ES2643469T3 - Anticuerpos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTP-beta) y usos de los mismos - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTP-beta) y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTPbeta) y a usos de los mismos. 5

Antecedentes de la invención

La angiogénesis, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente, desempeña un papel importante en una amplia selección de procesos fisiológicos y patológicos (Nguyen, L. L. et al., Int. Rev. Cytol, 204, 1-48, (2001)). La angiogénesis es un proceso complejo, mediado por la comunicación entre las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos y su entorno. En las primeras etapas de la angiogénesis, las células 10 tisulares o tumorales producen y secretan factores de crecimiento pro-angiogénicos en respuesta a estímulos ambientales tales como la hipoxia. Estos factores se difunden a las células endoteliales cercanas y estimulan receptores que conducen a la producción y secreción de proteasas que degradan la matriz extracelular circundante. Las células endoteliales activadas comienzan a migrar y proliferan en el tejido circundante hacia la fuente de estos factores de crecimiento (Bussolino, F., Trends Biochem. Sci., 22, 251-256, (1997)). Las células endoteliales dejan de 15 proliferar y se diferencian en estructuras tubulares, lo que es la primera etapa en la formación de vasos sanguíneos estables y maduros. Posteriormente, las células periendoteliales, tales como los pericitos y las células de músculo liso, son reclutadas al recipiente recién formado en una etapa adicional hacia la maduración del vaso.

La angiogénesis está regulada por un equilibrio de factores naturales proangiogénicos y antiangiogénicos. El factor de crecimiento endotelial vascular, el factor de crecimiento de fibroblastos y la angiopoyetina representan algunos de 20 los muchos factores de crecimiento potencialmente proangiogénicos. Estos ligandos se unen a sus respectivas tirosina quinasas receptoras en la superficie de las células endoteliales y transducen señales que potencian la migración y la proliferación celulares. Aunque se han identificado muchos factores reguladores, todavía no se conocen por completo los mecanismos moleculares que impulsan este proceso.

Existen muchos estados patológicos impulsados por una angiogénesis persistente no regulada o regulada 25 indebidamente. En dichos estados patológicos, la angiogénesis no regulada o regulada indebidamente puede causar una determinada enfermedad o agravar una afección patológica existente. Por ejemplo, la neovascularización ocular ha sido implicada como la causa más común de ceguera y subyace a la patología de aproximadamente 20 enfermedades oculares. En ciertas afecciones previamente existentes, tales como la artritis, los vasos sanguíneos capilares recién formados invaden las articulaciones y destruyen el cartílago. En la diabetes, nuevos capilares 30 formados en la retina invaden el humor vítreo, causando sangrado y ceguera.

Tanto el crecimiento como la metástasis de los tumores sólidos también pueden depender de la angiogénesis, Folkman et al., “Tumor Angiogenesis,” capítulo 10, 206-32, en “The Molecular Basis of Cancer”, Mendelsohn et al., eds., W. B. Saunders, (1995). Se ha demostrado que los tumores que aumentan hasta más de 2 mm de diámetro deben obtener su propio suministro de sangre y hacerlo induciendo el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos 35 capilares. Una vez incluidos estos nuevos vasos sanguíneos en el tumor, proporcionan nutrientes y factores de crecimiento esenciales para el crecimiento tumoral, así como un medio para que las células tumorales entren en la circulación y metastaticen a sitios distantes, tales como el hígado, el pulmón o el hueso (Weidner, New Eng. J. Med., 324, 1, 1-8 (1991)). Cuando se usan como fármacos en animales portadores de tumores, los inhibidores naturales de la angiogénesis pueden prevenir el crecimiento de tumores pequeños (O’Reilly et al., Cell, 79, 315-28 (1994)). En 40 algunos protocolos, la aplicación de dichos inhibidores conduce a la regresión y a la latencia del tumor incluso una vez cesado el tratamiento (O’Reilly et al., Cell, 88, 277-85 (1997)). Además, el suministro de inhibidores de la angiogénesis a ciertos tumores puede potenciar su respuesta a otros regímenes terapéuticos (véase, p. ej., Teischer et al., Int. J. Cancer, 57, 920-25 (1994)).

Aunque muchos estados patológicos son impulsados por una angiogénesis persistente no regulada o regulada 45 indebidamente, algunos estados patológicos pueden tratarse mejorando la angiogénesis. El crecimiento y la reparación de tejidos son eventos biológicos en donde se producen la proliferación celular y la angiogénesis. Por lo tanto, un aspecto importante de la reparación de heridas es la revascularización del tejido dañado por la angiogénesis.

Las heridas crónicas no cicatrizantes son una causa importante de morbilidad prolongada en la población humana 50 envejecida. Esto es el caso, en especial, en los pacientes acamados o diabéticos que desarrollan úlceras cutáneas graves y no cicatrizantes. En muchos de estos casos, el retraso en la cicatrización es el resultado de un suministro sanguíneo inadecuado ya sea como resultado de la presión continua o del bloqueo vascular. Una mala circulación capilar debida a una aterosclerosis de arterias pequeñas o una estasis venosa contribuye a la falta de reparación del tejido dañado. Dichos tejidos se suelen infectar con microorganismos que proliferan sin exposición por los sistemas 55 innatos de defensa del cuerpo que requieren tejido bien vascularizado para eliminar eficazmente los organismos patógenos. Como resultado de ello, la mayoría de la intervención terapéutica se centra en la restauración del flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos, lo que permite que los nutrientes y factores inmunológicos accedan al sitio de la

herida.

Las lesiones ateroscleróticas en los grandes vasos pueden causar isquemia tisular que podría mejorarse modulando el crecimiento de los vasos sanguíneos hacia el tejido afectado. Por ejemplo, las lesiones ateroscleróticas en las arterias coronarias pueden causar angina e infarto de miocardio, que podrían prevenirse si se pudiera restablecer el flujo sanguíneo estimulando el crecimiento de las arterias colaterales. De manera similar, las lesiones 5 ateroscleróticas en las grandes arterias que suministran las piernas pueden causar isquemia en el músculo esquelético que limite la movilidad y, en algunos casos, se requiere amputación, lo que también puede prevenirse mejorando el flujo sanguíneo con la terapia angiogénica.

Otras enfermedades tales como la diabetes y la hipertensión se caracterizan por una disminución en el número y en la densidad de pequeños vasos sanguíneos tales como las arteriolas y los capilares. Estos pequeños vasos 10 sanguíneos son importantes para el suministro de oxígeno y nutrientes. Una disminución en el número y en la densidad de estos vasos contribuye a las consecuencias adversas de la hipertensión y la diabetes incluyendo claudicación, úlceras isquémicas, hipertensión acelerada e insuficiencia renal. Estos trastornos comunes y muchas otras dolencias menos comunes, tales como la enfermedad de Burgers, podrían mejorarse aumentando el número y la densidad de pequeños vasos sanguíneos usando la terapia angiogénica. 15

Por lo tanto, existe una necesidad continua de identificar reguladores de la angiogénesis.

En vista de lo anterior, existe la necesidad de identificar dianas bioquímicas en el tratamiento de trastornos mediados por la angiogénesis. Sin embargo, la angiogénesis implica la acción de múltiples factores de crecimiento y sus receptores tirosina quinasas (RTK) afines, (Yancopoulos et al., Nature, 407,242-248, 2000). El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, es importante para la diferenciación de células endoteliales en vasos 20 sanguíneos nacientes en la vasculatura embrionaria. Además, el VEGF mejora el desarrollo de los vasos sanguíneos en la vasculatura adulta. La administración de VEGF exógeno aumenta el desarrollo de la vasculatura colateral y mejora el flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos.

Hasta la fecha, se han identificado tres RTK de VEGF, VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2 (KDR) y VEGFR3 (FLT-4). Aunque estos receptores están muy conservados, basados en la caracterización bioquímica y la actividad biológica, 25 cada uno tiene funciones específicas y no superpuestas. De los tres receptores, se cree que VEGFR2 desempeña el papel predominante en la mediación de las acciones de VEGF en la vasculatura en desarrollo y durante la angiogénesis en adultos. Sin embargo, tanto VEGFR1 como VEGFR3 son necesarios para el desarrollo normal de la vasculatura embrionaria y también pueden ser importantes para la angiogénesis en tejidos adultos. Tras la unión y la dimerización de VEGF, un cambio conformacional en el dominio de quinasa de VEGFR2 aumenta su actividad de 30 quinasa dando como resultado la "autofosforilación" del otro miembro del par en restos de tirosina específicos. Estas autofosforilaciones sirven para potenciar aún más la actividad quinasa y proporcionar puntos de anclaje para la asociación de moléculas de señalización intracelular.

Sin embargo, la activación de una sola vía angiogénica puede no ser suficiente para producir vasos persistentes y funcionales que proporcionen perfusión adecuada al tejido isquémico. Estos hallazgos, junto con el hecho de que 35 múltiples RTK participan en el montaje de la vasculatura embrionaria, indican que las dianas bioquímicas que modulan múltiples vías angiogénicas tendrán ventajas frente a la administración de un solo factor de crecimiento.

Las proteínas tirosina fosfatasas (PTP) comprenden una gran familia de enzimas estrechamente relacionadas que desfosforilan proteínas que contienen restos de fosfotirosina. Las recientes evidencias sugieren que una función de las PTP es limitar la fosforilación y la activación de las RTK. Por ejemplo, se demostró que HCPTPA, una proteína 40 tirosina fosfatasa de bajo peso molecular, se asocia con VEGFR2 y regula negativamente su activación en células endoteliales cultivadas y su actividad biológica en ensayos de angiogénesis (Huang et al., Journal of Biological Chemistry, 274, 38183- 38185, 1999).

