ES2644744T3 - Eliminación de agregados de proteína de preparaciones biofarmacéuticas en un modo de flujo continuo - Google Patents

Eliminación de agregados de proteína de preparaciones biofarmacéuticas en un modo de flujo continuo Download PDF

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ES2644744T3
ES2644744T3 ES13275053.0T ES13275053T ES2644744T3 ES 2644744 T3 ES2644744 T3 ES 2644744T3 ES 13275053 T ES13275053 T ES 13275053T ES 2644744 T3 ES2644744 T3 ES 2644744T3
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William Cataldo
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Kevin Galipeau
James Hamzik
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Description

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DESCRIPCION
Eliminacion de agregados de protelna de preparaciones biofarmaceuticas en un modo de flujo continuo Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos para eliminar agregados de protelna de preparaciones biofarmaceuticas que contienen un producto de interes en un modo de flujo continuo.
Antecedentes de la invencion
Los agregados de protelna son impurezas importantes que deben eliminarse de las preparaciones farmaceuticas que contienen un producto de interes, p.ej., una protelna terapeutica o una molecula de anticuerpo. Por ejemplo, es necesario eliminar los agregados de protelna y otros contaminantes de preparaciones biofarmaceuticas que contienen un producto de interes antes de poder utilizar el producto en aplicaciones de diagnostico, terapeuticas y otras aplicaciones. Asimismo, los agregados de protelna se encuentran tambien en preparaciones de anticuerpos recogidos de llneas celulares del hibridoma y deben ser eliminados antes de la utilizacion de la preparation de anticuerpo para el fin pretendido. Esto es especialmente importante en el caso de aplicaciones terapeuticas y para obtener la aprobacion de la Administration de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos.
La eliminacion de los agregados de protelna puede constituir todo un reto, ya que a menudo existen similitudes entre las propiedades flsicas y qulmicas de los agregados de protelna y el producto de interes en una preparacion biofarmaceutica que es por lo general una molecula monomerica. Existen muchos metodos diferentes dentro de la tecnica para eliminar los agregados de protelna de las preparaciones biofarmaceuticas, entre los que se incluyen, por ejemplo, cromatografla por exclusion de tamano, cromatografla de intercambio ionico y cromatografla de interaction hidrofobica.
Se conocen varios metodos de cromatografla de union y elucion para separar agregados de protelnas del producto de interes. Por ejemplo, se ha utilizado hidroxiapatita en la separation cromatografica de protelnas, acidos nucleicos, as! como anticuerpos. En la cromatografla con hidroxiapatita, normalmente se equilibra la columna y se aplica la muestra a una baja concentration de tampon fosfato y, a continuation, se eluyen las protelnas adsorbidas en un gradiente de concentracion de tampon fosfato (vease, p.ej., Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000)). Sin embargo, en varios casos, los investigadores no han podido eluir selectivamente anticuerpos de la hidroxiapatita o han observado que la cromatografla con hidroxiapatita no tenia como resultado un producto lo suficientemente puro (vease, p.ej., Jungbauer, J. Cromatografla 476:257-268 (1989); Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000)).
Por otra parte, se ha utilizado con cierto exito hidroxiapatita ceramica (CHT), una resina para cromatografla disponible en el mercado para eliminar los agregados de proteina en un formato de resina (BIORAD CORP, vease tambien, p.ej., la publication de patente Estadounidense no. WO/2005/044856), sin embargo, por lo general resulta cara y presenta una baja capacidad de union para los agregados de proteina.
Se ha descrito tambien un metodo de cromatografla de intercambio cationico de union y elucion que se utiliza a veces en la industria para la eliminacion de agregados (vease, p.ej., la patente Estadounidense No. 6.620.918), sin embargo, a menudo se observa que hay que jugar desfavorablemente con el compromiso entre el rendimiento de monomero y la eliminacion del agregado. En una reciente revision de metodos de eliminacion de agregados de soluciones de anticuerpos monoclonales, se senalo que en lo que se refiere a un modo de cromatografla de union y elucion “la cromatografla de intercambio cationico puede servir para separar agregados y monomeros, si bien puede resultar dificil de desarrollar una etapa de alto rendimiento con una alta capacidad.” Vease, p.ej., Aldington et al., J. Chrom. B, 848 (2007) 64-78.
En comparacion con los metodos de union y elucion y los metodos de cromatografla de exclusion por tamano, conocidos en la tecnica, la purification de proteinas en el modo de flujo continuo se considera mas deseable por resultar mas economico, sencillo y suponer un ahorro de tiempo y de tampon.
En la tecnica anterior, se han realizado varias tentativas para implementar la eliminacion de agregados por flujo continuo basadas en medios de cromatografla de interaccion hidrofobica (HIC por sus siglas en ingles) (vease, p.ej., la patente de Estados Unidos No. 7.427.659). Sin embargo, las separaciones preparativas basadas de HIC tienen un limitado potencial de aplicacion ya que por lo general es dificil desarrollar un proceso, presentan una ventana operativa limitada y se requiere una alta concentracion de sal en el tampon.
La cromatografla de partition debil (WPC por sus siglas en ingles) es otro modo de operation cromatografica en la que el producto se une mas debilmente que en el caso de la cromatografla de union-elucion, pero con mas fuerza que en el caso de la cromatografla de flujo continuo (vease, p.ej., patente de Estados Unidos No. 8.067.182); sin embargo, WPC conlleva tambien ciertos inconvenientes asociados entre los que se incluyen una ventana operativa limitada y una capacidad de union inferior para la eliminacion de impurezas en comparacion con los metodos de
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union y elucion.
Aunque se ha notificado que algunos de los metodos de flujo continuo descritos en la tecnica anterior sirven para unir agregados, parece ser que la especificidad para la union de agregados con respecto al producto de interes es baja. Por otra parte, no parece que exista ningun metodo conocido en la tecnica anterior que presente una alta especificidad de union de agregados de protelna de orden inferior, tales como p.ej., dlmeros, trlmeros o tetrameros.
Sumario de la invencion
Se divulgan composiciones nuevas y mejoradas, as! como metodos de flujo continuo, en los que se utilizan dichas composiciones para separar un producto de interes, p.ej., un anticuerpo terapeutico o una protelna monomerica de agregados de protelnas en una composition biofarmaceutica. Las composiciones y metodos descritos en el presente documento son especialmente utiles para separar una protelna monomerica de interes de agregados de protelnas de orden inferior, tales como, p.ej., dlmeros, trlmeros y tetrameros, que por lo general resultan diflciles de separar de la protelna monomerica.
La presente invencion se basa al menos en parte en la mayor selectividad de union de los agregados de protelna en comparacion con el producto de interes (es decir, molecula monomerica) a una superficie en un modo de flujo continuo, en virtud de lo cual se separan los agregados de protelna del producto de interes. La presente invencion puede llevar esto a cabo gracias a su diseno unico de superficie que tiene una densidad determinada de los grupos de union de intercambio cationico, facilitando as! la union de un mayor numero de agregados de protelnas a la superficie, en comparacion con las moleculas monomericas.
En ciertas realizaciones de acuerdo con la presente invencion, se proporciona un metodo de cromatografla de flujo continuo para separar una protelna monomerica de interes de agregados de protelna en una muestra, en el que dicho metodo comprende el contacto de la muestra con un soporte solido que comprende uno o mas grupos de union de intercambio cationico fijados, a una densidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM, en el que el soporte solido une selectivamente agregados de protelna en virtud de lo cual se separa la protelna monomerica de interes de los agregados de protelna.
En algunas realizaciones, el soporte solido utilizado en los metodos de acuerdo con la presente invencion se selecciona entre una resina cromatografica, una membrana, un monolito poroso, una tela tejida y una tela no tejida.
En algunas realizaciones, el soporte solido comprende una resina cromatografica o una perla porosa.
En algunas realizaciones, el soporte solido es una perla polimerica de polieter vinllico porosa o una perla de pollmero de polimetacrilato reticulado porosa.
En varias realizaciones, la resina cromatografica o la perla porosa comprende un tamano de partlcula medio de aproximadamente 50 micrometros, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 micrometros, o entre aproximadamente 20 y aproximadamente 140 micrometros, o entre aproximadamente 30 y aproximadamente 70 micrometros.
En algunas realizaciones, un soporte solido se selecciona entre una resina cromatografica o una perla porosa en las que el tamano de partlcula medio esta comprendido entre 10 micrometros y 500 micrometros, o entre 20 y 200 micrometros, o entre 20 y 90 micrometros. En una realization en particular, la resina cromatografica o perla porosa tiene un tamano de partlcula medio de aproximadamente 50 micrometros. En general, se puede mejorar la selectividad disminuyendo el tamano de partlcula. Las personas especializadas en la tecnica entenderan que es posible ajustar el tamano de partlcula medio al mismo tiempo que se mantiene cierto nivel de selectividad para la union de agregados de protelna sobre la base de las necesidades de una aplicacion o un proceso especlfico.
En algunas realizaciones, los agregados de protelna son agregados de protelna de orden inferior, como por ejemplo dlmeros, trlmeros y tetrameros.
En otras realizaciones, los agregados de protelna son agregados de protelna de orden superior como, por ejemplo, pentameros y de orden superior.
En algunas realizaciones, el grupo de intercambio cationico utilizado en los metodos de acuerdo con la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en un grupo sulfonico, un grupo sulfato, un grupo fosfonico, un grupo fosforico, y un grupo carboxllico
En algunas realizaciones, la protelna monomerica es un anticuerpo. En una realizacion en particular, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, la protelna monomerica es una protelna recombinante, p.ej., una protelna de fusion Fc. En otras realizaciones mas, la protelna monomerica es una molecula no anticuerpo.
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En algunas realizaciones de acuerdo con la presente invention, se proporciona un metodo de cromatografla de flujo continuo para separar una protelna monomerica de interes de agregados de protelna en una muestra, en el que dicho metodo comprende el contacto de la muestra con un soporte solido que comprende uno o mas grupos de union de intercambio cationico fijados a una densidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM, en el que el soporte solido une los agregados de protelna en relation con los monomeros a una selectividad superior a aproximadamente 10, en virtud de lo cual se separa la protelna de interes de los agregados de protelna.
En otras realizaciones, se proporciona un metodo de cromatografla de flujo continuo para reducir la concentration de agregados de protelna en una muestra, comprendiendo dicho metodo las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende una protelna de interes y de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 % de agregados de protelna; (b) poner en contacto la muestra con un soporte solido que comprende uno o mas grupos de union de intercambio cationico fijados, a una densidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM; y (c) recoger un efluente de flujo continuo de la muestra, en el que se reduce la concentracion de los agregados de protelna en el efluente en al menos un 50 % en relacion con la concentracion de los agregados en (a), reduciendo as! la concentracion de los agregados de protelna en la muestra.
En algunas realizaciones de acuerdo con los metodos de la presente invencion, la concentracion de la protelna de interes en el efluente es al menos 80 % de la concentracion de la protelna de interes en (a).
En algunas realizaciones, la conductividad ionica de la muestra que contiene agregados que se pone en contacto con dicho soporte solido se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mS/cm.
En algunas realizaciones, un proceso para la purification de una protelna de interes (p.ej., un anticuerpo monoclonal) descrito en el presente documento no requiere una etapa de cromatografla de intercambio cationico de union y elucion. Por consiguiente, dicho proceso elimina la necesidad de anadir una sal a la solution de elucion y el uso de posteriores etapas de dilution.
En algunas realizaciones, se proporciona un proceso para la purificacion de una protelna de interes (p.ej., un anticuerpo monoclonal), en el que el proceso no requiere un aumento de la conductividad. Por consiguiente, dicho proceso no requiere la dilucion tras la etapa de intercambio cationico para reducir la conductividad antes de realizar la posterior etapa de intercambio anionico de flujo continuo.
La presente invencion abarca tambien pollmeros que comprenden grupos de intercambio cationico, en los que los pollmeros estan fijados a un soporte solido.
imagen1
en la que R1 es un grupo de intercambio cationico; R2 es cualquier radical organico alifatico o aromatico que no contiene un grupo cargado; R3 es cualquier engarce organico alifatico o aromatico sin carga entre dos o mas cadenas polimericas cualquiera; “x”, “y” y “z” son fracciones molares promedio de cada monomero en el pollmero, en as que y>x; el slmbolo m representa que esta fijada una cadena de pollmero similar en el otro extremo del engarce.
Se describe un pollmero que comprende la siguiente estructura qulmica:
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en la que “x”, “y” y “z” son fracciones molares promedio de cada monomero del pollmero, en las que y>x; y el slmbolo m representa que esta fijado a una cadena de pollmero similar en el otro extremo del engarce.
Se describe un pollmero que comprende la siguiente estructura qulmica, en la que el pollmero esta injertado a traves de un enlace covalente en un soporte solido:
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en la que R1 es un grupo de intercambio cationico; R2 es cualquier radical organico alifatico o aromatico que no contiene un grupo cargado; y “x” e “y” son fracciones molares promedio de cada monomero en el pollmero, en las que y>x.
En algunas realizaciones, un pollmero de acuerdo con la presente invencion comprende la siguiente estructura
qulmica:
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resina
en la que “x” e “y” son fracciones molares promedio de cada monomero en el pollmero, en las que y > x y en el que el pollmero esta injertado a traves de una union en una resina cromatografica.
En varias realizaciones, los pollmeros estan fijados en un soporte solido.
En varias realizaciones de acuerdo con la presente invencion, se somete el efluente que contiene el producto de interes a uno o mas de los metodos de separacion descritos en el presente documento, en el que el efluente contiene menos de 20 %, o menos de 15 %, o menos de 10 %, o menos de 5 %, o menos de 2 % agregados de protelna.
En algunas realizaciones de acuerdo con la presente invencion, los metodos y/o composiciones de la presente invencion se pueden utilizar en combination con una o mas entre: cromatografla de Protelna A, cromatografla de afinidad, cromatografla de interaction hidrofobica, cromatografla de afinidad por metal inmovilizado, cromatografla por exclusion de tamano, diafiltracion, ultrafiltracion, filtracion de elimination viral, cromatografla de intercambio anionico y/o cromatografla de intercambio cationico.
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En algunas realizaciones, los agregados de protelna que se eliminan selectivamente mediante las composiciones descritas en el presente documento son agregados de peso molecular superior, es decir pentameros de protelna y de orden superior.
En algunas realizaciones, los agregados de protelna que se eliminan selectivamente mediante las composiciones descritas en el presente documento comprenden especies de agregados de orden inferior, tales como dlmeros, trlmeros y tetrameros de protelna.
En algunas realizaciones, se usan los soportes solidos que comprenden uno o mas grupos de union de intercambio cationico descritos en el presente documento en una etapa del proceso de purificacion de flujo continuo en un proceso de purificacion, en la que la etapa del proceso de purificacion de flujo continuo, as! como todo el proceso de purificacion, se pueden realizar de manera continua.
En algunas realizaciones, se conectan los soportes solidos descritos en el presente documento para que esten en comunicacion fluida con otros tipos de medio tanto corriente arriba como corriente abajo del soporte solido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se conecta un soporte solido que comprende uno o mas grupos de union de intercambio cationico, tal como se describe en el presente documento, con un medio de cromatografla de intercambio anionico corriente arriba y un medio de filtracion de virus corriente abajo desde el soporte solido. En una realizacion en particular, fluye una muestra a traves de carbon activado seguido de un medio de cromatografla de intercambio anionico seguido de un soporte solido que comprende uno o mas grupos de union de intercambio cationico seguido de un filtro de virus. En algunas realizaciones, se coloca una mezcladora estatica y/o un tanque de compensation entre el medio de intercambio anionico y el soporte solido que comprende uno o mas grupos de union de intercambio cationico, para realizar un cambio de pH.
En todos los casos, se pueden combinar las diversas realizaciones entre si, a no ser que sean tecnicamente incompatibles o se contradigan unas a otras. Por ejemplo, las realizaciones descritas en relation con los metodos en particular se pueden utilizar en combination con otros procesos descritos en el presente documento. Asimismo, los distintos productos y sus caracterlsticas son utiles en los metodos y productos que se describen en el presente documento en particular.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es una representation esquematica de una mejor selectividad de agregados utilizando una composition que tiene una densidad menor de grupos de union de intercambio cationico en comparacion con una composicion conocida en la tecnica.
Las Figuras 2A-2F son estructuras qulmicas representativas de varias de las composiciones que abarca la presente invention. Las figuras 2A-2D representan estructuras polimericas reticuladas inmovilizadas sobre un soporte solido; las Figuras 2E-2H representan estructuras polimericas injertadas fijadas covalentemente a un soporte solido. R1 es un grupo de intercambio cationico como p.ej., grupo sulfonico, sulfato, fosforico, fosfonico o carboxllico; R2 es cualquier radical organico alifatico o aromatico que no contiene un grupo cargado; R3 es un engarce organico alifatico o aromatico sin carga entre dos o mas cadenas polimericas cualquiera; “x”, “y” y “z” son fracciones molares promedio de cada monomero en el pollmero, en las que y>x; el slmbolo m representa que esta fijada una cadena de pollmero similar en el otro extremo del engarce; R4 es NH o O; R5 es un grupo alifatico o aromatico lineal o ramificado como -CH2-, -C2H4-, -C3H6-, -C(CH3)2-CH2-, -C6H4-; R6 es un grupo alifatico o aromatico lineal o ramificado sin cargar que contiene un engarce NH, O o S para la cadena de pollmero; y R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste contiene uno o mas radicales organicos alifaticos y aromaticos seleccionados independientemente del grupo que consiste en uno o mas radicales organicos neutros y que puede contener heteroatomos como O, N, S, P, F, Cl y similares.
