KR20140093600A - 항-ox40 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

인간 유래 OX40에 특이적으로 결합하는 인간 유래 항체, 선호적으로는 재조합 인간 유래 항체, 인간화하거나 키메라 항체를 발표하였다. 선호하는 항체는 OX40 수용체에 대한 높은 친화도를 가지고 생체외적이나 생체 내적으로 수용체를 활성화한다. 항체는 전체길이항체이거나 그의 항원결합부일 수 있다. 항체 또는 항체 부분은 OX40 활성이 해로운 이상으로 고통받고 있는 인간 목표물에서 수용체의 활성을 조절하는데 유용하다. 재조합 인간 유래 항체를 발현하기 위한 핵산, 벡터와 숙주를 제공하였고, 재조합 인간 유래 항체를 합성하는 방법 또한 제공하였다.

Description

항-OX40 항체 및 그의 용도{ANTI-OX40 ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME}
본 발명은 전반적으로 OX40-수용체의 활성화를 조절하는 것과 연관되어 있다. 그 중에서도 특히 OX40-수용체를 조절하여 인터루킨 10 (IL-10)을 생산하는 CD4+ 타입1 조절 T 세포 ("Tr1 세포") 와 Foxp3+를 발현하는 조절 T 세포 (또한 때로는 "Foxp3+ T-reg" 세포라고 불리우는)의 면역억제 작용을 방해하고, CD4+ 세포나 미접촉 T 세포로부터 Tr1 세포의 생성과 IL-10 생산을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2010년 8월 23일에 출원한 미국 특허 출원 번호 제61/375,999호 및 2010년 9월 8일 출원한 미국 특허 출원 번호 제61/380,827호의 우선권을 향유하며, 상기 출원은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 National Institutes of Health가 받은 R01 AI061645-01, R01 AI062888-01, U19 AI071130-01의 정부 지원에 의하여 완성되었다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 특정 권리를 갖는다.
본 공개는 37 C.F.R.§ 1.52(e)(v)와 관련된 sequence listing.txt라는 이름의 2011년 8월 23일, 13,836 바이트 크기의 텍스트 화일로 접수한 염기서열 리스트를 포함하며, 이 파일은 본 출원에 참조로 통합되어 있다. 첨부된 염기서열 설명과 순서 목록은 37 CFR § 1.821-1.825에 명시된 대로 특허 출원의 염기 및/또는 아미노산 서열 공개에 관한 규칙을 준수한다. 염기서열 리스트는 Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) 과 Biochemical J. 219 (No. 2):345-373 (1984) 에 서술되어 있는 IUPAC-IUBMB 표본에 준수하도록 정의된 한문자 핵산 염기서열 암호와 아미노산을 위한 세글자 암호를 포함한다. 염기서열과 아미노산 염기서열을 표시하기 위해 사용한 기호와 형식은 37 C.F.R. §1.822에 명시된 규칙을 준수한다.
Tr1 세포는 말초관용에 필수적인 역할을 한다. Tr1 세포들은 염증 면역 반응 중에 숙주 조직의 피해를 제한하는데 특히 중요하다. Tr1 세포들의 생성은 생체 내 및 생체 외에서 TH1과 TH2 면역 반응과 함께 일어난다.
Tr1 세포들은 항원에 의해 야기된 T 세포 면역 반응 중에 미접촉 CD4+ 세포들로부터 생성한다. Tr1 세포들은 TCR, CD28, IL-2 수용체를 통한 시그널링에 반응하지 않고, 생체 내와 생체 외에서 항원에 의하여 야기되는 미성숙 CD4+ T 세포의 증식을 억제하는 능력이 있다. Tr1 세포들은 자가면역증의 발생을 저해하는 능력이 있고, 미생물학적 병원체에 대한 면역 반응의 증폭도를 제한한다.
Tr1 세포들로 유도하는 분자 시그널들을 연구하는 동안, 이들 세포들의 생성을 부정적으로 조절하는 분자 시그널에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 면역억제약, 사이토카인, 공동자극 분자, DC들이 Tr1 세포들의 유도에 관여하는 것으로 추측하고 있지만, Tr1의 생성을 부정적으로 조절하는 신호에 대한 것은 여전히 알려져 있지 않다.
OX40 수용체의 활성화는 Tr1 세포들로부터의 IL-10 생산과 Tr1 세포들의 면역억제 기능 뿐만 아니라 미접촉상태 또는 메모리 CD4+ T 세포들로부터 Tr1 생성을 막는다. OX40 수용체의 활성화는 또한 Foxp3+ T-reg 세포들에 의한 IL-10 생성과 면역억제 기능을 막는다. 따라서, 본 명세서에서 OX40 수용체에 결합하는 작용 항체이며, IL-10 사이토카인 분비와/또는 Tr1과 Foxp3의 전체적인 면역억제 기능을 방해하는 OX40 수용체의 활성화를 조절하는 작용물을 제시한다. 본질적으로 항체들은 OX40 리간드를 흉내내고 Tr1 상 과/또는 "Foxp3+ T-reg" 라고 언급하는 자연 T 조절세포들 ("nTregs") 상의 OX40 수용체를 유발할 수 있다.
우리가 공동출원한 미국 출원 제11/659,266호 및 제12/861,135호에서 개시한 바와 같이, OX40L은 면역억제제 덱사메타존 (dexamethasone)과 비타민 D에 의해 유도되는 미성숙 CD4+와 메모리 CD4+ 세포로부터 IL-10을 생산하는 Tr1 세포의 생성과 기능을 방해한다. 본 발명자들은 OX40L이 조절 T 세포를 생산하는 IL-10의 생성과 기능을 방해한다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 OX40L에 의한 OX40의 시그널링이 배양환경에서 면역억제 T 세포를 생산하는 인간 유래 IL-10의 생성을 억제한다는 것을 나타낸다. OX40L의 이러한 독특한 기능은 다른 두개의 공동 활성촉진 TNF-계열 분자인 GITR-리간드와 4-1BB-리간드에는 없는 기능이다. OX40L은 또한 유도성 공동 활성촉진 리간드와 미성숙 DC가 제공하는 두개의 생리학적인 자극에 의해 유도되는 IL-10을 생산하는 Tr1 세포들의 생성과 기능을 강하게 억제한다. 단일클론 항체, 소분자들에 의한, 또는 OX40L에 의해서, 또는 그와 최소한 90%의 유사성을 갖는 단백질에 의해 인간 T 세포의 OX40 수용체에 시그널링을 하는 것은 IL-10을 생산하는 면역억제 T 세포의 생성과 기능을 조작하고 조절한다.
이러한 발견은 치료법의 수많은 응용법에 적용할 수 있다. 예를 들자면, 아고니스틱(agonistic) 항체, 소분자들, 또는 OX40L은 면역억제 T 세포를 생산하는 IL-10의 생성과 기능을 억제하는데 사용할 수 있고, 그리하여 암이나 전염성 질병을 치료하는 면역 반응을 향상하는데 사용하거나, 암 예방주사를 만들기 위한 보강제로 사용할 수 있다. OX40 또는 OX40L에 대한 길항적 항체, 또는 길항적 소분자들은 IL-10을 생산하는 면역억제 T 세포의 생성과 기능을 향상하는 데 사용할 수 있고 따라서 자가면역질환과 이식대 숙주 질환의 치료법의 개발에 활용할 수 있다. 우리의 발견은 또한 암, 또는 자가면역질환과 이식대 숙주 질환의 치료법을 개발하기 위해 T 세포상의 OX40 수용체를 활성화하는 (또는 반대로 OX40의 시그널링을 방해하는) 항체나 소분자의 고처리량의 스크리닝 방법을 제공한다.
인간 유래 OX40 수용체와 결합하는 단일클론 항체와 인간 유래 항체 (때로는 "항 OX40 항체) 및/또는 동일의 다른 변형으로 언급함)를 본 명세서에서 제공한다. 이러한 항체는 병리학적으로 OX40을 포함하는 급성 또는 만성 질환이나 신체적인 상태의 치료나 예방에 유용하다. 일례로, 인간 유래 OX40과 결합하고 암치료나 자가면역 질환 치료에 유효한 분리한 인간 유래 항체나 그에서 유래한 항원 결합부를 기술한다. 본 발명에 공개한 어떠한 항 OX40항체도 의약품으로 사용할 수 있다. 어떠한 하나 또는 그 이상의 항 OX40 항체를 본 명세서에 언급한 하나 또는 그 이상의 다양한 암이나 자가면역질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 OX40에 결합하는 분리된 인간화 항체를 제공한다. 여기 개시된 상기 분리된 항체는 OX40에 결합하며, 하기 유전자로부터 암호화된 OX40에 결합할 수 있다: NCBI Accession Number NP_003317, Genpept Accession Number P23510, 또는 상기 유전자와 90 퍼센트의 상동성을 갖는 유전자. 본 발명에서 제공하는 상기 분리된 항체는 하기 GenBank Accession Numbers: AAB39944, CAE11757, 또는 AAI05071 중 어느 하나를 갖는 OX40 수용체에 더 결합할 수 있다.
여기 교시된 바와 같이, 일 구체예는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체이다.
또 다른 구체예는 (a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 분리된 항체는 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 그와 90 퍼센트의 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR을 가질 수 있다.
또한, 상기 분리된 항체는 서열번호 7 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열번호 8 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열번호 9 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 그와 90 퍼센트의 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR을 가질 수 있다.
상기 분리된 항체는 서열번호 10, 11, 22 또는 23의 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 11, 22 또는 23의 아미노산 서열과 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 ("VL")을 가질 수 있다. 상기 분리된 항체는 서열번호 4, 5, 16 및 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 5, 16 및 17의 아미노산 서열과 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 ("VH")을 가질 수 있다. 또한, 일 구체예로서, 상기 분리된 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 상기 분리된 항체는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 분리된 항체는 서열번호 12 또는 24의 핵산 서열, 또는 서열번호 12 또는 24의 핵산 서열과 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다. 상기 분리된 항체는 서열번호 6 또는 18의 핵산 서열, 또는 서열번호 6 또는 18의 핵산 서열과 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 여기서 단일클론 항체를 제공한다. 상기 단일클론 항체는 서열번호 10 또는 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 10 또는 22의 아미노산 서열과 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 4 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 4 또는 16의 아미노산 서열과 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 단일클론 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 여기 교시된 항-OX40 중 어느 하나를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 여기 개시된 항-OX40 항체 중 어느 하나를 암호화하는 핵산을 각각 포함하는 숙주세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 생산하고(예를 들어, 여기 개시된 항-OX40 항체 중 어느 하나를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주세포), 및/또는 상기 숙주세포로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법을 제공한다.
용어 "항체"는 이황화 결합으로 서로 연결된 두개의 중쇄(H)과 두개의 경쇄(L)의 네 개의 폴리펩티드 체인을 구성하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서는 HCVR이나 VH로 축약)와 중쇄 불변 영역로 구성한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2, CH3의 세 도메인으로 구성한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서는 LCVR이나 VL로 축약)와 경쇄 불변 영역로 구성한다. 경쇄 불변 영역은 CL의 한개 도메인으로 구성한다. VH와 VL 부위는 상보성 결정부위 (CDR)라고 하는 고도가변 부위, 프레임워크 부위 (F)이라고 하는 좀더 보존된 산재한 부위로 더 세분할 수 있다. 각 VH와 VL은 세개의 CDR과 네개의 FR로 구성하며 아미노말단에서 카복시 말단으로 다음과 같은 순서로 배열한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
항체의 "항원 결합부위"(또는 "항체 부위")는 항원 (즉, hOX40)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 유지하고 있는 항체의 절편을 포함한다. 항체의 항원 결합부위 기능은 전체 길이의 항체 절편으로 수행할 수 있음이 알려져 있다. 결합 절편의 예는 (i) VL, VH, CL과 CH1도메인으로 구성하는 1가의 절편인 Fab 절편; (ii) 힌지 구역에서 이황화 다리로 연결된 두개의 Fab 절편으로 구성하는 F(ab')2 절편; (iii) VH와 CH도메인으로 구성하는 Fd 절편; (iv) 항체의 단일 암의 VL과 VH 도메인으로 구성하는 Fv 절편; (v) VH 도메인으로 구성하는 dAb 절편 (워드 (Ward) 등, (1989) 네이쳐 (Nature) 341:544-546); (vi) 분리한 상보적 결정 부위 (CDR)을 포함하는 항체의 "항원 결합부위" 용어를 포함한다. 더 나아가, Fv 절편의 두 도메인인 VL과 VH가 서로 다른 유전자에 의해 암호화하고 있음에도 불구하고, 재조합적인 방법을 이용하여 VL과 VH 부위가 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 체인 Fv (scFV)라고 알려져 있음: 버드 (Bird) 등 (1988) 사이언스 (Science) 242:423-426과 허스톤 (Huston) 등 (1988) 미국 과학 학회지 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 85:5879-5883을 참조)를 형성하는 단일 단백질 체인으로써 제조할 수 있는 합성 연결체를 이용하여 연결할 수 있다. 항체의 "항원 인식 부위"는 이러한 단일 체인 항체들 또한 포함한다.다이아바디(diabodies)와 같은 또 다른 형태의 단일 체인 항체도 또한 포함한다. 다이아바디는 2가의, 이중특이성의 항체로 VH와 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 체인으로 발현하기는 하지만, 사용한 링커가 같은 체인의 두 도메인간에 짝을 형성하기에는 너무 짧기 때문에 또 다른 체인의 상보적인 도메인과 짝을 짓도록 강제하여 두개의 항원 결합 사이트를 만들어 낸다 (피 홀링거 (Hollinger, P.) 등 (1993) 미국 과학 학회지 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90:6444-6448; 알 제이 폴략 (Poljak, R. J.) 등 (1994) 스트럭쳐 (Structure) 2:1121-1123)을 참조). 또 더 나아가, 항체나 그것으로부터의 항원 결합부분은 하나 또는 그이상의 단백질이나 펩타이드들로 된 항체나 항체 부분의 공유결합 또는 비공유적인 연합에 의하여 형성하는 더 큰 면역성결합 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역성결합 분자의 예는 스트렙타비딘 (streptavidin) 코어 부분을 이용하여 만든 scFv 분자의 사량체 (tetramer) (에스 엠 키프리야노프 (Kipriyanov, S. M.) 등 (1995) 인간 항체와 하이브리도마 (Human 항체 and Hybridomas) 6:93-101)과 시스테인 (cytsteine) 잔기, 마커 펩타이드와 C-말단 폴리히스티딘(polyhistidine) 태그를 이용하여 2가의 바이오티닐레이션된 (biotinylated) scFV 분자 만들기 (에스 엠 키프리야노프 (Kipriyanov, S. M.) 등 (1994) 분자 유전학 (Mol. Immunol.) 31:1047-1058)를 포함한다. Fab와 F(ab')2 절편과 같은 항체 부위는 각각 파파인(papain)이나 펩신 (pepsin) 분해와 같은 재래식의 기술을 이용하여 전체 항체로부터 만들 수 있다. 게다가, 항체, 항체부분과 면역성결합 분자들은 본 명세서에서 기술한 것과 같은 기본적인 DNA 재조합 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 선호하는 항원 결합 부위는 완전한 도메인이나 완전한 도메인의 짝들이다.
OX40/OX40-리간드 (OX40 수용체)/(OX40L)는 T 세포 증식, 생존, 사이토카인 생산, 메모리 세포 생성에 결정적인 공자극 분자의 쌍이다. 초기의 생체외 실험들은CD4+ T 세포에서의 OX40을 통한 시그널링은 TH1이 아닌 TH2 발달로 이어진다는 것을 보인다. 이러한 결과들은 OX40/OX40L 상호작용을 방해하는 것은 TH2에 의하여 매개되는 알러지 면역 반응의 유도와 유지를 방해한다는 것을 보여주는 생체 내 연구 결과가 지지한다. 그러나 OX40/OX40L 상호작용을 막는 것은 TH1이 매개하는 질환들을 완화하거나 예방한다. 게다가 수용성 OX40L의 처방이나 OX40L 의 종양에의 유전자 도입은 마우스에서 항종양 면역성을 강하게 증가시키는 결과를 가져온다. 최근의 연구는 또한 OX40/OX40L이 CD8 T 세포가 매개하는 면역 반응을 촉진하는 데 역할을 할 수도 있다는 것을 시사한다. 본 명세서에서 논의한 것처럼, OX40 시그널링은 조절 T 세포에서 자연적으로 발생하는 CD4+CD25+의 억제 기능을 방해하고, OX40/OX40L 쌍은 말초 면역과 면역관용의 전체적인 조절에 중요한 역할을 한다.
"카밧(Kabat) 번호", "카밧(Kabat) 정의", "카밧(Kabat) 라벨링"이라는 용어는 본 명세서에서 서로 교환적으로 사용한다. 본 발명이 속한 기술분야에서 인정받는 이들 용어는 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 영역나 항원 결합부위의 해당 부위의 다른 아미노산 잔기보다 더 다양성을 나타내는 (즉 고가변성의) 아미노산 잔기에 대한 넘버링 시스템을 일컫는다 (카밧 (Kabat) 등 (1971) 뉴욕 과학학회 연감 (Ann. NY Acad, Sci) 190:382-391, 이 에이 카밧 (Kabat, E. A.) 등 (1991) 면역학적으로 관심이 가는 단백질들의 서열, 제 5판, 미국 보건 및 인적 서비스부, 미국 국립보건원 출간번호 91-3242).
"재조합 인간 항체"는 호스트 세포에 트랜스펙션한 (transfected) 재조합 발현벡터를 이용하여 발현시킨 항체나 재조합, 조합식의 인간 항체 라이브러리로부터 분리한 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자 이식한 동물 (즉, 마우스)로부터 분리한 항체 (엘 디 테일러 (Taylor, L. D.) 등 (1992) 핵산 연구 (Nucl. Acids Res.) 20:6287-6295 참조) , 또는 다른 DNA 염기서열에서 인간 면역글로불린 유전자 염기서열의 스플라이싱 (splicing)을 포함하는 모든 다른 수단에 의하여 준비하고, 발현하고, 창조하거나 분리한 항체들과 같은 유전자재조합적인 방법에 의하여 준비하고, 발현하고, 창조하거나 분리한 인간 항체들을 포함한다.
용어 "분리한 항체"는 다른 항원적 특이성을 갖는 다른 항체들이 본질적으로 전혀 없는 항체를 포함한다 (즉, hOX40에 특이적으로 결합하는 분리한 항체는 본질적으로 hOX40이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 없는 항체이다). hOX40에 특이적으로 결합하는 분리한 항체는 다른 종의 OX40 분자에는 결합할 수도 있다. 또한 분리한 항체는 본질적으로 다른 세포 물질과/또는 화학물질이 없는 항체일 수도 있다.
용어 "액티비티(activity)"은 OX40 항원에 결합하는 항-인간 OX40항체와 같은 항체의 항원에 대한 특이적 결합력/친화도나/또는 hOX40수용체에 결합하는 항-OX40 항체가 hOX40의 생물학적인 액티비티를 활성화 하는 것이나 인간 L/OX40 세포 분석에서 수용체 결합을 활성화 하는 것과 같은 항체의 활성화 가능성과 같은 액티비티 (activities)를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 같은 "K off "라는 용어는 항체/항원 복합체로부터 항체가 해리해 나올때의 오프 레이트 (off rate) 상수를 언급하기 위해 사용한다. 본 명세서에서 사용하는 "K d "라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리상수를 언급하기 위하여 사용한다.
용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들어 비아코어 시스템 (BIAcore system) (파마시아 바이오센서 (Pharmacia Biosensor) AB, 웁살라 스웨덴과 뉴저지 피스카타웨이)를 사용하여 바이오센서 매트릭스에서 단백질 농도의 변화를 탐지하기 위해 실시간 생특이적인 상호작용의 분석을 가능케 하는 광학적인 현상을 포함한다. 추가적인 기술을 위해서는 실시예 5와 유 존슨 (Jonsson, U.) 등 (1993) 생물 의료 연감 (Ann. Biol. Clin.) 51:19-26; 유 존슨 (Jonsson, U.) 등 (1991) 바이오테크닉 (Biotechniques) 11:620-627; 비 존슨 (Johnson, B.) 등 (1995) 분자인식 저널 (J. Mol. Recognit.) 8:125-131; 비 존슨 (Johnson, B.) 등 (1991) 분석생화학 (Anal. Biochem.) 198:268-277을 참조하라.
용어 "벡터"는 그것과 연관한 또 다른 핵산을 운송하는 능력이 있는 핵산분자를 포함한다. 추가적인 DNA 절편들을 결찰할 수 있는 원형의 이중나선 DNA 루프를 일컫는 "플라스미드"는 벡터의 한가지 종류이다. 또 다른 종류의 벡터는 바이럴 벡터인데, 이 경우 추가적인 DNA 절편들은 바이러스 게놈에 결찰할 수 있다. 특정 벡터들은 그들이 소개되는 숙주 세포에서 자가 복제를 수행할 수 있다 (즉, 세균 복제 기원을 가진 세균 벡터들과 에피솜 (episomal) 포유동물 벡터). 다른 벡터들 (즉, 비에피소멀 (non-episomal) 포유동물 벡터)은 숙주세포로 들어갔을 때 숙주세포의 게놈에 통합하고, 그로 인하여 숙주세포 게놈과 함께 복제한다. 또한 특정 벡터들은 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터들은 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 줄여서 "발현 벡터"라고 지칭한다. 일반적으로 DNA 재조합 기술적으로 유용한 발현 벡터들은 종종 플라즈미드의 형태를 하고 있다. 현재 사양에서 플라즈미드가 가장 일반적으로 사용하는 벡터의 형식이므로 "플라스미드"와 "벡터"는 호환하여 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 수행하는 바이럴 벡터 (즉, 복제 불가능한 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스와 관련한 바이러스들)와 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함하고자 한다.
용어 "재조합 숙주세포"(또는 간단히 "숙주세포")는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 포함한다. 이러한 용어는 특정한 목표 세포 뿐만 아니라 그러한 세포들의 자손들도 일컫기 위하여 사용한다는 것을 이해해야만 한다. 돌연변이나 환경적인 영향에 의하여 계속되는 세대에서 특정한 변이가 발생할 수 있기 때문에, 사실상 이러한 자손이 부모세포와 동일하지 않을 수도 있으나, 본 명세서에서 사용하는 "숙주세포"라는 용어의 범위 안에는 계속 포함된다.
용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단에서 얻어지는 항체 또는 항체와 같은 집단을 지칭하지만, 콜러 (Kohler)와 밀스타인 (Milstein)이 처음으로 기술한 하이브리도마법 (네이쳐 (Nature),256:495-497, 1975) 이나 재조합 DNA법을 포함하지만 그에 국한하지는 않는 특정 방법에 의하여 항체를 생산하는 것을 요구하는 것으로 해석해서는 안된다.
용어 "키메라 항체"(또는 "키메라 면역글로불린")는 원하는 생물학적인 액티비티를 보이는 한 특정 종으로부터 유래하는 항체나 특정한 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 상동하는 중쇄 및/또는 경쇄로 구성하지만 체인의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래한 항체나 다른 항체 클래스의 대응 염기서열과 동일하거나 상응하는 서열로 구성하는 분자나 그러한 항체의 절편들을 지칭한다 (카빌리 (Cabilly) 등 (1984), 인프라 (infra); 모리슨 (Morrison) 등, 미국과학학회지 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.) 81:6851).
용어 "인간화 항체"는 인간 항체에서 유래하는 서열 뿐만 아니라 비인간 (즉, 설치류) 항체로부터 유래하는 서열을 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 인간화 항체는 결합력과/또는 생물학적 액티비티를 유의할만큼 변경하지 않는 동일하거나 다른 종으로 부터 보존적인 아미노산이나 비자연적인 잔기로 교체하는 것을 포함한다. 이러한 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 상보적 결정부위 (CDR)로부터의 잔기를 원하는 특성을 갖는 마우스, 랫트, 낙타, 소, 염소나 토끼와 같은 비인간종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 교체한 인간 면역글로불린 (수령자 항체)이다. 게다가 인간화 항체들은 수령자 항체나 도입한 CDR 또는 프레임워크 서열에서 찾을 수 없는 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은 추가로 항체의 작용을 가다듬거나 최대화하도록 만든다. 그러므로 일반적으로 인간화 항체는 최소한 한 개의 모든 또는 거의 모두 비인간 면역글로불린의 고도 가변 루프에 해당하고 모든 또는 거의 모든 인간 면역글로불린 서열의 FR 부위인 가변도메인으로 된 두가지 중의 한 형태인 가변도메인의 모두 또는 거의 모두를 포함한다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 최소한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부를 포함하거나 인간 면역글로불린의 불변 영역를 포함한다 (캐빌리 (Cabilly) 등, 미국 특허 제4,816,567호; 캐빌리 (Cabilly) 등, 유럽 특허 제0,125,023호 B1; 보스 (Boss) 등, 미국 특허 제4,816,397호; 보스 (Boss) 등, 유럽 특허 제0,120,694호 B1; 엠 에스 뉴버거 (Neuberger, M. S.) 등, WO 86/01533; 엠 에스 뉴버거 (Neuberger, M. S.) 등, 유럽 특허 제0,194,276호 B1; 윈터 (Winter), 미국 특허 제5,225,539호; 윈터 (Winter), 유럽 특허 제0,239,400호 B1; 이 에이 파들란 (Padlan, E. A.) 등, 유럽 출원 제0,519,596호 A1; 퀸 (Queen) 등 (1989) 미국 국립 과학 학회 연감 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol 86:10029-10033을 참조).
