ES2649155T3 - Anticuerpos anti-OX40 y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al OX40 humano, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; (e) una región de dominio variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.

Description

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CDR de la VL de AJ388641 se omiten en la figura. Se buscaron secuencias de VL humana homólogas a la región estructural de la VL de 106-222 en la base de datos GenBank, y se eligió la secuencia de la VL codificada por el ADNc humano AJ388641 (VL de AJ388641) como aceptora para la humanización. Las secuencias de las CDR de la VL de 106-222 se transfirieron a las posiciones correspondientes de la VL de AJ388641. No se llevaron a cabo sustituciones en la región estructural en la forma humanizada.

La FIG. 38 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de la VH de Hu106 flanqueada por los sitios SpeI y HindIII (subrayados) junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácidos se muestran en código de una letra. La secuencia del péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (Q) de la VH madura está doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991) están subrayadas. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento también se proporcionan en el listado de secuencias y los números de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias. La secuencia del intrón está en cursiva. Se clonó el fragmento del gen de la VH de Hu106 digerido con Spel y HindIII entre los sitios correspondientes en el vector de expresión que se muestra en la Figura 23.

La FIG. 39 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de la VL de Hu106-222 flanqueado por sitios NheI y EcoRI (subrayados) junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácidos se muestran en código de una letra. La secuencia del péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (D) de la VL madura está doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al, (1991) están subrayadas. La secuencia del intrón está en cursiva, se clonó el fragmento del gen de la VL de Hu106 digerido con NheI y EcoRI entre los sitios correspondientes en el vector de expresión que se muestra en la FIG. 23. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento también se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los números de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 40 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las secuencias de la VH de 119-122, de 119-122 humanizado (Hu119), y Z14189 (número de acceso de GenBank) aceptora humana. Los residuos de aminoácidos se muestran en código de una letra. Los números encima de las secuencias indican las localizaciones de acuerdo con Kabat et al. (“Sequences of Proteins of Immunological Interests”, 5ª edición, n.º de publicación del NIH 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de las CDR definidas por Kabat et al. (1991) están subrayadas en la VH del 119-122. Los residuos de las CDR de la VH de Z14189 se omiten en la figura. Se buscaron secuencias de la VH humana homólogas a la región estructural de la VH de 119-122 en la base de datos GenBank, y se eligió la secuencia de la VH codificada por el ADNc Z14189 humano (VH de Z14189) como aceptora para la humanización. Las secuencias de la CDR de la VH de 119-122 se transfirieron primero a las posiciones correspondientes de la VH de Z14189. A continuación, en las posiciones de la región estructural en que el modelo tridimensional de las regiones variables de 119-122 indicaba un contacto importante con las CDR, los residuos de aminoácidos de ratón de la VH de 119-122 fueron sustituidos por los residuos humanos correspondientes. Estas sustituciones se llevaron a cabo en las posiciones 26, 27, 28, 30 y 47 (subrayadas en la secuencia de la VH de Hu119) como se muestra en la figura. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento también se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los números de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 41 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las secuencias de la VL de 119-122, 119122 humanizado (Hu119), y M29469 (número de acceso de GenBank). Los residuos de aminoácidos se muestran en código de una letra. Los números encima de las secuencias indican las localizaciones de acuerdo con Kabat et al. (1991). Las secuencias de las CDR definidas por Kabat et al. (1) están subrayadas en la VL de 119-122. Los residuos de las CDR de la VL de M29469 se omiten en la secuencia. Se buscaron secuencias de VL humana homólogas a las estructuras de la VL de 119-122 en la base de datos GenBank, y se eligió la secuencia de VL codificada por el ADNc humano M29469 (VL de M29469) como aceptora para la humanización. Las secuencias de las CDR de la VL de 119-122 se transfirieron a las posiciones correspondientes de la VL de M29469. No hizo falta ninguna sustitución estructural en la forma humanizada. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento también se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los números de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 42 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de la VH de Hu119 flanqueada por sitios SpeI y HindIII (subrayados) junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácidos se muestran en código de una letra. La secuencia del péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (E) de la VH madura está doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991) están subrayadas. La secuencia del intrón está en cursiva. Se clonó el fragmento del gen de la VH de Hu119 digerido con Spel y HindIII entre los sitios correspondientes en el vector de expresión que se muestra en la FIG. 23. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento también se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los números de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 43 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de la VL de Hu119 flanqueada por sitios NheI y EcoRI (subrayados) junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácidos se muestran en código de una letra. La secuencia del péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (E) de la VL madura está doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991) están subrayadas. La secuencia del intrón está en cursiva. Se clonó el fragmento del gen de la VL de Hu119 digerido

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con NheI y EcoRI entre los sitios correspondientes en el vector de expresión que se muestra en la figura. 23. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento también se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los números de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