La Figura 3A es un grafico en el que se representan los resultados de un analisis de cromatografla por exclusion de tamano (SEC) de fracciones de un anticuerpo monoclonal (MAb I) pasado a traves de tres dispositivos de membrana diferentes, que consisten en membrana 7, Membrana 8 o una membrana disponible en el mercado (membrana Pall Mustang® S). En el eje de las x, se muestra la carga de MAb I total sobre la membrana en g/l y, en el eje de las y, se muestra la concentration relativa de monomero MAb I (representado por el % de rendimiento) en comparacion con la concentracion de partida.
La Figura 3B es un grafico en el que se representan los resultados de un analisis de cromatografla por exclusion de tamano (SEC) de fracciones de MAb I pasadas a traves de tres dispositivos de membrana que consiste en Membrana 7, Membrana 8 o membrana Pall Mustang® S. En el eje de las x, se muestra la carga total de MAb I sobre la membrana en g/l y, en el eje de las y, se muestra la concentracion relativa de dlmero MAb (representado por el % de rendimiento) en comparacion con la concentracion de partida. Tal como se observa, el dlmero atraviesa la membrana 7 significativamente mas tarde en comparacion con la membrana 8 y la membrana Pall Mustang® S.
La Figura 3C es un grafico en el que se representan los resultados de un analisis de cromatografla por exclusion de tamano (SEC) de fracciones de MAb I que pasan a traves de tres dispositivos de membrana, que contienen Membrana 7, Membrana 8 o membrana Pall Mustang® S. En el eje de las x, se muestra la carga total de MAb I en la membrana en g/l; en el eje de las y se muestra el rendimiento de agregado de alto peso molecular (HMW) de MAb I en comparacion con la concentracion de partida. Tal como se observa, HMW atraviesa la Membranas 7
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La Figura 4A es un grafico en el que se representa el paso sin retencion de agregados, segun se mide por SEC (mostrado en el eje de las y, a la derecha), para una reserva de anticuerpos para la Membrana 7 (que se muestra con triangulos blancos) y la Membrana 8 (se muestra en cuadrados blancos) en funcion de la carga de MAb. Asimismo, se muestra el rendimiento del monomero (es decir, el producto de interes) en la reserva para la Membrana 7 (triangulo oscuro) y la Membrana 8 (cuadrado cerrado).
La Figura 4B es un grafico en el que se representa el paso sin retencion de agregados (se muestra en el eje de las y a la derecha) para una reserva de anticuerpos para la Membrana 7 para 2 ciclos por separado (ciclo 1: se muestra con clrculos blancos; ciclo 2: se muestra en rombos blancos) en funcion de la carga de MAb. Tambien se muestra, el rendimiento de monomero en la reserva para la Membrana 7 (ciclo 1: se muestra con clrculos oscuros; ciclo 2: se muestra con rombos negros).
La Figura 5 es un grafico en el que se representa el paso sin retencion de agregados (se muestra en el eje de las y, a la derecha) para una reserva de anticuerpos para la Membrana 7 en funcion de la carga de MAb III (se muestra en el eje de las x como mg/ml). Se muestra tambien el rendimiento de monomero en la reserva para la Membrana 7 (se muestra en el eje de las y a la izquierda).
La Figura 6A es un grafico en el que se representan los coeficientes de partition a un pH 5,0 en funcion de la concentration de NaCl para la union de monomeros MAb I a la Membrana 8 (cuadrados blancos) y agregados MAb I a la Membrana 8 (triangulos blancos), monomeros MAb I a la Membrana 7 (cuadrados negros) y agregados MAb I a la Membrana 7 (triangulos cerrados).
La Figura 6B es un grafico en el que se representa los coeficientes de particion a un pH 5,0 en funcion de la concentracion de NaCl para la union de monomeros MAb II a la Membrana 8 (cuadrados blancos) y agregados MAb II a la Membrana 8 (triangulos blancos), monomeros MAb II a la Membrana 7 (cuadrados cerrados) y agregados MAb II a la Membrana 7 (triangulos cerrados).
La Figura 7 es un grafico en el que se representan las graficas de la selectividad para la union de MAb I y MAb II a las Membranas 7 y 8, respectivamente, a un pH 5,0. La selectividad de Membrana 8 para MAb I se muestra con los cuadrados blancos; la selectividad de Membrana 7 para MAb I se muestra con cuadrados negros; la selectividad de la Membrana 8 para MAb II se muestra con triangulos blancos; y la selectividad de la Membrana 7 para MAb II se muestra con los triangulos negros.
La Figura 8 representa un grafico en el que se indica el porcentaje de monomero con cargas de agregado de 10 y de 15 g/l.
La Figura 9 representa un grafico en el que se indica la region de operation optima (se muestra en blanco) a cargas de agregado de 5, 10 y 15 g/l. Optimo se definio como > 88 % de rendimiento de monomero con el < 2 % de agregado restante para completar el total de protelna. Las regiones en gris no satisfacen estos criterios.
La Figura 10 es un grafico en el que se representan los resultados de un experimento para investigar el efecto del caudal en la tasa de transferencia del dispositivo de filtration de virus. El eje de las y representa la calda de presion (psi) y el eje de las x representa la tasa de transferencia del dispositivo de filtracion del virus (kg/m2).
La Figura 11 es una representation esquematica del proceso de purification por flujo continuo conectado en el que se emplean las composiciones descritas en el presente documento. Se conecta un dispositivo que contiene carbon activado directamente a un dispositivo de intercambio anionico. El efluente del dispositivo de intercambio anionico pasa a traves de una mezcladora estatica, en la que se anade un acido acuoso para reducir el pH y, a continuation, pasa a traves de un dispositivo de flujo continuo de intercambio cationico, de acuerdo con la presente invention, y un filtro de virus.
La Figura 12 es un grafico en el que se representan los resultados de un experimento para medir el paso sin retencion de HCP tras un medio de cromatografla de intercambio anionico (ChromaSorb™). El eje de las x representa la concentracion de HCP (ppm) y el eje de las y representa la carga de AEX (kg/l).
La Figura 13 es un grafico en el que se representan los resultados de un experimento para medir la elimination de agregados de MAb en funcion de la carga del dispositivo de filtracion de virus en la etapa del procedimiento de purificacion de flujo continuo. El eje de las x representa la carga de filtracion e virus (kg/m2) y el eje de las y representa el porcentaje de agregados de MAb en la muestra tras la filtracion del virus.
La Figura 14 es un grafico en el que se representan los resultados de un experimento para demostrar la eliminacion de agregados MAb en funcion de la carga de protelna acumulativa utilizando una resina de intercambio cationico, tal como se describe en el presente documento (Lote no.12LPDZ119). El eje de las x representa la carga de protelna acumulativa en mg/ml, el eje de las y a la izquierda representa la concentracion de anticuerpo MAb en mg/ml y el eje de las y a la derecha representa el porcentaje de agregados de MAb en la muestra.
La Figura 15 es un grafico en el que se representan los resultados de un experimento para demostrar la eliminacion de agregados de MAb en funcion de la carga de protelna acumulativa, utilizando una resina de intercambio cationico, tal como se describe en el presente documento (Lote no. 12LPDZ128). El eje de las x representa la carga de protelna acumulativa en mg/ml, el eje de las y a la izquierda representa la concentracion del anticuerpo MAb en mg/ml y el eje de las y a la derecha representa el porcentaje de agregados de MAb en la muestra.
La Figura 16 es un grafico en el que se representan los resultados de un experimento para demostrar la eliminacion de agregados MAb en funcion de la carga de protelna acumulativa, utilizando la resina de intercambio cationico tal como se describe en el presente documento (Lote no. 12LPDZ129). El eje de las x representa la carga de protelna acumulativa en mg/ml, el eje de las y a la izquierda representa la concentracion del anticuerpo MAb en mg/ml y el eje de las y a la derecha representa el porcentaje de agregados MAb en la
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Figure 17 representa el cromatograma de la resina Lote n° 1712 con MAb5 a pH 5 y un tiempo de residencia de 3 minutos.
Descripcion detallada de la invencion
En la tecnica anterior se han descrito diversos metodos de union y elucion, as! como de flujo continuo, para intentar separar agregados de protelna de protelnas monomericas, que son productos de interes por lo general.
Los metodos de union y elucion por lo general consumen tiempo y requieren el desarrollo de un proceso de envergadura y a veces no resultan eficaces para separar los agregados y, en particular, los agregados de orden inferior, de una protelna monomerica, al mismo tiempo que se mantiene un alto rendimiento de la protelna monomerica. Se han descrito ciertos metodos de flujo continuo de intercambio cationico dentro de la tecnica, tanto con resinas porosas convencionales como con membranas; sin embargo, quedan cuestiones por resolver como la baja capacidad de los medios para la union de agregados, la baja selectividad de los dlmeros y, a menudo, el bajo rendimiento del producto de interes, es decir, las protelnas monomericas (vease p.ej., Liu et al., J. Chrom. A., 1218 (2011), 6943-6952).
Por otra parte, dentro de la tecnica anterior, se han descrito metodos en los que se emplea un grupo de intercambio cationico sobre soportes solidos para separar protelnas. Vease, p.ej., Wu et al. (Effects of stationary phase ligand density on high-performance ion-exchange cromatografla of protelnas, J. Chrom. 598 (1992), 7-13), en el que se explica la alta densidad de grupos de intercambio cationico sobre un soporte solido para conseguir la mejor resolution cromatografica de dos protelnas modelo. No obstante, recientemente, se ha investigado concretamente el efecto de la densidad de grupos de union de intercambio cationico sobre la elimination de agregados (vease, p.ej., Fogle et al., Effects of resin ligand density on yield and impurity clearance in preparative cation exchange cromatografla. I. Mechanistic evaluation, J. Chrom. A. 1225 (2012), 62-69). Se ha notificado que, en gran medida, la resolucion de formas de anticuerpo de alto peso molecular y monomericas no depende de la densidad de grupos de union.
Asimismo, se ha descrito WPC para su uso en la eliminacion de impurezas (vease, p.ej., Suda et al., Comparison of agarose and dextran-grafted agarose strong ion exchangers for the separation of agregados de protelna, J. Chrom. A, 1216: pp.5256-5264, 2009). En el caso de cromatografla de partition debil (WPC), el coeficiente de partition, Kp, oscila entre 0,1 y 20; un Kp > 20 esta asociado con cromatografla de union-elucion y un Kp < 0,1 esta asociado con cromatografla de flujo continuo. WPC tiene al menos dos graves inconvenientes. En primer lugar, una region operativa limitada (0,1< Kp <20), que tiene que estar entre la cromatografla de flujo continuo y la union-elucion (vease, p.je., la patente estadounidense No. 8.067.182). Dentro de esta region operativa, debe haber una alta selectividad entre el producto y las impurezas para que la separation sea eficiente. Normalmente, para los medios de intercambio ionico, la selectividad entre producto e impurezas aumenta a medida que aumenta el Kp, obteniendose la selectividad mas alta en condiciones de union-elucion. En segundo lugar, la capacidad para las impurezas es inferior que en el caso del modo union-elucion. Dado que los valores Kp son mas bajos, tambien lo sera la capacidad en condiciones de operation normales, en las que las concentraciones de impurezas son mas bajas que las del producto.
La presente invencion sirve para conseguir una separacion superior de agregados de protelna y protelnas monomericas, en comparacion con los distintos metodos descritos en la tecnica. Una caracterlstica distintiva de la presente invencion con respecto a los metodos descritos en la tecnica anterior es el uso de la baja densidad de grupos de intercambio cationico sobre un soporte solido, as! como la alta especificidad para la eliminacion de agregados de protelna de orden inferior, p.ej., dlmeros, trlmeros y tetrameros, que resultan normalmente mas diflciles de eliminar debido a la proximidad de su tamano con el del monomero y sus caracterlsticas superficiales.
Para poder entender mejor la presente invencion, se definiran en primer lugar algunos terminos. Otras definiciones quedaran expuestas a lo largo de la descripcion detallada.
I. Definiciones
El termino "cromatografla," tal como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier tipo de tecnica que separa el producto de interes (p.ej., protelna terapeutica o anticuerpo) de contaminantes y/o agregados de protelna en una preparation biofarmaceutica.
Los terminos “proceso de flujo continuo” o “modo de flujo continuo”, y “cromatografla de flujo continuo”, tal como se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren a una tecnica de separacion de producto en la que se pretende que fluya una preparacion biofarmaceutica que contiene el producto de interes a traves de un material. En algunas realizaciones, el producto de interes fluye a traves del material y las entidades no deseables se unen al material. En una realization en particular, el material contiene cierta densidad de grupos de union de intercambio cationico (es decir, mas baja que las de las composiciones de la tecnica anterior) y se utiliza para separar una protelna monomerica de agregados de protelna, en el que la protelna monomerica fluye a traves del material, al
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mismo tiempo que los agregados de protelna se unen al material.
El termino "cromatografla de afinidad" se refiere a una tecnica de separacion de protelnas en las que la molecula diana (p.ej., una region Fc que contiene la protelna o el anticuerpo de interes) se une especlficamente a un ligando que es especlfico para la molecula diana. Dicho ligando se denomina generalmente ligando bioespeclfico. En algunas realizaciones, el ligando bioespeclfico (p.ej. una Protelna A o una variante funcional de la misma) se une covalentemente a un material de matriz de cromatografla adecuado y es accesible para la molecula diana en solucion cuando la solucion entra en contacto con la matriz de cromatografla. La molecula diana retiene por lo general su afinidad de union especlfica para el ligando bioespeclfico durante las etapas cromatograficas, mientras que los demas solutos y/o protelnas en la mezcla no se unen apreciablemente o especlficamente al ligando. La union de la molecula diana al ligando inmovilizado permite que las protelnas contaminantes y las impurezas pasen a traves de la matriz de cromatografla, al tiempo que la molecula diana permanece especlficamente unida al ligando inmovilizado sobre el material en fase solida. La molecula diana especlficamente unida se elimina despues en su forma activa desde el ligando inmovilizado en condiciones adecuadas (p.ej., pH bajo, pH alto, alto contenido de sal, ligando de competicion etc.) y pasa a traves de una columna cromatografica con el tampon de elucion, sustancialmente desprovista de las protelnas contaminantes e impurezas que se hablan dejado pasar anteriormente a traves de la columna. Debe entenderse que es posible utilizar cualquier ligando adecuado para purificar sus protelnas de union especlficas correspondientes, p.ej., anticuerpo. En algunas realizaciones de acuerdo con la presente invention, se utiliza la protelna A como ligando para una protelna diana que contiene una region Fc. Las personas especializadas en la tecnica podran determinar facilmente las condiciones para la elucion del ligando bioespeclfico (p.ej. Protelna A) de la molecula diana (p.ej. una protelna que contiene region Fc). En algunas realizaciones, se puede utilizar la protelna G o la protelna L o una variante funcional de las mismas como ligando bioespeclfico. En algunas realizaciones, se utiliza en el proceso en el que se emplea un ligando bioespeclfico, como Protelna A, un pH dentro del intervalo de 5-9 para la union a la protelna que contiene la region Fc, seguido del lavado y re-equilibrio del ligando bioespeclfico /conjugado de molecula diana, que va seguido despues de elucion con un tampon que tiene un pH de aproximadamente 4 o inferior que contiene al menos una sal.
Los terminos "contaminante" "impureza," y "residuos," tal como se utilizan en el presente documento indistintamente se refieren a cualquier molecula extrana y objetable, incluyendo una macromolecula biologica como ADN, un ARN, una o mas protelnas de celula huesped, endotoxinas, llpidos, agregados de protelna y uno o mas aditivos que pueden estar presentes en una muestra que contiene el producto de interes que se esta separando de una o mas de las moleculas extranas u objetables. Asimismo, dicho contaminante puede incluir cualquier reactivo utilizado en una etapa que puede tener lugar antes del proceso de separacion. En una realization en particular, las composiciones y los metodos descritos en el presente documento tienen por objeto para eliminar selectivamente agregados de protelna de una muestra que contiene un producto de interes.
