ES2318063T3 - Polipeptidos derivados de la triptofanil arnt sintetasa utiles para la regulacion de la angiogenesis. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado, soluble en agua, constituido por la secuencia de restos de aminoácidos o una angiogénesis que inhibe su fragmento; presentando dicho polipéptido aislado un tamaño no superior a 45 kilodaltons.

Description

Polipéptidos derivados de la triptofanil ARNt sintetasa útiles para la regulación de la angiogénesis.

Reivindicación de prioridad

La presente solicitud reivindica prioridad para la solicitud provisional de Estados Unidos para la patente nº de serie 60/270.951 presentada el 23 de febrero de 2001.

Derechos gubernamentales

La presente invención fue realizada con la ayuda gubernamental de los Institutos Nacionales de la Salud del Gobierno de los Estados Unidos, beca GM23562; el Gobierno de los Estados Unidos posee determinados derechos en la invención.

Campo de la invención

La invención se refiere a polipéptidos truncados de ARNt sintetasa, a los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, a las células hospedadoras que incluyen dichos ácidos nucleicos o que expresan dichos polipéptidos, a las composiciones y kits que comprenden dichos polipéptidos, así como a la utilización de dichos polipéptidos para la preparación de composiciones farmacéuticas.

Antecedentes de la invención

Las aminoacil-ARNt sintetasas, que catalizan la aminoacilación de moléculas de ARNt, son proteínas antiguas que son esenciales para descodificar la información genética durante el proceso de traducción. En los eucariotas superiores, nueve aminoacil-ARNt sintetasas se asocian por lo menos con otros tres polipéptidos para formar un complejo polienzimático supramolecular (Mirande et al., Eur. J. Biochem. 147:281-89 (1985)). Cada una de las ARNt sintetasas eucarióticas está constituida por una enzima con núcleo, que está íntimamente relacionada con la contrapartida procariótica de la ARNt sintetasa, y un dominio adicional que está anexo al extremo del terminal amino o del terminal carboxi de la enzima del núcleo (Mirande, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40:95-142 (1991)).

En la mayoría de los casos, los dominios añadidos parece que contribuyen al montaje del complejo polienzimático. Sin embargo, la presencia de un dominio más no se correlaciona estrictamente con la asociación de una sintetasa en el complejo polienzimático.

Las moléculas TrpRS de mamífero tienen un dominio amino-terminal añadido. En las células humanas normales, pueden detectarse dos formas de TrpRS: una forma mayor constituida por la molécula completa (restos de aminoácidos 1-471 de la SEC. ID. nº: 1) y una forma truncada menor ("mini TrpRS"; restos de aminoácidos 1-424 de SEC. ID. nº: 3). La forma menor se genera por eliminación del dominio amino-terminal por corte y empalme alternativo del pre-ARNm (Tolstrup et al., J. Biol. Chem. 270:397-403 (1995)). Se ha determinado que el terminal amino de mino-TrpRS es el resto "met" en la posición 48 de la molécula completa de TrpRS (id.). Alternativamente, la TrpRS truncada puede generarse por proteólisis (Lemaire et al., Eur. J. Biochem. 51:237-52 (1975)). Por ejemplo, la TrpRS bovina se expresa mucho en el páncreas y se segrega en el jugo pancreático (Kisselev, Biochimie 75:1027-39 (1993)), dando como resultado de este modo la producción de una molécula truncada de TrpRS. Estos resultados sugieren que la TrpRS truncada puede tener una función distinta de la aminoacilación del ARNt (id.).

La angiogénesis, o proliferación de nuevos capilares a partir de los vasos sanguíneos preexistentes, es un proceso fundamental necesario para el desarrollo del embrión, el desarrollo posterior y la reparación de tejidos. La angiogénesis es un requisito previo para el desarrollo y la diferenciación del árbol vascular, así como para una amplia variedad de procesos fisiológicos fundamentales incluyendo la embriogénesis, el desarrollo somático, la reparación y regeneración de tejidos y órganos, el desarrollo cíclico del cuerpo lúteo y del endometrio y el desarrollo y diferenciación del sistema nervioso. En el sistema reproductor femenino, la angiogénesis se produce en el folículo durante su desarrollo, en el cuerpo lúteo después de la ovulación y en la placenta para establecer y mantener el embarazo. La angiogénesis además se produce como parte de los procesos de reparación del cuerpo, p. ej., en la cicatrización de heridas y fracturas. La angiogénesis es también un factor en el desarrollo del tumor, ya que un tumor debe estimular continuamente el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos capilares con objeto de desarrollarse. La angiogénesis es una parte esencial del desarrollo del cáncer sólido humano, y la angiogénesis anormal está asociada a otras enfermedades tales como la artritis reumatoide, la psoriasis y la retinopatía diabética (Folkman, J. y Klagbrun, M., Science 235:442-447 (1987)).

Varios factores están implicados en la angiogénesis, p. ej., las moléculas ácidas y básicas del factor de crecimiento de fibroblastos que son ambas mitógenas para las células endoteliales y otros tipos de células. La angiotropina y la angiogenina pueden producir angiogénesis, aunque sus funciones son anucleares (Folkman, J., Cancer Medicine, págs. 153-170, Lea y Febiger Press (1993)). Un mitógeno muy selectivo para las células endoteliales vasculares es el factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 13:19-32 (1992)).

La inmensa mayoría de enfermedades que producen la pérdida catastrófica de la visión actúan como resultado de la neovascularización ocular; la degeneración macular relacionada con la edad (ARMD) afecta a 12 a 15 millones de americanos de más de 65 años de edad y produce pérdida de la vista en el 10 al 15% de ellos como efecto directo de la neovascularización de la coroides (subretiniana). La causa principal de la pérdida de visión por los americanos con menos de 65 años de edad es la diabetes; 16 millones de individuos en los Estados Unidos son diabéticos y 40.000 al año padecen complicaciones oculares de la enfermedad, con frecuencia como resultado de la neovascularización de la retina. Aunque la fotocoagulación con láser ha sido eficaz para prevenir la pérdida grave de la vista en subgrupos de pacientes diabéticos con alto riesgo, la frecuencia global de 10 años de la retinopatía permanece sustancialmente inalterada. Para los pacientes con neovascularización de la coroides debida a la ARMD o a la enfermedad ocular inflamatoria tal como la histoplasmosis ocular, la fotocoagulación, con pocas excepciones, es ineficaz para prevenir la pérdida de la vista. Aunque desarrolladas recientemente, las terapias fotodinámicas no destructivas son prometedoras para reducir temporalmente la pérdida individual en pacientes con neovascularización de la coroides previamente intratable, solamente el 61,4% de los pacientes tratados cada 3 a 4 meses han mejorado o estabilizado la visión en comparación con el 45,9% del grupo tratado con placebo.

En el adulto normal, la angiogénesis está estrechamente regulada, y está limitada a cicatrización de heridas, embarazo y al ciclo uterino. La angiogénesis es producida por moléculas angiógenas específicas tales como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) básico y ácido, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la angiogenina, el factor de crecimiento transformante (TGF), el factor-\alpha de la necrosis tumoral (TNF-\alpha) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). La angiogénesis puede ser suprimida por moléculas inhibidoras tales como el interferón \alpha, la trombospondina-1, la angiostatina y la endostatina. Es el equilibrio de estos estimulantes naturales y de los inhibidores el que controla el sistema vascular capilar normalmente en reposo. Cuando este equilibrio está alterado, como en determinados estados patológicos, las células endoteliales capilares son inducidas a proliferar, migrar y por último diferenciarse.

La angiogénesis desempeña una función central en varias enfermedades incluyendo el cáncer y la neovascularización ocular. Se ha demostrado también que el desarrollo mantenido y la metástasis de varios tumores depende del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos del hospedador en el tumor en respuesta a factores angiógenos derivados del tumor. La proliferación de nuevos vasos sanguíneos en respuesta a varios estímulos se produce como el descubrimiento dominante en la mayoría de las enfermedades oculares incluyendo la retinopatía diabética proliferante (PDR), ARMD, glaucoma rubeótico, queratitis intersticial y retinopatía prematura. En estas enfermedades, el daño del tejido puede estimular la liberación de factores angiógenos dando como resultado la proliferación celular. VEGF desempeña una función dominante en la neovascularización del iris y en las retinopatías neovasculares. Aunque los informes demuestran claramente una correlación entre las concentraciones intraoculares de VEGF y la neovascularización ocular retinopática isquémica, FGF probablemente desempeña una función. Las FGF básica y ácida se conoce que están presentes en la retina normal del adulto, aun cuando cantidades detectables no se correlacionan constantemente con la neovascularización. Esto puede ser en gran medida debido al factor de que FGF se une muy estrechamente a los componentes cargados de la matriz extracelular y no puede estar disponible fácilmente en una forma libremente difundible que se detectaría por análisis convencionales de los fluidos intraoculares.

Una vía final frecuente en la respuesta angiógena implica intercambio de información mediada por integrina entre una célula endotelial vascular proliferante y la matriz extracelular. Esta clase de receptores de adhesión, denominados integrinas, se expresan como heterodímeros con una subunidad \alpha y \beta en todas las células. Dicha integrina, \alpha_{v}\beta_{3}, es el miembro más promiscuo de esta familia y permite que las células endoteliales interactúen con una amplia variedad de componentes de la matriz extracelular. Los antagonistas del péptido y del anticuerpo de esta integrina inhiben la angiogénesis mediante apoptosis inducida selectivamente de las células endoteliales vasculares proliferantes. Existen dos vías de angiogénesis dependientes de la citocina y pueden definirse por su dependencia de distintas integrinas de las células vasculares, \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}. Específicamente, la angiogénesis provocada por FGF básica y VEGF depende de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}, respectivamente, ya que los antagonistas del anticuerpo de cada integrina bloquean selectivamente una de estas vías angiógenas en los modelos de membrana de la córnea del conejo y corioalantoica del pollo (CAM). Los antagonistas peptídicos que bloquean todas las integrinas \alpha_{v} inhiben la angiogénesis estimulada por FGF y VEGF. Aunque los vasos sanguíneos oculares humanos normales no presentan ninguna de las dos integrinas, las integrinas \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} se presentan selectivamente en los vasos sanguíneos en los tejidos de pacientes con enfermedad ocular neovascular activa. Aunque solamente se observó \alpha_{v}\beta_{3} constantemente en el tejido de pacientes con ARMD, \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} estaban ambas presentes en el tejido de pacientes con PDR. Los antagonistas peptídicos de integrinas administrados sistemáticamente bloquearon la formación de nuevos vasos sanguíneos en un modelo de vasculogénesis de la retina de ratón.

Por consiguiente, los agentes antiangiógenos desempeñan una función en el tratamiento de la degeneración de la retina para impedir efectos dañinos de estos factores tróficos y de crecimiento. Los agentes angiógenos también desempeñan una función en la activación de la vascularización deseable al retardar la degeneración de la retina aumentando el flujo sanguíneo a las células.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado, soluble en agua que está constituido por la secuencia de restos de aminoácidos de SEC. ID. nº: 12 o un fragmento inhibidor de angiogénesis de la misma, teniendo dicho polipéptido aislado un tamaño no superior a 45 kilodaltons.

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En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que presenta la secuencia del resto de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 7.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que codifica un polipéptido aislado y soluble en agua de cualquiera de los aspectos primero y segundo de la presente invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende el polinucleótido aislado del tercer aspecto de la presente invención.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedadora recombinante que incluye el vector del cuarto aspecto de la presente invención o que expresa al polipéptido del primer aspecto de la presente invención.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un polipéptido soluble en agua constituido por la secuencia del resto de aminoácido de SEC. ID. nº: 12 o un fragmento inhibidor de la neovascularización ocular de la misma para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir la neovascularización ocular en un paciente que comprende administrar dicha composición farmacéutica a dicho paciente en una cantidad que inhiba la neovascularización ocular.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una composición angiostática inyectable que comprende un polipéptido constituido por la secuencia del resto de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 12 o un fragmento inhibidor de angiogénesis de la misma, y un excipiente acuoso farmacológicamente aceptable, conteniendo la composición el polipéptido en una concentración de por lo menos 0,1 miligramos por mililitro del excipiente acuoso.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un kit para inhibir la neovascularización ocular que comprende una cantidad de un polipéptido del primer aspecto de la presente invención suficiente para por lo menos una administración de una sola dosis, envasada en un recipiente adecuado, por lo menos una aguja de jeringuilla con autosellado que presenta un calibre inferior a 33, adecuado para la inyección intravítrea, y por lo menos una jeringuilla calibrada con precisión.

