ES2692377T3 - Composición farmacéutica para tratar el cáncer que comprende tripsinógeno y quimotripsinógeno - Google Patents

Composición farmacéutica para tratar el cáncer que comprende tripsinógeno y quimotripsinógeno Download PDF

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ES2692377T3
ES2692377T3 ES16174383.6T ES16174383T ES2692377T3 ES 2692377 T3 ES2692377 T3 ES 2692377T3 ES 16174383 T ES16174383 T ES 16174383T ES 2692377 T3 ES2692377 T3 ES 2692377T3
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende tripsinógeno y quimotripsinógeno, en la que la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno es 4:1, 8:1 o está en el intervalo de 4:1 a 8:1.

Description

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DESCRIPCION
Composicion farmaceutica para tratar el cancer que comprende tripsinogeno y quimotripsinogeno Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general a composiciones farmaceuticas que contienen una proenzima proteasa y a su uso para tratar el cancer.
Antecedentes de la invencion
La idea de usar proteasas para tratar el cancer ha existido durante mas de 100 anos. En 1905, John Beard propuso el uso de extractos de enzimas pancreaticas recien preparadas como una posible terapia contra el cancer y realizo experimentos exitosos con el modelo del sarcoma de raton de Jersen. Despues de inyectarle al raton la enzima proteasa tripsina, se observo una regresion de los tumores. Los resultados obtenidos por Beard produjeron un gran interes en ese momento, y los extractos de enzimas en bruto preparados a partir del pancreas de oveja se utilizaron para tratar a pacientes humanos con cancer para reducir la progresion de su tumor y prolongar el tiempo de supervivencia.
Mas recientemente, se ha demostrado que la administracion oral de enzimas es bien tolerada por los pacientes con buenas tasas de supervivencia en una variedad de canceres, incluidos los mielomas pancreaticos, intestinales, colorrectales y en etapa tardfa. Se ha requerido el uso de altas dosis de enzimas debido a la perdida e inactivacion a traves de la digestion y de otras enzimas inactivadoras en el plasma sangumeo, como las serpinas.
El uso de proenzimas (forma de enzimas precursoras inactivas) se ha utilizado para superar los problemas encontrados con la administracion oral de enzimas. Una mezcla de proenzimas que incluye el tripsinogeno, que es la forma proenzima de la tripsina inhibidora de la serina proteasa, ha demostrado que es util en el tratamiento de carcinomas y se cree que se activa selectivamente en la superficie de las celulas tumorales (Novak J y Trnka F, Proenzyme Therapy of Cancer, Anticancer Research, 25: 1157-1178, 2005; Patente de Estados Unidos N° 5.858.357). Se cree que el mecanismo de accion de la tripsina se produce a traves de la proteolisis de las celulas tumorales.
Existe la necesidad de identificar y proporcionar composiciones de proenzimas mejoradas que sean eficaces para tratar los canceres.
Compendio
La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una primera y una segunda proenzima proteasa capaz de activarse en la superficie, o cerca de esta, de una celula tumoral para mejorar la adhesion celula a celula de las celulas tumorales, efectuar la proteolisis de las celulas tumorales o inducir la apoptosis de las celulas tumorales, la diferenciacion o el inmunoreconocimiento, en donde la primera proenzima proteasa es un quimotripsinogeno y la segunda proenzima proteasa es un tripsinogeno, y la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno esta en el intervalo de 4:1 a 8:1.
En una realizacion de la invencion, la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno esta en el intervalo de entre 5:1 a 7:1. En otra realizacion, la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno es 6:1.
La invencion se refiere ademas al uso de esta composicion en la fabricacion de un medicamento para tratar el cancer.
Una primera descripcion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una proenzima proteasa y un agente activo, siendo la composicion capaz de proporcionar un enfoque multifuncional para tratar el cancer.
Una segunda descripcion proporciona una composicion farmaceutica que comprende:
una proenzima proteasa capaz de activarse en la superficie, o cerca de esta, de una celula tumoral para mejorar la adhesion de celula a celula de las celulas tumorales, efectuar la proteolisis de las celulas tumorales o inducir la apoptosis de las celulas tumorales, la diferenciacion o el inmunoreconocimiento y
un agente activo capaz de inducir actividad intracelular en las celulas tumorales.
En una realizacion de la segunda descripcion, la actividad intracelular es la apoptosis de las celulas tumorales, el inmunoreconocimiento o la diferenciacion.
En una realizacion de la primera o segunda descripcion, la composicion farmaceutica comprende una proenzima proteasa y un agente activo, siendo la composicion capaz de proporcionar un enfoque multifuncional para tratar el cancer, en el que la proenzima proteasa se selecciona de al menos uno de tripsinogeno y quimotripsinogeno, y el agente activo se selecciona de al menos uno de entre un compuesto de selenio, un compuesto vaniloide y un agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica y, opcionalmente, una glucosido hidrolasa. En una realizacion adicional, la
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proenzima proteasa es el tripsinogeno y el quimotripsinogeno.
Una tercera descripcion proporciona un agente o composicion para tratar el cancer, en el que el agente comprende una proenzima proteasa y un agente activo, que juntos son capaces de proporcionar un enfoque multifuncional para tratar el cancer.
Una cuarta descripcion proporciona un agente o una composicion para tratar el cancer, en el que el agente comprende:
una proenzima proteasa capaz de activarse en la superficie, o cerca de esta, de una celula tumoral para mejorar la adhesion de celula a celula de las celulas tumorales, efectuar la proteolisis de celulas tumorales o inducir la apoptosis, la diferenciacion o el inmunorreconocimiento de las celulas tumorales; y
un agente activo capaz de inducir actividad intracelular en celulas tumorales.
Una quinta descripcion proporciona el uso de una proenzima proteasa en la fabricacion de un medicamento que comprende un agente activo para tratar el cancer.
Una sexta descripcion proporciona el uso de un agente activo en la fabricacion de un medicamento que comprende una proenzima proteasa para tratar el cancer.
Una septima descripcion proporciona el uso de una proenzima proteasa y un agente activo en la fabricacion de un medicamento para tratar el cancer.
Una octava descripcion proporciona el uso de una proenzima proteasa en la fabricacion de un medicamento para tratar el cancer en un sujeto que esta siendo tratado con un agente activo, en donde el agente activo y la proenzima proteasa juntos pueden producir celulas tumorales y, opcionalmente, en donde el agente activo es capaz de inducir la actividad intracelular para mejorar el efecto de la proenzima proteasa.
Una novena descripcion proporciona el uso de un agente activo en la fabricacion de un medicamento para tratar el cancer en un sujeto que esta siendo tratado con una proenzima proteasa, en donde el agente activo y la proenzima proteasa juntos pueden producir celulas tumorales y, opcionalmente, en donde el agente activo es capaz de inducir la actividad intracelular para mejorar el efecto de la proenzima proteasa.
Una decima descripcion proporciona un metodo para tratar el cancer que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una proenzima proteasa y un agente activo.
En una realizacion de la decima descripcion, el metodo comprende la administracion conjunta o la administracion secuencial de la proenzima proteasa y el agente activo y, opcionalmente, el agente activo adicional. La administracion conjunta puede comprender la administracion de un medicamento unico que comprende la composicion farmaceutica de la primera y segunda descripcion, o la administracion conjunta de medicamentos separados que comprenden cada uno una proenzima proteasa y el agente activo y, opcionalmente, un agente activo adicional. La administracion secuencial puede implicar cualquier orden de administracion de la proenzima proteasa, el agente activo o el agente activo adicional. La secuencia y la administracion conjunta pueden implicar diferentes vfas de administracion de la proenzima proteasa, el agente activo o el agente activo adicional.
El metodo de acuerdo con la decima descripcion puede incluir la administracion de la proenzima proteasa o el agente activo a un sujeto que ya ha sido tratado por separado con el agente activo o la proenzima proteasa, respectivamente.
Una undecima descripcion proporciona un metodo para preparar la composicion farmaceutica de la primera y segunda descripciones, o la preparacion o formulacion de estas, mezclando la proenzima proteasa con el agente activo.
En una realizacion adicional de la undecima descripcion, el metodo puede comprender ademas la mezcla de un agente activo adicional de acuerdo con una realizacion de la primera y segunda descripcion con las proenzimas de proteasa y/o el agente activo.
En una realizacion de las descripciones anteriores, la proenzima proteasa es una proenzima serina proteasa. La proenzima serina proteasa puede ser tripsinogeno, quimotripsinogeno o una mezcla de estos. En otra realizacion, la proenzima proteasa comprende una primera proenzima proteasa y una segunda, en donde la primera proenzima proteasa es un quimotripsinogeno y la segunda proenzima proteasa es un tripsinogeno, y la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno esta en el intervalo de 4:1 a 8:1. En una realizacion adicional, la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno esta en el intervalo de entre 5:1 a 7:1. En una realizacion adicional, la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno es 6:1.
En una realizacion de las descripciones anteriores, el agente activo se selecciona de al menos uno del grupo que consiste en un compuesto de selenio, un compuesto vaniloide y un agente reductor de la glicolisis citoplasmatica y, opcionalmente, una glucosido hidrolasa. Por ejemplo, el agente activo puede ser un compuesto de selenio o una
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combinacion que consiste en un compuesto de selenio, un compuesto vaniloide, una glucosido hidrolasa y un agente reductor de la glucolisis citoplasmica.
En una realizacion de las descripciones anteriores, la composicion farmaceutica comprende una proenzima proteasa y un agente activo, siendo la composicion capaz de proporcionar un enfoque funcional para tratar el cancer, en el que la proenzima proteasa se selecciona de al menos uno de tripsinogeno y quimotripsinogeno, y el agente activo se selecciona de al menos uno de un compuesto de selenio, un compuesto vaniloide y un agente de reduccion de la glicolisis citoplasmica y, opcionalmente, una glucosido hidrolasa.
En una realizacion adicional de las descripciones anteriores, el compuesto de selenio es capaz de proporcionar una fuente biodisponible de selenio que puede ser absorbida por el cuerpo en el plasma sangumeo o los fluidos intercelulares. En una realizacion particular, el compuesto que contiene selenio es metilselenocistema o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
En una realizacion de los aspectos anteriores, la glucosido hidrolasa es una amilasa, por ejemplo, la a-amilasa.
En otra realizacion de las descripciones anteriores, el agente reductor de la glicolisis citoplasmica es la 2-desoxi-D- glucosa.
En otra realizacion de las descripciones anteriores, el compuesto vaniloide se selecciona de capsiato, a saber, 4- hidroxi-3-metoxibencil (E)-8-metil-6-nonenoato, dihidrocapsiato, a saber 8-metilonanoato de 4-hidroxi-3- metoxibencilo, y nordihidrocapsiato, a saber, 7-metiloctanoato de 4-hidroxi-3-metoxibencilo. Preferiblemente, el compuesto vaniloide es el capsiato. En una realizacion de las descripciones anteriores, el agente activo se selecciona de al menos uno del grupo que consiste en metilselenocistema, capsiato, a-amilasa y 2-desoxi-D- glucosa. En una realizacion particular, el(los) agente(s) activo(s) consiste(n) en metilselenocistema, capsiato, a- amilasa y 2-desoxi-D-glucosa.
En otra realizacion de la invencion, la composicion farmaceutica comprende ademas un agente activo tal como se define en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.
Una duodecima descripcion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un primer y segundo agente activo, cada uno capaz de inducir actividad intracelular en celulas tumorales, en el que el primer agente activo es un compuesto de selenio y el segundo agente activo es un agente de reduccion de la glucolisis citoplasmatica.
En una realizacion de la duodecima descripcion, la actividad intracelular es la apoptosis de celulas tumorales, el inmunorreconocimiento o la diferenciacion. En una realizacion, el compuesto de selenio se define de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En una realizacion preferida, el compuesto de selenio es metilselenocistema. En otra realizacion, el agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica es la 2-desoxi-D- glucosa.
En otra realizacion de la duodecima descripcion, la composicion farmaceutica comprende ademas una proenzima proteasa como se define en una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En otra realizacion de la duodecima descripcion, la composicion farmaceutica comprende ademas un agente activo seleccionado de un compuesto vaniloide y una glicosida hidrolasa como se define en una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.
Una decimotercera descripcion proporciona un uso de la composicion farmaceutica de acuerdo con la undecima o duodecima descripciones en la fabricacion de un medicamento para tratar el cancer.
Una decimocuarta descripcion proporciona un metodo para tratar el cancer que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion farmaceutica de acuerdo con la undecima o duodecima descripcion.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden proporcionarse en un vehmulo, portador o diluyente farmaceuticamente aceptable, y pueden incluir uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
En una realizacion adicional de las descripciones anteriores, las composiciones farmaceuticas, los agentes, el uso o los metodos pueden comprender uno o mas agentes activos adicionales capaces de mejorar la eficacia de la proenzima proteasa, el agente activo o las composiciones farmaceuticas, o reducir los efectos secundarios indeseables.
En una realizacion adicional de las descripciones anteriores, la composicion farmaceutica, la proenzima proteasa, el agente activo y el agente activo opcionalmente adicional, pueden proporcionarse juntos, por separado o en cualquier combinacion, en forma de un supositorio.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1A-D muestran cada una grafica de las curvas estandar del numero de celulas para las celulas Caco2, HEK293, OE33 y Pancl, respectivamente, con una densidad optica de 492 nm;
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La figura 2 muestra una fotomicrograffa de celulas OE33 tratadas con una formulacion de referencia de proenzima B;
La figura 3 muestra una grafica de celulas OE33 tratadas con un intervalo de concentraciones de la formulacion de referencia de la proenzima B;
Las figuras 4A-C muestran cada una grafica de celulas Pancl tratadas con las formulaciones de referencia de proenzima B, J y T, respectivamente;
Las figuras 5A-C muestran cada una grafica de celulas Caco2 tratadas con formulaciones de referencia de proenzima B, J y T, respectivamente;
Las figuras 6A y 6B proporcionan, cada una, fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de la p-catenina en celulas OE33 despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima J;
Las figuras 7A y 7B proporcionan, cada una, fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de E-cadherina en celulas OE33 despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima J;
Las figuras 8A y 8B proporcionan, cada una, fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de la p-catenina en celulas Pancl despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima J;
Las figuras 9A y 9B proporcionan, cada una, fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de E-cadherina en celulas Pancl despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima J;
Las figuras 10A y 10B proporcionan, cada una, fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de E-cadherina en celulas Caco2 despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima J;
Las figuras 11A y 11B proporcionan, cada una, fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de la p-catenina en celulas Caco2 despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima J;
La figura 12 proporciona fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de p-catenina y E-cadherina en celulas Pancl despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima T;
La figura 13 proporciona fotomicrograffas que muestran la regulacion al alza de p-catenina y E-cadherina en celulas Caco2 despues del tratamiento con la formulacion de referencia de proenzima T;
La figura 14 proporciona un analisis isobolografico para JBplvP y DCM en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2;
La figura 15 proporciona un analisis isobolografico para tripsinogeno y quimotripsinogeno en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2;
La figura 16 proporciona un analisis isobolografico para tripsinogeno y a-amilasa en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2;
La figura 17 proporciona un analisis isobolografico para quimotripsinogeno y a-amilasa en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2;
La figura 18 proporciona un analisis isobolografico para TA y quimotripsinogeno en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2;
La figura 19 proporciona un analisis isobolografico para CA y tripsinogeno en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2;
La figura 20 proporciona un analisis isobolografico para TC y a-amilasa en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2;
La figura 21 proporciona un diagrama de barras que muestra los pesos medios de las capsulas para diversas formulaciones de los Grupos 1 a 5 en un estudio comparativo in vivo anti-angiogenico de ratones equipados con capsulas fibrosas;
Las figuras 22A y 22B proporcionan un analisis isobolografico para JBp1vP y metilselenocistema en celulas HCT-15;
Las figuras 23A y 23B proporcionan un analisis isobolografico para JBp1vP y 2-desoxiglucosa en celulas HCT-15;
Las figuras 24A y 24B proporcionan un analisis isobolografico para JBp1vP y capsiato en celulas HCT-15; y
Las figuras 25A y 25B proporcionan un analisis isobolografico para 2-desoxiglucosa y metilselenocistema en celulas
HCT-15.
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Descripcion de las abreviaturas
En los ejemplos, se hara referencia a las siguientes abreviaturas en las que:
a-amilasa
A
ANOVA
Analisis de varianza
Avg
Promedio
bFGF
Factor de crecimiento de fibroblastos basico
BSA
Suero bovino de Albumina
BW
Peso corporal
°C
Grados Celsius
C
Capsiato
Caco2
Lmea de celulas del adenocarcinoma de colon humano
Quimotripsinogeno
pC
DAvg
Cambio en el peso corporal promedio
DCM
2-Desoxiglucosa, Capsiato y Metilselenocistema
D
2-Desoxi-D-glucosa
F
Fahrenheit
h
Hora
Hb
Hemoglobina
i.p.
intraperitoneal
IU
Unidades internacionales
JBp1
Formulacion de proenzima que comprende tripsinogeno, quimotripsinogeno y a-amilasa
JBpIvP
Formulacion de proenzima que comprende tripsinogeno, quimotripsinogeno y a-amilasa (pC:pT:A) en 6:1:0,25 en relacion en peso.
JBp1-DCM
Formulacion de proenzima que comprende quimotripsinogeno, a-amilasa, 2- desoxiglucosa, capsiato y metilselenocisteina
Mn
Peso molecular promedio en numero
Mw
Peso molecular promedio en peso
MW
Peso molecular
M
Metilselenocisteina
MSeA
Acido metilselenico
MTD
Maxima dosis tolerable
NMP
N-metil-2-pirrolidona
OE33
Lmea celular de adenocarcinoma esofagico
Panc1
Lmea celular de carcinoma ductal pancreatico humano
PBS
Solucion fosfatada con fosfato
PEG300
Polietilenglicol 300
p.o.
Per os, (sonda oral)
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RD
SeMeT
SEM
SRB
Tripsinogeno % en peso v/v
Descripcion detallada
Dosis recomendada
Selenometionina
Error estandar de la media
Ensayo de tincion de la protema con sulforodamina B pT
Porcentaje en peso Volumen por volumen
Aunque se ha demostrado que las formulaciones de proenzima de proteasa proporcionan beneficios terapeuticos en el tratamiento del cancer, el mecanismo de accion de las proenzimas de proteasa en celulas cancerosas y tumores malignos no se conoce completamente en la tecnica. Por lo tanto, el solicitante realizo una investigacion de los efectos y mecanismos implicados en el tratamiento de lmeas celulares de cancer con formulaciones de proenzimas de serina proteasa que comprenden tripsinogeno y quimotripsinogeno, que incluyeron investigaciones en tres lmeas celulares de cancer diferentes (Pancl, Caco2 y OE33). De particular interes fue el sorprendente descubrimiento de que las proenzimas proteasas estaban involucradas en la diferenciacion de las celulas tumorales de CaCo2 (posible conversion de celulas malignas en celulas no malignas) y en la regulacion positiva de la expresion de E-cadherina y p-catenina en todas las tres lmeas celulares.