본 명세서에서 기술하고 주장하는 각 항체들은 단수나 복수의 형태로 다음과 같이 지칭한다: "hOX40 agonistic antibody;" "hOX40 antagonist" "항-OX40 항체;" "항-hOX40 항체;" "항-hOX40 단일클론 항체;" "항-인간 OX40 항체;" "항-인간 OX40 단일클론 항체;" "항-hOX40 단일클론 항체;" "hOX40 특이적인 단일클론 항체;" "항-OX40L항체;" "항-hOX40L 항체;" "항-인간 OX40L 항체;" "인간 OX40 특이적인 항체;" "인간 OX40 특이적인 단일클론 항체;" "인간 OX40 특이적인 항체;" "인간 OX40 특이적인 단일클론 항체;" "인간 OX40 특이적인 항체;" "항-인간 OX40 특이적인 항체;" "항-인간 OX40 특이적인 단일클론 항체;" "h-OX40 특이적인 항체;" "h-OX40 특이적인 단일클론 항체;" "hOx40 아고니스틱 항체;" "hOX40 길항체" 및/또는 동일한 내용의 다른 유사한 형태.
본 출원에 참고자료로 통합한 미국 특허출원번호 11/659,266 “OX-40-수용체의 시그널링에 영향을 주어 질병상태를 치료하는 방법과 고처리량 스크리닝 방법과 그것에 관한 기질을 파악하기”에서 밝힌 것처럼, OX40L의 기능은 면역억제제 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3), ICOSL, 혹은 미성숙 DC에 의해 유도되는 Tr1세포의 생성의 부정적인 조절이라는 것이 알려졌다. 이러한 발견은 OX40L이 면역력을 향상하고 면역내성을 파괴하는 일반적인 기작을 보여준다.
면역조직학적 분석법 (도 1), 세포내 염색 (도 2), 세포분류 (도 3)을 사용하여 ICOS+IL-10-생산 및 ICOS-TGF-β 생산 Tregs 모두 인간 FL 조직을 침범하는 것을 보였다. 이들 FL-유래 FOXP3+ Tregs는 CD40-리간드에 의하여 전활성화한 자가조직 림프종 세포에 반응하여 FOXP3-CD4+CD25- 종양-침투 T 세포의 증식을 강력하게 억제할 수 있다 (도 4). 도 2의 실험에서, 종양세포들과 PBMCS는 치료전 초기진단을 한 7명의 환자에게서 얻었다. PBMC's는 비교를 위하여 7명의 건강한 공여자로부터도 얻었다. 전체 CD4+T 세포에 대한 조절 T 세포의 백분율은CD4+CD25+CD127lowFOXP3+ Tregs의 플로우 사이토메트릭 분석에 의하여 결정하였다. 도 2a는 Tregs의 FACS 분석의 대표적인 예를 보여주고, 도 2b는 모든 공여자에서의 Treg의 백분율을 보여준다.
OX40L이 덱스 (Dex)와 비트 D3(Vit D3)에 의해 유도된 CD4+ T 세포들로부터 Tr1의 생성을 방해한다는 것 또한 발견하였다. 면역억제제 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)의 조합이 미성숙 CD4+ T 세포의 Tr1 세포로의 분화를 지속적으로 유도한다는 것이 알려져 있다. OX40L이 Tr1 세포의 생성과 기능을 방해하는지 알아보기 위하여, 미성숙 CD4+ T 세포를 OX40L을 유전자 전달 감염한 L 세포의 존재 또는 부재한 환경에서 다음의 네가지 다른 배양 조건에서 항-CD3와 항-CD28 단일클론 항체와 함께 배양하였다: (1) Tr1 (덱스 (Dex)와 비트 D3(Vit D3)); (2) TH1 (IL-12); (3) TH2 (IL-4); (4) 중립 (배양액만)의 4 조건에서 7일간 배양 (도 5a). 초회감작 T 세포에 의한 IL-10 생산을 세포내 사이토카인 염색과 ELISA에 의하여 분석하였다.
도 5a의 실험에서, 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포내 분석을 플로우 사이토메트리에 의하여 수행하였다. 미성숙 CD4+ T 세포를 항-CD3와 항-CD28 단일클론 항체와 함께 IL-2의 존재 하에 표시한 재조합 사이토카인이나 시약과 함께 부모 L 세포나 OX40L-L 세포에서 7일간 배양하였다. 각각의 사이토카인 생산 T 세포의 백분율을 각 닷 블랏 (dot blot) 프로필에 나타내었다. 결과는 OX40L이 각기 다른 분극화 시그널에 의해 유도되는 미성숙 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 억제한다는 것을 보여준다. 도 5a에서 보이듯이, 2%에서 4%의 Tr1 세포들이 중성 또는 TH1이나 TH2 조건에서 배양한 미성숙 CD4+ T 세포로부터 생성한다. 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)와 배양한 경우 15%이상의 Tr1 세포들이 생성하였다. OX40L의 첨가는 Tr1 세포의 생성을 완전히 막아버린 반면, 모든 배양 조건에서 TNF-α 생산 T 세포의 생성은 증가하였다.
이러한 데이터는 ELISA데이터로 확인할 수 있다 (도 5b). 도 5b 실험에서, 항-CD3와 항-CD28 단일클론 항체에 의한 24시간의 재자극 후 상층액의 미성숙 CD4+ 세포에 의한 사이토카인 생산을 ELISA로 측정하였다. 미성숙 CD4+ T 세포를 항-CD3와 항-CD28 단일클론 항체와 함께 IL-2의 존재 하에 표시한 재조합 사이토카인이나 시약과 함께 부모 L 세포나 OX40L-L 세포에서 7일간 배양하였다. 데이터는 4회의 독립적인 실험의 평균±표준편차(SEM)로 표시하였다. 결과는 OX40L이 각기다른 분극화 시그널에 의해 유도된 미성숙 CD4+ 세포로부터의 Tr1 세포의 생성을 방해하는 것을 보여준다.
Tr1 조건 (덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3))으로 초회감작한 미성숙 CD4+ 세포는 무력한 상태이고 항-CD3와 항-CD28 단일클론 항체에 반응한 미성숙 CD4+ 세포의 증식을 억제하는 능력을 가진다 (도 5c). 도 5c의 실험에서 T 세포에서의 억제 기능을 [3H]티미딘(thymidine) 결합도로 측정하였다. 표시한 T 세포 군집의 혼합물을 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체로 재자극한다. 오차막대는 3회 실험의 표준편차를 나타낸다. OX40L과 함께 동일한 Tr1 조건으로 초회감작한 미성숙 CD4+ T 세포는 매우 왕성하게 증식하였고, 항-CD3와 항-CD28 단일클론 항체에 반응한 미성숙 CD4+ T 세포의 증식을 억제하는데 실패하였다. 데이터는 OX40L이 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)에 의해 유도된 미성숙 CD4+ T 세포로부터의 기능적으로 정상인 Tr1의 생성을 막음을 제시한다.
Tr1 세포들이 메모리 CD4+CD45RA-CD45RO+ T 세포로부터 생성할 수 있고 OX40L이 메모리 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포들이 생성하는 것을 방해한다는 것이 알려져 있다. 메모리 CD4+CD45RA-CD45RO+ T 세포들을 Tr1 조건 (덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3))에서 OX40L-트랜스펙션시킨 L 세포의 존재 또는 부재하에서 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체와 7일간 배양하였다. 도 6a의 실험에서 CD4+ 메모리 T 세포에 의한 사이토카인의 세포내 분석을 플로우 사이토메트리로 실시하였다. 메모리 CD4+CD45RO+CD25- 메모리 T 세포를 덱스 (Dex)와 비트D3 (vit D3)의 존재 또는 부재하에 부모적 L 세포나 OX40L-L 세포의 위에서 항-CD3, 항-CD28 단일클론 항체와 함께 7일간 배양하였다. 각각의 사이토카인-생산 T 세포의 백분율을 각각이 닷 블랏 프로파일에 나타내었다. 결과는 OX40L이 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3) 와 함께 배양하는 조건에서 메모리 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 방해하는 것을 보여준다. OX40L의 첨가는 메모리 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 완전히 막고TNF-α생산 세포들의 생성을 촉진함을 보여준다.
메모리 CD4+ T 세포로부터 IL-10 생산을 촉진하는 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)의 능력과, 이 능력이 OX40L에 의하여 방해받을 수 있다는 것을 IL-10 ELISA 분석에 의하여 확인하였다 (도 6b). 도 6b의 실험에서, 메모리 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체로 24시간 재자극한 후 상층액에서 ELISA로 측정하였다. 데이터는 4회의 독립적인 실험의 평균±표준편차 형태로 나타내었다. 결과는 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)이 존재하는 조건하에서 OX40L이 메모리 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 방해한다는 것을 보여준다.
추가로 OX40L이 Tr1 세포의 생성을 방해하지만 다른 TNF-계열 멤버들 (GITRL과 4-1BBL)은 방해하지 않는다는 것을 발견하였다. TNF-수퍼패밀리 중에서 OX40L, 글루코코티코이드-유도 TNF 수용체-리간드(GITRL), 4-1 BB-리간드 (4-1BBL)은 T 세포에 대한 공자극 기능을 갖는다. 오직 OX40L만이 Tr1 세포들을 방해하는지 조사하기 위하여 미성숙 CD4+ 세포를 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)의 존재하에 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체와 함께 배양하는데 부모 L 세포나 OX40L, GITRL, 4-1BBL을 트랜스펙션시킨 L 세포와 함께 7일간 배양하였다. OX40L, GITRL, 4-1BBL 모두 TNF-α 생산 세포들의 생성을 촉진하였으나, OX40L만이 Tr1 세포의 생성을 억제하였다 (도 7a와 7b).
도 7a의 실험에서, 미성숙 CD4+ 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포내 분석을 플로우 사이토메트리에 의하여 수행하였다. 미성숙 CD4+ 세포는 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)의 존재 하에 항-CD3, 항-CD28 단일클론 항체들과 IL-2와 함께 부모적 L 세포, OX40L-L 세포, GITRL-L 세포, 또는 4-1BBL-L 세포에서 7일간 배양하였다. 각기 사이토카인 생산 T 세포의 백분율을 각각 닷 블랏 프로파일에 표시하였다. 결과는 GITRL이나 4-1BBL이 아닌 OX40L만 Tr1 세포의 생성을 저해한다는 것을 보여준다.
도 7b의 실험에서 미성숙 CD4+ 세포에 의한 IL-10은 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체로 24시간동안 재자극한 다음 상등액에서 ELISA로 측정하였다. 데이터는 4회의 독립된 실험의 평균±표준편차 형태로 나타내었다. 결과는 GITRL이나 4-1BBL이 아닌 OX40L만 Tr1 세포의 생성을 저해한다는 것을 보여준다.
OX40L, GITRL, 4-1BBL 모두 전체 T 세포 숫자의 증가를 촉진한다 (도 7c). 도 7c의 실험에서, 생존한 T 세포의 숫자를 세었다. 데이터는 4회의 독립된 실험들의 평균±표준편차 형태로 나타내었다.
본 발명이 속한 분야에서의 지식을 가진 자들이 이해하는 것처럼, 도 7a, 7b, 7c의 결과들은 GITRL이나 4-1BBL이 아닌 OX40L만이 Tr1 세포들의 생성을 방해한다는 것을 보여준다. 이들 데이터들은 T 세포들을 모두 자극시키는 것으로 알려진 세 종류의 TNF-수퍼패밀리 중에서 OX40L이 Tr1 세포들의 생성을 방해하는 새롭고 독특한 기능을 가지고 있음을 암시한다.
OX40L이 ICOSL이나 미성숙 DC에 의하여 유도되는 Tr1 세포들의 생성을 방해한다는 것을 추가로 발견하였다. ICOS와 CD28은 T 세포에서 발현하는 CD28 패밀리 중에서 두 개의 긍정적인 공동 자극 수용체를 대표한다. 아고니스틱 항체나 ICOSL에 의해 ICOS를 통한 시그널링은 CD4+ T 세포를 자극하여 IL-10을 생산하는 것을 보여준다. OX40L이 CD4+ T 세포를 이용하여 IL-10을 생산하는 것을 유도하는 ICOS의 능력을 방해할 수 있는 지 조사하기 위하여, 미성숙과 메모리 CD4+ T 세포를 항-CD3 와 함께 ICOSL을 트랜스펙션 한 L 세포나 ICOSL를 트랜스펙션한 L 세포와 OX40L의 존재 하에서 7일간 배양하였다.
도 8a의 실험에서, 플로우 사이토메트리를 이용하여 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포내 분석을 실시하였다. 미성숙 CD4+ T 세포를 항-CD3 단일클론 항체로 전-코팅한 부모적 L 세포, ICOSL-L 세포와 L 세포의 혼합, 또는 ICOSL-L 세포와 OX40L-L 세포와 함께 7일간 배양하였다. 각각의 사이토카인을 생산하는 T 세포의 백분율을 각 닷 블랏 프로파일로 표시하였다. 결과는 OX40L이 ICOSL에 의하여 유도되는 미성숙 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 억제하는 것을 보여준다.
도 8b의 실험에서, 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체로 24시간 재자극한 후 상층액에서 ELISA를 이용하여 측정하였다. 미성숙 CD4+ T 세포는 항-CD3 단일클론 항체로 전-코팅한 부모적 L 세포, ICOSL-L 세포와 L 세포의 혼합물, 또는 ICOSL-L 세포와 OX40L-L 세포의 혼합물에서 7일간 배양하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균±표준편차 형태로 표시하였다. 결과는 OX40L이 ICOSL에 의하여 유도한 미성숙 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 8c의 실험에서, 플로우 사이토메트리를 이용하여 메모리 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인의 세포내 분석을 실시하였다. 메모리 CD4+ T 세포를 항-CD3 단일클론 항체로 전코팅한 부모적 L 세포나 ICOSL-L 세포와 L 세포의 혼합물, 또는 ICOSL-L 세포와 OX40L-L 세포의 혼합물에서 7일간 배양하였다. 각각의 사이토카인을 생산하는 T 세포의 백분율을 각 닷 블랏 프로파일에 표시하였다. 결과는 OX40L이 ICOSL에 의하여 유도한 메모리 CD4+ T 세포로부터의 Tr1 세포 생성을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 8d의 실험에서, 메모리 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체로 24시간 재자극한 후 상층액에서 ELISA를 이용하여 측정하였다. 메모리 CD4+ T 세포는 항-CD3 단일클론 항체로 전-코팅한 부모적 L 세포, ICOSL-L 세포와 L 세포의 혼합물, 또는 ICOSL-L 세포와 OX40L-L 세포의 혼합물에서 7일간 배양하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균±표준편차 형태로 표시하였다. 결과는 OX40L이 ICOSL에 의하여 유도한 메모리 CD4+ T 세포로부터의 Tr1 세포 생성을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 8a, 8b, 8c, 8d의 실험의 결과는 ICOSL이 미성숙 CD4+ T 세포와 메모리 CD4+ T 세포 모두로부터의 Tr1 세포 생성을 매우 촉진한다는 것을 보여준다. OX40L의 첨가는 TNF-α를 생산하는 세포들의 생성은 강력하게 촉진하는 반면, 미성숙 CD4+ T 세포와 메모리 CD4+ T 세포 모두로부터의 Tr1 세포 생성을 완전히 억제한다.
미성숙한 DC나 IFN-α나 IL-10을 처리한 DC가 미성숙 CD4+ T 세포가 Tr1 세포로 분화하는 것을 유도한다는 것이 알려져 있다. OX40L이 DC에 의하여 유도되는 Tr1 세포의 생성을 방해할수 있는 지의 여부를 조사하였다. 도 8e에서 보듯이, 미성숙한 DC나 IL-10이나IFN-α를 처리한 DC는 모두 미성숙 CD4+ T 세포로부터 10% 이상의 Tr1 세포들이 생성하도록 유도하였다. 대조적으로, CD40L에 의해 활성화한 DC는 약 3% Tr1 세포의 생성과 함께 강한 TH1 반응을 유도한다. DC-T 세포 배양에 재조합 OX40L를 첨가하면 미성숙 DC와 IL-10과 IFN-α를 처리한 DC에 의한 Tr1 세포의 유도를 완전히 억제하였다. 또한 OX40L은 CD40L에 의해 활성화한 DC에 의해 유도되는 Tr1의 잔여수의 생성 또한 억제하였다. 도 8e의 실험에서, 플로우 사이토메트리를 이용하여 CD4+ 미성숙 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 세포내 분석하였다. 미성숙 CD4+ T 세포를 수용성 재조합 OX40L의 존재 또는 부재하에서 7일간 미성숙 DC나 IFN-α, IL-10, CD40L과 함께 배양한 DC와 함께 배양하였다. 각각의 사이토카인을 생산하는 T 세포의 백분율을 각 닷 블랏 프로파일로 표시하였다. 결과는 OX40L이 DC로 유도한 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 억제한다는 것을 보여준다.
ELISA 데이터에 의하여 DC에 의하여 유도되는 Tr1 세포의 생성을 억제하는 OX40L의 능력을 확인하였다 (도 8f). 도 8f의 실험에서, 미성숙 CD4+ 세포에 의한 IL-10 생산을 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체로 24시간 동안 재자극한 후 상층액에서 ELISA를 이용하여 측정하였다. 미성숙 CD4+ 세포는 수용성 재조합 OX40L의 존재 또는 부재하에서7일간 미성숙 DC나 IFN-α, IL-10, CD40L과 함께 배양한 DC와 함께 배양하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균±표준편차 형태로 표시하였다. 결과는 OX40L이 DC에 의해 유도되는 CD4+ 세포로부터의 Tr1 세포의 생성을 억제한다는 것을 보인다. 그러므로 이들 데이터는 OX40L이 ICOSL과 DC가 제공하는 더 많은 생리학적 시그널에 의하여 유도되는 Tr1 세포들의 생성을 억제할 수 있음을 보여준다.
조절 T 세포가 B세포 비호지킨 림프종의 부분에 많이 존재한다는 것과 조절 T 세포의 림프종 부분으로의 모집에 B 세포가 관여한다는 것은 이전부터 시사하고 있었다. OX40L에 의한 것과 같은 OX40 수용체의 시그널링에 영향을 주는 것이 B세포 림프종에 대한 치료법을 제공할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다. B세포 림프종 환자로부터 얻은 냉동보관 샘플을 이용하여 Tr1 세포를 막아버리는 OX40L의 능력을 평가하였다. 사용한 샘플은 다른 치료를 받기 이전의 비장 표본에서 얻은 소낭성 림프종이었다. 세포들을 400×106개의 냉동 세포를 해동하여 127×106개의 살아있는 세포와 33.9×106개의 죽은 세포를 얻었다 (79% 생존율). FACS 염색을 통하여 충분한 숫자의 CD25+ 세포를 확인하였다. Treg 세포들을 두가지의 다른 조건하에서 배양하였다. 첫번째 조건에서는 CD25+/ICOS+ 세포들을 항-CD-3와 함께 IL-2 (900 ul/ml)의 존재 하에 부모적 L 세포나 항-ICOS 항체와 함께 OX40L-L 세포에서 3-6일간 배양하였다. 두번째 조건에서는CD25+/ICOS+ 세포들을 항-CD3와 함께 IL-2 (900 ul/ml)의 존재 하에 ICOS-L-L 세포나 ICOS-L-L 세포와 OX40L-L의 혼합물에서 3-6일간 배양하였다. ELISA를 이용하여 상등액에서 사이토카인 생산을 측정하였다. 결과는 OX40L이 Treg 세포에 의한 IL-10 생산을 대단히 억제한다는 것을 보여준다.
OX40L가 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3), ICOSL이나 DC에 의해 유도되는 Tr1 세포의 생성과 기능을 억제할 수 있는 능력을 가지고 있다는 사실은 본 기술이 속한 기술을 가진 자들이 이해하는 것처럼, OX40L이 다른 형태의 CD4나 CD8에 의하여 매개하는 면역 반응 동안 면역성을 향상시키고 면역내성을 파괴하는 새로운 기작을 보여준다. IL-12에 의해 유도된 TH1이나 IL-4에서 유도된 TH2 반응 동안 Tr1 세포의 생성을 억제하는 OX40L의 능력은 OX40L이 TH1이나 TH2가 매개하는 면역 반응의 정도를 조절할 수도 있다는 것을 시사한다. 게다가, 두개의 다른 TNF-패밀리 멤버인 GITRK과 4-1BBL이 이러한 기능적인 성질을 갖지 않는다는 것을 보아Tr1 세포의 생성을 억제하는 OX40L의 능력은 OX40L 특유의 성질인 것으로 보인다. 또한 Treg 세포에 의한 IL-10 생산을 억제하는 OX40L의 능력을 볼 때, OX40L은 B세포 림프종과 다른 암에 대한 잠재적인 치료법일 될 수 있다.
IL-10, IFN-α, ICOSL, 덱스 (Dex)와 비트 D3 (vit D3)와 같은 면역억제 화합물을 포함하는 많은 분자들이 Tr1 세포들의 생성을 촉진하는 것을 알아냈다. OX40L은 미성숙 CD4+ T 세포만이 아니라 메모리 CD4+ T 세포와 조절 T 세포로부터의 Tr1 세포 생성에 대한 잠재적인 억제물질이다. OX40/OX40L의 이러한 새로운 특성은 OX40 시그널링이 아네르기적(anergic) 자기반응성 T 세포가 효과기 세포 기능을 획득하도록 한다는 최근의 보고를 설명할 수 있다. 그러므로 OX40/OX40L을 타게팅하는 것은 인간의 알레르기와 자가면역질환에 대한 치료법 뿐만 아니라 인간의 전염성 질환과 흑생종, 뇌암, 골암, 백혈병, 림프종, 기저세포 암종과 같은 상피세포 유래의 신생물 (상피 암종), 선암, 입술 암, 입암, 식도암, 작은 대장암과 위암과 같은 위장암, 대장암, 간암, 방광암, 췌장암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 편평세포 및 기저세포암과 같은 피부암, 전립선암, 신장세포 암종 및 기타 암 등을 포함하지만 그에 국한하지 않는 암의 치료법을 제공한다.
항체나 본 명세서에서 기술하고 있는 방법으로 치료하거나 예상할 수 있는 이상상태는 피부 T-세포 백혈병, 머리와 목 종양, 췌장암, 방광암, 고급 신경아교종, 뇌 전이, 흑색종, 피부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 대장암, 백혈병, 골수이형성증후군 (전-백혈병 상태), 다발성 골수종과 같은 암의 치료나 예방을 포함한다. 일반적으로 어떠한 암의 전이는 본 명세서에서 기술한 화합물과 방법으로 치료하거나 예방할 수 있다. 항체는 모세혈관확장증, 정맥혈관종, 혈관모세포종과 같은 증식성 혈관형성 상태를 치료하거나 예방하는데 사용할 수도 있다. 그밖의 이상, 질환이나 상태는 바이러스성 질환, 전통적으로 "치료할 수 없는" 것으로 간주하던 것들을 포함한다. 예를 들어, 항체는 단일 병원체의 종을 동정하는데 사용할 수도 있다. 연구자들은 본 명세서에서 기술한 항체들을 유기체 내의 특정 세포나 분자를 동정하고 추적하는데 사용할 수 있다.
일반적으로 "암"과 "암성"이라는 용어는 포유동물에서 조절되지 않는 세포 성장으로 전형적으로 특징짓는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 더 구체적으로는, 본 명세서에서 기술한 하나 또는 그 이상의 항체나 그의 변형을 이용하여 예방하거나 치료할 수 있는 암은 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병을 포함하나 그에 한정하지 않는다. 이러한 암의 더 특정한 예는 편평세포암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평세포종을 포함), 복막의 암, 간세포암, 위 또는 위장암 (위장암과 위장기질암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간세포암, 방광암, 간암, 유방암, 대장암, 직장암, 자궁내막이나 자궁암, 침샘암종, 신장암이나 콩팥세포암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 다양한 형태의 머리와 목암, 흑색종, 표재확산흑색종, 악성 흑색종, 말단흑자흑색종, 결절성 흑색종 뿐만 아니라 B세포 림프종 (저급/여포성 비호지킨 림프종 (NHL); 소림프구 (SL) NHL; 중급/여포성 NHL; 중급 미만성 NHL; 고급 면역모구NHL; 고급 림프모구 NHL; 고급 소비균열세포 NHL; 큰종양 NHL; 외투세포림프종; AIDS-연관 림프종; 발덴스트롬마크로글로불린혈증을 포함); 만성 림프성 백혈병 (CLL); 급성 림프성 백혈병 (ALL); 모발상세포백혈병; 만성골수모구백혈병; 이식후림프증식질환 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증, 부종 (뇌암과 연관한 것과 같은), 메이그증후군과 같은 이상 혈관 증식을 포함하나 그에 국한하지 않는 암이다.
