RS55952B1 - Antitela na ox-40 i postupci njihove primene - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi uglavnom na moduliranje aktivacije receptora OX40 i, bliže, na moduliranje receptora OX40 da inhibira imunosupresivnu funkciju interleukina 10 (IL-10) stvaranjem T ćelija CD4<+>tipa 1 ("Tr1 ćelija") i regulatornih T ćelija koje eksprimiraju Foxp3<+>(koje se ovde ponekad nazivaju "Foxp3+ T-reg" ćelije), i stvaranjem Tr1 ćelija od CD4<+>ćelija ili naivnih ćelija i proizvodnju IL-10.

TEHNIČKI PROBLEM

[0002] Tr1 ćelije imaju kritičnu ulogu u perifernoj toleranciji. Tr1 ćelije su naročito važne u ograničavanju oštećenja tkiva domaćina tokom inflamatornih imunskih reakcija. Stvaranje Tr1 ćelija prati i TH1 i TH2 imunske odgovore i in vivo i in vitro.

[0003] Tr1 ćelije se stvaraju od naivnih CD4<+>T ćelija tokom imunskog odgovora T ćelija na antigen. Tr1 ćelije su anergične u odgovoru na signaliziranje preko TCR, CD28 i IL-2 receptora i imaju sposobnost da suprimuju proliferaciju naivnih CD4+ T ćelija izazvanu antigenom in vivo i in vitro. Tr1 ćelije imaju sposobnost da inibiraju razvoj autoimunskih oboljenja i da ograniče jačinu imunskog odgovora na mikrobijske patogene.

[0004] I, dok su molekulski signali koji vode do Tr1 ćelija proučavani, malo se zna o molekulskim signalima koji negativno regulišu stvaranje tih ćelija. Iako se smatra da imunosupresivni lekovi, citokini, kostimulativni molekuli i DC učestvuju u indukciji Tr1 ćelija, signali koji negativno regulišu stvaranje Tr1 ćelija ostaju neodređeni.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0005] Aktiviranje receptora OX40 blokira nastajanje Tr1 od naivnih ili memorijskih CD4+ T ćelija, kao i stvaranje IL-10 od Tr1 ćelija i imunosupresivnu funkciju Tr1 ćelija. Aktiviranje receptora OX40, takođe, blokira proizvodnju IL-10 u Foxp3<+>T-reg ćelijama i imunosupresivnu funkciju. Nađena su očigledna agonistična antitela na OX40 (Weinberg et al., J. Immunother.

29(2006), 575-585; Piconese et al., J. Exp. Med. 205(2008), 825-839; US Patent App. Pub. No.: 2006/0281072; US Patent App. Pub. No.: 2009/0214560; Ruby and Weinberg, Kancer Immunol. Immunother. 58(2009), 1941-1947).

Ovde su predstavljena agonistička antitela koja se vezuju za receptor OX40, gde agonist modulira aktiviranje receptora OX-40 da blokira sekreciju IL-10 citokina i/ili ukupnu imunosupresivnu funkciju Tr1 i Foxp3+ T-reg ćelija. U suštini, antitela otkrivena ovde, mogu da imitiraju ligand OX40 i pokrenu receptor OX-40 na Tr1 i/ili na prirodnim T regulatornim ćelijama ("nTregs"), koje se takođe nazivaju i "Foxp3<+>T-reg" ćelije.

[0006] Ovaj pronalazak se odnosi na realizacije definisane u zahtevima. Ovaj pronalazak se odnosi na sledeće:

1. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koje se vezuje za humani OX40 i koje sadrži: (a) varijabilni region CDR1 teškog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1; (b) varijabilni region CDR2 teškog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2; (c) varijabilni region CDR3 teškog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:3; (d) varijabilni region CDR1 lakog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7; (e) varijabilni region CDR2 lakog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8; i (f) varijabilni region CDR3 lakog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9.

2. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema članu 1, koje sadrži varijabilni region lakog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:10 i varijabilni region teškog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:4.

3. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom od prethodnih članova, gde je izolovano antitelo monoklonsko antitelo.

4. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom od prethodnih članova, gde je izolovano antitelo humanizovano antitelo.

5. Izolovano humanizovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, prema članu 4, koje sadrži varijabilni region lakog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:11 i varijabilni region teškog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:5.

6. Izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom od članova 1 do 5.

7. Ćelija-domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom od članova 1 do 5.

8. Postupak kojim se proizvodi antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koji obuhvata gajenje ćelija-domaćina iz člana 7; postupak koji po mogućstvu uključuje i dobijanje antitela, ili njegovog dela koji vezuje antigen, iz ćelija-domaćina.

9. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom od članova 1 do 5, za upotrebu kao lek.

10. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema članu 9, gde je lek namenjen tretiranju raka (karcinoma).

[0007] Kao što smo pokazali u prijavama patenata koje su u toku, US, serijski brojevi.11/659,266 i 12/861,135, OX40L inhibira stvaranje i funkciju Tr1 ćelija koje proizvode IL-10 iz naivnih i memorijskih CD4+ T ćelija što se indukuje imunosupresivnim lekovima deksametazonom i vitaminom D3. Otkrili smo da OX40L inhibira stvaranje i funkciju regulatornih Tr1 ćelija koje proizvode IL-10. Ova otkrića pokazuju da signalizacija OX40 preko OX40L suprimuje stvaranje imunosupresivnih T ćelija u kulturi koje proizvode humani IL-10. Ovu jedinstvenu funkciju OX40L ne dele i druga dva člana kostimulativne TNF familije, GITR-ligand i 4-1BB-ligand. OX40L, takođe, jako inhibira stvaranje i funkciju Tr1 ćelija koje proizvode IL-10 indukovanih pomoću dva fiziološka stimulansa koji dolaze od inducibilnog kostimulativnog liganda i nezrelih DC. Signali receptoru OX-40 na humanim T ćelijama od strane monoklonskih antitela, malih molekula ili OX40L, ili proteina koji ima sa njim najmanje 90 procenata homologije, modulira i reguliše stvaranje i funkciju imunosupresivnih T ćelija koje proizvode IL-10.

[0008] Ovaj pronalazak vodi do brojnih primena u lečenju. Na primer, agonistična antitela, mali molekuli ili OX40L mogu se upotrebiti za suprimovanje stvaranja i funkcije imunosupresivnih T ćelija koje proizvode IL-10, pa se stoga mogu upotrebiti za pojačanje imunskog odgovora u lečenju karcinoma i infektivnih bolesti, ili kao adjuvans za vakcine protiv karcinoma. Antagonistična antitela na OX40 ili OX40L, ili antagonistički mali molekuli, mogu se upotrebiti da podstaknu stvaranje i funkciju imunosupresivnih T ćelija koje proizvode IL-10, pa se stoga mogu upotrebiti za razvoj terapija za autoimunska oboljenja i oboljenja domaćina vezana za transplant (graft versus host diseases). Naše otkriće takođe omogućuje visoko efikasne postupke za skrinovanje antitela ili malih molekula koja ili aktiviraju receptor OX-40 (ili, naprotiv, blokiraju signalizaciju OX40) na T ćelijama, za razvoj terapeutskih sredstava za karcinom, ili, alternativno, autoimunska oboljenja i oboljenja domaćina vezana za transplant.

[0009] Ovde su data i monoklonska i humana antitela (koja se ovde ponekad nazivaju i "anti-OX40 antitela" i/ili neka varijanta ovoga) koja se vezuju za humani receptor OX-40. Ova antitela su korisna u lečenju ili prevenciji akutnih ili hroničnih bolesti ili stanja u čijoj patologiji učestvuje OX40. U jednom aspektu, opisano je izolovano humano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koje se vezuje za humani OX40 i koje je efikasno u lečenju karcinoma ili lečenju nekog autoimunskog oboljenja. Svako od antitela na OX40 otkrivenih ovde može se upotrebiti kao lek. Bilo koje antitelo na OX40, ili više njih, mogu se koristiti za tretiranje jedne ili više vrsta karcinoma ili autoimunskog oboljenja opisanih ovde.

[0010] Ovde su data izolovana humanizovana antitela koja se vezuju za OX40. Izolovana antitela koja su opisana ovde vezuju se za OX40, i mogu da se vežu za OX40 koji kodiraju sledeći geni: NCBI Pristupni broj NP_003317, Genpept Pristupni broj P23510, ili geni koji imaju 90 posto homologije sa njima. Izolovana antitela data ovde mogu se vezati i za receptor OX-40 koji ima jedan od sledećih pristupnih brojeva GenBank Pristupni brojevi: AAB39944, CAE11757, ili AAI05071.

[0011] U vezi sa ovim, primera radi, dato je jedno izolovano antitelo koje se vezuje za OX40 i koje sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.3;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.7;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.8; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.9.

[0012] Dalje, drugi primer je izolovano antitelo koje se vezuje za OX40 i koje sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca CDR1, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 13; (b) varijabilni region teškog lanca CDR2, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 14; (c) varijabilni region teškog lanca CDR3, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO. 15; (d) varijabilni region lakog lanca CDR1, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO. 19; (e) varijabilni region lakog lanca CDR2, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO. 20; i (f) varijabilni region lakog lanca CDR3, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.21.

[0013] Alternativno, neko izolovano antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca CDR1, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 ili 13; varijabilni region teškog lanca CDR2, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 ili 14; i/ili varijabilni region teškog lanca CDR3, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3 ili 15, ili varijabilni region teškog lanca CDR, koji ima 90 procenata homologije sa njim.

[0014] Dalje, neko izolovano antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca CDR1, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 ili 19; varijabilni region lakog lanca CDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 8 ili 20 i/ili varijabilni region lakog lanca CDR3, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9 ili 21, ili varijabilni region teškog lanca koji ima 90 procenata homologije sa njim.

[0015] Izolovano antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca ("VL") aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10, 11, 22 ili 23, ili aminokiselinske sekvence sa najmanje 90 procenata identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 10, 11, 22 ili 23. Izolovano antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca ("VH") aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, 5, 16 i 17, ili aminokiselinske sekvence sa najmanje 90 procenata identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 4, 5, 16 i 17. Kao takvo, i kao primer, izolovano antitelo može da sadrži varijabilnu tešku sekvencu SEQ ID NO:5 i varijabilnu laku sekvencu SEQ ID NO: 11, ili sekvencu koja ima 90 procenata homologije sa njima. Slično, izolovano antitelo može da ima varijabilnu tešku sekvencu SEQ ID NO: 17 i varijabilnu laku sekvencu SEQ ID NO: 23 ili sekvencu koja ima 90 procenata homologije sa njom.

[0016] Izolovano antitelo može da ima varijabilan lak lanac koji kodiraju sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 12, ili 24, ili sekvenca nukleinske kiseline sa najmanje 90 procenata identičnosti sa sekvencom nukleotida SEQ ID NO: 12 ili 24. Izolovano antitelo može da ima varijabilan težak lanac koji kodiraju sekvence nukleinske kiseline ili SEQ ID NO: 6 ili 18, ili sekvenca nukleinske kiseline sa najmanje 90 procenata identičnosti sa sekvencom nukleotida, ili SEQ ID NO: 6 ili 18.

[0017] Ovde su takođe data i monoklonska antitela. Monoklonska antitela mogu da imaju varijabilan lak lanac aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 10 ili 22, ili aminokiselinske sekvence sa najmanje 90 procenata identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 10 ili 22. Pored toga, data su i monoklonska antitela sa varijabilnim teškim lancem aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 4 ili 16, ili aminokiselinske sekvence sa najmanje 90 procenata identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 4 ili 16.

[0018] Ovde je, takođe, data izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koje od antitela na OX40 o kojima je pisano ovde. Pored toga, ovde su date i ćelije-domaćini, od kojih svaka sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira po neko od ovde opisanih antitela na OX40. Dati su i postupci dobijanja nekog antitela, (kao što su ćelija-domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira neko od ovde opisanih antitela na OX40), što obuhvata gajenje ćelija-domaćina, tako da se proizvodi antitelo, i/ili dobijanja datog antitela iz ćelije-domaćina.

KRATAK OPIS SLIKA

[0019] Da bi se postigao i detaljno shvatio način na koji su dobijene gorenavedene osobine, aspekti i prednosti ovog pronalaska, kao i ostalo što će se pojaviti, specifičniji opis kratko sumiran gore može se dobiti pozivanjem na njegove realizacije koje su ilustrovane slikama koje čine deo ove specifikacije. Međutim, treba napomenuti da priložene slike ilustruju neke od realizacija ovog pronalaska.

Sl. 1 pokazuje da su FOXP3+ Treg ćelije, infiltrirane u tkiva humanih folikularnih limfoma (FL) i kolokalizovane sa tumorskim B ćelijama i monocitima. Levo: Dvostruko imunobojenje FOXP3+ Treg ćelija (crveno) i CD20<+>B ćelija limfoma (zeleno); Desno: FOXP3<+>Treg ćelije (crveno) i CD11c+ monociti/makrofazi/DC (zeleno).

Sl. 2A i 2B pokazuju povećanje broja CD4+FOXP3<+>Treg ćelija kod pacijenata sa FL. Tumorske ćelije i PBMC dobijene su od šest pacijenata sa FL pri početnoj dijagnozi, pre terapije. Radi upoređivanja, PBMC su, takođe, dobijene i od šest normalnih donora. Procenti regulatornih T ćelija od ukupnih CD4<+>T ćelija određivan je analizom protočne citometrije CD4+CD25+CD127lowFOXP3+ Treg ćelija. Sl. 2A prikazuje reprezentativnu FACS analizu Treg ćelija. Od istog pacijenta podeljene su FL PBMC i FL tumorske ćelije. Sl.2B prikazuje procenat Treg ćelija svih donora. Horizontalni stubići ukazuju srednje vrednosti.

Sl. 3 prikazuje izolovanje ICOS+FOXP3+ ili ICOS-FOXP3+ Treg ćelija iz FL. Jednoćelijska suspenzija dobijena je od uzoraka slezine, pre bilo kog tretmana. Ćelije su otapane na dan analiziranja. T ćelije, obogaćene CD4<+>CD8-CD14-CD16-CD56-CD11c-TCRγδ<->ćelijama, podeljene su u CD25low i CD25high podgrupe. CD4+CD25highFOXP3+ Treg ćelije su dalje sortirane u ICOShigh i ICOSlow podgrupe na osnovu ekspresije ICOS na površini ćelija. U svim podgrupama određena je ekspresija FOXP3 u ćelijama.

Sl. 4 pokazuje da Treg ćelije unutar tumora inhibiraju proliferaciju CD4<+>CD25<->T ćelija koje se infiltriraju u FL, i da se ta inhibicija može delimično blokirati neutralizacionim antitelima na IL-10. CD4+CD25- T ćelije koje se infiltriraju u tumor, obeležene su CFSE-om i gajene sa ćelijama autolognog tumora, koje su prethodno aktivirane rekombinantnim CD40L, sa ili bez autolognih ICOS+FOXP3+ Treg ćelija, ili sa ICOS-FOXP3<+>Treg ćelijama, ili antitelom na IL-10 (10 µg/ml). Posle 72 sata gajenja, određivana je proliferacija CD4<+>CD25<->ćelija protočnom citometrijskom analizom razblaživanja CFSE.

Sl. 5A prikazuje intracelularnu analizu proizvodnje citokina u naivnim CD4+ T ćelijama protočnom citometrijom.

Sl. 5B prikazuje proizvodnju citokina od strane naivnih CD4+ T ćelija, određenu ELISA testom.

Sl. 5C prikazuje supresivnu funkciju Tr1 ćelija koje proizvode IL-10, određenu ugradnjom [3H]timidina.

Sl. 6A prikazuje intracelularnu analizu proizvodnje citokina od strane memorijskih CD4+ T ćelija određenu protočnom citometrijom.

Sl. 6B prikazuje proizvodnju IL-10 od strane memorijskih CD4+ T ćelija, određenu ELISA testom.

Sl. 7A prikazuje intracelularnu analizu proizvodnje citokina od strane naivnih CD4+ T ćelija određenu protočnom citometrijom.

Sl. 7B prikazuje proizvodnju IL-10 od strane naivnih CD4+ T ćelija, određenu ELISA testom.

Sl. 7C prikazuje broj izbrojanih vijabilnih T ćelija.

Sl. 8A prikazuje intracelularnu analizu proizvodnje citokina od strane naivnih CD4+ T ćelija određenu protočnom citometrijom.

Sl. 8B prikazuje proizvodnju IL-10 od strane naivnih CD4+ T ćelija, određenu ELISA testom.

Sl. 8C prikazuje intracelularnu analizu proizvodnje citokina od strane memorijskih CD4+ T ćelija određenu protočnom citometrijom.

Sl. 8D prikazuje proizvodnju IL-10 od strane memorijskih CD4+ T ćelija određenu ELISA testom.

Sl. 8E prikazuje intracelularnu analizu proizvodnje citokina od strane naivnih CD4+ T ćelija određenu protočnom citometrijom.

Sl. 8F prikazuje proizvodnju IL-10 od strane naivnih CD4+ T ćelija određenu ELISA testom.

Sl. 9 prikazuje proizvodnju IL-10 od strane regulatornih T ćelija određenu ELISA testom.

Sl. 10 prikazuje rezultate skrininga supernatanata hibridoma sa antitelom na humani OX40 na L-OX40 u odnosu na L roditeljske ćelije, određeno ELISA testom.

Sl. 11 prikazuje skrining monoklonskih antitela specifičnih za humani OX40, kako je određeno analizom protočne citometrije, uključujući i jednu realizaciju postupka iz ovog pronalaska.

Sl. 12 prikazuje potvrdu specifičnosti monoklonskih antitela na hOX40 korišćenjem SUPM2 ćelija koje eksprimiraju OX40 (SUPM2-OX40), uključujući i jednu realizaciju postupka iz ovog pronalaska.

Sl. 13 prikazuje monoklonska antitela specifična za OX40 koja mogu da inhibiraju stvaranje ćelija (Tr1) koje proizvode IL-10 od CD4<+>T ćelija stimulisanih vitaminom D3(0,1 µM)/Dex (50 nm), CD32L/ICOSL i antitelima na CD3/CD28 (0,2 µg/ml), uključujući i jednu realizaciju postupka iz ovog pronalaska. Na A su prikazani reprezentativni podaci sortiranja ćelija aktiviranih fluoresccencijom (FACS), a na B procenti ćelija koje proizvode IL-10 za sve tretmane monoklonskim antitelima na OX-40.

Sl. 14 prikazuje rezultate monoklonskih antitela specifičnih za hOX40 koja inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija, a stimulišu proliferaciju CD4<+>T ćelija, uključujući i jednu realizaciju postupka ovog pronalaska.

Sl. 15A, 15B, i 15C daje detalje titracije monoklonskih antitela za njihovu sposobnost da inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija od CD4<+>T ćelija, uključujući i jednu realizaciju postupka ovog pronalaska. Reprezentativni podaci FACS prikazani su na Sl.15A, a procenti Tr1 ćelija posle tretmana sa devet monoklonskih antitela na OX40 prikazani su na Sl.15B.

Sl. 16A, 16B, i 16C pokazuje da monoklonska antitela specifična za OX40 koja inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija koje proizvode IL-10 iz CD4<+>T ćelija, takođe, inhibiraju i poizvodnju IL-10 od strane ICOS+CD4+CD25highCD127-Treg ćelija i imunosupresivnu funkciju. Sveže izdvojene ICOS+CD4+CD25highCD127- Treg ćelije (ICOS<+>Treg) stimulisane su antitelima na CD3 (0,2 µg/ml) u prisustvu CD32L/ICOSL ćelija i CD32L/OX40L ćelija (Sl.16A) ili OX40 monoklonskim antitelima ili kontrolnim antitelom (SL. 16B) tokom pet dana. Ćelije su tada ponovo stimulisane antitelom na CD3/CD28 tokom 24 sata i supernatanti provereni na IL-10 testom pomoću imunosorbenta vezanog sa enzimom (enzyme-linked imunosorbent assay, ELISA). Sl. 16C je test za proliferaciju zasnovan na monocitima koji pokazuje da su od antitela dva blokirala funkciju ICOS<+>Treg ćelija.

Sl. 17A i 17B prikazuju identifikaciju monoklonskih antitela na hOX40 koja inhibiraju stvaranje Tr1 i blokiraju funkciju FOXP3+CD4+CD25high Treg ćelija, uključujući jednu realizaciju postupka ovog pronalaska. Na Sl. 17A prikazane su reprezentativne analize protočne citometrije. Na Sl.17B prikazani su podaci za šest monoklonskih antitela.

Sl. 18 pokazuje identifikovanje monoklonskih antitela na hOX40 koja ne inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija, ali blokiraju funkciju FOXP3<+>CD4<+>CD25<high>Treg ćelija.

Sl. 19A i 19B prikazuje agonistička antitela na hOX40 koja blokiraju funkciju CD4+CD25<high>Treg ćelija izvedenih iz limfoma. Na Sl. 19A prikazane su reprezentativne FACS analize, a podaci iz svih eksperimenata prikazani su na Sl.19B.

Sl. 20 pokazuje da monoklonska antitela na hOX40 mogu da se vežu za rezus CD4<+>T ćelije. Kao što je pokazano, šest od monoklonskih antitela na hOX40 mogu da se vežu za rezus aktivirane CD4+ T ćelije i vezaće se za rezus OX40 i aktivirati OX40 signaliziranje.

Sl. 21 prikazuje da se svako od Hu 106-222 Partija I i II antitela iz Primera I sastoji od teškog lanca molekulske težine oko 50 kD i lakog lanca molekulske težine oko 25 kD. Čistoća Hu106-222 Partija I i II antitela bila je veća od 95%.

Sl. 22 prikazuje analizu mišjih 106-122, Ch106 i Hu106-222 (Partija II) antitela u odnosu na vezivanje za L/OX40 ćelije (Primer I).

Sl. 23 opisuje šematsku strukturu ekspresionog vektora za Hu106 IgG1/kapa antitelo (ekspresioni vektor). Idući u smeru kazaljke na satu, od SalII mesta na vrhu, plazmid sadrži transkripcionu jedinicu za težak lanac, počev od prvog glavnog ranog promotora i enhancera (CMV promotor) citomegalovirusa (CMV) od koga otpočinje transkripcija gena za težak lanac antitela. Posle CMV promotora ide VH egzon, genomska sekvenca koja sadrži konstantan region gama-1 teškog lanca, uključujući CH1, zglob, CH2 i CH3 egzone sa intronima i mesto za poliadenilaciju posle egzona CH3. Posle sekvence gena za težak lanac, transkripciona jedinica za lak lanac počinje CMV promotorom, posle čega ide VL egzon i genomska sekvenca koja sadrži egzon konstantnog regiona (CL) kapa lanca čoveka sa delom introna koji mu prethodi i mestom za poliadenilaciju posle egzona CL. Posle gena za lak lanac dolazi rani promotor SV40 (SV40 promotor), gen za ksantin guanin fosforibozil transferazu (gpt) E. coli, i segment koji sadrži mesto za poliadenilaciju SV40 (mesto SV40 poly(A)). Najzad, plazmid sadrži deo plazmida pUC19, koji sadrži bakterijski start (oridžin) replikacije (pUC ori) i gen za beta laktamazu (beta laktamaza). Položaji relevantnih mesta delovanja restrikcionih enzima pokazana su na slici.

