ES2634237T5 - Vacunación de recién nacidos y niños - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Vacunación de recién nacidos y niños
La presente invención se refiere a vacunas que comprenden al menos un ARNm codificador de al menos un antígeno para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un recién nacido y/o un niño de una edad de no más de 2 años, preferiblemente de no más de 1 año, en especial de no más de 9 meses o incluso 6 meses, comprendiendo el tratamiento la vacunación del recién nacido o del niño y la provocación de una respuesta inmunitaria en dicho recién nacido o niño.
El diagnóstico, la prevención y el tratamiento de infecciones y alergias en recién nacidos y niños tiene gran interés y cada vez más se realizan intensas investigaciones en todo el mundo. En este contexto, es de principal relevancia el profundo conocimiento de los mecanismos del sistema inmune de bebés y niños. Como es bien conocido, el principal papel del Sistema inmunitario es proteger el organismo contra patógenos, pero la respuesta del sistema inmune a tales patógenos no es la misma durante toda la vida. Además, es sabido que las respuestas del sistema inmune subyacen bajo alteraciones asociadas a la edad. Igualmente, las respuestas del sistema inmune de recién nacidos y niños no son las mismas que en los adultos. En particular, la respuesta de las células T y B difiere de hecho en muchos aspectos, lo que contribuye a la necesidad de los cuidados prenatales del sistema inmune fetal y a la transición a las condiciones externas durante el nacimiento.
Como es bien conocido, todos los sistemas orgánicos del cuerpo sufren una dramática transición durante el nacimiento, desde una protegida existencia intra-uterina al ambiente exterior radicalmente distinto. Esta fuerte transición es seguida por una maduración gradual, dependiente de la edad. Como indica Ofer (véase Ofer, NATURE REVIEWS | IMMUNOLOGY VOLUME 7 | MAY 2007 | 379), los sistemas inmunes fetal y neonatal están normalmente asociados con demandas fisiológicas en tres aspectos: protección contra la infección, incluyendo patógenos virales y bacterianos en la interfase maternal-fetal, prevención de las respuestas polarizadas potencialmente perjudiciales de las células pro-inflamatorias/auxiliares T1 (Th1), que pueden inducir reacciones autoinmunes entre la madre y el feto, y mediación de la transición entre el ambiente intra-uterino normalmente estéril al ambiente extraño rico en antígenos del mundo exterior, incluyendo la colonización primero de la piel y del tracto intestinal por microorganismos. Dada la limitada exposición a los antígenos en el útero y los bien descritos defectos en la inmunidad adaptativa neonatal, los recién nacidos deben confiar en sus sistemas inmunes innatos para su protección en un grado significativo. Dado que el sistema inmune innato puede instruir la respuesta inmunitaria adaptativa, la distinta expresión funcional de la inmunidad innata neonatal, incluyendo una influencia contra las citoquinas polarizantes de células Th1, contribuye a un patrón diferenciado de las respuestas inmunes adaptativas neonatales. Evidencias sólidas indican que la producción inducida por la infección de citoquinas polarizantes de células pro-inflamatorias/Th1, incluyendo el factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina-1p (IL-1p), está asociada al parto y al nacimiento prematuro. En particular, se piensa que la producción de TNF favorece el aborto debido a la inducción de la apoptosis de células placentarias y fetales. La capacidad de las citoquinas pro-inflamatorias de inducir un aborto espontáneo es también una razón importante para la tendencia de los sistemas inmunes fetal y materno de numerosas especies de mamíferos a las citoquinas polarizantes de células TH2 (véase Levy, 2007, supra).
Debido a esta deficiente producción de células Th1 asociadas a citoquinas, inicialmente se pensó que el sistema inmune innato neonatal estaba habitualmente deteriorado o deprimido; sin embargo, la producción estimuladainducida de ciertas citoquinas (por ejemplo IL-6, IL-10 e IL-23) por monocitos neonatales y células presentadoras de antígenos (APCs) realmente excede la de los adultos (véase Angelone, D. et al., Pediatr. Res. 60, 205-209 (2006); Vanden Eijnden, S., Goriely, S., De Wit, D., Goldman, M. & Willems, F. Eur. J. Immunol. 36, 21-26, (2006); Chelvarajan, R. L. et al., J. Leukoc. Biol. 75, 982-994 (2004)). Sin embargo, todavía parece existir una tendencia contra las citoquinas polarizantes de células Th1, lo que hace que el recién nacido sea susceptible a infecciones microbianas y contribuye a la incapacidad de la respuesta inmune neonatal a la mayoría de las vacunas, frustrando así los esfuerzos por proteger a esta población tan vulnerable. Tras el nacimiento, existe una maduración dependiente de la edad de la respuesta inmune. Es de señalar que exposición prenatal y postnatal a productos microbianos ambientales que pueden activar la inmunidad innata podrían acelerar este proceso de maduración, en particular si la exposición tiene lugar repetidas veces en el tiempo, disminuyendo la polarización de las células TH2 y/o mejorando la polarización de las células Th1 y, por tanto, reduciendo potencialmente alergias y atopías, según la hipótesis de higiene (véase de nuevo Levy, 2007, supra).
Marchant y Goldmann (véase Marchant and Goldmann, Clinical and Experimental Immunology, 2005, 14: 10-18) han estudiado las respuestas inmunes mediadas por las células T en la vida temprana, en particular en recién nacidos. Como se indica allí, los linfocitos T circulantes neonatales son fundamentalmente diferentes de las células T naive adultas y tienen características de emigrantes tímicas recientes. Contienen altas concentraciones de círculos de escisión de receptor de células T (TRECs), subproductos de AND episomal de reorganización de cadena TCRa que no se replican, sino que se diluyen durante la división celular. Al igual que las células naive adultas, la mayoría de los linfocitos neonatales expresan la isoforma CD45 RA+ y las moléculas co-estimulatorias CD27 y CD28. Al contrario que los linfocitos naive adultos, los linfocitos neonatales expresan la molécula CD38. Además, una alta proporción de células T circulantes neonatales están en ciclo y muestran una mayor susceptibilidad a la apoptosis, indicando una alta renovación celular. La proliferación de linfocitos T naive también puede detectarse durante la vida fetal y podría durar hasta los cinco años de edad. La alta renovación celular observada en la vida temprana probablemente juega un papel central en el establecimiento del repertorio de células T. A pesar de su alta renovación, las células T mantienen las secuencias teloméricas largas debido a una gran actividad constitutiva de la telomerasa. In vitro, la apoptosis de los linfocitos T neonatales puede ser evitada por las citoquinas señalizadoras mediante la cadena y del receptor IL-2, esto es IL2, IL-4, iL-7 e IL-15. Entre estas citoquinas, IL-7 e IL-15 también inducen la proliferación de linfocitos T neonatales en ausencia de otros estímulos. La IL-7 está implicada en el desarrollo de timocitos en una etapa previa a la reorganización de los receptores de células T. La IL-15 preferentemente estimula la proliferación de células T CD8 más que de CD4+. Al contrario que IL-7, la IL-15 induce la diferenciación de linfocitos T CD8+ in vitro (véase Marchant and Goldmann, 2005, supra).
Diversos mecanismos limitan las respuestas de tipo T-auxiliar 1 (Th1) en la vida temprana. En el útero, las respuestas Th1 son tóxicas para la placenta y están inhibidas trofoblastos derivados de IL-10 y la progesterona. En el nacimiento, las respuestas Th1 son todavía de menor magnitud que más tarde en la vida. In vitro, las células T CD4+ de los recién nacidos producen menores niveles de IFNy que las células T naive adultas y están hipermetiladas en sitios CpG y no CpG dentro del promotor IFNy . En presencia de una co-estimulación de CD28 subóptima, la IL-12 estimula la producción tanto de IL-4 como de IFNy por los linfocitos T CD4 neonatales, mientras que las células adultas no producen IL-bajo condiciones similares. En respuesta a la activación policlonal o de superantígeno, los timocitos postnatales se desarrollan en citoquinas Th2 productoras de células CD4, aunque es necesaria la IL-12 para estimular la producción de IFNy. Por el contrario, las células T CD8+ neonatales producen niveles similares de IFNy y tienen un patrón de metilación del promotor de IFNy comparable al de las células naive adultas. Además, los linfocitos T CD8 neonatales son altamente dependientes de la presencia de IL-4 en el momento del cebado para diferenciarse en células productoras de IL-4. La capacidad de los linfocitos T CD4 neonatales de expresar el ligando CD40 (CD154), una molécula que juega un papel crítico en la ayuda de los linfocitos B y las células T CD8+, sigue siendo controvertida (véase también Marchant and Goldmann, 2005, supra).
Igualmente, los datos disponibles indican que los linfocitos T naive están programados de forma diferente es los neonatos y los adultos. Brevemente, la capacidad de las células T CD4+ neonatales de producir IFNy y de las DC neonatales de promover respuestas Th1 es menor en comparación con la de los adultos en estudios in vitro. Además, las respuestas Th1 a diversas vacunas y patógenos infecciosos in vivo son pobres durante la vida temprana. Sin embargo, pueden desarrollarse respuestas Th1 maduras en ciertas condiciones, tales como la vacunación BCG neonatal y la infección por Bordetella pertussis, probablemente en relación con una activación más eficiente de los DC. Así, el paradigma clásico de que los recién nacidos tienen linfocitos T incompetentes que se desarrollan sólo débilmente o de que tienen respuestas tolerogénicas debe reconsiderarse. La observación de que pueden desarrollarse respuestas celulares inmunes maduras en la vida temprana sugiere que, bajo condiciones apropiadas de estimulación, los linfocitos T neonatales pueden adaptarse a luchar contra patógenos intracelulares (véase también Marchant and Goldmann, 2005, supra).
No solo las diferencias en las respuestas de las células T, sino también en las respuestas de las células B parecen mostrar un fuerte impacto en la inmunoprotección recién nacidos y/o niños en comparación con individuos adultos. Durante mucho tiempo se ha pensado que la vulnerabilidad de los niños menores de 18-24 meses a las bacterias encapsuladas, como pneumococcus, Haemophilus influenzae B (Hib) y meningococcus, reflejan un fallo general para generar respuestas de las células T independientes de las células B a la mayoría de polisacáridos bacterianos (véase Claire-Anne Siegrist y Richard Aspinall, NATURE REVIEWS | IMMUNOLOGY VOLUME 9 | MARCH 2009 | 185). Sin embargo, la inmadurez del sistema inmune de los recién nacidos y/o niños también tiene un efecto directo en la magnitud de las respuestas de las células T dependientes de las proteínas de antígenos. Se investigaron los mecanismos que dan forma a las respuestas de las células B en la vida temprana empleando una inmunización neonatal en modelos de ratón, que se desarrollaron para reproducir las principales limitaciones de las respuestas inmunes a las vacunas administradas a una edad temprana (véase Claire-Anne Siegrist y Richard Aspinall, 2009, supra). Existen numerosas diferencias entre las células B esplénicas del ratón neonato y del adulto, aunque se han identificado pocas en comparación con las células B periféricas humanas. Específicamente, las células B neonatales expresan menores niveles de las moléculas co­ estimuladoras CD40, CD80 y CD86, lo que disminuye sus respuestas a los ligandos CD40 (CD40L) y a la interlequina-10 (IL-10) expresada por las células T. Las células B esplénicas de la zona marginal de los niños expresan menores niveles de CD21, lo que limita su capacidad de responder a los complejos complemento de polisacáridos. La expresión de TACI (ligando de interacción de ciclofilina, activador transmembrana y calcio modular; también conocidos como TNFRSF13B), un importante receptor de la co-estimulación, también está disminuida tanto en ratones recién nacidos como neonatales y en las células humanas B neonatales, en particular en los nacidos prematuros. Además, las respuestas de las células B en la vida temprana están influenciadas por numerosos factores extrínsecos. Los anticuerpos de origen materno se unen a los antígenos de las vacunas en un epítopo de forma específica y, por tanto, evitan que las células B de los niños accedan a los epítopos inmunodominantes de la vacuna. Igualmente, los ratones y humanos neonatos tienen bajos niveles del componente de complemento sérico C3, lo que limita sus respuestas a los complejos de antígenos C3d. El bazo humano contiene menos macrófagos en la zona marginal (que tienen un papel crucial en la inducción de una respuesta de anticuerpos mediante la captura de partículas de antígenos) en neonatos que en adultos y las células difieren en su capacidad de producir citoquinas. En el ratón bebé, las respuestas de las células B están limitadas por un marcado retraso en la maduración de la red de células dendríticas foliculares (FDC), debido al fallo de los precursores de FDC para responder a la señalización de las células B mediada por linfotoxina-a. El centro de las FDC germinales nucleares reacciona atrayendo a las células B específicas de antígeno, retiene los antígenos en forma de complejos inmunes que estimulan en alta medida las células B y proporciona señales que llevan a la hipermutación somática y a la recombinación de la recombinación de clase. Por tanto, la inmadurez de la red FDC retrasa y limita la magnitud de las respuestas del centro germinal, incluso cuando se emplean potentes adyuvantes que inducen patrones de activación de células B, Células T y DC similares a las adultas. Además de la maduración postnatal de las respuestas de los anticuerpos, la persistencia de los anticuerpos in vivo exhibe un importante efecto. El mantenimiento a largo plazo de anticuerpos específicos con una vida media corta requiere la persistencia de las células B productoras de anticuerpos, los cuales pueden ser producidos continuamente a partir de un pool de memoria de células B o pueden permanecer como células plasmáticas de larga vida. La depleción de las células de memoria B mediada por anticuerpos, que no afecta a las células en plasma, ha demostrado que la etapa célula-plasma es independiente del pool de células B de memoria. También se ha demostrado que la persistencia de los anticuerpos in vivo puede estar influida por factores medioambientales. Esto apoya la hipótesis de que la limitada persistencia de las respuestas de los anticuerpos en la vida temprana se debe a la exposición a una alta carga de antígenos ambientales, lo que resulta en una competición el acceso a un limitado grupo de nichos de supervivencia de células plasmáticas en la médula ósea (véase Claire-Anne Siegrist y Richard Aspinall, 2009, supra).