Los terminos “inmunoglobulina”, "Ig" o "anticuerpo" (que se utilizan indistintamente en el presente documento) se refieren a una protelna que tiene una estructura de cadena de cuatro polipeptidos basica que consiste en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por enlaces disulfuro de intercadena, que tiene la capacidad de unirse especlficamente a antlgeno. Las expresiones “inmunoglobulina de cadena simple” o “anticuerpo de cadena simple” (que se utilizan indistintamente en el presente documento) se refieren a una protelna que tiene una estructura de cadena de dos polipeptidos que consiste en una cadena pesada y una ligera, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por engarces de peptido intercadena, que tiene la capacidad de unirse especlficamente a antlgeno. El termino “dominio” se refiere a una region globular de un polipeptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles de peptido (p.ej. que comprende 3 o 4 bucles de peptido) estabilizados, por ejemplo, por una hoja plegada p y/o un enlace disulfuro intercadena. Asimismo, se puede hacer referencia en el presente documento a los dominios como “constante” o “variable” sobre la base de la relativa falta de variacion de secuencia dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio “constante” o la significativa variation dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio “variable”. Generalmente, en la tecnica se hace referencia indistintamente a “dominios” de anticuerpo o polipeptido y a “regiones” de anticuerpo o polipeptido. Se hace referencia indistintamente a dominios “constantes” de cadenas ligeras de anticuerpo y a “regiones constantes de cadena ligera”, “dominios constantes de cadena ligera”, regiones “CL” o dominios “CL”. Se hace referencia indistintamente a dominios “constantes” de cadena pesada de anticuerpo y a “regiones constantes de cadena pesada”, “dominios constantes de cadena pesada”, regiones “CH” o dominios “CH”. Se hace referencia indistintamente a dominios “variables” de cadenas ligeras de anticuerpo y a “regiones variables de cadena ligera”, “dominios variables de cadena ligera”, regiones “VL” o dominios “VL”. Se hace referencia indistintamente a dominios “variables” de cadenas pesadas de anticuerpo y a “regiones variables de cadena pesada”, “dominios variables de cadena pesada”, regiones “VH” o dominios “VH”.
Las inmunoglobulinas o los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomerica o polimerica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamera y/ anticuerpos IgA que existen en forma monomerica, dimerica o multimerica. El termino “fragmento” se refiere a una parte o una portion de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos restos de aminoacido que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse por tratamiento qulmico o enzimatico de un anticuerpo o una cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos se pueden obtener tambien por medios recombinantes. Entre los ejemplos de fragmentos se incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv.
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La expresion “fragmento de union a antlgeno” se refiere a una porcion de polipeptido de una inmunoglobulina o un anticuerpo que se une a un antlgeno o compite con un anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se derivan) para la union de antlgeno (es decir, union especlfica). Los fragmentos de union se pueden producir a traves de tecnicas de ADN recombinante o escision qulmica o enzimatica de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de union incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, cadenas simples y anticuerpos de cadenas simples.
El termino “preparacion biofarmaceutica” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una composicion que contiene un producto de interes (p.ej., una protelna terapeutica o un anticuerpo que es normalmente un monomero) y componentes no deseados, tales como agregados de protelna (p.ej. agregados de protelna de orden inferior y agregados de alto peso molecular del producto de interes).
Tal como se utiliza en el presente documento, y a no ser que se indique de otra forma, el termino “muestra” se refiere a cualquier composicion o mezcla que contiene una molecula diana. Las muestras se pueden derivar de fuentes biologicas u otras fuentes. Las fuentes biologicas incluyen fuentes eucariotas y procariotas, tales como celulas vegetales y animales, tejidos y organos. La muestra tambien puede incluir diluyentes, tampones, detergentes y especies contaminantes, residuos y similares que se encuentran mezclados con la molecula diana. La muestra se puede estar “parcialmente purificada” (es decir, ha sido sometida a una o mas etapas de purificacion, como por ejemplo etapas de filtracion) o se puede obtener directamente de un organismo o celula huesped que produce dicha molecula diana (p.ej., la muestra puede comprender fluidos de cultivo de celulas recogidas). En algunas realizaciones, la muestra es un alimento de cultivo celular. En algunas realizaciones, la muestra que se somete a los procesos de purificacion de fluido continuo descritos en el presente documento es un eluato de una etapa de cromatografla de union y elucion, p.ej. una cromatografla de afinidad de Protelna A.
La expresion "agregado de protelna " o "agregados de protelna," tal como se utiliza indistintamente en el presente documento, se refiere a una asociacion de al menos dos moleculas de un producto de interes, p.ej., una protelna o anticuerpo terapeutico. La asociacion de al menos dos moleculas de un producto de interes puede producirse a traves de cualquier medio, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, union covalente, no covalente, disulfuro o reticulacion no reducible.
La concentracion del agregado se puede medir en una muestra de protelna utilizando cromatografla por exclusion de tamano (SEC), un metodo muy conocido y comunmente aceptado en la tecnica (vease, p.ej., Gabrielson et al., J. Pharm. Sci., 96, (2007), 268-279). Las concentraciones relativas de especies de diversos pesos moleculares se miden en el efluente utilizando absorbancia de UV, al tiempo que los pesos moleculares de las fracciones se determinan llevando a cabo la calibracion del sistema siguiendo las instrucciones del fabricante de la columna.
Los terminos “dlmero”, “dlmeros”, “dlmero de protelna” o “dlmeros de protelna”, tal como se utilizan indistintamente en el presente documento se refieren a una fraccion de orden inferior de agregados de protelna que comprende predominantemente agregados que contienen dos moleculas monomericas, pero que pueden tambien contener cierta cantidad de trlmeros y tetrameros. Esta fraccion se observa normalmente como el primer pico de resolucion en un cromatograma SEC inmediatamente antes del pico del monomero principal.
La expresion “agregados de alto peso molecular” o “HMW”, tal como se utilizan indistintamente en el presente documento, se refiere a una fraccion de orden superior de agregados de protelna, es decir, pentamera y superior. Esta fraccion se observa normalmente como uno o mas picos en un cromatograma SEC antes del pico del dlmero.
Los terminos “grupo de union” o “ligando” tal como se utilizan indistintamente en el presente documento se refieren a una estructura qulmica especlfica inmovilizada sobre un soporte solido (p.ej., una superficie porosa) que es capaz de atraer una protelna monomerica o agregados de protelna desde una solucion. La atraccion de la protelna al grupo de union puede ser de cualquier tipo incluyendo ionica, polar, dispersiva, hidrofobica, afinidad, quelacion de metal o van der Waals.
La expresion “grupo de union de intercambio cationico”, tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un grupo de union de carga negativa. En una realizacion en particular, el grupo de union es un grupo sulfonato cargado negativamente.
El termino “soporte solido” se refiere en general a cualquier material (poroso o no poroso) en el que se fijan los grupos de union. La fijacion de los grupos de union en el soporte solido puede tener lugar a traves de un enlace covalente, como por ejemplo en el caso de un injerto, o por revestimiento, adhesion, adsorcion y mecanismos similares. Entre los ejemplos de soportes solidos utilizados en los metodos y composiciones descritos en el presente documento se incluyen, sin limitarse a ellos, membranas, perlas porosas, fibras de malla al azar, monolitos y resinas.
El termino “densidad” tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la concentracion de los grupos de union o ligandos sobre el soporte solido, que se expresa generalmente como concentracion de ligando en moles por litro de medio poroso. Una unidad comunmente aceptada de densidad de ligando de intercambio ionico es mili- equivalentes por litro, o meq/l (equivalente a peqml), que se corresponde con la cantidad molar de grupos ionicamente intercambiables en un volumen de medio dado. Para los grupos cargados con una sola fraccion
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ionizable, la densidad de ligando en meq/l podrla ser equivalente a la densidad de estos grupos expresada en mmoles/l o mM.
El termino “selectividad” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una relacion de coeficientes de particion adimensional de dos especies entre una fase movil y una fase estacionaria. Un coeficiente de particion (Kp) es la relacion Q/C, en la que Q y C son respectivamente las concentraciones de protelna unida y libre.
Las expresiones “etapa de proceso” o “operacion unitaria”, tal como se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren al uso de uno o mas metodos o dispositivos para conseguir un resultado determinado en un proceso de purificacion. Entre los ejemplos de etapas de proceso u operaciones unitarias que se pueden emplear se incluyen, pero sin limitarse a ellas, aclarado, cromatografla de union y elucion, inactivacion de virus, purificacion de flujo continuo y formulacion. Ha de entenderse que cada una de las etapas de proceso u operaciones unitarias puede incluir mas de una etapa o metodo o dispositivo para conseguir el resultado pretendido de esa etapa de proceso u operacion unitaria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la etapa de aclarado y/o la etapa de purificacion de flujo continuo pueden incluir mas de una etapa o metodo o dispositivo para conseguir esa etapa de proceso u operacion unitaria. En algunas realizaciones, el uno o mas dispositivos utilizados para realizar la etapa de proceso u operacion unitaria son dispositivos de un solo uso y se pueden eliminar y/o reemplazar sin tener que reemplazar ningun otro dispositivo en el proceso ni sin tener siquiera que detener el ciclo del proceso.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “tanque de reserva” se refiere a cualquier contenedor, recipiente, reserva, tanque o bolsa, utilizado normalmente entre las etapas del procedimiento y que tiene un tamano/volumen adecuado para permitir la recogida de todo el volumen de produccion de una etapa del proceso. Los tanques de reserva se pueden utilizar para retener o almacenar o manipular las condiciones de la solucion de todo el volumen de produccion de una etapa del proceso. En varias realizaciones de acuerdo con la presente invention, el proceso obvia la necesidad de usar uno o mas tanques de reserva.
En algunas realizaciones, el proceso descrito en el presente documento puede utilizar uno o mas tanques de compensacion.
El termino "tanque de compensation" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier contenedor o recipiente o bolsa que se utiliza entre etapas de procedimiento o dentro de una etapa de procedimiento (p.ej. cuando una sola etapa de procedimiento comprende una o mas etapas); en el que la produccion de una etapa fluye a traves del tanque de compensacion hasta la siguiente etapa. Por consiguiente, un tanque de compensacion es diferente de un tanque de reserva ya que no tiene como objeto retener o recoger todo el volumen de produccion de una etapa; sino que permite el flujo continuo de la produccion de una etapa a la siguiente. En algunas realizaciones, el volumen de un tanque de compensacion utilizado entre dos etapas del proceso o dentro de una etapa de proceso en un proceso o un sistema descrito en el presente documento no es mas del 25 % de todo el volumen de la produccion de la etapa de proceso. En otra realization, el volumen de un tanque de compensacion no es mas del 10 % de todo el volumen de la produccion de una etapa de proceso. En otras realizaciones, el volumen de un tanque de compensacion es menos de 35 % o menos de 30 %, o menos de 25 %, o menos de 20 %, o menos de 15 %, o menos de 10 % de todo el volumen del cultivo celular en un bio-reactor, que constituye el material de partida del que se ha de purificar las moleculas diana.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se utiliza un tanque de compensacion corriente arriba de una etapa que emplea el soporte solido descrito en el presente documento.
El termino "proceso continuo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un proceso para purificar una molecula diana que incluye dos o mas etapas de proceso (u operaciones unitarias), de manera que la produccion de una etapa de proceso fluye directamente a la siguiente etapa de proceso dentro del proceso, sin interruption y en el que se pueden realizar dos o mas etapas de proceso a la vez durante al menos parte de su duration. Es decir, en caso de un proceso continuo, tal como se describe en el presente documento, no es necesario completar una etapa de proceso antes de comenzar la siguiente etapa de proceso, sino que una portion de la muestra se desplaza siempre a traves de las etapas del proceso. El termino “proceso continuo” tambien se aplica a las etapas dentro de una etapa del proceso, en cuyo caso, durante la realizacion de una etapa de proceso que incluye varias etapas, la muestra fluye de forma continua a traves de las multiples etapas que son necesarias parar realizar la etapa del proceso. Un ejemplo de dicha etapa del proceso descrita en el presente documento es una etapa de purificacion de flujo continuo que incluye varias etapas que se realizan de manera continua, p.je., carbon activado en flujo continuo, seguido de medio AEX de flujo continuo seguido de medio CEX de flujo continuo, con la utilization de los soportes solidos descritos en el presente documento, seguido filtration de virus de flujo continuo.
La expresion "matriz de intercambio anionico" se utiliza en el presente documento para referirse a una matriz que esta cargada positivamente, p.ej., que tiene uno o mas ligandos cargados positivamente, como grupos amino cuaternarios, fijados. Entre las resinas de intercambio anionico disponibles en el mercado se incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare). Otros ejemplos de materiales que se pueden utilizar en los procesos y sistemas descritos en el presente documento incluyen Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE highcap, Eshmuno® Q y Fractogel® EmD DEAE (EMD Millipore).
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Los terminos "carbon activado" o "carbon activado", tal como se utilizan indistintamente en el presente documento se refieren a un material carbonaceo que ha sido sometido a un proceso para potenciar su estructura porosa. Los carbonos activados son solidos porosos con areas superficiales muy altas. Se pueden derivar de diversas fuentes incluyendo, carbon, madera, cascara de coco, cascara de nuez y turba. El carbon activado se puede producir a parti r de estos materiales por activacion flsica que implica el calentamiento en una atmosfera controlada o activacion qulmica con acidos fuertes, bases u oxidantes. Los procesos de activacion producen una estructura porosa con areas superficiales altas que dan al carbon activado una gran capacidad para eliminar las impurezas. Los procesos de activacion se pueden modificar para controlar la acidez de la superficie. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se utiliza carbon activado en una etapa de purification de flujo continuo, que normalmente sigue a una etapa de cromatografla de union y elucion o una etapa de inactivation de virus que a su vez, sigue a una etapa de cromatografla de union y elucion. En algunas realizaciones, se incorpora el carbon activado dentro de un medio de celulosa, p.ej., una columna o algun dispositivo adecuado.
El termino “mezcladora estatica” se refiere a un dispositivo para mezclar dos materiales fluidos, normalmente llquidos. El dispositivo consiste generalmente en elementos de mezclado (elementos fijos) que estan alojados en una carcasa cillndrica (tubo). El diseno global del sistema lleva incorporado un metodo para suministrar dos corrientes de fluidos a la mezcladora estatica. A medida que se desplazan las corrientes a traves de la mezcladora, los elementos fijos combinan de forma continua los materiales. El mezclado completo depende de muchas variables, incluyendo las propiedades de los fluidos, el diametro interior del tubo, el numero de elementos de mezclado y el diseno, etc. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se utilizan una o mas mezcladoras estaticas en los procesos descritos en el presente documento. En una realizacion en particular, se utiliza una mezcladora estatica para conseguir el cambio de solution deseado tras la etapa de cromatografla de intercambio anionico y antes del contacto de una muestra con el soporte solido de intercambio cationico, tal como se describe en el presente documento.
II. Ejemplos de soportes solidos
La presente invention proporciona soportes solidos que tienen una determinada densidad de grupos de union o ligandos fijados, que unen agregados de protelna mas favorablemente que la forma monomerica de una protelna que suele ser el producto de interes. Sin desear vincularse a una teorla, se contempla que es posible utilizar cualquier soporte solido adecuado en el caso de la presente invencion. Por ejemplo, el soporte solido puede ser poroso o no poroso o puede ser continuo, como por ejemplo en forma de membrana o un monolito. El soporte solido podrla ser tambien discontinuo, como por ejemplo en forma de partlculas, perlas o fibras. En cualquiera de estos casos (continuo o discontinuo), lo importante es que el soporte solido se caracterice por tener un area superficial alta, integridad mecanica, integridad en un entorno acuoso y capacidad para proporcionar distribution de flujo para asegurar accesibilidad de los grupos de union.
Entre los ejemplos de soportes solidos porosos continuos se incluyen membranas microporosas, es decir, que tienen tamanos de poro comprendidos entre aproximadamente 0,05 micrometres y 10 micrometres. Las membranas porosas que se pueden utilizar en las composiciones y los metodos de acuerdo con la presente invencion pueden clasificarse como simetricas o asimetricas por su naturaleza, lo que se refiere a la uniformidad de los tamanos de poro a traves del grosor de la membrana o, para una fibra hueca, a traves de la pared microporosa de la fibra. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "membrana simetrica" se refiere a una membrana que tiene un tamano de poro sustancialmente uniforme a traves de la section transversal de la membrana. Tal como se emplea en el presente documento, la expresion “membrana asimetrica” se refiere a una membrana en la que el tamano de poro promedio no es constante a traves de la seccion transversal de la membrana. En algunas realizaciones, en el caso de membranas asimetricas, los tamanos de poro pueden variar uniformemente o de forma discontinua en funcion de la localization a lo largo de la seccion transversal de la membrana. En algunas realizaciones, las membranas asimetricas pueden tener una relation entre los tamanos de poro en una superficie externa y los tamanos de poro de la superficie externa contraria, estando dicha relacion por encima de uno sustancialmente.
En las composiciones y metodos descritos en el presente documento, se puede utilizar varias membranas microporosas fabricadas de una amplia variedad de materiales. Entre los ejemplos de dichos materiales se incluyen polisacaridos, pollmeros sinteticos y semi-sinteticos, metales, oxidos de metal, ceramicas, vidrio y combinaciones de los mismos.
Entre los ejemplos de pollmeros que se pueden utilizar para fabricar las membranas microporosas que se pueden utilizar en las composiciones y metodos descritos en el presente documento se incluyen, sin limitare a ellas, poliacrilamidas sustituidas o sin sustituir, poliestirenos, polimetacrilamidas, poliimidas, poliacrilatos, policarbonatos, polimetacrilatos, pollmeros hidrofilos de polivinilo, poliestirenos, polisulfonas, poliester sulfonas, copollmeros de estireno y divinilbenceno, polisulfonas aromaticas, politetrafluoroetilenos (PTFE), pollmeros termoplasticos perfluorados, poliolefinas, poliamidas aromaticas, poliamidas alifaticas, polietilenos de peso molecular ultra-alto, difluoruro de polivinilideno (PVFG), polieter eter cetonas (PEEK) poliesteres y combinaciones de los mismos.