Sl. 24 prikazuje poređenja između antitela Hu 106-222 Partija I i II u vezivanju za L/OX40 ćelije (Primer I niže).

Sl. 25 pokazuje da se Hu119-122 sastoji od teškog lanca molekulske težine od oko 50 kD i lakog lanca molekulske težine od oko 25 kD. Čistoća Hu119 bila je veća od 95% (Primer II niže).

Sl. 26 prikazuje rezultat FACS analize ovde opisanih antitela Ch119-122 i Hu119-122 (Primer II niže).

Sl. 27 pokazuje da klon humanizovanog monoklonskog antitela na OX40, mAb klon 119-122 (Hu119), i njegovo antitelo sa mutiranim FcR vezivanjem (Hu119-AA), podstiču proliferaciju naivnih CD4+ T ćelija. Hu119-122 je davalo bolju stimulatorsku aktivnost T ćelija nego roditeljsko mišje monoklonsko antitelo na humani OX40 (mišji119-122). Međutim, himerno monoklonsko antitelo na humani OX40 (Ch119, mišji VH i VL, ali humani gama-1 i kapa konstantni regioni) nisu podsticali proliferaciju T ćelija.

Sl. 28 pokazuje da humanizovano antitelo na OX40 sa mutiranim FcR vezivanjem može da klonira 106-222 (Hu222AA) i klon 106-222 himernog mAb na humani OX40 (Ch222) podstiče proliferaciju naivnih T ćelija stimulisanu antitelom na CD3. Ova antitela imaju sličnu stimulatorsku aktivnost kao roditeljsko mišje monoklonsko antitelo na humani OX40 (mišji222). Međutim, potpuno humanizovano antitelo na humani OX40, Hu222, nije podsticalo proliferaciju T ćelija u poređenju sa humanim IgG1.

Sl. 29 A i B pokazuje da klon 119-122 humanizovanog i mišjeg monoklonskog antitela blokira supresivnu funkciju CD4+ Treg ćelija.

Sl. 30 daje podatke koji pokazuju da antitela na humani OX40 podstiču proliferaciju CD4<+>i CD8+ T ćelija primenom antitela vezanih za ploče.

Sl. 31 pokazuje da humanizovana i mišja antitela na humani OX40 zahtevaju unakrsno spajanje (cross-linking) da bi mogla da podstiču proliferaciju T ćelija.

Sl. 32 pokazuje da antitela na humani OX40 blokiraju aktivnost CD4+FOXP3<+>nTreg ćelija primenom antitela vezanih za ploče.

Sl. 33 pokazuje da visoke koncentracije mišjih antitela na humani OX40 pretežno ubijaju FOXP3+ Treg ćelije.

Sl. 34 pokazuje da mišja monoklonska antitela na humani OX40 deluju neposredno ili na efektorske T ćelije ili na nTreg ćelije da blokiraju supresivnu funkciju Treg ćelija.

Sl. 35A, 35B, i 35C pokazuju rezultate tretiranja tumora monoklonskim antitelom na hOX40 u miševima u koje su adoptivno transferovane hOX40<+>CD8<+>T ćelije. Monoklonsko antitelo na humani OX40 dovodi do ekspanzije T ćelija i preživljavanja in vivo. Režim terapeutske vakcinacije pokazan je na Sl.35A. Reprezentativne in vivo slike bioluminescencije prikazane su na Sl.35B. Rezultati tretiranja tumora antitelom prikazani su na Sl.35C.

Sl. 36 pokazuje poređenje aminokiselinskih sekvenci 106-222, humanizovanog 106-222 (Hu106), i humanog akceptora X61012 (pristupni broj GenBank). Prikazane su VH sekvence. Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Brojevi iznad sekvenci označavaju položaje prema Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Iste sekvence kao ovde navedene, date su i u Spisku sekvenci (Sequence Listing), a brojevi položaja mogu biti različiti. Na Sl. 36 sekvence CDR, kako su ih definisali Kabat et al. (1991), su podvučene u 106-222 VH. Na slici su izostavljene CDR amino kiseline u X61012 VH. U bazama podataka GenBank tražene su humane VH sekvence homologne 106-222 okvirima VH i kao akceptor za humanizovanje izabrana je VH sekvenca koju kodira humana X61012 cDNK (X61012 VH). Sekvence CDR 106-222 VH su prvo prenete u odgovarajuće položaje u X61012 VH. Sledeće, u položajima okvirnih regiona gde je trodimenzionalni model 106-222 varijabilnih regiona sugerisao značajan kontakt sa CDR-ovima, amino kiseline mišjeg 106-222 VH zamenjene su odgovarajućim humanim amino kiselinama. Ove supstitucije su izvršene na položajima 46 i 94 (podvučeni u Hu106 VH). Pored toga, amino kiselina humanog okvira, za koju je nađeno da je atipična za odgovarajući V region podgrupe zamenjena je najtipičnijom amino kiselinom da bi se smanjila potencijalna imunogenost. Ova supstitucija izvršena je na položaju 105 (dvostruko podvučeno u Hu106 VH).

Sl. 37 pokazuje poređenje aminokiselinskih sekvenci 106-222, humanizovanog 106-222 (Hu106), i humanog akceptora AJ388641 (pristupni broj GenBank) Prikazane su VL sekvence. Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Brojevi iznad sekvenci označavaju položaje prema Kabat et al. (1991). Iste sekvence kao ovde navedene, date su i u Spisku sekvenci, mada brojevi položaja mogu biti različiti. CDR sekvence, kako su ih definisali Kabat et al. (1), su u 106-222 VH podvučene. Na slici su izostavljene amino kiseline CDR iz AJ388641 VL. U bazama podataka GenBank tražene su humane VL sekvence homologne 106-222 okvirima VL i kao akceptor za humanizovanje izabrana je VL sekvenca koju kodira humana AJ388641 cDNK (AJ388641 VL). Sekvence CDR 106-222 VL su prvo prenete u odgovarajuće položaje u AJ388641 VL. Nisu vršene nikakve supstitucije u okvirnom regionu humanizovanog oblika.

Sl. 38 prikazuje sekvencu nukleotida VH gena Hu106 oivičenu restrikcionim mestima SpeI i HindIII (podvučeno) kao i izvedenu aminokiselinsku sekvencu. Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Sekvenca signalnog peptida je nakošena (italik). N-terminalna amino kiselina (Q) zrelog VH je dvostruko podvučena. CDR sekvence prema definiciji Kabata et al. (1991) su podvučene. Iste sekvence koje se zahtevaju ovde date su, takođe, i u Spisku sekvenci, a brojevi položaja u Spisku sekvenci mogu biti različiti. Sekvenca introna je nakošena. Fragment VH gena Hu106, obrađen enzimima SpeI i HindIII, ukloniran između odgovarajućih mesta u ekspresionom vektoru, prikazan je na Sl.23.

Sl. 39 prikazuje sekvencu nukleotida VL gena Hu106-222 oivičenu restrikcionim mestima Nhel i EcoRI (podvučeno) kao i izvedenu aminokiselinsku sekvencu. Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Sekvenca signalnog peptida je nakošena. N-terminalna amino kiselina (D) zrelog VL je dvostruko podvučena. Sekvence CDR, prema definiciji Kabata et al. (1991) su podvučene. Sekvenca introna je nakošena. Fragment VL gena Hu106, obrađen enzimima Nhel i EcoRI, ukloniran između odgovarajućih mesta u ekspresionom vektoru, prikazan je na Sl.23. Iste sekvence koje se zahtevaju ovde date su, takođe, i u Spisku sekvenci, mada brojevi položaja u Spisku sekvenci mogu biti različiti.

Sl. 40 prikazuje poređenje VH aminokiselinskih sekvenci 119-122, humanizovanog 119-122 (Hu119), i humanog akceptora Z14189 (pristupni broj u GenBank). Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Brojevi iznad sekvenci označavaju položaje prema Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). CDR sekvence prema definiciji Kabata et al. (1991) su podvučene u 119-122 VH. Na slici su izostavljene amino kiseline VH CDR u Z14189. Sekvence VH čoveka, homologne VH okvirnim regionima 119-122 tražene su u bazi podataka GenBank, i sekvenca VH koju kodira humana Z14189 cDNK (Z14189 VH) izabrana je za akceptora humanizacije. CDR sekvence 119-122 VH prvo su prenete u odgovarajuće položaje Z14189 VH. Zatim su, na položajima okvira gde je trodimenzionalni model varijabilnih regiona 119-122 sugerisao značajne kontakte sa CDR-ovima, amino kiseline u mišjem 119-122 VH zamenjene odgovarajućim humanim amino kiselinama. Kao što je pokazano na slici, ove zamene izvršene su na položajima 26, 27, 28, 30 i 47 (podvučeno u sekvenci Hu119 VH). Iste sekvence koje se zahtevaju ovde date su, takođe, i u Spisku sekvenci, a brojevi položaja u Spisku sekvenci mogu biti različiti.

Sl. 41 prikazuje poređenje VL aminokiselinskih sekvenci 119-122, humanizovanog 119-122 (Hu119), i humanog akceptora M29469 (pristupni broj u GenBank). Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Brojevi iznad sekvenci označavaju položaje prema Kabat et al. (1991). Sekvence CDR, definisane prema Kabat et al. (1) su podvučene u 119-122 VL. U sekvenci su izostavljene amino kiseline CDR VL u M29469. Humane VL sekvence homologne okvirnim regionima 119-122 VL tražene su u bazi podataka GenBank i sekvenca VL koju kodira humana M29469 cDNK (M29469 VH) izabrana je za akceptora humanizacije. CDR sekvence 119-122 VL prenete su u odgovarajuće položaje M29469 VL. U humanizovanom obliku nije bila potrebna zamena amino kiselina u okvirnom regionu. Iste sekvence koje se zahtevaju ovde date su i u Spisku sekvenci, mada brojevi položaja u Spisku sekvenci mogu biti različiti.

Sl. 42 prikazuje sekvencu nukleotida VH gena Hu119 oivičenu restrikcionim mestima SpeI i HindIII (podvučeno) kao i izvedenu aminokiselinsku sekvencu. Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Sekvenca signalnog peptida je nakošena. N-terminalna amino kiselina (E) zrelog VH je dvostruko podvučena. N-terminalna amino kiselina (E) zrelog VH je dvostruko podvučena. CDR sekvence prema definiciji Kabata et al. (1991) su podvučene. Sekvenca introna je nakošena. Fragment VH gena Hu119, obrađen restrikcionim enzimima SpeI i HindIII, ukloniran između odgovarajućih mesta u ekspresionom vektoru, prikazan je na Sl. 23. Iste sekvence koje se zahtevaju ovde date su, takođe, i u Listingu sekvenci, mada brojevi položaja u Listingu sekvenci mogu biti različiti.

Sl. 43 prikazuje sekvencu nukleotida VL gena Hu119 oivičenu restrikcionim mestima NheI i EcoRI (podvučeno), kao i izvedenu aminokiselinsku sekvencu. Ostaci amino kiselina označeni su po jednim slovom. Sekvenca signalnog peptida je nakošena. N-terminalna amino kiselina (E) zrelog VL je dvostruko podvučena. CDR sekvence prema definiciji Kabata et al. (1991) su podvučene. Sekvenca introna je nakošena. Fragment VL gena obrađen restrikcionim enzimima NheI i EcoRI, ukloniran između odgovarajućih mesta u ekspresionom vektoru, prikazan je na Sl. 23. Iste sekvence koje se zahtevaju ovde date su i u Spisku sekvenci, mada brojevi položaja u Spisku sekvenci mogu biti različiti.

DETALJAN OPIS

[0020] Termin „antitelo“ uključuje molekul imunoglobulina koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki težak lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantan region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki lak lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantan region lakog lanca sadrži jedan domen, CL. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti u hipervarijabilne regione, nazvane regioni određivanja komplementarnosti (CDRs), između kojih su konzervisaniji regioni, nazvani okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, poređanih počev od amino-kraja ka karboksi-kraju sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0021] Termin „deo za koji se vezuje antigen“ nekog antitela (ili „deo antitela“) uključuje fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za neki antigen (npr., hOX40). Pokazano je da funkciju antitela za vezivanje nekog antigena mogu obaviti i delovi celog antitela. Primeri fragmenata nekog antitela koji vezuju antigen, obuhvaćeni terminom „deo za koji se vezuje antigen“, uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragmenti, bivalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH2 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog od krakova antitela (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Osim toga, mada dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodiraju odvojeni geni, ovi geni se mogu spojiti primenom „rekombinantnih postupaka“, sintetičkom spojnicom (linker) što omogućuje da se sintetišu kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni sparuju i formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natal. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). I ova jednolančana antitela obuhvaćena su terminon „deo za koji se vezuje antigen“ nekog antitela. Takođe su obuhvaćeni i drugi oblici jednolančanih antitela, kao što su dijatela. Dijatela su bivalentna, bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani u jednom polipeptidnom lancu, ali korišćenjem spojnice koja je suviše kratka da bi omogućila sparivanje između dva domena na istom lancu, forsira se sparivanje domena sa komplementarnim domenom na drugom lancu, čime se stvaraju dva vezivna mesta za antigene (vidi, npr. Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Pored toga, antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, mogu biti deo većih imunoadhezionih molekula formiranih kovalentnim ili nekovalentnim udruživanjem antitela ili njegovog dela sa jednim ili više proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezionih molekula uključuju korišćenje središnjeg dela streptavidina za formiranje tetramernih molekula scFv (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) i upotrebu cisteinskog ostatka, marker peptida i polihistidinskog markera na C-kraju da bi se dobili bivalentni i biotinilovani scFv molekuli (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol.31:1047-1058), Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab')2fragmenti mogu se dobiti od celih antitela konvencionalnim tehnikama, kao što su digestija celih antitela papainom ili pepsinom. Osim toga, antitela, delovi antitela i imunoadhezioni molekuli mogu se dobiti primenom standardnih tehnika rekombinantne DNK, kao što je opisano ovde. Poželjni delovi koji vezuju antigen su celi domeni ili parovi domena.

[0022] OX40/OX40-ligand (receptor OX40)/(OX40L) je par kostimulativnih molekula kritičnih za proliferaciju T ćelija, preživljavanje, proizvodnju citokina i stvaranje memorijskih ćelija. Rani in vitro eksperimenti su pokazali da signaliziranje putem OX40 na CD4+ T ćelijama dovodi do razvoja TH2, ali ne i TH1. Ove rezultate podržavaju in vivo ispitivanja koja pokazuju da blokiranje interakcije OX40/OX40L sprečava indukciju i održavanje alergijskih imunskih reakcija koje se odvija pomoću TH2. Međutim, blokiranje interakcije OX40/OX40L poboljšava ili sprečava oboljenja u kojima posreduje TH1. Štaviše, pokazano je da davanje rastvorljivog OX40L ili prenos gena OX40L u tumore snažno podstiče antitumorski imunitet miševa. Nedavna ispitivanja, takođe, sugerišu da OX40/OX40L mogu da igraju ulogu u izazivanju imunskih odgovora posredovanih CD8 T ćelijama. Kao što se ovde razmatra, OX40 signaliziranje blokira inhibitornu funkciju CD4<+>CD25+ prirodno postojećih T regulatornih ćelija, a par OX40/OX40L igra kritičnu ulogu u globalnoj regulaciji perifernog imuniteta u odnosu na toleranciju.

[0023] Termini „Kabatovo numerisanje“, „Kabatove definicije“ i „Kabatovo obeležavanje“ ovde se koriste ravnopravno. Ovi termini, poznati u struci, odnose se na sistem numersanja aminokiselinskih ostataka koji su promenljiviji (tj. hipervarijabilni) od drugih aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca nekog antitela, ili u njegovom delu koji vezuje antigen. (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 and, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health i Human Services, NIH Publication No.91-3242).

[0024] Izraz „rekombinantno humano antitelo“ obuhvata humana antitela koja su pripremljena, eksprimovana, stvorena ili izolovana rekombinantnim postupcima, kao što su antitela koja se eksprimiraju pomoću rekombinantnog ekspresionog vektora kojim se transfektuje ćelija domaćina, antitela izolovana iz rekombinanta, kombinovane biblioteke humanih antitela, antitela izolovana iz neke životinje (npr, miša) transgene za imunoglobulinske gene čoveka (vidi npr., Tailor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela pripremljena, eksprimovana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji koristi obradu imunoglobulinskih gena čoveka u neke druge DNK sekvence. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz embrionalnih imunoglobulinskih sekvenci čoveka (vidi Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242).

[0025] „Izolovano antitelo“ podrazumeva neko antitelo koje je bitno oslobođeno od ostalih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje specifično vezuje hOX40 je bitno oslobođeno od antitela koja specifično vezuju antigene koji nisu hOX40). Izolovano antitelo koje specifično vezuje hOX40 može da veže molekule OX40 drugih vrsta. Osim toga, izolovano antitelo može biti oslobođeno drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0026] Termin „aktivnost“ podrazumeva aktivnosti kao što su specifičnost/afinitet antitela za neki antigen, na primer, antitelo na OX40 čoveka koje se vezuje za OX40 antigen, i/ili aktivaciona moć nekog antitela, na primer, antitela na OX40 čije vezivanje za hOX-40 receptor aktivira biološku aktivnost hOX40, ili aktivacija vezivanja receptora u testu za humane L/OX40 ćelije.

[0027] Termin „Koff“, kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu brzine disocijacije antitela iz kompleksa antitelo/antigen. complex. Termin „Kd“, kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena.

[0028] Izraz „rezonancija površinskog plazmona“ uključuje optičku pojavu koja omogućuje analizu tokom vremena (real-time) biospecifičnih interakcija detekcijom promena koncentracija proteina u biosenzornom matriksu, na primer, korišćenjem BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden i Piscataway, N.J.). Za dalje opise vidi Primer 5 i Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit.8:125-131; i Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

[0029] Termin „vektor“ podrazumva molekul nukleinske kiseline koji može da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedan tip vektora je „plazmid“, što se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu uvezati dodatni segmenti DNK. Drugi tip vektora je virusni vektor, gde se dodatni segmenti DNK mogu uvezati u virusni genom. Neki vektori se mogu autonomno replikovati u ćeliji-domaćinu u koju su ubačeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijski start replikacije i epizomski sisarski vektori). Drugi vektori (npr. neepizomski sisarski vektori) mogu se integrisati u genom ćelije-domaćina posle uvođenja u ćeliju-domaćina i tada se replikuju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, neki vektori mogu da dovedu do ekspresije gena za koji su operativno vezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „rekombinantni ekspresioni vektori“ (ili, jednostavno, „ekspresioni vektori“). Uglavom, ekspresioni vektori koji se koriste u tehnikama rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji „plazmid“ i „vektor“ se mogu ravnopravno koristiti, pošto je plazmid najčešće korišćen oblik vektora. Međutim, treba uključiti i druge oblike vektora, kao što su virusni vektori (npr., replikaciono defektni retrovirusi, adenovirusi i adeno-srodni virusi), koji imaju ekvivalentne funkcije.

[0030] Izraz „rekombinantna ćelija-domaćin“ (ili, jednostavno „ćelija-domaćin“) podrazumeva ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Treba znati da se ovi termini ne odnose samo na tu određenu ćeliju, nego i na potomstvo te ćelije. Pošto u sledećim generacijama može da dođe do izvesnih modifikacija, ili zbog mutacija ili zbog uticaja sredine, to potomstvo ne mora u stvari da bude identično roditeljskoj ćeliji, ali će ipak biti obuhvaćeno terminom „ćelija-domaćin“, kako se ovde koristi.

[0031] Termin „monoklonsko antitelo“ (monoklonsko antitelo) odnosi se na antitelo, ili populaciju sličnih antitela, dobijenih iz populacije suštinski homogenih antitela, i ne treba da bude protumačeno kao zahtev da se antitelo proizvede nekim specijalnim postpupkom, uključujući, ali i ne ograničavajući se njima, da monoklonska antitela mogu biti dobijena postupkom hibridoma, koji su prvi put opisali Kohler i Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975), ili postupcima rekombinantne DNK.

[0032] Termin „himerno antitelo“ (ili „himerni imunoglobulin“) odnosi se na molekul koji sadrži težak i/ili lak lanac, identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste, ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od neke druge vrste ili pripada nekoj drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost. (Cabilly et al. (1984), infra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81:6851).

[0033] Termin „humanizovano antitelo“ odnosi se na oblike antitela koja sadrže i sekvence antitela koja nisu ljudska (npr. mišjih) i antitela čoveka. Humanizovano antitelo može da sadrži konzervativne supstitucije amino kiselina ili neprirodne ostatke iz iste ili druge vrste koje ne menjaju značajno njegovu vezivnu i/ili biološku aktivnost. Takva antitela su himerna antitela koja sadrže minimalne sekvence imunoglobulina koji ne pripada čoveku. U većini slučajeva, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac) u kojima su amino kiseline iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) primaoca zamenjeni amino kiselinama iz CDR neke druge vrste (donorsko antitelo), kao što su miš, pacov, kamila, goveče, koza ili zec, koje imaju željene osobine. Osim toga, humanizovana antitela mogu da sadrže i amino kiseline koje se ne nalaze ni u primaocu, ni u unetim CDR, ni u okvirnim sekvencama. Ove modifikacije se vrše da bi se dalje poboljšale i maksimizovale performanse antitela. Stoga će, uglavnom, humanizovano antitelo sadržati ceo, ili skoro ceo, najmanje jedan, a u jednom aspektu dva, varijabilan domen u kome sve ili skoro sve, hipervarijabilne petlje odgovaraju petljama nehumanog imunoglobulina, a svi, ili skoro svi, FR regioni imaju sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo ćelija po potrebi sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), ili konstantan region humanog imunoglobulina (vidi, npr., Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent No. 0,125,023 B1; Boss et al., U.S. Pat. No. 4,816,397; Boss et al., European Patent No.0,120,694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., European Patent No.0,194,276 B1; Winter, U.S. Pat. No.5,225,539; Winter, European Patent No.0,239,400 B1; Padlan, E. A. et al., European Patent Application No. 0,519,596 A1; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 86:10029-10033).

[0034] Za svako od antitela opisanih ovde i u Zahtevima može se upotrebiti ili jednina ili množina, kao što su: „antitelo na OX40“; „antitelo na hOX-40“; „monoklonsko antitelo na hOX40“; „antitelo na humani OX40“; „antitelo na humani OX40 mAb“; „antitelo na hOX40 mAb“ „specifično monoklonsko antitelo na hOX40“; „antitelo na OX40L“; „antitelo na hOX40L“; „antitelo na humani OX40L“; „specifično antitelo na humani OX40“; „specifično monoklonsko antitelo na humani OX40“; „specifično antitelo na humani OX40“; „specifično antitelo na humani OX40“; „specifično monoklonsko antitelo na humani OX40“; „specifično antitelo na h-OX40“; „specifično monoklonsko antitelo na h-OX40“; „agonistično antitelo na hOX40“; „antagonist hOX40“ i/ili druge slične varijante ovog.