Como es sabido, la administración de una única dosis de una vacuna en el nacimiento puede no conseguir anticuerpos específicos durante el cebado para obtener respuestas secundarias consecuentes, lo que indica una vía de diferenciación neonatal preferencial hacia las células B de memoria que hacia las células plasmáticas. Al modelo de diferenciación de las células B parecen contribuir diversos factores. El destino de las células B naive específicas de antígeno, y su diferenciación en células plasmáticas de vida corta, de vida larga p de células B de memoria está controlado por las señales de activación tempranas de las células B. Las células B de alta afinidad son reclutadas activamente hacia el pool de células plasmáticas, mientras que de afinidad moderada permanecen como células B de memoria en los órganos linfoides secundarios. Así, la menor afinidad del receptor de las células B y/o el retraso en la afinidad de maduración de las células B naive neonatales podría disminuir la fuerza de la señal y favorecer la diferenciación en células B de memoria.
La limitada expresión de CD21 por las células B del niño también se apoya en la generación de células B de memoria y perjudica el desarrollo de células plasmáticas, que podría estar apoyado por la señalización mediada por CD40, citoquinas como Il-21 e interacciones con ligandos tales como factor de activación de células B (BAFF; también conocido como TNFSF13B) y APRIL. Es de señalar que estos factores de apoyo a las células plasmáticas todos son expresados a bajos niveles en la vida temprana, a pesar de que se proporcionen señales de activación adicionales para mejorar la activación de DC y células T. Además, las células B de la vida temprana podrían tener que competir por recursos limitados dentro del centro germinal, lo que afectaría a la respuesta de los anticuerpos. Así, la diferenciación de las células plasmáticas podría “forzarse” en la vida temprana proporcionando señales de activación de DC adicionales. Por tanto, una combinación de factores parece resultar en una diferenciación preferente de las células B de la vida temprana hacia células B de memoria en vez de hacia células plasmáticas de vida larga en un modelo. Es de señalar que, aunque se ha demostrado que puede formarse un pool de células B de memoria en la vida temprana, esto no debería considerarse como una prueba de que su magnitud o persistencia es similar a aquella proporcionada en huéspedes inmunológicamente maduros. Observaciones recientes del fallo de las vacunas de refuerzo en proporcionar una respuesta de memoria en adolescentes o adultos jóvenes que habían sido vacunados contra el virus de la hepatitis C en la infancia sugieren que las células B de memoria desencadenadas en la infancia podrían no durar mucho. Está por determinar si esto refleja un pool más pequeño de células. En resumen, un gran número de factores determinantes intrínsecos y extrínsecos de las células B parecen cooperar para limitar la inducción y la persistencia de células plasmáticas secretoras de anticuerpos en la vida temprana, a la vez que apoyan la inducción preferencia de respuestas de las células B de memoria (véase Claire-Anne Siegrist y Richard Aspinall, 2009, supra).
Tal como se ha descrito más arriba, las alteraciones en las respuestas de las células T y también en las respuestas de las células B muestran un efecto significativo no solo en la inmunoprotección frente a patógenos, sino también en las estrategias de vacunación en recién nacidos y/o niños para combatir enfermedades infecciosas, pero posiblemente también alergias, trastornos autoinmunes y otras enfermedades. Se han llevado a cabo muchos intentos de proporcionar vacunas eficientes que pueda solventar al menos algunas de las limitaciones anteriores.
Una estrategia anterior para superar estas deficiencias en el contexto de las vacunas de la gripe a base de virus se refiere a la administración de ADN plásmido desnudo (pHA) que expresa la hemaglutinina (HA) de la cepa neurovirulenta A/WSN/33 del virus de la gripe para conseguir una respuesta inmune protectora por inoculación a ratones recién nacidos y adultos (véase Bot et al., 1997, International Immunology, Vol. 9, No. 11, pp. 1641­ 1650). Como demuestran Bot et al. (1997), la exposición continua a pequeñas dosis de antígeno tras la inmunización neonatal con ADN puede llevar a primar las células B específicas y las Th, más que a inducir tolerancia. Sin embargo, sólo la inmunización pHA del ratón adulto llevó a una respuesta de Th1 parcialmente fuerte, mientras que en neonatos inducía una respuesta mixta Th1/Th2. Otra aproximación similar del mismo grupo de trabajo estaba dirigida a la administración combinada de plásmidos que expresan nucleoproteína (NP) o hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. La inmunización neonatal de ratones BALB/c fue seguida de un cebado de células B, Th y CTL más que de tolerancia (véase Bot et al., Vaccine, Vol. 16, No. 17, pp. 16751682, 1998). Sin embargo, la protección en términos de supervivencia frente al reto letal con cepas homólogas o heterólogas no fue reportada por ser incompleta. Además, en el caso del plásmido de expresión de NP, la inmunidad protectora proporcionada por la inmunización neonatal requería mucho tiempo para desarrollarse en comparación con la inmunización adulta. Ni Bot et al. (1997, supra) ni Bot et al. (1998, supra) demostraron una buena respuesta de Th1 en neonatos. Además, incluso aunque se recogió en ambos artículos que la vacunación con AND representa un medio eficiente y Seguro para generar amplias respuestas inmunes humorales y celulares al virus de la gripe durante las etapas tempranas de la vida postnatal, ahora se ha encontrado que el ADN puede ser peligroso debido a su no deseada inserción en el genoma. Estas vacunas basadas en AND pueden llevar incluso a la interrupción de genes funcionales y al cáncer o a la formación de anticuerpos anti-ADN y, por tanto, no son un objetivo hoy en día.
Otros estudios se dirigieron a la mejora de los sistemas de suministro y administración de inmunomoduladores para optimizar las respuestas de las vacunas en la vida temprana. Jiri Kovarik y Claire-Anne Siegrist se centraron en los problemas derivados del intento de vacunar contra patógenos muy pronto en la vida y en el papel de adyuvantes selectivos que podrían emplearse para: (i) inducir rápidamente una fuerte respuesta de los anticuerpos de los isotipos apropiados; (ii) proporcionar una respuesta de los anticuerpos sostenida que se amplíe más allá de la infancia; (iii) inducir respuestas de Th1 y CTL eficientes en vez de polarización preferencial de Th2 en las respuestas de la vida temprana; (iv) escapar de las respuestas a la vacuna mediadas por la inhibición de anticuerpos maternos; (v) mostrar una reactogenicidad aceptable en la vida temprana; y (vi) permitir la incorporación de varios antígenos de vacuna en una única formulación para reducir el número de inyecciones necesarias (véase Jiri Kovarik y Claire-Anne Siegrist, Immunology and Cell Biology (1998) 76, 222-236). Kovarik y Siegrist (1998, supra) inter alia discuten diferentes sistemas de suministro de antígenos, tales como la administración se sustancias particuladas, emulsiones, liposomas, virosomas, microesferas, vacunas vivas, vectores y vacunas de ADN, así como el uso de inmunomoduladores como MPL, QS21, derivados de MDP, citoquinas, interferones y oligodesoxinucleótidos CpG y combinaciones de sistemas de presentación de antígenos e inmunomoduladores. Sin embargo, al que igual que en el caso de Kovarik y Siegrist (1998, supra) muchas de estas combinaciones son hipotéticas e incluso pueden no proporcionar una respuesta de Th1 eficiente o incluso conllevar efectos secundarios no deseados.
De forma similar, Adrian Bot y Constantin Bona (véase Adrian Bot y Constantin Bona, Microbes and Infection 4 (2002) 511-520) sugieren el uso de motivos CpG bacterianos para activar las células presentadoras de antígenos inmaduras y para mejorar la inmunogenicidad neonatal de las vacunas de ADN. Además, Bot y Bona (2002, supra) sugieren una combinación de refuerzo subsiguiente con vacunas convencionales. Sin embargo, la estrategia subrayada en este artículo no conduce a una respuesta de Th1 convincente. Además, el estudio está basado en el uso de vacunas de AND, lo cual puede considerarse potencialmente peligroso.
Otra estrategia prometedora pero muy específica recae en el uso del nuevo adyuvante específico IC31. Como es sabido en la técnica, solo hay unos pocos adyuvantes aprobados para su uso en humanos. Uno de los adyuvantes principales aprobados para uso humano es, por ejemplo, el alumbre, un adyuvante a base de sal de aluminio. Sin embargo, aunque están aprobadas para uso en humanos, dichas sales de aluminio no proporcionaron un aumento satisfactorio de las respuestas inmunitarias por las vacunas de la gripe estacional en ensayos clínicos tempranos en humanos, un efecto que puede ser esperado igualmente durante otras estrategias de vacunación. Otras vacunas de la gripe con adyuvantes autorizadas incluyen hasta la fecha Fluad® (Novartis Vaccines), que contiene MF59 en combinación con una formulación de vacuna de subunidades, y las vacunas virosomales Inflexal®V (Berna Biotech, una compañía de Crucell) e Invivac® (Solvay). Aunque estudios con animales y ensayos clínicos en humanos han revelado un perfil de inmunogenicidad más alto - definido como respuestas de anticuerpos aumentadas - con la vacuna de la gripe con adyuvante MF59, el MF59 no es un adyuvante potente para la inducción de respuestas inmunitarias celulares dirigidas de tipo 1. A diferencia del Fluad®, las vacunas virosomales representan envolturas del virus de la gripe reconstituidas que contienen las proteínas de superficie de la gripe funcionales hemaglutinina y neuramidasa en su bicapa fosfolipídica. La inmunogenicidad y la tolerabilidad local de vacunas de la gripe a base de virosomas han sido demostradas en diversos estudios. Sin embargo, el desarrollo de formulaciones virosomales es muy complejo y los costes de los materiales son altos.
En este contexto, Kamath et al. (véase Kamath et al., 2008, PLoS ONE 3(11): e3683. doi:10.1371/journal.pone.0003683) reportaron el uso report de un adyuvante específico IC31 con la proteína de fusión Ag85b-ESAT-6 para la inmunización de ratones neonatos y adultos. Al contario que el alumbre, IC31H inducía fuertes respuestas de Th1 y Th17 en ambos grupos de edad, caracterizadas por células T multifuncionales que expresan IL-2 y TNFa con o sin IFNy. En el drenaje de nódulos linfáticos, similarmente un número pequeño de DC contenían el adyuvante y/o el antígeno tras la inmunización neonatal o adulta. La expresión de la producción de CD40, CD80, CD86 e IL-12p40 se enfocó en el minuto adyuvante-rumbo de la población DC, donde la dirección/activación de DC era similar en adultos y neonatos. Estas respuestas celulares DC/T resultaban en una reducción equivalente del crecimiento bacteriano tras la infección con M. bovis BCG, mientras que no se observó una protección cuando se empleó alumbre como adyuvante. Sin embargo, no se indica ningún otro adyuvante en Kamath et al. (2008, supra) que permita extender este ejemplo específico a otras vacunas.
Dado que las vacunas basadas en ARN representan una modalidad de inmunización interesante, Johansson et al. (véase Johansson et al., 2012, PLoS ONE 7(1): e29732) investigaron las respuestas inmunitarias provocadas por replicones de ARN desnudo, replicones lanzados por ADN y ARNm desnudo administrado mediante electroporación intradérmica. En su estudio se detectaron respuestas inmunitarias en ratones adultos inmunizados con replicones de ARN desnudo o replicones lanzados por ADN, mientras que en los ratones adultos inmunizados con ARNm i.d. no se logró inducir ninguna respuesta inmunitaria detectable.
Sin embargo, en otro estudio, el tratamiento de ratones adultos con una vacuna de ARNm de dos componentes que apoya tanto la expresión de antígenos como la estimulación inmunitaria mediada por receptor de tipo Toll 7 (TLR7), medió en una fuerte respuesta antitumoral (Fotin-Mleczek et al., 2011, J Immunother 34(1): 1-15). En resumen, la vacuna de ARNm de dos componentes, que contenía ARNm libre y complejado con protamina, mostró una actividad autoadyuvante, indujo respuestas inmunitarias adaptativas equilibradas y medió en una actividad antitumoral constante (Fotin-Mleczek et al., 2011, supra). No obstante, estos estudios de vacunación a base de ARNm se referían únicamente a animales adultos, pero no a recién nacidos o crías.
Resumiendo lo anterior, ninguna de las vacunas del estado actual de la técnica permite provocar una respuesta inmune eficientemente en recién nacidos y/o niños que muestre características al menos similares a una respuesta inmune en adultos. En particular, muchas vacunas no proporcionan una respuesta inmune Th1 eficiente en recién nacidos y/o niños. Así, existe una necesidad urgente de vacunas optimizadas para estos pacientes. Más concretamente se requieren vacunas que no acarreen los problemas mostrados en el estado anterior de la técnica o al menos disminuyan estos problemas en una medida significativa. Además, está previsto proporcionar vacunas que permitan inducir respuestas inmunitarias de Th1 en recién nacidos y/o niños, preferiblemente sin que conduzcan a un cambio de respuestas inmunitarias de Th1 a Th2 después de la administración. Del mismo modo se deberían evitar las vacunas a base de ADN debido a la posible inserción de ADN en el genoma, la posible interrupción de genes y la formación de anticuerpos anti-ADN.
El objeto que subyace en la presente invención se resuelve mediante la materia de las reivindicaciones adjuntas, de forma especialmente preferente tal como se indica en adelante.
El objeto que subyace en la presente invención se resuelve mediante una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones.