Descripción detallada

El término "anticuerpo" incluye una molécula de inmunoglobulina compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (que en el presente documento se abrevia HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera ((que en el presente documento se abrevia LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o "porción de anticuerpo") incluye fragmentos de un anticuerpo que mantienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hOX4O). Se ha mostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo pueden realizarla fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab ')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), que consta de un dominio VH y (vi) una región determinante de la complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, con un enlazador sintético que les permite formar una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al, (1988) Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 85:5879-5883 Dichos anticuerpos de cadena sencilla también se pretende que estén englobados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También se engloban otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448, Poljak, R. J. et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Aún más, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión de mayor tamaño, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región flanqueada de estreptavidina para elaborar una molécula tetramérica scFv (Kipriyanov, S. M. et al. (1995) “Human Antibodies and Hybridomas” 6: 93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una marca de polihistidina C-terminal para elaborar moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab ')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse usando técnicas de ADN recombinante estándares, como se describe en el presente documento. Las porciones de unión a antígeno preferidas son dominios completos o pares de dominios completos.

OX40/ligando de OX40 (receptor de OX40)/(OX40L) son un par de moléculas coestimuladoras críticas para la proliferación y supervivencia de los linfocitos T, la producción de citocinas y la generación de células de memoria. Los experimentos in vitro iniciales demostraron que la señalización a través de OX40 en los linfocitos T CD4+ conduce al desarrollo de TH2, pero no de TH1. Estos resultados fueron apoyados por estudios in vivo que muestran que el bloqueo de la interacción OX40L/OX40 evitaba la inducción y el mantenimiento de respuestas inmunitarias alérgicas mediadas por TH2. Sin embargo, el bloqueo de la interacción OX40/OX40L mejora o impide enfermedades mediadas por TH1. Además, se mostró que la administración de OX40L soluble o la transferencia de genes de OX40L a los tumores potencia fuertemente la inmunidad antitumoral en ratones. Estudios recientes sugieren también que OX40/OX40L pueden desempeñar un papel en la estimulación de respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T. Como se analiza en el presente documento, la señalización de OX40 bloquea la función inhibidora de los linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ naturales y el par OX40/OX40L desempeña un papel crítico en la regulación global de la inmunidad periférica frente a la tolerancia.

Las expresiones "numeración de Kabat", “definiciones de Kabat" y "marcaje de Kabat" se usan indistintamente en el presente documento. Estos términos, que son reconocidos en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de

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residuos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. Acad Sci. 190: 382-391 y, Kabat, E. A. et al. (1991) “Sequences of Immunological Interest”, 5ª edición, U.S. Department of Health and Human Services, n.º de publicación del NIH: 91-3242).

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una colección de anticuerpos humanos combinatoria recombinante, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico con genes de la inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D., et al, (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana (véase Kabat, E. A. et al. (1991) “Sequences of Immunological Interest”, 5ª edición, U.S. Department of Health and Human Services, n.º de publicación del NIH: 91-3242).

Un "anticuerpo aislado" incluye un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hOX40 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de hOX40). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hOX40 puede unirse a moléculas de OX40 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo por un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 humano que se une a un antígeno OX40 y/o la potencia de activación de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 cuya unión al receptor de hOX40 activa la actividad biológica de hOX40 o la activación de la unión al receptor en un ensayo celular de L/OX40 .

El término “Koff “, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno. El término ”Kd“, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

La frase "resonancia de plasmón superficial" incluye un fenómeno óptico que permite analizar las interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, véase el Ejemplo 5 y Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Liu, et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131 y Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El término "vector" incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo los vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión recombinantes” (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, se pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus sin capacidad de replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven para funciones equivalentes.

La frase "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") incluye una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse no sólo a la célula en cuestión particular, sino a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido ya sea a mutaciones o a influencias ambientales, dicha progenie puede no ser idéntica, de hecho, a la célula parental, pero todavía se incluye dentro del alcance de la expresión "célula huésped" como se usa en el presente documento.

La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) se refiere a un anticuerpo, o población de anticuerpos similares, obtenidos a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, y no ha de interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante un procedimiento particular, e incluye pero no se limita a los anticuerpos monoclonales que pueden elaborarse por el procedimiento del hibridoma descrito primero por Kohler y Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975), o por procedimientos de ADN recombinante.

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respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual (dot blot). Los resultados muestran que OX40L, pero no GITR1 ni 4-1BBL, inhibe la generación de linfocitos Tr1.

En los experimentos de la FIG. 7B, se midió la IL-10 producida por los linfocitos CD4+ en los sobrenadantes después de la reestimulación con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h por ELISA. Los datos se muestran en términos de la media ± SEM de cuatro experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L, pero no GITR1 ni 4-1BBL, inhibe la generación de linfocitos Tr1.

OX40L, GITR1 y 4-1BBL promovían todos un aumento del número total de linfocitos T (FIG. 7C). En los experimentos de la FIG. 7C, se contó el número de linfocitos T viables. Los datos se muestran en términos de la media ± SEM de cuatro experimentos independientes.

