ES2678053T3

ES2678053T3 - Inmunoestimulante que tiene una acción antineoplásica y procedimiento para producir dicho inmunoestimulante

Info

Publication number: ES2678053T3
Application number: ES03733607.0T
Authority: ES
Inventors: Aina Muceniece
Original assignee: Ditesan Ltd
Current assignee: Ditesan Ltd
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2018-08-08
Anticipated expiration: 2023-06-13
Also published as: EP1537872A4; WO2003105875A8; EP1537872B1; LV12861B; EA007839B1; AU2003241866A1; EA200500014A1; WO2003105875A1; EP1537872A1; TR201809382T4

Abstract

Un procedimiento para la preparación de un inmunoestimulante con efecto antitumoral, el cual comprende una cepa de virus no patogénico, caracterizado por el hecho de que, esta cepa, se obtiene, - mediante el aislamiento del virus, el cual se trata del enterovirus del tipo ECHO 7 (Picomaviridae Enterovirus specie Echovirus), seguido de - la adaptación del virus, al tejido tumoral, mediante el paso en serie de éste, en el tejido tumoral, el cual se trata de un melanoblastoma procedente de varios pacientes, y la selección de la cepa que tiene una afinidad para el tumor, a cuyo efecto, la adaptación del virus al tejido tumoral, se lleva a cabo en concordancia con el esquema de propagar el virus propagado en el tejido tumoral, en un cultivo de ensayo de los fibroblastos embrionarios humanos, y de nuevo, pasando el virus en tejido tumoral, en donde, la totalidad de 3 - 10 pasos sucesivos, se lleva a cabo, de una forma alternante, en cultivos finitos procedentes de tumores individuales, y en cultivos de ensayo, y - la propagación sucesiva de esta cepa adaptada, procediendo a hacer pasar, en el cultivo de fibroblasto embrionario, humano, hasta un título 5 -7 log TCD 50 / 0,1 ml del enterovirus del tipo ECHO-7, después de lo cual, se procede a aislar el cultivo viral propagado, - el enterovirus del tipo ECHO-7 obtenido, siendo efectivo, in vivo, en la supresión del crecimiento tumoral.

Description

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DESCRIPCION

Inmunoestimulante que tiene una accion antineoplasica y procedimiento para producir dicho inmunoestimulante

La presente invencion, se refiere al sector de la medicina, a procedimientos para producir preparaciones para la inmunoterapia activa de tumores malignos, tales como, por ejemplo, el melanoma maligno.

En la actualidad, se conoce el inmunoestimulante consistente en una mezcla de antigenos tumorales y la fuente de Mn++ (iones de manganeso) Patente britanica UK n° 1 592 496, registrada en fecha 24 / 11 de 1997 y la patente francesa n° 2 423 223, registrada en fecha 20.5.1979 (Clas. Int. A61K39/00). Dicho inmunoestimulante, probo su eficacia, en las etapas primarias de enfermedades, o en el caso de un tratamiento secundario mediante una pequena cantidad de celulas remanentes, despues del primer tratamiento.

Sin embargo, si la administracion debe llevarse a cabo al interior de un tumor de un tamano considerable, la inyeccion, podna parecer inutil o incluso convertir las cosas en peores, debido al incremento de numero de antfgenos tumorales circulantes que, a su vez, bloqueen las celulas inmunes.

Las posibilidades de preparar las vacunas espedficas a partir de tumores individuales, se encuentran limitadas por el tiempo y por la cantidad material disponible.

Asf mismo, se conocen adyuvantes inmunoestimulantes los cuales contienen el antfgeno primario procedente de la celula muerta de B.Pertussis NRRL-11.232, acoplada con diisocianato, con el segundo antigeno procedente de las celulas vivas de adenocarcinoma (patente estadounidense US n° 4 285 930, registrada en fecha 13.11.1979 (Clas. Int. A61K39/12/).

La aplicacion de los mencionados estimulantes, incrementaba la eficiencia de la compleja terapia. Al mismo tiempo, la aplicacion de tales tipos de preparaciones, viene acompanada de efectos secundarios, tanto de indole local como de indole general, tales como, por ejemplo, los consistentes en la inflamacion, ulceras, linfadenopatia, fenomenos de hipersensibilidad, etc.

A partir de los estimulantes conocidos, el mas similar al inmunoestimulante propuesto de inmunidad celular con efecto antitumoral, es aquel que contiene el cultivo viral atenuado del Vaccinia virus, cepa AS ATTC No. VR 2010 (patente estadounidense US No. 4 315 914, registrada en fecha 04.04.1980 / Clas. Int. A61K45/05/).