Las formas de realización preferidas de los aspectos de la presente invención están publicadas en las reivindicaciones 2 a 6, 12 a 23, 25 y 27.

Los polipéptidos derivados de triptofanil-ARNt sintetasa, más cortos que los naturales, tienen actividad de quimiocina y son útiles para investigación, diagnóstico, pronóstico y aplicaciones terapéuticas. En una forma de realización, estos polipéptidos derivados de ARNt sintetasa son útiles para regular la función de las células endoteliales vasculares, y en particular, para inhibir la angiogénesis, especialmente la neovascularización ocular.

Estos polipéptidos derivados de triptofanil-ARNt truncado sintetasa tienen un truncamiento en el terminal amino, pero pueden incluir un dominio de unión al nucleótido con pliegue de Rossmann. Estos polipéptidos son capaces de regular la función de la célula endotelial vascular.

La composición y las formas farmacéuticas que incluyen polipéptidos derivados de triptofanil-ARNt truncado sintetasa junto con un excipiente farmacéuticamente adecuado, son adecuadas para administración intraocular, p. ej., intravítrea, subretiniana o similares, así como para la administración generalizada, p. ej., administración transdérmica, a través de las mucosas, entérica o parenteral.

Una cantidad de polipéptido inhibidora de angiogénesis junto con un excipiente o vehículo apropiado, fisiológicamente compatible es útil en el tratamiento de las enfermedades oculares neovasculares tales como la degeneración macular relacionada con la edad, las complicaciones oculares de la diabetes, el glaucoma rubeótico, la retinopatía prematura, la queratitis, la retinopatía isquémica (p. ej., células depranocíticas), la miopía patológica, la histoplasmosis ocular, la pterygia, la coroidopatía interna punitiva y similares.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos,

La Figura 1 presenta la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido triptofanil-ARNt sintetasa (SEC. ID. nº: 1) con secuencias de identificación incluidas (SEC. ID. nº: 10 y SEC. ID. nº: 11) presentadas en un recuadro, comprendidas también en la forma truncada (secuencias de restos de aminoácidos 94-471 de la SEC. ID. nº: 1);

la Figura 2 es una fotomicrografía que ilustra el desarrollo vascular retiniano en un modelo de ratón;

la Figura 3 es una representación gráfica de los datos indicados en el Ejemplo 3, más adelante;

la Figura 4 es una representación gráfica de los datos indicados en el Ejemplo 4, más adelante; y

la Figura 5 es una fotomicrografía que ilustra la localización del enlace de un fragmento de TrpRS (T2) en la retina en un modelo de ratón.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas Definiciones

"Polipéptidos truncados de ARNt sintetasa" significa polipéptidos que son más cortos que la correspondiente ARNt sintetasa completa.

"TrpRS" significa triptofanil-ARNt sintetasa.

"Cultivo celular" comprende tanto el medio de cultivo como las células cultivadas.

La frase "aislamiento de un polipéptido del cultivo celular" comprende el aislamiento de un polipéptido soluble o segregado del medio de cultivo así como el aislamiento de una proteína de la membrana íntegra de las células cultivadas.

"Extracto celular" incluye el medio de cultivo, especialmente el medio de cultivo agotado del que se han extraído las células. Un extracto celular que conpresenta el ADN o proteína de interés debe entenderse que significa una preparación de homogeneizado o una preparación exenta de células obtenida a partir de las células que expresan la proteína o que contienen el ADN de interés.

"Plásmido" es una molécula de ADN autónomo, extracromosómico autorreplicante y se designa mediante una letra "p" minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida en la presente memoria están disponibles en el mercado, disponibles para el público en base no limitada, o pueden ser considerados plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Además, plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la técnica y son evidentes para cualquier especialista experto.

"Digestión" de ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en determinadas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción utilizadas en la presente memoria están disponibles en el mercado y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se utilizaron como conocería cualquier especialista experto. Con fines analíticos, se utiliza por lo general 1 \mug de plásmido o de fragmento de ADN aproximadamente con 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución de tampón. Con objeto de aislar fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, por lo general se digieren 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones apropiados y las cantidades de sustrato para las enzimas de restricción específicas están especificados por el fabricante. Se utilizan habitualmente tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden oscilar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Tras la digestión la reacción se electroforiza directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado. Los nucleótidos presentes en varios fragmentos de ADN y ARN se designan en la presente memoria mediante las denominaciones habituales de una sola letra (A, T, C, G y U) utilizadas en la materia.

"Polinucleótido" que expresa la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, ADN que incluye el ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena de codificación o la cadena sin codificación (complementaria). La secuencia de codificación que codifica al polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia de codificación mostrada en SEC. ID. nº: 6 o puede ser una secuencia de codificación diferente cuya secuencia de codificación, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica la misma secuencia polipeptídica madura mostrada en la SEC. ID. nº: 7.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" comprende un polinucleótido que incluye solamente la secuencia de codificación para el polipéptido así como un polinucleótido que incluye la codificación adicional y/o la secuencia no codificadora.

"Oligonucleótidos" se refiere a un polinucleótido monocatenario o a dos cadenas de polinucleótido complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Dichos oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato en 5' y por lo tanto no se ligarán a otro oligonucleótido sin añadir un fósforo con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no ha sido desfosforilado.

"Resto de aminoácidos" se refiere a un aminoácido que es una parte de un polipéptido. Los restos de aminoácido descritos en la presente memoria están preferentemente en la forma isomérica "L". Sin embargo, los restos en la forma isomérica "D" pueden sustituirse por cualquier resto de L-aminoácido, siempre que la propiedad funcional deseada sea conservada por el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el terminal amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el terminal carboxilo de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos habitual descrita en J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) y adoptada en 37 C.F.R. \NAK \NAK 1.821 - 1.822 las abreviaturas para los restos de aminoácidos se presentan en la Tabla siguiente:

TABLA 1 Tabla de correspondencia

1

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Todas las secuencias de restos de aminoácidos representadas en la presente memoria por fórmulas presentan una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del terminal amino al terminal carboxilo. Además, la frase "resto de aminoácido" está ampliamente definida para incluir los aminoácidos listados en la Tabla 1 así como los aminoácidos modificados y no habituales, tales como los referidos en 37 C.F.R. \NAK \NAK 1.821 - 1.822, e incorporados en la presente memoria como referencia. Un guión al comienzo o final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos o a un grupo con terminal amino tal como NH_{2} o a un grupo con terminal carboxilo tal como COOH.

En un péptido o proteína, las sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos son conocidas por los expertos en esta materia y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en zonas no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, p. ej., Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4ª edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224).

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Dichas sustituciones se realizan preferentemente de acuerdo con las publicadas en la Tabla 2 siguiente:

TABLA 2

2

Se pueden permitir también otras sustituciones y pueden determinarse experimentalmente o de acuerdo con las sustituciones conservadoras conocidas.

"Plásmido complementario" describe vectores de plásmido que liberan ácidos nucleicos en una estirpe celular encapsulada para la integración estable en el interior de un cromosoma en el genoma celular.

"Plásmido de abastecimiento" es un vector plásmido que lleva o abastece ácidos nucleicos que codifican un gen terapéutico o un gen que codifica un producto terapéutico o un precursor del mismo o un gen regulador u otro factor que produce un efecto terapéutico cuando se administra in vivo en o en el interior de una estirpe celular, tal como, pero sin limitarse a una estirpe celular encapsulada, para propagar vectores víricos terapéuticos.

En la presente memoria se describe una variedad de vectores. Por ejemplo, se utiliza un vector para administrar moléculas de ácido nucleico específicas en una estirpe celular encapsulada para la integración estable en un cromosoma. Estos tipos de vectores están identificados generalmente en la presente memoria como plásmidos complementarios. Un tipo más de vector descrito en la presente memoria lleva o suministra moléculas de ácido nucleico en o dentro de una estirpe celular (p. ej. estirpe celular encapsulada) con el fin de propagar vectores víricos terapéuticos; por consiguiente, estos vectores se denominan generalmente en la presente memoria plásmidos de liberación. Un tercer "tipo" de vector descrito en la presente memoria se utiliza para transportar moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas o polipéptidos terapéuticos o proteínas reguladoras o son secuencias reguladoras para células específicas o tipos de células en un paciente necesitado de tratamiento; estos vectores son generalmente identificados en la presente memoria como vectores víricos terapéuticos o vectores adenovíricos recombinantes o vectores derivados de Ad y están en forma de una partícula de virus que encapsula un ácido nucleico vírico que conpresenta una casete de expresión para expresar el gen terapéutico.

"ADN o ácido nucleico homólogo" se refiere a un ácido nucleico que incluye una secuencia nucleotídica conservada preseleccionada, tal como una secuencia que codifica un polipéptido terapéutico. La expresión "sustancialmente homólogo" significa que presenta por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, aún más preferentemente por lo menos 95% de homología con ésta o un porcentaje menor de homología o identidad y de actividad o función biológica conservada.

Los términos "homología" e "identidad" se utilizan con frecuencia indistintamente. A este respecto, el grado de homología o identidad puede determinarse, por ejemplo, combinando la información de la secuencia utilizando un programa informático GAP. El programa GAP utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), estudiado por Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en las secuencias más cortas de las dos. Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que conpresenta un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gibskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986), tal como describe Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos finales. Si alguna de las dos moléculas de ácido nucleico tienen secuencias nucleotídicas que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas" pueden determinarse utilizando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa "FASTA", que utiliza, por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988). Alternativamente puede utilizar la función BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information para determinar la identidad. En general, las secuencias se alinean de modo que se obpresenta igualdad de orden superior. "Identidad" por sí misma presenta un significado reconocido en la materia y puede calcularse utilizando las técnicas publicadas. (Véase, p. ej.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, D.W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, Nueva York, (1993); Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Humana Press, Nueva Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987); y Gribskov, M. y Devereux, J., eds., Sequence Analysis Primer, M. Stockton Press, Nueva York, (1991)). Aunque existen numerosos procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los especialistas expertos (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988)). Los métodos empleados habitualmente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, los dados a conocer en Martin J. Bishop, ed., Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994), y Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos. Los procedimientos preferidos del programa informático para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al, paquete del programa GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)).

El término "identidad" representa una comparación entre una prueba y un polipéptido o polinucleótido de referencia. Por ejemplo, un polipéptido de prueba puede definirse como cualquier polipéptido que sea 90% o más idéntico a un polipéptido de referencia. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término por lo menos "90% idéntico a" se refiere a identidades por ciento desde 90 hasta 99,99 con respecto a los polipéptidos de referencia. La identidad a un nivel del 90% o más es indicativa del hecho de que, suponiendo a título de ejemplo se comparan una longitud de 100 aminoácidos del polinucleótido de prueba y de referencia. No más del 10% (es decir, 10 de cada 100) aminoácidos en el polipéptido de prueba se diferencian del de los polipéptidos de referencia. Pueden hacerse comparaciones similares entre unos polipéptidos de prueba y de referencia. Dichas diferencias pueden estar representadas como mutaciones puntuales distribuidas al azar sobre toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o pueden estar contenidas en una o más posiciones de longitud variable hasta el máximo permisible, p. ej., diferencia de aminoácidos 10/100 (aproximadamente 90% de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones o eliminaciones de ácido nucleico o aminoácido.

Las expresiones "terapia génica" y "terapia genética" se refieren a la transferencia del ADN heterólogo para determinadas células, células diana, de un mamífero, particularmente de un ser humano, con un trastorno o enfermedades para las que se busca la terapia. El ADN se introduce en las células diana seleccionadas de tal manera que se expresa el ADN heterólogo y se produce un producto terapéutico codificado por éste. Alternativamente, el ADN heterólogo puede mediar de alguna manera la expresión del ADN que codifica el producto terapéutico, puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN que de alguna manera media, directa o indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. La terapia genética puede utilizarse también para reemplazar un gen defectuoso o complementar un producto génico producido por el mamífero o la célula en la que se introduce. El ácido nucleico introducido puede codificar un compuesto terapéutico, tal como un factor de crecimiento o un inhibidor del mismo, o un factor de la necrosis tumoral o un inhibidor de la misma, tal como un receptor para éste, que normalmente no se produce en el mamífero hospedador o que no se produce en cantidades terapéuticamente eficaces o en un periodo terapéuticamente útil. El ADN heterólogo que codifica el producto terapéutico puede modificarse antes de la introducción en las células del hospedador afectado con objeto de potenciar o si no alterar el producto o la expresión del mismo.