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Entre los ejemplos de membranas microporosas disponibles en el mercado se incluyen Durapore® y Millipore Express® distribuida por EMD Millipore Corp. (Billerica, MA); Supor® distribuida por Pall Corp. (Port Washington, NY); y Sartopore® y Sartobran® distribuidas por Sartorius Stedim Biotech S.A. (Aubagne Cedex, Francia).
Otros ejemplos de soportes solidos continuos son monolitos, como materiales monollticos CIM® distribuidos por BIA Separations (Villach, Austria).
Entre los ejemplos de soportes solidos discontinuos se incluyen perlas para cromatografla porosas. Las personas especializadas en la tecnica reconoceran que es posible fabricar perlas para cromatografla a partir de una gran variedad de materiales polimericos e inorganicos, tales como polisacaridos, acrilatos, metacrilatos, poliestirenicos, esteres vinllicos, vidrio de poro controlado, ceramicas y similares.
Entre los ejemplos de perlas para cromatografla disponibles en el mercado se incluyen GPG de EMD Millipore Corp.; Sepharose® de GE Healthcare Life Sciences AB; TOYOPEARL® de Tosoh Bioscience; y PORoS® de Life Technologies.
Otros ejemplos de soportes solidos son materiales fibrosos tejidos y no tejidos, como por ejemplo mallas de fibra y fieltros, as! como fibras empaquetadas en una carcasa, por ejemplo, una columna de cromatografla, carcasa de plastico desechable y similar. Entre los ejemplos de soportes solidos se incluyen tambien fibras de malla al azar.
III. Ejemplos de grupos de union
Se puede fijar una gran variedad de grupos de union o ligandos a los soportes solidos y utilizarse para eliminar eficazmente los agregados de protelna de una muestra, tal como se describe en el presente documento. En general, el grupo de union debera ser capaz de atraer y unir los agregados de la protelna en una solucion. La atraccion de la protelna al grupo de union puede ser de cualquier tipo, incluyendo ionica (p.ej., grupos de intercambio cationico), polar, dispersiva, hidrofobica, afinidad, quelacion metalica o van der Waals.
Entre los ejemplos de grupos de union ionica se incluyen, sin limitarse a ellos, sulfato, sulfonato, fosfato, fosfonato, carboxilato; amina primaria, secundaria, terciaria y amonio cuaternario; aminas heteroclclicas, como piridina, pirimidina, piridinio, piperazina y similares.
Los grupos polares incluyen una amplia variedad de entidades qulmicas que comprenden enlaces qulmicos polarizados como C-O, C =O, C-N, C = N, C = N, N-H, O-H, C-F, C-Cl, C-Br, C-S, S-H, S-O, S = O, C-P, P-O, P = O, P-H. Entre los ejemplos de grupos polares se incluyen carbonilo, carboxilo, alcohol, tiol, amida, haluro, amina, ester, eter, tioester y similares.
Los grupos de union hidrofobos son capaces de establecer interacciones hidrofobicas. Entre los ejemplos de grupos hidrofobos se incluyen alquilo, cicloalquilo, haloalquilo, fluoroalquilo, arilo y similares.
Los grupos de union por afinidad son disposiciones de varias funcionalidades de union que proporcionan coordinadamente una interaccion altamente especlfica con la protelna diana. Entre los ejemplos de grupos de union por afinidad se incluyen Protelna A y Protelna G y dominios y variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, un grupo de union preferente es un grupo ionico. En una realizacion en particular, un grupo de union es un grupo sulfonato de carga negativa. En general, los grupos sulfonato de carga negativa presentan varias ventajas. Por ejemplo, presentan un amplio potencial de aplicacion para unir protelnas de carga positiva en una solucion; la qulmica no resulta cara y es sencilla y se dispone de muchos metodos de fabrication y slntesis; la interaccion entre el grupo de union y las protelnas se comprende muy bien (vease, p.ej., Stein et al., J. Chrom. B, 848 (2007) 151-158) y la interaccion se puede manipular facilmente alterando las condiciones de solucion y dicha interaccion se puede aislar de otras interacciones.
IV. Metodos de fijacion de los grupos de union a un soporte solido y control de la densidad de los grupos de union en el soporte solido
En las composiciones y metodos descritos en el presente documento, se fijan grupos de union adecuados al soporte solido, en los que se controla densidad de los grupos de union sobre el soporte solido de manera que se proporciona una mayor capacidad de unir agregados de protelna con respecto al producto de interes.
Las composiciones y los metodos descritos en el presente documento se basan en un descubrimiento sorprendente e inesperado de que la menor densidad de los grupos de union en un soporte solido es mas eficaz para eliminar los agregados de protelna en un modo de flujo continuo, incluso a pesar de que la tecnica anterior pareciera indicar la idoneidad de tener una alta densidad de grupos de union. Las composiciones y los metodos descritos en el presente documento son especialmente eficaces en la elimination de los agregados de protelna de orden inferior, tales como p.ej., dlmeros, trlmeros y tetrameros, en un modo de flujo continuo, que por lo general resultan mas diflciles de separar de la forma monomerica de protelnas, en comparacion con agregados de orden superior, tales como p.ej.,
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pentameros y superiores.
Los diversos metodos conocidos en la tecnica anterior, as! como los descritos en el presente documento, se pueden utilizar para fijar grupos de union a un soporte solido para su uso en los metodos descritos en el presente documento. En general, los criterios para lograr la fijacion incluyen conseguir la densidad del grupo de union deseada y una baja tasa de desprendimiento de grupos de union (es decir, una baja lixiviacion de los grupos de union). Los grupos de union podrlan fijarse directamente a un soporte solido o se podrlan incorporar en una molecula de pollmero que, a su vez se puede unir a un soporte solido. Alternativamente, los grupos de union se pueden incorporar en un revestimiento reticulado aplicado sobre un soporte solido con o sin formar un enlace qulmico entre el revestimiento y el soporte solido.
Dentro de la tecnica se conoce una serie de metodos para fijar grupos de union a un soporte solido (vease, por ejemplo, Ulbricht, M., Advanced Functional Pollmero Membranas, Pollmero, 47, 2006, 2217-2262). Estos metodos incluyen, sin limitarse a ellos, modificacion directa del soporte solido con grupos de union por qulmica de acoplamiento adecuada; adsorcion y fijacion de moleculas polimericas. Este ultimo se puede llevar a cabo por injerto “en” (cuando el pollmero se fabrica previamente antes de la reaccion con la superficie) e injerto “desde” (cuando la polimerizacion se inicia utilizando grupos superficiales).
Tal como se describe en el presente documento, la capacidad para controlar la densidad de los grupos de union en la superficie del soporte solido es crucial para conseguir con exito la separation de agregados de protelna y el producto de interes. La densidad de los grupos de union, expresada en moles/l de medio poroso, o M, puede medirse convenientemente utilizado metodos conocidos entre las personas especializadas en la tecnica. Por ejemplo, se puede medir la densidad de los grupos de acido sulfonico utilizando analisis de intercambio de iones litio. En este analisis. En este analisis, los hidrogenos de los grupos acido sulfonico se intercambian completamente por iones litio, se aclaran con agua, posteriormente se eliminan por lavado los iones litio en una solution acida concentrada y se mide la concentration de litio en la solucion de lavado acida por cromatografla de iones.
En la cromatografla de protelna, por lo general ha sido deseable una mayor densidad de ligandos (grupos de union) ya que por lo general proporciona una mayor capacidad de union (vease, p.ej., Fogle et al., J. Chrom. A, 1225 (2012) 62-69). Normalmente, la densidad de ligandos para la mayorla de las resinas de intercambio cationico (CEX) disponibles en el mercado es al menos 100 miliequivalentes/L, o mM para un ligando monovalente. Por ejemplo, SP Sepharose Fast Flow y CM Sepharose Fast Flow, distribuidas ambas por GE Healthcare, se incluyen en la lista de la bibliografla de productos por tener la concentracion del grupo de intercambio cationico 180-250 mM y 90-130 mM, respectivamente.
Existe una serie de metodos dentro de la tecnica a los que se puede recurrir para controlar la densidad de los grupos de union sobre un soporte solido. Cuando se fijan directamente los grupos de union sobre el soporte solido, la densidad se puede controlar por la duration de la reaccion, el tipo y la concentracion de catalizador, la concentracion del reactivo, la temperatura y la presion. Cuando se requiere un tratamiento previo de la superficie (activation) del soporte solido, por ejemplo por oxidation parcial o hidrolisis, el grado de pretratamiento servira tambien para controlar la densidad de los grupos de union que se fijen a la superficie tratada previamente.
Cuando se incorporan los grupos de union en una estructura polimerica que se adsorbe, adhiere, injerta o reviste sobre un soporte solido, la densidad de los grupos de union se puede controlar mediante la composition de la estructura polimerica. Un enfoque para crear la estructura polimerica con una densidad controlada de los grupos de union es la copolimerizacion, es decir la polimerizacion de dos o mas tipos de monomeros diferentes en una estructura polimerica unica. Un grupo de union puede ser una parte de uno de los tipos de monomero utilizados para crear la estructura polimerica, al mismo tiempo que se pueden anadir otros monomeros neutros para reducir la densidad de los grupos de union.
La selection de los monomeros utilizados para crear un pollmero que comprende grupos de union esta dictada por la reactividad de los monomeros. La reactividad de los diferentes tipos de monomero y los efectos en la composicion de pollmero esta muy estudiada y documentada (vease, por ejemplo, Polymer Handbook, 3a ed., John Wiley & Sons, 1989, p. II). Los parametros de los monomeros perfectamente aceptados que predicen la composicion del pollmero y su estructura son las relaciones de reactividad de los monomeros (vease, por ejemplo, Odian, J., Principles of Polymerization, 4a ed., John Wiley & Sons, 2004, p. 466).
Un metodo preferente para fijar los grupos de union en el soporte solido es una reaccion de polimerizacion in situ que incorpora el grupo de union en un revestimiento reticulado que se aplica sobre el soporte solido. Dicho metodo se describe en las patentes estadounidenses Nos. 4.944.879 y 4.618.533, as! como la publication de patente estadounidense publicada No. US2009/208784. Este metodo es sencillo ademas de economico. Se puede crear un revestimiento cargado copolimerizando un monomero acrllico cargado, por ejemplo, acido 2-acrilamido-2- metilpropanesulfonico (AMPS), con un engarce de reticulation adecuado como N,N'-metilen-bisacrilamida (MBAM). La publicacion de patente estadounidense No. US2009208784, divulga una membrana microporosa modificada con una mezcla de AMPS y MBAM que se puede utilizar para eliminar los agregados de protelna de alto peso molecular y para mejorar la capacidad del filtro de virus nanoporoso. Sin embargo, las publicaciones de patente que se han
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mencionado no explican el control de la densidad del ligando, tal como se describe en el presente documento, para conseguir la eliminacion selectiva de agregados de protelna y, sobre todo, agregados de protelna de orden inferior, como dlmeros, trlmeros, tetrameros etc.
Un monomero neutro que se puede utilizar para reducir la densidad de los ligandos de union cargados se puede seleccionar dentro de un extenso grupo de monomeros acrllicos, metacrllicos y acrilamida como por ejemplo acrilamida, acrilato de hidroxipropilo, acrilato de hidroxietileno y metacrilato de hidroxietilo. Un monomero preferente es dimetilacrilamida (DMAM). La relacion de reactividad entre los monomeros AMPS y DMAM (r1 = 0,162, r2 = 1,108) (vease, p.ej., Pollmero Handbook, 3rd ed., John Wiley and Sons, 1989, p. II/156) predice que un pollmero que incluye estos monomeros deberla tener una tendencia para bloques cortos de poli(DMAM) espaciados por unidades de AMPS individuales, reduciendo as! la densidad de los grupos de union. La seleccion de la relacion entre DMAM y AMPS en la solucion de reaccion es por tanto un metodo importante para conseguir una densidad controlada de los grupos de union.
En la Figura 2A se representa estructura qulmica representativa de pollmero que contiene grupos de union, que se reviste sobre un soporte solido. Para revestir el pollmero, por lo general se reticula con otros pollmeros. En la Figura 2A, se muestra la estructura polimerica en la que R1 es cualquier radical organico alifatico o aromatico que contiene un grupo de intercambio cationico, como p.ej., sulfonico, sulfato, fosforico, fosfonico o carboxllico; R2 es cualquier radical organico alifatico o aromatico que no contiene un grupo cargado y R3 es un engarce organico alifatico o aromatico sin cargar entre dos o mas cadenas polimericas cualquiera.
En la estructura polimerica representada en la Figura 2A, y>x, lo que significa que los grupos neutros (representados por “R2”) estan presentes en un numero mayor que los grupos cargados (representados por “R1”). En este caso, “x”, “y” y “z” son fracciones molares promedio de cada monomero en el pollmero y oscilan independientemente entre aproximadamente 0,001 y 0,999. El slmbolo m representa simplemente que esta fijada una cadena de pollmero similar en el otro extremo del reticulador.
En algunas realizaciones, el pollmero que contiene grupos de union es un copollmero de bloque, lo que significa que incluye una cadena larga o bloque de un tipo de monomero (p.ej., que contiene grupos de union neutros o cargados) seguido de una cadena larga o bloque de un tipo de un monomero diferente (p.ej. cargado si el primer bloque es neutro, y neutro si el primer bloque esta cargado).
En otras realizaciones, el pollmero que contiene grupos de union contiene los monomeros en un orden aleatorio.
En otras realizaciones mas, el pollmero que contiene grupos de union es un copollmero alternante, en el que cada monomero siempre esta adyacente a dos monomeros de diferente clase en cada lado.
En algunas realizaciones, una estructura qulmica representativa de un pollmero que contiene grupos de union es la representada en la Figura 2B, en la que R4 es NH o O; R5 es un grupo alifatico o aromatico lineal o ramificado como -CH2-, -C2H4-, -C3H6-, -C(CH3)2-CH2-, -C6H4-; y R6 es un grupo sin cargar alifatico o aromatico lineal o ramificado que contiene un engarce NH, O, o S para la cadena de pollmero.
En otras realizaciones, una estructura qulmica representativa de un pollmero que contiene grupos de union es la representada en la Figura 2C. R7 y R8 se seleccionan independientemente de un grupo que contiene uno o mas radicales organicos alifaticos o aromaticos neutros y puede contener heteroatomos como O, N, S, P, F, Cl y otros.
En otras realizaciones mas, una estructura representativa de un pollmero que contiene grupos de union esta representada por la Figura 2D.
Otra estructura qulmica representativa de un pollmero que contiene grupos de union, que esta injertado en un soporte solido esta representada en la Figura 2E. El soporte solido esta representado como un rectangulo. En la Figura 2E, se representa una estructura polimerica en la que R1 es un radical organico alifatico o aromatico que contiene un grupo de intercambio cationico, como p.ej., sulfonico, sulfato, fosforico, fosfonico o carboxllico; R2 es cualquier radical organico alifatico o aromatico que no contiene un grupo cargado. En la estructura polimerica representada en la Figura 2A, y>x, lo que significa que los grupos neutros (representados por "R2") estan presentes en un mayor numero que los grupos cargados (representados por "R1").
En algunas realizaciones, el pollmero de injerto que contiene grupos de union es un pollmero de bloque, lo que significa que incluye una cadena larga o bloque de un tipo de monomero (p.ej., que contiene grupos de union neutros o cargados) seguido de una cadena larga o bloque de un tipo de monomero diferente (p.ej., cargado si el primer bloque era neutro y neutro si el primer bloque era cargado).
En otras realizaciones, el pollmero que contiene grupos de union contiene los monomeros en un orden aleatorio.
En otras realizaciones, el pollmero que contiene grupos de union es un copollmero alternante, en el que cada monomero esta siempre adyacente a dos monomeros de diferente tipo.
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En algunas realizaciones, una estructura qulmica representativa de un pollmero que contiene grupos de union esta representada en la Figura F, en la que R4 es NH o O; R5 es un grupo alifatico o aromatico lineal o ramificado, como - CH2-, -C2H4-, -C3H6-, -C(CH3)2-CH2-, -C6H4-; y R6 es un grupo sin cargar alifatico o aromatico lineal o ramificado que contiene un engarce NH, O o S para la cadena de pollmero.
En otras realizaciones, una estructura qulmica representativa de pollmero que contiene grupos de union esta representada en la Figura 2G. R7 y R8 se seleccionan independientemente de un grupo que contiene uno o mas radicales organicos alifaticos y aromaticos neutros y puede contener heteroatomos como O, N, S, P, F, Cl y otros.
En otras realizaciones mas, una estructura representativa de pollmero que contiene grupos de union esta representada en la Figura 2H.
El grupo acido sulfonico en las Figuras 2B-2D y 2F-2H puede estar en una forma protonada tal como se representante, as! como en una forma de sal que contiene un contra-ion adecuado como sodio, potasio, amonio y similares.