[0035] Kao što je izneto u U.S. Patent Application No.11/659,266 pod naslovom "Methods to Treat Disease States by Influencing the Signaling of OX-40-Receptors and High Throughput Screening Methods and Identifying Substrates Thereof", otkriveno je da je funkcija OX40L negativna regulacija stvaranja Tr1 ćelija indukovano imunosupresivnim agensima Dex i vit D3, ICOSL, ili nezrelim DCs. Ovo otkriće pokazuje opšti mehanizam kojim OX40L podstiče imunitet i prekida imunsku toleranciju.

[0036] Primenom imunohistološke analize (Sl. 1), intracelularnim bojenjem (Sl.2) i sortiranjem ćelija (Sl.3) mi smo pokazali da se i ICOS<+>Treg ćelije koje proizvode IL-10 i ICOS-TGF- β Treg ćelije infiltriraju u FL tkiva čoveka. Ove FOXP3<+>Treg ćelije, izvedene od FL, mogu snažno da inhibiraju proliferaciju FOXP3-CD4+CD25- T ćelija koje se infiltriraju u tumor u odgovoru na autologne limfoma ćelije prethodno aktivirane na CD40-ligand (Sl. 4). Supresorska aktivnost ICOS+ Treg ćelija može se delimično blokirati neutrališućim antitelom na IL-10, čime se potvrđuje uloga u FL Treg ćelija koje proizvode ICOS<+>IL-10 (Sl.4). U eksperimentu sa Sl.2, tumorske ćelije i PBMCS dobijeni su od 7 pacijenata sa početnim dijagnozama pre terapije. Radi upoređivanja, PBMC su takođe dobijeni i od 7 zdravih donora. Procenti regulatornih T ćelija u odnosu na ukupne CD4+ T ćelije određene su protočnom citometrijskom analizom CD4<+>CD25<+>CD127<low>FOXP3<+>Treg ćelija. Sl. 2A prikazuje reprezentativnu FACS analizu Treg ćelija, dok Sl. 2B pokazuje procenat Treg ćelija svih donora.

[0037] Takođe je otkriveno da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od CD4<+>T ćelija indukovanih pomoću Dex i vit D3. Poznato je da kombinacija imunosupresivnih lekova Dex i vit D3 uvek indukuje diferencijaciju naivnih CD4+ T ćelija u Tr1 ćelije. Da bi se ispitalo da li OX40L može da inhibira stvaranje i funkciju Tr1 ćelija, naivne CD4<+>T ćelije gajene su sa monoklonskim antitelima na CD3 plus CD28, sa i bez L ćelija transfektovanih sa OX40L pod četiri različita uslova gajenja, uključujući: (1) Tr1 (Dex i vit D3); (2) TH1 (IL-12); (3) TH2 (IL-4); ili (4) neutralne (samo medijum) tokom 7 dana (Sl. 5A). Količina IL-10 koju proizvode aktivirane (primed) T ćelije analizirana je intracelularnim bojenjem citokina i ELISA testom.

[0038] U eksperimentima na Sl. 5A, intracelularna analiza proizvodnje citokina koju daju naivne CD4+ T ćelije obavljena je protočnom citometrijom. Naivne T ćelije gajene su sa monoklonskim antitelima na CD3 i CD28 u prisustvu IL-2 na roditeljskim L ćelijama, ili OX40L-L ćelijama sa navedenim rekombinantnim citokinima ili reagensima tokom 7 dana. Procenti odgovarajućih T ćelija koje proizvode citokine ukazani su na svakom dot blot profilu. Rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od naivnih CD4<+>T ćelija indukovanih različitim polarizujućim signalima. Kao što je prikazano na Sl.5A, imeđu 2% i 4% Tr1 ćelija svoreno je od naivnih CD4<+>T ćelija gajenih u neutralnim ili TH1 ili TH2 uslovima. Više od 15% Tr1 stvoreno je u kulturi Dex plus vit D3. Dodavanje OX40L potpuno je blokiralo stvaranje Tr1 ćelija, dok je u svim uslovima gajenja dolazilo do stvaranja T ćelija koje proizvode TNF-α.

[0039] Ovi podaci su potvrđeni ELISA testom (Sl. 5B). U eksperimentima na Sl. 5B, količina citokina koju proizvode naivne CD4+ ćelije u supernatantima posle ponovne stimulacije monoklonskim antitelima na CD3 plus CD28 tokom 24h merena je testom ELISA. Naivne CD4+ T ćelije gajene su sa monoklonskim antitelima na CD3 plus CD28 u prisustvu IL-2 na roditeljskim L ćelijama ili OX40L-L ćelijama sa navedenim rekombinantnim citokinima ili reagensima tokom 7 dana. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) iz četiri nezavisna eksperimenta. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od naivnih CD4+ T ćelija indukovanih različitim polarizujućim signalima.

[0040] Naivne CD4+ T ćelije aktivirane (primed) Tr1 uslovima (Dex plus vit D3) bile su anergične i mogle su da suprimuju proliferaciju naivnih CD4+ T ćelija u odgovoru na monoklonska antitela na CD3 plus CDR28 (Sl. 5C). U eksperimentima na Sl. 5C, supresivna funkcija T ćelija merena je preko ugrađivanja [<3>H]timidina. Smeše navedenih populacija T ćelija ponovo su stimulisane monoklonskim antitelima na CD3 plus CD28. Stubići koji predstavljaju greške su SEM iz po tri ležišta. Otkriveno je da naivne CD4<+>T ćelije aktivirane istim Tr1 uslovima u prisustvu OX40L intenzivno proliferišu i nisu u stanju da inhibiraju proliferaciju naivnih CD4<+>T ćelija u odgovoru na monoklonska antitela na CD3 plus CD28. Podaci sugerišu da OX40L blokira stvaranje funkcionalnih Tr1 ćelija od naivnih CD4<+>T ćelija indukovanih pomoću Dex i vit D3.

[0041] Otkriveno je da se Tr1 ćelije mogu generisati iz memorijskih CD4<+>CD45RA-CD45RO<+>T ćelija i da OX40L može da inhibira stvaranje Tr1 ćelija iz memorijskih CD4<+>T ćelija. Memorijske CD4+CD45RA-CD45RO+ T ćelije gajene su 7 dana sa monoklonskim antitelima na CD3 plus CD28 sa ili bez L ćelija transfektovanih OX40L-om u Tr1 uslovima (Dex plus vit D3). U eksperimentima na Sl. 6A, intracelularna analiza količine citokina koju proizvode CD4<+>memorijske T ćelije obavljena je protočnom citometrijom. Memorijske CD4<+>CD45RO<+>CD25-memorijske T ćelije gajene su sa monoklonskim antitelima na CD3, CD28 i IL-2 na roditeljskim L ćelijama ili OX40L-L ćelijama, sa ili bez Dex plus vit D3, tokom 7 dana. Procenti odgovarajućih T ćelija koje proizvode citokine ukazani su na svakom dot blot profilu. Rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija iz memorijskih CD4<+>T ćelija pod uslovima sa Dex plus vit D3. Sl.6A pokazuje da se veliki broj Tr1 ćelija (>20%) stvara iz CD4<+>memorijskih T ćelija u kulturi sa Dex plus vit D3. Dodavanje OX40L potpuno blokira stvaranje Tr1 ćelija i izaziva stvaranje ćelija koje proizvode TNF-α od memorijskih CD4<+>T ćelija.

[0042] Sposobnost Dex plus vit D3 da izazovu memorijske CD4+ T ćelije da proizvode IL-10 i da ovu sposobnost može da inhibira OX40L, potvrđeni su IL-10 ELISA analizom. (Sl. 6B). U eksperimentima na Sl. 6B, količina IL-10 koju proizvode memorijske CD4<+>T ćelije merena je u supernatantima posle ponovne stimulacije monoklonskim antitelima na CD3 i CD28 tokom 24 sata ELISA testom. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM četiri nezavisna eksperimenta. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija iz memorijskih CD4<+>T ćelija pod uslovima sa Dex plus vit D3.

[0043] Osim toga, otkriveno je da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija, dok drugi članovi TNF-familije (GITRL i 4-1BBL) ne inhibiraju. U okviru TNF-superfamilije, OX40L, ligand TNF receptora indukovan glukokortikoidom (GITRL), i 4-1BB-ligand (4-1BBL) imaju kostimulativnu funkciju za T ćelije. Da bi se ispitalo da li je OX40L jedinstven za inhibiciju Tr1 ćelija, naivne CD4+ T ćelije gajene su sa monoklonskim antitelima na CD3 plus CD28 sa Dex plus vit D3, sa roditeljskim L ćelijama ili L ćelijama transfektovanim sa OX40L, GITRL, ili 4-1BBL tokom 7 dana. Dok su i OX40L i GITRL i 4-1BBL dovodili do stvaranja ćelija koje proizvode TNF-α, samo je OX40L inhibirao stvaranje Tr1 ćelija (Sl.7A i 7B).

[0044] U eksperimentima na Sl. 7A, intracelularna analiza proizvodnje citokina od strane naivnih CD4+ T ćelija izvršena je protočnom citometrijom. Naivne CD4<+>T ćeljene su sa monoklonskim antitelima na CD3, CD28 i IL-2, na roditeljskim L ćelijama, OX40L-L ćelijama, GITRL-L ćelijama, ili 4-1BBL-L ćelijama, u prisustvu Dex plus vit D3 tokom 7 dana. Procenti odgovarajućih T ćelija koje proizvode citokine ukazani su na svakom dot blot profilu. Ovi rezultati pokazuju da OX40L, ali ne i GITRL, ni 4-1BBL, inhibira stvaranje Tr1 ćelija.

[0045] U eksperimentima na Sl. 7B, IL-10 proizveden od strane naivnih CD4+ ćelija meren je u supernatantima posle ponovne stimulacije monoklonskim antitelima na CD3 i CD28 tokom 24 sata ELISA testom. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM iz četiri nezavisna eksperimenta. Ovi rezultati pokazuju da OX40L, ali ne i GITRL, ni 4-1BBL, inhibira stvaranje Tr1 ćelija.

[0046] I OX40L, i GITRL, i 4-1BBL dovode do ekspanzije ukupnog broja T ćelija (Sl. 7C). U eksperimentima sa Sl. 7C, brojan je broj vijabilnih T ćelija. Prikazani su podaci kao srednja vrednost ± SEM iz četiri nezavisna eksperimenta.

[0047] Kao što će stručnjaci shvatiti, rezultati na Sl. 7A, 7B, i 7C pokazuju da OX40L, ali ne i GITRL ni 4-1BBL, inhibira stvaranje Tr1 ćelija. Ovi rezultati sugerišu da od tri člana TNF-superfamilije za koje se zna da kostimulišu T ćelije, OX40L ima novu i jedinstvenu funkciju u inhibiranju generisanja Tr1 ćelija.

[0048] Pored toga, otkriveno je da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija indukovano ICOSL ili nezrelim DC. ICOS i CD28 predstavljaju dva pozitivna kostimulativna receptora u okviru CD28 familije eksprimovane na T ćelijama. Pokazano je da signalizacija putem ICOS agonističnh antitela ili ICOSL izaziva CD4+ T ćelije da proizvode IL-10. Da bi se ispitalo da li OX40L može da inhibira ICOS da indukuje poizvodnju IL-10 od strane CD4+ T ćelija, naivne i memorijske CD4<+>T ćelije gajene su sa antitelom na CD3 u prisustvu L ćelija transfektovanih ICOSL-om, ili L ćelija transfektovanih ICOSL-om u prisustvu OX40L tokom 7 dana.

[0049] U eksperimentima na Sl. 8A, intracelularna analiza proizvodnje citokina od strane naivnih CD4+ T ćelija izvršena je protočnom citometrijom. Naivne CD4<+>T ćelije gajene su 7 dana na roditeljskim L ćelijama, na smeši ICOSL-L ćelija i L ćelija, ili na smeši ICOSL-L ćelija i OX40L-L ćelija, koje su prethodno bile obložene monoklonskim antitelom na CD3. Procenti odgovarajućih T ćelija koje proizvode citokine ukazani su na svakom dot blot profilu. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od naivnih CD4<+>T ćelija indukovanih ICOSL-om.

[0050] U eksperimentima na Sl. 8B, IL-10 koji proizvode CD4+ ćelije meren je u supernatantima posle ponovne stimulacije monoklonskim antitelima na CD3 i CD28 tokom 24 sata testom ELISA. Naivne CD4+ T ćelije gajene su 7 dana na roditeljskim L ćelijama, na smeši ICOSL-L ćelija i L ćelija, ili na smeši ICOSL-L ćelija i OX40L-L ćelija, koje su prethodno bile obložene monoklonskim antitelom na CD3. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od naivnih CD4<+>T ćelija indukovanih ICOSL-om.

[0051] U eksperimentima na Sl. 8C, intracelularna analiza proizvodnje citokina od strane memorijskih CD4+ T ćelija izvršena je protočnom citometrijom. Memorijske CD4<+>T ćelije gajene su 7 dana na roditeljskim L ćelijama, na smeši ICOSL-L ćelija i L ćelija, ili na smeši ICOSL-L ćelija i OX40L-L ćelija, koje su prethodno bile obložene monoklonskim antitelom na CD3. Procenti odgovarajućih T ćelija koje proizvode citokine ukazani su na svakom dot blot profilu. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od memorijskih CD4<+>T ćelija indukovanih ICOSL-om.

[0052] U eksperimentima na Sl. 8D, IL-10 koji proizvode CD4+ ćelije meren je u supernatantima posle ponovne stimulacije monoklonskim antitelima na CD3 i CD28 tokom 24 sata testom ELISA. Memorijske CD4+ T ćelije gajene su 7 dana na roditeljskim L ćelijama, na smeši ICOSL-L ćelija i L ćelija, ili na smeši ICOSL-L ćelija i OX40L-L ćelija, koje su prethodno bile obložene monoklonskim antitelom na CD3. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od memorijskih CD4<+>T ćelija indukovanih ICOSL-om.

[0053] Rezultati eksperimenata na Sl. 8A, 8B, 8C, i 8D pokazuju da ICOSL značajno izaziva stvaranje Tr1 ćelija i od naivnih i od memorijskih CD4<+>T ćelija. Dodavanje OX40L u potpunosti inhibira stvaranje Tr1 ćelija i od naivnih i od memorijskih CD4<+>T ćelija, dok snažno izaziva stvaranje ćelija koje proizvode TNF-α.

[0054] Poznato je da nezreli DC ili DC tretirani IFN-α ili IL-10 mogu da indukuju naivne CD4<+>T ćelije da se diferenciraju u Tr1 ćelije. Ispitivano je da li OX40L može da inhibira stvaranje Tr1 ćelija indukovano DC-ovima. Kao što je pokazano na Sl. 8E, nezreli DC ili DC tretirani IL-10 ili IFN-α indukuju stvaranje više od 10 % Tr1 ćelija od naivnih CD4<+>T ćelija. Nasuprot tome, DC activirani CD40L-om indukuju snažan TH1 odgovor, koga prati stvaranje oko 3% Tr1 ćelija. Dodavanje rekombinantnog OX40L u kulture DC-T ćelija potpuno inhibira stvaranje Tr1 ćelija indukovanih nezrelim DC i DC tretiranih sa IL-10 i IFN-α. Pored toga, OX40L takođe inhibira stvaranje rezidualnog broja Tr1 ćelija indukovanih zrelim DC aktiviranim CD40L-om. U eksperimentima na Sl. 8E, intracelularna analiza proizvodnje citokina od strane naivnih CD4+ T ćelija izvršena je protočnom citometrijom. Naivne CD4<+>T ćelije su gajene zajedno, sa ili bez rastvorljivog rekombinantnog OX40L, 7 dana, sa nezrelim DC ili DC gajenim sa IFN-α, IL-10, i CD40L. Procenti odgovarajućih T ćelija koje proizvode citokine ukazani su na svakom dot blot profilu. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od naivnih CD4<+>T ćelija indukovanih DC-ovima.

[0055] Sposobnost OX40L da inhibira stvaranje Tr1 ćelija indukovano DC-ovima potvrđena je ELISA podacima (Sl.8F). U eksperimentima na Sl.8F, proizvodnja IL-10 od strane naivnih CD4+ ćelija merena je u supernatantima posle ponovne stimulacije monoklonskim antitelima na CD3 i CD28, tokom 24h, testom ELISA. Naivne CD4+ T ćelije su gajene zajedno, sa ili bez rastvorljivog rekombinantnog OX40L, 7 dana, sa nezrelim DC ili DC gajenim sa IFN-α, IL-10, i CD40L. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta. Ovi rezultati pokazuju da OX40L inhibira stvaranje Tr1 ćelija od CD4<+>T ćelija indukovanih DC-ovima. Tako, ovi podaci pokazuju da OX40L može da inhibira stvaranje Tr1 ćelija od naivnih CD4<+>T ćelija indukovanih sa više fizioloških signala koje daju ICOSL i DC.

[0056] Ranije je bilo sugerisano da regulatornih T ćelija ima u velikom broju u oblasti ne-Hočkinovog limfoma B ćelija i da B ćelije učestvuju u regrutovanju regulatornih T ćelija u oblast limfoma. Ispitivano je da li bi uticanje na signale za OX40-receptor, kao što je OX40L, mogli da daju terapiju protiv limfoma B ćelija. Za procenu sposobnosti OX40L da isključi Tr1 ćelije korišćeni su zamrznuti uzorci (Cryopreserved) B ćelija limfoma pacijenata. Upotrebljeni uzorci bili su folikularni limfomi dobijeni iz uzoraka slezine pre bilo kakvog lečenja. Ćelije su otopljene, pri čemu je 400×10<6>zamrznutih ćelija davalo 127×10<6>živih ćelija i 33,9×10<6>mrtvih ćelija (79% vijabilnosti). FACS bojenjem identifikovan je dovoljan broj CD25+ ćelija. U eksperimentima na Sl.

9, količina IL-10 sekretovana Treg ćelijama koje proizvode ICOS<+>IL-10 određena je ELISA testom. Treg ćelije su gajene pod dva različita uslova. U uslovu 1, CD25<+>/ICOS<+>ćelije gajene su sa antitelom na CD3, u prisustvu IL-2 (900 µl/ml) na roditeljskim L ćelijama ili OX40L-L ćelijama sa antitelom na ICOS, tokom 3-6 dana. U uslovu 2 CD25+/ICOS+ ćelije su gajene sa antitelom na CD3 u prisustvu IL-2 (900 µl/ml) na ICOS-L-L ćelijama ili smeši OX40L-L i ICOS-L-L ćelija tokom 3 do 6 dana. Proizvodnja citokina u supernatantima merena je ELISA testom. Rezultati pokazuju da OX40L u velikoj meri inhibira proizvodnju IL-10 od strane Treg ćelija.

[0057] Nalazi da OX40L ima sposobnost da inhibira stvaranje i funkciju Tr1 ćelija indukovanih imunosupresivnim lekovima Dex plus vit D3, ICOSL, ili DC, osvetljavaju nov mehanizam kojim OX40L izaziva imunost i ukida toleranciju tokom različitih oblika imunskih odgovora posredovanih CD4- ili CD8, kao što će shvatiti prosečni stručnjak. Sposobnost OX40L da inhibira stvaranje T1 ćelija i tokom odgovora TH1 indukovanog IL-12, i TH2 indukovanog IL-4 sugerišu da OX40L može da kontroliše jačinu imunskih odgovora posredovanih TH1 ili TH2. Pored toga, sposobnost OX40L da inhibira stvaranje Tr1 ćelija izgleda da je jedinstvena funkcija OX40L, pošto druga dva člana THF-familije, GITRL i 4-1BBL, nemaju ovu funkcionalnu osobinu. Štaviše, sposobnost OX40L da inhibira Treg ćelije da proizvode IL-10 identifikuje OX40L kao moćan tretman za limfome B ćelija i drugih oblika raka.

[0058] Identifikovani su mnogi molekuli koji izazivaju stvaranje T1 ćelija, uključujući IL-10, IFN-α, ICOSL, i imunosupresivna jedinjenja, kao što su Dex plus vit D3. OX40L predstavlja moćan inhibitor za stvaranje T1 ćelija, ne samo od naivnih CD4<+>T ćelija, već i od memorijskih CD4<+>T ćelija i regulatornih T ćelija. Ova nova osobina OX40/OX40L može da objasni nedavan izveštaj koji pokazuje da OX40L signaliziranje omogućuje anergičnim autoreaktivnim T ćelijama da steknu funkcije efektorskih ćelija. Stoga ciljanje OX40/OX40L daje tretman za alergijska i autoimunska oboljenja čoveka, a pruža i mogućnost razvoja tretmana humanih infektivnih oboljenja i karcinoma, uključujući, ali se i ne ograničavajući njima, melanome, rak mozga, rak kostiju, limfome, neoplazije izvedene od epitelnih ćelija (epitelni karcinomi), kao što je rak bazalnih ćelija, karcinome, adenokarcinome, gastrointestinalne karcinom, kao što su rak usana, rak usta, rak ezofaga, rak tankog creva i rak želuca, rak kolona, rak jetre, rak bešike, rak pankreasa, rak jajnika, rak grlića materice, rak pluća, rak dojke, i rak kože, kao što su rak skvamoznih ćelija i rak bazalnih ćelija, karcinom prostate, rak bubrežnih ćelija, i druge poznate oblike raka.

[0059] Poremećaji ili stanja koja se mogu sprečiti ili lečiti antitelima i ovde opisanim postupcima uključuju prevenciju ili tretiranje kancera, kao što su kutane promene kod leukemija, tumori glave i vrata, rak pankreasa, rak bešike, gliomi visokog stepena malignosti, metastaze u mozgu, melanomi, rak kože, rak pluća, rak dojke, rak prostate, rak kolona, leukemija, mijelodisplastični sindrom (stanje koje prethodi leukemiji), i multipli mijelomi. Uopšteno, metastaza bilo kog raka može se sprečiti ili lečiti ovde opisanim jedinjenjima i postupcima. Antitela se, takođe, mogu koristiti za sprečavanje proliferativnih angiogenih stanja, uključujući telangektaziju, venske angiome, hemangioblastome. Drugi poremećaji, oboljenja ili stanja uključuju virusna oboljenja, od kojih su neka tradicionalno smatrana „neizlečivim“. Antitela, na primer, se mogu takođe upotrebiti za klasifikaciju sojeva nekih patogena. Istraživači mogu da koriste neka od antitela opisanih ovde da identifikuju i prate specifične ćelije ili molekule u nekom organizmu.