Además de VEGFR2, la entrada de señalización de otra RTK, Tie-2, el receptor de las angiopoyetinas (Ang1 y Ang2), también es importante. La eliminación del gen Ang1 o Tie-2 en ratones puede producir letalidad embrionaria 45 secundaria a anomalías en la vasculatura en desarrollo (Yancopoulos et al., Nature, 407, 242-248, 2000). Además, la sobreexpresión de Ang1 en la piel aumenta la vascularización cutánea y la administración de Ang1 exógeno aumenta el flujo sanguíneo al músculo esquelético isquémico (Surf et al., Science, 282, 468-471, 1998). Además, la inhibición de la activación de Tie-2 inhibe la angiogénesis y limita la progresión tumoral en modelos animales de cáncer (Lin et al., J Clin. Invest., 100, 2072-2078, 1997). Además de sus actividades angiogénicas, la activación de 50 Tie-2 mediante administración exógena de Ang1 bloquea el flujo vascular mediado por VEGF y produce efectos proinflamatorios, pero aumenta sus efectos angiogénicos (Thurston et al., Nature Medicine, 6, 460-463, 2000). Por lo tanto, las dianas biológicas que modulan la señalización tanto de VEGFR2 como de Tie-2 pueden producir terapias proangiogénicas o antiangiogénicas superiores.

Se ha sugerido la HPTPbeta (descrita por primera vez en Kruegar et al., EMBO J., 9, (1990)) para modular la 55 actividad de la tirosina quinasa Tie-2 de tipo receptor de angiopoyetina, p. ej., documento WO 00/65085). También se sugiere HPTPbeta para regular las actividades de VEGFR2, p. ej., la publicación de patente de EE.UU. n.º 2004/0077065.

Sería deseable desarrollar anticuerpos, p. ej., un anticuerpo monoclonal humanizado, que regularan selectivamente la actividad de HPTPbeta y, de este modo, realizaran la señalización angiogénica, estimularan el crecimiento de los vasos sanguíneos (angiogénesis) y/o aumentaran el flujo sanguíneo en tejido isquémico o redujeran la señalización angiogénica, redujeran el crecimiento de los vasos sanguíneos y/o disminuyeran el flujo sanguíneo al tejido afectado. En la presente memoria, se describen anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a HPTPbeta y regulan la 5 señalización celular angiogénica que, a su vez, regula la angiogénesis.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana HPTPbeta y, por lo tanto, regulan la señalización celular angiogénica que, a su vez, regula la angiogénesis.

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 1 o a un fragmento de unión al 10 antígeno aislado de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 5. El anticuerpo y el fragmento de unión al antígeno se unen a la proteína fosfatasa tirosina beta humana, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo regula la señalización celular angiogénica que, a su vez, regula la angiogénesis.

La invención se refiere a un anticuerpo o a un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une a la primera repetición FN3 de la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde la primera repetición FN3 de la 15 proteína tirosina fosfatasa beta humana tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.

En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal R15E6 (hibridoma de ratón, células de bazo Balbc (linfocitos B) depositadas en la colección americana de cultivos tipo (ATCC), código postal 1549, Manassas, VA 20108 EE.UU., 4 de mayo de 2006, n.º de cesión de la ATCC PTA-7580). 20

En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno está humanizado.

En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende residuos de la región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal R15E6 y está humanizado.

En otra realización, la invención se refiere a un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal, en donde el fragmento comprende regiones variables de cadena pesada y ligera. 25

La invención se refiere a un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal, en donde el fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab.

También se describen en la presente memoria métodos de tratamiento de un trastorno regulado por la angiogénesis en un sujeto, que comprenden: identificar un sujeto que necesita la regulación de la angiogénesis; y administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a HPTPbeta y 30 regula la angiogénesis.

También se describen métodos de tratamiento de un trastorno regulado por la angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno elevado por angiogénesis, y se selecciona del grupo que consiste en retinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, anemia de células falciformes, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la 35 carótida, uveítis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso sistémico, retinopatía de la prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones causantes de retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Best, miopía, fosas ópticas, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de retina, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones posteriores al láser y a traumatismo, enfermedades asociadas con la rubeosis y vitreorretinopatía proliferativa. 40

También se describen métodos de tratamiento de un trastorno regulado por la angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno elevado por angiogénesis y se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, retinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, artritis reumatoide, hemangiomas, enfermedad de Osier-Weber-Rendu o telangiectasia hemorrágica hereditaria, y tumores sólidos o de transmisión sanguínea. 45

También se describen métodos de un trastorno regulado por la angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno elevado por angiogénesis, y se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inflamatorias intestinales tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, soriasis, sarcoidosis, artritis reumatoide, hemangiomas, enfermedad de Osier-Weber-Rendu o telangiectasia hemorrágica hereditaria, tumores sólidos o de transmisión sanguínea, y síndrome de inmunodeficiencia adquirida. 50

También se describen métodos de tratamiento de un trastorno regulado por la angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno reducido por angiogénesis, y se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, isquemia de músculo esquelético o isquemia miocárdica, apoplejía, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad vascular periférica, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cerebrovascular, neuropatía diabética y cicatrización de heridas. 55

También se describen métodos de tratamiento de un trastorno regulado por la angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno reducido por angiogénesis, y se selecciona del grupo que consiste en isquemia de músculo esquelético o isquemia miocárdica, apoplejía, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad vascular periférica, enfermedad de las arterias coronarias.

También se describen métodos de tratamiento de un trastorno reducido por angiogénesis en un sujeto, en donde el 5 trastorno reducido por angiogénesis es enfermedad vascular periférica.

También se describen métodos de tratamiento de un trastorno reducido por angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno reducido por angiogénesis es enfermedad de las arterias coronarias.

También se describen en la presente memoria composiciones farmacéuticas que comprenden: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana; y un vehículo farmacéuticamente 10 aceptable.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal R15E6; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden: un anticuerpo o un fragmento del mismo que 15 se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene las mismas, o esencialmente las mismas, características biológicas de R15E6; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno está 20 humanizado; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo comprende residuos de la región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal R15E6 y está humanizado; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras 25

Figura 1. Diseño y producción de la proteína del ECD de HPTPβ. (Panel A) Representación esquemática de HPTPβ de longitud completa y de la proteína de fusión del dominio extracelular de HPTPβ-6His. (Panel B) La tinción con plata de Imidazol se eluye de una columna de Ni-NTA cargada con sobrenadante de células HEK293 transfectadas con un vector que dirige la expresión de βECD-6His. Se detecta una sola banda de alto peso molecular que coincide con la proteína del dominio extracelular de HPTPβ-6His. 30

Figura 2. R15E6 reconoce HPTPβ endógena en células endoteliales. (Panel A) Los lisados de células endoteliales se inmunoprecipitan con un anticuerpo de control (Carril 1), con R15E6 (Carril 2) o con una mezcla de anticuerpos anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (Carril 3). Los inmunoprecipitados se resuelven mediante SDS-PAGE, se transfieren a una membrana de PVD y se sondan mediante transferencia Western con una mezcla de anticuerpos R15E6, anti-Tie2 y anti-VEGFR2. Se observa una sola banda principal de alto peso molecular que coincide con HPTPβ con R15E6 35 (Carril 2) y no con el anticuerpo de control (Carril 1) ni la mezcla de anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (Carril 3). (Panel B) Las células endoteliales se someten a análisis FACS con R15E6 (pico blanco) o un control de anticuerpo no primario (pico negro). El cambio robusto en la fluorescencia indica que R15E6 se une a HPTPβ en la superficie de las células endoteliales intactas.

Figura 3. R15E6 mejora la activación del receptor de Tie2 en células HUVEC. La activación de Tie2 se mide en 40 células endoteliales humanas como se describe en el Ejemplo 4. R15E6 aumenta de forma dependiente de la dosis la activación de Tie2 basal e inducida por Ang1.

Figura 4. R15E6 mejora la supervivencia de HUVEC. La supervivencia de células endoteliales humanas privadas de suero se mide como se describe en el Ejemplo 4. En consonancia con sus efectos sobre la activación de Tie2, R15E6 aumenta de forma dependiente de la dosis la supervivencia de las células endoteliales tanto basal como 45 inducida por Ang1 (Panel A). Además, R15E6 también aumenta de forma dependiente de la dosis la supervivencia de las células endoteliales mediada por VEGF y por FGF (Paneles B y C). Un anticuerpo de control no mejora la supervivencia de las células endoteliales (Panel D).

Figura 5. R15E6 mejora la migración de HUVEC. La migración de células endoteliales humanas se mide como se describe en el Ejemplo 4. R15E6 aumenta de forma dependiente la migración de las células endoteliales tanto basal 50 como inducida por VEGF.

Figura 6. R15E6 mejora la morfogénesis capilar en el ensayo de crecimiento de HUVEC/perlas. La morfogénesis capilar de las células endoteliales humanas se mide en el ensayo de crecimiento en perlas como se describe en el Ejemplo 4. R15E6 mejora la morfogénesis capilar de las células endoteliales tanto basal como inducida por VEGF.

