ES2676146T3

ES2676146T3 - Composiciones de ARNi de Serpina1 y métodos de uso de las mismas

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Publication number: ES2676146T3
Application number: ES14730051.1T
Authority: ES
Inventors: Alfica Sehgal; Klaus CHARISSE; Brian Bettencourt; Martin Maier; Kallanthottathil G. Rajeev; Gregory Hinkle; Muthiah Manoharan
Original assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2014-05-22
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2034-05-22
Also published as: AU2014268509A1; PE20160030A1; KR102295648B1; SG10201804472YA; GT201500330A; TW201936624A; US10920223B2; CN105408481B; US20210317452A1; US9574192B2; EA201592223A1; KR20220154244A; CN105408481A; US20180346910A1; NZ753769A; DK2999785T3; PL2999785T3; EP3412774A1; HK1221979A1; RU2015154721A

Abstract

Un agente de iARN bicatenario para inhibir la expresión de Serpina1 en una célula, en el que dicho agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante y una hebra no codificante que forman una región bicatenaria, en el que dicha hebra codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, o SEQ ID NO: 11, y dicha hebra no codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 25, en el que sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que dicha hebra codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5', en el que sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra no codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que dicha hebra no codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5' y dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 3', en el que dicha hebra codificante está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector bivalente o trivalente ramificado en el extremo 3', en el que "sustancialmente todos" de los nucleótidos que están modificados significa que no más de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos están sin modificar.

Description

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cada np, nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;

p, q y q' son cada uno independientemente 0-6;

np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante un enlace fosforotioato;

5 cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;

YYY e Y'Y'Y' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en los que las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor;

10 en los que la hebra codificante comprende al menos un enlace fosforotioato; y

en los que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando, en la que el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.

En una implementación, Na' comprende 1-25 nucleótidos, y en la que uno de las 1-25 nucleótidos en una de las posiciones 2-9 del extremo 5' es un desapareamiento de nucleótido. En una realización, la base desapareada es una

15 base universal.

La presente divulgación también proporciona células, vectores, células huésped y composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes de iARN bicatenario de la invención.

La presente divulgación proporciona agente de iARN seleccionado del grupo de agentes de iARN enumerado en una cualquiera de las Tablas 1, 2, 5, 7, 8 y 9.

20 La presente divulgación también proporciona una composición que comprende un agente antisentido de polinucleótido modificado. El agente es capaz de inhibir la expresión de Serpina1 en una célula, y comprende una secuencia complementaria a una secuencia sentido seleccionada del grupo de las secuencias enumeradas en una cualquiera de las Tablas 1, 2, 5, 7, 8 y 9, en la que el polinucleótido tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.

25 En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula in vitro que contiene el agente de iARN bicatenario de la invención.

En algunas implementaciones, el agente de iARN se administra usando una composición farmacéutica.

En implementaciones preferidas, el agente de iARN se administra en una disolución. En algunas de tales implementaciones, el ARNip se administra en una disolución no tamponada. En una implementación, el ARNip se

30 administra en agua. En otras implementaciones, el ARNip se administra con una disolución de tampón, tal como un tampón acetato, un tampón citrato, un tampón prolamina, un tampón carbonato, o un tampón fosfato o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la disolución de tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS).

En una implementación, las composiciones farmacéuticas comprenden además una formulación de lípido. En un

35 aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para inhibir la expresión de Serpina1 en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, composición, vector, o una composición farmacéutica de la invención; y mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen Serpina1, inhibiendo así la expresión del gen Serpina1 en la célula.

40 En una implementación, la célula está dentro de un sujeto.

En una implementación, el sujeto es un ser humano.

En una implementación, la expresión de Serpina1 se inhibe al menos aproximadamente el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%o 95%.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad

45 asociada a Serpina1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, composición, vector, o una composición farmacéutica de la invención, tratándose así el sujeto.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado a Serpina1. Los métodos incluyen administrar por vía subcutánea al sujeto una cantidad terapéuticamente 50 eficaz de un agente de iARN bicatenario, en el que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante

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y una hebra no codificante que forman una región bicatenaria, en el que la hebra codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, o SEQ ID NO: 11, y la hebra no codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 25, en el que sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra no codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que la hebra no codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5' y dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 3', en el que sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que la hebra codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5' y, en el que la hebra codificante está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector bivalente o trivalente ramificado en el extremo 3', tratándose así el sujeto.

En una implementación, una de las 3 diferencias de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la hebra no codificante es un desapareamiento de nucleótido en la región semilla de la hebra no codificante. En una implementación, la hebra no codificante comprende una base universal en el nucleótido desapareado.

En una implementación, todos los nucleótidos de la hebra codificante y todos los nucleótidos de la hebra no codificante comprenden una modificación.

En una implementación, la enfermedad asociada a Serpina1 es un trastorno del hígado, por ejemplo, enfermedad hepática crónica, inflamación del hígado, cirrosis, fibrosis hepática y/o carcinoma hepatocelular

En una implementación, la administración del agente de iARN al sujeto produce una disminución en la cirrosis hepática, fibrosis y/o acumulación de proteína Serpina1 en el hígado. En otra realización, la administración del agente de iARN al sujeto produce, por ejemplo, produce además, una disminución en la inflamación pulmonar.

En una implementación, el sujeto es un ser humano.

En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.

En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra vía subcutánea o por vía intravenosa.

En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de inhibición del desarrollo de carcinoma hepatocelular en un sujeto que tiene una variante de deficiencia de Serpina1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, composición, vector o una composición farmacéutica de la invención, inhibiéndose así el desarrollo de carcinoma hepatocelular en el sujeto.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de inhibición del desarrollo de carcinoma hepatocelular en un sujeto que tiene una variante de deficiencia de Serpina1. Los métodos incluyen administrar por vía subcutánea al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de iARN bicatenario, en el que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante y una hebra no codificante que forman una región bicatenaria, en el que la hebra codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, o SEQ ID NO: 11, y la hebra no codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 25, en el que sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra no codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que la hebra no codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5' y dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 3', en el que sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que la hebra codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5' y, en el que la hebra codificante está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector bivalente o trivalente ramificado en el

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extremo 3', inhibiéndose así el desarrollo de carcinoma hepatocelular en el sujeto que tiene una variante de deficiencia de Serpina1.

