ES2647313T3

ES2647313T3 - Péptidos, procoagulantes y sus derivados y usos para ellos

Info

Publication number: ES2647313T3
Application number: ES12732896.1T
Authority: ES
Inventors: Yi-Lan Wang; Guanghui Zhang
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2017-12-20
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: RU2635510C2; US20130004478A1; MX2014000210A; US9717820B2; US9149511B2; AU2012275858B2; WO2013003045A2; MX347200B; JP6117198B2; CN103687631B; JP2014523312A; EP2726115B1; CA2840290C; AU2012275858A1; CA2840290A1; WO2013003045A3; US20150359925A1; EP2726115A2; CN103687631A; RU2014102975A

Abstract

Un material de sellado hemostático o de tejido que comprende: (a) un péptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de análogo de aminoácido de los mismos, y (b) un andamio hemostático en el que dicho andamio hemostático es gelatina reticulada en forma de partículas con un vehículo líquido.

Description

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Nombre trivial: Símbolos Nombre sistemático Fórmula

Alanine: Ala A Ácido 2-aminopropanoico CH3CH(NH2)-COOH

Arginina: Arg R Ácido 2-amino-5guanidinopentanoico H2NC(=NH)-NH-[CH2]3-CH(NH2)-COOH

Asparagina: Asn N Ácido 2-amino-3carbamoilpropanoico H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH

Ácido aspártico: Asp D Ácido 2-Aminobutanodioico HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH

Cisteína: Cys C Ácido 2-amino-3mercaptopropanoico HS-CH2-CH(NH2)-COOH

Glutamina: Gln Q Ácido 2-Amino-4carbamoilbutanoico H2N-CO H2N-CO-[CH2]2-CH(NH2)-COOH

Ácido glutámico: Glu E Ácido 2-aminopentanodioico HOOC-[CH2]2-CH(NH2)-COOH

Glicina: Gly G Ácido aminoetanoico CH2(NH2)-COOH

Histidina: His H Ácido 2-Amino-3-(1H-imidazol-4ilo)propanoico

Isoleucina: Ile I Ácido 2-Amino-3-metilpentanoico C2H5-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH

Leucina: Leu L Ácido 2-Amino-4-metilpentanoico (CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH

Lisina: Lys K Ácido 2,6-Diaminohexanoico H2N-[CH2]4-CH(NH2)-COOH

Metionina: Met M Ácido 2-Amino-4(metiltio)butanoico CH3-S-[CH2]2-CH(NH2)-COOH

Fenilalanina: Phe F Ácido 2-Amino-3-fenilpropanoico C6H5-CH2-CH(NH2)-COOH

Prolina: Pro P Ácido pirrolidina-2-carboxílico

Serina: Ser S Ácido 2-amino-3hidroxipropanoico HO-CH2-CH(NH2)-COOH

Treonina: Thr T Ácido 2-amino-3-hidroxibutanoico CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH

Triptofan: Trp W Ácido 2-Amino-3-(1H-indol-3-ilo)propanoico

Tirosina: Tyr Y Ácido 2-Amino-3-(4-hidroxifenilo)propanoico

Valina: Val V Ácido 2-Amino-3-metilbutanoico (CH3)2CH-CH(NH2)-COOH

De acuerdo con una realización de la presente invención, un péptido de 8 aminoácidos que tiene una secuencia de RFYVVMWK (Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys (SEQ ID NO: 1)), también denominado aquí RK-8, (opcionalmente conjugado con PEG o pegilado) que puede derivarse de la proteína humana TSP-1, se encontró que tiene propiedades hemostáticas fuertes y/o propiedades de sellado tisular cuando se usa en combinación con armazón hemostático en el que dicho armazón hemostático es gelatina reticulada en forma de partículas con un vehículo líquido. En una realización, el polímero absorbible natural es SURGI-FLOTM disponible en Ethicon, Inc, que es una gelatina reticulada en forma de partículas que se combina con un vehículo líquido y un componente de gas en un dispositivo de suministro, tal como una jeringa.

