ES2655701T3

ES2655701T3 - Composiciones y métodos relacionados con variantes de la proteína A (SpA)

Info

Publication number: ES2655701T3
Application number: ES11801511.4T
Authority: ES
Inventors: Olaf Schneewind; Alice G. Cheng; Dominique M. Missiakas; Hwan Kim
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2011-07-01
Publication date: 2018-02-21
Anticipated expiration: 2031-07-01
Also published as: BR112013000097A2; US20150056240A1; JP2013534532A; US8821894B2; AU2011274367B2; WO2012003474A2; EP2588120A2; US20130171183A1; US10464971B2; US11059866B2; CN103037885B; ZA201209561B; AU2011274367A1; KR20130093084A; CA2803298A1; BR112013000097B1; US20170369536A1; US20200140494A1; SG186290A1; US20210290748A1

Abstract

Un polipéptido inmunogénico aislado que comprende un dominio D de variante de la proteína A (SpA) que tiene (a) dos sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a Fc; y (b) dos sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a VH3; en el que para (a) la variante de SpA comprende una sustitución del resto de glicina en cada posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácidos 9 y 10 de SEQ ID NO: 2; y para (b) la variante de SpA comprende una sustitución del resto de serina en cada posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácido 36 y 37 de SEQ ID NO: 2.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y métodos relacionados con variantes de la proteína A (SpA)

La presente invención ser realizó con apoyo gubernamental en virtud de AI057153, AI052474 y GM007281 concedidas por los Institutos Nacionales de la Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

I. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la Inmunología, la Microbiología y la Patología. Más concretamente, se refiere a métodos y a composiciones que implican variantes de la proteína A bacteriana, que se pueden usar para generar una respuesta inmune.

II. Antecedentes

El número de infecciones contraídas tanto fuera como dentro de los hospitales ha aumentado en los últimos años con el aumento del uso de dispositivos intravasculares. Las infecciones intrahospitalarias (nosocomiales) causan una gran morbilidad y mortalidad, más concretamente, en Estados Unidos, donde afectan a más de 2 millones de pacientes al año. Las infecciones más frecuentes son infecciones del tracto urinario (el 33 % de las infecciones), seguidas por la neumonía (15,5 %), las infecciones de sitios quirúrgicos (14,8 %) y las infecciones primarias del torrente sanguíneo (13 %) (Emorl y Gaynes, 1993).

Los patógenos nosocomiales más importantes incluyen Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativos (principalmente Staphylococcus epidermidis), enterococcus sp., Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Aunque estos patógenos causan aproximadamente el mismo número de infecciones, la gravedad de los trastornos que producen en combinación con la frecuencia de aislados resistentes a antibióticos nivelan esta clasificación hacia S. aureus y S. epidermidis como los patógenos nosocomiales más importantes.

Los estafilococos pueden causar una amplia variedad de enfermedades en los seres humanos y otros animales, bien a través de la producción o la invasión de toxinas. Las toxinas estafilocócicas también son una causa común de intoxicación alimentaria, pues las bacterias pueden crecer en alimentos no almacenados de forma apropiada.

Staphylococcus epidermidis es un comensal habitual de la piel que es además un importante patógeno oportunista responsable de infecciones producidas en dispositivos médicos defectuosos e infecciones en los sitios quirúrgicos. Los dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluyen normalizadores de pulsaciones cardiacas, derivaciones del líquido cefalorraquídeo, catéteres para diálisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopédicos y válvulas cardíacas protésicas.

Staphylococcus aureus es la causa más común de las infecciones nosocomiales, con importantes morbilidad y mortalidad. Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis séptica, neumonía, abscesos y síndrome del choque tóxico. S. aureus puede sobrevivir en superficies secas, aumentando la posibilidad de transmisión. Cualquier infección por S. aureus puede causar el síndrome estafilocócico de la piel escaldada, una reacción cutánea a la exotoxina absorbida en el torrente sanguíneo. También puede causar un tipo de septicemia denominada piemia, que puede suponer un peligro para la vida. Existe el problema de que Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se ha convertido en la principal causa de infecciones intrahospitalarias.

Las infecciones por S. aureus y S. epidermidis normalmente se tratan con antibióticos, siendo la penicilina el fármaco escogido, mientras que la vancomicina se usa para los aislados resistentes a la meticilina. El porcentaje de cepas estafilocócicas que muestran una resistencia de amplio espectro a los antibióticos se ha vuelto cada vez más frecuente, lo que supone una amenaza para una terapia antimicrobiana eficaz. Además, la reciente aparición de una cepa de S. aureus resistente a la vancomicina ha suscitado el temor de que están surgiendo y propagándose cepas de MRSA para las que no se dispone de una terapia eficaz.

Se encuentra en investigación una alternativa al tratamiento con antibióticos para las infecciones estafilocócicas que usa anticuerpos dirigidos contra antígenos estafilocócicos. Dicha terapia implica la administración de antisuero policlonal (documentos WO00/15238 y WO00/12132) o el tratamiento con anticuerpos monoclonales contra el ácido lipoteicoico (documento WO98/57994).

Un enfoque alternativo sería el uso de una vacuna activa para generar una respuesta inmune contra los estafilococos. Se ha secuenciado el genoma del S. aureus, y se han identificado muchas de las secuencias codificantes (documentos WO02/094868 y EP0786519), que pueden conducir a la identificación de posibles antígenos. Lo mismo ocurre para S. epidermidis (documento WO01/34809). Como perfeccionamiento de dicho enfoque, otros investigadores han identificado proteínas que son reconocidas por el suero hiperinmune de pacientes que han padecido una infección por estafilococos (documentos WO01/98499 y WO02/059148).

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S. aureus secreta una plétora de factores de virulencia en medio extracelular (Archer, 1998; Dinges et al., 2000; Foster, 2005; Shaw et al., 2004; Sibbald et al., 2006). Como la mayoría de las proteínas secretadas, estos factores de virulencia son trasladados por la maquinaria Sec a través de la membrana plasmática. Las proteínas secretadas por la maquinaria Sec portan un péptido líder N-terminal que es eliminado por una peptidasa líder una vez que la preproteína se acopla en el translocón Sec (Dalbey y Wickner, 1985; van Wely et al., 2001). Un análisis reciente del genoma sugiere que las actinobacterias y los miembros de las Firmicutes codifican un sistema de secreción adicional que reconoce un subconjunto de proteínas de manera independiente de Sec (Pallen, 2002). ESAT-6 (antígeno diana de secreción temprana de 6 kDa) y CFP-10 (antígeno de filtrado de cultivos de 10 kDa) de Mycobacterium tuberculosis representan los primeros sustratos de este nuevo sistema de secreción denominado eSx-1 o Snm en M. tuberculosis (Andersen et al., 1995; Hsu et al., 2003; Pym et al., 2003; Stanley et al., 2003). En S. aureus, dos factores similares a ESAT-6 denominados EsxA y EsxB son secretados por la vía Ess (sistema de secreción de ESAT-6) (Burts et al., 2005).

La primera generación de vacunas dirigidas contra S. aureus o contra las exoproteínas que produce han alcanzado un éxito limitado (Lee, 1996). Sigue existiendo la necesidad de desarrollar vacunas eficaces contra infecciones estafilocócicas. También se necesitan composiciones adicionales para tratar las infecciones estafilocócicas.

Sumario de la invención

La proteína A (SpA) (SEQ ID NO: 33), una proteína de superficie anclada a la pared celular de Staphylococcus aureus, permite la evasión bacteriana de las respuestas inmunes innatas y adaptativas. La proteína A se une a las inmunoglobulinas en su parte Fc, interactúa con el dominio VH3 de los receptores de linfocitos B estimulando de manera inapropiada la proliferación de linfocitos B y la apóptosis, se une a los dominios A1 del factor de von Willebrand para activar la coagulación intracelular, y además se une al receptor 1 del TNF para contribuir a la patogénesis de la neumonía estafilocócica. Debido al hecho de que la proteína A captura la inmunoglobulina y muestra atributos tóxicos, no se ha seguido de manera rigurosa la posibilidad de que esta molécula de superficie pueda funcionar como una vacuna en los seres humanos. En el presente documento, los inventores demuestran que las variantes de la proteína A que ya no son capaces de unirse a las inmunoglobulinas, que se eliminan, por tanto, de su potencial toxigénico, es decir, que son no toxigénicas, estimulan respuestas inmunes humorales que protegen contra enfermedades estafilocócicas.

La invención proporciona un polipéptido inmunogénico aislado que comprende un dominio D de variante de la proteína A (SpA) que tiene (a) dos sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a Fc; y (b) dos sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a VH3; en el que para (a) la variante de SpA comprende una sustitución del resto de glicina en cada posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácidos 9 y 10 de SEQ ID NO: 2; y para (b) la variante de SpA comprende una sustitución del resto de serina en cada posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácido 36 y 37 de SEQ ID NO: 2.

También se proporcionan:

- una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de la invención en una composición farmacéuticamente aceptable;

- una vacuna que comprende el polipéptido o la composición de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable;

- una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia codificante del polipéptido de la invención;

- un método de fabricación de una vacuna que comprende las etapas de mezclar antígenos para preparar la composición de la invención y la adición de un excipiente farmacéuticamente aceptable; y

- una composición para su uso en la generación de una respuesta inmune contra una bacteria estafilocócica en un sujeto que comprende un polipéptido de la invención o una composición de la invención.

En el presente documento, se desvelan variantes de SpA de longitud completa que comprenden un dominio A, B, C, D y E de la variante. En ciertos aspectos de la divulgación, la variante de SpA comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos que es un 80, 90, 95, 98, 99 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34. En otras realizaciones, la variante de SpA comprende un segmento de SpA. El segmento de SpA puede comprender al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más dominios de unión de IgG. Los dominios de IgG pueden ser al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más dominios A, B, C, D o E de la variante. En ciertos aspectos, la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más dominios A de la variante. En un aspecto adicional, la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más dominios B de la variante. En un aspecto adicional más, la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más dominios C de la variante. En otro aspecto adicional más, la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más dominios D de la variante. En ciertos aspectos, la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más

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dominios E de la variante. En un aspecto adicional, la variante de SpA comprende una combinación de los dominios A, B, C, D y E en diversas combinaciones y permutaciones. Las combinaciones pueden incluir la totalidad o parte de un segmento del péptido señal de SpA, un segmento de la región X de SpA y/o un segmento de la señal de clasificación de SpA. En otros aspectos, la variante de SpA no incluye un segmento del péptido señal de SpA, un segmento de la región X de SpA y/o un segmento de la señal de clasificación de SpA. En ciertos aspectos de la divulgación, un dominio A de la variante comprende una sustitución de la posición o posiciones 7, 8, 34 y/o 35 de SEQ ID NO: 4. En otro aspecto, un domino B de la variante comprende una sustitución de la posición o posiciones 7, 8, 34 y/o 35 de SEQ ID NO: 6. En otro aspecto más, un dominio C de la variante comprende una sustitución de la posición o posiciones 7, 8, 34 y/o 35 de SEQ ID NO: 5. En ciertos aspectos, un dominio D de la variante comprende una sustitución de la posición o posiciones 9, 10, 36 y/o 37 de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional, un dominio E de la variante comprende una sustitución de la posición o posiciones 6, 7, 33 y/o 34 de SEQ ID NO: 3.

En ciertos aspectos de la divulgación, una variante del dominio D de SpA o su equivalente puede comprender una mutación de la posición 9 y 36; 9 y 37; 9 y 10; 36 y 37; 10 y 36; 10 y 37; 9, 36 y 37; 10, 36 y 37, 9, 10 y 36; o 9,10 y 37 de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional, se pueden incluir mutaciones análogas en uno o más de los dominios A, B, C o E.

En aspectos adicionales de la divulgación, el aminoácido glutamina (Q) de la posición 9 de SEQ ID NO: 2 (o su aminoácido análogo en otros dominios de SpA) se puede reemplazar por una alanina (A), una asparagina (N), un ácido aspártico (D), una cisteína (C), un ácido glutámico (E), una fenilalanina (F), una glicina (G), una histidina (H), una isoleucina (I), una lisina (K), una leucina (L), una metionina (M), una prolina (P), una serina (S), una treonina (T), una valina (V), un triptófano (W) o una tirosina (Y). En algunos aspectos, la glutamina de la posición 9 puede sustituirse con una arginina (R). En un aspecto adicional, la glutamina de la posición 9 de SEQ ID NO: 2, o su equivalente, puede sustituirse con una lisina o una glicina. Cualquier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las sustituciones se pueden excluir explícitamente.

En otro aspecto de la divulgación, el aminoácido glutamina (Q) de la posición 10 de SEQ ID NO: 2 (o su aminoácido análogo en otros dominios de SpA) se puede reemplazar por una alanina (A), una asparagina (N), un ácido aspártico (D), una cisteína (C), un ácido glutámico (E), una fenilalanina (F), una glicina (G), una histidina (H), una isoleucina (I), una lisina (K), una leucina (L), una metionina (M), una prolina (P), una serina (S), una treonina (T), una valina (V), un triptófano (W) o una tirosina (Y). En algunos aspectos, la glutamina de la posición 10 puede sustituirse con una arginina (R). En un aspecto adicional, la glutamina de la posición 10 de SEQ ID NO: 2, o su equivalente, puede sustituirse con una lisina o una glicina. Cualquier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las sustituciones se pueden excluir explícitamente.

En ciertos aspectos de la divulgación, el ácido aspártico (D) de la posición 36 de SEQ ID NO: 2 (o su aminoácido análogo en otros dominios de SpA) se puede reemplazar por una alanina (A), una asparagina (N), una arginina (R), una cisteína (C), una fenilalanina (F), una glicina (G), una histidina (H), una isoleucina (I), una lisina (K), una leucina (L), una metionina (M), una prolina (P), una serina (S), una treonina (T), una valina (V), un triptófano (W) o una tirosina (Y). En algunos aspectos, el ácido aspártico de la posición 36 puede sustituirse con un ácido glutámico (E). En ciertos aspectos, un ácido aspártico de la posición 36 de SEQ ID NO: 2, o su equivalente, puede sustituirse con una alanina o una serina. Cualquier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las sustituciones se pueden excluir explícitamente.

En otro aspecto de la divulgación, el ácido aspártico (D) de la posición 37 de SEQ ID NO: 2 (o su aminoácido análogo en otros dominios de SpA) se puede reemplazar por una alanina (A), una asparagina (N), una arginina (R), una cisteína (C), una fenilalanina (F), una glicina (G), una histidina (H), una isoleucina (I), una lisina (K), una leucina (L), una metionina (M), una prolina (P), una serina (S), una treonina (T), una valina (V), un triptófano (W) o una tirosina (Y). En algunos aspectos, el ácido aspártico de la posición 37 puede sustituirse con un ácido glutámico (E). En ciertos aspectos, un ácido aspártico de la posición 37 de SEQ ID NO: 2, o su equivalente, puede sustituirse con una alanina o una serina. Cualquier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las sustituciones se pueden excluir explícitamente.

En un aspecto de la divulgación, el amino de la posición 9 de SEQ ID NO: 2 (o un aminoácido análogo en otro dominio de SpA) se reemplaza por una alanina (A), una glicina (G), una isoleucina (I), una leucina (L), una prolina (P), una serina (S) o una valina (V). En ciertos aspectos, el aminoácido de la posición 9 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una glicina. En un aspecto adicional, el aminoácido de la posición 9 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una lisina.

En un aspecto de la divulgación, el amino de la posición 10 de SEQ ID NO: 2 (o un aminoácido análogo en otro dominio de SpA) se reemplaza por una alanina (A), una glicina (G), una isoleucina (I), una leucina (L), una prolina (P), una serina (S) o una valina (V). En ciertos aspectos, el aminoácido de la posición 10 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una glicina. En un aspecto adicional, el aminoácido de la posición 10 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una lisina.

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En un aspecto de la divulgación, el amino de la posición 36 de SEQ ID NO: 2 (o un aminoácido análogo en otro dominio de SpA) se reemplaza por una alanina (A), una glicina (G), una isoleucina (I), una leucina (L), una prolina (P), una serina (S) o una valina (V). En ciertos aspectos, el aminoácido de la posición 36 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una serina. En un aspecto adicional, el aminoácido de la posición 36 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una alanina.

En un aspecto de la divulgación, el amino de la posición 37 de SEQ ID NO: 2 (o un aminoácido análogo en otro dominio de SpA) se reemplaza por una alanina (A), una glicina (G), una isoleucina (I), una leucina (L), una prolina (P), una serina (S) o una valina (V). En ciertos aspectos, el aminoácido de la posición 37 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una serina. En un aspecto adicional, el aminoácido de la posición 37 de SEQ ID NO: 2 se reemplaza por una alanina.

En ciertos aspectos de la divulgación, la variante de SpA incluye una sustitución de (a) una o más sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de IgG del dominio A, B, C, D y/o E de SpA que interrumpe o disminuye la unión a Fc de IgG; y (b) una o más sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio A, B, C, D y/o E de SpA que interrumpe o disminuye la unión a Vh3. En otros aspectos más, la secuencia de aminoácidos de una variante de SpA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica, incluyendo todos los valores e intervalos existentes entre ellos, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2-6.

En un aspecto adicional de la divulgación, la variante de SpA incluye (a) una o más sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de IgG del dominio D de SpA, o en una posición de aminoácido correspondiente de otros dominios de IgG, que interrumpe o disminuye la unión a Fc de IgG; y (b) una o más sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio D de SpA, o en una posición de aminoácido correspondiente de otros dominios de IgG, que interrumpe o disminuye la unión a Vh3. En ciertos aspectos de la divulgación, los restos de aminoácidos F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 y/o K35 (SEQ ID NO: 2, QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNES) del subdominio de unión a Fc de IgG del dominio D están modificados o sustituidos. En ciertos aspectos, los restos de aminoácido Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43 y/o E47 (SEQ ID NO: 2) del subdominio de unión a Vh3 del dominio D están modificados o sustituidos de manera que la unión a Fc o Vh3 está atenuada. En aspectos adicionales, las modificaciones o sustituciones correspondientes pueden diseñarse en las posiciones correspondientes del dominio A, B, C y/o E. Las posiciones correspondientes se definen mediante la alineación de la secuencia de aminoácidos del dominio D con una o más de las secuencias de aminoácidos de otros dominios de unión a IgG de SpA, por ejemplo, véase la FIG. 2A. En ciertos aspectos, la sustitución de aminoácidos puede ser cualquiera de los otros 20 aminoácidos. En un aspecto adicional, las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden excluirse específicamente de posibles sustituciones de aminoácidos. En otros aspectos, solo se incluyen sustituciones no conservativas. En cualquier caso, se contempla cualquier sustitución o combinación de sustituciones que reduzca la unión del dominio de modo que la toxicidad de SpA se reduzca significativamente. La importancia de la reducción en la unión se refiere a una variante que produce una toxicidad mínima o nula cuando se introduce en un sujeto y puede evaluarse usando métodos in vitro descritos en el presente documento.

En ciertas realizaciones, una variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos del dominio D de la variante de SpA. En ciertos aspectos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 o más restos de aminoácidos de la variante de SpA se sustituyen o modifican - incluyendo, pero sin limitación, los aminoácidos F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 y/o K35 (SEQ ID NO: 2) del subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio D, y el resto de aminoácido Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43 y/o E47 (SEQ ID NO: 2) del subdominio de unión a Vh3 del dominio D. En un aspecto de la divulgación, los restos de glutamina de la posición 9 y/o 10 de SEQ ID NO: 2 (o las posiciones correspondientes en otros dominios) están mutados. En otro aspecto de la divulgación, los restos de ácido aspártico 36 y/o 37 de SEQ ID NO: 2 (o las posiciones correspondientes de otros dominios) están mutados. En la invención, la glutamina 9 y 10, y los restos de ácido aspártico 36 y 37 están mutados. Los mutantes/variantes de SpA o SpA-D no toxigénicos purificados descritos en el presente documento ya no son capaces de unirse significativamente (es decir, demuestran una afinidad de unión atenuada o interrumpida) a Vh3 de Fcy o F(ab)2 y tampoco estimulan la apóptosis de los linfocitos B. Estas variantes de proteína A no toxigénicas se pueden usar como vacunas de subunidades y elevar las respuestas inmunes humorales y conferir inmunidad protectora contra la exposición a S. aureus. En comparación con la proteína A de longitud completa de tipo silvestre o el dominio D de SpA de tipo silvestre, la inmunización con variantes de SpA-D dio produjo un aumento en el anticuerpo específico de la proteína A. Usando un modelo de ratón de exposición a estafilococos y de formación de abscesos, se observó que la inmunización con las variantes de proteína A no toxigénicas generaba una protección significativa contra la infección por estafilococos y la formación de abscesos. Como casi todas las cepas de S. aureus expresan la proteína A, la inmunización de los seres humanos con las variantes no toxigénicas de la proteína A pueden neutralizar este factor de virulencia y, de esta manera, establecer inmunidad protectora. En ciertos aspectos, la inmunidad protectora protege de o mejora la infección por cepas de estafilococos resistentes a fármacos, tales como la USA300 y otras cepas de MRSA.

Las realizaciones incluyen el uso de las variantes de la proteína A en composiciones para el tratamiento de infecciones bacterianas y/o estafilocócicas. La presente solicitud también proporciona una composición

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inmunogénica que comprende una variante de la proteína A o un fragmento inmunogénico de la misma. En ciertos aspectos, el fragmento inmunogénico es un segmento del dominio D de la proteína A. Además, la presente invención proporciona composiciones que se pueden usar para tratar (por ejemplo, limitar la formación y/o persistencia de abscesos estafilocócicos en un sujeto) o prevenir una infección bacteriana. En algunos casos, los métodos para estimular una respuesta inmune implican administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que incluye o codifica la totalidad o parte de un polipéptido o antígeno de la variante de la proteína A, y en ciertos aspectos otras proteínas bacterianas. Otras proteínas bacterianas incluyen, pero sin limitación, (i) un factor de virulencia secretado y/o una proteína o un péptido de la superficie celular; o (ii) una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un factor de virulencia secretado y/o una proteína o un péptido de la superficie celular.

En otros aspectos, se puede administrar al sujeto la totalidad o parte de una variante de la proteína A, tal como un segmento del dominio D de la variante de la proteína A. El polipéptido de la invención puede formularse en una composición farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además uno o más de al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 antígenos estafilocócicos adicionales o un fragmento inmunogénico de los mismos (por ejemplo, Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla (por ejemplo, mutantes H35), IsdC, SasF, vWbp o vWh). Los antígenos estafilocócicos adicionales que se pueden usar en combinación con una variante de la proteína A incluyen, pero sin limitación, la proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa (GenBank CAC80837), Aap (n° de acceso del GenBank AJ249487), Ant (número de acceso del GenBank NP_372518), autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (rAp), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento Wo 00/12689), SdrG/Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador AbC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina (véase las publicaciones PCT documentos WO2007/113222, WO2007/113223, WO2006/032472, WO2006/032475, W02006/032500). El antígeno estafilocócico o fragmento inmunogénico se puede administrar de forma concurrente con la variante de la proteína A. El antígeno estafilocócico o fragmento inmunogénico y la variante de la proteína A se puede administrar en la misma composición. La variante de la proteína A además puede ser una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una variante de la proteína A. Una molécula de ácido nucleico recombinante puede codificar la variante de la proteína A y al menos un antígeno estafilocócico o un fragmento inmunogénico del mismo. Como se usa en el presente documento, el término “modular” o “modulación” abarca los significados de las palabras “aumentar” o “inhibir”. La “modulación” de la actividad puede ser tanto un aumento como una disminución de la actividad. Como se usa en el presente documento, el término “modulador” se refiere a compuestos que efectúan la función de una fracción, incluyendo la regulación positiva, la inducción, la estimulación, la potenciación, inhibición, regulación negativa o supresión de una proteína, ácido nucleico, gen, organismo o similar.

En ciertas realizaciones los métodos y las composiciones usan o incluyen o codifican la totalidad o parte del antígeno o de la variante de la proteína A. En otros aspectos, la variante de la proteína A se puede usar en combinación con factores secretados o antígenos de superficie incluyendo, pero sin limitación, uno o más de un polipéptido Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp o vWh aislado o segmento inmunogénico del mismo. Los antígenos estafilocócicos adicionales que se pueden usar en combinación con una variante de la proteína A incluyen, pero sin limitación, la proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG/Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SsP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina. En ciertas realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolosina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión al colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a la elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión al fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a la fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC immunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina se pueden excluir

específicamente de una formulación de la invención.

La siguiente tabla enumera las diversas combinaciones de variantes de SpA y los otros diversos antígenos estafilocócicos.