IV. Dispositivos que llevan incorporadas las composiciones descritas en el presente documento
En algunas realizaciones, los soportes solidos que tienen grupos de union fijados, tal como se ha descrito en el presente documento, se incorporan en dispositivos. Los dispositivos adecuados para los soportes solidos como, por ejemplo, membranas microporosas, incluyen cartuchos de filtracion, capsulas y vainas. Entre los ejemplos de dispositivos se incluyen tambien los cartuchos de filtracion de placas apiladas descritos en las publicaciones estadounidenses Nos. US20100288690 A1 y US20080257814 A1. En el caso de estos dispositivos, se une permanentemente un soporte solido a la carcasa polimerica y los dispositivos tienen una entrada para llquido, una salida y una apertura de ventilacion y ademas reducen al mlnimo el volumen del llquido retenido. Otros ejemplos de dispositivo incluyen cartuchos de filtro plegados y cartuchos de filtro arrollados en espiral. Otros ejemplos mas de dispositivos son columnas de cromatografla. Las columnas de cromatografla se pueden producir a partir de una serie de materiales adecuados, como vidrio, metal, ceramica y plastico. El usuario final puede rellenar estas columnas con el soporte solido, o tambien es posible que vengan pre-rellenadas por el fabricante y que se suministren al usuario final ya rellenadas.
V. Metodos de uso de las composiciones y los dispositivos descritos en el presente documento
Los dispositivos que contienen soportes solidos que tienen grupos de union fijados (p.ej., grupos de union de intercambio cationico) se pueden utilizar para eliminar los agregados de protelna en un modo de flujo continuo. Antes de la aplicacion para separacion a escala preparativa, el proceso debe desarrollarse y validarse en cuanto a unas condiciones de solucion apropiadas como el pH y la conductividad, y se debe determinar el intervalo de carga de protelna en el dispositivo. Los metodos para el desarrollo y validacion de proceso son muy conocidos y se practican en la industria de forma habitual. Normalmente implican enfoques de Diseno de Experimentos (DoE) que se ilustran en los ejemplos a continuacion.
Los dispositivos se suelen lavar por descarga, desinfectar y equilibrar con una solucion de tampon apropiada antes de su uso. Se ajusta la solucion de protelna a una conductividad y un pH deseables y despues se bombea a traves de un dispositivo a una presion constante o a un flujo constante. Se recoge el efluente y se analiza para determinar el rendimiento de protelna y la concentracion de agregado.
En algunas realizaciones, un dispositivo para eliminar el agregado, tal como se describe en el presente documento, esta conectado directamente a un dispositivo de filtracion de virus que esta disenado para asegurar la eliminacion de partlculas virales sobre la base de su tamano, por ejemplo, tal como se instruye en la patente estadounidense No. 7.118.675.
La etapa de eliminacion de agregado por flujo continuo utilizando las composiciones y dispositivos descritos en el presente documento se puede incorporar en cualquier momento del proceso de purificacion de protelnas, p.je., en un proceso de purificacion de anticuerpo. En la Tabla 1 se describen ejemplos de procesos de purificacion de protelna que incorpora la eliminacion del agregado de flujo continuo como una o mas de las etapas intermedias, que se resalta en negrita. Debe entenderse que son posibles muchas variaciones de estos procesos.
La etapa de “captura de protelna” tal como se describe en el presente documento, se refiere a la etapa de un proceso de purificacion de protelna que implica el aislamiento de la protelna de interes de una muestra llquida de cultivo celular aclarado o sin aclarar realizando al menos dos de las siguientes etapas: i) someter el llquido de cultivo celular a una etapa seleccionada entre una o mas entre: adsorcion de la protelna de interes sobre una resina de cromatografla, una membrana, un monolito, un medio tejido o no tejido, precipitacion, floculacion, cristalizacion, union a una molecula pequena soluble o un ligando polimerico, obteniendo as! una fase de protelna que comprende la protelna de interes, como pueda ser un anticuerpo; y (ii) reconstituir la protelna de interes eluyendo o disolviendo la protelna en una solucion de tampon adecuada.
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La purificacion por union/elucion es una etapa de proceso opcional que consiste en la union de la protelna de interes a un medio de cromatografla adecuado, opcionalmente, el lavado de la protelna de union y su elucion con una solucion de tampon apropiada.
El pulido por AEX de flujo continuo es una etapa de proceso opcional que consiste en el flujo de la solucion de protelna de interes a traves de un medio de cromatografla AEX adecuado sin union significativa de la protelna de interes al medio.
El flujo continuo de carbon activado es una etapa de purificacion opcional disenada para eliminar las distintas impurezas relacionadas con el proceso, tal como se describe en la solicitud de patente provisional co-pendiente no. 61/575.349.
La filtracion de virus consiste en el flujo de la solucion de protelna a traves de una membrana porosa que puede presentarse en forma de lamina plana o fibra hueca que retiene las partlculas virales en un alto grado de LRV, al mismo tiempo que pasa sustancialmente toda la protelna de interes.
Tabla 1
Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Etapa 5
Proceso A
Captura de anticuerpo Purificacion union/elucion Pulido AEX de flujo continuo Eliminacion de agregado por flujo continuo Filtracion de virus
Proceso B
Captura de anticuerpo Eliminacion de agregado por flujo continuo Purificacion union/elucion Pulido AEX de flujo continuo Filtracion de virus
Proceso C
Captura de anticuerpo Purificacion union/elucion Eliminacion de agregado por flujo continuo Pulido AEX de flujo continuo Filtracion de virus
Proceso D
Eliminacion de agregado por flujo continuo Captura de anticuerpo Purificacion union/elucion Pulido AEX de flujo continuo Filtracion de virus
Proceso E
Captura de anticuerpo Eliminacion de agregado por flujo continuo Pulido AEX de flujo continuo Filtracion de virus
Proceso F
Captura de anticuerpo Eliminacion de agregado por flujo continuo Pulido AEX de flujo continuo Purificacion union/elucion Filtracion de virus
Proceso G
Captura de anticuerpo Pulido AEX de flujo continuo Eliminacion de agregado por flujo continuo Purificacion union/elucion Filtracion de virus
Proceso H
Captura de anticuerpo Pulido AEX de flujo continuo Eliminacion de agregado por flujo continuo Filtracion de virus
Proceso I
Captura de anticuerpo Flujo continuo de carbon activado Pulido AEX de flujo continuo Eliminacion de agregado por flujo continuo Filtracion de virus
Debe entenderse que en la Tabla 1 anterior, la etapa de captura de anticuerpo, as! como la purificacion de union/elucion se pueden llevar a cabo en cualquiera de los tres modos: (1) modo discontinuo, en el que se carga el medio de captura con la protelna diana, se detiene la carga, se lava y se eluye el medio y se recoge la reserva; (2) modo semi-continuo, en el que se lleva a cabo la carga de forma continua y la elucion es intermitente, p.ej., en el caso de un procedimiento de cromatografla multi-columna continuo empleando dos, tres o mas columnas; y (3) modo completamente continuo, en el que la carga y la elucion se llevan a cabo de forma continua.
El caudal optimo utilizado con el soporte solido de intercambio cationico de flujo continuo descrito en el presente documento puede tener a veces un efecto sobre el comportamiento de eliminacion del agregado del soporte solido y, cuando se ubica el soporte solido corriente arriba de un filtro de virus, puede afectar tambien al comportamiento del filtro de virus. El caudal optimo puede determinarse facilmente en un sencillo conjunto de experimentos utilizando la solucion de protelna de interes. Los caudales tlpicos entran dentro del intervalo comprendido entre aproximadamente 0,05 y 10 CV/min.
Algunos ejemplos de los procesos descritos en la Tabla 1, en particular el Proceso E, Proceso H y Proceso I, no incluyen una etapa de cromatografla de intercambio cationico de union y elucion, pero siguen asegurando la eliminacion de agregado utilizando los metodos descritos en el presente documento. La eliminacion de la etapa de cromatografla de intercambio cationico de union y elucion ofrece una serie de significativas ventajas para el proceso de purificacion corriente abajo, es decir, se ahorra tiempo de proceso, se simplifica el desarrollo del proceso, se
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elimina la limpieza y la validacion de la limpieza, etc. Otra solida ventaja es la eliminacion de elucion de alta conductividad, que da cabida a la realizacion de todo el proceso corriente abajo sin la adicion de sal y sin posteriores diluciones.
La presente invencion se ilustra ademas con los siguientes ejemplos que no deberan interpretarse como exhaustivos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparacion de membrana modificada superficialmente de intercambio cationico (CEX)
En este experimento, se prepararon membranas modificadas superficialmente CEX con una densidad variable de grupos de union, que en este caso son radicales de acido sulfonico con carga negativa. La densidad de los grupos de intercambio cationico fue controlada segun la formulacion de la solucion reactiva utilizada para modification superficial. Para conseguir una densidad inferior, se anadio un monomero reactivo sin carga, N,N-dimetilacrilamida, en diferentes cantidades.
Se preparo una serie de soluciones acuosas con un contenido de acido 2-acrilamido-2-metilpropanesulfonico (AMPS) comprendido entre 0 y 4,8 % en peso, de N,N-dimetilacrilamida comprendido entre 0 y 4,8 % en peso y 0,8 % en peso de N,N'-metilenbisacrilamida. Se corto una membrana de polietileno de peso molecular ultra-alto hidrofila con un tamano de poro valorado en 0,65 um y un grosor de 0,125 mm en piezas cuadradas de 14 cm por 14 cm y se sumergio cada una de las piezas en una de las soluciones durante 30 segundos para asegurar que se humedeclan completamente. Se escurrio el exceso de solucion y se expuso la membrana a 2 MRads de radiation de haz de electrones bajo una atmosfera inerte. A continuation, se aclaro la membrana con agua desionizada y se seco al aire.
En la Tabla 2 se enumeran las variantes de membranas modificadas superficialmente CEX que se prepararon. Se determino utilizando intercambio de ion litio que la densidad de grupo anionico era 0,13 mmoles/g para la Membrana 8 (sin anadir DMAM) y 0,08 mmol/g para la Membrana 7 (1:1 AMPS: DMAM en peso), que corresponde a densidades de ligando de 34 y 21 mM, respectivamente.
Ejemplo 2. Analisis de selectividad de union de agregado utilizando mediciones de la capacidad estatica
En este experimento, se sometieron a ensayo membranas CEX con diferentes densidades de grupos de union preparadas en el Ejemplo 1, en cuanto a su selectividad para la union de monomeros de protelna y agregados de protelna.
Se preparo una solucion de 2 g/l de un anticuerpo monoclonal parcialmente purificado, al que se hace referencia como MAb I, con un contenido de aproximadamente 15 % de agregados en 50 mM de tampon de acetato sodico, pH 5,0. Se empapo previamente un disco de membrana de 14 mm en el tampon de acetato y despues se transfirio a 0,5 ml de solucion de anticuerpo. Se agitaron suavemente los viales de solucion durante 15 horas y se analizaron las especies de peso molecular que quedaron en la solucion por cromatografla por exclusion de tamano. En la Tabla 2 se muestran los resultados.
Si bien los rendimientos generalmente bajos de MAb indican que se han cargado las membranas a una baja capacidad en este experimento, una de las variantes, Membrana 7, demostro una eliminacion practicamente completa de los dlmeros y agregados de alto peso molecular (HMW). Esto indica que es posible conseguir una solida selectividad de union de agregados.
Tabla 2
Membrana Muestra No.
AMPS % p (grupo de union CEX) DMAM % p (grupo neutro) monomero MAb que queda en rendimiento de solucion (%) Dfmero MAb que queda en el rendimiento de solucion (%) Agregado HMW MAb que queda en rendimiento de solucion (%)
1
0 4,8 82,5 86,1 80,4
2
0,1 4,7 80,8 69,2 81,8
3
0,2 4,6 86,6 75,4 94.5
4
0,4 4,4 88,4 77,9 106.5
5
0,6 4,2 78,0 63,5 53,7
6
1 3,8 70,3 32,3 n/d
7
2,4 2,4 29,4 1,6 n/d
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8 (membrana tecnica anterior descrita en WO 2010098867)
4,8 0 44,4 14,7 n/d
9
Control de membrana sin modificar 80,4 69,0 74,7
n/d - no detectado
Ejemplo 3. Eliminacion de agregados en modo de flujo continuo para un anticuerpo monoclonal parcialmente purificado (MAb I)
En un experimento representativo, se demostro el exito del uso de membranas de acuerdo con la presente invencion para la eliminacion de agregados de proteina de una muestra con un contenido de anticuerpo monoclonal en modo de flujo continuo.
Se sellaron cinco capas de la Membrana 7 del Ejemplo 1 en un dispositivo de polipropileno ventilado, con un area de filtracion de membrana frontal de 3,1 cm2 y un volumen de membrana de 0,2 ml. En adelante, se hace referencia a este tipo de dispositivo como dispositivo “Micro”. Se dializo MAb I purificado a 4,5 g/l en 50 mM de tampon acetato, pH 5,0. Se diluyo el material resultante, denominado MAb I parcialmente purificado, a una concentracion de 1 g/l de MAb I con 5 % de agregados, en 50 mM de acetato, pH 5, con una conductividad de ~3,0 mS/cm. A continuacion, se paso el material (aproximadamente 80-100 ml) a traves de dispositivos de 0,2 ml que contenian o bien la membrana 7 o bien la membrana 8 del ejemplo 1, o un dispositivo Acrodisk de 0,18 ml que contenia una membrana Pall Mustang® S (disponible en el mercado por Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) a ~ 1 CV/min. Antes de pasar el MAb, se humedecieron los dispositivos de membrana con agua 18 mQ y se equilibraron con 50 volumenes de columna (CV) de 50 mM de acetato sodico, pH 5,0. Se recogio el flujo continuo de la solucion MAb para su analisis utilizando cromatografia por exclusion de tamano analitica (SEC). En las figuras 3A-3C se muestran los resultados. Es evidente que la Membrana 7, con una densidad menor de grupos de union AMPS en comparacion con la Membrana 8, segun se establecio en el Ejemplo 1, ofrece una selectividad superior de union de agregados.
En la Tabla 3 se resume la capacidad de union de agregados de las tres membranas medidas a aproximadamente 20 % de paso sin retencion de agregados. Tal como se demuestra, la Membrana 7 presenta un aumento tres veces mayor de la capacidad de union de agregado en comparacion con las membranas disponibles en el mercado, p.ej., la membrana Pall Mustang® S, asi como la Membrana 8.
Tabla 3. Carga de dispositjvo y capacidad de paso sin retencion de dimero en torno a 20 %
Membrana
A % paso de dimero Carga de membrana (g/l) Capacidad de dimero (mg/ml) Rendimiento de monomero (%)
7
16,2 300 10,7 89,2
8
23,1 120 3,9 77,1
PALL Mustang S
28,6 120 3,7 71,0
Ejemplo 4. Eliminacion de agregados en modo de flujo continuo para anticuerpo monoclonal parcialmente purificado (MAb II)
En otro experimento, se demuestra el exito del uso de las membranas de acuerdo con la presente invencion para eliminar los agregados de proteina de una muestra que contiene un anticuerpo monoclonal diferente.
Se ajusto MAb II purificado de Proteina A a un pH 5,0 utilizando 1 M Tris base y a una conductividad de 3,4 mS/cm utilizando solucion de NaCl 5 M. El material resultante denominado MAb II parcialmente purificado tenia una concentracion de 6 g/l con 2,4 % de agregados. A continuacion, se paso el material (aproximadamente 18 ml) a traves de dispositivos de 0,2 ml que contenian o bien la membrana 7 o bien la membrana 8 del Ejemplo 1. Antes de pasar MAb a traves de la membrana, se humedecio la membrana con agua 18 mQ y se equilibro con 50 volumenes de columna (CV) de 50 mM de acetato sodico, pH 5,0. Se recogio el flujo continuo de la solucion MAb para su analisis por cromatografia por exclusion de tamano (SEC). Las 2 primeras fracciones fueron de ~4,5 ml cada una, mientras que el resto de las 10 fracciones fueron de 0,85 ml cada una. Despues del tratamiento de MAb, se lavo la membrana con 20 CV de 50 mM de acetato sodico, pH 5,0. Se eluyo la proteina unida utilizando de acetato sodico50 mM, pH 5,0 + 1 M NaCl en 30 CV. La cantidad total de MAb II cargada en las membranas fue 531 mg/ml. Se calculo el rendimiento de monomero MAb sobre la base de la cantidad de monomero en el flujo continuo frente al total de monomero que paso a traves de la membrana.
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Tal como se muestra en la Figura 4A, se observo muy poco agregado (<0,1 % en la reserva) en la reserva de paso sin retencion de la Membrana 7, hasta ~ 13 g/l de carga de agregado, en cambio se observo el paso sin retencion de agregado para la Membrana 8 incluso en la primera fraccion recogida, lo que indica una capacidad del agregado superior para la membrana 7. La cantidad de agregados en la reserva del paso sin retencion para la Membrana 8 fue 0,8 %. A una carga de agregado de 13 g/l, los rendimientos de monomero fueron 93 y 86 para la Membrana 8 y la Membrana 7, respectivamente. Aunque el rendimiento fue ligeramente mas bajo, no se observo el paso sin retencion de agregado para la Membrana 7. Un paso sin retencion posterior de los agregados es indicativo de una mayor capacidad de union del agregado. Estas curvas de paso sin retencion se pueden utilizar para guiar el diseno de un proceso o dispositivo de eliminacion de agregado a escala preparativa. Por ejemplo, un dispositivo que contiene la Membrana 7 puede cargarse a al menos 500 g/l para conseguir una pureza de la reserva de <0,1 % de agregados. Por lo general, es muy deseable una carga superior para aumentar el rendimiento de monomero y reducir el coste global asociado con el proceso. Por otra parte, se puede conseguir un mayor rendimiento aumentando la carga hasta que se observa el paso sin retencion del agregado o modificando las condiciones de solucion. Los datos de flujo continuo demuestran claramente el comportamiento superior de la Membrana 7 para la eliminacion de agregados.