El solicitante cree que una reduccion en la metastasis por las formulaciones de proenzima de serina proteasa surge a traves de la regulacion positiva de la expresion y formacion de complejos de E-cadherina/p-catenina, que estan implicados en la adhesion de celula a celula. El corolario del aumento de la adhesion de celula a celula es una reduccion de la metastasis porque es menos probable que las celulas malignas se difundan o escapen del tumor primario.
Con la disponibilidad de esta nueva informacion, la presente descripcion investigo formulaciones que comprendfan una proenzima proteasa en combinacion con uno o mas agentes activos que eran capaces de proporcionar una interrelacion funcional en el tratamiento del cancer. Por ejemplo, el agente activo puede proporcionar una actividad mejorada para el tratamiento del cancer a la pro-enzima sola operando en una funcion diferente de la celula tumoral con respecto a la expresion de E-cadherina y p-catenina, pero donde el resultado general es proporcionar un tratamiento mejorado, que puede incluir una reduccion en la metastasis y/o un aumento en la apoptosis, inmunoreconocimiento o diferenciacion de la celula tumoral. En otras palabras, las composiciones farmaceuticas de la primera y segunda descripcion proporcionan una proenzima proteasa en combinacion con un agente activo, permitiendo la combinacion un enfoque multicelular o multifuncional para dirigir o tratar una celula o celulas cancerosas. Por ejemplo, las proenzimas se activan en la superficie de la celula tumoral, o cerca de esta, para promover la expresion de moleculas de adhesion celula a celula y, por lo tanto, reducir la metastasis, mientras que un agente activo separado, como la metilselenocisteina, puede funcionar a un nivel intracelular para ayudar con la reduccion de la metastasis, diferenciacion o muerte de la celula tumoral (p. ej., necrosis, apoptosis, inmunoreconocimiento).
Proenzimas proteasas
Una proenzima (tambien conocida como zimogeno) es una forma precursora de una enzima que no tiene la actividad espedfica de la enzima y, por lo tanto, se denomina tfpicamente una forma inactiva de la enzima. Las proenzimas se mantienen en su estado inactivo hasta que se requieren, de modo que evitan o reducen los efectos no espedficos de la actividad enzimatica en sitios no deseados. Las proenzimas pueden activarse en las enzimas activas correspondientes mediante otras enzimas dando como resultado una cascada de activacion, que incluye la accion de multiples enzimas y la autoactivacion. Las proenzimas se consideran activadas selectivamente por las celulas cancerosas que, a su vez, estan sometidas a la proteolisis por la enzima activa.
La expresion "proenzima proteasa", como se usa en este documento, significa una forma precursora de una enzima proteasa que puede activarse in situ en la enzima proteasa activa. Las proenzimas proteasas pueden ser de origen humano o animal. La enzima proteasa puede actuar para proporcionar uno o mas efectos celulares que incluyen la proteolisis, la regulacion positiva de la expresion de E-cadherina y/o p-catenina, la apoptosis, el inmunoreconocimiento potenciado y la diferenciacion de las celulas tumorales. Las enzimas proteasas incluyen serina proteasas, treonina proteasas, cistema proteasas, aspartato proteasas, metaloproteasas o proteasas de acido glutamico. Las proteasas pueden ser endopeptidasas o exopeptidasas. Las endopeptidasas (o endoproteinasas) son peptidasas proteolfticas que rompen los enlaces peptfdicos de los aminoacidos no terminales (es decir, dentro de la molecula), a diferencia de las exopeptidasas, que rompen los enlaces peptfdicos en los extremos de la molecula.
La proenzima proteasa puede ser un precursor de una enzima a partir de peptidasas de la clase enzimatica 3.4,
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particularmente serina endopeptidasas de la clase enzimatica 3.4.21 y, mas particularmente, quimotripsina de la clase enzimatica 3.4.21.1, quimotripsina C de la enzima 3.4.21.2 o tripsina de la clase de enzimas 3.4.21.4 (clases agrupadas segun la clasificacion del Comite de Nomenclature de la Union Internacional de Bioqmmica y Biolog^a Molecular).
La proenzima proteasa puede ser una proenzima serina proteasa. Las enzimas de la serina proteasa incluyen las formas de tipo tripsina o quimotripsina, tipo subtilisina, alfa/beta hidrolasa y peptidasas senal. Las serina proteasas pueden incluir las siguientes serina endopeptidasas:quimotripsina, metridina, tripsina, trombina, factor de coagulacion Xa, plasmina, enteropeptidasa, acrosina, endopeptidasa a-Lftica, glutamil endopeptidasa, catepsina G, factor de coagulacion Vila, factor de coagulacion IXa, cucumisina, prolil oligopeptidasa, factor de coagulacion Xia, braquiurano, calicrema de plasma, calicrema de tejido, elastasa pancreatica, elastasa de leucocitos, factor de coagulacion Xlla, quimasa, complemento activado C1r, complemento activado C1s, convertasa C3/C5 de la ruta del complemento clasico, factor I del complemento, factor D del complemento, convertasa C3/C5 de la ruta del complemento alternativo, cerevisina, hipodermina C, lisil endopeptidasa, endopeptidasa La, Y-renina, venombin AB, leucil endopeptidasa triptasa, escutelarina, quexina, subtilizacion, orizina, peptidasa K, termomicolina, termitasa, endopeptidasa So, activador t-plasminogeno, protema C (activada), endopeptidasa pancreatica E, elastasa pancreatica II, serina endopeptidasa espedfica de IgA, activador de u-plasminogeno, venombina A, furina, mieloblastina, semenogelasa, granzima A, granzima B, estreptogrisina A, estreptogrisina B, glutamil endopeptidasa II, oligopeptidasa B, factor de coagulacion C del limulus, factor de coagulacion del limulus B, enzima de coagulacion del limulus, represor LexA, peptidasa I de senal, togavirina, flavivirina, endopeptidasa Clp, proprotema convertasa 1, proprotema convertasa 2, activador del factor V de veneno de serpiente, lactocepina, ensamblaje, hepacivirina, espermosina, sedolisina, xantomonalisina, peptidasa de procesamiento C-terminal, fisarolisina, serina proteasa-2 asociada a lectina de union a manano, proteasa romboidal, hepsina, peptidasa Do, HtrA2 peptidasa, matriptasa, C5a peptidasa, aqualisina 1, sitio-1 proteasa, poliprotema peptidasa de pestivirus NS3, serina peptidasa de arterivirus equino, birnavirus vp4 peptidasa de necrosis pancreatica infecciosa, spoIVB peptidasa, enzima quimotnptica del estrato corneo, calicrema 8, calicrema 13, oviductina.
La proenzima serina proteasa de la presente invencion es una mezcla de tripsinogeno y quimotripsinogeno.
Las proenzimas tripsinogeno y quimotripsinogeno pueden ser precursoras de las enzimas seleccionadas a partir de las clases de quimotripsina 3.4.21.1 o 3.4.21.2 o tripsina de la clase 3.4.21.4, o seleccionadas de cualquier otra fuente adecuada. Estas enzimas estan disponibles comercialmente y pueden ser de origen bovino o porcino.
El quimotripsinogeno es una forma proenzimatica de la enzima quimotripsina, que escinde preferentemente protemas en los siguientes aminoacidos: tirosina, triptofano, fenilalanina y leucina. La quimotripsina puede referirse o incluir quimotripsina A, quimotripsina B (incluidas las formas B1 y b2), quimotripsina C, a-quimar oft, avazima, quimara, quimotest, enzeon, quimar, quimotrasa, a-quimotripsina A, a-quimotripsina. La quimotripsina C puede formarse a partir de quimiotripsinogeno C de cerdo o de la subunidad II de procarboxipeptidasa A de ganado vacuno, y preferentemente escinde protemas en los siguientes aminoacidos: tirosina, triptofano, fenilalanina, leucina, metionina, glutamina y asparagina. El quimotripsinogeno incluye al quimotripsinogeno B1 y al quimotripsinogeno B2.
El tripsinogeno es una forma proenzimatica de la tripsina, que escinde preferentemente protemas en arginina y lisina. La tripsina puede referirse o incluir a a-tripsina, p-tripsina, cocoonasa, parenzima, parenzimol, triptar, tripuro, pseudotripsina, triptasa, tripcelim, hidrolasa receptora de esperma p-tripsina puede formarse a partir de tripsinogeno por escision de un enlace peptfdico. Otras escisiones de enlaces peptfdicos producen formas a y otras iso-formas. Se pueden aislar multiples tripsinas cationicas y anionicas del pancreas de muchos vertebrados y de especies inferiores, como cangrejos de no, insectos (cocoonasa) y microorganismos (Streptomyces griseus). En los procesos normales durante la digestion, el tripsinogeno inactivo se activa por la enteropeptidasa presente en la mucosa intestinal para formar la enzima tripsina, que es una serina proteasa que luego actua para romper los enlaces peptfdicos en el lado carboxilo de los aminoacidos/protemas basicos.
Como se menciono, la forma de proenzima proporciona esencialmente una forma inactivada de la enzima que se activa in situ (por ejemplo, la activacion in vivo o in vitro). Por ejemplo, la activacion de la proenzima (conversion de proenzima en enzima activa) puede ocurrir en contacto con la superficie de la celula tumoral. Se cree que las proenzimas tripsinogeno y quimotripsinogeno se activan selectivamente en las enzimas tripsina y quimotripsina en contacto con celulas tumorales y no en contacto con celulas sanas. El uso de proenzimas reduce los problemas asociados con el suministro in situ de una enzima activa, como reacciones indeseables o la inactivacion de la enzima antes de alcanzar el objetivo deseado de una celula tumoral.
En relacion con las celulas tumorales, las enzimas proteasas pueden actuar para romper la pared celular de las celulas malignas al dividir los enlaces amida presentes en las cadenas peptfdicas de las paredes celulares (proteolisis). Tambien se entiende que los inhibidores de la proteasa, que estan presentes en las celulas no malignas e inhiben o reducen el efecto de las enzimas en la descomposicion de las paredes celulares, estan ausentes en las celulas tumorales malignas. Ademas de proporcionar actividad proteolttica, las proenzimas de proteasa pueden regular al alza la expresion de p-catenina y E-cadherina en las celulas tumorales. La adhesion celula a celula se facilita mediante la formacion de complejos o la union entre p-catenina y E-cadherina en la superficie celular y, por lo tanto, una mayor expresion de p-catenina y E-cadherina conduce a una mayor adhesion de celula a celula y, por lo
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tanto, reduce la metastasis de las celulas tumorales. Las proenzimas de proteasa tambien pueden proporcionar otra actividad celular, como un aumento del inmunoreconocimiento o de la diferenciacion.
Agentes activos
Los agentes activos de la primera descripcion, segunda descripcion, duodecima descripcion y la invencion son para tratar el cancer o inducir la actividad intracelular para mejorar el tratamiento de una celula tumoral.
En una realizacion, la actividad intracelular es la apoptosis de celulas tumorales, necrosis, inmunoreconocimiento o diferenciacion.
En relacion con el enfoque multifuncional, en una realizacion, los agentes activos son capaces de proporcionar una interrelacion funcional con las proenzimas proteasas en el tratamiento del cancer. Por ejemplo, el agente activo puede proporcionar una actividad mejorada para el tratamiento del cancer que puede o no estar relacionada con la expresion de E-cadherina y p-catenina, pero donde el resultado general es proporcionar un tratamiento mejorado, como una reduccion de la metastasis y/o un aumento de la apoptosis, el inmunoreconocimiento o la diferenciacion de la celula tumoral. El agente activo puede operar a nivel intracelular para ayudar con la reduccion de la metastasis, la diferenciacion o la muerte de la celula tumoral (por ejemplo, necrosis, apoptosis, inmunoreconocimiento).
En una realizacion, el agente activo se selecciona de al menos uno del grupo que consiste en un compuesto de selenio, un compuesto vaniloide y un agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica y, opcionalmente, una glucosido hidrolasa. Por ejemplo, el agente activo puede consistir en un compuesto de selenio, o puede ser una combinacion de agentes activos que consiste en un compuesto de selenio, un compuesto vaniloide, una glicosido hidrolasa y un agente de reduccion de la glucolisis citoplasmatica.
Compuesto de selenio
En una realizacion, la expresion "compuesto de selenio" significa cualquier compuesto que contenga selenio que sea capaz de proporcionar una fuente biodisponible de selenio. El compuesto de selenio puede incluir compuestos inorganicos, tales como minerales que contienen selenitos y selenatos, y compuestos organicos, tales como la metilselenocistema. El compuesto de selenio se puede obtener como un extracto vegetal o de una smtesis comercial. En una realizacion particular, el compuesto de selenio proporciona una fuente biodisponible de selenio que puede ser facilmente absorbida por el cuerpo en el plasma sangumeo o los fluidos intercelulares.
En una realizacion, la expresion "compuesto de selenio" significa un aminoacido que contiene un compuesto de selenio divalente o tetravalente. El aminoacido puede seleccionarse de isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cistema, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptofano, glicina, valina, prolina, serina, tirosina, arginina, histidina. El selenio divalente o tetravalente tambien puede estar presente en el aminoacido en sustitucion del azufre u otras especies divalentes que puedan aparecer de forma natural en estos aminoacidos.
En una realizacion, la expresion "compuesto de selenio" significa un compuesto que contiene un compuesto de selenio divalente de formula I o un compuesto de selenio tetravalente de formula II:
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Formula I Formula II
o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, en la que:
R1 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de H, OH, -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)-OR5, alquilo C1-4 y alquenilo C2-6, en donde alquilo C1-4 y alquenilo C2-6 estan opcionalmente sustituidos con 0-3 sustituyentes seleccionados independientemente entre halogeno, OH, -NH2, -C(O)OH, -C(O)-OR5;
R2 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, OH, -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)-OR5, alquilo C1-12 y alquenilo C2-12, en donde alquilo C1-12 y alquenilo C2-12 se interrumpen opcionalmente con uno o mas grupos seleccionados entre -NH-, -N(alquilo C1-4)-, -NH(CO)-, -C(O)-, -C(O)O-, -O- y -C(NH2)H-C(O)O-, y opcionalmente sustituido con 0-3 sustituyentes seleccionados independientemente entre halogeno, -NH2, -OH, -alquilo C1-4, - C(O)OH, -C(O)H, -C(O)-OR5, -N(alquilo C^H, -N(alquilo ^.4)2, -C(NH2)H-C(O)OH, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo; y
en donde R5 se selecciona de alquilo, alquenilo, cicloalquilo y cicloalquenilo, particularmente alquilo C1-12.
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En la realizacion anterior se apreciara que:
alquilo C1-4 y alquilo C1-12 significan una cadena de cicloalquilo lineal o ramificada, o una combinacion de estas; y
alquenilo C2-6 y alquenilo C2-12 significan una cadena de cicloalquenilo lineal o ramificada, o una combinacion de estas.
En una realizacion particular, Ri y R3 se seleccionan cada uno independientemente de H, OH y alquilo C1-4, y mas particularmente son metilo.
En otra realizacion particular, R2 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, OH y -alquil Ci-6-C(NH2)H- C(O)OH y, mas particularmente, -alquil Ci-3-C(NH2)H-C(O)OH.
En otra realizacion, el compuesto de selenio se selecciona de metilselenocistema, metilselenol y acido metilselenmico, o una sal o mezcla farmaceuticamente aceptable de los mismos. En una realizacion particular, el compuesto de selenio es metilselenocistema o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos de selenio se seleccionan para mejorar la eficacia del tratamiento de las proenzimas de proteasa proporcionando una interrelacion funcional o un enfoque multifuncional para tratar el cancer. Por ejemplo, el compuesto de selenio puede inducir la actividad intracelular para mejorar el tratamiento de la celula tumoral por medio de la apoptosis de las celulas tumorales, el inmunoreconocimiento y/o la diferenciacion.
La relacion entre la ingesta de selenio y el cancer se conoce desde hace decadas. El selenio es un oligoelemento esencial con una cantidad diaria recomendada (RDA) de 55 microgramos. El selenio es esencial para activar diversas enzimas clave, como la antioxidante glutation peroxidasa, la enzima metabolica tiorredoxina reductasa y la enzima activadora de la hormona tiroidea yodotironina deyodinasa. Se ha considerado que el selenio proporciona proteccion contra el cancer mediante el aumento de la actividad antioxidante de las celulas y el tngado (glutation peroxidasa) o mediante la promocion de la eliminacion de carcinogenos ambientales (glutation S-transferasa). Las formas organicas de selenio, como la selenometionina, pueden ser toxicas a niveles de aproximadamente 3500 microgramos por dia, mientras que las formas inorganicas de selenio, como el selenito/selenato de sodio, pueden ser toxicas en aproximadamente 1500 microgramos. El selenio es seguro en dosis a largo plazo en niveles de aproximadamente 400 pg/dfa, aunque los protocolos de tratamiento del cancer pueden tratarse en intervalos de aproximadamente de 900 a 2.000 |jg de selenio por dia.
Se ha demostrado que algunos efectos anticancengenos de selenio se producen en dosis cercanas a niveles de dosis potencialmente toxicos, pero las enzimas selenoprotemas estan generalmente saturadas (actividad maxima) en ingestas dieteticas de solo 90 jg de selenio por dia, muy por debajo de las dosis optimas contra el cancer.
Las formas inorganicas, como el selenito/selenato, han demostrado ser mas efectivas para tratar el cancer que las formas organicas tfpicas, como la selenometionina. Las formas de selenito/selenato se pueden metabolizar a seleniuro de hidrogeno, que es toxico tanto para las celulas cancerosas como para las celulas sanas y funciona a traves de un mecanismo de necrosis menos selectivo e invasivo (en oposicion a la apoptosis). La selenometionina es menos toxica, pero se incorpora en gran medida a las protemas corporales generales que no tienen actividad anticancengena.
La metilselenocistema (tambien conocida como Se-metilselenocistema) es un agente quimiopreventivo que bloquea la progresion del ciclo celular y la proliferacion de lesiones mamarias premalignas, e induce la apoptosis de lmeas celulares cancengenas, con muy baja toxicidad y acumulacion corporal. La metilselenocistema se forma de forma natural en varias plantas, incluidos el ajo, los puerros silvestres, las cebollas y el brocoli cultivados en suelos con alto contenido en selenio, y los alimentos ricos en metilselenocistema han demostrado una buena actividad anticancengena, sin un exceso de acumulacion en tejidos o toxicidad. La metilselenocistema se convierte en metilselenol por la enzima beta-liasa. En cuanto a la actividad contra las celulas tumorales, se sabe que el metilselenol inhibe la angiogenesis y causa la apoptosis, pero tiene una toxicidad baja y el organismo la elimina facilmente.
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Las siguientes estructuras qmmicas representan diversos compuestos de selenio:
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o
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Metilselenocisterna
Selenometionina Acido metilselenico
(MSC)
(SeMeT) (MSeA)
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NaO ONa Selenito de sodio
H3C—Se-H Metilselenol
Los compuestos de selenio de acuerdo con las realizaciones anteriores pueden incluir todas las sales, hidratos, solvatos, formas cristalinas, diastereomeros, isomeros conformacionales (por ejemplo, isomeros cis y trans) farmaceuticamente aceptables, tautomeros, profarmacos, metabolitos y formas enantiomericas de los mismos.