Tabla 1. Combinaciones de SpA y antígenos estafilocócicos

Eap: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Ebh: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Emp: + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsaB: + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsaC: + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxA: + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxB: + + + + + + + + + + + + + + +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

Ebh: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Emp: + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsaB: + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsaC: + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxA: + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxB: + + + + + + + + + + + + + + +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

Emp: + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsaB: + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsaC: + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxA: + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxB: + + + + + + + + + + + + + + +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

EsaB: + + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsaC: + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxA: + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxB: + + + + + + + + + + + + + + +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

EsaC: + + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxA: + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxB: + + + + + + + + + + + + + + +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

EsxA: + + + + + + + + + + + + + + + +

EsxB: + + + + + + + + + + + + + + +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

EsxB: + + + + + + + + + + + + + + +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

SdrC: + + + + + + + + + + + + + +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

SdrD: + + + + + + + + + + + + +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

SdrE: + + + + + + + + + + + +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

IsdA: + + + + + + + + + + +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

IsdB: + + + + + + + + + +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

ClfA: + + + + + + + + +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

ClfB: + + + + + + + +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

Coa: + + + + + + +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

Hla: + + + + + +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

HlaH35A: + + + + +

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

5

10

15

20

25

30

35

40

IsdC: + + + +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

SasF: + + +

vWbp: + +

vWh: +

vWbp: + +

vWh: +

vWh: +

En realizaciones adicionales, la variante de la proteína A aislada se multimeriza, por ejemplo, se dimeriza en una fusión lineal de dos o más polipéptidos o segmentos peptídicos. En ciertos aspectos de la invención, una composición comprende multímeros o concatámeros de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más proteínas de la superficie celular aisladas o segmentos de las mismas. Los concatámeros son polipéptidos lineales que tienen una o más unidades peptídicas de repetición. Los polipéptidos o fragmentos de SpA pueden ser consecutivos o estar separados mediante un espaciador u otras secuencias peptídicas, por ejemplo, uno o más péptidos bacterianos adicionales. En una realización adicional, los demás polipéptidos o péptidos contenidos en el multímero o concatámero pueden incluir, pero sin limitación, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Los antígenos estafilocócicos adicionales que se pueden usar en combinación con una variante de la proteína A incluyen, pero sin limitación, la proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG/Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina.

El término “variante de la proteína A” o “variante de la SpA” se refiere a polipéptidos que incluyen un dominio de la IgG de SpA que tiene dos o más sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a Fc y a Vh3. En un cierto aspecto, la variante de SpA incluye un péptido de dominio D de la variante, así como variantes de polipéptidos de SpA y segmentos de las mismas que son no toxigénicos y que estimulan una respuesta inmune contra la proteína A de las bacterias estafilocócicas y/o bacterias que las expresan.

Las realizaciones de la presente invención incluyen composiciones para su uso en la generación de una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo o estafilococos en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de una variante de la proteína A o un segmento de la misma. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la generación de una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo o estafilococos en un sujeto son para su uso en un método que comprende proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o más proteínas secretadas y/o proteínas de la superficie celular o segmentos/fragmentos de las mismas. Una proteína secretada o proteína de la superficie celular incluye, pero sin limitación, las proteínas Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp y/o vWh, y los fragmentos inmunogénicos de las mismas. Los antígenos estafilocócicos adicionales que se pueden usar en combinación con una variante de la proteína A incluyen, pero sin limitación, la proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (rAp), SasA, SasB,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG/Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador AbC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina.

Aspectos de la divulgación incluyen composiciones que incluyen un polipéptido, un péptido o una proteína que es o que al menos es un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica o similar a la proteína A, o una segunda proteína o péptido que es una proteína bacteriana secretada o una proteína de la superficie celular bacteriana. En un aspecto adicional de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o que sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a un polipéptido del dominio D (SEQ ID NO: 2), del dominio E (SEQ ID NO: 3), del dominio A (SEQ ID NO: 4), del dominio C (SEQ ID NO: 5), del dominio B (SeQ ID NO: 6) de la proteína A, o a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido del dominio D, dominio E, dominio A, dominio C o dominio B de la proteína A. En ciertos aspectos, un segmento de polipéptido de proteína A tendrá una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En la técnica, se conoce la similitud o la identidad, siendo preferida la identidad, y se puede usar una serie de diferentes programas para identificar si una proteína (o un ácido nucleico) tiene identidad o similitud de secuencia con respecto a una secuencia conocida. La identidad y/o similitud de las secuencias se determina usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, el algoritmo de identidad de secuencias de Smith y Waterman (1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad de la secuencia de Needleman y Wunsch (1970), mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, de Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al. (1984), preferentemente usando los ajustes por defecto, o mediante inspección. Preferentemente, el porcentaje de identidad se calcula usando herramientas de alineamiento conocidas, y fácilmente verificables, por los expertos en la materia. El porcentaje de identidad es esencialmente el número de aminoácidos idénticos dividido entre el número total de aminoácidos multiplicado por cien.

Otras realizaciones adicionales incluyen composiciones para su uso en métodos para estimular en un sujeto una respuesta inmune protectora o terapéutica contra una bacteria estafilocócica que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que incluye (i) una variante de SpA, por ejemplo, un polipéptido de dominio D de la variante de SpA o un péptido del mismo; o, (ii) administrar un polipéptido de dominio D de la variante de SpA con cualquier combinación o permutación de proteínas bacterianas descritas en el presente documento. En una realización preferida, la composición no es una bacteria estafilocócica. En ciertos aspectos, el sujeto es un ser humano o una vaca. En un aspecto adicional, la composición se formula en una formulación farmacéuticamente aceptable. Los estafilococos pueden ser Staphylococcus aureus.

Todavía otras realizaciones adicionales incluyen vacunas que comprenden una composición farmacéuticamente aceptable que tiene un polipéptido variante de SpA aislado, en las que la composición es capaz de estimular una respuesta inmune contra una bacteria estafilocócica. La vacuna comprende un polipéptido variante de SpA aislado descrito en el presente documento. En ciertos aspectos de la invención, el polipéptido variante de SpA aislado, o cualquier otra combinación o permutación de proteína/s o péptido/s descrito/s se multimerizan, por ejemplo, se dimerizan o se concamerizan. En un aspecto adicional, la composición de vacuna está contaminada por menos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,05 % (o cualquier intervalo derivable de los mismos) de otras proteínas estafilocócicas. Una composición puede comprender además un polipéptido de SpA no aislado. Por lo general, la vacuna comprende un adyuvante. En ciertos aspectos, una proteína o un péptido de la invención se enlaza (covalente o no covalentemente) al adyuvante, preferentemente, el adyuvante se conjuga químicamente con la proteína.

En otros aspectos adicionales más de la divulgación, una composición de vacuna es una composición farmacéuticamente aceptable que tiene un ácido nucleico recombinante que codifica todo o parte de un polipéptido variante de SpA, o cualquier otra combinación o permutación de proteína/s o péptido/s descrito/s en el presente documento, en la que la composición es capaz de estimular una respuesta inmune contra una bacteria estafilocócica. La composición de vacuna puede comprender un ácido nucleico recombinante que codifica todo o parte de un polipéptido variante de SpA, o cualquier otra combinación o permutación de proteína/s o péptido/s descrito/s en el presente documento. En ciertos aspectos, el ácido nucleico recombinante contiene un promotor heterólogo. Preferentemente, el ácido nucleico recombinante es un vector. Más preferentemente, el vector es un plásmido o un vector vírico. En algunos aspectos, la vacuna incluye una bacteria recombinante no estafilocócica que contiene el ácido nucleico. Los no estafilococos recombinantes pueden ser Salmonella u otras bacterias gram- positivas. La vacuna puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, más preferentemente un adyuvante.

Otras realizaciones adicionales incluyen composiciones para su uso en métodos de estimulación, en un sujeto, de una respuesta inmune protectora o terapéutica contra una bacteria estafilocócica que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de un polipéptido variante de SpA y que comprende además una o más de una proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp o vWh, o péptido de la misma. En una realización preferida, la composición comprende una

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bacteria no estafilocócica. En una realización adicional, la composición se formula en una formulación farmacéuticamente aceptable. Los estafilococos para los que se está tratando al sujeto pueden ser Staphylococcus aureus. Las realizaciones de la invención también incluyen composiciones de variantes de SpA que contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o más factores de virulencia secretados y/o proteínas de superficie celular, tales como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp o vWh en diversas combinaciones. En ciertos aspectos, una formulación de vacuna incluye Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp y vWh. En ciertas realizaciones, una combinación de antígeno puede incluir (1) una variante de SpA e IsdA; (2) variante de SpA y ClfB; (3) variante de SpA y SdrD; (4) variante de SpA y variante Hla o Hla; (5) variante de SpA y ClfB, SdrD, y la variante Hla o Hla; (6) Variante de SpA, IsdA, SdrD, y variante Hla o Hla; (7) variante de SpA, IsdA, ClfB, y variante Hla o Hla; (8) variante de SpA, IsdA, ClfB y SdrD; (9) variante de SpA, IsdA, ClfB, SdrD, y la variante Hla o Hla; (10) variante de SpA, IsdA, ClfB y SdrD; (11) variante de SpA, IsdA, SdrD, y variante Hla o Hla; (12) variante de SpA, IsdA, y variante Hla o Hla; (13) variante de SpA, IsdA, ClfB, y variante Hla o Hla; (14) variante de SpA, ClfB y SdrD; (15) variante de SpA, ClfB, y variante Hla o Hla; o (16) variante de SpA, SdrD, y la variante Hla o Hla.

En ciertos aspectos, una bacteria que administra una composición de la invención estará limitada o atenuada con respecto al crecimiento prolongado o persistente o a la formación de abscesos. En otro aspecto más, la/s variante/s de SpA pueden sobreexpresarse en una bacteria atenuada para potenciar o complementar además una respuesta inmune o una formulación de vacuna.

La expresión "proteína EsxA" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos EsxA de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas EsxA de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína EsxB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos EsxB de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas EsxB de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína SdrD" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos SdrD de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas SdrD de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína SdrE" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos SdrE de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas SdrE de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína IsdA" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos IsdA de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas IsdA de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína IsdB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos IsdB de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas IsdB de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína Eap" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos Eap de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas Eap de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína Ebh" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos Ebh de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas Ebh de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína Emp" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos Emp de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas Emp de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína EsaB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos EsaB de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas EsaB de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína EsaC" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos EsaC de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas EsaC de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína SdrC" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos SdrC de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune

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contra las proteínas SdrC de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína ClfA" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos ClfA de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas ClfA de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína ClfB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos ClfB de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas ClfB de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína Coa" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos Coa de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas Coa de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína Hla" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos Hla de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas Hla de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína IsdC" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos IsdC de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas IsdC de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína SasF" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos SasF de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas SasF de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína vWbp" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos vWbp (proteína de unión al factor de von Willebrand) de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas vWbp de las bacterias estafilocócicas.

La expresión "proteína vWh" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos vWh (homólogo de la proteína de unión al factor de von Willebrand) de tipo silvestre aislados de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas vWh de las bacterias estafilocócicas.

Una respuesta inmune se refiere a una respuesta humoral, a una respuesta celular o a una respuesta tanto humoral como celular en un organismo. Una respuesta inmune se puede medir mediante ensayos que incluyen, pero sin limitación, ensayos que miden la presencia o la cantidad de anticuerpos que reconocen de forma específica una proteína o una proteína de la superficie celular, ensayos que miden la activación o proliferación de linfocitos T, y/o ensayos que miden la modulación en términos de la actividad o la expresión de una o más citocinas.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsxA. En ciertos aspectos, la proteína EsxA tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsxB. En ciertos aspectos, la proteína EsxB tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SdrD. En ciertos aspectos, la proteína SdrD tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SdrE. En ciertos aspectos, la proteína SdrE tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína IsdA. En ciertos aspectos, la proteína IsdA tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

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En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína IsdB. En ciertos aspectos, la proteína IsdB tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsaB. En ciertos aspectos, la proteína EsaB tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína ClfB. En ciertos aspectos, la proteína ClfB tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína IsdC. En ciertos aspectos, la proteína IsdC tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SasF. En ciertos aspectos, la proteína SasF tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SdrC. En ciertos aspectos, la proteína SdrC tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína ClfA. En ciertos aspectos, la proteína ClfA tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Eap. En ciertos aspectos, la proteína Eap tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nO: 23.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Ebh. En ciertos aspectos, la proteína Ebh tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Emp. En ciertos aspectos, la proteína Emp tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsaC. En ciertos aspectos, la proteína EsaC tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. La secuencia de los polipéptidos EsaC pueden encontrarse en las bases de datos de proteínas e incluye, pero sin limitación, los números de acceso ZP_02760162 (GI:168727885), NP_645081.1 (GI:21281993) y NP_370813.1 (GI:15923279).

En aspectos adicionales más de la divulgación, una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que sea o sea al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o

similar a una proteína Coa. En ciertos aspectos, la proteína Coa tendrá toda o una parte de la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

similar a una proteína Hla. En ciertos aspectos, la proteína Hla tendrá toda o una parte de la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

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similar a una proteína vWa. En ciertos aspectos, la proteína vWa tendrá toda o una parte de la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

similar a una proteína vWbp. En ciertos aspectos, la proteína vWbp tendrá toda o una parte de la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

En ciertos aspectos, un polipéptido o segmento/fragmento puede tener una secuencia que sea al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia. El término “similitud” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia que tiene un determinado porcentaje de aminoácidos que bien son idénticos con el polipéptido de referencia o constituyen sustituciones conservativas con los polipéptidos de referencia.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8,9,10,11,12, 13,14, 15 o más aminoácidos de la variante dentro de al menos, o como máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,

50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,

81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,

109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186,187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1.000 o más aminoácidos contiguos, o cualquier intervalo derivable de los mismos, de SEQ ID NO: 2-30 o SEQ ID NO: 32-34.

Un segmento polipeptídico como el descrito en el presente documento puede incluir 3, 4, 5, 6, 7, 8,9,10,11,12,13,14, 15,16, 17 o más aminoácidos de la variante dentro de al menos, o como máximo 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,

126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,

149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,

172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186,187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,

195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217,

218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240,

241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1.000 o más aminoácidos contiguos, o cualquier intervalo derivable de los mismos, de SEQ ID nO: 2-30 o sEq ID NO: 32-34.

Las composiciones pueden formularse en una composición farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones de la invención, la bacteria estafilocócica es una bacteria de S. aureus.

En aspectos adicionales, se puede administrar una composición más de una vez a un sujeto, y se puede administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más veces. La administración de las composiciones incluye, pero sin limitación, la vía oral, parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa o diversas combinaciones de las mismas, incluyendo inhalación o aspiración.

En otros aspectos más de la divulgación, una composición comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido descrito en el presente documento o segmentos/fragmentos del mismo. Por lo general, una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido descrito en el presente documento contiene un promotor heterólogo. En ciertos aspectos, una molécula de ácido nucleico recombinante es un vector, en otros aspectos más, el vector es un plásmido. En ciertos aspectos, el vector es un vector vírico. En ciertas realizaciones, una composición incluye una bacteria no estafilocócica recombinante que contiene o expresa un polipéptido descrito en el presente documento. En determinadas realizaciones, la bacteria no estafilocócica recombinante es Salmonella u otra bacteria gram-positiva. Una composición normalmente se administra a mamíferos tales como sujetos humanos, pero se contempla la administración a otros animales que sean capaces de generar una respuesta inmune. En realizaciones adicionales, la bacteria estafilocócica que contiene o expresa el polipéptido es Staphylococcus aureus. En realizaciones adicionales, la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora.

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En aspectos adicionales, una composición comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica todo o parte de una o más proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, SpA, vWbp o vWh, o péptido o variante de la misma. Otros antígenos estafilocócicos adicionales que se pueden usar en combinación con los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg +, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG/Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento wO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SsP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina. En determinados aspectos, una bacteria es una bacteria no estafilocócica recombinante, tal como una Salmonella u otra bacteria gram-positiva.

Las composiciones de la invención normalmente se administran a sujetos humanos, pero se contempla la administración a otros animales que son capaces de generar una respuesta inmune a una bacteria estafilocócica, en particular, ganado, caballos, cabras, ovejas y otros animales domésticos, es decir, mamíferos.

En ciertas realizaciones, la bacteria estafilocócica es Staphylococcus aureus. En realizaciones adicionales, la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora. En otros aspectos más, las composiciones de la invención se pueden usar en la prevención, mejora, reducción o tratamiento de la infección de tejidos o glándulas, por ejemplo, glándulas mamarias, en particular, mastitis y otras infecciones. Otros métodos incluyen, pero sin limitación, la reducción de forma profiláctica de la carga bacteriana en un sujeto que no muestra signos de infección, en particular, aquellos sujetos que se sospecha que están o que se encuentran en riesgo de ser colonizados por una bacteria diana, por ejemplo, pacientes que están o estarán en riesgo o serán susceptibles de infección durante una estancia, un tratamiento y/o una recuperación en el hospital.

Cualquier realización tratada con respecto a un aspecto de la invención también se aplica a otros aspectos de la invención. En particular, cualquier realización tratada en el contexto de un polipéptido o péptido o ácido nucleico de la variante de SpA se puede implantar con respecto a otros antígenos, tales como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG/Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina (o ácido nucleico), y viceversa. También se entiende que se pueden excluir específicamente de la composición reivindicada una o más de Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (RaP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG/Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, sSp-2 y/o proteína de unión a Vitronectina.

Las realizaciones de la invención incluyen composiciones que contienen o no contienen una bacteria. Una composición puede incluir o puede no incluir una bacteria estafilocócica atenuada o viable o intacta. En ciertos aspectos, la composición comprende una bacteria que no es una bacteria estafilocócica o no contiene una bacteria estafilocócica. En ciertas realizaciones, una composición bacteriana comprende una variante de la proteína A estafilocócica aislada o expresada de forma recombinante. La composición puede ser o incluir una bacteria estafilocócica modificada por ingeniería genética de forma recombinante, que haya sido modificada de forma que comprenda modificar específicamente la bacteria con respecto a un factor de virulencia secretado o a una proteína de la superficie celular. Por ejemplo, la bacteria se puede modificar de forma recombinante para expresar más de un factor de virulencia o una proteína de la superficie celular de lo que expresaría si no estuviera modificada.

El término “aislado” puede referirse a un ácido nucleico o a un polipéptido que se encuentra sustancialmente libre de material celular, material bacteriano, material vírico o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de

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ADN recombinante) de su fuente de origen, o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetizan químicamente). Además, un compuesto aislado se refiere a aquel que se puede administrar a un sujeto como un compuesto aislado; en otras palabras, el compuesto no puede considerarse simplemente como “aislado” si está adherido a una columna o embebido en gel de agarosa. Además, un “fragmento de ácido nucleico aislado” o “péptido aislado” es un fragmento de ácido nucleico o proteína que no es de origen natural como fragmento y/o normalmente no se encuentra en estado funcional.

Las fracciones de la invención, tales como polipéptidos, péptidos, antígenos o inmunógenos, se pueden conjugar o enlazar de forma covalente o no covalente con otras fracciones tales como adyuvantes, proteínas, péptidos, soportes, fracciones de fluorescencia o marcadores. El término “conjugado” o “inmunoconjugado” se usa ampliamente para definir la asociación operativa de una fracción con otro agente y no pretende referirse exclusivamente a cualquier tipo de asociación operativa, y no se limita en particular a la “conjugación” química. En particular, se contemplan las proteínas de fusión recombinantes. Las composiciones de la invención pueden además comprender un adyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un adyuvante puede acoplarse de forma covalente o no covalente a un polipéptido o péptido de la invención. En ciertos aspectos, el adyuvante se conjuga químicamente a una proteína, un polipéptido o un péptido.

El término “proporcionar” se usa de acuerdo con su significado habitual para indicar “suministrar o facilitar para su uso”. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína se proporciona directamente mediante la administración de la proteína, mientras que en otros aspectos, la proteína se proporciona de manera eficaz administrando un ácido nucleico que codifica la proteína. En ciertos aspectos, la divulgación contempla composiciones que comprenden diversas combinaciones de ácido nucleico, antígenos, péptidos y/o epítopos.

El sujeto tendrá (por ejemplo, está diagnosticado con una infección estafilocócica), se sospechará que tenga o estará en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica. Las composiciones de la presente invención incluyen composiciones inmunogénicas en las que el/los antígeno/s o el/los epítopo/s está/n contenido/s en una cantidad eficaz para lograr el fin deseado. Más concretamente, una cantidad eficaz significa una cantidad de principios activos necesarios para estimular o generar una respuesta inmune, o proporcionar resistencia a, mejora de o mitigación de una infección. En aspectos más específicos, una cantidad eficaz evita, alivia o mejora los síntomas de una enfermedad o infección, o prolonga la supervivencia del sujeto que se está tratando. La determinación de la cantidad eficaz es competencia de los expertos en la materia, en especial, en vista de la divulgación detallada que se proporciona en el presente documento. Para cualquier preparación usada en los métodos de la invención, se puede estimar inicialmente una cantidad o dosis eficaz a partir de estudios in vitro, cultivos celulares y/o ensayos con modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una respuesta inmune deseada o concentración o título de anticuerpo en circulación. Dicha información se puede usar para determinar de forma más exacta las dosis útiles en seres humanos.

Las realizaciones del apartado de ejemplos se entienden como realizaciones de la invención que son aplicables a todos los aspectos de la invención.

El uso del término “o" en las reivindicaciones se usa para referirse a “y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas se excluyan entre sí, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere solo a alternativas y a "y/o". También se contempla que cualquier cosa enumerada usando el término "o" se puede excluir específicamente.

A lo largo de la presente solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la desviación típica del error para el dispositivo o método que se está empleando para determinar el valor.

Siguiendo la ley de patentes de larga data, los términos "un" y "una", cuando se usan junto con la expresión "que comprende/n" en las reivindicaciones o en la memoria descriptiva, denota uno o más, a menos que se indique específicamente.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones específicas de la invención, se dan únicamente a modo ilustrativo, ya que hay diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención que serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la presente descripción detallada.

Descripción de las figuras

De modo que la materia en la que se logran las características, ventajas y objetos de la invención mencionados anteriormente, así como otros que se aclararán y que pueden entenderse en detalle, en los dibujos adjuntos, se ilustran descripciones más concretas y ciertas realizaciones de la invención brevemente resumidas anteriormente. Estos dibujos forman parte de la memoria descriptiva. Sin embargo, debe observarse que los dibujos adjuntos ilustran ciertas realizaciones de la invención y, por lo tanto, no deben considerarse como limitantes en su alcance.

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FIG. 1A-1B. (FIG. 1A) Estructura primaria del precursor de Proteína A con un péptido señal del motivo YSIRK N- terminal, cinco dominios de unión a inmunoglobulina como repeticiones en tándem designadas como E, D, A, B, C, región X y la señal de clasificación LPXTG. (FIG. 1B) Después de la síntesis del precursor de Proteína A, los estafilococos secretan este producto a través de la vía Sec, y la sortasa A escinde la señal de clasificación LPXTG entre los restos T y G. el ataque nucleófilo del grupo amino dentro del lípido II en el producto intermedio enlazado a tioéster de proteína A de sortasa forma el enlace de amida que se enlaza la Proteína A a la envoltura de la pared celular y permite su visualización en la superficie bacteriana.

FIG. 2. Modelo tridimensional de las interacciones moleculares entre el dominio D de SpA de la proteína A, el dominio Fab de VH3 del receptor de la linfocitos B y el dominio Fcy de la inmunoglobulina. El modelo se deriva de dos estructuras cristalinas (Graille et al., 2000 y Gouda et al., 1992) que revelaron restos de cadenas laterales implicadas en la formación de enlaces iónicos que permiten estos complejos. Gln-9 y Gln-10 de SpA-D potencian la unión a Fcy, mientras que Asp-36 y Asp-37 permiten la formación de complejos con Fab de VH3.

FIG. 3. Panel izquierdo - La SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie revela la posición migratoria de SpA, SpA-D, SpA-DQ9,10K;d36,37a, IgG humana y sortasa A (SrtA) marcadas con His purificadas, una proteína de control. Panel derecho - SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie para revelar la elución de complejos de inmunoglobulina de proteína A eluidos después de la cromatografía de afinidad de IgG humana en columnas de Ni-NTA precargadas con SpA, SpA-D, SpA-DQ9,10K;D36,37A o SrtA.

FIG. 4. Ensayos ELISA para cuantificar la inmunoglobulina humana (hlgG), fragmentos de IgG F(ab)2 humanos y fragmentos de Fc humanos de inmunoglobulina (hFc). Se recubrieron las placas con cantidades iguales de SpA marcada con His, SpA-D, SpADQ9,10K;D36,37A o SrtA. Se añadieron hlgG-HRP, F(ab)2-HRP y hFc-HRP a las placas y se incubaron durante una hora. Se registró la absorbancia a 450 nm y representó gráficamente para determinar la mitad de los títulos máximos.

FIG. 5. Se inyectaron SpA-D purificado, SpA-DQ9,10K;D36,37A o un control simulado de PBS en el peritoneo de ratones y se analizaron en cuanto a su capacidad para reducir la población de linfocitos B en el bazo de ratones BALB/c experimentales. Los animales se sacrificaron 4 horas después de la inyección, se les extirpó el bazo, se homogenizó el tejido y se tiñó con anticuerpos CD19 dirigidos contra linfocitos B. El número de linfocitos B se cuantificó por clasificación FACS.

