrar que FGF21 inducía actividad luciferasa cuando las células expresaban una combinación de KLB y cualquiera de FGFR1c, 2c o 3c, y FGF19 inducía actividad en células que expresaban una combinación de KLB y FGFR4. El FGF21 recombinante era de R&D Systems (2539-FG/^cF), excepto para el ensayo de unión celular a radioligando, que se realizó con FGF21 yodado de Phoenix Pharmaceuticals y FGF21 no marcado producido internamente. Los ADNc que codificaban el dominio extracelular (DEC) de FGFR1 b, 1 c, 2b, 2c, 3b, 3c y 4 humanos se clonaron en un vector de expresión que contenía el promotor de citomegalovirus (CMV) para generar proteínas quiméricas FGFR humano-Fc humano o proteínas FGFR marcado con His.

Sin embargo, como se describe anteriormente, el anticuerpo anti-FGFR1c original, R1MAb3 (YW182.5) de BsAb10, de forma sorprendente, se puede unir a FGFR1b, una isoforma de FGFR1 que no interactúa con KLB. Además, R1MAb3 (YW182.5) y pueden activar FGFR1b en el ensayo con GAL-e Lk 1 en células L6, lo que contrasta con la actividad de BsAb10 (véase la fig. 2C y 2B).

Además, una combinación de FGFR1b y KLB no respaldó la activación por BsAb10 (fig. 9A). Sin ceñirse a ninguna teoría particular, estos datos sugieren que la presencia del complejo FGFR1/KLB preformado es un requisito previo para la activación de FGFR1 dependiente de KLB por BsAb10.

Ejemplo 8: BsAb10 y sus derivados actúan como miméticos moleculares de FGF21

Otras caracterizaciones de BsAb10 y sus derivados (BsAb11-20) y FGF21 revelaron algunas similitudes y diferencias. Para determinar el nivel de fosforilación de los intermedios en la señalización de MAPK, las células se cultivaron en medio basal de preadipocitos 2 que contenía FBS, L-glutamina y GA-1000. Una vez que sean confluentes, los preadipocitos subcutáneos (adquiridos de Lonza) se diferenciaron en medios de cultivo que contenían dexametasona, indometacina y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). Para el análisis de expresión génica, las células se diferenciaron durante 14 días y, a continuación, se cultivaron además durante 48 h adicionales con los agonistas indicados. Para el análisis de señalización de MAPK, las células se diferenciaron durante 10 días, se cultivaron en medio libre de suero durante 3 h y, a continuación, se cultivaron durante una hora adicional con los agonistas indicados.

Como se muestra en la fig. 6D, BsAb10, BsAb17, BsAb20 y FGF21 mostraron una actividad comparable para inducir la fosforilación de los intermedios en la señalización de MAPK, tales como MEK y ERK, en adipocitos humanos primarios, que representan el tipo de célula pertinente para la actividad antidiabética de FGF21, como se determina por inmunoelectrotransferencia. Los anticuerpos usados para el análisis de inmunoelectrotransferencia fueron de Cell Signaling Technology: pFRS2a (T196) (n.° 3864), pMEK1/2 (S217/221) (n.° 9154), pERK1/2 (T202/204) (n.° 4370), ERK1/2 (n.° 4695), HSP90 (n.° 4874), p-actina (n.° 5125), de abcam: UCP1 (ab10983) o de R&D Systems: KLB (AF2619).

Como se muestra en la fig. 8B, se observó un incremento de la fosforilación de ERK, representado como un cambio en veces de los niveles de pERK, en adipocitos humanos primarios tratados con BsAb10, BsAb17, BsAb20 o FGF21.

Además, el perfil de afinidad de BsAb10 se asemeja al de FGF21. Cuando se sometió a prueba por FACS, BsAb10 mostró una fuerte unión a células que expresaban hKLB, tanto como si se coexpresaba FGFR1c o no (fig. 10A). De forma sorprendente, se observó muy poca unión de BsAb10 cuando las células expresaban FGFR1c, pero no KLB, lo que indica que la afinidad monovalente del brazo de YW182.5 es extremadamente baja (fig. 10A).

Como se muestra en la fig. 10B, un ensayo de ligando radiomarcado indicó que la constante de disociación (Kd) de BsAb10 con respecto a las células que expresan tanto FGFR1c como KLB es de 2,3 nM, cerca de 5,3 nM observada para hFGF21 en un formato de ensayo similar. Estos valores estaban cerca de la CE50 observada de estas moléculas en el ensayo con GAL-ELK1 en células HEK293 (3,2 nM y 4,7 nM, respectivamente, para BsAb10 y FGF21. Cuando las células expresaban KLB humano solo, o KLB de ratón solo, la Kd era de 6,6 nM y 15,5 nM, respectivamente.

Puesto que la afinidad por FGFR1 era tan baja, el ensayo de ligando de radiomarcaje no pudo determinar de forma fiable la Kd de BsAb10 con respecto a las células que expresaban solo FGFR1c, pero se estimó que era > 300 nM, como se muestra en la fig. 3B. Debido a un motivo similar, tampoco se pudo determinar de forma fiable la cinética de unión de BsAb10 a FGFR1 por RPS.

Además, la interacción entre las proteínas DEC de FGFR1c y DEC de KLB se estabilizó por BsAb10 como se observó previamente para FGF21, consecuente con la noción de que BsAb10 actúa como un mimético de FGF-21 selectivo de FGFR1c (fig. 11) (Yie et al., Chemical Biology; Drug Design 79, 398-410 (2012)). La interacción FGFR1/KLB/BsAb10 se estudió por mediciones de resonancia de plasmón superficial (RPS) en un instrumento PROTEON™ XPR36 (Bio-Rad Laboratories) a 25 °C. La proteína f Gf R1-HIS (20 |jg/ml) a pH 4,5 se inmovilizó a una densidad superficial (1000 UR) en un chip de sensor PROTEON™ GLC activado usando procedimientos estándar de acoplamiento de amina como se describe por el fabricante. Se inyectaron BsAb10 y/o mezclas 1:1 de BsAb10 y DEC de KLB a 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM o 200 nM en PBS que contenía TWEEN®-20 al 0,005 % v/v, NaCl 0,3 M (pH 7,4) a un caudal de 80 jl/m in y se registraron sensogramas para las fases de asociación y desasociación. Los analitos se inyectaron durante 300 s y se dejó que se desasociaran durante 600 s. Los datos se referenciaron con puntos intermedios, se procesaron y se midieron las constantes de desasociación con el programa informático PROTEON™ Manager (versión 3.0, Bio-Rad). La activación del complejo FGFR1c/KLB por BsAb10 sugirió la formación del complejo ternario por DEC de FGFR1c, DEC de KLB y BsAb10.