El inmunoestimulante, se produce mediante el aislamiento del Vaccinia virus, no patogenico, haciendolo pasar en un cultivo monocapa de celulas de rinon de la rata, y propagandolo en un cultivo monocapa de embriones de pollos.

Este inmunoestimulante, viene representado por el mayor estructuralmente y antigenicamente complejo virus de DNA genomico, expresandose en sf mismo, como el estimulante policlonal del sistema inmune, que afecta, sobre todo, a la inmunidad celular. En el caso de la administracion parenteral perdurable de este, podnan aparecer varios efectos secundarios, tales como, por ejemplo, los consistentes en las reacciones de hipersensibilidad, los cuales son tfpicos, asf mismo, tambien, para los inmunoestimulantes bacterianos no espedficos.

Estos efectos secundarios, reducen la efectividad de la aplicacion de la preparacion mediante la cual se pretende suprimir el desarrollo del tumor que aparece despues de la operacion.

En muchos casos, estos efectos secundarios, convierten la aplicacion de esta preparacion en imposible, en general.

Los virus Coxsackie del grupo A, han mostrado ser activos contra las celulas malignas in vitro e in vivo y el Echovirus tipo 7, in vitro (publicacion de patente internacional WO 01/37866, registrada en fecha 31.5.2001 /Clas. Int. A61K39/12/), pero no se aborda la preparacion del Echovirus. Incluso si los virus pertenecen a la misma familia, o resulta de una forma automatica, a partir de ello, el hecho de que, estos, sean igualmente oncotropicos y oncoltticos.

Ferdats et al, en Melanoma Research: 329 - 330 (1999), indican que se ha desarrollado y se ha probado una vacuna de echovirus, pero no proporcionan detalles tecnicos sobre el desarrollo y la fabricacion de tal tipo de producto de vacuna, mediante la utilizacion del tipo E7.

Sinkovics et al., abordan, en Journal of Clinical Virology 16: 1-15 (2000), principalmente, las propiedades oncoltticas del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV - [de sus siglas, en idioma ingles, correspondientes a Newcastle disease virus] -) y mencionan brevemente una cepa de echovirus utilizada como vacuna, para prevenir o evitar las recafdas o reincidencias del melanoma, pero no se proporcionan las etapas exactas de preparacion de la vacuna.

Kelly et al., estudian, en Journal of Medical Virology 11: 257 - 264 (1983), la replicacion del virus de la encefalomiocarditis, perteneciente a la familia Picornaviridae, in vitro, en varios tipos de celulas de mairnferos, incluyendo a los fibroblastos y las celulas de melanoma.

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El objeto de la presente invencion, es el de presentar un procedimiento para la preparacion de un inmunoestimulante con efecto antitumoral, in vitro, el cual comprende una cepa de virus no patogenico, con objeto de incrementar la eficacia de supresion de un crecimiento maligno, despues de la operacion, en caso de la administracion de larga duracion.

El objeto de la invencion, se consigue, debido al hecho de que, en el procedimiento de producir el inmunoestimulante, la cepa de virus no patogenico, se obtiene,

- mediante el aislamiento del virus, el cual se trata del enterovirus del tipo ECHO 7 (Picomaviridae Enterovirus especie Echovirus), seguido de

- la adaptacion del virus, al tejido tumoral, mediante el paso en serie de este, en el tejido tumoral, el cual se trata de un melanoblastoma procedente de varios pacientes, y la seleccion de la cepa que tiene una afinidad para el tumor, a cuyo efecto, la adaptacion del virus al tejido tumoral, se lleva a cabo en concordancia con el esquema de propagar el virus propagado en el tejido tumoral, en un cultivo de ensayo de los fibroblastos embrionarios humanos, y de nuevo, pasando el virus en tejido tumoral, en donde, la totalidad de 3 - 10 pasos sucesivos, se lleva a cabo, de una forma alternante, en cultivos finitos procedentes de tumores individuales, y en cultivos de ensayo, y

- la propagacion sucesiva de la cepa adaptada, procediendo a hacer pasar, en el cultivo de fibroblasto embrionario, humano, hasta un tttulo 5 -7 log TCD 50 / 0,1 ml del enterovirus del tipo ECHO-7, despues de lo cual, se procede a aislar el cultivo viral propagado,

- el enterovirus del tipo ECHO-7 obtenido, siendo efectivo, in vivo, en la supresion del crecimiento del tumor.