FIG. 6. Generación de una vacuna de proteína A no toxigénica. a, producto de la traducción de proteína A (SpA) de S. aureus Newman y USA300 LAC con un péptido señal N-terminal (recuadro blanco), cinco dominios de unión a inmunoglobulina (IgBD designados E, D, A, B y C), señal de clasificación de región X y C-terminal variable (recuadro negro). b. secuencia de aminoácidos de las cinco IgBD así como de SpA-Dkkaa no toxigénica, con las posiciones de haces a-helicoidales triples (HI, H2 y H3), así como glutamina (Q) 9, 10 y aspartato (D) 36, 37 indicados. c, SDS-PAGE teñida con azul Coomassie de SpA, SpA-D, SpA-Dkkaa o SrtA purificada en Sefarosa Ni-NTA en presencia o ausencia de inmunoglobulina humana (hlgG). d, ELISA que examina la asociación de SpA, SpA-D o SpA-Dkkaa inmovilizado con IgG humana, así como sus fragmentos Fc o F(ab)2 y el factor de von Willebrand (vWF). e, se cuantificaron mediante FACS linfocitos B CD19+ en el tejido esplénico de ratones BALB/c que se habían inmunizado de manera simulada o tratado con SpA-D o SpA-Dkkaa.

FIG. 7. La vacuna de proteína A no toxigénica previene la formación de abscesos. Histopatología del tejido renal aislado durante la necropsia de ratones BALB/c que habían sido inmunizados de manera simulada (PBS) o vacunados con SpA, SpA-D, así como SpA-Dkkaa y expuestos a S. aureus Newman. Se tiñeron los tejidos seccionados finos con hematoxilina-eosina. Las flechas blancas identifican infiltrados de leucocitos polimorfonucleares (PMN). Las flechas oscuras identifican las comunidades de abscesos estafilocócicas.

FIG. 8. Los anticuerpos generados por la vacuna de proteína A no toxigénica bloquean la función superantigénica de los linfocitos B de SpA. a, los anticuerpos de conejo generados contra SpA-Dkkaa se purificaron en una matriz con antígeno inmovilizado y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con azul Coomassie. Los anticuerpos se escindieron con pepsina y los fragmentos F(ab)2 se purificaron mediante una segunda serie de cromatografía de afinidad en matriz de SpA-Dkkaa. b, los F(ab)2 específicos de SpA-Dkkaa interfieren con la unión de SpA o SpA-D a inmunoglobulina humana (hlgG) o; c, al factor de von Willebrand (vWF).

FIG. 9. La proteína A no toxigénica de longitud completa genera mejores respuestas inmunitarias. a, Se purificó SpAkkaa de longitud completa sobre Sefarosa Ni-NTA y se analizó mediante SDS-PAGE teñida con azul Coomassie. b, los linfocitos B CD19+ en tejido esplénico de ratones BALB/c que se habían inmunizado de forma simulada o tratado con SpA o SpAkkaa se cuantificaron mediante FACS. c, ELISA que examina la asociación de SpA inmovilizada o SpAkkaa con IgG humana, así como sus fragmentos Fc o F(ab)2 o factor de von Willebrand (vWF). d, títulos de anticuerpos en suero humano o murino contra el toxoide diftérico (CRM197) y SpAkkaa no toxigénico o SpA-Dkkaa. Se examinaron voluntarios humanos con antecedentes de inmunización con DTaP e infección por estafilococos (n = 16), así como ratones (n = 20) que se habían infectado con S. aureus Newman o USA 300 LAC o inmunizado con SpAkkaa o SpA-Dkkaa mediante transferencia puntual cuantitativa.

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FIG. 10. La infección estafilocócica no genera inmunidad protectora. Se infectaron ratones BALB/c (n = 20) con S. aureus Newman o con una exposición simulada (PBS) durante treinta días, y la infección se eliminó con tratamiento con cloranfenicol. Ambas cohortes de animales fueron expuestas a S. aureus Newman, y se analizó carga bacteriana (UFC) en tejido homogenizado de riñón después de la necropsia realizada en el día 4.

FIG. 11. Comparación de la formación de abscesos en ratones tratados con PBS, SpA, SpA-D y SpA-Dkkaa.

FIG. 12A-12C (A). ELISA que examina la asociación de SpA, SpA-D, SpA-D kkaa o SpA-Dggss inmovilizadas con IgG humana, así como sus fragmentos Fc o F(ab)2 e IgM. Se comparó la significación estadística de la unión de SpA-D kkaa y SpA-Dggss a cada ligando frente a SpA-D; la unión de SpA-D se comparó con SpA (n = 3); * significa p < 0,05; ** significa p < 0,01. (B) ELISA que examina el nivel de anticuerpos de reacción cruzada de muestras de suero hiperinmune recogidas de ratones inmunizados activamente (n = 5) con SpA-D, SpA-Dkkaa y SpA-Dggss. (C) Formación de abscesos en ratones tratados con PBS, SpA-D, SpA-Dkkaa y SpA-Dggss.

Descripción detallada

Staphylococcus aureus es un comensal de la piel y de los orificios nasales de los seres humanos, y la causa principal de infecciones en el torrente sanguínea, en la piel y en tejidos blandos (Klevens et al., 2007). El reciente y drástico aumento de la mortalidad de las enfermedades estafilocócicas se atribuye a la propagación de las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) que no suelen ser susceptibles a los antibióticos (Kennedy et al., 2008). En un gran estudio retrospectivo, la incidencia de infecciones por MRSA fue del 4,6 % de todas las admisiones hospitalarias en Estados Unidos (Klevens et al., 2007). Los costes del cuidado sanitario anual para 94.300 individuos infectados con una MRSA en Estados Unidos superan los 2,4 miles de millones de dólares (Klevens et al., 2007). La actual MRSA epidémica ha precipitado una crisis en la salud pública que es necesario abordar mediante el desarrollo de una vacuna preventiva (Boucher y Corey, 2008). Hasta la fecha, no se dispone de una vacuna autorizada por la FDA que prevenga las enfermedades por S. aureus.

Los inventores describen en el presente documento el uso de la proteína A, una proteína de superficie anclada a la pared celular de los estafilococos, para la generación de variantes que puedan servir como vacunas subunitarias. La patogénesis de las infecciones estafilocócicas se inicia a medida que las bacterias van invadiendo la piel o el torrente sanguíneo a través de un traumatismo, heridas quirúrgicas o dispositivos médicos (Lowy, 1998). Aunque el patógeno invasor puede ser fagocitado y destruido, los estafilococos también pueden escapar de las defensas inmunes naturales y sembrar infecciones en los tejidos de los órganos, lo que induce a respuestas inflamatorias que atraen macrófagos, neutrófilos, y otros fagocitos (Lowy, 1998). La respuesta de invasión de las células inmunes en el sitio de la infección está acompañada por la necrosis por licuefacción, ya que el hospedador busca evitar la propagación estafilocócica y permite la eliminación de los restos de tejido necrótico (Lam et al., 1963). Dichas lesiones se pueden observar mediante microscopía como zonas hipercelulares que contienen tejido necrótico, leucocitos y un nido central de bacterias (Lam et al., 1963). A menos que los abscesos estafilocócicos se drenen quirúrgicamente y se traten con antibióticos, la infección diseminada y la septicemia producen un resultado letal (Sheagren, 1984).

II. ANTÍGENOS ESTAFILOCÓCICOS

A. Proteína A estafilocócica (SpA)

Todas las cepas de Staphylococcus aureus expresan el gen estructural para la proteína A (spa) (Jensen, 1958; Said- Salim et al., 2003), un factor de virulencia bien caracterizado cuyo producto proteico de superficie anclado a la pared celular (SpA) abarca cinco dominios de unión a la inmunoglobulina altamente homólogos denominados E, D, A, B y C (Sjodahl, 1977). Estos dominios muestran ~ 80 % de identidad a nivel de los aminoácidos, son de 56 a 61 restos de longitud, y están organizados como repeticiones en tándem (Uhlen et al., 1984). La SpA se sintetiza como una proteína precursora con un péptido señal YSIRK/GS N-terminal y una señal de clasificación del motivo LPXTG C- terminal (DeDent et al., 2008; Schneewind et al., 1992). La proteína A anclada a la pared celular se muestra en gran abundancia en la superficie estafilocócica (DeDent et al., 2007; Sjoquist et al., 1972). Cada uno de sus dominios de unión a inmunoglobulina se compone de hélices a anti-paralelas que se unen en un haz de tres hélices y se unen al dominio Fc de la inmunoglobulina G (IgG) (Deisenhofer, 1981; Deisenhofer et al., 1978), la cadena pesada de VH3 (Fab) de la IgM (es decir, el receptor de linfocitos B) (Graille et al., 2000), el factor de von Willebrand en su dominio A1 [vWF AI es un ligando para plaquetas] (O'Seaghdha et al., 2006) y el receptor I (TNFRI) del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) (Gomez et al., 2006), que se muestra sobre las superficies de los epitelios de las vías respiratorias (Gomez et al., 2004; Gomez et al., 2007).

La SpA impide la fagocitosis de neutrófilos de estafilococos mediante su característica de unirse al componente Fc de la IgG (Jensen, 1958; Uhlen et al., 1984). Además, la SpA es capaz de activar la coagulación intravascular mediante su unión a los dominios AI del factor de von Willebrand (Hartleib et al., 2000). Las proteínas plasmáticas tales como el fibrinógeno y la fibronectina actúan como puentes entre los estafilococos (CIfA y CIfB) y la integrina de plaquetas GPIIb/IIIa (O'Brien et al., 2002), una actividad que se complementa a través de la asociación de la proteína A con vWF AI, lo que permite a los estafilococos capturar las plaquetas a través del receptor de plaquetas

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GPIb-a (Foster, 2005; O'Seaghdha et al., 2006). La SpA también se une al TNFRI y esta interacción contribuye a la patogénesis de neumonía estafilocócica (Gomez et al., 2004). La SpA activa la señalización proinflamatoria a través de la activación de TRAF2 mediada por TNFR1, la quinasa p38/c-Jun, proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y el factor de transcripción Rel NF-KB. La unión a SpA además induce la supresión de TNFR1, una actividad que parece requerir la enzima conversora del TNF (TACE) (Gomez et al., 2007). Todas las actividades de SpA anteriormente mencionadas están mediadas a través de sus cinco dominios de unión a IgG y pueden modificarse mediante las mismas sustituciones de aminoácidos, inicialmente definidas por su requerimiento para la interacción entre la proteína A y la IgG1 humana (Cedergren et al., 1993).

SpA también funciona como un superantígeno de los linfocitos B mediante la captura de la región Fab de la IgM portadora de VH3, el receptor de linfocitos B (Gomez et al., 2007; Goodyear et al., 2003; Goodyear y Silverman, 2004; Roben et al., 1995). Tras la exposición por vía intravenosa, las mutaciones de la proteína A estafilocócica (SpA) muestran una reducción en la carga estafilocócica en los tejidos de los órganos y reduce de forma drástica la capacidad de formar abscesos (descrita en el presente documento). Durante la infección por S. aureus de tipo silvestre, se forman abscesos en un período de cuarenta y ocho horas, y se pueden detectar mediante microscopía óptica del tejido renal en secciones finas y coloreado con hematoxilina-eosina, inicialmente marcado por un flujo de entrada de leucocitos polimorfonucleares (PMN). El día 5 de la infección, los abscesos aumentan de tamaño y encierran una población central de estafilococos, rodeada por una capa de material amorfo eosinófilo y una gran masa de PMN. La histopatología reveló una necrosis masiva de PMN en la proximidad del nido estafilocócico en el centro de las lesiones de abscesos, además de una capa de fagocitos sanos. Los inventores además observaron un borde de PMN necróticos en la periferia de lesiones de abscesos, bordeando la pseudocápsula eosinófila que separaba el tejido renal sano de la lesión infecciosa. Las variantes estafilocócicas carentes de la proteína A no son capaces de establecer los rasgos histopatológicos de los abscesos, y se eliminan durante la infección.

En estudios previos, Cedergren et al. (1993) diseñaron cinco sustituciones individuales en el subdominio de unión al fragmento Fc del dominio B de SpA, L17D, N28A, I31A y K35A. Estos autores crearon estas proteínas para analizar los datos reunidos de una estructura tridimensional de un complejo entre un dominio de SpA y Fc1. Cedergren et al. determinaron los efectos de estas mutaciones sobre la estabilidad y la unión, pero no completaron el uso de dichas sustituciones para la producción de un antígeno de la vacuna.

Brown et al. (1998) describen estudios diseñados para crear nuevas proteínas basadas en SpA que permitan el uso de condiciones de elución más favorables cuando se usan como ligandos de afinidad. Las mutaciones estudiadas incluyeron mutaciones únicas de Q13A, Q14H, N15A, N15H, F17H, Y18F, L21H, N32H o K39H. Brown et al. informan que las sustituciones de Q13A, N15A, N15H y N32H tuvieron poca diferencia con los valores de la constante de disociación, y que la sustitución de Y18F produjo la reducción del doble en la afinidad de unión en comparación con la SpA de tipo silvestre. Brown et al. también informan que las sustituciones de L21H y F17H disminuyen la afinidad de unión cinco veces y cien veces respectivamente. Los autores también estudiaron sustituciones análogas en dos dominios en tándem. Por lo tanto, los estudios de Brown et al. se dirigieron a generar una SpA con un perfil de elución más favorable, de ahí el uso de las sustituciones de His para proporcionar una alteración sensible al pH en la afinidad de unión. Brown et al. no mencionaron el uso de SpA como antígeno vacunal.

Graille et al. (2000) describen una estructura cristalina del dominio D de SpA y el fragmento Fab de un anticuerpo IgM humano. Graille et al. definen, mediante el análisis de una estructura cristalina, los restos de aminoácidos del dominio D que interactúan con el fragmento Fab como restos Q26, G29, F30, Q32, S33, D36, D37, Q40, N43, E47 o L51, así como los restos de aminoácido que forman la superficie de contacto entre los subdominios del dominio D. Graille et al. definen las interacciones moleculares de estas dos proteínas, pero no mencionan ningún uso de sustituciones en los restos que interactúan para producir un antígeno vacunal.

O'Seaghdha et al. (2006) describe estudios sobre la dilucidación de qué subdominio del dominio D se une a vWF. Los autores generaron mutaciones únicas bien en los subdominios de unión a Fc o a VH3, es decir, los restos de aminoácidos F5A, Q9A, Q10A, F13A, Y14A, L17A, N28A, I31A, K35A, G29A, F30A, S33A, D36A, D37A, Q40A, E47A o Q32A. Los autores descubrieron que vWF se une al mismo subdominio que se une Fc. O'Seaghda et al. definen el subdominio del dominio D responsable de la unión a vWF, pero está silenciado con respecto a cualquier uso de sustituciones en los restos que interactúan en la producción de un antígeno vacunal.

[0113] Gomez et al. (2006) describe la identificación de los restos responsables de la activación del TNFR1 mediante el uso de mutaciones únicas de F5A, F13A, Y14A, L17A, N21A, I31a, Q32A y K35A. Gomez et al. no mencionan ningún uso de las sustituciones en los restos de interacción en la producción de un antígeno vacunal.

Se purificó proteína A recombinante marcada por afinidad, un polipéptido que abarca los cinco dominios de la IgG (EDCAB) (Sjodahl, 1977), pero que carece de la región X C-terminal (Guss et al., 1984), de E. coli recombinante y se usó como un antígeno vacunal (Stranger-Jones et al., 2006). Debido a la propiedad de la SpA de unirse a la parte Fc de la IgG, no se puede medir una respuesta inmune humoral específica a la proteína A (Stranger-Jones et al., 2006). Los inventores han superado este obstáculo a través de la generación de SpA-DQ9,10K;D36,37A. Los ratones BALB/c inmunizados con la proteína A recombinante (SpA) mostraron una protección significativa contra la exposición por vía intravenosa con cepas de S. aureus: una reducción logarítmica de 2.951 en la carga

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estafilocócica en comparación con el tipo silvestre (p > 0,005; prueba t de Student) (Stranger-Jones et al., 2006). Los anticuerpos específicos de SpA pueden causar un aclaramiento fagocítico previo a la formación de abscesos de la barrera eosinófilo mencionada anteriormente en los abscesos que separan las comunidades estafilocócicas de las células inmunes, ya que estas no se forman durante la infección con las cepas de mutantes de la proteína A. Cada uno de los cinco dominios de SpA (es decir, los dominios formados a partir de haces de tres hélices denominados E, D, A, B y C) ejerce propiedades de unión similares (Jansson et al., 1998). La estructura cristalina y en solución del dominio D se ha solucionado con y sin los ligandos Fc y VH3 (Fab), que se unen a la proteína A de forma no competitiva en sitios distintos (Graille et al., 2000). Las mutaciones en los restos que se sabe están implicados en la unión a IgG (FS, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 y K35), también se requieren para la unión de vWF AI y TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gomez et al., 2006; O'Seaghdha et al., 2006), mientras que los restos importantes para la interacción de VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) parecen no tener impacto sobre las otras actividades de unión (Graille et al., 2000; Jansson et al., 1998). SpA se dirige específicamente a un subconjunto de linfocitos B que expresa IgM relacionada con la familia VH3 en su superficie, es decir, receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Ante la interacción con SpA, estos linfocitos B proliferan y se destinan a la apóptosis, lo que conduce a una eliminación preferencial y prolongada de los linfocitos B de tipo innato (es decir, los linfocitos B de la zona marginal y los linfocitos B2 foliculares) (Goodyear et al., 2003; Goodyear et al., 2004).

Base molecular de la función y presentación en la superficie de la proteína A. La proteína A se sintetiza como precursor en el citoplasma bacteriano y se secreta a través de su péptido señal YSIRK en su pared transversal, es decir, el septo de división celular de los estafilococos (FIG. 1) (DeDent et al., 2007; De Dent et al., 2008). Tras la escisión de la señal de clasificación LPXTG C-terminal, la proteína A se ancla a puentes transversales del péptidoglicano bacteriano mediante la sortasa A (Mazmanian et al., 1999; Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 2000). La proteína A es la proteína de superficie más abundante de los estafilococos; la molécula es expresada por casi todas las cepas de S. aureus (Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008; Said-Salim et al., 2003). Los estafilococos giran en torno al 15-20 % de su pared celular por ciclo de división (Navarre y Schneewind, 1999). Las hidrolasas murinas escinden las cadenas de glicano y los péptidos de la pared del péptidoglicano, liberando de este modo la proteína A con su tetrapéptido disacárido de la pared celular C-terminal hacia el medio extracelular (Ton- That et al., 1999). Por tanto, mediante su diseño fisiológico, la proteína A tanto se ancla a la pared celular como se muestra sobre la superficie bacteriana, pero también se libera hacia los tejidos circundantes durante la infección del hospedador (Marraffini et al., 2006).

La proteína A captura inmunoglobulinas en la superficie bacteriana y esta actividad bioquímica permite el escape estafilocócico de las respuestas inmunes innatas y adquiridas del hospedador (Jensen, 1958; Goodyear et al., 2004). Lo interesante es que la región X de la proteína A (Guss et al., 1984), un dominio de repetición que une los dominios de unión a IgG a la señal de clasificación LPXTG/anclaje a la pared celular, es quizás la parte más variable del genoma estafilocócico (Said-Salim, 2003; Schneewind et al., 1992). Cada uno de los cinco dominios de unión a la inmunoglobulina de la proteína A (SpA), formados a partir de haces de tres hélices y denominados E, D, A, B y C, ejerce propiedades funcionales y estructurales similares (Sjodahl, 1977; Jansson et al., 1998). La estructura cristalina y en solución del dominio D se ha resuelto con y sin los ligandos Fc y VH3 (Fab), que se unen a la proteína A de una forma no competitiva en distintos sitios (Graille 2000).

En el complejo de estructura cristalina, Fab interactúa con la hélice II y la hélice III del dominio D a través de una superficie compuesta de cuatro cadenas p de la región VH (Graille 2000). El eje principal de la hélice II del dominio D es de aproximadamente 50° con respecto a la orientación de las cadenas, y la parte interhelicoidal del dominio D es la más próxima a la cadena C0. El sitio de interacción en Fab se encuentra apartado de la región constante de la cadena pesada y la cadena ligera de la Ig. La interacción implica los siguientes restos del dominio D: Asp-36 de la hélice II, Asp-37 y Gln-40 en el bucle entre la hélice II y la hélice III y otros restos diversos (Graille, 2000). Ambas superficies de interacción se componen predominantemente de cadenas laterales polares, con tres restos de carga negativa en el dominio D y dos restos de carga positiva en Fab 2A2 enterrado por la interacción, lo que proporciona una atracción electroestática global entre las dos moléculas. De las cinco interacciones polares identificadas entre Fab y el dominio D, tres son entre las cadenas laterales. Se forma un puente de sal entre Arg-H19 y Asp-36, y se realizan dos enlaces de hidrógeno entre Tyr-H59 y Asp-37, y entre Asn-H82a y Ser-33. Debido a la conservación de Asp-36 y Asp-37 en los cinco dominios de unión a IgG de la proteína A, los inventores mutaron estos restos.

Los sitios SpA-D responsables de la unión a Fab se encuentran estructuralmente separados de la superficie del dominio que media en la unión a Fcy. La interacción de Fcy con el dominio D implica principalmente a los restos en la hélice I, con una menor implicación de la hélice II (Gouda et al., 1992; Deisenhofer, 1981). A excepción de Gln-32, un contacto de poca importancia en ambos complejos, ninguno de los restos que median en la interacción de Fcy participa en la unión a Fab. Para examinar la relación espacial entre estos diferentes sitios de unión a Ig, se han superpuesto los dominios de SpA en estos complejos para construir un modelo de un complejo entre Fab, el dominio D de SpA y la molécula Fcy. En este modelo ternario, Fab y Fcy forman una estructura de tipo sándwich en torno a las caras opuestas de la hélice II sin evidencia de impedimento estérico de ninguna de las interacciones. Dichos hallazgos ilustran cómo, a pesar de su pequeño tamaño (es decir, 56-61 aa), un dominio de SpA puede mostrar simultáneamente ambas actividades, lo que explica la evidencia experimental de que las interacciones de Fab con un dominio individual son no-competitivas. Los restos para la interacción entre SpA-D y Fcy son Gln-9 y Gln-10.

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Por el contrario, la ocupación de la parte Fc de IgG en el dominio D bloquea su interacción con el vWF A1 y probablemente también el TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006). Las mutaciones en los restos esenciales para la unión a Fc de IgG (F5, Q9, Q10, S11, f13, Y14, L17, N28, I31 y K35) también se requieren para la unión a vWF A1 y a TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006; Cedergren et al., 1993; Gomez et al., 2006), mientras que los restos fundamentales para la interacción con VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) no tienen impacto alguno en las actividades de unión de Fc, vWF A1 o TNFR1 de la IgG (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). La actividad de unión a Fab de la inmunoglobulina de la proteína A se dirige a un subconjunto de linfocitos B que expresan IgM relacionada con la familia Vh3 en su superficie, es decir, estas moléculas funcionan como receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Tras la interacción con SpA, estos linfocitos B proliferan rápidamente y, a continuación, se destinan a la apóptosis, lo que conduce a una eliminación preferencial y prolongada de los linfocitos B de tipo innato (es decir, linfocitos B de la zona marginal y linfocitos B2 foliculares) (Goodyear y Silverman, 2004; Goodyear y Silverman, 2003). Más del 40 % de los linfocitos B circulantes son la diana de la interacción de la proteína A, y la familia Vh3 representa la mayor familia de receptores de linfocitos B humanos que confieren respuestas humorales protectoras contra los patógenos (Goodyear y Silverman, 2004; Goodyear y Silverman, 2003). Por lo tanto, la proteína A funciona de forma análoga hacia los superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), a pesar de que esta última clase de moléculas, por ejemplo, SEB, TSST-1, TSST-2, forman complejos con el receptor de linfocitos T para estimular inadecuadamente las respuestas inmunes del hospedador, generando, de ese modo, rasgos de enfermedad característicos de las infecciones estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Dichos hallazgos en conjunto documentan las contribuciones de la proteína A en cuanto al establecimiento de infecciones estafilocócicas y en la modulación de las respuestas inmunes del hospedador.

En resumen, puede verse que los dominios de la proteína A muestran dos superficies de contacto diferentes para la unión con moléculas hospedadoras, y cualquier desarrollo de vacunas a base de proteína A debe considerar la generación de variantes que no perturben la señalización de la célula hospedadora, la agregación plaquetaria, el secuestro de inmunoglobulinas o la inducción de la proliferación y la apóptosis de linfocitos B. Dichas variantes de la proteína A deberían además ser de utilidad a la hora de analizar las vacunas para determinar la capacidad de generar anticuerpos que bloqueen las actividades de la SpA mencionadas anteriormente y ocupar los cinco dominios de repetición en sus superficies de contacto de unión doble. Dicho objetivo se articula y se aplica en el presente documento por primera vez, y se describen en detalle métodos para la generación de variantes de la proteína A que se puedan usar como una vacuna segura para seres humanos. Para alterar la unión de Fcy, vWF AI y TNFR1 a la IgG, se mutaron la glutamina (Q) 9 y la 10 [numeración obtenida a partir del dominio D de SpA como se describe en Uhlen et al., 1984], y se generaron sustituciones de lisina para ambas glutaminas, con la esperanza de que estas suprimieran las propiedades del ligando en la primera superficie de contacto de la unión. Para alterar la unión de VH3 de Fab a la IgM, se mutaron el aspartato (D) 36 y 37, siendo cada uno de ellos necesario para la asociación con el receptor de linfocitos B. Se sustituyeron tanto D36 como D37 con alanina. Las mutaciones Q9,10K y D36,37A se combinan en el presente documento en la molécula recombinante SpA-DQ9,10K;D36,37A y se ensayan para determinar las propiedades de unión de la proteína A. Además, SpA-D y SpA-DQ9,10K;D36,37A se someten a estudios de inmunización en ratones y conejos, y se analizan para determinar [1] la producción de anticuerpos específicos (SpA-D Ab); [2] la capacidad del anticuerpo contra SpA-D de bloquear la asociación entre la proteína A y sus cuatro ligandos diferentes; y, [3] las propiedades del anticuerpo contra SpA-D para generar inmunidad protectora contra infecciones estafilocócicas. (Véase el apartado de ejemplos de más adelante).