Como se muestra en la fig. 11, también se observó que BsAb10 formaba un complejo ternario con DEC de KLB recombinante y FGF21 o FGF19. La interacción BsAb10/KLB/FGF se estudió por mediciones de interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED (ForteBio) a 25 °C. Se inmovilizó BsAb10 (20 jg/m l) a pH 4,5 en puntas de biosensor reactivo con amina activado como se describe por el fabricante. Se capturó DEC de KLB (20 jg/m l) en PBS que contenía TWEEN®-20 al 0,005 % v/v, NaCl 0,3 M (pH 7,4) en las mismas puntas de biosensor y se midió con FGF21 (R&D Systems) a 0, 0,2, 0,8, o 2 jM en el mismo tampón. Los datos cualitativos se procesaron con el programa informático de adquisición de datos (ForteBio).

La figura 12A muestra un esquema de un experimento de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) en superficie celular que se realizó. Para TR-FRET, las células COS7 se cotransfectaron para expresar FGFR1 marcado con SNAP y KFB sin marca y se sembraron en una placa de 96 pocillos de fondo blanco (Costar) a 100.000 células por pocillo. Las células transfectadas se marcaron 24 h después de la transfección con 100 nM de bencilguanina-SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) conjugado a donante y 1 jM de bencilguanina-SNAPAlexa647 (NEB) conjugado a aceptor durante 1 h a 37 °C, 5 % de CO2. Después de tres lavados, la emisión de Lumi4-Tb y la señal de TR-FRET se registraron a 620 nm y 665 nm, respectivamente, durante 400 ps después de un retraso de 60 ps tras la excitación por láser a 343 nm usando un lector de placas Safire2 (Tecan) a t=0 y t=15 min después de la adición de ligando. La señal de emisión del Alexa647 se detectó a 682 nm después de la excitación a 640 nm usando el mismo lector de placas. A continuación, la intensidad de FRET se calculó como: (señal a 665 nm de células marcadas con SNAP-donante y SNAP-aceptor) - (señal a 665 nm del mismo lote de células transfectadas marcadas con SNAP-donante y SNAP no marcado).

Como se muestra en la fig. 12B, el experimento de TR-FRET sugirió que tanto BsAb17 como FGF21 potencian la dimerización de DEC de FGFR1c cuando KFB también está presente en la célula. Los resultados se mostraron como proporción de FRET: intensidad de FRET dividida por la emisión del donante a 620 nm.

Además, BsAb10 se une a la mitad C terminal de DEC de KFB, aunque se ha creído que FGF21 y FGF19 se unen al mismo sitio en KLB en la mitad N terminal (Goetz et al. Mol. Cell. Biol. 32(10): 1944-54 (2012); Foltz et al. Sci. Transí. Med. 4: 162ra153 (2012)), lo que sugiere que el epítopo de BsAb10 en KFB debe de ser distinto del sitio de unión para FGF21 y FGF19. Para cartografiar el epítopo de KFB para BsAb10, la unión de 8C5 (el brazo de unión a KLB de BsAb10) a una serie de antígenos quiméricos expresados en células HEK293. Cada quimera se construyó fusionando KLB humano y proteína Klotho alfa humana (KLA) (50 % de identidad con respecto a las proteínas KLB humanas) o KLB de conejo (86 % de identidad con respecto a la KLB humana). Como se resume en la fig. 13A, 8C5 se une al dominio C terminal de KLB, en particular, en la región que contiene 34 aminoácidos en el ^{dominio C terminal de k lb}(SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS; SEQ ID N0: ¹⁴²⁾

Como se muestra en la fig. 13B, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 puede corresponder a los aminoácidos 857-890 de una proteína KLB que incluya una secuencia señal, por ejemplo, tal como una secuencia de 52 aminoácidos que tenga la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 157, o se puede referir a los aminoácidos 805-838 de una proteína KLB que no incluya una secuencia señal.

A pesar de la similitud entre FGF21 y BsAb10 y sus derivados en la acción en dirección 3', el epítopo de BsAb10 en k Lb es distinto del sitio de unión para FGF21 y FGF19 (fig. 14A).

La fig. 14B muestra los resultados de un ensayo de luciferasa con GAL-ELK1 realizado en células de mioblasto L6 de rata cotransfectadas con FGFR4 y KLB y tratadas con FGF19 solo o en combinación con un anticuerpo anti-KLB/anti-FGFR1c (BsAb17). Como se muestra en la fig. 14B, el pretratamiento con BsAb17 tampoco bloqueó la actividad de FGF-19 en células L6 que expresaban el complejo FGFR4/KLB.

Adicionalmente, y como se muestra en la fig. 14C, el pretratamiento con BsAb17 no bloqueó la actividad de FGF-19 en células de hepatoma H4IIE que expresaban FGFR4 y KLB. En presencia de BsAb17, FGF19 todavía podía activar el complejo FGFR4/KLB para inducir la fosforilación de ERK (fig. 14C). Estos datos indican que el anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c, no interfiere en la interacción de FGF-19 o FGF21 con el complejo KLB/FGFR1c.