[0060] Uopšteno, termini „rak“ i „kancerozni“ odnose se na, ili opisuju, fiziološko stanje kod sisara koje se tipično odlikuje nekontrolisanim rastom ćelija. Specifičnije, tipovi raka koji se mogu tretirati ili prevenirati korišćenjem bilo kog, ili više ovde opisanih antitela, ili neke njihove varijante, uključuju, ali se ne ograničavaju njima, karcinome, limfome, blastome, sarkome i leukemije. Specifičnije, primeri ovih oblika raka uključuju, ali se ne ograničavaju njima, rak skvamoznih ćelija, rak pluća, (uključujući mikrocelularni karcinom, nemikrocelularni karcinom, adenokarcinom pluća, i skvamozni karcinom pluća), rak peritoneuma, hepatocelularni rak, gastrični ili „stomačni“ rak (uključujući gastrointestinalni rak i gastrointestinalni stromalni rak), rak pankreasa, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak bešike,

hepatom, rak dojke, rak debelog creva, kolorektalni rak, karcinome endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačne žlezde, renalni rak ili rak bubrega, rak jetre, rak prostate, rak vulve, rak tiroidee, jetarne karcinome i različite tipove raka glave i vrata, melanome, površinske melanome, lentigo maligne melanome, akralni lentiginozni melanom, nodularne melanome, kao i limfome B ćelija (uključujući folikularni ne-Hočkinov (NHL) niskog stepena malignosti; NHL malih limfocita (SL); folikularni NHL srednjeg stepena malignosti; difuzni NHL srednjeg stepena malignosti; imunoblastni NHL visokog stepena malignosti; limfoblastni NHL visokog stepena malignosti; NHL malih nezarezanih ćelija visokog stepena malignosti; NHL velike tumorske mase; limfom mantle ćelija, limfome srodne AIDS-u; i Waldenstromovu makroglobulinemiju); hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL); akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL); leukemiju vlasastih ćelija, hroničnu mijeloblastnu lukemiju; i posttransplantacionu limfoproliferativnu bolest (PTLD), kao i abnormalnu vaskularnu proliferaciju udruženu sa fakomatozama, edeme (kao što su oni vezani za tumore mozga) i Meigsov sindrom.

[0061] Ovde su, takođe, dati i postupci za lečenje i prevenciju imunskih poremećaja. Ovi postupci sadrže načine davanja efikasne količine antitela subjektu kome je takav tretman potreban. U nekim vidovima, imunski poremećaj je imunski poremećaj ili je autoimunski poremećaj. Poremećaj je astma, atopijski dermatitis, alergijski rinitis, inflamatorno oboljenje creva, multipla skleroza, GVHD i/ili sistemski eritemski lupus. U nekim vidovima, poremećaj je oboljenje vezano za virus, bakterije ili neke druge infektivne agense.

[0062] Pored toga, antitela i postupci koji su ovde opisani, mogu se primeniti za sprečavanje ili lečenje zapaljenjskih oboljenja i stanja, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, i autoimunska oboljenja, kao što su lupus i mešana autoimunska oboljenja. Na primer, ovde opisana antitela mogu biti korisna u lečenju čitavog niza autoimunskih i zapaljenjskih oboljenja, uključujući i načine davanja terapeutski efikasne količine antitela subjektu kome je takav tretman potreban, gde je autoimunsko oboljenje ili zapaljenjsko oboljenje bilo koje, jedno ili više, od sledećih oboljenja: dijabetes melitus zavisan od insulina (IDDM), dijabetes melitus, multipla skleroza, eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis, akutan diseminovan encefalomijelitis, artritis, reumatoidni artritis, eksperimentalni autoimunski artritis, mijastenija gravis, tiroiditis, Hašimotova bolest, primarni miksedem, tirotoksikoza, perniciozna anemija, autoimunski atrofični gastritis, Adisonova bolest, prevremena menopauza, muška neplodnost, juvenilni dijabetes, Goodpasture-ov sindrom, pemfigus vulgaris, pemfigoid, simpatička oftalmija, fakogeni uveitis, autoimunska hemolitička anemija, idiopatska leukopenija, primarna bilijarna ciroza, aktivan hronični hepatitis Hbs-ve,kriptogena ciroza, ulcerozni kolitis, Sjogrenov sindrom, skleroderma, Wegenerova granulomatoza, poli/dermatomiozitis, diskoidni LE, sistemski eritemski lupus, Kronova bolest, psorijaza, ankilozni spondilitis, antifosfolipidni sindrom, aplastična anemija, autoimunski hepatitis, celijačna bolest, Gravesova bolest, Gilen-Bare-ov sindrom, (GBS), idiopatska trombocitopenična purpura, opsoklonus-mioklonus sindrom (OMS), optički neuritis, Ordov tireoiditis, pemfigus, poliartritis, primarna bilijarna ciroza, Reiterov sindrom, Takajasu temporalni arteritis, topla autoimuna hemolitička anemija, Wegenerova granulomatoza, univerzalna alopecija, Behcetova bolest, Čagasova bolest, sindrom hroničnog umora, disautonomija, endometrioza, Hidradenitis suppurativa, intersticijalni cistitis, neuromiotonija, sarkoidoza, skleroderma, ulcerozni kolitis, vitiligo, vulvodinija, inflamatorna oboljenja kože, alergijski kontaktni dermatitis, H. pylory gastritis, hronična nazalna inflamatorna oboljenja, arterioskleroza i bolest „kalem protiv domaćina“.

[0063] Specifičnije, „autoimunsko oboljenje“ kako se ovde navodi, je oboljenje ili poremećaj koji potiče od sopstvenih tkiva ili organa jedne osobe i usmeren je na njih, ili je ko-segregat ili njegova manifestacija ili stanje koje je proizašlo iz njega. Autoimunsko oboljenje može se odnositi na stanje koje nastaje zbog, ili je pogoršano time, antitelima koja proizvode B ćelije koja reaguju sa normalnim telesnim tkivima i antigenima. Takođe, autoimunsko oboljenje je ono koje može da dovede do sekrecije antitela specifičnog za neki epitop sopstvenog antigena (npr., nuklearnog antigena).

[0064] Autoimunska oboljenja ili bolesti koje se mogu lečiti i/ili sprečiti bilo kojim antitelima opisanim ovde, jednim ili više, uključuju, ali se ne ograničavaju njima, artritis (reumatoidni artritis, kao što je akutni artritis, hroničan reumatoidni artritis, giht ili gihtični artritis, akutni gihtični artritis, akutni imunološki artritis, hroničan zapaljenjski artritis, degenerativni artritis, kolagenom indukovani artritis tipa H, infektivan artritis, lajmski artritis, proliferativni artritis, psorijatični artritis, Stillova bolest, vertebralni artritis i juvenilni reumatoidni artritis, osteoartritis, hroničan progresivan artritis, deformišući artritis, primarni hroničan poliartritis, reaktivni artritis, i ankilozni spondilitis), zapaljenjska hiperproliferativna kožna oboljenja, psorijaza, kao što je plak psorijaza, gutatna psorijaza, pustulozna psorijaza i psorijaza noktiju, atopija, uključujući atopijska oboljenja kao što su polenska kijavica i Jobov sindrom, dermatitis, uključujući kontaktni dermatitis, hroničan kontaktni dermatitis, eksfolijativni dermatitis, alergijski dermatitis, alergijski kontaktni dermatitis, dermatitis herpetiformis, numularni ekcem, seboreičan dermatitis, nespecifičan dermatitis, primarni iritativni kontaktni dermatitis i atopijski dermatitis, hiper IgM sindrom vezan za X-hromozom, alergijska intraokularna zapaljenjska oboljenja, urtikarije kao što su hronična alergijska urtikarija i hronična idiopatska urtikarija, uključujući hroničnu autoimunsku urtikariju, miozitis, polimiozitis/dermatomiozitis, juvenilni dermatomiozitis, toksičnu epidermalnu nekrolizu, sklerodermu (uključujući sistemsku sklerodermu), skleroze kao što su sistemska skleroza, multipla skleroza (MS) kao što je spina-optička MS, primarna progresivna MS (PPMS) i relapsno remitentna MS (RRMS), progresivna sistemska skleroza, ateroskleroza, arterioskleroza, diseminirana skleroza, ataksična skleroza, optički neuromijelitis (NMO), zapaljenjsko oboljenje creva (IBD) (na primer, Kronova bolest, gastrointestinalna oboljenja posredovana autoimunitetom, kolitis, kao što su ulcerozni kolitis, mikroskopski kolitis, kolageni kolitis, polipozni kolitis, nekrotizujući enterokolitis, i transmuralni kolitis, i autoimunsko zapaljenjsko oboljenje creva), zapaljenje creva, pioderma gangrenosum, nodozni eritem, primarni sklerozni kolangitis, sindrom poremećenog disanja, uključujući sindrom akutnog respiratornog distresa odraslih (ARDS), meningitis, zapaljenje cele ili dela uvee, iritis, horoiditis, autoimunski hematološki poremećaj, reumatoidni spondilitis, reumatoidni sinovitis, hereditarni angioedem, oštećenje kranijalnog nerva kao u meningitisu, gestacijski herpes, gestacijski pemfigoid, pruritis skrotuma, autoimunska prevremena insuficijencija jajnika, nagli gubitak sluha zbog autoimunskog stanja, oboljenja koja posreduje IgE, kao što su anafilaksija, i alergijski i atopijski rinitis, kao što su Rasmusenov encefalitis i limbični encefalitis i/ili encefalitis moždanog stabla, uveitis, kao što su prednji uveitis, akutni prednji uveitis, granulomatozni uveitis, negranulomatozni uveitis, fakoantigeni uveitis, zadnji uveitis ili autoimunski uveitis, glomerulonefritis (GN) sa i bez nefrotskog sindroma, kao što je hroničan glomerulonefritis ili akutan glomerulonefritis, kao što je primarni GN, imunski posredovan GN, membranski GN (membranozna nefropatija), idiopatski membranozni GN ili idiopatska membranozna nefropatija, membrano- ili membrano-proliferativan GN (MPGN), uključujući Tip I i Tip II, i rapidno progresivni GN, proliferativni nefritis, autoimunska poliglandularna endokrinološka insuficijencija, balanitis, uključujući balanitis plazma ćelija, balanopostitis, prstenasti centrifugalni eritem, erythema dyschromicum perstans, erythema multiforme, anularni granulom, lišaj sa sitnim papulama, lichen sclerosus et atroficus, običan hroničan lišaj, lichen spinulosus, ravan lišaj, lamelarna ihtioza, epidermolitička hiprekeratoza, premaligna keratoza, gangrenozna pioderma, alergijska stanja i odgovori, alergijska reakcija, ekcemi, uključujući alergijske i atopijske ekceme, kserotičan ekcem, dihidrotičan ekcem i mehurasti palmoplantarni ekcem, astma, kao što su bronhijalna astma ili asthma bronchiale i autoimunska astma, stanja koja uključuju infiltriranje T ćelija i hronične zapaljenjske odgovore, imunske reakcije na strane antigene, kao što su fetalne krvne grupe A-B-O tokom trudnoće, hronično pulmonarno zapaljenjsko oboljenje, autoimunski miokarditis, nedostatak adhezije leukocita, lupus, uključujući lupus nefritis, lupus cerebritis, eritemski lupus kod dece, lupus koji nije renalan, vanbubrežni lupus, diskoidni lupus i diskoidni eritemski lupus, alopecia lupus, sistemski eritemski lupus (SLE), kao što su kožni SLE ili subakutni kožni SLE, neonatalni lupus sindrom (NLE) i diseminirani eritemski lupus, juvenilni dijabetes melitus (tipa I), uključujući pedijatrijski dijabetes melitus zavisan od insulina (IDDM), dijabetes melitus odraslih (dijabetes tipa II), autoimunski dijabetes, idiopatski dijabetes insipidus, dijabetesnu retinopatiju, dijabetesnu nefropatiju, dijabetesni poremećaj velikih arterija, imunske odgovore vezane za akutnu i odloženu hiperosetljivost posredovanu citokinima i T-limfocitima, tuberkulozu, sarkoidozu, granulomatozu, uključujući limfomatoidnu granulomatozu, Wegenerovu granulomatozu, agranulocitozu, vaskulitise, uključujući vaskulitis, vaskulitis velikih krvnih sudova (uključujući reumatsku polimijalgiju i arteritis džinovskih ćelija (Takayasu)), vaskulitis srednjih krvnih sudova (uključujući Kawasakijevu bolest i nodozni poliarteritis/nodozni periarteritis), mikroskopski poliarteritis, imunovaskulitis, CNS vaskulitis, kožni vaskulitis, hipersenzitivni vaskulitis, nekrotizirajući vaskulitis, kao što je sistemski nekrotizirajući vaskulitis i ANCA vaskulitis, kao što je Churg-Straussov vaskulitis ili sindrom (CSS) i ANCA vaskulitis malih krvnih sudova, temporalni arteritis, aplastična anemija, autoimunska aplastična anemija, Coombsova pozitivna anemija, Diamond-Blackfanova anemija, hemolitička anemija ili imunska hemolitička anemija uključujući autoimunsku hemolitičku anemiju (AIHA), pernicioznu anemiju (anemia perniciosa), Addisonovu bolest, anemiju čistih crvenih ćelija ili aplaziju (PRCA), nedostatak Faktora VIII, hemofiliju A, autoimunsku neutropeniju, pancitopeniju, leukopeniju, bolesti koje uključuju dijapedezu leukocita, CNS zapaljenjske poremećaje, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, sindrom povreda više organa, kao što su one koje nastaju kao posledica septikemije, trauma ili hemoragija, bolest posredovanu kompleksom antigen-antitelo, oboljenje koje uključuje antitela na glomerularnu bazalnu membranu, antifosfolipidni sindrom, alergijski neuritis, Behcetovu bolest /sindrom, Castlemanov sindrom, Goodpastureov sindrom, Reynaudov sindrom, Sjogrenov sindrom, Stivens-Džonsonov sindrom, pemfigoid kao što su bulozni pemfigoid i pemfigoid kože, pemfigus (uključujući pemfigus vulgaris, pemfigus foliaceus, pemfigus mukozne membrane, pemfigoid i pemfigus eritematozus), autoimunske poliendokrinopatije, Reiterova bolest ili sindrom, termička povreda, preeklampsija, poremećaji imunskog kompleksa, kao što su imunski kompleksi i nefritis, nefritis posredovan antitelom, polineuropatije, hronična neuropatija, kao što su IgM polineuropatije ili neuropatija posredovana IgM-om, trombocitopenija (kakva se razvija kod pacijenata sa infarktom miokarda, na primer), kao trombotična trombocitopenična purpura (TTP), post-transfuziona purpura (PTP), trombocitopenija izazvana heparinom i autoimunska ili imunski posredovana trombocitopenija, kao što je idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), uključujući hronični ili akutni ITP, skleritis kao što je idiopatski keratoskleritis, episkleritis, autoimunsko oboljenje testisa i jajnika uključujući autoimunski orhitis i ooforitis, primarni hipotiroidizam, hipoparatiroidizam, autoimunska endokrina oboljenja uključujući tiroiditis, kao autoimunski tiroiditis, Hašimoto bolest, hronični tiroiditis (Hašimoto tiroiditis), ili subakutni tiroiditis, autoimunsko tiroidno oboljenje, idiopatski hipotiroidizam, Grejvsova bolest, poliglandularni sindromi, kao što su autoimunski poliglandularni sindromi (ili poliglandularni endokrinopatski sindromi), paraneoplastični sindromi, uključujući neurološke paraneoplastične sindrome, kao Lambert-Eatonov miastenični sindrom ili Eaton-Lambertov sindrom, „stiff-man“ sindrom, encefalomijelitis, kao alergijski encefalomijelitis ili encephalomyelitis allergica i eksperimentalni alergijski encefalomijelitis (EAE), mijastenija gravis, kao mijastenija gravis vezana za timom, degeneracija malog mozga, neuromijotonija, opsoklonus ili opsoklonus-mioklonus sindrom (OMS) i senzorna neuropatija, multifokalna motorna neuropatija, Sheehan-ov sindrom, autoimunski hepatitis, hronični hepatitis, lupoidni hepatitis, hepatitis džinovskih ćelija hroničan aktivan hepatitis ili autoimunski hroničan aktivan hepatitis, limfoidni intersticijalni pneumonitis (LIP), bronhiolitis obliterans (netransplantatni) vs NSIP, Guillain-Barre sindrom, Bergerova bolest (IgA nefropatija), idiopatska IgA nefropatija, linearna IgA dermatoza, akutna febrilna neutrofilna dermatoza, subkornealna pustularna dermatoza, prolazna akantolitička dermatoza, ciroza, kao što je primarna bilijarna ciroza i pneumonociroza, sindrom autoimunske enteropatije, celijakija ili celijačna bolest, celijačni spru (glutenska enteropatija), refraktorni spru, idiopatski spru, krioglobulinemija, amilotrofna lateralna skleroza (ALS; Lou Gehrigova bolest), oboljenje koronarne arterije, autoimunsko oboljenje uva, kao što je autoimunsko oboljenje unutrašnjeg uva (AIED), autoimunski gubitak sluha, polihhondritis, kao što je refraktorni ili relapsni polihondritis ili polihondritis u relapsu, pulmonarna alveolarna proteinoza, Coganov sindrom/nesifilitičan intersticijalni keratitis, Belova paraliza, Sweetovo oboljenje/sindrom, autoimunska rozacea, bol vezan za zoster, amiloidoza, nekancerozna limfocitoza, primarna limfocitoza, koja uključuje monoklonsku limfocitozu B ćelija (npr., benignu monoklonsku gamopatiju i monoklonsku gamopatiju neodređenog značaja, MGUS), perifernu neuropatiju, paraneoplastičan sindrom, kanalopatije kao što su epilepsija, migrena, aritmija, mišićni poremećaji, gluvoća, slepilo, periodična paraliza, i kanalopatije CNS, autizam, zapaljenjska miopatija, fokalna ili segmentna ili fokalno segmentna glomeruloskleroza (FSGS), endokrina oftalmopatija, uveoretinitis, horioretinitis, autoimunski hepatološki poremećaj, fibromijalgija, višestruko otkazivanje endokrinih funkcija, Schmidt-ov sindrom, adrenalitis, gastrična atrofija, presenilna demencija, bolesti demijelinizacije, kao što su autoimunska oboljenja demijelinizacije i hronična zapaljenjska demijelinizaciona polineuropatija, Dressler-ov sindrom, alopecija areata, alopecija totalis, CREST sindrom (kalcinoza, Raynaudov fenomen, poremećaj pokretljivosti jednjaka, sklerodaktilija i teleangiektazija), autoimunska neplodnost muškaraca i žena, npr. zbog antitela na spermatozoide, mešana bolest vezivnih tkiva, Chagas-ova bolest, reumatska groznica, rekurentni abortusi, farmerska pluća, multiformni eritem, sindrom post kardiotomije, Kušingov sindrom, pluća ljubitelja ptica, alergijski granulomatozni angiitis, benigni limfocitni angiitis, Alportov sindrom, alveolitis, kao što je alergijski alveolitis i fibrozni alveolitis, intersticijalna bolest pluća, transfuzijska reakcija, lepra, malarija, parazitske bolesti, kao što je lajšmanijaza, tripanosomijaza, šistosomijaza, askarijaza, aspergiloza, Sampterov sindrom, aplanov sindrom, denga, endokarditis, fibroza endomiokarda, difuzna intersticijalna plućna fibroza, intersticijalna plućna fibroza, plućna fibroza, idiopatska plućna fibroza, cistična fibroza, endoftalmitis, oslabljeni dugotrajni eritem, fetalna eritroblastoza, eozinofilni faciitis, Shulman-ov sindrom, Felty-jev sindrom, filarijaza, ciklitis, kao što su hronični ciklitis, heterohronični ciklitis, iridociklitis (akutan ili hroničan), ili Fuchov ciklitis, Henoch-Schonleinova purpura, infekcija humanim imunodeficijentnim virusom (HIV), SCID, sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS), infekcija ekovirusom, sepsa, endotoksemija, pankreatitis, tirotoksikoza, infekcija parvovirusom, infekcija rubella virusom, post-vakcinacioni sindromi, kongenitalna infekcija rubella virusom, infekcija Epstein-Barr virusom, zauške, Evanov sindrom, autoimunsko otkazivanje gonada, Sydenham-ovas horeja, poststreptokokni nefritis, tromboangitis obliterans, tirotoksikoza, tabes dorsalis, horioiditis, polimijalgija džinovskih ćelija, hronični hipersenzitivni pneumonitis, keratokonjunktivitis sicca („suvo oko“), epidemijski keratokonjunktivitis, idiopatski nefritični sindrom, nefropatija minimalnih promena, benigna nasledna i ishemijsko-reperfuziona povreda, reperfuzija transplantiranog organa, autoimunost retine, upala zglobova, bronhitis, hronična opstruktivna bolest disajnih puteva/pluća, silikoza, afte, aftozni stomatitis, arteriosklerotični poremećaji, aspermatogeneza, autoimunska hemoliza, Boeck-ova bolest, krioglobulinemija, Dipitrenova kontraktura, fakoanafilaktièki endoftalmitis, alergijski enteritis, leprozni nodozni eritem, idiopatska facijalna paraliza, sindrom hroničnog umora, reumatska groznica, Hamman-Rich sindrom, senzoneuralni gubitak sluha, paroksizmalna hemoglobinurija, hipogonadizam, regionalni ileitis, leukopenija, infektivna mononukleoza, transverzalni mijelitis, primarni idiopatski miksedem, nefroza, simpatička oftalmija, granulomatozni orhitis, pankreatitis, akutni poliradikulitis, gangrenozna pioderma, De Quervain-ov tiroiditis, stečena atrofija slezine, nemaligni timom, vitiligo, sindrom toksičkog šoka, trovanje hranom, stanja koja uključuju infiltraciju T ćelija, nedostatak adhezije leukocita, imunski odgovori vezani sa akutnom i odloženom hipersenzitivnošću u kojima posreduju citokini i T limfociti, oboljenja koja uključuju dijapedezu leukocita, sindrom povreda više organa, oboljenja u kojima posreduju kompleksi antigen-antitelo, oboljenje koje uključuje antitela na glomerularnu bazalnu membranu, alergijski neuritis, autoimunske poliendokrinopatije, ooforitis, primarni miksedem, autoimunski atrofični gastritis, simpatička oftalmija, reumatske bolesti, mešana bolest vezivnog tkiva, nefrotički sindrom, insulitis, poliendokrini sindrom, autoimunski poliglandularni sindrom tipa I, idiopatski hipoparatiroidizam sa početkom u odraslom dobu (AOIH), kardiomiopatija kao što je dilatirana kardiomiopatija, stečena bulozna epidermoliza (EBA), hemohromatoza, miokarditis, nefrotski sindrom, primarni sklerozirajući holangitis, purulentan ili nepurulentan sinuzitis, akutan ili hroničan sinuzitis, etmoidalni, frontalni, maksilarni ili sfenoidni sinuzitis, poremećaj vezan za eozinofile, kao što je eozinofilija, pulmonalna infiltraciona eozinofilija, eozinofilija-mijalgija sindrom, Loflerov sindrom, hronična eozinofilna pneumonija, tropska plućna eozinofilija, bronhopneumonijska aspergiloza, aspergilom, ili granulomi koji sadrže eozinofile, anafilaksa, seronegativan spondiloartritis, poliendokrina autoimunska bolest, sklerozirajući holangitis, skleritis, episkleritis, hronična mukokutana kandidijaza, Brutonova bolest, prolazna hipogamaglobulinemija kod dece, Wiskott-Aldrich-ov sindrom, ataksija teleangiektazija, angiektazija, autoimunski poremećaji vezani za kolagenu bolest, reumatizam, neurološka bolest, limfadenitis, smanjen odgovor krvnim pritiskom, vaskularna disfunkcija, povreda tkiva, kardiovaskularna ishemija, hiperalgezija, renalna ishemija, cerebralna ishemija i oboljenje koje prati vaskularizaciju, poremećaji alergijske hipersenzitivnosti, glomerulonefritis, reperfuziona povreda, ishemijski reperfuzioni poremećaj, reperfuziona povreda miokardnog ili nekog drugog tkiva, limfomatozni traheobronhitis, zapaljenjske dermatoze, dermatoze sa akutnim zapaljenjskim komponentama, višestruko otkazivanje organa, bulozne bolesti, nekroza kore bubrega, akutni purulentni meningitis ili neki drugi zapaljenjski poremećaji centralnog nervnog sistema, okularni i orbitalni zapaljenjski poremećaji, sindromi vezani za granulocitnu transfuziju, toksičnost indukovana citokinima, narkolepsija, ozbiljna akutna upala, uporna hronična upala, pijelitis, intimalna hiperplazija, peptički ulkus, valvulitis i endometrioza.