면역이상을 치료하거나 예방하는 방법 또한 본 명세서에서 제공한다. 이러한 방법은 호과적인 양의 항체를 그러한 치료가 필요한 목적물에 처방하는 것을 포함한다. 몇몇 예에서, 면역이상은 면역이상 또는 자가면역이상이다. 이러한 이상은 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 염증성 장질환, 다발성 경화증, GVHD, 및/또는 전신홍반루푸스이다. 어떠한 예에서 이러한 이상은 바이러스, 세균 또는 그밖의 전염성 물질과 관련한 질병이다.
게다가, 본 명세서에서 기술한 항체들과 방법들은 관절염, 류마티스 관절염, 크론씨병, 궤양성 대장염과 같은 염증성 질환과 상태와 루푸스, 혼합자가면역질환과 같은 자가면역질환의 치료와 예방에 사용할 수 있다. 일례로, 본 명세서에서 기술한 항체들은 필요한 대상체에 치료적으로 효과적인 양의 항체를 주사하는 방식으로 다양한 자가면역 및 염증성질환을 치료하는데 유용할 수 있는데, 가능한 자가면역질환이나 염증성 질환은 다음중 한가지 또는 그이상의 병이 될 수 있다: 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 당뇨병, 다발성 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 급성 파종성 뇌척수염, 관절염, 류마티스 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 중증근육무력증, 갑상샘염, 하시모토병, 원발점액부종, 갑상샘 중독증, 악성빈혈, 자가면역성 위축위염, 애디슨병, 조기폐경, 남성불임, 소아당뇨, 굿파스쳐증후군, 보통천포창, 유사천포창, 교감성안염, 수정체성 포도막염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 벽혈구감소, 원발쓸개관간경화, 활성 만성 간염Hb s - ve , 원인미상의 간경화, 궤양대장염, 쉐그렌증후군, 공피증, 베게너육아종증, 폴리/피부근육염, 원반형 LE, 전신홍반루푸스, 크론씨병, 건선, 강직척추염, 항인지질항체증후군, 재생불량성 빈혈, 자가면역간염, 복강질환, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군 (GBS), 특발저혈소판자색반병, 옵소클로누스 마이오클로누스 신드롬 (Opsoclonus myoclonus syndrome) (OMS), 시신경염, 오드의 갑상샘염 (ORd's thyroiditis), 천포창, 다관절염, 원발쓸개관간경화, 라이터 증후군, 다카야스병, 관자동맥염, 온난항체 자가면역성 용혈성 빈혈, 베게너 육아종증, 전신탈모증, 베체트병, 샤가스병, 만성피로증후군, 자율신경기능장애, 자궁내막증, 화농땀샘염, 사이질방광염, 신경근육긴장증, 사코이드증, 공피증, 궤양대장염, 백반증, 여성외음부통, 염증성 피부질환, 알러지 접촉 피부염, H. pyrori 위염, 만성비염성 질환, 만성 코염증성 질환, 동맥경화, 조직물과 이식물 질환.
더 구체적으로, 본 명세서에서 "자가면역질환"은 개인 자체의 조직이나 기관이나 동시 분리 또는 그로 인한 발현 또는 거기에서부터 결과하는 조건으로부터 또는 그에 직접적으로 대항함으로써 발생하는 질환이나 이상상태를 지칭한다. 자가면역질환은 B세포에 의한 일반적인 신체조직과 항원에 반응하는 항체의 생산으로부터 결과하거나 이에 의하여 학화되는 상태를 지칭할 수 있다. 또한 자가면역질환은 자가항원 (즉, 핵항원)으로부터의 에피톱에 특이적인 자가항체의 분비를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기술한 하나 또는 그이상의 항체로 치료하거나 예방할 수 있는 자가면역질환 또는 자가면역이상은 관절염 (급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍이나 통풍관절염, 급성 통풍관절염, 급성 면역관절염, 만성 염증성관절염, 퇴행성관절염, II형 콜라겐 유래 관절염, 감염관절염, 라임관절염, 증식관절염, 건선관절염, 스틸씨병, 척추관절염, 소아류마티스 관절염, 골관절염, 만성 변형성 관절염, 변형관절염, 만성 프리마리아 다발성 관절염 (polyarthritis chronica primaria), 반응관절염, 강직척추염과 같은 류마티스 관절염), 염증성 과증식성 피부질환 (inflammatory hyperproliferative skin diseases), 판건선, 방울건선, 고름물집건선, 손톱의 건선과 같은 건선, 건초열, 좁 증후군 (Job's syndrome)과 같은 아토피성 질환을 포함하는 아토피, 접촉피부염, 만성 접촉피부염, 탈락피부염, 알레르기 피부염, 알레르기 접촉피부염, 포진피부염, 동전모양 피부염, 지루피부염, 비특이성 피부염, 원발자극피부염, 아토피성 피부염등을 포함하는 피부염, X-염색체 연관 과민성 IgM 증후군 (x-linked hyper IgM syndrome), 알러지성 안내 염증성 질환, 만성 알레르기성 두드러기와 자가면역 두드러기를 포함하는 만성 특발성 두드러기와 같은 두드러기, 근염, 다발성근염/피부근염, 청소년성 피부근육염, 독성표피괴사용해, 공피증 (전신피부경화증 포함), 전신경화증, 스피노-옵티칼 다발경화증 (spino-optical MS), 일차진행성 다발적경화증 (primary progressive MS) (PPMS), 재발-완화반복성 다발적경화증 (RRMS)와 같은 다발경화증 (MS), 진행전신경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 파종경화증, 운동실조경화증, 시신경척수염 (NMO), 염증성 장질환 (IBD) (예로는 크론병, 자가면역관련 장관증, 궤양대장염, 궤양성 대장염, 현미경적 대장염, 교원성대장염, 폴립성 대장염, 괴사소장대장염, 전층대장염 (transmural colitis)등의 대장염, 자가면역 염증성 장질환), 대장염증, 괴저화농피부증, 결절홍반, 원발성 경화성 담관염, 성인 또는 급성호흡곤란증후군 (ARDS)과 같은 호흡곤란증후군, 수막염, 포도막 전부 또는 일부 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역성 혈액장애, 류마티스 척추염, 류마티스 윤활막염, 유전성혈관부종, 수막염 따른 뇌 신경 손상, 임신헤르페스, 임신유사천포창, 음낭가려움, 자가면역성 조기폐경, 자가면역 환경에 의한 갑작스러운 청력상실, 아나필락시스 (anaphylaxis)과 알러지비염과 아토피성비염과 같은 IgE 관련 질환, 라스무센뇌염과 변연계 또는 뇌간뇌염과 같은 마뇌염, 전포도막염, 급성전포도막염,육아종 포도막염, 비육아종 포도막염, 수정체파괴성 포도막염, 후포도막염, 또는 자가면역 포도막염과 같은 포도막염, 만성사구체신염이나 일차성 사구체신염, 면역 매개 사구체신염, 막사구체신염 (막성신장병), 특발성막사구체신염 또는 특발성 막성신장병과 같은 급성 사구체신염, I형과 II형을 포함하는 막증식사구체신염 (MPGN), 급속진행사구체신염과 같은 콩팥증후군을 동반한 또는 동반하지 않은 사구체신염 (GN), 증식성 신장염, 자가면역성 다선성 부전, 국한성 형질세포귀두염을 포함하는 귀두염, 귀두포피염, 중심 원심성 윤상홍반, 지속색소이상홍반, 다형홍반, 고리육아종, 광택태선, 경피성 위축성 태선, 만성 단순태선, 극상태선, 층판성 비늘증, 표피박리과다각화증, 전암성 각화증 (premalignant keratosis), 괴저화농피부증, 알레르기 환경과 알레르기반응 (allergic response), 알레르기반응 (allergic reaction), 알레르기성 또는 아토피성 습진, 건조습진, 발한이상습진, 수포성손발바닥습진과 같은 습진, 천식기관지염, 기관지천식, 자가면역 천식과 같은 천식, T 세포의 침윤과 만성염증반응을 포함하는 상태, 임신중 태아 A-B-O 혈액형과 같은 외래 항원에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환 (chronic pulmonary inflammatory disease), 자가면역성 심근염, 백혈구부착결핍증, 루푸스 신장병, 루푸스 뇌염, 소아루푸스, 비신장루푸스 (non-renal lupus), 신장외 루푸스 (extra-renal lupus), 원반모양루푸스와 원반모양홍반루푸스, 탈모성 루푸스 (alopecia lupus), 피부전신홍반루푸스나 아급성피부전신홍반루푸스와 같은 전신홍반루푸스 (SLE), 신생아루푸스증후군, 파종상홍반성루푸스를 포함하는 루푸스, 소아 인슐린의존형 당뇨병 (IDDM)을 포함하는 유년발병형 (타입 I) 당뇨병, 성인발병형 당뇨병 (타입 II) 당뇨병, 자가면역성 당뇨, 특발성 요붕증, 당뇨성망막병증, 당뇨신장병, 당뇨성 대형 동맥 이상, 사이토카인과 T-림포사이트에 의해 매개되는 급 성및 지연과민증과 연관한 면역 반응, 결핵, 사코이드증, 림프종모양육아종증을 포함하는 육아종증, 베게너육아종증, 무과립구증, 혈관염, 대혈관 혈관염 (류마티스성 다발성 근육통과 거세포 (타카야수) 동맥염을 포함), 중혈관염 (카와사키증과 결절다발동맥염/결절동맥주위염을 포함), 광학현미경적 다발성 동맥염, 면역성혈관염 (immunovasculitis), 중추신경 혈액염, 피부혈관염, 과민혈관염, 전신성괴사혈관염과 같은 괴사혈관염, 처그-스트라우스 혈관염이나 처그-스트라우스 증후군 (CSS)와 같은 ANCA-연관 혈관염과 ANCA-연관 소혈관 혈관염을 포함하는 혈관병증, 관자동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역성 재생불량성 빈혈, 쿰 양성 빈혈 (Coombs positive anemia), 다이아몬드-블랙판 빈혈, 용종성 빈혈이나 자가면역용혈빈혈 (AIHA)을 포함하는 면역용혈빈혈, 악성빈혈, 애디슨병, 진정적혈구계빈혈 또는 진정적혈구계 무형성증 (PRCA), 팩터 VIII 결핍, A형 혈우병, 자가면역성 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 동반하는 질병, 중추신경 염증성 이상, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 패혈증, 외상이나 출혈에 수반하는 것과 같은 다발성장기손상 증후군, 항원항체 복합체 매개 질환들, 항사구체기저막 항제 칠환, 항인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병/베체트 증후군. 캐슬만 증후군, 굿파스처 증후군, 레이노 증후군, 쇠그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 물집유사천포창 및 피부유사천포창과 같은 유사천포창, 천포창 (보통천포창, 낙엽천포창, 점액막천포창 (pemphigus mucus-membrane pemphigoid), 홍반천포창을 포함), 자가면역다발성 내분비 장애증, 라이터병 또는 라이터증후군, 열손상, 자간전증, 면역복합체성 신장염과 같은 면역복합체 이상, 항체매개 신장염, 다발신경병증, IgM 다발신경병증이나 IgM 매개 다발신경병증과 같은 만성신경병증, 혈전저혈소판혈증자색반병 (TTP), 수혈후자반증 (PTP), 헤파린유인성 혈소판감소증, 만성 또는 급성 특발성 혈소판 감소성 자색반증과 같은 특발성 혈소판 감소성 자색반증 (ITP)와 같은 자가면역 또는 면역매개 혈소판감소증을 포함하는 혈소판감소증 (일례로 심근경색증 환자에서 발생하는 것 같은), 특발성 세라토-공막염 (idiopathic cerato-scleritis)와 같은 공막염, 상공막염, 자가면역성 고환염과 난소염을 포함하는 고환과 난소의 자가면역성 질환, 일차성 갑상선기능저하증, 부갑상선저하증, 자가면역 갑상샘염, 하시모토병, 만성 갑상샘염 (하시모토 갑상샘염), 또는 아급성갑상선염과 같은 갑상샘염을 포함하는 자가면역성 내분비 질환, 자가면역성 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브 병, 자가면역성 다분비선증후군 (또는 다분비선내분비선증후군 (polyglandular endocrinopathy syndromes)), 램버트-이튼 근무력증후군이나 이튼-램브트 신드롬과 같은 방종양신경 증후군을 포함하는 신생물딸림증후군, 강직증후군, 알레르기성 뇌척수염과 실험성 알레르기성 뇌척수염 (EAE)과 같은 뇌척수염, 타이모마-연관 중증근육무력증 (thymoma-associated myasthenia gravis), 소뇌변성, 신경근육긴장증, 눈간대경련 또는 눈간대경련 근간대경련 증후군 (opsoclonus myoclonus syndrome) (OMS), 감각신경병증과 같은 중증근육무력증, 다초점성 운동신경병증, 시한증후군, 자가면역성 간염, 만성 간염, 유낭창 간염, 거대세포 간염, 만성활동간염 또는 자가면역성 만성활동간염, 림프모양 사이질 폐렴 (lymphoid interstitial pneumonitis) (LIP), 폐쇄기관지염 (비이식성) 대 NSIP, 길랭-바 증후군, 버거씨 병 (IgA 신장병), 특발성 IgA 신장병, 선상 면역글로불린A 피부병, 급성 유열 호중구성 피부증, 각질하농포성 피부증, 일과성 극세포해리성 피부병, 원발쓸개관간경화, 폐경변과 같은 경화증, 자가면역 장질환 증후군, 복강질환, 복강스프루 (celiac sprue) (글루텐장병증), 불응성스프루, 특발성스프루, 저온글로불린혈증, 근위축측삭경화 (ALS; 루게릭병), 심장동맥병, 자가면역내이질환 (AIED)과 같은 자가면역성 귀질환, 자가면역 청력상실, 난치성 다발성 연골염, 재발성 다발성 연골염과 같은 다발연골염, 폐포단백증, 코간증후군/비매독성 각막실질염, 벨마비, 스위트병/증후군, 주사 자가면역 (rosacea autoimmnune), 대상포진-관련 통증, 아밀로이드증, 비종양성 림프구증가증, 단일클론성 B 세포 림프증가증 (즉, 양성단세포군감마글로불린혈증 과 알려지지않은 중요성의 단세포군감마글로불린혈증 , MGUS)을 포함하는 원발성림프구증가증, 말초신경증, 신생물딸림증후군, 간질, 편두통, 부정맥, 근육이상, 난청, 실명, 주기마비, 중추신경계 채널병과 같은 채널병, 자폐증, 염증성근육병증, 국소 또는 분절 또는 국소분절 사구체경화증 (FSGS), 내분비성 안질환, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역성 간이상, 섬유근통, 다발성 내분비 부전, 쉬미트증후군, 부신염, 위선위축, 노년전 치매, 자가면역성 탈수초성질환과 만성 염증성 탈수초성 다발신경증과 같은 탈수초성질환, 드레슬러 증후군, 알로페시아 그레아타 (alopecia greata), 전두탈모 (alopecial totalis), 크레스트 증후군 (CREST syndrome) (석회증, 레이노현상, 식도운동장애, 가락피부경화증, 모세혈관확장증), 항-정자 항체로 인한 자가면역성 남녀 불임, 혼합결합조직병, 샤가스병, 류마티스열, 반복유산, 농부폐, 다형홍반, 심근경색후 증후군, 쿠싱증후군, 새 사육가 폐, 알레르기성 육아종성 혈관염, 양성림프구혈관염, 알포트증후군, 알레르기성 폐포염, 섬유화폐포염과 같은 폐포염, 사이질폐질환, 수혈부작용, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증과 같은 기생충증, 카이파노소미아시스 (kypanosomiasis), 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터증후군, (Sampter's syndrome), 캐이플란증후군, 뎅기, 심장내막염, 심내막심근섬유증, 미만성 간질성 폐섬유증, 간질성 폐섬유증, 폐섬유증, 특발폐섬유증, 낭성섬유증, 안구내염, 장기융기성 홍반 (erythema elevatum et diutinum), 태아적모구증, 호산구성 근막염, 슐만증후군 (Shulman's syndrome), 펠티증후군 (Felty's syndrome), 사상충증, 만성 섬모체염, 홍채이색섬모체염, 홍채섬모체염 (급성이나 만성) 또는 푹스홍채이색섬모체염과 같은 섬모체염, 헤노흐-쇤라인자색반, 인간 면역결핍바이러스 (HIV) 감염, 중증혼합면역결핍증 (SCID), 후천성면역결핍증후군 (AIDS), 에코바이러스 감염 (echovirus infection), 패혈증, 내독소혈증, 췌장염, 갑상샘중독증, 파르보바이러스 감염 (parvovirus infection), 풍진바이러스, 접종후 증후군 (post-vaccination syndromes), 선천성 풍진 증후군, 엡스타인-바 바이러스 감염 (Epstein-Barr virus infection), 유행성이하선염, 에반스증후군 (Evan? syndrome), 자가면역성 생식샘 부전, 시덴함무도병 (Sydenham's chorea), 연쇄상구균감염후 신장염, 폐쇄혈전혈관염, 갑상샘중독증, 척수매독, 맥락막염, 거대세포 다발성 근육염, 만성 과민성폐렴, 건절편막결막염, 유행성각막결막염, 특발성 신장염증후군, 미세변화신장병증, 양성가족성 및 심근허혈재관류 손상 (benign familial and ischemia-reperfusion injury), 장기이식 혈액재관류 (transplant organ reperfusion), 자가면역성 망막 (retinal autoimmunity), 관절염증, 기관지염, 만성폐쇄성 기관/폐질환 (chronic obstructive airway/pulmonary disease), 규폐증, 아프타(aphthae), 아프타구내염, 죽상경화성 이상, 아스퍼니오게니스 (asperniogenese), 자가면역성 용혈, 뵈크병 (Boeck's disease), 저온글로불린혈증, 뒤피트랑구축 (Dupuytren's contracture), 수정체과민성 안외염 (endophthalmia phacoanaphylactica), 알레르기성 소장염 (enteritis allergica), 나병결절홍반, 특발얼굴마비, 만성피로증후군, 류마티스열 (febris rheumatic), 함만-리치병 (Hamman-Rich's disease), 감각신경난청, 발작성 혈색소뇨증 (haemoglobinuria paroxysmatica), 생식샘기능저하증, 국한회장염 (ileitis regionalis), 백혈구감소증, 전염단핵구증 (mononucleosis infectiosa), 횡단성 척수염 (traverse myelitis), 원발 특발성 점액부종 (primary idiopathic myxedema), 신장증, 교감눈염증 (ophthalmia symphatica), 육아종성 고환염 (orchitis granulomatosa), 췌장염, 급성다발신경근염 (polyradiculitis acuta), 괴저화농피부증, 드퀘르벵갑상선염 (Quervain's thyreoiditis), 후천성비장위축증 (acquired spenic atrophy), 양성흉선종, 백반증, 독소충격증후군, 식중독, T 세포의 침윤을 포함하는 상태, 백혈구부착결핍, 사이토카인과 T-림프구에 의해 매개되는 급성 또는 지연과민과 연관한 면역 반응, 백혈구누출을 포함하는 질환, 다발성장기손상 증후군 (multiple organ injury syndrome), 항원-항체 복합체 매개 질환들 (antigen-antibody complex-mediated diseases), 항사구체기저막항체질환, 알레르기성 신경염, 자가 면역 다발성 내분비 장애, 난소염, 원발성 점액부종 (primary myxedema), 자가면역성 위축위염, 교감눈염증, 류마티스 질환, 혼합결합조직병, 콩팥증후군, 췌도염, 다내분비선 부전, 타입 I 자가면역성 다선성 증후군 (autoimmune polyglandular syndrome type I), 성년개시 특발성 부갑상선기능저하증 (AOIH), 확장심근병증과 같은 심근병증, 후천성 표피 수포층 (EBA), 혈색소증, 심근염, 콩팥증후군, 원발 경화성 담관염, 화농성 또는 비화농성 동염, 급성 또는 만성 동염, 벌집뼈, 전두, 상악, 또는 접형골 동염, 호산구증가증, 호산구증가성 폐침윤, 호산구증가근육통증 증후군, 뢰플러증후군 (Loffler's syndrome), 만성호산구폐렴, 열대성 폐호산구증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증 (bronchopneumonic aspergillosis), 아스페르길루스종이나 호산구를 포함하는 육아종과 같은 호산구 관련 이상, 아낙필라시스 (anaphylaxis), 혈청음성 척추관절염, 다내분비선 자가면역 질환, 경화담관염, 공막, 상공막, 만성점막피부캔디다증, 브루톤 증후군 (Bruton's syndrome), 영아 일과성 감마글로불린저혈증, peptic ulcer, valvulitis, and endometriosis. 비스코트-알드리치 증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome), 모세혈관확장성 운동실조증후군, 안지엑타시스 (angiectasis), 콜라겐증과 연관한 자가면역이상, 류마티즘, 신경질환, 림프절염, 혈압반응의 감소, 혈관기능장애, 조직손상, 심장혈관허혈, 통각과민증, 신허혈, 대뇌허혈, 맥관신생을 수반하는 질환, 알레르기성 민감증, 사구체신염 (glomerulonephritides), 재관류 손상, 허혈 재관류 이상, 심장근육 또는 다른 조직의 재관류 손상, 림프종성 기관기관지염 (lymphomatous tracheobronchitis), 염증성 피부병 (inflammatory dermatoses), 급성 염증 요인에 의한 피부병, 다발성 장기 부전, 수포성 질환 (bullous diseases), 신장피질괴사, 급성화농성수막염이나 다른 중추신경계 염증 이상, 안구와 안와 염증성 이상, 과립구 수혈관련 증후군 (granulocyte transfusion-associated syndromes), 사이토카인 유도 독성 (cytokine-induced toxicity), 기면증, 심한 급성 염증 (acute serious inflammation), 만성 난치성 염증, 신우염, 동맥말단과다형성 (endarterial hyperplasia), 소화궤양, 판막염, 자궁내막증을 포함하나 이에 국한하지 않는다.
본 명세서에서 기술한 항체는 다양한 학술적, 의학적, 상업적 이용처를 가질 수 있다. 항체들은 예를 들어 다양한 종류의 질환이나 약품 (의약품), 독소나 호르몬을 포함하는 그 밖의 단백질의 존재를 생체 내나 생체외에서 감지하는 진단시험에 사용할 수 있다. 본 명세서에서 기술한 항체는 예를 들면 환자의 혈청이나 혈액을 이용하여 질병을 진단하는데 유용할 수 있다. 이러한 질환은 OX40과 관련된 질병들이나 질병이나 많은 암, 염증이나 자가면역 질환을 포함하는 OX40과 관련하지 않음을 표시할 수 있다. 항체는 암의 방사면역적 탐지와 방사면역적 치료에 사용할 수 있고, 어떠한 새로운 시험 방법이 본 명세서에서 기술한 암과 같은 특이적인 세포형태의 세포막 만을 목표로 하는 항체들을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 기술한 항체는 키트나 다른 진단 패키지의 일부로 만들 수 있다. 이러한 식으로 본 명세서에서는 본 명세서의 전처리 방법을 이용하여 진단 키트나 생산 기사를 제공한다. 진단 키트는 다음의 어떤 한가지나 그 이상으로 구성할 수 있다: 길항제/항체/약물참고자료; 항체를 무력화하는 포지티브 컨트롤 (선호적으로 시노 원숭이 (cyno monkey)의 염소); 단백질 A+G 컬럼 (즉 단백질 A/G 컬럼); 지방제거 시약; 면역글로불린 친화성 분리 완충액(들) (예로써 결합, 추출 및 중성화 완충액); 보체 혈청; 세포에 대한 분석희석제; 사용 메뉴얼 또는 문건; 냉동한 세포의 바이알 (예, WIL2 세포); 세포 표지 시약 (세포 타이터 글로.RTM (CELL TITER GLO. RTM)) 등. 예로써, 진단 키트는 다음과 같은 것들을 포함할 수 있으나 이에 국한하지는 않는다: (a) 지질제거 시약; (b) 면역글로불린의 친화성 분리를 위한 완충액 (즉, 결합 및 추출 완충액); (c) 진단키트 사용자에게 표본에 세포를 기준으로 하는 생분석 (항체 무력화 분석같은) 자가면역질환이나 암 피험자로부터 얻은 전처리한 생물학적 표본을 사용하는 방법 (즉, 혈청 간섭의 문제를 피하기 위해)을 지시하는 사용 메뉴얼. 진단키트는 선택적으로 추가로 다음의 한가지나 그 이상의 것을 포함할 수 있다: 약물참고자료, 항체를 무력화하는 포지티브 컨트롤, 보체 혈청, 세포에 대한 분석희석제, 세포 표지시약 등.