"ADN heterólogo" es el ADN que codifica el ARN y las proteínas que no son producidas normalmente in vivo por la célula en la que se expresa o que media o codifica mediadores que alternan la expresión del ADN endógeno afectando la transcripción, traducción u otros procedimientos bioquímicos regulables. El ADN heterólogo puede denominarse también ADN extraño. Cualquier ADN que un experto en la materia reconozca o considere como heterólogo o extraño a la célula en la que se expresa está comprendido en la misma por el ADN heterólogo. Ejemplos de ADN heterólogos incluyen, pero no se limitan al ADN que codifica proteínas marcadoras traceables, tales como una proteína que proporciona resistencia al fármaco, el ADN que codifica sustancias terapéuticamente eficaces, tales como los agentes anticancerígenos, enzimas y hormonas y el ADN que codifica otros tipos de proteínas, tales como los anticuerpos. Los anticuerpos que son codificados por el ADN heterólogo pueden segregarse o expresarse en la superficie de la célula en la que el ADN heterólogo se ha introducido. Por consiguiente, "ADN heterólogo" o "ADN extraño", se refiere a una molécula de ADN que no está presente en la orientación y posición exactas como molécula de ADN de contrapartida encontrada en el adenovirus natural correspondiente. Puede referirse también a una molécula de ADN de otro organismo o especie (es decir, exógeno) o de otro serotipo Ad.

"Producto de ADN terapéuticamente eficaz" es un producto que está codificado por el ADN heterólogo de modo que, durante la introducción del ADN en un hospedador, se expresa un producto que mejora eficazmente o elimina los síntomas, las manifestaciones de una enfermedad hereditaria o adquirida o que cura dicha enfermedad. Por lo general, el ADN que codifica el ADN heterólogo deseado se clona en un vector plásmido y se introduce por procedimientos rutinarios, tales como la absorción o microinyección el ADN mediada por fosfato cálcico, en células productoras, tales como las células encapsuladas. Tras la ampliación en las células productoras, los vectores que contienen el ADN heterólogo se introducen en las células diana seleccionadas.

"Vector de expresión o distribución" se refiere a cualquier plásmido o virus en el que puede insertarse un ADN extraño o heterólogo para su expresión en una célula hospedadora adecuada, es decir, la proteína o polipéptido codificado por el ADN se sintetiza en el sistema de la célula hospedadora. Los vectores capaces de dirigir la expresión de segmentos de ADN (genes) que codifican una o más proteínas se denominan en la presente memoria "vectores de expresión". Asimismo están incluidos los vectores que permiten la clonación del ADNc (ADN complementario) procedente de los ARNm producidos utilizando la transcriptasa inversa.

"Gen" es una molécula de ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica codifica el ARN o polipéptido. Un gen puede ser ARN o ADN. Los genes pueden incluir zonas que preceden y que siguen a la zona de codificación (anterior y posterior) así como las secuencias de intervención (intrones) entre segmentos individuales de codificación (exones).

"Aislada" con relación a una molécula de ácido nucleico, polipéptido u otra biomolécula, significa que el ácido nucleico o polipéptido se ha separado del entorno genético del cual se obtuvieron el polipéptido o el ácido nucleico. Puede también significar el estado alterado a partir del natural. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural en un animal vivo no está "aislado", pero tal como se emplea el término en la presente memoria, el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Por lo tanto, un polipéptido o polinucleótido producido y/o contenido dentro de la célula hospedadora recombinante se considera aislado. Asimismo "polipéptido aislado" o un "polinucleótido aislado" quiere decir polipéptidos o polinucleótidos que han sido purificados, parcial o sustancialmente, a partir de una célula hospedadora recombinante o de una fuente natural. Por ejemplo, una versión de un compuesto producida por recombinación genética puede estar sustancialmente purificada por el procedimiento de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Los términos "aislado" y "purificado" se utilizan a veces indistintamente. Dicho polipéptido podría formar parte de un vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría formar parte de una composición, y todavía estaría aislado porque dicho vector o composición no forma parte de su entorno natural.

"Polinucleótido aislado" significa que el ácido nucleico carece de las secuencias de codificación de estos genes que, en el genoma natural del organismo (si existe) flanquean inmediatamente el gen que codifica el ácido nucleico de interés. El ADN aislado puede ser monocatenario o bicatenario, y puede ser ADN genómico, ADNc, ADN híbrido recombinante o ADN sintético. Puede ser idéntico a una secuencia de ADN natural o puede diferenciarse de dicha secuencia por eliminación, adición o sustitución de uno o más nucleótidos.

"Aislada" o "purificada" en cuanto se refiere a las preparaciones a partir de células u hospedadores biológicos significa cualquier extracto celular que conpresenta el ADN o la proteína indicados incluyendo un extracto en bruto del ADN o proteína de interés. Por ejemplo, en el caso de una proteína, puede obtenerse una preparación purificada siguiendo una técnica individual o una serie de técnicas de preparación o bioquímicas y el ADN o proteína de interés pueden estar presentes en varios grados de pureza en estas preparaciones. Los procedimientos pueden incluir por ejemplo, pero no se limitan a, fraccionamiento del sulfato amónico, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad, centrifugación por gradiente de densidad y electroforesis.

Una preparación de ADN o proteína que está "sustancialmente pura" o "aislada" significa una preparación exenta de materiales naturales con la que dicho ADN o proteína está asociado normalmente en la naturaleza. "Esencialmente pura" debería entenderse que significa una preparación "muy" purificada que conpresenta por lo menos el 95% del ADN o de la proteína de interés.

"Estirpe celular de encapsulación" es una estirpe celular que proporciona un producto génico desaparecido o su equivalente.

"Partícula vírica de adenovirus" es la estructura mínima o la unidad funcional de un virus. Un virus puede referirse a una sola partícula, a una solución madre de partículas o a un genoma vírico. La partícula de adenovirus (Ad) es relativamente compleja y puede resolverse en varias subestructuras.

"Elemento regulador de la postranscripción (PRE)" es un elemento regulador encontrado en el ARN mensajero celular que no está cortado ni empalmado, es decir, mensajes sin intrón. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan al virus de la hepatitis humana, al virus de la hepatitis de la marmota americana, al gen TK ni al gen de la histona de ratón. El PRE puede colocarse antes de una secuencia poliA y después de una secuencia de ADN heterólogo.

"Pseudotipado" describe la producción de vectores adenovíricos que tienen la proteína de la cápside modificada o las proteínas de la cápside de un serotipo diferente al del serotipo del propio vector. Un ejemplo, es la producción de una partícula del vector 5 de adenovirus que conpresenta una proteína de la fibra Ad37. Esto puede realizarse produciendo el vector adenovírico en estirpes celulares de encapsulación que expresan diferentes proteínas de la
fibra.

Los "activadores de interés en la presente memoria" pueden ser inducibles o constitutivos. Los activadores inducibles iniciarán la transcripción solamente en presencia de una molécula adicional; los activadores constitutivos no requieren la presencia de ninguna molécula adicional para regular la expresión génica. Un activador regulable o inducible puede describirse también como activador cuando la cantidad o extensión de la unión e iniciación de la ARN polimerasa está modulada por estímulos externos. Dichos estímulos incluyen, pero no se limitan a varios compuestos o composiciones, fuentes de energía luminosa, térmica, de tensión y química. Los activadores inducibles, suprimibles y reprimibles se consideran activadores regulables. Los activadores preferidos en la presente memoria son activadores que se expresan selectivamente en las células oculares, particularmente en las células fotorreceptoras.

"Receptora" se refiere a una molécula biológicamente activa que se une específicamente a (o con) otras moléculas. La expresión "proteína receptora" puede utilizarse para indicar más específicamente la naturaleza proteínica de un receptor específico.

"Recombinante" se refiere a toda descendencia formada como resultado de la ingeniería genética. Éste puede utilizarse también para describir un virus formado por recombinación de plásmidos en una célula encapsulada.

"Transgén" o "molécula terapéutica de ácido nucleico" incluye las moléculas de ADN y ARN que codifican un ARN o polipéptido. Dichas moléculas pueden ser secuencias "naturales" o derivadas de las naturales; pueden ser también "artificiales" o "extrañas" que derivan de las naturales o por recombinación. El término "transgén", que puede utilizarse indistintamente en la presente memoria con la expresión "molécula terapéutica de ácido nucleico", se utiliza con frecuencia para describir un gen heterólogo o extraño (exógeno) que es transportado por un vector vírico y transducido en una célula hospedadora. Las moléculas terapéuticas de ácido nucleico incluyen secuencias complementarias o secuencias nucleotídicas que pueden transcribirse en secuencias complementarias. Todas las secuencias nucleotídicas terapéuticas (o transgenes) incluyen moléculas de ácido nucleico que funcionan para producir un efecto deseado en la célula o en el núcleo celular en el que se administran dichas secuencias terapéuticas. Por ejemplo, una molécula terapéutica de ácido nucleico puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína funcional deseada para la administración en una célula que es inque puede producir esta proteína funcional.

"Vítreo del ojo" se refiere a un material que rellena la cámara posterior del cristalino del ojo (es decir, humor vítreo o cuerpo vítreo).

"Zona activadora" se refiere a la parte del ADN de un gen que controla la transcripción del ADN al que está unido operativamente. La zona activadora incluye secuencias específicas de ADN que son suficientes para el reconocimiento, unión e iniciación de la transcripción de la ARN polimerasa. Esta parte de la zona activadora se denomina activador. Además, la zona activadora incluye secuencias que modulan esta actividad de reconocimiento, unión e iniciación de la transcripción de la ARN polimerasa. Estas secuencias pueden ser factores de actuación cis o pueden ser sensibles a factores de actuación trans. Los activadores, que dependen de la naturaleza de la regulación pueden ser constitutivos o regulados.

"Operativamente unida" significa que las secuencias o segmentos se han unido por enlace covalente en una pieza de ADN, ya sea en forma mono o bicatenaria, por lo que controlan las secuencias en una expresión o replicación de control del segmento u otro control de otros segmentos. Sin embargo los dos segmentos no están necesariamente contiguos.

"Encapsulado" se refiere a una matriz sólida o material tales como vidrio, plástico (p. ej., polietileno, polipropileno o policarbonato), papel, hoja de aluminio y similares capaces de mantener dentro de límites fijados a un polipéptido, anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal descrito en la presente memoria. De este modo, por ejemplo, un envase puede ser un vial de vidrio utilizado para contener cantidades en miligramos de un polipéptido contemplado o puede ser un pocillo de una placa de microvaloración a la que se han fijado (es decir, unido) de manera operativa cantidades de un polipéptido o anticuerpo para que sea que puede estar inmunológicamente unida por un anticuerpo o antígeno, respectivamente.

"Instrucciones para su utilización" incluyen típicamente una expresión tangible que describe la concentración de reactivo o por lo menos un parámetro del procedimiento de análisis, tal como las cantidades relativas de reactivo y de muestra que deben mezclarse, los periodos de mantenimiento para las mezclas reactivo/muestra, temperatura, condiciones del tampón y similares.

"Sistema de diagnóstico" en el contexto de la presente invención incluye también un marcador o medios indicadores capaces de señalizar la formación de un inmunocomplejo que conpresenta un polipéptido o una molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria.

"Complejo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al producto de una reacción de unión específica tal como una reacción anticuerpo-antígeno o receptor-ligando. Los complejos a título de ejemplo son productos de inmunorreacción.

"Marcador" y "medios indicadores" en sus diversas formas gramaticales se refieren a átomos y moléculas individuales que están implicados directa o indirectamente en la producción de una señal detectable para indicar la presencia de un complejo. Cualquier marcador o medios indicadores pueden estar unidos a una proteína, polipéptido o molécula de anticuerpo expresados o incorporados a los mismos, que forma parte de un anticuerpo o de una composición de anticuerpo monoclonal descrita en la presente memoria o utilizados por separado, y los átomos o moléculas pueden utilizarse solos o conjuntamente con reactivos adicionales. Dichos marcadores son bien conocidos en la química de diagnóstico clínico y constituyen una parte de la presente invención únicamente siempre que se utilicen sino con las utilizaciones y/o sistemas de nuevas proteínas.