El enterovirus (familia Picomaviridae, genero Enterovirus, specie Echovirus), es conocido, como uno de los virus de RNA mas simples. Este tiene unicamente 4 polipeptidos estructurales y, correspondientemente en concordancia, no tantos determinantes antfgenos (centros activos), para las interacciones con varios clones de la celulas inmunocompetentes.

El efecto antitumoral de este inmunoestimulante, afecta, principalmente, a la etapa humoral del respuesta inmune (linfocitos B). Se conoce el hecho de que, en el caso de la induccion de un proceso maligno, la actividad funcional de los linfocitos B (celulas B), se suprime antes que aquella de las celulas T (linfocitos T).

El conjunto de caractensticas y rasgos espedficos del procedimiento, facilita la adaptacion del cultivo no patogenico aislado, al tejido tumoral, de varios pacientes, asf como tambien su propagacion. En el caso en el que, el tttulo del virus, sea inferior a un valor de 5 log TCD 50 / 0,1 ml, no se observa el efecto inmunoestimulante, debido al hecho de que, la actividad del cultivo, es demasiado debil.

Si los tftulos son mayores de un valor de 7 log TCD 50 / 0,1 ml, se observa la disminucion de la actividad del cultivo.

Los enterovirus, se recuperan a partir del tracto intestinal de los hombres, principalmente, a partir de los ninos sanos de 2 - 5 anos de edad, y estos se afslan en cultivos primarios embrionarios, humanos. A continuacion, se selecciona el serotipo no patogenico Picomaviridae Enterovirus ECHO-7. Se utilizan las heces, para recuperar el virus.

Despues de que se haya producido el cultivo inicial, se detecta su oncotropismo para el melanoblastoma u otros tumores, en cultivos finitos a corto plazo, procedentes de tumores.

El cultivo seleccionado se adapta a los pasos en serie, en tejidos tumorales de melanoblastomas, procedentes de varios pacientes, para incrementar la especificidad del efecto.

La cepa que ha experimentado varios pases, se propaga al tftulo de 5 - 7 log TCD 50 / 0,1 ml, en el cultivo de fibroblastos embrionarios, humanos.

La descripcion detallada del procedimiento, se facilita abajo, a continuacion.

El cultivo inicial no patogenico de Picomaviridae Enterovirus, tipo ECHO-7, se recupera del tracto intestinal de ninos sanos, de 2 - 5 anos de edad. Las muestras fecales, se utilizan para la recuperacion primaria del virus. La muestra fecal, colocada en frascos esteriles, se almacena en el refrigerador, a una temperatura de -10 °C. Para la recuperacion del virus, se utiliza una solucion salina equilibrada de Hanks, al 20 %, en suspension. La solucion, se centrifuga a una velocidad angular de 300 r.p.m. (revoluciones por minuto), durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. Se procede a congelar el sobrenadante, y este se almacena, a dicha temperatura, durante un transcurso de tiempo de 24 horas. A continuacion, se procede a descongelar la suspension, se anaden antibioticos: penicilina - 1000 U/ml, estreptomicina - 250 U/ml, y se incube, durante un transcurso de tiempo de 1 - 2 horas. La suspension obtenida, se centrifuga 1 - 2 veces, a 300 r.p.m. durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. Se procede a congelar de nuevo, el sobrenadante final, despues de someterse a ensayo para la esterilidad, y este se almacena, a una temperatura comprendida dentro de unos margenes situados entre -10 °C y -20 °C.

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Mediante el material que contiene el virus producido, se precede a inocular la monocapa de cultivo tripsinizada de fibroplastos embrionarios humanos. Como medio de mantenimiento para cultivos inoculados, se utiliza el Medio 199, con un 2 % de suero de ternero, como medio de crecimiento - Medio 199 con un 10 % de suero de ternero.

Despues de 1 hora de contacto con las celulas, la suspension, se retira, y se procede a la adicion de medio de mantenimiento. A continuacion, los tubos del cultivo de celulas, se incuban, a una temperatura de 37 °C y durante un transcurso de tiempo de 2 - 10 dfas. Durante este perredo, se llevan a cabo 2 - 3 pasos en serie del material, en cultivos de fibroblastos embrionarios humanos. La incubacion de los tubos, en cualquier paso, perdura, hasta la completa degeneracion de las celulas.