45 En una realización, una secuencia de análogo de aminoácido se utiliza por lo cual al menos un aminoácido en la secuencia SEQ ID NO: 1 ha sido sustituido con amino-ácidos analógicos o bio-similares. A continuación, se proporciona una tabla de aminoácidos análogos o bio-similares:

Nombre trivial: Símbolos Aminoácidos Analógicos o BioSimilares

Arginina: Arg R His (H), Lys (K)

Lisina: Lys K Arg (R), His (H)

Metionina: Met M Ala (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Trp (W), Tyr (Y), Val (V), Cys (C), Ser (S)

Triptófano: Trp W (H) (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Met (M), Tyr (Y), Val (V), His (H)

Tirosina: Tyr Y Ala (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Met (M), Trp (W), Val (V), His (H)

Valina: Val V Ala (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Met (M), Trp (W), Val (V)

Fenilalanina: Phe F Trp (W), Tyr (Y), His (H), Ile (I), Leu (L)

Los aminoácidos pueden estar en forma L, D, o sus derivados [por ejemplo, pseudoaminoácido, aminoácido funcionalizado (por ejemplo, aminoácido fluorado... etc.), aminoácido beta, aminoácido gamma... etc.]. Los ejemplos de los péptidos análogos particularmente preferidos para la secuencia peptídica SEQ ID NO: 1 son:

KRFYVVMWKK

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Como se usa en este documento, "hemostático", o "propiedades hemostáticas", significa la capacidad de detener o minimizar el sangrado, como un experto en el arte de la hemostasis entendería esos términos, como se ejemplifica adicionalmente en los ejemplos de la especificación.

El polímero biocompatible utilizado para preparar las partículas es una gelatina reticulada. Un polvo de gelatina preferido es un polvo de gelatina parcialmente reticulado preparado moliendo esponja de gelatina en partículas que tienen un diámetro promedio de aproximadamente 40 micrómetros a aproximadamente 1200 micrómetros, más preferiblemente de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 1000 micrómetros, como se determina mediante difracción láser.

Las composiciones estériles de la presente invención comprenden preferiblemente una fase líquida continua en la que se dispersan el extracto hemostático y partículas a base de gelatina sólidas. Dependiendo del dispositivo médico particular y su uso, el líquido puede ser acuoso o no acuoso. Preferiblemente, la fase líquida es acuosa. Los líquidos acuosos pueden incluir, sin limitación, soluciones acuosas biocompatibles, tales como cloruro de calcio y solución salina. Más preferiblemente, la fase líquida comprende solución salina. La fase líquida y la fase en partículas sólidas están presentes en cantidades relativas efectivas para proporcionar una composición, por ejemplo, una pasta o suspensión, adecuada para uso en la provisión de hemostasia. En ciertas realizaciones, la relación en peso de partículas sólidas a líquido generalmente es de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 1:12,

o de aproximadamente 1: 3 a aproximadamente 1: 8 o incluso aproximadamente 1: 5.

Las composiciones hemostáticas pueden comprender además cantidades eficaces de uno o más aditivos o compuestos, incluyendo, pero no limitado a, agentes antimicrobianos, agentes tensioactivos, antioxidantes, humectantes, agentes humectantes, lubricantes, espesantes, diluyentes, estabilizadores de irradiación, por ejemplo, eliminadores de radicales, plastificantes y estabilizadores. Por ejemplo, se puede añadir glicerol para mejorar la capacidad de extrusión o la capacidad de inyección de la composición. Cuando se utiliza el glicerol puede estar presente en las composiciones de aproximadamente 0% a aproximadamente 20% en peso, basado en el peso de la fase líquida. Preferiblemente, la composición puede comprender de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% en peso de glicerol, en base al peso de la fase líquida. Más preferiblemente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso de glicerol, en base al peso de la fase líquida.

En adición, aminas cuaternarias se pueden utilizar para proporcionar propiedades mejoradas a las composiciones. Por ejemplo, se pueden usar cloruro de benzalconio, polibreno u onámero M a niveles de hasta aproximadamente 1 por ciento en peso, basado en el peso de la fase líquida. Preferiblemente, el cloruro de benzalconio se usa en niveles de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,01% en peso, basado en el peso de la fase líquida. Más preferiblemente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,006% en peso de cloruro de benzalconio, en base al peso de la fase líquida. Se cree que las aminas cuaternarias pueden cumplir múltiples funciones, actuando como un agente antimicrobiano, un agente espumante, un eliminador de radicales y como neutralizador de heparina.