B. Coagulasas estafilocócicas

Las coagulasas son enzimas producidas por bacterias Staphylococcus que convierten el fibrinógeno en fibrina. Coa y vWh activan la protrombina si proteólisis (Friedrich et al., 2003). El complejo coagulasa-protrombina reconoce el fibrinógeno como un sustrato específico, convirtiéndolo directamente en fibrina. La estructura cristalina del complejo activo reveló la unión de los dominios D1 y D2 a la protrombina y la inserción de su Ile1-Val2 N-terminal en el bolsillo lle16, lo que induce un sitio activo funcional en el zimógeno a través de un cambio de configuración (Friedrich et al., 2003). El exositio I de la a-trombina, el sitio de reconocimiento del fibrinógeno y el proexositio I de la protrombina son bloqueados por el D2 de Coa (Friedrich et al., 2003). No obstante, la asociación del complejo tetramérico (Coa- protrombina)2 se une al fibrinógeno en un nuevo sitio con una alta afinidad (Panizzi et al., 2006). Este modelo explica las propiedades coagulantes y la eficaz conversión del fibrinógeno por parte de la coagulasa (Panizzi et al., 2006).

El fibrinógeno es una glicoproteína de gran tamaño (Mr ~340.000), formada por tres pares de cadenas Aa, Bp y y enlazadas de forma covalente para formar un “dímero de trímeros”, en el que A y B designan los fibrinopéptidos liberados por la escisión de la trombina (Panizzi et al., 2006). La molécula alargada se pliega en tres dominios separados, un fragmento E central que contiene los extremos N-terminales de las seis cadenas y dos fragmentos D flanqueantes formados principalmente por los extremos C-terminales de las cadenas Bp y y. Estos dominios globulares están conectados por largas estructuras helicoidales triples. Los complejos de coagulasa-protrombina, que convierten el fibrinógeno humano en la fibrina autopolimerizante, no son la diana de los inhibidores de trombina en circulación (Panizzi et al., 2006). Por lo tanto, las coagulasas estafilocócicas se desvían de la vía fisiológica de coagulación de la sangre.

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Todas las cepas de S. aureus secretan coagulasa y vWbp (Bjerketorp et al., 2004; Field y Smith, 1945). Aunque, en obras previas, se ha informado de importantes contribuciones de la coagulasa a la patogénesis de las infecciones estafilocócicas (Ekstedt y Yotis, 1960; Smith et al., 1947), investigaciones más recientes con herramientas de genética molecular desafiaron este punto de vista al observar fenotipos sin virulencia con modelos de endocarditis, abscesos cutáneos y mastitis en ratones (Moreillon et al., 1995; Phonimdaeng et al., 1990). La generación de variantes isogénicas de S. aureus Newman, un aislado clínico completamente virulento (Duthie et al., 1952), se describe en el presente documento, mostrando los mutantes de coa, de hecho, defectos de virulencia en un modelo de bacteriemia letal y absceso renal en ratones. Según la experiencia de los inventores, S. aureus 8325-4 no es completamente virulento, y se presupone que las lesiones mutágenas en esta cepa pueden no ser capaces de revelar defectos de virulencia in vivo. Además, los anticuerpos generados contra Coa o vWbp alteran la patogénesis de las infecciones por S. aureus Newman hasta el grado de ser un reflejo del impacto de las eliminaciones de los genes. Coa y vWbp contribuyen a la formación de abscesos estafilocócicos y bacteriemia letal, y pueden funcionar como antígenos protectores en vacunas subunitarias.

Estudios bioquímicos documentan el valor biológico de los anticuerpos contra Coa y vWbp. Mediante la unión al antígeno y el bloqueo de su asociación con factores de coagulación, los anticuerpos evitan la formación de complejos Coa-protrombina y vWbp-protrombina. Estudios de transferencia pasiva revelaron la protección de animales experimentales contra la formación de abscesos estafilocócicos y la exposición letal mediante anticuerpos de Coa y vWbp. Por lo tanto, los anticuerpos que neutralizan Coa y vWbp generan protección inmune contra la enfermedad estafilocócica.

Estudios previos revelaron la necesidad de coagulasa para resistir a la fagocitosis en sangre (Smith et al., 1947), y los inventores observaron un fenotipo similar para los mutantes de Acoa en sangre de ratón tratada con lepirudina (véase el Ejemplo 3 de más adelante). Debido a que el vWbp presenta una mayor afinidad con la protrombina humana que su homólogo en ratones, se sospecha que puede ocurrir lo mismo para las variantes de AvWbp en la sangre humana. Además, la expresión de Coa y vWbp en lesiones de abscesos, así como su sorprendente distribución en la pseudocápsula eosinófila que le rodea (las comunidades de abscesos estafilocócicos (SAC) o la pared de fibrina periférica), sugieren que las coagulasas secretadas contribuyen al establecimiento de estas lesiones. Esta hipótesis se ensayó y, de hecho, los mutantes de Acoa resultaron defectuosos en el establecimiento de abscesos. Un ensayo correspondiente, que bloquea la función de la Coa con anticuerpos específicos, produjo el mismo efecto. Por consiguiente, se propone que la coagulación de la fibrina es un hecho de vital importancia en el establecimiento de abscesos estafilocócicos que puede establecerse como diana para el desarrollo de vacunas protectoras. Debido a su función de solapamiento en la protrombina humana, tanto Coa como vWbp se consideran excelentes candidatos para el desarrollo de vacunas.

C. Otros antígenos estafilocócicos

Las investigaciones a lo largo de diversas décadas pasadas han identificado a las exotoxinas de S. aureus, las proteínas de superficie y las moléculas reguladoras como importantes factores de virulencia (Foster, 2005; Mazmanian et al., 2001; Novick, 2003). Se ha logrado un gran avance en cuanto a la regulación de estos genes. Por ejemplo, los estafilococos realizan un censo bacteriano a través de la secreción de péptidos autoinductores que se unen a un receptor afín a una concentración umbral, activando de ese modo reacciones de fosfotransferencia y la activación de la transcripción de muchos de los genes de la exotoxina (Novick, 2003). La patogénesis de las infecciones estafilocócicas se basa en estos factores de virulencia (exotoxinas secretadas, exopolisacáridos y adhesinas de superficie). El desarrollo de vacunas estafilocócicas se ve dificultado por la naturaleza multifacética de los mecanismos de invasión estafilocócica. Está bien establecido que los microorganismos vivos atenuados son vacunas sumamente eficaces; las respuestas inmunes generadas por dichas vacunas suelen ser de mayor magnitud y de mayor duración que las producidas por inmunógenos no replicantes. Una explicación para este hecho puede ser que las cepas vivas atenuadas establecen infecciones limitadas en el hospedador e imitan los estados tempranos de la infección natural. Las realizaciones de la invención se dirigen a composiciones y a métodos que incluyen polipéptidos y péptidos de la variante de SpA, así como otras proteínas, polipéptidos y péptidos extracelulares inmunogénicos (incluyendo tanto péptidos o proteínas secretadas como de la superficie celular) de bacterias gram positivas para su uso en la mitigación o inmunización contra la infección. En realizaciones particulares, la bacteria es una bacteria estafilocócica. Las proteínas, los polipéptidos o los péptidos extracelulares incluyen, pero sin limitación, proteínas secretadas y de la superficie celular de las bacterias diana.

El patógeno humano S. aureus secreta EsxA y EsxB, dos proteínas de tipo ESAT-6, a través de la envoltura bacteriana (Burts et al., 2005). Las esxA y esxB estafilocócicas se agrupan con otros seis genes en el orden de transcripción: esxA esaA essA esaB essB essC esaC esxB. Los acrónimos esa, ess y esx representan accesorios de secreción, sistema de secreción o secreción extracelular de ESAT-6, respectivamente, dependiendo de si las proteínas codificadas desempeña un papel accesorio (esa) o directo (ess) para la secreción, o si se secretan en un el medio extracelular (esx). En el presente documento, se refiere a la agrupación entera de ocho genes como la agrupación Ess. EsxA, esxB, essA, essB y essC son todos necesarios para la síntesis o secreción de EsxA y EsxB. Los mutantes que no producen EsxA, EsxB y EssC presentan defectos en la patogénesis de los abscesos murinos de S. aureus, lo que sugiere que este sistema de secreción especializado puede ser una estrategia general de la patogénesis bacteriana humana. Se ha informado de la secreción de sustratos no WXG100 por parte de la vía de

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ESX-1 para diversos antígenos incluyendo EspA, EspB, Rv3483c y Rv3615c (Fortune et al., 2005; MacGurn et al., 2005; McLaughlin et al., 2007; Xu et al., 2007). También se ha mostrado que la vía alternativa de ESX-5 secreta tanto proteínas WXG100 como no WXG100 en micobacterias patogénicas (Abdallah et al., 2007; Abdallah et al., 2006).

La vía Ess de Staphylococcus aureus puede verse como un módulo de secreción dotado de componentes de transporte especializados (Ess), factores accesorios (Esa) y sustratos de secreción afines (Esx). EssA, EssB y EssC se requieren para la secreción de EsxA y EsxB. Debido a que se prevé que son proteínas transmembrana, se contempla que estas proteínas forman un aparato de secreción. Algunas de las proteínas de esta agrupación de genes ess pueden transportar de forma activa sustratos segregados (actuando como un motor), mientras que otras pueden regular el transporte (regulador). La regulación puede realizarse, pero sin limitación, mediante mecanismos de transcripción o posteriores a la traducción para polipéptidos secretados, la clasificación de sustratos específicos para ubicaciones definidas (por ejemplo, medio extracelular o células hospedadoras) o el seguimiento del tiempo de los eventos de secreción durante la infección. En este momento, no está claro si todas las proteínas Esx secretadas funcionan como toxinas o contribuyen indirectamente a la patogénesis.

Los estafilococos se basan en la adhesión mediada por las proteínas de superficie a las células hospedadoras o la invasión de tejidos como una estrategia para escapar de las defensas inmunes. Además, S. aureus utiliza las proteínas de superficie para secuestrar el hierro del hospedador durante la infección. La mayoría de las proteínas de superficie implicadas en la patogénesis estafilocócica portan señales de clasificación C-terminales, es decir, están enlazadas de forma covalente a la envoltura de la pared celular mediante la sortasa. Además, las cepas estafilocócicas que carecen de los genes requeridos para el anclaje de las proteínas de superficie, es decir, sortasa A y B, presentan una espectacular deficiencia de virulencia en diversos modelos diferentes de enfermedad en ratón. Por lo tanto, los antígenos de las proteínas de superficie representan una diana para la vacuna validada, ya que los genes correspondientes son esenciales para el desarrollo de la enfermedad estafilocócica y pueden aprovecharse en diversas realizaciones de la invención. La superfamilia de enzimas sortasa son transpeptidasas gram-positivas responsables del anclaje de los factores de virulencia de las proteínas de superficie a la capa de peptidoglicano de la pared celular. Se han identificado dos isoformas de la sortasa en Staphylococcus aureus, SrtA y SrtB. Se ha mostrado que estas enzimas reconocen el motivo LPXTG en el sustrato proteico. La isoforma SrtB parece ser importante en la adquisición del hierro hémico y la homeostasis del hierro, mientras que la isoforma SrtA desempeña un papel de vital importancia en la patogénesis de las bacterias gram-positivas modulando la capacidad de la bacteria para adherirse al tejido del hospedador a través del anclaje covalente de las adhesinas y otras proteínas al peptidoglicano de la pared celular. En determinadas realizaciones, las variantes de SpA descritas en el presente documento se pueden usar en combinación con otras proteínas estafilocócicas tales como las proteínas Coa, Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsaB, EsxA, EsxB, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC, SasF, vWbp y/o vWh.

Ciertas realizaciones de la invención incluyen composiciones proteicas que incluyen polipéptidos, péptidos o ácidos nucleicos que codifican una o varias variantes de SpA y otros antígenos estafilocócicos tales como otras proteínas transportadas por la vía Ess, o sustratos de sortasa. Estas proteínas se pueden modificar mediante la eliminación, inserción y/o sustitución.

Los polipéptidos Esx incluyen la secuencia de aminoácidos de las proteínas Esx de las bacterias del género Staphylococcus. La secuencia Esx puede ser de una determinada especie de estafilococo, tal como de Staphylococcus aureus, y puede proceder de una determinada cepa, tal como, por ejemplo, la Newman. En ciertas realizaciones, la secuencia de EsxA es SAV0282 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma usando el Número de Acceso del Genbank Q99WU4 (gi|68565539). En otras realizaciones, la secuencia de EsxB es SAV0290 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma usando Número de Acceso del Genbank Q99WT7 (gi|68565532). En realizaciones adicionales, se pueden usar otros polipéptidos transportados por la vía Ess, cuyas secuencias pueden ser identificadas por un experto en la materia usando bases de datos y recursos accesibles por Internet.

Los polipéptidos de sustrato de la sortasa incluyen, pero sin limitación, la secuencia de aminoácidos de las proteínas SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC o SasF de las bacterias del género Staphylococcus. La secuencia del polipéptido de sustrato de la sortasa puede ser de una especie estafilocócica en particular, tal como Staphylococcus aureus, y puede proceder de una determinada cepa, tal como, por ejemplo, Newman. En ciertas realizaciones, la secuencia de SdrD procede de la cepa N315 y se puede acceder a la misma usando el Número de Acceso del Genbank NP_373773.1 (gi|15926240). En otras realizaciones, la secuencia de SdrE procede de la cepa N315 y se puede acceder a la misma usando el Número de Acceso del Genbank NP_373774.1 (gi| 15926241). En otras realizaciones, la secuencia de IsdA es SAV1130 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma usando el Número de Acceso del Genbank NP_371654.1 (gi| 15924120). En otras realizaciones, la secuencia de IsdB es SAV1129 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma usando el Número de Acceso del Genbank NP_371653.1 (gi|15924119). En realizaciones adicionales, se pueden usar otros polipéptidos transportados por la vía Ess o procesados por la sortasa, cuyas secuencias pueden ser identificadas por un experto en materia usando bases de datos y recursos accesibles por Internet.

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Pueden identificarse ejemplos de diversas proteínas que pueden usarse en el contexto de la presente invención mediante el análisis de los registros de bases de datos de genomas bacterianos, incluyendo, pero sin limitación, los números de acceso NC_002951 (GI:57650036 y CP000046 de GenBank), NC_002758 (GI:57634611 y BA000017 de GenBank), NC_002745 (GI:29165615 y BA000018 de GenBank), NC_003923 (GI:21281729 y BA000033 de GenBank), NC_002952 (GI:49482253 y BX571856 de GenBank), NC_002953 (GI:49484912 y BX571857 de GenBank), NC_007793 (GI:87125858 y CP000255 de GenBank), NC_007795 (GI:87201381 y CP000253 de GenBank).

Como se usa en el presente documento, una “proteína” o un “polipéptido” se refiere a una molécula que comprende al menos diez restos de aminoácidos. En algunos aspectos de la divulgación, se emplea una versión de tipo silvestre de una proteína o un polipéptido, sin embargo, en muchas realizaciones de la invención, se emplea una proteína o un polipéptido modificados para generar una respuesta inmune. Los términos descritos anteriormente se pueden usar indistintamente. Una “proteína modificada” o “un polipéptido modificado” o una “variante” se refieren a una proteína o a un polipéptido cuya estructura química, en particular, su secuencia de aminoácidos, se encuentra alterada con respecto a la proteína o el polipéptido de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una proteína o un polipéptido modificado/variante tiene al menos una actividad o función modificada (que reconoce que las proteínas o los polipéptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). Se contempla específicamente que una proteína o un polipéptido modificado/variante pueden estar alterados con respecto a una actividad o función y seguir conservando una actividad o función de tipo silvestre en otros aspectos, tal como la inmunogenicidad.

En ciertas realizaciones, el tamaño de una proteína o de un polipéptido (de tipo silvestre o modificado) puede comprender, pero sin limitación, , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,

91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250,

275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.750, 2.000, 2.250, 2.500 moléculas amino o más, y cualquier intervalo que pueda obtenerse de las mismas, o derivado de una secuencia de aminoácidos correspondiente descrita o a la que se refiere en el presente documento. Se contempla que los polipéptidos se pueden mutar por truncamiento, volviéndolos más cortos que su forma de tipo silvestre correspondiente, pero, además, podrían modificarse fusionando o conjugando una secuencia de proteínas heteróloga con una determinada función (por ejemplo, para la dirección o localización, para el aumento de la inmunogenicidad, con fines de purificación, etc.).

Como se usa en el presente documento, una “molécula amino” se refiere a cualquier aminoácido, derivado de aminoácidos o imitador de aminoácido conocido en la materia. En determinadas realizaciones, los restos de la molécula proteica son secuenciales, sin que ninguna molécula de no amino interrumpa la secuencia de los restos de la molécula amino. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender una o más fracciones de moléculas no amino. En determinadas realizaciones, la secuencia de restos de la molécula proteica puede ser interrumpida por una o más fracciones de moléculas no amino.

Por consiguiente, la expresión “composición proteica” engloba secuencias de moléculas amino que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes en las proteínas sintetizas de forma natural, o al menos un aminoácido modificado o no habitual.

Las composiciones proteicas pueden realizarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, incluyendo (i) la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas biológicas moleculares convencionales; (ii) el aislamiento de compuestos proteicos a partir de fuentes naturales; o (iii) la síntesis química de materiales proteicos. Ya se han desvelado previamente las secuencias de nucleótidos, así como de proteínas, polipéptidos y péptidos para diversos genes, y pueden encontrarse en bases de datos informatizadas reconocidas. Una de dichas bases de datos es la base datos Genbank y la GenPept del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (véase en Internet, en ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones de codificación para estos genes se pueden amplificar y/o expresar usando las técnicas desveladas en el presente documento o como será conocido para los expertos habituales en la materia.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de SpA, coagulasas y otros polipéptidos de la divulgación pueden ser variantes sustitutivas, insercionales o de eliminación. Una variación de un polipéptido de la divulgación puede afectar a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos contiguos o no contiguos del polipéptido, en comparación con el tipo silvestre. Una variante puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, incluyendo todos los valores e intervalos que hay entre los mismos, idéntica a cualquier secuencia proporcionada o referenciada en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 2-8 o SEQ ID NO: 11-30. Una variante puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más aminoácidos sustitutos. Se contemplan para su uso en las composiciones y en los métodos descritos en el presente documento un polipéptido procesado o secretado por la vía Ess o por otras proteínas de superficie (véase la Tabla 1) o sustratos de sortasa de cualquier especie y cepa de staphylococcus.

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Las variantes de eliminación normalmente carecen de uno o más restos de la proteína nativa o de tipo silvestre. Pueden eliminarse los restos individuales o puede eliminarse una serie de aminoácidos contiguos. Puede introducirse un codón de terminación (mediante sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico de codificación para generar una proteína truncada. Los mutantes insercionales normalmente implican la adición de material en un punto no terminal del polipéptido. Esto puede incluir la inserción de uno o más restos. También se pueden generar adiciones terminales, denominadas proteínas de fusión. Estas proteínas de fusión incluyen multímeros o concatámeros de uno o más péptidos o polipéptidos descritos o a los que se refiere en el presente documento.

Las variantes sustitutivas normalmente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservativas, es decir, un aminoácido se reemplaza por otro de forma y carga similar. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina por serina; arginina por lisina; asparagina por glutamina o histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparagina; glutamato por aspartato; glicina por prolina; histidina por asparagina o glutamina; isoleucina por leucina o valina; leucina por valina o isoleucina; lisina por arginina; metionina por leucina o isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina o metionina; serina por treonina; treonina por serina; triptófano por tirosina; tirosina por triptófano o fenilalanina; y valina por isoleucina o leucina. De manera alternativa, las sustituciones pueden no ser conservativas de manera que se ve afectada una función o actividad del polipéptido. Los cambios no conservativos normalmente implican el reemplazo de un resto con uno que sea químicamente distinto, tal como un aminoácido polar o con carga por un aminoácido no polar o sin carga, y viceversa.

Tabla 2. Ejemplos de proteínas de superficie de cepas de S. aureus

n.° SAV: n.° SA Superficie MW2 Mu50 N315 Newman MRSA252* MSSA476*

SAV0111: SA0107 Spa 492 450 450 520 516 492

SAV2503: SA2291 FnBPA 1015 1038 1038 741 - 1015

SAV2502: SA2290 FnBPB 943 961 961 677 965 957

SAV0811: SA0742 ClfA 946 935 989 933 1029 928

SAV2630: SA2423 ClfB 907 877 877 913 873 905

Np
Np: Cna 1183 - - - 1183 1183

SAV0561: SA0519 SdrC 955 953 953 947 906 957

SAV0562: SA0520 SdrD 1347 1385 1385 1315 - 1365

SAV0563: SA0521 SdrE 1141 1141 1141 1166 1137 1141

Np
Np: Pls - - - - - -

SAV2654: SA2447 SasA 2275 2271 2271 2271 1351 2275

SAV2160: SA1964 SasB 686 2481 2481 2481 2222 685

: SA1577 SasC 2186 213 2186 2186 2189 2186

SAV0134: SA0129 SasD 241 241 241 241 221 241

SAV1130: SA0977 SasE/ IsdA 350 350 350 350 354 350

SAV2646: SA2439 SasF 635 635 635 635 627 635

SAV2496: SasG 1371 525 927 - - 1371

SAV0023: SA0022 SasH 772 - 772 772 786 786

SAV1731: SA1552 SasI 895 891 891 891 534 895

SAV1129: SA0976 SasJ/IsdB 645 645 645 645 652 645

: SA2381 SasK 198 211 211 - - 197

: Np SasL - 232 - - - -

SAV1131: SA0978 IsdC 227 227 227 227 227 227

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Las proteínas de la invención pueden ser recombinantes o sintetizarse in vitro. Como alternativa, una proteína no recombinante o recombinante se puede aislar de una bacteria. También se contempla la implantación de una bacteria que contiene dicha variante en las composiciones de la invención. Por consiguiente, no es necesario aislar una proteína.

La expresión “codón funcionalmente equivalente” se usa en el presente documento para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (véase la siguiente Tabla 2).

Tabla 3. Tabla de codones

Aminoácidos: Codones

Alanina: Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína: Cys C UGC UGU

Ácido aspártico: Asp D GAC GAU

Ácido glutámico: Glu E GAA GAG

Fenilalanina: Phe F UUC UUU

Glicina: Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina: His H CAC CAU

Isoleucina: Ile I AUA AUC AUU

Lisina: Lys K AAA AAG

Leucina: Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina: Met M AUG

Asparagina: Asn N AAC AAU

Prolina: Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina: Gln Q CAA CAG

Arginina: Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina: Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina: Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina: Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano: Trp W UGG

Tirosina: Tyr Y UAC UAU

Se entenderá que las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos pueden incluir restos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales, o secuencias 5' o 3', respectivamente, y aun así seguir siendo esencialmente como se expone en una de las secuencias desveladas en el presente documento, siempre que la secuencia cumpla con los criterios establecidos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína (por ejemplo, la inmunogenicidad) en lo que se refiere a la expresión de proteínas. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a las secuencias de ácidos nucleicos que pueden, por ejemplo, incluir diversas secuencias no codificantes que flanqueen la parte 5' o la 3' de la región de codificación.

A continuación se presente una descripción basada en el cambio de aminoácidos de una proteína para crear una variante de polipéptido o péptido. Por ejemplo, se pueden reemplazar ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en una estructura proteica con o sin apreciar pérdida de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión al antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas sustrato. Ya que es la capacidad y naturaleza interactiva de una proteína lo que define esa actividad funcional de la proteína, pueden realizarse ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica, y en su secuencia de codificación de ADN subyacente, y, no obstante, producir una proteína con una propiedad deseable. Los inventores contemplan, por tanto, que es posible realizar diversos cambios en las secuencias de ADN de los genes.

Se contempla que, en las composiciones de la invención, hay entre 0,001 mg y 10 mg de polipéptido, péptido y/o proteína total por ml. La concentración de la proteína en una composición puede ser de aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 mg/ml o más. De esto, aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % puede ser una

variante de SpA, y se puede usar en combinación con otros péptidos o polipéptidos, tales como otros péptidos

bacterianos y/o antígenos.

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La presente invención contempla polipéptidos o péptidos de la variante de SpA para su uso en un método de terapia preventiva o método terapéutico contra el desarrollo de una enfermedad o afección asociada con una infección por un patógeno estafilocócico.