Despues del aislamiento del virus citopatogenico, el material producido, se titula y se serotipan.

El material que contiene el virus citopatogenico se centrifuga a 3000 r.p.m, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos y, a continuacion, este se almacena a una temperatura situada entre -20 °C y - 70 °C.

El tttulo del virus en el cultivo de fibroblastos embrionarios humanos, es el correspondiente a un valor de 5 - 7 log TCD 50 / 0,1 mm.

Despues del aislamiento, las cepas de virus, se sometieron a test de ensayo, para el oncotropismo en cultivos tumorales finitos.

La adaptacion del cultivo de virus aislado, se lleva a cabo en el tejido tumoral obtenido a partir de material operatorio obtenido de varios pacientes, los cuales nunca se sometieron a ningun tratamiento. El tejido tumoral, se purifica, a partir del tejido adiposo, de las lesiones necroticas, y de la sangre. El tejido tumoral purificado, se incuba, durante un transcurso de tiempo de 18 - 20 horas, a una temperatura de 0 °C y, a continuacion, este se trocea, en fragmentos de 0,1 - 0,2 mm, y se embebe en medio 199 o medio Eagle, sin suero (100 mg de tejido / 4 ml de medio).

El tejido, se infecta con cultivo de virus 105 - 105 TCD 50, y se incuba en termostato, a una temperatura de 37 °C, sin aportacion adicional de CO2. Se cambian 5 ml de medio fresco, diariamente. El cultivo, se finaliza, cuando se alcanza la muerte de los fragmentos tumorales, lo cual se comprueba morfologicamente y visualmente, en concordancia con el cambio de color del medio.

Para la deteccion de la intensidad de la propagacion del virus, se procede a llevar a cabo la titulacion del virus, en la fase lfquida del cultivo tumoral, del cual se extraen muestras diariamente. La intensidad de la reproduccion del virus, se evalua procediendo a calcular el porcentaje de la cantidad de virus detectado en el cultivo infectado, con respecto a la dosis de infeccion. En el caso en el que se encuentre la multiplicacion de virus, en el tejido tumoral, se procede entonces a centrifugar material procedente de los dfas de maxima propagacion, a una velocidad angular de 3000 r.p.m., durante un transcurso de tiempo de 20 minutos.

La adaptacion del cultivo, se lleva a cabo en concordancia con el siguiente esquema: el virus propagado en el tejido tumoral, se pasa (se propaga) en el cultivo de ensayo de fibroplastos embrionarios humanos, y se pasa, otra vez, en tejido tumoral. En conjunto, se llevan a cabo 3 - 10 pasos sucesivos, de una forma alternada, en cultivos finitos procedentes de tumores individuales y en cultivos de ensayo.

La cepa de virus inicial, se almacena en la fase congelada, a una temperatura comprendida dentro de unos margenes situados entre -20 °C y -70 °C.

La propagacion de la cepa, se lleva a cabo en un cultivo de fibroblastos embrionarios humanos, hasta que el tftulo, sea de un valor de 5 - 7 log TCD 50 / 0,1 ml, con medio 199, exento de suero, y mediante la adicion de antibioticos: penicilina 100 U / ml, estreptomicina 50 U / ml.

El indicador del valor pH - fenol rojo, pudo anadirse, al medio, en una concentracion del 0,002 %.

La fase lfquida del cultivo infectado de fibroblastos embrionarios humanos, despues de la completa degeneracion de las celulas, se centrifuga, a 3000 r.p.m., durante un transcurso de tiempo de 20 minutos.

El inmunoestimulante producido con efecto antitumoral, es un lfquido esteril de color rosa. Este se introduce en viales, a razon de 2 ml (2 x 107 TCD 50) - siendo esta la dosis para una inyeccion. La preparacion, se almacena en estado congelado.

El inmunoestimulante producido, se aplico para el tratamiento de pacientes con melanoma de piel, maligno (T1-3, N0, M0), despues de la eliminacion operatoria de bien ya sea el tumor primario, o del tumor primario, conjuntamente con ganglios linfaticos regionales.

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La preparacion, se administra 2 - 4 semanas despues de la operacion, como inyeccion parenteral (intramuscular), en la region glutea lateral superior.