Sin apoyarse en ninguna teoría particular, las vacunas de ARN integran elegantemente adyuvanticidad y expresión de antígeno, imitando así aspectos relevantes de las infecciones virales. Esto aumenta su eficacia en comparación con otras vacunas inactivadas (muertas), que requieren el uso de adyuvantes avanzados en recién nacidos o niños, simplificando la manipulación y producción. El ARN se puede dirigir a una serie de receptores de reconocimiento de patrones inmunológicos dedicados, incluyendo receptores de tipo Toll 3, 7 y 8, RIG-I, MDA5, PKR, y otros que pueden actuar de forma sinérgica y servir para mejorar la inducción de respuesta de las células B y T adaptativas específicas de antígeno. En un aspecto importante, mediante síntesis de antígenos en células huésped transfectadas, las vacunas de ARNm introducen directamente antígeno en rutas de procesamiento y presentación de antígenos celulares, otorgando acceso a moléculas MHC y desencadenando la respuesta de las células T, independientemente del haplotipo MHC de los huéspedes. Esto posibilita la inducción de respuestas de células T policlonales que pueden actuar de forma sinérgica con otras respuestas inmunitarias, incluyendo las células B. Además, la presentación del espectro completo de epítopos de unión de MHC puede evitar las limitaciones debidas a un sistema inmune inmaduro en recién nacidos o niños. Además, la producción endógena de antígeno asegura la modificación postraduccional fiel (por ejemplo procesamiento proteolítico, glicosilación, etc.), que puede influir positivamente en la inmunogenicidad. Además, las vacunas de ARN presentan características de seguridad que las hace superiores para su uso con recién nacidos y/o niños. Por ejemplo, la reactogenicidad aumentada de las vacunas vivas atenuadas generalmente impide el uso en este grupo objetivo altamente relevante. Sin embargo, teniendo en cuenta la persistencia corta y la descomposición sin rastro del vector de vacuna en cuestión de días, la buena inmunogenicidad observada es inesperada y contrasta con las reivindicaciones de las vacunas de ADN plásmido, que vinculaban de diversas formas la eficacia a la expresión persistente de antígeno.
El o los ARNm de la vacuna de la invención tal como se definen más arriba, que codifican al menos un antígeno, se pueden seleccionar entre cualesquiera de los antígenos conocidos por los expertos, preferiblemente adecuados para provocar una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un paciente. De acuerdo con la presente invención, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que es reconocida por el sistema inmunitario y que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria específica de antígeno, por ejemplo mediante la formación de anticuerpos o células T específicas de antígeno como parte de una respuesta inmunitaria adaptativa. En este contexto, la primera etapa de una respuesta inmunitaria adaptativa es la activación de las células T específicas de antígeno naive o diferentes inmunocitos capaces de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno por células presentadoras de antígeno. Esto ocurre en los tejidos linfoides y órganos a través de los cuales pasan constantemente células T naive. Los tres tipos de células que pueden servir como células presentadoras de antígeno son células dendríticas, macrófagos y células B. Cada una de estas células tiene una función diferente en la provocación de respuestas inmunitarias. Las células dendríticas tisulares absorben antígenos por fagocitosis y macropinocitosis y son estimuladas por contacto, por ejemplo con un antígeno extraño, para migrar al tejido linfoide local, donde se diferencian en células dendríticas maduras. Los macrófagos ingieren antígenos en forma de partículas, tales como bacterias, y son inducidos por agentes infecciosos u otros estímulos apropiados para expresar moléculas MHC. La capacidad única de las células B para unirse a antígenos de proteína solubles e internalizar los mismos a través de sus receptores también puede ser importante para inducir células T. La presentación del antígeno sobre moléculas MHC conduce a la activación de las células T, que induce a su proliferación y diferenciación en células T efectoras armadas. La función más importante de las células T efectoras es la destrucción de células infectadas por células T citotóxicas CD8+ y la activación de macrófagos por células TH1, que juntos constituyen la inmunidad mediada por células, y la activación de células B por células tanto TH2 como TH1 para producir diferentes clases de anticuerpo, dirigiendo así la respuesta inmunitaria humoral. Las células T reconocen un antígeno por sus receptores de células T, que no reconocen y se unen al antígeno directamente, sino que en lugar de ello reconocen fragmentos peptídicos cortos, por ejemplo de antígenos proteínicos de patógenos, que están unidos a moléculas MHC sobre la superficie de otras células.
En el contexto de la presente invención, los antígenos codificados por el o los ARNm de la vacuna de la invención comprenden normalmente cualquier antígeno que entre dentro de la definición arriba dada, de forma especialmente preferente antígenos proteínicos y peptídicos. De acuerdo con la invención, los antígenos codificados por el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden ser antígenos generados fuera de la célula, más típicamente antígenos no derivados del propio organismo huésped (por ejemplo un humano) (es decir, no auto-antígenos), sino más bien derivados de células huésped fuera del organismo huésped, por ejemplo antígenos patógenos, en particular antígenos virales, bacterianos, fúngicos, antígenos de protozoos, antígenos alérgicos, etc. Los antígenos codificados por el o los ARNm de la vacuna tal como se describe aquí pueden ser además antígenos generados dentro de la célula, el tejido o el cuerpo, por ejemplo por secreción de proteínas, su degradación, metabolismo, etc.
Los antígenos patógenos comprenden en particular por ejemplo antígenos de la gripe, preferiblemente gripe A, gripe B, gripe C o thogotovirus, preferiblemente antígenos de la gripe hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA), preferiblemente antígenos de la gripe derivados de los subtipos de hemaglutinina H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14 o H15, y/o los subtipos de neuraminidasa N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9, o preferiblemente seleccionados entre los subtipos de la gripe A H1N1, H1 N2, H2N2, H2N3, H3N1, H3N2, H3N3, H5N1, H5N2, H7N7 o H9N2, o cualquier otra combinación, o de proteína de matriz 1 (M1), proteína de canal iónico M2 (M2), nucleoproteína (NP), etc.; o por ejemplo antígenos del virus sincicial respiratorio (VSR), incluyendo proteína F, proteína G, etc.
Los antígenos derivados de hongos que son codificados por el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden incluir antígenos derivados, de forma no limitativa, por ejemplo de Alternia sp., Aspergillus sp., Beauveria sp., Candida sp., Cladosporium sp., Endothia sp., Curcularia sp., Embellisia sp., Epicoccum sp., Fusarium sp., Malassezia sp., Penicillum sp., Pleospora sp., Saccharomyces sp., etc.
Los antígenos derivados de bacterias que son codificados por el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden incluir antígenos derivados, de forma no limitativa, por ejemplo de Bacillus tetani, Staphylococcus aureus, Streptomyces griseus, etc.
Son particularmente preferentes los antígenos derivados del virus de la gripe A (antígenos HA, NA, NP, M2, M1), virus de la gripe B (antígenos HA, NA), virus sincicial respiratorio (antígenos F, G, M, SH), virus de la parainfluenza (antígenos de glicoproteína), Streptococcus pneumoniae (antígenos Pht, PcsB, StkP), Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, sarampión, paperas, rubeola, virus de la rabia (antígenos G, N), Staphylococcus aureus (antígeno de toxina), Clostridium difficile (antígeno de toxina), Mycobacterium tuberculosis (antígenos latentes), Candida albicans, Haemophilus influenzae B (HiB), virus de la polio, virus de la hepatitis C (antígenos de superficie y núcleo), papilomavirus humano (L1, L2, E6, E7), virus de la inmunodeficiencia humana (antígenos gp120, gag, env), SARS CoV (proteína espiga), Staphylococcus aureus (antígenos IsdA, IsdB, toxina), toxina pertussis, poliovirus (VP1-4), Plasmodium (antígenos NANp , proteína CSP, ssp2, ama1, msp142), Staphylococcus aureus (IsdA, IsdB, toxina), Bordetella pertussis (toxina), poliovirus VP1-4, Plasmodium (NANP, proteína CSP, antígenos ssp2, ama1, msp142).
Los antígenos codificados por el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden comprender además fragmentos de antígenos tales como los aquí mencionados, en particular de antígenos proteínicos o peptídicos. Los fragmentos de estos antígenos en el contexto de la presente invención pueden comprender fragmentos que preferiblemente tienen una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo fragmentos tales como los procesados y presentados por moléculas MHC de clase I, preferiblemente con una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9 o 10 (o incluso 11 o 12 aminoácidos), o fragmentos tales como los procesados y presentados por moléculas MHC de clase II, preferiblemente con una longitud de aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más aminoácidos, pudiendo seleccionarse estos fragmentos de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Normalmente, estos fragmentos son reconocidos por células T en forma de un complejo consistente en el fragmento de péptido y una molécula MHC, es decir, los fragmentos normalmente no son reconocidos en su forma nativa.
Los fragmentos de antígenos tal como se definen aquí también pueden comprender epítopos de dichos antígenos. Los epítopos (también denominados "determinantes antigénicos") son normalmente fragmentos situados sobre la superficie exterior de antígenos peptídicos o proteínicos (nativos) tal como se definen aquí, que preferiblemente tienen de 5 a 15 aminoácidos, de forma especialmente preferible tienen de 5 a 12 aminoácidos, de forma todavía más preferible tienen de 6 a 9 aminoácidos, que pueden ser reconocidos por anticuerpos, es decir, en su forma nativa.
De acuerdo con otro aspecto particularmente preferente, los antígenos codificados por el o los ARNm de la vacuna tal como se describe aquí pueden formar un cóctel de antígenos, por ejemplo en una composición (inmunoestimuladora) activa o un kit de partes (en el que preferiblemente cada antígeno está contenido en una parte del kit), preferiblemente para provocar una respuesta inmunitaria (adaptativa) para el tratamiento de una enfermedad o trastorno tal como se definen aquí. Con este fin, la vacuna de la invención puede comprender al menos un ARNm, pudiendo codificar cada ARNm al menos uno, preferiblemente dos, tres, cuatro o incluso más antígenos (preferiblemente diferentes) tal como se mencionan aquí. Alternativamente, la vacuna de la invención puede contener al menos uno, dos, tres cuatro o incluso más ARNm (preferiblemente diferentes), codificando cada ARNm al menos un antígeno tal como se mencionan aquí.
En los aspectos arriba indicados, cada uno de los antígenos arriba definidos puede ser codificado por un ARNm (monocistrónico). Dicho de otro modo, en este caso el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden comprender al menos dos (tres, cuatro, etc.) ARNm (monocistrónicos), pudiendo codificar cada uno de estos al menos dos (tres, cuatro, etc.) ARNm (monocistrónicos) por ejemplo solo un antígeno (preferiblemente diferente), preferiblemente seleccionado entre una de las combinaciones de antígenos arriba mencionadas.
De acuerdo con un aspecto particularmente preferente, el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden comprender (al menos) un ARNm bicistrónico o incluso multicistrónico, preferiblemente ARNm, es decir, (al menos) un ARNm que porta por ejemplo dos o incluso más secuencias que codifican al menos dos antígenos (preferiblemente diferentes), preferiblemente seleccionados entre una de las combinaciones de antígenos arriba mencionadas. Dichas secuencias codificadoras, por ejemplo de los al menos dos antígenos (preferiblemente diferentes), del (al menos) un ARNm bicistrónico o incluso multicistrónico pueden estar separadas por al menos una secuencia IRES (sitio interno de entrada al ribosoma), tal como se define más abajo. Por tanto, el concepto "que codifican al menos dos antígenos (preferiblemente diferentes) puede significar, de forma no limitativa, que el (al menos uno) ARNm (bicistrónico o incluso multicistrónico) puede codificar por ejemplo al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más antígenos (preferiblemente diferentes) del grupo o los grupos de antígenos arriba mencionados, o de sus fragmentos o variantes, etc. En este contexto, una, así llamada, secuencia IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) tal como se define aquí puede actuar como un único sitio de unión de ribosoma, pero también puede servir para proporcionar un ARN bicistrónico o incluso multicistrónico tal como se define aquí que codifica varias proteínas, que han de ser traducidas por los ribosomas independientemente entre sí. Algunos ejemplos de secuencias IRES que pueden ser utilizadas de acuerdo con la invención son las de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus (PV), virus de la encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia múrida (MLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).
De acuerdo con otro aspecto particularmente preferible, el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden comprender una mezcla de al menos un ARNm monocistrónico tal como se define aquí y al menos un ARN, preferiblemente ARNm, bicistrónico o incluso multicistrónico tal como se define aquí. El o los ARN monocistrónicos y/o el o los ARN bicistrónicos o incluso multicistrónicos codifican preferiblemente antígenos diferentes, o sus fragmentos o variantes, seleccionándose los antígenos preferiblemente entre los antígenos arriba mencionados, de forma especialmente preferible entre las combinaciones arriba mencionadas. No obstante, el o los ARN monocistrónicos y el o los ARN bicistrónicos o incluso multicistrónicos preferiblemente también pueden codificar (en parte) antígenos idénticos seleccionados entre los antígenos arriba mencionados, preferiblemente entre las combinaciones arriba mencionadas, siempre que el o los ARNm de la vacuna de la invención en su totalidad proporcionen al menos dos antígenos (preferiblemente diferentes) tal como se definen aquí. Este aspecto puede resultar ventajoso por ejemplo para una administración escalonada, por ejemplo en función del tiempo, de uno o más del o de los ARNm de la vacuna de la invención a un paciente que lo requiera. Los componentes de dicha vacuna se pueden administrar por ejemplo por separado como componentes de la misma vacuna de la invención tal como se define de acuerdo con la presente invención.
En otra realización preferente, el o los ARNm de la vacuna de la invención también se pueden encontrar en forma de un ácido nucleico modificado.
De acuerdo con un primer aspecto, el o los ARNm de la vacuna de la invención se pueden proporcionar en forma de un "ácido nucleico estabilizado" que es esencialmente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo por una exonucleasa o una endonucleasa).
En este contexto, el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden contener modificaciones de esqueleto, modificaciones de azúcar o modificaciones de base. Una modificación de esqueleto en relación con la presente invención es una modificación en la que los fosfatos del esqueleto de los nucleótidos contenidos en el o los ARNm de la vacuna de la invención están modificados químicamente. Una modificación de azúcar en relación con la presente invención es una modificación química del azúcar de los nucleótidos del o de los ARNm de la vacuna de la invención. Además, una modificación de base en relación con la presente invención es una modificación química de la fracción de base de los nucleótidos del o de los ARNm de la vacuna de la invención.