En una implementación, el sujeto es un primate o roedor. En otra implementación, el sujeto es un ser humano.

En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. En otra implementación, el agente de iARN bicatenario se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.

En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra a una dosis de aproximadamente 3 mg/kg. En otra implementación, el agente de iARN bicatenario se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg. En otra implementación más, el agente de iARN bicatenario se administra a una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg dos veces por semana. En otra implementación más, el agente de iARN bicatenario se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg cada dos semanas. En otra implementación más, el agente de iARN bicatenario se administra a una dosis de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 mg/kg una vez por semana.

En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra dos veces por semana. En otra implementación, el agente de iARN se administra cada dos semanas.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de reducción de la acumulación de Serpina1 erróneamente plegada en el hígado de un sujeto que tiene una variante de deficiencia de Serpina1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, composición, vector, o una composición farmacéutica de la invención, reduciéndose así la acumulación de Serpina1 erróneamente plegada en el hígado del sujeto.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de reducción de la acumulación de Serpina1 erróneamente plegada en el hígado de un sujeto que tiene una variante de deficiencia de Serpina1. Los métodos incluyen administrar por vía subcutánea al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de iARN bicatenario, en el que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante y una hebra no codificante que forman una región bicatenaria, en el que la hebra codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQIDNO:2, o SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:6, SEQIDNO:7, SEQIDNO:8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, o SEQ ID NO: 11, y la hebra no codificante comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 25, en el que sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra no codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que la hebra no codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5' y dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 3', en el que sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra codificante comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-flúor, en el que la hebra codificante comprende dos enlaces internucleotídicos fosforotioato en el extremo 5' y, en el que la hebra codificante está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector bivalente o trivalente ramificado en el extremo 3', reduciéndose así la acumulación de Serpina1 erróneamente plegada en el hígado del sujeto que tiene una variante de deficiencia de Serpina1.

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En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra por vía subcutánea o por vía intravenosa.

La Figura 1 es un gráfico que representa la eficacia in vivo y duración de la respuesta para los ARNip indicados en ratones transgénicos que expresan la forma Z-AAT de AAT humana.

Las Figuras 2A-2B representan la eficacia in vivo de cinco ARNip con valores de CI50 bajos. Se inyectaron ratones transgénicos que expresan el alelo Z-AAT humana con 10 mg/kg de dúplex de ARNip en el día 0 y se siguió AAT humana en suero durante 21 días después de la dosis (Figura 2A). Cada punto representa un promedio de tres ratones y las barras de error reflejan la desviación estándar. La Figura 2B representa niveles de ARNm de hAAT en hígado normalizados a GAPDH para cada grupo. Las barras reflejan el promedio y las barras de error reflejan la desviación estándar.

Las Figuras 3A-3C representan la supresión de AAT duradera de una manera sensible a la dosis. La Figura 3A representa específicamente la curva de eficacia que muestra la inactivación máxima de niveles de proteína hAAT en suero alcanzados a diferentes dosis de AD-59054 administrado por vía subcutánea a ratones transgénicos. Cada punto es un promedio de tres animales y las barras de error representan la desviación estándar. La duración de la inactivación después de una dosis única de ARNip de AAT a 0,3, 1, 3 o 10 mg/kg se muestra en la Figura 3B. Los niveles de hAAT se normalizaron al promedio de tres sangrados previos para cada animal. El grupo de PBS sirve de control para reflejar la variabilidad en los niveles de hAAT en suero. Cada punto de datos es un promedio de tres animales y las barras de error reflejan la desviación estándar. En la Figura 3C, los animales se administraron con AD-59054 a una dosis de 0,5 mg/kg dos veces a la semana. Cada punto de datos es un promedio con respecto a hAAT de suero de cuatro animales y las barras de error reflejan la desviación estándar.

Las Figuras 4A-4D representan la disminución de la incidencia de tumor con reducción en Z-AAT. La Figura 4A representa el diseño del estudio por el cual ratones envejecidos con hígados fibróticos se administraron por vía subcutánea una vez cada dos semanas (Q2W) con PBS o 10 mg/kg de dúplex de ARNip AD58681 durante 11 dosis y se sacrificaron 7 días después de la última dosis. La Figura 4B muestra los niveles de ARNm de hAAT en hígado en grupos de control y tratados. La Figura 4C muestra los niveles en hígado de ARNm de Col1a2 en grupos de control y tratados. La Figura 4D representa los niveles en hígado de ARNm de PtPrc en grupos de control y tratados.

Las Figuras 5A-5C representan la disminución de la incidencia de tumor con reducción en Z-AAT. Se recogieron muestras de suero de ratones tratados según el diseño del estudio de la Figura 4A para monitorizar el grado de supresión de hAAT. La Figura 5A representa niveles de proteína hAAT en suero después de la primera dosis. La Figura 5B y Figura 5C representan tinción con PAS de secciones de hígado de dos compañeros de camada tratados con ya sea PBS o ARNip de AAT. Los puntos de color más oscuro representan los glóbulos o agregados de Z-AAT.

La Figura 6 representa la eficacia in vivo de los compuestos indicados.

Las Figuras 7A y 7B son gráficos que representa la duración de la inactivación de AAT en primates no humanos después de una dosis única de AD-59054, AD-61719, o AD-61444 a una dosis de 1 mg/kg (7A) o 3 mg/kg (7B). Cada punto de datos es un promedio de tres animales y las barras de error reflejan la desviación estándar.