Como entenderán los expertos en la técnica, los resultados de las FIG. 7A, 7B, 7C muestran que GX40L, pero no GITR1 ni 4-1BBL, inhibe la generación de linfocitos Tr1. Estos datos sugieren que, entre los tres miembros de la superfamilia del TNF conocidos por coestimular linfocitos T, OX40L tiene una función novedosa y única en la inhibición de la generación de linfocitos Tr1.

Se descubrió además que OX40L inhibe la generación de linfocitos Tr1 inducidos por ICOSL o las DC inmaduras. ICOS y CD28 representan los dos receptores coestimuladores positivos dentro de la familia de CD28 expresados en los linfocitos T. La señalización mediante ICOS de los anticuerpos agonistas o ICOSL se ha mostrado que estimula a los linfocitos T CD4+ a producir IL-10. Para investigar si OX40L puede inhibir la capacidad de ICOS de inducir la producción de IL-10 por los linfocitos T CD4+, se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados y de memoria con anti-CD3 en presencia de células L transfectadas con ICOSL o células L transfectadas con ICOSL en presencia de OX40L durante 7 días.

En los experimentos de la FIG. 8A, se llevó a cabo un análisis intracelular de la producción de citocinas por linfocitos T CD4+ indiferenciados mediante citometría de flujo. Se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, que se prerrecubieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los porcentajes de linfocitos T que producen citocinas respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual (dot blot). Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados inducidos por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8B, se midió por ELISA la producción de IL-10 en los linfocitos CD4+ indiferenciados en los sobrenadantes después de la reestimulación con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24

h. Se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, que se prerrecubrieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los datos se muestran en términos de la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados inducidos por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8C, se llevó a cabo un análisis intracelular de la producción de citocinas por los linfocitos T CD4+ de memoria mediante citometría de flujo. Se cultivaron linfocitos T CD4+ de memoria durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, que se prerrecubrieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los porcentajes de linfocitos T productores de citocinas respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos CD4+ de memoria inducidos por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8D, se midió por ELISA la producción de IL-10 por linfocitos T CD4+ de memoria en los sobrenadantes después de la reestimulación con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h. Se cultivaron linfocitos T CD4+ de memoria durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, que se prerrecubrieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los datos se muestran en términos de la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ de memoria inducidos por ICOSL.

Los resultados de los experimentos de las FIG. 8A, 8B, 8C, y 8D muestran que ICOSL promovía significativamente la generación de linfocitos Tr1 a partir tanto de linfocitos T CD4+ indiferenciados como de memoria. La adición de OX40L inhibía completamente la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ tanto indiferenciados como de memoria, mientras que promovía fuertemente la generación de células que producen TNF-α.

Se sabe que las DC inmaduras o DC tratadas con IFN-α o IL-10 pueden inducir a linfocitos T CD4+ indiferenciados a diferenciarse en linfocitos Tr1. Se investigó si OX40L podía inhibir la generación de linfocitos Tr1 inducidos por DC. Como se muestra en la FIG. 8E, las DC inmaduras o DC tratadas con IL-10 o IFN-α inducían todas la generación de más de un 10 % de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados. Por el contrario, las DC activadas por CD40L inducen una fuerte respuesta TH1, acompañada por la generación de aproximadamente un 3 % de linfocitos Tr1. La adición de OX40L recombinante a cultivos de DC-linfocitos T inhibía completamente la generación de linfocitos Tr1 inducidos por DC inmaduras y DC tratadas con IL-10 e IFN-α. Además, OX40L también inhibía la generación del número residual de linfocitos Tr1 inducidos por DC maduras activadas por CD40L. En los

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anticuerpos, por ejemplo, también se pueden usar para clasificar las cepas de un solo patógeno. Los investigadores pueden utilizar los anticuerpos descritos en el presente documento para identificar y rastrear células o moléculas específicas en un organismo.

De forma general, los términos "cáncer" y "canceroso" hacen referencia o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Más específicamente, los cánceres que pueden tratarse o prevenirse usando uno cualquiera o más de los anticuerpos descritos en el presente documento o una variante de los mismos, incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma espinocelular, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma pulmonar no microcítico, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer del estroma gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de extensión superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acrales, melanomas nodulares, así como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no de Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células pequeñas no hendidas de alto grado; NHL con enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); tricoleucemia; leucemia mieloblástica crónica y trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), así como la proliferación vascular anormal asociada a la facomatosis, edema (como el asociado a los tumores cerebrales) y el síndrome de Meigs.

También se proporcionan en el presente documento procedimientos para tratar o prevenir un trastorno inmune. . Estos procedimientos comprenden administrar una cantidad eficaz del anticuerpo a un sujeto necesitado de dicho tratamiento. En algunas realizaciones, el trastorno inmune es un trastorno inmune o un trastorno autoinmune. El trastorno es asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, GVHD y/o lupus sistémico eritematoso. En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad asociada a un virus, bacteria u otro agente infeccioso.