En ciertas realizaciones, las combinaciones de antígenos estafilocócicos se usan en la producción de una composición inmunogénica que sea eficaz en el tratamiento o la prevención de infecciones estafilocócicas. Las infecciones estafilocócicas se desarrollan a lo largo de varias etapas diferentes. Por ejemplo, el ciclo de vida estafilocócico implica la colonización de comensales, el inicio de la infección accediendo a tejidos anexos o al torrente sanguíneo, y/o la multiplicación anaeróbica en la sangre. La interacción entre los determinantes de virulencia de S. aureus y los mecanismos de defensa del hospedador puede inducir complicaciones tales como endocarditis, formación de abscesos metastásica y síndrome de sepsis. Las diferentes moléculas en la superficie de la bacteria participan en diferentes etapas del ciclo de infección. Las combinaciones de ciertos antígenos pueden generar una respuesta inmune que proteja contra múltiples etapas de la infección estafilocócica. La efectividad de la respuesta inmune puede medirse en ensayos de modelos en animales y/o usando un ensayo opsonofagocítico.

D. Polipéptidos y producción de polipéptidos

La presente invención describe polipéptidos, péptidos y proteínas, y fragmentos inmunogénicos de los mismos, para su uso en diversas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, los polipéptidos específicos se ensayan o se usan para generar una respuesta inmune. Todas o parte de las proteínas de la invención también se pueden sintetizar en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Se encuentran disponibles en el mercado diversos sintetizadores automáticos, y se pueden usar de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); y Barany y Merrifield (1979).

De manera alternativa, se puede emplear la tecnología de ADN recombinante, en la que una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de la invención se inserta en un vector de expresión, se transforma o se transfecta en una célula hospedadora apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión.

Un aspecto de la divulgación incluye el uso de la transferencia de genes a las células, incluyendo microorganismos, para la producción y/o presentación de polipéptidos o péptidos. El gen para el polipéptido o péptido de interés puede transferirse a células hospedadoras apropiadas seguido del cultivo de células en condiciones apropiadas. La generación de vectores de expresión recombinantes, y los elementos incluidos en los mismos, son bien conocidos en la técnica y se describen brevemente en el presente documento. Como alternativa, la proteína que se va a producir puede ser una proteína endógena sintetizada habitualmente por la célula que se aísla o se purifica.

Otro aspecto de la divulgación usa estirpes celulares de linfocitos B autólogos, que se transfectan con un vector vírico que expresa un producto inmunogénico, y más concretamente, una proteína que tiene actividad inmunogénica. Otros ejemplos de estirpes celulares hospedadoras de mamíferos incluyen, pero sin limitación, células Vero y HeLa, otras estirpes celulares B y T, tales como CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji, así como estirpes celulares de ovario de hámster chino, W138, BhK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN y células mDcK. Además, se puede escoger una cepa de la célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la manera deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, la glicosilación) y el procesamiento (por ejemplo, la escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento posterior a la traducción y la modificación de proteínas. Se pueden escoger estirpes celulares o sistemas hospedadores apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea expresada.

Se puede usar un número de sistemas de selección incluyendo, pero sin limitación, timidina quinasa del HSV, hipoxantineguanina fosforibosiltransferasa y genes de adenina foforibosiltransferasa, en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, se puede usar la resistencia antimetabólica como la base de la selección: para dhfr, que confiere resistencia a la trimetoprima y al metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina.

Las células animales se pueden propagar in vitro de dos maneras: como células no dependientes del anclaje que se cultivan en suspensión a través del volumen del cultivo, o como células dependientes del anclaje que requieren la fijación a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un crecimiento celular de tipo monocapa).

Los cultivos no dependientes del anclaje o en suspensión a partir de estirpes celulares continuas establecidas son el medio más ampliamente usado de producción a gran escala de células y productos celulares. Sin embargo, las células cultivadas en suspensión tienen limitaciones tales como el potencial tumorigénico y una producción de proteínas inferior a la de las células adherentes.

En los casos en los que se menciona una proteína en concreto en el presente documento, es preferentemente una referencia a una proteína recombinante o nativa, u opcionalmente, una proteína en la que se ha eliminado cualquier secuencia señal. La proteína se puede aislar directamente de la cepa estafilocócica o producirse mediante técnicas de ADN recombinante. Se pueden incorporar fragmentos inmunogénicos de la proteína a la composición

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inmunogénica de la invención. Se trata de fragmentos que comprenden al menos 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos o 100 aminoácidos, incluyendo todos los valores e intervalos entre los mismos, tomados de forma contigua a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, dichos fragmentos inmunogénicos son inmunológicamente reactivos con los anticuerpos generados contra las proteínas estafilocócicas o con anticuerpos generados por la infección de un hospedador mamífero con estafilococos. Los fragmentos inmunogénicos también incluyen fragmentos que, cuando se administran a una dosis eficaz, (ya sean solos o como un hapteno enlazado a un vehículo), provocan una respuesta inmune protectora o terapéutica contra una infección estafilocócica, en ciertos aspectos es protectora contra una infección por S. aureus y/o S. epidermidis. Dicho fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una secuencia líder N-terminal y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad, al menos un 85 % de identidad, al menos un 90 % de identidad, al menos un 95 % de identidad o al menos un 97-99 % de identidad, incluyendo todos los valores e intervalos entre los mismos, con el segmento de la secuencia seleccionado de un polipéptido descrito.

También se incluyen en las composiciones inmunogénicas de la invención proteínas de fusión compuestas de una o más proteínas estafilocócicas, o fragmentos inmunogénicos de proteínas estafilocócicas. Dichas proteínas de fusión se pueden fabricar de manera recombinante, y pueden comprender una parte de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas estafilocócicas o segmentos. Como alternativa, una proteína de fusión puede comprender múltiples partes de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 proteínas estafilocócicas. Estas pueden combinar diferentes proteínas estafilocócicas y/o múltiples de la misma proteína o fragmento de proteína, o fragmentos inmunogénicos en la misma proteína (formando un multímero o concatámero). Como alternativa, la divulgación también incluye proteínas de fusión individuales de proteínas estafilocócicas o fragmentos inmunogénicos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas tales como un suministrador de epítopos de linfocitos T o marcadores de purificación, por ejemplo: p-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, proteínas verdes fluorescentes (GFP), marcadores de epítopos tales como FLAG, marcador myc, poli histidina o proteínas de superficie víricas tales como el hemaglutinina del virus de la gripe, o proteínas bacteriana tales como el toxoide tetánico, toxoide diftérico o CRM197.

II. ÁCIDOS NUCLEICOS

En el presente documento se desvelan polinucleótidos recombinantes que codifican las proteínas, los polipéptidos y los péptidos de la invención. Se incluyen las secuencias de ácido nucleico para SpA, coagulasas y otras proteínas bacterianas, y se pueden usar para preparar péptidos o polipéptidos.

Como se usa en la presente solicitud, el término “polinucleótido” se refiere a una molécula de ácido nucleico que bien es recombinante o que se ha aislado libre de ácido nucleico genómico total. El término “polinucleótido” incluye oligonucleótidos (ácidos nucleicos de 100 restos o menos de longitud), vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus y similares. Los polinucleótidos incluyen, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente de sus genes de origen natural o secuencias de codificación de proteínas. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (de codificación o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser ARN, ADN (genómico, ADNc o sintético), análogos de los mismos, o una combinación de los mismos. Las secuencias de codificación o no codificación pueden, pero no necesitan, estar presentes dentro de un polinucleótido.

En este sentido, el término “gen”, “polinucleótido” o “ácido nucleico” se usa para referirse a un ácido nucleico que codifica una proteína, un polipéptido o un péptido (incluyendo cualquier secuencia requerida para una transcripción, una modificación posterior a la traducción o una localización apropiadas). Como los expertos en la materia entenderán, este término engloba secuencias genómicas, casetes de expresión, secuencias de ADNc y segmentos de ácido nucleico modificados por ingeniería genética más pequeños que expresan o se pueden adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión y mutantes. Un ácido nucleico que codifica parte o la totalidad de un polipéptido puede contener una secuencia de ácido nucleico contigua de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280,

290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500,

510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730,

740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960,

970, 980, 990, 1.000, 1.010, 1.020, 1.030, 1.040, 1.050, 1.060, 1.070, 1.080, 1.090, 1.095, 1.100, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 9.000, 10.000 o más nucleótidos, nucleósidos o pares de bases, incluyendo todos los valores e intervalos entre los mismos, de un polinucleótido que codifica una o más secuencias de aminoácidos descritas. También se contempla que un determinado polipéptido puede ser codificado por ácidos nucleicos que contienen variaciones que tienen secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes pero que, no obstante, codificarse la misma proteína o una sustancialmente similar (véase la Tabla 3 anterior).

En realizaciones particulares, la invención se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican la variante de SpA o coagulasa. El término “recombinante” se puede usar en combinación con un polinucleótido o un polipéptido y se refiere, en general, a un polipéptido o polinucleótido producido y/o manipulado in vitro o que es un producto de replicación de

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dicha molécula.

En otras realizaciones, la invención se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y a vectores recombinantes que llevan incorporados secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos o péptidos de variante de SpA o coagulasa para generar una respuesta inmune en un sujeto. También se desvelan ácidos nucleicos para su uso en vacunas genéticas.

Los segmentos de ácido nucleico usados se pueden combinar con otras secuencias de ácido nucleico tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, múltiples sitios de clonación, otros segmentos de codificación y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Se contempla, por lo tanto, que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando limitada su longitud total preferentemente por la facilidad de preparación y el uso en el protocolo de ácidos nucleicos recombinantes deseado. En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia polipeptídica con secuencias de codificación heterólogas adicionales, por ejemplo, para permitir la purificación del polipéptido, transporte, secreción, modificación posterior a la traducción, o para beneficios terapéuticos tales como la dirección o la eficacia. Como se ha descrito anteriormente, se puede añadir un marcador u otros polipéptidos heterólogos a la secuencia de codificación del polipéptido modificada, de modo que “heterólogo” se refiere a un polipéptido que no es el mismo que el polipéptido modificado.

En ciertas realizaciones diferentes, la invención se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y a vectores recombinantes que incluyen, dentro de su secuencia, una secuencia de ácido nucleico contigua de sEq ID NO: 1 (dominio D de SpA) o SEQ ID NO: 3 (SpA) o cualquier otras secuencias de ácido nucleico que codifique coagulasas u otros factores de virulencia secretados y/o proteínas de superficie, incluyendo proteínas transportadas por la vía Ess, procesada por la sortasa, o proteínas.

En el presente documento, se desvelan variantes de polinucleótidos que tienen una identidad sustancial con las secuencias desveladas en el presente documento; comprendiendo estas al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, o una identidad de secuencia superior, incluyendo todos los valores e intervalos entre los mismos, en comparación con una secuencia polinucleotídica de la presente invención, usando los métodos descritos en la presente documento (por ejemplo, análisis BLAST usando parámetros convencionales).

La divulgación también contempla el uso de polinucleótidos que son complementarios a todos los polinucleótidos descritos anteriormente.

A. Vectores

Los polipéptidos de la invención pueden ser codificados por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término “vector” se usa para referirse a una molécula de ácido nucleico portadora en la que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico para su introducción en una célula en la que pueda reproducirse o expresarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser “heteróloga”, lo que significa que se encuentra en un contexto foráneo a la célula en la que el vector se está introduciendo o al ácido nucleico al que se incorpora, que incluye una secuencia homóloga a una secuencia de la célula o el ácido nucleico, pero en una posición dentro de la célula hospedadora o el ácido nucleico en el que no se encuentra normalmente. Los vectores incluyen ADN, ARN, plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC) Un experto en la materia estaría bien preparado para construir un vector mediante técnicas recombinantes convencionales (por ejemplo, Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996). Además de codificar un polipéptido de variante de SpA, el vector puede codificar otras secuencias de polipéptidos tales como uno o más péptidos bacterianos, un marcador o un péptido de aumento de la inmunogenicidad. Entre los vectores de utilidad que codifican dichas proteínas de fusión, se incluyen vectores pIN (Inouye et al., 1985), vectores que codifican un tramo de histidinas y vectores pGEX, para su uso en la generación de proteínas de fusión solubles de glutatión-S- transferasa (GST) para su purificación y posterior separación o escisión.

La expresión “vector de expresión” se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de transcribirse. En algunos casos, se traducen las moléculas de ARN en una proteína, un polipéptido o un péptido. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de “secuencias de control”, lo que se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y, posiblemente, la traducción de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un determinado organismo hospedador. Además de controlar las secuencias que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y se describen en el presente documento.

1. Promotores y potenciadores

Un “promotor” es una secuencia de control. El promotor normalmente es una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controlan el inicio y la velocidad de transcripción. Puede contener elementos genéticos en los

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que pueden unirse proteínas reguladoras y moléculas tales como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las expresiones “posicionado operativamente”, “enlazado operativamente”, “bajo el control”, y “bajo el control de la transcripción” significan que un promotor se encuentra en una ubicación y/u orientación funcional correcta en relación a una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y la expresión de esa secuencia. Un promotor se puede usar o no en combinación con un “potenciador”, que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación de la transcripción de una secuencia de ácido nucleico.

Como es natural, puede ser importante emplear un promotor y/o un potenciador que dirija de forma eficaz la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula u organismo seleccionado para la expresión. Los expertos en la materia de la Biología molecular conocen, en general, el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas (véase Sambrook et al., 2001). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos del tejido o inducibles, y, en ciertas realizaciones, pueden dirigir una expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido en condiciones específicas, tal como la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes.

Se pueden emplear diversos elementos/promotores en el contexto de la presente invención para regular la expresión de un gen. Los ejemplos de dichos elementos inducibles, que son regiones de una secuencia de ácido nucleico que se puede activar en respuesta a un estímulo específico, incluyen, pero sin limitación, la cadena pesada de inmunoglobulina (Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990), la cadena ligera de inmunoglobulina (Queen et al., 1983; Picard et al., 1984), el receptor de linfocitos T (Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990), HLA DQ a y/o DQ p (Sullivan et al., 1987), interferón p (Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988), interleucina-2 (Greene et al., 1989), el receptor de la interleucina-2 (Greene et al., 1989; Lin et al., 1990), MHC de clase II 5 (Koch et al., 1989), HLA-DRa de MHC de clase II (Sherman et al., 1989), p-actina (Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989), creatina quinasa muscular (MCK) (Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989), Prealbúmina (Transthyretin) (Costa et al., 1988), Elastasa I (Ornitz et al., 1987), metalotioneína (MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989), Colagenasa (Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987), albúmina (Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990), a-fetoproteína (Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989), Y-globina (Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990), p-globina (Trudel et al., 1987), c-fos (Cohen et al.,

1987) , c-Ha-Ras (Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985), insulina (Edlund et al., 1985), molécula de adhesión a células neuronales (NCAM) (Hirsh et al., 1990), a1-antitripaína (Latimer et al., 1990), H2B (TH2B) histona (Hwang et al., 1990), colágeno de ratón y/o de tipo I (Ripe et al., 1989), proteínas reguladas por la glucosa (GRP94 y GRP78) (Chang et al., 1989), hormona de crecimiento de rata (Larsen et al., 1986), amiloide A de suero humano (SAA) (Edbrooke et al., 1989), troponina I (TN I) (Yutzey et al., 1989), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Pech et al., 1989), distrofia muscular de Duchenne (Klamut et al., 1990), SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988), polioma (Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988), retrovirus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al., 1988; Reisman et al., 1989), virus del papiloma (Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos y Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987), virus de la hepatitis B (Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988), virus de la inmunodeficiencia humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989), citomegalovirus (CMV) IE (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986), virus de la leucemia de simio de Gibbon (Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989).

Los elementos inducibles incluyen, pero sin limitación, MT II - éster de forbol (TFA)/metales pesados (Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989); MMTV (virus de tumor mamario de ratón) - glucocorticoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988); p- interferón - poli(rI)x/poli(rc) (Tavernier et al., 1983); Adenovirus 5 E2 - ElA (Imperiale et al., 1984); colagenasa - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987a); estromelisina - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); SV40 - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); gen MX murino - interferón, virus de la enfermedad de Newcastle (Hug et al.,

1988) ; gen GRP78 - A23187 (Resendez et al., 1988); a-2-macroglobulina - IL-6 (Kunz et al., 1989); Vimentina - Suero (Rittling et al., 1989); gen H-2Kb de MHC de clase I - interferón (Blanar et al., 1989); HSP70 - gran antígeno T de ElA/SV40 (Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); proliferina - éster de forbol/TPA (Mordacq et al., 1989); factor de necrosis tumoral - PMA (Hensel et al., 1989); y gen de la hormona estimulante del tiroide a - hormona tiroidea (Chatterjee et al., 1989).

No se cree que el promotor que se emplea en particular para controlar la expresión del péptido o de la proteína que codifica el polinucleótido de la invención sea de importancia fundamental, siempre que sea capaz de expresar el polinucleótido en una célula diana, preferentemente una célula bacteriana. Cuando se dirige una célula humana, es

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preferible situar la región de codificación del polinucleótido adyacente a y bajo el control de un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana. En términos generales, dicho promotor podría incluir un promotor bien bacteriano, humano o vírico.

En aspectos de la divulgación en los que se administra un vector a un sujeto para la expresión de una proteína, se contempla que un promotor que se desea para su uso con el vector es aquel que no se encuentra regulado negativamente por las citocinas, o aquel que es lo suficientemente fuerte como para que, incluso estando regulado negativamente, produzca una cantidad eficaz de una variante de SpA para generar una respuesta inmune. Los ejemplos no limitantes de estos son CMV IE y RSV LTR. Se pueden usar promotores específicos de tejidos, en particular, si la expresión es en células en las que se desea la expresión de un antígeno, tal como células dendríticas o macrófagos. Los promotores de MHC I y mHc II de mamífero son ejemplos de dichos promotores específicos de tejidos.

2. Señales de inicio y sitios internos de unión al ribosoma (IRES)

También se puede requerir una señal de inicio específica para una traducción eficaz de secuencias de codificación. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Un experto habitual en la materia sería capaz de determinar esta circunstancia fácilmente y proporcionar las señales necesarias.

En ciertos aspectos de la divulgación, el uso de elementos de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) se emplea para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de exploración ribosómica de la traducción dependiente de la caperuza metilada de 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988; Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden estar enlazados a marcos de lectura abiertos heterólogos. Pueden transcribirse juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. Pueden expresarse múltiples genes de manera eficaz usando un solo promotor/potenciador para transcribir un solo mensaje (véanse las patentes de EE.UU. n.° 5.925.565 y 5.935.819).

3. Marcadores seleccionables y detectables

En ciertos aspectos de la divulgación, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la presente invención se pueden identificar in vitro o in vivo codificando un marcador seleccionable o detectable en el vector de expresión. Cuando se transcribe y se traduce, un marcador confiere un cambio identificable a la célula, lo que permite una fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. En general, un marcador seleccionable es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es aquel en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es aquel en el que su presencia evita su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia al fármaco.

B. Células hospedadoras

Como se usa en el presente documento, el término “célula”, y las expresiones “estirpe celular” y “cultivo celular” pueden usarse indistintamente. Todos estos términos además incluyen su progenie, que es todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, “célula hospedadora” se refiere a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedadora puede usarse, y ha sido usada, como receptor para vectores o virus. Una célula hospedadora puede ser “transfectada” o “transformada”, lo que se refiere a un proceso mediante el que un ácido nucleico exógeno, tal como una secuencia de codificación de proteínas recombinantes, se transfiere a o se introduce en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye la célula primaria en cuestión y a su progenie.

Las células hospedadoras pueden derivarse de células procariotas o eucariotas, incluyendo bacterias, células de levadura, células de insecto y células de mamífero para la replicación del vector o la expresión de parte o la totalidad de la/s secuencia/s de ácido nucleico. Se encuentran disponibles numerosas estirpes y cultivos celulares para su uso como una célula hospedadora, y se pueden obtener a través de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), que es una organización que funciona como un archivo para cultivos vivos y materiales genéticos (www. atcc.org).

C. Sistemas de expresión

Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos una parte o la totalidad de las composiciones tratadas anteriormente. Los sistemas basados en procariotas y/o eucariotas pueden emplearse para su uso con la presente invención para producir secuencias de ácido nucleico, o sus polipéptidos, proteínas y péptidos afines. Muchos de dichos sistemas se encuentran ampliamente disponibles en el mercado.

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El sistema de células/baculovirus de insecto puede producir un alto nivel de expresión de proteínas de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las patentes de EE.UU. n.° 5.871.986, 4.879.236, y que pueden adquirirse, por ejemplo, con el nombre MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® y BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM de CLONTECH®.

Además de los sistemas de expresión desvelados de la invención, otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen el sistema de expresión de mamíferos inducible COMPLETE CONTROL™ de STRATAGENE®, que implica un receptor inducible por ecdisoma sintético, o su sistema de expresión de pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible se encuentra disponible de INVITROGEN®, el cual porta el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamíferos inducible que usa el promotor CMV de longitud completa. INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión en levaduras denominado sistema de expresión en Pichia methanolica, que está diseñado para una producción de alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia methanolica. Un experto en la materia sabría cómo expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptido afín.

III. POLISACÁRIDOS

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender además polisacáridos capsulares que incluyen uno o más del polisacárido capsular PIA (también conocido como PNAG) y/o S. aureus de tipo V y/o de tipo VIII y/o el polisacárido capsular de S. epidermidis de Tipo I y/o Tipo II y/o Tipo III.

A. PIA (PNAG)

En la actualidad, es evidente que las diversas formas de polisacáridos de superficie estafilocócicos identificados como PS/A, PIA y SAA son la misma entidad química - PNAG (Maira-Litran et al., 2004). Por lo tanto, el término PIA o PNAG abarca todos los polisacáridos u oligosacáridos obtenidos de los mismos.

PIA es una adhesina polisacárida intercelular, y se compone de un polímero de glucosamina enlazada en (3-(1 —^6) sustituida con constituyentes N-acetilo y O-succinilo. Este polisacárido está presente tanto en S. aureus como en S. epidermidis, y se puede aislar de cualquier fuente (Joyce et al., 2003; Maira-Litran et al., 2002). Por ejemplo, el PNAG puede aislarse de la cepa MN8m (WO04/43407) de S. aureus. La PIA aislada de S. epidermidis es un constituyente integral de la biopelícula. Es responsable de mediar en la adhesión célula-célula y, probablemente, también funciona para proteger la colonia en crecimiento de la respuesta inmune del hospedador. Recientemente, se mostró que el polisacárido conocido previamente como poli-W-succinil-p-(1—6)-glucosamina (PNSG) no tiene la estructura esperada, ya que la identificación de la N-succinilación era incorrecta (Maira-Litran et al., 2002). Por lo tanto, el polisacárido conocido formalmente como PNSG y que se ha encontrado ahora que es PNAG, también está englobado por el término PIA.

PIA (o PNAG) pueden ser de diferentes tamaños que varían de más de 400k Da a entre 75 y 400 kDa a entre 10 y 75 kDa, hasta oligosacáridos compuestos de hasta 30 unidades de repetición (de glucosamina enlazada en p-(1—6) sustituida con constituyentes N-acetilo y O-succinilo). Se puede usar cualquier tamaño del polisacárido u oligosacárido de PIA en una composición inmunogénica de la invención; en un aspecto, el polisacárido es de más de 40 kDa. La determinación del tamaño se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante microfluidización, irradiación ultrasónica o mediante escisión química (documentos WO 03/53462, EP497524, EP497525). En ciertos aspectos, PIA (PNAG) es al menos o como máximo de 40-400 kDa, 40-300 kDa, 50-350 kDa, 60-300 kDa, 50-250 kDa y 60-200 kDa.

PIA (PNAG) puede tener un diferente grado de acetilación debido a la sustitución con acetato en los grupos amino. PIA producido in vitro está casi totalmente sustituido en los grupos amino (95-100 %). Como alternativa, se puede usar un PIA (PNAG) desacetilado con menos del 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % de acetilación. Se prefiere el uso de un PIA (PNAG) desacetilado, ya que los epítopos no acetilados de PNAG son eficaces en la mediación de la destrucción opsónica de bacterias Gram-positivas, preferentemente S. aureus y/o S. epidermidis. En ciertos aspectos, PIA (PNAG) tiene un tamaño de entre 40 kDa y 300 kDa y está desacetilado de manera que un 60 %, 50 %, 40 %, 30 % o 20 % de los grupos amino están acetilados.

El término PNAG (dPNAG) desacetilado se refiere a un polisacárido u ologosacárido PNAG en el que menos de un 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % o 10 % de los grupos amino están acetilados. En ciertos aspectos, PNAG se desacetila para formar dPNAG tratando químicamente el polisacárido nativo. Por ejemplo, el PNAG nativo se trata con una solución básica de forma que el pH se eleva por encima de 10. Por ejemplo, el PNAG se trata con NaOH, KOH o NH4OH 0,1-5 M, 0,2-4 M, 0,3-3 M, 0,5-2 M, 0,75-1,5 M o 1 M. El tratamiento es durante al menos 10 a 30 minutos, o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 horas a una temperatura de 20-100, 25-80, 30-60 o 30-50 o 35-45 °C. Se puede preparar dPNAG como se describe en el documento WO 04/43405.

El/los polisacárido/s pueden conjugarse o no conjugarse a una proteína vehículo.