La Figura 8A muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 1 (SEQ ID NO: 1); la Figura 8B muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 3 (SEQ ID NO: 2); la Figura 8C muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 2 (SEQ ID NO: 3); la Figura 8D muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 4 (SEQ ID NO: 4); la Figura 8E muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 5 (SEQ ID NO: 5); la Figura 8F muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 6 (SEQ ID NO: 6); la Figura 8G muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 7 (SEQ ID NO: 7); la Figura 8H muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 8 (SEQ ID NO: 8); la Figura 8I muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 9 (SEQ ID NO: 9); la Figura 8J muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 10 (SEQ ID NO: 10); la Figura 8K muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Homo sapiens, variante de transcrito 11 (SEQ ID NO: 11); la Figura 8L muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Macaca mulatta (SEQ ID NO: 12); la Figura 8M muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Macaca mulatta, variante de transcrito 6 (SEQ ID NO: 13); la Figura 8N muestra la secuencia de nucleótidos de Serpina1 de Macaca mulatta, variante de transcrito 4 (SEQ ID NO: 14); la Figura 8O muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 15); la Figura 8P muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 16); la Figura 8Q muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 17); la Figura 8R muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 18); la Figura 8S muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 5

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(SEQ ID NO: 19); la Figura 8T muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 20); la Figura 8U muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 7 (SEQ ID NO: 21); la Figura 8V muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 22); la Figura 8W muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 23); la Figura 8X muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 24); la Figura 8Y muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 25); la Figura 8Z muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 12 (SEQ ID NO: 26); la Figura 8AA muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 13 (SEQ ID NO: 27); y Figura 8AB muestra el complemento inverso de SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 28).

La presente divulgación proporciona composiciones que comprenden agentes, por ejemplo, oligonucleótidos monocatenarios y bicatenarios, por ejemplo, agentes de iARN, por ejemplo, agentes de ARNi bicatenario, que se dirigen a Serpina1. También se desvelan métodos de uso de las composiciones de la invención para inhibir la expresión de Serpina1 y para tratar enfermedades asociadas a Serpina1, tales como trastornos del hígado, por ejemplo, enfermedad hepática crónica, inflamación del hígado, cirrosis, fibrosis hepática y/o carcinoma hepatocelular.

I. Definiciones

Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se definen primero. Además, debe observarse que siempre que se cite un valor o intervalo de valores de un parámetro, se pretende que valores e intervalos intermedios a los valores citados también sean parte de la presente invención.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento, por ejemplo, una pluralidad de elementos.

El término "que incluye" se usa en el presente documento para significar, y se usa indistintamente con, la expresión "que incluye, pero no se limita a".

El término "o" se usa en el presente para significar, y se usa indistintamente con, el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente de otro modo.

Como se usa en el presente documento, "Serpina1" se refiere al inhibidor de serpina peptidasa, clado A, gen o proteína de miembro 1. Serpina1 también se conoce como alfa-1-antitripsina, α-1-antitripsina, AAT, inhibidor de la proteasa 1, PI, PI1, antielastasa y antitripsina.

El término Serpina1 incluye Serpina1 humana, cuya secuencia de aminoácidos y de nucleótidos puede encontrarse en, por ejemplo, N.º de acceso de GenBank GI:189163524 (SEQ ID NO: 1), GI:189163525 (SEQ ID NO: 2), GI:189163526 (SEQ ID NO: 3), GI:189163527 (SEQ ID NO: 4), GI:189163529 (SEQ ID NO: 5), GI:189163531 (SEQ ID NO: 6), GI:189163533 (SEQ ID NO: 7), GI:189163535 (SEQ ID NO: 8), GI:189163537 (SEQ ID NO: 9), GI:189163539 (SEQ ID NO: 10), y/o GI:189163541 (SEQ ID NO: 11); Serpina1 de rhesus, cuya secuencia de aminoácidos y de nucleótidos puede encontrarse en, por ejemplo, N.º de acceso de GenBank GI:402766667 (SEQ ID NO: 12), GI:297298519 (SEQ ID NO: 13) y/o GI:297298520 (SEQ ID NO: 14); Serpina1 de ratón, cuya secuencia de aminoácidos y de nucleótidos puede encontrarse en, por ejemplo, N.º de acceso de GenBank GI:357588423 y/o GI:357588426; y rata, cuya secuencia de aminoácidos y de nucleótidos puede encontrarse en, por ejemplo, N.º de acceso de GenBank GI:77020249. Ejemplos adicionales de secuencias de ARNm de Serpina1 están fácilmente disponibles usando, por ejemplo, GenBank y OMIM.

Se han identificado más de 120 alelos de Serpina1 y los alelos "M" se consideran el alelo no mutante o "normal" (por ejemplo, "PIM1-ALA213" (también conocido como PI, M1A), "PIM1-VAL213" (también conocido como PI, MIV), "PIM2", "PIM3" y PIM4"). Pueden encontrarse variantes adicionales en, por ejemplo, la base de datos A(1)ATVar (véase, por ejemplo, Zaimidou, S., et al. (2009) Hum Mutat. 230(3):308-13 y www.goldenhelix.org/A1ATVar).

Como se usa en el presente documento, el término "alelo de deficiencia de Serpina1" se refiere a un alelo de variante que produce proteínas que no se pliegan apropiadamente y pueden agregarse intracelularmente y, así, no non apropiadamente transportadas del sitio de síntesis en el hígado al sitio de acción dentro del cuerpo.

Alelos de deficiencia de Serpina1 a modo de ejemplo incluyen, el "alelo Z", el "alelo S", el "alelo PIM(Malton)" y el "alelo PIM(Procida)".

Como se usa en el presente documento, los términos "alelo Z", "PIZ" y "Z-AAT" se refieren a un alelo de variante de Serpina1 en el que el aminoácido en la posición 342 de la proteína cambia de una glutamina a una lisina como resultado del codón relevante que cambia de GAG a AAG. Un sujeto homocigótico para un alelo Z puede denominarse "PIZZ". Mutaciones Z-AAT representan el 95 % de los pacientes con deficiencia de Serpina1 y se estima que está presente en 100.000 estadounidenses y aproximadamente 3 millones de individuos en el mundo. El alelo Z alcanza frecuencias polimórficas en caucásicos y es raro o está ausente en asiáticos y negros. El fenotipo ZZ homocigótico está asociado a un alto riesgo de tanto enfisema como enfermedad hepática. La proteína Z-AAT no se pliega correctamente en el retículo endoplásmico, conduciendo a polímeros de hoja en bucle que se agregan y

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refiere a una región en la hebra no codificante que es sustancialmente complementaria a parte de una secuencia de ARNm de Serpina1. Si la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los desapareamiento son los más tolerados en las regiones terminales y, si están presentes, están generalmente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.