본 명세서에서 기술한 항체나 그밖의 발견은 고처리량 스크리닝 방법 또한 제공한다. 더 특이적으로는, 그리고 본 기술이 속하는 분야에서 통상적인 지식을 가진 인간들이 이해하는 바에 따르면, OX40 수용체에 결합하고 Tr1의 생성과 작용을 방해할 수 있거나 Tr1 세포의 생성과 작용을 촉진하는 길항적인 또는 아고니스틱 단일클론 항체나 소분자를 스크리닝하는 고처리량 방법이 가능하게 한다. 이러한 방법 중의 하나에서, IL-10을 생성하는 능력을 가진 인간 T 세포라인 (SU-DHL-1)을 인간 OX40 유전자를 트랜스펙션한다 (SUOX40). 100,00개의 SUOX40 세포를 96웰 플레이트(96 well-plate)에서 100,000 개의 마우스 섬유아세포 (L cell)이나100,000개의 OX40 리간드를 발현하는 마우스 섬유아세포 (OX40-리간드 L 세포)와 함께 배양한다. 배양 48시간 후에, 배양상층액을 수집하여 IL-10특이적인 ELISA를 이용하여 IL-10을 측정한다. 대표실험에서 100,000개의 SUOX40 세포는 OX40리간드의 부재하에서 배양했을 때 최대 6,000pg/ml의 IL-10을 생산하였다. OX40리간드의 존재하에서는 100,000개의 SUOX40 세포는 1,000 pg/ml 미만의 IL-10을 생산하였다. 이 배양방법은 그중에서도 SUOX40 세포에 의한 IL-10 생산을 억제하는 OX40리간드 능력을 막는 길항적 단일클론 항체나 소분자를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 또 다르게는, 이 배양 방법은 OX40리간드를 발현하는 L 세포를 OX40에 특이적인 잠재적인 아고니스틱 단일클론 항체나 소분자로 교체하여 그들의 SUOX40 세포에 의한 IL-10 생산을 억제하는 능력을 평가하는 방법으로 변형할 수 있다.
본 명세서에서 기술한 항-OX40 항체는 유기물의 유기물표본에서 발견되는 약품이나 다른 분자의 활성을 시험하거나 측정하는 분석법으로써 또는 분석법에 사용할 수 있다. 이들은 또한 표본 내의 물질의 양을 측정하는 정량적인 분석으로 사용할 수 있다. 생체분석이나 면역학적 분석은 이들 항체를 사용할 수 있는 특별한 생화학적 분석의 많은 종류들 중의 한 부분이다. 본 명세서에서 가르치는 항-OX40 항체는 효소활성, 항원포획, 줄기세포 활성과 경쟁적인 단백질 결합과 같은 과정들을 측정하는 다른 분석들에 사용할 수 있다.
인간 GITRL, OX40L, 4-1BBL을 발현하는 L 세포들은 본 발명이 속한 기술분야에서의 지식을 습득하고 있는 인간들이 이해하는 것처럼 레트로바이러스가 매개하는 형질도입을 이용하여 생성한다. 간략하게 설명하면, 인간 유래 GITRL (Accession # NM_005092), OX40L (Accession # NM_003326), 4-1BBL (Accession # NM_003811), ICOSL (Accession # NM_015259)의 전체길이 암호화 염기서열을 HSV-1으로 자극한 PBMC로부터 마련한 RNA를 이용한 RT-PCR로 증폭한다. 그 이후 cDNA를 MSCV에 기반한 레트로바이러스 벡터 pMIGW2 안에 클로닝하고 결과물로 나오는 플라즈미드를 제한효소로 잘라낸다음 DNA 염기서열분석으로 확인한다. 재조합 레트로바이러스를 생산하기 위하여, 각각의 벡터는 팩키징 컨스트럭트 (packaging construct) pCL-gp (gag/pol)와 pHCMV-VSVg (VSV 글라이코단백질 (glycoprotein) 봉투)와 함께 HEK293T 세포에 코유전자전달감염 (co-transfect)한다. 이틀 후에 바이러스를 함유한 배양 상층액을 회수하여 moi 100에 CD32 L 세포를 감염시키는데 사용한다. 이러한 조건에서 >95%의 세포들이 생산적으로 형질전환하였다.
본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼, 분리한CD14+ 단핵세포들 (순도 >94%)를100 ng/ml의 GM-CSF와 50 ng/ml의 IL-4 (둘 다 R&D로부터 구입)의 존재하에서 5일간 배양한다. 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼, 결과물인 비성숙 DC를 세척하고 IFN-α(1000 U/ml, PBL 바이오메디컬 래보라토리(PBL Biomedical Laboratories)), IL-10 (10 ng/ml, R&D), 방사선조사한 CD40L-유전자 전달 감염한 L 세포 (DC와 L 세포 비율, 4:1)의 존재하에 24시간 동안 배양하여 성숙한 DC를 얻는다.
미성숙 CD4+ T 세포와 메모리 CD4+ T 세포 (순도 각 >99%)를 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼 CD4+ T 세포 분리 키트 II (밀트네이 바이오텍 (Miltenyi Biotec))를 이용하여 PBMC로부터 얻어내고 셀 소팅한단(미성숙 T 세포는 CD4+CD45RA+CD45RO-CD25- 분획, CD4+CD45RA-CD45RO+CD25- 분획은 메모리 T 세포). 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼, 4x104개의 신선하게 순화한 동종의 미성숙 CD4+ T 세포를 인간 유래 재조합 OX40L (R&D, 100 ng/ml)의 존재 또는 부재하에 둥근 바닥 96-웰 배양접시에서 7일간 미성숙의 또는 배양한 DC (DC와 T 비율 1:10)과 함께 배양한다. 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼 순화한 CD4+ T 세포들 또한 수용성 항-CD28 단일클론 항체 (CD28.2, 1 ㎍/ml)과 IL-2 (50 U/ml, R&D)의 존재하에서 IL-12 (10 ng/ml, R&D), IL-4 (25 ng/ml, R&D), 또는 덱사메타손 (dexamethasone) (5x10-8 M, 라이프 테크놀로지 (Life Technologies))과 1 알파, 25-디하이드록시비타민 D3(10-7 M)의 혼합물과 함께 방사선을 조사한 CD32/OX40L-L 세포, CD32/GITRL-L 세포, CD32/4-1BBL-L 세포, 또는 CD32-L 세포에서 항-CD3 단일클론 항체 (OKT3, 0.2 ㎍/ml)로 전 코팅한 48-웰 배양접시 (T 세포와 L 세포 비율 2.5:1)에서 7일간 배양한다. 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼, 배양에는 RPMI 1640 배지에 10% FCS, 2 mM L-글루타민 (L-glutamine), 1 mM 소디움 파이루베이트 (sodium pyruvate), 페니실린 G (penicillin G), 스트렙토마이슨 (streptomycin)을 첨가한 것을 사용하였다.
본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼 배양한 T 세포를 수집하고 세척한 다음 플레이트에 부착한 항-CD3 (5 ㎍/ml)와 수용성 항-CD28 (2 ㎍/ml)으로 1x106 세포/ml의 농도에서 재자극한다. 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼, 상층액 내의 IL-4, IL-10, TNF-α, IFN-α의 수준을 ELISA (모든 키트들은 R&D로부터 구입)로 측정하였다. 세포내 사이토카인 생산을 위하여 배양한 T 세포를 50 ng/ml의 PMA와 2 ㎍/ml의 이오노마이신 (ionomycin)으로 6시간 동안 재자극 하였다. 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼 마지막 두시간동안은 브레펠딘 A (Brefeldin A) (10 ㎍/ml)을 첨가하였다. 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼, 세포들은 PE로 표지한 IL-4 나 TNF-α에 대한 단일클론 항체와 FITC로 표지한 IFN-α와 APC로 표지한 항-IL-10 (모두 BD로부터 구입)의 조합으로 FIX와 PERM 키트 (CALTAG)를 이용하여 염색하였다.
본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼 T 세포들을 수집하여 EDTA를 포함한 배양액에 다시 풀어주어 클러스터를 용해한다. 본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼 생존할 수 있는 세포들은 트립판-블루 (trypan-blue) 사세포 제외법으로 숫자를 세었다. 억제 기능 분석을 위하여, 미성숙의 CD4+ T 세포 (A)와 항-CD3 단일클론 항체, 항-CD28 단일클론 항체, IL-2, 덱스 (Dex)와 비타민 D3에 의하여 미성숙 CD4+ T 세포로부터 생성한 Tr1 세포를 L 세포 (B)나 OX40L-L 세포 (C), 이들 세 세포 형식과 그들의 1:1 비율의 혼합체의 존재에서 배양하고 5 ㎍/ml의 항-CD3 단일클론 항체와 1 ㎍/ml의 항-CD28 단일클론 항체의 존재하에서 5일간 배양하면서 재자극한 다음본 발명이 속한 기술분야의 지식을 습득한 자들이 이해하는 것처럼 [3H]티미딘 결합 ([3H]thymidine incorporation)으로 세포 증식을 측정하였다.
항-인간 OX40 특이적인 단일클론 항체의 생성
본 발명자들은 인간 유래 OX40을 인식하는 여러개의 아고니스트 (agonist) 마우스 단일클론 항체를 생산하였다. 항체들의 항원 반응 특이도는 플로우사이토메트리 (flow cytometry) (도 10-12). 항체의 아고니스트 (agonist) 활성은 기능적분석을 통하여 확인하였다. 본 발명자들은 20개의 OX40 특이적 항체들 중의 9개가 비타민 D3/덱사메타손 (dexamethasone) 매개 CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포들의 생성을 방해할 수 있다 (도 13)는 것을 발견하였고, ICOS+CD4+CD25highFOXP3+ Treg IL-10 생산을 억제한다 (도 16)는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 항체의 역가를 구했고, 최소 4 ng/ml의 농도에서 Tr1 세포 생성을 억제하는 잠재적인 활성을 가진 5개를 찾았다 (도 15).
OX40 항체는 CD4+CD25highFOXP3+ Treg 기능을 억제한다.
일부 OX40 단일클론 항체들은 FOXP3+ Treg의 억제적 기능을 방해한다 (도 17). Tr1 세포와CD4+CD25highCD127?OXP3+ Tregs로부터 IL-10 생성을 유력하게 억제하는 5개의 항체 (119-8B, 119-43, 119-122, 119-173B, 106-222) 중에서 3개 (119-43, 119-122, 106-222)가 CD4+CD25highCD127?OXP3+ Treg 기능을 잠재적으로 억제하였다 (도 17). 그러나 11개의 항체중에서 2개 (119-33, 120-140A)는 IL-10 생산에 대한 아무런 활성을 보이지 않지만, CD4+CD25highFOXP3+ Treg의 기능은 억제한다.
항-인간 OX40 단일클론 항체
항-인간 OX40 단일클론 항체의 생성은 예를 들어, 6-8주 된 BALB/c 마우스를 인간 OX40을 유전자 전달 감염한 마우스 세포 라인에 면역접종하고 기 확립한 프로토콜을 따르는 것으로 수행하였다. 특이적으로 표지한 OX40+ 세포들을 염색하는 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 확립하고 이후 추가로 분석하였다.
본 발명자들은 Tr1 세포의 생성및 기능을 저해하여 OX40 시그널링을 야기하는 클론 (즉 아고니스트 (agonist) 항체)들을 탐지하는 철저한 스크리닝법을 디자인하였다. 이들 클론들은 이후로 순화하였다. hOX40에 대한 아고니스트 (agonist) 항체들은 인간화할 수도 있고, 단일로 또는 항암 예방주사와 다른 보조제들과 복합적으로 인간의 항암 치료를 위한 의학적 프로토콜에 사용할 수 있다. 몇가지 다른 종양 타입이 이들 항체의 목표가 될 수 있는데, 여기에는 흑색종, 림프종, 유방암 등을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 6-8주된 BALB/c 암컷 마우스에 피하면역주사를 하거나 풋패드 (footpad)로 사용을 한다. 각 마우스는 500만 마리의 인간 유래-OX40 (L-OX40)으로 유전자 전달 감염한 L 세포들을 3일 간격으로 6회 주사하였다. 여섯번째 주사 3일 후에 마우스들을 죽이고 슬와림프절 (풋패드 면역시)나 비장 (피하 면역주사)을 제거하여 세포들을 SP2.0 골수종세포나 NSO 골수종세포와 1대 1 비율로 융합하여 기 확립된 프로토콜을 이용하여 하이브리도마 클론을 생성한다. 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 클론들은 이후 ELISA 분석을 통하여 L-hOX40 세포에 결합하는 특이성을 가진 세포를 스크리닝한다. L-hOX40 세포만 결합하고 L 세포에는 결합하지 않는 하이브리도마 상층액은 이후 플로우 사이토메트리 분석에 의하여 L-hOX40과 SUPM2-hOX40에의 결합을 확인하였다.
도 10의 실험에서, hOX40 하이브리도마 상층액을 ELISAdp 의하여 L 세포와 비교해서 L-hOX40에 대하여 스크린하였다. 20개의 hOX40에 특이적인 단일클론 항체를 선택하였다. 2천만개의 L 세포나 인간 유래 OX40을 발현하는 L 세포 (L-hOX40)를 PBS에 용해한 0.01% 마그네슘 칼슘 클로라이드와 세포를 섞음으로써 96웰 플레이트에 코팅하고 판상 후드에서 밤새도록 건조하였다. 플레이트는 -20℃에서 최소한 1일 이상 냉각한다. 항체 결합 분석을 위하여, 냉각한 세포를 PBS로 다시 수화하고 PBS에 0.05% 트윈 (Tween) 20을 포함한 세척 완충액으로 세척하고 세척 완충액에 2% BSA으로 블록하였다. 조절한 세포들을 OX40 항체 상등액과 결합하는데 사용하였다. 세포에 결합한 항체는 2차 항체인 항-마우스 IgG FC HRP로 탐지하였다. hOX40 특이적인 하이브리도마 상층액은 OX40을 발현하는 L 세포는 인식하지만 L 세포는 인식하지 못하였다.
도 11의 실험에서, hOX40 특이적인 단일클론 항체를 플로우 사이토메트리 분석을 통하여 스크리닝하였다. 동일한 숫자 (10만)의 L 세포와 L-hOX40을 FACS 완충액 (1% FCS/2mM EDTA/PBS)와 혼합하고 0.5 ㎍의 FPLC (단백질 A 하이트랩/젠틀 (Protein A HiTrap/Gentle) 항원/항체 일루션 (Ag/Ab elution) 완충액)으로 순화한 항체와 배양하였다. 그 후 세포들을 세척하고 2차 항체인 PE-결합시킨 항-마우스 IgG로 염색하였다. 두개의 피크가 항-hOX40 단일클론 항체에 의한 양성 및 음성 염색을 표시한다. 단일 피크는 항체의 결합이 없거나 비특이적 결합을 의미한다. 플로우 사이토메트리 분석을 통하여 20개의 hOX40 특이적인 단일클론 항체를 확인하였다.
도 12의 실험에서,hOX40을 발현하는 SUPM2 세포 SUMP2-hOX40)를 이용하여 hOX40 단일클론 항체의 특이성을 확인하였다. 동일한 숫자 (10만)의 SUPM2와 SUPM2-hOX40 세포들을 FACS 완충액 (1% FCS/2mM EDTA/PBS)에 혼합하고 도 11에 나오는 것처럼 hOX40 단일클론 항체 결합에 이용하였다. 각 항체의 결합특이성을 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 한 개의 피크는 항체의 결합이 없거나 비특이적인 결합을 의미하는 반면, 두 개의 피크는 항-hOX40 단일클론 항체에 의한 양성 및 음성 염색을 표시한다. 20개의 hOX40 특이적인 단일클론 항체를 재확인하였다.
도 13의 실험에서, 비타민 D3 (10 마이크로몰 (micromole) mM)/덱스 (Dex) (50 나노몰 (nanoM)), CD32L/ICOSL, 항-CD3/CD28 (0.2 마이크로그램(microgram)/ml)로 자극한 CD4+ 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 억제할 수 있는 인간 유래 OX40 특이적인 단일클론 항체를 찾아내고자 하였다. 항-hOX40 단일클론 항체를 0일에 세포배양액에 첨가하고, 자극 7일 후에 CD4+ T 세포들을 IL-10 세포내 염색 후 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 대표적인 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 데이터는 A에 나타내었고, 모든 항-hOX40 단일클론 항체 처리후의 Tr1 세포의 백분율을 B에 나타내었다. 본 실험에서 얻어진 세포들을 사용하여, CD4+ T 세포의 증식을 자극하는 항-hOX40 특이적인 단일클론 항체(도 14, 세포들은 자극 7일 후에 거수하였음)와 CD4+로부터 Tr1 생성을 억제하는 항체 (도 13)를 파악하고자 하였다.
CD4+ T 세포로부터 Tr1 세포의 생성을 억제하는 능력을 가진 hOX40 단일클론 항체를 찾아내기 위하여, Tr1 세포들을 도 13 상부에서 기술한 실험처럼 배양하고 생성하였다. 대표적인 FACS 데이터를 A에 표시하였고, 아홉 종류의 항-hOX40 단일클론 항체를 처리한 후 Tr1 세포의 백분율을 B에 표시하였다. 다섯종의 hOX40 특이적인 단일클론 항체가 4ng/ml의 농도에서 Tr1 세포의 생성을 방해하였다 (도 15).
도 16a, 16b, 16c의 실험에서 방금 분류한 ICOS+CD4+CD127-CD25high T 세포를 CD32L/ICOSL 세포와 CD32L/hOX40L 세포 또는 항-hOX40 단일클론 항체 또는 대조군 항체의 존재하에 항-CD3 (0.2 ㎍/ml)로 5일간 자극하였다. 이후, 세포들을 거수하고 5 x 104 개의 세포를 항-CD3/CD28로 24시간 재자극한 다음 상등액을 Elisa 키트를 이용하여 IL10의 분비를 분석하였다. 본 실험으로 CD4+ T 세포로부터 Tr1 생성을 억제하면서 또한 자연적으로 ICOS+CD4+CD25high T 세포로부터 IL-10 생산을 방해하는 hOX40 특이적인 단일클론 항체를 찾아내었다. 신선하게 분류한 ICOS+ ICOS-CD4+CD127-CD25high Tregs를 방사선 조사한 단핵백혈구와 항-CD3 (0.3㎍/ml)과 항-hOX40 단일클론 항체의 존재하에서 CFSE로 표지한 CD4+CD25low 세포들과 배양하였다. 배양 3.5일 후, FACS를 사용하여 세포내의 CFSE의 희석도를 이용하여 세포증식을 평가하였다 (도 16c)
도 17a와 17B는 Tr1 세포의 생성을 방해하고 FOXP3+CD4+CD25high Treg 기능을 막는 항-hOX40 단일클론 항체의 탐지를 보여준다. 신선하게 분류한 FOXP3+CD4+CD127-CD25high T 세포 (3.5 x 104)를 방사선 조사한 단핵백혈구 (7 x 104, 6000 래드 (rad))와 0.3 ㎍/ml 의 항-CD3와 다양한 농도의 항-hOX40 단일클론 항체의 존재하에서 CFSE로 표지한 CD4+CD25low 세포 (7 x 104)와 배양하였다. 배양 3-4일 후, 플로우 사이토메트리 분석을 이용하여 세포내의 CFSE의 희석도를 측정하여 세포 증식을 평가하였다. 분열한 세포의 백분율을 표시하였다. 대표적인 플로우 사이토메트리 분석을 도 17a에 나타내었다. 여섯종류의 단일클론 항체의 데이터를 도 17b에 나타내었다.
도 18의 실험에서, 신선하게 분류한 FOXP3+CD4+CD127-CD25high T 세포(3.5 x 104)를 방사선 조사한 단핵백혈구 (7 x 104, 6000 래드 (rad))와 0.3 ㎍/ml 의 항-CD3와 다양한 농도의 항-hOX40 단일클론 항체의 존재하에서 CFSE로 표지한CD4+CD25low 세포 (7 x 104)와 배양하였다. 배양 3-4일 후, FACS 분석을 이용하여 세포내의 CFSE의 희석도를 측정하여 세포 증식을 평가하였다. 데이터는 2회의 실험을 대표한다. 본 발명자들은 Tr1 생성을 억제하지 않지만 FOXP3+CD4+CD25high Treg 기능을 방해하는 항-hOX40 단일클론 항체를 파악하였다.
도 19a와 19b의 실험에서, 림프종 유래의 CD4+CD25high T 세포를 방사선 조사한 단핵백혈구 (7 x 104, 6000 래드 (rad))와 0.3 ㎍/ml의 항-CD3와 25 ㎍/ml의 항-hOX40 단일클론 항체의 존재하에서 CFSE로 표지한 CD4+CD25low 세포 (7 x 104)와 배양하였다. 배양 3-4일 후, FACS 분석을 이용하여 세포내의 CFSE의 희석도를 측정하여 세포 증식을 평가하였다. 대표적인 FACS 분석을 도 19a에 나타내었고 모든 실험의 데이터를 도 19b에 나타내었다. 본 발명자들은 림프종 유래의 CD4+CD25high Treg의 기능을 방해하는 hOX40 아고니스트 (agonist) 항체를 발견하였다.
도 20은 인간과 붉은털 원숭이의 OX40에 특이적으로 결합하는 OX40 아고니스틱 (agonistic) 항체의 발견을 보인다. 붉은털 원숭이 말초혈 단핵세포를 피콜 (ficoll) 원심분리에 의하여 획득하였다. CD4+ T 세포는 CD4 마이크로비드 (microbead)로 획득하였다. CD4+ T 세포를 10g/ml의 붉은 강낭콩 (phaseolus vulgaris) (PHA) 렉틴 (lectin)으로 자극하였다. 자극 2일 후, 세포들을 항-hOX40 단일클론 항체 후 염소 항-마우스 IgG-APC와 CD69-PE로 염색하였다. 106-317을 음성대조군으로 사용하였다. 여섯종의 T 세포 증식을 강하게 활성화하는 항-hOX40 단일클론 항체가 활성화한 붉은털 원숭이의 CD4+ T 세포에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 이들 여섯종의 항-hOX40 단일클론 항체들의 독성을 원숭이에서 시험할 수 있음을 보인다.
재래식의 융합 프로토콜 (protocol)을 사용하여 획득한 500종의 항-인간 OX40 양성 클론들 중에서 겨우 일곱 종 만이 OX40을 촉발하는 특성을 보여주는데, 이 특성에는 표 1에 표시한 것과 같은 IL-10 생산 Tr1 생성과 nTreg 억제 기능을 방해하는 능력을 포함하나 그에 국한하지는 않는다.
OX40 특이적인 단일클론 항체의 목록
단일클론 항체 클론 IL-10의 방해 nTreg의 방해
1 106-108 - -
2 106-317 - -
3 106-107 - -
4 106-148 - -
5 119-204A - -
6 119-220C - +
7 119-33A - +
8 119-58 - +
9 119-181A - +
10 119-157A - +
11 120-140A - +
12 119-8B + -
13 119-173B + -
14 106-132 + +
15 106-222 + +
16 119-43 + +
17 119-122 + +
18 119-69A + +
19 120-56 + +
20 120-270 + +
106-222와 119-122 하이브리도마 클론을 다음 세 가지 기준에 근거하여 선택하였다.
1. CD4+ T 세포 (유도가능 Treg)로부터 Tr1 세포의 생성을 방해하였다.
2. FOXP3+nTreg 세포의 억제적 기능을 반대로 한다.
3. 이들은 사용량에 의존하는 Tr1 세포의 방해와 FOXP3+Treg 기능의 억제와 반대로 하는 것을 보여준다.
키메라 (chimeric)와 인간화 항체
인간화 (또한 리셰이핑 (reshaping) 또는 CDR-접목법이라고도 함)는 다른 종의 소스 (설치류를 포함하며 이에 국한하지 않음)로부터 얻은 단일클론 항체의 면역원성을 감소시키고 인체 면역체계의 활성화를 향상하기 위하여 설립한 기술이다. 비록 분자생물학적인 기술을 이용하여 조작한 단일클론 항체를 제작하는 방법은 알려져 있으나, 간단한 설치류 상보성결정부위 (CDR)을 인간 프레임워크에 접목하는 것도 항상 원래 단일클론 항체의 결합친화성과 특이성을 재구축하는데 성공하는 것은 아니다.
항체를 인간화하기 위하여, 인간화 항체의 디자인이 기존 분자의 기능을 재현하는데 가장 중요한 단계이다. 이 디자인은 여러가지 선택을 포함한다: CDR의 범위, 사용할 인간 프레임워크와 설치류 단일클론 항체로부터 인간 프레임워크 부분으로 치환할 잔기 (역돌연변이) 등. 이들 역돌연변이의 위치는 주로 염기서열/구조적 분석이나 다양한 부위의 3D 구조의 상보성 모델의 분석을 통하여 파악한다.