De acuerdo con otro aspecto, el o los ARNm de la vacuna de la invención pueden contener una modificación de lípido. Un ácido nucleico con modificación de lípido de este tipo comprende normalmente un ácido nucleico tal como se define aquí, por ejemplo un ARNm u otro ácido nucleico. Este ARNm con modificación de lípido de la vacuna de la invención normalmente comprende además al menos un enlazador enlazado de forma covalente con esta molécula de ácido nucleico y al menos un lípido enlazado de forma covalente con el enlazador respectivo. Alternativamente, el ARNm con modificación de lípido de la vacuna de la invención comprende al menos una molécula de ácido nucleico tal como se define aquí, por ejemplo un ARNm o cualquier otro ácido nucleico y al menos un lípido (bifuncional) enlazado de forma covalente (sin enlazador) con esta molécula de ácido nucleico. De acuerdo con una tercera alternativa, el ARNm con modificación de lípido de la vacuna de la invención comprende una molécula de ácido nucleico tal como se define aquí, por ejemplo un ARNm o cualquier otro ácido nucleico, al menos un enlazador enlazado de forma covalente con esta molécula de ácido nucleico y al menos un lípido enlazado de forma covalente con el enlazador respectivo y también al menos un lípido (bifuncional) enlazado de forma covalente (sin enlazador) con esta molécula de ácido nucleico.
Igualmente, el o los ARNm de la vacuna de la invención se pueden estabilizar para prevenir la degradación del ARNm mediante diversas estrategias. En la técnica es sabido que, en general, la inestabilidad y la degradación (rápida) del ARN pueden representar un problema grave en la aplicación de composiciones basadas en ARN. Esta inestabilidad del ARN se debe normalmente a enzimas degradadoras de ARN, "ARNasas" (ribonucleasas), pudiendo a veces la contaminación con estas ribonucleasas degradar por completo el ARN en solución. Por consiguiente, la degradación natural del ARN en el citoplasma celular está regulada muy finamente y las contaminaciones con RNasas pueden ser eliminadas normalmente mediante un tratamiento especial antes del uso de dichas composiciones, en particular con pirocarbonato de dietilo (PCDE). En este contexto, en la técnica anterior se conoce una serie de mecanismos de degradación que también pueden emplearse. Por ejemplo, la estructura terminal tiene normalmente una importancia crítica, en particular para un ARNm. Por ejemplo, el extremo 5' de los ARNm naturales presentan normalmente una llamada "estructura de casquete" (un nucleótido de guanosina modificado) y el extremo 3' presenta normalmente una secuencia de hasta 200 nucleótidos de adenosina (la llamada cola de poli-A).
El o los ARNm de la vacuna de la invención se modifican y así se estabilizan modificando el contenido de G/C de la región codificadora del ARNm.
Por consiguiente, el contenido de G/C de la región codificadora del o de los ARNm de la vacuna de la invención se incrementa en comparación con el contenido de G/C de la región codificadora de su secuencia codificadora de tipo silvestre particular, es decir del ARNm no modificado. La secuencia de aminoácidos codificadora del ARNm preferiblemente no está modificada en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo silvestre particular.
La modificación del contenido de G/C del o de los ARNm de la vacuna de la invención se basa en el hecho de que la secuencia de cualquier región de ARNm que debe traducirse es importante para una traducción eficiente de dicho ARNm. Por tanto, la composición y la secuencia de los diversos nucleótidos son importantes. En particular, las secuencias que tienen un contenido aumentado de G (guanosina)/C (citidina) son más estables que las secuencias que tienen un contenido aumentado de A (adenosina)/U (uridina). De acuerdo con la invención, los codones de la secuencia codificadora o el ARNm varían en comparación con su secuencia codificadora de tipo silvestre o ARNm, mientras se conserva la secuencia de aminoácidos traducida, de modo que incluyen un mayor número de nucleótidos de G/C. Con respecto al hecho de que varios codones codifican un mismo aminoácido (la llamada degeneración del código genético), es posible determinar los codones más favorables para la estabilidad (el llamado uso de codones alternativo).
El contenido de G/C de la región codificadora del o de los ARNm de la vacuna de la invención se incrementa al menos en un 15%, de forma particularmente preferente al menos en un 20%, en comparación con el contenido de G/C de la región codificadora del ARNm de tipo silvestre. De acuerdo con un aspecto específico, al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de forma especialmente preferible al menos un 70%, de forma incluso más preferible al menos un 80% y de forma totalmente preferente al menos un 90%, un 95% o incluso un 100% de los codones sustituidos en la región codificadora de una proteína o péptido tal como se definen aquí o su fragmento o variante del mismo o la secuencia completa de la secuencia de ARNm de tipo silvestre o secuencia codificadora están sustituidos, aumentando así el contenido de G/C de dicha secuencia.
En este contexto, es particularmente preferible aumentar el contenido de G/C del o de los ARNm de la vacuna de la invención al máximo (es decir, un 100% de los codones sustituibles), en particular en la región que codifica una proteína, en comparación con la secuencia de tipo silvestre.
De acuerdo con la invención, otra modificación preferente del o de los ARNm de la vacuna de la invención se basa en el descubrimiento de que la eficacia de traducción también está determinada por una frecuencia diferente en la presencia de ARNt en las células. Por tanto, si el o los ARNm de la vacuna de la invención presentan una mayor cantidad de los llamados "codones raros", el ARNm modificado correspondiente se traduce en un grado considerablemente peor que en el caso en que están presentes codones que codifican ARNt relativamente "frecuentes".
Preferiblemente, la región codificadora del o de los ARNm de la vacuna de la invención se modifica en comparación con la región correspondiente del ARNm de tipo silvestre o la secuencia codificadora, de modo que al menos un codón de la secuencia de tipo silvestre que codifica un ARNt que es relativamente raro en la célula es sustituido por un codón que codifica un ARNt que es relativamente frecuente en la célula y que porta el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro. Mediante esta modificación, las secuencias del o de los ARNm de la vacuna de la invención, en especial si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica un ARNm, son modificadas de modo que se insertan codones para los que están disponibles ARNt frecuentemente presentes. Dicho de otro modo, de acuerdo con la invención, mediante esta modificación todos los codones de la secuencia de tipo silvestre que codifican un ARNt que es relativamente raro en la célula puede ser intercambiado en cada caso por un codón que codifica un ARNt que es relativamente frecuente en la célula y que, en cada caso, porta el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.
Los expertos en la técnica saben qué ARNt están presentes de forma relativamente frecuente en la célula y cuáles, en cambio, están presentes de forma relativamente rara; véase, por ejemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11 (6): 660-666. Los codones que utilizan para el aminoácido particular el ARNt que está presente con mayor frecuencia, por ejemplo el codón Gly, que utiliza el ARNrt que está presente con mayor frecuencia en la célula (humana), son particularmente preferentes.
De acuerdo con la invención, es particularmente preferente vincular el contenido de G/C secuencial, que está aumentado en al menos un 15%, en particular maximizado, en el o los ARNm modificados de la vacuna de la invención con los codones "frecuentes" sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la región codificadora del ARNm. Este aspecto preferente posibilita la provisión de al menos un ARNm de la vacuna de la invención traducido y estabilizado (modificado) de forma particularmente eficaz.
De acuerdo con otro aspecto preferente de la invención, el o los ARNm de la vacuna de la invención tal como se define aquí o cualquier otra molécula de ácido nucleico tal como se define aquí tienen preferiblemente al menos una secuencia estabilizadora en 5' y/o en 3'. Estas secuencias estabilizadoras en las regiones no traducidas 5' y/o 3' tienen el efecto de aumentar la vida media del ácido nucleico en el citosol. Estas secuencias estabilizadoras pueden tener un 100% de identidad de secuencia con secuencias naturales presentes en virus, bacterias y eucariotas, pero también pueden ser parcial o totalmente sintéticas. Como ejemplos de secuencias estabilizadoras que pueden emplearse en la presente invención para un ácido nucleico estabilizado se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de (alfa)globina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis. Otro ejemplo de secuencia estabilizadora tiene la fórmula general (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/u)cC (SEQ ID N°: 383), que está contenida en la 3'UTR del ARN muy estable que codifica (alfa)globina, colágeno de tipo (I), 15-lipoxigenasa o tirosina hidroxilasa (véase Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 1997, 94: 2410 a 2414). Evidentemente, estas secuencias estabilizadoras pueden ser utilizadas individualmente o en combinación entre sí y también en combinación con otras secuencias estabilizadoras conocidas por los expertos en la técnica. No obstante, preferiblemente se llevan a cabo sustituciones, adiciones o eliminaciones de bases con el o los ARNm de la vacuna de la invención o cualquier otra molécula de ácido nucleico tal como se define aquí, en especial si el ácido nucleico está en forma de ARNm, utilizando una matriz de ADN para preparar la molécula de ácido nucleico mediante técnicas de la bien conocida mutagénesis dirigida o con una estrategia de ligación de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001). En dicho proceso, para la preparación del o de los ARNm de la vacuna de la invención tal como se define aquí, se puede transcribir in vitro una molécula de ADN correspondiente. Esta matriz de ADN comprende preferiblemente un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T7 o SP6, para la transcripción in vitro, al que le siguen la secuencia de nucleótidos deseada para el o los ARNm a preparar y una señal de terminación para la transcripción in vitro. La molécula de ADN que forma la matriz del o de los ARNm de interés se puede preparar por proliferación fermentativa y aislamiento subsiguiente como parte de un plásmido que puede ser replicado en bacterias. Los plásmidos que pueden mencionarse como adecuados para la presente invención son, por ejemplo, los plásmidos pT7Ts (número de acceso de GenBank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2360), serie pGEM®, por ejemplo pGEMq-1 (número de acceso de GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (número de acceso de GenBank X65327); véase también Mezei y Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
El o los ARNm de la vacuna de la invención se pueden preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos de síntesis, por ejemplo síntesis en fase sólida, así como métodos in vitro, como reacciones de transcripción in vitro.
El o los ARNm de la vacuna de la invención se asocian con un agente de complejación para aumentar la eficiencia de transfección del o de los ARNm, y agentes adecuados en este contexto para aumentar la eficiencia de transfección es protamina.
El ácido nucleico inmunoestimulador, tal como se utiliza aquí, es un ARNm. El ARN inmunoestimulador puede ser un ARN no codificador (monocatenario) (lineal) (largo). En este contexto, es particularmente preferente que el ARNm porte un trifosfato en su extremo 5', que es el caso para un ARN transcrito in vitro. Un ARN inmunoestimulador tal como se utiliza aquí se puede seleccionar además entre cualquier clase de moléculas de ARNm halladas en la naturaleza o preparadas por síntesis, y que puedan inducir una respuesta inmunitaria innata y puedan apoyar una respuesta inmunitaria adaptativa inducida por antígeno. Una respuesta inmunitaria se puede producir de diversos modos. Un factor esencial para una respuesta inmunitaria (adaptativa) adecuada es la situación de diferentes subpoblaciones de células T. Los linfocitos T se dividen normalmente en dos subpoblaciones, las células T auxiliares 1 (Th1) y las células T auxiliares 2 (Th2), con las que el sistema inmunitario puede destruir patógenos (por ejemplo antígenos) intracelulares (Th1) y extracelulares (Th2). Las dos poblaciones de células Th se diferencian en el patrón de las proteínas efectoras (citoquinas) producidas por las mismas. Por tanto, las células Th1 ayudan a la respuesta inmunitaria celular mediante activación de macrófagos y células T citotóxicas. Por otro lado, las células Th2 promueven la respuesta inmunitaria humoral mediante estimulación de células B para conversión en células plasmáticas y mediante formación de anticuerpos (por ejemplo contra antígenos). Por consiguiente, la relación Th1/Th2 tiene gran importancia en la inducción y el mantenimiento de una respuesta inmunitaria adaptativa. La relación Th1/Th2 de la respuesta inmunitaria (adaptativa) puede desplazarse hacia la respuesta celular (respuesta Th1) e induce así una respuesta inmunitaria celular. El sistema inmunitario innato que puede apoyar una respuesta inmunitaria adaptativa se puede activar mediante ligandos de receptores de tipo Toll (TLR). Los TLR son una familia de polipéptidos de receptor de reconocimiento de patrón (PRR) altamente conservados que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y desempeñan una función crítica en la inmunidad innata en mamíferos. Actualmente se han identificado al menos trece miembros de esta familia, denominados TLR1 - TLR13 (receptores de tipo Toll: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13). Además, se ha identificado una serie de ligandos de TLR específicos. Por ejemplo, se ha descubierto que un ADN bacteriano no metilado y análogos sintéticos del mismo (CpG ADN) son ligandos para TLR9 (Hemmi H et al. (2000) Nature 408:740-5; Bauer S et al. (2001) Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98, 9237-42). Además, se ha informado de que algunos ligandos para determinados TLR incluyen determinadas moléculas de ácido nucleico y que determinados tipos de ARN son inmunoestimuladores de forma independiente o dependiente de la secuencia, pudiendo estimular estos diversos ARN inmunoestimuladores por ejemplo TLR3, TLR7 o TLR8, o receptores intracelulares tales como RIG-I, MDA-5, etc.
De acuerdo con una realización particularmente preferente, el ARnm tal como se utiliza aquí puede comprender o consistir en un ácido nucleico de fórmula (I) o (II):
GlXmGn, (fórmula (I))
donde:
G es guanosina, uridina o un análogo de guanosina o uridina;
X es guanosina, uridina, adenosina, timidina, citidina o un análogo de los nucleótidos arriba mencionados;
l es un número entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, G es guanosina o un análogo de la misma, cuando l > 1, al menos un 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma;
m es un número entero y es al menos 3, donde cuando m = 3, X es uridina o un análogo de la misma, cuando m > 3, están presentes al menos 3 uridinas o análogos de uridina sucesivos;
n es un número entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, G es guanosina o un análogo de la misma, cuando n > 1, al menos un 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma;
ClXmCn, (fórmula (II))
donde:
C es citidina, uridina o un análogo de citidina o uridina;
X es guanosina, uridina, adenosina, timidina, citidina o un análogo de los nucleótidos arriba mencionados;
l es un número entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, C es citidina o un análogo de la misma, cuando l > 1, al menos un 50% de los nucleótidos son citidina o un análogo de la misma;
m es un número entero y es al menos 3, donde cuando m = 3, X es uridina o un análogo de la misma, cuando m > 3, están presentes al menos 3 uridinas o análogos de uridina sucesivos;
n es un número entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, C es citidina o un análogo de la misma, cuando n > 1, al menos un 50% de los nucleótidos son citidina o un análogo de la misma.