Además, los anticuerpos y procedimientos que se describen en el presente documento se pueden usar para prevenir

o tratar enfermedades y afecciones inflamatorias, tales como osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedades autoinmunes, tales como lupus y enfermedad autoinmune mixta. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles en el tratamiento de una variedad de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo a un sujeto que lo necesite, en el que la enfermedad autoinmune o enfermedad inflamatoria es una cualquiera o más de las siguientes enfermedades: diabetes sacarina insulinodependiente (IDDM), diabetes sacarina, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, encefalomielitis diseminada aguda, artritis, artritis reumatoide, artritis autoinmune experimental, miastenia grave, tiroiditis, enfermedad de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis, anemia perniciosa, gastritis autoinmune atrófica, enfermedad de Addison, menopausia prematura, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmía simpática, uveítis facogénica, anemia hemolítica autoinmune, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa Hbs-ve, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, escleroderma, granulomatosis de Wegener, poli/dermatomiositis, LE discoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, psoriasis, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia aplásica, hepatitis autoinmune, enfermedad celíaca, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS), púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de opsoclono-mioclono (OMS). Neuritis óptica, tiroiditis de Ord, pénfigo, poliartritis, cirrosis biliar primaria, síndrome de Reiter, enfermedad de Takayasu, arteritis temporal, anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos calientes, granulomatosis de Wegener, alopecia universal, enfermedad de Behçet, enfermedad de Chagas. Síndrome de fatiga crónica, disautonomía, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, neuromiotonía, sarcoidosis, esclerodermia, colitis ulcerosa, vitíligo, vulvodinia, enfermedades inflamatorias de la piel, dermatitis de contacto alérgica, gastritis por H. pylory, enfermedad inflamatoria nasal crónica, arteriosclerosis y enfermedad del injerto contra el huésped.

Más específicamente, una "enfermedad autoinmune" tal como se usa en el presente documento es una enfermedad

o trastorno que surge de y dirigido contra los propios tejidos u órganos de un individuo o un segregado o manifestación de los mismos o afección resultante de ello. La enfermedad autoinmune puede hacer referencia a una afección que resulta de, o se agrava por, la producción por linfocitos B de anticuerpos que son reactivos con los tejidos y los antígenos normales del cuerpo. Además, una enfermedad autoinmune es una que puede implicar la secreción de un autoanticuerpo que es específico de un epítopo de un autoantígeno (por ejemplo un antígeno nuclear).

Las enfermedades o trastornos autoinmunes que se pueden tratar y/o prevenir mediante uno cualquiera o más de los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, artritis (artritis reumatoide, como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, gota o artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inmunológica aguda,

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con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura postransfusión (PTP), trombocitopenia inducida por heparina y trombocitopenia autoinmune o inmunomediada tal como púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), incluyendo PTF crónica o aguda, escleritis como queratoescleritis idiopática, epiescleritis, enfermedad autoinmuntiaria del testículo y el ovario incluyendo orquitis y ovaritis autoinmunes, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis tales como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto ), o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmune, hipotiroidismo idiopático. Enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o síndrome de la persona rígida, encefalomielitis como encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave, como miastenia grave asociada a timoma, degeneración cerebelosa, neuromiotonía, síndrome de opsoclono u opsoclonomioclono (OMS) y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmune, neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), nefropatía idiopática por IgA, dermatosis por IgA lineal, dermatosis neutrofílica febril aguda, dermatosis pustulosa subcorneal, dermatosis acantolítica transitoria, cirrosis como cirrosis biliar primaria y neumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca o enfermedad celiaca, esprúe celíaco (enteropatía por gluten), esprúe resistente, esprúe idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad autoinmune del oído como la enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), pérdida de la audición autoinmune, policondritis como policrondritis resistente o en recidiva o recidivante, proteinosis alveolar pulmonar, síndrome de Cogan/queratitis intersticial no sifilítica,

parálisis de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosácea autoinmune, dolor asociado a zóster, amiloidosis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de linfocitos B monoclonales (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significado incierto, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmias, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal o segmentaria o focal y segmentaria (FSGS), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno de hepatológico autoinmune, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades autoinmunes desmielinizantes y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Dressler, alopecia areata, alopecia total, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmune masculina y femenina, por ejemplo, debido a anticuerpos antiespermatozoides, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome poscardiotomía, síndrome de Cusbing, pulmón de los criadores de pájaros, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a la transfusión, lepra, malaria, enfermedades parasitarias como leishmaniasis, kipanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevatum diutinium, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica) o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schönlein,

infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), SCID, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS), infección por ecovirus, sepsis, endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infección por parvovirus, infección por el virus de la rubéola, síndromes después de la vacunación, infección de rubéola congénita, infección por el virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis postestreptocócica, tromboangeítis obliterante, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de células gigantes, neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrótico idiopático, nefropatía de cambios mínimos, lesión familiar benigna e isquemia por reperfusión, reperfusión en trasplante de órganos, autoinmunidad de la retina, inflamación de las articulaciones, bronquitis, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias/pulmonar, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos, asperniogénesis, hemólisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, oftalmía final facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Haniman-Rich, pérdida de audición neurosensorial, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema primario idiopático, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tiroiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, timoma no maligno, vitíligo, síndrome de choque tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que implican la infiltración de linfocitos T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas a la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión orgánica múltiple, enfermedades mediadas por complejos de antígeno-anticuerpo, enfermedad por anticuerpos antimembrana basal glomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ovaritis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmune,