Como se demuestra en los ejemplos de trabajo más adelante, se ha descubierto sorprendentemente que un único desapareamiento de nucleótido en la región semilla de la hebra no codificante de los agentes de iARN desvelados en el presente documento fue tolerado por todas las bases, excepto C. La "región semilla" es la región en la hebra no codificante de un agente de iARN responsable del reconocimiento del ARNm diana y se corresponde con, por ejemplo, los nucleótidos 2-8 del extremo 5' de la hebra no codificante. Después de hibridarse la región semilla, Argonaute somete entonces secuencias de ARNm complementarias 10 nucleótidos del extremo 5' de la hebra no codificante incorporada a la degradación nucleolítica, produciendo la escisión del ARNm diana. Por consiguiente, en una realización, la hebra no codificante de un agente de iARN de la invención comprende un desapareamiento de nucleótido en la región semilla de la hebra no codificante, por ejemplo, un desapareamiento en una cualquiera de las posiciones 2-8 del extremo 5' de la hebra no codificante.

El término "hebra codificante", como se usa en el presente documento, se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra no codificante.

Como se usa en el presente documento, el término "región de escisión" se refiere a una región que se localiza inmediatamente adyacente al sitio de escisión. El sitio de escisión es el sitio sobre la diana en el que se produce la escisión. En algunas implementaciones, la región de escisión comprende tres bases en cualquier extremo de, y inmediatamente adyacentes a, el sitio de escisión. En algunas implementaciones, la región de escisión comprende dos bases en cualquier extremo de, e inmediatamente adyacentes a, el sitio de escisión. En algunas realizaciones, el sitio de escisión se produce específicamente en el sitio unido por los nucleótidos 10 y 11 de la hebra no codificante, y la región de escisión comprende nucleótidos 11, 12 y 13.

Como se usa en el presente documento, y a menos que se indique lo contrario, el término "complementaria", cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar una estructura de dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como entenderá el experto. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, pudiendo incluir las condiciones rigurosas: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50 ºC o 70 ºC durante 12-16 horas seguido de lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes como pueden encontrarse dentro de un organismo. Por ejemplo, una secuencia complementaria es suficiente para permitir que avance la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, iARN. El experto podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias según la aplicación definitiva de los nucleótidos hibridados.

Las secuencias pueden ser "completamente complementarias" entre sí cuando hay apareamiento de bases de los nucleótidos de la primera secuencia de nucleótidos con los nucleótidos de la segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de la longitud entera de la primera y segunda secuencias de nucleótidos. Sin embargo, si una primera secuencia se denomina "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 4, 3 o 2 pares de bases desapareados tras la hibridación, mientras que se retiene la capacidad para hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación definitiva. Sin embargo, si se diseñan dos oligonucleótidos para formar, tras la hibridación, uno o más nucleótidos protuberantes monocatenarios, tales nucleótidos protuberantes no deben considerarse desapareamientos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, todavía puede denominarse "completamente complementario" para los fines descritos en el presente documento.

También pueden incluir secuencias "complementarias", como se usa en el presente documento, o formarse completamente a partir de, pares de bases no de Watson-Crick y/o pares de bases formados a partir de nucleótidos no naturales y modificados, en tanto que se cumplan todos los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse. Tales pares de bases no de Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, apareamiento de bases de Wobble o Hoogstein G:U.

Los términos "complementaria", "completamente complementaria" y "sustancialmente complementaria" en el presente documento pueden usarse con respecto al apareamiento de bases entre la hebra codificante y la hebra no codificante de un ARNbc, o entre la hebra no codificante de un ARNbc y una secuencia diana, como se entenderá del contexto de su uso.

Como se usa en el presente documento, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario a al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica Serpina1) que incluye una 5' UTR, un

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Las formulaciones de LNP01 se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud internacional N.º WO 2008/042973.

Formulaciones de lípido-ARNbc a modo de ejemplo adicionales se describen en la Tabla A.

Tabla A.

Lípido ionizable/catiónico: Conjugado de lípido catiónico/lípido no catiónico/colesterol/PEG-lípido Relación de lípido:ARNip

LNP-1: 1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA) DLinDMA/DPPC/colesterol/PEG-cDMA (57,1/7,1/34,4/1,4) Lípido:ARNip ~ 7:1

2-XTC: 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DPPC/colesterol/PEG-cDMA 57,1/7,1/34,4/1,4 Lípido:ARNip ~ 7:1

LNP05: 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 Lípido:ARNip ~ 6:1

LNP06: 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 Lípido:ARNip ~ 11:1

LNP07: 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 60/7,5/31/1,5, Lípido:ARNip ~ 6:1

LNP08: 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 60/7,5/31/1,5, Lípido:ARNip ~ 11:1

LNP09: 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip 10:1

LNP10: (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aHciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100) ALN100/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip 10:1

LNP11: 4-(Dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31tetraen-19-ilo (MC3) MC-3/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip 10:1

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LNP12: 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2hidroxidodecil)amino)etil)(2hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1) Tech G1/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip 10:1

LNP13: XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip: 33:1

LNP14: MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 40/15/40/5 Lípido:ARNip: 11:1

LNP15: MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG/GalNAc-PEG-DSG 50/10/35/4,5/0,5 Lípido:ARNip: 11:1

LNP16: MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip: 7:1

LNP17: MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip: 10:1

LNP18: MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip: 12:1

LNP19: MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/35/5 Lípido:ARNip: 8:1

LNP20: MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DPG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip: 10:1

LNP21: C12-200 C12-200/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip: 7:1

LNP22: XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 Lípido:ARNip: 10:1

DSPC: diestearoilfosfatidilcolina DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina PEG-DMG: PEG-didimiristoilglicerol (C14-PEG, o PEG-C14) (PEG con peso en moles promedio de

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PEG-DSG: PEG-diestirilglicerol (C18-PEG, o PEG-C18) (PEG con peso en moles promedio de 2000)

PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG con peso en moles promedio de 2000)

LNP (1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) que comprende formulaciones descritas en la publicación internacional N.º WO2009/127060, presentada el 15 de abril de 2009.