[0065] Antitela koja su opisana ovde mogu imati čitav niz akademskih, medicinskih i komercijalnih primena. Antitela se mogu koristiti u različitim vrstama dijagnostičkih testova, na primer, za detektovanje mnogih oboljenja ili prisustva lekova (farmaceutskih proizvoda), toksina, ili drugih proteina, uključujući hormone, bilo in vitro bilo in vivo. Ovde opisana antitela mogu se koristiti za testiranje oboljenja, na primer, u serumu ili krvi pacijenata.

Oboljenje može da uključi bolesti vezane za OX40, ali i oboljenja ili indicije koji nisu vezani za OX40, uključujući različite vrste raka, zapaljenjska ili autoimunska oboljenja. Antitela se mogu, takođe, koristiti za radioimunsku detekciju i radioimunsku terapiju raka, a neki novi postupci testiranja mogu da iskoriste ova opisana antitela za ciljanje samo ćelijskih membrana specifičnih tipova ćelija, tj. raka.

[0066] Ovde opisana antitela mogu se učiniti delom nekog kompleta ili drugog dijagnostičkog paketa. U tom smislu ovde je dat dijagnostički komplet ili proizvedeni artikal za primenu u ovde iznetom postupku za prethodno tretiranje. Dijagnostički komplet može da sadrži jedno ili više od sledećih: referentni materijal antagonist/antitelo/lek; neutralno antitelo za pozitivnu kontrolu (poželjno kozje ili Cynomolgus majmuna); proteinsku A+G kolonu (tj., proteinsku A/G kolonu); reagens za uklanjanje lipida; imunoglobulinski afinitetni pufer(e) za prečišćavanje; (na primer, vezivni, elucioni i neutrališući pufer); serum sa komplementom; razblaživač ćelija za probu; priručnik sa uputstvima ili literaturu; fiole sa zamrznutim ćelijama (na primer, WIL2 ćelijama); reagens za obeležavanje ćelija (kao što je CELL TITER GLO.RTM.), itd. Primera radi, dijagnostički komplet može da sadrži, ali nije ograničen ovim: (a) reagens za uklanjanje lipida; (b) pufere (npr. vezivni i elucioni pufer) za afinitetno prečišćavanje imunoglobulina; i (c) priručnik sa uputstvima za korisnike dijagnostičkog kompleta koje upućuju korisnika dijagnostičkog kompleta kako da koristi komplet za tretiranje biološkog uzorka nekog autoimunskog oboljenja ili osobu sa kancerom pre izvođenja biološke probe zasnovane na ćelijama (kao što je proba sa neutrališućim antitelom) na datom uzorku (npr. da se izbegne problem interferencije seruma). Dijagnostički komplet po potrebi sadrži i neki, ili više: reference za lek, pozitivnu kontrolu sa neutrališućim antitelom, serum sa komplementom, razblaživač ćelija za probu; reagens za obeležavanje ćelija, itd.

[0067] Antitela i druga ovde opisana otkrića takođe daju i visoko efikasne postupke skrinovanja. Specifičnije, kao što će shvatiti prosečni stručnjaci, omogućeno je i stvaranje visoko efikasnih postupaka za pretragu antagonističnih ili agonističnih monoklonskih antitela ili malih molekula koji se vezuju za receptore OX40 i koji mogu da inhibiraju stvaranje i funkciju Tr1 ćelija ili da izazovu stvaranje i funkciju Tr1 ćelija. U jednom takvom postupku, linija humanih T ćelija (SU-DHL-1) koja ima sposobnost da proizvodi IL-10 bila je transfektovana humanim genom za OX40 (SUOX40). 100 000 SUOX40 ćelija je gajeno u pločama sa 96 ležišta, ili sa 100 000 mišjih fibroblastnih ćelija (L ćelije) ili 100000 mišjih fibroblastnih ćelija koje eksprimiraju humani OX40 ligand (OX40-ligand L ćelije). Posle 48 sati gajenja, supernatanti kultura su sakupljeni za merenje IL-10 pomoću ELISA testa specifičnog za IL-10. U reprezentativnom eksperimentu, 100 000 SUOX40 ćelija proizvodile su do 6000 pg/ml IL-10 kada su gajene bez OX40 liganda. U prisustvu OX40 liganda, 100 000 SUOX40 ćelija proizvodile su manje od 1 000 pg/ml IL-10. Ovaj postupak gajenja može se primeniti za pretragu, inter alia, antagonističnih monoklonskih antitela ili malih molekula koji blokiraju sposobnost OX40-liganda da inhibira SUOX40 ćelije da proizvode IL-10. Alternativno, ovaj postupak gajenja može se modifikovati zamenom L ćelija koje eksprimiraju OX40-ligand potencijalnim agonističnim monoklonskim antitelima ili malim molekulima specifičnim za OX40 da bi se odredila, inter alia, njihova sposobnost da inhibiraju SUOX40 da proizvode IL-10.

[0068] Ovde opisana antitela na OX40 mogu se upotrebiti kao proba ili za testiranje ili merenje aktivnosti nekog leka ili drugog molekula koji je nađen u organizmu ili organskom uzorku. Ona se, takođe, mogu upotrebiti u nekoj kvantitativnoj probi za merenje količine neke supstance u uzorku. Biološke probe i imunske probe su neke od mnogih vidova specijalizovanih biohemijskih proba u kojima se ova antitela mogu upotrebiti. Antitela na OX40 o kojima je pisano ovde mogu se koristiti u drugim probama za merenje procesa, kao što su enzimska aktivnost, zarobljavanje antigena, aktivnost stem ćelija i kompetitivno vezivanje proteina.

[0069] L ćelije koje eksprimiraju humane GITRL, OX40L, 4-1BBL, ICOSL stvorene su transdukcijom pomoću virusa, kao što će shvatiti stručnjaci. Ukratko, potpune sekvence koje kodiraju humane GITRL (Pristupni # NM_005092), OX40L (Pristupni # NM_003326), 4-1BBL (Pristupni # NM_003811), ICOSL (Pristupni # NM_015259) umnožene su pomoću RT-PCR sa RNK dobijenom iz PBMC stimulisanih HSV-1-om. Zatim su cDNK klonirane u retroviusnom vektoru pMIGW2, baziranom na MSCV i nastali plazmidi provereni digestijom restrikcionim enzimima i sekvenciranjem DNK. Da bi se dobio rekombinantni retrovirus, HEK293T ćelije su kotransfektovane svakim od vektora sa konstruktima za pakovanje pCL-gp (gag/pol) i pHCMV-VSVg (VSV glikoproteinski omotač). Posle dva dana, pokupljeni su supernatanti kultura koje sadrže virus i upotrebljeni za infekciju CD32 L ćelija at moi 100. Pod ovim uslovima produktivno je transdukovano >95% ćelija.

[0070] Izolovani CD14+ monociti (čistoće >94%) gajeni su u prisustvu 100 ng/ml GM-CSF i 50 ng/ml IL-4 (oba od R&D) 5 dana, kao što će znati stručnjaci. Nastale nezrele DC oprane su i gajene 24 sata sa IFN-α (1000U/ml, PBL Biomedical Laboratories), IL-10 (10 ng/ml, R&D), i ozračenim L ćelijama transfektovanim sa CD40L, (odnos DC prema L ćelijama 4:1), da bi se dobile zrele DC, kao što će znati stručnjaci.

[0071] Naivne CD4+ T ćelije i memorijske CD4<+>T ćelije (svaka čistote >99%) izolovane su iz PBMC pomoću CD4<+>T cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) posle čega su podvrgnute ćelijskom sortiranju (CD4+CD45RA+CD45RO-CD25-frakcija kao naivne T ćelije i CD4<+>CD45RA-CD45RO+CD25-frakcija kao memorijske T ćelije), kao što će znati stručnjaci. 4x10<4>sveže prečišćenih alogenih naivnih CD4+ T ćelija gajeno je u istoj kulturi sa nezrelim ili gajenim u kulturi DC (odnos DC prema T 1:10) sa ili bez rekombinantnog humanog OX40L (R&D, 100 ng/ml) u pločama sa 96 ležišta zaobljenog dna, tokom 7 dana, kao što će znati stručnjaci. Prečišćene CD4<+>T ćelije su gajene i sa IL-12 (10 ng/ml, R&D), IL-4 (25 ng/ml, R&D), ili sa kombnacijom dksametazona (5x10-8 M, Life Technologies) i 1alfa,25-dihidroksivitamina D3 (10-7 M) 7 dana u prisustvu rastvorljivog monoklonskog antitela na CD28 (CD28.2, 1 µg/ml) i IL-2 (50 U/ml, R&D) na ozračenim CD32/OX40L-L ćelijama, CD32/GITRL-L ćelijama, CD32/4-1BBL-L ćelijama, ili roditeljskim CD32-L ćelijama koje su bile prethodno obložene monoklonskim antitelom na CD3 (OKT3, 0,2 µg/ml) u pločama za kulture sa 48 ležišta (odnos T ćelija prema L ćelijama 2,5:1), kao što će znati stručnjaci. U nekim, eksperimentima, CD<4+>T ćelije su gajene 7 dana na CD32-L ćelijama, smeši CD32-L ćelija i CD32/ICOSL-L ćelija (odnos 1:1), ili smeši CD32/ICOSL-L ćelija i CD32/OX40L-L ćelija (odnos 1:1) prethodno obloženih monoklonskim antitelom na CD3 (0,2 µg/ml) u pločama za kulture sa 48 ležišta, kao što će znati stručnjaci. Korišćen je RPMI 1640 kome je za kulture dodato 10% FCS, 2 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, penicilin G, i streptomicin, kao što će znati stručnjaci.

[0072] T ćelije iz kultura sakupljene su i oprane, a zatim ponovo stimulisane antitelom na CD3 (5 µg/ml) i rastvorljivim antitelom na CD28 (2 µg/ml) vezanim za ploče, pri koncentraciji od 1x10<6>ćelija/ml, tokom 24 h, kao što će znati stručnjaci. Nivoi IL-4, IL-10, TNF-α, i IFN-α u supernatantima mereni su ELISA testom (svi kompleti od R&D), kao što će znati stručnjaci. Za proizvodnju intracelularnog citokina, T ćelije u kulturi ponovo su stimulisane sa 50 ng/ml PMA plus 2 µg/ml jonomicina tokom 6 sati. Dva sata pre kraja dodat je brefeldin A (10 µg/ml), kao što će znati stručnjaci. Ćelije su obojene kombinacijom PE, obeleženog monoklonskim antitelima na IL-4, ili TNF-α FTTC obeleženih monoklonskim antitelima na IFN-α i APC obeleženog monoklonskim antitelima na IL-10 (sve od BD) korišćenjem FIX i PERM kompleta (CALTAG), kao što će znati stručnjaci.

[0073] T ćelije su sakupljene i resuspendovane u medijumu koji sadrži EDTA da bi se disosovale grupe ćelija, kao što će znati stručnjaci. Vijabilne ćelije su brojane uz isključivanje mrtvih ćelija bojenjem sa tripan plavim, kao što će znati stručnjaci. Za probu supresivne funkcije, naivne CD4<+>T ćelije (A) i Tr1 ćelije generisane od naivnih CD4<+>T ćelija monoklonskim antitelom na CD3, monoklonskim antitelom na CD28, IL-2, Dex, i vit D3 u prisustvu roditeljskih L ćelija (B) ili OX40L-L ćelija (C), ova tri tipa ćelija i njihove smeše u odnosu 1:1 ponovo su stimulisane tokom 5 dana gajenja u prisustvu 5 µg/ml monoklonskog antitela na CD3 i 1 µg/ml monoklonskog antitela na CD28, posle čega je proliferacija ćelija merena preko ugradnje [<3>H]timidina, kao što će znati stručnjaci.

Stvaranje monoklonskih antitela specifičnih za humani OX40

[0074] Mi smo generisali više mišjih agonističnih monoklonskih antitela na humani OX40. Da antitela specifično vezuju dati antigen dokazano je protočnom citometrijom (Sl. 10-12). Agonistična aktivnost antitela potvrđena je funkcionalnim probama. Našli smo da devet od 20 antitela specifičnih za OX40 mogu da blokiraju stvaranje Tr1 ćelija od CD4<+>T ćelija posredovano vitaminom D3/deksametazonom (Sl. 13), podstaknu proliferaciju CD4+ T ćelija (Sl. 14), i suprimuju ICOS+CD4+CD25highFOXP3+ Treg u proizvodnji IL-10 (Sl. 16). Titrovali smo antitela i našli da njih pet ima snažnu aktivnost u suprimovanju stvaranja Tr1 ćelija čak i pri tako niskim koncentracijama kao što je 4 ng/ml (Sl.15).

Antitela na OX40 inhibiraju funkciju Treg CD4+CD25highFOXP3+

[0075] Neka od monoklonskih antitela na OX40 inhibiraju supresivnu funkciju FOXP3+ Treg (Sl.

17). Od pet antitela (119-8B, 119-43, 119-122, 119-173B, i 106-222) koja očito inhibiraju Tr1 ćelije da proizvode IL-10 i CD4<+>CD25<high>CD127-FOXP3<+>Treg ćelije, tri (119-43, 119-122, i 106-222) su mogla snažno da blokiraju funkciju CD4<+>CD25<high>CD12TFOXP3<+>Treg (Sl.17), Međutim, dva (119-33 i 120-140A) od 11 antitela ne ispoljavaju aktivnost protiv proizvodnje IL-10, ali blokiraju funkciju CD4+CD25highFOXP3+ Treg (Sl.18).

Monoklonska antitela na humani OX40

[0076] Stvaranje monoklonskih antitela na humani OX40 obavljeno je, na primer, imunizovanjem BALB/c miševa starih 6-8 nedelja mišjom ćelijskom linijom transfektovanom humanim OX40 prema ustaljenim protokolima. Ustanovljeni su klonovi hibridoma koji sekretuju monoklonsko antitelo koje specifično boji OX40<+>ćelije i dalje analizirani.

[0077] Dizajnirali smo iscrpno skrinovanje da detektujemo klonove koji započinju signaliziranje OX40 (t.j., agonistična antitela) inhibiranjem stvaranja i funkcije Tr1 ćelija. Ti klonovi su dalje prečišćavani. Agonistična antitela na hOX40 mogu se humanizovati i koristiti u kliničkim protokolima za antitumorsku terapiju ljudi, ili samostalno ili u kombinaciji sa antitumorskom vakcinacijom i drugim adjuvansima. Nekoliko različitih tipova tumora mogu da budu ciljani ovim antitelima, uključujući melanome, limfome i kancer dojke.

[0078] U jednom drugom obliku, upotrebljene su ženke BALB/c miševa stare 6-8 nedelja za imunizaciju u šapu ili subkutano. Svaki miš je injektiran sa 5 miliona mišjih L ćelija transfektovanih humanim OX40 (L-OX40), 6 puta u intervalima od po 3 dana. Tri dana posle šeste injekcije miševi su žrtvovani i izvađeni su im potkoleni limfni čvorovi (iz imunizovanih u šape) ili slezine (iz onih subkutano imunizovanih) i ćelije su fuzionisane sa SP2.0 mijelomom ili NSO mijeloma ćelijama u odnosu 1 prema 1 da bi se napravili klonovi hibridoma primenom ustaljenih protokola. Klonovi hibridoma koji sekretuju monoklonsko antitelo su zatim pretraženi ELISA testom u odnosu na specifičnost njihovog vezivanja za L-hOX40 ćelije. Dalje je potvrđeno citometrijskom protočnom analizom da se supernatanti hibridoma koji se vezuju za L-hOX40 ćelije, a ne i L roditeljske ćelije, vezuju za L-hOX40 i SUPM2-hOX40 ćelije.

[0079] U eksperimentu sa Sl.10, supernatanti hOX40 hibridoma pretraženi su ELISA testom na L-hOX40 versus L roditeljske ćelije. Selektovano je dvadeset monoklonskih antitela specifičnih za hOX40. Dvadeset miliona L ćelija ili L ćelija koje eksprimiraju humani OX40 (L-hOX40) obložene su na ploči sa 96 ležišta mešanjem ćelija sa 0,01% magnezijum kalcijum hloridom u PBS i ostavljeno da se suši preko noći u laminarnom aspiratoru (kapeli). Ploče su zatim zamrznute na -20°C najmanje jedan dan pre upotrebe. Za probe sa vezivanjem antitela, zamrznute ćelije su rehidrirane u PBS i isprane puferom za pranje koji sadrži PBS plus 0,05% Tween 20, i blokirane 2%-nim BSA u puferu za pranje. Kondicionirane ćelije su zatim korišćene za vezivanje supernatanata antitela na OX40. Vezivanje antitela za ćelije detektovano je zatim pomoću sekundarnog antitela na mišji IgG FC HRP. Supernatanti hibridoma specifičnih za hOX40 prepoznaju L ćelije koje eksprimiraju OX40, ali ne i roditeljske ćelije

[0080] U eksperimentu na Sl. 11, monoklonska antitela specifična na hOX40 pretražena su analizom protočne citometrije. Jednak broj (100k) L ćelija i L-hOX40 pomešan je u FACS puferu (1% FCS/2mM EDTA/PBS) i inkubiran sa 0,5 µg FPLC (Protein A HiTrap/Gentle Ag/Ab elucioni pufer) prečišćenih antitela. Ćelije su zatim oprane i obojene sekundarnim antitelom, antitelom na mišji IgG konjugovan sa PE. Dva maksimuma pokazuju pozitivno i negativno bojenje monoklonskim antitelom na hOX40. Samo jedan maksimum sugeriše da nema vezivanja antitela ili da nije specifično. Analizom protočne citometrije potvrđeno je dvadeset specifičnih monoklonskih antitela.

[0081] U eksperimentu na Sl 12, specifičnost monoklonskih antitela na hOX40 potvrđena je korišćenjem SUPM2 ćelija koje eksprimiraju hOX40 (SUPM2-hOX40). Jednak broj (100k) SUPM2 i SUPM2-hOX40 ćelija pomešan je u FACS puferu (1%FCS/2mM EDTA/PBS) i korišćen za vezivanje hOX40 monoklonskih antitela kao na Sl. 11. Specifičnost vezivanja analizirana je protočnom citometrijom. Dva maksimuma ukazuju na pozitivno i negativno bojenje monoklonskim antitelom na hOX40, dok samo jedan maksimum sugeriše da nema vezivanja antitela ili da ono nije specifično. Ponovo je potvrđeno da ima dvadeset monoklonskih antitela specifičnih za hOX40.

[0082] U eksperimentu na Sl. 13, hteli smo da identifikujemo specifična monoklonska antitela na humani OX40 koja mogu da inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija od CD4<+>T ćelija stimulisano VitD3(10 mikromola mM)/Dex (50 nanoM), CD32L/ICOSL i antitelom na CD3/CD28 (0,2 mikrogram/ml). Monoklonska antitela na hOX40 dodata su u kulturu 0. dana gajenja, a 7. dana posle stimulisanja, CD4+ T ćelije podvrgnute su intracelularnom bojenju i sa IL-10, posle čega su analizirane protočnom citometrijom. Podaci reprezentativnog sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS) prikazani su na A, a procenti Tr1 ćelija za sva tretiranja monoklonskim antitelima na hOX40 prikazani su na B. Korišćenjem ćelija dobijenih u ovom eksperimentu želeli smo da identifikujemo monoklonska antitela specifična za hOX40, koja stimulišu proliferaciju CD4<+>T ćelija (Sl.14, ćelije su brojane 7. dana stimulacije) i inhibiraju stvaranje Tr1 od CD4<+>(Sl.13).

[0083] Da bi se identifikovala hOX40 monoklonska antitela sa sposobnošću inhibiranja stvaranja Tr1 ćelija od CD4<+>T ćelija, Tr1 ćelije su generisane i gajene kao što je opisano gore u eksperimentima na Sl. 13. Reprezentativni FACS podaci prikazani su na A, a procenti Tr1 ćelija posle tretmana sa devet monoklonskih antitela na hOX40 prikazani su na B. Pet monoklonskih antitela specifičnih za hOX40 snažno inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija pri koncentracijama od 4 ng/ml (Sl. 15).

[0084] U eksperimentu na Sl. 16A, 16B, i 16C, sveže sortirane ICOS<+>CD4<+>CD127-CD25<high>T ćelije stimulisane su antitelima na CD3 (0,2 µg/ml) u prisustvu CD32L/ICOSL ćelija i CD32L/hOX40L ćelija ili monoklonskih antitela na hOX40 ili kontrolnih antitela, tokom 5 dana. Zatim su ćelije izbrojane i 5 x 10<4>ćelija je ponovo stimulisano antitelima na CD3/CD28 tokom 24 sata i supernatanti su provereni Elisa kompletom na sekreciju IL-10. Identifikovali smo specifična monoklonska antitela na hOX40 koja inhibiraju stvaranje T1 od CD4+ T ćelija i, takođe, inhibiraju prirodne ICOS+CD4+CD25high T ćelije da proizvode IL-10. Sveže sortirane ICOS<+>ICOS-CD4+CD127-CD25high Treg ćelije gajene su sa CD4<+>CD25<low>ćelijama obeleženim CFSE u prisustvu ozračenih monocita i monoklonskim antitelima (mAbs) na CD3 (0,3 µg/ml) i hOX40. Posle 3,5 dana gajenja, procenjivana je ćelijska proliferacija FACS-om zbog razblaživanja CFSE u ćelijama (Sl.16C).