El esquema de administracion, es como sigue: durante los primeros tres meses, una inyeccion de 2 ml (2 x 107 TDC 50 / dfa), 3 d^as, de una forma consecutiva, despues de cada recorrido de tratamiento, en un intervalo de tres semanas, en los siguientes tres meses - una inyeccion / semanalmente. A continuacion, hay un intervalo de tres meses, y se repiten inyecciones, mensualmente, dentro de lo meses postoperatorios 9° - 12°.

La administracion de la preparacion, podna comenzarse antes de la eliminacion del tumor primario - 1 - 2 semanas previamente a la operacion: una inyeccion de 2 ml (2 x 107 TDC 50 / dfa), durante 3 dfas, de una forma consecutiva.

Es tambien posible, asf mismo, un penodo de administracion mas prolongado - de hasta 2 - 3 anos de penodo postoperatorio, mediante inyecciones mensuales de 2 ml.

La administracion de la preparacion, no provoca, practicamente, efectos secundarios.

Abajo, a continuacion, se proporcionan los resultados de ensayos clmicos de la preparacion inmunoestimulante propuesta (ISVO - inmunoestimulante de origen viral - [de sus siglas, en idioma ingles, correspondientes a immunostimulator of viral origin] -), la preparacion de origen bacteriano (Corinebacterium Parvum) y una preparacion qrnmica, Decaris (Levamisol), para pacientes con melanoma maligno.

El Decaris, se administro en concordancia con el siguiente esquema: tabletas, peroralmente administradas, dos veces por semana, con 3 dfas de intervalo, durante 8 meses, desde la 2a - 4a semana, despues de la eliminacion del tumor primario.

La preparacion de C.P., se administro segun el siguiente esquema: la inmunoestimulacion, se comenzo 1 - 4 semanas despues de la operacion radical. Durante los primeros cinco dfas, la preparacion, se administro por via intravenosa, a razon de 1 - 4 mg diarios, en dosificacion ascendente. A continuacion, durante un transcurso de tiempo de 1 ano, la preparacion, se administro por via subcutanea, una vez a la semana, a razon de 1 ml, en 4 puntos, en la region abdominal.

Se procedio a analizar los materiales, con referencia a los pacientes los cuales se encontraban en observacion, durante un transcurso de tiempo no inferior a los 3 anos.

Abajo, a continuacion, se proporcionan, en la tabla 1, los datos sobre la supervivencia y los procesos dinamicos, en los pacientes afectados de melanoma cutaneo, despues de la operacion radical.

Tabla 1

Parametro observado: Inmunoestimulante C.P. Decaris ISVO Solo operacion

Supervivencia: 13 : 12* 22 : 28 21 : 25 62 % 78,6 % 84 % 54,5 %

Estabilizacion del proceso: 10 : 21 17 : 28 18 : 25 47 % 60,7 % 64% 25,7 %

*- en el numerador, se indica el numero de pacientes con resultados positivos con respecto al numero total de pacientes observados; en el denominador - el porcentaje de este valor de relacion.

Los datos, demuestran el hecho de que, los mejores resultados de supervivencia, se obtuvieron en el caso de la administracion del inmunoestimulante propuesto, basado en el cultivo de enterovirus.

En la Tabla 2, se proporcionan los datos de la dinamica de la mortalidad de los pacientes afectados de melanoma, despues de la cirugfa y de la inmunoestimulacion.

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Tabla 2

Grupo de pacientes observado: Numero de pacientes los cuales murieron durante: el primer ano 2 anos 3 anos

C.P.: 1 : 21 6 : 21 8 : 21 5 % 29 % 38 %

Decaris: 2 : 28 6 : 28 6 : 28 7 % 21 % 21 %

ISVO: 0 : 25 2 : 25 4 : 25 0 % 8 % 16 %

Solo operacion: 54,5 %

*- en el numerador, se indica el numero de pacientes muertos, con respecto al numero total de pacientes observados; en el denominador - el porcentaje de este valor de relacion.

Puede concluirse, a rafz de los datos obtenidos, el hecho de que, la inmunoestimulacion proporcionada por el inmunoestimulante propuesto, un significativo incremento de la supervivencia de los pacientes, puesto que, durante el primer ano, no murio nadie, de entre el grupo tratado con ISVO, mientras que, en los otros grupos, murieron un 5 % y un 7 %, respectivamente.

La diferencia en la mortalidad, se observa asf mismo, tambien, despues de los 2 anos, en comparacion con la segunda mejor preparacion, Decaris, en donde, el ISVO, indujo unos resultados 1,3 veces mejores.

La preparacion propuesta, disminuyo asf mismo, tambien, la frecuencia de la progresion del proceso, despues de la operacion radical.