La figura 4B presenta el rendimiento de monomero y los niveles de agregado en las reservas del paso sin retencion para dos ciclos diferentes utilizando dos lotes diferentes de Membrana 7. El ciclo 2 se cargo con 700 mg/ml en comparacion con el ciclo 1 a 530 mg/ml. Las condiciones de solucion (pH y conductividad) fueron similares en ambos ciclos, mientras que las concentraciones MAb fueron diferentes (ciclo 1: 6 g/l; ciclo 2: 4,4 g/l). La cantidad de agregados en la reserva fue similar en ambos ciclos, pero hubo algunas diferencias en el rendimiento (sin embargo, se anticipa que las diferencias en los rendimientos se podrlan atribuir a una variabilidad general de las tecnicas de analisis utilizadas para medir las concentraciones de MAb). Como dato curioso, incluso a una carga de MAb de 700 g/ml, la cantidad de agregados en la reserva es solamente 0,25% (ciclo 2; Figura 4B) lo que indica una capacidad de union para los agregados de > 15 g/l.
Ejemplo 5. Eliminacion de agregados en modo de flujo continuo para un anticuerpo monoclonal parcialmente purificado (MAb III) que contiene agregados inducidos de pH alto
En otro experimento, se demostro el exito del uso de membranas de acuerdo con la presente invencion para la eliminacion de agregados de protelna de una muestra que contiene otro anticuerpo monoclonal mas, MAb III.
Se preparo una solucion de material de alimentacion de IgG monoclonal parcialmente purificado (MAb III) a 6 g/l en 50 mM de tampon acetato, pH 5, con una conductividad de 3,5 mS/cm. Previamente, se impacto el MAb III a un pH alto (11) con el fin de generar 3,7 % de agregados en total (se midio por SEC-HPLC). Se pre-moldeo un dispositivo de filtracion Micro con un area de filtracion de 3,1 cm2 y un volumen de 0,2 ml utilizando 5 capas de Membrana 7. Antes de pasar el MAB, se humedecio la membrana con agua 18 mQ y se equilibro con 50 volumenes de columna (CV) de 50 mM de acetato sodico, pH 5,0. El flujo continuo de la solucion de MAb fue a 2,5 CV/min y se recogieron las fracciones para su analisis por cromatografla por exclusion de tamano analltica (SEC). La cantidad total de MAb III que se cargo en las membranas fue 930 mg/ml. Se calculo el rendimiento del monomero sobre la base de la cantidad de monomero en el flujo continuo frente al total de monomero que paso a traves de la membrana.
De manera similar a los Ejemplos 3 y 4 para MAb I y II, la Membrana 7 presento una alta selectividad y una alta capacidad de union (>10 mg/ml) para agregados de MAb III, tal como se muestra en la Figura 5.
Ejemplo 6: Purificacion de monomeros de proteina y agregados de proteina
En este experimento, se generaron preparaciones de monomeros de anticuerpo y agregados puros utilizando SEC preparativa para la posterior caracterizacion de la Membrana 7.
Se purificaron monomeros y agregados de una mezcla utilizando la resina Sephacryl S-300 HR (GE Healthcare). Se pasaron 4,5 ml de MAb parcialmente purificada a 4,5 - 6 g/l a traves de una columna de 330 ml. Antes de la inyeccion de MAb, se equilibro la columna con 1 volumen de columna (CV) de PBS. Se recogieron dos fracciones de elucion: fracciones de agregado y de monomero. Se concentro la fraccion de agregado 10 X utilizando una membrana Amicon UF de llmite 3000 MW y se analizo utilizando SEC analltica. El contenido de agregado fue >70 % en estas fracciones con una concentracion de ~0,5 g/l.
Ejemplo 7: Determinacion de parametros de modelo de la accion de masa esterica (SMA): carga caracterfstica (v) y constante de equilibrio SMA (KSMA)
Se diseno el siguiente experimento para elucidar el mecanismo de la selectividad de union de agregado observada para las membranas de acuerdo con la presente invencion. Utilizando el modelo de Accion de Masa Esterica (SMA) (vease p.ej., Brooks, C. A. and Cramer, S. M., Steric mass-action ion exchange: Displacement profiles and induced salt gradients. A/ChE Journal, 38: pp. 1969-1978, 1992), se midio el numero de interacciones de agregado con la superficie (v) y la constante de afinidad (Ksma) para el monomero y los agregados, para reflejar la afinidad de los monomeros y los agregados con la superficie.
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El modelo SMA se ha utilizado con exito para explicar algunas complejidades de interacciones de intercambio anionico no lineales. El modelo tiene en cuenta los sitios que no estan disponibles para las moleculas de protelna considerando tanto los sitios “perdidos” (p.ej., que no estan disponibles para union) como consecuencia de la interaction directa protelna-ligando como los sitios estericamente “perdidos” como consecuencia del impedimento de la protelna. Se da por supuesto que la cantidad de sitios “perdidos” como consecuencia del impedimento esterico es proporcional a la concentration de protelna unida. La ecuacion SMA para un sistema de un solo componente viene dada por:
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en la que Q y C son respectivamente concentraciones de protelna unida y libre. K es la constante de asociacion en equilibrio de SMA; v es la carga caracterlstica; a es el factor esterico; Csal es la concentracion de sal libre; Qsal es la concentracion de sal unida disponible para intercambio ionico; y a es la capacidad ionica total de la resina. La carga caracterlstica es el promedio del numero de sitios en el soporte solido modificado ocupados por una protelna a traves de interacciones ionicas y el factor esterico es el numero de sitios estericamente impedidos por una protelna tras la union con el adsorbente.
Para la region lineal de la isoterma de adsorcion (cuando Q es muy pequena a >> (a + v) Q y es posible aproximar la ecuacion anterior a:
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El termino Q/C se define como el coeficiente de partition (Kp) y la relation de coeficientes de partition se define como selectividad (S). Un metodo alternativo para determinar el coeficiente de particion es calculando la pendiente de la isoterma de adsorcion en la region lineal (p.ej., tal como se describe en la patente EE.UU. No. 8.067.182).
En un experimento, se humedecieron dispositivos Micro de membrana de 0,2 ml (que contiene tanto Membrana 7 como 8) utilizado agua y se equilibraron con 20 CV (4 ml) de 50 mM de acetato sodico, pH 5,0 (tampon A). Se inyectaron 100 pl de monomero o agregado purificado (en cuanto al proceso de purification descrito en el Ejemplo) a 0,5 g/l. Se eluyo la protelna unida utilizando 20 CV de gradiente de tampon A y tampon A + 500 mM NaCl. Se selecciono la concentracion de sal para los ciclos isocraticos sobre la base del intervalo de concentracion de sal (conductividad) en el que eluye la protelna. Se realizo el ciclo isocratico cargando 100 pl de protelna en la membrana. El tampon de corrida fue tampon A + sal (se utilizaron diferentes concentraciones de sal sobre la base del intervalo de elucion de protelna, tal como se ha descrito anteriormente). Se llevo un seguimiento del cromatograma de elucion utilizando senal UV280 o UV230 y se senalo el volumen de retention en el maximo de protelna. Se determinaron los parametros SMA utilizando el metodo de elucion isocratico tal como lo describe Pedersen, et al, (Pedersen, et. al., Whey proteins as a model system for chromatographic separation of proteins, J. Chromatogr. B, 790: pp. 161 -173, 2003).
En la Tabla 4 se resumen los parametros de SMA para MAb I para las Membranas 8 y 7. La Tabla 4 resume los parametros SMA para MAb II para las Membranas 8 y 7. Se determino Ksma dando por supuesta una capacidad ionica de 34 y 21 mM para las membranas 8 y 7, respectivamente. Se utilizo una porosidad de membrana de 78 %.
Tabla 4. parametros SMA para MAb I
MAb I
Especie V Ksma
Membrana 8
Monomero 13,2 1,04E13
Agregados
13,55 1,00E13
Membrana 7
Monomero 9,66 4,21 E10
Agregados
14,0 2,32E14
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MAb II
Especie V Ksma
Membrana 8
Monomero 9,8 2,79E9
Agregados
11,2 4,44E10
Membrana 7
Monomero 13,4 2,11E12
Agregados
23,4 9,06E21
Para ambos MAb, se observo que la diferencia en la carga caracterlstica del monomero y los agregados es superior para la Membrana 7, lo que indica un mayor numero de interacciones para los agregados que para los monomeros. Por otra parte, la afinidad (tal como se observa por KSMA) es superior para la Membrana 7 que para la Membrana 8.
Tal como queda representado en las Figuras 6A y 6B, se observo que el coeficiente de partition (una medida de la afinidad) para agregados es superior que la observada para monomeros en el caso de ambas Membranas 8 y 7, indicando as! una union mas fuerte a los agregados que a los monomeros. Tambien se observo que el efecto es mas pronunciado en el caso de la Membrana 7 en relacion con la Membrana 8, lo que demuestra un comportamiento superior de los primeros para la elimination de agregados.
Tal como se representa en la Figura 7, la Membrana 7 tiene una selectividad superior (S = relation entre el Kp del agregado y el Kp del monomero) que la membrana 8 para dos MAb diferentes (MAb I y MAB II) a pH 5,0 a todas las concentraciones de sal. Cabe destacar que la selectividad aumenta a medida que disminuye la concentration de sal para ambas membranas. Y, curiosamente el aumento de la selectividad es mucho mayor para la Membrana 7 que la Membrana 8, lo que indica que una selectividad superior podrla tener lugar incluso a una menor densidad de los grupos de union. Asimismo, tal como se representa en la Figura 7, los maximos beneficios de comportamiento (un mayor rendimiento de monomero y una mayor eliminacion de agregado) se obtuvieron incluso a concentraciones de sal menores (o una selectividad superior).
Ejemplo 8: Determinacion de ventana operativa para la Membrana 7
En un experimento representativo, se demostro, utilizando un enfoque de Diseno de Experimentos (DoE), que se puede conseguir una ventana de proceso practica, es decir, combination de pH de solution, conductividad ionica y carga de protelna sobre las membranas de acuerdo con la presente invention. El enfoque de Diseno de Experimentos (DoE) es una herramienta de ingenierla comunmente aceptada para identificar de forma fiable las condiciones operativas (vease, por ejemplo, Anderson, M.J. and Whitcomb, P.J. 2010 Design of Experiments. Kirk- Othmer Encyclopedic of Chemical Technology. 1-22).
Se llevo a cabo un enfoque DoE de respuesta superficial de material compuesto central aplicando con 3 factores en modo discontinuo para la Membrana 7 con el fin de determinar su ventana operativa. Los parametros que se investigaron fueron: pH, conductividad y carga de agregado. Se incubaron diversas cantidades de MAb I parcialmente purificado (0,5 - 2,1 ml) en distintas condiciones (Tabla 5) con 13 |jl de membrana durante 20 horas. A continuation, se analizo el sobrenadante en cuanto a los agregados y el rendimiento utilizando SEC analltica.
Tabla 6. Ciclos y resultados de un enfoque de Diseno de experimentos de respuesta superficial de material _________________________ compuesto central de 3 factores______________________________
Etiqueta
pH Cond (mS/cm) Carga de agregado (g/l) % monomero % rendimiento
1
4 3 5 100 78,4
2
6 3 5 100 85,9
3
4 10 5 100 77,7
4
6 10 5 95,6 100
5
4 3 15 98,1 92,8
Este estudio de DoE resalto tres parametros operativos clave - carga, pH y conductividad, en la determinacion del comportamiento de la membrana para el rendimiento y la eliminacion de agregados e indican un procedimiento simple para definir la ventana operativa deseada. En las Figuras 8 y 9 se traza el grafico de los resultados.
Ejemplo 9. Uso de membranas de acuerdo con la presente invencion en la proteccion de filtracion de virus corriente abajo durante la purificacion de anticuerpos utilizando una corriente de alimentacion que contiene agregados inducidos por calor
En este ejemplo se demuestra que se pueden emplear con exito las membranas que comprenden uno o mas grupos de intercambio cationico descritos en el presente documento para aumentar la tasa de transferencia de un filtro de virus corriente abajo en un proceso de purificacion.
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En general, se ha notificado anteriormente que es posible utilizar una membrana modificada superficialmente para tratar previamente el material de alimentacion de anticuerpo antes de la filtracion de virus (vease, por ejemplo, la patente estadounidense No. 7.118.675 y PCT la publicacion no. WO 2010098867). Dado el alto coste de la filtracion de virus, aumentar la tasa transferencia del filtro tiene un efecto directo sobre el coste final del producto de protelna. Actualmente, se distribuyen en el mercado una serie de productos comerciales especlficamente para aumentar la tasa de transferencia de los filtros de virus, incluyendo los distribuidos por EMD Millipore Corporation, p.ej., Viresolve® Prefilter y Viresolve® Pro Shield. Sin embargo, tal como se ha demostrado en el presente documento, las membranas de acuerdo con la presente invencion son bastante superiores en la protection de filtros de virus corriente abajo en comparacion con los descritos en la tecnica anterior o los que existen hoy en dla en el mercado.
Se preparo una corriente de alimentacion de IgG policlonal de choque termico para determinar la proteccion de un filtro de virus a 0,1 g/l, utilizando la IgG de SeraCare Life Sciences (Milford, Ma), Solution de Gamma Globulina Humana al 5 %, Catalogo no. HS-475-1L, en 50 mM de acetato, un pH 5, a 8,1 o 16,0 mS/cm (utilizando NaCl) a traves del siguiente procedimiento. Se agito un litro de una solucion 0,1 g/l (a 8,1 o 16,0 mS/cm) a 170 rpm al mismo tiempo que se calentada en un bano de agua constante establecido en 65 ° Celsius durante 1 hora despues de alcanzar la temperatura. Se retiro la solucion del calor y la agitation y se dejo enfriar a temperatura ambiente durante 3 horas y despues se refrigero a 4 °C durante toda la noche. Al dla siguiente se dejo templar la IgG policlonal de choque termico a la temperatura ambiente. Se prepararon soluciones frescas de 0,1 g/l de IgG policlonal en tampones filtrados para esterilizacion, pH y conductividad apropiados (8,1 o 16,0 mS/cm).
Se prepararon soluciones finales para realizar un ensayo completo utilizando 9 % en volumen de soluciones de reserva de IgG policlonal de choque termico y las soluciones de IgG policlonales 0,1 g/l recien preparadas. Se realizaron los ajustes del pH y la conductividad finales utilizando 10 M HCl, NaOH o 4 M NaCl. Se pre-moldearon dispositivos de filtracion Micro con un area de filtracion de 3,1 cm2 utilizando 3 capas de membrana y se colocaron en serie en una relation de area 1:1 con dispositivos Viresolve® Pro (EMD Millipore Corp., Billerica, MA). Se humedecieron previamente ambos dispositivos y se ventilaron para eliminar el aire utilizando el tampon solamente, pH 5, 5 mM de acetato, 8,1 o 16,0 mS/cm. A una presion constante de 30 psi (207 kPa), se midio un flujo inicial en ml de tasa de transferencia de tampon/min por masa durante un perlodo de 15 minutos para determinar el valor de flujo constante inicial. Se cambio el material de alimentacion por material de alimentacion de IgG policlonal de choque termico a 30 psi (207 kPa) y se midio la tasa de transferencia en volumen y se trazo un grafico con respecto al tiempo hasta que decayo el flujo a un 25 % del flujo del tampon inicial solamente. Se midio la tasa de transferencia total de IgG policlonal de choque termico en l/m2 a V75 y se convirtio a kg de membrana IgG/m2 policlonal. Tal como se puede observar en la Tabla 6, la Membrana 7 proporciono una proteccion superior de un filtro de elimination de virus (mayor transferencia volumetrica) que la Membrana 8.
Tabla 7
Tasa de transferencia de V75 (l/m2)
8,1 mS/cm 16 mS/cm
Viresolve® Pro solamente
46,5 26
Dispositivo Membrana 8 + Viresolve® Pro (Prior Art)
487 1,406
Disposiivo Membrana 7 + Viresolve® Pro
1,567 >2,390
Ejemplo 10. Uso de membranas de acuerdo con la presente invencion en la proteccion de filtro de virus corriente abajo utilizando un material de alimentacion de anticuerpo monoclonal
Se preparo una solucion de material de alimentacion de IgG monoclonal parcialmente purificado (MAb III) para 6 g/l en tampon acetato 50 mM, pH 5, con una conductividad de 8,5 mS/cm (con adicion de NaCl). El MAb III habla sido sometido a choque previamente a un pH superior (11) para generar aproximadamente 4 % de agregados en total (segun se mide por SEC-HPLC). Se moldearon previamente los dispositivos de filtracion Micro con un area de filtracion de 3,1 cm2 utilizando 3 capas de membrana y se colocaron en serie en una relacion de area 1:1 con dispositivos Viresolve® Pro (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA). Se humedecieron y se ventilaron previamente ambos dispositivos para eliminar el aire utilizando solamente el tampon filtrado esteril50 mM de acetato, pH 5, 8,5 mS/cm. Se acondiciono previamente tambien la membrana de virus durante 10 minutos a un caudal constante que genero una contrapresion constante de 30 psi (207 kPa). A continuation, se introdujo la solucion de MAb III a un flujo constante de 200 l/(m2-h) a traves de los dispositivos en serie y se midio la contra presion con respecto a tiempo. Se determino la tasa de transferencia de volumen total a un criterio de valoracion en el que la contrapresion alcanzo 30 psi. Se convirtio la tasa de transferencia l/m2 a un llmite de 30 psi (207 kPa) en kg de MAb por m2 de membrana.