Ejemplo 9: BsAb10 y sus derivados actúan como un mimético de FGF21 de acción prolongada in v iv o

La reactividad cruzada de BsAb10 y sus derivados con el complejo de receptores murinos como se describe anteriormente (véase, por ejemplo, la fig. 6C y 10B) permitió someter a prueba su actividad in vivo en modelos de ratón. Para evitar la potencial toxicidad de la función efectora de IgG, se introdujo una mutación doble [D265A/N297G] en BsAb20 en la región Fc que anula la unión a FcgR y el reclutamiento de células efectoras inmunitarias. Además, para evitar la potencial toxicidad de la función efectora de IgG, se introdujo N297G en BsAb17 en la región Fc que anula la unión a FcgR y el reclutamiento de células efectoras inmunitarias.

Como se muestra en la fig. 15A, cuando se inyectó i.p. en ratones db/db diabéticos a 5 mg/kg, BsAb17 redujo los niveles de glucemia en un grado similar sin afectar a la ingesta de alimento o al peso corporal. Los ratones C57BL/6 magros tratados con BsAb17 mostraron glucemia reducida, pero no lograron hipoglucemia tóxica (fig. 15A).

Además, cuando a los ratones C57BL/6 alimentados con una dieta hiperlipídica (obesidad inducida por dieta, DIO) se les inyectó BsAb17 a 3 mg/kg el día 0 y 6, se observaron reducciones significativas de pérdida de peso y glucemia (fig. 15B). Para la alimentación con una dieta hiperlipídica, se usó una dieta hiperlipídica y con alto contenido de carbohidratos (Harlan Teklad TD.03584, un 58,4 % de calorías procedentes de grasa).

Como se muestra en la fig. 15C, se observó una mejora en la tolerancia a la glucosa en ratones C57BL/6 alimentados con una dieta hiperlipídica (obesidad inducida por dieta, DIO) a los que se les inyectó BsAb17 a 3 mg/kg.

También se observaron reducciones de los triglicéridos hepáticos, insulina en suero, ácidos grasos libres, triglicéridos y colesterol total en ratones C57BL/6 alimentados con una dieta hiperlipídica (obesidad inducida por dieta, DIO) a los que se les inyectó BsAb17 a 3 mg/kg (fig. 15D). Previamente se observaron resultados similares con inyecciones de FGF21.

Se realizó un experimento separado en ratones heterocigóticos para klb y ratones carentes de klb homocigóticos para determinar si la mejora en la tolerancia a la glucosa observada tras el tratamiento con un anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c requiere KLB funcional. Para generar ratones carentes (con desactivación génica de) de klb se obtuvo un par de nucleasas con dedos de cinc (ZFN) específicas de Klb de Sigma-Aldrich y se usó para microinyección pronuclear de acuerdo con procedimientos establecidos. El par de ZFN selecciona como diana la siguiente secuencia de Klb en el genoma de ratón (sitio de corte en letras minúsculas), y los ratones con desactivación génica carecen de una deleción de pb (g en negrita), lo que provoca un cambio del marco:

GTTACCGGCTTCtccgjjíiGACGGGAAAGCAATATGG (SEQ |D N0: 156) La f¡g 16A muestra |a secuencia de aminoácidos N terminal de la proteína KLB de ratón y la correspondiente secuencia de aminoácidos codificada por el alelo de klb en los ratones carentes de klb.

La figura 16B muestra los resultados de una inmunoelectrotransferencia que se realizó para confirmar la carencia de expresión de la proteína KLB en ratones carentes de klb.

Como se muestra en la fig. 16C, BsAb20 mejoró la tolerancia a la glucosa en ratones heterocigóticos para klb como se mide por la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT), pero no ratones carentes de klb homocigóticos, lo que indica que las mejoras en la tolerancia a la glucosa requieren KLB funcional. Para la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT), los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche y se les inyectaron i.p. 2 g/kg de solución de glucosa.

Además, a diferencia del R1Mab1 anti-FGFR1, que altera los niveles de FGF23 y fósforo en suero (Wu et al., Sci Transí Med 3, 113ra126 (2011) y Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013)), el anticuerpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 no afectó a estos parámetros en suero, lo que indica la ausencia de actividad agonista de FGFR1 independiente de KLB (fig. 16D).

Como se muestra en la fig. 17, BsAb17 no alteró los niveles de FGF23 o fósforo en suero, que son marcadores sensibles de FGFR1 independiente de KLB. La acción de la insulina en ratones tratados con BsAb17 se midió por pinzamiento hiperinsulinémico-normoglucémico. En resumen, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se cateterizaron la arteria carótida común izquierda y la vena yugular derecha para la toma de muestras e infusión, respectivamente. Los extremos libres de los catéteres se tunelizaron bajo la piel hasta la parte posterior del cuello, donde los extremos sueltos de los catéteres se fijaron a un tubo fabricado de MICRO-RENATHANE® (0,033 en DO). Los animales se alojaron individualmente después de la cirugía y el peso corporal se registró diariamente. Todos los experimentos metabólicos se realizaron tras un periodo de recuperación posoperatoria de 5 días y se han descrito previamente. Se colocaron ratones conscientes y sin restricciones en un recipiente de plástico de 1 l revestido con lecho de paja y se les mantuvo en ayunas a las 7:00 h (t=-300 min). Los ratones se conectaron de inmediato a una placa giratoria de acero inoxidable de doble canal (Instech Laboratories) para permitir la infusión simultánea en la vena yugular y la toma de muestras de sangre arterial. Los ratones no se manipularon y se dejó que se movieran libremente para eliminar el estrés. 2 h antes del inicio del pinzamiento, se administró un bolo de 5 |^jC¡ de [3-3H]-D-glucosa en la vena yugular (t=-120 min), seguido de una infusión constante a una tasa de 0,05 jCi/min. Después de un periodo de equilibrio de 2 h a t=0 min (es decir, un ayuno de 5 h) se extrajo una muestra de sangre arterial de valor de referencia para la medición de glucemia, [3-3H]-D-glucosa, hematocrito e insulina en plasma. A continuación, se inició un pinzamiento hiperinsulinémico-normoglucémico (4 mU/kg/min) de 145 min. Se añadió [3-3H]-D-glucosa a la infusión de glucosa variable que se usó para mantener la normoglucemia y se interrumpió la infusión constante de [3-3H]-D-glucosa para pinzar la actividad específica de glucosa arterial a un nivel constante. Los glóbulos rojos de un ratón donante en un fondo de C57B1/6J se lavaron y reconstituyeron en un volumen equivalente de solución salina heparinizada al 0,9 % (hematocrito ~50 %) y se infundieron a una tasa de 4 jl/m in durante la duración del estudio para reemplazar la sangre extraída durante el estudio. Se tomaron muestras de sangre arterial cada diez minutos para determinar los niveles de glucemia. En t=80, 90, 100 y 120 min, se tomaron muestras de sangre para determinar [3-3H]-D-glucosa. A t=120 min, se administró un bolo de 13 jC i de 2-desoxi[14C]glucosa ([2-14C]DG) en el catéter de la vena yugular. A t=122, 125, 130, 135 y 145 min, se tomaron muestras de sangre arterial para determinar la glucemia, [3-3H]-D-glucosa y [2-14C]DG en plasma. La concentración de insulina arterial se midió a los 100 y 120 min. A continuación, a t=145 min, los ratones se anestesiaron. Se extirparon el sóleo, gastrocnemio, vasto externo superficial blanco (Quad), hígado, corazón, tejido adiposo blanco epididimario y subcutáneo, tejido adiposo pardo y cerebro, se congelaron de inmediato en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C hasta un futuro análisis tisular. La insulina inmunorreactiva se sometió a ensayo usando un kit de radioinmunoanálisis Linco Rat (LincoResearch).