Exposición

El polipéptido mostrado en la Figura 1 como restos de aminoácidos 94-471 de la SEC. ID. nº: 1 (p. ej., SEC. ID. nº: 12), así como los que presentan la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 7, o el polipéptido codificado por el ADNc de la SEC. ID. nº: 6, constituyen partes de la presente invención. La presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido mostrado en la SEC. ID. nº: 7, SEC. ID. nº: 12 y el polipéptido codificado por el ADNc de la SEC. ID. nº: 6 así como variantes de dichos polinucleótidos cuyas variantes codifican un fragmento inhibidor de angiogénesis de los polipéptidos de la SEC. ID. nº: 7 y la SEC. ID. nº: 12.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término T1 se refiere tanto al polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 13 como al polipéptido activado por His_{6} que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 5. El término T2, tal como se emplea en la presente invención, se refiere tanto al polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 12 como al polipéptido activado por His_{6} que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 7. El término TrpRS, tal como se emplea en la presente invención, se refiere tanto al polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de los restos 1-471 de la SEC. ID. nº: 1 como al polipéptido activado por His_{6} que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 1.

En los polinucleótidos, la secuencia de codificación para el polipéptido maduro puede fusionarse en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido de una célula hospedadora, por ejemplo, una secuencia principal que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que presenta una secuencia principal es una preproteína y puede tener la secuencia principal separada por la célula hospedadora para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden también codificar una preproteína que es la proteína madura más los restos adicionales de aminoácidos en 5'. Una proteína madura que presenta una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez se escinde la prosecuencia queda una proteína madura activa.

De este modo, por ejemplo, el polinucleótido puede codificar una proteína madura, o una proteína que presenta una prosecuencia o una proteína que presenta tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia principal).

Los polinucleótidos pueden tener también la secuencia de codificación fusionada en el marco a una secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexa-histidina aportada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedador bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando se utiliza un hospedador de mamífero, p. ej. células COS-7. La etiqueta HA corresponde a un epítopo procedente de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)).

Cuando se refiere al polipéptido de la SEC. ID. nº: 7, a la SEC. ID. nº: 12 o a un polipéptido codificado por el polinucleótido de la SEC. ID. nº: 6, el término "fragmento", significa una porción de polipéptido que conserva sustancialmente la misma función angioestática (es decir, que inhibe la angiogénesis) o a la actividad como tal polipéptido.

El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferentemente un polipéptido recombinante.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan en forma aislada, y preferentemente se purifican hasta la homogeneidad.

La presente invención incluye también vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, y células de hospedador que están modificadas genéticamente con los vectores de la invención.

Las células hospedadoras se modifican genéticamente (se transducen, transforman o transfectan) con los vectores de la presente invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, de partícula vírica, de fago, etc. Las células hospedadoras modificadas genéticamente pueden cultivarse en un medio nutritivo convencional modificado apropiado para los activadores del funcionamiento, seleccionando transformables o ampliando los genes polipeptídicos de la ARNt sintetasa. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas anteriormente con la célula hospedadora seleccionadas para la expresión y son evidentes para cualquier especialista experto.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden utilizarse para producir los correspondientes polipéptidos mediante técnicas recombinantes. De este modo, por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos puede estar incluida en cualquiera de entre una variedad de vehículos de expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, p. ej., derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago; plásmidos de levadura, vectores procedentes de combinaciones de plásmido y de ADN de fago, ADN vírico tal como vacunas, adenovirus, virus de peste aviar y pseudorrabia. Un vector citado es el pET20b. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.

Tal como se describió anteriormente, la secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en unas secuencias apropiadas de endonucleasa de restricción por los procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que dichos procedimientos y otros están incluidos dentro del alcance de los expertos en la materia.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está operativamente unida a una(s) secuencia(s) de control de expresión apropiada(s) (activador) para dirigir la síntesis del ARNm. Ejemplos representativos de dichos activadores incluyen LTR o activador SV40, los activadores lac o trp de E. coli, el activador P_{L} del fago lambda y otros activadores conocidos para controlar la expresión de los genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión conpresenta también una secuencia de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector puede también incluir secuencias apropiadas para ampliar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferentemente un gen para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células hospedadoras transformadas tales como resistencia a la dihidrofolato reductasa o a la neomicina para el cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que conpresenta la secuencia de ADN apropiada como se describió anteriormente en la presente memoria, así como una secuencia activadora o de control apropiada, puede emplearse para transformar un hospedador apropiado que permita al hospedador expresar la proteína. Ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen las células bacterianas, tales como E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces, células micóticas, tales como levadura; células de insecto, tales como Drosophila y Sf9; células de animales tales como CHO, COS o de melanoma de Bowes; células vegetales, etc. La selección de un hospedador apropiado se considera que está dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de lo dado a conocer en la presente memoria.

Más específicamente, la presente invención incluye también montajes recombinantes que comprenden una o más de las secuencias tal como se describió con amplitud anteriormente. Los montajes comprenden un vector, tal como un vector plásmido o vírico, en el que se ha insertado una secuencia de la invención en una orientación transcrita o complementaria. En un aspecto preferido de la presente forma de realización, el montaje comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un activador, operativamente unido a la secuencia. Los expertos en la materia conocen grandes cantidades de vectores y activadores adecuados, y están disponibles en el mercado. A título de ejemplo se proporcionan los vectores siguientes: Bacterianos: pQE70, pQE-9 (Qiagen), PBS, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH46a (Stratagene), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, PRIT5 (Pharmacia). Eucarióticos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, PMSG, pSVL (Pharmacia) y pET20B. En una forma de realización preferida, el vector es el pET20B. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el hospedador.

Pueden seleccionarse zonas activadoras en cualquier gen deseado utilizando vectores de CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los activadores bacterianos denominados específicos incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, PL y trp. Los activadores eucarióticos incluyen CMV precoz inmediato, timidina cinasa de VSH, SV40 precoz y tardío, las LTR de retrovirus y metaltioneína-I de ratón. La selección del vector y activador apropiados está dentro del nivel de cualquier experto en la materia.

En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen el montaje descrito anteriormente. La célula hospedadora puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura o la célula hospedadora puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción del montaje en la célula hospedadora puede efectuarse por transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986)).

Los montajes en las células hospedadoras pueden utilizarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos por síntesis por sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de activadores apropiados. Pueden emplearse también sistemas de traducción exentos de células para producir dichas proteínas utilizando los ARN derivados de los montajes de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su utilización con hospedadores procarióticos y eucarióticos están descritos por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), cuya exposición está incorporada a la presente memoria como referencia.

La transcripción de un ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente desde alrededor de 10 a alrededor de 300 pares de bases (bp), que actúan en un activador para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (100 a 270 bp), un potenciador del activador precoz de citomegalovirus, un potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de la replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, p. ej., el gen con resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un activador derivado de un gen muy expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Dichos activadores pueden proceder de enzimas glucolíticas que codifican operones tales como la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se monta en la fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y preferentemente, una secuencia principal que puede dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido con identificación N-terminal que proporciona las características deseadas, p. ej., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Después de la transformación de una cepa de hospedador adecuada y el crecimiento de la cepa del hospedador hasta una densidad celular apropiada, el activador seleccionado es desreprimido por medios apropiados (p. ej., cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional.

Las células por lo general se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto en bruto resultante se conserva para purificación ulterior.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier procedimiento conveniente, incluyendo el ciclo de congelación-descongelación, tratamiento con ultrasonidos, ruptura mecánica o utilización de agentes de lisado celular.

Pueden emplearse también varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las estirpes COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), y otras estirpes celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las estirpes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un activador y potenciador adecuados y también algunas secuencias de unión del ribosoma necesarias, secuencias de poliadenilación, secuencias donantes y receptoras de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes en C5. Para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos pueden utilizarse las secuencias de ADN derivadas del genoma vírico SV40, por ejemplo, origen de SV40, activador precoz, potenciador, secuencias de corte y empalme y poliadenilación.

Se recuperan los polipéptidos y se purifican de los cultivos celulares recombinantes por los procedimientos utilizados hasta ahora, incluyendo la precipitación con sulfato amónico o etanol, la extracción con ácido, la cromatografía por intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía en fosfocelulosa, la cromatografía por interacción hidrófoba, la cromatografía por afinidad, la cromatografía en hidroxiapatito y la cromatografía en lectinas. Es preferible tener concentraciones bajas (aproximadamente 0,1 a 5 mM) de ión calcio presentes durante la purificación (Price, et al., J. Biol. Chem., 244:917 (1969)). Cuando sea necesario pueden utilizarse las etapas de replegamiento de la proteína, en la terminación de la configuración de la proteína madura. Por último, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) durante las etapas finales de la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto natural purificado, un producto de los procedimientos de síntesis química o ser producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariótico o eucariótico (por ejemplo, mediante células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glucosilados con carbohidratos de mamífero u otros eucarióticos o pueden no estar glucosilados.

Los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse para mejorar la estabilidad y aumentar la potencia por medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, los L-aminoácidos pueden estar sustituidos por D-aminoácidos, el terminal amino puede estar acetilado o el terminal carboxi modificado, p. ej., protegido con etilamina (Dawson, D.W., et al., Mol. Pharmacol., 55:332-338 (1999)).

El polipéptido de la presente invención puede emplearse también como terapia génica según la presente invención mediante la expresión de dicho polipéptido in vivo.

Varios vectores víricos que pueden utilizarse para la terapia génica como se da a conocer en la presente memoria incluyen adenovirus, herpes virus, vacunas, virus adeno-asociados (AAV), o, preferentemente, un virus con ARN tal como un retrovirus. Preferentemente, el vector retrovírico es un derivado de un retrovirus murino o aviar o es un vector lentivírico. El vector retrovírico preferido es un vector lentivírico. Ejemplos de vectores retrovíricos en los que puede insertarse un solo gen extraño incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), el virus del tumor de mama murino (MuMTV), VIS, VIB, VIH y el virus del sarcoma de Rous (RSV). Numerosos vectores retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que las células transducidas pueden ser identificadas y generadas. Insertando una secuencia polipeptídica de interés que se une al ADN derivado del dedo de cinc en el vector vírico, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector se hace específico para la diana. Los vectores retrovíricos pueden hacerse específicos para la diana insertando, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína. La administración dirigida preferida se realiza utilizando un anticuerpo para dirigir el vector retrovírico. Los expertos en la materia conocerán, o pueden determinar fácilmente sin experimentación excesiva, secuencias polinucleotídicas específicas que pueden insertarse en el genoma retrovírico que permitan la administración específica de la diana del vector retrovírico que conpresenta el polinucleótido de la proteína que se une al nucleótido con dedo de cinc.

Dado que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren asistencia con objeto de producir partículas infecciosas de vector. Esta asistencia puede proporcionarse, por ejemplo, utilizando estirpes celulares colaboradoras que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras en la LTR. Estos plásmidos están ausentes en una secuencia nucleotídica que permite al mecanismo de encapsulación reconocer un ARN transcrito para la encapsulación. Las estirpes celulares colaboradoras que presentan eliminaciones de la señal de encapsulación incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, \Psi2, PA317 y PA 12. Estas estirpes celulares producen viriones vacíos, ya que ningún genoma está encapsulado. Si se introduce un vector retrovírico dentro de dichas células en las que la señal de encapsulación está intacta, pero los genes estructurales se sustituyen por otros genes de interés, puede encapsularse el vector y producirse el virión del vector. Los viriones del vector producidos por este procedimiento pueden utilizarse a continuación para infectar una estirpe celular de tejido, tal como las células NIH 3T3, para producir grandes cantidades de viriones retrovíricos híbridos.