Figura 7. El análisis de transferencia Western localiza el epítopo de unión a R15E6 en la repetición FN3 N-terminal del dominio extracelular de HPTPβ. (Panel A) Mediante análisis Western, R15E6 se une a todos los mutantes de truncamiento C-terminales demostrando que el epítopo de unión está situado en las 2 repeticiones FN3 N-terminales. (Panel B) El análisis de proteínas quiméricas de ratón/humanas localiza además el epítopo de unión a R15E6 en la repetición FN3 N-terminal de HPTPβ. 5

Figura 8. El análisis de MSD confirma la ubicación del epítopo de unión a R15E6 en la repetición FN3 N-terminal del dominio extracelular de HPTPβ. (Panel A) Mediante análisis de MSD, R15E6 se une a todos los mutantes de truncamiento C-terminales confirmando que el epítopo de unión está situado en las 2 repeticiones FN3 N-terminales. (Panel B) El análisis de proteínas quiméricas de ratón/humanas localiza además el epítopo de unión a R15E6 en la repetición FN3 N-terminal de HPTPβ. 10

Figura 9. El análisis de MSD demuestra que el fragmento Fab de R15E6 monovalente también se une a la repetición FN3 N-terminal de HPTPβ. (Panel A) Al igual que el anticuerpo R15E6 intacto, el fragmento Fab de R15E6 se une a todos los mutantes de truncamiento C-terminales, confirmando que el epítopo de unión está situado en las 2 repeticiones FN3 N-terminales. (Panel B) El análisis de proteínas quiméricas de ratón/humanas localiza además el epítopo de unión del fragmento Fab de R15E6 en la repetición FN3 N-terminal de HPTPβ. 15

Figura 10. El fragmento Fab de R15E6 monovalente no mejora la activación de Tie2 y bloquea la activación de Tie2 por el R15E6 intacto.

Figura 11. El fragmento Fab de R15E6 inhibe potentemente la supervivencia de las células endoteliales. (Panel A) En comparación con un fragmento Fab de control, el fragmento Fab de R15E6 inhibe potentemente la supervivencia de las células endoteliales. (Panel B) El efecto inhibidor del fragmento Fab de R15E6 se rescata por la competencia 20 con el R15E6 intacto.

Figura 12. El fragmento Fab de R15E6 inhibe la migración de las células endoteliales mediada por VEGF.

Descripción del listado de secuencias

En la Tabla I, se muestran cada una de las secuencias de nucleótidos y de proteínas de la lista de secuencias, junto con el correspondiente número de acceso de Genbank o Derwent, según proceda, y las especies de las que derivan. 25

Tabla I

Descripción de la secuencia

SEQ ID NO: Nucleótido, Proteína Especie N.º de acceso del Genbank equivalente

Dominio extracelular de HPTPbeta con marcador de His y Gly

1, 2 Homo Sapiens

Dominio extracelular de HPTPbeta de longitud completa

3 Homo Sapiens X54131 NM_002837

1/2 (AA1-730, 8 FN3) 775 aa

4 Homo Sapiens

1/4 (AA1-376, 4 FN3) 421 aa

5 Homo Sapiens

1/8 (AA1-202, 2 FN3) 247 aa

6 Homo Sapiens

ECD1 de longitud completa de ratón 632 aa

7 Mus musculus NM_029928

Primera FN3 humana-1/2 de ratón

8 Quimera humana-de ratón

Segunda FN3 humana-1/2 de ratón

9 Quimera humana-de ratón

Dos primeras FN3 humanas-1/2 de ratón

10 Quimera humana-de ratón

FN3 humana, primera repetición

11 Homo sapiens

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a HPTPbeta y a usos de los mismos.

Se pueden usar técnicas convencionales para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo y la transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden realizarse según las especificaciones del fabricante o como se realizan comúnmente en la 5 técnica o como se describe en la presente memoria. En general, las técnicas y los procedimientos se realizan según métodos convencionales conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, la química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica que se describen en la 10 presente memoria son los que se conocen y se usan comúnmente en la técnica. Las técnicas convencionales se pueden usar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéuticas, y tratamiento de pacientes.

Se entenderá que los siguientes términos y expresiones, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados: 15

"Proteína" se usa en la presente memoria indistintamente con péptido y polipéptido. HPTPbeta es la proteína tirosina fosfatasa humana como se definió en el listado de secuencias. En algunas de las realizaciones, se usan diversos fragmentos de HPTPbeta. Los homólogos, ortólogos, fragmentos, variantes y mutantes de la proteína y del gen HPTPbeta, como se describe más adelante, se consideran dentro del alcance del término "HPTPbeta".

Por "fragmento" se entiende una parte de la secuencia de nucleótidos o proteínas. Los fragmentos pueden conservar 20 la actividad biológica de la proteína nativa. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos también son útiles como sondas de hibridación y cebadores o para regular la expresión de un gen, p. ej., antisentido, ARNip o micro ARN. Una parte biológicamente activa puede prepararse mediante el aislamiento de una parte de una de las secuencias de nucleótidos de la invención, la expresión de la parte codificada (p. ej., mediante expresión recombinante in vitro) y la evaluación de la actividad de la proteína codificada. 25

Un experto en la técnica también reconocería que pueden ser útiles genes y proteínas de especies distintas de las enumeradas en el listado de secuencias, en particular, especies de vertebrados. Dichas especies incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, cerdos, cabras, vacas, monos, chimpancés, ovejas, hámster y pez cebra. Un experto en la técnica reconocerá además que mediante el uso de sondas de las secuencias de especies conocidas, se podrían obtener secuencias de ADNc o secuencias genómicas homólogas a la secuencia 30 conocida de la misma o de especies alternativas mediante métodos de clonación conocidos. Dichos homólogos y ortólogos se contemplan como útiles en la práctica de la invención.

Por "variantes" se entiende secuencias similares. Por ejemplo, las variantes conservativas pueden incluir aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de la invención. Se pueden identificar variantes alélicas naturales y variantes de corte y empalme con el 35 uso de técnicas conocidas, p. ej., con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y técnicas de hibridación. Para aislar ortólogos y homólogos, en general, se utilizan condiciones de hibridación rigurosas, dictadas por secuencias, longitud de secuencia, contenido de guanina + citosina (GC) y otros parámetros específicos. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, p. ej., las derivadas usando mutagénesis dirigida. Las variantes pueden 40 contener secuencias adicionales del locus genómico solo o en combinación con otras secuencias. Las variantes pueden contener secuencias adicionales del locus genómico solo o en combinación con otras secuencias.

Las moléculas de la invención también incluyen proteínas truncadas y/o mutadas en donde las regiones de la proteína no requeridas para la unión al ligando o la señalización se han eliminado o modificado. De manera similar, se pueden mutar o modificar sus actividades de unión al ligando o señalización. Dichas mutaciones pueden implicar 45 mutaciones no conservativas, eliminaciones o adiciones de aminoácidos o dominios proteicos. Las proteínas variantes pueden conservar o no la actividad biológica. Dichas variantes pueden proceder, p. ej., del polimorfismo genético o de la manipulación humana.

También se contemplan en la presente memoria proteínas de fusión. Usando métodos conocidos, un experto en la técnica sería capaz de fabricar proteínas de fusión de las proteínas de la invención; que, aunque diferentes de la 50 forma nativa, pueden ser útiles. Por ejemplo, la pareja de fusión puede ser una secuencia polipeptídica de señal (o líder) que dirija junto con la traducción o después de la traducción la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a otro sitio (p. ej., el líder del factor alfa de levadura). Como alternativa, puede añadirse para facilitar la purificación o la identificación de la proteína de la invención (p. ej., poli-His, péptido Flag o proteínas fluorescentes).

El término “antígeno” se refiere a una molécula o a una parte de una molécula capaz de unirse mediante un agente 55 de unión selectiva, tal como un anticuerpo, y además es capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante antigénico, preferiblemente un determinante polipeptídico, capaz de realizar la unión específica a una inmunoglobulina o a un receptor de linfocitos T. En ciertas realizaciones, los determinantes de epítopos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas tales como aminoácidos, azúcares, lípidos, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que 5 es unida por un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferiblemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. También se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando presenta mayor afinidad hacia el antígeno que otras moléculas relacionadas y/o no relacionadas.

El término "anticuerpo" (Ab), como se emplea en la presente memoria, incluye anticuerpos monoclonales, 10 anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), anticuerpos monocatenarios, p. ej., anticuerpos de llama y camello, fragmentos de anticuerpo, p. ej., regiones variables y/o fragmentos de regiones constantes, siempre que presenten una actividad biológica deseada, p. ej., actividad de unión al antígeno. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con "anticuerpo" en la presente memoria.

Un "anticuerpo aislado" es aquel que ha sido identificado y/o separado y/o recuperado de su entorno natural. 15

La unidad básica de anticuerpo de cuatro cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J y contienen, por tanto, 10 sitios de unión al antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar conjuntos polivalentes que comprenden de 2 a 5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de 20 las IgG, la unidad de cuatro cadenas, en general, es de aproximadamente 150 kilo Dalton (kDa). Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena H tiene en el extremo N, un dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas α y γ, y cuatro dominios CH para los isotipos 25 µ y ε. Cada cadena L tiene en el extremo N, un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL está alineado con el VH, y el CL está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Se cree que determinados restos de aminoácidos forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. El emparejamiento de un VH y VL juntos forma un solo sitio de unión al antígeno. Para consultar la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, p. ej., “Basic 30 and Clinical Immunology”, 8ª edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, 1994, página 71 y capítulo 6.

Se puede asignar la cadena L de cualquier especie de vertebrado a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las 35 inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas α, δ, ε, γ y μ, respectivamente. Las clases γ y α se dividen además en subclases basándose en las diferencias relativamente menores en la secuencia y la función de CH, p. ej., los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

Los miembros de la familia Camelidae, p. ej., llama, camello y dromedarios, contienen un tipo único de anticuerpo, 40 que carecen de cadenas ligeras y carecen además del dominio CH1 (Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol., 74, 277-302 (2001)). La región variable de estos anticuerpos de cadena pesada se denominan VHH o VHH, y constituyen el fragmento de unión al antígeno intacto disponible más pequeño (15 kDa) derivado de una inmunoglobulina funcional.