Para medir la [3-3H]-D-glucosa, las muestras de plasma se desproteinizaron con hidróxido de bario (Ba(OH)2) y sulfato de cinc (ZnSO4), se secaron y se determinó la radioactividad usando recuento de centelleo líquido. Los tejidos extirpados se desproteinizaron con ácido perclórico y, a continuación, se neutralizaron a un pH de ~7,5. Se contó una porción de la muestra ([2-14C]DG y [2-14C]DG-Gfosfato ([2-14C]DGP) y una porción se trató con Ba(OH)2 y ZnSO4 y el sobrenadante se contó ([2-14C]D^g). Los niveles de radioactividad de [2-14C]DG y [2-14C]DG-fosfato ([2-14C]^dG^p) se determinaron usando recuento de centelleo líquido. Las tasas de flujo de glucosa se evaluaron usando ecuaciones en estado no estacionario teniendo en cuenta un volumen de distribución (130 ml/kg). Se calcularon el aclaramiento específico de tejido (Kg) de [2-14C]DG y un índice de absorción de glucosa (Rg) como se describe previamente (Kraegen, E.W. et al., Am. J. Physiol. 248, E353-362 (1985)): Kg=[2-14C]DGptej¡do/ABC [2-14C]DGplasma, Rg=Kg x [glucosa]plasma, donde [2-14C]DGptejido es la radioactividad (dpm/g) de [2-14C]DGP en el tejido, el ABC [2-14C]DGplasma es el área bajo la curva de desaparición de [2-14C]DG en plasma (dpm/ml/min) y [glucosa]plasma es la glucemia promedio ( jg / j l) durante el periodo experimental (t=102-125 min). Los datos se presentan como media ± EEM.

Como se muestra en la fig. 15E, que representa la utilización de glucosa en todo el cuerpo medida tras una inyección única de BsAb17 a 10 mg/kg, BsAb17 mejoró las tasas de utilización de glucosa en todo el cuerpo estimulada por insulina.

Además, y como se muestra en la fig. 15F, BsAb17 mejoró la supresión de insulina de las tasas de producción de glucosa endógena tras una inyección única de BsAb17 a 10 mg/kg. Estos resultados indican que una inyección única de 10 mg/kg de BsAb17 en ratones con DIO 5 días antes del pinzamiento redujo notablemente las concentraciones de glucosa e insulina en ayunas.

La absorción de glucosa tisular (Rg) al final del periodo estimulado por insulina se potenció en el corazón, músculo esquelético, tejidos adiposos blancos (WAT) y tejido BAT interescapular (iBAT), lo que indica una sensibilización a la insulina en todo el cuerpo por BsAb17 (fig. 15G).

La cantidad de fluctuación de glucosa en sangre arterial se determinó durante el experimento de pinzamiento. Como se muestra en la fig. 18A, la cantidad de fluctuación de glucosa en sangre arterial fue diferente entre ratones a los que se les inyectó BsAb17 frente a los ratones a los que se les inyectó IgG de control durante el experimento de pinzamiento hiperinsulinémico-normoglucémico.

También se determinó la diferencia en peso entre los ratones a los que se les inyectó BsAb17 frente a los ratones a los que se les inyectó IgG de control. Como se muestra en la fig. 18B, los cambios observados en las concentraciones de glucosa e insulina fueron sin una pérdida evidente de peso.

También se analizó la tasa de infusión de glucosa en estado estacionario tras una inyección con BsAb17. Como se muestra en la fig. 18C, la tasa de infusión de glucosa en estado estacionario se incrementó en un 64 % tras una inyección de BsAb17. Estos resultados demuestran que BsAb17 mejoró la sensibilidad a la insulina en todo el cuerpo en ratones con DIO incluso antes de que la pérdida de peso se vuelva evidente.

Los estudios previos con dosis farmacológicas de FGF19 o FGF21 han demostrado un gasto energético (EE) incrementado (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013); Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013)), por tanto, se razonó que se observaría un efecto similar. Se usaron las siguientes ecuaciones para calcular el EE y el cociente respiratorio (RQ). EE=VO2X(3,815+1,232xRQ), donde (RQ=VCO2/VO2). De hecho, la inyección de BsAb17 única en ratones con DIO o magros a temperatura ambiente normal (21 °C) dio lugar a un incremento significativo del consumo de O2 (VO2), la producción de CO2 (VCO2) y un EE por animal inyectado sin cambio significativo en el recuento de actividad (fig. 19A). De forma inesperada, el incremento de un 15-46 % observado en EE no acompañó cambios significativos en los cocientes respiratorios (RQ=VCO2/VO2) (fig. 19A).