Compuesto vaniloide
En una realizacion, la expresion "compuesto vaniloide" se refiere a cualquier compuesto que contenga un resto de tipo vanililo o vaniloilo o farmacoro. Los compuestos vaniloides incluyen clases qmmicas conocidas de vaniloides naturales tales como resiniferanoides, capsaicinoides, dialdehfdos insaturados y trifenilfenoles. Por ejemplo, los compuestos de estas clases qmmicas conocidas incluyen resiniferatoxina, capsaicina, isoveleral y escutigeral, respectivamente. Los ejemplos de otros compuestos vaniloides incluyen vainilina, acido vamlico, nonivamida, olvanil, dihidrocapsaicina y acido vanilil mandelico. Los compuestos vaniloides pueden incluir compuestos de origen natural, como la capsaicina o vaniloides semisinteticos o sinteticos, como la capsazepina.
En otra realizacion, la expresion "compuesto vaniloide" significa un compuesto de formula general III:
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Formula III
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que:
R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente de H, OH, OCH3, C(O)H, O-alquilo C2-6, O-alquenilo C2-6, SH, S-alquilo C1-6, NH2, NH-alquilo C1-6 y N(alquil Ci_6)2i
R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo C1-20, alquenilo C2-20 y alquinilo C2-20, en donde el alquilo C1-20, alquenilo C2-20 y alquinilo C2-20 se interrumpen opcionalmente con uno o mas grupos seleccionados de - NR6-, -NH(CO)-, -C(O)-, -C(O)O-, -O-, -C(NR6R6)H-C(O)O-, -C(S)-, -C(S)NR6- y -NR6-C(S)-NR6, y opcionalmente sustituidos con 0-3 sustituyentes seleccionados independientemente entre halogeno, -NH2, -OH, -alquilo C1-4, - C(O)OH, -C(O)OR5, -C(O)H, -N(alquil Cm)H, -N(alquil ^.4)2, -C(NH2)H-C(O)OH, -C(S)-, cicloalquilo opcionalmente sustituido, cicloalquenilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido; y
en donde R5 se selecciona de alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, particularmente alquilo C1-12; y R6 se selecciona de H, alquilo C1-6; y R3 y R4 se pueden unir para formar un anillo insaturado opcionalmente sustituido o saturado que tiene de 3 a 8 atomos de carbono en el anillo que incluye de 0 a 3 heteroatomos seleccionados de O, S y N.
En la realizacion anterior se apreciara que:
Alquilo C2-6 y alquilo C1-20 significan una cadena de cicloalquilo lineal o ramificada, o una combinacion de estas;
Alquenilo C2-6 y alquenilo C2-20 significan una cadena de cicloalquenilo lineal o ramificada, o una combinacion de estas;
Alquinilo C2-20 significa una cadena de cicloalquinilo lineal o ramificada, o una combinacion de estas;
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Cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquilcicloalquenilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido significan una sustitucion opcional con uno o mas grupos seleccionados de halogeno, -NH2, -OH, -alquilo C1-4, -C(O), -C(O)OH, -C(O)OR5, -C(O)H, -N(alquil Ci-4)H, -N(alquil C1-O2, -C(NH2)H-C(O)OH, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo, y, por ejemplo, incluirla resiniferatoxina.
En una realization particular, Ri y R2 se seleccionan cada uno independientemente de OH, C(O)H y OCH3 y, mas particularmente, de OH y OCH3.
En otra realizacion particular, R3 se selecciona entre -alquil Ci-4-NH-C(O)-alquenilo C1-12, -alquil Ci-4-NH-C(O)-alquilo C1-12 y, mas particularmente, -CH2-NH-C(O)-C4H8-CH=CH-CH(CH3)CH3. Se apreciara en esta realizacion que la cadena alquilo o alquenilo puede ser lineal o ramificada.
En otra realizacion particular, R3 se selecciona entre -alquil Ci-4-O-C(O)-alquenilo C1-12, -alquil Ci-4-O-C(O)-alquilo C1-12 y, mas particularmente, -CH2-O-C(O)-C4H8-CH=CH-CH(CH3)CH3. Se apreciara en esta realizacion que la cadena alquilo o alquenilo puede ser lineal o ramificada.
En otra realizacion particular, R4 es H.
El compuesto vaniloide se puede seleccionar entre capsaicina, dihidrocapsaicina y nordihidrocapsaicina.
Preferiblemente, el compuesto vaniloide se selecciona de capsiato, dihidrocapsiato y nordihidrocapsiato. En una realizacion, el compuesto vaniloide es el capsiato. Se proporcionan preferiblemente el capsiato, dihidrocapsiato y nordihidrocapsiato en una forma que esta sustancialmente libre de capsaicinas, por ejemplo, con una pureza de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99,9%. Se apreciara que los capsiatos, que se obtienen tlpicamente como extractos de chiles, generalmente contienen pequenas cantidades de capsaicinas y otros compuestos estructuralmente similares. Las capsaicinas pueden presentar una respuesta inflamatoria indeseable (al desencadenar una gran liberation de histamina localizada) y, por lo tanto, pueden ser menos deseables tipos particulares de reglmenes de administration para cierto compuestos, o para cantidades o purezas particulares de esos compuestos, que se pueden adaptar para satisfacer los requisitos especlficos. Una fuente de capsiato de alta pureza es la de los chiles dulces "CH-19" de Ajinomoto Co.
En otra realizacion, el compuesto vaniloide se selecciona de 8-metil-N-vanilil-6-no-enamida; N-vanililnonanamida; N- (9-decenil)-4-hidroxi-3-metoxi-fenilacetamida; N-(9Z-dodecenil)-4-hidroxi-3-metoxifenilacetamida; N-(9Z-tetradecenil)- 4-hidroxi-3-metoxifenilacetamida; N-((4-hidroxi-3-metoxifenil)-metil)-9-decenamida; N-((4-hidroxi-3-metoxifenil)-metil) -9Z-dodecenamida; N-((4-hidroxi-3-metoxifenil)-metil)-9Z-tetradecenamida y N-((4-(3-fenil-2(S)-2-amino-1-propoxi)-3- metoxifenil)-metil)-nonanamida.
En otra realizacion, el compuesto vaniloide es la capsazepina, a saber, N-[2-(4-clorofenil)etil]-7,8-dihidroxi-1,3,4,5- tetrahidro-2-benzazepina-2-carbotiomida.
Varios vaniloides, en particular la capsaicina, se unen al receptor transitorio receptor tipo I vaniloide potencial (TRPV1), un canal ionico que responde de manera natural a estlmulos nocivos como las altas temperaturas y el pH acido. Otros vaniloides que actuan en TRPV1 incluyen resiniferatoxina y olvanil.
Los compuestos vaniloides incluyen la capsaicina y el capsiato, los cuales tambien se conocen como capsinoides. Los capsinoides, que incluyen el capsiato, el dihidrocapsiato y el nordihidrocapsiato, son sustancias presentes de forma natural en los chiles. Aunque son estructuralmente similares a la capsaicina, que es el compuesto que causa la pungencia en los pimientos picantes, los capsinoides carecen en gran medida de esta caracterlstica y tienen un "umbral de sabor picante" estimado en aproximadamente 1/1000 de la capsaicina.
La capsaicina es (E)-N-[(4-hidroxi-3-metoxifenil)metil]-8-metil-6-nonenamida, y sus analogos incluyen dihidrocapsaicina, que es un derivado 6,7-dihidro de la capsaicina. Como se menciono anteriormente, los capsinoides incluyen capsiato, a saber, (E)-8-metil-6-nonenoato de 4-hidroxi-3-metoxibencilo, dihidrocapsiato, a saber, 8-metilnonanoato de 4-hidroxi-3-metoxibencilo, y nordihidrocapsiato, a saber, 7-metiloctanoato de 4-hidroxi-3- metoxibencilo. La estructura qulmica de algunos de estos compuestos es la siguiente:
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Los capsiatos pueden producir apoptosis y reducir la incidencia de tumores. Se cree que los capsiatos inducen la apoptosis al afectar el estado redox de las celulas a traves de las mitocondrias celulares.
Los compuestos vaniloides se seleccionan para mejorar la eficacia del tratamiento de las proenzimas de proteasa al proporcionar una interrelacion funcional o un enfoque multifuncional para tratar el cancer. Por ejemplo, el compuesto vaniloide puede inducir una actividad intracelular que mejore el tratamiento de la celula tumoral mediante la apoptosis de las celulas tumorales, el inmunoreconocimiento y/o la diferenciacion.
Las siguientes estructuras qmmicas para la vainilina, el acido vamlico y la resiniferatoxina son:
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Los compuestos vaniloides de acuerdo con las realizaciones anteriores pueden incluir todas las sales, hidratos, solvatos, formas cristalinas, diastereomeros, isomeros conformacionales (por ejemplo, isomeros cis y trans) farmaceuticamente aceptables, tautomeros, profarmacos, metabolitos y formas enantiomericas de los mismos.
Glicosido hidrolasa
En una realizacion de la invencion o de las descripciones, la expresion "glucosido hidrolasa" significa cualquier enzima que pueda hidrolizar el enlace glicosfdico entre dos o mas carbohidratos, o entre un carbohidrato y un resto no carbohidrato. La glucosido hidrolasa puede ser una enzima de la clase 3.2.1, particularmente una enzima de las clases 3.2.1.1 a 3.2.I.3. En una realizacion, la glucosido hidrolasa es una amilasa. La amilasa puede seleccionarse entre a-amilasa, p-amilasa y Y-amilasa, mas particularmente amilasa 2, amilasa alfa 1A, amilasa alfa 1B, amilasa alfa 1C, amilasa alfa 2A, amilasa alfa 2B. En una realizacion, la amilasa es la a-amilasa.
Las amilasas son glucosidos hidrolasas y actuan sobre los enlaces a-1,4-glicosfdicos. Las amilasas descomponen los carbohidratos presentes en las glicoprotemas superficiales de las celulas tumorales. La amilasa se selecciona para mejorar la eficacia del tratamiento de las proenzimas de la proteasa proporcionando una interrelacion funcional o un enfoque multifuncional para tratar el cancer. La amilasa puede ser de origen humano, animal, bacteriano o vegetal. Por ejemplo, la a-amilasa se puede obtener de cualquiera de Aspergillus oryzae, Bacillus licheniformis, malta de cebada, pancreas de cerdo, pancreas humano, pancreas porcino y Triticum aestivum.
Agente reductor de la glucolisis citoplasmatica
En una realizacion, la expresion "agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica" significa un agente capaz de reducir la glicolisis citoplasmica. En otra realizacion, el agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica es la 2- desoxi-D-glucosa, o una sal, ester o profarmaco farmaceuticamente aceptable del mismo.
El agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica se selecciona para mejorar la eficacia del tratamiento de las proenzimas de proteasa al proporcionar una interrelacion funcional o un enfoque multifuncional para tratar el cancer.
El agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica puede ser un bloqueador o inhibidor de la glucolisis, por ejemplo, el oxamato, que es mas espedfico para las celulas que metabolizan anaerobicamente y puede inhibir la deshidrogenasa lactica, o el yodoacetato, que puede inhibir la glucolisis en la gliceraldetndo 3-fosfato deshidrogenasa.
Los inhibidores glucolfticos pueden incluir analogos lipofilos o profarmacos de 2-desoxi-D-glucosa. Los analogos lipofilos incluyen derivados de grupos hidroxilo como esteres, eteres, fosfoesteres. Otros incluyen la eliminacion del grupo hidroxilo y el reemplazo con halogenos como fluor o yodo, o con grupos tiol o tioalquilo. Se puede proporcionar 2-desoxi-glucosa formulada en liposomas y sus analogos o derivados de 2-desoxiglucosa escindibles enzimaticamente. Los ejemplos incluyen glucoronidos con glucosidos en la posicion C-1. Los analogos lipofflicos de 2-desoxi-D-glucosa, que pueden actuar como profarmacos de 2-desoxi-D-glucosa, tales como mono y diesteres de 2-desoxi-D-glucosa, pueden incluir ejemplos tales como valerato, miristato y palmitato.
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Los inhibidores glucol^ticos tambien pueden incluir 6-desoxi-D-glucosa, 6-fluoro-D-glucosa, 6-O-metil-D-glucosa, 6- tio-D-glucosa, 2-desoxi-D-glucosa en sf y su analogos, 2-desoxi-2-halo-D-glucosa, por ejemplo 2-bromo-, 2-fluoro o 2-yodo-D-glucosa, 3-desoxi o 3-fluoro-D-glucosa o 4-desoxi o 4-fluoro-D-glucosa, 2-fluoro o 3-fluoro-gliceraldetndos o gliceratos, por ejemplo, 3-fluoro-2-fosfoglicerato, acido 2-fluoro-propionico o sus sales, acido 2,2-difluoro- propionico, 3-halo-piruvato, acido 3-halopropionico, acido 2,2-tiometilacetico, 1-desoxi-D-glucosa, 5-tio-D-glucosa, 3- fluoro-D-glucosa y 4-fluoro-D-glucosa, 2-fluoro-, 2-yodo-, 2-tio o 2-metoxi-gliceraldehidos o gliceratos, 3-fluoro-, 3,3- difluoro-, enolasa 3-yodo-, 3-carboxilo y 3-tiogliceratos.
En una realizacion, la expresion "agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica" significa un compuesto de Formula IV:
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o una de sus sales, profarmacos o esteres farmaceuticamente aceptables, en donde: X se selecciona de O y S;
Ri se selecciona de H, halogeno, OH, -OC(O)R6;
R2 a R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, halogeno, OH, -OC(O)R6; R5 se selecciona de halogeno, OH, SH, -OC(O)R6; y
R6 es alquilo C1-20.
Halogeno significa preferiblemente F, Br o I, mas preferiblemente F. Cada una de las siguientes realizaciones pueden tomarse individualmente o en cualquiera de sus combinaciones. X es O. Ri es OH. R2 es H o F. R3 es OH o F. R4 es OH o F. R5 es OH, F o SH.
En otra realizacion, X es O, Ri se selecciona de OH, R2 se selecciona de H, Br, F, I, OH, -C(O)-OR6, en donde R6 se selecciona de alquilo C1-20, y de R3 a R5 es OH. Preferiblemente, R2 es H.
Agentes activos adicionales
Las composiciones farmaceuticas de la primera descripcion, segunda descripcion y duodecima descripcion de la invencion pueden comprender ademas otros agentes activos. La adicion de estos agentes activos puede mejorar el tratamiento del cancer. Usando este enfoque, uno puede ser capaz de lograr una eficacia terapeutica con dosis mas bajas de cada agente, reduciendo asf la posibilidad de efectos secundarios adversos. Tambien se pueden reducir los efectos secundarios no deseados y permitir el uso de dosis mas altas de cada agente. Los agentes activos adicionales pueden proporcionar funciones terapeuticas suplementarias, adicionales o mejoradas.
Las composiciones farmaceuticas de la primera descripcion, segunda descripcion y duodecima descripcion y la invencion pueden, por lo tanto, contener uno o mas de los siguientes agentes activos adicionales que proporcionan funciones terapeuticas suplementarias, adicionales o mejoradas:
Antioxidantes que incluyen vitamina C (acido ascorbico), vitamina E (tocoferoles, tocotrienoles), antioxidantes polifenolicos (resveratrol, flavonoides), carotenoides (licopeno, carotenos, lutema). El resveratrol ha demostrado tener capacidad antitumoral y quimiopreventiva, en particular el trans-resveratrol para el tratamiento de celulas humanas de cancer de mama.
La L-treanina, a saber, la gamma-glutametiletilamida o 5-N-etil-glutamina, que es un analogo del acido glutamico o derivado de aminoacido.
Curcuminoides, curcumina o sus derivados.
Beta glucanos (1-3, 1-6 beta-glucanos).
Cianuro de hidrogeno (HCN), por ej. los iones OSCN generados por LPO pueden acelerar la proteolisis. Extractos de fitonutrientes que incluyen flavanoles, xantofilas, liminoides.
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Inhibidores de la enzima proteasa, p. ej., la aprotinina tambien conocida como inhibidor de la tripsina pancreatica bovina. El uso de inhibidores enzimaticos en combinacion con las composiciones farmaceuticas puede facilitar la inhibicion de cualquier enzima proteasa que pueda estar presente en el sistema/cuerpo lejos de la celula tumoral y reducir as^ cualquier efecto indeseable de dichas enzimas activas.
Factores de crecimiento (por ejemplo, BMPs, TGF-P, FGF, IGF).
Citocinas (por ejemplo, interleuquinas y CDF).
Antibioticos
Factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogenica del factor de crecimiento fibroblastico acido o basico (FGF) o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, protema C, o protema S, un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2.
Cualquier otro agente activo beneficioso para tratar el cancer.
Cuando se usan otros agentes terapeuticos adicionales en combinacion con la proenzima proteasa o el agente activo de las descripciones primera y segunda, se pueden usar en cantidades como se indica en la Physician Desk Reference (PDR) o segun lo determinen los expertos en la tecnica.
Definiciones
"Activacion", en relacion con las proenzimas proteasas, significa la conversion in situ (por ejemplo, in vitro o in vivo) de la proenzima proteasa en una forma capaz de mejorar la adhesion celula a celula de las celulas tumorales, efectuar la proteolisis de las celulas tumorales o inducir la apoptosis celular en tumores, diferenciacion o inmunoreconocimiento.
La "apoptosis" es un proceso generalmente controlado, ordenado y cuidadoso de autodestruccion celular que puede ser desencadenado por diversos estfmulos. La apoptosis es menos invasiva que la necrosis, que puede danar el tejido circundante y causar inflamacion.
La "angiogenesis" se refiere a la formacion de vasos sangumeos, en particular la proliferacion de nuevos capilares a partir de vasos sangumeos preexistentes. La angiogenesis es necesaria para que las celulas cancerosas se conviertan en tumores porque las celulas cancerosas necesitan un suministro de sangre significativamente mayor que las celulas normales para sobrevivir. La angiogenesis o los eventos angiogenicos estan involucrados en una serie de procesos patologicos, en particular el crecimiento tumoral y la metastasis, y otras afecciones en las que se incrementa la proliferacion de los vasos sangumeos, especialmente del sistema microvascular, como la retinopatfa diabetica, la psoriasis y las artropatfas.
El termino "pericelular" significa en los tejidos que rodean una celula, cerca, sobre o dentro de estos. Mas particularmente, el termino significa en los tejidos que rodean una celula tumoral o dentro de estos.
El termino "intracelular" significa dentro de la celula.
Los terminos "diferenciacion" y "diferenciar", o variaciones similares de los mismos, significan la capacidad de las celulas para volverse mas especializadas para diferentes funciones. En un nivel, se considera que las celulas tumorales malignas son celulas que se han desdiferenciado, lo que significa que eran celulas mas especializadas que se han vuelto menos especializadas y, en el proceso, la capacidad del cuerpo para limitar el crecimiento de estas celulas malignas se ha visto comprometida. Por lo tanto, la diferenciacion de las celulas tumorales implica una transformacion de las celulas malignas, al menos en parte, hacia un tipo de celulas sanas o normales; lo que significa una transformacion de la celula maligna de manera que reduce las propiedades del crecimiento descontrolado, la invasion y/o la metastasis.