Los ácidos nucleicos de fórmulas (I) o (II), que pueden ser utilizados como una secuencia de ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser moléculas de ácido nucleico relativamente cortas, con una longitud típica de aproximadamente 5 a 100 (pero también puede tener una longitud mayor de 100 nucleótidos para realizaciones específicas, por ejemplo hasta 200 nucleótidos), de 5 a 900 o de 5 a 80 nucleótidos, preferiblemente una longitud de aproximadamente 5 a 70, de forma especialmente preferible una longitud de aproximadamente 8 a 60 y, más preferiblemente una longitud de aproximadamente 15 a 60 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 60, de forma totalmente preferible de 30 a 60 nucleótidos. Si el ácido nucleico de fórmula (I) o (II) tiene una longitud máxima de por ejemplo 100 nucleótidos, m será normalmente <98. La cantidad de nucleótidos G en el ácido nucleico de fórmula (I) está determinada por l o n. En este contexto, l y n son en cada caso, independientemente entre sí, un número entero de 1 a 40, en donde, cuando l o n = 1, G es guanosina o un análogo de la misma, y cuando l o n > 1, al menos un 50% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma. Por ejemplo, de forma no limitativa, cuando l o n = 4, Gl o Gn pueden ser, por ejemplo, GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG o GGGG, etc.; cuando l o n = 5, Gl o Gn pueden ser, por ejemplo, GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG, GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG, o GGGGG, etc. Un nucleótido adyacente a Xm en el ácido nucleico de fórmula (I) preferiblemente no es una uridina. De modo similar, la cantidad de nucleótidos C en el ácido nucleico de fórmula (II) está determinada por l o n. En este contexto, l y n son en cada caso, independientemente entre sí, un número entero de 1 a 40, donde, cuando l o n = 1, C es citidina o un análogo de la misma, y cuando l o n > 1, al menos un 50% de los nucleótidos son citidina o un análogo de la misma. Por ejemplo, de forma no limitativa, cuando l o n = 4, C i o Cn pueden ser, por ejemplo, CUCU, CCUU, UCUC, UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC o CCCC, etc.; cuando l o n = 5, C i o Cn pueden ser, por ejemplo, CCCUU, CCUCU, CUCCU, UCCCU, UCCUC, UCUCC, UUCCC, CUCUC, CCCCU, CCCUC, CCUCC, CUCCC, UCCCC, o CCCCC, etc. Un nucleótido adyacente a Xm en el ácido nucleico de fórmula (II) preferiblemente no es una uridina. Preferiblemente, en relación con la fórmula (I), cuando l o n > 1, al menos un 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100% de los nucleótidos son guanosina o un análogo de la misma, tal como se define más arriba. Los nucleótidos restantes hasta el 100% (cuando la guanosina constituye menos del 100% de los nucleótidos) en las secuencias flanqueadoras G y/o Gn son uridina o un análogo de la misma, tal como define más arriba. También preferiblemente, l y n son en cada caso, independientemente entre sí, un número entero de 2 a 30, de forma especialmente preferible de 2 a 20 y de forma incluso más preferible de 2 a 15. El límite inferior de l o n puede variar en caso necesario y es al menos 1, preferiblemente al menos 2, de forma especialmente preferible al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Esta definición es aplicable correspondientemente a la fórmula (II).
De acuerdo con una realización particularmente preferente, un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las fórmulas (I) o (II) arriba mostradas, que puede ser utilizado como una secuencia de ácidos nucleicos inmunoestimuladores se puede seleccionar entre una secuencia que comprende o consiste en cualquiera de las siguientes secuencias:
GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 289);
GGGGGUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 290);
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 291);
GUGUGUGUGUGUUUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO: 292);
GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUGGUUGGUUGGUU (SEQ ID NO: 293);
GGGGGGGGGUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 294);
GGGGGGGGUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 295);
GGGGGGGUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 296);
GGGGGGGUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 297);
GGGGGGUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 298);
GGGGGGUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 299);
GGGGGGUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 300);
GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 301):
GGGGGUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 302);
GGGGUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 303);
GGGGUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 304);
GGUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 305);
GUUUUUUUUUUUUUUUUUUG (SEQ ID NO: 306);
GGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 307);
GGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 308);
GGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 309);
GGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 310);
GGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 311);
GGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 312);
GGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 313);
GGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 314);
GGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 315);
GGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 316);
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 317);
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 318);
GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 319);
GGGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 320);
GGGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 321);
GGGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 322);
GGGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 323);
GGGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 324);
GGGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 325);
GGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 326);
GGGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 327);
GGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 328);
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 329);
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 330);
GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 331);
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 332);
GUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUG (SEQ ID NO: 333);
GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 334);
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GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 336);
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 337);
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 338);
GGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGG (SEQ ID NO: 339);
GGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 340);
GGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGG (SEQ ID NO: 341);
GGUUUGG (SEQ ID NO: 342);
GGUUUUGG (SEQ ID NO: 343);
GGUUUUUGG (SEQ ID NO: 344);
GGUUUUUUGG (SEQ ID NO: 345);
GGUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 346);
GGUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 347);
GGUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 348);
GGUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 349);
GGUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 350);
GGUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 351);
GGUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 352);
GGUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 353);
GGUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 354);
GGGUUUGGG (SEQ ID NO: 355);
GGGUUUUGGG (SEQ ID NO: 356);
GGGUUUUUGGG (SEQ ID NO: 357);
GGGUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 358);
GGGUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 359);
GGGUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 360);
GGGUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 361);
GGGUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 363);
GGGUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 364);
GGGUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 365);
GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUU UUUUUUGGG (SEQ ID NO: 366);
GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 367);
GGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUU GGG (SEQ ID NO: 368); GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG (short GU-rich, SEQ ID NO: 369) o
CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUU UUUUCCC (SEQ ID NO: 370)
CCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCC(SEQ ID NO: 371) CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC (SEQ ID NO: 372)
o una secuencia que tenga al menos un 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 95% de identidad de secuencia con cualquiera de estas secuencias.
De acuerdo con otra realización particularmente preferente, una secuencia de ácidos nucleicos inmunoestimuladores tal como se utiliza aquí, puede comprender o consistir en un ácido nucleico de fórmula (III) o (IV):
(NuGlXmGnNv )a , (fórmula (III))
donde:
G es guanosina (guanina), uridina (uracilo) o un análogo de guanosina (guanina) o uridina (uracilo), preferiblemente guanosina (guanina) o un análogo de la misma;
X es guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un análogo de estos nucleótidos (nucleósidos), preferiblemente uridina (uracilo) o un análogo de la misma;
N es una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una longitud de aproximadamente 4 a 50, preferiblemente de aproximadamente 4 a 40, de forma especialmente preferible de aproximadamente 4 a 30 o 4 a 20 ácidos nucleicos, seleccionándose cada N independientemente entre guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un análogo de estos nucleótidos (nucleósidos);
a es un número entero de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 15, de forma totalmente preferible de 1 a 10;
l es un número entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, G es guanosina (guanina) o un análogo de la misma, cuando l > 1, al menos un 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son guanosina (guanina) o un análogo de la misma;
m es un número entero y es al menos 3, donde cuando m = 3, X es uridina (uracilo) o un análogo de la misma, y cuando m > 3, están presentes al menos 3 uridinas (uracilos) o análogos de uridina (uracilo) sucesivos;
n es un número entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, G es guanosina (guanina) o un análogo de la misma, cuando n > 1, al menos un 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son guanosina (guanina) o un análogo de la misma;
u, v pueden ser, independientemente entre sí, un número entero de 0 a 50, donde, preferiblemente, cuando u = 0, v > 1, o cuando v = 0, u > 1;
teniendo la molécula de ácido nucleico de fórmula (III) una longitud de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente al menos 100 nucleótidos, de forma especialmente preferible al menos 150 nucleótidos, de forma incluso más preferible al menos 200 nucleótidos y de forma totalmente preferible al menos 250 nucleótidos.
(NuClXmCnNv )a (fórmula (IV))
donde:
C es citidina (citosina), uridina (uracilo) o un análogo de citidina (citosina) o uridina (uracilo), preferiblemente citidina (citosina) o un análogo de la misma;
X es guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un análogo de los nucleótidos (nucleósidos) arriba mencionados, preferiblemente uridina (uracilo) o un análogo de la misma;
N es en cada caso una secuencia de ácidos nucleicos que tienen, independientemente entre sí, una longitud de aproximadamente 4 a 50, preferiblemente de aproximadamente 4 a 40, de forma especialmente preferible de aproximadamente 4 a 30 o 4 a 20 ácidos nucleicos, siendo seleccionada cada N independientemente entre guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un análogo de estos nucleótidos (nucleósidos);
a es un número entero de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 15, de forma totalmente preferible de 1 a 10;
l es un número entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, C es citidina (citosina) o un análogo de la misma, cuando l > 1, al menos un 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son citidina (citosina) o un análogo de la misma;
m es un número entero y es al menos 3, donde cuando m = 3, X es uridina (uracilo) o un análogo de la misma, cuando m > 3, están presentes al menos 3 uridinas (uracilos) o análogos de uridina (uracilo) sucesivos;
n es un número entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, C es citidina (citosina) o un análogo de la misma, cuando n > 1, al menos un 50% de estos nucleótidos (nucleósidos) son citidina (citosina) o un análogo de la misma;
u, v pueden ser, independientemente entre sí, un número entero de 0 a 50, donde, preferiblemente, cuando u = 0, v > 1, o cuando v = 0, u > 1;
teniendo la molécula de ácido nucleico de fórmula (IV) una longitud de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente al menos 100 nucleótidos, de forma especialmente preferible al menos 150 nucleótidos, de forma incluso más preferible al menos 200 nucleótidos y de forma totalmente preferible al menos 250 nucleótidos.
Cualquiera de las definiciones dadas más arriba de las fórmulas (I) y (II), por ejemplo para los elementos N (es decir, Nu y Nv ) y X (Xm), en particular la estructura de núcleo tal como se define más arriba, así como para los números enteros a, l, m, n, u y v, son aplicables de modo similar a elementos de fórmulas (III) y (IV) correspondientemente. La definición de elementos adyacentes Nu y Nv en la fórmula (IV) es idéntica a las definiciones arriba indicadas para Nu y Nv en la fórmula (IV).