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oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, síndrome poliglandular autoinmune de tipo I, hipoparatiroidismo idiopático del adulto (AOIH), miocardiopatía como miocardiopatía dilatada, epidermólisis ampollosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis de etmoides, frontal, maxilar o esfenoide, un trastorno relacionado con eosinófilos, tales como eosinofilia, eosinofilia por infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia,

síndrome de Löffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, escleritis, epiescleritis, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia-telangiectasia, angiectasia, trastornos autoinmunes asociados a la enfermedad del colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, linfadenitis, reducción de la respuesta de la tensión arterial, disfunción vascular, lesión de los tejidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral y enfermedad de acompañamiento de vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, trastornos de reperfusión isquémica, lesión por reperfusión de los tejidos de miocardio o de otro tipo, traqueobronquitis linfomatosa, dermatosis inflamatorias, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, insuficiencia orgánica múltiple, enfermedades ampollosas, necrosis cortical renal, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados a la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, narcolepsia, inflamación aguda grave, inflamación crónica intratable, pielitis, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden tener una variedad de usos académicos, médicos y comerciales. Los anticuerpos se pueden usar en diferentes tipos de pruebas de diagnóstico, por ejemplo, para detectar una amplia variedad de enfermedades o la presencia de fármacos (productos farmacéuticos), toxinas u otras proteínas incluyendo las hormonas, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles en pruebas para detectar la enfermedad, por ejemplo, en el suero o la sangre de los pacientes. La enfermedad puede incluir enfermedades relacionadas con OX40 o enfermedades o indicaciones no relacionadas con OX40 incluyendo diversos tipos de cáncer, enfermedad inflamatoria o autoinmune. Los anticuerpos también se pueden usar en la radioinmunodetección y la radioinmunoterapia del cáncer, y algunos nuevos procedimientos de ensayo pueden utilizar estos anticuerpos descritos para actuar sólo en las membranas celulares de células de tipos específicos, es decir, cancerosas.

Los anticuerpos descritos en el presente documento podrían ser parte de un kit u otro paquete de diagnóstico. Por tanto, se proporciona en el presente documento un kit de diagnóstico, o artículo de fabricación, para usar con el procedimiento de pretratamiento descrito en la presente memoria. El kit de diagnóstico puede comprender uno cualquiera o más de lo siguiente: material de referencia antagonista/anticuerpo/fármaco; anticuerpo neutralizante de control positivo (preferiblemente de cabra o mono cangrejero); columna de proteína A + G (por ejemplo columna de proteína A/G); reactivo de deslipidación; tampón(es) de purificación por afinidad de inmunoglobulinas (por ejemplo, tampones de unión, elución y neutralización); suero de complemento; diluyente de ensayo para las células; manual de instrucciones o bibliografía; vial de células congeladas (por ejemplo, células WIL2); reactivo de marcaje de células (como CELL TITER GLO.RTM.), etc. A modo de ejemplo, el kit de diagnóstico puede incluir, pero no se limita a: (a) reactivo de deslipidación; (b) tampones (por ejemplo, tampones de unión y elución) para la purificación por afinidad de las inmunoglobulinas; y (c) manual de instrucciones que instruye al usuario del kit de diagnóstico para usar el kit para pretratar una muestra biológica de un sujeto con enfermedad autoinmune o cáncer antes de realizar un bioensayo basado en células (tal como un ensayo de anticuerpos neutralizantes) en la muestra ( por ejemplo, para evitar el problema de interferencia del suero). El kit de diagnóstico comprende además opcionalmente uno cualquiera o más de: material de referencia de fármaco, control positivo de anticuerpo neutralizante, suero de complemento, diluyente de ensayo para las células, y reactivo de marcaje de células, etc.

Los anticuerpos y otros descubrimientos descritos en el presente documento también proporcionan procedimientos de cribado de alto rendimiento. Más específicamente, y como conocen los expertos en la técnica, se facilitan procedimientos de alto rendimiento para el cribado de anticuerpos monoclonales antagonistas o agonistas o moléculas pequeñas que se unen a receptores de OX40, y que pueden inhibir la generación y función de los linfocitos Tr1 o promover la generación y función de los linfocitos Tr1. En uno de dichos procedimientos, se transfectó una línea celular de linfocitos T humanos (SU-DHL-1) que tiene la capacidad de producir IL-10 con el gen de OX40-humano (SUOX40). Se cultivaron 100.000 células SUOX40 con 100.000 fibroblastos de ratón (células L) o

100.000 fibroblastos de ratón que expresan el ligando de OX40 humano (células L con ligando de OX40) en placas de 96 pocillos. Después de 48 horas de cultivo, se recogieron los sobrenadantes del cultivo para medir la IL-10 mediante un ELISA específico de IL-10. En un experimento representativo, 100.000 células SUOX40 produjeron hasta 6000 pg/ml de IL-10 cultivadas en ausencia de ligando de OX40. En presencia de ligando de OX40, las