El término “variable” se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en 45 secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión al antígeno y define la especificidad de un determinado anticuerpo hacia su antígeno. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominados regiones marco conservadas (FR) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables", que tienen cada una de 9 a 12 aminoácidos 50 de longitud. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuración de lámina β, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina β. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Los dominios constantes no 55 participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

La expresión “región hipervariable” cuando se usa en la presente memoria se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable, en general, comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (p. ej., alrededor de 60

aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente 1-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable".

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que 5 comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo epítopo, es decir, un solo determinante antigénico. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminarse con otros anticuerpos. El adjetivo "monoclonal" no debe interpretarse 10 como que es necesario que la producción del anticuerpo se realice mediante algún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridomas o pueden prepararse usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales o vegetales eucariotas (véase, p. ej., la patente de EE.UU. n.º 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos fágicos, usando las técnicas disponibles, p. ej., Clackson et al., 15 Nature, 352:624-628 (1991).

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una determinada especie o que pertenecen a una determinada clase o subclase de anticuerpos, mientras que el resto de la/s cadena/s son idénticas u homólogas a secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra 20 especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (véase la patente de EE.UU. n.º 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81, 6851-6855 (1984)).

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una parte de un anticuerpo multimérico, preferiblemente la región de unión al antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', 25 F(ab')2, dímeros y trímeros de conjugados de Fab, Fv, scFv, minicuerpos; dia-, tria- y tetracuerpos; anticuerpos lineales (véase Hudson et al, Nature Med. 9, 129-134 (2003)).

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión al antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de una cadena pesada y una cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles de cada 30 una de las cadenas H y L) que aportan los restos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que solo comprende tres CDR específicas de un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno y, por lo tanto, se incluyen en la definición de Fv.

"Fv monocatenario" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los 35 dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una sola cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.

Los términos "dia-, tria- y tetracuerpos" se refieren a pequeños fragmentos de anticuerpo preparados mediante la construcción de fragmentos sFv con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 restos) entre los dominios VH y VL, 40 de manera que se obtiene el apareamiento entre cadenas, pero no dentro de las cadenas, de los dominios V, dando lugar a un fragmento multivalente.

La expresión “anticuerpo humanizado” o “anticuerpo humano” se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y ligera procedentes de una especie no humana (p. ej., un ratón), pero en los que se ha alterado al menos una parte de la secuencia de VH y/o VL para que sea más de " tipo humano", es 45 decir, más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en el que las secuencias CDR humanas se introducen en secuencias de VH y VL no humanas para reemplazar las correspondientes secuencias de CDR no humanas. Los medios para preparar anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados son conocidos por los expertos en la técnica (véase, p. ej., las patentes de EE.UU. n.º 4.816.567 y 5.225.539). Un método de preparación de anticuerpos humanos emplea 50 el uso de animales transgénicos tales como un ratón transgénico. Estos animales transgénicos contienen una parte sustancial del genoma productor de anticuerpos humanos insertado en su propio genoma, y la producción de los anticuerpos endógenos del propio animal se hace deficiente en la producción de anticuerpos. Los métodos de fabricación de dichos animales transgénicos son conocidos en la técnica. Dichos animales transgénicos pueden fabricarse usando la tecnología XenoMouseR™ o usando un enfoque de "minilocus". Los métodos de fabricación de 55 XenoMouseR™ se describen en las patentes de EE.UU. n.º 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598 y 6.075.181. Los métodos de fabricación de animales transgénicos usando el enfoque de "minilocus" se describen en las patentes de EE.UU. n.º 5.545.807, 5.545.806 y 5.625.825, y en el documento WO 93/12227.

La humanización de un anticuerpo no humano se ha vuelto rutinaria en los últimos años, y ahora está dentro del conocimiento de un experto en la técnica. Varias compañías proporcionan servicios de fabricación de un anticuerpo 60

humanizado, p. ej., Xoma, Aries, Medarex, PDL y Cambridge Antibody Technologies. Los protocolos de humanización se describen ampliamente en la literatura técnica, p. ej., Kipriyanov y Le Gall, Molecular Biotechnol, Vol. 26, pág. 39-60 (2004), Humana Press, Totowa, NJ; Lo, Methods Mol. Biol., Vol. 248, pág. 135-159 (2004), Humana Press, Totowa, NJ; Wu et al, J. Mol. Biol. 294, 151-162 (1999).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden expresarse en líneas celulares distintas de 5 las líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden usarse para la transformación de una célula hospedadora de mamífero adecuada mediante métodos conocidos para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, p. ej., el empaquetado del polinucleótido en un virus (o en un vector vírico) y la transducción de una célula hospedadora con el virus (o vector), o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ilustra en las patentes de EE.UU. n.º 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 10 y 4.959.455. El procedimiento de transformación usado puede depender del hospedador que se vaya a transformar. Los métodos de introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son conocidos en la técnica e incluyen; pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del/de los polinucleótido/s en liposomas, mezcla de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente y microinyección directa del ADN en 15 núcleos.

Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada, una región variable de cadena pesada, una región constante de cadena ligera o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo, o un fragmento del mismo en una combinación adecuada si se desea, se inserta en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligación convencionales. La región constante de cadena 20 pesada o de cadena ligera del anticuerpo se puede añadir al extremo C de la región variable apropiada y se liga en un vector de expresión. El vector normalmente se selecciona para que sea funcional en la célula hospedadora empleada en particular (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora de manera que pueda producirse la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Para una revisión de los vectores de expresión, véase Methods Enzymol. vol. 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press. 25

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención se unen a HPTPbeta y regulan la angiogénesis. Como se definió anteriormente, el término anticuerpo se usa para denotar un fragmento de unión al antígeno. Los usos de dichos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno se describen mejor a continuación.

Ensayos de selección usando modelos in vitro e in vivo de angiogénesis

Los anticuerpos de la invención se pueden seleccionar en ensayos de angiogénesis que son conocidos en la 30 técnica. Dichos ensayos incluyen ensayos in vitro, que miden los sustitutos del crecimiento de los vasos sanguíneos en células cultivadas o la formación de estructuras vasculares a partir de explantes tisulares, y ensayos in vivo, que miden el crecimiento de los vasos sanguíneos directa o indirectamente (Auerbach, R., et al. (2003). Clin Chem 49, 32-40, Vailhe, B., et al. (2001). Lab Invest 81, 439-452).

Modelos de angiogénesis in vitro 35

La mayoría de estos ensayos emplean células endoteliales cultivadas o explantes de tejido, y miden el efecto de agentes sobre respuestas de células "angiogénicas" o sobre la formación de estructuras de tipo capilar sanguíneo. Los ejemplos de ensayos de angiogénesis in vitro incluyen, pero no se limitan a, migración y proliferación de células endoteliales, formación de tubos capilares, crecimiento endotelial, el ensayo de explante de anillo aórtico y el ensayo de arco aórtico de pollo. 40

Modelos de angiogénesis in vivo

En estos ensayos, los agentes o anticuerpos se administran local o sistémicamente en presencia o ausencia de factores de crecimiento (es decir, VEGF o angiopoyetina 1) y se mide el crecimiento de los nuevos vasos sanguíneos mediante la observación directa o midiendo un marcador sustituto tal como el contenido de hemoglobina o un indicador fluorescente. Los ejemplos de angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, ensayo de membrana 45 corioalantoica de pollo, ensayo de angiogénesis corneal y ensayo de tapón MATRIGEL™.

Tratamiento de los trastornos regulados por la angiogénesis

El término "regular" se define como en sus significados aceptados que aparecen en los diccionarios. Por lo tanto, el significado del término "regular" incluye, pero no se limita a, regular positiva o negativamente, fijar, ordenar o uniformizar, gobernar o dirigir mediante diversos medios. En un ejemplo, se puede usar un anticuerpo en un método 50 para el tratamiento de un "trastorno elevado por angiogénesis" o "trastorno reducido por angiogénesis". Como se emplea en la presente memoria, un "trastorno elevado por angiogénesis" es aquel que implica angiogénesis no deseada o elevada en la manifestación biológica de la enfermedad, del trastorno y/o de la afección; en la cascada biológica que conduce al trastorno; o como un síntoma del trastorno. De igual manera, el "trastorno reducido por angiogénesis" es aquel que implica angiogénesis deseada o reducida en las manifestaciones biológicas. Esta 55 "implicación" de la angiogénesis en un trastorno elevado/reducido por angiogénesis incluye, pero no se limita a, las siguientes:

(1) La angiogénesis como "causa" del trastorno o de la manifestación biológica, si el nivel de angiogénesis se eleva o reduce genéticamente, por infección, por autoinmunidad, traumatismo, causas biomecánicas, estilo de vida o por otras causas.

(2) La angiogénesis como parte de la manifestación observable de la enfermedad o del trastorno. Es decir, la enfermedad o el trastorno se puede medir en términos del aumento o de la reducción de la angiogénesis. Desde 5 un punto de vista clínico, la angiogénesis indica la enfermedad; sin embargo, la angiogénesis no necesita ser el "sello distintivo" de la enfermedad o del trastorno.