De acuerdo con una realización muy particularmente preferente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la fórmula (IV), que puede ser utilizada como una secuencia de ácido nucleico inmunoestimuladora se puede seleccionar por ejemplo de entre cualquiera de las siguientes secuencias:
U A G C G A A G C U C U U C C A C C U A G G U U U U U U U U U U U U U U U C G G U G C C U U C C U A -G A A G U A C A C G (SEQ ID N O : 373)
U A G C G A A G C U C U U G G A C C U A G G U U U U U U U U U U U U U U U G G G U G C G U U C C U A -G AAG U AC ACG AU C G C U U C G A G AACCUG G AUCCAAAAAAAAAAAAAAACCCAC-G C AA G G A U C U U C A U G U G C (SEQ ID N O : 374)
G G G A G A A A G C U C A A G C U U G G A G C A A U G C C C G C A C A U U G A C G A A A C C G A G U U G -C A U A U C U C A G A G U A U U C G C C C C C G U G U A G G U U A U U C U U G A C A G A C A G U G -G A G C U U A U U C A C U C C C A G G A U C C G A G U C G C A U A C U A C G G U A C U G G U G A C A G A C -C U A G G U C G U C A G U U G A C C A G U C C G C C A C U A G A C G U G A G U C C G U C A A A G C A G U U A -G A U G U U A C A C U C U A U U A G A U C (SEQ ID N O : 375)
G G G A G A A A G C U C A A G C U U G G A G C A A U G C C C G C A C A U U G A G G A A A C C G A G U U G -C A U A U C U C A G A G U A U U G G C C C C C G U G U A G G U U A U U C U U G A C A G A C A G U G -G A G C U U A U U C A C U C C C A G G A U C C G A G U C G C A U A C U A C G G U A C U G G U G A C A G A C -C U A G G U C G U C A G U U G A C C A G U C C G C C A C U A G A C G U G A G U C C G U C A A A G C A G U U A -G A U G U U A C A C U C U A U U A G A U C U C G G A U U A C A G C U G G A A G G A G C A G G A G U A G U G -U U C U U G C U C U A A G U A C C G A G U G U G C C C A A U A C C C G A U C A G C U U A U U A A C G A A C -G G C U C C U C C U C U U A G A C U G C A G C G U A A G U G C G G A A U C U G G G G A U C A A A U U A C U -G AC U G C C U G G AU U ACCCU CGG ACA U A U AACC U U G U AGCAC-G C U G U U G C U G U A U A G G U G A C C A A C G C C C A C U C G A G U A G A C C A G C U C U -C U U A G U C C G C A C A A U C A U A G G A G G C G C G G U C A A U C U A C U U C U G G C U A G U U -A A G A A U A G G C U G C A C C G A C C U C U A U A A G U A G C G U G U C C U C U A G (SEQ ID N O : 376)
G G G AG A AAG C U C AA G C U U G G AG C A AU G C C C G C A C A U U G AG G A AA C C G A G U U G -C A U A U C U C A G A G U A U U G G C C C C C G U G U A G G U U A U U C U U G A C A G A C A G U G -G A G C U U A U U C AC U C C C AG G AU C C G AG U C G C AU A C U AC G G U A C U G G U G AC AG AC -C U A G G U C G U C AG U U G AC C AG U C C G C C AC U AG A C G U C A C U C C G U C A AA G C AG U U A-G A U G U U A C A C U C U AU U A G A U C U C G G A U U A C A G C U G G A A G G A G C A G G A G U A G U G -U U C U U G C U C U A A G U A C C G AC U G U G C C C AAU AC C C G AU C AG C U U AU U AA C G AAC -G G C U C C U C C U C U U AG AC U G C A G C G U AA G U G C G G AA U C U G G G G AU C AA AU U AC U -G ACU G C C U G G A U U AC C C U C G G AC AU AU A AC C U U G U AG C A C -G C U G U U G C U G U A U A G G U G A C C A AC G C C C A C U C G A G U AG A C C A G C U C U -C U U A G U C C G G A C A A U G A U A G G A G G C G C G G U C A A U C U A C U U C U G G C U A G U U -AAG AAU AG G C U G C AC C G AC C U C U A U A AG U A G C G U G U C C U C U A G A G C U A C -G C AG G U U C G C A A U A A A A G C G U U G A U U A G U G U G C A U A G A A C A G A C C U -C U U AU U C G G U G A AA C G C C A G AA U G C U AA AU U C C A AU AA C U C U U C C C AA AAC -G C G U AC G G C C G A AG A C G C G C G C U U AU C U U G U G U AC G U U C U C G C AC AU G G AA-G A A U C A G C G G G C A U C G U G G U A C G G C A A U A G G G G A G C U G G G U A G -CAG CG AAAAAG G G CCCCUG CG CAC-G U AG C U U C G C U G U U C G U C U G AA AC AAC C C G G -C A U C C G U U G U A G C G A U C C C G U U A U C A G U G U U A U U C U U G U G C G C A C U A A G A U -U C AU G G U G U A G U C G A C A A U A A C A G C G U C U U G G C A G A U U C U G G U C A C G U G -C C C U AU G C C C G G G C U U G U G C C U C U C AG G U G C AC AG C G AU AC U U AAA-G C C U U C AA G G U AC U C G AC G U G G G U AC C G AU U C G U G AC AC U U C C U AA G AU -U AU U C C AC U G U G U U AG C C C C G C AC C G C C G AC C U AAAC U G G U C C AAU G U AU AC -G C A U U C G C U G A G C G G A U C G A U A A U A A A A G C U U G A A U U (SEQ ID N O : 377)
G G C A G A A A G C U C A A G C U U A U C C A A G U A G G C U G G U C A C C U G U A C A A C -G U A G C C G G U A U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U G A C C G U C U C A A G G U C C A A -G U U A G U C U G C C U A U A A A G G U G C G G A U C C A C A G C U G A U C A A A G A C U U G U G -C G G U A C G G U U A A U C U C C C C U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U A G U -A A A U G C G U C U A C U G A A U C C A G C G A Ü G A U G C U G G C C C A G A U C (SEQ ID N O : 378)
G G G A G A A A G C U C A A G C U U A U C C A A G U A G G C U G G U C A C C U G U A C A A C -G U A G C C G G U A U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U G A C C G U C U C A A G G U C C A A -G U Ü A G U C U G C C U A U A A A G G Ü G C G G A U C C A C A G C U G A U G A A A G A C U U G U G -C G G U A C G G U U A A U C U C C C C U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U A G U -A A A U G C G U C U A C U G A A U C C A G C G A U G A U G C U G C C C C A G A U C U U C G A C C A C A A -G U G C A U A U A G U A G U C A U -C G A G G G U C G C C U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U G G C C C A G U U C U G A G A C U -U C C C U A G A G A C U A C A G U U A C A G C U G C A G U A G Ü A A C C A C U G C G G C U A U U G C A G -G A A A U C C C G U U C A G G U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U C C G C U C A C U A U G A U -U A A G A A C C A G G U G G A G U G U C A C U G C U C U C G A G G U C U C A C G A -G A G C G C U C G A U A C A G U C C U U G G A A -G A A U C U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U G U G C G A C G A U C A C A G A G A A C U -U C U A U U C A U G C A G G U C U C C U C U A (R 722 SÉQ ID N O : 379)
G G G A G A A A G C U C A A G C U U A U C C A A G U A C G C U G G U C A C C U G U A C A A C -G U A G C C G G U A U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U C A C C G U C U C A A G G U C C A A -G U U A G U C U G C C U A U A A A G G U G C G G A U C C A C A G C U G A U G A A A G A C U U G U G -C G G U A C G G U U A A U C U C C C C U Ü U U U U U U U U U U U U U U U U U U U A G U -A A A U G C G U C U A C U G A A U C C AG C G A U G AU G C U G G C C C A G AU C U U C G A C C A C AA-G U G C A U A U A G U A G U C A U -C G A G G G U C G C C U U U U U U U U U U U U U Ü U U U U U U U U U G G C C C A G U U C U G A G A C U -U C C C U AG A G A C U A C A G U U A C A G C U G C A G U A G U A A C C A C U G C G G C U A U U G C A G -G A A A U C C C G U U C A G G U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U C C G C Ü C A C U A U G A U -U AA G AA C C AG G U G G A G U G U C A C U G C U C U C G A G G U C U C A C G A -G A G C G C U C G A U AC AG U C C U U G G AA-G A A U C U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U G U G C G A C G A U C A C A G A G A A C U -U C U A U U C AU G C A G G U C U G C U C U AG A AC G AA C U G AC C U G A C G C C U G A AC U -U A U G A G C G U G C G U A U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U C C U C C C A A C A A A U -G U C G A U C A A U A G C U G G G C U G U U G G A G A C G C G U C A G C A A A U G C C G U G -G C U C C A U A G G A C G U G U A G A C U U C U A U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U C C C G G -G A C C A C A A A U A A U A U U C U U G C U U G G U U G G G C G -C AA G G G C C C C G U A U C A G G U C A U A A A C G G G U A C A U G U U G -C A C A G G C U C C U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U C G C U G A G U U A U U C C G G U C U C AAAAG AC G G C AG AC G U C AG UCG ACAACACG G UCU AAAG C AG UG-C U A C A A U C U G C C G U G U U C G U G U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U G U G A A C -C U AC AC G C C G U G C A C U C U A G U U C G C A A U -U C A U A G G G U A C C G G C U C A G A G U U A U G C C U U G G U U G A A A A C U G C C C A G C A U A C U -U U U U U U U U U U U U U U U U U U U C A U A U U C C C A U G C U -A A G C A A G G G A U G C C G C G A G U C A U G U U A A G C U U G A A U U (SEQ ID N O : 380)
De acuerdo con otra realización muy particularmente preferente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la fórmula (V) se puede seleccionar por ejemplo entre cualquiera de las siguientes secuencias:
U A G C G A A G C U C U U G G A C C U A C C U U U U U U U U U U U U U U C C C U G C G U U C C U A G A A -G UACACG (SEQ ID N O : 381)
o
U A G C G A A G C U C U U G G A C C U A C C U U U U U U U U U U U U U U U C C C U G C G U U C C U A G AAG UAC ACG AU CG CU U C G AG AAC C U G G AUG G AAAAAAAAAAAAAAAG G G AC-G C AA G G AU C U U C AU C U G C (SEQ ID NO: 382)
o una secuencia que tenga al menos un 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 95% de identidad de secuencia con cualquiera de estas secuencias.
Finalmente, el denominado "componente (adyuvante)", que puede ser utilizado junto con el ARNm en la vacuna tal como se describe aquí, se prepara preferiblemente de acuerdo con una primera etapa complejando el o los ARN(m) del componente (adyuvante) con protamina en una relación específica, para formar un complejo estable. En este contexto es sumamente preferible que, después de complejar el ARN(m), en el componente (adyuvante) no quede nada de protamina libre o solo quede una cantidad insignificantemente pequeña de ésta. Por consiguiente, la relación entre el ARN(m) y la protamina en el componente (adyuvante) es 2:1 (p/p).
Además, la vcuna tal como se reivindica se puede envasar adicionalmente con una molécula portadora para posibilitar el envasado combinado del componente (adyuvante) y el antígeno. Dicha molécula portadora se puede seleccionar entre cualquier polímero adecuado para envasar y preferiblemente transportar la vacuna tal como se reivindica al interior de células, tejido, etc., de un paciente tal como se define aquí.
En otro aspecto preferente de la presente invención, la vacuna de la invención puede comprender un soporte y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. En el contexto de la presente invención, un soporte farmacéuticamente aceptable incluye normalmente la base líquida o no líquida de una composición que comprende los componentes de la vacuna de la invención. Si la composición se proporciona en forma líquida, el soporte consistirá normalmente en agua libre de pirógenos; soluciones (acuosas) salinas isotónicas o tamponadas, por ejemplo soluciones tamponadas con fosfato, citrato, etc. El tampón de inyección puede ser hipertónico, isotónico o hipotónico cono referencia al medio de referencia específico, es decir, el tampón puede tener un contenido de sal mayor, idéntico o menor con referencia al medio de referencia específico, pudiendo utilizarse preferiblemente concentraciones de las sales arriba mencionadas que no conduzcan a un deterioro celular debido a ósmosis u otros efectos de la concentración. Medios de referencia son por ejemplo líquidos presentes en métodos "in vivo", tales como sangre, linfa, líquidos citosólicos, u otros líquidos corporales, o por ejemplo líquidos que pueden emplearse como medios de referencia en métodos "in vitro", tales como tampones o líquidos comunes. Estos tampones o líquidos comunes son conocidos por los expertos en la técnica. Una solución Ringer Lactato es particularmente preferente como base líquida.
No obstante, para la vacuna de la invención también se pueden utilizar uno o más materiales de carga o diluyentes sólidos o líquidos o materiales de encapsulación compatibles, que sean adecuados para ser administrados a un paciente a tratar. El término "compatible", tal como se utiliza aquí, significa que estos constituyentes de la vacuna de la invención pueden ser mezclados con los componentes de la vacuna de la invención de modo que no se produce ninguna interacción que pudiera reducir sustancialmente la eficacia farmacéutica de la vacuna de la invención bajo las condiciones de uso normales.
Se describe aquí también que la vacuna puede comprender un adyuvante. En este contexto, un adyuvante se puede entender como cualquier compuesto que sea adecuado para iniciar o aumentar una respuesta inmunitaria del sistema inmunitario innato, es decir, una respuesta inmunitaria no específica. Dicho de otro modo, cuando es administrada, la vacuna preferiblemente provoca una respuesta inmunitaria innata debido al adyuvante opcionalmente contenido dentro de la misma. Dicho adyuvante se puede seleccionar entre adyuvantes conocidos por los expertos y adecuados para el presente caso, es decir, que apoyan la inducción de una respuesta inmunitaria innata en un mamífero, por ejemplo una proteína adyuvante tal como se define más arriba o un adyuvante tal como se define más adelante.
Dicho adyuvante se puede seleccionar entre los componentes (adyuvantes) tal como se definen más arriba.
Dicho adyuvante se puede seleccionar entre adyuvantes conocidos por los expertos y adecuados para el presente caso, es decir, que apoyen la inducción de una respuesta inmunitaria innata en un mamífero y/o que sean adecuados para el depósito y suministro de los componentes de la vacuna de la invención. El adyuvante se puede seleccionar entre el grupo consistente en quitosano, TDM, MDP, dipéptido de muramilo, pluronics, solución de alumbre, hidróxido de aluminio, ADJUMERTM (polifosfaceno); gel de fosfato de aluminio; glucanos de algas; algamulina; gel de hidróxido de aluminio (alumbre); gel de hidróxido de aluminio altamente adsorbente de proteínas; gel de hidróxido de aluminio de baja viscosidad; AF o SPT (emulsión de escualano (5%), Tween 80 (0,2%), Pluronic L121 (1,25%), solución salina tampón de fosfato, pH 7,4); AVRIDINETM (propanodiamina); BAY R1005TM (hidroacetato de (N-(2-desoxi-2-L-leucilaminob-D-glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoíl-amida); CALCIT-RIOLTM (1-alfa,25-dihidroxi-vitamina D3); gel de fosfato de calcio; c A p TM (nanopartículas de fosfato de calcio); holotoxina colérica, proteína de fusión toxina colérica-A1-proteína-A-D-fragmento, subunidad B de la toxina colérica; CRL 1005 (copolímero en bloque P1205); liposomas que contienen citoquinas; DDA (bromuro de dimetildioctadecil-amonio); DHEA (deshidroepiandrosterona); DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol); complejo DOC/alumbre (sal sódica de ácido desoxicólico); adyuvante completo de Freund; adyuvante incompleto de Freund; gamma inulina; adyuvante Gerbu (mezcla de: i) N-acetilglucosaminil-(P1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D35 glutamina (GMDP), ii) cloruro de dimetildioctadecilamonio (DDA), iii) complejo de sal zinc-L-prolina (ZnPro-8); GM-CSF); Gm DP (N-acetilglucosaminil-(b1-4)-N-acetilmuramil-L47 alanil-D-isoglutamina); imiquimod (1-(2-metipropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina); ImmTher™ (dipalmitato de N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol); DRVs (immunoliposomas preparados a partir de vesículas de deshidratación); interferón gamma; interleuquina-1 beta; interleuquina-2; interleuquina-7; interleuquina-12; ISCOMSTM; ISCOPREP 7.0.3. TM; liposomas; LOXORIBINETM (7-alil-8-oxoguanosina); adyuvante oral LT 5 (enterotoxina-protoxina lábil de E. coli); microesferas y micropartículas de cualquier composición; MF59TM; (emulsión de escualeno en agua); MONTANIDE ISA 51TM (adyuvante incompleto de Freund purificado); MONTANIDE ISA 720TM (adyuvante de aceite metabolizable); MPLTM (3-Q-desacil-4'-monofosforil lípido A); liposomas MTP-PE y MTP-PE ((N-acetil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi))-etilamida, sal monosódica); MURAMETIDETM (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MU-RAPALMITINETM y DMURAPALMITINETM (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-gliceroldipalmitoilo); NAGO (neuraminidasa-galactosa oxidasa); nanoesferas o nanopartículas de cualquier composición; NISVs (vesículas tensioactivas no iónicas); PLEURANTM (-glucano); PLGA, PGA y PLA (homo- y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico; microesferas/nanoesfereas); PLURONIC L121TM; PMMA (polimetilmetacrilato); PODDSTM (microesferas de proteinoide); derivados de carbamato de polietileno; poli-rA: poli-rU (complejo de ácido poliadenílico-ácido poliuridílico); polisorbato 80 (Tween 80); cocleatos de proteína (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMUlOn TM (QS-21); Quil-A (Quil- A saponina); S-28463 (4-amino-otec-dimetil-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol); SAF-1TM ("formulación adyuvante Syntex"); proteoliposomas de Sendai y matrices lipídicas que contienen lípidos; Span-85 (trioleato de sorbitano); Specol (emulsión de Marcol 52, Span 85 y Tween 85); escaleno o Robane® (2,6,10,15,19,23-hexametiltetra-cosano y 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexano); esteariltirosina (clorhidrato de octadeciltirosina); Theramid® (N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Aladipalmitoxipropilamida); teronil-MDP (TermurtidaTM o [thr 1]-MDP; N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina); partículas Ty (Ty-VLPs o particulas similares a virus); liposomas Walter-Reed (liposomas que contienen lípido A adsorbido sobre hidróxido de aluminio), y lipopéptidos, incluyendo Pam3Cys, en particular sales de aluminio, tales como Adju-phos, Alhydrogel, Rehydragel; emulsiones, incluyendo CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin; copolímeros, incluyendo Optivax (CRL1005), L121, Poloaxmer4010), etc.; liposomas, incluyendo Stealth, cocleatos, incluyendo B iOrAL; adyuvantes derivados de plantas, incluyendo QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; adyuvantes adecuados para la coestimulación, incluyendo Tomatina, biopolímeros, incluyendo PLG, PMM, Inulina, adyuvantes derivados de microbios, incluyendo Romurtide, DETOX, MPL, CWS, Manosa, secuencias de ácido nucleico CpG, CpG7909, ligandos de TLR 1-10 humano, ligandos de múrido TLR 1-13, ISS-1018, 35 IC31, imidazoquinolinas, Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs, toxina colérica, toxina lábil al calor, Pam3Cys, flagelina, anclaje GPI, LNFPIII/Lewis X, péptidos antimicrobianos, UC-1V150, proteína de fusión RSV, cdiGMP; y adyuvantes adecuados como antagonistas incluyendo neuropéptidos CGRP.