100.000 células SUOX40 producían menos de 1000 pg/ml de IL-10. Este procedimiento de cultivo puede usarse para el cribado de, entre otras cosas, los anticuerpos monoclonales antagonistas o pequeñas moléculas que bloquean la capacidad del ligando de OX40 de inhibir la producción de IL-10 por las células SUOX40. Como alternativa, este procedimiento de cultivo puede modificarse sustituyendo las células L que expresan ligando de OX40 por anticuerpos monoclonales agonistas potenciales o pequeñas moléculas específicas de OX40 para determinar, entre otras cosas, su capacidad para inhibir la producción de IL-10 por las células SUOX40.

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especificidad de unión a antígeno de los anticuerpos mediante citometría de flujo (FIG. 10-12). Se validó la actividad agonista de los anticuerpos mediante ensayos funcionales. Se encontró que nueve de los 20 anticuerpos específicos anti-OX40 podían bloquear la generación de linfocitos Tt1 mediada por vitamina D3/dexametasona a partir de linfocitos T CD4+ (FIG. 13), potenciar la proliferación de linfocitos T CD4+ (FIG. 14), y suprimir la producción de IL-10 por Treg ICOS+ CD4+ CD25+ FOXP3alto (FIG. 16). Se titularon los anticuerpos y se encontró que cinco poseían una actividad potente de supresión de la generación de linfocitos Tr1 a concentraciones de tan solo 4 ng/ml (FIG. 15).

Los anticuerpos de OX40 inhiben la función de los Treg CD4+ CD25altoFOXP3+

Algunos de los anticuerpos monoclonales de OX40 inhiben la función supresora de los Treg FOXP3+ (FIG. 17). De los cinco anticuerpos (119-8B, 119-43, 119-122, 119-173B, y 106-222) que inhiben potentemente la producción de IL-10 a partir de linfocitos Tr1 y Treg CD4+ CD25alto CD127-FOXP3 +, tres (119 -43, 119-122, y 106-222) eran potentes en el bloqueo de la función de Treg CD4+ CD25alto CD127TOXP3+. (FIG. 17), sin embargo, dos (119-33 y 120-140A) de los 11 anticuerpos que no tienen actividad frente a la producción de IL-10, bloquean sin embargo la función de Treg CD4+ CD25+ FOXP3alto (FIG. 18).

Anticuerpos monoclonales anti-OX40 humano

La generación de anticuerpos monoclonales anti-OX40 humano se llevó a cabo, por ejemplo, mediante la inmunización de ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad con una línea celular de ratón transfectada con OX40 humano siguiendo los protocolos establecidos. Se establecieron y analizaron adicionalmente los clones de hibridoma que secretaban anticuerpo monoclonal que teñía específicamente las células OX40+.

Se diseñó un cribado exhaustivo para detectar los clones que desencadenan la señalización de OX40 (es decir, anticuerpos agonistas) mediante la inhibición de la generación y la función de los linfocitos Tr1. Esos clones se purificaron adicionalmente. Los anticuerpos agonistas contra hOX40 pueden ser humanizados y usarse en protocolos clínicos para terapia antitumoral humana, ya sea solos o en combinación con vacunación antitumoral y otros adyuvantes. Varios tipos de tumores diferentes podrían ser el blanco de estos anticuerpos, incluyendo melanoma, linfoma y cáncer de mama.

En otra realización, se usaron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad para inmunización en la almohadilla de la pata o subcutánea. Cada ratón se inyectó con 5 millones de células L murinas transfectadas con OX40 humano (L-OX40) 6 veces a intervalos de 3 días. Tres días después de la sexta inyección, los ratones se sacrificaron y se retiraron los ganglios linfáticos poplíteos (cuando la inmunización fue en la almohadilla de la pata) o el bazo (cuando la inmunización fue subcutánea) y se fusionaron las células con células de mieloma SP2.0 o de mieloma NSO en una relación de 1 a 1 para generar clones de hibridoma usando protocolos establecidos. Los clones de hibridoma que secretaban anticuerpo monoclonal se cribaron para determinar la especificidad de unión a las células L-hOX40 mediante ensayos ELISA. Los sobrenadantes de hibridoma que se unían a las células L-hOX40 y no a las células L parentales se analizaron además para determinar la unión a las células L-hOX40 y SUPM2-L-hOX40 por citometría de flujo,

En el experimento de la FIG. 10, se cribaron sobrenadantes de hibridoma de hOX40 contra L-hOX40 frente a células L parentales por ELISA. Se seleccionaron veinte anticuerpos monoclonales específicos de hOX40. Se recubrieron veinte millones de células L o células L que expresan OX40 humano (L-hOX40) sobre una placa de 96 pocillos mezclando las células con cloruro de magnesio y calcio al 0,01 % en PBS y se dejó que secaran durante la noche en una campana de flujo laminar. Las placas se congelaron entonces a -20 °C durante al menos un día antes de su uso. Para los ensayos de unión a anticuerpos, se rehidrataron las células congeladas con PBS y se lavaron con tampón de lavado que contenía PBS más 0,05 % de Tween 20, y se bloquearon con BSA al 2 % en tampón de lavado. Se usaron entonces las células acondicionadas para determinar la unión a los sobrenadantes de los anticuerpos anti-OX40. Se detectó entonces la unión de los anticuerpos a las células con un anticuerpo secundario, anti-fragmento Fc de la IgG de ratón conjugado con HRP. Los sobrenadantes de hibridoma específicos de hOX40 reconocen las células L que expresan OX40 pero no las células L parentales.