El termino "inmunoreconocimiento" significa reconocimiento por parte del sistema inmunologico y su posterior retirada o eliminacion por parte del sistema inmunitario. Una de las funciones del sistema inmunologico es identificar y eliminar tumores. Las celulas transformadas de los tumores expresan antfgenos que no se encuentran en las celulas normales. Para el sistema inmunologico, estos antfgenos parecen extranos y su presencia hace que las celulas inmunitarias ataquen las celulas tumorales transformadas. Algunas formas de celulas cancerosas tambien tienen la capacidad de prevenir o reducir el inmunoreconocimiento.
El termino "metastasis" o "metastatizar" variaciones similares de los mismos se refieren a la propagacion de una enfermedad desde un organo o parte del cuerpo a otro organo no adyacente o parte del cuerpo. Las celulas tumorales malignas y las infecciones tienen la capacidad de metastatizar. Por ejemplo, las celulas cancerosas pueden desprenderse o escapar de un tumor primario, entrar en los vasos linfaticos y sangumeos, circular a traves del torrente sangumeo y volverse a depositar en otras partes del cuerpo. Un nuevo tumor formado a partir de un tumor primario despues de la metastasis se denomina tumor secundario o metastasico y esta compuesto por las mismas celulas que el tumor primario u original. Por ejemplo, la metastasis del cancer de mama a los pulmones
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forma un tumor secundario que comprende celulas mamarias anormales, no celulas pulmonares anormales, y se denomina cancer de mama metastasico, no cancer de pulmon.
El termino "malignidad", "maligno" o variaciones similares de los mismos se refiere a la tendencia de las celulas cancerosas y los tumores a continuar creciendo y desarrollandose, lo que implica propiedades caractensticas de la anaplasia, invasividad y metastasis. Por ejemplo, un tumor maligno puede contrastarse con un tumor benigno no canceroso en el sentido de que un tumor maligno no es autolimitado en su crecimiento, es capaz de invadir tejidos adyacentes y puede propagarse a tejidos distantes (metastasis), mientras que un tumor benigno no tiene ninguna de esas propiedades.
"Anaplasia" se refiere a una inversion de la diferenciacion en las celulas, que es caractenstica de los tumores malignos. Este termino cubre una mayor capacidad de multiplicacion. La anaplasia implica falta de diferenciacion, mayor desdiferenciacion o mayor perdida de diferenciacion estructural y funcional presente en celulas normales.
La "proteolisis" es la degradacion dirigida (digestion) de las protemas por parte de las enzimas celulares llamadas proteasas o por la digestion intramolecular. Mas particularmente, la proteolisis es la descomposicion de las protemas por las enzimas proteasas que escinden, por hidrolisis, el enlace amida/peptido en las protemas.
Las expresiones "adhesion celula a celula", "moleculas de adhesion celular" o expresiones similares de las mismas se refieren a un intervalo de moleculas de adhesion celula a celula conocidas que generalmente estan ubicadas en la superficie exterior de una celula y que estan involucradas en la union de una celula con otra celula o celulas, siendo la E-cadherina y la p-catenina sus ejemplos. Diferentes tipos de celulas pueden tener formas alternativas de estas moleculas. Estas moleculas pueden ademas estar involucradas en la adhesion con la matriz extracelular. Otras moleculas de adhesion celula a celula pueden seleccionarse entre las familias de protemas de adhesion celular de cadherina, integrina, selectina e inmunoglobulina.
Los terminos "homologo" y "equivalente funcional" se tomaran para incluir otras protemas o variantes, como las moleculas conocidas dentro de la misma familia de protemas, ademas de las moleculas recombinantes.
Por "regulacion al alza" se entendera que esto incluye aumentar el nivel de expresion o actividad de la molecula en relacion con un nivel de referencia predeterminado. Esto puede ser un aumento de al menos 5% sobre el nivel de referencia. Particularmente preferida, sin embargo, sena una regulacion al alza de al menos 10%, 20% 30%, 40% o 50% o mas, en relacion con el nivel de referencia. El nivel de referencia se puede determinar por una variedad de medios, como, por ejemplo, de acuerdo con la expresion o actividad de la molecula antes del tratamiento, o de acuerdo con el nivel normal o esperado para un tipo de celula dado.
Metodos y usos
El uso de la quinta a la novena descripcion o de la decimotercera descripcion, o del metodo de la decima descripcion o de la decimocuarta descripcion, puede implicar uno o mas de los siguientes efectos: reduccion en la recurrencia de tumores malignos, reduccion en la metastasis de tumores malignos, reduccion en el numero o tamano de los tumores, diferenciacion de las celulas tumorales, expresion de p-catenina y E-cadherina en tumores malignos para facilitar la adhesion de celula a celula y la reduccion de la metastasis, reduccion de la capacidad de las celulas tumorales para prevenir el inmunoreconocimiento.
Una realizacion de las descripciones proporciona un metodo para diferenciar una celula cancerosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una proenzima proteasa y un agente activo de las descripciones primera y segunda durante un tiempo y en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion en la celula cancerosa. El uso de la quinta y sexta descripcion y el metodo de la septima descripcion pueden implicar la diferenciacion de una celula cancerosa. En una realizacion particular, la diferenciacion de las celulas cancerosas es la diferenciacion de las celulas de carcinoma de colon.
En una realizacion, el uso de la quinta a la novena descripcion o de la decimotercera descripcion, o el metodo de la decima descripcion o de la decimocuarta descripcion, es beneficioso cuando se usa para el tratamiento del cancer metastasico. La metastasis es la etapa del cancer donde la enfermedad se propaga a otras partes del cuerpo. Por lo tanto, la prevencion o el retraso de la metastasis es particularmente importante, ya que esta etapa se acompana de una reduccion marcada en el exito de otros tratamientos y una reduccion en la supervivencia del sujeto. En otra realizacion, se proporciona un medio seguro y eficaz para prevenir, retrasar o mejorar de otro modo la metastasis del cancer mediante la regulacion al alza de las moleculas de adhesion celula-celula en una celula cancerosa a traves de la administracion al sujeto de una cantidad efectiva de una proenzima proteasa y un agente activo de las descripciones primera y segunda.
"Tratar" o "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapeutico como a las medidas profilacticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir, mejorar, reducir o ralentizar (disminuir) el cancer o la diseminacion (metastasis) del mismo.
"Prevenir", "prevencion", "preventivo" o "profilactico" se refiere a evitar que ocurra, o impedir, salvaguardar o protegerse de la aparicion de una condicion, enfermedad, trastorno o fenotipo, incluida una anomalfa o smtoma. Un
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sujeto que necesita prevencion puede ser propenso a desarrollar la enfermedad.
El termino "mejorar" o "mejora" se refiere a una disminucion, reduccion o eliminacion de una afeccion, enfermedad, trastorno o fenotipo, incluida una anomalfa o smtoma. Un sujeto que necesita tratamiento puede tener previamente la condicion, o puede ser propenso a tener la condicion o puede ser uno en quien se debe prevenir la condicion.
El "sujeto" incluye un mairnfero. El mairnfero puede ser un ser humano, o puede ser un animal domestico, un animal de zoologico o un animal de comparMa. Si bien se contempla particularmente que las composiciones de la invencion para su uso en los metodos para el tratamiento medico de seres humanos tambien son aplicables al tratamiento veterinario, incluido el tratamiento de animales de comparMa como perros y gatos, y animales domesticos como caballos, vacas y ovejas, o animales de zoologico tales como felinos, canidos, bovidos y ungulados. Un sujeto puede padecer cancer u otro trastorno, o puede no padecer un cancer u otro trastorno (es decir, estar libre de una enfermedad detectable).
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de composicion, o agente o compuesto en la composicion, capaz de tratar, prevenir o mejorar el cancer o la diseminacion (metastasis) del mismo. Una cantidad terapeuticamente efectiva puede determinarse empmcamente y de manera rutinaria en relacion con el tratamiento del cancer, y dara como resultado una mayor esperanza de vida.
El uso de la quinta a la novena descripcion o de la decimotercera descripcion, o sus usos en un metodo de la decima descripcion o de la decimocuarta descripcion, puede implicar el tratamiento de neoplasias y afecciones relacionadas, canceres, tumores, afecciones malignas y metastasicas. Los tejidos y organos asociados con los tumores solidos y la metastasis que pueden tratarse con una proenzima proteasa y un agente activo de la primera y segunda descripcion incluyen, entre otros, tracto biliar, vejiga, sangre, cerebro, mama, cuello uterino, colon, endometrio, esofago, cabeza, cuello, rinon, laringe, hngado, pulmon, medula, melanina, ovario, pancreas, prostata, recto, rinon, retina, piel, estomago, testfculos, tiroides, tracto urinario y utero.
El uso de las descripciones quinta a novena o la descripcion decimotercera, o sus usos en un metodo de la decima descripcion o decimocuarta descripcion, es particularmente adecuado para tratar los canceres y los carcinomas metastasicos de los siguientes tipos: cancer de pancreas, cancer de esofago, cancer de colon, cancer de intestino, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de mama, melanoma maligno o cancer de pulmon.
El uso de la quinta a la novena descripcion o de la decimotercera descripcion, o su uso en un metodo de la decima descripcion o de la decimocuarta descripcion, puede proporcionar un enfoque de efectos multiples para tratar el cancer, por ejemplo, aumentando la apoptosis de las celulas tumorales, la adhesion celula a celula, la diferenciacion y la inmunogenicidad (reconocimiento y eliminacion por el sistema inmune). Por lo tanto, es beneficioso realizar un tratamiento en ausencia de cualquier otro tratamiento que pueda suprimir o danar el sistema inmunologico.
En una realizacion, el uso de las descripciones quinta a novena o la descripcion decimotercera, o su uso en un metodo de la decima descripcion o decimocuarta descripcion, implica el tratamiento de sujetos que tienen niveles bajos de expresion de E-cadherina y p-catenina. Tambien se pueden identificar otros grupos de pacientes que son particularmente adecuados para el tratamiento de acuerdo con el metodo o el uso de los aspectos anteriores.
El uso de la quinta a la novena descripcion o de la decimotercera descripcion, o su uso en un metodo de la decima descripcion o de la decimocuarta descripcion, puede complementarse con otros enfoques terapeuticos anticancengenos convencionales dirigidos al tratamiento o la prevencion de trastornos proliferativos (por ejemplo, tumor). Por ejemplo, tales metodos pueden usarse en la prevencion del cancer profilactico, la prevencion de la recurrencia del cancer y las metastasis despues de la cirugfa, y como adyuvante de otras terapias convencionales para el cancer.
Composiciones farmaceuticas, formulaciones y vfas de administracion.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, pueden formularse, por ejemplo, empleando vehnculos o diluyentes solidos o lfquidos convencionales, asf como aditivos farmaceuticos de un tipo apropiado para el modo de administracion deseado (por ejemplo, excipientes, aglutinantes, conservantes, estabilizantes, aromatizantes, etc.) de acuerdo con tecnicas tales como las bien conocidas en la tecnica de la formulacion farmaceutica.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima y la invencion, pueden administrarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por via oral, tal como en forma de comprimidos, capsulas, granulos o polvos; sublingualmente, bucalmente, parenteralmente, tal como mediante inyeccion o infusion subcutanea, intravenosa, intramuscular o intracisternal (por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables esteriles); por via nasal, tal como por pulverizacion por inhalacion; topicamente, tal como en forma de una crema o unguento; o por via rectal, tal como en forma de supositorios; en formulaciones de dosis unitarias que contienen vehnculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables y no toxicos. Pueden, por ejemplo, administrarse en una forma adecuada para la liberacion inmediata o prolongada, por ejemplo, mediante el uso de dispositivos tales como implantes subcutaneos, esferoides encapsulados o bombas osmoticas.
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Ademas de los primates, como, p. ej., seres humanos, se puede tratar una variedad de otros mairnferos de acuerdo con los metodos de la decima descripcion. Por ejemplo, se pueden tratar mairnferos que incluyen, entre otros, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedoras o murinas.
El termino "composicion", como se usa en este documento, pretende abarcar un producto que comprenda la proenzima proteasa y uno o mas agentes activos y, opcionalmente, uno o mas agentes activos adicionales, asf como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de los mismos.
La expresion "farmaceuticamente aceptable", como se usa en este documento, significa que el vehfculo, diluyente o excipiente no es perjudicial para el receptor de este.
Los terminos "administracion de" y "administrar" deben entenderse en el sentido de proporcionar a una persona que necesita tratamiento.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o la invencion, y las preparaciones o formulaciones de estos se pueden preparar mezclando los componentes de la composicion; a saber, las proenzimas de proteasa con uno o mas agentes activos, que incluyen un compuesto de selenio y/o un compuesto vaniloide. En una realizacion adicional de las descripciones, los componentes pueden incluir un agente activo adicional como se describe en el presente documento. La mezcla se puede realizar secuencial o simultaneamente.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica farmaceutica. Todos los metodos incluyen la etapa de poner juntos los agentes activos y la proenzima proteasa con el vehfculo que constituye uno o mas ingredientes accesorios. En general, las composiciones farmaceuticas se preparan poniendo juntos de manera uniforme e mtima los agentes activos y las proenzimas de proteasa con un vehfculo lfquido o un vehfculo solido finamente dividido o ambos, y luego, si es necesario, conformando el producto en la formulacion deseada. Los agentes activos y las proenzimas de proteasa de las descripciones se proporcionan en una forma de unidad de dosis en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado sobre el proceso o el estado de las enfermedades despues de la administracion unica o repetida.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, tabletas, pastillas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, capsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas a uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica para la fabricacion de composiciones farmaceuticas y tales composiciones pueden contener uno o mas agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmaceuticamente elegantes y sabrosas. Los comprimidos contienen la proenzima proteasa y el agente activo de la primera y segunda descripcion en mezcla con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulacion y desintegracion, por ejemplo, almidon de mafz o acido algmico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidon, gelatina o goma arabiga, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, acido estearico o talco. Los comprimidos pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse mediante tecnicas conocidas para retrasar la desintegracion y absorcion en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una accion sostenida durante un penodo mas largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo temporal tal como el monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Tambien pueden recubrirse para formar comprimidos terapeuticos osmoticos para el control de la liberacion.
Las formulaciones para uso oral tambien pueden presentarse como capsulas de gelatina dura en las que la proenzima proteasa y el agente activo de las descripciones primera y segunda se mezclan con un diluyente solido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolm, o como capsulas de gelatina blanda en donde la proenzima proteasa y el agente activo de las descripciones primera y segunda se mezclan con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina lfquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas de las descripciones contienen el agente activo y la proenzima proteasa en mezcla con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Los excipientes son agentes de suspension, por ejemplo, la carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arabiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfatido natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenooxicetanol o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y un hexitol, como el monooleato de polioxietileno sorbitol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y anhfdridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de polietileno sorbitan. Las suspensiones acuosas tambien pueden contener uno o mas
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conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes saborizantes y uno o mas agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el agente activo y la proenzima proteasa en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco, o en un aceite mineral como la parafina lfquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetilico. Agentes edulcorantes tales como los expuestos anteriormente, y agentes saborizantes pueden agregarse para proporcionar una preparacion oral sabrosa. Estos pueden conservarse mediante la adicion de un antioxidante como el acido ascorbico.
Los polvos y granulos dispersables adecuados para la preparacion de una suspension acuosa mediante la adicion de agua proporcionan la proenzima proteasa y el agente activo de la primera y segunda descripcion en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspension y uno o mas conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspension se ejemplifican por los ya mencionados anteriormente. Tambien pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, tambien pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina lfquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo, goma arabiga o goma tragacanto, fosfatidos naturales, por ejemplo, soja, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de acidos grasos y anhfdridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitan y productos de condensacion de dichos esteres parciales con oxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitano. Las emulsiones tambien pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.
Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Tambien pueden contener agentes demulcentes, conservantes, aromatizantes y colorantes.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, pueden estar en forma de una suspension acuosa u oleaginosa inyectable esteril. Esta suspension puede formularse de acuerdo con la tecnica conocida usando aquellos agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspension que se han mencionado anteriormente. Las composiciones farmaceuticas de la primera y segunda descripcion tambien pueden ser una solucion o suspension inyectable esteril en un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solucion en 1,3-butano-diol. Entre los vehfculos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan el agua, la solucion de Ringer y la solucion isotonica de cloruro de sodio. Ademas, los aceites fijos esteriles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspension. Para este proposito, se puede emplear cualquier aceite fijo insfpido, incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Ademas, los acidos grasos como el acido oleico encuentran uso en la preparacion de inyectables.
En una realizacion particular, las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, se formulan como supositorios para la administracion rectal del farmaco. Estas formulaciones se pueden preparar mezclando la proenzima proteasa y el agente activo de las descripciones primera y segunda con un excipiente no irritante adecuado que sea solido a temperaturas ordinarias, pero lfquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundira en el recto para liberar el farmaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles. La administracion rectal se puede usar para eliminar el efecto de primer paso entero- hepatico en el tracto gastrointestinal relacionado con la administracion oral de enzimas.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, tambien pueden formularse en liposomas. Como se sabe en la tecnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolfpidos u otras sustancias lipfdicas. Los liposomas estan formados por cristales lfquidos hidratados mono- o multilamelares que se dispersan en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lfpido no toxico, fisiologicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. La formulacion de liposomas puede contener estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lfpidos preferidos son los fosfolfpidos y fosfatidilcolinas, tanto naturales como sinteticos. Los metodos para formar liposomas son conocidos en la tecnica.
Las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administracion. Las proenzimas de proteasa y los agentes activos y, opcionalmente, el agente activo adicional, de la composicion farmaceutica se pueden proporcionar como componentes separados en el contenedor, paquete o dispensador, para ser tomados por separado o juntos en el mismo momento, o diferente, en el uso de la quinta a la novena descripcion o su uso en un metodo de la decima descripcion.
Dosis y cantidades terapeuticamente eficaces
Un nivel de dosificacion apropiado para las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda, o la descripcion duodecima o de la invencion, sera generalmente de aproximadamente 0,01 a 500 mg por kg de peso corporal por dfa por paciente, que puede administrarse en dosis unicas o multiples. Puede ser de aproximadamente
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0,1 a aproximadamente 250 mg/kg por d^a; o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg/kg por d^a. Un nivel de dosificacion adecuado puede ser de aproximadamente 0,01 a 250 mg/kg por dfa, de aproximadamente 0,05 a 100 mg/kg por dfa, o de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg por dfa. Dentro de este intervalo, la dosis puede ser de 0,05-0,5, 0,5-5 o 5-50 mg/kg por dfa. Para la administracion oral, las composiciones farmaceuticas de las descripciones primera y segunda pueden proporcionarse en forma de comprimidos que contienen 1,0-4000 miligramos de la proenzima proteasa y el agente activo, particularmente 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0,
100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 750,0, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, y 4000 miligramos de la proenzima proteasa y el agente activo para el ajuste sintomatico de la dosis al paciente a tratar. Las composiciones farmaceuticas como se describen en el presente documento pueden administrarse en un regimen de 1 a 4 veces por dfa, una o dos veces por dfa, o una vez al dfa, con requisitos reducidos de administracion que generalmente conducen a un mayor cumplimiento.