Se provocó un incremento similar de EE sin cambio en RQ por infusión continua de FGF21 en ratones con DIO (fig.

21C).

La fig. 20A muestra la cantidad de VO2, VCO2 y los recuentos de actividad total de ratones con DIO tratados con una inyección de BsAb17 única a temperatura ambiente normal.

Como se muestra en la fig. 19B, el incremento de EE se mantuvo cuando la temperatura de la jaula se elevó a la termoneutralidad (29-30 °C), lo que sugiere que la inducción de BsAb17 de la activación de grasa parda no depende de la entrada termogénica adaptativa del sistema nervioso simpático.

La fig. 20B muestra la cantidad de VO2, VCO2 y los recuentos de actividad total de ratones con DIO tratados con una inyección de BsAb17 única a temperatura ambiente normal seguido de un cambio de temperatura a la termoneutralidad.

También fue evidente un incremento de EE cuando se sometieron a prueba ratones con DIO aclimatados a temperatura ambiente termoneutra (29-30 °C) durante dos semanas (fig. 21B).

Como se resume en la fig. 21A, que muestra los valores de EE promedio, se observaron cambios en EE en ratones magros y con DIO a temperatura ambiente normal y en ratones magros y con DIO aclimatados a temperatura ambiente termoneutra.

Por el contrario, una infusión continua con el agonista de adrenoceptor específico p3 CL-316.243 indujo un incremento agudo de EE y una reducción de RQ como se anticipó (fig. 19H). La infusión continua de FGF21 o CL-316.243 se realizó usando una minibomba osmótica (Alzet 2001) que se implantó por vía subcutánea. Por tanto, el EE inducido por BsAb17 y FGF21 es sólido, pero parece más selectivo que otros mecanismos de activación de BAT descritos previamente, tales como la administración de simpaticomiméticos (norepinefrina o agonista de adrenoceptor específico p3 CL-316.243), péptidos natriuréticos cardíacos o interleucina-4, que acompañan la promoción de la oxidación lipídica y la reducción de RQ (Gerhart-Hines et al., Mol. Cell 44, 851-863 (2011); Mattsson et al., American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 299, E374-383 (2010); Nguyen et al., Nature 480, 104-108 (2011); Birkenfeld et al. Diabetes 57, 3199-3204 (2008); Bordicchia et al., J. Clin. Invest. 122, 1022-1036 (2012); y de Souza et al., Diabetes 46, 1257-1263 (1997)).

Sin ceñirse a ninguna teoría particular, varias líneas de evidencia sugirieron el papel dominante de la activación de BAT en la acción metabólica de BsAb17. En primer lugar, como se muestra en la fig. 19C, la inyección de BsAb17 incrementó la absorción de 18F-fludesoxiglucosa (FDG) específicamente en iBAT.

En segundo lugar, una inyección de BsAb17 única indujo la expresión de la proteína UCP1 en WAT inguinal (ingWAT), lo que es indicativo del oscurecimiento del tejido adiposo (fig. 19D).

Como se muestra en la fig. 19E, también se observó la inducción de la expresión de UCP1 en adipocitos primarios cultivados tratados con FGF21 o BsAb17, lo que indica una acción directa sobre los adipocitos maduros. Para determinar la expresión de UCP1, se usó ARN total para sintetizar ADNc usando el kit de síntesis de ADNc SUPERSCRIPT® VILO (ABI). Para qPCR, las muestras se procesaron por triplicado en el instrumento de PCR ultrarrápida ViiA7 (Applied Biosystems). La sonda de ensayo de expresión génica TAQMAN® prediseñada de Applied Biosystems usada fue UCP1 (Hs01027785_m1). Para cada muestra, la abundancia de ARNm se normalizó a la cantidad de transcritos de TBP (Hs00427620_m1) y SDHA (Hs00188166_m1).

En tercer lugar, usando el sistema de telemetría, se observó un incremento de la temperatura corporal central en reposo después de una inyección de BsAb17 única que duró >26 días antes de volver gradualmente al valor de referencia (fig. 19F).

La fig. 22 muestra las diferencias en la temperatura corporal central que se observaron en los ratones después de una inyección de BsAb17 única en comparación con los ratones tratados con IgG de control. Las temperaturas corporales centrales se supervisaron usando un transmisor TA-F10 (Data Sciences International, DSI) que se implantó quirúrgicamente en la cavidad peritoneal. Después de la recuperación de la cirugía, los ratones se aleatorizaron en grupos en base al peso corporal y temperatura corporal central. La temperatura corporal central y la actividad se supervisaron usando el sistema de telemetría implantable DSI.

Los perfiles de expresión génica se analizaron en iBAT de ratones con DIO que recibieron una inyección única de BsAb17, FGF21 o IgG de control. Como se muestra en la fig. 19G, una inyección de BsAb17 única indujo cambios en la expresión génica en iBAT que se asemeja a inyecciones dos veces al día con FGF21.

Finalmente, cuando se inyectaron en ratones C57BL/6, tanto FGF21 como BsAb20 indujeron la fosforilación de ERK y MEK en diversos tejidos adiposos, incluyendo iBAT e ingWAT (fig. 23).

En estudios previos, se sugirió que la adiponectina contribuía a la acción completa de FGF21 (Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17, 790-797 (2013)). De hecho, la inyección única de BsAb17 en ratones con DIO dio lugar a un incremento de los niveles de adiponectina de peso molecular alto (PMA) en suero, con pérdida de peso asociada (fig. 24A).

De forma similar, una inyección única de BsAb17 en macacos cangrejeros magros (fig. 24B) dio lugar a un incremento de los niveles de adiponectina de peso molecular alto (PMA) en suero, con pérdida de peso asociada.

Como se muestra en la fig. 24C, tras una inyección única de BsAb17, los ratones con desactivación génica para adiponectina (Adipoq) en HFD presentaron una sólida respuesta en la elevación de EE (incremento de un 25,3 % frente a incremento de un 20,9 % en ratones wt).