En el experimento de la FIG. 11, se cribaron anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 por citometría de flujo. Se mezclaron un número igual (100k) de células L y L-hOX40 en tampón de FACS (FCS al 1 % /EDTA 2 mM/PBS) y se incubaron con 0,5 µg de anticuerpos purificados por FPLC (proteína A de HiTrap/tampón de elución Gentle Ag/Ab). Se lavaron entonces las células y se tiñeron con un anticuerpo secundario, anti-IgG de ratón conjugado con PE. Dos picos indican tinción positiva y negativa por el anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Un solo pico sugiere ausencia de unión o unión inespecífica de los anticuerpos. Se confirmaron veinte anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 por citometría de flujo.

En el experimento de la FIG. 12, se confirmó la especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 mediante el uso de células SUPM2 que expresan hOX40 (SUPM2-hOX40). Se mezclaron un número igual (100k) de células SUPM2 y SUPM2-hOX40 en tampón de FACS (FCS al 1 %/EDTA 2 mM/PBS) y se usaron para determinar la unión al anticuerpo monoclonal anti-hOX40 como en la FIG. 11. La especificidad de unión de cada anticuerpo se analizó por citometría de flujo. Dos picos indican tinción positiva y negativa por el anticuerpo monoclonal anti-hOX40, mientras que un solo pico sugiere ausencia de unión o unión inespecífica de los anticuerpos. Se reconfirmaron

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veinte anticuerpos monoclonales específicos de hOX40.

En el experimento de la FIG. 13, se ha tratado de identificar anticuerpos monoclonales específicos de OX40 humano que puedan inhibir la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ estimulados por VitD3 (10 micromoles mM)/Dex (50 nanoM), CD32L/ICOSL y anti-CD3/CD28 (0,2 microgramos/ml). Se añadieron anticuerpos monoclonales anti-hOX40 el día 0 de cultivo celular y se sometieron los linfocitos T CD4+ después de 7 días de estimulación a tinción intracelular de IL-10 seguida de análisis por citometría de flujo. Se muestran los datos representativos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en A. Y se muestran los porcentajes de linfocitos Tr1 para todos los tratamientos de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 en B. Usando células obtenidas a partir de este experimento, se ha tratado de identificar anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 que estimulen la proliferación de linfocitos T CD4+ (FIG. 14, las células se contaron el día 7 después de la estimulación) e inhiban la generación de Tr1 a partir de CD4+ (FIG. 13).

Con el fin de identificar dichos anticuerpos monoclonales de hOX40 por su capacidad para inhibir la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+, se generaron linfocitos Tr1 y se cultivaron como se describe en los experimentos de la FIG. 13 anteriormente. Se muestran los datos representativos de FACS en A y se muestra el porcentaje de linfocitos Tr1 después del tratamiento con nueve anticuerpos monoclonales anti-hOX40 en B. Cinco anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 inhibían fuertemente la generación de linfocitos Tr1 a una concentración de 4 ng/ml (FIG. 15).

En el experimento de las FIG. 16A, 16B, y 16C, se estimularon linfocitos T ICOS+ CD4+ CD127-CD25 alto recién clasificados con anti-CD3 (0,2 µg/ml) en presencia de células CD32L/ICOSL y células CD32L/hOX40L o anticuerpos monoclonales anti-hOX40 o anticuerpo de control durante 5 días. Se contaron entonces las células y se reestimularon 5 x 104 células con anti-CD3/CD28 durante 24 horas y se ensayó en los sobrenadantes la secreción de IL-10 con un kit de Elisa. Se identificaron los anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 que inhiben la generación de Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ y también inhiben la producción de IL-10 a partir de linfocitos T

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ICOS+CD4+CD25alto naturalmente. Se cultivaron Treg ICO +ICOS CD4+ CD127”CD25altosrecién clasificados marcados con linfocitos CD4 +CD25bajo marcados con CFSE en presencia de monocitos irradiados y mAb anti-CD3 (0,3 µg/ml) y anti-hOX40. Después de 3,5 días de cultivo, se valoró la proliferación celular por dilución de CFSE en las células por FACS (FIG. 16C).