Otro sistema de administración dirigido para polinucleótidos que codifican polipéptidos que se unen al ADN derivado del dedo de cinc es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípido incluyendo las emulsiones aceite-en-agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. El sistema coloidal preferido utilizado según la presente invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas artificiales de la membrana que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. Se ha demostrado que las vesículas unilaminares grandes (LUV), cuyo intervalo de tamaño está comprendido entre 0,2 y 4,0 \mum pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que conpresenta grandes macromoléculas. El ARN, el ADN y los viriones intactos pueden encapsularse en el interior acuoso y administrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, (1981)). Además de las células de mamífero, se han utilizado liposomas para la administración de polinucleótidos en células vegetales, de levadura y bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia génica eficaz, deben estar presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes de interés con gran eficacia aunque sin comprometer su actividad biológica; (2) unión preferencial y sustancial a una célula diana en comparación con las células que no son diana; (3) administración de los contenidos acuosos de la vesícula al citoplasma de la célula diana con gran eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, (1988)).

La composición del liposoma es habitualmente una combinación de fosfolípidos, particularmente de fosfolípidos de alta temperatura en la fase de transición, habitualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. Pueden utilizarse también otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza iónica y de la presencia de cationes divalentes.

Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen los compuestos de fosfatidilo, tal como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en los que el resto de lípido conpresenta de 14 a 18 átomos de carbono, particularmente entre 16 y 18 átomos de carbono, y está saturado. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diesteroilfosfatidilcolina.

La administración dirigida de los liposomas se ha clasificado basándose en factores anatómicos y mecánicos. La clasificación anatómica está basada en el nivel de selectividad, por ejemplo, específico para el órgano, específico para la célula y específico para el orgánulo. La administración dirigida mecánica puede distinguirse basándose en si es pasiva o activa. La administración dirigida pasiva utiliza la tendencia natural de los liposomas a distribuirse en las células del sistema retículo-endotelial (RES) en los órganos que contienen capilares sinusoidales. La administración dirigida activa, por otra parte, implica la alteración del liposoma acoplando el liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glucolípido o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma con objeto de conseguir la administración dirigida a los órganos y a los tipos de células distinta de las zonas de localización naturales.

La superficie del sistema de administración dirigida puede modificarse de varias maneras. En el caso de un sistema liposómico de administración dirigida, pueden incorporarse grupos de lípidos dentro de una bicapa de lípido del liposoma con objeto de mantener el ligando de administración dirigida en asociación estable con la bicapa liposómica. Pueden utilizarse varios grupos de enlace para unir las cadenas de lípido al ligando objetivo.

En general, los compuestos unidos a la superficie del sistema de administración dirigida serán ligandos y receptores que permitirán al sistema de administración dirigida encontrar y "residir" en las células deseadas. Un ligando puede ser cualquier compuesto de interés que se una a otro compuesto, tal como un receptor.

En general, las proteínas superficiales de la membrana que se unen a moléculas efectoras específicas se denominan receptores. En la presente invención, los anticuerpos son los receptores preferidos. Pueden utilizarse anticuerpos para dirigir liposomas a los ligandos específicos de la superficie de la célula. Por ejemplo, determinados antígenos expresados específicamente en las células tumorales, denominados antígenos asociados al tumor (TAA) pueden aprovecharse con el fin de dirigir liposomas que contienen la proteína de unión al nucleótido con dedo de cinc del anticuerpo directamente al tumor maligno. Ya que el producto génico de la proteína que se une al nucleótido con dedo de cinc puede indiscriminarse con respecto al tipo de célula en su función, un sistema de administración dirigida ofrece una mejora significativa sobre los liposomas no específicos que se inyectan al azar. Pueden utilizarse numerosos procedimientos para acoplar por enlace covalente anticuerpos policlonales o monoclonales a una bicapa de liposoma. Los liposomas dirigidos al anticuerpo pueden incluir anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de los mismos tales como Fab y F(ab')_{2}, siempre que se unan eficazmente a un epítopo antigénico en las células diana. Los liposomas pueden también estar dirigidos a las células que expresan receptores para hormonas u otros factores del suero.

Para un experto en la materia están disponibles múltiples procedimientos víricos y no víricos adecuados para la introducción de una molécula de ácido nucleico dentro de una célula diana. La manipulación genética de las células del tumor primario es bien conocida en la materia. La modificación genética de una célula puede realizarse utilizando una o más técnicas bien conocidas en el campo de la terapia génica (Mulligan, R.C. Human Gene Therapy, 5(4):543-563 (1993)). Los métodos de transducción vírica pueden comprender la utilización de un virus con ADN o ARN recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que conduce o inhibe la expresión de una proteína que presenta actividad de sialil-transferasa para infectar una célula diana. Un virus con ADN adecuado para su utilización en la presente invención incluye pero no está limitado a un adenovirus (Ad), virus adeno-asociado (AAV), herpes virus, virus de la vacuna o a un virus de la poliomelitis. Un virus con ARN adecuado para su utilización en la presente invención incluye pero no se limita a un retrovirus o a un virus de Sindbis. Los expertos en la materia entienden que existen varios de dichos virus con ADN y ARN que pueden ser adecuados para su utilización en la presente invención.

Los vectores adenovíricos son útiles para la transferencia génica en el interior de las células eucarióticas, para estudiar la expresión génica eucariótica, para el desarrollo de vacunas y en modelos de animales. La terapia génica mediada por Ad se ha utilizado también en seres humanos, tal como para la transferencia del gen regulador de la conductancia de la transmembrana en la fibrosis cística (CFTR) al pulmón. Las vías para administrar Ad recombinante a diferentes tejidos in vivo incluyen, por ejemplo, la instilación intratraqueal, la inyección en el músculo, la inyección intravenosa periférica y la inoculación estereotáctica al cerebro. El vector adenovírico, a continuación, es utilizado ampliamente por un experto en la materia y es adecuado para su utilización en la presente invención.

El virus adenoasociado (AAV) se ha introducido recientemente como un sistema de transferencia genética con aplicaciones potenciales en terapia génica. El AAV natural se ha descrito para demostrar infectividad a alto nivel, amplio intervalo del hospedador y especificidad en la integración en el genoma de la célula hospedadora. El virus simple del herpes de tipo I (VHS-1) es atractivo como sistema vectorial, especialmente para su utilización en el sistema nervioso a causa de su propiedad neurótropa. El virus de vacuna, de la familia poxvirus, se ha desarrollado también como vector de expresión. Un experto en la materia utiliza extensamente cada uno de los vectores descritos anteriormente y serían adecuados para su utilización en la presente invención.

Los vectores retrovíricos son capaces de infectar un gran porcentaje de células diana y de integrarse en el genoma celular. Los retrovirus se desarrollan como vectores de transferencia génica relativamente más pronto que otros virus, y se utilizaron en primer lugar con éxito para el marcado génico y la transducción del ADNc de la adenosina desaminasa (ADA) en linfocitos humanos. Los retrovirus preferidos incluyen lentivirus. En las formas de realización preferidas, el retrovirus se selecciona de entre el grupo constituido por VIH, VIB y VIS.

Las técnicas de administración "no vírica" que se han utilizado o propuesto para la terapia génica incluyen los complejos ADN-ligando, los complejos adenovirus-ligando-ADN, la inyección directa de ADN, la precipitación con CaPO_{4}, las técnicas de la pistola genética, la electroporación, los liposomas y la lipofección. Un experto en la materia utiliza extensamente cualquiera de estos procedimientos y serían adecuados para su utilización en la presente invención. Un experto en la materia dispone de otros procedimientos adecuados, y debe entenderse que la presente invención puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de los procedimientos de transfección disponibles. Los expertos en la materia han utilizado varias de dichas metodologías con éxito variable. La lipofección puede realizarse encapsulando una molécula de ADN aislada en el interior de una partícula liposómica y poniendo en contacto la partícula liposómica con la membrana celular de la célula diana. Los liposomas son partículas coloidales, de automontaje en las que una bicapa del lípido, compuesta por moléculas anfifílicas tales como la fosfatidilserina o la fosfatidilcolina, encapsula una parte del medio circundante de modo que la bicapa de lípido rodea un interior hidrófilo. Los liposomas unilaminares o polilaminares pueden construirse de modo que el interior contenga un producto químico deseado, fármaco, o, como en la presente invención, una molécula de ADN aislada.

Las células pueden transfectarse in vivo, ex vivo o in vitro. Las células pueden transfectarse como células primarias aisladas de un paciente o una estirpe celular procedente de células primarias, y no son necesariamente autólogas para el paciente al que se administran las células finalmente. Después de la transfección ex vivo o in vitro, las células pueden ser implantadas en un hospedador.

Con objeto de obtener la transcripción del ácido nucleico de la presente invención en una célula diana, se utiliza una zona reguladora de la transcripción que puede conducir la expresión génica en la célula diana. La zona reguladora de la transcripción puede comprender un elemento activador, potenciador, silenciador o represor y está funcionalmente asociado con el ácido nucleico de la presente invención. Preferentemente, la zona reguladora de la transcripción conduce la expresión génica de alto nivel en la célula diana. Las zonas reguladoras de la transcripción adecuadas para su utilización en la presente invención incluyen pero no se limitan al potenciador/activador precoz inmediato citomegalovirus (CMV) humano, al potenciador/activador precoz de SV40, al activador de poliomavirus JC, al activador de albúmina, a PGK y al activador de \alpha-actina acoplado al potenciador de CMV.

Los vectores de la presente invención pueden construirse utilizando técnicas recombinantes normalizadas ampliamente disponibles para un experto en la materia. Dichas técnicas pueden encontrarse en las referencias habituales de la biología molecular tal como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), D. Goeddel, ed., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology series, vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1991), e Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA (1990).

La administración de un polipéptido o de un ácido nucleico de la presente invención a una célula diana in vivo puede llevarse a cabo utilizando alguna de las diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.

Los vectores de la presente invención pueden administrarse por vía oral, parenteral, por atomización para inhalación, por vía rectal o tópica en las formulaciones de la unidad de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos convencionales farmacéuticamente aceptables. El término parenteral tal como se utiliza en la presente memoria incluye las técnicas subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, de infusión o por vía intraperitoneal. Los supositorios para administración rectal del fármaco pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado tal como manteca de coco y polietilenglicoles que son sólidos a las temperaturas ordinarias pero líquidos a la temperatura rectal y por consiguiente se mezclarán en el recto y liberarán el
fármaco.

El régimen de dosificación para tratar un trastorno o una enfermedad con los vectores de la presente invención y/o las composiciones de la presente invención se basa en varios factores, incluyendo el tipo de enfermedad, la edad, el peso, el sexo, el estado clínico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y el compuesto específico empleado. De este modo, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero puede determinarse de forma rutinaria utilizando procedimientos normalizados.

Los compuestos farmacéuticamente activos de la presente invención pueden procesarse según los procedimientos convencionales de farmacia para producir composiciones medicinales o agentes para la administración a pacientes, incluyendo seres humanos y otros mamíferos. Para la administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma, por ejemplo, de líquido, en una inserción ocular, una cápsula, un comprimido o una suspensión. La composición farmacéutica se prepara preferentemente en forma de una unidad de dosificación que conpresenta una cantidad dada de agente activo. Por ejemplo, ésta puede contener una cantidad de vector desde aproximadamente 10^{3} a 10^{15} partículas víricas, preferentemente desde aproximadamente 10^{6} a 10^{12} partículas víricas. Una dosis diaria adecuada para un ser humano u otro mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la enfermedad del paciente y de otros factores, pero, una vez más, puede determinarse utilizando procedimientos de rutina. La administración puede ser mediante inyección del agente activo en forma de una composición junto con vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados tales como solución salina, dextrosa o agua.

Aunque los ácidos nucleicos y/o los vectores de la invención pueden administrarse como el único agente farmacéutico activo, pueden utilizarse también en combinación con uno o más vectores de la invención u otros agentes. Cuando se administran en combinación, los agentes terapéuticos pueden formularse como composiciones independientes que se dan a la misma vez o en diferentes veces, o los agentes terapéuticos pueden administrarse como una única composición.

El polipéptido de la presente invención puede también utilizarse en combinación con un vehículo farmacéuticamente adecuado. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye pero no se limita a solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debería seguir el modo de administración.