(3) La angiogénesis es parte de la cascada bioquímica o celular que produce la enfermedad o el trastorno. En este sentido, la regulación de la angiogénesis puede interrumpir la cascada, y puede controlar la enfermedad. Los ejemplos no limitantes de trastornos regulados por la angiogénesis que pueden tratarse mediante la presente 10 invención se describen más adelante en la presente memoria.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades asociadas con la neovascularización retiniana/coroidea que incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, anemia de células falciformes, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la carótida, uveítis/vitritis crónica, infecciones 15 micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso sistémico, retinopatía de la prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones causantes de retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Best, miopía, fosas ópticas, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de retina, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, y complicaciones posteriores al láser y a traumatismo. Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con la rubeosis (neovascularización del iris) y 20 enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso incluyendo todas las formas de vitreorretinopatía proliferativa, asociadas o no a la diabetes.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades asociadas con la inflamación crónica. Las enfermedades con síntomas de inflamación crónica incluyen enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, soriasis, sarcoidosis y artritis reumatoide. La angiogénesis es un 25 elemento clave que estas enfermedades inflamatorias crónicas tienen en común. La inflamación crónica depende de la formación continua de crecimientos capilares para mantener un flujo de entrada de células inflamatorias. El flujo de entrada y la presencia de las células inflamatorias producen granulomas y, por lo tanto, mantienen el estado inflamatorio crónico. La inhibición de la angiogénesis por las composiciones y los métodos de la presente invención evitaría la formación de granulomas y aliviaría la enfermedad. 30

La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se caracterizan por la inflamación crónica y la angiogénesis en diversos sitios del tracto gastrointestinal. La enfermedad de Crohn se caracteriza por una inflamación granulomatosa crónica en todo el tracto gastrointestinal, que consiste en nuevos crecimientos de capilares rodeados por un cilindro de células inflamatorias. La prevención de la angiogénesis inhibe la formación de los crecimientos e impide la formación de granulomas. La enfermedad de Crohn se presenta como una enfermedad inflamatoria transmural crónica que 35 afecta más comúnmente al íleon distal y al colon, pero también puede presentarse en cualquier parte del tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano y el área perianal. En general, los pacientes con enfermedad de Crohn tienen diarrea crónica asociada con dolor abdominal, fiebre, anorexia, pérdida de peso e hinchazón abdominal. La colitis ulcerosa es también una enfermedad crónica, inespecífica, inflamatoria y ulcerosa que se origina en la mucosa colónica y se caracteriza por la presencia de diarrea sanguinolenta. 40

Las enfermedades inflamatorias intestinales también muestran manifestaciones extraintestinales tales como lesiones cutáneas. Dichas lesiones se caracterizan por inflamación y angiogénesis, y pueden presentarse en muchos sitios distintos del tracto gastrointestinal. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser capaces de tratar estas lesiones previniendo la angiogénesis, reduciendo así el flujo de entrada de células inflamatorias y la formación de lesiones. 45

La sarcoidosis es otra enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por ser un trastorno granulomatoso multisistémico. Los granulomas de esta enfermedad pueden formarse en cualquier parte del cuerpo y, por lo tanto, los síntomas dependen del sitio de los granulomas y de si la enfermedad se activa. Los granulomas son creados por los crecimientos de capilares angiogénicos, proporcionando un suministro constante de células inflamatorias.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden tratar las afecciones inflamatorias crónicas asociadas con 50 la soriasis. La soriasis, una enfermedad de la piel, es otra enfermedad crónica y recurrente que se caracteriza por pápulas y placas de diversos tamaños. La prevención de la formación de los nuevos vasos sanguíneos necesarios para mantener las lesiones características conduce al alivio de los síntomas.

La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la inflamación inespecífica de las articulaciones periféricas. Se cree que los vasos sanguíneos del revestimiento sinovial de las articulaciones sufren 55 angiogénesis. Además de formar nuevas redes vasculares, las células endoteliales liberan factores y especies reactivas del oxígeno que conducen al crecimiento del pannus y a la destrucción del cartílago. Los factores implicados en la angiogénesis pueden contribuir activamente al, y ayudar a mantener el, estado crónicamente inflamado de la artritis reumatoide. Otras enfermedades que se pueden tratar según la presente invención son

hemangiomas, enfermedad de Osier-Weber-Rendu, telangiectasia hemorrágica hereditaria, tumores sólidos o transmitidos por sangre y síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar para tratar un "trastorno reducido por angiogénesis". Como se emplea en la presente memoria, un "trastorno reducido por angiogénesis" es aquel que la angiogénesis se consideraría beneficiosa para tratar una enfermedad, un trastorno y/o una afección. El trastorno se 5 caracteriza por tejido que sufre o corre el riesgo de sufrir daño isquémico, infección y/o mala cicatrización, que se produce cuando el tejido se ve privado de un suministro adecuado de sangre oxigenada debido a una circulación inadecuada. Como se emplea en la presente memoria, se usa "tejido" en el sentido más amplio para incluir, pero sin limitación, los siguientes: tejido cardíaco tal como miocardio y ventrículos cardíacos; tejido eréctil; músculo esquelético; tejido neurológico tal como del cerebelo; órganos internos tales como el cerebro, el corazón, el 10 páncreas, el hígado, el bazo y los pulmones; o zona generalizada del cuerpo tal como miembros enteros, un pie o apéndices distales tales como dedos de las manos o de los pies.

Métodos de vascularización del tejido isquémico

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en un método de vascularización de tejido isquémico. Como se emplea en la presente memoria, "tejido isquémico" significa tejido que está privado de un flujo sanguíneo 15 adecuado. Los ejemplos de tejido isquémico incluyen, pero no se limitan a, tejido que carece de suministro sanguíneo adecuado como consecuencia de infartos miocárdicos y cerebrales, isquemia mesentérica o de extremidad, o el resultado de una oclusión o estenosis vascular. En un ejemplo, la interrupción del suministro de sangre oxigenada puede deberse a una oclusión vascular. Dicha oclusión vascular puede ser causada por arteriosclerosis, traumatismo, procedimientos quirúrgicos, enfermedad y/u otras etiologías. Están disponibles 20 técnicas rutinarias convencionales para determinar si un tejido está en riesgo de sufrir daño isquémico por oclusión vascular no deseada. Por ejemplo, en la enfermedad miocárdica, estos métodos incluyen una variedad de técnicas de formación de imágenes (p. ej., metodologías de radiotrazadores, radiografías y MRI) y pruebas fisiológicas. Por lo tanto, la inducción de la angiogénesis es un medio eficaz para prevenir o atenuar la isquemia en tejidos afectados o en riesgo de ser afectados por una oclusión vascular. Además, se contempla completamente el tratamiento del 25 músculo esquelético y la isquemia miocárdica, apoplejía, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad vascular periférica, enfermedad de las arterias coronarias.

Un experto en la técnica de uso de técnicas convencionales puede medir la vascularización tisular. Los ejemplos no limitantes de medición de la vascularización en un sujeto incluyen SPECT (tomografía computarizada de emisión de un solo fotón); PET (tomografía de emisión de positrones); MRI (formación de imágenes por resonancia magnética); 30 y combinación de las mismas, midiendo el flujo de sangre al tejido antes y después del tratamiento. La angiografía puede usarse como una evaluación de la vascularidad macroscópica. La evaluación histológica puede usarse para cuantificar la vascularización a nivel de los vasos pequeños. Estas y otras técnicas se describen en Simons, et al., “Clinical trials in coronary angiogenesis” Circulation, 102, 73-86 (2000).

Métodos de reparación tisular 35

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en un método de reparación tisular. Como se emplea en la presente memoria, "reparación tisular" significa potenciar la reparación, la regeneración, el crecimiento y/o el mantenimiento del tejido, incluyendo, pero no limitado a, la reparación de heridas o la obtención por ingeniería genética de tejidos. Un experto en la técnica aprecia que se requiere la formación de nuevos vasos sanguíneos para la reparación tisular. A su vez, el tejido puede ser dañado por, incluyendo, pero no limitado a, lesiones o afecciones 40 traumáticas incluyendo artritis, osteoporosis y otros trastornos del esqueleto, y quemaduras. El tejido también puede ser dañado por lesiones debidas a procedimientos quirúrgicos, irradiación, laceración, productos químicos tóxicos, infección vírica o infecciones bacterianas, o quemaduras. El tejido que necesita reparación también incluye heridas no cicatrizantes. Los ejemplos de heridas no cicatrizantes incluyen úlceras cutáneas no cicatrizantes producidas como consecuencia de patología diabética; o fracturas que no se curan fácilmente. 45

Los anticuerpos también se pueden usar en la reparación tisular en el contexto de los procedimientos de regeneración guiada de tejidos (GTR). Dichos procedimientos son usados actualmente por los expertos en la técnica para acelerar la cicatrización de heridas después de procedimientos quirúrgicos invasivos.

Los anticuerpos pueden usarse en un método de potenciación de la reparación tisular caracterizado por un mejor crecimiento de tejido durante el proceso de obtención de tejidos por ingeniería genética. Como se emplea en la 50 presente memoria, "obtención de tejidos por ingeniería genética" se define como la creación, el diseño y la fabricación de dispositivos protésicos biológicos, en combinación con materiales sintéticos o naturales, para el aumento o el reemplazo de tejidos y órganos corporales. Por lo tanto, los presentes métodos pueden usarse para aumentar el diseño y el crecimiento de tejidos humanos fuera del cuerpo para su posterior implantación en la reparación o el reemplazo de tejidos enfermos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser útiles para potenciar el 55 crecimiento de reemplazos de injertos de piel que se usan como terapia en el tratamiento de quemaduras.

En otro ejemplo de obtención de tejidos por ingeniería genética, los anticuerpos de la presente invención pueden incluirse en dispositivos que contienen células o que están exentos de células que inducen la regeneración de tejidos humanos funcionales cuando se implantan en un sitio que requiere regeneración. Como se describió anteriormente,

se puede usar la regeneración de tejido guiada por biomateriales para potenciar el recrecimiento óseo en, por ejemplo, la enfermedad periodontal. Así pues, se pueden usar anticuerpos para potenciar el crecimiento de tejidos reconstituidos ensamblados en configuraciones tridimensionales en el sitio de una herida u otro tejido que necesite dicha reparación.