최근 들어, 지정한 장소에 있는 아미노산을 다양화하기 위하여 파지 라이브러리 (phage libraries)를 사용하고 있다. 유사하게, 설치류 CDR을 접목하기에 가장 적절한 인간 프레임워크를 선택하기 위한 많은 방법을 사용하였다. 초기의 실험들은 제한된 수의 잘 알려졌지만, 설치류 단일클론 항체의 염기서열과는 무관한 인간 단일클론 항체들 (항상은 아니어도 대개 구조가 알려진)을 사용하였다 (소위 고정 프레임워크 접근법). 일부 그룹은 설치류 가변 영역와 높은 아미노 산 염기 동일성을 가진 가변 영역를 사용하였다 (상동부위 매칭 또는 베스트 핏 (best-fit); 일부는 일치서열이나 생식세포서열을 사용하기도 하고 다른 일부는 몇몇 다른 인간 유래 단일클론 항체로부터 각각 경쇄이나 중쇄의 가변 영역에 있는 프레임워크 염기서열의 절편을 선택하였다. 또한 설치류 잔기의 표면을 인간 유래 단일클론 항체에서 발견할 수 있는 가장 공통적인 잔기로 교체하는 방법으로 인간화에 접근하기도 하였으며 ("표면꾸미기 (resurfacing or veneering)"), 이것은 CDR 범위의 정의를 다르게 사용하였다. 인간화 항체는 아래에 기술한다. 그러나, 서열번호 4와 10, 또는 서열번호 16과 22와 같은 중쇄 변이부와 경쇄 변이부로 구성하는 키메라 항체 또한 본 명세서에서 기술한다.
인간화한 단일클론 항체는 마우스류의 항-OX40항체로부터 유래하였다.
분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 1이나 13의 아미노산 서열로 구성하는 가변 중쇄 CDR1을 가질 수 있다. 분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 2나 14의 아미노산 서열로 구성하는 가변 중쇄 CDR2를 가질 수 있다. 분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 3 또는 15로 구성하는 가변 중쇄 CDR3를 가질 수 있다.
분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 7이나 19의 아미노산 서열로 구성하는 가변 경쇄 CDR1을 가질 수 있다. 분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 8이나 80의 아미노산 서열로 구성하는 가변 경쇄 CDR2를 가질 수 있다. 분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 9 또는 21로 구성하는 가변 경쇄 CDR3를 가질 수 있다.
분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 11이나 23의 아미노산 서열, 또는 서열번호 11 이나 23과 최소한 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성하는 가변 경쇄을 가질 수 있다. 분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 5나 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 5나 17의 아미노산 서열과 최소한 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성하는 가변 중쇄를 가질 수 있다.
분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 12나 24의 염기서열, 또는 서열번호 12나 24의 아미노산 서열과 최소한 90%의 동일성을 갖는 염기 서열에 의하여 암호화 하는 가변 경쇄을 가질 수 있다. 분리한 인간화 항-OX40 항체는 서열번호 6나 18의 염기서열, 또는 서열번호 6나 18의 아미노산 서열과 최소한 90%의 동일성을 갖는 염기 서열에 의하여 암호화 하는 가변 경쇄을 가질 수 있다.
인간화한 항-OX40 항체의 발현
발명의 항체 또는 항체부분은 숙주세포에서 면역글로불린 경쇄와 중쇄 유전자의 재조합적인 발현을 통하여 준비할 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현하기 위하여, 숙주세포는 면역글로불린 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA 절편을 포함하는 하나나 그 이상의 재조합 발현벡터를 유전자전달감염 (transfect)하여서, 경쇄와 중쇄이 숙주 세포에서 발현하고, 더 선호적으로는 숙주세포를 배양하는 배양액으로 분비하여 그 배양액으로부터 항체들을 수집할 수 있다. 기본적인 DNA재조합 방법을 사용하여 항체 중쇄와 경쇄 유전자를 획득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터에 결합한 다음 그 벡터를 샘브룩 (Sambrook), 프릿츠 (Fritsch)와 매니아티스 (Maniatis) (편집 (eds)), 분자 클로닝; 실험실 메뉴얼(Molecular Cloning; A Laboratory Manual), 2판, 뉴욕 콜드스프링 하버 (Cold Spring Harbor, N. Y.), (1989), 오수벨 (Ausubel) , F. M. (편집 (eds.)) 분자생물학의 최근 프로토콜 (Current Protocols in Molecular Biology), 그린 출판사 (Greene Publishing Associates), (1988)과 보스 (Boss) 등의 미국 특허 제4,816,397호에서 기술한 방법으로 숙주세포에 도입한다.
항체와 항체절편 및 그 변형은 다양한 동물세포로부터 생산할 수 있는데, 그중에서도 포유동물 세포를 선호하며, 마우스류나 인간 세포들을 특별히 선호한다. 또한, 재조합 DNA 발현 시스템은 숙주세포를 이용하는 것을 포함하며 발현 컨스트럭트 (constructs)는 특정한 단백질을 높은 수준으로 생산하도록 조작하였다. 이러한 숙주세포와 발현 컨스트럭트는 대장균 (Escherichia coli); 플라즈미드나 바이러스 (박테리오파지 (bacteriophage))로부터 유래한존재하는 발현 컨스트럭트; 에피좀(episomal)으로 존재하거나 또는 염색체에 통합하는 발현 컨스트럭트가 존재하는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisieae) 나 피키아 파스토라스 (Pichia pastoras)와 같은 이스트; Sf9세포와 바쿨로바이러스 (baculovirus)와 같은 곤충세포와 바이러스; 존재하는 에피소멀 (episomal) 또는 염색체에 통합하는 (레트로바이러스를 포함하나 그에 국한하지 않음) 발현벡터 (이러한 방법은 예를 들어 베르마 (Verma)등, 면역학적 방법 저널 (J. Immunol . Methods) 216:165-181, 1988의 원고에서 발견할 수 있다)와 포유동물 세포등을 포함할 수 있다. 항체들은 식물 (이러한 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,046,037호; 마 (Ma) 등, 사이언스 (Science) 268:716-719, 1995에서 찾아볼 수 있음)이나 파지 시현 기술 (phage display technology) (이러한 방법은 예를 들어 윈터 (Winter) 등, 면역학 리뷰 연감 (Annu . Rev . Immunol) 12:433-155, 1994에서 찾아볼 수 있음)에 의하여 생산할 수 있다.
인간 유래 항-OX40 항체는 원하는 수준의 활성과 결합 특이성/친화성을 보여주며 기본적인 재조합 DNA 기술로 추가로 조작할 수 있다. 예를 들면 가변부 유전자들을 전체길이 항체 체인 유전자나Fab 절편 유전자, 또는 scFV 유전자로 전환할 수 있다. 이러한 조작에서 VL- 또는 VH-를 암호화 하는 DNA 절편은 기능적으로 항체 불변부나 유연한 연결체 (flexible linker)와 같은 다른 단백질을 암호화하는 또 다른 DNA 절편과 연결할 수 있다. 본 문맥에서 사용한 것처럼, "기능적으로 연결"은 두 DNA절편을 두개의 DNA 절편을 프레임 내에 유지 (remain in-frame)하면서 아미노산 염기를 암호화하도록 연결하는 것을 의미한다.
또 다른 면에서, VH 지역을 암호화하는 분리한 DNA는 VH를 암호화하는 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2, CH3)를 암호화하는 다른 DNA 분자와 기능적으로 결합하여 전체길이 중쇄 유전자로 전환할 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 염기서열은 본 발명이 속한 기술분양서 알려져 있고 (즉, 카밧 (Kabat) E. A. 등, (1991) 면역학적으로 관심이 있는 단백질들의 염기서열, 제 5판, 미국 보건 및 인적 서비스부, 미국 국립보건원 출간번호 91-3242) , 이들 지역을 포함하는 DNA 절편은 기본적인 PCR 증폭에 의하여 획득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 카밧 (Kabat) (카밧 (Kabat) E. A. 등, (1991) 면역학적으로 관심이 있는 단백질들의 염기서열, 제 5판, 미국 보건 및 인적 서비스부, 미국 국립보건원 출간번호 91-3242)에서 기술한 것처럼 IgG-1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, 또는 IgD 불변 영역와 모든 동종 이인자형 변형의 중쇄일 수 있으나, 가장 선호하는 것은 IgG1이나 IgG4의 불변 영역이다. 중쇄 유전자의 Fab 절편 유전자의 경우, VH를 암호화하고 있는 DNA는 중쇄의 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자와 기능적으로 연결할 수 있다.
또한, 표면 항원과 결합한 인간화 항체는 FcR을 가진 세포들과 상호작용할 수 있다. 이러한 상호작용은 Fc가 유도하는 크로스링크 (cross-linking)으로 인하여 ADCC와/또는 시그널 향상과 같은 효과기 기능을 유도할 수 있다. 상호작용은 치료에 도움이 되거나 해로울 수 있다. 이러한 해로운 부작용은 추위, 열, 저혈압, 어떤 경우에는 호흡곤란을 포함한다 (디스틀렛와이트 JR 2세 (Thistlethwaite JR Jr.), 코시미 (Cosimi) AB, 델모니코 (Delmonico) FL 등).
어떤 해로운 효과는 T 세포의 표면에서 발견할 수 있는 단백질 복합체로부터 유래할 수 있다. T 세포의 활성화에 앞서, 단백질 복합체가 항원 수용체를 통해 생성한 시그널의 형질도입에 관여할 수 있다. 간단히 말하면, T 세포의 활성화는 항원 수용체의 향상된 크로스링크를 포함하는 사건들의 연쇄작용을 시작한다. 수용체의 크로스링크는 종양괴사펙터 알파 (tumor necrosis factor alpha)(TNF-α, 인터루킨-2 (Interleukin-2) (IL-2)와 인터페론 감마 (Interferon gamma)(IFN-γ와 같은 몇몇 사이토카인 (cytokine)의 유도를 이끌어내는 분열촉진 시그널을 강화하는데 기여할 수 있다. 이러한 사이토카인들은 대량으로 생성할 경우 유독하다.
일례로, 항-CD3 단일클론 항체는 현재 T 세포가 인슐린을 생산하는 이자섬을 공격하는 1형 당뇨를 포함하는 자가면역 질환의 치료에 사용하고 있다 (카우프만 (Kaufman) A와 헤롤드 (Herold) K. 1형 당뇨의 치료를 위한 항-CD3 단일클론 항체 당뇨대사연구리뷰 (Diabetes Metab Res Rev)2009; 25:302-306). 항-CD3 항체들은 T 세포에 의한 표적의 용해를 억제하고 항원 수용체 CD3의 크로스링크를 향상시킨다. 추가하여, 잠재적인 분열촉진 활성과 함께, 항-CD3 항체는 사이토카인 (cytokine), 특히종양괴사펙터 알파 (tumor necrosis factor alpha)(TNF-α, 인터루킨-2 (Interleukin-2) (IL-2)와 인터페론 감마 (Interferon gamma)(IFN-γ의 잠재적인 유도자이다. 약물에 대한 반응으로 T 세포로부터 사이토카인 특히 TNF-α의 대량 방출 (샤테뉘드 (Chatenoud) L.)은 독성효과를 발생한다. 이러한 바람직하지 않은 부작용은 CD3 분자를 포함하는 T 세포와 항체의 Fc 부분과 결합하는 FcR을 포함하는 세포의 크로스링크에 기여한다. 크로스링크는 T 세포와 FcR을 포함하는 세포를 활성화시켜 이전에 언급한것처럼 사이토카인의 대량 분비를 유도한다.
마찬가지로, 잠재적으로 바람직하지 않은 부작용이 항-OX40 항체를 사용한 결과로 나타날 수 있다. 일례로, OX40을 발현하는 T 세포에 결합하는 항-OX40 항체는 FcR을 포함하는 세포에도 결합하여 항체를 처방받은 환자에게 유익하거나 해가 될 수 있는 사이토카인의 생산을 유발할 수 있다. 이러한 잠재적인 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 독성효과를 피하고 바람직할 수 있는 FcR 부위에 돌연변이를 제공하는 항-OX40 항체의 FcR부위를 돌연변이하는 방법을 디자인하여 본 명세서에 나타낸다.
FcR (CD16, CD32, CD64)와 상호작용하는 인간 IgG1의 위치가 알려져 있다. 이 위치는 CH2 도메인 상부에 존재한다. 가장 중요한 아미노산은 234와 235위치에 존재하는 류신이다. 이 두 잔기를 두개의 알라닌 잔기로 돌연변이시켜서 IgG1의 모든 FcR에 대한 상호작용을 무효화하였다. 이러한 돌연변이를 일으킨 인간화한 항-CD3 (HuOKT3AA)은 더 많이 안전한 약품이고, HuOKT3의 그것과는 다른 활동 기작을 갖는다. 본 명세서에 전체가 참고자료에 의하여 통합된 미국 특허 제6,491,916호을 참조하라.
AA 돌연변이의 위치는 다음과 같다:
234 235
---A---P---E---L---L---G---G---P--- 와일드타입(Wild type) IgG1 CH2 상부
---A---P---E---A---A---G---G---P--- AA 돌연변이 IgG1 CH2 상부
본 명세서에서 기술한 Hu222AA와 Hu122AA은 이들 돌연변이를 포함할 수 있다. 만일 분석시스템이 FcR을 포함하는 세포들을 포함할 경우, 와일드 타입과 AA 돌연변이간에 차이를 관찰할 수 있다. 그렇지 않다면, 두 항체는 동일하게 행동해야 한다.
VL 지역을 암호화하는 분리한 DNA는 VL을 암호화하는 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 다른 DNA와 기능적으로 연결하여 전체길이 경쇄 유전자 (Fab 경쇄 유전자이기도 한)로 전환할 수 있다. 인간 유래 경쇄 불변 영역의 염기서열은 본 명세서가 속하는 기술분야에서 알려져 있고 (카밧 (Kabat) E. A. 등, (1991) 면역학적으로 관심이 있는 단백질들의 염기서열, 제 5판, 미국 보건 및 인적 서비스부, 미국 국립보건원 출간번호 91-3242을 참조하라), 이들 부위를 포함하는 DNA 절편들은 기본적인 PCR 증폭으로 획득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파나 람다 불변 영역일 수 있다.
ScFV 유전자를 만들기 위하여, VH와 VL을 암호화하는 DNA 절편을 유연한 링커 (flexible linker) 즉, 아미노산 서열(Gly.sub.4-Ser).sub.3를 암호화하는 또 다른 절편과 기능적으로 연결하여 VL과 VH 부위를 유연한 링커로 연결함으로써VH와 VL 서열이 연속적인 단일체인 단백질로 발현할 수 있도록 한다 (버드 (Bird)등 (1988) 사이언스 (Science) 242:423-426; 휴스턴 (Huston) 등 (1988) 미국 과학아카데미 연감 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 85:5879-5883; 매카퍼티 (McCafferty) 등, 네이쳐 (Nature) (1990) 348:552-554를 참조하시오).
본 명세서에서 기술한 항체들의 아미노산 서열 변형은 심사숙고한 것이다. 일례로, 항체의 결합친화도와/또는 다른 생물학적 특성을 바람직하게 개선할 수도 있다. 항체의 아미노산 서열 변형은 항체 핵산에 적절한 뉴클리오티드 (nucleotide)의 변화를 집어넣거나 펩티드 합성을 통하여 준비하였다. 이러한 변성은 일례로 항체의 아미노산 서열내의 잔기의 삭제와/또는 삽입과/또는 교체를 포함한다. 삭제, 삽입, 치환의 어떠한 조합으로 원하는 특성을 보유하는 최종 컨스트럭트를 만들어 낸다. 아미노산 변조는 서열이 만들어진 시점에 목표 항체 아미노산 서열에 들어갈 수 있다.
항체의 선호하는 장소에 돌연변이를 발생시키기 위하여 특정 잔기나 부분을 파악하는데 유용한 방법은 커닝햄 (Cunningham)과 웰스 (Wells) (1989) 사이언스 (Science), 244:1081-1085에서 기술한 "알라닌(alanine) 스캐닝 (scanning) 돌연변이발생"이다. 여기에서, 목표로 하는 잔기나 잔기의 군집을 파악 (즉 알지닌, 아스파라진, 히스티딘, 라이신, 글루타민과 같은 대전한 잔기)하고 중성 또는 음성으로 대전한 아미노산 (가장 알맞은 것은 알라닌 (alanine)이나 폴리알라닌 (polyalanine))으로 교체하여 항원과 아미노산의 상호작요에 영향을 준다. 이러한 치환에 기능적인 민감성을 나타내는 아미노산의 위치를 치환한 장소에 추가로 또는 다른 변종을 집어넣어서 더 세밀하게 다듬는다. 그러므로 아미노산 서열 변종을 만들기 위한 장소는 미리 결정하지만, 돌연변이의 성질은 본질적으로 미리결정할 필요는 없다. 일례로, 어떤 주어진 장소에 대한 돌연변이의 효과를 분석하기 위하여 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 생성을 목표 코돈이나 부위에 수행하고, 발현한 면역글로불린을 원하는 활성이 있는지 스크리닝 한다.
아미노산 서열 삽입은 아미노말단 및/또는 카르복시말단의 한개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴립펩타이드의 합체와 하나 또는 여러개의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 (methionyl) 잔기나 세포독성 폴리펩티드에 결합한 항체를 포함한다. 항체 분자의 또 다른 삽입 변종은 항체의 N-이나 C-말단에 효소나 (예, ADEPT) 항체의 혈청내 반감기를 증가시키는 폴리펩티드를 결합하는 것을 포함한다. 항체의 또 다른 형식의 아미노산 변종은 항체의 본래의 글라이코실레이션 (glycosylation) 패턴을 변화시킨다. 이러한 변형은 하나 또는 그 이상의 항체에서 발견할 수 있는 탄수화물 부분을 제거하는 것과/또는 하나나 그 이상의 항체에 존재하지 않는 글라이코실레이션 위치를 추가하는 것을 포함한다.
또 다른 형식의 변종은 아미노산 치환 변종이다. 이러한 변종은 항체분자에서 최소한 하나의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 치환한다. 치환성 돌연변이를 위한 가장 중요한 부위는 고도가변영역을 포함하나 FR 변형도 또한 고려한다. 보존적인 치환이 본 명세서에 참고자료로 "선호하는 치환"의 제목하에 통합한 미국 특허 제7,812,133호, col. 43, ls. 55에서 Col. 44 1. 49의 표 1에 나타난다. 만약 이러한 치환이 생물학적 활성에서의 변화를 가져온다면, 표 1에서 "치환의 예" 라고 명명한, 또는 추가로 아미노산 클래스에 대한 참고자료를 아래에 설명한 것처럼, 더 많은 실질적인 변화가 도입되고 산물을 스크리닝 할 수도 있다.
게다가, 항체의 생물학적인 특성에 대한 실질적인 변형은(a) 치환 부위의 일례로 종이나 헬리컬 구조와 같은 폴리펩타이드 등뼈의 구조, (b) 목표부위에 있는 분자의 전위나 소수성, 또는 (c) 곁사슬의 부피를 유지하려는 그들의 노력을 유의미하게 변화시키는 치환을 선택함으로써 달성할 수 있다. 자연적으로 존재하는 잔기는 공통된 곁사슬의 특성에 따라 다음의 그룹으로 구분할 수 있다: (1) 소수성 : 노류신 (norleucine), 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신; (2) 중성 친수성: 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라진, 글루타민; (3) 산성: 아스파르트산, 글루탐산; (4) 염기성: 히스티딘, 라이신, 알기닌; (5) 체인 방향에 영향을 주는 잔기: 글라이신, 프롤린; (6) 방향족: 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌. 비보존적인 치환은 이들 중의 한 멤버에서 다른 클래스의 멤버로의 교환하게 될 것이다.
본 명세서에서 기술한 항체나 항체부분을 발현하기 위하여, 부분적 또는 전체길이의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA들을 상기한 것처럼 획득하여 유전자들이 전사와 번역을 조절하는 염기서열과 기능적으로 연결하도록 발현벡터에 삽입한다. 이 문맥에서, 용어 "기능적으로 연결"은 항체 유전자가 벡터 내의 전사와 발현을 조절하는 염기서열이 항체 유전자의 전사와 번역을 조절하는 의도한 기능을 수행할 수 있도록 결찰함을 의미한다. 발현벡터와 발현 조절 염기서열은 발현시키기 위하여 사용하는 숙주 세포와 호환할 수 있도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 서로 다른 벡터에 삽입하거나 더 전형적으로는 두 유전자를 같은 발현벡터에 삽입할 수 있다. 항체 유전자는 기본적인 방법 (즉, 항체 유전자 절편과 벡터의 상보적인 제한효소 위치의 결찰, 또는 제한효소 위치가 없을 경우 둔단연결)으로 발현 벡터에 삽입한다.
도 23은 Hu106-222 Ig1/카파 항체를 위한 발현벡터의 그러한 개요적인 구조를 보여준다. 제일 위의 살I (SalI) 사이트로부터 시계방향으로 진행하면서, 플라즈미드는 항체 중쇄 유전자의 전사 시작을 촉진하기 위한 인간 거대세포 바이러스 (cytomegalovirus) (CMV) 주 극초기 프로모터 (promoter)로 시작하는 중쇄 전사유닛을 포함한다. CMV 프로모터의 뒤에는 불변 영역 CH1, 힌지, CH2, CH3 엑손 (exon)과 내부 인트론을 포함하는 인간 유래 감마-1 중쇄를 포함하는 VH 엑손 (exon)과 CH3 엑손 (exon)의 뒤에는 폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 사이트가 위치한다. 중쇄 유전자 염기서열의 뒤에는, CMV 프로모터로 시작하는 경쇄 전사 유닛이 시작하고, 그 뒤에는 VL 엑손과 인간 유래 카파 체인 불변 영역 엑손 (CL)과 그에 따르는 인트론 부분을 포함하는 게놈 염기서열이 존재하며, CL 엑손의 뒤에는 폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 사이트가 존재한다. 경쇄 유전자의 뒤에는 SV40 초기 프로모터 (SV40 프로모터), 대장균 잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (xanthine guanine phosphoribosyl transferase) 유전자 (gpt), SV40 폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 사이트 (SV40 폴리(A) 사이트)를 포함하는 절편이 존재한다. 마지막으로, 플라즈미드는 플라즈미드 pUC19의 부분을 포함하는데, 이 부분은 세균 복제 시작점 (pUC ori)와 베타-락타메이즈 (beta-lactamase) 유전자 (베타 락타메이즈 (beta lactamase))를 포함한다. 제한효소 사이트들의 상대적인 위치를 그림에 표시하였다.
재조합 발현벡터는 숙주세포로부터 항체 체인의 분비를 촉진시키는 신호펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 체인 유전자는 신호펩타이드가 항체 체인 유전자의 아미노 말단에 프레임이 맞도록 연결한 벡터에 클로닝할 수 있다. 신호펩타이드는 면역글로불린 신호펩타이드이거나 이종성의 신호펩타이드 (즉 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호펩타이드)일 수 있다.
위에서 언급한 것처럼, 항체 체인 유전자에 부가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 항체의 발현을 조절하는 조절 염기서열을 가지고 있다. "조절 염기서열"이란 항체 체인 유전자의 전사나 번역을 조절하는 프로모터 (promoter), 인헨서 (enhancer) 및 다른 발현 조절 요소 (즉, 폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 신호)를 포함한다는 의미이다. 이러한 조절 염기서열은 일례로 괴델 (Goeddel); 유전자 발현 기술 (Gene Expression Technology): 효소학의 방법들 (Methods in Enzymology) 185, 아카데미 출판 (Academic Press), 샌디에고, 캘리포니아 (1990)에서 기술하고 있다. 조절 염기서열의 선택을 포함한 발현벡터의 디자인은 형질전환할 숙주세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 정도등의 요소에 달려있을 수 있다는 것이 중요하다. 표유동물 숙주세포 발현을 위한 선호하는 조절 염기서열은 거대세포바이러스 (CMV)로부터 유래한 프로모터 (promoter)와/또는 인헨서 (enhancer) (CMV 프로코터/인헨서와 같은), 원숭이바이러스 40 (Simian Virus 40) (SV40 프로모터/인헨서), 아데노바이러스 (즉, 아데노바이러스 주 후기 프로모터 (AdMLP))와 폴리오마 바이러스 (polyoma)와 같은 포유동물 세포에서 단백질의 높은 수준의 발혈은 지시하는 바이러스성 요소를 포함한다. 바이러스성 조절 요소의 더 자세한 기술과 그의 염기서열은 스틴스키 (Stinski)의 미국 특허 제5,168,062호, 벨 (Bell) 등의 미국특허 제4,510,245호, 셰프너 (Schaffner) 등의 미국특허 제4,968,615호, 뷰자드 (Bujard) 등의 미국특허 제5,464,758호, 뷰자드 (Bujard) 등의 미국특허 제5,654,168호를 참조하라.