Tal como se puede apreciar en la Tabla 8, a continuacion, la Membrana 7 proporciono una proteccion superior para un filtro de eliminacion de virus (una mayor transferencia volumetrica) que la membrana 8.
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Transferencia a 30 psi (kg/m2)
Viresolve® Pro solamente
0,06
Dispositivo Membrana 8 + Viresolve® Pro
0,33
Dispositivo Membrana 7 + Viresolve® Pro
0,66
Ejemplo 11. Efecto de tiempo de residencia en el comportamiento del filtro de virus
En este experimento representative, se investigo el efecto del tiempo de residencia en el comportamiento de una filtracion de virus, en el que se coloco el filtro de virus corriente debajo de la Membrana 7 en un proceso de purificacion de flujo continuo. Se observa que un menor caudal a traves del dispositivo que contiene la Membrana 7 y la etapa de filtracion de virus tiene como resultado una mayor tasa de transferencia del filtro de virus.
Se conecta un dispositivo de tres capas que contiene la Membrana 7, que tiene un area de membrana de 3,1 cm2 y un volumen de membrana de 0,12 ml, en serie con un dispositivo de filtracion de virus, que tiene un area de membrana de 3,1 cm2. Se procesa aproximadamente 3 mg/ml de una IgG humana policonal (Seracare) en 20 mM de tampon acetato sodico, pH 5,0, a traves de dos dispositivos conectados. Se lleva a cabo el experimento a dos caudales por separado, 109 y 200 LMH. Se coloca un filtro esteril de 0,22 pm entre el dispositivo de cromatografla de intercambio cationico y el dispositivo de filtracion de virus.
Se utiliza un sensor de presion para medir la presion a traves del conjunto a diferentes caudales. Normalmente, una presion de aproximadamente 50 psi (344 kPa) es una indicacion del atasco o ensuciamiento de la membrana de filtracion de virus. Tal como se muestra en la Figura 10, cuando se realiza el experimento a un caudal mas bajo (es decir 100 LMH), se puede procesar mas volumen de muestra a traves de la membrana de filtracion de virus (es decir, mayor tasa de transferencia) en relacion con el caso en el que se procesa la muestra a un caudal mayor (es decir 200 LMH). Esto se podrla atribuir a un tiempo de residencia mayor de la muestra en el dispositivo de cromatografla de intercambio cationico que puede tener como resultado una mejor union de agregados de IgG de peso molecular alto, evitando as! el atasco prematuro del filtro de virus.
Ejemplo 12. Conexion de varias etapas de eliminacion de impurezas en flujo continuo en una etapa
En este experimento representativo, se demuestra la viabilidad de conectar varias etapas de eliminacion de impurezas en una unica operacion, al mismo tiempo que se satisfacen los objetivos de pureza y rendimiento. Esto se realiza conectando los dispositivos individuales, en concreto carbon activado, un dispositivo de intercambio anionico (p.ej., ChromaSorb™), una mezcladora estatica en llnea y/o un tanque de compensacion para cambio de pH, un dispositivo de flujo continuo de intercambio cationico para la eliminacion de agregados, tal como se describe en el presente documento y un dispositivo de eliminacion de virus (p.ej. Viresolve® Pro).
A continuacion, se describen el ajuste, equilibrio y procedimiento.
El tren de purificacion de flujo continuo consiste en cinco operaciones unitarias principales. carbon activado (con un filtro de profundidad opcional al frente), un dispositivo de cromatografla de intercambio anionico (p.ej., ChromaSorb), una mezcladora estatica en llnea y/o un tanque de compensacion para el ajuste del pH en llnea, un dispositivo de flujo continuo de intercambio cationico para la eliminacion de agregado y un dispositivo de filtracion de virus (p.ej., Viresolve® Pro).
La Figura 11 ilustra el orden en el que se conectan estas operaciones unitarias.
Se pueden incluir las bombas necesarias, sensores de conductividad y UV de forma adicional.
Todos los dispositivos se humedecieron individualmente en una estacion diferente y despues se ensamblan. Los dispositivos se humedecen y se tratan previamente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se lava por descarga el filtro de lecho profundo (calidad A1HC) con 100 l/m2 de agua seguido de 5 volumenes de tampon en equilibrio 1 (EB1; tampon de elucion de Protelna A ajustado a pH 7,5 con 1 M Tris base, pH 11). Se rellena una columna de 2,5 cm Omnit con 2,5 ml de carbon activado tal como se describen en la solicitud de patente provisional estadounidense co-pendiente No. 61/575,349, registrada el 19 de agosto 19, 2011, para producir una carga de MAb de 0,55 kg/l. Se lava por descarga la columna con 10 CV de agua y despues se equilibra con EB1 hasta que se estabiliza el pH a un pH 7,5. Se conectan dos dispositivos ChromaSorb (0,2 y 0,12 ml) en serie para conseguir una carga de anticuerpo de 4,3 kg/l. Se humedecen los dispositivos con agua a 12,5 CV/min durante al menos 10 minutos, seguido de 5 DV EB1. Se utiliza una mezcladora estatica con helice desechable (Koflo Corporation, Cary, IL) con 12 elementos para realizar ajustes del pH en llnea. Se conectan dispositivos de 1,2 ml que contienen Membrana 7 en paralelo para eliminar los agregados, de manera que se pueden cargar aproximadamente 570 mg/ml de anticuerpo.
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Se humedecen con 10 DV de agua seguido de 5 DV de tampon de equilibrio 2 (EB2; EB1 ajustado a un pH 5,0 utilizando 1 M de acido acetico). Se trataron los dispositivos posteriormente con 5 DV (volumenes de dispositivo) de EB2 + 1 M NaCl y a continuacion, se equilibro con 5 DV EB2. Se humedecio un dispositivo de 3,1 cm2 VireSolve® Pro con agua presurizada a 30 psi (207 kPa) durante al menos 10 min. A continuacion, se lleva un seguimiento del caudal cada minuto hasta que el caudal permanece constante durante 3 minutos seguidos. Despues de humedecer y equilibrar todos los dispositivos, se conectan, tal como se muestra en la Figura anterior. Se hace correr EB1 a traves de todo el sistema hasta que las lecturas de la presion y las lecturas del pH se estabilizan. Tras el equilibrio, se pasa el material de alimentacion (elucion de Protelna A ajustada a un pH 7,5) a traves del tren de flujo continuo. Durante el ciclo, se recogen las muestras antes del tanque de compensacion y despues de Viresolve® Pro para controlar la concentracion de IgG y los niveles de impurezas (HCP, dNa, PrA lixiviado y los agregados). Despues de procesar el material de alimentacion, se lava por descarga el sistema con 3 volumenes muertos de eB1 para recuperar la protelna en los dispositivos y en el bombeo.
El material de alimentacion para el proceso de flujo continuo conectado es eluato de Protelna A de MAb IV, producido en un proceso de protelna discontinuo. El nivel natural de agregados en este MAb no excede 1 %, de manera que se desarrollo un procedimiento especial para aumentar el nivel de agregados. Se elevo el pH de la solucion a 11 con NaOH acuoso, con agitacion suave y se mantuvo durante 1 hora. A continuacion, se redujo el pH lentamente a pH 5, con HCl acuoso, con agitacion suave. Se repitio el ciclo del pH 4 veces mas. El nivel de agregados final es aproximadamente 5 %, que consisten sobre todo en dlmeros y trlmeros de MAb IV segun se mide por SEC. A continuacion, se dializa la corriente de alimentacion en tampon Tris-HCl, pH 7,4, conductividad aproximadamente 3 mS/cm.
El material de alimentacion de MAb procesado para este ciclo es 102 ml de 13,5 mg/ml MAb IV a un caudal de 0,6 ml/min.
El paso sin retencion de HPC en funcion de la carga de dispositivo tras ChromaSorb esta por debajo del llmite superior de 10 ppm (Figura 12). Los agregados se reducen de 5 % a 1,1 % con el dispositivo CEX (Figura 13). El rendimiento de MAb IV del proceso conectado es 92 %. La tasa de transferencia del dispositivo Viresolve® Pro fue > 3,7 kg/m2.
Los Ejemplos 13-19 demuestran la viabilidad de la fabricacion de composiciones para eliminar agregados en un modo de flujo continuo utilizando una resina de intercambio cationico o fibras de malla al azar como soportes solidos en lugar de una membrana.
Ejemplo 13. Preparacion de resina de intercambio cationico (CEX) fuerte polimerica modificada con un copolimero de inierto de AMPS/DMAM
En este experimento representativo, se preparo una serie de resinas de intercambio cationico (CEX) con una superficie de copolimero AMPS/DMAM injertada (CEX fuerte) con una densidad variable de grupos de union, que son radicales de acido sulfonico con carga negativa. La densidad de ligandos y la composicion el grupo de intercambio cationico fuerte se controla mediante la composicion de la solucion reactiva utilizada para la modificacion superficial. Para variar la densidad de los grupos de intercambio cationico fuertes, se anadieron los monomeros reactivos cargados y sin cargar AMPS y DMA en varias relaciones molares.
Se marca un matraz de tres bocas de 1000 ml con agitador mecanico y embudo de vertido a un volumen definido de 830 ml. En este matraz, se disuelven 8,25 g de hidroxido sodico en 429,34 g de agua desionizada. Se enfria la solucion a 0°C y se anaden 13,68 g de AMPS lentamente en varias porciones mientras se agita. A continuacion, se anaden 26,22 g de DMAM. Se ajusta el valor de pH de la solucion a 6,0-7,0 por adicion de 65 % acido nitrico y/o 1 M de hidroxido sodico. Se anaden 400 ml de resina de perla de base polimerica sedimentada con un tamano de particula medio de 50 micrometros a la solucion con agitacion suave (120 rpm). Se ajusta el volumen total de la mezcla de reaccion a 830 ml (de acuerdo con la marca) mediante la adicion de agua desionizada. Se vuelve a ajustar el valor de pH de la mezcla a un pH de 6,0 a 7,0 mediante la adicion de 65 % de acido nitrico. Se agita la mezcla suavemente (120 rpm) y se calienta a 40 °C. Se anade una solucion de 6,75 g de nitrato de amonio y cerio (IV) y 2,96 g de acido nitrico al 65 % en 15 g de agua ionizada rapidamente con agitacion vigorosa (220 rpm). A continuacion, se agita la mezcla de reaccion a 120 rpm a 40 °C durante 3 horas.
A continuacion, se vierte la mezcla de reaccion en una frita de vidrio (porosidad P3) y se separa el sobrenadante por succion. Se lava la resina restante sucesivamente con las siguientes soluciones: 3 x 400 ml de agua desionizada; 10 x 400 ml 1 M acido sulfurico + 0,2 M acido ascorbico; 3 x 100 ml de agua desionizada; 10 x 400 ml de agua desionizada caliente (60 °C); 2 x 400 ml de agua desionizada; 2 x 400 ml de hidroxido sodico1 M; 2 x 100 ml de agua desionizada; durante una segunda etapa de lavado con agua desionizada, ajuste del pH a 6,5-7,0 con acido clorhidrico al 25 %; 2 x 400 ml etanol al 70 % / agua desionizada al 30 %; 2 x 100 ml de agua desionizada; y 2 x 100 ml de etanol al 20 % / agua desionizada al 80 % + 150 mM NaCl.
Una vez completado el procedimiento de lavado indicado, se almacena la resina como una suspension 1:1 (v/v) en una solucion de etanol al 20 %, agua desionizada al 80 % y 150 mM NaCl.
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En la Tabla 9 se enumeran las resinas CEX fuertes que contienen acido sulfonico sintetizadas con diversas relaciones molares de AMPS y DMAM preparadas de acuerdo con este ejemplo.
Tabla 9: Resinas CEX sintetizadas preparadas de acuerdo con este Ejemplo
Ejemplo
No. lote Interno Cantidad molar de DMAM [mol] Cantidad molar AMPS [mol] Relacion molar DMAM/AMPS Capacidad ionica [meq/ml]
A
12LP-DZ105 0,30 0,075 4 32,5
B
12LP-DZ128 0,375 0,075 5 27,7
C
12LP-DZ129 0,45 0,075 6 24,7
D
12LP-DZ119 0,00 0,075 SO3 Puro 12,0
Ejemplo 14. Eliminacion de agregados de un material de alimentacion de anticuerpo monoclonal utilizando una resina de intercambio cationico (CEX) fuerte polimerica modificada con copolimero de inierto AMPS /DMAM
Se relleno con muestras de resina Lote no. 1 2LPDZ11 9, 1 2LPDZ1 28 y 1 2LPDZ1 29 una columna de cromatografla Omnifit® con un diametro interno de 6,6 mm a una altura de lecho de 3 cm con el resultado de aproximadamente 1 ml de lecho de resina rellenada. Se equipo un sistema de cromatografla Explorer 100 AKTA y se equilibro con tampones apropiados para explorar estas columnas para cromatografla de flujo continuo (Tabla 10). Se cargaron las columnas de cromatografla que contenlan muestras de resina 1 2LPDZ11 9, 1 2LPDZ1 28 y 12LPDZ129 sobre el sistema de cromatografla con tampon de equilibrio. El material de alimentacion fue IgG1 (MAbB) que se purifico utilizando un medio de cromatografla de afinidad ProSep® Ultra Plus y se ajusto a un pH 5,0 con 2 M Tris base. La concentracion final de MAbB de la reserva de protelna A fue 13,8 mg/ml, contenla 2,05 % de producto agregado y la conductividad fue aproximadamente 3,5 mS/cm. Se cargaron las resinas a un tiempo de residencia de 3 minutos y una densidad de carga de 414 mg/ml.
Tabla 10: Metodo para realizar experimentos de cromatografla para las muestras de resina Lote No. 12LPDZ119, ___________________________________12LPDZ128y 12LPDZ129__________________________________
Metodo de rastreo de cromatografla de flujo continuo de resinas 12LPDZ119, 12LPDZ128 y 12LPDZ129
Etapa
Solucion Tiempo de residencia (minutos) Volumenes de columna
Equilibrio
50 mM acetato sodico pH 5 3 8
Carga
50 mM acetato sodico pH 5 con 13,8 mg/ml mAbB 3 30 (414 mg Protelna/ml Resina)
Lavado
50 mM acetato sodico pH 5 3 10
Depuracion
50 mM acetato sodico pH, 750 mM NaCl 3 5
Lavado in situ
0,5 M NaOH 3 5
Equilibrio
50 mM acetato sodico pH 5 3 5
Se recogio el flujo continuo en fracciones de 2 ml y se sometieron a ensayo para determinar el total de concentracion de protelna en un espectrofotometro NanoDrop 2000 y se determino cuantitativamente el contenido de agregado por cromatografla de llquidos de alto rendimiento por exclusion de tamano (SE-HPLC). Se llevo a cabo el ensayo de cuantificacion de agregados Tosoh Bioscience TSKGel G3000SWXL, 7,8 mm x 30 cm, 5 pm (Catalogo No. 08541) columna con tampon de equilibrio de 0,2 M fosfato sodico, pH 7,2. Los resultados muestran que se recoge la protelna monomerica mAbB en la fraccion de flujo continuo en altas concentraciones a cargas de protelna acumulativa relativamente mucho menores que el producto agregado.
Para el Lote No. 12LPDZ119, se recuperaron 368,1 mg o aproximadamente 88,9 % de protelna a una carga acumulativa de protelna de 414 mg/ml, se redujo el nivel de agregado de 2,05 % a 0,39 % en las fracciones de flujo continuo, y la reserva de depuracion contenla 21,2 % de agregados lo que sugiere la capacidad de la resina para retener agregados selectivamente.
Para el Lote No. 12LPDZ128, se recuperaron 357,9 mg o aproximadamente 86,4 % de protelna a una carga de protelna acumulativa de 414 mg/ml, se redujo el nivel de agregados de 2,05 % a 0,14 % en las fracciones de flujo continuo y la reserva de depuracion contenla 13,4 % de agregados lo que indica la capacidad de la resina para retener agregados selectivamente.
Para el Lote No. 12LPDZ129, se recuperaron 359,9 mg o aproximadamente 86,9 % de protelna a una carga de protelna acumulativa de 414 mg/ml, se redujo el nivel de agregado de 2,05 % a 0,52 % en las fracciones de flujo continuo y la reserva de depuracion contenla 16,8 % de agregados lo que indica la capacidad de las resinas para
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retener agregados selectivamente.
La Figura 14 representa el paso sin retention del monomero mAbB y agregados para el Lote No. 12LPDZ119; La Figura 15 representa el paso sin retencion de monomero MAbB y agregados para el Lote No. 12LPDZ128; y la Figura 16 representa el paso sin retencion de monomero MAbB y agregados para el Lote No. 12LPDZ129.