La preparación hemostática puede contener además cantidades eficaces de uno o más aditivos o compuestos seleccionados del grupo que consiste en agentes antimicrobianos, agentes tensioactivos, antioxidantes, humectantes, agentes humectantes, lubricantes, espesantes, diluyentes, estabilizadores de irradiación, por ejemplo, eliminadores de radicales, plastificantes y estabilizantes, más particularmente incluyendo una cantidad de glicerol potenciadora de la extrusión, y preferiblemente donde el glicerol está presente en una cantidad de aproximadamente 1% a aproximadamente 20% en peso, basado en el peso de la fase líquida de la preparación hemostática general.

Tales composiciones hemostáticas pueden comprender además neutralizadores de heparina, procoagulantes adicionales o agentes hemostáticos, tales como el fibrinógeno, fibrina, Factor Xa, o Factor VIIa. Por "cantidad efectiva", se entiende la cantidad necesaria para proporcionar las composiciones de esas propiedades para las que se está añadiendo el aditivo. La cantidad eficaz también es limitada por la cantidad máxima que puede añadirse sin causar efectos biológicos perjudiciales.

Los métodos para la incorporación de péptidos sobre soportes de gelatina. En una realización para la fabricación de composiciones de la invención, una pasta sustancialmente homogénea se prepara mezclando las partículas con el líquido para formar una pasta uniforme. El líquido incluye el material hemostático péptido y puede incluir cantidades eficaces de otros aditivos disueltos en la misma como se describió anteriormente. La mezcla puede llevarse a cabo mediante extrusión o mediante la mezcla en un espacio cerrado en condiciones eficaces para proporcionar una dispersión uniforme de las partículas sólidas en la fase líquida. Alternativamente, un mezclador, por ejemplo un mezclador planetario doble, se puede utilizar en la fabricación de composiciones de la presente invención. Se añade el líquido que contiene el material peptídico hemostático a la mezcladora. El líquido puede incluir cantidades efectivas de aditivos disueltos en él antes de la adición de las partículas a la solución. Por ejemplo, una solución salina que contiene material peptídico, glicerol y cloruro de benzalconio hemostático se puede preparar y después se añadió a la mezcladora. Las partículas sólidas se añaden a la mezcladora en el tiempo con mezcla continua hasta que se han añadido todos los ingredientes. La mezcla se continúa hasta que se forma una composición sustancialmente homogénea que contiene las partículas sólidas dispersadas uniformemente en toda la fase líquida continua.

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Las composiciones hemostáticas preparadas como anteriormente se pueden esterilizar proporcionar composiciones estériles que comprenden el péptido hemostático. En algunas realizaciones, las composiciones se transfieren a un dispositivo médico como se describió anteriormente y el dispositivo que contiene la composición hemostática se esteriliza, preferiblemente por la radiación ionizante. Más preferiblemente, la esterilización es por irradiación gamma como se ejemplifica en el presente documento.

Las composiciones de la presente invención incluyen composiciones descritas en la presente memoria que son estériles, en los que han sido irradiados con un nivel de, por ejemplo, irradiación ionizante. Dicha irradiación puede incluir haz de electrones o irradiación gamma. El nivel de irradiación y las condiciones de esterilización, incluyendo el tiempo que las composiciones se irradian, son los que proporcionan composiciones estériles, como se define aquí. Una vez que tengan el beneficio de esta descripción, un experto en la técnica será capaz de determinar fácilmente el nivel de irradiación necesario para proporcionar composiciones estériles.

Los dispositivos médicos en los que pueden utilizarse las composiciones hemostáticas de la presente invención incluyen cualquier dispositivo que actualmente se utiliza para aplicar una pasta hemostática fluida o inyectable o suspensión a un sitio, o herida, requiere hemostasia. Una esponja puede ser aplicada por la mano o por otros medios de manera convencional. La hemostasis que requiere sitio puede ser el resultado de una lesión o un procedimiento quirúrgico. Los ejemplos de dispositivos o aplicadores incluyen jeringas tales como Becton Dickinson

o jeringas luer Monoject. Otros dispositivos se describen en detalle en la patente de los Estados Unidos Nº 6.045.570, los contenidos de la cual se incorporan por referencia en su totalidad.

Los péptidos sintéticos de secuencias variables se sintetizaron con la tesis mediada por síntesis de péptido soportado por sólido mediado por Fmoc. Péptidos conjugados con PEG, PEG2000-RK-8 o PEG5000-RK-8, designado como P2K-RK-8 o P5K-RK-8, respectivamente, se sintetizaron mediante la conjugación de metoxipolietilenglicol-N-hidroxisuccinimida (mPEG-NHS) en el extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 1 purificado a través de la síntesis en solución. Los péptidos se purificaron por C18 RP-HPLC para dar >95% de pureza. Sus identidades se analizaron mediante MALDI-TOF MS o ESI-MS.