[0085] Sl. 17A i 17B prikazuju identifikovanje monoklonskih antitela na hOX40 koja inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija i blokiraju funkciju FOXP3<+>CD4<+>CD25<high>Treg. Sveže sortirane FOXP3+CD4+CD127-CD25high T ćelije (3,5 x 10<4>) gajene su sa CD4<+>CD25<low>ćelijama obeleženim CFSE (7 x 10<4>) u prisustvu ozračenih monocita (7 x 10<4>, 6000 rad) i 0,3 µg/ml antitela na CD3 i različitim koncentracijama monoklonskih antitela na hOX40. Posle 3 do 4 dana gajenja, procenjivana je ćelijska proliferacija analizom protočne citometrije zbog razblaživanja CFSE u ćelijama. Naznačen je procenat ćelija koje se dele. Reprezentativne analize protočne citometrije prikazane su na Sl.17A. Podaci za 6 monoklonskih antitela prikazani su na Sl.17B.

[0086] U eksperimentu na Sl.18, sveže sortirane FOXP3<+>CD4<+>CD127-CD25<high>T ćelije (3,5 x 10<4>) gajene su sa CD4+CD25low ćelijama obeleženim CFSE (7 x 10<4>) u prisustvu ozračenih monocita (7 x 10<4>, 6000 rad) i 0,3 µg/ml antitela na CD3 i različitih koncentracija OX40 monoklonskih antitela. Posle 3 do 4 dana gajenja, procenjivana je ćelijska proliferacija FACS-om zbog razblaživanja CFSE boje u ćelijama. Predstavljeni su podaci iz dva eksperimenta. Identifikovali smo monoklonska antitela na hOX40 koja ne inhibiraju stvaranje T1, ali blokiraju funkciju FOXP3+CD4+CD25high Treg

[0087] U eksperimentu na Sl.19A i 19B, CD4+CD25high T ćelije izvedene od limfoma gajene su sa CD4+CD25low ćelijama obeleženim CFSE (7 x 10<4>) izolovanim od zdravog donora, u prisustvu ozračenih alogenih monocita (7 x 10<4>, 6000 rad) i 0,3 mikrogram/ml monoklonskih antitela na CD3 i 25 µg/ml monoklonskih antitela na hOX40. Posle 3 do 4 dana gajenja, FACS-om je procenjena proliferacija ćelija zbog razblaženja CFSE. Reprezentativne FACS analize prikazane su na Sl.19A, a podaci iz svih eksperimenata dati su na Sl. 19B. Otkrili smo da agonistična antitela na hOX40 blokiraju funkciju CD4+CD25high Treg.

[0088] Sl. 20 prikazuje identifikaciju agonističnih antitela na OX40 koja se specifično vezuju za OX40 čoveka i rezusa. Mononuklearne ćelije periferijske krvi rezusa dobijene su centrifugiranjem u fikolu. CD4+ T ćelije dobijene su pomoću mikrokuglica sa CD4. CD4<+>T ćelije stimulisane su sa 10 µg/ml lektina phaseolusa vulgaris (PHA). Dva dana posle stimulacije, ćelije su obojene pomoću hOX40 monoklonskih antitela, a zatim kozjim antitelom na mišji IgG-APC i CD69-PE. 106-317 je služio kao negativna kontrola. Pokazano je da šest monoklonskih antitela na hOX40, koja snažno aktiviraju proliferaciju T ćelija, nisu mogla da vežu aktivirane CD4<+>T ćelije rezusa. Ovi rezultati ukazuju da se toksičnost ovih šest monoklonskih antitela na hOX40 može testirati na majmunima.

[0089] Samo sedam od 500 klonova pozitivnih za antitela na humani OX40 dobijenih konvencionalnim protokolima za fuziju, ispoljava osobinu da aktivira OX40, uključujući, ali i ne ograničavajući se njima, sposobnost da blokiraju stvaranje Tr1 koje proizvode IL-10 i nTreg supresivnu funkciju, kao što je prikazano na Tabeli 1.

Tabela 1. Spisak specifičnih monoklonskih antitela na OX40

Klon monoklonskih antitela Blokira IL-10 Blokira nTreg

[0090] Klonovi hibridoma 106-222 i 119-122 selektovani su na osnovu tri kriterijuma:

1. Oni inhibiraju stvaranje Tr1 ćelija od CD4<+>T ćelija (inducibilne Treg)

2. Oni revertiraju supresivnu funkciju FOXP3<+>nTreg ćelija

3. Oni ispoljavaju doznu zavisnost inhibicije isključivanja Tr1 ćelija i reverziju funkcije FOXP3+Treg.

Himerna i humanizovana antitela

[0091] Humanizacija (takođe nazvana i Remodelovanje ili CDR-presađivanje) je jedna ustanovljena tehnika za smanjivanje imunogenosti monoklonskih antitela iz ksenogenih izvora (uključujući, ali ne i ograničeno njima, glodare) i poboljšanje njihovog aktiviranja imunskog sistema čoveka. Iako je poznat mehanički deo proizvodnje inženjerisanih monoklonskih antitela korišćenjem tehnika molekularne biologije, obično presađivanje regiona koji određuju komplementarnost (CDR) glodara u okvire antitela čoveka ne uspostavlja uvek afinitet vezivanja i specifičnost prvobitnog monoklonskog antitela.

[0092] Da bi se jedno antitelo humanizovalo, dizajn humanizovanog antitela postaje kritičan stupanj u reprodukovanju funkcije originalnog molekula. Ovaj dizajn uključuje različite izbore: obim CDR, humane okvire koji se koriste i supstituciju amino kiselina iz monoklonskog antitela glodara u regione humanog okvira (povratne mutacije). Položaj ovih povratnih mutacija u principu se određuje analizom sekvence/strukture ili pomoću modela homologije 3D struktura promenljivih regiona.

[0093] Nedavno su biblioteke faga upotrebljene za izmenu amino kiselina na izabranim položajima. Slično, primenjeno je mnogo pristupa da se izaberu najpogodnji humani okviri u koje će se ubaciti glodarski CDR. Rani eksperimenti su koristili ograničeni podskup dobro okarakterisanih humanih monoklonskih antitela (često, ali ne uvek, kada je bila poznata struktura), bez obzira na identičnost sekvenci monoklonskom antitelu glodara (pristup takozvanih fiksiranih okvira). Neke grupe koriste varijabilne regione velike identičnosti sekvenci sa varijabilnim regionima glodara (poređenje homolognih delova ili najbolji fit); druge koriste konsenzusne ili embrionske sekvence, dok neke druge selektuju fragmente okvirnih sekvenci unutar varijabinog regiona svakog lakog ili teškog lanca iz nekoliko različitih humanih monoklonskih antitela. Razvijeni su, takođe, i pristupi za humanizaciju u kojima se površinske amino kiseline u monoklonskim antitelima glodara zamenjuju najčešćim amino kiselinama nađenim u monoklonskim antitelima čoveka (promena površine ili „furniranje“) kao i oni koji koriste razlike u definicijama veličina CDR-ova. Humanizovana antitela su opisana niže. Međutim, ovde su opisana i himerna antitela koja sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, sekvence SEQ ID NO: 4 i 10, ili SEQ ID NOr: 16 i 22.

[0094] Humanizovana monoklonska antitela izvedena su iz mišjih antitela na OX40.

[0095] Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni CDR1 teškog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 ili 13. Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni CDR2 teškog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 ili 14. Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni CDR3 teškog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3 ili 15.

[0096] Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni CDR1 lakog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 ili 19. Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni CDR2 lakog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 8 ili 20. Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni CDR3 lakog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9 ili 21.

[0097] Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni lak lanac aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 11 ili 23, ili aminokiselinske sekvence sa najmanje 90 procenata identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 11 ili 23. Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni težak lanac aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 5 ili 17, ili aminokiselinske sekvence sa najmanje 90 procenata identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 5 ili 17.

[0098] Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni lak lanac koji kodira nukleinska kiselina sekvence SEQ ID NO: 12 ili 24, ili nukleinska kiselina sa najmanje 90 procenata identičnosti sa amino-kiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 12 ili 24. Izolovana humanizovana antitela na OX40 mogu imati varijabilni težak lanac koji kodira nukleinska kiselina sekvence SEQ ID NO: 6 ili 18, ili nukleinska kiselina sa najmanje 90 procenata identičnosti sa amino-kiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 6 ili 18.

Ekspresija humanizovanih antitela na OX40

[0099] Antitelo, ili deo antitela, ovog pronalaska može se dobiti rekombinantnom ekspresijom gena za lak i težak lanac imunoglobulina u ćeliji domaćinu. Da bi se jedno antitelo eksprimiralo rekombinantno, ćelija domaćin se transfektuje sa jednim ili dva ekspresiona vektora koji nose fragmente DNK koji kodiraju imunoglobulinski lak i težak lanac antitela, tako da se lak i težak lanac antitela eksprimiraju u ćeliji domaćinu i, poželjno, sekretuju u medijum u kome se ćelije domaćini gaje i iz kog medijuma se antitela mogu izolovati. Za dobijanje gena za lake i teške lance antitela koristi se standardna metodologija rekombinantne DNK, kao i za ugrađivanje ovih gena u rekombinantne ekspresione vektore i uvođenje vektora u ćelije domaćine, kao što je opisano u Sambrook, Fritsch i Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) i u U.S. Pat. No.4,816,397, Boss et al .

[0100] Antitela i fragmenti antitela, kao i njihove varijante mogu se dobiti iz različitih animalnih ćelija, prevashodno iz sisarskih ćelija, od kojih su najpoželjnije mišje i humane ćelije. Takođe, ekspresioni sistemi rekombinantne DNK mogu da uključe i one koji koriste ćelije domaćine i ekspresione konstrukte koji su inženjerisani tako da proizvode visoke nivoe određenog proteina. Takve ćelije domaćini i ekspresioni konstrukti mogu da obuhvate i Escherichia coli; u kojoj se nalaze ekspresioni konstrukti izvedeni iz plazmida ili virusa (bakteriofaga); kvasce, kao što su Saccharomyces cerevisieae ili Pichia pastoras u kojima su ekspresioni konstrukti epizomi ili ugrađeni u hromozome; ćelije insekata i viruse, kao što su Sf9 ćelije i bakulovirus; i sisarske ćelije koje sadrže epizomske ili ugrađene u hromozome (uključujući, ali i ne ograničavajući se njima, retrovirusne) ekspresione konstrukte (ti postupci, na primer, mogu se videti u rukopisu Verma et al., J. lmmunol. Methods 216:165-181, 1998). Antitela se mogu takođe proizvoditi u biljkama (ti postupci, na primer, mogu se videti u U.S. Pat. No. 6,046,037; Ma et al., Science 268:716-719, 1995) ili tehnologijom eksponiranja na fazima (ti postupci, na primer, mogu se videti u Winter et al., Annu. Rev. Immunol.12:433-455, 1994).

[0101] Humana antitela na OX40 koja ispoljavaju željeni nivo aktivnosti i specifičnost/afinitet vezivanja mogu se dalje manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer, da se geni za varijabilne regione konvertuju u gene za cele lance antitela, u gene za Fab fragmente ili u gen za scFv. U ovim manipulacijama, fragment DNK koji kodira VL- ili VH, operativno se veže za drugi fragment DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantan region antitela ili elastična spojnica (linker). Termin „operativno povezan“, kako se koristi u ovom kontekstu, označava da su dva fragmenta DNK tako spojena da aminokiselinske sekvence koje kodiraju ova dva fragmenta DNK ostaju u okviru čitanja.

[0102] U drugom aspektu, izolovana DNK koja kodira VH region može se konvertovati u gen za ceo težak lanac operativnim vezivanjem DNK koja kodira VH, za drugi molekul DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). U struci su poznate sekvence gena za kostantan region teškog lanca čoveka (vidi, npr. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), a fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnim umnožavanjem pomoću PCR. Konstantni regioni teškog lanca mogu biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantan region i bilo koja alotipska varijanta u njima, kao što je opisao Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), ali najpoželjniji je konstantan region IgG1 ili EgG4. Za gen Fab fragmenta teškog lanca, DNK koja kodira VH može se operativno vezati za drugi molekul DNK koji kodira samo konstantan region CH1 teškog lanca.

[0103] Takođe, humanizovano antitelo, vezano za površinski antigen, može da interaguje sa ćelijama koje nose FcR. Ova interakcija može da izazove efektorsku funkciju, kao što je ADCC i/ili da podstakne signalizaciju zbog unakrsnog vezivanja posredovanog Fc. Za terapiju, ova interakcija može biti blagotvorna ili štetna. Sporedni štetni efekti uključuju ježenje, grozničavost, hipotenziju i, u nekim slučajevima, dispneu (Thistlethwaite JR Jr., Cosimi AB, Delmonico FL, et al.).

[0104] Neki štetni bočni efekti mogu da potiču od proteinskog kompleksa koji se nalazi na površini T ćelija. Posle aktivacije T ćelija, proteinski kompleks učestvuje u transdukciji signala koji se stvaraju preko receptora antigena. Ukratko, aktivacija T ćelija otpočinje kaskadu događaja koji uključuju pojačano unakrsno vezivanje receptora antigena. Unakrsno vezivanje receptora može da doprinese jakom mitogenom signalizovanju koje dovodi do indukovanja izvesnih citokina, kao što su alfa faktor nekroze tumora (TNF-α), interleukin-2 (IL-2) i gama interferon (IFN-γ). Poznato je da su ovi citokini, ako se stvore u velikim količinama, toksični.

[0105] Na primer, monoklonska antitela na CD3 sada se koriste za lečenje autoimunskih bolesti, uključujući dijabetes melitus Tip I, u kome T ćelije posreduju u napadu na pankreatična ostrvca, proizvođače insulina (Kaufman A, i Herold K.Anti-CD3 mAbs for treatment of type 1 dijabetes Dijabetes Metab Res Rev 2009; 25: 302-306). Poznato je da antitela na CD3 inhibiraju lizu mete koju bi vršile T ćelije i podstiču unakrsno vezivanje receptora antigena CD3. Osim toga, poznato je da su, pored snažne mitogene aktivnosti, antitela na CD3 moćan induktor citokina, specifično, alfa faktora nekroze tumora (TNF-α), interleukina-2 (IL-2) i gama interferona (IFN-γ). Ogromno oslobađanje citokina, naročito TNF-α, iz T ćelija, kao odgovor na lek (Chatenoud L.), proizvodi toksične efekte. Ovi neželjeni sporedni efekti pripisani su unakrsnom vezivanju T ćelija koje nose molekule CD3 i ćelija koje nose FcR, koje se vezuju za Fc deo antitela. Kao što je napomenuto, unakrsno vezivanje aktivira kako T ćelije, tako i ćelije koje nose FcR, što dovodi do masivnog oslobađanja citokina.

[0106] Slično tome, potencijalni neželjeni sporedni efekti mogu da nastanu i zbog upotrebe antitela na OX40. Na primer, antitela na OX40 koja se vezuju za T ćelije koje eksprimiraju OX40, mogu takođe da se vežu i za ćelije koje nose FcR i otpočnu proizvodnju citokina, što može biti blagotvorno ili štetno po pacijente koji se tretiraju ovim antitelom. Da bi se prevazišao ovaj potencijalni problem, dizajnirali smo i predstavili ovde postupke za mutiranje FcR dela antitela na OX40, da bi se izbegli toksični efekti i dobile mutacije u FcR delu koje mogu biti poželjne.

[0107] Mesto na humanom IgG1 koje interaguje sa FcR (CD16, CD32 i CD64) je poznato. Mapira u gornjem delu CH2 domena. Najvažnije amino kiseline su dva ostatka Leu na položajima 234 i 235. Mutiranjem ova dva ostatka u dva Ala ostatka, ukidaju se sve interakcije IgG1 sa svim FcR. Humanizovano antitelo na CD3 sa ovim ugrađenim mutacijama (HuOKT3AA), je mnogo bezbedniji lek i njegov mehanizam dejstva se razlikuje od mehanizma HuOKT3. Vidi, npr., US Pat. No. 6, 491,916.

[0108] Položaji AA mutanta su prikazani na sledeći način:

234 235

---A---P---L---L---G---G---P--- Gornji deo CH2 prirodnog (wild) tipa IgG1

---A---P---E---A---A---G---G---P--- Gornji deo CH2 IgG1 mutanta AA

[0109] Ovde opisani Hu222AA i Hu122AA mogu da sadrže ove mutacije. Ako probni sistem sadrži ćelije koje nose FcR može se videti razlika između prirodnog tipa i AA mutanta. Inače, ova dva antitela se isto ponašaju.

[0110] Izolovana DNK koja kodira VL region može se konvertovati u gen za kompletan lak lanac (kao i u gen za Fab lakog lanca) operativnim vezivanjem DNK koja kodira VL za drugi molekul DNK koji kodira konstantan region, CL, lakog lanca. U tehnici su poznati geni za konstantne regione lakog lanca (vidi, npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), a DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnim umnožavanjem pomoću PCR. Konstantan region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantan region.

[0111] Da bi se kreirao scFv gen, fragmenti DNK koji kodiraju VH- i VL se operativno vezuju za drugi fragment koji kodira elastičnu spojnicu, npr., kodiraju aminokiselinsku sekvencu (Gly.sup.4-Ser).sup.3, tako da se VH i VL sekvence mogu eksprimirati kao kontinuirani jednolančani protein, u kome su VL i VH regioni spojeni elastičnom spojnicom (vidi npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554.

[0112] Razmatraju se modifikacije aminokiselinske(ih) sekvence(i) ovde opisanih antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili drugih bioloških osobina antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela dobijaju se uvođenjem odgovarajućih izmena nukleotida u nukleinskoj kiselini za antitela ili sintezom peptida. Ove modifikacije uključuju, na primer, delecije, i/ili insercije i/ili supstitucije amino kiselina u aminokiselinske sekvence antitela. Radi se tako da se svaka kombinacija delecije, insercije ili supstitucije nađe u finalnom konstruktu, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene osobine. Izmene amino kiselina mogu se uvesti u aminokiselinsku sekvencu antitela u vreme kad se ta sekvenca pravi.

[0113] Koristan postupak za identifikovanje određenih aminokiselinskih ostataka ili regiona antitela koji su omiljene lokacije za mutagenezu naziva se „skenirana mutageneza alaninom“ (alanine scanning mutagenesis) kao što su ga opisali Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Tu se amino kiselina ili grupa amino kiselina identifikuje (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zameni neutralnom ili negativno naelektrisanom amino kiselinom (najčešće alaninom ili polialaninom) da bi se uticalo na interakciju amino kiselina sa antigenom. Položaji amino kiselina koji pokazuju funkcionalnu osetljivost na zamene menjaju se tada daljim uvođenjem ili drugih varijanti, ili drugih mesta zamena. Stoga, dok je mesto uvođenja promene aminokiselinske sekvence predodređeno, priroda mutacije, per se ne mora biti predodređena. Na primer, da bi se analizirao efekt mutacije na određenom mestu, vrši se skeniranje ili nasumična mutageneza u ciljanom kodonu ili regionu i eksprimirani imunoglobulini se skeniraju za željenu aktivnost.

[0114] Insercije u aminokiselinsku sekvencu uključuju fuzije sa amino ili karboksilnim krajem, počev od jedne amino kiseline, do polipeptida od stotinu ili više amino kiselina, kao i umetanja unutar sekvence jedne ili više amino kiselina. Primeri insercija na krajevima uključuju antitelo sa metioninom na N-kraju ili antitelo fuzionisano sa citotoksičnim polipeptidom. Druge varijante antitela sa insercijama uključuju fuziju N- ili C-kraja antitela sa nekim enzimom (npr. ADEPT) ili polipeptidom koji produžavaju poluživot antitela u serumu. Drugi tip aminokiselinskih varijanti antitela menja prvobitni način glikozilacije antitela. Ove izmene uključuju deletiranje jedne ili više ugljovodoničnih grupa koje se nalaze u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koji se inače ne nalaze na antitelu.

[0115] Drugi tip promena je variranje supstitucijom amino kiselina. U ovim varijantama je najmanje jedna amino kiselina u molekulu antitela zamenjena različitom amino kiselinom. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali se mogu razmatrati i izmene u FR. Konzervativne supstitucije prikazane su u Tabeli 1 patenta US Pat. No.

7,812,133, Col. 43, ls. 55 do Col. 44 1. 49 i pod naslovom „najčešće supstitucije“. Ako takve supstitucije menjaju biološku aktivnost, tada se mogu uvesti veće promene, u Tabeli 1 nazvane „uzorne supstitucije“, ili, kao što su kasnije opisane u vezi sa klasama amino kiselina, i proizvodi skrinovati.

[0116] Pored toga, znatne modifikacije bioloških osobina antitela postignute su odabiranjem supstitucija koje se značajno razlikuju po svojim efektima na održavanje (a) strukture polipeptidne okosnice u okolini supstitucije, na primer, slojevita ili spiralna konformacija (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu ili (c) glavnine bočnog lanca. Amino kiseline koje se prirodno nalaze, podeljene su u grupe prema zajedničkim osobinama bočnih lanaca: (1) hidrofobne: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) kisele: asp, glu; (4) bazne: his, lys, arg; (5) amino kiseline koje utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i (6) aromatične: trp, tyr, phe. Nekonzervativne supstitucije zahtevaju razmenu člana jedne od ovih klasa članom iz druge klase.

[0117] Da bi se antitela, ili delovi ovde opisanih antitela, eksprimirala, DNK koje kodiraju delimične ili potpune lake i teške lance, dobijene kao što je gore opisano, ubacuju se u ekspresione vektore tako da ovi geni budu operativno vezani za kontrolne sekvence transkripcije i translacije. U ovom kontekstu, termin „operativno vezani“ znači da je gen za antitelo povezan sa vektorom tako da kontrolne sekvence transkripcije i translacije u vektoru služe svojoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena za antitelo. Ekspresioni vektor i kontrolne sekvence za ekspresiju biraju se tako da budu kompatibilne upotrebljenoj ćeliji domaćinu. Gen za lak lanac antitela i gen za težak lanac antitela mogu se ubaciti u zasebne vektore ili, češće, oba gena se ubacuju u isti ekspresioni vektor. Geni za antitelo se ubacuju u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr. ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena za antitelo i vektoru, ili povezivanjem ravnih krajeva ako nema restrikcionih mesta).

[0118] Na Sl. 23 prikazana je jedna takva šematizovana struktura ekspresionog vektora za Hu106-222 IgG1/kapa antitelo. Idući u smeru kretanja kazaljke na satu, od SalI mesta na vrhu, plazmid sadrži transkripcionu jedinicu za težak lanac, počev od glavnog prvog (immediate) ranog promotora i enhensera humanog citomegalovirusa (CMV promotor) koji treba da otpočnu transkripciju gena za težak lanac antitela. Posle CMV promotora ide VH egzon, genomska sekvenca koja sadrži konstantan region humanog gama-1 teškog lanca, uključujući CH1, zglob, CH2 i CH3 egzone sa intronima i mesto poliadenilacije posle CH3 egzona. Posle sekvence teškog lanca, transkripciona jedinica lakog lanca počinje CMV promotorom, posle koga ide VL egzon, genomska sekvenca koja sadrži egzon (CL) sa delom prethodnog introna konstantnog regiona humanog kapa lanca i mesto poliadenilacije posle CL egzona. Posle gena za lak lanac ide rani SV40 promotor (SV40 promotor), gen E. coli za ksantin guaninfosforibozil transferazu (gpt), i segment sa SV40 mestom poliadenilacije (mesto SV40 poly(A)). Na kraju, plazmid sadrži deo plazmida pUC19, koji sadrži bakterijski start (origin) replikacije (pUC ori) i beta-laktamazni gen (beta laktamaza). Na slici su prikazani i položaji relevantnih mesta restrikcionih enzima.