La invención proporciona también un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado a dicho(s) recipiente(s)
puede estar un prospecto en la forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la preparación, utilización o venta de los productos farmacéuticos o biológicos, cuyo prospecto refleja la aprobación por la agencia de la preparación, utilización o venta para la administración humana. Además, el polipéptido de la presente invención puede ser empleado junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de manera conveniente, tal como por las vías intraocular, colirios y generalizada. Las cantidades y regímenes de dosificación de los polipéptidos derivados de la ARNt sintetasa administradas a un paciente dependerán de numerosos factores, tales como del modo de administración, de la naturaleza de la enfermedad en tratamiento, del peso corporal del paciente en tratamiento y del criterio del médico que receta. Generalmente hablando, el polipéptido se administra en dosis terapéuticamente eficaces de por lo menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal. Preferentemente, la dosificación es de aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal al día, teniendo en cuenta la frecuencia, las vías de administración, los síntomas, etc.

Puede utilizarse terapia angioestática con TrpRS para combatir la actividad angiógena de factores endógenos y exógenos angiógenos y para evitar el desarrollo adicional o incluso mejorar los tumores sólidos, ya que la angiogénesis y la neovascularización son etapas esenciales en el desarrollo del tumor sólido. Dichas terapias puede utilizarse también para tratar la artritis reumatoide, la psoriasis y la retinopatía diabética que se caracterizan todas por angiogénesis anormal.

Se proporcionan composiciones que contienen cantidades y concentraciones terapéuticamente eficaces de vectores para la administración de adenovirus recombinante para la administración de productos génicos terapéuticos a células que expresan un receptor específico. Estas células incluyen las células del ojo. Son de particular interés las células fotorreceptoras del ojo. La administración puede efectuarse por cualquier medio mediante el cual se efectúa la puesta en contacto con los fotorreceptores. Para proporcionar acceso a las células fotorreceptoras, los medios preferibles de administración incluyen, pero no se limitan a, la inyección subretiniana o la inyección intravítrea.

Las composiciones víricas recombinantes pueden formularse también para la implantación en el interior de la cámara anterior o posterior del ojo, preferentemente en la cavidad vítrea, en las formulaciones de liberación prolongada, tal como adsorbidas a soportes biodegradables, incluyendo esponjas de colágeno o en liposomas. Las formulaciones de liberación prolongada pueden formularse para la administración de dosis múltiples, de modo que durante un periodo seleccionado de tiempo, tal como un mes o hasta aproximadamente un año, se administran varias dosis. De este modo, por ejemplo, pueden prepararse liposomas de modo que se administra en una inyección un total de aproximadamente dos hasta aproximadamente cinco o más veces la dosis individual.

Los vectores se formulan en un vehículo oftalmológicamente aceptable para la administración intraocular, preferentemente intravítrea, en un volumen de entre aproximadamente 0,05 ml y 0,15 ml, con preferencia aproximadamente 0,05 y 0,1 ml.

Las composiciones pueden suministrarse en un vial esterilizado sellado que conpresenta una cantidad del agente activo que durante la administración intraocular libera una cantidad suficiente de partículas víricas a los fotorreceptores en un volumen de aproximadamente 50 a 150 \mul, que conpresenta por lo menos aproximadamente 10^{7}, más preferentemente por lo menos aproximadamente 10^{8} unidades formadoras de placa en dicho volumen. Por lo general, los viales contendrán, por lo tanto, aproximadamente 0,15 ml de la composición.

Para preparar dichas composiciones, las partículas víricas se dializan en un vehículo adecuado oftalmológicamente aceptable o las partículas víricas pueden concentrarse y/o mezclarse con éstas. La mezcla resultante puede ser una solución, suspensión o emulsión. Además, las partículas víricas pueden formularse como único ingrediente farmacéuticamente activo en la composición o pueden combinarse con otros agentes activos para el trastorno específico tratado.

Para la administración por inyección intraocular o mediante colirios, los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina equilibrada (BSS), solución de lactato de Ringer y soluciones que contienen agentes espesantes y disolventes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos. Las suspensiones liposómicas pueden ser también adecuadas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden prepararse según los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los vehículos adecuados oftalmológicamente aceptables son conocidos. Las soluciones o mezclas deseadas para su utilización oftálmica pueden formularse como soluciones isotónicas del 0,01% al 10%, pH aproximadamente entre 5 y 7, con sales apropiadas (véase, p. ej., la patente U.S. nº 5.116.868, que describe composiciones típicas de soluciones oftálmicas de irrigación y soluciones para aplicación local). Dichas soluciones, que tienen un pH ajustado a aproximadamente 7,4, tienen, por ejemplo, cloruro sódico 90-100 mM, fosfato potásico dibásico
4-6 mM, fosfato sódico dibásico 4-6 mM, citrato sódico 8-12 mM, cloruro de magnesio 0,5-1,5 mM, cloruro cálcico 1,5-2,5 mM, acetato sódico 15-25 mM, D,L-\beta-hidroxibutirato sódico 10-20 mM y glucosa 5-5,5 mM.

Las composiciones pueden prepararse con vehículos que protegen el agente activo contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como formulaciones de liberación lenta o recubrimientos. Dichos vehículos incluyen formulaciones de liberación controlada, tales como, pero sin limitarse a, sistemas de administración microencapsulados y polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el acetato de viniletileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres, ácido poliláctico y otros tipos de implantes que pueden colocarse directamente en la cámara anterior o posterior o en la cavidad vítrea del ojo. Las composiciones pueden administrarse en granulados, tal como granulados ELVAX® (resina del copolímero de acetato de viniletileno, DuPont).

Las suspensiones liposómicas, incluyendo los liposomas dirigidos al tejido, pueden ser también adecuadas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, pueden prepararse formulaciones liposómicas por procedimientos conocidos por los expertos en la materia (véase, p. ej. Kimm et al., Bioch. Bioph. Acta 728:339-398 (1983); Assil et al., Arch. Ophthalmol. 105:400 (1987); y en la patente U.S. nº 4.522.811). Las partículas víricas pueden estar encapsuladas en el interior de la fase acuosa de los sistemas liposómicos.

Los materiales o agentes activos pueden mezclarse también con otros materiales activos, que no proporcionan la acción deseada o con materiales que complementan la acción deseada o que tienen otra acción, incluyendo los materiales viscoelásticos, tal como el ácido hialurónico, que se comercializa con la marca comercial HEALON® (Pharmacia, Inc.), que es una solución de alto peso molecular (P.M.) de aproximadamente la fracción de 3 millones de hialuronato sódico (véase, p. ej., las patentes U.S. nº 5.292.362, nº 5.282.851, nº 5.273.056, nº 5.229.127, nº 4.517.295 y nº 4.328.803) y las resinas comercializadas con la marca comercial VISCOAT® (disponible en Alcon Surgical, Inc.), que son (met)acrilatos que contienen flúor, tales como, 1H,1H,2H,2H-heptadecafluorodecilmetacrilato (véase, p. ej., las patentes U.S. nº 5.278.126, nº 5.273.751 y nº 5.214.080) y las resinas comercializadas con la marca comercial ORCOLON® (Optical Radiation Corporation, véase, p. ej., la patente U.S. nº 5.273.056) y metilcelulosas, hialuronatos de metilo, poliacrilamidas y polimetacrilamidas (véase, p. ej., la patente U.S. nº 5.273.751). Los materiales viscoelásticos están presentes generalmente en cantidades que oscilan desde aproximadamente 0,5 a 5,0%, preferentemente entre 1 y 3% en peso del material conjugado y sirven para recubrir y proteger los tejidos tratados. Las composiciones pueden incluir también un colorante, tal como azul de metileno u otros colorantes inertes, de modo que la composición pueda verse cuando se inyecta dentro del ojo. Pueden incluirse agentes activos adicionales.

Las composiciones pueden estar dentro de ampollas, jeringuillas de un solo uso o viales de múltiples o una sola dosis de vidrio, plástico u otro material adecuado. Dichas composiciones contenidas en el interior pueden suministrarse en kits. En particular, en la presente memoria se proporcionan kits que contienen viales, ampollas u otros recipientes, preferentemente viales de un solo uso con una cantidad suficiente de la composición a administrar de aproximadamente 0,100 ml de la misma y agujas de un solo uso, preferentemente agujas de calibre 25-33 con autosellado, o más pequeñas.

Por último, las composiciones pueden estar envasadas como artículos de preparación que contienen material de envasado, por lo general un vial, una composición oftalmológicamente aceptable que conpresenta un polipéptido de la presente invención y una etiqueta que indica la utilización terapéutica de la composición.

También se suministran kits para la puesta en práctica de las utilizaciones en la presente memoria. Los kits contienen uno o más recipientes, tal como viales sellados, con composición suficiente para administración de una sola dosis, y una o más agujas, tal como agujas de calibre 25-33 o más pequeñas con autosellado, preferentemente agujas de calibre 33 o más pequeñas, con jeringuillas calibradas con precisión u otros dispositivos de administración calibrados con precisión, adecuados para la inyección intravítrea.

La administración de la composición es preferentemente por inyección intraocular, aunque pueden ser eficaces otros modos de administración, si la cantidad suficiente del compuesto consigue ponerse en contacto con la cavidad vítrea. La inyección intraocular puede efectuarse por inyección intravítrea, inyección en el humor acuoso o inyección en las capas externas del ojo, tal como la inyección subconjuntiva o la inyección subtenón o mediante aplicación tópica en la córnea, si se utiliza una formulación penetrante.

Para cualquier paciente en concreto, los regímenes específicos de dosificación deberían ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de los virus recombinantes. La concentración e intervalos de cantidades publicados en la presente memoria son únicamente a título de ejemplo y no pretenden limitar el alcance o la puesta en práctica de las utilizaciones reivindicadas.

Los ejemplos siguientes son ilustrativos de formas de realización específicas de la invención, y de varias utilizaciones de la misma. Se proporcionan a título ilustrativo y explicativo solamente, pero no deben considerarse limitativos.

Ejemplo 1

Preparación de TrpRS recombinante exenta de endotoxina

Se preparó de la forma siguiente TrpRS humana recombinante exenta de endotoxina. Se prepararon plásmidos que codifican la TrpRS completa (restos de aminoácidos 1 a 471 de la SEC. ID. nº: 1) o la TrpRS truncada, denominada en lo sucesivo T2 (SEC. ID. nº: 12), constituida esencialmente por los restos 94 a 471 de la SEC. ID. nº: 1 (es decir, los restos 94 a 471 de la TrpRS completa) y una segunda TrpRS truncada, denominada en lo sucesivo T1 (SEC. ID. nº: 13), constituida esencialmente por los restos 71 a 471 de la SEC. ID. nº: 1. Cada plásmido también codificó una etiqueta C-terminal que comprende seis restos de histidina (p. ej. los restos de aminoácidos 472 a 484 de la SEC. ID. nº: 1), y un resto inicial de metionina. La T1 activada por His_{6} presenta la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. nº: 5, mientras que la T2 activada por His_{6} presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 7.

Los plásmidos anteriores se introdujeron en la cepa BL 21 (DE 3) de E. coli (Novagen, Madison, WI). Se preparó asimismo para su utilización la EMAPII madura humana, que codifica también una etiqueta C-terminal de seis restos de histidina. Se provocó la sobreexpresión de TrpRS recombinante tratando las células con \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo durante 4 horas. Se lisaron las células a continuación y se purificaron las proteínas procedentes del sobrenadante en columnas de afinidad de níquel HIS-BIND® (Novagen) según el protocolo sugerido por el fabricante. Después de la purificación, se incubaron las proteínas TrpRS con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía ZnSO_{4} 1 \muM y a continuación se eliminó el Zn^{2+} libre (Kisselev et al., Eur. J. Biochem. 120:511-17 (1981)).

Se eliminó la endotoxina procedente de las muestras de proteína por separación de fases utilizando Triton X-114 (Liu et al., Clin. Biochem. 30:455-63 (1997)). Se determinaron las muestras de proteína que contenían menos de 0,01 unidades de endotoxina por ml utilizando un ensayo de coagulación en gel E-TOXATO® (Sigma, St. Louis, MO). Se determinó la concentración de proteínas mediante el ensayo Bradford (BioRad, Hércules, CA) utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como patrón.

Ejemplo 2

Escisión de TrpRS humana mediante PMN elastasa

La escisión de TrpRS humana completa fue examinada con PMN elastasa. Se trató la TrpRS con PMN elastasa en PBS (pH 7,4) a una proporción de proteasa:proteína de 1:3000 durante 0, 15, 30 ó 60 minutos. Después de la escisión, se analizaron las muestras en geles de SDS al 12,5%-poliacrilamida. La escisión con PMN elastasa de una TrpRS completa de aproximadamente 53 kDa, codificada por los nucleótidos 3428 a 4738 de la SEC. ID. nº: 2 del ADN) generó un fragmento mayor de aproximadamente 46 kDa (SEC. ID. nº: 5, T1 con la etiqueta de histidina C-terminal) y un fragmento menor de aproximadamente 43 kDa (SEC. ID. nº: 7, teniendo T2 la etiqueta de histidina C-terminal).