XTC que comprende formulaciones descritas, por ejemplo, en la solicitud provisional de EE.UU. N.º de serie 61/148.366, presentada el 29 de enero de 2009; la solicitud provisional de EE.UU. N.º de serie 61/156.851, presentada el 2 de marzo de 2009; la solicitud provisional de EE.UU. N.º de serie presentada el 10 de junio 2009; la solicitud provisional de EE.UU. N.º de serie 61/228.373, presentada el 24 de julio de 2009; la solicitud provisional de EE.UU. N.º de serie 61/239.686, presentada el 3 de septiembre de 2009, y la solicitud internacional N.º PCT/US2010/022614, presentada el 29 de enero 2010.

MC3 que comprende formulaciones descritas, por ejemplo, en la publicación de EE.UU. N.º 2010/0324120, presentada el 10 de junio de 2010.

ALNY-100 que comprende formulaciones descritas, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional número PCT/US09/63933, presentada el 10 de noviembre de 2009.

C12-200 que comprende formulaciones descritas en la solicitud provisional de EE.UU. N.º de serie 61/175.770, presentada el 5 de mayo de 2009 y la solicitud internacional N.º PCT/US10/33777, presentada el 5 de mayo de 2010.

Síntesis de lípidos ionizables/catiónicos

Cualquiera de los compuestos, por ejemplo, lípidos catiónicos y similares, usados en las partículas de ácido nucleico-lípido de la invención puede prepararse por técnicas de síntesis orgánica conocidas, que incluyen los métodos descritos en más detalle en los ejemplos. Todos los sustituyentes son como se definen más adelante, a menos que se indique lo contrario.

"Alquilo" significa un hidrocarburo alifático saturado de cadena lineal o ramificado, no cíclico o cíclico, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono. Alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, nbutilo, n-pentilo, n-hexilo y similares; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo y similares. Alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares.

"Alquenilo" significa un alquilo, como se ha definido anteriormente, que contiene al menos un doble enlace entre átomos de carbono adyacentes. Alquenilos incluyen tanto isómeros cis como trans. Alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo y similares.

"Alquinilo" significa cualquier alquilo o alquenilo, como se ha definido anteriormente, que contiene adicionalmente al menos un triple enlace entre carbonos adyacentes. Alquinilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1 butinilo y similares.

"Acilo" significa cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo en el que el carbono en el punto de unión está sustituido con un grupo oxo, como se define más adelante. Por ejemplo, -C(=O)alquilo, -C(=O)alquenilo y -C(=O)alquinilo son grupos acilo.

"Heterociclo" significa un anillo heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros, o bicíclico de 7 a 10 miembros, que está tanto saturado, insaturado, como es aromático, y que contiene 1 o 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y en el que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado, que incluye anillos bicíclicos en los que cualquiera de los heterociclos anteriores están condensados con un anillo de benceno. El heterociclo puede unirse mediante cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se definen más adelante. Los heterociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.

Los términos "alquilo opcionalmente sustituido", "alquenilo opcionalmente sustituido", "alquinilo opcionalmente sustituido", "acilo opcionalmente sustituido" y "heterociclo opcionalmente sustituido" significan que, cuando están

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solubilización del fármaco mejorada, protección del fármaco de la hidrólisis enzimática, posible potenciamiento de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por el tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración por vía oral con respecto a formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada y toxicidad reducida (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.º 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Frecuentemente, las microemulsiones pueden formarse espontáneamente cuando sus componentes se ponen juntos a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos termolábiles, péptidos o ARNi. Las microemulsiones también han sido eficaces en la administración transdérmica de componentes activos en tanto aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones en microemulsión y las formulaciones de la presente invención faciliten la elevada absorción sistémica de los ARNi y ácidos nucleicos del tubo gastrointestinal, además de mejorar la captación celular local de los ARNi y ácidos nucleicos.

Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para potenciar la absorción de los ARNi y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de la penetración usados en las microemulsiones de la presente invención pueden clasificarse como que pertenecen a una de las cinco amplias categorías--tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uno de estas clases se ha tratado anteriormente.

iii. Micropartículas

Un agente de iARN de la invención puede incorporarse en una partícula, por ejemplo, una micropartícula. Las micropartículas pueden producirse por secado por pulverización, pero también pueden producirse por otros métodos que incluyen liofilización, evaporación, secado en lecho fluidizado, secado a vacío, o una combinación de estas técnicas.

iv. Potenciadores de la penetración

En una implementación, se emplean diversos potenciadores de la penetración para efectuar la eficaz administración de ácidos nucleicos, particularmente ARNi, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en disolución en tanto formas ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, normalmente solo los fármacos liposolubles o lipófilos cruzan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden cruzar membranas celulares si la membrana que va a cruzarse se trata con un potenciador de la penetración. Además de ayudar en la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos.

Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de las cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada uno de las clases anteriormente mencionadas de potenciadores de la penetración se describe a continuación en mayor detalle.

Los tensioactivos (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfacial entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de los ARNi mediante la mucosa. Además de sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter) (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan de potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C1-20 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo) y mono-y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (véase, por ejemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

La función fisiológica de la bilis incluye facilitar la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan de potenciadores de la penetración. Así el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes que

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SERPINA1 diseñados a medida para experimentos de PCH y 5 µl de mezcla maestra de la sonda Lightcycler 480 (catálogo de Roche N.º 04887301001) por pocillo en placas de 384 pocillos (catálogo de Roche N.º 04887301001). Se hizo PCR en tiempo real en un sistema de PCR en tiempo real LC480 de Roche (Roche). Cada dúplex se probó en al menos dos transfecciones independientes con dos duplicados biológicos cada uno, y cada transfección se

5 ensayó por duplicado.