Abajo, a continuacion, en la Tabla 3, se proporcionan los datos de la frecuencia del progreso del proceso, en los pacientes afectados de melanoma, despues de la operacion radical y la inmunoestimulacion.

Tabla 3

Penodo de tiempo: Preparacion C.P. Decaris ISVO Solo operacion

3 anos: 11 : 21 11 : 28 29 : 25 53 % 39 % 36 % 74,3 %

*- en el numerador, se indica el numero de pacientes con progreso del proceso, con respecto al numero total de pacientes observados; en el denominador - el porcentaje de este valor de relacion.

Tal y como podra verse a rafz de la tabla, la progresion mas lenta de proceso, fue, en el caso de un tratamiento, la correspondiente al tratamiento con la preparacion propuesta.

El modelo patron de la diseminacion del tumor - melanoma cutaneo despues una operacion radical, en dependencia de la preparacion utilizada, se proporciona en la Tabla 4.

Tabla 4

Inmunoestimulante: Recafdas Metastasis Subcutanea Ganglios linfaticos Pulmones Cerebro

C.P.: 1 : 11 9 % 4:11 6:11 7 : 11 3: 11 36 % 55 % 63 % 27 %

Decaris: no 1 : 8 4 : 8 2 : 8 1 : 8 12,5 % 50 % 25 % 12,55 %

ISVO: no 3 : 9 4 : 9 1 : 9 1 : 9 33 % 45 % 11 % 11 %

*- en el numerador, se indica el numero de pacientes con recafdas (metastasis), con respecto al numero total de pacientes observados; en el denominador - el porcentaje de este valor de relacion.

Los datos proporcionados en la Tabla 4, indican el hecho de que, en el caso de un tratamiento con la preparacion propuesta, la metastasis, son mayormente subcutaneas y en ganglios linfaticos, las cuales podfan detectarse y eliminarse de una forma relativamente facil. Las metastasis en los pulmones, se encontraron de una forma 6 y 2,5 veces mas raramente, que en el caso de un tratamiento con otras preparaciones conocidas.

El modelo patron del progreso de la enfermedad, entre los pacientes los cuales murieron, se proporciona en la Tabla 5.

Tabla 5

Grupo observado: Numero de pacientes Duracion de la estabilizacion (meses) Penodo de diseminacion (meses) Duraciones de la supervivencia (meses)

C.P.: 9 13 9 22

Decaris: 6 10 5 15

ISVO: 10 17 12 29

5 Los datos proporcionados en la Tabla 6, indican el hecho de que, la preparacion propuesta, extiende de una forma significativa, el penodo de estabilizacion y el penodo de diseminacion, pero, la duracion de la supervivencia, se prolongo durante un transcurso de tiempo de 12 meses mas, que la correspondiente en el caso de Decaris, y durante un transcurso de tiempo de 7 meses mas, que la correspondiente en el caso de Corinebacterium Parvum.

10 Abajo, a continuacion, en la Tabla 6, se facilitan los datos de supervivencia de pacientes afectados de cancer gastrico, despues de una operacion radical, en la fase 3a de la enfermedad.

Tabla 6

Penodo de observacion: Supervivencia de los pacientes (frecuencia en (%) Operacion + ISVO Operacion

2 anos: 15 : 21* 45,8 71,41

5 anos: 10 : 21* 24,2 47,6

*- en el numerador, se indica el numero de pacientes vivos, con respecto al numero total de pacientes observados; en el denominador - el porcentaje de este valor de relacion.

15 Puede concluirse, a rafz de los resultados presentados, el hecho de que, en los pacientes tratados con la preparacion propuesta, la frecuencia de la supervivencia, es 1,5 - 2 veces mayor, en comparacion con solo la operacion.

Abajo, a continuacion, en la Tabla 7, se facilitan los datos de supervivencia de pacientes afectados de cancer de 20 recto, despues de una operacion radical.

Tabla 7

Penodo de observacion: Supervivencia de los pacientes (frecuencia en %) Operacion + ISVO Operacion

5 anos: 10 : 14* 58,2 71,2

Tal y como puede verse, a rafz de los resultados, la administracion de la preparacion propuesta, incrementaba la 25 supervivencia en un porcentaje del 14 %.

Abajo, a continuacion, se proporcionan los resultados del control de estatus inmune, durante el tratamiento, con el inmunoestimulante propuesto (ISVO).