La dosis puede variar ampliamente dependiendo de si se administra una unica forma de administracion de la composicion y si el compuesto vaniloide se incluye como agente activo en la composicion o tableta (u otra forma de administracion). Tfpicamente, los compuestos vaniloides tales como un capsiato o una capsaicina pueden proporcionarse en dosis relativamente grandes de entre 0,1 a 5 g y, mas particularmente, de aproximadamente 1-2 g por administracion.
Una administracion unica adecuada para una realizacion de las composiciones farmaceuticas como se describe en el presente documento puede comprender:
• Tripsinogeno en una cantidad de entre 1-100 mg, particularmente 2-50 mg, mas particularmente (en mg)
1.0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0;
• Quimotripsinogeno en una cantidad de entre 1-100 mg, particularmente 2-50 mg, mas particularmente (en mg) 1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0;
• Compuesto de selenio en una cantidad de entre 0,01-3 mg, particularmente 0,1-1 mg, mas particularmente (en mg) 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 1,0;
• Compuesto vaniloide en una cantidad de entre 0,1-4000 mg, particularmente 0,5-3000 mg, mas particularmente (en mg) 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000;
• Amilasa en una cantidad de entre 0,1 y 100 mg, particularmente 1-15 mg, mas particularmente 1,0, 2,0, 3,0,
4.0, 5,0, 7,5, 10,0, 15,0;
• 2-Desoxi-D-glucosa en una cantidad de entre 0,1-100 mg, particularmente 1-15 mg, mas particularmente
1.0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 7,5, 10,0, 15,0.
Sin embargo, se entendera que el nivel de dosis espedfico y la frecuencia de dosificacion para cualquier paciente particular pueden variar y dependera de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto espedfico empleado, la estabilidad metabolica y la duracion de la accion de ese compuesto, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y el momento de la administracion, la tasa de excrecion, la combinacion de medicamentos, la gravedad de la afeccion en particular y el huesped que recibe la terapia.
Los niveles de dosificacion adecuados para los diversos componentes (si estan presentes) de una realizacion de las composiciones farmaceuticas como se describe en el presente documento, pueden comprender:
• Quimotripsinogeno en una cantidad de al menos 0,2 mg/kg, o en un intervalo de 0,2-5 mg/kg, en un intervalo de 0,5 a 2,0 mg/kg, o aproximadamente 0,8 mg/kg;
• Tripsinogeno en una cantidad inferior a 0,5 mg/kg, o en un intervalo de 0,01 a 0,4 mg/kg, o en un intervalo de 0,05 a 20 mg/kg, o aproximadamente 0,1 mg/kg;
• Metilselenocistema en una cantidad de al menos 0,0001 mg/kg, o en un intervalo de 0,001-0,01 mg/kg, en un intervalo de 0,002-0,005 mg/kg, o aproximadamente 0,003 mg/kg;
• Capsiato en una cantidad de al menos 1 mg/kg, o en un intervalo de 5-500 mg/kg, o en un intervalo de 10100 mg/kg, o aproximadamente 30 mg/kg;
• Amilasa en una cantidad de al menos 0,001 mg/kg, o en un intervalo de 0,01-0,1 mg/kg, en un intervalo de 0,02-0,05 mg/kg, o aproximadamente 0,03 mg/kg;
• 2-Desoxi-D-glucosa en una cantidad de al menos 1 mg/kg, o en un intervalo de 5-500 mg/kg, o en un intervalo de 10-100 mg/kg, o aproximadamente 30 mg/kg.
Una relacion adecuada en % en peso para los diversos componentes (si estan presentes) de una realizacion de las composiciones farmaceuticas como se describe en el presente documento, puede comprender:
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quimotripsinogeno:tripsinogeno:amilasa:2-desoxiglucosa:capsiato:metilselenocistema en una proporcion de 200400:25-75:5-15:5.000-20.000:5.000-20.000:0,1-10, o aproximadamente 300:50:10:10.000:10.000:1.
Las concentraciones adecuadas para los diversos componentes (si estan presentes) de las composiciones farmaceuticas como se describen en el presente documento, que pueden ser particularmente efectivas si estan presentes en la superficie de una celula tumoral, o cerca de esta, pueden comprender:
Quimotripsinogeno en una concentracion de al menos 0,5 mg/ml, o en un intervalo de 1-2 mg/ml;
Tripsinogeno en una concentracion inferior a 0,25 mg/ml, o en un intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml;
Amilasa en una concentracion de al menos 0,01 mg/ml, o en un intervalo de 0,02-0,1 mg/ml;
Compuesto vaniloide en una concentracion de al menos 5 mg/ml, o en un intervalo de 10-20 mg/ml;
2-Desoxi-D-glucosa en una concentracion de al menos 5 mg/ml, o en un intervalo de 10-20 mg/ml;
Compuesto de selenio en una concentracion de menos de 0,01 mg/ml, o en un intervalo de 0,001-0,005 mg/ml.
Puede proporcionarse una mejor actividad mas para las composiciones farmaceuticas si la concentracion, o cantidad relativa, del compuesto de selenio se mantiene dentro de un intervalo espedfico cuando esta presente. La concentracion de metilselenocistema puede ser inferior a 0,01 mg/ml, inferior a 0,005 mg/ml, inferior a 0,001 mg/ml, inferior a 0,0005 mg/ml o en el intervalo de 0,0005 a 0,01 mg/ml, o el intervalo de 0,001 a 0,005 mg/ml.
Formulacion de Proenzima Quimotripsinogeno/Tripsinogeno
Se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una primera y una segunda proenzima proteasa capaz de activarse en la superficie, o cerca de esta, de una celula tumoral para mejorar la adhesion celula a celula de las celulas tumorales, efectuar la proteolisis de las celulas tumorales o inducir la apoptosis de las celulas tumorales, diferenciacion o inmunoreconocimiento, en el que la primera proenzima proteasa es quimotripsinogeno y la segunda proenzima proteasa es tripsinogeno, y la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno esta en el intervalo de 4:1 a 8:1. La composicion farmaceutica puede comprender ademas uno o mas agentes activos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.
En una realizacion, la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno esta en el intervalo de entre 5:1 a 7:1, preferiblemente de 6:1.
Formulacion del agente activo
Se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un primer y segundo agente activo, cada uno capaz de inducir actividad intracelular en celulas tumorales, en el que el primer agente activo es un compuesto de selenio y el segundo agente activo es un agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica.
En una realizacion, la actividad intracelular es la apoptosis de celulas tumorales, inmunoreconocimiento o diferenciacion. El compuesto de selenio y/o el agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica comportan un compuesto como se describe en las realizaciones anteriores. Preferiblemente, el compuesto de selenio es metilselenocistema. Preferiblemente, el agente de reduccion de la glucolisis citoplasmica es 2-desoxi-D-glucosa.
La composicion farmaceutica puede comprender ademas una proenzima proteasa de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. La composicion farmaceutica puede comprender ademas un agente activo seleccionado de un compuesto vaniloide y una glicosida hidrolasa de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.
Metodos de deteccion e identificacion
Una realizacion adicional proporciona un metodo para identificar un agente util en la regulacion al alza de la expresion de moleculas de adhesion celula-celula de una o varias celulas cancerosas, comprendiendo el metodo poner en contacto una celula cancerosa o moleculas de adhesion celula-celula de la celula cancerosa con una composicion como se describio anteriormente en este documento, que agrega un agente de prueba, monitorea o mide el nivel de adhesion celula-celula o de expresion de moleculas de adhesion celula-celula y evalua el efecto del agente de prueba. La seleccion de bibliotecas qmmicas de compuestos pequenos y la deteccion de expresion de anticuerpos son ejemplos de fuentes disponibles de agentes de prueba que pueden evaluarse facilmente utilizando este tipo de procedimientos. Por ejemplo, el cribado qmmico de alto rendimiento (HTS) se puede utilizar facilmente para cribar miles de moleculas, como agentes qmmicos o anticuerpos, mediante robotica y placas de microtitulacion. Para desarrollar una deteccion de este tipo, es necesario proporcionar un ensayo de deteccion adecuado que se realice durante la deteccion. Este ensayo de deteccion incorporana una molecula de adhesion celula-celula o una celula cancerosa como una celula cancerosa metastasica. El ensayo incluina celulas de referencia y, opcionalmente, ofrecena la comparacion de la adicion de compuestos de prueba, proenzimas y enzimas opcionales. De manera
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similar, las tecnicas de expresion de fagos pueden utilizarse facilmente para proporcionar un metodo de alto rendimiento para la evaluacion de agentes potenciales utiles en la regulacion al alza de la expresion de moleculas de adhesion celula-celula de celulas cancerosas.
Puntos generales
Cualquier discusion de documentos, actuacion, materiales, dispositivos, artmulos o similares que se haya incluido en la presente memoria descriptiva es unicamente con el proposito de proporcionar un contexto para la presente invencion. No debe tomarse como una admision de que alguno o todos estos asuntos forman parte de la base del estado de la tecnica o eran de conocimiento general comun en el campo relevante para la presente invencion, tal como existfa en Australia antes de la fecha de prioridad de cada reivindicacion de esta solicitud.
Las presentes realizaciones deben considerarse en todos los aspectos ilustrativas y no restrictivas.
Tal como se utiliza en la memoria descriptiva, las formas singulares "un" "uno/una" y "el/la" incluyen a las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "un disolvente" incluye mezclas de disolventes, la referencia a "un agente" incluye mezclas de dos o mas de dichos agentes, y similares.
En las reivindicaciones que siguen y en la descripcion anterior de la invencion, excepto cuando el contexto requiera lo contrario debido al lenguaje expreso o la implicacion necesaria, la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se usan en un sentido inclusivo; es decir, para especificar la presencia de las caractensticas indicadas, pero no para excluir la presencia o adicion de caractensticas adicionales en las diversas realizaciones de la invencion.
Materiales y metodos
Con el fin de que la naturaleza de la presente invencion pueda entenderse mas claramente, los detalles tecnicos se describiran a continuacion con referencia a los siguientes experimentos y ejemplos.
Experimento 1: Identificacion del mecanismo de accion de las proenzimas.
Se realizo una investigacion de los efectos y mecanismos involucrados en el tratamiento de lmeas celulares de cancer con composiciones farmaceuticas que comprendfan tripsinogeno y quimotripsinogeno en tres tipos diferentes de lmeas celulares. Las lmeas celulares utilizadas fueron Pancl: una lmea celular de carcinoma ductal pancreatico humano, Caco2: una lmea celular de adenocarcinoma de colon humano, y OE33: una lmea celular de adenocarcinoma esofagico.
Todas las lmeas celulares se mantuvieron en matraces de cultivo T 75 a 37°C en una atmosfera humidificada que contema 5% de CO2. Los medios utilizados para mantener las celulas en cultivo fueron: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) para PANC1; Medio mmimo esencial de Eagle (EMEM) para CaCO2 y medio RPMI 1640 para OE33 (Invitrogen, Merelbeke, Belgica). Todos los medios se complementaron con suero bovino fetal al 10% (FBS; Invitrogen), 100 Ul/ml de penicilina (Invitrogen), 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen) y L-glutamina 2 mM (Sigma).
El tripsinogeno (Try) y el a-quimotripsinogeno (Chy) se pueden comprar en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se pueden obtener de origen pancreatico bovino. Las formulaciones se proporcionaron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS, Sigma) y se diluyeron cuando fue necesario con suero bovino fetal al 10%.
Se prepararon y probaron una serie de formulaciones, y se codificaron de acuerdo con la Tabla 1 a continuacion.
Tabla 1: Codigos de Formulacion
Codigo de Formulacion
Combinacion
B:
Quimotripsinogeno; Tripsinogeno y Elastasa
C:
Placebo
J:
Quimotripsinogeno; Tripsinogeno y a-Amilasa
T:
Quimotripsinogeno y Tripsinogeno
Se prepararon varias concentraciones para obtener una comprension de la concentracion de la formulacion que efectua la viabilidad celular. Sobre la base de una concentracion inicial original de cada mezcla designada como 1 *, se codificaron y conformaron seis diluciones diferentes de cada una de las formulaciones, como se muestra en la Tabla 2 a continuacion.
Tabla 2: Concentraciones de enzimas
Dilucion
Concentraciones de enzimas
0,25x
Tripsinogeno: 0,00325 mg/ml
a-Quimotripsinogeno: 0,00325 mg/ml
a-Amilasa: 0,00075 mg/ml
Elastasa: 0,0005 mg/ml
0,5x
Tripsinogeno: 0,0065 mg/ml
a-Quimotripsinogeno: 0,0065 mg/ml
a-Amilasa: 0,015 mg/ml
Elastasa: 0,001 mg/ml
1x
Tripsinogeno: 0,013 mg/ml
a-Quimotripsinogeno: 0,013 mg/ml
a-Amilasa: 0,003 mg/ml
Elastasa: 0,002 mg/ml
1,25x
Tripsinogeno: 0,0162 mg/ml
a-Quimotripsinogeno: 0,0162 mg/ml
a-Amilasa: 0,00375 mg/ml
Elastasa: 0,0025 mg/ml
2,5x
Tripsinogeno: 0,0325 mg/ml
a-Quimotripsinogeno: 0,0325 mg/ml
a-Amilasa: 0,0075 mg/ml
Elastasa: 0,005 mg/ml
5x
Tripsinogeno: 0,065 mg/ml
a-Quimotripsinogeno: 0,065 mg/ml
a-Amilasa: 0,015 mg/ml
Elastasa: 0,01 mg/ml
Para obtener una correlacion entre la densidad optica y el numero de celulas, se sembro un numero de celulas conocido y, despues de unir las celulas, las celulas se tineron con sulforodamina B (SRB). Este metodo proporciono 5 datos de absorbancia o densidad optica de las celulas despues de la tincion y permitio el desarrollo de curvas estandar para convertir la absorbancia en el numero de celulas para cada tipo de celula como se muestra en la FIG. 1.
Efecto de las formulaciones en lmeas celulares de prueba
Para determinar el efecto citotoxico de las formulaciones sobre las lmeas celulares de prueba, las celulas se 10 colocaron en placas y se trataron con las formulaciones. El efecto se evaluo mediante ensayo de protemas y microscopfa.
Se uso la tincion de la protema SRB para probar el efecto de diferentes formulaciones sobre la proliferacion celular. El tinte se une a los aminoacidos basicos de las protemas celulares y, a traves de la evaluacion colorimetrica, proporciona una estimacion de la masa proteica total, que esta relacionada con el numero de celulas. Los valores de 15 la concentracion inhibitoria maxima media (CI50) se determinaron a partir de curvas de log-lineal dosis-respuesta
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para cada formulacion.
Dfa 1: Se sembraron celulas en placas de cultivo de 24 pocillos a baja densidad (1000-3000 celulas por pocillo, dependiendo del tipo de celula). Las lmeas celulares utilizadas fueron Panc1: lmea celular de carcinoma ductal pancreatico humano, Caco2: lmea celular de cancer colorrectal, OE33: lmea celular de cancer de esofago y HEK293. HEK293 es una lmea celular transformada derivada de rinon embrionario humano. Se uso una placa de cultivo de 24 pocillos de cada lmea celular para probar cada una de las diferentes formulaciones de combinacion. Cada una de las diluciones de la formulacion se probo en cuatro pocillos. Se uso una placa de cultivo de 24 pocillos de cada lmea celular como control, se sembro el mismo numero de celulas y se cambio el medio cuando las celulas se trataron.
Dfa 2: Se retiro el medio y se anadio a las celulas medio recien preparado que contema las diferentes diluciones de las formulaciones.
Dfa 5: Se elimino de nuevo el medio y se anadio a las celulas medio recien preparado que contema las diferentes diluciones de las formulaciones.
Dfa 6 o 7: Las celulas se fijaron con 10% de acido tricloroacetico (TCA) fno (4°C). Tras una suave aspiracion del medio, se anadio TCA a los pocillos. Las placas se dejaron durante 30 min a 4°C, se lavaron 3 veces con agua desionizada y se dejaron secar a temperatura ambiente durante al menos 24 h.
Las celulas fijas se tineron con SRB de la siguiente manera. Se anadio 1 ml de 0,4% de SRB (p/v en solucion de acido acetico al 1%) a cada pocillo y se dejo a temperatura ambiente durante 20 min. Se retiro el SRB y las placas se lavaron 3 veces con acido acetico al 1% antes de secar al aire. La SRB unida se solubilizo con 500 ml de solucion de base Tris 10 mM y las placas se dejaron en un agitador de placas durante al menos 10 minutos. Se transfirieron 100 ml de cada pocillo a un pocillo de una placa de 96 pocillos; esto se realizo 3 veces por pocillo de la placa de 24 pocillos. La absorbancia se leyo en un lector de placas de 96 pocillos a 492 nm.
Efecto de las formulaciones sobre la viabilidad de la lmea celular de cancer de esofago (OE33)
Las celulas OE33 se sembraron a una densidad de 3000 celulas/ml (Dfa 1). Las celulas fueron tratadas con 0,25 x; 0,5 x; 1 x; 1,25 x; 2,5 x y 5 x de las diferentes formulaciones en el Dfa 2 y el Dfa 5. Las celulas se fijaron en el dfa 7.
Microscopicamente, el tratamiento con la formulacion B hizo que las celulas mostraran una morfologfa redondeada, lo que tambien causo la contraccion celular y un mayor desprendimiento. Por lo tanto, despues de 48 horas de incubacion, solo quedaron unidas unas pocas celulas y los restos celulares y las celulas flotantes eran visibles en el medio (Figura 2).
Los resultados observados por microscopfa optica fueron corroborados por el ensayo de tincion de la protema SRB. La Tabla 3 muestra el valor medio para 4 pocillos replicados de cada tratamiento, el efecto sobre la muerte celular de la formulacion B fue dependiente de la concentracion; 2,5 x y 5 x matan todas las celulas en los pocillos. El valor de CI50 se obtuvo representando la absorbancia frente a la concentracion, como se muestra en la FIG. 3.
El control, que se muestra como la DO para la concentracion 0, fue la media de 24 pocillos duplicados. En el momento de la fijacion, todos los 24 pocillos de la placa de control eran completamente confluentes.
Tabla 3: Efecto de diferentes concentraciones de la formulacion B en las celulas OE33
CONC (1)
OE33 B (1)
0
0,851
0,4
0,819
0,2
0,814
1
0,812
1,25
0,815
2,5
0,076
5
0,076
Efecto de las formulaciones en celulas de carcinoma de conducto pancreatico humano (panc1)
Las celulas Panc1 se sembraron a una densidad de 20.000 celulas/ml (dfa 1). Las celulas fueron tratadas con 0,25
x; 0,5 x; 1 x; 1,25 x; 2,5 x y 5 x de las diferentes formulaciones el d^a 2 y el dfa 4. Las celulas se fijaron en el dfa 5. La formulacion de control C a las concentraciones probadas no tuvo ningun efecto sobre la viabilidad de las celulas Panel (datos no mostrados). Microscopicamente, las formulaciones B, J y T mostraron un efecto sobre la viabilidad celular, las celulas tratadas con 2,5 x y 5 x de estas formulaciones se redondearon y murieron (datos no mostrados).