Tal como se demuestra en la Figura 14, con la resina del Lote No. 12LPDZ119, la concentration de MAbB recogida en las fracciones de flujo continuo alcanza > 90 % de su concentracion de carga original con 110 mg/ml de carga de protelna acumulativa. En cambio, el nivel de agregado fue de solamente 0,56 % o 27,8 % de la concentracion de carga original a 414 mg/ml de carga de protelna acumulativa. Esto indica que la resina retiene selectivamente especies agregadas para cargas alta de protelna al mismo tiempo que permite la recuperation de monomero de protelna MAb) a un 88,9 % de su masa inicial total.
Tal como se demuestra en la Figura 15, con la resina del Lote No. 12LPDZ128, la concentracion de mAbB recogida en las fracciones de flujo continuo alcanza > 90 % de su concentracion de carga original con 138 mg/ml de carga de protelna acumulativa. En cambio, el nivel de agregado fue de solamente 0,42 % o 20,9 % de la concentracion de carga original a 414 mg/ml de carga de protelna acumulativa. Esto indica que la resina retiene selectivamente especies agregadas para cargas altas de protelna al mismo tiempo que permite la recuperacion del monomero de protelna a un 86,4 % de su masa inicial total.
Tal como se demuestra en la Figura 16, con la resina del Lote No. 12LPDZ129, la concentracion de mAbB recogida en las fracciones de flujo continuo alcanza > 90 % de su concentracion de carga original con 110 mg/ml de carga de protelna acumulativa. En cambio, el nivel de agregado fue solamente 0,99 % o 49,2 % de la concentracion de carga original a 414 mg/ml de carga de protelna acumulativa. Esto indica que la resina retiene selectivamente especies agregadas para cargas altas de protelna al mismo tiempo que permite la recuperacion del monomero de protelna a un 86,9 % de su masa inicial total.
Ejemplo 15. Preparacion de una resina (CEX) de intercambio cationico fuerte modificada con un copolimero de inierto AMPS /DMAM
En un tarro de vidrio de 250 ml, se anadieron 64 ml de una torta humeda de resina de cromatografla Toyopearl HW75-F A continuation, se anadieron, 115 g de hidroxido sodico 5M, 18,75 g de sulfato sodico y 4 ml de eter alil glicidllico (AGE) al tarro que contenla la resina. A continuacion, se coloco el tarro en un hibridador a 50°C durante toda la noche con rotation a velocidad media. Al dla siguiente, se dreno el filtro en un conjunto de filtro de vidrio sinterizado (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA) y se lavo la torta humeda con metanol y despues de aclaro con agua desionizada. En un vial de vidrio, se anadieron 10 ml de la torta humeda de la resina AGE activada. Se anadieron al vial de vidrio, 0,2 g de persulfato de amonio, 0,3 g de AMPS, 1,2 g de DMAM y 48 g de agua desionizada y se calentaron los viales a 60°C durante 16 horas. Al dla siguiente, se dreno por filtration la resina en un conjunto de filtro de vidrio sinterizado (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA) y se lavo la torta humeda con una solution de metanol y agua desionizada y se etiqueto la resina como Lote No. 1712.
Ejemplo 16. Eliminacion de agregados a diferentes tiempos de residencia de un material de alimentacion de anticuerpo monoclonal utilizando una resina de intercambio cationico (CEX) polimerica modificada con un copolimero de inierto AMPS/DMAM
Se relleno con resina resultante, Lote # 1712 del Ejemplo 14 una columna de cromatografla Omnifit® con un diametro interno de 6,6 mm a una altura de lecho de 3 cm con el resultado de aproximadamente 1 ml de lecho de resina rellenada. Se equipo un sistema de cromatografla AKTA Explorer 100 y se equilibro con tampones apropiados para explorar estas columnas para cromatografla de flujo continuo (similar al ejemplo 14). Se cargaron las columnas de cromatografla que contienen la muestra de resina en un sistema de cromatografla con un tampon de equilibrio. El material de carga fue un material de carga de IgG1 (mAb5) que fue purificado utilizando un medio de cromatografla de afinidad ProSep® Ultra Plus y se ajusto a un pH 5,0 con 2 M base Tris. Se diluyo la concentracion final de la reserva de Protelna A a 4 mg/ml, contenla un 5,5 % de producto agregado y una conductividad de aproximadamente 3,2 mS/cm. Se cargo la resina a un tiempo de residencia de 1, 3, o 6 minutos y a una densidad de carga de 144 mg/ml. La fraction maxima de depuration durante el tiempo de residencia de 3 minutos contenla 95,6 % agregados lo que indica un alto nivel de selectividad de especies agregadas. En la tabla 11, a continuacion, se representan los resultados.
En la Tabla 11 se representa la retencion del monomero y agregados para el Lote No. 1712 con MAb5 a un pH 5,0 a 6, 3, o 1 minutos de tiempo de residencia. Tal como se muestra en la Tabla 11, como promedio, se pueden recoger especies monomericas a concentraciones cercanas a la concentracion de alimentacion relativamente pronto en comparacion con las especies agregadas para todos los tiempos de residencia sometidos a ensayo, lo que indica que la selectividad es relativamente independiente de los caudales.
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Recogida de flujo continuo
Densidad de carga de proteina acumulativa Promedio de tiempos de residencia 6, 3, o 1 Minuto Tiempo de residencia de 6 minutos Tiempo de residencia de 3 minutos Tiempo de residencia de 1 minuto
Fraction No.
(mg/ml) % Proteina en flujo continuo % Agregados % Agregados % Agregados
1
16 13,5 0,0% 0,0% 0,0%
2
32 94,3 0,0% 0,0% 0,0%
3
48 94,4 0,0% 0,0% 0,0%
4
64 95,2 0,0% 0,0% 0,0%
5
80 98,3 0,5% 0,0% 0,0%
6
96 100,0 0,7% 0,3% 0,0%
7
112 99,3 1,1% 0,9% 2,1%
8
128 100,0 2,3% 1,6% 2,8%
9
144 100,0 3,1% 3,6% 4,8%
La Figura 17 representa un cromatograma del Lote No. 1712 con MAb5 a pH a tiempos de residencia de 5 y 3 minutos. Tal como se representa en la Figura 17, la mayor parte del producto se recoge en el flujo continuo y esto lo indica el paso sin retention relativamente rapido de la traza UV de protelna. El tamano maximo de depuration varla generalmente sobre la base de las condiciones y la masa total cargada pero esta relativamente enriquecida con especies de agregado a 95,6 % en comparacion con el material cargado que tenia solamente 5,5 % de agregados.
Ejemplo 17. Purificacion de un anticuerpo monoclonal utilizando cromatografla de afinidad de Protelna A seguido del uso de una resina de cromatografla
En un experimento representativo descrito en el presente documento, se purifico un anticuerpo monoclonal utilizando cromatografla de afinidad de protelna A seguido del uso de una resina de cromatografla de acuerdo con la presente invention. Los resultados de este experimento demuestran un hallazgo inesperado de que los metodos no requerlan un aumento de la conductividad o el uso de diluciones cuando se pusieron en marcha en un modo de flujo continuo.
Se expreso una IgG1 (MAb5) en un cultivo celular de celulas de ovario de hamster chino (CHO). Se clarifico un cultivo celular por filtration de lecho profundo en dos etapas seguido de filtration esteril. En primer lugar se clarifico el culturo celular que contenla 0,5 mg/ml de mAb5 utilizando medios de cromatografla de afinidad ProSep® Ultra Plus (Proteina A). El tampon de elucion de cromatografla de proteina A utilizado fue acido acetico 100 mM. Se ajusto el pH de la reserva de elucion de protelna A a un pH de 5,0 utilizando 2 M Tris base y la conductividad de la solution resultante fue aproximadamente 3,5 mS/cm. Se hizo correr la resina Lote No. 1712 en un modo de flujo continuo de acuerdo con el metodo descrito en el presente documento a un tiempo de residencia de 3 minutos y se recogieron fracciones de flujo continuo y se reservaron pequenas partes allcuotas para el ensayo.
Se agruparon las fracciones de flujo continuo, se ajustaron a un pH 7,5 y se hicieron correr en modo de flujo continuo utilizando o bien ChromaSorb, que es un absorbente de membrana de intercambio anionico tolerante de sal, que se cargo a 5 kg/l o bien Fractogel TMAE que es una resina de intercambio anionico que se cargo a 150 mg/ml. Se sometieron a ensayo las fracciones para la concentration de protelna, nivel de agregado, proteina A lixiviada y proteinas de ovario de hamster china (CHOP). En la tabla 12, a continuation, se muestran los resultados.
Tabla 12
Etapa 1
Etapa / Carga de proteina % Recuperacion para Etapa % Agregados en reserva Proteina A lixiviada reserva (ppm) CHOP en reserva(ppm)
Reserva cromatografla de afinidad de Protelna A
97 5,40 251 24000
Resina Lote No. 1712 corrida en modo de flujo continuo tal como se describe en el presente documento
Etapa 2
16 14 0,00 0,4 1
32
94 0,00 1,8 1300
48
94 0,00 1,9 4400
64
95 0,00 2,1 9300
80
98 0,50 2,4 19400
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25
30
35
40
45
Etapa 3 o Etapa 3
96 100 0,70 2,5 24800
112
99 1,10 3,1 25500
Reserva ClEx FT
> 90 % <0,5 % 0,8 (ppm) 11500(ppm)
Absorbente membrana de intercambio anionico ChromaSorb
> 90 % < 0,5% NA 60
Fractogel TMAE
> 90 % < 0,5% NA 200
Normalmente, un proceso de purificacion cromatografica implica una cromatografla de intercambio cationico de union y elucion como etapa anterior a la cromatografla de intercambio anionico y ademas requiere una etapa de dilucion o una etapa de intercambio de tampon para reducir la conductividad a un nivel que es adecuado para la cromatografla de intercambio anionico de flujo continuo. Sin embargo, tal como se muestra en la Tabla 12, los procesos descritos en el presente documento utilizando medios de intercambio cationico de acuerdo con la presente invention no requieren un aumento de la conductividad para operar y, en consecuencia, no requieren una etapa de dilucion o una etapa de intercambio de tampon antes de la etapa de purificacion.
Ejemplo 18. Preparacion de fibra de malla dispuesta al azar de intercambio cationicos (CEX) fuerte modificada con un copolimero de inierto AMPS/DMAM
En este experimento representativo, se utilizaron fibras de malla al azar de intercambio cationico como soporte solido.
Se combinaron en un tarro de vidrio de 1 l, 20 g de fibras varios lobulos de nilon, o fibras de mallas dispuestas al azar, con 400 g de hidroxido sodico 4M, 24 g de sulfato sodico y 160 ml de eter alil gliclclico (AGE). A continuation, se coloco el tarro en un hibridador a 50 °C durante toda la noche girando a una velocidad media. Al dla siguiente, se filtraron las fibras en un conjunto de filtro de vidrio sinterizado y se lavaron las fibras con metanol y se aclararon con agua Milli-Q. Un dla despues, se lavaron las fibras con agua, seguido de metanol y despues agua de nuevo, se succiono para obtener una torta seca y se seco en un horno de vaclo a 50 °C durante 1 dla. Se etiqueto la muestra resultante Muestra No. 1635. En tres viales de vidrio por separado, se pesaron 2 gramos de una torta seca de la muestra No. 1635, fibras AGE activadas, y se anadieron a un vial de vidrio para modificarlo adicionalmente por injerto. Se anadieron al vial de vidrio persulfato amonico, AMPS, DMAM y agua desionizada en las cantidades especificadas en la Tabla 13 y se calento el vial a 60 °C durante 16 horas con rotation continua. Al dla siguiente, se filtraron las muestras de fibra en un conjunto de filtro de vidrio sinterizado y se lavo la torta humeda con una solution de agua desionizada. Se etiquetaron los viales que contenlan las fibras como Lote # 1635-1, 1635-2 y 1635-5. A continuacion, se titulo el Lote No. 1635-5 en cuanto a la reducida capacidad ionica, que segun se observo era aproximadamente 28 pmoles/ml. A continuacion, se dio por supuesto que las muestras No. 1635-1 y No. 1635-2 tenlan tambien una capacidad ionica reducida inferior a 28 pmoles/ml.
Tabla 13
Ingredientes
No.1635-1 No.1635-2 No.1635-5
Fibras (g)
2,0 2,0 2,0
Persulfato amonico (g)
0,18 0,18 0,18
AMPS (g)
0,48 0,60 0,72
DMAM (g)
0,48 0,60 0,72
Agua (g)
28,86 28,62 28,38
Ejemplo 19: Eliminacion de agregados de una corriente de alimentacion de anticuerpo monoclonal utilizando fibras de mallas dispuestas al azar de intercambio cationico fuerte (CEX) modificadas con copolimero iniertado de AMPS/DMAM
Se relleno una columna de cromatografla Omnifit® con las fibras de malla dispuestas al azar modificadas resultantes, Lote no. 1635-1, no. 1635-2, no. 1635-5 del Ejemplo 17 en una columna de cromatografla con un diametro interno de 6,6 mm hasta una altura de lecho de 3 cm con el resultado de un lecho de fibra relleno de aproximadamente 1 ml. Se equipo un sistema de cromatografla AKTA Explorer 100 y se equilibro con tampones apropiados para explorar estas columnas para cromatografla de flujo continuo (similar al Ejemplo 13). Se cargaron columnas de cromatografla que contienen las muestras de fibra de malla dispuestas al azar sobre el sistema de cromatografla con un tampon de equilibrio. El material de alimentacion fue un material de alimentacion de IgG1 (mAb5) purificado mediante el uso de cromatografla de afinidad de protelna A y se ajusto a un pH 5,0 con 2 M Tris base. La concentration final de la reserva de protelna A fue 4 mg/ml y contenla 5,5 % de agregado o producto HMW. Se rellenaron las columnas con fibra Lote no. 1635-1 y Lote no. 1635-2 a una carga de masa de 64 mg/ml y se cargo la columna con fibra Lote1635-5 a una carga de masa de 80 mg/ml. En la Tabla 14 a continuacion se
representan los resultados.
5
*N/A = no aplicable
Carga de protelna acumulativa mg/ml
Fibra Lote No. 1635-1 Fibra Lote No. 1635-2 Fibra Lote No. 1635-5
Monomero (%)
Dlmeros (%) LMW (%) Monomero (%) Dlmeros (%) LMW (%) Monomero (%) Dlmeros (%) LMW (%)
8
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
16
85,8 0,0 14,0 86,0 0,0 15,6 1,7 0,0 10,2
24
84,3 0,0 15,6 85,6 0,0 14,8 51,8 0,0 13,4
32
83,2 0,6 16,0 83,0 0,0 17,1 85,6 0,0 15,1
40
79,4 2,4 17,7 81,1 0,0 14,9 86,5 0,0 13,9
48
79,6 4,4 15,8 82,5 1,5 15,9 83,3 0,0 15,8
56
82,4 4,4 12,8 79,4 2,1 18,3 87,1 0,0 13,1
64
81,1 4,5 14,2 83,1 3,1 14,7 85,4 2,3 13,6
72
N/A* N/A N/A N/A N/A N/A 85,7 4,0 13,6
80
N/A N/A N/A N/A N/A N/A 85,1 5,1 13,8
Maxima depuracion
38,0 63,5 0,0 54,4 35,0 11,0 51,3 43,0 5,6

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso de flujo continuo para aumentar la pureza de una molecula diana en un eluato de Protelna A, que comprende las etapas de:
    a) contacto del eluato recuperado de una columna de cromatografla de Protelna A con un pollmero que incluye dos o mas monomeros, en donde el pollmero comprende uno o mas grupos de union de intercambio cationico fijados al mismo, a una densidad de 1 a 30 mM, y el pollmero esta injertado a traves de un engarce en una resina
    imagen1
    en la que y > x; y
    b) obtencion de una muestra de flujo continuo de la Etapa a) que comprende la molecula diana,
    en donde el nivel de agregados en la muestra de fluido continuo es inferior al nivel de agregados en el eluato de Protelna A, aumentando as! la pureza de la molecula diana.
  2. 2. Un proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el proceso se realiza a una conductividad ionica menor o igual a 10 mS/cm.
  3. 3. El proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la molecula diana es un anticuerpo monoclonal.
  4. 4. El proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la molecula diana es una protelna recombinante.
  5. 5. El proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la resina de cromatografla o la perla porosa son una perla polimerica de polieter vinllico o una perla de pollmero de polimetacrialto reticulado poroso.
  6. 6. El proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los agregados son agregados de protelna de orden inferior.
  7. 7. El proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los agregados son agregados de protelna de alto peso molecular.
  8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la resina de cromatografla o la perla porosa comprenden un tamano de partlcula medio de entre 10 y 500 micrometros.
  9. 9. El proceso de flujo continuo de acuerdo con reivindicacion 1, en el que la resina de cromatografla o la perla porosa comprende un tamano de partlcula medio de entre 20 y 140 micrometres.
  10. 10. El proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la resina de cromatografla o la perla porosa comprenden un tamano de partlcula medio de entre 30 y 70 micrometres.
  11. 11. El proceso de flujo continuo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la resina de cromatografla o la perla porosa comprenden un tamano de partlcula medio de 50 micrometres.
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