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B. Polisacáridos del tipo 5 y tipo 8 de S. aureus

La mayoría de las cepas de S. aureus que causan infección pueden contener polisacáridos de tipo 5 o de tipo 8. Aproximadamente un 60 % de las cepas humanas son de tipo 8 y aproximadamente un 30 % son de tipo 5. Las estructuras de los antígenos del polisacárido capsular de tipo 5 y tipo 8 se describen en Moreau et al., (1990) y en Fournier et al., (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición, así como ManNAcA que se puede usar para introducir un grupo sulfhidrilo. Las estructuras son:

Tipo 5

^4)-p-D-ManNAcA(3OAc)-(1^4)-a-L-FucNAc(1^3)-p-D-FucNAc-(1^

Tipo 8

^3)-P-D-ManNAcA(4OAc)-(1^3)-a-L-FucNAc(1^3)-P-D-FucNAc-(1^

Recientemente (Jones, 2005), la espectroscopia de RMN revisó las estructuras a:

Tipo 5

^-4)-P-D-ManNAcA-(1^4)-a-L-FucNAc(3OAc)-(1^3)-P-D-FucNAc-(1^

Tipo 8

^3)-p-D-ManNAcA(4OAc)-(1^3)-a-L-FucNAc(1^3)-a-D-FucNAc(1^.

Los polisacáridos se pueden extraer de la cepa adecuada de S. aureus usando un método bien conocido por los expertos en la materia; véase la patente de EE.UU. n.° 6.294.177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de S. aureus de Tipo 5 y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus de Tipo 8.

Los polisacáridos son de tamaño nativo o pueden dimensionarse, como alternativa, por ejemplo, mediante microfluidización, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención además incluye oligosacáridos derivados de los polisacáridos de tipo 5 y 8 de S. aureus. Los polisacáridos de tipo 5 y 8 incluidos en la composición inmunogénica de la invención, se conjugan preferentemente con una proteína vehículo tal como se describe más adelante o, como alternativa, no se conjugan. Las composiciones inmunogénicas de la invención contienen, como alternativa, un polisacárido bien de tipo 5 o de tipo 8.

C. Antígeno 336 de S. aureus

En el presente documento, se desvelan composiciones inmunogénicas que comprenden el antígeno 336 de S. aureus descrito en la patente de EE.UU. n.° 6.294.177. El antígeno 336 comprende una hexosamina enlazada en p, no contiene ningún grupo O-acetilo y se une específicamente a los anticuerpos de S. aureus de tipo 336 depositados como ATCC 55804. En un aspecto de la divulgación, el antígeno 336 es un polisacárido que es del tamaño nativo o que se puede dimensionar de manera alternativa, por ejemplo, mediante microfluidización, radiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. También se desvelan oligosacáridos obtenidos del antígeno 336. El antígeno 336 puede estar no conjugado o conjugado a una proteína vehículo.

D. Polisacáridos de tipo I, II y III de S. epidermidis

Entre los problemas asociados con el uso de los polisacáridos en la vacunación se encuentra el hecho de que los polisacáridos en sí son poco inmunogénicos. Se prefiere que los polisacáridos utilizados en la invención se enlacen a una proteína vehículo que proporcione la ayuda de un linfocito T testigo para mejorar la inmunogenicidad. Los ejemplos de dichos vehículos que pueden conjugarse a inmunógenos polisacáridos incluyen los toxoides de la Difteria y el Tétanos (DT, DT CRM197 y TT, respectivamente), hemocianina de lapa californiana (KLH), y el derivado proteico purificado (PPD) de la tuberculina, exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina o fragmentos de cualquiera de las anteriores. Los fragmentos adecuados para su uso incluyen fragmentos que engloban epítopos T auxiliares. En particular, el fragmento de la proteína D de H. influenza contendrá preferentemente el tercio del extremo N de la proteína. La proteína D es una proteína de unión a IgD de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610 B1) y es un posible inmunógeno. Además, las proteínas estafilocócicas se pueden usar como proteína vehículo en los conjugados de polisacáridos de la invención.

Una proteína vehículo que sería particularmente ventajosa para su uso en el contexto de vacunas estafilocócicas es el toxoide alfa estafilocócico. La forma nativa puede conjugarse a un polisacárido, ya que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. Preferentemente, las toxinas alfa detoxificadas genéticamente tales como las variantes His35Leu o His35Arg se usan como vehículos ya que la toxicidad residual es inferior. Como alternativa, la toxina alfa se detoxifica químicamente mediante el tratamiento con un reactivo de entrecruzamiento, formaldehído o glutaraldehído. Una toxina alfa detoxificada genéticamente es detoxificada químicamente de forma opcional, preferentemente mediante el tratamiento con un reactivo de entrecruzamiento, formaldehído o glutaraldehído para reducir adicionalmente la toxicidad.

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Los polisacáridos pueden enlazarse a la/s proteína/s vehículo/s mediante cualquier método conocido (por ejemplo, los métodos descritos en las patentes de eE.UU. n.° 4.372.945, 4.474.757 y 4.356.170). Preferentemente, se lleva a cabo la química de conjugación con CDAP (véase el documento WO95/08348). En CDAP, el reactivo de cianilación tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) se usa preferentemente para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación puede realizarse según condiciones relativamente suaves, que eviten la hidrólisis de los polisacáridos sensibles a la alcalinidad. Esta síntesis permite un acoplamiento directo con una proteína vehículo.

La conjugación implica preferentemente producir un enlace directo entre la proteína vehículo y el polisacárido. Opcionalmente, se puede introducir un espaciador (tal como dihidruro adípico (ADH)) entre la proteína vehículo y el polisacárido.

IV. RESPUESTA INMUNE Y ENSAYOS

Como se ha tratado anteriormente, la invención se refiere a composiciones para su uso en la generación o inducción de una respuesta inmune en un sujeto contra una variante de SpA o péptido coagulasa. En una realización, la respuesta inmune puede proteger contra o tratar a un sujeto que tiene, o se sospeche que tiene, o está en riesgo de desarrollar una infección o enfermedad relacionada con la misma, en particular, las relacionadas con los estafilococos. Un uso de las composiciones inmunogénicas de la invención es prevenir las infecciones nosocomiales mediante la inoculación a un sujeto antes de someterse a una operación en un hospital o en otro entorno con un elevado riesgo de infección.

A. Inmunoensayos

En el presente documento, se desvelan ensayos serológicos para evaluar si y hasta qué punto una respuesta inmune es inducida o generada por las composiciones de la invención. Existen muchos tipos de inmunoensayos que se pueden implantar. Los inmunoensayos incluyen, pero sin limitación, los descritos en la patente de EE.UU. n.° 4.367.110 (ensayo de tipo sándwich de doble anticuerpo monoclonal) y en la patente de EE.UU. n.° 4.452.901 (ensayo de transferencia Western). Otros ensayos incluyen la inmunoprecipitación de ligandos marcados e inmunocitoquímica, tanto in vitro como in vivo.

En general, los inmunoensayos son ensayos de unión. Ciertos inmunoensayos preferidos son los diversos tipos de ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y radioinmunoensayos (RlA) conocidos en la técnica. La detección inmunohistoquímica usando secciones de tejidos es también particularmente útil. En un ejemplo, se inmovilizan anticuerpos o antígenos en una superficie seleccionada, tal como un pocillo de una placa de microtitulación de poliestireno, varilla graduada o soporte de columna. A continuación, se añade a los pocillos una composición de ensayo que se sospecha que contiene al antígeno o anticuerpo deseado, tal como una muestra clínica. Tras la unión y el lavado para eliminar complejos inmunes enlazados de manera no específica, se puede detectar el antígeno o el anticuerpo. En general, la detección se realiza mediante la adición de otro anticuerpo, específico del antígeno o anticuerpo deseado, que está enlazado a un marcador detectable. Este tipo de ELISA se conoce como “ELISA de tipo sándwich”. La detección también puede realizarse mediante la adición de un segundo anticuerpo específico para el antígeno deseado, seguida de la adición de un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión para el segundo anticuerpo, estando el tercer anticuerpo unido a un marcador detectable.

Los ensayos ELISA de competición también son posibles implantaciones en las que las muestras de ensayo compiten para unirse con cantidades conocidas de antígenos o anticuerpos marcados. La cantidad de especies reactivas en la muestra desconocida se determina mezclando la muestra con las especies marcadas conocidas antes o durante la incubación con pocillos recubiertos. La presencia de especies reactivas en la muestra actúa para reducir la cantidad de especies marcadas disponibles para unirse al pocillo y, por tanto, reduce la señal final. Independientemente del formato empleado, los ELISA tienen determinadas características en común, tales como recubrimiento, incubación o unión, lavado para eliminar las especies enlazadas de forma no específica, y detección de los complejos inmunes enlazados.

Los antígenos o anticuerpos también se pueden enlazar a un soporte sólido tal como en forma de placa, perlas, varilla graduada, membrana o matriz en columna, y la muestra que se va a analizar se aplica al antígeno o anticuerpo inmovilizado. Al recubrir una placa bien con un antígeno o con un anticuerpo, en general, se incubarán los pocillos de la placa con una solución del antígeno o del anticuerpo, bien durante la noche o durante un período de tiempo especificado. A continuación, se lavarán los pocillos de la placa para eliminar el material adsorbido de forma incompleta. Cualquier superficie disponible que quede de los pocillos se “recubre” después con una proteína no específica que es antigénicamente neutral con respecto al antisuero del ensayo. Estas incluyen albúmina de suero bovino (BSA), caseína y soluciones de leche en polvo. El recubrimiento permite el bloqueo de sitios de adsorción no específicos en la superficie de inmovilización y, por tanto, reduce el fondo causado por la unión inespecífica del antisuero sobre la superficie.

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B. Diagnóstico de la infección bacteriana

Además del uso de proteínas, polipéptidos y/o péptidos, así como anticuerpos que unen a estos polipéptidos, proteínas y/o péptidos, para tratar o prevenir la infección como se ha descrito anteriormente, la presente divulgación contempla el uso de estos polipéptidos, proteínas, péptidos y/o anticuerpos en una variedad de formas, incluyendo la detección de la presencia de estafilococos para diagnosticar una infección, ya sea en un paciente o en un equipo médico que también pueda infectarse. Un método preferido de detección de la presencia de infecciones implica las etapas de obtener una muestra sospechosa de estar infectada por una o más especies o cepas de bacterias estafilocócicas tales como una muestra tomada de un individuo, por ejemplo, de sangre, saliva, tejidos, hueso, músculo, cartílago o piel. Tras el aislamiento de la muestra, se pueden llevar a cabo ensayos de diagnóstico que utilizan los polipéptidos, las proteínas, los péptidos y/o los anticuerpos de la presente invención para detectar la presencia de estafilococos, y dichas técnicas de ensayo para determinar dicha presencia en una muestra son bien conocidas por los expertos en la materia, e incluyen métodos tales como radioinmunoensayo, análisis de transferencia Western y ensayos de ELISA. En general, se contempla un método de diagnóstico de una infección, en el que se ha añadido a una muestra sospechosa de estar infectada con estafilococos el polipéptido, la proteína, el péptido, el anticuerpo o el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención, y los estafilococos están indicados por la unión del anticuerpo a los polipéptidos, las proteínas y/o los péptidos, o polipéptidos, proteínas y/o péptidos que se unen a los anticuerpos en la muestra.

Por consiguiente, los anticuerpos se pueden usar para la prevención de la infección por bacterias estafilocócicas (es decir, inmunización pasiva), para el tratamiento de una infección en curso o para su uso como herramientas de investigación. El término "anticuerpos", como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, monocatenarios, biespecíficos, simiescos y humanizados o primatizados, así como fragmentos Fab, tales como los fragmentos que mantienen la especificidad de unión de los anticuerpos, incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina Fab. Por consiguiente, la divulgación contempla el uso de cadenas simples tales como las cadenas pesadas y ligeras variables de los anticuerpos. La generación de cualquiera de estos tipos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos es muy conocida por los expertos en la materia. Se pueden encontrar ejemplos específicos de la generación de un anticuerpo hacia una proteína bacteriana en la publicación de patente de EE.UU. n.° 20030153022.

Cualquiera de los polipéptidos, proteínas, péptidos y/o anticuerpos descritos anteriormente se pueden marcar directamente con un marcador detectable para la identificación y cuantificación de bacterias estafilocócicas. Los marcadores para su uso en inmunoensayos son conocidos, en general, por los expertos en la materia, e incluyen enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas, incluyendo particular tales como oro coloidal o perlas de látex. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos de inmunoadsorción enzimática ligados a una enzima (ELISA).

C. Inmunidad protectora

En algunas realizaciones de la invención, las composiciones proteináceas confieren inmunidad protectora a un sujeto. La inmunidad protectora se refiere a la capacidad de un cuerpo para desarrollar una respuesta inmune específica que protege al sujeto de desarrollar una enfermedad o afección en particular que implique al agente contra el que hay una respuesta inmune. Una cantidad inmunogénicamente eficaz es capaz de conferir inmunidad protectora al sujeto.

Como se usa en el presente documento, en la memoria descriptiva y en el siguiente apartado de reivindicaciones, el término polipéptido o péptido se refiere a un tramo de aminoácidos enlazado covalentemente entre los enlaces peptídicos. Diferentes polipéptidos tienen diferentes funcionalidades de acuerdo con la presente invención. Aunque de acuerdo con un aspecto, un polipéptido se deriva de un inmunógeno diseñado para inducir una respuesta inmune activa en un receptor, según otro aspecto de la invención, un polipéptido se deriva de un anticuerpo que resulta después de la obtención de una respuesta inmune activa en, por ejemplo, un animal, y que puede servir para inducir una respuesta inmune pasiva en el receptor. En ambos casos, sin embargo, el polipéptido está codificado por un polinucleótido de acuerdo con cualquier posible uso de codones.

Como se usa en el presente documento, la expresión "respuesta inmune" o su equivalente "respuesta inmunológica" se refiere al desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos), celular (mediada por linfocitos T específicos del antígeno o sus productos de secreción) o respuesta tanto humoral como celular dirigida contra una proteína, un péptido, un hidrato de carbono o un polipéptido de la invención en un paciente receptor. Dicha respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administración de inmunógeno o una respuesta pasiva inducida por la administración de anticuerpo, material que contiene anticuerpo o linfocitos T cebadas. Se genera una respuesta inmune celular mediante la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas MHC de Clase I o Clase II, para activar linfocitos T auxiliares CD4 (+) específicos del antígeno y/o linfocitos T citotóxicos CD8 (+). La respuesta también puede implicar la activación de monocitos, macrófagos, linfocitos NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de microglia, eosinófilos u otros componentes de la inmunidad innata. Como se usa en el presente documento, "inmunidad activa" se refiere a cualquier inmunidad conferida a un sujeto mediante la administración de un antígeno.

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Como se usa en el presente documento, "inmunidad pasiva" se refiere a cualquier inmunidad conferida a un sujeto sin administración de un antígeno al sujeto. La "inmunidad pasiva", por lo tanto, incluye, pero sin limitación, la administración de efectores inmunes activados que incluyen mediadores celulares o mediadores de proteínas (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o policlonales) de una respuesta inmune. Se puede usar una composición de anticuerpo monoclonal o policlonal en la inmunización pasiva para la prevención o el tratamiento de la infección por organismos portadores del antígeno reconocido por el anticuerpo. Una composición de anticuerpo puede incluir anticuerpos que se unen a una variedad de antígenos que, a su vez, pueden estar asociados con diversos organismos. El componente de anticuerpo puede ser un antisuero policlonal. En ciertos aspectos, el/los anticuerpo/s se purifican por afinidad a partir de un animal o un segundo sujeto que se ha expuesto a uno o varios antígenos. Como alternativa, se puede usar una mezcla de anticuerpos, que es una mezcla de anticuerpos monoclonales y/o policlonales contra antígenos presentes en los mismos microbios u organismos relacionados, o diferentes, tales como bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativas, incluyendo, pero sin limitación, la bacteria Staphylococcus.

Se puede conferir inmunidad pasiva a un paciente o sujeto administrando al paciente inmunoglobulinas (Ig) y/u otros factores inmunes obtenidos de un donante u otra fuente que no sea el paciente que tenga una inmunorreactividad conocida. En otros aspectos, una composición antigénica de la presente invención se puede administrar a un sujeto que luego actúa como fuente o donante de globulina, producida en respuesta a la exposición a la composición antigénica ("globulina hiperinmune"), que contiene anticuerpos dirigidos contra Staphylococcus u otro organismo. Un sujeto así tratado donaría plasma a partir del que se obtendría la globulina hiperinmune, mediante la metodología de fraccionamiento de plasma convencional, y se administraría a otro sujeto para conferir resistencia contra o para tratar la infección por estafilococo. Las globulinas hiperinmunitarias de acuerdo con la invención son particularmente útiles para individuos inmunodeprimidos, para individuos sometidos a procedimientos invasivos o en los que el tiempo no permite al individuo producir sus propios anticuerpos en respuesta a la vacunación. Véanse las patentes de EE.UU. n.° 6.936.258, 6.770.278, 6.756.361, 5.548.066, 5.512.282, 4.338.298 y 4.748.018, para los métodos ilustrativos y las composiciones relacionadas con la inmunidad pasiva.

Para los fines de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "epítopo" y la expresión "determinante antigénico" se usan indistintamente para referirse a un sitio en un antígeno al que las linfocitos B y/o T responden o reconocen. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se retienen al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una configuración espacial única. Los métodos de determinación de la configuración espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, “Epitope Mapping Protocols” (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. Los linfocitos T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para las células CD8 o de aproximadamente 13-15 aminoácidos para las células CD4. Los linfocitos T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígenos, según se determina mediante la incorporación de 3H-timidina H linfocitos T cebados en respuesta a un epítopo (Burke et al., 1994), mediante la destrucción dependiente del antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., 1996) o por secreción de citocinas.

La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante ensayos de proliferación (linfocitos T CD4 (+)) o CTL (linfocitos T citotóxicos). Las contribuciones relativas de las respuestas humorales y celulares al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno se pueden distinguir aislando por separado las células IgG y los linfocitos T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se usan indistintamente, y se refieren a cualquiera de varias clases de proteínas relacionadas estructuralmente que funcionan como parte de la respuesta inmune de un animal o receptor, cuyas proteínas incluyen IgG, IgD, IgE, IgA, IgM y proteínas relacionadas.

En condiciones fisiológicas normales, los anticuerpos se encuentran en el plasma y otros fluidos corporales y en la membrana de ciertas células y son producidos por linfocitos del tipo denominado linfocitos B o su equivalente funcional. Los anticuerpos de la clase IgG están formados por cuatro cadenas polipeptídicas enlazadas entre sí por enlaces disulfuro. Las cuatro cadenas de moléculas de IgG intactas son dos cadenas pesadas idénticas denominadas cadenas H y dos cadenas ligeras idénticas denominadas cadenas L.

Para producir anticuerpos policlonales, se inmuniza un hospedador, tal como un conejo o una cabra, con el antígeno o fragmento de antígeno, en general, con un adyuvante y, si es necesario, se acopla a un vehículo. Los anticuerpos contra el antígeno se recogen posteriormente de los sueros del hospedador. El anticuerpo policlonal puede purificarse por afinidad contra el antígeno convirtiéndolo en monoespecífico.

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Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por hiperinmunización de un donante apropiado con el antígeno o ex vivo mediante el uso de cultivos primarios de células esplénicas o estirpes celulares derivadas del bazo (Anavi, 1998; Huston et al., 1991; Johnson et al., 1991; Mernaugh et al., 1995).

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, la expresión "una parte inmunológica de un anticuerpo" incluye un fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento Fv de un anticuerpo, una cadena pesada de un anticuerpo, una cadena ligera de un anticuerpo, un heterodímero que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena pesada de un anticuerpo y una variante monocatenaria de un anticuerpo, que también se conoce como scFv. Además, el término incluye inmunoglobulinas quiméricas que son los productos de expresión de genes fusionados derivados de diferentes especies, una de las especies puede ser un ser humano, en cuyo caso se dice que una inmunoglobulina quimérica está humanizada. Por lo general, una parte inmunológica de un anticuerpo compite con el anticuerpo intacto del que se deriva para la unión específica a un antígeno.

Opcionalmente, un anticuerpo o preferentemente una parte inmunológica de un anticuerpo, se puede conjugar químicamente a, o expresarse como, una proteína de fusión con otras proteínas. Para los fines de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, todas estas proteínas fusionadas se incluyen en la definición de anticuerpos o una parte inmunológica de un anticuerpo.

Como se usan en el presente documento, la expresión "agente inmunogénico", o los términos "inmunógeno" o "antígeno" se usan indistintamente para describir una molécula capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí misma en la administración a un receptor, solo, junto con un adyuvante o presentado en un vehículo de presentación.

Composiciones para su uso en un método de tratamiento

Las composiciones de la invención se pueden usar en métodos de tratamiento de una enfermedad o afección causada por un patógeno estafilocócico. Se puede proporcionar un polipéptido inmunogénico de la invención para inducir una respuesta inmune en una persona infectada con estafilococo o que se sospeche que ha estado expuesta a estafilococos. Se pueden emplear métodos con respecto a los individuos que dieron positivo para la exposición a estafilococos o que se considera que están en riesgo de infección en función de la posible exposición.

En particular, las composiciones de la invención se pueden usar en un método de tratamiento para la infección por estafilococos, en particular, las infecciones nosocomiales adquiridas en el hospital. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas de la invención son particularmente ventajosas para su uso en casos de cirugía electiva. Dichos pacientes sabrán la fecha de la cirugía por anticipado, y podrían ser inoculados por anticipado. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas de la invención también son ventajosas para su uso en la inoculación de los trabajadores de la atención sanitaria.

En algunas realizaciones, la composición se administra en presencia de adyuvantes o vehículos u otros antígenos estafilocócicos. Además, en algunos ejemplos, el tratamiento comprende la administración de otros agentes comúnmente usados contra la infección bacteriana, tales como uno o más antibióticos.

El uso de péptidos para la vacunación puede requerir, pero no necesariamente, la conjugación del péptido con una proteína vehículo inmunogénica, tal como el antígeno de superficie de la hepatitis B, la hemocianina de lapa californiana o la albúmina de suero bovino. Los métodos de realización de esta conjugación son bien conocidos en la técnica.

V. VACUNA Y OTRAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN

A. Vacunas

La presente invención incluye composiciones para su uso en métodos de prevención o mejora de infecciones estafilocócicas, en particular, infecciones nosocomiales adquiridas en el hospital. La divulgación contempla vacunas para su uso en inmunización tanto activa como pasiva. Las composiciones inmunogénicas, propuestas como adecuadas para su uso como una vacuna, se pueden preparar a partir de uno o varios polipéptido inmunogénico de SpA, tal como una variante del dominio D de SpA o coagulasas inmunogénicas. En otras realizaciones, se pueden usar SpA en combinación con otras proteínas de virulencia secretadas, proteínas de superficie o fragmentos inmunogénicos de las mismas. En ciertos aspectos, el material antigénico se somete extensamente a diálisis para eliminar las moléculas de bajo peso molecular no deseadas y/o se liofiliza para una formulación más preparada en un vehículo deseado.

Otras opciones para una vacuna a base de proteína/péptido implican la introducción de ácidos nucleicos que codifican el/los antígeno/s como vacunas de aDn. En este sentido, informes recientes han descrito la construcción de virus vaccinia recombinantes que expresan bien epítopos de CTL mínimos contiguos (Thomson, 1996) o una combinación de epítopos de linfocitos B, linfocitos T citotóxicos (CTL) y T (auxiliares) (Th) de varios microbios (An,

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1997), y el uso exitoso de dichas construcciones para inmunizar ratones para cebar respuestas inmunes protectoras. Por lo tanto, existe amplia evidencia en la bibliografía sobre la utilización exitosa de péptidos, células presentadoras de antígenos pulsadas con péptido (APC) y construcciones que codifican péptidos para el cebado eficaz in vivo de respuestas inmunes protectoras. El uso de secuencias de ácidos nucleicos como vacunas se ilustra en las patentes de EE.UU. n.° 5.958.895 y 5.620.896.

La preparación de vacunas que contienen una o varias secuencias de polipéptidos o péptidos como principios activos, en general, se entiende bien en la técnica, como se ilustra en las patentes de EE.UU. n.° 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y 4.578.770. Por lo general, dichas vacunas se preparan como inyectables bien en forma de soluciones o suspensiones líquidas: también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también puede ser emulsionada. El ingrediente inmunogénico activo se suele mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH o adyuvantes que mejoran la eficacia de las vacunas. En realizaciones específicas, las vacunas se formulan con una combinación de sustancias, como se describe en las patentes de EE.UU. n.° 6.793.923 y 6.733.754.

Las vacunas se pueden administrar convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos: dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contengan el principio activo en el intervalo del aproximadamente 0,5 % al aproximadamente 10 %, preferentemente del aproximadamente 1 % al aproximadamente 2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación sostenida, y contienen del aproximadamente 10 % al aproximadamente 95 % de principio activo, preferentemente del aproximadamente 25 % al aproximadamente 70 %.

Los polipéptidos y las construcciones de ADN que codifican polipéptidos pueden formularse en una vacuna como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares

Por lo general, las vacunas se administran de una manera compatible con la forma farmacéutica, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz e inmunogénica. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se va a tratar, incluyendo la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas de principio activo requeridas para su administración dependen del juicio del médico. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación. Las pautas adecuadas para la administración inicial y las inyecciones de refuerzo también son variables, pero están tipificadas por una administración inicial seguida de inoculaciones posteriores u otras administraciones.