5 Los resultados observados por microscopfa optica fueron corroborados por el ensayo de tincion de la protema SRB. La Tabla 4 muestra el valor medio para 4 pocillos replicados de cada concentracion de las formulaciones utilizadas. El efecto sobre la muerte celular de la formulacion B, J y T dependio de la concentracion; 2,5 x y 5 x matando a todas las celulas en los pocillos como se muestra en la FIG. 4. El valor de IC50 se obtuvo representando la absorbancia frente a la concentracion como se muestra en la FIG. 4. El control, que se muestra como la DO para la 10 concentracion 0, fue la media de 24 pocillos duplicados.
Tabla 4 Efecto de las formulaciones B, J y T en las celulas Pancl
CONCENTRACION
B J T
OD OD OD
0
0,442 0,442 0,442
0,4
0,447 0,542 0,514
0,2
0,465 0,548 0,529
1
0,440 0,517 0,538
1,25
0,450 0,501 0,599
2,5
0,237 0,284 0,511
5
0,063 0,046 0,076
Efecto de las formulaciones sobre celulas del cancer colorrectal (Caco2)
Se sembraron celulas Caco2 a una densidad de 20.000 celulas/ml (dia 1). Las celulas fueron tratadas con 0,25 x; 15 0,5 x; 1 x; 1,25 x; 2,5 x y 5 x de las diferentes formulaciones, el dfa 2 y el dfa 4. Las celulas se fijaron en el dfa 5. La
formulacion C a las concentraciones probadas no tuvo ningun efecto sobre la viabilidad de las celulas Caco2, despues del tratamiento en el dfa 5, las celulas mostraron una monocapa confluente y saludable (datos no mostrados).
El ensayo de tincion de la protema SRB (Tabla 5) muestra el valor medio de 4 pocillos replicados de cada 20 concentracion de las formulaciones utilizadas, el efecto sobre la muerte celular de la formulacion B, J y T fue dependiente de la concentracion: 2,5 x y 5 x eliminadas todas las celulas en los pocillos como se muestra en la FIG. 5. La menor concentracion de estas tres formulaciones no tuvo efecto en la viabilidad celular, como se puede observar, las densidades opticas (OD) registradas no fueron significativamente diferentes del grupo de control. El control fue la media de 24 pocillos duplicados, en el momento de la fijacion, todos los 24 pocillos de la placa de 25 control eran completamente confluentes.
Tabla 5: Efecto de las formulaciones B, J y T sobre las celulas Caco2
CONC (1)
B (1) J (1) T (1)
0
0,421 0,421 0,421
0,4
0,370 0,387 0,440
0,2
0,393 0,440 0,431
1
0,384 0,429 0,515
1,25
0,395 0,458 0,478
2,5
0,251 0,131 0,304
5
0,078 0,074 0,176
Los tratamientos B, J y T tienen un efecto toxico en todos los tipos de celulas probados. La concentracion de las formulaciones B, J y T que muestran un efecto sobre la viabilidad celular fue de 2,5 * y 5 *. Despues del tratamiento, las celulas muestran una morfologfa redondeada, encogimiento celular y aumento del desprendimiento.
Determinacion de IC50 de las formulaciones
5 El valor de CI50 para cada formulacion se obtuvo representando la absorbancia frente a la concentracion. La IC50 de las diferentes formulaciones se obtuvo para las lmeas celulares: Caco2, Pancl y OE33 cuando se administro dos veces en una semana. Los valores finales de CI50 (con las correspondientes concentraciones reales de mg/ml) se utilizaron en los ensayos celulares posteriores.
Tabla 6A: CI 50 de las formulaciones en Pancl
B (2,4x) J (2,5x) T(2,5x)
Tripsinogeno (mg/ml)
0,031 0,0032 0,0032
Quimotripsinogeno (mg/ml)
0,031 0,0032 0,0032
Elastasa(mg/ml)
0,0048 0,0075 -
10
Tabla 6B: CI 50 de formulaciones en celulas OE33
B (2,4x) J (2,5x) T (2,5x)
Tripsinogeno (mg/ml)
0,031 0,0032 0,0032
Quimotripsinogeno (mg/ml)
0,031 0,0032 0,0032
Elastasa (mg/ml)
0,0048 0,0075 -
Tabla 6C: CI 50 de formulaciones en celulas Caco2
B (2,5x) J (2,4x) T (2,5x)
Tripsinogeno (mg/ml)
0,032 0,031 0,032
Quimotripsinogeno (mg/ml)
0,032 0,0031 0,0032
Elastasa (mg/ml)
0,005 0,0072 -
15 Expresion de marcadores de adhesion celular
Se investigaron los cambios en la expresion de los marcadores de adhesion celular de p-catenina y E-cadherina en celulas Pancl, OE33 y Caco2 despues del tratamiento con la concentracion de CI50 de las formulaciones J y T.
Las celulas se trataron con la concentracion de CI50 de las formulaciones. Las celulas se recogieron, se lavaron tres veces con solucion salina tamponada con fosfato PBS y se fijaron con paraformaldel'ndo al 4% en PBS durante 30 20 minutos. Las celulas se lavaron tres veces con PBS y se fijaron posteriormente con acetona/metanol (1:1) enfriado con hielo durante 5 minutos a -20°C. Las celulas se lavaron tres veces en PBS y se bloquearon en solucion de tampon de bloqueo al 2% durante 1 hora temperatura ambiente. Las celulas se incubaron durante la noche en un anticuerpo primario diluido en una solucion tampon de bloqueo a 4°C. Las celulas se lavaron tres veces en PBS y luego se incubaron durante 2 horas con anticuerpos secundarios en una solucion tampon de bloqueo. Las celulas se 25 lavaron tres veces en PBS y se incubaron 15 minutos en 1:1000 DAPI/PBS (para demostrar la tincion nuclear) a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos con medios de montaje. Los controles se realizaron con celulas no tratadas.
La tincion por inmunofluorescencia indirecta se realizo utilizando anticuerpos monoclonales producidos contra E- cadherina (Transduction Labs BD Biosciences Clone 36) y p-catenina (Transduction Labs BD Biosciences Clone 14). 30 El anticuerpo secundario utilizado es la fluorescema anti-raton de caballo (Vector Labs FI2000).
El incremento de la expresion de p-catenina y E-cadherina despues del tratamiento con las formulaciones probadas se cuantifico midiendo la intensidad de fluorescencia de las muestras bajo microscopfa de fluorescencia; se midieron diferentes campos de una misma muestra y la media de las colecciones de intensidad se muestra en Tabla 7.
5
10
15
20
25
30
Tabla 7: Media de la intensidad de fluorescencia de las celulas tratadas con las formulaciones J y T
Panc1 Caco2 OE33
J T J T J T
E-cadherina
21,99 33,59 78,03 73,13 47,27 -
Control
12,92 10,02 10,59 12,43 6,06 -
p-catenina
32,92 42,92 64,20 67,05 34,62 -
Control
10,58 9,32 11,92 5,92 16,22 -
Resumen
Las celulas Panc1, Caco2 y OE33, cuando se trataron con la concentracion de CI50 de las formulaciones J y T, mostraron un aumento en la intensidad de la inmunofluorescencia cuando se compararon con las celulas no tratadas. Esto se correlaciona con un aumento en la expresion de p-catenina y E-cadherina en celulas cancerosas en comparacion con las celulas de control, como se muestra en las Figs. 6 a 13. La p-catenina y la E-cadherina se muestran en verde y los nucleos se muestran en azul.
Ejemplo 1: Formulaciones mejoradas de proenzimas
Se realizo un estudio para determinar el efecto de la formulacion de proenzima que comprende tripsinogeno (pT), quimotripsinogeno (pC) y a-amilasa (A) (formulacion denominada JBp1) sobre el crecimiento de 24 lmeas celulares de cancer. Sobre la base de los valores de IC50 y de inhibicion maxima generados en este estudio inicial, se seleccionaron tres lmeas celulares para comprender mejor los efectos de los tres componentes individuales en JBp1 sobre el crecimiento de las celulas cancerosas. El estudio aplico el metodo isobolografico para comprender la interaccion entre los tres componentes de JBp1: a-amilasa, tripsinogeno y quimotripsinogeno. Sobre la base de los resultados obtenidos, se propuso y probo una formulacion mejorada (JBplvP) en estudios isobolograficos con una segunda formulacion que comprendfa 2-desoxi-D-glucosa (D), capsiato (C) y metilselenocistema (M).
Resumen
Las propiedades inhibitorias del crecimiento celular de la formulacion de proenzima JBp1 se estudiaron en un panel de 24 lmeas celulares de cancer humano. Se obtuvieron valores de CI50 para la mayona de las lmeas celulares en este panel. Sobre la base de los valores de CI50 y la inhibicion maxima del crecimiento, se seleccionaron tres lmeas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2 para estudios de combinacion adicionales utilizando el metodo isobolografico. El uso de isobologramas permitio el estudio del nivel de interaccion entre los tres componentes individuales de JBp1: a-amilasa, tripsinogeno y quimotripsinogeno. Al estudiar la actividad de la inhibicion del crecimiento de los componentes individuales en combinacion entre sf y las mezclas de dos componentes, se identifico una composicion mejorada de la formulacion JBp1 y se denomino “JBplvP”. Esta formulacion mejorada se probo en ensayos de combinacion contra una segunda formulacion que comprendfa 2-desoxi-D-glucosa (D), capsiato (C) y metilselenocistema (M), en donde la segunda formulacion se denomina DCM y la combinacion de la primera y segunda formulacion que se conoce como JBp1vP-DCM. El analisis isobolografico de la interaccion entre JBplvP y DCM mostro el potencial para actuar de forma sinergica, especialmente a bajas concentraciones de DCM (ver resultados para la lmea celular MIAPaCa-2 en la Figura 14 y la Tabla 8).
Tabla 8: Resumen del analisis isobolografico para quimiotripsinogeno, tripsinogeno, a-amilasa y combinaciones duales en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2
A-549
T C A TC TA CA JBp1vP DCM
T
WR NR -
C
WR N NR
A
NR N N
TC
N
TA
NR
CA
-
JBp1vP
N
DCM
N
HCT-15
T C A TC TA CA JBp1vP DCM
T
N N NR
C
N N N
A
N N N
TC
N
TA
N
CA
NR
JBp1vP
N
DCM
N
MIAPaCa-2
T C A TC TA CA JBp1vP DCM
T
WR WR WR
C
WR WR NR
A
WR WR NR
TC
NR
TA
NR
CA
WR
JBp1vP
NR
DCM
NR
Leyenda:
T: tripsinogeno C: quimotripsinogeno 5 A: a-amilasa
TC: quimotripsinogeno^ripsinogeno (6:1)
TC: quimotripsinogeno:a-amilasa (1:0,25)
TA: tripsinogeno:a-amilasa (1:0,25)
WR: Interaccion sinergica de amplio rango (valores de mas de 7 g por debajo de 1,0)
10 NR: Interaccion sinergica de rango estrecho (valores de 3 a 7 g por debajo de 1,0)
N: Interaccion no sinergica (valores de menos de 3 g por debajo de 1,0)
Metodo isobolografico
Las relaciones dosis-respuesta de los agentes pueden usarse para construir un modelo que de el efecto esperado
de una combinacion. La combinacion de los farmacos A y B se denominara (da, db) donde da y db son dosis de A y B. El efecto se trata como una funcion matematica, E (da, db). E, a veces, se expresa como un efecto fraccionario, entonces la fraccion de supervivencia es S:S = 1 - E. Finalmente, Da y Db son dosis de los medicamentos A y B administrados por separado, lo que produce una respuesta igualmente eficaz con la combinacion. Los isoboles 5 (curvas de efecto iso) se pueden construir basandose en el supuesto de que no haya interaccion entre los farmacos utilizados en combinacion. La combinacion (da, db) esta representada por un punto en un grafico que tiene ejes que representan dosis de los medicamentos individuales. Se espera que, si los medicamentos no interaction, este punto caera en una lrnea recta (isobolo) que conecte los dos ejes entre los valores que representan las dosis (Da y Db) e igualmente eficaces con la combinacion (da, db). La ecuacion para la interaccion cero isobolo para dos compuestos 10 es:
imagen8
Cuando el numero de compuestos en combinacion es n, la ecuacion es:
f)
«)
Cuando los farmacos en la combinacion son igualmente eficaces con las dosis individuales, el isobolo es una lrnea 15 recta. Sin embargo, si el efecto de la combinacion es mayor del esperado a partir de las curvas de dosis-respuesta individuales, entonces se necesitan cantidades mas pequenas de da y/o db para producir un efecto equipotente para Da y Db (ambos sin cambios), por lo tanto:
imagen9
Esta relacion tambien se denomina valor g y se utiliza para determinar el tipo de interaccion. En este caso, el isobolo 20 calculado es concavo. El antagonismo producina efectos en la direccion opuesta; por lo tanto, el isobolo que representa este tipo de interaccion sena convexo.
En resumen, los valores de g pueden ser:
imagen10
LX
<1 superadictivo (sinergico)
=■1 adictivo (zona de interaccion)
subadictivo (antagonico)
Se estudio la interaccion entre los tres componentes de la nueva formulacion JBp1 (a-amilasa, tripsinogeno y 25 quimotripsinogeno). Ademas, se empleo el metodo isobolografico para determinar una proporcion mejorada de los tres componentes en la formulacion. La formulacion mejorada de JBp1 se estudio luego en combinacion con una segunda formulacion DCM.
Materiales y metodos
Se obtuvieron placas de cultivo celular esteriles de fondo plano de 96 pocillos de Becton-Dickinson (North Ryde, 30 NSW, Australia); medio de cultivo celular RPMI 1640 y DMEM, FBS, GlutaMax, penicilina-estreptomicina, piruvato de sodio, HEPES, HAM, FCS y DPBS se obtuvieron de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VlC, Australia); Azul de Tripano se obtuvo de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia); el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue® se obtuvo de Promega (Madison, WI, EE.UU.); el fluorometro SpectraMax Gemini XPS se obtuvo de Molecular Devices (Sunnyvale, California, EE.UU.).
35 Todas las lrneas celulares utilizadas en estos estudios fueron de origen humano y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, Md., EE.UU.).
La siguiente Tabla 9 muestra las condiciones de crecimiento y las densidades iniciales de siembra de celulas en celulas por pocillo utilizadas en todas las pruebas de CI50 y ensayos de combinacion. Las celulas se cultivaron a 37°C en una incubadora de cultivo celular humidificada con 95% de aire/5% de CO2.
Tabla 9: Condiciones de crecimiento y densidades de siembra para el estudio de CI50 y ensayos combinados
Lmea celular
Tipo de tumor Medio de cultivo celular Densidad de siembra
COLO-205
Carcinoma, colorrectal RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 2000
COLO-201
Carcinoma, colorrectal RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 2500
HCT-116
Carcinoma, colorrectal RPMI + 10 % FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 2000
HCT-15
Carcinoma colorrectal RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 2000
HT-29
Adenocarcinoma, colorrectal RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
BxPC-3
Adenocarcinoma RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
MIAPaCa-2
Carcinoma DMEM + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep + 1% HEPES + 1% NaPy 4000
PANC-1
Carcinoma epitelioide DMEM + 10% F CS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 3000
A2780
Ovario, adenocarcinoma RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
OVCAR-3
Ovario, adenocarcinoma RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 3000
SK-OV-3
Adenocarcinoma, ovario, Ascitos Malignos RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
BT-474
Carcinoma de mama RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 5000
MDA-MB- 231
adenocarcinoma de mama DMEM + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 5000
MDA-MB- 453
Carcinoma de mama RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 5000
MDA-MB- 468
Adenocarcinoma de mama RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
A549
NSCLC RPMI + 10 % FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 3000
HOP-92
NSCLC, derrame pleural RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
NCI-H460
NSCLC, derrame pleural RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 3000
NCI-H520
NSCLC, carcinoma de celulas escamosa + RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
NCI-H596
NSCLC, carcinoma adenoescamoso RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 3000
NIC-H82
NSCLC RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 5000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1% Pen/Strep
OE-21
escamoso esofagico RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 5000
OE-33
escamoso esofagico RPMI + 10% FCS + 1% GlutaMax + 1% Pen/Strep 5000
KYSE-30
carcinoma de celulas escamosas RPMI + F12 de HAM F12 (1:1) + 2% FCS + % GlutaMax + 1% Pen/Strep 4000
Artmulos de prueba y formulacion
El artmulo de prueba 1 fue el tripsinogeno, que fue suministrado por Applichem (Darmstadt, Alemania). El artmulo de prueba 2 fue el quimotripsinogeno, que fue suministrado por BBI Enzymes (Gwent, Reino Unido). El Artmulo de prueba 3 fue la a-amilasa, que fue suministrado por Annecis Ltd (Lancaster, Reino Unido). El artmulo de prueba 4 fue la 2-desoxiglucosa, que fue suministrado por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). El artmulo de prueba 5 fue capsiato, que fue suministrado por Propanc Pty Ltd. El artmulo de prueba 6 fue metilselenocistema, que fue suministrado por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia)
La a-amilasa, el tripsinogeno y el quimotripsinogeno se disolvieron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 4°C para su uso posterior. El artmulo de prueba DCM se compone de 2-desoxiglucosa, capsiato y metilselenocistema en una proporcion de 1:1:0,0001. Estos tres componentes se mezclaron juntos en estas proporciones, se suspendieron de nuevo en PBS y se usaron inmediatamente despues de la preparacion.
Ensayos de crecimiento celular
Para los analisis de CI50, los artmulos de prueba se agregaron a las celulas 24 horas despues de la siembra. Las concentraciones del artmulo de prueba se probaron por triplicado para cada lmea celular. El ensayo CellTiter-Blue® se llevo a cabo en todas las placas 72 horas despues de la adicion de los artmulos de prueba.
Para los ensayos de combinacion, se sembraron dos placas de 96 pocillos para cada lmea celular y la combinacion del artmulo de prueba, para permitir la replicacion de cada experimento. Los artmulos de prueba se agregaron a las celulas 24 horas despues de la siembra de acuerdo con el siguiente esquema de pipeteo (las celulas dentro del intervalo A3:G11 contienen la combinacion de ambos farmacos en las concentraciones indicadas en la columna 2 y en la fila H). Las concentraciones iniciales para cada compuesto en cada lmea celular se decidieron en funcion de la CI 50 calculada de manera que la CI50 para cada farmaco se encontraba dentro de la concentracion en la serie de dilucion. El ensayo CellTiter-Blue® se llevo a cabo en todas las placas 72 horas despues de la adicion de los artmulos de prueba.
Despues de la incubacion de celulas en medios que contienen el artmulo de prueba, se agregaron 10 pL de CellTiter-Blue® a cada pocillo y se incubaron con celulas hasta 4 horas. La fluorescencia se midio utilizando un fluorometro Spectramax Gemini XPS. Todos los datos se registraron y se ingresaron en las hojas de calculo de Microsoft® Excel para su interpretacion.
Los datos recopilados de los ensayos CellTiter-Blue® se representaron como curvas de respuesta a la dosis para la determinacion de la CI50 y como isobologramas para evaluar el tipo de interaccion entre las combinaciones del artmulo de prueba. Para las determinaciones de CI50, se calculo la inhibicion del crecimiento y se represento frente a la concentracion del compuesto. En estas representaciones, el eje X (concentracion del compuesto) se represento en una escala logantmica. La concentracion de CI50 se calculo como la concentracion inhibitoria (CI) media maxima (50%) para cada compuesto utilizando GraphPad Prism version 5.0 para Mac OSX (GraphPad Software, San Diego, EE.UU.).