En otro ejemplo de obtención de tejidos por ingeniería genética, los anticuerpos pueden incluirse en dispositivos 5 externos o internos que contienen tejidos humanos diseñados para reemplazar la función de tejidos internos enfermos. Este enfoque implica aislar las células del cuerpo, colocarlas con matrices estructurales e implantar el nuevo sistema dentro del cuerpo o usar el sistema fuera del cuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden incluir en un injerto vascular revestido con células para potenciar el crecimiento de las células contenidas en el injerto. Se prevé que los métodos de la invención se pueden usar para aumentar la reparación, la regeneración y la obtención 10 por ingeniería genética de tejidos en productos tales como cartílago y hueso, tejidos del sistema nervioso central, músculo, hígado y células de islotes pancreáticos (productoras de insulina).

Formulaciones farmacéuticas y métodos de uso

Los anticuerpos de la invención se pueden administrar a individuos para tratar o prevenir enfermedades o trastornos que estén regulados por genes y proteínas de la invención. El término "tratamiento" se emplea en la presente 15 memoria para referirse a que la administración de un compuesto de la presente invención mitiga una enfermedad o un trastorno en un hospedador. Por lo tanto, el término "tratamiento" incluye, prevenir que se produzca un trastorno en un hospedador, en particular, cuando el hospedador está predispuesto a adquirir la enfermedad, pero aún no ha sido diagnosticado de la enfermedad; inhibir el trastorno; y/o aliviar o revertir el trastorno. En la medida en que los métodos de la presente invención están dirigidos a prevenir trastornos, se entiende que el término "prevenir" no 20 requiere que se impida por completo el estado patológico. (Véase el Noveno Diccionario Colegiado de Webster). En cambio, como se emplea en la presente memoria, el término prevención se refiere a la capacidad del experto en la técnica para identificar una población que sea susceptible a trastornos, de manera que la administración de los compuestos de la presente invención pueda ocurrir antes de que comience una enfermedad. El término no implica que el estado patológico se evite por completo. Los compuestos identificados mediante los métodos de selección de 25 la presente invención se pueden administrar conjuntamente con otros compuestos.

La seguridad y la eficacia terapéutica de los compuestos identificados pueden determinarse mediante procedimientos convencionales usando tecnologías in vitro o in vivo. Se pueden preferir los compuestos que presentan grandes índices terapéuticos, aunque los compuestos con índices terapéuticos inferiores pueden ser útiles si el nivel de efectos secundarios es aceptable. Los datos obtenidos de las técnicas toxicológicas y farmacológicas in 30 vitro e in vivo pueden usarse para formular el intervalo de dosis.

La eficacia de un compuesto puede evaluarse además en modelos animales o en ensayos clínicos de pacientes con angiogénesis no regulada o regulada indebidamente.

Como se emplea en la presente memoria, se entiende que "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y 35 retardantes de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, dichos medios se pueden usar en las composiciones de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios a las composiciones. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de 40 administración deseada. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, p. ej., intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (p. ej., inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol 45 bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. El preparado parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. 50

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, CREMOPHOR EL™ (BASF, Parsippany, N. J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una 55 facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del 60

tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo a la 5 composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida a un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de la esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y el resto de ingredientes 10 requeridos. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente esterilizada del mismo.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera que se ha 15 de atravesar. Dichos agentes penetrantes son conocidos en general en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede realizarse usando pulverizados nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (p. ej., con bases de supositorios 20 convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto frente a la eliminación rápida del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales 25 como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos de preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según los 30 métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. n.º 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. "Forma de unidad de dosificación" como se emplea en la presente memoria se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto 35 que se vaya a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico que debe alcanzarse en particular, y de las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. 40

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Producción de la proteína del dominio extracelular de HPTPβ

Métodos: se clona la HPTPβ de longitud completa desde una biblioteca de placenta humana según las instrucciones del fabricante (Origene). El clon es idéntico a un clon de ADNc previamente publicado (n.º de acceso del Genbank X54131) a excepción de que carece de la repetición FNIII n.º 5. Se clona un ADNc que codifica todo el dominio 45 extracelular soluble (ECD) de HPTPβ mediante PCR a partir del ADNc de longitud completa (véase la secuencia que figura más adelante) que codifica los aminoácidos 1-1534 con una His-His-His-His-His-His-Gly (6His-Gly) C-terminal (SEQ ID NO: 1). Se clona el ADNc resultante en vectores de expresión de mamífero para la expresión transitoria (pShuttle-CMV) o estable (pcDNA3.1 (-)) en células HEK293. Para obtener el ECD de HPTPβ (βECD) purificado, las células HEK293 transfectadas con un vector de expresión de βECD se incuban en OptiMEM sin suero (Gibco) 50 durante 24 horas en condiciones normales de crecimiento. Se recupera el medio acondicionado, se centrifuga para eliminar los residuos (1000 rpm x 5 minutos) y se añade 1 ml de Ni-NTA agarosa lavada (Qiagen) (500 µl de material envasado) a cada 10 ml de medio aclarado y se deja reposar durante la noche a 4 ºC. Al día siguiente, se carga la mezcla en una columna y se lava con 20 volúmenes de lecho de NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8. A continuación, se eluye la proteína de dominio extracelular de HPTPβ purificada (SEQ ID NO: 2) en seis 55 fracciones con 200 μl/elución en NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8. Se analizan las fracciones para determinar el contenido de proteínas usando electroforesis en gel de poliacrilimida SDS reductora-desnaturalizante y se detectan mediante tinción con plata (Invitrogen) y se confirman por espectrometría de masas.

Resultados: para desarrollar un anticuerpo contra el dominio extracelular de HPTPβ, se desarrollan vectores de

expresión que dirigen la expresión de una proteína de dominio extracelular de HPTPβ marcada con 6-His (Figura 1, Panel A). Posteriormente, se purifica la proteína de dominio extracelular de HPTPβ marcada con 6-His hasta casi la homogeneidad (Figura 1, Panel B) del medio acondicionado de células HEK293 transfectadas con el vector de expresión.

Ejemplo 2. Generación de anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de HPTPβ 5

Métodos: para la producción del inmunógeno del dominio extracelular de HPTPβ, se conjuga la proteína de dominio extracelular de HPTPβ-6His purificada con tiroglobulina porcina (Sigma) usando química de acoplamiento de EDC (Hockfield, S. et al, (1993) Cold Spring Habor Laboratory Press. Volumen 1 pág. 111-201, Immunocytochemistry). El conjugado de dominio extracelular de HPTPβ-tiroglobulina resultante se somete a diálisis contra PBS, pH 7,4. A continuación, se inmunizan ratones Balb/c adultos por vía subcutánea con el conjugado (100-200 μg) y adyuvante de 10 Freund completo en una mezcla 1:1. Después de 2-3 semanas, se inyecta a los ratones por vía intraperitoneal o subcutánea adyuvante de Freund incompleto y el conjugado en una mezcla 1:1. La inyección se repite a las 4-6 semanas. Se recogen los sueros de ratones 7 días después de la tercera inyección y se ensayan para determinar la inmunorreactividad hacia el antígeno del dominio extracelular de HPTPβ mediante ELISA y transferencia Western. Los ratones que muestran una buena respuesta al antígeno se refuerzan mediante una sola inyección intra-bazo con 15 50 μl de proteína de dominio extracelular de HPTPβ purificada mezclada 1:1 con hidróxido de Alum usando una aguja extra larga de calibre 31 (Goding, J. W., (1996) “Monoclonal Antibodies: Principles and Practices”. Tercera edición, Academic Press Limited, pág. 145). En resumen, los ratones se anestesian con avertina al 2,5 %, y se crea una incisión de 1 centímetro en la piel y la pared oblicua izquierda del cuerpo. Se administra la mezcla de antígenos insertando la aguja desde la parte posterior a la parte anterior del bazo en una inyección longitudinal. Se sutura la 20 pared del cuerpo y la piel se sella con dos pequeños clips metálicos. Los ratones son controlados para una recuperación segura. Cuatro días después de la cirugía se extrae el bazo del ratón y se preparan suspensiones monocelulares para la fusión con células de mieloma de ratón para la creación de líneas celulares de hibridoma (Spitz, M., (1986) “Methods In Enzymology”, volumen 121. Eds. John J, Lagone and Helen Van Vunakis. pág.33-41 (Academic Press, Nueva York, NY)). Los hibridomas resultantes se cultivan en medio modificado por Dulbeccos 25 (Gibco) suplementado con suero de ternero fetal al 15 % (Hyclone) e hipoxatina, aminopterina y timidina.

La detección de los hibridomas positivos comienza 8 días después de la fusión y continúa durante 15 días. Los hibridomas que producen anticuerpos anti-dominio extracelular de HPTPβ se identifican mediante ELISA en dos conjuntos de placas de 96 pocillos: uno recubierto con el dominio extracelular de HPTPβ marcado con histidina y el otro recubierto con una proteína MurA bacteriana marcada con histidina como control negativo. El anticuerpo 30 secundario es una IgG de asno anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunoresearch). La inmunorreactividad se controla en pocillos usando el desarrollo de color iniciado por comprimidos de ABTS disueltos en tampón TBS, pH 7,5. Las mezclas de reacción de HRP individuales se terminan mediante la adición de 100 microlitros de SDS al 1 % y la lectura de la absorbancia a 405 nm con un espectrofotómetro. Los hibridomas que producen anticuerpos que interactúan con el dominio extracelular de HPTP 35 β-6His, y no con la proteína murA-6His se usan para un análisis posterior. Se realizan dos veces diluciones limitadoras (0,8 células por pocillo) en clones positivos en placas de 96 pocillos, definiéndose la clonalidad como la que tiene más del 99 % de los pocillos con reactividad positiva. Los isotipos de anticuerpos se determinan usando la tecnología iso-strip (Roche). Para obtener el anticuerpo purificado para una evaluación adicional, se purifican los sobrenadantes del cultivo tisular por afinidad usando columnas de proteína A o proteína G. 40

Resultados: se aíslan cinco anticuerpos monoclonales inmunorreactivos hacia la proteína de dominio extracelular de HPTPβ y se les da la siguiente nomenclatura R15E6, R12A7, R3A2, R11C3, R15G2 y R5A8.