La forma de aplicación puede variar ampliamente. Es aplicable cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que estas incluyen la aplicación oral dentro de una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral, mediante inyección y similares. La dosis de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con el tamaño y la salud del sujeto.

En ciertos casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más administraciones. Las vacunas pueden ser a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 intervalos de doce semanas, incluyendo todos los intervalos entre los mismos. Serán deseables los refuerzos periódicos en intervalos de 1 a 5 años para mantener los niveles de protección de los anticuerpos. El curso de la inmunización puede ir seguido de ensayos de anticuerpos contra los antígenos, como se describe en las patentes de EE.UU. n.° 3.791.932; 4.174.384 y 3.949.064.

1. Vehículos

Una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Por lo tanto, suele ser necesario reforzar el sistema inmune del hospedador, como se puede lograr acoplando un péptido o polipéptido a un vehículo. Los vehículos ilustrativos y preferidos son la hemocianina de lapa californiana (KLH) y la albúmina de suero bovino (BSA). También se pueden usar otras albúminas tales como la ovoalbúmina, la albúmina de suero de ratón o la albúmina de suero de conejo como vehículos. Los medios de conjugación de un polipéptido a una proteína vehículo son bien conocidos en la técnica, e incluyen glutaraldehído, éster de m-maleimidobencoil-W-hidroxisuccinimida, carbodiimida y bencidina

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bis-biazotada.

2. Adyuvantes

La inmunogenicidad de las composiciones de polipéptidos o péptidos se puede mejorar mediante el uso de estimulantes inespecíficos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen todos los compuestos inmunoestimulantes aceptables, tales como citocinas, toxinas o composiciones sintéticas. Se pueden usar varios adyuvantes para potenciar una respuesta de anticuerpos contra un polipéptido o coagulasa de variante de SpA, o cualquier otra proteína o combinación bacteriana contemplada en el presente documento. Los adyuvantes pueden (1) atrapar el antígeno en el cuerpo para causar una liberación lenta; (2) atraer células implicadas en la respuesta inmune hacia sitio de administración; (3) inducir la proliferación o activación de células del sistema inmunitario; o (4) mejorar la propagación del antígeno en todo el cuerpo del sujeto.

Los adyuvantes incluyen, pero sin limitación, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, sales minerales, polinucleótidos y sustancias naturales. Los adyuvantes específicos que se pueden usar incluyen IL-1, IL- 2, IL-4, IL-7, IL-12, Y-interferón, GMCSP, BCG, sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio u otro compuesto de aluminio, compuestos de MDP tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A y monofosforil lípido A (MPL). RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS) en una emulsión de escualeno/Tween 80 al 2 %. Se pueden usar incluso antígenos del MHC. En las patentes de Ee.UU. n.° 6.814.971, 5.084.269, 6.656.462, se ilustran otros adyuvantes o métodos.

Diversos métodos para lograr un efecto adyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como hidróxido de aluminio o fosfato (alumbre), comúnmente usados como una solución del aproximadamente 0,05 al aproximadamente 0,1 % en salina tamponada con fosfato, mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol®) usados como una solución al aproximadamente 0,25 %, agregación de la proteína en la vacuna mediante el tratamiento térmico con temperaturas que varían entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 101 °C durante un período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. También se puede emplear para producir un efecto adyuvante la agregación mediante reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (Fab) contra la albúmina; la mezcla con células bacterianas (por ejemplo, C. parvum), endotoxinas o componentes lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas; la emulsión en vehículos oleosos fisiológicamente aceptables (por ejemplo, mono-oleato de manida (Aracel A)); o la emulsión con una solución al 20 % de un perfluorocarbono (Fluosol-DA®) usada como un sustituto del bloque.

Los ejemplos de adyuvantes que se suelen preferir incluyen adyuvante de Freund completo (un estimulante no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis muerta), adyuvantes de Freund incompletos e hidróxido de aluminio.

En algunos aspectos, se prefiere que el adyuvante se seleccione para que sea un inductor preferido de un tipo de respuesta Th1 o Th2. Los niveles altos de citocinas de tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células a un antígeno dado, mientras que los niveles elevados de citocinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción de la respuesta inmune Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo apoyará una respuesta inmune que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de lo descrito en los clones de linfocitos T CD4+ murinos por Mosmann y Coffman (Mosmann y Coffman, 1989). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 están asociadas con la producción de las citocinas INF-y e IL-2 por los linfocitos T. Otras citocinas que se suelen asociar directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo Th1 no son producidas por linfocitos T, tales como IL- 12. Por el contrario, las respuestas de tipo Th2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10.

Además de los adyuvantes, se puede desear administrar conjuntamente modificadores de respuesta biológica (BRM) para potenciar las respuestas inmunes. Se ha demostrado que los BRM regulan positivamente la inmunidad de los linfocitos T o regulan negativamente la actividad de las células supresoras. Dichas BRM incluyen, pero sin limitación, cimetidina (CIM, 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); o dosis bajas de ciclofosfamida (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ) y citocinas tales como Y-interferón, IL-2 o IL-12 o genes que codifican las proteínas implicadas en funciones de ayuda inmunitaria, tales como B-7.

B. Componentes y fracciones lipídicas

En el presente documento, se desvelan composiciones que comprenden uno o más lípidos asociados con un ácido nucleico o un polipéptido/péptido. Un lípido es una sustancia que es insoluble en agua y extraíble con un disolvente orgánico. El experto en la materia entiende por lípidos a los compuestos distintos a los descritos específicamente en el presente documento, y son englobados por las composiciones y los métodos de la presente divulgación. Un componente lipídico y un componente no lipídico pueden unirse entre sí, bien de forma covalente o de forma no covalente.

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Un lípido puede ser un lípido de origen natural o un lípido sintético. Sin embargo, un lípido es habitualmente una sustancia biológica. Los lípidos biológicos se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfinolípidos, glucolípidos, sulfatidas, lípidos con ácidos grasos enlazados por éter y éster, y lípidos polimerizables, y combinaciones de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico o un polipéptido/péptido, asociado con un lípido puede dispersarse en una solución que contiene un lípido, disolverse con un lípido, emulsionarse con un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, unirse covalentemente con un lípido, estar contenido como una suspensión en un lípido o asociado de otro modo a un lípido. Una composición asociada a un lípido o lípido-poxvirus de la presente divulgación no se limita a ninguna estructura en particular. Por ejemplo, se pueden entremezclar simplemente en una solución, posiblemente formando agregados que no sean uniformes ni en tamaño ni en forma. En otro ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelos o con una estructura “hundida”. En otro ejemplo no limitante, también se contempla un complejo de lipofectamina (Gibco BRL)-poxvirus o Superfect (Qiagen)-poxvirus.

En ciertas realizaciones, una composición puede comprender aproximadamente 1 %, aproximadamente el 2 %,

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aproximadamente: el 7 %, aproximadamente el 8 %, aproximadamente el 9 %, aproximadamente el 10 %

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aproximadamente el 99 %, de un determinado tipo de lípido o componente no lipídico tal como un adyuvante, antígeno, péptido, polipéptido, azúcar, ácido nucleico u otros materiales desvelados en el presente documento o conocidos por un experto en la materia. En un ejemplo no limitante, una composición puede comprender del aproximadamente 10 % al aproximadamente 20 % de lípidos neutros, y del aproximadamente 33 % al aproximadamente 34 % de una cerebrosida, y aproximadamente el 1 % de colesterol. En otro ejemplo no limitante, un liposoma puede comprender del aproximadamente 4 % al aproximadamente 12 % de terpenos, en el que aproximadamente un 1 % de la micela es específicamente licopeno, dejando del aproximadamente 3 % al aproximadamente 11 % del liposoma comprendiendo otros terpenos; y del aproximadamente 10 % al aproximadamente 35 % de fosfatidil colina, y aproximadamente el 1 % de un componente no lipídico. Por lo tanto, se contempla que las composiciones de la presente invención pueden comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípidos u otros componentes en cualquier combinación o intervalo de porcentajes.

C. Terapia de combinación

Las composiciones y los métodos relacionados de la presente invención, en particular, la administración de un factor de virulencia secretado o una proteína de superficie, incluyendo un péptido o polipéptido de variante de SpA, y/o otros péptidos o proteínas bacterianos a un paciente/sujeto, también se pueden usar en combinación con la administración de terapias tradicionales. Estas incluyen, pero sin limitación, la administración de antibióticos tales como estreptomicina, ciprofloxacino, doxiciclina, gentamicina, cloranfenicol, trimetoprima, sulfametoxazol, ampicilina, tetraciclina o diversas combinaciones de antibióticos.

En un aspecto, se contempla que una vacuna y/o terapia de polipéptidos se utilice en combinación con tratamiento antibacteriano. Como alternativa, la terapia puede preceder o ir después del tratamiento con el otro agente en intervalos que varían de minutos a semanas. En realizaciones en las que los otros agentes y/o proteínas o polinucleótidos se administran por separado, debería garantizarse, en general, que no transcurra un período de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de manera que el agente y la composición antigénica sigan siendo capaces de ejercer un efecto combinado de forma ventajosa en el sujeto. En dichos casos, se

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contempla que es posible administrar ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 h entre sí o dentro de aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, se puede desear prolongar el período de tiempo para la administración de forma significativa, donde hay un lapso de varios días (2, 3, 4, 5,6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.

Se pueden emplear diversas combinaciones, por ejemplo, la terapia con antibióticos es “A” y la molécula inmunogénica proporcionada como parte de un régimen de terapia inmune, tal como un antígeno, es “B”:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B

B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A.

La administración de composiciones inmunogénicas de la presente invención a un paciente/sujeto seguirá protocolos generales para la administración de dichos compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hubiera, de la composición de SpA, u otras composiciones descritas en el presente documento. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla la aplicación de diversas terapias convencionales, tales como la hidratación, en combinación con la terapia descrita.

D. Composiciones farmacéuticas generales

En algunos aspectos de la divulgación, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto. Diferentes aspectos de la presente divulgación implican la administración de una cantidad eficaz de una composición a un sujeto. Se pueden administrar antígenos estafilocócicos, miembros de la vía Ess, incluyendo polipéptidos o péptidos de la clase Esa o Esx, y/o miembros de sustratos de sortasa al paciente para protegerle contra la infección por uno o más patógenos de estafilococos. Como alternativa, se puede dar un vector de expresión que codifica uno o más de dichos polipéptidos o péptidos a un paciente como un tratamiento preventivo. Además, dichos compuestos se pueden administrar en combinación con un antibiótico o un agente antibacteriano. En general, dichas composiciones se disuelven o se dispersan en un vehículo farmacéuticamente aceptable o un medio acuoso.

Además de los compuestos formulados para la administración parenteral, tales como para inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para la administración por vía oral; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma usada en la actualidad, incluyendo cremas, lociones, enjuagues bucales, inhaladores y similares.

Los compuestos activos de la presente invención se pueden formular para su administración por vía parenteral, por ejemplo, formularse para la inyección por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o incluso intraperitoneal. Los expertos en la materia conocerán la preparación de una composición acuosa que contenga un compuesto o compuestos que aumenten la expresión de una molécula MHC de clase I a la luz de la presente divulgación. Por lo general, dichas composiciones se pueden preparar como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para su uso en la preparación de soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido antes de la inyección; y, los preparados también se pueden emulsionar.

Se pueden preparar en agua soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables, mezcladas de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su uso como inyectables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; las formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta un grado en el que se pueda inyectar fácilmente. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como las bacterias y los hongos.

Las composiciones proteináceas pueden formularse en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. También se pueden obtener sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y

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aceites vegetales. Se puede mantener una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula adecuado en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. Se puede lograr la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Se puede alcanzar la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente adecuado con diversos de los demás ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de una esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo, más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.

La administración de las composiciones de acuerdo con la presente invención normalmente será a través de cualquier vía habitual. Esto incluye, pero sin limitación, la administración oral, nasal o bucal. Como alternativa, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal o intravenosa. En ciertas realizaciones, una composición vacunal se puede inhalar (por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.651.655). Dichas composiciones se administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen vehículos fisiológicamente aceptables, tampones u otros excipientes. Como se usa en el presente documento, la expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance de un juicio médico fiable, adecuados para entrar en contacto con tejidos humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones problemáticas en proporción con una relación beneficio/riesgo razonable. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable”, significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicado en portar o transportar un agente químico.

Para la administración por vía parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe estar tamponada de forma adecuada, si fuera necesario, y el diluyente líquido debe volverse isotónico primero con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas en particular son especialmente adecuadas para la administración por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los medios acuosos estériles que se pueden emplear resultarán conocidos para los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, se podría disolver una dosis en una solución de NaCl isotónica, y bien añadirse a un fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de la infusión, (véase por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 1990). Algunas variaciones en la dosis serán necesarias dependiendo del estado del sujeto. La persona responsable de la administración determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individualmente.

Se determina una cantidad eficaz de la composición terapéutica o profiláctica basándose en el objetivo deseado. La expresión “dosis unitaria” o “dosificación” se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas para su uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas tratadas anteriormente en asociación con la administración, es decir, la vía y el régimen adecuados. La cantidad que se va a administrar, tanto de acuerdo con una serie de tratamientos como con una dosis unitaria, depende de la protección deseada.

Las cantidades exactas de la composición también dependen del juicio del profesional sanitario y son específicas para cada individuo. Los factores que afectan a la dosis incluyen el estado físico y clínico del sujeto, la vía de administración, el objetivo deseado del tratamiento (alivio de los síntomas frente a curación), y la potencia, estabilidad y toxicidad de la composición en particular.

Tras la formulación, se administrarán las soluciones de manera compatible con la forma farmacéutica y en una cantidad tal que sea terapéutica o profilácticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables que se han descrito anteriormente.

E. Administración in vitro, ex vivo o in vivo

Como se usa en el presente documento, la expresión administración in vitro se refiere a manipulaciones realizadas en células extraídas de o fuera de un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, células en cultivo. La expresión administración ex vivo se refiere a células que han sido manipuladas in vitro, y que se administran posteriormente a un sujeto. La expresión administración in vivo incluye todas las manipulaciones realizadas en un sujeto.

En ciertos aspectos de la presente divulgación, las composiciones se pueden administrar bien in vitro, ex vivo o in vivo. En ciertos aspectos in vitro, se incuban estirpes celulares de linfocitos B autólogos con un vector vírico de la

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presente invención durante 24 a 48 horas, o con una variante de SpA y/o coagulasa y/o cualquier otra composición descrita en el presente documento durante dos horas. A continuación, las células transducidas se pueden usar para su análisis in vitro o, como alternativa, para su administración ex vivo. Las patentes de EE.UU. n.° 4.690.915 y 5.199.942, desvelan métodos para la manipulación ex vivo de células mononucleares sanguíneas y células de la médula ósea para su uso en aplicaciones terapéuticas.

F. Anticuerpos e inmunización pasiva

Otro aspecto de la divulgación es un método de preparación de una inmunoglobulina para su uso en la prevención o el tratamiento de la infección estafilocócica que comprende las etapas de inmunizar a un receptor o donante con la vacuna de la invención y aislar la inmunoglobulina del receptor o donante. Una inmunoglobulina preparada mediante este método es un aspecto adicional de la divulgación. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable es un aspecto adicional que se podría usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la enfermedad estafilocócica. Se desvelan además composiciones para su uso en un método de tratamiento o prevención de la infección por estafilococos que comprende una etapa de administrar a un paciente una cantidad eficaz de la preparación farmacéutica de la invención.

Los inóculos para la producción de anticuerpos policlonales normalmente se preparan dispersando la composición antigénica en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como solución salina u otros adyuvantes adecuados para uso humano para formar una composición acuosa. Se administra una cantidad inmunoestimulante de inóculo a un mamífero, y el mamífero inoculado se mantiene luego durante un tiempo suficiente para que la composición antigénica induzca anticuerpos protectores.

Los anticuerpos se pueden aislar en la medida deseada mediante técnicas bien conocidas tales como la cromatografía de afinidad (Harlow y Lane, 1988). Los anticuerpos pueden incluir preparados de antisuero de una variedad de animales de uso común, por ejemplo, cabras, primates, burros, cerdos, caballos, cobayas, ratas u seres humanos.

Una inmunoglobulina producida de acuerdo con la divulgación puede incluir anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos o subfragmentos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas completas de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE), anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con doble especificidad para dos o más antígenos de la invención. También pueden ser fragmentos (por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares) que incluyen fragmentos híbridos. Una inmunoglobulina también incluye proteínas naturales, sintéticas o modificadas genéticamente que actúan como un anticuerpo uniéndose a antígenos específicos para formar un complejo.

Una vacuna de la presente invención se puede administrar a un receptor que luego actúa como una fuente de inmunoglobulina, producida en respuesta a la exposición de la vacuna específica. Un sujeto así tratado donaría plasma a partir del que se obtendría la globulina hiperinmune mediante la metodología de fraccionamiento de plasma convencional. La globulina hiperinmune se administraría a otro sujeto para conferir resistencia contra o tratar la infección por estafilococos. Las globulinas hiperinmunes son particularmente útiles para el tratamiento o la prevención de la enfermedad estafilocócica en bebés, individuos inmunodeprimidos o cuando se requiere tratamiento y no hay tiempo para que el individuo produzca anticuerpos en respuesta a la vacunación.

Un aspecto adicional de la divulgación es una composición farmacéutica que comprende dos de más anticuerpos monoclonales (o fragmentos de los mismos, preferentemente humanos o humanizados) reactivos contra al menos dos constituyentes de la composición inmunogénica de la invención, que se podrían usar para tratar o prevenir la infección por bacterias Gram-positivas, preferentemente estafilococos, más preferentemente S. aureus o S. epidermidis. Dichas composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos monoclonales que pueden ser inmunoglobulinas enteras de cualquier clase, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad hacia dos o más antígenos de la invención. También pueden ser fragmentos (por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares) que incluyen fragmentos híbridos.

Los métodos de fabricación de anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir la fusión de esplenocitos con células de mieloma (Kohler y Milstein, 1975, Harlow y Lane, 1988). Como alternativa, pueden obtenerse fragmentos Fv monoclonales rastreando una biblioteca de presentación en fagos adecuada (Vaughan et al., 1998). Los anticuerpos monoclonales pueden ser humanizados o parcialmente humanizados mediante los métodos conocidos.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención. Un experto en la materia apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos, y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como aquellos objetos, fines y ventajas inherentes en el presente documento. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en el presente documento son actualmente representativos de realizaciones preferidas.

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EJEMPLO 1

VARIANTES DE LA PROTEÍNA A NO TOXIGÉNICA COMO VACUNAS SUBUNITARIAS PARA PREVENIR INFECCIONES POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS

A. RESULTADOS

Modelo animal para una infección por S. aureus. Se infectaron ratones BALB/c mediante inyección intravenosa con 1 x 107 UFC del aislado clínico humano de S. aureus Newman (Baba et al., 2007). En un período de 6 horas después de la infección, desapareció el 99,999 % de los estafilococos de la corriente sanguínea y se distribuyeron a través de la vasculatura. La diseminación estafilocócica a los tejidos periféricos se produjo rápidamente, a medida que la carga bacteriana en el riñón y otros tejidos de órganos periféricos alcanzó un valor 1 x 105 UFC/g en las tres primeras horas. La carga estafilocócica en los tejidos del riñón aumentó en 1,5 log de UFC en veinticuatro horas. Cuarenta y ocho horas después de la infección, los ratones desarrollaron abscesos diseminados en múltiples órganos, detectables mediante microscopía óptica de tejido renal en secciones finas y teñido con hematoxilina- eosina. El diámetro inicial de los abscesos fue de 524 pM (± 65 pM); se marcaron inicialmente las lesiones mediante un influjo de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y no albergaban ninguna organización de estafilococos discernible, la mayoría de los cuales parecían residir dentro de los PMN. El día 5 de la infección, los abscesos aumentaron de tamaño y encerraron una población central de estafilococos, rodeada por una capa de material amorfo eosinófilo y una gran masa de PMN. La histopatología reveló una necrosis masiva de PMN en la proximidad del nido estafilocócico en el centro de las lesiones de abscesos, además de una capa de fagocitos sanos. Se observó un borde de PMN necróticos en la periferia de las lesiones de abscesos, bordeando material eosinófilo, amorfo que separa el tejido renal sano de las lesiones. Finalmente, los abscesos alcanzaron un diámetro de > 1,524 pM en el día 15 o 36. En intervalos de tiempo posteriores, la carga estafilocócica se aumentó a 104-106 UFC/g y las lesiones de abscesos en crecimiento migraron hacia la cápsula del órgano. Las lesiones periféricas tendían a la ruptura, liberando de este modo material necrótico y estafilococos en la cavidad peritoneal o el espacio retroperitoneal. Estos eventos dieron como resultado una bacteriemia además de una onda secundaria de abscesos, lo que dio lugar finalmente a un desenlace letal.

Para enumerar la carga estafilocócica en el tejido renal, se sacrificaron los animales, se extirparon los riñones y el tejido homogenizado se extendió sobre medio de agar para la formación de colonias. En el día 5 de la infección, se observó una media de 1 x 106 de UFC/g de tejido renal para S. aureus Newman. Para cuantificar la formación de abscesos, se examinaron los riñones a simple vista, y se otorgó a cada órgano individual una puntuación de uno o cero. Se dividió la suma final entre el número total de riñones para calcular el porcentaje de abscesos en la superficie (Tabla 4). Además, se fijaron unos riñones escogidos aleatoriamente en formalina, se embebieron, se prepararon en secciones finas y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Para cada riñón, se observaron por microscopía cuatro secciones sagitales en intervalos de 200 pM. Se contaron los números de lesiones para cada sección y se calculó la media para cuantificar el número de abscesos dentro de los riñones. El S. aureus Newman causó 4,364 ± 0,889 de abscesos por riñón, y se observaron abscesos en la superficie en 14 de 20 riñones (70 %) (Tabla 4).

Cuando se examinó mediante microscopio de barrido electrónico, se situó S. aureus Newman en césped estrechamente asociado en el centro de los abscesos. Los estafilococos estaban contenidos por pseudocápsulas amorfas que separaban las bacterias de la masa de leucocitos de los abscesos. No se observaron células inmunes en estos nidos centrales de estafilococos, sin embargo, se situaron glóbulos rojos ocasionales entre las bacterias. Las poblaciones bacterianas del centro de los abscesos, designadas comunidades de abscesos estafilocócicas (SAC), se mostraron homogéneas y recubiertas por un material granular denso en electrones. La cinética del aspecto de las lesiones infecciosas y los atributos morfológicos de los abscesos formados por S. aureus Newman fueron similares a lo observado tras la infección del ratón con S. aureus USA300 (LAC), el actual clon de S. aureus epidémico resistente a meticilina adquirido en la comunidad (CA-MRSA) en Estados Unidos (Diep et al., 2006).

Tabla 4. Requisitos genéticos para la formación de abscesos de S. aureus Newman en ratones

: Carga estafilocócica en tejido renal Formación de abscesos en tejido renal

Genotipo: alog10 de UFC/g de tejido bSignificancia (valor p) cReducción (log10 de UFC/g) dAbscesos superficiales (%) eNúmero de abscesos por riñón fSignificancia (valor p)

Tipo silvestre: 6,141 ± 0,192 70 4,364 ± 0,889

AsrtA: 4,095 ± 0,347 6,4 x 10'6 2,046 0 0,000 ± 0,000 0,0216

spa: 5,137 ± 0,347 0,0144 1,004 13 0,375 ± 0,374 0,0356

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Carga estafilocócica en tejido renal

Genotipo

logio de UFC/g de tejido

Significancia (valor p)

Reducción (log10 de UFC/g)

Formación de ^ abscesos en tejido renal

Abscesos

superficiales

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Número de abscesos por riñón

Significancia (valor p)

Medias de la carga estafilocócica calculada como el logi0 de UFC/g en tejidos renales homogenizados 5 días después de la infección en cohortes de quince ratones BALB/c por cepa de exposición. Se indica el error típico de las medias (±ETM).

bLa significación estadística se calculó con la prueba t de Student y se registraron los valores de p; los valores de p < 0,05 se consideraron significativos.

cReducción en la carga bacteriana calculada como log10 de UFC/g.

dLa formación de abscesos en tejidos renales cinco días después de la infección es midió mediante inspección macroscópica (% positivo).

eHistopatología de secciones delgadas de riñón teñidas con hematoxilina-eosina de ocho a diez animales; se registró el número medio de abscesos por riñón y volvió a promediar para la obtención de la media final (±ETM). fLa significación estadística se calculó con la prueba t de Student y se registraron los valores de p; los valores de p < 0,05 se consideraron significativos.____________________________________________________________

Los mutantes de la proteína A (spa) de S. aureus son avirulentos y no pueden formar abscesos. La Sortasa A es una transpeptidasa que inmoviliza diecinueve proteínas de superficie en la envoltura de la cepa Newman de S aureus (Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). Las obras anteriores han identificado a la sortasa A como un factor de virulencia en múltiples sistemas de modelos de animales, sin embargo, las contribuciones de esta enzima y sus proteínas de superficie ancladas para la formación o persistencia de abscesos todavía no se han desvelado (Jonsson et al., 2002; Weiss et al., 2004). En comparación con la cepa parental de tipo silvestre (Baba et al., 2007), una variante isogénica srtA (AsrtA) no formó lesiones de abscesos ni en el examen macroscópico ni en la histopatología en los días 2, 5 o 15. En los ratones infectados con el mutante de strA, solo se recuperaron 1 x 104 UFC/g del tejido renal en el día 5 de la infección que es una reducción de 2,046 log10 de UFC/g en comparación con la cepa parental de tipo silvestre (p = 6,73 x 10"6). Se observó un defecto similar para el mutante de srtA de la cepa USA300 de MRSA (datos no mostrados). El microscopio de barrido electrónico mostró que los mutantes de srtA se encontraban muy dispersados y a menudo asociados con leucocitos en tejido renal saludable. El día quince después de la infección, los mutantes de srtA se eliminaron de los tejidos renales, una reducción > 3,5 log 10 UFC/g en comparación con el tipo silvestre (Tabla 3). Por lo tanto, las proteínas de superficie ancladas por la sortasa A permiten la formación de lesiones de abscesos y la persistencia de bacterias en los tejidos del hospedador, en los que los estafilococos se reproducen como comunidades embebidas en una matriz extracelular y protegidos de los leucocitos por una pseudocápsula amorfa.