[0119] Rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira i signalni peptid koji olakšava izlučivanje lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen za lanac antitela može se tako klonirati u vektor da je signalni peptid povezan u okvir čitanja sa genom za amino kraj lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili neki heterologni signalni peptid (tj., signalni peptid iz nekog drugog proteina, a ne imunoglobulina).

[0120] Kao što je već navedeno, pored gena za lance antitela, ovde dati rekombinantni ekspresioni vektori nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lance antitela u ćeliji domaćinu. Termin „regulatorne sekvence“ uključuje promotore, enhensere i druge elemente koji kontrolišu ekspresiju (npr. signale za poliadenilaciju) i koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena za lance antitela. Takve regulatorne sekvence opisane su u, na primer, Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Biće jasno da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može da zavisi od takvih faktora, kao što su izbor ćelija domaćina koje će biti transformisane, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Najpoželjnije regulatorne sekvence za ekspresiju u sisarskim ćelijama domaćinima uključuju virusne elemente koji određuju visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili enhenseri izvedeni od citomegalovirusa (CMV) (kao što je CMV promotor/enhenser), Simian Virusa 40 (SV40) (kao što je SV40 promotor/enhenser), adenovirusa, (npr. glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci vidi npr., U.S. Pat. No. 5,168,062 Stinski, U.S. Pat. No. 4,510,245 Bell et al. i U.S. Pat. No.4,968,615 Schaffner et al., U.S. Pat. No.5,464,758 Bujard et al. i U.S. Pat. No. 5,654,168 Bujard et al.

[0121] Pored gena za lance antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori mogu da sadrže i dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr. start mesta, oridžine replikacije) i gene za selektabilne markere. Gen za selektabilni marker olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je uveden vektor (vidi npr., U.S. Pat. Nos. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi patenti Axel et al.). Na primer, tipično, gen za selektabilni marker pridaje ćeliji domaćinu u koju je uveden vektor otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat. Geni za preferencijalne selektabilne markere uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za primenu kod dhfr.sup.- ćelija domaćina sa selekcijom metatreksatom i amplifikacijom) i neo gen (za selekciju pomoću G418).

[0122] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodiraju teške i lake lance koriste se za transfekciju ćelija domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici termina „transfekcija“ obuhvataju mnoštvo tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotske ili eukariotske ćelije domaćine, npr. elektroporacija, kalcijumfosfatna precipitacija, transfekcija DEAE-dekstranom i slično. Iako je teorijski moguće eksprimirati antitela i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama domaćinima, ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama i, preferencijalno, u sisarskim ćelijama domaćinima, je najpoželjnija zato što će te eukariotske ćelije, a naročito sisarske ćelije, pre nego prokariotske ćelije, formirati i sekretovati pravilno upakovana i imunološki aktivna antitela. Sisarske ćelije domaćini za ekspresiju ovde opisanih rekombinantnih antitela uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (kao što su dhfr-CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, upotrebljene sa DHFR selektabilnim markerom, kao što su, npr., opisane u R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), NS0 ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene za antitela, uvedu u sisarske ćelije domaćine, antitela se proizvode gajenjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljnog da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćinima ili izlučivanje antitela u medijum u kome su ćelije domaćini gajeni. Antitela se iz medijuma dobijaju standardnim postupcima za prečišćavanje proteina.

[0123] Ćelije domaćini se, takođe, mogu upotrebiti da proizvedu delove celih antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Podrazumeva se da će varijacije gornjih procedura biti u okviru ovog pronalaska. Na primer, može biti poželjno da se ćelija domaćin transfektuje nekom DNK koja kodira ili lak lanac ili težak lanac (ali ne i oba) nekog antitela ovog pronalaska. Tehnologija rekombinantne DNK može se, takođe, primeniti za uklanjanje dela ili cele DNK koja kodira jedan od, ili oba, lakog i teškog lanca koji nisu potrebni za vezivanje za OX40. Molekuli koji se eksprimiraju sa tako okrnjenih molekula DNK, takođe, su obuhvaćeni antitelima ovog pronalaska. Pored toga, mogu se, standardnim hemijskim postupcima za unakrsno povezivanje (crosslinking), proizvesti bifunkcionalna antitela u kojima se nalazi jedan težak i jedan lak lanac iz antitela ovog pronalaska, a drugi težak i lak lanac su specifični ne za OX40, već za neki drugi antigen.

Farmaceutske kompozicije i farmaceutske primene

[0124] Antitela i delovi antitela ovog pronalaska mogu se ugraditi u farmaceutske kompozicije pogodne za davanje subjektima. Tipično, farmaceutska kompozicija sadrži neko antitelo ili deo antitela ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se koristi ovde, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje i bilo koji od, i sve, rastvarače, disperzione medije, prevlake, antibakterijske agense, antimikotike, izotonične agense, agense koji odlažu absorpciju, i slično ako su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju, jedan ili više, vodu, soni rastvor, fosfatni pufer, dekstrozu, glicerol, etanol i sl., kao i njihove kombinacije. U mnogo slučajeva u kompozicije je bolje uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što su manitol i sorbitol, ili natrijum hlorid. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu sadržati još i manje količine pomoćnih supstanci, kao što su ovlaživači ili agensi za emulgaciju, prezervative ili pufere, koji produžavaju vek trajanja ili podstiču efikasnost antitela ili dela antitela.

[0125] Antitela i delovi antitela ovog pronalaska mogu se ugraditi u farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralno davanje (npr. intravenozno, subkutano, intraperitonealno, intramuskularno). Kompozicije mogu biti različitih oblika. Oni uključuju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste oblike doza, kao što su tečni rastvori, (npr., rastvori koji se mogu injecirati ili davati kao infuzije), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškove, lipozome i supozitorije. Željeni oblik zavisi od nameravanog načina davanja i terapeutske primene. Tipične kompozicije su u obliku rastvora koji se mogu injecirati ili davati kao infuzije, kao što su kompozicije slične onima koje se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi drugim antitelima. Antitelo se može dati intravenoznom infuzijom ili injekcijom, ili intramuskularnom ili subkutanom injekcijom.

[0126] Put i/ili način davanja zavisi od željenih rezultata. U nekim oblicima, aktivno jedinjenje može se pripremiti sa nosačem koji će štititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao u formulaciji sa kontrolisanim otpuštanjem, uključujući implant, trandermalne flastere, i sistemi za isporuku u mikrokapsulama. Mogu se koristiti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Patentirano je, ili opšte poznato stručnjacima, mnogo postupaka za pripremanje takvih formulacija. Vidi, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0127] U kompozicije se, takođe, mogu ugraditi dodatna aktivna jedinjenja. U nekim oblicima, antitelo opisano ovde, ili njegov deo, se koformulišu sa, ili istovremeno daju sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa koji su korisni za tretiranje poremećaja u kojima je inaktiviranje OX40 štetno. Na primer, antitelo na OX40 ovog pronalaska, ili njegov deo, može se staviti u istu formulaciju i/ili dati istovremeno sa jednim ili više dodatnih antitela koja se vezuju za druge mete (npr. antitela koja vezuju druge citokine ili se vezuju za površinske molekule ćelije). Štaviše, jedno ili više antitela opisanih ovde mogu se koristiti u kombinaciji sa dva ili više navedenih terapeutskih agenasa. Takve kombinovane terapije mogu povoljno da koriste niže doze datih terapeutskih agenasa, čime se izbegava moguća toksičnost ili komplikacije vezane za različite monoterapije. Iskusni praktičari će oceniti da, kada se antitela ovog pronalaska koriste kao deo kombinovane terapije, mogu biti poželjne niže doze antitela nego kada se samo antitelo daje subjektu (npr. upotrebom kombinovane terapije može se postići sinergistički terapeutski efekt što, sa svoje strane, omogućuje korišćenje niže doze antitela za postizanje željenog terapijskog efekta.

[0128] Ovde opisana antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, mogu se upotrebiti sami ili u nekoj kombinaciji za tretiranje takvih bolesti. Treba shvatiti da se ova antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, mogu koristiti sami ili u kombinaciji sa nekim dodatnim agensom, npr. terapeutskim agensom, gde je dodatni agens odabrao vešt stručnjak za nameravanu svrhu. Na primer, dodatni agens može biti terapeutski agens za koji se u struci zna da je koristan u lečenju bolesti ili stanja koji se tretiraju ovde navedenim antitelom. Dodatni agens može, takođe, da bude agens koji daje blagotvornu osobinu terapeutskoj kompoziciji, npr. agens koji utiče na viskozitet kompozicije.

[0129] Ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu da uključuju „terapeutski efikasnu količinu“ ili „profilaktički efikasnu količinu“ nekog antitela, ili dela antitela, ovog pronalaska. „Terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu koja, pri dozama i potrebnim periodima vremena, efikasno ostvaruje željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efikasna količina antitela, ili njegovog dela, može da varira zavisno od činilaca, kao što su, stanje bolesti, starost, pol, težina individue i od sposobnosti antitela, ili njegovog dela, da izazove željeni odgovor u datoj individui. Terapeutski efektivna količina je, takođe, i ona količina pri kojoj su svi toksični ili štetni efekti antitela ili njegovog dela nadmašeni terapeutski blagotvornim efektima. „Profilaktički efikasna količina“ odnosi se na količinu koja, pri dozama i potrebnim periodima vremena, efikasno ostvaruje željeni profilaktički rezultat.

[0130] Režimi doziranja mogu se podesiti tako da pruže optimalan željeni odgovor (npr. terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se dati samo jedna bolus doza, može se dati nekoliko podeljenih doza tokom vemena ili se doza može srazmerno smanjivati ili povećavati, zavisno od potreba terapeutske situacije. Naročito je povoljno, zbog lakšeg davanja i uniformnosti doziranja, formulisati parenteralne kompozicije u obliku jediničnih doza. Jedinična doza, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice prilagođene da budu jedinične doze za sisarske subjekte koji se leče, gde svaka jedinica sadrži predodređenu količinu aktivnog jedinjenja, sa farmaceutskim nosačem, sračunatu da proizvede željeni terapeutski efekt. Specifikacija oblika jedinične doze određena je, i neposredno zavisna od (a) jedinstvenih odlika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog i profilaktičkog efekta koji treba postići i (b) ograničenja svojstvenih mogućnostima formulisanja tog aktivnog jedinjenja u tretiranju individualnih osetljivosti.

PRIMER I

[0131] Himerna i humanizovana 106-222 IgG1/kapa monoklonska antitela (Ch222, odnosno Hu222) prečišćena su iz supernatanata kultura odgovarajućih NSO stabilnih transfektanata korišćenjem kolone od proteina A, kao što je opisano u Dodacima (Appendices) A i B. Hu222 je eluiran sa kolone na dva različita načina. Ukratko, Hu222 Partija I eluirana je slabim fosfatnim puferom, a Partija II Pierceovim blagim Ag/Ab elucionim puferom. Prinos Hu222 je bio bolji kada je za eluiranje korišćen slab fosfatni pufer. Ch222 je eluiran sa kolone blagim Ag/Ab elucionim puferom.

[0132] Prečišćena Hu222 Partija I i II antitela okarakterisana su pomoću SDS-PAGE uporedo sa mišjim antitelom 106-222, sledeći standardne procedure. Po 5 µg svakog antitela analizirano je u redukujućim uslovima. Kao što je prikazano na Sl.21, svako od Hu222 Partija I i II antitela sastoji se od teškog lanca molekulske težine od oko 50 kD i lakog lanca molekulske težine od oko 25 kD. Čistoća Hu222 Partija I i II antitela bila je veća od 95%.

[0133] Kontaminacija humanizovanih antitela endotoksinom analizirana je pomoću kompleta amebocitnog lizata limulusa (Limulus Amebocyte Lysate, LAL) QCL-1000, Lonza. Nivo endotoksina bio je manji od 0,5 EU/mg proteina i za Hu222 Partija I i za II antitela.

Karakterisanje Hu106-222 u odnosu na vezivanje za L/OX40 ćelije

[0134] Vezivanje mišjih 106-222, Ch106-222 i Hu106-222 antitela za OX40 ispitivano je FACS probom za vezivanje za L/hOX40 ćelije, uglavnom prema protokolu koji je dala Dr. Laura Bover. Antitela vezana za L/hOX40 ćelije detektovana su kozjim antitelom na IgG antitela miša, obeleženim PE-om (za mišji 106-222) ili kozjim antitelom na IgG antitela čoveka, obeleženim PE-om (za Ch106 i Hu106).

[0135] Sl. 22 prikazuje analizu mišjih antitela 106-222, Ch106 i Hu106-222 (Partija II) u pogledu vezivanja za L/OX40 ćelije. Titraciona kriva Hu106-222 (Partija II) je skoro identična sa krivom za Ch106-222, što ukazuje da se vezivni afinitet mišjeg 106-222 zadržao i u Hu106-222. Titraciona kriva mišjeg 106-222 slična je krivama Ch106 i Hu106; međutim, zbog razlika u sekundarnim antitelima, podaci samo ukazuju da je afinitet mišjeg 106-222 sličan afinitetu Hu106-222.

[0136] Sl. 24 prikazuje poređenje između Hu106-222 Partija I i II antitela u odnosu na njihovo vezivanje za L/hOX40 ćelije. Mada je potrebna dalja analiza, afinitet dve partije Hu106-222 izgleda da su međusobno slične, ako ne i identične. Znači, kiselo eluiranje Hu106-222 sa protein A kolone izgleda da ne utiče na njegov afinitet.

Prečišćavanje Ch106-222

[0137] NS0 stabilan transfektant C8 ćelije gajene su u 500 ml Hybridoma SFM medijumu (Invitrogen) u rotirajućim bocama (roller bottle) do iscrpljenja. Kultura je centrifugirana u centrifužnim epruvetama od 250 ml (Corning, 250 ml Centrifuge Tube, Cat# 430776) u Bekmanovoj centrifugi Coulter's Allegra X-12R Centrifuge, na 2000 obrt/min, 15 min. Supernatanti kultura naneti su na kolonu od 1 ml GE Healthcare HiTrap MabSelect SuRe (Cat# 11-034-95) pomoću P1 pumpe, Pharmacia. Kolona je isprana sonim rastvorom puferovanim trisom (Pierce, Cat# 28379) i eluirana blagim Ag/Ab elucionim puferom (Pierce's Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Cat # 21027). Sakupljane su frakcije (oko 1 ml) i merena njihova apsorbancija, OD, na 280nm.

[0138] Spojene su frakcije 3 do 6 (zapremina = 3,0 ml, OD na 280 nm = 0,14). Spojene frakcije su oslobođene soli na koloni od 10 ml Sephadex G25 medijum, u PBS. Sakupljane su frakcije od po 1ml.

[0139] Spojene su frakcije 6 do 9 (zapremina = 3,0 ml, OD na 280 nm = 0,11). Spojene frakcije su dijalizovane prema PBS preko noći. Posle dijalize, zapremina je bila 3,0 ml i OD na 280 nm je bila 0,19. Ovaj preparat nazvan je Ch106, partija 8/31/09, koncentracije 0,13 mg/ml.

Prečišćavanje Hu106-222

[0140] NS0 stabilan transfektant 1-C6 ćelije gajene su u 500 ml Hybridoma SFM medijumu (Invitrogen) u rotirajućim bocama do iscrpljenosti. Kultura je centrifugirana u centrifužnim epruvetama od 250 ml (Corning, 250 ml Centrifuge Tube, Cat# 430776) u Bekmanovoj centrifugi Coulter's Allegra X-12R Centrifuge, na 2000 obrt/min, 15 min.

[0141] Partija 1: 150 ml supernatanta kulture naneto je na kolonu od 1 ml GE Healthcare HiTrap MabSelect SuRe (Cat# 11-034-95) pomoću P1 pumpe, Pharmacia. Kolona je isprana PBS-om i vezano antitelo eluirano rastvorom 0,1M glycine-HCl, 0,1 M NaCl (pH 3,0). Eluirane frakcije (od po 1 ml) sakupljane su u epruvete koje sadrže po 50 µl 1M Tris-HCl (pH 8,0).

Fra OD na

2 0,88

3 2,84

4 1,29

5 0,63

6 0,18

[0142] Spojene su frakcije 2 to 5 (zapremina = 4,2 ml, OD na 280 nm = 1,59). Spojene frakcije su dijalizovane prema PBS preko noći. Posle dijalize, zapremina je bila 4,2 ml i OD na 280 nm je bila 1,54. Rastvor antitela (partija 9/18/09 I; 1,1 mg/ml) sterilisan je filtriranjem.

Partija II:

[0143] Ostatak supernatanta kulture (350 ml) nanet je na kolonu od 1 ml GE Healthcare HiTrap MabSelect SuRe pomoću P1 pumpe, Pharmacia. Kolona je isprana sonim rastvorom puferovanim trisom i eluirana blagim Ag/Ab elucionim puferom Sakupljane su frakcije (oko 1 ml) i merena njihova OD na 280 nm.

Fra OD n

2 0,12

3 0,85

4 2,17

5 1,47

6 1,02

7 0,81

8 0,66

9 0,54

10 0,44

11 0,46

[0144] Spojene su frakcije 3 do 7 (zapremina = 4,2 ml, OD na 280 nm = 1,22). Da bi se ispitalo da li je eluiranje blagim Ag/Ab elucionim puferom efikasno, kolona je ponovo oprana sonim rastvorom koji je puferovan trisom i antitelo je eluirano 0,1M glicin-HCl, 0,1M NaCl (pH 3,0).

Fr OD na

1 0,05

2 0,05

3 1,23

4 0,49

5 0,10

[0145] Frakcije 3 do 7, eluirane blagim Ag/Ab elucionim puferom, spojene su i oslobođene soli na koloni od 10 ml Sephadex G25 medijum u PBS. Sakupljane su frakcije od 1 ml.

[0146] Frakcije 5 do 8 su spojene (zapremina = 4,0 ml, OD na 280 nm = 1,12). Spojene frakcije su dijalizovane preko noći prema PBS. Posle dijalize, zapremina je bila 4,0 ml i OD na 280 nm 1,12. Rastvor antitela (partija 9/18/09 II; 0,8 mg/ml) sterilisan je filtrovanjem.

[0147] U eluiranju IgG1 humanog antitela sa kolone od proteina A, postupak eluiranja visokim koncentracijama soli blagim Ag/Ab elucionim puferom (Pierce's Gentle Ag/Ab Elution Buffer) nije bio tako efikasan kao postupak sa niskim pH. Pošto se antitela nisu eluirala blagim Ag/Ab elucionim puferom u vidu oštrog maksimuma, bilo je potrebno spajati mnogo frakcija da bi se sakupio eluirani IgG i spojene frakcije odsole pre dijalize. Loš elucioni profil dobijen sa blagim Ag/Ab elucionim puferom i dodatni stupanj prečišćavanja uticali su na prinos antitela. Preporučuje se da se postupak eluiranja visokim koncentracijama soli primeni samo ako je IgG koji treba prečistiti nestabilan u kiselini.

Primer II

Prečišćavanje antitela Ch119-122 i Hu119-122

[0148] Upotrebom kolone od proteina A prečišćeno je himerno monoklonsko antitelo 119-122 IgG1/kapa (Ch119) iz supernatanta kulture odgovarajućeg NS0 stabilnog transfektanta (klon G11) gajenog u Hybridoma-SFM medijumu (Invitrogen). Posle eluiranja blagim Pierce/ovim, Ag/Ab elucionim puferom, pufer za Ch119 zamenjen je PBS-om filtrovanjem na gelu, a zatim dijalizom. Koncentracija Ch119 bila je 0,21 mg/ml.

[0149] Humanizovano 119-122 IgG1/kapa monoklonsko antitelo (Hu122) prečišćeno je iz supernatanta kulture odgovarajućeg NS0 stabilnog transfektanta (klon 2F5) gajenog u Hybridoma-SFM medijumu primenom kolone od proteina A. Hu106-222 eluirano je sa kolone puferom niskog pH, neutralizovano sa 1 M Tris-HCl (pH 8,0), i dijalizovano prema PBS. Koncentracija Hu122 bila je 1,6 mg/ml.

[0150] Prečišćeni Hu106-222 okarakterisan je standardnim procedurama na SDS-PAGE, paralelno sa mišjim 119-122. Po 5 µg svakog antitela analizirano je pod redukujućim uslovima. Kao što je prikazano na Sl. 25, Hu119-122 se sastoji od teškog lanca molekulske težine od oko 50kD i lakog lanca molekulske težine od oko 25 kD. Čistoća Hu119 je bila veća od 95%.

Karakterisanje Hu119-122 u odnosu na vezivanje za L/OX40 ćelije

[0151] Vezivanje mišjih 119-122, Ch119-122 i Hu119-122 antitela na OX40 ispitivano je FACS probom za vezivanje sa L/hOX40 ćelijama, uglavnom prema protokolu koji je dala Dr. Laura Bover. Antitela vezana za L/OX40 ćelije detektovana su kozjim antitelom na IgG antitela miša, obeleženim PE-om (za mišji 119-122), ili kozjim antitelom na IgG antitela čoveka, obeleženim PE-om (za Ch119-122 i Hu119-122).

[0152] Sl. 26 prikazuje rezultat FACS analize. Titraciona kriva Hu119-122 bila je slična krivoj za Ch119-122, što sugeriše da se vezivni afinitet mišjeg 119-122 zadržava u Hu119-122. Međutim,vrednosti MCF pri višim koncentracijama antitela Ch109-122 i Hu119-122 ne padaju tačno na odgovarajuće krive. Posle podešavanja eksperimentalnih uslova, FACS analizu bi trebalo ponoviti.