Un adyuvante se puede seleccionar entre adyuvantes que apoyan la inducción de una respuesta inmunitaria Th1 o la maduración de células T naive, tales como GM-CSF, IL-12, IFNg, cualquier ARN tal como se define aquí, preferiblemente un ARN inmunoestimulador, CpG ADN, etc.
La vacuna de la invención puede contener adicionalmente un agente inmunoterapéutico adicional seleccionado de entre inmunoglobulinas, preferiblemente IgG, anticuerpos monoclonales o policlonales, suero o sueros policlonales, etc. Preferiblemente, dicho agente terapéutico adicional se puede proporcionar como un péptido/proteína o puede ser codificado por un ácido nucleico, preferiblemente mediante un ADN o un ARN, de forma especialmente preferible un ARNm. Este agente inmunoestimulador permite proporcionar vacunación pasiva adicional a la vacunación activa provocada por el antígeno codificado con ARNm de la composición de la invención o la composición de la vacuna.
La vacuna de la invención puede contener adicionalmente una o más sustancias auxiliares para aumentar su inmunogenicidad o capacidad inmunoestimuladora, si así se desea. De este modo se logra preferiblemente una acción sinérgica de la vacuna de la invención y una sustancia auxiliar que puede estar contenida opcionalmente en la vacuna o se puede formular con el inhibidor. A este respecto, dependiendo de los diversos tipos de sustancias auxiliares, pueden entrar en consideración diversos mecanismos. Por ejemplo, una primera clase de sustancias auxiliares adecuadas está formada por compuestos que permiten la maduración de células dendríticas (DC), por ejemplo lipopolisacáridos, TNF-alfa o ligando CD40. En general, como sustancia auxiliar se puede utilizar cualquier agente que influya en el sistema inmunitario a modo de una "señal de peligro" (LPS, GP96, etc.) o citoquinas, tal como GM-CFS, que permite mejorar una respuesta inmunitaria y/o influir de forma dirigida en la misma. Sustancias auxiliares particularmente preferentes son citoquinas, tales como monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimioquinas, que adicionalmente promueven la respuesta inmunitaria innata, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta o TNF-alfa, factores de crecimiento tales como hGH.
La vacuna de la invención también puede contener adicionalmente cualquier otro compuesto conocido por ser inmunomodulador debido a su afinidad de unión (como ligando) con receptores de tipo Toll humanos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, Tl R9, TLR10, o debido a su afinidad de unión (como ligandos) con receptores de tipo Toll murinos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13, un ligando de un receptor de tipo NOD, o un ligando de un receptor de tipo RIG-I.
En este contexto, la vacuna de la invención también puede contener adicionalmente un ácido nucleico inmunoestimulador.
La vacuna de la invención tal como se define de acuerdo con la presente invención puede comprender además otros aditivos o compuestos adicionales. Otros aditivos que pueden incluirse en la vacuna de la invención son emulsionantes, por ejemplo, Tween®, agentes humectantes, por ejemplo, laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes, soportes farmacéuticos; agentes formadores de comprimidos; estabilizadores; antioxidantes; conservantes.
Otro aditivo que puede estar contenido en la vacuna de la invención puede ser un agente antibacteriano. En este contexto, cualquier agente antibacteriano conocido por los expertos puede emplearse en combinación con los componentes de la vacuna de la invención tal como se define aquí. Ejemplos no limitativos de agentes antibacterianos incluyen amikacina, amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, anfotericina-B, ampicilina, ampicilina-sulbactam, apramicina, azitromicina, aztreonam, bacitracina, bencilpenicilina, caspofungina, cefaclor, cefadroxilo, cefalexina, cefalotina, cefazolina, cefdinir, cefepima, cefixima, cefmenoxima, cefoperazona, cefoperazona-sulbactam, cefotaxima, cefoxitina, cefbirome, cefpodoxima, cefpodoxima-ácido clavulánico, cefpodoxima-sulbactam, cefbrozil, cefquinoma, ceftazidima, ceftibutina, ceftiofur, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cloranfenicol, florfenicol, ciprofloxacina, claritromicina, clinafloxacina, clindamicina, cloxacilina, colistina, cotrimoxazol (trimtoprim/sulfamethxazol), dalbavancin, dalfopristina/quinopristina, daptomicina, dibekacina, dicloxacilina, doripenem, doxiciclina, enrofloxacina, ertapenem, eritromicina, flucloxacilina, fluconazol, flucitosina, fosfomicina, ácido fusídico, garenoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, gentamicina, imipenem, itraconazol, kanamicina, ketoconazol, levofloxacina, lincomicina, linezolid, loracarbef, mecilinam (amdinocilina), meropenem, metronidazol, meziocilina, mezlocilina-sulbactam, minociclina, moxifloxacina, mupirocina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacina, ofloxacina, oxacilina, pefloxacina, penicilina V, piperacilina, piperacilina-sulbactam, piperacilina-tazobactam, rifampicina, roxitromicina, esparfloxacino, espectinomicina, espiramicina, estreptomicina, sulbactam, sulfametoxazol, teicoplanina, telavancina, telitromicina, temocilina, tetraciclina, ticarcilina, ticarcilina-ácido clavulánico, tigeciclina, tobramicina, trimetoprima, trovafloxacina, tilosina, vancomicina, virginiamicina, y voriconazol.
Otro aditivo más que puede estar contenido en la vacuna de la invención puede ser un agente antiviral, preferiblemente, pero no de forma limitativa, análogos de nucleósido (por ejemplo zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina), foscarnet, amantadina, peramivir, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, interferones alfa y otros interferones, AZT, t-705, zanamivir (Relenza®) y oseltamivir (Tamiflu®). Otros agentes antivirales incluyen vacunas del virus de la gripe, por ejemplo Fluarix® (Glaxo SmithKline), FluMist® (Medlmmune Vaccines), Fluvirin® (Chiron Corporation), Flulaval® (GlaxoSmithKline), Afluria® (CSL Bio-therapies Inc.), Agriflu® (Novartis) o Fluzone® (Aventis Pasteur).
La vacuna de la invención normalmente comprende una "cantidad segura y eficaz" de los componentes de la vacuna de la invención tal como se define aquí. Tal como se utiliza aquí, una "cantidad segura y eficaz" significa preferiblemente una cantidad de los componentes, preferiblemente del o de los ARNm, que es suficiente para inducir de forma significativa una modificación positiva de una enfermedad o trastorno tal como se define aquí. Sin embargo, al mismo tiempo, una "cantidad segura y eficaz" es suficientemente pequeña para evitar efectos secundarios graves y para permitir una relación razonable entre ventajas y riesgos. La determinación de estos límites está normalmente dentro del alcance del criterio médico.
Tal como se define aquí, la vacuna tal como se reivindica que codifica al menos un antígeno se utiliza en la profilaxis de una enfermedad infecciosa en un recién nacido o un niño de una edad no superior a 2 años, preferentemente no superior a 1 año (12 meses), en particular no superior a 9, 6 o 3 meses. El tratamiento comprende la vacunación del recién nacido o del niño y provocar una respuesta inmune en dicho recién nacido o niño. Un recién nacido o niño es (paciente) humano que tiene una edad no superior a 2 años, preferentemente no superior a año y medio, en especial no superior a un año (12 meses), incluso más preferentemente no superior a 9 meses, 6 meses o incluso 3 meses. Así, un recién ancido o niño puede comprender una edad de aproximadamente 0 a 2 años, preferentemente de 0 a año y medio, en especial de 0 a 1 año (0 a 12 meses), incluso más preferentemente de no más de 0 a 9 meses, 0 a 6 meses o incluso 0 a 3 meses. Además, un recién nacido o niño puede distinguirse en un recién nacido, típicamente con una edad inferior a 1 año (12 meses), preferentemente no más de 9 meses, 6 meses o incluso 3 meses. Por tanto, un recién nacido o niño puede tener una edad de aproximadamente 0 a 1 año (0 a 12 meses), preferentemente no más de 0 a 9 meses, 0 a 6 meses o incluso 0 a 3 meses. Un recién ancido o niño se puede distinguir además como un niño, típicamente con una edad superior a 3 meses, preferentemente con una edad de 6 meses, en especial con una edad de más de 9 meses. Los recién nacidos o niños pueden ser varones o mujeres.
Tal como se define además en la presente invención, el tratamiento comprende la vacunación del paciente y la provocación de una respuesta inmunitaria en dicho paciente. En este contexto, la vacunación tiene lugar normalmente a través de la administración de la vacuna de la invención. La administración puede realizarse vía parenteral, oral, nasal, pulmonar, por inhalación (por ejemplo mediante un aerosol o espray), tópica, rectal, bucal, vaginal, o a través de un depósito implantado. Tal como se utiliza aquí, el término "parenteral" incluye la inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, transdérmica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardíaca, intra-arterial y sublingual, o técnicas de infusión. Preferiblemente, la vacuna de la invención se puede administrar vía intradérmica para alcanzar APC en la dermis. De modo igualmente preferible, la vacuna de la invención tal como se define aquí puede ser administrada vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, incluyendo, de forma no limitativa, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. De modo igualmente preferible, la vacuna de la invención puede ser administrada vía tópica, en especial cuando el objetivo de tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, incluyendo por ejemplo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparar fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la vacuna de la invención se puede formular en un ungüento adecuado que contiene la vacuna de la invención y opcionalmente otros componentes tal como se definen aquí suspendidos o disueltos en uno o más soportes. También se puede emplear una administración vía pulmonar, por ejemplo mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de pulverización para una utilización a modo de espray.
La vacuna de la invención puede emplearse en combinación con otras terapias, preferiblemente con una terapia para una enfermedad tal como se define aquí, o terapias adicionales. Tal como se utiliza aquí, el concepto "en combinación", en el contexto de la administración de dos o más terapias a un recién nacido o niño tal como se define aquí, se refiere al uso de más de una terapia, preferiblemente dos terapias o incluso más. El uso del concepto "en combinación" no restringe el orden en el que las terapias son administradas al recién nacido o niño tal como se define aquí. Por ejemplo, una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) puede ser administrada en cualquier momento antes (por ejemplo 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), al mismo tiempo o después (por ejemplo 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) de la administración de una segunda terapia a un recién nacido o niño tal como se define aquí. En algunos aspectos, la o las terapias adicionales son terapias tumorales convencionales, cirugía, quimioterapias, inmunoterapias, terapias genéticas, tratamientos contra el dolor, medicaciones antipiréticas, terapias que alivian o ayudan a respirar, otras vacunas/inmunizaciones (activas o pasivas), terapias antivirales, terapias antibacterianas, terapias antifúngicas, terapias antiparasitarias, terapias antialérgicas, terapias tumorales convencionales, quimioterapias, o pueden incluir una profilaxis post-exposición a o para cualquiera de las enfermedades qauñi citadas, preferentemente para la rabia, la infección viral RSV, etc. En determinados aspectos, las terapias son administradas con una diferencia de menos de 5 minutos, con una diferencia de menos de 30 minutos, con una diferencia de 1 hora, con una diferencia de aproximadamente 1 hora, con una diferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas, con una diferencia de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas, con una diferencia de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas, con una diferencia de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas, con una diferencia de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas, con una diferencia de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas, con una diferencia de aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas, con una diferencia de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas, con una diferencia de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas, con una diferencia de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas, con una diferencia de aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas, con una diferencia de aproximadamente 12 horas a 18 horas, con una diferencia de 18 horas a 24 horas, con una diferencia de 24 horas a 36 horas, con una diferencia de 36 horas a 48 horas, con una diferencia de 48 horas a 52 horas, con una diferencia de 52 horas a 60 horas, con una diferencia de 60 horas a 72 horas, con una diferencia de 72 horas a 84 horas, con una diferencia de 84 horas a 96 horas, o con una diferencia de 96 horas a 120 horas. En aspectos específicos, dentro de la misma visita del paciente se administran dos o más terapias.
Ejemplos de dosis para ARNm que codifican al menos un antígeno tal como se define aquí pueden estar, de forma no limitativa, dentro del intervalo de aproximadamente 10 ng a 1 g, de 100 ng a 100 mg, de 1 pg a 10 pg, 0 de 30-300 pg de ARNm por paciente. Preferiblemente, la vacuna de la invención se formula correspondientemente para que comprenda una dosis, dos dosis, tres o incluso más dosis.