Para calcular el cambio de veces relativo, se analizaron datos en tiempo real usando el método Ct y se normalizaron a los ensayos realizados con células transfectadas con AD-19 5510 nM, o células transfectadas con vector vacío. Para los ensayos de captación libre, los datos se normalizaron a células tratadas con PBS o GalNAc1955 (mayor concentración usada para compuestos experimentales). Se calcularon CI50 usando un modelo de ajuste

10 de 4 parámetros usando XLFit y se normalizaron a células transfectadas con AD-1955 durante el mismo intervalo de dosis, o a su propia dosis más baja.

Las secuencias sentido y antisentido de AD-1955 son: SENTIDO: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' (SEQ ID NO: 33); y ANTISENTIDO: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (SEQ ID NO: 40).

Los cebadores Taqman y sondas usados fueron los siguientes:

15 Cebadores y sondas de TaqMan para Serpina1 y Gapdh de cinomolgo:

Serpina1: Cebador directo: ACTAAGGTCTTCAGCAATGGG (SEQ ID NO: 34); Cebador inverso: GCTTCAGTCCCTTTCTCATCG (SEQ ID NO: 35); sonda de TaqMan: TGGTCAGCACAGCCTTATGCACG (SEQ ID NO: 36)

Gapdh: Cebador directo: GCATCCTGGGCTACACTGA (SEQ ID NO: 37); Cebador inverso: 20 TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO: 38); sonda de TaqMan: CCAGGTGGTCTCCTCC (SEQ ID NO: 39)

Tabla B: Abreviaturas de monómeros de nucleótido usados en la representación de secuencias de ácidos nucleicos.

Abreviatura: Nucleótido(s)

A: Adenosina-3'-fosfato

Af: 2'-fluoroadenosina-3'-fosfato

Afs: 2'-fluoroadenosina-3'-fosforotioato

As: adenosina-3'-fosforotioato

c: citidina-3'-fosfato

Cf: 2'-fluorocitidina-3'-fosfato

Cfs: 2'-fluorocitidina-3'-fosforotioato

Cs: citidina-3'-fosforotioato

G: guanosina-3'-fosfato

Gf: 2'-fluoroguanosina-3'-fosfato

Gfs: 2'-fluoroguanosina-3'-fosforotioato

Gs: guanosina-3'-fosforotioato

T: 5'-metiluridina-3'-fosfato

Tf: 2'-fluoro-5-metiluridina-3'-fosfato

Tfs: 2'-fluoro-5-metiluridina-3'-fosforotioato

Ts: 5-metiluridina-3'-fosforotioato

U: uridina-3'-fosfato

Uf: 2'-fluorouridina-3'-fosfato

Ufs: 2'-fluorouridina-3'-fosforotioato

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Abreviatura: Nucleótido(s)

Us: uridina-3'-fosforotioato

N: cualquier nucleótido (G, A, C, T o U)

a: 2'-O-metiladenosina-3'-fosfato

as: 2'-O-metiladenosina-3'-fosforotioato

c: 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato

cs: 2'-O-metilcitidina-3'-fosforotioato

g: 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato

gs: 2'-O-metilguanosina-3'-fosforotioato

t: 2'-O-metil-5-metiluridina-3'-fosfato

ts: 2'-O-metil-5-metiluridina-3'-fosforotioato

u: 2'-O-metiluridina-3'-fosfato

us: 2'-O-metiluridina-3'-fosforotioato

dT: 2'-desoxitimidina

dTs: 2'-desoxitimidina-3'-fosforotioato

dU: 2'-desoxiuridina

s: enlace fosforotioato

L96: N-[tris(GalNAc-alquil)-amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol Hyp-(GalNAc-alquilo)3

I: inosina-3'-fosfato

Is: inosina-3'-fosforotioato

dI: 2'-desoxirriboinosina

dIs: 2'-desoxiinosina-3'-fosforotioato

Y34: 2-hidroximetil-tetrahidrofurano-4-metoxi-3-fosfato (2'-OMe furanosa abásica)

Y34s: 2-hidroximetil-tetrahidrofurano-4-metoxi-3-fosforotioato (2'-OMe furanosa abásica)

P: 5'-fosfato

Ejemplo 1. Síntesis de oligonucleótidos conjugados con GalNAc

Se diseñaron una serie de dúplex de ARNip que abarcan la secuencia de ARNm de Serpina1, se sintetizaron y conjugaron un GalNAc trivalente en el extremo 3 de la hebra codificante usando las técnicas descritas anteriormente. Las secuencias de estos dúplex se muestran en la Tabla 1. Estas mismas secuencias también se sintetizaron con diversas modificaciones de nucleótidos y se conjugaron con un GalNAc trivalente. Las secuencias de los dúplex modificados se muestran en la Tabla 2.

76

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SEQ ID NO:: Posición en NM_000295.4

129: 467-489

130: 467-489

131: 1453-1475

132: 1453-1475

133: 1448-1470

134: 1448-1470

135: 1458-1480

136: 1458-1480

137: 1449-1471

138: 1449-1471

139: 1436-1458

140: 1436-1458

141: 1445-1467

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SEQ ID NO:: Posición en NM_000295.4

142: 1445-1467

143: 1119-1141

144: 1119-1141

145: 878-900

146: 878-900

147: 1439-1461

148: 1439-1461

149: 1459-1481

150: 1459-1481

151: 1430-1452

152: 1430-1452

153: 1466-1488

154: 1466-1488

155: 877-899

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SEQ ID NO:: Posición en NM_000295.4

156: 877-899

157: 1429-1451

158: 1429-1451

159: 1454-1476

160: 1454-1476

161: 1214-1236

162: 1214-1236

163: 1574-1596

164: 1574-1596

165: 837-859

166: 837-859

167: 1212-1234

168: 1212-1234

169: 872-894

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SEQ ID NO:: Posición en NM_000295.4