PRIMER III

[0153] Da bi se procenila sposobnost naših humanizovanih antitela na humani OX-40 da podstaknu proliferaciju T-ćelija, obavili smo test za proliferaciju koristeći CD32-L ćelije obložene antitelom na CD3 i sveže izolovane naivne CD4<+>T ćelije. Sl.27 pokazuje da klon 119-122 (Hu122) humanizovanih monoklonskih antitela na humani OX40 i njegovo antitelo mutirano u FcR u odnosu na vezivanje (Hu122-AA) podstiču proliferaciju naivnih CD4<+>T ćelija. Hu122 je imao bolju stimulativnu aktivnost na T ćelije u poređenju sa ishodnim mišjim mAb na OX40 (mišji 122). (Sl. 27)

[0154] Mutirano FcR vezivanje humanizovanog mAb klona 106-222 (Hu222-AA) na humani OX40 i klon 106-222 himernih mAb (Ch222) na humani OX40 podsticali su proliferaciju naivnih CD4+ T ćelija stimulisanu antitelima na CD3. Ova antitela imaju sličnu stimulativnu aktivnost u poređenju sa ishodnim mišjim mAb na humani OX40 (mišji 106-222). Međutim, potpuno humanizovano antitelo na humani OX40, Hu106, nije podsticalo proliferaciju T ćelija. (Sl.28)

[0155] Da bi se procenila sposobnost humanizovanih antitela na humani OX-40 da blokiraju supresivnu funkciju CD4+ regulatornih T ćelija (Treg), uradili smo probe na proliferaciju koristeći sveže izdvojene naivne CD4<+>T ćelije i CD4<+>CD25<high>CD127<low>Treg ćelije. Našli smo da himerno antitelo Ch122 i humanizovano antitelo sa mutiranim vezivanjem Fc (Hu122-AA) ispoljavaju veću moć u blokiranju funkcije CD4<+>Treg nego ishodno mišje monoklonsko antitelo na humani OX40 (mišji 122) . (Sl.29 A-B)

[0156] U eksperimentu na Sl. 27, sveže izdvojene CD4<+>CD25<low>CD127<+>CD45RO-D45RA<+>naivne T ćelije stimulisane su L ćelijama koje eksprimiraju CD32 (CD32-L) i koje su obložene sa 4 koncentracije antitela na CD3 plus 2 µg/ml antitela klona 119 na humani OX40 ili kontrolna antitela. Tri dana posle stimulacije, dodat je radioaktivni izotop tricijum i nastavljeno gajenje još dodatnih 16-18 sati do sakupljanja ćelija. Dati su reprezentativni podaci eksperimenata iz dva donora. CD32-L ćelije koje eksprimiraju hOX40 ligand (CD32-L/hOX40L) služe kao pozitivna kontrola, dok humani i mišji IgG1 služe kao negativne kontrole.

[0157] U eksperimentu na Sl. 28, sveže izdvojene naivne T ćelije stimulisane su CD32-L ćelijama obloženim sa 4 koncentracije antitela na CD3 plus 2 µg/ml monoklonskih antitela na humani OX40 klona 106-222 (Hu222) ili kontrolnih antitela. Tri dana posle stimulacije, dodat je radioaktivni izotop tricijum i nastavljeno gajenje još dodatnih 16-18 sati do sakupljanja ćelija. Dati su reprezentativni podaci eksperimenata iz dva donora. CD32-L/hOX40L služi kao pozitivna kontrola, dok humani i mišji IgG1 služe kao negativne kontrole.

[0158] U eksperimentu na Sl. 29. sveže izdvojene CD4<+>naivne T ćelije gajene su u prisustvu CD4+CD25highCD127lowTreg na tri odnosa Treg: T efektor, i stimulisane su CD32-L ćelijama obloženim sa 0,2µg/ml antitela na CD3 plus 10 µg/ml monoklonskih antitela klona 119/122 na humani OX40 ili kontrolnih antitela. Tri dana posle stimulacije, dodat je radioaktivni izotop tricijum i nastavljeno gajenje još dodatnih 16-18 sati do sakupljanja ćelija. Dati su reprezentativni podaci tri eksperimenta. CD32-L/hOX40L služi kao pozitivna kontrola, dok humani i mišji IgG1 služe kao negativne kontrole.

PRIMER IV

[0159] Pošto će, kada se daju pacijentima putem intravenskog injeciranja, antitela naići na mononuklearne ćelije ukupne periferne krvi (PBMC), mi smo, u svojim probama za proliferaciju, testirali sposobnost naših antitela na humani OX40 da stimulišu proliferaciju T ćelija koristeći PBMC kao antigen-prezentujuće ćelije (APCs). Međutim, sa našim mišjim monoklonskim antitelima na humani OX40, dobili smo jako varijabilne podatke kada smo koristili PBMC kao APC, što se ne vidi kada se kao APC koriste monociti, što sugeriše da je našim antitelima za aktivnost potrebna neka vrsta unakrsnog spajanja. Da bi se proverila ta mogućnost, ploče su obložene našim monoklonskim antitelima na humani OX40 i CD 3, oprane i korišćene za stimulisanje proliferacije CD4+ ili CD8+ T ćelija u odsustvu pomoćničkih ćelija. Sl. 30 pokazuje rezultate da antitela na humani OX40 podstiču proliferaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija.

[0160] Sveže izdvojenih 1 x 10<5>of CD4<+>CD25<low>CD45RO-CD45RA<+>naivnih T ćelija (Sl. 30A) ili CD3+CD8+ T ćelija (Sl. 30B) stimulisano je antitelom na CD3 (3 µg/ml), vezanim za ploču, i mišjim monoklonskim antitelom na humani OX40 (2 µg/ml). Trećeg dana gajenja dodat je tricirani timidin i ćelije su pokupljene posle 15 sati inkubiranja. Proliferacija T ćelija procenjena je na osnovu ugradnje timidina. Monoklonska antitela na humani OX40 izvedena su iz tri fuzije hibridoma. Brojevi posle broja fuzije označavaju specifično antitelo. Mišji IgG1 i 119-42 služili su kao negativne kontrole. Svaki tretman izvođen je u triplikatu. Prikazani su reprezentativni podaci 4 donora T ćelija (Sl. 30C) Sve tri verzije humanizovanih mAb na humani OX40 [hur106-222 i Hu119-122; Hu106-222AA i Hu119-122AA (AA označavaju da su dve amino kiseline u veyivnom mestu Fc mutirane u amino kiselinu alanin); i Ch119-122 (sličan humanizovanom 119-122, osim što je mišji „paratop“ varijabilnog regiona nepromenjen)] stimulisali su proliferaciju naivnih CD4<+>T ćelija. Antitela na CD28 služila su kao pozitivna kontrola.

[0161] Kao što je prikazano na Sl. 30, panelima A i B, mišji mAb na humani OX40, vezani za ploču, snažno stimulišu proliferaciju naivnih CD4<+>T ćelija i CD8<+>T ćelija, u opsegu 10 do 14 puta. Proširili smo ispitivanja na naša humanizovana mAb na humani OX40 i našli da su tri verzije naših humanizovanih antitela, bilo da su u potpunosti humanizovana, bilo da su himerna ili su imala AA mutante u kojima su amino kiseline odgovorne za vezivanje za receptor Fc prevedene u alanin, bile snažni stimulatori proliferacije naivnih CD4<+>T ćelija (Sl.30C).

[0162] Sl. 31 pokazuje da je mišjim i humanizovanim antitelima na humani OX40 potrebno unakrsno spajanje da bi podstakla proliferaciju T ćelija. Sveže izdvojene naivne CD4<+>T ćelije stimulisane su, bez pomoćničkih ćelija, antitelima na CD3 (3 µg/ml) vezanim za ploču, plus humanizovanim monoklonskim antitelima na humani OX40 (2 µg/ml), vezanim za ploču ili solubilnim. Trećeg dana gajenja dodat je tricirani timidin i ćelije su pokupljene posle još 15 sati inkubiranja. Proliferacija T ćelija procenjena je na osnovu ugradnje timidina.

Mišji IgG1 i antitela na CD28 služila su kao negativna, odnosno pozitivna kontrola. Naivne CD4<+>T ćelije stimulisane su, bez pomoćničkih ćelija, antitelom na CD3, vezanim za ploču. Sledećeg dana, mAb 119-122 (2 µg/ml) na humani OX40 dodat je sam, ili u kombinaciji sa jednakom količinom sekundarnog antitela na Fc. Proliferacija ćelija procenjena je kao što je opisano u panelu A.

[0163] Jačina naših humanizovanih monoklonskih antitela na OX40, mAb Hu106-222 i Hu119-122, bila je uporediva sa jačinom antitela na CD28. Nasuprot tome, kada se kulturi T ćelija doda solubilno antitelo na humani OX40, nema stimulatornog efekta (Sl. 31A). Međutim, ako se doda solubilno monoklonsko antitelo na humani OX40, mAb 119-122, zajedno sa F(ab')2fragmentom kozjeg antitela na mišji IgG, specifično sekundarno antitelo na Fc fragment, stimulatorni efekt se uspostavlja (Sl. 31B). Ovi rezultati pokazuju da monoklonska antitela na humani OX40, za svoje biološke aktivnosti zahtevaju unakrsno spajanje.

[0164] Da bismo procenili sposobnost naših agonističkih monoklonskih antitela na OX40 da blokiraju supresivnu funkciju CD4+CD25<high>CD12T nTreg ćelija, izvršili smo probe na proliferaciju u prisustvu CD4+CD25<Iow>CD127+CD45RO+ T efektorskih ćelija (Teff) i CD4<+>nTreg ćelija. Koristeći naš sistem vezivanja za ploče, u kome se ploče oblažu monoklonskim antitelima na humani OX40, zajedno sa antitelima na CD3, bez pomoćnih ćelija, našli smo da dvanaest (222, 132, 8B, 33A, 43, 58B, 122, 157A, 173B, 220C, 140A, 270) od naših mišjih monoklonskih antitela na humani OX40 snažno inhibira supresiju nTreg ćelija (Sl.32A i 32B). Mada je odnos nTreg ćelija prema T efektorskim ćelijama primenjenjen u ovim probama bio 1:1, ova antitela su bila u stanju da stimulišu T efektorske ćelije da proliferišu 10 do 35 procenata više od procenta koji postižu T efektorske ćelije bez nTreg ćelija. Naša humanizovana monoklonska antitela na humani OX40, takođe, su povratila supresivnu funkciju nTreg ćelija na slične nivoe (Sl. 32C). Svi ovi rezultati sugerišu da su naša mišja monoklonska antitela na humani OX40 moćni stimulatori OX40, što dovodi do snažnog podsticaja proliferacije T ćelija i inhibicije supresivne funkcije nTreg. Štaviše, naša humanizovana monoklonska antitela na OX40 sačuvala su moćne biološke aktivnosti svojih roditeljskih mišjih antitela

[0165] Sl. 32 pokazuje da mAb na humani OX20 blokiraju aktivnost CD4+FOXP3<+>nTreg ćelija. CD4+CD25-CD45RO+ T efektorske ćelije obeležene CFSE-om i CD4<+>FOXP3<+>Treg ćelije izvedene su od istog zdravog donora. T ćelije su stimulisane solubilnim antitelom na CD28 (0,5 µg/ml) i antitelom na CD3 (3 µg/ml) vezanim za ploču i monoklonskim antitelima na humani OX40 (2 µg/ml). Proliferacija T efektorskih ćelija procenjena je protočnom citometrijom u odnosu na razblaženje CFSE. Odnos nTreg prema T efektorskim ćelijama bio je 1:1. Mišji IgG1 služio je kao negativna kontrola. Naivne CD4+ T ćelije služile su kao kontrolne T ćelije da pokažu specifičnu inhibiciju proliferacije T efektorskih ćelija nTreg ćelijama. Sl. 32A daje reprezentativne FACS podatke koji prikazuju proliferaciju T efektorskih ćelija u prisustvu naivnih CD4<+>T ćelija, nTreg ćelija ili nTreg ćelija plus mAb 119-33A na humani OX40. Sl.32B prikazuje procenat proliferacije T efektorskih ćelija u prisustvu nTreg ćelija posle tretmana mišjim mAb (testirano 20) na humani OX40. Sl. 32C pokazuje da sve tri verzije humanizovanih mAb na humani OX40 obnavljaju proliferaciju T efektorskih ćelija.

[0166] Nedavan rad sugeriše da aktiviranje (triggering ) OX40 može da indukuje apoptozu u liniji humanih T ćelija koje eksprimiraju OX40 (Yoshiaki Takahashi et al., 200B, Aids Research and human Retroviruses, 24). Stoga smo testirali efekt povećavanja koncentracija mAb 106-222 na humani OX40, uz fiksiranu nisku dozu antitela na CD3, na preživljavanje tri podgrupe T ćelija u prisustvu monocita. Sl. 33A pokazuje da visoke koncentracije (20-30 µg/ml) mAb 106-222 na humani OX40 pretežno ubijaju aktivirane FOXP3<+>nTreg ćelije, dok su aktivirane naivne i memorijske CD4+ T ćelije bile ili otporne ili manje osetljive na ovaj napor. Da bismo proverili da li mAb na humani OX40 deluje neposredno na Treg ćelije i izaziva smrt ćelija, izvršili smo nove eksperimente bez pomoćničkih ćelija. Sl. 33B pokazuje da jaka OX40 signalizacija, u kombinaciji sa antitelom na CD3, specifično ubija nTreg ćelije kada nema pomoćničkih ćelija. Da bismo utvrdili da li ubitačni efekti posredovani monoklonskim antitelom na humani OX40 imitiraju aktiviranje OX40 prirodnim OX40 ligandom, koristili smo liniju mišjih fibroblastnih L ćelija koja prekomerno eksprimira hOX40L i upotrebili je da stimuliše nTreg ćelije u prisustvu malih doza antitela na CD3 i dobili smo slične ubilačke efekte na nTreg ćelijama (Sl. 33C). Ovi rezultati sugerišu da jako aktiviranje OX40 ubija Treg ćelije koje eksprimiraju OX40.

[0167] Specifično, Sl.33 pokazuje da visoke koncentracije monoklonskog antitela na humani OX40 pretežno ubija FOXP3<+>Treg ćelije. Na Sl.33A, svaka od podgrupa T ćelija (naivne CD4+CD25lowCD127+CD45RO-CD45RA+; memorijske CD4+CD25lowCD127+CD45RA-CD45RO+ i nTreg ćelije, CD4<+>CD25<high>CD127<low>) gajena je sa jednakim odnosom CD14<+>monocita u prisustvu solubilnog antitela na CD3 (0,3 µg/ml) i rastućim koncentracijama mišjeg monoklonskog antitela, mAb 106-222, na humani OX40. Vijabilnost ćelija određivana je analizom protočne citometrije posle 3 dana gajenja kulture, oslanjajući se na vijabilne limfocite. Prikazani su podaci za dva donora T ćelija. Sl.33B i 33C pokazuje da jako aktiviranje OX40 ubija CD4<+>FOXP<3>Treg ćelije. Sl.33B pokazuje da se CD4<+>FOXP3<+>Treg ćelije stimulišu antitelom na CD3 (2 µg/ml) vezanim za ploču, plus solubilno 119-122 mAb (30 µg per milion ćelija) ili mišje kontrolno antitelo IgG1. Posle jednog dana gajenja brojane su pomoću hemocitometra žive ćelije koje se ne boje tripan plavim. Sl.33C pokazuje da su CD4+FOXP3+ Treg ćelije stimulisane solubilnim antitelom na CD3 (0,2 µg/ml) plus L ćelije ili L ćelijama koje eksprimiraju hOX40 ligand (L/hOX40L). Žive ćelije su brojane jedan dan posle stimulacije.

[0168] Sledeće što smo tražili bilo je da odredimo da li monoklonsko antitelo, mAb, na humani OX40 deluje neposredno na T ćelije da blokira nTreg supresivnu funkciju. Sveže izdvojene CDR4+ T efektorske ćelije ili nTreg ćelije, prvo su aktivirane preko noći monoklonskim antitelom na CD3, a zatim tretirane monoklonskim antitelima na humani OX40 tokom 4 sata. T efektorske ćelije su zatim oprane, obeležene CFSE-om, i gajene zajedno sa nTreg ćelijama u prisustvu jednakog broja CD14+ monocita i antitela na CD3. Na sličan način, prethodno stimulisane nTreg ćelije su oprane i gajene sa netretiranim T efektorskim, obeleženim CFSE-om ćelijama.

[0169] Sl. 34 pokazuje da monoklonska antitela na humani OX40 deluju neposredno na T ćelije i blokiraju supresivne funkcije Treg ćelija. Sl. 34A pokazuje da monoklonska antitela na humani OX40 deluju neposredno na efektorske memorijske T ćelije i čine ih otpornim na supresiju nTreg ćelijama. CD4<+>CD25<low>CD127<+>CD45RA-CD45RO<+>memorijske T ćelije stimulisane su antitelima na CD3 vezanim za ploče (0,8 µg/ml) u medijumu za kulture (RPMI/10% FACS/ P/S plus IL-2, 30 IU/ml) tokom 12 sati, a zatim tretirane monoklonskim antitelima na humani OX40 tokom 4 sata, oprane 3 puta i 8 x 104 efektorskih T ćelija obeleženih CFSE-om gajeno je sa opadajućim odnosima nTreg ćelija. Proliferacija efektorskih T ćelija evaluirana je protočnom citometrijom preko razblaženja CFSE. Monoklonsko antitelo na humani OX40 deluje na Treg ćelije čineći ih nesposobnim da suprimuju proliferaciju T efektorskih ćelija (Sl. 34B). CD4<+>CD25<high>CD127<low>nTreg ćelije su prethodno stimulisane antitelima na CD3 vezanim za ploče (2 µg/ml) u medijumu za kulture tokom 12 sati, a zatim tretirane monoklonskim antitelom na humani OX40, mAb 119-122 ili 106-222, ili kontrolnim antitelom, antitelom na ICOS ili mišjim IgG1, kao što je opisano za panel A, oprane i gajene sa T efektorskim memorijskim ćelijama obeleženim CFSE-om. Proliferacija T efektorskih ćelija evaluirana je protočnom citometrijom preko razblaženja CFSE.

[0170] T efektorske ćelije tretirane monoklonskim antitelom na humani Ox40 postale su otporne na supresiju nTreg ćelijama (Sl. 34A). Nasuprot tome, proliferacija T efektorskih ćelija tretiranih kontrolnim mišjim IgG1 antitelom ostala je osetljiva na supresiju Treg ćelijama. Sl. 34B pokazuje da nTreg ćelije tretirane monoklonskim antitelima na humani OX40 nisu mogle da suprimuju proliferaciju T efektorskih ćelija. Nasuprot tome, nTreg ćelije tretirane kontrolnim antitelima, kao što su antitela na I COS ili mišji IgG1, ostale su supresivne. Ovi rezultati sugerišu da naša monoklonska antitela na humani OX40 deluju neposredno i na T efektorske ćelije i na nTreg ćelije da uspostave proliferaciju T efektorskih ćelija.

PRIMER V

[0171] Dodatni preliminarni in vivo podaci pokazuju da antitelo na humani OX40 radi u miševima – podstiče ekspanziju T ćelija i odbacivanje tumora kod miševa. Prethodno je pokazano da mAb na humani OX40 može specifično da aktivira NF-κB kaskadu u mišjim CD8<+>T ćelijama transdukovanim humanim OX40. Da bi se odredilo da li mAb na hOX40 može da podstakne odbacivanje tumora izazivajući preživljavanje efektorskih CD8<+>T ćelija i njihovu klonsku ekspanziju in vivo, transgene Pmel CD8+ T ćelije transdukovane luciferaznim genom i hOX40, adaptivno su prenete u C57BL/6 albino miševe koji imaju nepigmentisane MC38 tumore. Posle adoptivnog transfera transdukovanih T ćelija, miševi su tretirani antitelima. Četvrtog dana nađeno je da je značajno više humanih OX40<+>luciferaza<+>Pmel T ćelija migriralo u pluća miševa tretiranih monoklonskim antitelom na hOX40 u poređenju sa mišem tretiranim kontrolnim antitelom IgG1 (Sl. 35B), što ukazuje da je aktiviranje hOX40 u miševima izazvalo ekspanziju CD8<+>T ćelija. Osmog dana (podaci nisu prikazani) i 12. dana posle tretmana, nađeno je da je ista grupa miševa, tretirana monoklonskim antitelom na hOX40, zadržala značajno više luciferaza<+>Pmel T ćelija u predelu tumora nego kontrolna grupa miševa tretiranih sa IgG1 (Sl. 35B), što opet ukazuje da je aktiviranje hOX40 u miševima dovelo do preživljaavanja CD8<+>T ćelija. I, najzad, veličine tumora u miševima koji su primili hOX40<+>Pmel CD8<+>T ćelije i posle tretirani monoklonskim antitelom na hOX40 bile su značajno manje nego u miševima koji su primili netransdukovane Pmel T ćelije i bili tretirani monoklonskim antitelom na hOX40 ili hOX40<+>Pmel T ćelije, posle čega je sledio tretman kontrolnim antitelom koji je odgovarao mišjem IgG1. Ovi rezultati pokazuju da aktiviranje humanog OX40 u miševima daje biološke efekte slične onima mišjeg OX40 (Gough MJ et, 2008). Prema tome, podaci pokazuju sposobnost monoklonskog antitela na humani OX40 da stimuliše ekspanziju CD<+>T ćelija i preživljavanje in vivo i da podstakne odbacivanje tumora.

Monoklonsko antitelo na humani OX40 izaziva ekspanziju T ćelija i preživljavanje in vivo.

[0172] Na Sl.35A prikazan je naš režim terapeutske vakcinacije. Grupama od po 5 C57BL/6 albino miševa subkutano (S.C) je implantirano po 5 x 10<5>nepigmentisanih MC38/gp100 tumorskih ćelija (dan 0). Šestog dana, izazvana je limfopenija davanjem 350 cGy doze zračenja. Sedmog dana, 7, 1 x 106 luciferazom transdukovanih Pmel-1 T ćelija, sa ili bez ekspresije humanog OX40, adoptivno je preneto u miševe sa tumorima (n = 5 per grupa), posle čega im je data intravenozna injekcija sa 5 x 105 DC koje su kratkotrajno tretirane Gp100 peptidom. Rekombinantni humani IL-2 je intraperitonealno davan tokom 3 dana posle transfera T ćelija. Antitela su davana 7., 9. i 11. dana, sa 100, 50 i 50 µg, po injekciji, po mišu (Sl. 35B). Slike bioluminescencije in vivo pokazale su akumulaciju CD8+ pmel-1 T ćelija koje eksprimiraju luciferazu u plućima i tumorima dana 4. i 12. Prikazana su po dva od pet miševa u grupi, 4. i 12. dana (Sl.35C). Tumori su odgovarali na tretman monoklonskim antitelom na hOX40. Veličina tumora merena je svaka 3 dana. Pmel-1 i Pmel-1 plus mišji IgG1 služili su kao kontrole.

LISTING SEKVENCI

[0173]

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koje vezuje humani OX40 koji sadrži: (a) varijabilni region CDR1 teškog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1; (b) varijabilni region CDR2 teškog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2; (c) varijabilni region CDR3 teškog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:3; (d) varijabilni region CDR1 lakog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7; (e) varijabilni region CDR2 lakog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8; i (f) varijabilni region CDR3 lakog lanca, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9.

2. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region lakog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:10 i varijabilni region teškog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:4.

3. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je izolovano antitelo monoklonsko antitelo.

4. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je izolovano antitelo humanizovano antitelo.

5. Izolovano humanizovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, prema zahtevu 4, koje sadrži varijabilni region lakog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:11 i varijabilni region teškog lanca sekvence koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:5.

6. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom zahtevu od 1 do 5

7. Ćelija-domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom zahtevu od 1 do 5

8 Postupak za dobijanje antitela, ili njegovog dela koji vezuje antigen, koji uključuje gajenje ćelija-domaćina iz zahteva 7; postupak koji poželjno uključuje i dobijanje antitela, ili njegovog dela koji vezuje antigen, iz ćelija-domaćina.

9. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kom zahtevu od 1 do 5, za upotrebu kao lek.

10. Izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, za primenu prema zahtevu 9, gde je lek namenjen tretiranju raka.