Para los estudios de combinacion, el analisis isobolografico se realizo utilizando la plantilla de analisis patentada de vivoPharm. El analisis isobolografico proporciona una medida del tipo de interaccion (es decir, sinergica, aditiva o antagonista) que ocurre entre dos compuestos. Un parametro que define el tipo de interaccion es el valor g. Como se describio anteriormente, los valores de g de mas de 1,0 indican una interaccion antagonica y los valores de g de menos de 1,0 indican una interaccion sinergica. Cada ensayo isobolografico da como resultado valores de 9 g, uno para cada concentracion del segundo compuesto en la combinacion (compuesto B en la plantilla de analisis). Para este estudio, las interacciones entre dos compuestos se clasificaron en tres grupos: interacciones sinergicas de amplio intervalo que mostraron mas de 7 g de valores por debajo de 1,0, interacciones sinergicas de intervalo estrecho que dieron como resultado valores de 3 a 7 g por debajo de 1,0 e interacciones no sinergicas que produjeron valores de menos de 3 g por debajo de 1,0. La tabla 5 muestra el resumen de todas las interacciones analizadas en este estudio.
Todos los procedimientos utilizados en la realizacion de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos operativos estandar.
Resultados
Se realizaron ensayos de determinacion de CI50 para JBp1 en 24 lmeas celulares de cancer. Como se ve en la Tabla 5 10, se obtuvieron valores de IC50 para 15 de las lmeas celulares (A2780, HOP-92, BxPc-3, HT-29, KYSE-30,
MIAPaCa-2, OE-33, A549, HCT-15, OE-21, NCI-H82, HCT-116, MDA-MB468, NCI-H460 y BT474). Las lmeas celulares restantes mostraron valores maximos de inhibicion o curvas de dosis-respuesta que no permitieron la determinacion de los valores de CI50 dentro del intervalo de concentraciones de JBp1 analizadas en este estudio. La Tabla 10 muestra los valores de IC50 y de inhibicion de crecimiento maxima para las 24 lmeas celulares en orden 10 decreciente de inhibicion de crecimiento maxima.
Sobre la base de la CI50 y los valores de inhibicion maxima obtenidos para las 24 lmeas celulares y la idoneidad de cada lmea celular para estudios de seguimiento en animales, se seleccionaron tres lmeas celulares para estudios isobolograficos. Estas lmeas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2, estan resaltadas en negrita en la Tabla 10.
Tabla 10: Resumen de los valores de IC50 para JBp1 en 24 lmeas celulares
Lmea celular
IC50 JBp1 (mg/mL) % de inhibicion maxima
A2780
0,09 93,4
HOP-92
0,13 91,1
BxPc-3
0,16 90,7
HT-29
0,04 87,6
KYSE-30
0,03 86,2
MIAPaCaCa-2
0,08 85,0
OE-33
0,15 84,1
A549
0,15 83,9
HCT-15
0,08 82,3
OE-21
0,42 68,2
NCI-H82
0,06 66,9
HCT-116
0,14 62,4
MDA-MB468
0,10 62,3
COLO-205
- 61,7
NCI-H460
0,07 58,9
BT474
0,01 55,3
SK-OV-3
- 54,5
PANC-1
- 52,8
NCI-596
- 51,4
MDA-MB-231
- 47,5
COLO-201
- 36,3
NCI-H520
- 34,0
MDA-MB-453
- 16,2
OVCAR-3
- 9,3
5
10
15
20
25
30
35
40
El metodo isobolografico para estudiar la interaccion entre compuestos requiere la determinacion de los valores de CI 50 para esos componentes antes de realizar los ensayos de combinacion. Por lo tanto, se realizaron ensayos de determinacion de CI50 para los tres componentes individuales de JBp1, a saber, tripsinogeno, quimotripsinogeno y a- amilasa, en las tres lmeas celulares seleccionadas A-549, HCT-l5 y MIAPaCa-2. Como se ve en la Tabla 11, el tripsinogeno mostro valores de CI50 que oscilaron entre 0,23 y 0,41 mg/ml en las tres lmeas celulares. La a-amilasa y el quimotripsinogeno no presentaron valores de CI50 dentro del intervalo de concentraciones analizadas.
Tabla 11 Resumen de los valores de CI50 y la inhibicion maxima del crecimiento para tripsinogeno, quimotripsinogeno y a-amilasa en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2.
Valores IC50 (mg/mL)
A-549 HCT-15 MIAPaCa-2
Tripsinogeno
0,23 0,41 0,28
Quimotripsinogeno
- - -
a-Amilasa
- - -
Inhibicion Maxima (%)
A-549 HCT-15 MIAPaCa-2
Tripsinogeno
75,7 77,2 82,3
Quimotripsinogeno
26,5 16,6 28,9
a- amilasa
2,6 16,0 13,8
El analisis isobolografico proporciona una medida del tipo de interaccion (es decir, sinergica, aditiva o antagonista) que ocurre entre dos compuestos. Un parametro que define el tipo de interaccion es el valor g. Como se describio anteriormente, los valores de g de mas de 1,0 indican una interaccion antagonica y los valores de g de menos de 1,0 indican una interaccion sinergica. Cada ensayo isobolografico da como resultado valores de 9 g, uno para cada concentracion del segundo compuesto en la combinacion (compuesto B en la plantilla de analisis). Para este estudio, las interacciones entre dos compuestos se clasificaron en tres grupos: interacciones sinergicas de amplio rango que mostraron valores de mas de 7 g por debajo de 1,0, interacciones sinergicas de rango estrecho que dieron como resultado valores de 3 a 7 g por debajo de 1,0 e interacciones no sinergicas que produjeron valores de menos de 3 g por debajo de 1,0. La tabla 8 muestra el resumen de todas las interacciones analizadas en este estudio.
A pesar del hecho de que no se obtuvieron valores de CI50 para la a-amilasa y el quimotripsinogeno, la interaccion entre sf y con el tripsinogeno se estudio en ensayos de combinacion, ya que se entiende que estos componentes aun interaction cuando se combinan con un segundo compuesto. Las figuras 15-17 muestran los isobologramas resultantes de los ensayos de combinacion entre a-amilasa, tripsinogeno y quimotripsinogeno en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2.
Como se ve en la fig. 15 y en la Tabla 8, el tripsinogeno y el quimotripsinogeno mostraron resultados isobolograficos compatibles con un amplio rango de interaccion sinergica en celulas A-549 y MIAPaCa-2. En las celulas HCT-15, el perfil isobolografico fue consistente con una interaccion no antagonista (la lmea isobolografica se ubica casi superpuesta en el eje X y podna no ser claramente distinguible en la figura). Sobre la base de los resultados generales de los ensayos de combinacion en las tres lmeas celulares seleccionadas, se definio que la proporcion mejorada de tripsinogeno y quimotripsinogeno en la formulacion debena establecerse en 6:1 (quimotripsinogeno:tripsinogeno). Esta relacion se apoya en: 1) las concentraciones mas altas de quimotripsinogeno mejoraron significativamente el efecto inhibidor del crecimiento, como se refleja por los valores de g muy bajos a 1 y 2 mg/ml de quimotripsinogeno en celulas A-549 y MIAPaCa-2; y 2) las concentraciones de tripsinogeno por encima de 0,25 mg/ml no agregaron efectos inhibitorios adicionales. Por lo tanto, el promedio de las dos concentraciones superiores de quimotripsinogeno (1,5 mg/ml) se dividio por la concentracion superior de tripsinogeno (0,25 mg/ml) para obtener una relacion de 1,5 a 0,25 o 6:1.
La figura 16 muestra los isobologramas para la interaccion entre tripsinogeno y a-amilasa en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. La combinacion de estos dos compuestos dio como resultado interacciones sinergicas en celulas A- 549 y MIAPaCa-2 y una interaccion no sinergica en celulas HCT-15 (Tabla 8). La interaccion positiva fue del tipo de rango amplio en celulas MIAPaCa-2 y del tipo de rango estrecho en celulas A-549. Dado el rango de respuestas observado para esta interaccion en las tres lmeas celulares probadas, estos datos no se utilizaron para determinar la proporcion entre estos dos componentes en la formulacion JBp1.
5
10
15
20
25
30
35
La figura 17 muestra los isobologramas para la interaccion entre el quimotripsinogeno y la a-amilasa en celulas A- 549, HCT-15 y MIAPaCa-2. La combinacion de estos dos compuestos dio como resultado una interaccion sinergica en celulas MIAPaCa-2 e interacciones no sinergicas en celulas A-549 y HCT-15. Dado el efecto negativo de la a- amilasa en los efectos inhibidores del crecimiento celular del quimotripsinogeno, se decidio dejar la proporcion de este componente con respecto a los otros dos componentes de JBp1 en la concentracion original (1:0,25, quimotripsinogeno:a-amilasa).
En resumen, despues de la primera ronda de ensayos de combinacion, se determino que la relacion quimotripsinogeno:tripsinogeno se establecena en 6:1 y las proporciones de quimotripsinogeno:a-amilasa y tripsinogeno:a-amilasa se utilizanan en las concentraciones originales de 1:0,25.
Para la segunda ronda de estudios de combinacion, el par de compuestos y la proporcion definida anteriormente se redefinieron como los nuevos compuestos de prueba de la siguiente manera:
- Quimotripsinogeno:tripsinogeno (6:1) = TC
- Quimotripsinogeno:a-amilasa (1:0,25) = CA
- Tripsinogeno:a-amilasa (1:0,25) = TA
Se realizaron ensayos de determinacion de CI50 para estos compuestos redefinidos en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. La Tabla 12 presenta las curvas de dosis-respuesta y los valores de CI50 calculados y la inhibicion maxima del crecimiento para los tres compuestos en las tres lmeas celulares seleccionadas. Los valores de CI50 se obtuvieron para TC y TA en las tres lmeas celulares. Sin embargo, no se pudieron encontrar valores de CI50 para CA dentro del intervalo de concentraciones analizadas.
Tabla 12: Resumen de los valores de CI50 y la inhibicion maxima del crecimiento para TC, TA y CA en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2.
Valores CI50 (mg/mL)
A-549 HCT-15 MIAPaCa-2
TC
0,61 0,28 0,33
TA
0,59 0,37 0,61
CA
- - -
Inhibicion maxima (%)
TC
88,3 87,1 88,9
TA
86,7 84,8 83,1
CA
51,3 31,3 33,9
Despues de la determinacion de los valores de CI50 para TC, CA y TA, se realizaron ensayos combinados entre estos tres componentes y el tercer componente correspondiente en la formulacion JBp1 (es decir, TA versus quimotripsinogeno, CA versus tripsinogeno y TC versus a-amilasa).
La figura 18 presenta los isobologramas para la combinacion entre TA y quimotripsinogeno. La combinacion de estos dos compuestos dio como resultado interacciones sinergicas en celulas A-549 y MIAPaCa-2 y una interaccion no sinergica en celulas HCT-15.
La figura 19 presenta los isobologramas para la combinacion entre CA y tripsinogeno. La combinacion de estos dos compuestos dio como resultado interacciones sinergicas en celulas HCT-15 y MIAPaCa-2 y una interaccion no sinergica en celulas A-549. En general, la tendencia observada apunto hacia una interaccion positiva para estos dos componentes, consistente con la interaccion sinergica observada entre el quimotripsinogeno y el tripsinogeno. Estos resultados justifican aun mas la relacion 6:1 (quimotripsinogeno:tripsinogeno) seleccionada en base a los resultados anteriores discutidos.
La figura 20 presenta los isobologramas para la interaccion entre TC y a-amilasa. La tendencia general observada para esta combinacion fue consistente con interacciones no sinergicas. Para diseccionar aun mas este efecto negativo de la a-amilasa sobre los efectos inhibidores del crecimiento de la TC, los valores de CI50 para la TC se extrajeron de la plantilla de analisis isobolografico y se representaron frente a la concentracion correspondiente de la a-amilasa. Los valores aumentaron proporcionalmente a la concentracion de a-amilasa para las tres lmeas celulares.
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Estos resultados sugieren que los niveles de a-amilasa en la formulacion de JBp1 deben mantenerse bajos para evitar posibles efectos antagonicos con quimotripsinogeno y tripsinogeno.
La Tabla 8 anterior resume todos los resultados de la combinacion de los componentes individuales y duales entre sf.
Sobre la base de los estudios de combinacion descritos anteriormente, las proporciones de quimotripsinogeno, tripsinogeno y a-amilasa en la formulacion de JBp1 se definieron como 6:1:0,25 (quimotripsinogeno:tripsinogeno:a- amilasa). Esta formulacion mejorada de JBp1 fue identificada por el sufijo "vP" para diferenciarla de la formulacion original de JBp1.
Los valores de CI50 se determinaron para la formulacion mejorada JBplvP y se compararon con los valores obtenidos para la formulacion original JBp1. La Tabla 13 presenta las curvas de dosis-respuesta, los valores de CI50 y la inhibicion maxima del crecimiento para estas dos formulaciones en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. Como muestran estos resultados, la formulacion mejorada de JBplvP presento valores de CI50 mas bajos que JBp1 en celulas A-549 y HCT-15 y un valor de CI50 similar en celulas MIAPaCa-2. Es importante destacar que JBplvP mostro valores de inhibicion de crecimiento maximos mas altos que JBp1 en las tres lmeas celulares.
Tabla 13: Resumen de los valores de CI50 y la inhibicion maxima del crecimiento para JBp1, JBplvP y DCM en celulas MIAPaCa-2
valores de CI50 (mg/mL)
A-549 HCT-15 MIAPaCa-2
JBp1
0,51 - 0,30
JBp1vP
0,33 0,36 0,37
DCM
1,5 0,4 0,15
Inhibicion maxima (%)
A-549 HCT-15 MIAPaCa-2
JBp1
65,4 35,2 81,0
JBp1vP
82,5 75,1 90,2
DCM
92,8 92,9 94,2
Se examino JBp1vP por su capacidad para inhibir el crecimiento celular en combinacion con el compuesto de prueba DCM. Antes de los ensayos de combinacion, la CI50 de DCM se determino en celulas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. Como se ve en las Tablas 8 y 13, el DCM mostro valores de CI50 en el intervalo de 0,15 a 1,5 mg/ml y valores de inhibicion de crecimiento maximo de mas del 92% para las tres lmeas celulares.
La figura 14 muestra los isobologramas para la combinacion entre JBp1vP y DCM. El analisis isobolografico mostro que la interaccion entre estos dos componentes en las celulas A-549 y HCT-15 no fue sinergica. En las celulas MlAPaCa-2, la combinacion de JBp1vP y DCM dio como resultado una interaccion sinergica de rango estrecho, espedficamente a concentraciones mas bajas de DCM. Los valores de g para este estudio de combinacion estuvieron muy por debajo de 1,0 para las dos concentraciones mas bajas de DCM.
En vista de que se entendio que M puede proporcionar un efecto antagonista en JBp1, estos resultados demostraron inesperadamente que DCM es eficaz en combinacion con JBp1.
En resumen, JBp1vP y DCM interactuaron sinergicamente a bajas concentraciones de DCM, JBp1vP tambien muestra efectos inhibidores del crecimiento de celulas cancerosas mejores respecto a la formulacion de JBp1 in vitro, y JBp1vP y DCM sinergizan para inhibir el crecimiento de celulas cancerosas in vitro.
Ejemplo 2: Estudio in vivo de mejores formulaciones de proenzimas
Se realizo un estudio para determinar la eficacia anti-angiogenica in vivo de JBp1 (tripsinogeno, quimotripsinogeno y a-amilasa), administrado a 0,13 mg/kg, 0,78 mg/kg y 0,03 mg/kg, respectivamente), solo y en combinacion con un adyuvante, fue investigado DCM (2-Desoxiglucosa, Capsiato y Metilselenocistema a 30,55 mg/kg, 29,12 mg/kg, 0,003 mg/kg, respectivamente) usando el ensayo de AngioChamber™ de vivoPharm. El ensayo AngioChamber™ utiliza el proceso fisiologico normal de cicatrizacion de heridas para promover la formacion de capsulas fibrosas alrededor de una camara implantada (Wood, JM, Bold, G., Buchdunger, E., Cozens, R., et al. “PTK787/ZK 222584, a
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Novel and Potent Inhibitor of Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinases, Impairs Vascular Endothelial Growth Factor-Induced Responses and Tumour Growth After Oral Administration”. Cancer Research, 60 (8):2178- 2189 (2000)). La inclusion del factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) en la camara apoya la formacion de capsulas de fibrosas al tiempo que induce el desarrollo de vasos sangumeos. Por lo tanto, este sistema se utiliza para evaluar la eficacia de los tratamientos anti-angiogenicos mediante la medicion de la formacion de capsulas fibrosas (peso humedo de la capsula en la terminacion).
Resumen
Cincuenta ratones FvB hembra recibieron cada uno un AngioChamber™ implantado por v^a subcutanea, con o sin bFGF. Diez ratones fueron seleccionados al azar e implantados con Chambers sin bFGF. Cuarenta ratones que se implantaron con Chambers que conteman bFGF se asignaron al azar por peso corporal en cuatro grupos de tratamiento de 10 ratones el dfa 0 del estudio.
JpB1 consistio en tripsinogeno, quimotripsinogeno y a-amilasa, administrados a 0,13 mg/kg, 0,78 mg/kg y 0,03 mg/kg, respectivamente. El DCM consistio en 2-desoxiglucosa, capsiato y metilselenocistema a 30,55 mg/kg, 29,12 mg/kg, 0,003 mg/kg, respectivamente.
Los ratones de cada grupo recibieron un tratamiento diario (dfas 0 a 4) con Vehfculos Control (NMP:PEG300 (1:9, v/v), po, 5 ml/kg), JBp1 (i.p., en un volumen de dosificacion de 10 mL/kg), JBp1-DCM (i.p., en un volumen de dosificacion de 10 mL/kg) o Sorafenib (60 mg/kg, p.o., en un volumen de dosificacion de 5 mL/kg). El vehfculo control se administro a dos grupos, uno de los cuales se implanto con AngioChambers™ cargado sin bFGF (Control de la lmea de base), el otro se implanto con AngioChambers™ con bFGF (Control de induccion). Los grupos de tratamiento de los compuestos se implantaron con AngioChambers™ cargado con bFGF.
Las mediciones del peso corporal se registraron para todos los animales en el primer dfa de tratamiento (Dfa 0) y luego diariamente hasta el dfa de finalizacion del estudio (Dfa 5).
Los ratones en todos los grupos perdieron peso corporal inmediatamente despues del inicio del tratamiento, un resultado esperado del procedimiento quirurgico. Los ratones tratados con vehfculo control (con bFGF) JBp1 y JBp1- DCM recuperaron el peso corporal durante la duracion restante del estudio, sin una perdida significativa del peso corporal medio en el dfa de la terminacion. El peso corporal no se recupero en los ratones tratados con el vehfculo control (sin bFGF) y Sorafenib, y ambos grupos tuvieron una perdida de peso corporal significativa al finalizar el estudio, lo cual es comun en los ratones tratados con NMP:PEG300.