30 1. Reaccion de DTH al antigeno tumoral asociado a melanoma

No habfa cambios significativos en la frecuencia de una reaccion positiva de DTH (hipersensibilidad de tipo retardado - [de sus siglas, en idioma ingles, correspondientes a delayed-type hypersensitivity] -), en los pacientes tratados con ISVO, durante los primeros 6 meses (50 - 60 %). Despues de reanudar la inmunoestimulacion (9 - 12 35 meses), este mdice, se elevo en un porcentaje del 10 % de los pacientes, lo cual significa que, la frecuencia, de la reacciones normales de DTH, no cambian ni se incrementan, durante la estimulacion con ISVO.

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En el caso de un tratamiento con Decaris, la frecuencia de las reacciones normales de DTH, experimentan cambios, no existe reaccion, en un 35 % de los pacientes, despues de un transcurso de tiempo de 2 meses. En una parte de los pacientes, la frecuencia de esta reaccion, experimenta cambios significativos (20 - 30 %).

Puesto que la reaccion de DTH, muestra la capacidad del organismo para distinguir, reaccionar y rechazar el antigeno asociado al tumor, la estabilizacion o la elevacion de este mdice, son indicadores favorables, pero las fluctuaciones bruscas y la disminucion de esta reaccion, son indicaciones no favorables del estatus inmune en curso de inmunoestimulacion. Asf, de este modo, en concordancia con este mdice, el ISVO, funciona mejor que el Decaris.

2. RILA para antigeno tumoral asociado a melanona

El tratamiento con ISVO, en el penodo postoperatorio, no provoca fluctuaciones bruscas de reacciones. La frecuencia de deteccion de esta reaccion, en el transcurso de la inmunoestimulacion, tiene una tendencia a incrementarse. Entre los pacientes tratados con Decaris, la frecuencia de deteccion de esta reaccion, en el curso de la estimulacion, se redujo desde un 60 % a un 30 %, lo cual significa que, en el final del recorrido, los leucocitos de unicamente un 30 % de los pacientes, reconocieron y reaccionaron con el antigeno del melanoma. RILA asf como la DTRH, exhiben la capacidad de los linfocitos T, para distinguir y reaccionar con el antigeno asociado a tumor. La ausencia o diminucion de esta reactividad, debe verse con un debilitamiento de la resistencia tumoral.

Debe mencionarse el hecho de que, despues de que haya cesado el tratamiento con Decaris, este mdice, vuelve a su valor inicial.

3. El inhibidor de adherencia de leucocitos en suero

Durante el curso de la inmunoestimulacion con ISVO, la frecuencia de deteccion de este mdice, aumenta, desde un 35 %, en el inicio del curso (trascurso), hasta un 80 %, en el final. En el grupo de pacientes tratados con Decaris, la frecuencia de deteccion de este mdice, se reduce, desde un 40 %, en el inicio del recorrido, hasta un 20 % en el final del trascurso de la estimulacion.

El inhibidor de adherencia de leucocitos detectados en RILA, se detecta, en un 60 - 80 % de personas sanas. El mismo mdice, se encuentra en pacientes afectado de melanoma, despues de una operacion radical y un tratamiento con ISO, y en la etapa o fase de estabilizacion. El inhibidor, desparece, durante el proceso de diseminacion, lo cual significa que, esta presencia del inhibidor de la adherencia de leucocitos, en suero, es uno de los indices de estatus inmune normal. La aparicion de este, en un 45 % de los pacientes tratados con ISVO, se contempla con el efecto de inmunoestimulacion positivo.

A efectos comparativos, en el grupo tratado con Decaris, despues de 4 meses de tratamiento, el inhibidor, se encuentra unicamente en un porcentaje del 20 % de los pacientes.

4. El factor de bloqueo en suero, detectado en RILA

El factor de bloqueo, muestra el estado de bloqueo de celulas inmunocompetentes que participan en los procesos de inmunidad antitumoral.

Este factor, se detecta en un 25 - 30 % de los pacientes, despues de que se haya extirpado la lesion de melanoma primario. En los pacientes tratados con ISVO, en el 6° mes de inmunoestimulacion, este factor, de detecta unicamente en un 10 % de los pacientes.

El factor de bloqueo en suero, se reduce asf mismo, tambien, durante los primeros 2 meses de estimulacion con Decaris, y este se detecta en un 10 % de los pacientes, pero, en el 6° mes de la inmunoestimulacion, ese factor, se detecta en unicamente un 30 - 40 % de los pacientes, incluyendo a aquellos pacientes, los cuales no presentaban el factor de bloqueo, despues de la extirpacion del tumor.