Además, tras una inyección única de BsAb17, los ratones con desactivación génica para adiponectina (Adipoq) en HFD presentaron un peso corporal y niveles de triglicéridos hepáticos reducidos (fig. 24D). Sin embargo, la respuesta en la tolerancia a la glucosa, tolerancia a la insulina, cambios en la insulina en suero y diversos lípidos se atenuaron algo en los ratones con desactivación génica (fig. 24D), de forma consecuente con la idea de que BsAb17 actúa como un mimético de FGF21 en la regulación del metabolismo de nutrientes en todo el cuerpo en parte por medio de la función de adiponectina. Para determinar la tolerancia a la insulina, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 h y se les inyectó i.p. 1 U/kg de solución de insulina humana (Humulin R, Eli Lilly and Company).

La selectividad intensificada del receptor de BsAb10 (véase la fig. 9A) y la baja penetración cerebral de las moléculas de IgG descrita previamente (Yu et al., Sci TransíMed 3, 84ra44 (2011)) predicen un perfil de seguridad alterado de BsAb10 y sus derivados en comparación con FGF21/19. Consecuente con el bajo nivel de expresión de FGFR1 en el hígado, FGF21, pero no BsAb17, indujo la expresión de ARNm de los genes diana de FGFR clásicos Spry4 y Dusp6 en el hígado (fig. 25).

BsAb17 o BsAb20 también dieron como resultado una señal de fosfo-ERK incrementada en diversos tejidos adiposos y células acinares pancreáticas, pero no en el hígado (fig. 23).

La fig. 26 muestra que BsAb17 tampoco incrementa la fosforilación de ERK en diversos cortes cerebrales, incluyendo órganos periventriculares, como se determina por inmunohistoquímica.

Además, el tratamiento prolongado con BsAb20 de ratones con DIO durante 8 semanas redujo el número de células BrdU+ en el hígado al nivel de ratones C57BL/6 magros, lo contrario de lo que se esperaba para la actividad similar a FGF19 (fig. 27). Para la incorporación de BrdU hepática, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 100 mg/kg de BrdU (BD Biosciences) 2 h antes de sacrificarlos. La tinción anti-BrdU se llevó a cabo como se describe (Nicholes, K., et al. Am. J. Pathol. 160, 2295-2307 (2002)) y los hepatocitos positivos para BrdU se contaron usando el sistema de análisis de imágenes automatizado Ariol.

Se realizó el análisis óseo de ratones que se trataron con un anticuerpo anti-KLB/anti-FGFRIc. La fig. 28A muestra una representación esquemática del análisis. Para realizar el análisis óseo, se formaron imágenes de muestras de fémur por un sistema de formación de microimágenes |^jCT40 de SCANCO Medical (Basserdorf, Suiza) que funciona con un nivel de energía de tubo de rayos X de 70 keV y una corriente de 114 microamperios. Se obtuvieron cortes de imágenes axiales contiguas con un tamaño de vóxel isotrópico de 12 jm . El análisis morfométrico del hueso trabecular dentro del fémur se realizó con el programa informático de evaluación jCT40 de SCANCO Medical (Basserdorf, Suiza). Se usó un contorneado semiautomatizado para definir un volumen de interés (VDI), que comprende el hueso trabecular secundario dorsal con respecto a la placa de crecimiento del fémur proximal y que se extiende 1,5 mm distal al hueso trabecular primario. El hueso cortical se excluyó por la colocación de los límites del VDI dentro del límite interior del hueso cortical. Antes de la segmentación de imágenes, se aplicó un filtro de paso bajo gausiano tridimensional (3D) restringido a los datos de imagen para la supresión del ruido (filtro sigma=0,5, soporte de filtro=1). Se aplicó un umbral global (0,36 gHA/cm3) para extraer una estructura trabecular "binarizada" del VDI. El umbral de segmentación trabecular se eligió por inspección visual de los resultados de segmentación de un subconjunto representativo de las muestras. Las características estructurales trabeculares se cuantificaron por análisis morfométrico en 3D directo. Los estudios previos han demostrado que el análisis morfométrico del hueso trabecular por microtomografía computarizada se correlaciona bien con estimaciones similares realizadas por histomorfometría.

Como se muestra en la fig. 28B, el tratamiento con BsAb20 prolongado de ratones con DIO durante 6 semanas dio como resultado los cambios esperados en los parámetros metabólicos sin ninguna señal negativa en diversos parámetros óseos en huesos corticales femorales y trabeculares tibiales en base a microtomografía computarizada.

Como se muestra en la fig. 29, la inyección de BsAb17 en ratones con DIO no incrementó los niveles de corticosterona en suero por encima del control. El balance energético positivo crónico común en la sociedad moderna ha estado promoviendo la pandemia de obesidad y las alteraciones metabólicas asociadas caracterizadas por la resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperlipidemia y hepatoesteatosis, que, a menudo, dan lugar a enfermedades graves, tales como diabetes de tipo 2, cirrosis, apoplejía y cardiopatía. En 2009, se informó de la presencia de BAT positivo para UCP1 en seres humanos adultos y su importancia funcional en la promoción del EE por medio de disipación de calor, lo que despertó un inmenso interés en la inducción terapéutica y activación de ^bA^tpara el tratamiento de la obesidad y enfermedad metabólica relacionada (Yoneshiro y Saito, Ann. Med., 1-9 (2014)).

Sin embargo, la mayoría de los mecanismos de activación de BAT conocidos también inducen la lipólisis de tejido adiposo blanco, lo que puede tener un impacto negativo sobre la respuesta cardiovascular (Dong et al., CellMetab.