Las FIG. 17 A y 17B muestran la identificación de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que inhiben la generación de linfocitos Tr1 y bloquean la función de Treg FGXP3+CD4+CD25alto. Se cultivaron linfocitos T FOXP3+ CD4+ CD127-CD25alto (3,5 x 104) con células CD4+ CD25bajo marcadas con CFSE (7 x 104) en presencia de monocitos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0,3 µg/ml de anticuerpos anti-CD3 y diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Después de 3 a 4 días de cultivo, se valoró la proliferación celular por dilución del CFSE en las células mediante análisis de citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células divididas. Se muestran los análisis representativos de citometría de flujo en la FIG. 17A. Se muestran los datos de 6 anticuerpos monoclonales en la FIG. 17B.

En el experimento de la FIG. 18, se cultivaron linfocitos T FOXP3+ CD4+ CD127-CD25alto (3,5 x 104) con células CD4+ CD25bajo marcadas con CFSE (7 x 104) en presencia de monocitos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0,3 µg/ml de anticuerpos anti-CD3 y diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-OX40. Después de 3 a 4 días de cultivo, se valoró la proliferación celular por dilución de tinte CFSE en las células por FACS. Los datos son representativos de dos experimentos. Se identificaron anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que no inhiben la generación de Tr1 pero bloquean la función de Treg FOXP3+CD4+CD25alto.

En el experimento de las FIG. 19A y 19B, se cultivaron linfocitos T CD4+CD25alto derivados de linfoma con linfocitos CD4+ CD25bajo marcados con CFSE (7 x 104) aislados de donantes sanos en presencia de monocitos alogénicos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0,3 microgramos/ml de anticuerpo anti-CD3 y 25 µg/ml de anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Después de 3 a 4 días de cultivo, se valoró la proliferación celular por dilución de CFSE por FACS. Se muestran los análisis de FACS representativos en la FIG. 19A y se muestran los datos para todos los experimentos en la FIG. 19B. Se ha descubierto que los anticuerpos agonistas de hOX40 bloquean la función de los Treg CD4+CD25altoderivados de linfoma.

La FIG. 20 muestra la identificación de anticuerpos agonistas de OX40 que se unen específicamente a OX40 humano y de rhesus. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de Rhesus por centrifugación de Ficoll. Se obtuvieron linfocitos T CD4+ por microperlas de CD4. Se estimularon linfocitos T CD4+ con 10 µg/ml de lectina de Phaseolus vulgaris (PHA). Dos días después de la estimulación, las células se tiñeron con mAb antihOX40 seguido de anticuerpo de cabra contra IgG de ratón-APC y CD69-PE. 106-317 sirvió como control negativo. Se muestra que seis mAb anti-hOX40 que activan fuertemente la proliferación de linfocitos T podían unirse a linfocitos T CD4+ de Rhesus activados. Estos resultados indican que la toxicidad de estos seis anticuerpos monoclonales anti-hOX40 puede ensayarse en monos.

Sólo siete de 500 clones positivos anti-OX40 humano obtenidos usando los protocolos de fusión convencionales exhibieron las propiedades de activación de OX40, incluyendo, pero no limitado a, la capacidad de bloquear la generación de Tr1 que producen IL-10 y la función de supresión de nTreg como se divulga en la Tabla 1.

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Tabla 1. Lista de anticuerpos monoclonales específicos de OX40

Clon anticuerpo monoclonal

de Bloqueo de IL-10 Bloqueo de nTreg

1

106-108 - -

1

106-317 - -

106-107

- -

4

106-148 - -

5

119-204A - -

6

119-220C - +

119-33A

- +

8

119-58 - +

9

119-181A - +

10

119-157A - +

11

120-140A - +

12

119-8B + -

13

119-173B + -

14

106-132 + +

15

106-222 + +

16

119-43 + +

17

119-122 + +

18

119-69A + +

19

120-56 + +

20

120-270 + +

Los clones de hibridoma 106-222 y 119-122 se seleccionaron sobre la base de tres criterios

1. Inhiben la generación de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ (Treg inducible)

5 2. Revierten la función supresora de los linfocitos nTreg FOXP3+

3. Exhiben inhibición dependiente de la dosis de la desactivación de linfocitos Tr1 y reversión de la función de Treg FOXP3+

Anticuerpos quiméricos y humanizados

La humanización (también llamada remodelación o injerto de CDR) es una técnica establecida para la reducción de

10 la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales a partir de fuentes xenogénicas (incluyendo pero no limitado a, roedores) y para la mejora de su activación del sistema inmunitario humano. Aunque es conocida la mecánica de la producción del anticuerpo monoclonal genomanipulado usando las técnicas de la biología molecular, el simple injerto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de roedores en estructuras humanas no siempre reconstituye la afinidad de unión y la especificidad del anticuerpo monoclonal original.

15 Para humanizar un anticuerpo, el diseño del anticuerpo humanizado se convierte en el paso crítico en la reproducción de la función de la molécula original. Este diseño incluye diversas opciones: la extensión de las CDR, las regiones estructurales humanas a usar y la sustitución de los residuos procedentes del anticuerpo monoclonal de roedor en las regiones estructurales humanas (retromutaciones). Las posiciones de estas retromutaciones se han

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Claims (1)

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