Las mezclas con SurgifloTM, que es una matriz hemostática a base de gelatina se prepararon del siguiente modo. Los artículos de ensayo incluyen mezclas de SurgifloTM basadas en gelatina con 2 ml de solución salina normal o 2 ml de solución salina normal que contienen componente activo o como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 pegilado, o su análogo; o solución de 2 mL de EVITHROMTM que contiene trombina principalmente humana (composición completa de Evithrom® contiene trombina humana (800-1200 UI/mL), cloruro de calcio, albúmina humana, manitol, acetato de sodio, y agua para inyección).

Para la preparación del artículo de prueba, SurgifloTM se mezcló a fondo con el material hemostático por los siguientes pasos: 1. Extraer 2 ml de solución de material hemostático tal como solución salina o solución salina con el péptido en una jeringa vacía; 2. Mezclar los 2 componentes mediante la fijación de un conector luer a una jeringa precargada y adjuntar la jeringa que contiene solución de material hemostático al otro extremo del adaptador luer, y luego inyectar la solución de material hemostático en una jeringa precargada; 3. Continuar para mezclar los componentes empujando el material combinado de ida y vuelta hasta que la consistencia está equilibrado, y aplicarse a la herida.

Todas las concentraciones en los ejemplos y tablas se refieren a la concentración en 2 ml de solución salina antes de la mezcla con 6 ml de SurgifloTM. Al mezclar la concentración del ingrediente activo o excipiente en el artículo de prueba corresponderá a 1/4 de la concentración en la solución salina; Por ejemplo la concentración de 5 mM a que se refiere en los ejemplos corresponde a la concentración final de 0,25 X 5 mM = 1,25 mM en el material hemostático.

En las figuras, el SF es sinónimo de SurgifloTM Hemostatic Matrix; y TH significa EVITHROMTM, disponible de Ethicon, Inc., que contiene trombina tópica (humana), 800 ~ 1.200 UI/mL.

Mientras que los siguientes ejemplos demuestran ciertas realizaciones de la invención, no han de interpretarse como limitantes del alcance de la invención, sino más bien como contribuyentes a una descripción completa de la invención.

EJEMPLO 1

Con referencia ahora a la Figura 1, los datos sobre el momento de la hemostasia en minutos se presenta para varios sistemas ensayados, todos incluyendo SurgifloTM, (designado en la tabla como SF), y diferentes tipos de aditivos para mejorar la hemostasia, incluyendo trombina humana (designada como TH en el gráfico) y el péptido sintético SEQ ID NO: 1 que tiene una concentración que varía de 0,01 mM a 5 mM. Las mezclas de SurgifloTM con trombina se designan en la tabla como SF/TH; las mezclas de SurgifloTM con SEQ ID NO: 1 se designan en la tabla como SF/RK-8.

Los datos se recogieron usando modelo punzón de biopsia de hígado porcino [8 mm de ancho x 7 mm de

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profundidad], con el tiempo de taponamiento inicial: 30s; tiempo de observación: 30s; N es el número de experimentos para cada punto de datos; N = 3. Las barras de error en las tablas corresponden a las desviaciones estándar.

Un estudio de actividad hemostática in vivo se realizó usando el modelo de punzón de biopsia de hígado porcino, con la herida perforada de apertura de 8 mM x 7 mM de ancho profundo hecho en el hígado y el artículo de prueba se aplica a un sitio de la herida recién creado seguido de una presión digital oclusiva (taponamiento). Se aplicó presión inicialmente durante 30 segundos y se midió usando un temporizador electrónico. Tras el taponamiento durante 30 segundos, se interrumpió la presión digital; se eliminó inmediatamente la almohadilla de gasa sobre el artículo. Se realizó una evaluación de la hemostasia durante un período de 30 segundos. Si el sangrado de flujo libre no se observó dentro de los 30 segundos, se observó el tiempo para la hemostasis, en un formato de minutos y segundos, y las pruebas se llegó a la conclusión de ese artículo. Si se observó sangrado de flujo libre, la presión y la gasa se vuelven a aplicar durante un taponamiento adicional de 30 segundos y períodos de observación hasta que se logró la hemostasia o hasta que el período de prueba llegó a diez minutos. La hemostasia se determinó por el cese de la hemorragia de flujo libre en menos de diez minutos. La almohadilla de gasa se utilizó como control negativo.