항체 체인 유전자와 조절 염기서열에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 벡터의 복제를 조절하는 유전자 (즉, 복제의 기원)와 선택적인 마커 유전자의 염기서열과 같은 추가적인 염기서열을 가지고 있을 수 있다. 선택적인 마커 유전자는 벡터가 들어간 숙주세포의 선택을 촉진한다 (악셀 (Axel)등의 미국특허 제4,399,216호, 제4,634,665호, 제5,179,017호를 참조하라). 일례로, 전형적인 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 들어간 숙주세포에 G418, 하이그로마이신 (hygromycin)이나 메토트렉세이트 (methotrexate)와 같은 약물에 내성을 부여한다. 선호하는 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 (dihydrofolate) 환원효소 (DHFR) 유전자 (dhfr.sup.-숙주세포의 메토트렉세이트 (methotrexate) 선택/증폭에 사용)과 네오 (neo) 유전자 (G418 선택)를 포함한다.
경쇄와 중쇄의 발현을 위하여, 경쇄와 중쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 기본적인 기술을 사용하여 숙주세포에 유전자 전달 감염시킨다. 다양한 형태의 "유전자 전달 감염"은 종외의 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주세포에 집어넣기 위하여 일반적으로 사용하는 폭넓은 기술, 즉 전기충격 (electroporation), 칼슘포스페이트 (calcium-phosphate) 침전법, DEAE-덱스트란 (dextran) 유전자전달감염법 등을 포함하는 의미이다. 이론적으로 본 발명의 항체를 원핵이나 진핵 숙주세포에서 발현시키는 것이 가능하긴 하지만, 진핵세포, 가장 선호하기로는 포유동물 숙주세포에서 하에의 발현이 가장 선호하는 방법이다. 그 이유는 이러한 진핵세포들, 그중에서도 포유동물세포,이 원핵세포들보다 적절하게 뭉쳐지고 면역학적으로 활성이 있는 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 크기 때문이다. 본 명세서에서 기술한 재조합 항체를 발현할 포유동물 숙주세포는 중국햄스터난소세포 (CHO세포) (울랍 (Urlaub)과 카신 (Chasin), (1980) 미국 국립 과학학회 연감 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 77:4216-4220) 에서 기술한 dhfr-CHO 세포를 R. J. 카우프만 (Kaufman)과 P. A. 샤프 (Sharp)(1982) 분자 생물학 (Mol. Biol.) 159:601-621에서 기술한 것처럼 DHFR 선택가능한 마커를 사용함), NS0 골수종세포, COS 세포, SP2세포를 포함한다. 항체유전자를 암호화하는 재조합 발현벡터가 포유동물 숙주세포에 들어가면, 숙주세포에서 항체의 발현이 가능할 만큼 충분히 오랫동안 숙주세포를 배양하여 항체를 만들거나 숙주세포가 자라는 배양액으로 항체를 분비한다. 항체는 기본적인 단백질 순화 방법을 사용하여 배양액에서 회수할 수 있다.
숙주세포들을 Fab 절편이나 scFV 분자와 같은 완전한 항체의 일부를 생산하는데 사용할 수도 있다. 상기한 방법의 변형이 본 발명의 범위 내에 있음을 이해하여야 한다. 일례로, 본 발명의 항체의 경쇄이나 중쇄 중의 하나 (그러나 두 체인 모두는 아님)를 암호화하는 DNA를 숙주세포에 유전자 전달 감염시키는 것이 바람직할 수도 있다. 재조합 DNA기술은 또한 OX40과 결합하는데 필요하지 않은 경쇄이나 중쇄 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부나 전부를 제거하는데 사용할 수도 있다. 이러한 불완전한 DNA 분자로부터 발현한 분자들 또한 본 발명의 항체에 포함할 수 있다. 추가하여, 기본적인 화학적 크로스링크 방법에 의하여 본 발명의 항체를 다른 항체에 크로스링크함으로써본 발명의 항체의 중쇄와 경쇄 한쪽씩과 OX40이 아닌 다른 항원에 특이적인 항체의 중쇄와 경쇄로 만드는 이작용기성 항체를 생산할 수 있다.
제약 구성과 제약 투여
본 발명의 항체와 항체부분은 대상물에 투여하기에 합당하도록 제약 구성에 포함할 수 있다. 일반적으로, 제약 구성은 본 발명의 항체나 항체부분과 제약적으로 적합한 운반체로 구성한다. 본 명세서에서 사용한 "제약적으로 적합한 운반체"는 모든 용매, 분산 미디어 (dispersion media), 코팅, 항균 및 항진균물질, 등장성 및 흡수성 지연물, 및 생리학적으로 호환성이 있는 모든 물질을 포함한다. 제약적으로 적합한 운반체의 예로는 물, 식염수, 인산완충식염수 (phosphate buffered saline), 덱스트로스 (dextrose), 글리세롤 (glycerol), 에탄올 (ethanol) 중의 하나나 그 이상, 또한 이들의 조합물을 포함한다. 많은 경우 성분 중에 설탕, 만니톨 (mannitol)과 같은 폴리알콜 (polyalcohols), 솔비톨 (sorbitol), 또는 소금이 들어있는 등장성 물질을 포함하는 것을 선호한다. 제약적으로 적합한 운반체는 추가로 습윤제 또는 유화제, 방부제나 완충액과 같은 보관기간을 향상하거나 항체나 항체부분의 효능을 향상시키는 소량의 부가적인 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 항체와 항체부분은 비경구적인 투약 (정맥투여, 피하투여, 복강내 투여, 근육내 투여)에 적합한 제약구성에 적용할 수 있다. 이러한 발명의 구성은 다양한 형태를 가질 수 있다. 일례로 액상 용액 (주사가능하고 주입가능한 용액), 분산이나 현택액, 타블렛, 알약, 가루약, 리포좀 (liposome)과 좌약상태와 같은 액상, 반고체상과 고체상 형태를 포함한다. 선호하는 형태는 의도하는 투약방법과 치료적인 적용방법에 따라 달라진다. 대표적인 구성이 인간에 대한 다른 항체의 수동적인 면역에 사용하는 것과 비슷한 구성의 주사가능한 형태나 주입가능한 용액의 형태이다. 항체는 정맥주사용 주입이나 주사 또는 근육하 도는 피하 주사에 의하여 투약할 수 있다.
투약의 방법 및/또는 방식은 매우 원하는 결과에 따라 다양할 수 있다. 어떤 실시예에서, 활성 화합물은 이식, 경피성 패치, 미세피막 전달 방식을 포함하는 방출조절방식과 같이 화합물이 급속하게 방출되는 것으로부터 보호하는 운반체와 함께 마련할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트 (ethylene vinyl acetate), 폴리안하이드라이드 (polyanhydrides), 폴리글라이콜릭 산 (polyglycolic acid), 콜라겐 (collagen), 폴리오르쏘에스터 (polyorthoesters), 폴리락틱산 (polylactic acid)와 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 이러한 처방전을 준비하는 많은 방법이 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 인간들에 의하여 특허를 얻었거나 잘 알려져 있다. 이에 관해서는 지속성 조잘 방출 약물전달 시스템 (Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems), J. R. 로빈슨 (Robinson) 편집, 마르셀 데커사 (Marcel Dekker, Inc), 뉴욕, 1978을 참조하라.
보충적인 활성 화합물을 구성에 추가할 수 있다. 어떤 실시예에서 본 발명의 항체나 항체부분을 하나나 그 이상의 OX40의 불활성화가 손해가 되는 질병을 치료하는데 도움이 되는 추가적인 약제와 함께 처방하고/또는 함께 투약할 수 있다. 일례로, 본 발명의 항-OX40 항체 또는 항체부분을 하나나 그 이상의 다른 목표물과 결합하는 추가적인 항체 (즉 다른 사이토카인이나 세포표면분자와 결합하는 항체)와 함께 처방하고/또는 함께 투약할 수도 있다. 게다가, 본 발명의 하나나 그 이상의 항체를 둘이나 그 이상의 전술한 치료용 물질과 혼용할 수 있다. 이러한 혼용요법은 투약하는 치료용 물질의 더 적은 용량을 유리하게 활용할 수 있다. 숙련된 개업의에게 본 발명의 항체가 복합요법의 일부로써 사용될 때항체 단독으로 사용하는 것보다 더 적은양의 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다 (즉 혼합요법의 사용을 통하여 원하는 치료효과를 얻기 위해 항체를 더 적은 양을 사용하게 하면서 치료의 상승효과를 성취할 수도 있다)는 것이 알려질 수 있다.
본 명세서에서 기술한 항체나 그의 항원결합부위는 이러한 질병을 치료하는데 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 항체나 그의 항원결합부위는 단독으로 또는 추가적인 물질, 즉 치료적 물질과 혼합으로 사용할 수 있으며, 추가적인 물질은 그 필요로하는 목적에 따라 숙련된 기술자에 의하여 선택될 수 있다는 것을 이해하여야만 한다. 일례로, 추가적인 물질은 치료적인 물질로 본 명세서에서 사용한 항체에 의하여 치료하는 질병이나 조건을 치료하는데 유용한 것이 알려져있을 수 있다. 추가적인 물질은 또한 치료적인 혼합물에 이익을 주는 물질, 즉 구성의 점도에 영향을 주는 물질일 수 있다.
본 명세서에서 기술한 제약 구성은 "치료적으로 유효한 양" 또는 "예방적으로 유효한 양"의 본 발명의 항체나 항체부분을 포함할 수 있다. "치료적으로 유효한 양"은 사용량과 필요한 시간의 기간동안 원하는 치료적 결과를 달성할 수 있는 유효양을 뜻한다. 항체나 항체부분의 치료적으로 유효한 양은 질환상태, 나이, 성별과 개인의 체중과 같은 요소에 따라 차이가 있을 수 있다; 개인에서 원하는 반응을 유도하는 항체나 항체부분의 능력에 따라 차이가 있을 수도 있다. 치료적으로 유효한 양은 또한 항체나 항체부분의 독성효과나 유해한 효과보다 치료적으로 이득이 되는 효과가 더 큰 양을 말한다. "예방적으로 유효한 양"은 사용량과 필요로 하는 시간동안 원하는 예방 결과를 얻기에 효과적인 양을 뜻한다.
복용요법은 최적의 희망하는 반응 (즉, 치유적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조절할 수 있다. 일례로, 한개의 알약을 처방할 수도 있고, 여러번으로 분할한 용량을 지속적으로 투약할 수도 있으며, 치료적인 상황의 긴급성에 따라 용량을 비율적으로 감소시키거나 증가시킬 수도 있다. 복용의 편의성이나 용량의 통일을 위해 복용 단위 형태를 비경구적인 구성으로 체형화할 수 있다는 점이 큰 장점이다. 본 명세서에서 사용한 복용 단위 형태는 포유동물인 목적물을 치료하기 위한 단위의 용량을 물리적으로 분리한 유닛을 말한다; 각각의 유닛은 필요로 하는 제약적인 운반체와 함께 기대하는 치료효과를 얻도록 계산한 활성 화합물의 미리 결정한 양을 포함한다.
본 발명의 상기에 언급한 특징, 기능 측면과 장점 뿐 아니라 다른 것들도 명백하고 상세하게 이해할 수 있도록, 상기 간단히 요약한 본 발명을 더 자세한 설명하기 위하여 본 발명의 일부를 구성하는 도면으로 도시하는 내용을 참조로 한다. 그러나, 본 발명을 다른 동일하게 효과적인 실시예들에서 인정할 수 있듯이, 첨부한 도면은 본 발명의 일부 실시예를 도시하는 것으로, 따라서 발명의 범위를 제한하고 있지 않다는 것을 명시한다.
도 1은 FOXP3+ Tregs가 인체의 소포림프종(FL) 조직에 침범하여 종양 B세포와 단핵세포와 공존하는 것을 보인다. 좌: FOXP3+ Tregs(적색)와 CD20+ B 림프종 세포 (녹색)의 이중 면역염색; 우: FOXP3+ Tregs (적색)과 CD11c+ 단핵세포/대식세포/DC (녹색)의 이중 면역염색
도 2a와 2b는 FL 환자에서 CD4+FOXP3+ Tregs 숫자가 증가하는 것을 보여준다. 종양세포와 PBMC는 치료전 FL로 초기진단 받은 여섯명의 환자에게서 획득하였다. PBMC는 비교를 위해서 여섯명의 일반 공여자로부터도 획득하였다. 전체 CD4+ T 세포에 대한 조절 T 세포의 백분율은 CD4+CD35+CD127lowFOXP3+ Tregs 의 플로우 사이토메트릭 분석방법 (flow cytometric analysis) 에 의해 결정하였다. 도 2a는 Tregs의 대표적인 FACS 분석을 보여준다. FL PBMC와 FL 종양세포는 동일 환자로부터 분리하였다. 도 2b는 모든 공여자들의 Tregs 백분율을 보여준다. 수직바는 평균을 나타낸다.
도 3은 FL로부터 ICOS+FOXP3+또는 ICOS-FOXP3+ Tregs의 분리를 보여준다. 단일 세포 현탁액은 어떠한 처치를 하기 전의 비장 표본으로부터 획득하였다. 세포들은 분석일 당일에 녹였다. 농축한 CD4+CD8-D14-D16-D56-D11c-TCRγδ- T 세포들은 CD25low와 CD25high 부분집합으로 분류하였다. CD4+CD25highFOXP3+ Tregs는 이후 ICOS의 표면 발현도에 근거하여 ICOShigh와 ICOSlow 부분집합으로 더 분류하였다. FOXP3의 세포 내적 발현은 모든 부분집합에서 결정하였다.
도 4는 종양 내 Tregs가 FL에서 침범한 CD4+CD25- T 세포들의 증식을 저해하고, 이 저해가 항 IL-10 중성화 항체에 의하여 부분적으로 방지할 수 있음을 보여준다. CFSE로 표지한 종양에 침투한 CD4+CD25- T 세포들은 동종 autologous ICOS+FOXP3+ Tregs나 ICOS-FOXP3+ Tregs, 또는 anti-IL-10 (10 ㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 재조합 CD40L에 의하여 선활성화 한 동종 종양 세포들과 배양하였다. 배양 72시간 후CD4+CD25- 세포들의 증식을 CFSE 희석도의 플로우 사이토메트릭 분석방법으로 결정하였다.
도 5a는 본 발명의 방법의 실시예에 따른 플로우 사이토메트리에 의해 결정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포 내적 분석을 보여준다.
도 5b는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 ELISA로 결정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산을 보여준다.
도 5c는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 [3H]티미딘 결합도에 의해 결정한 IL-10을 생산하는 Tr1 세포의 억제기능을 보여준다.
도 6a는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 플로우 사이토메트리로 결정한 메모리 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포 내적 분석을 보여준다.
도 6b는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 ELISA로 결정한 메모리 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 보여준다.
도 7a는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 플로우 사이토메트리로 결정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포 내적 분석을 보여준다.
도 7b는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 ELISA에 의해 결정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 보여준다.
도 7c는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 측정한 활력있는 T 세포의 수를 보여준다.
도 8a는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 플로우 사이토메트리로 결정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포내 분석을 보여준다.
도 8b은 본 발명의 방법의 실시예에 따라 ELISA로 결정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 보여준다.
도 8c는 본발명의 방법의 실시예에 따라 플로우 사이토메트리로 결정한 메모리 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포내 분석을 보여준다.
도 8d는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 ELISA로 측정한 메모리 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 보여준다.
도 8e는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 플로우 사이토메트리로 결정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 세포내 분석을 보여준다.
도 8f는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 ELISA로 측정한 미성숙 CD4+ T 세포에 의한 IL-10 생산을 보여준다.
도 9는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 ELISA로 측정한 조절 T 세포에 의한 IL-10 생산을 보여준다.
도 10은 ELISA에 의해 측정한 L-OX40 및 L 부모 세포에서의 항 인간 유래 OX40 하이브리도마 (hybridoma) 상층액의 스크리닝 결과를 보여준다.
도 11은 본 발명의 방법의 실시예에 따라 플로우 사이토메트리 분석에 의해 결정한 인간 유래 OX40 특이적인 단일클론 항체의 스크리닝을 보여준다.
도 12는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 OX40을 발현하는 SUPM2 세포 (SUPM2-OX40)을 사용하여 항 hOX40 단일클론 항체의 특이성을 확인하는 것을 보여준다.
도 13은 본 발명의 방법의 실시예에 따라 비타민 D3 (0.1 ?)/Dex (50 nm), CD32L/ICOSL 과 항 CD3/CD28 (0.2 ㎍/ml)로 자극한 CD4+ T 세포로 부터 IL-10을 생산하는 세포들 (Tr1)의 생성을 억제할 수 있는 OX40 특이적인 단일클론 항체를 보여준다.
도 14는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 Tr1 세포 생성을 억제하는 hOX40 특이적인 단일클론 항체가 CD4+ T 세포 증식 또한 자극한다는 결과를 보여준다.
도 15a, 15b, 15c는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 CD4+ T 세포로 부터 Tr1 세포의 생성을 억제하는 능력을 위해 OX40 단일클론 항체의 적정을 상술한다. 대표하는 FACS 데이터를 도 15a에 보이고 있고, OX40 단일클론 항체를 처리한 다음 Tr1 세포의 백분율을 도 15b에 보여주고 있다.
도 16a, 16b, 16c는 CD4+ T 세포로부터 IL-10을 생산하는 Tr1 세포를 생성하는 것을 억제하는 OX40 특이적인 단일클론 항체가 ICOS+CD4+CD25highCD127- Treg IL-10 생산과 면역억제기능 또한 억제한다는 것을 보여준다. 막 분류한 ICOS+CD4+CD25highCD127- Treg IL-10 (ICOS+Tregs)를 CD32L/ICOSL 세포와 CD32L/OX40L 세포 (도 16a) 또는 OX40 단일클론 항체나 대조군 항체 (도 16b)의 존재하에 항 CD3 (0.2 ㎍/ml)로 5일간 자극하였다. 세포들은 이후 24시간동안 항 CD3/CD28로 재자극하고 상등액을 효소결합 면역흡수 분석법 (ELISA)로 IL-10을 분석하였다. 도 16c는 항체들 중 둘이 ICOS+Treg 기능을 방해하는 것을 보여주는 단핵세포 기반의 증식 분석이다.
도 17a와 17b는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 Tr1 세포의 생성을 억제하고FOXP3+CD4+CD25high Treg의 기능을 저해하는 항 hOX40 단일클론 항체를 찾아내는 것을 보여준다. 대표적인 플로우 사이토메트리 분석을 도 17a에 보이고, 여섯종의 단일클론 항체의 데이터를 도 17b에 보이고 있다.
도 18은 본 발명의 방법의 실시예에 따라 Tr1 생성은 억제하지 않으나FOXP3+CD4+CD25high Treg 기능을 억제하는 항 hOX40 단일클론 항체를 찾아내는 것을 보여준다.
도 19a와 19b는 본 발명의 방법의 실시예에 따라 림프종에서 유래한 CD4+CD25high Treg의 기능을 저해하는 항 hOX40 길항항체를 보여준다. 대표적인 FACS 분석을 도 19a에 보여주고, 모든 실험에 대한 데이터를 도 19b에 보여준다.
도 20은 붉은털원숭이 CD4+ T에 결합하는 항 hOX40 단일클론 항체를 보여준다. 그림에서 보여지듯이, 항 OX40 단일클론 항체들 중에서 여섯종이 붉은털원숭이의 활성화 CD4+ T 세포와 결합을 할 수 있고, 붉은털원숭이 OX40과 결합할 것이며 OX40 시그널링을 활성화할 것이다.
도 21은 실시예 1의 Hu106-222 로트 I과 II 항체는 각각 분자량 50kDa 정도의 중쇄와 분자량 약 25kDa의 경쇄로 구성하고 있음을 보여준다. Hu106-222 로트 I과 II의 순도는 95%이상으로 보인다.
도 22는 L/OX40 세포와 결합하는 마우스 106-222, Ch106과 Hu106-222 (로트 II)항체의 분석을 보여준다 (실시예 1).
도 23은 Hu106 IgG1/kappa 항체의 발현벡터(이하 발현벡터)의 개략적인 구조를 묘사한다. 상부의 SalI 사이트로부터 시계?향으로 진행하면서, 플라즈미드는 항체 중쇄 유전자의 전사를 개시하기 위하여 인간 거대세포바이러스 (cytomegalovirus)(CMV) 주요 초기 프로모터(major immediate early promoter) 와 인핸서(enhancer) (CMV promoter)로 시작하는 중쇄 전사유니트를 포함한다. CMV 프로모터의 뒤로는VH 엑손 (exon), CH1, 힌지부분, CH2와 CH3엑손 및 개제 인트론을 포함하는 인간 감마 I 중쇄 불변 영역 게놈 염기서열과 CH3 엑손 이후 폴리아데닐레이션 사이트 (polyadenylation site)가 위치한다. 중쇄 유전자 염기서열의 이후에는 경쇄 전사 유니트가 계속되는데, CMV 프로모터로부터 시작해서 VL 엑손과 인간 카파 체인 불변 영역 엑손 (CL)과 그에 따르는 인트론부위, 그리고 이후 폴리아데닐레이션 사이트가 따라온다. 경쇄 유전자 이후로는 SV40 초기 프로모터 (SV40 프로모터), 대장균 잔틴 구아닌 포스포라이보실 트랜스퍼레이즈 (xanthine guanine phosphoribosyl transferase) 유전자 (gpt), SV40 폴리아데닐레이션 사이트 (SV40 폴리(A) 사이트)를 포함하는 절편이 계속된다. 마지막으로 플라즈미드는 미생물적 복제 중심 (pUC ori)과 베타-락타메이즈 (beta-lactamase) 유전자 (베타 락타메이즈)로 구성하는 pUC19 플라즈미드의 부분을 포함한다. 제한효소의 상대적인 위치가 그림에 나와 있다.
도 24는 L/OX40 세포에 결합하는 Hu106-222 로트 I과 II 항체간의 비교를 나타낸다 (실시예 1 하단).
도 25는 Hu119-122가 분자량 약 50kDa의 중쇄와 분자량 약 25kDa의 경쇄로 구성되어 있음을 보여준다. Hu119의 순도는 95% 이상이다 (실시예 II 하단).
도 26은 본 명세서에 기술한 Ch119-122와 Hu119-122 항체의 FACS 분석 결과를 보여준다 (실시예 II 하단).
도 27은 인간화한 항-인간 OX40 단일클론 항체 클론 119-122 (Hu119)와 그의 FcR 결합 돌연변이 항체 (Hu119-AA)가 미성숙 CD4+ T 세포 증식을 향상한다는 것을 보여준다. Hu119-122는 부모적 마우스(mouse) 항-인간 OX40 단일클론 항체 (마우스 119-122)와 비교하여 더 나은 T 세포 자극 활성을 나타낸다. 그러나 키메라 항-인간 OX40 단일클론 항체 (Ch119, 마우스 VH와 VL을 가지고 인간 감마-1과 카파 불변 영역)는 T 세포 증식을 향상하는데 실패하였다.
도 28은 FcR 결합 돌연변이 항-인간 OX40 단일클론 항체 클론 160-22 (Hu222AA)와 키메라 항-인간 OX40 단일클론 항체 클론 106-222 (Ch222)가 항-CD3 자극의 미성숙 CD4+ T 세포 증식을 향상하는 것을 보여준다. 이들 항체들은 부모적 마우스 항-인간 OX40 단일클론 항체 (마우스 222)과 비교하여 유사한 자극활성을 가지고 있다. 그러나 완전히 인간화한 항-인간 OX40항체 Hu222은 인간 IgG1과 비교하였을 때 T 세포 증식을 향상하지 못한다.
도 29a와 b는 인간화한 마우스 항-인간 OX40 단일클론 항체 클론 119-122가 CD4+ Treg 억제 기능을 방해하는 것을 보여준다.
도 30은 플레이트에 결합한 항체들을 이용하여 항-인간 OX40 항체들이 CD4+과 CD8+ T 세포 증식을 향상하는 것을 보여주는 데이터를 제공한다.
도 31은 인간화한 마우스 항-인간 OX40 항체 T 세포 증식을 향상하기 위해서는 크로스링크 (cross-linking)를 필요로 한다는 것을 보여준다.
도 32는 항-인간 OX40 항체가 CD4+FOXP3+nTregs의 활성을 억제하는 것을 플레이트에 결합한 항체들을 이용하여 보여준다.
도 33은 고농도의 마우스 항-인간 OX40 항체가 FOXP3+ Tregs를 선택적으로 죽이는 것을 보여준다.
도 34는 마우스 항-인간 OX40 단일클론 항체가 효과기 T 세포나 nTregs에 직접 작용해서 Tregs의 억제기능을 방해하는 것을 보여준다.