170: 872-894

171: 1577-1599

172: 1577-1599

173: 497-519

174: 497-519

175: 855-877

176: 855-877

177: 714-736

178: 714-736

179: 1457-1479

180: 1457-1479

181: 1319-1341

182: 1319-1341

183: 1120-1142

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SEQ ID NO:: Posición en NM_000295.4

184: 1120-1142

185: 534-556

186: 534-556

187: 1383-1405

188: 1383-1405

189: 1121-1143

190: 1121-1143

191: 787-809

192: 787-809

193: 909-931

194: 909-931

195: 1489-1511

196: 1489-1511

197: 533-555

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SEQ ID NO:: Posición en NM_000295.4

212: 849-871

213: 848-870

214: 848-870

215: 492-514

216: 492-514

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SEQ ID NO:

305

306

307

308

309

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314

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SEQ ID NO:

318

319

320

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SEQ ID NO:

332

333

334

335

336

337

338

339

340

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SEQ ID NO:

346

347

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349

350

351

352

353

354

355

356

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SEQ ID NO:

360

361

362

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366

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368

369

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SEQ ID NO:

374

375

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SEQ ID NO:

388

389

390

391

392

Ejemplo 2. Cribado in vitro e in vivo.

Se evaluó un subconjunto de estos dúplex para eficacia en ensayos de dosis única como se ha descrito anteriormente. La Tabla 3 muestra los resultados de un cribado de dosis única en hepatocitos primarios de ratón (Hep3b) transfectados con los ARNi modificados conjugados con GalNAC indicados y los resultados de cribado por

5 captación libre de dosis única en hepatocitos primarios de Cynomolgus (PCH) con los ARNi modificados conjugados con GalNAC indicados. Los datos se expresan como fracción de mensajero que queda con respecto a las células tratadas con AD-1955, un control no de direccionamiento para experimentos de Hep3B, o con respecto a células intactas para experimentos de PCH.

Tabla 3. Cribado de eficacia de Serpina1 por captación libre en células Hep3b primarias y en hepatocitos primarios 10 de mono Cynomolgus (PCH).

Transfección (Hep3b): Captación libre (PCH)

10 nM: 0,1 nM 10 nM 500 nM

Promedio: DE Promedio DE Promedio DE Promedio DE

AD-58681: 2,7 0,8 4,2 0,5 72,7 9,8 42,1 4,6

AD-59084: 2,1 0,2 6,2 0,6 74,5 10,1 54,2 13,3

AD-59060: 1,2 0,4 6,5 0,3 87,4 8,7 69,5 4,5

AD-59054: 2,2 1,4 7,2 0,7 59,1 10,8 50,3 5,0

AD-59072: 1,3 0,3 7,7 0,2 87,6 6,4 86,2 9,9

AD-59048: 1,1 0,4 8,1 0,4 72,9 19,5 46,4 5,8

AD-59062: 1,4 0,0 9,2 0,6 77,9 11,6 64,9 11,0

AD-59078: 1,8 0,0 12,1 0,2 89,2 9,3 71,1 3,2

AD-59056: 1,8 0,1 20,2 1,8 88,9 13,4 83,7 8,5

AD-59091: 3,8 0,5 26,6 4,1 89,7 15,0 75,6 7,5

AD-59083: 2,3 0,6 27,2 2,5 94,5 9,1 74,5 11,9

AD-59073: 3,7 0,7 27,3 2,3 101,5 15,7 85,1 18,9

AD-59066: 5,9 1,7 31,5 3,4 106,2 25,3 28,2 27,1

AD-59059: 2,9 0,7 32,9 3,4 101,3 10,4 84,9 18,0

AD-59070: 7,4 1,0 33,9 6,6 87,5 9,3 80,1 13,2

AD-59063: 3,0 0,3 35,0 3,9 99,3 4,9 91,1 7,9

AD-59069: 5,6 0,5 39,6 3,5 90,5 19,6 100,4 7,3

AD-59082: 5,0 2,3 41,3 1,8 89,2 27,3 87,8 3,9

AD-59088: 5,2 0,2 41,5 2,1 96,4 17,1 96,2 18,2

AD-59080: 8,2 1,8 41,8 2,1 94,3 4,9 93,4 15,0

AD-59058: 6,4 0,7 43,9 0,3 112,1 12,7 92,5 8,6

AD-59090: 5,8 0,5 44,8 0,8 119,3 14,6 100,2 26,7

AD-59057: 6,2 0,3 47,5 0,9 95,2 7,8 76,1 5,8

AD-59051: 7,0 0,3 52,2 4,4 89,4 2,8 82,0 13,6

AD-59065: 12,7 1,4 60,1 4,4 94,1 9,7 90,6 5,9

91

Transfección (Hep3b): Captación libre (PCH)