El anticuerpo monoclonal R15E6 es depositado en la colección americana de cultivos tipo (ATCC), código postal 1549, Manassas, VA 20108 EE.UU., 4 de mayo de 2006.

Ejemplo 3. R15E6 se une a HPTPβ endógena en células endoteliales humanas 45

A. R15E6 se une a la HPTPβ endógena como se demuestra mediante inmunoprecipitación y transferencia Western

Materiales: células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), medio EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; OPTIMEM I (Gibco), albúmina de suero bovino (BSA, Santa Cruz), solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco), factores de crecimiento incluyendo Angiopoyetina 1 (Ang1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento fibroblástico (FGF) (R&D Systems), anticuerpo monoclonal Tie2 50 (Duke University/P&GP), anticuerpo policlonal contra el receptor VEGF 2 (VEGFR2) (Whitaker et al.), proteína A/G agarosa (Santa Cruz), sistema de electroforesis/transferencia de gel pre-moldeado de Tris-Glicina (6-8 %) (Invitrogen), membranas de PVDF (Invitrogen), tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM, NaCl 137 mM, glicerol al 10 %, triton-X-100 al 1 %, EDTA 2 mM, NaOV 1 mM, NaF 1 mM, PMSF 1 mM, 1 μg/ml de leupeptina, 1 μg/ml de pepstatina). 55

Método: se tratan previamente las HUVEC durante 30 min con anticuerpo (en OPTIMEM) u OPTIMEM I solo. Tras retirar el pretratamiento, se tratan las células con Ang1 (100 ng/ml) durante 6 minutos en PBS + BSA al 0,2 % y se lisan en tampón de lisis. Los lisados se aplican directamente sobre un gel de Tris-Glicina o se inmunoprecipitan con 2-5 μg/ml de anticuerpo Tie-2 o 10 μg/ml de anticuerpo R15E6 y proteína agarosa A/G. Se enjuagan las muestras

inmunoprecipitadas 1 vez con tampón de lisis y se hierven durante 5 min en 1 x tampón de muestra. Se resuelven las muestras en un gel de Tris-Glicina, se transfieren a una membrana de PVDF y se detectan mediante transferencia Western usando los anticuerpos indicados (Ab pTYR (PY99, Santa Cruz), Tie-2, VEGFR2 y/o R15E6).

Resultados: mediante IP/transferencia Western, R15E6 reconoce una banda principal, de alto peso molecular coincidente con el tamaño de HPTPβ (Figura 2; Panel A, Carril 2). Las bandas menos intensas, de menor peso 5 molecular, probablemente representan formas precursoras menos glicosiladas de HPTPβ. Una inmunoprecipitación (IP) con IgG no inmune, de control, no muestra bandas en el intervalo de pesos moleculares de HPTPβ (Figura 2, Panel A, Carril 1) y una IP de Tie2/VEGFR2 combinados muestra bandas del peso molecular esperado (Figura 2, Panel A, Carril 3). Este resultado demuestra que R15E6 reconoce y es específico de HPTPβ.

B. R15E6 se une a la HPTPβ endógena como se demuestra mediante análisis de FACS 10

Materiales: HUVEC, medio EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; Anticuerpo secundario marcado con Alexfluor 488 de Molecular Probes; Solución salina equilibrada de Hanks (Gibco); citómetro de flujo FACSCAN y software CellQuest de Becton Dickenson.

Método: se someten las HUVEC a tripsinización, se tratan con solución neutralizante de tripsina y se enjuagan con HBSS. Se añade anticuerpo R15E6 (0,6 μg) a 250.000 células en 50 μl de HBSS y se incuba en hielo durante 20 15 minutos. Las células se enjuagan con 1 ml de HBSS seguido de la adición de 2 μg de anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia durante 20 minutos en hielo. Se enjuagan las células y se vuelven a suspender en 1 ml de HBSS, y luego se analizan en el citómetro de flujo FACSCAN con el software CellQuest. Las células de control se tratan únicamente con anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia.

Resultados: mediante análisis de FACS, HUVEC intactas, R15E6 causa un potente desplazamiento (> 90 % de las 20 células) en la señal de fluorescencia en comparación con el anticuerpo secundario solo (Figura 2, Panel B). Este resultado indica que R15E6 se une a HPTPβ endógena presentada en la superficie de las células endoteliales intactas.

Ejemplo 4. R15E6 mejora la activación de Tie2 y potencia múltiples respuestas angiogénicas (supervivencia de células endoteliales, migración y morfogénesis capilar) 25

A. R15E6 mejora la fosforilación de Tie2 en ausencia y en presencia de la angiopoyetina 1 (Ang1), el ligando Tie2

Métodos: se cultivan HUVEC en medio libre de suero como se describió anteriormente en presencia o en ausencia de diversas concentraciones de R15E6 y con o sin Ang1 añadida. Se preparan lisados, se inmunoprecipitan con un anticuerpo Tie2, se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfieren a una membrana de PVDF. A continuación, se someten proteínas inmunoprecipitadas unidas a membrana a transferencia Western en 30 serie con un anticuerpo antifosfotirosina para cuantificar la fosforilación de Tie2 seguida por un anticuerpo Tie2 para cuantificar el total de Tie2. La fosforilación de Tie2 se expresa como la proporción de la señal de antifosfotirosina con respecto a la señal total de Tie2.

Resultados: R15E6 mejora la fosforilación de Tie2 tanto en ausencia como en presencia de Ang1 (Figura 3). Este resultado indica que la unión de R15E6 a HPTPβ en la superficie de las células endoteliales modula su función 35 biológica produciendo una mejor activación de Tie2 en ausencia o en presencia de ligando.

B. R15E6 mejora la supervivencia de células endoteliales en ausencia y en presencia de factores de crecimiento endotelial

Materiales: HUVEC, medios EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; DMEM (Cell Gro), BSA deslipidada (BD Falcon), Ensayo de ATP Cell Titer GIo (Promega), factores de crecimiento (Ang1, VEGF 165 y FGF) 40 (R&D Systems), lector de placas Victor V Multilabel (Perkin Elmer Wallac).

Método: Se sembraron HUVEC en placas a 10.000 células/pocillo, se privaron de suero en DMEM/BSA al 0,2 % y se trataron durante 72 h en presencia o ausencia de factor de crecimiento (Ang1, VEGF o FGF) con o sin diversas concentraciones de anticuerpo R15E6. Tras 72 horas, se enjuagan las células con DMEM, y se cuantifican las células supervivientes midiendo los niveles de ATP usando el ensayo de luminiscencia Cell Titer GIo según las 45 instrucciones del fabricante (Promega).

Resultados: de acuerdo con los resultados del ensayo de activación de Tie2, R15E6 aumenta la supervivencia de las células endoteliales en ausencia de factor de crecimiento añadido a concentraciones de entre 0,5 y 5 nM (Figura 4, Panel A). De forma similar, R15E6 aumenta la supervivencia de las células endoteliales mediada por Ang1 (Figura 4, Panel A), así como la supervivencia celular mediada por VEGF y FGF (Figura 4, Paneles B y C). No se observa 50 supervivencia mejorada con un anticuerpo monoclonal de control (Figura 4, Panel D). Estos resultados demuestran que la unión de R15E6 a HPTPβ en la superficie de las células endoteliales mejora la supervivencia de las células endoteliales basales, así como la supervivencia celular mediada por múltiples vías angiogénicas (Ang1, VEGF y FGF).

C. R15E6 mejora la migración de las células endoteliales en ausencia y en presencia de VEGF 55

Materiales: HUVEC, medios EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; EBM libre de rojo fenol (PRF-EBM, Cambrex), BSA deslipidada (BD Falcon), Sistema de migración de células endoteliales BD Falcon Biocoat (BD Falcon), Calceína AM (Molecular Probes); factores de crecimiento (VEGF 165) (R&D Systems), lector de placas Victor V Multilabel (Perkin Elmer Wallac).

Método: Se volvieron a suspender HUVEC en PRF-EBM + BSA al 0,1 % y se sembraron a 50.000 5 células/transpocillo (BD Bioscience, tamaño de poro de 3 μm). El factor de crecimiento/R15E6 se coloca en el pocillo inferior de la cámara de transpocillos y se incuba durante 4-22 h. Las células que migran a través de la membrana se detectan marcando con 4 µg/ml de Calceína AM durante 90 min. La fluorescencia se mide usando un instrumento Victor V (485/535).

Resultados: en consonancia con los resultados del estudio de supervivencia, R15E6 mejora la migración de las 10 células endoteliales tanto basal como mediada por VEGF (Figura 5).