도 35a, 35b, 35c는 마우스에서 항-hOX40 단일클론 항체의 hOX40+CD8+ T 세포로 적응적으로 전환한 종양에 대한 치료 결과를 보여준다. 항-인간 OX40 단일클론 항체는 T 세포 팽창과 생체 내 (in vivo) 생존을 촉진한다. 도 35a는 치유적인 백신 요법을 보여준다. 대표적인 생체 내 생물발광 이미지를 35b에서 보여준다. 항체 종양 요법의 결과를 도 35c에 보여준다.
도 36은 106-222, 인간화한 106-222 (Hu106)의 아미노산 서열의 정열을 나타내고, 인간 수용체 X61012 (젠뱅크 (GenBank) 가입번호) VH 서열의 아미노산 서열을 보여준다. 아미노산 잔기는 단일문자 코드로 표기하였다. 아미노산 서열 위의 숫자는 카밧 (Kabat) 등 (면역학적으로 관심이 가는 단백질들의 서열, 제 5판, 미국 국립보건원 출간번호 91-3242, 미국 보건 및 인적 서비스부, 1991)에 따른 위치를 나타낸다. 본 명세서에서 주장하는 동일한 서열을 서열목록에서 제공하며, 위치 번호는 다를 수 있다. 도 36에서, 카밧 (Kabat) 등 (1991)이 정의한 CDR 서열은 106-222VH에 밑줄그어 강조하고 있다. X61012에서 CDR 부위는 그림에서 제외하였다. 106-222 VH 구조와 상동한 인간 VH 서열을 젠뱅크 데이타베이스에서 탐색하였고, X61012 cDNA (X61012 VH)가 암호화하고 있는 VH 서열을 인간화 수용체로 선택하였다. 제일 먼저 106-222 VH의 CDR 서열을 X61012 VH의 해당하는 위치로 전송하였다. 그 다음, 106-222 가변 영역의 3차원 모델이 CDR과 가장 현저하게 접촉하는 것으로 제안된 구조 위치에서 마우스 106-222 VH의 아미노산 서열을 해당하는 인간 서열로 교체하였다. 이 교체는 위치 46과 94 (Hu106 VH에서 밑줄그어 강조)에서 수행하였다. 추가하여, 해당하는 V부위 서브그룹에서 예외적으로 발견되는 인간 구조 잔기는 잠재적인 면역원성을 감소시키는 가장 일반적인 잔기로 교체하였다. 이 교체는 105 위치 (Hu106 VH에서 이중 밑줄 부위)에서 수행하였다.
도 37은 106-222, 인간화한 106-222 (Hu106)의 아미노산 서열을 정렬한 결과를 보여주고, 인간 수용체 AJ388641 (젠뱅크 가입번호) VL 서열을 보여준다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 나타냈다. 서열 위의 숫자는 카밧 (Kabat) 등 (1991)에 따른 위치를 나타낸다. 본 명세서에서 주장한 것과 동일한 서열을 위치번호가 다를 수 있음에도 불구하고 또한 서열목록에서 제공하고 있다. 카밧 (Kabat) 등 (1)에 의해 정의한 CDR 서열을 106-222 VH에서 밑줄을 그어 강조하였다. AJ388641 VL에서 CDR 잔기는 그림에서 제외하였다. 106-222 VL 구조와 상동한 인간 VL 서열을 젠뱅크 데이터베이스에서 검색하고, 인간 AJ388641 cDNA (AJ388641 VL)에 의하여 암호화한 VL 서열을 인간화를 위한 수용체로 선택하였다. 106-222 VL의 CDR 서열을 AJ388641 VL의 상응하는 위치로 전송하였다. 인간화 형태에서 구조 교체는 수행하지 않았다.
도 38은 SpeI과 HindIII 위치 (밑줄)를 측면에 추가한 Hu106 VH 유전자의 염기서열을 추정 아미노산 서열과 함께 나타내었다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 표시하였다. 시그널 펩티드 서열은 이탤릭체로 표시하였다. 성숙한 VH의 N-말단 아미노산 잔기 (Q)는 이중밑줄로 표시하였다. 카밧 (Kabat) 등 (1991)의 정의에 따른 CDR 서열은 밑줄로 표시하였다. 본 명세서에서 주장한 것과 동일한 서열이 또한 서열목록에서 제공하며, 위치 번호는 서열목록에서 다를 수 있다. 인트론 서열은 이탤릭으로 나타내었다. SpeI과 HindIII로 절단한 Hu106 VH 유전자 절편을 도 23에 보여준 발현벡터의 상응하는 위치로 클론하였다.
도 39는 NheI과 EcoRI 위치 (밑줄)을 측면에 추가한Hu106-222 VL의 염기서열과 거기에서 추론한 아미노산 서열을 보여준다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 표시한다. 시그날 펩티드는 이탤릭으로 표시한다. 성숙한 VL의 N-말단 아미노산 잔기 (D)를 이중밑줄로 표시하였다. 카밧 (Kabat) 등 (1991)의 정의에 의한 CDR 서열은 밑줄로 표시하였다. 인트론 서열은 이탤릭으로 표시하였다. NheI과 EcoRI으로 절단한 Hu106 VL 유전자 절편을 도 23에서 보인 발현 벡터의 상응하는 위치에 클론하였다. 본 명세서에서 주장한 것과 동일한 서열을 서열목록에 제공하며 위치 번호는 서열목록과 다를 수 있다.
도 40은 119-222, 인간화한 119-222 (Hu119)의 아미노산 서열의 정렬을 보여주고, 인간 수용체 Z14189 (젠뱅크 가입번호) VH 서열을 보여준다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 표시한다. 서열 위의 숫자는 카밧 (Kabat) 등 (면역학적으로 관심이 가는 단백질들의 서열, 제 5판, 미국 국립보건원 출간번호 91-3242, 미국 보건 및 인적 서비스부, 1991)에 따른 위치를 표시한다. 카밧 (Kabat) 등 (1991) 이 정의한 CDR 서열은 119-122 VH에 밑줄로 표시하였다. Z14189 VH의 CDR 잔기는 그림에서 제외하였다. 119-122 VH 구조와 상등한 인간 VH 서열을 젠뱅크 데이터베이스에서 검색하였고, 인간 Z14189 cDNA (Z14189 VH)에 의해 암호화하는 VH 서열을 인간화를 위한 수용체로 선택하였다. 제일 먼저 119-122 VH의 CDR 서열을 Z14189 VH의 상응하는 부분에 전송한다. 그 다음, 119-122 가변 영역의 3차원 모델에서 CDR과 가장 중요하게 접촉하는 것으로 제안된 구조부위에서 마우스 119-122 VH의 아미노산 잔기를 대응하는 인간 잔기로 교체하였다. 이러한 교체는 그림에서 보여주듯이 위치 26, 27, 28, 30과 47 (Hu119 VH 서열에 밑줄로 표시)에서 수행하였다. 본 명세서에서 주장한 것과 동일한 서열을 서열목록에서 또한 제공하고 있으며, 위치 숫자는 서열목록에서 다를 수도 있다.
도 41은 119-122, 인간화한 119-122 (Hu119)의 아미노산 서열의 정렬을 보여주고, 인간 수용체 M29469 (젠뱅크 가입번호) VL 서열을 보여준다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 표시하였다. 서열 위의 숫자는 카밧 (Kabat) 등 (1991)에 따른 위치를 표시한다. 카밧 (Kabat) 등 (1)이 정의한 CDR 서열은 119-122 VL에 밑줄로 표시하였다. M29469 VL의 CDR 잔기는 서열에서 제외하였다. 119-122 VL구조에 상동한 인간 VL 서열을 젠뱅크 데이터베이스에서 탐색하고, 인간 M29469 cDNA (M29469 VL)에서 암호화하고 있는 VL서열을 인간화를 위한 수용체로 선택하였다. 119-122 VL의 CDR 서열을 M29469 VL의 대응하는 위치에 전송하였다. 인간화 형태에 구조 교체는 필요하지 않았다. 본 명세서에 주장한 것과 동일한 서열을 서열목록에 제공하며, 위치 번호는 서열목록에서 차이가 있을 수 있다.
도 42는 SpeI과 HindIII 사이트 (밑줄)을 측면에 추가한 Hu119 VH 유전자의 염기서열을 추정한 아미노산 서열과 함께 보여준다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 표시하였다. 시그널 펩티드는 이탤릭체로 표시하였다. 성숙한 VH의 N-말단 아미노산 잔기 (E)를 이중밑줄로 표시하였다. 카밧 (Kabat) 등 (1991)의 정의에 따른 CDR 서열은 밑줄로 표시하였다. 인트론 서열은 이탤릭체로 표시하였다. SpeI과 HindIII로 절단한 Hu119 VH유전자 절편을 도 23에서 보인 발현벡터의 대응하는 위치에 클론하였다. 본 명세서에서 주장한 것과 동일한 서열을 서열목록에서도 제공하며, 서열목록에서는 위치 숫자가 다를 수 있다.
도 43은 NheI과 EcoRI 사이트 (밑줄)을 측면에 추가한 Hu119 VL 유전자의 염기서열을 추론한 아미노산 서열과 함께 보여준다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 표시하였다. 시그널 펩티드 서열은 이탤릭체로 표시하였다. 성숙한 VL의 N-말단 아미노산 잔기 (E)는 이중밑줄로 표시하였다. 카밧 (Kabat)등 (1991)의 정의에 의한 CDR 서열은 밑줄로 그어 표시하였다. 인트론 서열은 이탤릭체로 표시하였다. NheI과 EcoRI으로 절단한 Hu119 VL유전자 절편은 도 23의 발현 벡터의 대응하는 위치에 클론하였다. 본 명세서 주장한 것과 동일한 서열을 서열목록에서 제공하며, 위치 숫자는 서열목록에서 다를 수 있다.
실시예 I
키메라화한 106-222 IgG1/카파 단일클론 항체와 인간화한 106-222 IgG1/카파 단일클론 항체 (각각, Ch222와 Hu222)를 대응하는 안정하게 유전자 전달 감염한 NS0의 배양상층액으로부터 부록 A와 B에서 기술한 것처럼 단백질 A 컬럼을 이용하여 순화한다. Hu222는 두가지 다른 방법으로 컬럼으로부터 추출한다. 간단하게 설명하면, Hu222 로트 (Lot) I은 낮은 pH 완충액으로 추출하고, 로트 II는 피어스의 순한 Ag/Ab 추출 완충액 (Pierce? Gentle Ag/Ab Elution Buffer)를 이용하여 추출한다. Hu222의 수율은 낮은 pH 완충액을 사용하였을 때 더 높았다. Ch222는 순한 Ag/Ab 추출 완충액을 이용하여 컬럼에서 추출하였다.
순화한 Hu222 로트 (Lot) I과 II항체는 기본적인 실험방법에 따라 마우스 106-222와 함께 SDS-PAGE로 특성을 조사하였다. 각각 항체의 5mg을 환원조건하에서 분석하였다. 도 21에 나타난 것처럼, 각각의 Hu222 로트 I과 로트 II 항체는 분자량 50kD 정도의 중쇄와 분자량 25kD 정도의 경쇄로 구성한다. Hu222 로트 I과 로트 II 항체의 순도는 95%이상이다.
인간화 항체의 엔도톡신 (endotoxin) 오염여부를 론자의 리물루스 아메보사이트 조직융해체)Lonza's Limulus Amebocyte Lysate) (LAL) QCL-1000 키트를 사용하여 분석하였다. 엔도톡신 수준은 Hu222 로트 I과 II 항체 모두 0.5 EU/mg 단백질 이하였다.
L/ OX40 세포에 결합하는 Hu106 -222의 특성분석
마우스 106-222, Ch106-222과 Hu 106-222 항체의 OX40에 대한 결합을 기본적으로 로라 보버 박사 (Dr. Laura Bover)가 제공한 실험법에 따라 L/hOX40 세포를 가지고 FACS 결합 분석법으로 시험하였다. L/hOX40 세포에 결합하는 항체를 PE로 표지한 염소 항-마우스 IgG 항체 (마우스 106-222항체)나 PE로 표지한 염소 항-인간 IgG 항체 (Ch106과 Hu106)으로 감지하였다.
도 22는 마우스 106-222, Ch106과 Hu106-222 (로트 II) 항체의 L/OX40 세포에 대한 결합을 분석한 것을 보여준다. Hu106-222 (로트 II)의 적정곡선 (titration curve) Ch106-222의 그것과 거의 동일하였으며, 이것은 마우스Hu106-222가 106-222의 항원결합 친화도를 유지하고 있음을 의미한다. 마우스 106-222의 적정곡선은 Ch106과 Hu105의 그것과 유사하였다; 그러나, 이차 항체의 차이로 인하여, 데이터는 마우스 106-222의 친화도는 Hu106-222의 그것과 유사하는 것만을 의미한다.
도 24는 Hu106-222 로트 I과 II 항체간의 L/hOX40 세포에 대한 결합도를 비교한 것이다. 추가적인 분석이 필요하기는 하지만, 두 로트의 Hu106-222의 친화도는 동일하지는 않더라도 서로 유사한 것으로 나타난다. 그러므로 단백질 A 컬럼으로부터 Hu106-222의 산을 이용한 추출은 그 친화도에 영향을 미치지 않는 것처럼 보인다.
Ch106 -222의 순화
NS0 안정한 유전자전달감염 C8을 롤러병 (roller bottle)에서 500ml의 인비트로젠 하이브리도마 SFM (Invitrogen's hybridoma SFM) 배양액에서 완전히 소모할 때까지 배양하였다. 배양액을 코닝 (Corning's) 250 ml 원심분리 튜브 (카탈로그 번호 430776)에 넣고 베크만 콜터 알레그라 (Beckman Coulter's Allegra) X-12R 원심분리기 (2000 RPM에서 15분)에서 원심분리한다. 배양상층액을 파마시아 (Pharmacia) P1 펌프를 이용하여 1ml GE 헬스케어 (Healthcare) 하이트랩 맵셀렉트 슈어 컬럼 (HiTrap MabSelect SuRe column) (카탈로그 번호 11-034-95)에 로딩한다. 컬럼을 트리스로 완충한 식염수 (피어스 (Pierce), 카탈로그 번호 28379)로 세척하고 피어스의 순한 Ag/Ab 추출 완충액 (Pierce's Gentl Ag/Ab Elution Buffer) (카탈로그 번호 21027)로 추출한다. 프랙션 (Fractions) (약 1 ml)을 수집하여 OD를 280 nm에서 측정한다.
프랙션 (Fraction) # 280 nm 에서의 OD
3 0.12
4 0.30
5 0.18
6 0.11
프랙션 3에서 6까지 모은 결과 (부피 = 3.0ml, 280 nm에서의 OD = 0.14). 모은 프랙션은 10ml 세파덱스 (Sephadex) G25 중간크기 컬럼에서 PBS로 탈염한다. 1ml의 프랙션씩 수집하였다.
프랙션 (Fraction) # 280 nm 에서의 OD
5 0.09
6 0.19
7 0.12
8 0.12
9 0.00
프랙션 6에서 9까지 모은 결과 (부피 = 3.0 ml, 280 nm에서의 OD = 0.11). 모은 프랙션은 PBS에서 오버나잇 (overnight)으로 투석하였다. 투석후, 부피는 3.0 ml이었고, 280 nm에서의 OD는 0.19였다. 이 준비를 Ch106, 로트 8/31/09라고 부르며 농도는 0.13 mg/ml이었다.
Hu106 -222의 순화
NS0 안정한 유전자 전달 감염 1-C6를 롤러병 (roller bottle)에서 500 ml의 인비트로젠 하이브리도마 SFM (Invitrogen's hybridoma SFM) 배양액에서 완전히 소모할 때까지 배양하였다. 배양액을 코닝 (Corning's) 250 ml 원심분리 튜브 (카탈로그 번호 430776)에 넣고 베크만 콜터 알레그라 (Beckman Coulter's Allegra) X-12R 원심분리기 (2000 RPM에서 15분)에서 원심분리한다.
로트 1: 150ml의 배양상층액을 파마시아 (Pharmacia) P1 펌프를 이용하여 1ml GE 헬스케어 (Healthcare) 하이트랩 맵셀렉트 슈어 컬럼 (HiTrap MabSelect SuRe column) (카탈로그 번호 11-034-95)에 로딩한다. 컬럼을 PBS로 세척하고 결합한 항체를 0.1M 글라이신-HCl (glycine-HCL), 0.1 M 염화나트륨 (pH 3.0)으로 추출한다. 추출한 프랙션 (각 1 ml)을 50ml 1M 트리스-HCl (Tris-HCl) (pH 8.0)을 포함하는 튜브에 수집한다.
프랙션 (Fraction) # 280 nm 에서의 OD
2 0.88
3 2.84
4 1.29
5 0.63
6 0.18
프랙션 2에서 5까지 모은 것 (부피 = 4.2ml, 280 nm에서 OD = 1.59). 모은 프랙션은 PBS에서 오버나잇 (overnight)으로 투석하였다. 투석 후, 부피는 4.2ml이고 280 nm에서 OD는 1.54였다. 항체 용액 (로트 9/18/09 I; 1.1 mg.ml)을 필터로 살균하였다.
로트 II: 남아있는 배양상층액 (350ml)을 파마시아 (Pharmacia) P1 펌프를 이용하여 1ml GE 헬스케어 (Healthcare) 하이트랩 맵셀렉트 슈어 컬럼 (HiTrap MabSelect SuRe column) (카탈로그 번호 11-034-95)에 로딩한다. 컬럼을 트리스 완충한 식염수 (Tris-buffered saline)로 세척하고 순한 Ag/Ab 추출 완충액 (Gentle Ag/Ab Elution Buffer)로 추출한다. 프랙션 (약 1ml)을 수집하여 그들의 280 nm에서의 OD를 측정한다.
프랙션 (Fraction) # 280 nm 에서의 OD
2 0.12
3 0.85
4 2.17
5 1.47
6 1.02
7 0.81
8 0.66
9 0.54
10 0.44
11 0.46
3에서 7까지의 프랙션을 모았다 (부피 = 4.2 ml, 280 nm에서 OD = 1.22). 컬럼을 트리스 완충한 식염수 (Tris-buffered saline)로 다시 세척하고 순한 Ag/Ab 추출 완충액이 효과적인지 시험하기 위하여 항체를 0.1M 글라이신-HCl (glycine-HCL), 0.1 M 염화나트륨 (pH 3.0)으로 추출한다.
프랙션 (Fraction) # 280 nm 에서의 OD
1 0.05
2 0.05
3 1.23
4 0.49
5 0.10
순한 Ag/Ab 추출 완충액 (Gentle Ag/Ab Elution Buffer)로 추출한 프랙션 3에서 7까지를 모으고 10 ml 세파덱스 (Sephadex) G25 중간크기 컬럼에서 PBS로 탈염한다. 1ml의 프랙션을 수집한다.
프랙션 (Fraction) # 280 nm 에서의 OD
4 0.38
5 0.96
6 1.38
7 1,33
8 1.10
9 0.12
프랙션 5에서 8까지 수집하였다 (부피 = 4.0 ml, 280 nm에서 OD = 1.12). 모은 프랙션은 PBS에서 오버나잇 (overnight)으로 투석하였다. 투석후, 부피는 4.0 ml이고 280 nm에서의 OD는 1.12였다. 항체 용액 (로트 9/18/09 II; 1.1 mg.ml)을 필터로 살균하였다
피어스의 순한 Ag/Ab 추출 완충액 (Pierce? Gentle Ag/Ab Elution Buffer) 를 이용한 고염분 추출법은 단백질 A 컬럼으로에 결합한 인간 IgG1항체를 추출하는데 저pH 방법 만큼 효과적이지 않았다. 순한 Ag/Ab 추출 완충액으로 추출한 항체는 날카로운 피크를 보이면서 추출할 수 없었기 때문에, 추출한 IgG의 많은 프랙션을 모으고 투석 후 모은 프랙션을 탈염해야 할 필요성이 있었다. 순한 Ag/Ab 추출 완충액의 낮은 추출 프로필과 추가적인 순화 단계가 항체의 수율에 영향을 미쳤다. 고염분 추출방법은 순화해야 할 IgG가 산성에 취약할 때에만 사용하는 것이 좋다.
실시예 II
Ch119 -122와 Hu119 -122 항체의 순화
대응하는 하이브리도마-SFM (Hybridoma-SFM) (인비트로젠 (Invitrogen)) 에서 배양한 NS0 안정한 유전자전달감염 세포 (클론 G11)의 배양상층액으로부터 키메라 119-112 IgG/카파 단일클론 항체 (Ch119)를 단백질 A 컬럼을 이용하여 순화하였다. 피어스의 순한 Ag/Ab 추출 완충액 (Pierce? Gentle Ag/Ab Elution Buffer)으로 추출한 다음, Ch119의 완충액을 젤 필트레이션 (gel filtration) 후 투석을 통하여 PBS로 교체하였다. Ch119의 농도는 0.21 mg/ml이었다.
대응하는 하이브리도마-SFM (Hybridoma-SFM) 에서 배양한 NS0 안정한 유전자전달감염 세포 (클론 2F5)의 배양상층액으로부터 인간화한 119-122 IgG/카파 단일클론 항체 (Hu122)를 단백질 A 컬럼을 이용하여 순화하였다. Hu106-222는 저 pH 완충액으로 컬럼에서 추출하고, 1M 트리스-HCl (Tris-HCl) (pH 8.0)으로 중화하고 PBS로 투석하였다. Hu122의 농도는 1.6 mg/ml이었다.
순화한 Hu106-222를 기본적인 실험방법에 따라서 마우스 119-122와 함께 SDS-PAGE로 특성을 분석하였다. 각 항체 5 ㎍씩을 환원조건 하에서 분석하였다. 도 25에서 볼 수 있듯이 Hu119-222는 분자량 약 50kD의 중쇄와 분자량 약 25kD의 경쇄로 구성한다. Hu119의 순도는 95%이상이다.
L/ hOX40 세포에 결합하는 Hu119 -122의 특성
마우스 119-122, Ch119-122과 Hu119-122 항체의 OX40에 대한 결합을 기본적으로 로라 보버 박사 (Dr. Laura Bover)가 제공한 실험법에 따라 L/hOX40 세포를 가지고 FACS 결합 분석법으로 시험하였다. L/hOX40 세포에 결합하는 항체를 PE로 표지한 염소 항-마우스 IgG 항체 (마우스 119-122 항체)나 PE로 표지한 염소 항-인간 IgG 항체 (Ch119-122과 Hu119-122)으로 감지하였다.
도 26은 FACS 분석의 결과를 보여준다. Hu119-122의 적정곡선은 Ch119-122의 그것과 유사하며, 이것은 마우스 119-122의 항원 결합 친화성이 Hu119-122에서 유지됨을 시사한다. 그러나, Ch119-122와 Hu119-122의 고 항체 농도에서의 MCF 값은 적정 곡선에 맞게 떨어지지 않았다. 실험조건을 조정한 후에 FACS 분석을 반복해야할 것이다.
실시예 III
인간화한 항-인간 유래 OX40항체의 T 세포 증식을 향상하는 능력을 평가하기 위하여, 항-CD3 코팅한 CD32-L 세포와 신선하게 분류한 미성숙 CD4+ T 세포를 이용한 증식분석을 수행하였다. 도 27은 인간화한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 클론 119-122 (Hu122)와 그의 FcR 결합 돌연변이 항체 (Hu122-AA)가 미성숙 CD4+ T 세포의 증식을 향상시키는 것을 보여준다. Hu122가 원래의 마우스 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 (마우스 122)와 비교하였을 때 더 나은 T 세포 자극 활성을 나타냈다 (도 27).
FcR 결합 돌연변이 인간화한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 클론 106-222 (Hu222-AA)와 키메라 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 클론 106-222 (Ch222)는 항-CD3 자극 미성숙 CD4+ T 세포 증식을 향상하였다. 이들 항체들은 원래의 마우스 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 (마우스 106-222)와 비교하였을 때 비슷한 자극활성을 가지고 있었다. 그러나 완전히 인간화한 항-인간 유래 OX40 항체 Hu106은 T 세포 증식을 향상시키지 않았다 (도 28).
인간화한 항-인간 유래 OX40 항체의 CD4+ 조절 T 세포 (Tregs)의 억제 기능을 방해하는 능력을 평가하기 위하여, 신선하게 분류한 미성숙 CD4+ T 세포와 CD4+CD25highCD127low Tregs를 이용하여 증식 분석을 실시하였다. 그 결과 키메라 항체 Ch122와 Fc 결합 돌연변이 인간화 항체 (Hu122-AA)가 CD4+ Treg 억제 기능을 방해하는 면에서 원래의 마우스 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 (마우스 122)보다 더 높은 가능성을 보였다 (도 29a, 도 29b).