10 nM: 0,1 nM 10 nM 500 nM

Promedio: DE Promedio DE Promedio DE Promedio DE

AD-59087: 7,7 1,0 62,1 4,7 92,3 6,8 72,6 10,4

AD-59075: 9,3 2,3 62,9 2,0 101,7 10,6 99,0 18,8

AD-59092: 14,6 4,0 65,5 1,7 87,4 17,3 94,1 21,2

AD-59081: 10,9 2,3 68,2 2,4 115,1 18,4 106,1 11,8

AD-59064: 11,0 0,1 71,6 4,5 91,3 14,7 87,2 10,3

AD-59052: 21,8 2,6 78,6 2,4 99,9 9,2 88,9 17,5

AD-59076: 14,5 4,2 79,4 1,5 84,9 27,2 101,7 10,8

AD-59068: 48,1 1,6 81,8 2,5 100,2 19,7 107,1 25,8

AD-59089: 30,4 0,6 82,6 9,0 87,3 11,9 89,1 3,7

AD-59093: 23,5 0,2 85,2 5,4 72,1 48,5 103,0 13,2

AD-59061: 38,1 2,2 86,5 4,4 100,3 13,3 102,3 9,0

AD-59074: 38,9 5,4 86,6 3,0 106,5 10,3 100,6 14,7

AD-59079: 45,1 0,8 87,6 4,8 100,5 17,4 92,1 33,3

AD-59071: 58,6 1,0 96,2 7,1 82,3 25,8 110,7 2,2

AD-59086: 78,3 1,1 96,3 4,1 93,1 7,3 97,1 17,0

AD-59094: 96,6 2,7 102,1 0,8 75,2 52,7 76,9 7,9

AD-59085: 99,3 3,7 102,5 4,4 94,1 10,0 102,4 16,3

AD-59067: 88,7 0,8 103,7 0,9 118,5 17,2 108,9 30,3

AD-59053: 98,5 4,7 103,7 1,9 98,7 14,8 96,4 8,1

AD-59077: 100,5 8,2 104,8 1,6 88,0 32,5 88,1 4,1

Los valores de CI50 para dúplex seleccionados por transfección en Hep3B primarias se muestran en la Tabla 4. Tabla 4. Valores de CI50 de Serpina1 para dúplex seleccionados por transfección en la línea celular humana Hep3B.

Dúplex: CI50 (nM)

AD-58681: 0,031

AD-59054: 0,128

AD-59062: 0,130

AD-59084: 0,143

AD-59048: 0,146

AD-59072: 0,197

AD-59056: 0,408

AD-59078: 0,600

92

imagen106

Ejemplo 5. Disminución de la incidencia de tumor con reducción en Z-AAT.

Ratones transgénicos que expresan Z-AAT humana desarrollan tumores con la edad. Este experimento se diseñó para determinar si la administración crónica de estos ratones envejecidos con un ARNip de la invención podía disminuir la incidencia de tumor en los ratones. Específicamente, ratones envejecidos (25-46 semanas de edad) con 5 hígados fibróticos fueron crónicamente administrados con dúplex de ARNip AD-58681 parad disminuir la incidencia de tumor de hígado. Los animales fueron administrados por vía subcutánea cada dos semanas (Q2W) con PBS o 10 mg/kg de ARNip de AAT durante 11 dosis y se sacrificaron 7 días después de la última dosis (Figura 4A). Se midieron los niveles en hígado de ARNm de hAAT, ARNm de Col1a2 y ARNm de PtPrc en grupos de control y tratados. Los animales tratados con ARNip de AAT mostraron más del 90 % de disminución en los niveles de ARNm

10 de hAAT (Figura 4B). Se midió ARNm de Col1a2 como marcador de fibrosis y los niveles de este marcador disminuyeron en animales tratados con ARNip de AAT (Figura 4C). Se midió ARNm de PtPrc (CD45) como marcador para la presencia de células inmunitarias (Figura 4D). Hay más infiltración de células inmunitarias en hígados enfermados y, como se muestra en la Figura 4D, los niveles de ARNm de PtPrc disminuyeron significativamente cuando los animales se trataron con ARNip de AAT.

15 Se recogieron muestras de suero después de la primera dosis para monitorizar el grado de supresión de AAT. Todos los animales tratados con ARNip de AAT mostraron menos del 5 % de proteína AAT residual y una dosis única mantuvo los niveles de AAT por debajo del 80 % durante 14 días antes de administrar la siguiente dosis (Figura 5A). La Tabla 6 proporciona observaciones de los animales en el momento del sacrificio (día 132). Animales transgénicos administrados con el dúplex de ARNip presentaron incidencia tumoral reducida cuando se compararon con animales

20 de control no tratados. Específicamente, cuatro de los seis animales tratados con PBS mostraron tumores en los hígados, mientras que solo uno de los seis animales tratados con ARNip de AAT mostró un tumor de hígado. Se calculó que el valor de p para la diferencia en la incidencia de tumor por la prueba de la t era 0,045. La Figura 5B y Figura 5C muestran tinción con PAS de secciones de hígado de dos compañeros de camada tratados con ya fuera PBS o ARNip de AAT. Los puntos de color más oscuro representan los glóbulos o agregados de Z-AAT. Estos datos

25 indican que el dúplex de ARNip es eficaz en disminuir los niveles de Z-AAT en ratones transgénicos y los reducidos niveles de Z-AAT muestran un beneficio fisiológico en forma de hígados más sanos.

Tabla 6.

Tratamiento: Animal N.º Observación

4734: hígado pálido

4737: tumor grande en el lóbulo lateral izquierdo, ∼5 mm de diámetro

PBS: 4754 hígado pálido, tumor de 2 mm en el lóbulo caudado, muchas lesiones en el 2º lóbulo auxiliar

4759: hígado oscuro, tumor de 1,5 mm en el lóbulo caudado, lesión de 1 mm en el lóbulo medial derecho, múltiples lesiones de 1 mm en 1º lóbulo auxiliar

4771: tumor de 3 mm en el lóbulo lateral izquierdo

4775: hígado oscuro

4748: hígado oscuro

4756: hígado pálido, tumor de 3 mm en el lóbulo caudado

AAT-ARNip: 4760 hígado oscuro

4770: nada anormal

4772: nada anormal

4776: nada anormal

Ejemplo 6. Optimización de moléculas de partida de AD-59054

30 Como se ha descrito anteriormente, se demostró que AD-59054 suprimía duraderamente AAT de una manera sensible a la dosis in vivo. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de AD-59054 abarca una región en ARNm de AAT que incluye un polimorfismo prevalente de un solo nucleótido (SNP) (N.º de acceso de SNP de referencia: rs1303 (véase, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)). Específicamente, la localización de SNP se corresponde con el nucleótido en la posición 6 (5' a 3') en la hebra no codificante de AD-59054 (es decir, dentro de la

35 región semilla de AD-59054). Por consiguiente, como desapareamientos dentro de la región semilla pueden conducir 94

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imagen108

-

(5' -> 3')

SEQ ID NO:: CI50

media

429: 0,098

430: 0,102

431: 0,147

432: 1,499

433: 0,088

434: 0,097

435: 0,059

436: 0,333

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Claims

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