De acuerdo con un aspecto específico, la vacuna de la invención puede ser administrada a un recién nacido o niño en forma de una dosis individual. En determinados aspectos, la vacuna de la invención puede ser administrada a un recién nacido o niño en forma de una dosis individual seguida por una segunda dosis más adelante y opcionalmente después incluso una tercera, cuarta (o más) dosis, etc. De acuerdo con este aspecto, a un recién nacido o niño se le pueden administrar inoculaciones de refuerzo con la vacuna de la invención a intervalos de tiempo específicos, preferiblemente tal como se define más abajo, después de la segunda (o tercera, cuarta, etc.) inoculación. En determinados aspectos, estas inoculaciones de refuerzo con la vacuna de la invención pueden utilizar un compuesto o componente adicional tal como se define para la vacuna de la invención tal como se define aquí. En algunos aspectos, la administración de la misma vacuna de la invención y/o las administraciones de refuerzo se pueden repetir y dichas administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, por ejemplo de 1 a 5 días, de 1 a 10 días, de 5 a 15 días, de 10 a 20 días, de 15 a 25 días, de 20 a 30 días, de 25 a 35 días, de 30 a 50 días, de 40 a 60 días, de 50 a 70 días, de 1 a 75 días, o 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, o al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, 18 meses, 24 meses. En determinados aspectos, la vacuna de la invención puede ser administrada a un sujeto como una dosis individual una vez al año.
En aspectos particulares, la vacuna de la invención puede ser administrada a un paciente recién ancido o niño en otoño o invierno, es decir, antes de la estación de la gripe o durante la misma en cada hemisferio. En un aspecto, a un recién nacido o niño se le administra su primera dosis en la estación, por ejemplo a finales de septiembre o principios de octubre, de modo que la segunda dosis (si es necesaria) puede ser administrada antes del pico de la estación de la gripe.
En aspectos particulares, la vacuna de la invención puede ser administrada al menos una vez, preferiblemente dos o más veces, a un reicén nacido o niño antes de un tratamiento de una enfermedad tal como se define aquí, preferiblemente al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, por ejemplo de 1 a 5 días, de 1 a 10 días, de 5 a 15 días, de 10 a 20 días, de 15 a 25 días, de 20 a 30 días, de 25 a 35 días, de 30 a 50 días, de 40 a 60 días, de 50 a 70 días, de 1 a 75 días, o 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, o al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses antes de un tratamiento de una enfermedad tal como se define aquí. Una segunda dosis o dosis adicional puede ser administrada después directamente antes del tratamiento, al mismo tiempo o después del tratamiento.
Además, una enfermedad tal como se define de acuerdo con la presente invención se selecciona de entre enfermedades infecciosas, preferiblemente enfermedades infecciosas (virales, bacterianas o por protozoos).
De acuerdo con un aspecto específico, las enfermedades tal como se definen aquí comprenden enfermedades infecciosas, preferiblemente enfermedades infecciosas (virales, bacterianas o por protozoos). Estas enfermedades infecciosas, preferiblemente enfermedades infecciosas virales, bacterianas o por protozoos, se seleccionan normalmente entre enfermedades infecciosas virales tales como gripe, preferiblemente gripe A, gripe B, gripe C o thogotovirus, de forma especialmente preferible gripe A incluyendo por ejemplo los subtipos de hemaglutinina H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14 o H15, y/o los subtipos de neuraminidasa N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9, o preferiblemente los subtipos de la gripe A H1N1, H1N2, H2N2, H2N3, H3N1, H3N2, H3N3, H5N1, H5N2, H7N7 o H9N2, etc., o cualquier otra combinación, malaria, síndrome respiratorio agudo grave (SRAG), fiebre amarilla, SIDA, borreliosis de Lyme, leishmaniasis, ántrax, meningitis, condiloma acuminado, verrugas huecas, dengue, fiebre de los tres días, virus del Ébola, resfriado, meningoencefalitis de verano temprana (FSME), herpes, hepatitis, herpes simplex tipo I, herpes simplex tipo II, herpes zóster, virus herpes humano 8 (HHV-8; herpesvirus de Sarcoma de Kaposi (KSHV)); infección por virus de los papilomas humanos, encefalitis japonesa, enfermedades asociadas a arenavirus (infección por fiebre de Lassa), virus Marburg, sarampión, fiebre aftosa, mononucleosis infecciosa (fiebre glandular de Pfeiffer), paperas, infección por virus Norwalk, viruela, poliomielitis (cojera infantil), pseudocrup, eritema infeccioso (quinta enfermedad), rabia, verrugas, fiebre del Nilo occidental, varicela, citomegalovirus (CMV), ántrax, borreliosis, botulismo, Campylobacter, Chlamydia trachomatis (inflamación de la uretra, conjuntivitis), cólera, difteria, donavanosis, epiglotitis, tifus, gangrena gaseosa, gonorrea, tularemia, Helicobacter pylori, tos ferina, osteomielitis, legionelosis, lepra, listeriosis, neumonía, meningitis, meningitis bacteriana, ántrax, otitis media, Mycoplasma hominis, sepsis neonatal (corioamnionitis), noma, paratifus, peste, síndrome de Reiter, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, Salmonella paratyphus, Salmonella typhus, escarlatina, sífilis, tétanos, gonorrea, fiebre Tsutsugamushi, tuberculosis, tifus, vaginitis (colpitis), chancro blando, y enfermedades infecciosas causadas por parásitos, protozoos u hongos, tales como amebiasis, bilharciosis, enfermedad de Chagas, Echinococcus, tenia de los peces, tenia vulpina, pie de atleta, tenia canina, candidiasis, manchas por hongos de levadura, sarna, leishmaniasis cutánea, lambliasis (giardiasis), piojos, malaria, microscopía, oncocercosis (ceguera de los ríos), enfermedades fúngicas, tenia bovina, esquistosomiasis, tenia porcina, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis (enfermedad del sueño), leishmaniasis visceral, dermatitis del área del pañal o tenia diminuta.
En otra realización preferente, la vacuna de la invención se puede formular como un kit, preferiblemente como un kit de partes. Por consiguiente, la presente descripción también proporciona kits, en particular kits de partes, que comprenden los componentes de la vacuna de la invención solos o en combinación con otros ingredientes tal como se definen más arriba, y opcionalmente instrucciones técnicas con información sobre la administración y la posología de la vacuna de la invención. Los componentes de la vacuna de la invención, solos o en combinación con otros ingredientes tal como se definen más arriba, pueden estar contenidos en el kit en cualquiera de las partes del kit o en partes diferentes del kit, por ejemplo cada uno del o de los ARNm que codifica al menos un antígeno tal como se define más arriba en una parte del kit, y preferiblemente otros componentes mezclados con cada uno del o de los ARNm que codifican al menos un antígeno o por separado en otra parte del kit. Dichos kits, preferiblemente kits de partes, se pueden aplicar, por ejemplo, para cualquiera de los usos o aplicaciones arriba mencionados.
Figuras:
Figura 1A: muestra la evolución del peso del ratón del experimento. Como resultado, un ratón recién nacido vacunado con ARNm que codifica PR8 H1 Hemaglutinina tenía una superviviencia significativamente mejor (todos los ratones sobrevivieron) contra la infección desafío de gripe que con un ARNm control (todos los ratones murieron 5 días después de la vacunación con un ARNm codificador de ovoalbúmina de pollo cuando se vacunaron con el ARN de control el primer día con 8 semanas y murieron aproximadamente 6 días después de la vacunación con una ARNm de control cuando se vacunaron con 8 semanas). Lo más sorprendentente, la tasa de supervivencia era comparable a la de ratones adultos.
Figuras 1B,C: muestran la secuencia de codificación de los ARNm utilizados para la vacunación de ratones recién nacidos y de 8 semanas de edad (véase la Figura 1A) que codifican PR8 H1 HA (hemaglutinina del virus de la gripe A/Puerto Rico/8/1934) (SEQ ID N°: 384) (Figura 1B) u ovoalbúmina de Gallus gallus como control (ARNm de control) (SEQ ID N°: 385) (Figura 1C).
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparación de constructos de ARNm
Para los presentes ejemplos se prepararon secuencias de ADN codificadoras de PR8 H1 HA (hemaglutinina de A/Puerto Rico/8/1934) (SEQ ID NO: 384), y ovoalbúmina de Gallus gallus, respectivamente, como control (ARNm de control) (SEQ ID NO: 385), y se utilizaron para reacciones posteriores de transcripción in vitro.
De acuerdo con una primera preparación, la secuencia de ADN denominada PR8 H1 HA (hemaglutinina de A/Puerto Rico/8/1934) (SEQ iD NO: 384) (véase la Figura 1 C) se preparó modificando la secuencia de ADN codificadora de hemaglutinina de tipo silvestre introduciendo una secuencia optimizada de GC para un mejor uso y estabilización de codones. En la SEQ ID NO: 384 (véase la Figura 1 C) se muestra la secuencia del ARNm correspondiente. La secuencia se introdujo además en un vector pCV19 y se modificó para incluir secuencias estabilizadoras derivadas de alfa-globina-3'-UTR (muag (alfa-globina-3'-UTR mutada)), un tramo de 70 x adenosina en el extremo 3'-terminal (cola de poli-A) y un tramo de 30 x citosina en el extremo 3'-terminal (cola de poli-C). La secuencia del constructo de ADN final se denominó "PR8 H1 HA".
De acuerdo con una segunda preparación, la secuencia de ADN denominada ovoalbúmina de Gallus gallus, respectivamente, como control (ARNm de control) (SEQ ID NO: 385) (véase la Figura 1 D) se preparó modificando la secuencia de ADN codificadora de ovoalbúmina de Gallus gallus de tipo silvestre introduciendo una secuencia optimizada de GC para un mejor uso y estabilización de codones. En la SEQ ID NO: 385 (véase la Figura 1 D) se muestra la secuencia del ARNm correspondiente. La secuencia se introdujo además en un vector pCV19 y se modificó para comprender secuencias estabilizadoras derivadas de alfa-globina-3'-UTR (muag (alfa-globina-3'-UTR mutada)), un tramo de 70 x adenosina en el extremo 3'-terminal (cola de poli-A) y un tramo de 30 x citosina en el extremo 3'-terminal (cola de poli-C). La secuencia del constructo de ADN final se denominó "ovoalbúmina de Gallus gallus".
En otra etapa, los plásmidos de ADN respectivos arriba preparados se transcribieron en ARNm in vitro utilizando T7-polimerasa. A continuación, el ARNm obtenido se purificó utilizando Pure-Messenger® (CureVac, Tübingen, Alemania).
Todos los ARNm obtenidos aquí utilizados se complejaron además con protamina antes de su uso. La complejación de ARN consistía en una mezcla de un 50% de ARNm libre y un 50% de ARNm complejado con protamina en una relación en peso 2:1. En primer lugar, el ARNm se complejó con protamina mediante adición lenta de protamina-solución de lactato de Ringer a ARNm. En cuanto se generaron establemente los complejos, se añadió ARNm libre, la mezcla se agitó brevemente y la concentración final de la vacuna se ajustó con solución de lactato de Ringer.
Ejemplo 2 - Vacunación de ratones recién nacidos o de 8 semanas de edad
En este experimento, ratones recién nacidos o de 8 semanas de edad fueron vacunados dos veces vía intradérmica con 80 pg de ARNm codificador de PR8 H1 HA (hemaglutinina de A/Puerto Rico/8/1934; Figura 1 B) o con ARNm codificador de ovoalbúmina de Gallus gallus como control (ARNm de control; Figura 1 C). La primera inyección se realizó el primer día de vida (24 horas) y con 8 semanas respectivamente. Cinco semanas después de la última vacunación, los ratones fueron retados con una dosis letal 10 veces mayor de virus PR8 (10 LD50). El peso de los ratones se controló a lo largo de 2 semanas y los ratones fueron sacrificados cuando habían perdido más de un 25% de su peso original. Los resultados se muestran en la Figura 1 A. La Figura 1A muestra la evolución del peso de lso ratones en el experimento. Como resultado, los ratones vacunados con ARNm codificador de hemaglutinina PR8 H1 presentaban una supervivencia considerablemente mejor (todos los ratones sobrevivieron) frente a la infección reto con gripe únicamente con el ARNm de control (todos los ratones del control murieron aproximadamente 5 días después de la vacunación con el ARNm de control codificador de ovoalbúmina de pollo, cuando se vacunaron con el control de ARNm en primer día y murieron aproximadamente 6 días después de la vacunación con ARNm de control cuando se vacunaron con 8 semanas). Todos los ratones recién nacidos vacunados sobrevivieron al reto con el antígeno PR8H1 Hemaglutinina, por contraste con el control.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Vacuna que comprende al menos un ARNm que codifica al menos un antígeno para su uso en la profilaxis de una enfermedad infecciosa en un recién nacido y/o niño, con una edad no superior a 2 años, donde
- el tratamiento comprende la vacunación del recién nacido o niño y la provocación de una respuesta inmunitaria en dicho recién nacido o niño;
- el contenido de G/C de la región codificadora del o de los ARNm está incrementada en al menos un 15% en comparación con el contenido de G/C la región codificadora de la secuencia codificadora de tipo silvestre respectiva; y
- la vacuna se formula para comprender:
a) un componente adyuvante que comprende o consiste en al menos un ARNm complejado con protamina en una relación ARNm:protemina de 2:1 (p/p) y
b) al menos un ARNm libre que codifica un antígeno.
2. Vacuna para su uso en la profilaxis de una enfermedad infecciosa de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la provocación de una respuesta inmunitaria en un paciente comprende la provocación de una respuesta inmunitaria de Th1.
3. Vacuna para su uso en la profilaxis de una enfermedad infecciosa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el recién nacido o niño es varón o hembra, un mamífero, un humano y/o tiene una edad no superior a 2 años, no superior a 1,5 años, no superior a 1 año (12 meses), no superior a 9 meses, 6 meses o 3 meses.
4. Vacuna para su uso en la profilaxis de una enfermedad infecciosa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la enfermedad infecciosa se selecciona de entre enfermedades infecciosas virales, enfermedades infecciosas bacterianas o enfermedades infecciosas por protozoos.
5. Vacuna para su uso en la profilaxis de una enfermedad infecciosa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el antígeno se selecciona de entre antígenos de proteína y de péptido, antígenos patógenos, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos de protozoos y antígenos de animales.
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