18, 118-129 (2013)). Cabe señalar que el trasplante de BAT incrementa el EE e induce la pérdida de peso sin cambios en el RQ (Stanford et al., J. Clin. Invest. 123, 215-223 (2013)). A este respecto, FGF21 y el anticuerpo agonista anti-FGFR1/KLB descrito en el presente documento presentan un enfoque único para inducir selectivamente una respuesta termogénica en BAT sin cambiar RQ, imitando, por tanto, el trasplante de BAT, en lugar de una simpatoactivación no específica. Además, en base a lo que se observó en ratones, se contempla que la activación mediada por anticuerpo del complejo FGFR1c/KLB pueda proporcionar un medio más seguro y más eficaz para el tratamiento antiobesidad y antidiabético, a diferencia de la activación del complejo FGFR/KLB más amplia por análogos de FGF21 o FGF19.

Ejemplo 10: humanización del anticuerpo anti-KLB 8C5

Las CDR de la cadena ligera murina de 8C5 se injertaron en las regiones estructurales de la cadena ligera Kappa2 y Kappa4 humanas. Además del injerto primario, también se generaron mutaciones puntuales en cada una, de modo que la posición 4 de la cadena ligera se convirtió en una leucina (designada como "M4L"). Se realizó un análisis para identificar aquellas que se expresaban mejor y no mostraban una agregación significativa. De forma similar, las CDR de la cadena pesada se injertaron en las regiones estructurales de la cadena pesada de IgG1 humana H1, H2, H3 y H4. Se mutaron diversos residuos en las cadenas principales de la cadena pesada como sigue: para H1, se introdujeron los siguientes cambios: K71R, N73T y V78A (origen designado como "KNV" y construcción designada como "RTA"); para H2, se introdujo el siguiente cambio: N73T (origen designado como "KNV" y construcción designada como "KTV"); para H3, se introdujeron los siguientes cambios: K71R y V78L (origen designado como "KNV" y construcción designada como "RNL"; y, para H4, se introdujeron los siguientes cambios: K71V, N73T y V78F (origen designado como "KNV" y construcción designada como "VTF").

Se produjeron anticuerpos en base a todas las combinaciones por pares de las 4 cadenas ligeras y 8 cadenas pesadas (para un total de 32 anticuerpos) y se sometieron a prueba los niveles de expresión y la afinidad. En base a estos experimentos, la cadena ligera K4.M4L y la cadena pesada H3.KNV derivadas de 8C5 presentaron la mejor combinación de nivel de expresión y afinidad deseada.

Las secuencias de las regiones variables de 8C5.K4.M4L.H3.KNV y el anticuerpo de longitud completa son como sigue:

Región variable de la cadena pesada de 8C5.K4.M4L.H3.KNV

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEW

LGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDY GSTYVDAIDYWGQGTLVTVSS ^{(SEQ ID NO: 128)}

Cadena pesada completa de 8C5.K4.M4L.H3.KNV

E VQLVESGGGLVQPGGS LRLSC AASDFSLTTY GVHW VRQ APGKGLEW

LG VIWSGGSTD YN AAFIS RLTIS KDN S KNTV YLQMN S LRAEDTA V YYC ARD Y GSTYVDAIDYWGQGTLVT VS S ASTKGPS VFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVS WNSGALT S G VHTFPA VLQS S GLYSLS S VVT VPS S S LGTQTYICN V NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW Y VDGVE VHN AKTKPREEQY GSTYR V VS VLT VLHQDWLNGKE YKCKV S NKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPS REEMT KN QVSLSC A VKGFYPS DIA VEWES NGQPENN YKTTPPVLDS DGS FFLV S KLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ |D NQ.12g)

Región variable de la cadena ligera de 8C5.K4.M4L.H3.KNV

DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYMTWYQQKPGQPP

KLLIYRAANLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPWT

^{f g q g t k v e ik}(SEQIDNO:130)

Cadena ligera completa de 8C5.K4.M4L.H3.KNV

D1VLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYMTWYQQKPGQPP

KLLIYRAANLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPWT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC ^{(SEQ ID NO: 131)}

Ejemplo 11: generación de un anticuerpo anti-FGFRI híbrido entre YW182.3 e YW182.5

Se descubrió que YW182.5, que era el brazo anti-FGFR1 que no activaba el complejo KLB/FGFR1c en ausencia de un brazo anti-FGFR1, daba buenos resultados al combinarse con 8C5, y que tiene un triptófano en la posición 33 de la cadena pesada que es susceptible a la oxidación. YW182.2, que parece unirse al mismo epítopo que YW182.5, también tiene un triptófano de este tipo en la posición 33 de la cadena pesada. Se introdujeron varias mutaciones en esta posición para obviar este problema: para YW182.5, se introdujeron W33Y, W33h , W33F y W33L, y, para YW182.2, se introdujeron W33Y y W33F. De forma sorprendente, las mutaciones introducidas tuvieron efectos diferentes en los dos anticuerpos. En el caso de YW182.2, se observó que las mutaciones no afectaban apreciablemente a la afinidad o actividad agonista con respecto a FGFR1, mientras que, para YW182.5, las mutaciones disminuyeron en gran medida la afinidad y actividad agonista con respecto a FGFR1 (véase, por ejemplo, la fig. 31). Por lo tanto, se realizaron experimentos para identificar un anticuerpo con las mutaciones W33Y, pero con una afinidad más cercana a la del anticuerpo YW182.5 usando dos enfoques.

En un enfoque, para la secuencia de cadena pesada de YW182.2 W33Y, se realizó un barrido de alanina a través de CDR3, mutando las posiciones 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a y 100b a alanina. Se analizó la afinidad de los anticuerpos resultantes y se identificaron aquellos que retenían la afinidad muy alta del YW182.2 W33Y original (tabla 9).

Tabla 9. Afinidad de los derivados de YW182.2.