5. Anticuerpos antivirales en suero

Durante los primeros meses de la inmunoestimulacion con ISVO, hay un fuerte incremento de anticuerpos antitumorales en suero, los cuales se detectan mediante reaccion de neutralizacion y reaccion de inhibicion de hemaglutinacion. Durante este penodo, los tftulos de anticuerpos antivirales, se incrementaron desde 1 : 20, hasta 1 : 5000 - 10000. Despues de que se terminara la inmunoestimulacion (6 - 9 mes), los tftulos de anticuerpo, cayeron y, a continuacion, se convirtieron en estables, con la reactivacion de la inmunoestimulacion (9 - 12 meses).

Esto indica que tiene lugar una inmunogenesis viral activa, en los organismos de los pacientes. El penodo de inmunogenesis viral, es favorable, para la expresion de inmunidad antitumoral, via recurrencia y normalizacion de procesos, bloqueados mediante el crecimiento (tumor) maligno.

Esto significa que, la administracion de ISVO, en penodo postoperatorio, despues de una extirpacion radical del melanoma primario, o bien convierte en estable las reacciones inmunes del organismo, o bien las activa.

Aparte de ello, no se observaron signos de hiperestimulacion ni de reacciones autoinmunes. Los mdices de estatus 5 inmunes, presentan una evidencia en cuanto al hecho de que, no se observaron los efectos toxicos, durante la administracion parenteral de larga duracion, de ISVO.

El inmunoestimulante propuesto, basado en una cepa de enterovirus adaptada a tumor, no patogenica, del tipo ECHO Picomaviridae Enterovirus, es efectivo en la supresion del crecimiento tumoral.

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Este tipo de virus, pertenece a los virus sin envoltura y, debido a ello, este no porta antigenos de origen celular, lo cual podna inducir a reacciones autoinmunes.

De una forma adicional, es caractenstico de este tipo de virus, la seguridad genetica, basada en la organizacion del 15 genoma, el cual no se integra en el genoma de celulas huesped, y no se recombina con los genomas de otros virus.

El procedimiento desarrollado para producir el inmunoestimulante, asegura la maxima actividad de la preparacion obtenida.

20 El inmunoestimulante propuesto, suprime, de una forma activa, el crecimiento tumoral maligno, en el caso de recafdas. De una forma adicional, las metastasis, son predominantemente subcutaneas y en los ganglios linfaticos, las cuales podnan extirparse de una forma comparativamente facil.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un procedimiento para la preparacion de un inmunoestimulante con efecto antitumoral, el cual comprende una cepa de virus no patogenico, caracterizado por el hecho de que, esta cepa, se obtiene,

5

- mediante el aislamiento del virus, el cual se trata del enterovirus del tipo ECHO 7 (Picomaviridae Enterovirus specie Echovirus), seguido de

- la adaptacion del virus, al tejido tumoral, mediante el paso en serie de este, en el tejido tumoral, el cual se trata de un melanoblastoma procedente de varios pacientes, y la seleccion de la cepa que tiene una afinidad para el

10 tumor, a cuyo efecto, la adaptacion del virus al tejido tumoral, se lleva a cabo en concordancia con el esquema de propagar el virus propagado en el tejido tumoral, en un cultivo de ensayo de los fibroblastos embrionarios humanos, y de nuevo, pasando el virus en tejido tumoral, en donde, la totalidad de 3 - 10 pasos sucesivos, se lleva a cabo, de una forma alternante, en cultivos finitos procedentes de tumores individuales, y en cultivos de ensayo, y

- la propagacion sucesiva de esta cepa adaptada, procediendo a hacer pasar, en el cultivo de fibroblasto 15 embrionario, humano, hasta un tftulo 5 -7 log TCD 50 / 0,1 ml del enterovirus del tipo ECHO-7, despues de lo cual,

se procede a aislar el cultivo viral propagado,

- el enterovirus del tipo ECHO-7 obtenido, siendo efectivo, in vivo, en la supresion del crecimiento tumoral.
2. - El procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por el hecho de que, la citada cepa de enterovirus, se 20 ha aislado del tracto intestinal de un nino de 2 - 5 anos de edad.
3. - Enterovirus no patogenico del tipo ECHO 7 (Picomaviridae Enterovirus specie Echovirus), obtenido mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2.