Como puede verse en la Figura 1, la mezcla SurgifloTM con la concentración más alta de la SEQ ID NO: 1 (5 mM) tiene una eficacia similar a la mezcla de SurgifloTM/trombina (SF/TH), lo que indica un fuerte efecto hemostático del péptido SEQ ID NO: 1.

EJEMPLO 2

Con referencia ahora a la Figura 2, los datos sobre el momento de la hemostasia en minutos se presenta para varios sistemas ensayados, todos incluyendo SurgifloTM, (designado en la tabla como SF), y diferentes tipos de aditivos para mejorar la hemostasia, incluyendo trombina humana (designada como TH en el gráfico) y péptido sintético PEG-conjugado (o pegilado) de la SEQ ID NO: 1. Para PEG-conjugación, PEG2000 o polietilenglicol con el peso molecular medio de 2000 Da se utilizó, designado en el gráfico como P2K. La mezcla de SEQ ID NO: 1 pegilado y SurgifloTM se designa en el gráfico como SF/P2K-RK-8. Esta mezcla se puso a prueba con la concentración de la SEQ ID NO: 1 que varía de 0,05 mM a 5 mM.

Los datos se recogieron usando modelo punzón de biopsia de bazo porcino in vivo en sacabocados [6 mm de ancho x 3 mM de profundidad], tiempo inicial de taponamiento en: 30s; tiempo de observación: 30s; N = 3.

El estudio de actividad hemostática in vivo se realizó usando el modelo de punzón de biopsia de bazo porcino, con la abertura de herida perforada 6 mM de ancho x 3 mM de profundidad hecha en el bazo y el artículo de prueba se aplica a un sitio de la herida recién creado seguido de una presión oclusiva digital (taponamiento). Se aplicó presión inicialmente durante 30 segundos y fue programado usando un temporizador electrónico. Tras el taponamiento durante 30 segundos, se interrumpió la presión digital; la almohadilla de gasa sobre el artículo se eliminó inmediatamente. Se realizó una evaluación de la hemostasia durante un período de 30 segundos. Si el sangrado de flujo libre no se observó dentro de los 30 segundos, se observó el tiempo para la hemostasis, en un formato de minutos y segundos, y se concluyeron las pruebas de ese artículo. Si se observó sangrado de flujo libre, la presión y la gasa se vuelven a aplicar para un taponamiento de 30 segundos adicionales y períodos de observación hasta que se logró la hemostasia o hasta que el período de prueba llegó a diez minutos. Hemostasis se determinó por el cese de libre flujo de sangrado en menos de diez minutos. La almohadilla de gasa se utilizó como control negativo.

Como puede verse en la Figura 2, en mezclas con SurgifloTM, SEQ ID NO: 1 pegilado es comparable a la trombina en un amplio intervalo de concentraciones que varían de 0,05 mM a 5 mM, mostrando prácticamente al mismo tiempo la hemostasia como trombina y posiblemente el mejor momento para hemostasis de trombina a una concentración de 0,1 mM de SEQ ID NO: 1 pegilado.

EJEMPLO 3

Con referencia ahora a la Figura 3, los datos sobre el momento de la hemostasia en minutos se presentan para varios sistemas ensayados, todos incluyendo SurgifloTM, (designado en la tabla como SF), y diferentes tipos de controles o aditivos para mejorar la hemostasia, incluyendo: humana trombina (designada como SF/TH); péptido SEQ ID NO: 1 (designado como SF/RK-8), que tiene una concentración de 5 mM; SEQ ID NO: 1 conjugada con PEG 2000 (designado en la tabla como SF/PEG2000-RK8) que tiene una concentración de 5 mM; PEG2000 (designado en la tabla como SF/PEG2000) que tiene una concentración de 5 mM; y solución salina normal (designada en el gráfico como SF/solución salina).

Los datos se recogieron usando modelo punzón de biopsia de bazo porcino [6 mm de ancho x 3 mm de profundidad], tiempo de taponamiento inicial: 30s; tiempo de observación: 30s; N = 3.

Como puede verse en la Figura 3, la comparación directa de mezclas de SurgifloTM con SEQ ID NO: 1 y con

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