En un segundo enfoque, se mezclaron y combinaron las CDR del anticuerpo YW182.2 W33Y (con afinidad muy alta) y el anticuerpo YW182.5 W33Y (casi sin unión). Los anticuerpos YW182.2 W33Y e YW182.5 W33Y tienen secuencias de CDR idénticas en la cadena ligera (CDR-L1, RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 139); CDR-L2, SASFLYS (SEQ ID NO: 140); y CDR-L3 QQSYTTPPT (SEQ !D N0: 141), una única diferencia aminoacídica en ^{CDR-H1 (YW182.2W33Y CDR-H1,}STYIS ^{(SEQ ID NO: 152) eYW182.5 W33Y CDR-H1,}SNYIS ^{(SEQ ID NO:}136)); tres diferencias aminoacídicas en o contiguas a CDR-H2 (YW182.2 W33Y CDR-H2, ^{E1DPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 137 e YW182.5 W33Y,}EIDPYDGATDYADSVKG ^{(SEQ ID NO: 153)); y secuencias de CDR-H3 muy diferentes (YW182.2 W33Y,}EHFDAWVHYYVMDY ^{(SEQ ID NO: 154) e}YW182.5 W33Y GTDVMDY (SEQ ID NO: 138). Se construyeron y se sometieron a prueba anticuerpos con cadenas pesadas en base a todas las posibles combinaciones de CDR de la cadena pesada de YW182.5 W33Y e YW182.2 W33Y (ocho, incluyendo los dos anticuerpos originales). La mayoría de los anticuerpos tenían una afinidad similar al uno o al otro, pero, de forma sorprendente, una combinación demostró una unión que era casi idéntica a la del anticuerpo YW182.5 original. Este anticuerpo tiene la CDR-H1 y la CDR-H3 de YW182.5 W33Y, pero la CDR-H2 de YW182.2 W33Y. Este anticuerpo se designó como "YW182.5 YGDY" para representar los siguientes cambios en la secuencia de YW182.5: w 33Y, A49G, A56D y D58Y.

Las secuencias del anticuerpo YW182.5 YGDY son como sigue:

Región variable de la cadena pesada de YW182.5_YGDY

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNY1SWVRQAPGKGLEW

VGEIDPYDGDTYYADS VKGRFTIS ADTS KNT A YLQMNSLRAEDT A V Y YC ATG TDVMDYWGQGTLVTVSS (SEQ |D N0:132)

Cadena pesada completa de YW182.5_YGDY

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNYISWVRQAPGKGLEW

VGEIDPYDGDTY Y ADS VKGRFTIS ADT S KNTA YLQMNS LRAEDTA VYYC ATG TDVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKC KV S NKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQ V YTLPPS REEMTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ |D NQ.133)

Región variable de la cadena ligera de YW182.5_YGDY

D1QMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI

YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTK VEIK(SE^{q id no}: 134).

Cadena ligera completa de YW182.5_YGDY

D1QMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI

YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC ^{(SEQ ID NO: 135)}

Ejemplo 12: pruebas de anticuerpos biespecíficos con variantes de 8C5 y anti-FGFRI humanizadas Se sometieron a prueba diversas combinaciones de anticuerpos biespecíficos de 8C5.K4H3.M4L.KNV y diferentes brazos anti-FGFR1 en el ensayo de luciferasa basado en GAL-ELK1 en células HEK293 que expresaban FGFR1c con o sin KLB. Como se observó previamente, cada combinación de anticuerpos biespecíficos indujo actividad luciferasa de una manera dependiente de la dosis en células que expresaban hFGFR1c y hKLB recombinantes, pero no en células sin expresión de KLB (fig. 30). Estos datos confirman que estas variantes modificadas retienen las ventajas de los anticuerpos originales, por ejemplo, BsAb13. La afinidad de unión de un anticuerpo anti-KLB/anti-FGFR1 que tiene un brazo de 8C5 humanizado (8C5.K4.M4L.H3.KNV) y un brazo de YW182.5_YGDY para complejos KLB/FGFR1c humanos, de macaco cangrejero y de ratón en la superficie de células HEK293 se muestra en la tabla 10.

Tabla 10. Afinidades de unión.

Además de los diversos aspectos de la divulgación representados y reivindicados, la materia objeto divulgada también está dirigida a otros aspectos de la divulgación que tienen otras combinaciones de los rasgos característicos divulgados y reivindicados en el presente documento. Como tales, los rasgos característicos particulares presentados en el presente documento se pueden combinar entre sí de otras maneras dentro del alcance de la materia objeto divulgada, de modo que la materia objeto divulgada incluya cualquier combinación adecuada de los rasgos característicos divulgados en el presente documento. La descripción anterior de aspectos específicos de la divulgación de la materia objeto divulgada se ha presentado con propósitos de ilustración y descripción. No se pretende que sea exhaustiva o que limite la materia objeto divulgada a aquellos aspectos de la divulgación divulgados.

Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones en las composiciones y procedimientos de la materia objeto divulgada.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a beta-Klotho (KLB) y al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1c (FGFR1c), que comprende:

(a) un primer brazo que comprende:

(i) un dominio con CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15, un dominio con CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 31, un dominio con CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 47, un dominio con CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 62, un dominio con CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 78, y un dominio con CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 93; y

(b) un segundo brazo que comprende:

(i) un dominio con CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 136, un dominio con CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 137, un dominio con CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 138, un dominio con CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 139, un dominio con CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 140, y un dominio con CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 141.

2. El anticuerpo biespecífico aislado o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

3. El anticuerpo biespecífico aislado o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, en el que el primer brazo comprende: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 128 y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 130.

4. El anticuerpo biespecífico aislado o porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el primer brazo comprende: (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 129 y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 131.

5. El anticuerpo biespecífico aislado o porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el segundo brazo comprende: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 132 y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 134.

6. El anticuerpo biespecífico aislado o porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el segundo brazo comprende: (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 133 y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 135.

7. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo biespecífico o porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 de modo que se produzca el anticuerpo, recuperando opcionalmente el anticuerpo de la célula huésped.

10. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico o porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente un agente terapéutico adicional.

11. El anticuerpo biespecífico aislado o porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en obesidad, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD), diabetes de tipo 2, diabetes distinta de tipo 2, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria latente (LAD) y diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY).

12. El anticuerpo biespecífico aislado para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el trastorno es diabetes.

13. El anticuerpo biespecífico aislado para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el trastorno es NASH.