도 27의 실험에서, 신선하게 분류한 CD4+CD25lowCD127+CD45RO-CD45RA+ 미성숙 T 세포를 4가지 농도의 항-CD3 항체를 코팅한 CD32를 발현하는 L 세포 (CD32-L)과 2?g/ml의 항-인간 유래 OX40 항체 클론 119 항체나 대조군 항체로 자극하였다. 자극 3일 후, 방서성 트리튬 (tritium)을 첨가하고 세포를 수확하기전 16-18시간을 추가로 배양하였다. 데이터는 두 공여자로부터의 실험을 대표한다. CD32-L 세포 발현 hOX40 리간드 (CD-32L/hOX40L)를 양성대조군으로 사용하였고, 인간과 마우스 IgG1을 음성대조군으로 사용하였다.
도 28의 실험에서, 새롭게 분류한 미성숙 CD4+ T 세포들을4가지 농도의 항-CD3 항체를 코팅한 CD32를 발현하는 L 세포 (CD32-L)과 2 ㎍/ml의 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 클론 106-222 (Hu222) 항체나 대조군 항체로 자극하였다. 자극 3일 후, 방사성 트리튬 (tritium) 을 첨가하고 세포를 수확하기전 16-18시간을 추가로 배양하였다. 데이터는 두 공여자로부터의 실험을 대표한다. CD-32L/hOX40L을 양성대조군으로 사용하였고, 인간과 마우스 IgG1을 음성대조군으로 사용하였다.
도 29의 실험에서, 새롭게 분류한 CD4+ 미성숙 T 세포를CD4+CD25highCD127lowTregs의 존재하에서 세가지 Tregs: T 이펙터 (effector) 비율로 배양하고 0.2 ㎍/ml의 항-CD3 항체를 코팅한 CD32를 발현하는 L 세포 (CD32-L)와 10 ㎍/ml의 항-인간 유래 OX40 항체 클론 119-122 항체나 대조군 항체로 자극하였다. 자극 3일 후, 방사성 트리튬 (tritium) 을 첨가하고 세포를 수확하기전 16-18시간을 추가로 배양하였다. 데이터는 3회의 실험을 대표한다. CD32-L/hOX40L은 양성대조군으로 사용하였고, 인간과 마우스 IgG1을 음성대조군으로 사용하였다.
실시예 IV
항체들을 정맥주사를 통하여 환자에게 투여할 경우 전체 말단 혈액 단핵 세포 (PBMCs)와 만나게 될 것이므로, 항-인간 유래 OX40항체들의 항원 표시 세포 (APCs)로써 PBMCs를 이용하여 T 세포 증식을 자극하는 능력에 대하여 증식분석의 방법으로 테스트 하였다. 그러나,마우스 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체로PBMCs를APCs로 사용할 때 단핵세포를 APCs로 사용할 때 볼 수 없었던 매우 가치있는 데이터를 얻을 수 있었고, 이것은 우리의 항체가 활성을 위해서 어떤 종류의 크로스링크를 필요로 한다는 것을 암시한다. 이 가능성을 확인하기 위하여, 플레이트를 우리의 항-인간화 OX40 단일클론 항체와 항-CD3로 코팅하고, 세척한 다음부세포의 부재하에서 CD4+ 나 CD8 + T 세포의 증식을 자극하는데 사용하였다. 도 30은 항-인간화 OX40 항체들이 CD4+ 와 CD8 + T 세포 증식을 향상하는 것을 보여준다.
새롭게 분류한 1x105 개의 CD4+CD25lowCD45RO-CD45RA+ 미성숙 T 세포 (도 30a)나CD3+CD8+ T 세포 (도 30b)를 플레이트에 결합한 항-CD3 (3 ㎍/ml)와 항-인간 유래 OX40 마우스 단일클론 항체 (2 ㎍/ml)로 자극하였다. 적정한 싸이미딘 (thymidine)을 배양 3일째에 첨가하고, 15시간 더 배양한 다음 세포들을 수확하였다. T 세포의 증식을 싸이미딘 통합 정도로 평가하였다. 항-인간화 OX40 단일클론 항체들은 세번의 하이브리도마 (hybridoma) 융합으로부터 유래하였다. 융합숫자를 따라오는 숫자는 특이적 항체를 표시한다. 마우스 IgG1과 119-42를 음성대조군으로 사용하였다. 각각의 처리는 3회씩 반복하였다. 4 T 세포 공여자로부터 구한 대표적인 데이터를 보여준다 (도 30c). 모든 세 종류의 인간화한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 [Hu4106-222, Hu119-122; Hu106-222AA, Hu119-122AA (AA는 Fc 결합부의 두 아미노산이 알라닌으로 돌연변이 되었음을 의미); Ch119-122 (인간화한 119-122와 마우스 가변 영역 "파라토프(paratope)"를 유지한다는 점을 제외하고는 동일함)는 미성숙 CD4+ T 세포 증식을 자극하였다. 항-CD28을 양성대조군으로 사용하였다.
도 30에서 나타난것처럼, 패널 A와 B가 플레이트에 결합한 마우스 항-인간화 OX40단일클론 항체가 잠재적으로 미성숙 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 증식을 약 10에서 40배 자극한다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 우리의 연구를 우리의 인간화한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체로까지 확대하였고, 우리의 인간화 항체들의 세 가지 버젼이, 완전히 인간화하였는지, 키메라화 하였는지, 또는 Fc 수용체에 결합하는데 관여하는 아미노산 잔기를 알라닌 (alanine)으로 변경한 AA 돌연변이가 미성숙 CD4+ T 세포 증식의 잠재적인 자극물질이라는 것을 발견하였다 (도 30c).
도 31은 마우스와 인간화한 항-인간 유래 OX40 항체가 T 세포 증식을 향상시키기 위해서는 크로스링크가 필요하다는 것을 보여준다. 신선하게 분류한 미성숙 CD4+ T 세포를 부세포의 부재하에서 플레이트에 결합한 항-CD3 (3 ㎍/ml)와 플레이트에 결합하거나 수용성의 인간화한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 (2 ㎍/ml)로 자극하였다. 적정한 싸이미딘 (thymidine)을 배양 3일째에 첨가하고, 15시간 더 배양한 다음 세포들을 수확하였다. T 세포의 증식을 싸이미딘 통합 정도로 평가하였다. 마우스 IgG1과 항-CD28을 음성대조군과 양성대조군으로 각각 사용하엿다. 두 공여자로부터 대표적인 데이터를 표시하였다. 미성숙 CD4+ T 세포를 부세포의 부재하에 플레이트에 결합한 항-CD3으로 자극하였다. 다음날, 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 119-122 (2 ㎍/ml)를 단독으로 추가하거나 동일한 양의 Fc에 대한 이차 항체와 함께 추가하였다. 패널 에이에 평가한 세포증식을 표시하였다.
인간화한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 Hu106-222와 Hu119-122의 효력을은 항-CD28의 그것과 비교할만 하였다. 대조적으로, 수용성 항-인간 유래 OX40항체를 T 세포 컬쳐에 추가하였을 때, 자극효과는 사라졌다 (도 31a). 그러나 수용성의 항-인간 유래 OX40 단일클론항첼 119-122를 F(ab')2 절편 염소 항-마우스 IgG, 즉 Fc 절편 특이적인 2차 항체와 함께 첨가하자 자극효과를 회복하였다 (도 31b). 이러한 결과는 항-인간화 OX40 단일클론 항체가 생물학적인 활성을 위해서는 크로스링크가 필요하다는 것을 보여준다.
아고니스틱 (argonistic), 항-인간화 OX40 단일클론 항체의CD4+CD25highCD12T nTregs 의 억제 기능을 방해하는 능력을 평가하기 위하여, CD4+CD25IowCD127+CD45RO+ T 효과기 세포 (Teff)와CD4+ nTregs의 존재하에서 증식분석을 수행하였다. 항-인간화 OX40 단일클론 항체와 항-CD3를 플레이트에 코팅하고 부세포가 부재한 플레이트에 결합한 시스템을 이용하여, 열두종 (222, 132, 8B, 33A, 43, 58B, 122, 157A, 173B, 220C, 140A, 270)의 항-인간화 OX40 마우스 단일클론 항체가 nTreg 억제를 강력하게 방해하였다 (도 32a와 32b. 본 실험에서 사용한 nTreg와 T 효과기 세포의 비율이 1:1이었으나, 이러한 항체들은 nTreg의 부재시 T 효과기세포에 의하여 달성할 수 있는 백분율보다 10에서 35퍼센트 더 증식하도록 T 효과기세포를 자극할 수 있었다. 인간화한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체들은 또한 비슷한 수준으로 nTreg의 억제 기능을 되돌릴 수 있었다 (도 32C). 이러한 결과들을 종합하면, 우리의 항-인간 유래 OX40 마우스 단일클론 항체는 OX40의 강력한 자극자임을 암시하며, 상당한 수준의 T 세포 증식 향상과 nTreg 억제기능의 방해를 가져온다. 게다가, 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체들은 그들의 원래의 마우스 항체의 강력한 생물학적 활성을 유지한다.
도 32는 항-인간 유래 OX20 단일클론 항체가 CD4+FOXP3+nTregs의 활성을 막는 것을 보여준다. CFSE로 표지한CD4+CD25-CD45RO+ T 효과기 세포와 CD4+FOXP3+ Tregs를 동일한 건강한 공여자로부터 얻는다. T 세포를 수용성 항-CD28 (0.5 ㎍/ml)과 플레이트에 결합한 항-CD3 (3 ㎍/ml)과 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 (2 ㎍/ml)로 자극한다. T 효과기 세포의 증식을 CFSE의 희석도를 플로우사이트메트리로 측정하여 평가한다. nTreg와 T 효과기 세포의 비율은 1:1이다. 마우스 IgG1을 음성대조군으로 사용하였다. 미성숙 CD4+ T를nTreg에 의한 T 효과기 세포의 증식에 특정한 억제를 보여주는 대조군 T 세포로 사용하였다. 도 32A는 미성숙 CD4+ T 세포, nTreg, 또는 nTreg와 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 119-33A의 존재하에서 T 효과기 세포의 증식을 보여주는 대표적인 FACS 데이터이다. 도 32B는 마우스 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 (20회 테스트)를 처리한 후 nTreg의 존재하에서 T 효과기 세포 증식의 백분율을 보여준다. 도 32C는 모든 세가지 버전의 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체들이 T 효과기 세포의 증식을 회복시키는 것을 보여준다.
최근의 보고는 OX40을 자극하는 것이 OX40을 발현하는 인간 T 세포 셀라인의 아폽토시스 (apoptosis)를 유발한다고 보고하였다 (요시아키 타카하시 (Yoshiaki Takahashi) 등, 200B, AIDS 연구와 인간 레트로바이러스 (AIDS research and human Retroviruses), 24). 그러므로 본 발명자들은 고정된,저용량의 항-CD3의 단핵백혈구의 존재하에서 세가지 T 세포 서브셋의 생존에 대한 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 106-222의 농도 증가의 효과를 시험하였다. 도 33A는 고농도의 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 106-222 (20-30 ㎍/ml)가 선호적으로 활성화한FOXP3+ nTregs를 선택적으로 죽이고, 활성화한 미성숙과 성숙CD4+ T 세포는 이러한 효과에 저항성이 있거나 덜 민감하였다. 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체가 Treg에 직접적으로 세포 사멸을 유도하는지 확인하기 위하여, 부세포의 부재하에서 새로운 실험을 실시하였다. 도 33B는 항-CD3와 함께 강한 OX40 시그널링이 부세포의 부재하에서 nTregs를 특이적으로 죽이는 것을 보여준다. 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체에 의해 매개되는 세포사며 효과가 자연적인 OX40리간드에 의한 OX40 유발을 흉내내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 hOX40L을 과발현하는 마우스 피브로블라스트 (fibroblast) L 세포 라인을 사용하여 낮은 용량의 항-CD3의 존재하에서 nTregs를 자극하고 nTregs에 대한 유사한 세포사멸 효과를 얻었다 (도 33c). 이러한 결과는 강한 OX40 유도는 OX40을 발현하는 Tregs 세포를 죽인다는 것을 시사한다.
특히, 도 33은 고농도의 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체가 특이적으로FOXP3+ Tregs를 죽인다는 것을 보여준다. 도 33A에서 T 세포 서브셋 (미성숙, CD4+CD25lowCD127+CD45RO-CD45RA+; 메모리, CD4+CD25lowCD127+CD45RA-CD45RO+; nTregs, CD4+CD25highCD127low)들을 각각 수용성 항-CD3 (0.3 ㎍/ml)의 존재와 증가하는 농도의 마우스 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 106-222의 존재하에서 CD14+ 단핵백혈구와 동일한 비율로 배양하였다. 활력있는 림프구세포를 게이팅 (gating)하는 플로우 사이토메트리 분석으로 배양 3일후에 세포 활성을 측정하였다. 두 T 세포 공여자로부터의 데이터를 표시하고 있다. 도 33B와 33C는 OX40의 강력한 자극 (triggering)이 CD4+FOXP3+ Tregs를 죽이는 것을 보여준다. 도 33B는CD4+FOXP3+ Tregs가 플레이트에 결합한 항-CD3 (2 ㎍/ml)와 수용성 119-122 단일클론 항체(30 ㎍ per million cells)나 마우스 IgG1 대조군 항체로 자극되어지는 것을 보여준다. 배양 1일 후 트리판 블루 (Trypan blue)-음성의 살아있는 세포를 헤마사이토미터 (hemacytometer)를 사용하여 카운트하였다. 도 33C는 CD4+FOXP3+ Tregs를 수용성 항-CD3 (0.2 ㎍/ml)와 L 세포 또는 hOX40리간드를 발현하는 L 세포 (L/hOX40L)로 자극하는 것을 보여준다. 살아있는 세포는 1일간의 자극 후에 카운트하였다.
본 발명자들은 그 이후 항-인간 유래 XO40 단일클론 항체가 T 세포에 직접적으로 작용하여 nTreg의 억제 기능을 방해할 수 있는지 확인하고자 하였다. 신선하게 분류한 CD4+ T 작용기 세포나 nTreg를 항-CD3로 오버나잇 미리 활성화시킨 다음, 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체를 4시간 동안 첨가해 주었다. 이후 T 효과기세포들을 세척하고, 동일한 숫자의 CD14+ 단핵백혈구와 항-CD3의 존재하에 nTregs를 함께 배양하였다. 유사하게, 미리 자극한 nTregs를 세척하고 전처리하지 않은 CFSE-표지한 T 효과기 세포와 배양하였다.
도 34는 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체가 T 세포에 직접적으로 작용하여 Tregs의 억제 기능을 방해한다는 것을 보여준다. 도 34A는 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체가 효과기 메모리T 세포에 직접적으로 작용하여 nTreg에 의해 억제되는 것에 대한 저항성을 부여하는 것을 보여준다. CD4+ CD25lowCD127+CD45RA-CD45RO+ 메모리 T 세포를 플레이트에 결합한 항-CD3 (0.8 ㎍/ml)와 함께 배양액(RPMI/10% FCS/ P/S 와30 IU/ml의 IL-2)에서 12시간 배양한 다음 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 (119-122, 50만 세포당 22 ㎍)을 배양액에 4시간동안 첨가한 후 3회 세척하고 8 x 104의 CFSE 표지한 효과기 T 세포들을 감소하는 비율의 nTregs와 함께 배양한다. 효과기 T 세포의 증식은 CFSE의 희석을 플로우 사이토메트리로 측정하여 평가한다. 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체는 Tregs에 작용하여 T 효과기 세포의 증식을 억제하지 못하게 만든다 (도 34B). CD4+CD25highCD127low nTregs를 배양액 속에 플레이트에 결합한 항-CD3 CD3 (2 ㎍/ml)를 첨가하여 12시간 동안 전자극하고, 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체 119-122나 106-222, 또는 대조군 항체인 항-ICOS나 마우스 IgG1으로 패널 A에 기술한 것처럼 표지한다. 이후 세척하고 CFSE-표지한 T효과기 세포와 함께 배양한다. 효과기 T 세포의 증식은 CFSE의 희석을 플로우 사이토메트리로 측정하여 평가한다.
항-인간 유래 OX40 단일클론 항체로 처리한 T효과기 세포는 nTreg 세포에 의한 억제에 저상성을 가지게 된다 (도 34A). 대조적으로 마우스 IgG1 대조군항체를 처리한 T 효과기 세포의 증식은 nTregs에 의한 억제에 민감하도록 유지된다. 도 34B는 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체로 처리한 nTregs가 T 효과기 세포의 증식을 억제하지 못하는 것을 보여준다. 대조적으로 항-ICOS나 마우스 IgG1과 같은 대조군 항체를 처리한 nTregs는 억제가 가능하다. 이러한 결과들은 우리의 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체가 T 효과기 세포와 nTregs에 모두 직접적으로 작용하여 T 작용기 세포의 증식을 회복시킨다는 것을 시사한다.
실시예 V
부가적인 예비 생체 내 데이터가 항-인간 유래 OX40 항체 마우스에서 T 세포 증식과 종양거부를 향사시킨다는 것을 보여준다. 이전에도 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체가 인간 유래 OX40을 형질도입한 마우스 CD8+ T 세포에 서NF-κB 캐스케이드 (cascade)를 특이적으로 활성화한다는 것이 알려졌다. 항-hOX40 단일클론 항체가 효과기 CD8+ T 세포의 생존과 클론 팽창을 생체 내에서 촉진하여 종양거부를 촉진시키는지를 판단하기 위하여, 루시퍼레이즈 (luciferase) 유전자를 유전자 이식한 Pmel CD8+ T 세포에 형질전환하고 hOX40을 비-색소성 M38 종양을 가진 C57BL/6 흰마우스에 적응적으로 전달하였다. 형질전환한 T 세포의 전달이 끝나고, 마우스들을 항체로 처리하였다. 항-hOX40 단일클론 항체로 처리한 마우스에서 IgG1 대조군 항체로 처리한 마우스에 비교하였을 때 유의적으로 더 많은 인간 OX40+ luciferase+ Pmel T 세포들이 4일간 폐로 이동하였다 (도 35b). 이것은 hOX40이 마우스에서CD8+ T 세포의 확장을 촉진하는 것을 유도하였음을 나타낸다. 처리후 8일째 (데이터 보여주지 않음)과 12일째에, 항-hOX40 단일클론 항체로 처리한 그룹의 마우스에서 IgG1으로 처리한 대조군 마우스들보다 유의적으로 더 많은luciferase+Pmel T 세포들을 종양사이트에서 발견할 수 있었으며 (도 35b), 이것 또한 마우스에서 hOX40이 CD8+ T 세포의 생존을 촉진시키는 것을 유도한다는 것을 보여준다. 마지막으로, hOX40+Pmel CD8+ T 세포를 받고 이후 항-hOX40단일클론 항체로 처치한 마우스의 종양크기는 형질전환하지 않은 Pmel T 세포를 받고 항-hOX40 단일클론 항체로 처치하거나 hOX40+Pmel T 세포로 형질전환하고 IgG1 항체로 처치한 대조군 마우스들과 비교했을 때 유의미하게 작아졌다. 이러한 결과들은 마우스에서 인간 유래 OX40으로 트리거링하는 것은 마우스 OX40으로 트리거링 하는 것과 유사한 결과를 가져온다는 것을 보여준다 (고우 (Gough) MJ 등, 2008). 그러므로 데이터는 항-인간 유래 OX40 단일클론 항체의 생체 내에서의 CD+ T 세포 확장과 생존을 자극하고 종양거부를 향상하는 능력을 보여준다.
항-인간 유래 OX40 단일클론 항체가 T 세포의 확장과 생체 내에서의 생존을 촉진한다.
우리의 치료적인 예방주사 요법을 도 35a에 도해하였다. C57BL/6 흰마우스 5 그룹에 피하적으로 (S.C) 5 x 105 비색소성 MC38/gp100 종양세포를 이식하였다 (0일). 6일째에, 350 cGy 용량의 방사선조사로 림프구감소증을 유도하였다. 7일째에1 x 106 루시퍼레이즈 (luciferase) 형질전환한 Pmel-1 T 세포를 인간 유래 OX40 발현과 함께 또는 없이 종양을 가진 마우스에 적응적으로 전달하였다 (그룹당 n=5). 그 다음5 x 105 Gp100 펩티드-펄스드 (peptide-pulsed) DCs를 정맥주사하였다. T 세포 전달후 3일간 재조합 인간 유래 IL-2를 복강내에 주사하였다. 항체들은 마우스당 7일, 9일, 11일에 각각 100, 50, 50 ㎍씩 주사하였다 (도 35b). 생체 내 생체형광이미지는 루시퍼레이즈를 발현하는CD8+ pmel-1 T 세포들이 폐와 종양 사이트에 축적되는 것을 4일과 12일에 보여준다. 그룹당 5마리중 2마리의 마우스를 4일과 12일에 보여준다 (도 35c). 종양들이 항-hOX40 단일클론 항체를 이용한 처치에 반응하였다. 종양 크기는 매 3일마다 측정하였다. Pmel-1과 Pmel-1과 IgG1을 처리한 것을 대조군으로 하였다.
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Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 actagtacca ccatggcttg ggtgtggacc ttgctattcc tgatggcagc tgcccaaagt 60 atccaagcac aggttcagtt ggtgcagtct ggatctgagc tgaagaagcc tggagcctca 120 gtcaaggttt cctgcaaggc ttctggttat accttcacag actattcaat gcactgggtg 180 cgacaggctc caggacaagg tttaaagtgg atgggctgga taaacactga gactggtgag 240 ccaacatatg cagatgactt caagggacgg tttgtcttct ctttggacac ctctgtcagc 300 actgcctatt tgcagatcag cagcctcaaa gctgaggaca cggctgtgta ttactgtgct 360 aatccctact atgattacgt ctcttactat gctatggact actggggtca gggaaccacg 420 gtcaccgtct cctcaggtaa gaatggcctc tcaagctt 458 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 7 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 9 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 12 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 gctagcacca ccatggagtc acagattcag gtctttgtat tcgtgtttct ctggttgtct 60 ggtgttgacg gagacattca gatgacccag tctccatcct ccctgtccgc atcagtggga 120 gacagggtca ccatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt agcctggtat 180 caacagaaac caggaaaagc ccctaaacta ctgatttact cggcatccta cctctacact 240 ggagtccctt cacgcttcag tggcagtgga tctgggacgg atttcacttt caccatcagc 300 agtctgcagc ctgaagacat tgcaacatat tactgtcagc aacattatag tactcctcgg 360 acgttcggtc agggcaccaa gctggaaatc aaacgtaagt agaatccaaa gaattc 416 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 13 Ser His Asp Met Ser 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 14 Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu 1 5 10 15 Arg <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 15 His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 451 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 actagtacca ccatggactt cgggctcagc ttggttttcc ttgtccttat tttaaaaagt 60 gtacagtgtg aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tagtgcagcc tggagggtcc 120 ctgagactct cctgtgcagc ctctgaatac gagttccctt cccatgacat gtcttgggtc 180 cgccaggctc cggggaaggg gctggagttg gtcgcagcca ttaatagtga tggtggtagc 240 acctactatc cagacaccat ggagagacga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300 tcactgtacc tgcaaatgaa cagtctgagg gccgaggaca cagccgtgta ttactgtgca 360 agacactatg atgattacta cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tatggtcact 420 gtctcttcag gtgagtccta acttcaagct t 451 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 19 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 20 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 21 Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 22 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 23 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 gctagcacca ccatggagac agacacactc ctgttatggg tactgctgct ctgggttcca 60 ggttccactg gtgaaattgt gctgacacag tctcctgcta ccttatcttt gtctccaggg 120 gaaagggcca ccctctcatg cagggccagc aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat 180 atgcactggt accaacagaa accaggacag gctcccagac tcctcatcta tcttgcatcc 240 aacctagaat ctggggtccc tgccaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcacc 300 ctcaccatca gcagcctaga gcctgaggat tttgcagttt attactgtca gcacagtagg 360 gagcttccgc tcacgttcgg cggagggacc aaggtcgaga tcaaacgtaa gtacactttt 420 ctgaattc 428

Claims (19)

  1. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  2. (a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  3. 서열번호 7 또는 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 또는 19의 아미노산 서열과 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  4. 서열번호 8 또는 20의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8 또는 20의 아미노산 서열과 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  5. 서열번호 9 또는 21의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9 또는 21의 아미노산 서열과 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  6. 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열과 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  7. 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열과 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  8. 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열과 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체.
  9. 서열번호 5 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체, 또는 이와 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 OX40 상의 에피토프에 결합하는 분리된 항체.
  10. 서열번호 7 또는 19, 서열번호 8 또는 20, 서열번호 9 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체 또는 그와 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체.
  11. 서열번호 1 또는 13, 서열번호 2 또는 14, 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 OX40에 결합하는 분리된 항체 또는 그와 적어도 90 퍼센트의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 분리된 핵산.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주세포.
  14. 제13항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 숙주세포로부터 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 의약품으로 사용되는 것인 항체.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 자가면역질환을 치료하는 용도로 사용되는 것인 항체.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 암을 치료하는 용도로 사용되는 것인 항체.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 의약품으로 제작하는 것으로, 상기 의약품은 암 또는 자가면역질환을 치료하기 위한 것인 상기 항체의 용도.
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