El análisis por inmunotransferencia Western con antibióticos dirigidos contra la etiqueta His_{6} del terminal carboxilo de la proteína recombinante TrpRS puso de manifiesto que ambos fragmentos poseían la etiqueta His_{6} en su terminal carboxilo. De este modo, solamente el terminal amino de dos fragmentos de TrpRS se había truncado. Las secuencias con terminal amino de los fragmentos de TrpRS se determinaron por degradación de Edman utilizando un secuenciador modelo 494 de ABI. El secuenciado de estos fragmentos demostró que las secuencias con terminal amino eran S-N-H-G-P (SEC. ID. nº: 8) y S-A-K-G-I (SEC. ID. nº: 9), lo que indica que los restos con terminal amino de los fragmentos de TrpRS mayor y menor estaban situados en las posiciones 71 y 94, respectivamente de la TrpRS completa. En la Figura 1 se resumen estos montajes de de TrpRS humana. Las secuencias con la característica -HVGH- (SEC. ID. nº: 10) y -KMSAS- (SEC. ID. nº: 11), se presentan en recuadros.

Se analizó la actividad angioestática de los fragmentos mayor y menor de TrpRS en ensayos de angiogénesis. Las formas recombinantes de los fragmentos mayor y menor de TrpRS SEC. ID. nº: 5 y SEC. ID. nº: 7 cada una con una etiqueta de histidina con terminal C (restos de aminoácidos 472 a 484 de la SEC. ID. nº: 1) se utilizaron en estos ensayos. Ambos fragmentos de TrpRS eran capaces de inhibir la angiogénesis.

Ejemplo 3

Fragmentos truncados de TrpRS presentan efecto angioestático potente para la angiogénesis retiniana

Se examinó la actividad angioestática de las formas truncadas procedentes de la triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS, 53 kDa, SEC. ID. nº: 1), en un modelo de angiogénesis retiniana de ratón después del nacimiento. Friedlander et al., Abstracts 709-884 y 714-889, IOVS 41(4):138-139 (15 de marzo de 2000) han descrito que la angiogénesis retiniana después del nacimiento procede en etapas en el ratón. En la presente memoria se describe un procedimiento de ensayo de inhibición de la angiogénesis aprovechando esta vascularización retiniana en etapas.

Se prepararon la mini-TrpRS recombinante exenta de endotoxina (variante de corte y empalme de 48 kDa de TrpRS activada por histidina; SEC. ID. nº: 3) y T2 (producto de la escisión de 43 kDa de TrpRS activada por histidina; SEC. ID. nº: 7) como proteínas recombinantes. Estas proteínas se inyectaron por vía intravítrea en ratones Balb/C recién nacidos los días 7 u 8 después del nacimiento (P) y se recogieron las retinas en P12 o P13. El anticuerpo del colágeno IV y el anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína se utilizaron para observar los vasos en preparaciones completas montadas de retina. Se evaluó la actividad antiangiógena por examen al microscópico confocal basándose en el efecto de las proteínas inyectadas en la formación del plexo profundo, externo y vascular. La inyección intravítrea y el aislamiento de la retina se realizó con un microscopio de disección (SMZ 645, Nikon, Japón). Se creó una fisura en el párpado en los ratones del día 7 después del nacimiento (P7) con una cuchilla fina para exponer el glóbulo a la inyección de T2 (5 pmoles) o de TrpRS (5 pmoles). Se inyectaron las muestras (0,5 \mul) con una jeringuilla provista de una aguja del calibre 32 (Hamilton Company, Reno, NV). La inyección se practicó entre el ecuador y el limbo de la córnea; durante la inyección la posición de la punta de la aguja se controló por observación directa para determinar que estaba en la cavidad vítrea. Los ojos con cristalinos inducidos con la aguja o daño en la retina se excluyeron del estudio. Tras la inyección, los párpados se volvieron a colocar para cerrar la fisura.

El día 12 después del nacimiento (P12), se practicó la eutanasia a los animales y se extrajeron los núcleos oculares. Después de 10 minutos en paraformaldehído al 4% (PFA), se separaron la córnea, los cristalinos, la esclerótica y el humor vítreo mediante una incisión del limbo. Se preparó la retina aislada por tinción mediante impregnación en metanol durante 10 minutos en hielo, seguido de bloqueo en suero bovino fetal al 50% (Gibco, Grand Island, NY) con suero de cabra normal al 20% (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) en PBS durante 1 hora en hielo. Se observaron específicamente los vasos sanguíneos tiñendo la retina con un anticuerpo de colágeno IV anti-ratón de conejo (Chemicon, Temecula, CA) diluido 1:200 en tampón de bloqueo durante 18 h a 4ºC. Un anticuerpo de IgG anti-conejo de cabra conjugado con ALEXA FLUOR® 594 (Molecular Probes, Eugene, OR) (dilución 1:200 en tampón de bloqueo) se incubó con la retina durante 2 h a 4ºC. Las retinas se montaron con medio M de montaje de fundido lento (Molecular Probes, Eugene, OR).

Se evaluó la actividad angioestática basándose en el grado de angiogénesis en la capa vascular retiniana profunda y más externa (capa secundaria) que se forma entre P8 y P12. Se evaluó el aspecto de la red de vasos sanguíneos más internos (capa primaria) para el desarrollo normal y los signos de toxicidad. Ninguno de los montajes de proteínas utilizado en este ejemplo produjo efectos desfavorables en la capa primaria.

La Fig. 2 proporciona una representación fotomicrográfica de la capacidad de T2 para inhibir la vascularización de la red secundaria profunda de la retina del ratón. En la Fig. 2, la fila A presenta la red vascular de la retina expuesta a TrpRS, la fila B presenta la red vascular de una retina expuesta a mini-TrpRS y la fila C presenta la red vascular de una retina expuesta al polipéptido T2 de la presente invención. La primera columna (izquierda) presenta la red superficial primaria y la segunda columna presenta la red profunda secundaria. Como es evidente a partir de la Fig.2, ninguno de los polipéptidos afectó la red superficial primaria, mientras que solamente T2 inhibió significativamente la vascularización de la red profunda secundaria.

La mayoría de los ojos tratados con PBS presentaban un desarrollo vascular retiniano normal, pero la inhibición completa de la capa vascular más externa se observó en aproximadamente el 8,2% (n=73) de los ojos tratados. La inhibición completa de la red externa se observó en el 28% de los ojos tratados con mini-TrpRS (0,5 mg/ml) (n=75). La forma truncada, más pequeña (T2) fue un inhibidor de angiogénesis mucho más potente a una dosis dependiente; el 14,3% se inhibieron completamente después del tratamiento con 0,1 mg/ml de T2 (n=14), el 40% después del tratamiento con 0,25 mg/ml (n=20) y el 69,8% se inhibió completamente después de 0,5 mg/ml (n=53). Los datos para los tratamientos con 0,5 mg/ml se presentan gráficamente en la Fig. 3. Los extractos de retina de ratón contienen una proteína con la misma masa molecular aparente e inmunorreactividad que la mini-TrpRS humana, analizada por SDS-PAGE e inmunotransferencia Western. La TrpRS de ratón y humana completas comparten aproximadamente el 88% de identidad de aminoácidos y contienen 475 y 471 aminoácidos respectivamente. Las formas truncadas de TrpRS especialmente T2, tienen un potente efecto angioestático sobre el desarrollo vascular retiniano.

Ejemplo 4

Ensayo de angiogénesis con matrigel

Se utilizó un ensayo de angiogénesis con matrigel en ratón para examinar la actividad angioestática de T2 (SEC. ID. nº: 7) según los procedimientos descritos por Brooks et al., Methods Mol. Biol., 129: 257-269 (1999) y Eliceirl et al., Mol. Cell, 4: 915-924 (1999). Se realizó tal como se describe con las modificaciones siguientes. Se implantaron 400 \mul de matrigel sin factor de crecimiento (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) que contenía VEGF 20 nM por vía subcutánea en ratones wehi atímicos. Se probó inicialmente la actividad angioestática de T2 incluyendo T2 2,5 \muM en el tampón de matrigel. Se determinó la potencia incluyendo varias concentraciones de T2 en el tapón. El día 5, se inyectó a los ratones por vía intravenosa Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I con lectina con unión endotelial marcada con fluoresceína, isolectina B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se reseccionaron los tapones de matrigel. Se determinó cuantitativamente el contenido de fluoresceína de cada tapón por análisis espectrofotométrico después de disgregar el tapón en tampón RIPA (fosfato sódico 10 mM, pH 7,4, cloruro sódico 150 mM, Nonidet P-40 al 1%, desoxicolato sódico al 0,5% y dodecil sulfato sódico al 0,1%).

Ejemplo 5

Localización de la fijación de T2 en la retina

Para evaluar la absorción y localización de T2 inyectada en la retina, se inyectó en el humor vítreo del ojo T2 marcada con fluoresceína (ALEXA® 488, Molecular Probes, Inc., Eugene OR) el día 7 después del nacimiento (P7). Se recogieron las esferas en P8 y P12 y se fijaron en PFA al 4% durante 15 min. Se disecaron más las retinas exentas de tejido adherente no retiniano y se colocaron en PFA al 4% durante la noche a 4ºC y a continuación se empaparon en medio (TISSUE-TEK® O.C.T., Sakura Fine Technical Co., Japón) en nieve carbónica. Se rehidrataron las secciones del criostato (10 micras) con PBS y se bloquearon con BSA al 5%, suero de cabra normal al 2% en PBS. Se observaron los vasos sanguíneos con anticuerpo de colágeno IV anti-ratón tal como se describió anteriormente. Se utilizó VECTASHIELD® que contenía mancha nuclear DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para montar los tejidos con un cubreobjetos.

Alternativamente, se incubaron secciones de retina no teñidas con TrpRS completa marcada con fluoresceína 200 nM o T2 marcada con fluoresceína en tampón de bloqueo durante la noche a 4ºC. Se lavaron las secciones seis veces durante 5 minutos cada una en PBS, seguido de incubación con 1 \mug/ml de DAPI durante 5 minutos para observación de los núcleos. El bloqueo previo con T2 sin marcar se realizó incubando T2 1 \muM sin marcar durante 8 horas a 4ºC antes de la incubación con T2 marcada con fluoresceína. Se examinaron las retinas con un microscopio confocal multifotón MRC 1024 de BioRad. Se produjeron imágenes vasculares en 3-D de una serie de imágenes de la serie Z utilizando el programa informático Confocal Assistant (BioRad, Hércules, CA).

Potencia angioestática de T2 en el ensayo con tapón matrigel en ratón. Los inventores examinaron T2 (SEC. ID. nº: 7) para determinar si había actividad angioestática, aun cuando se había perdido la actividad de aminoacilación. Se utilizó el ensayo con matrigel en ratón para examinar la actividad angioestática de T2 in vivo. VEGF_{165} provoca el desarrollo de vasos sanguíneos en el tapón de matrigel en ratón. Cuando se añadió T2 al matrigel junto con VEGF_{165}, se bloqueó la angiogénesis en función de la dosis con una IC_{50} de 1,7 nM como se muestra en la Fig. 4.

T2 marcada con fluoresceína se localiza en los vasos sanguíneos de la retina. Con objeto de observar la localización intraocular de T2 (SEC. ID. nº: 7), los inventores examinaron la distribución de T2 marcada con fluoresceína después de la inyección intravenosa el 7º día tras el nacimiento. Se aislaron las retinas al día siguiente, se seccionaron y examinaron utilizando microscopia confocal. La distribución de la proteína inyectada se limitó a los vasos sanguíneos. Se confirmó esta localización mediante T2 marcada por tinción conjunta se trataron los ojos con anticuerpo anti-colágeno IV marcado con fluoresceína (ALEXA® 594) (datos no mostrados). Cinco días después de la inyección de T2 marcada con fluoresceína (en P12), la fluorescencia verde de la T2 marcada era todavía visible (Fig. 5A). En estas retinas, no se observó la capa vascular secundaria en P12, lo que indica que la T2 marcada con fluoresceína conservaba actividad angioestática comparable a T2 sin marcar. Las retinas inyectadas en T7 con TrpRS completa marcada con fluoresceína desarrolló una capa vascular secundaria mediante P12 pero no se observó tinción vascular (Fig. 5B). En la Fig. 5, las proteínas marcadas con fluoresceína son verdes, los vasos marcados con colágeno son rojos y los núcleos son azules.