D. R15E6 mejora el crecimiento de células endoteliales y la morfogénesis capilar en ausencia y en presencia de factores de crecimiento endotelial

Materiales: HUVEC y medios EGM de Cambrex; perlas Cytodex y colágeno de tipo I de Sigma; medios PBS y M199 de Dulbecco de Gibco; VEGF de R&D. 15

Método: Se cultivan HUVEC de paso 4 (células 2 x 106) con 5 mg de perlas Cytodex en 10 ml de EGM en placas bacteriológicas tratadas con cultivo no tisular de 100 mm durante 48 horas con vórtice ocasional. Las perlas recubiertas con células se transfieren a un tubo cónico de 50 ml y se vuelven a suspender en 380 µl de D-PBS. Los geles de colágeno se preparan mediante la adición de 71,4 μl de perlas recubiertas con células a 2,8 ml de una solución matricial que consiste en 3 mg/ml de colágeno en medio M199 suplementado con NaOH 0,005 N, HEPES 20 20 mM y NaHCO3 26 mM. Se dispensan trescientos cincuenta microlitros de las perlas en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos y se deja solidificar la matriz durante 1 hora a 37 ºC/CO2 al 5 %. Se añade 1 ml de medio EGM con o sin VEGF (10 ng/ml) o R15E6 (7,5 μg/ml) por pocillo y se devuelve a la incubadora. Después de 48 horas, un observador con ocultación visualiza los crecimientos con un microscopio invertido de contraste de fase, y observa 50 perlas por pocillo, en pocillos por triplicado, para la presencia de crecimientos de células endoteliales. 25 Los resultados se expresan como el número de crecimientos por perla.

Resultados: en consonancia con los resultados de los otros ensayos, R15E6 también mejora la morfogénesis capilar basal y mediada por VEGF en el ensayo de crecimiento de perlas endoteliales (Figura 6).

Ejemplo 5. El epítopo de unión para R15E6 está en la repetición FN3 N-terminal del dominio extracelular de HPTPβ humana 30

A. El análisis de transferencia Western de mutantes de truncamiento C-terminal recombinantes y las proteínas quiméricas de ratón/ser humano muestran que el epítopo de unión a R15E6 está en la repetición FN3 N-terminal del dominio extracelular de HPTPβ

Métodos: se transfectan las células HEK293 con vectores de expresión que codifican el mutante de truncamiento de HPTPβ o la quimera de ratón/ser humano indicados. A continuación, se incuban las células transfectadas en 35 OptiMEM durante 24 horas más, tras lo que se recoge el medio acondicionado que contiene el dominio extracelular de HPTPβ y bien se almacena para su uso futuro o se usa inmediatamente para estudios de transferencia Western o ECL (véase más adelante). Para el análisis de transferencia Western, se resuelven 20 μl de medio acondicionado que contiene la proteína HPTPβ indicada o ninguna proteína recombinante (simulado, vector vacío transfectado) mediante PAGE, se transfiere a una membrana de PVDF y se sonda con R15E6. 40

Resultados: mediante análisis de transferencia Western, R15E6 se une a todos los mutantes de eliminación C-terminal de HPTPβ (Figura 7A), indicando que el epítopo de unión está dentro de las dos primeras repeticiones FN3 N-terminales. R15E6 no se une al dominio extracelular de HPTPβ murina (SEQ ID NO: 7), lo que demuestra especificidad para la proteína humana (Figura 7B, carril 6 frente a carril 2). El reemplazo de la primera o de la primera y la segunda repetición FN3 N-terminal murina por las secuencias humanas restableció la unión de R15E6 45 (Figura 7B, carriles 3 y 5). Por el contrario, el reemplazo de solo la segunda repetición FN3 murina con la secuencia humana no restablece la unión (Figura 7B, carril 4). En conjunto, estos hallazgos localizan el epítopo de unión de R15E6 en la repetición FN3 N-terminal (~100 aminoácidos) de HPTPβ humana.

B. El análisis ECF (electroquimioluminiscente) de mutantes de truncamiento terminal y las proteínas quiméricas de ratón/ser humano confirman que el epítopo de unión a R15E6 está en la repetición FN3 N-terminal del dominio 50 extracelular de HPTPβ

Métodos: Los sobrenadantes que contienen la proteína HPTPβ indicada se recubren en una placa de MSD de 96 pocillos de alta unión (Meso Scale Discovery), se dejan secar y se bloquean con BSA al 3 % durante 1 h. La proteína se incuba luego con el anticuerpo monoclonal R15E6 o el fragmento Fab de R15E6 (10 nM o 1,5 μg/ml) durante 1 h, se enjuaga y se incuba con un anticuerpo anti-ratón de cabra con un marcador MSD-Tag (10 nM) durante 1 h. Se 55 enjuaga el anticuerpo en exceso y se añade tampón de lectura de MSD. Se mide la emisión de luz usando el lector Sector 2400 (MSD). El MSD utiliza la detección electroquimioluminiscente para detectar las uniones en matrices con

patrón. La tecnología de Meso Scale Discovery usa microplacas MULTI-ARRAY™ y MULTI-SPOT™ patentadas con electrodos integrados en la parte inferior de la placa. Los electrodos de MSD están hechos de carbono, y los reactivos biológicos pueden unirse al carbono simplemente por adsorción pasiva y conservar un alto nivel de actividad biológica. Los ensayos de MSD usan marcadores electroquimioluminiscentes para la detección ultrasensible. Estos marcadores electroquimioluminiscentes emiten luz cuando se estimulan electroquímicamente. El 5 proceso de detección se inicia en los electrodos incorporados situados en la parte inferior de las microplacas de MSD y solo se excitan los marcadores que están cerca del electrodo, y la luz se detecta a 620 nm.

Resultados: en consonancia con los estudios de transferencia Western, R15E6 se une a todas las proteínas de truncamiento C-terminal HPTPβ mediante el análisis de MSD (Figura 8A). También coincidiendo con el análisis de transferencia Western, R15E6 no se une al dominio extracelular de HPTPβ murina, pero la unión se restablece 10 mediante la sustitución de la repetición FN3 N-terminal murina con el dominio FN3 N-terminal humano (Figura 8B). Estos datos confirman que el epítopo de unión de R15E6 está en la repetición FN3 N-terminal de HPTPβ humana. Como era de esperar, el epítopo de unión del fragmento Fab de R15E6 monovalente también se podría correlacionar con la repetición FN3 más N-terminal de HPTPβ humana (Figura 9).

Ejemplo 6. Un fragmento Fab de R15E6 monovalente bloquea la activación de Tie2 mediada por R15E6 e inhibe la 15 supervivencia y la migración de las células endoteliales

Métodos: la activación de Tie2, y los ensayos de supervivencia y migración de células endoteliales se realizan como se describió anteriormente en el Ejemplo 4. Los fragmentos Fab de R15E6 monovalentes se preparan como se describió anteriormente. Se somete el R15E6 purificado a diálisis en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, que contiene EDTA 2 mM y ditiotreitol 1 mM. Se activa la papaína (Pierce) a 1-2 mg/ml en el tampón anteriormente mencionado durante 20 15 minutos a 37 ºC. Se incuba R15E6 a 10 mg/ml con papaína en el mismo tampón usando una proporción de enzima:sustrato de 1:100, durante 1 h a 37 ºC. La digestión se termina mediante la adición de yodoacetamida (concentración final de 20 mM), y se mantiene sobre hielo durante 1 h, protegido de la luz. Se somete el material digerido con papaína a diálisis toda la noche contra solución salina tamponada con fosfato, para eliminar la yodoacetamida. Se controla la extensión de la digestión mediante SDS-PAGE con la desaparición de la cadena 25 pesada gamma (PM 55.000 kDa) y la aparición del fragmento Fc de las cadenas gamma (PM 27.000 kDa) y ligera (PM 22.000-25.000 kDa).

Resultados: a diferencia del anticuerpo R15E6 intacto, los fragmentos Fab no mejoran la activación de Tie2 (Figura 10). Además, en presencia de fragmento Fab en exceso, la activación de Tie2 mediada por R15E6 se bloquea (Figura 10). Sorprendentemente, el fragmento Fab de R15E6 inhibe marcadamente la supervivencia de las células 30 endoteliales en comparación con un Fab de control (Figura 11A), y este efecto podría rescatarse mediante la adición de R15E6 intacto (Figura 11B). Coincidiendo con el efecto negativo sobre la supervivencia endotelial, el Fab de R15E6 también bloquea la migración de las células endoteliales mediada por VEGF (Figura 12). Estos hallazgos demuestran que el R15E6 dimérico, intacto, es necesario para mejorar la señalización angiogénica y que el R15E6 monomérico bloquea estas acciones y, en realidad, tiene un efecto negativo sobre las respuestas de las células 35 endoteliales angiogénicas.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo aislado que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTPβ), en donde el anticuerpo aislado es un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo monoclonal comprende dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, en donde dicho anticuerpo aislado regula positivamente la angiogénesis, en donde 5 el anticuerpo aislado se une a la primera repetición FN3 de HPTPβ, en donde la primera repetición FN3 de HPTPβ tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.
2. 2. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, siendo el anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular de hibridoma con n.º de ATCC PTA-7580.
3. 3. El anticuerpo aislado según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo aislado está humanizado. 10
4. 4. El anticuerpo aislado según la reivindicación 1, que comprende regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular de hibridoma con n.º de ATCC PTA-7580 y que está humanizado.
5. 5. Un fragmento de unión al antígeno aislado de un anticuerpo monoclonal que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTPβ), en donde el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal es un fragmento Fab, 15 en donde dicho fragmento de unión al antígeno regula negativamente la angiogénesis, en donde el fragmento de unión al antígeno se une a la primera repetición FN3 de HPTPβ, en donde la primera repetición FN3 de HPTPβ tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11.
6. 6. El fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 5, siendo el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular de hibridoma con n.º de ATCC PTA-7580. 20
7. 7. El fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 5, en donde el fragmento de unión al antígeno está humanizado.
8. 8. El fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 5, comprendiendo el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular de hibridoma con n.º de ATCC PTA-7580 y que está humanizado. 25