La sortasa A ancla un gran espectro de proteínas con señales de clasificación del motivo LPXTG a la envoltura de la pared celular, proporcionando así a la superficie de presentación de muchos factores de virulencia (Mazmanian et al., 2002). Para identificar las proteínas de superficie necesarias para la formación de abscesos estafilocócicos, se introdujeron inserciones de bursa aurealis en secuencias de codificación 5' de genes que codifican polipéptidos con proteínas del motivo LPXTG (Bae et al., 2004) y estas mutaciones se transdujeron en S. aureus Newman. Las mutaciones en el gen estructural para la proteína A (spa) redujo la carga estafilocócica en tejidos de riñón de ratón infectados en un valor 1,004 log10 (p = 0,0144). Cuando se analizaron para determinar su capacidad para formar abscesos en tejidos renales mediante histopatología, se observó que los mutantes de spa no fueron capaces de formar abscesos en comparación con la cepa parental de tipo silvestre de S. aureus Newman (4,364 ± 0,889 abscesos de S. aureus Newman por riñón frente a la mutante de spa isogénica con 0,375 ± 0,374 lesiones; p = 0,0356).

La proteína A bloquea las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Algunos estudios han identificado la proteína A como un factor de virulencia de vital importancia durante la patogénesis de las infecciones por S. auneus. Las obras anteriores demostraron que la proteína A impide la fagocitosis de los estafilococos uniendo el componente Fc de la inmunoglobulina (Jensen 1958; Uhlén et al., 1984), activa la agregación de plaquetas a través del factor de Von WIllebrand (Hartleib et al., 2000), funciona como un superantígeno de linfocitos B capturando la región F(ab)2 de IgM portadora de VH3 (Roben et al., 1995) y, a través de su activación del TNFR1, puede iniciar la neumonía estafilocócica (Gomez et al., 2004). Debido al hecho de que la proteína A captura la inmunoglobulina y muestra atributos tóxicos, no se ha seguido de manera rigurosa la posibilidad de que esta molécula de superficie pueda funcionar como una vacuna en los seres humanos. Los inventores demuestran por primera vez que las variantes de la proteína A que ya no son capaces de unirse a las inmunoglobulinas, vWF y TNFR-1, se eliminan de su potencial toxigénico y son capaces de estimular respuestas inmunes humorales que protegen contra enfermedades estafilocócicas.

Base molecular de la función y presentación en la superficie de la proteína A. La proteína A se sintetiza como precursor en el citoplasma bacteriano y se secreta a través de su péptido señal YSIRK en su pared transversal, es decir, el septo de división celular de los estafilococos (FIG. 1) (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008). Tras la escisión de la señal de clasificación LPXTG C-terminal, la proteína A se ancla a puentes transversales del péptidoglicano bacteriano mediante la sortasa A (Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). La proteína A es la proteína de superficie más abundante de los estafilococos; la molécula es expresada

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por casi todas las cepas de S. aureus (Saíd-Salim et al., 2003; Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008). Los estafilococos giran en torno al 15-20 % de su pared celular por ciclo de división (Navarre y Schneewind, 1999). Las hidrolasas murinas escincen las cadenas de glicano y los péptidos de la pared del péptidoglicano, liberando de este modo la proteína A con su tetrapéptido disacárido de la pared celular C-terminal hacia el medio extracelular (Ton- That et al., 1999). Por tanto, mediante su diseño fisiológico, la proteína A tanto se ancla a la pared celular como se muestra sobre la superficie bacteriana, pero también se libera hacia los tejidos circundantes durante la infección del hospedador (Marraffini et al., 2006).

La proteína A captura inmunoglobulinas en la superficie bacteriana y esta actividad bioquímica permite el escape estafilocócico de las respuestas inmunes innatas y adquiridas del huésped (Jensen 1958; Goodyear y Silverman 2004). Lo interesante es que la región X de la proteína A (Guss et al., 1984), un dominio de repetición que une los dominios de unión a IgG a la señal de clasificación LPXTG/anclaje a la pared celular, es quizás la parte más variable del genoma estafilocócico (Schneewind et al., 1992; Saíd-Salim et al., 2003). Cada uno de los cinco dominios de unión a la inmunoglobulina de la proteína A (SpA), formados a partir de haces de tres hélices y denominados E, D, A, B y C, ejerce propiedades funcionales y estructurales similares (Sjodahl 1977; Jansson et al., 1998). La estructura cristalina y en solución del dominio D se ha resuelto con y sin los ligandos Fc y VH3 (Fab), que se unen a la proteína A de una forma no competitiva en distintos sitios (Graille et al., 2000).

En el complejo de estructura cristalina, Fab interactúa con la hélice II y la hélice III del dominio D a través de una superficie compuesta de cuatro cadenas p de la región VH (Graille et al., 2000). El eje principal de la hélice II del dominio D es de aproximadamente 50° con respecto a la orientación de las cadenas, y la parte interhelicoidal del dominio D es la más próxima a la cadena C0. El sitio de interacción en Fab se encuentra apartado de la región constante de la cadena pesada y la cadena ligera de la Ig. La interacción implica los siguientes restos del dominio D: Asp-36 de la hélice II, así como Asp-37 y Gln-40 en el bucle entre la hélice II y la hélice III, además de otros restos diversos con SpA-D (Graille et al., 2000). Ambas superficies de interacción se componen predominantemente de cadenas laterales polares, con tres restos de carga negativa en el dominio D y dos restos de carga positiva en Fab 2A2 enterrado por la interacción, lo que proporciona una atracción electroestática global entre las dos moléculas. De las cinco interacciones polares identificadas entre Fab y el dominio D, tres son entre las cadenas laterales. Se forma un puente de sal entre Arg-H19 y Asp-36, y se realizan dos enlaces de hidrógeno entre Tyr-H59 y Asp-37, y entre Asn-H82a y Ser-33. Debido a la conservación de Asp-36 y Asp-37 en los cinco dominios de unión a IgG de la proteína A, estos residuos se seleccionaron para la mutagénesis.

Los sitios SpA-D responsables de la unión a Fab se encuentran estructuralmente separados de la superficie del dominio que media en la unión a Fcy. La interacción de Fcy con el dominio B implica principalmente a los restos en la hélice I, con una menor implicación de la hélice II (Deisenhofer 1981; Gouda et al., 1992). A excepción de Gln-32, un contacto de poca importancia en ambos complejos, ninguno de los restos que median en la interacción de Fcy participa en la unión a Fab. Para examinar la relación espacial entre estos diferentes sitios de unión a Ig, se han superpuesto los dominios de SpA en estos complejos para construir un modelo de un complejo entre Fab, el dominio D de SpA y la molécula Fcy. En este modelo ternario, Fab y Fcy forman una estructura de tipo sándwich en torno a las caras opuestas de la hélice II sin evidencia de impedimento estérico de ninguna de las interacciones. Dichos hallazgos ilustran cómo, a pesar de su pequeño tamaño (es decir, 56-61 aa), un dominio de SpA puede mostrar simultáneamente ambas actividades, lo que explica la evidencia experimental de que las interacciones de Fab con un dominio individual son no-competitivas. Los restos para la interacción entre SpA-D y Fcy son Gln-9 y Gln-10.

Por el contrario, la ocupación de la parte Fc de IgG en el dominio D bloquea su interacción con el vWF A1 y probablemente también el TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006). Las mutaciones en los restos esenciales para la unión a Fc de IgG (F5, Q9, Q10, S11, f13, Y14, L17, N28, I31 y K35) también se requieren para la unión a vWF A1 y a TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gómez et al., 2006; O'Seaghdha et al. 2006), mientras que los restos fundamentales para la interacción con Vh3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) no tienen impacto alguno en las actividades de unión de Fc, vWF A1 o TNFR1 de la IgG (jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). La actividad de unión a Fab de la inmunoglobulina de la proteína A se dirige a un subconjunto de linfocitos B que expresan IgM relacionada con la familia VH3 en su superficie, es decir, estas moléculas funcionan como receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Tras la interacción con SpA, estos linfocitos B proliferan rápidamente y, a continuación, se destinan a la apóptosis, lo que conduce a una eliminación preferencial y prolongada de los linfocitos B de tipo innato (es decir, linfocitos B de la zona marginal y linfocitos B2 foliculares) (Goodyear y Silverman, 2003; Goodyear y Silverman, 2004). Es importante señalar que más del 40 % de los linfocitos B circulantes son la diana de la interacción de la proteína A, y la familia VH3 representa la mayor familia de receptores de linfocitos B humanos que confieren respuestas humorales protectoras contra los patógenos (Goodyear y Silverman 2003; Goodyear y Silverman 2004). Por lo tanto, la proteína A funciona de forma análoga hacia los superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), a pesar de que esta última clase de moléculas, por ejemplo, SEB, TSST-1, TSST-2, forman complejos con el receptor de linfocitos T para estimular inadecuadamente las respuestas inmunes del hospedador, generando, de ese modo, rasgos de enfermedad característicos de las infecciones estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Dichos hallazgos en conjunto documentan las contribuciones de la proteína A en cuanto al establecimiento de infecciones estafilocócicas y en la modulación de las respuestas inmunes del hospedador.

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Variante no toxigénica de la Proteína A. Los inventores han desarrollado una variante no toxigénica de la proteína A estafilocócica y, con este reactivo en mano, se pusieron como objetivo por primera vez a medir la respuesta inmune de animales a la inmunización de la proteína A. Además, los inventores abordaron la cuestión de si la inmunización de animales con una variante no toxigénica de la proteína A podría generar respuestas inmunes que elevaran la inmunidad protectora contra la infección estafilocócica.

Para alterar las actividades de unión de Fc, vWF A1 y TNFR1 a la IgG de la proteína A, se modificaron los restos 9 y 10 de la glutamina (Q) [la numeración en el presente documento se obtiene a partir de la establecida para el dominio D de SpA] generando sustituciones de lisina o glicina para ambas glutaminas esperando que estas sustituciones suprimieran los enlaces de iones formados entre la proteína A de tipo silvestre y sus ligandos. El efecto añadido de las dobles sustituciones de lisina puede ser que estos restos con carga positiva instituyen una carga repelente para las inmunoglobulinas. Para alterar la unión de Fab VH3 a la IgM, los inventores seleccionaros los restos de aspartato (D) 36 y 37 de SpA-D, cada uno de los cuales se requiere para la asociación de la proteína A con el receptor de linfocitos B. Ambos D36 y D37 se sustituyeron con alanina. Las mutaciones Q9,10K y D36,37A se combinaron en la molécula recombinante SpA-DQ9,10K;D36,37A y se examinaron para determinar las propiedades de unión de la proteína A. ' ' '

En resumen, la secuencia genómica de la proteína A (spa) de Staphylococcus aureus N315 se amplificó mediante PCR con los cebadores (GCTGCACATATGGCGCAACACGATGAAGCTCAAC [cebador 5'](SEQ ID NO: 35) y AGTGGATCCTTATGCTTTGTTAGCATCTGC [cebador 3'] (SEQ ID NO: 36)), clonados en el vector pET15b (pYSJ1, codones 48-486) (Stranger-Jones, et al., 2006), y el plásmido recombinante se transformó en E. coli BL21(DE3) (Studier et al., 1990). El producto de la proteína A obtenido de pYSJ1 alberga los restos 36-265 de SpA fusionados al marcador His N-terminal (MGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ LID NO: 37)). Después de la expresión inducible por IPTG, se purificó la SpA marcada con His6 N-terminal recombinante por cromatografía de afinidad sobre resina de Ni-NTA (Stranger-Jones et al., 2006). El dominio D de SpA (SpA-D) se amplificó por PCR con un par de cebadores específicos (AACATATGtTcAACAAAGATCAACAAAGC [cebador 5'](SEQ ID NO: 38) y AAGGATCCAGATTCGTTTAATTTTTTAGC [cebador 3'] (SEQ ID NO: 39)), subclonados en el vector pET15b (pHAN1, codones 212-261 de spa), y el plásmido recombinante se transformó en E. coli BL21(DE3) para expresar y purificar la proteína marcada con His6 N-terminal recombinante. Para generar mutaciones en la secuencia de codificación de SpA-D, se sintetizaron conjuntos de dos pares de cebadores (para las sustituciones de D a A: CTT CATT CAAAGTCTT AAAGCCGCCCCAAGCCAAAGCACT AAC [cebador 5'] (SEQ ID NO: 40) y

GTTAGTGCTTTGGCTTGGGGCGGCTTTAAGACTTTGAATGAAG [cebador 3'] (SEQ ID NO: 41); para las

sustituciones de Q a K CATATGTTCAACAAAGATAAAAAAAGCGCCTTCTATGAAATC [cebador 5'] (SEQ ID NO: 42) y GATTTCATAGAAGGCGCTTTTTTTATCTTTGTTGAACATATG [cebador 3'] (SEQ ID NO: 43); para las sustituciones de Q a G CATAT GTT CAACAAAGAT GGAGGAAGCGCCTT CTAT GAAAT C [cebador 5'] (SEQ ID NO: 44) y GATTTCATAGAAGGCGCTTCCTCCATCTTTGTTGAACATATG' [cebador 3'] (SEQ ID NO: 45). Los cebadores se usaron para protocolos de mutagénesis de cambios rápidos. A continuación de la mutagénesis, se confirmaron las secuencias de ADN para cada una de las proteínas recombinantes: SpA, SpA-D y SpA-DQ9,10G;D36,37A y SpA- Dq9,10K;D36,37a. Todas las proteínas se purificaron a partir de lisados de E. coli recombinante usando cromatografía con Ni-NTA, y posteriormente se sometieron a diálisis contra PBS y se almacenaron a 4 °C.

Para medir la unión de la inmunoglobulina a la proteína A y a sus variantes, se diluyeron 200 pg de proteína purificada en un volumen de 1 ml usando un tampón de columna (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) y, a continuación, se cargó en una columna de Ni-NTA pre-equilibrada (1 ml de volumen del lecho). Las columnas se lavaron con 10 ml de tampón de columna. Se diluyeron 20o pg de IgG humana en un volumen total de tampón de columna de 1 ml y, a continuación, se aplicó a cada una de las columnas cargadas con proteína A y sus variantes. Las columnas se lavaron posteriormente con 5 ml de tampón de lavado (imidazol 10 mM en tampón de columna) y 5 ml de tampón de columna. Las muestras de proteínas se eluyeron con 2 ml de tampón de elución (imidazol 500 mM en tampón de columna), se recogieron las fracciones y los alícuotas se sometieron a electroforesis en gel SDS- PAGE, seguido de tinción con azul Coomassie. Como se muestra en la Figura 3, la proteína A de tipo silvestre (SpA) y su dominio D de SpA ambos mantuvieron la inmunoglobulina durante la cromatografía. Por el contrario, la variante de S pA-D Q9,10K; d36,37a no se unió a la inmunoglobulina.

Para cuantificar la unión de la proteína A y sus variantes a la parte Fc de la inmunoglobulina y el dominio VH3 de Fab, se usó inmunoglobulina G humana conjugada con HRP [hIgG], la parte Fc de la IgG humana [hFc] y la parte F(ab)2 de la IgG humana [hF(ab)2] además de ensayos ELISA para cuantificar la cantidad relativa de unión a la proteína A y sus variantes. Los datos de la Figura 4 demuestran la unión de SpA y SpA-D a hIgG y hFc, mientras que SpA-DQ9,10G;D36,37A y SpA-D q9,10K;D36,37a mostraron únicamente actividades de unión secundarias. La SpA unió cantidades similares de hFc y hF(ab)2, sin embargo la unión de SpA-D a hF(ab)2 fue reducida en comparación con la SpA de longitud completa. Este resultado sugiere que la presencia de múltiples dominios de unión a IgG puede aumentar de forma cooperativa la capacidad de la proteína A para unirse al receptor de linfocitos B. En comparación con el reducido poder de unión de SpA-D por hF(ab)2, de las dos variantes solo SpA-DQ9,10K;D36,37A mostró una reducción significativa en la capacidad para unirse al dominio VH3 de la inmunoglobulina. Para examinar los atributos toxigénicos de SpA-D y sus variantes, se inyectaron proteínas purificadas en ratones, que fueron sacrificados después de 4 horas para extraerles el bazo. Se homogenizó tejido de los órganos, se eliminó material capsular y se colorearon linfocitos B con anticuerpos CD19 fluorescentes. Tras el análisis de FACS para cuantificar

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la abundancia de linfocitos B en tejido esplénico, se observó que la SpA causa una caída del 5 % en el recuento de linfocitos B en comparación con un control de simulación (PBS) (FIG. 5). Por el contrario, SpADQ9,10K; d36,37a no causó ninguna reducción en los recuentos de linfocitos B, lo que indica que la molécula mutante había perdido sus atributos toxigénicos de estimulación de la proliferación y muerte de los linfocitos B (Figura 5). En resumen, las sustituciones de aminoácidos en los restos Q9, Q10, D36 y D37 de SpA-D suprimieron la capacidad de los dominios de la proteína A para unirse a las inmunoglobulinas o ejercer funciones toxigénicas en tejidos humanos o animales.

Las variantes de la proteína A no toxigénicas generan la protección de la vacuna. Para ensayar si la proteína A y sus variantes pueden funcionar como antígenos de vacuna, se emulsionaron SpA, SpA-D, SpA-DQ9,10K;D36,37A y SpA-DQ9,10G;D36,37A con adyuvante de Freund completo o incompleto, y se inmunizaron ratones BALB/c de 4 semanas el día 1 y el día 11 con 50 pg de proteína purificada. Se analizaron cohortes de animales (n = 5) para determinar las respuestas inmunes humorales a la inmunización mediante sangrado de los animales antes (día 0) y después del programa de inmunización (día 21). La Tabla 5 indica que los ratones inmunizados generaron una modesta respuesta inmune humoral dirigida a la proteína A o a su módulo SpA-D, mientras que la cantidad de anticuerpo generado después de la inmunización con SpA-DQ9,10K;D36,37A o SpA-DQ9,10G;D36,37A aumentó de cuatro a cinco veces. Después de la exposición intravenosa con 1 x 107 UFC de S. aureus Newman, los animales se sacrificaron el día 4, se extrajeron los riñones y bien se analizaron para determinar la carga estafilocócica (sembrando tejido homogenizado sobre placas de agar y enumerando las unidades formadoras de colonia, UFC) o realizando histopatología. Como era esperaba, los ratones inmunizados de forma simulada (PBS) (n = 19) portaban 6,46 log10 (± 0,25) UFC en el tejido renal, y las lesiones infecciosas se organizaron en 3,7 (± 1,2) abscesos por órgano (n = 10) (Tabla 5). La inmunización de los animales con SpA condujo a una reducción de 2,51 log10 uFc en el día 5 (p = 0,0003) con 2,1 (± 1,2) abscesos por órgano. Los últimos datos indican que no hubo una reducción significativa en la formación de abscesos (p = 0,35). La inmunización con SpA-D generó resultados similares: una reducción de 2,03 log10 UFC en el día 5 (p = 0,0001) con 1,5 (± 0,8) abscesos por órgano (p = 0,15). Por el contrario, la inmunización con SpA-DQ9,10K;D36,37A o SpA-DQ9,10G;d36,37a creó un aumento de la protección, con una reducción de 3,07 log 10 y 3,03 log10 UFC en el día 4, respectivamente (significancia estadística p < 0,0001 para ambas observaciones). Además, la inmunización tanto con SpA-DQ9,10K;D36,37A como con SpA-DQ9,10G;D36,37A generó una protección significativa de la formación de abscesos estafilocócicos, ya que solamente se identificaron 0,5 (± 0,4) y 0,8 (± 0,5) lesiones infecciosas por órgano (p = 0,02 y p = 0,04). Por lo tanto, la inmunización con variantes de proteína A no toxigénicas genera un aumento de las respuestas inmunes humorales para la proteína A y proporciona inmunidad protectora contra la exposición estafilocócica. Estos datos indican que la proteína A es un candidato ideal para una vacuna humana que prevenga una enfermedad por S. aureus.

Estos emocionantes resultados tienen varias implicaciones para el diseño de una vacuna humana. En primer lugar, la generación de mutaciones por sustitución que afectan a la capacidad de los dominios de unión a inmunoglobulina de la proteína A, ya sea sola o en combinación con dos o más dominios, puede generar variantes no toxigénicas adecuadas para el desarrollo de una vacuna. Parece probable que una combinación de dominios de unión a IgG mutantes que se asemeje mucho a la estructura de la proteína A, pueda generar incluso mejores respuestas humorales, como se describe en el presente documento, para el dominio D de SpA solo. Además, un atributo probable de los anticuerpos específicos de la proteína A puede ser que la interacción de los sitios de unión del antígeno con la superficie microbiana puede neutralizar la capacidad de los estafilococos de capturar inmunoglobulinas a través de la parte Fc, o de estimular el receptor de linfocitos B a través de las actividades de unión de VH3.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1. Un polipéptido inmunogénico aislado que comprende un dominio D de variante de la proteína A (SpA) que tiene

(a) dos sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a Fc; y (b) dos sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a VH3; en el que para (a) la variante de SpA comprende una sustitución del resto de glicina en cada posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácidos 9 y 10 de SEQ ID NO: 2; y para (b) la variante de SpA comprende una sustitución del resto de serina en cada posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácido 36 y 37 de SEQ ID NO: 2.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende además:

(i) una o más variantes de un dominio E, dominio A, dominio B o dominio C de SpA;

(ii) dos o más segmentos de dominio D; o

(iii) un segmento no de proteína A, preferentemente, un segundo segmento de antígeno;

en el que el segundo segmento de antígeno es opcionalmente un segmento de antígeno estafilocócico, preferentemente, un segmento de Emp, EsxA, EsxB, EsaC, Eap, Ebh, EsaB, Coa, vWbp, vWh, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, IsdC, ClfA, ClfB y/o SasF.
3. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de la reivindicación 1 o 2 en una composición farmacéuticamente aceptable.
4. La composición de la reivindicación 3, que comprende además:

(a) al menos un segundo antígeno estafilocócico, preferentemente, en el que el segundo antígeno se selecciona entre un péptido EsaB, Emp, EsxA, EsxB, EsaC, Eap, Ebh, Coa, vWbp, vWh, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, IsdC, ClfA, ClfB y/o SasF; o

(b) un adyuvante, preferentemente, en el que la variante de SpA está acoplada a un adyuvante.
5. La composición de la reivindicación 3 o 4, que comprende además un polisacárido u oligosacárido PIA; o un polisacárido u oligosacárido capsular de tipo V y/o de tipo VIII de S. aureus.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la que el polisacárido capsular estafilocócico está conjugado con un vehículo proteico, preferentemente, en el que el vehículo proteico se selecciona del grupo que consiste en toxoide tetánico, toxoide diftérico, CRM 197, proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina y toxoide alfa.
7. Una vacuna que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 o 2, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 o 2.
9. Un método de fabricación de una vacuna que comprende las etapas de mezclar antígenos para preparar la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 y añadir un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición para su uso en la generación de una respuesta inmune contra una bacteria estafilocócica en un sujeto que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
11. La composición para el uso de la reivindicación 10:

(a) en la que al sujeto también se administra un adyuvante;

(b) en la que la bacteria estafilocócica es una bacteria de S. aureus.

(c) en la que la bacteria estafilocócica es resistente a uno o más tratamientos, preferentemente, en la que la bacteria estafilocócica es resistente a la meticilina;

(d) en la que la composición se administra más de una vez al sujeto;

(e) en la que la composición se administra por vía oral, parenteral, subcutánea, intramuscular o intravenosa;

(f) en la que la composición comprende una bacteria no estafilocócica recombinante que expresa la variante de SpA, preferentemente en la que la bacteria no estafilocócica recombinante es una Salmonella;

(g) en la que el sujeto es un mamífero, preferentemente, un ser humano;

(h) en la que la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora; o

(i) en la que el sujeto ha desarrollado, es sospechoso de haber desarrollado o está en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica; preferentemente en la que el sujeto es diagnosticado de una infección estafilocócica persistente.

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