Para evaluar más las propiedades de fijación de la T2 marcada, se tiñeron retinas normales de recién nacido con T2 marcada con fluoresceína. En estas condiciones, T2 marcada con fluoresceína solo se unió a los vasos sanguíneos (Fig. 5C). La fijación era específica ya que se bloqueó por incubación previa con T2 sin marcar (datos no mostrados). No se observó tinción de vasos retinianos cuando se aplicó a las retinas TrpRS completa marcada con fluoresceína (Fig. 5D), que concuerda con la ausencia de actividad angioestática de la enzima completa.

Como se muestra en la Fig. 5, T2 marcada con fluoresceína es angioestática y se localiza en los vasos sanguíneos retinianos. Se inyectaron (0,5 \mul, por vía intravenosa) el 7º día después del nacimiento (P7) de T2 marcada con fluoresceína (Fig. 5A) o TrpRS completa (Fig. 5B). Se recogieron las retinas en P8 y se tiñeron con un anticuerpo anti-colágeno IV y tinción nuclear de API. T2 marcada (flecha superior que apunta al vaso en la Fig. 5A) se localizó en los vasos sanguíneos en la red superficial primaria (1º). Obsérvese que la red profunda secundaria está completamente ausente (2º). Aunque tanto las capas vasculares primarias (1º) como secundarias (2º) están presentes en los ojos inyectados con TrpRS completa marcada con fluoresceína (flechas en la Fig. 5B), no se observó
marcado.

En una serie independiente de experimentos, se tiñeron secciones congeladas de retinas P15 con T2 marcada con fluoresceína (Fig. 5C) o TrpRS completa marcada con fluoresceína (Fig. 5D) y se diagnosticaron por la imagen en el microscopio de láser de escaneado confocal. La T2 marcada se localizó selectivamente en los vasos sanguíneos y aparece como un vaso verde brillante que penetra las capas vasculares de la retina primarias y secundarias justo por debajo de la etiqueta "2º" en la Fig. 5C. No se observó tinción con TrpRS completa (Fig. 5D).

La TrpRS completa conpresenta un único dominio con terminal NH_{2} y carece de actividad angioestática. Eliminando parte o todo este dominio completo se pone de manifiesto una proteína con actividad angioestática. Las estructuras responsables de actividad angioestática de T2 parecen estar contenidas dentro del dominio que se une al nucleótido del pliegue Rossmann del núcleo. El dominio con terminal NH_{2}, que puede ser eliminado mediante corte y empalme alternativo o por proteólisis, puede regular la actividad angioestática de TrpRS, posiblemente poniendo de manifiesto una secuencia de fijación necesaria para la angiostasis que es inaccesible en TrpRS completa.

La angiogénesis provocada por VEGF en el modelo matrigel de ratón fue inhibida completamente por T2 ya que era angiogénesis fisiológica en la retina del recién nacido. Resulta interesante que el efecto antiangiógeno más potente de los fragmentos de TrpRS in vitro y en CAM y en los modelos matrigel se observa en la angiogénesis estimulada por VEGF. Los resultados de la angiogénesis de la retina de ratón recién nacido son coherentes con un enlace entre la angiogénesis estimulada por VEGF y los efectos angioestáticos de los fragmentos de TrpRS; la angiogénesis de la retina en este sistema puede ser dirigida por VEGF. Además, la inhibición observada en el modelo de retina era específica para los vasos recién desarrollados. Los vasos de la capa vascular primaria preexistentes (en el momento de la inyección) estaban inalterados por el tratamiento. Aunque el mecanismo de la actividad angioestática de T2 no es conocido, la localización específica de T2 para el sistema vascular endotelial retiniano y el efecto selectivo de T2 en los vasos sanguíneos recién desarrollados sugiere que T2 puede funcionar mediante un receptor celular endotelial expresado en las células proliferantes o migrantes. La comprensión adicional del mecanismo de actividad angioestática de T2 requiere la identificación del receptor celular aplicable.

Una variedad de tipos de células que producen, estimulación en el interferón y, la mini-TrpRS angioestática también producen factores angioestáticos tales como IP-10. De este modo, estos resultados aumentan la posibilidad de una función para TrpRS en trayectorias normales, fisiológicamente aplicables de la angiogénesis. Otra proteína-pro-EMAPII (p43) celular omnipresente presenta dos funciones aparentemente no relacionadas similares a las descritas en la presente memoria para TrpRS. La pro-EMAPII ayuda a la traducción de la proteína asociándose al complejo multisintetasa de las aminoacil ARNt sintetasas de mamífero. Es procesada y segregada como EMAPII y se ha sugerido una función para EMAPII como mediador angioestático durante el desarrollo del pulmón.

De este modo, T2 puede utilizarse en el remodelado angiógeno fisiológicamente aplicable observado en condiciones normales o patológicas. En la angiogénesis normal, T2 puede ayudar a establecer zonas avasculares fisiológicamente importantes presentes en algunos órganos tales como la zona avascular de la fovea de la retina central. La angiogénesis patológica puede producirse si la escisión de TrpRS completa se inhibía, conduciendo a un sobrecrecimiento de los vasos.

En las enfermedades oculares, la neovascularización puede conducir a la pérdida catastrófica de la visión. Estos pacientes pueden recibir potencialmente gran beneficio de la inhibición terapéutica de la angiogénesis. El factor de crecimiento endotelial vascular ha estado asociado a la neovascularización y al edema macular en la retina, aunque se cree que otros estímulos angiógenos también desempeñan funciones en la angiogénesis retiniana. Los inventores han observado una asociación entre la angiogénesis estimulada por VEGF y la potente actividad angioestática de los fragmentos de TrpRS, haciendo a estas moléculas útiles en el tratamiento de las retinopatías hipóxicas, y otras, proliferantes. No se ha informado en la bibliografía de un agente antiangiógeno que inhiba completamente el 70% del tiempo la angiogénesis, como la hace la T2 de la presente invención (Fig. 5). Otra ventaja de los fragmentos de TrpRS es que representan antiangiógenos naturales y, por consiguiente, potencialmente no inmunógenos. De este modo, estas moléculas pueden ser liberadas por las células dirigidas o por terapia a base de vector vírico. Debido a que muchos pacientes con enfermedades neovasculares oculares se han asociado a la enfermedad isquémica generalizada, es deseable el tratamiento antiangiógeno local con células modificadas genéticamente o vectores víricos colocados directamente en el ojo.

Además del tratamiento de las retinopatías angiógenas, los fragmentos de TrpRS de la presente invención, particularmente T2 y los fragmentos que inhiben la angiogénesis de la misma, pueden inhibir también el crecimiento del tumor sólido impidiendo la vascularización del tumor. Los fragmentos de TrpRS de la presente invención bloquean la proliferación inducida por VEGF y la quimiotaxia de las células endoteliales in vitro, y de este modo son útiles en el tratamiento de cualquier patología que implique la proliferación y vascularización de las células endoteliales no deseadas.

<110> The Scripps Research Institute

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<120> Polipéptidos derivados de la triptofanil ARNt sintetasa útiles para la regulación de la angiogénesis

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<130> 18-144

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<150> PCT/US02/05185

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<151> 2002-02-22

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<150> 60/270, 951

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<151> 2001-02-23

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<160> 13

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<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

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<210> 1

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<211> 484

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> TrpRS humana recombinante

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<400> 1

3

4

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<210> 2

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<211> 4877

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> mini TrpRS humana recombinante en pET20B

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<221> CDS

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<222> (3428)..._(4738)

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<400> 2

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5

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<210> 3

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<211> 437

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> mini Trps humano en Pet20b

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<400> 3

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9

10

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<210> 4

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<211> 4811

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Producto de escisión T1 de recombinante TrpRs humano

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<221> CDS

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<222> (3428)..._(4672)

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<400> 4

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11

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<210> 5

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<211> 415

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Producto de escisión T1 de recombinante TrpRs humano

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<400> 5

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15

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<210> 6

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<211> 4742

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Producto de escisión T2 de recombinante TrpRs humano

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<221> CDS

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<222> (3428)...(4603)

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<400> 6

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17

18

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20

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<210> 7

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<211> 392

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Producto de escisión T2 de recombinante TrpRs humano

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<400> 7

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21

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<210> 8

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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22

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<210> 9

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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23

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<210> 10

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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24

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<210> 11

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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25

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<210> 12

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<211> 378

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

26

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<210> 13

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<211> 401

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

27

Claims (27)

1. Polipéptido aislado, soluble en agua, constituido por la secuencia de restos de aminoácidos

28

o una angiogénesis que inhibe su fragmento;

presentando dicho polipéptido aislado un tamaño no superior a 45 kilodaltons.

2. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, que es un fragmento inhibidor de angiogénesis que puede inhibir la neovascularización ocular.

3. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, que es un fragmento inhibidor de angiogénesis que puede inhibir la neovascularización ocular y que incluye por lo menos una de las secuencias de identificación de restos de aminoácidos HVGH (SEC. ID. nº: 10) y KMSAS (SEC. ID. nº: 11).

4. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, que es un fragmento inhibidor de angiogénesis que puede inhibir la neovascularización ocular y que incluye la secuencia de identificación de restos de aminoácidos HVGH (SEC. ID. nº: 10).

5. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, que es un fragmento inhibidor de angiogénesis que puede inhibir la neovascularización ocular y que presenta un tamaño inferior a 43 kilodaltons.

6. Polipéptido aislado que presenta la secuencia de restos de aminoácidos SEC. ID. nº: 7.

7. Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido aislado, soluble en agua según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Vector recombinante que comprende el polinucleótido aislado según la reivindicación 7.

9. Célula hospedadora recombinante que incluye el vector según la reivindicación 8.

10. Célula hospedadora recombinante que expresa el polipéptido según la reivindicación 1.

11. Utilización de un polipéptido soluble en agua que está constituido por la secuencia de restos de aminoácidos

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o un fragmento inhibidor de la neovascularización ocular de la misma para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir la neovascularización ocular en un paciente que comprende administrar dicha composición farmacéutica a dicho paciente en una cantidad que inhiba la neovascularización ocular.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa a diario.

13. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa semanalmente.

14. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa mensualmente.

15. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa trimestralmente.

16. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa semestralmente.

17. Utilización según la reivindicación 11, en la que se administra al paciente una dosis diaria de polipéptido de 20 a 100 microgramos.

18. Utilización según la reivindicación 11, en la que se administra al paciente una dosis trimestral de polipéptido de 2 a 9 miligramos.

19. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa por suministro intravítreo.

20. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa por suministro intraocular.

21. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa mediante un dispositivo de suministro prolongado.

22. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa mediante terapia génica.

23. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración se efectúa por suministro ocular basado en células.

24. Composición angiostática inyectable que comprende un polipéptido constituido por la secuencia de restos de aminoácidos

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o un fragmento inhibidor de angiogénesis de la misma y un excipiente acuoso farmacológicamente aceptable, conteniendo la composición el polipéptido en una concentración de por lo menos 0,1 miligramos por mililitro de excipiente acuoso.

25. Composición angiostática según la reivindicación 24, en la que el polipéptido presenta la secuencia de restos de aminoácidos SEC. ID. nº: 7 o SEC. ID. nº: 12 y está presente en una concentración comprendida en el intervalo de 0,1 a 0,5 miligramos por mililitro de excipiente acuoso.

26. Kit para inhibir la neovascularización ocular que comprende una cantidad de un polipéptido según la reivindicación 1, suficiente para por lo menos una administración de una sola dosis, envasada en un recipiente sellado adecuado; por lo menos una aguja de jeringuilla de autosellado que presenta un calibre inferior a 33, adecuado para la inyección intravítrea; y por lo menos una jeringuilla calibrada con precisión.

27. Kit según la reivindicación 26, que comprende además material con información impresa que describe la composición, su procedimiento de administración y cualquier información de seguridad y eficacia requerida tal como puede resultar requerida por las regulaciones gubernamentales.