Se extirparon AngioChambers™ de cada raton 24 horas despues del tratamiento final (dfa 5). Se retiro la capsula fibrosa alrededor de la camara y se registro el peso humedo.
Todos los tratamientos dieron como resultado una inhibicion significativa de la angiogenesis inducida por bFGF en comparacion con el Control de Induccion, como lo indican los pesos humedos de la capsula en el dfa de finalizacion del estudio. El tratamiento con JBp1-DCM y Sorafenib, que es un comparador efectivo de farmacos angiogenicos, redujo significativamente la angiogenesis en comparacion con la monoterapia con JBp1. No hubo diferencias significativas en la actividad anti-angiogenica entre JBp1-DCM y sorafenib. Por lo tanto, en este modelo, tanto JBp1 como JBp1-DCM fueron eficaces en la inhibicion de la formacion de capsulas fibrosas. La adicion de DCM a la formulacion JBp1 dio como resultado una inhibicion mejorada en comparacion con JBp1 solo. El tratamiento de JBp1-DCM fue tan eficaz como Sorafenib en este modelo.
Materiales y metodos
La heparina, NMP, PBS y PEG300 se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). Se obtuvieron filtros Acrodisc de 0,22 pM de Pall Corporation (Sydney, NSW, Australia). El bFGF humano recombinante se obtuvo de Shenandoah Biotechnology (Warwick, PA, Ee.UU.). AngioChambers™ fue suministrado por Angst + Pfister AG (Stuttgart, Alemania). La agarosa fue suministrada por Omnigel Lo.M (Edwards Instruments Co., NSW, Australia).
El sistema de prueba incluyo 50 ratones FvB hembras, con 5 grupos de estudio de 10 ratones por grupo (2 grupos control y 3 grupos de tratamiento). Se utilizaron condiciones y regfmenes estandar para el control de los animales.
Se utilizaron camaras de tejido poroso (AngioChambers™) hechas de perfluoro-alcoxi-teflon (Teflon®-PFA, 21 mm x 8 mm de diametro, 550 pL de volumen), perforadas con 80 orificios de 0,8 mm espaciados regularmente. Ambos extremos fueron sellados con tapas extrafbles del mismo material. Las camaras se llenaron en condiciones esteriles con agarosa al 0,8% que contema 20 UI/ml de heparina, con o sin 4 pg/ml de bFGF. La solucion de agarosa se mantuvo a 37°C antes de llenar las camaras.
Para la implantacion de la camara, los ratones fueron anestesiados por inhalacion de isofluorano. Se realizo una pequena incision en la piel dorsal central de cada raton y la camara se inserto por via subcutanea y se coloco entre los omoplatos. La herida se cerro con dos clips de 1,4 mm (Michel Clip).
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Compuestos de prueba y formulaciones
El vehmulo control fue NMP:PEG300 (1:9 v/v). JpB1 era el artmulo de prueba 1 y consistfa en tripsinogeno, quimotripsinogeno y a-amilasa, administrados a 0,13 mg/kg, 0,78 mg/kg y 0,03 mg/kg, respectivamente. El DCM fue el artmulo de prueba 2 y consistio en 2-desoxiglucosa, capsiato y metilselenocistema a 30,55 mg/kg, 29,12 mg/kg, 0,003 mg/kg, respectivamente. Cada compuesto se disolvio por separado en PBS. Las soluciones madre se esterilizaron por filtracion (0,22 pM). En cada dfa de dosificacion, las existencias se mezclaron en las combinaciones apropiadas.
Sorafenib fue el compuesto de referencia y se suministro en comprimidos de 315 mg que conteman 200 mg de Sorafenib activo. Las tabletas se trituraron y se disolvieron en NMP para formular una solucion madre de Sorafenib activo, que se diluyo con PEG300 para lograr la concentracion de dosis requerida con una relacion final de NMP:PEG300 de 1:9.
Diez ratones fueron seleccionados al azar e implantados con Chambers sin bFGF. Cuarenta ratones que fueron implantados con Chambers que conteman bFGF fueron asignados al azar por peso corporal en cuatro grupos de tratamiento de 10 ratones en el dfa 0 del estudio. Los tratamientos comenzaron el dfa 0 (2 horas despues de que los ratones se recuperaran de la cirugfa) y se continuaron durante cinco dfas consecutivos (dfa 0 a 4).
El vehmulo control (NMP:PEG300 (1:9 v/v)) (Grupos 1 y 2) y Sorafenib (60 mg/kg; Grupo 5) se administraron por via oral (p.o.) en un volumen de dosificacion de 5 ml/kg. JBp1 (tripsinogeno, quimotripsinogeno y a-amilasa a 0,13 mg/kg, 0,78 mg/kg y 0,03 mg/kg, respectivamente) se administro solo (Grupo 3) y en combinacion con DCM (2- Desoxiglucosa, Capsiato y Metilselenocistema a 30,55 mg/kg, 29,12 mg/kg, 0,003 mg/kg, respectivamente) (Grupo 4). Ambos se administraron mediante inyeccion intraperitoneal (i.p.) en un volumen de dosificacion de 10 ml/kg. Cuando JBp1 y DCM se administraron en combinacion, los seis compuestos se formularon y se administraron juntos en la unica inyeccion.
El peso corporal de cada animal se midio inmediatamente antes de la dosificacion. El volumen de la solucion de dosificacion administrada a cada animal se calculo y ajusto en funcion del peso corporal individual.
Los animales se trataron de acuerdo con el programa anterior, comenzando 2 horas despues de que los ratones se recuperaran de la cirugfa para implantar el AngioChamber™ en el dfa 0 del estudio. Los AngioChambers™ se eliminaron de todos los ratones post mortem en el dfa de finalizacion (Dfa 5). La capsula fibrosa vascularizada que se habfa formado alrededor de cada camara se retiro con cuidado y el peso humedo se registro de inmediato.
El tratamiento de cualquier animal cesana si su peso corporal bajara a menos del 85% desde el del ingreso al estudio. Si esto ocurriera, las mediciones de peso corporal continuanan por un penodo corto. Si no se media la ganancia de peso corporal, entonces el animal era sacrificado. Los animales tambien se sacrificaban si se observaba una reaccion adversa grave al tratamiento. El grado de la reaccion adversa se evaluaba utilizando una hoja de puntuacion clmica pro-forma que enumeraba los smtomas y una puntuacion adjunta (grna incluida en el Apendice 2). La combinacion de los smtomas observados y el puntaje total resultante determinaron el curso de accion a tomar con respecto al bienestar del animal.
La inhibicion de la angiogenesis por los artmulos de prueba (%) se calculo utilizando la siguiente formula:
% de inhibicion = [(A - B)/(A - C) * 100]
donde A es el peso medio de la capsula de ratones con AngioChambers™ implantado que conteman el factor de crecimiento y tratados con el Vehmulo control (Grupo 2).
B es el peso medio de la capsula de ratones con AngioChambers™ implantado que conteman el factor de crecimiento y tratados con el Artmulo de prueba (Grupos 3-5),
y C es el peso promedio de la capsula de ratones con AngioChambers™ implantado sin factor de crecimiento y tratados con Vehmulo control (Grupo 1).
Todos los calculos estadfsticos se realizaron utilizando SigmaStat 3.0 (SPSS Australasia, North Sydney, NSW, Australia). Se uso una prueba t pareada para determinar la importancia en el cambio de peso corporal dentro de un grupo de tratamiento entre el Dfa 0 y el dfa de finalizacion del estudio. Cuando los datos no pasaron la prueba de normalidad, se realizo la prueba de suma de intervalos firmada de Wilcoxon. El objetivo de los analisis estadfsticos restantes fue mostrar que el compuesto de referencia, Sorafenib y los Artmulos de prueba inhibfan significativamente la induccion de la capsula fibrosa por bFGF. Se considera esencial la induccion significativa de la formacion de la capsula fibrosa por bFGF para aceptar los resultados del estudio. Se realizo un analisis de varianza de una via (ANOVA) en los datos de peso de la capsula al final del estudio. Cuando se encontraron diferencias significativas, se realizaron los procedimientos de los grupos de comparacion multiple de todos los pares y comparacion multiple versus control (metodo de Holm-Sidak). Un valor de p inferior a 0,05 se considero significativo.
Todos los procedimientos utilizados en la realizacion de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con los
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Procedimientos Operativos Estandar de vivoPharm, con referencia particular a SOP N°. vP_EF0317 "General Procedures for Angiogenesis Studies". Los procedimientos operativos estandar se mantienen archivados en las instalaciones seguras de vivoPharm.
Resultados y observaciones
Todos los ratones en todos los grupos presentaron piloereccion durante la duracion del estudio. Un raton tratado con Vehnculo control (con bFGF; Grupo 2) fue encontrado muerto el D^a 1 del estudio, probablemente debido a complicaciones de la cio^a. Un raton tratado con Vehnculo control (sin bFGF; Grupo 1) tema la pata trasera derecha adherida al pelaje abdominal el dfa 4. Este se separo bajo anestesia por inhalacion.
Los ratones en todos los grupos perdieron peso corporal inmediatamente despues del inicio del tratamiento, probablemente debido al procedimiento quirurgico. Los ratones tratados con Vehnculo control (con bFGF; Grupo 2) JBp1 (Grupo 3) y JBp1-DCM (Grupo 4) recuperaron constantemente el peso corporal durante la duracion restante del estudio, sin perdida significativa de peso corporal medio en el dfa de finalizacion.
El peso corporal no se recupero en ratones tratados con Vehnculo control (sin bFGF; Grupo 1) y Sorafenib (Grupo 5), con ambos grupos con una perdida significativa de peso corporal (5,5% y 5,6%, respectivamente) al finalizar el estudio.
El peso humedo de la capsula fibrosa esta impulsado principalmente por la extension de la angiogenesis inducida por el bFGF capturado en los AngioChambers™ y, posteriormente, por la estimulacion del VEGF endogeno. Una capsula fibrosa pequena o ligera se correlaciona con un pequeno grado de formacion de vasos sangumeos en el interior y, por lo tanto, una inhibicion mas alta de la angiogenesis por un tratamiento particular.
En este estudio, la formacion de capsulas fibrosas de las capsulas escindidas fue significativamente mayor en el grupo de Vehnculo control con bFGF cargado en la camara (Grupo 2, Control de Induccion) que en el grupo de Vetnculo control sin bFGF cargado en la camara (Grupo 1, Control de Lmea de Base) (Figura 21), lo que indica que bFGF estimulo adecuada y significativamente la formacion de capsulas.
Como todos los grupos de tratamiento teman bFGF cargado en la camara, todas las comparaciones con el grupo de Vehnculo control discutidas a continuacion se refieren al Control de Induccion, Grupo 2 (con bFGF cargado en la camara).
La figura 21 muestra los resultados de las pruebas para los grupos 1-5. El grupo 1 es Vehnculo control (NMP:PEG300 (1:9, v/v)) sin bFGF. El grupo 2 es Vehfculo control (NMP:PEG300 (1:9, v/v)), con bFGF. El grupo 3 es JBp1*, con bFGF. El grupo 4 es JBp1-DCM*, con bFGF. El grupo 5 es sorafenib, 60 mg/kg, con bFGF. El sfmbolo de referencia "a" significa significativamente diferente al Control de Induccion (Vehnculo control con bFGF (Grupo 2)) (p <0,05: ANOVA de una via). El sfmbolo de referencia "b" significa significativamente diferente a la monoterapia con JBp1 (con bFGF) (Grupo 3) (p <0,05: ANOVA de una via). Todos los tratamientos se administraron una vez al dfa durante 5 dfas (dfa 0-4).
El tratamiento con JBp1, JBp1-DCM y Sorafenib (Grupos 3, 4 y 5, respectivamente) produjo una reduccion significativa en la angiogenesis en comparacion con el Control de Induccion (Grupo 2), como lo indica la diferencia en el peso de la capsula (Figura 21). El tratamiento con JBp1-DCM y Sorafenib (Grupos 4 y 5, respectivamente) redujo significativamente la angiogenesis en comparacion con la monoterapia con JBp1 (Grupo 3).
Las camaras recolectadas de ratones tratados con JBp1 solo (Grupo 3) teman mas sangre libre en el espacio entre la capsula fibrosa y la camara que las tratadas con JBp1-DCM (Grupo 4). La capsula fibrosa alrededor de las camaras recolectadas de ratones tratados con JBp1-DCM (Grupo 4) era mas ngida que la tratada con Vehnculo control (sin y con bFGF; Grupo 1 y 2, respectivamente).
Conclusion
La eficacia anti-angiogenica in vivo del tratamiento intraperitoneal con JBp1 (tripsinogeno (0,13 mg/kg), quimotripsinogeno (0,78 mg/kg) y a-amilasa (0,03 mg/kg), administrada sola y en combinacion con DCM (2- desoxiglucosa (30,55 mg/kg), Capsiato (29,12 mg/kg) y Metilselenocistema (0,003 mg/kg) se investigo en ratones FvB hembras utilizando el ensayo vivo Pharm's AngioChamber™. El efecto de los artfculos de prueba se comparo con el de un compuesto de referencia, Sorafenib (60 mg/kg, p.o.).
En este estudio, todos los tratamientos dieron como resultado una inhibicion significativa de la angiogenesis inducida por bFGF en comparacion con el control de induccion, como lo indican los pesos humedos de la capsula en el dfa de finalizacion del estudio. Tanto el compuesto de referencia, Sorafenib, como la combinacion de JBp1-DCM redujeron significativamente la angiogenesis en comparacion con la monoterapia con JBp1. Por lo tanto, se ha demostrado que JBp1-DCM es eficaz para reducir la angiogenesis.
Ejemplo 3: Estudio in vitro de formulaciones de proenzimas
Se realizo un estudio para determinar el efecto de la formulacion de proenzima que comprende tripsinogeno (pT),
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quimotripsinogeno (pC) y a-amilasa (A) (formulacion denominada JBpIvP) con agentes activos de metilselenocistema (M), capsiato (C) o 2-desoxiglucosa (D). El estudio aplico el metodo isobolografico para comprender la interaccion entre estos componentes.
Resumen
Se estudiaron las propiedades inhibitorias del crecimiento celular de estas formulaciones de proenzimas. Sobre la base de los valores de CI50 y la inhibicion maxima del crecimiento, se seleccionaron tres lmeas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2 para los estudios de combinacion utilizando el metodo isobolografico. El uso de isobologramas permitio el estudio del nivel de interaccion entre los tres componentes individuales y JBpIvP. Al estudiar la actividad de inhibicion del crecimiento de los componentes individuales en combinacion entre sf y como mezclas con JBpIvP, se identificaron formulaciones mejoradas. Los resultados de estas formulaciones mejoradas se muestran en las Figs. 22-24, que proporcionan un analisis isobolografico para JBpIvP e individualmente M, C y D, respectivamente, en celulas hCT-15.
Ejemplo 4: Estudio in vitro de formulaciones que contienen 2-desoxiglucosa y metilselenocistema
Se realizo un estudio para determinar el efecto de una formulacion que comprende metilselenocistema (M) y 2- desoxiglucosa (D). El estudio aplico el metodo isobolografico para comprender la interaccion entre estos componentes.
Resumen
Se estudiaron las propiedades inhibitorias del crecimiento celular de estas formulaciones de proenzimas. Basandose en los valores de CI50 y la inhibicion maxima del crecimiento, se seleccionaron tres lmeas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2 para el estudio de combinacion utilizando el metodo isobolografico. El uso de isobologramas permitio el estudio del nivel de interaccion entre estos dos componentes. Al estudiar la actividad de inhibicion del crecimiento de los componentes individuales y en combinacion entre sf, se identifico una formulacion mejorada. Los resultados de la formulacion mejorada se muestran en la FIG. 25, que proporciona un analisis isobolografico para la combinacion M y D en celulas hCt-15.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion farmaceutica que comprende tripsinogeno y quimotripsinogeno, en la que la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno es 4:1, 8:1 o esta en el intervalo de 4:1 a 8:1.
  2. 2. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, en la que la composicion no contiene amilasa.
    5 3. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1 o 2, en la que la relacion en peso de quimotripsinogeno:
    tripsinogeno esta entre 5:1 y 7:1.
  3. 4. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsina es 6:1.
  4. 5. Una composicion farmaceutica que comprende tripsinogeno y quimotripsinogeno para usar en un metodo para 10 tratar el cancer, en donde la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno es 4:1, 8:1 o esta en el intervalo de
    4:1 a 8:1.
  5. 6. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 5, en la que la composicion no contiene amilasa.
  6. 7. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 5 o 6, en la que la relacion en peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno esta entre 5:1 y 7:1.
    15 8. La composicion farmaceutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la relacion en
    peso de quimotripsinogeno:tripsinogeno es 6:1.
  7. 9. La composicion farmaceutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de ovario, cancer de colon, cancer de intestino, cancer de prostata, cancer de estomago, melanoma maligno, cancer de pancreas, cancer de esofago, cancer de pulmon y cancer de 20 mama.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3095458T (pt) 2009-10-22 2018-11-09 Propanc Pty Ltd Composição farmacêutica para tratar cancro compreendendo tripsinogénio e quimiotripsinogénio
CA2903845C (en) * 2013-03-15 2022-08-23 Alltech, Inc. Compositions comprising selenium and use of same for the treatment and prevention of disease or conditions associated with mitochondrial dysfunction
CZ307195B6 (cs) 2013-11-18 2018-03-14 František Trnka Farmaceutická kompozice obsahující směs proenzymů a enzymů
DK3116511T3 (da) * 2014-03-14 2020-11-23 Alltech Inc Sammensætninger af selenoorganiske forbindelser og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US20160106722A1 (en) 2014-10-21 2016-04-21 Life Plus, LLC Human therapeutic agents
US10092550B2 (en) 2014-10-21 2018-10-09 Ions Pharmaceutical S.À R.L. Therapeutic compositions containing curcumin, harmine, and isovanillin components, and methods of use thereof
US9907786B2 (en) 2014-10-21 2018-03-06 Ions Pharmaceutical S.À R.L. Therapeutic compositions containing harmine and isovanillin components, and methods of use thereof
US12419938B2 (en) 2015-11-12 2025-09-23 Propanc Pty Ltd Proenzyme composition
CN108367054A (zh) * 2015-11-12 2018-08-03 普罗潘克股份有限公司 酶原组合物
CN108697771A (zh) 2016-01-29 2018-10-23 普罗潘克股份有限公司 癌症治疗
US20190134166A1 (en) * 2016-04-12 2019-05-09 Propanc Pty Ltd Composition of proenzymes for cancer treatment
EP3517117A1 (en) 2018-01-30 2019-07-31 Medizinische Universität Wien Medicament for prevention or treatment of rhinovirus infection
US12129265B2 (en) 2020-07-21 2024-10-29 Ankh Life Sciences Limited Therapeutic agents and uses thereof
US12516307B2 (en) 2020-08-18 2026-01-06 Onchilles Pharma, Inc. Modified porcine pancreatic elastase proteins
WO2022261440A1 (en) * 2021-06-11 2022-12-15 Sorrento Therapeutics, Inc. Administration of resiniferatoxin for treatment of pancreatic cancer
CN115040642B (zh) * 2022-06-30 2025-03-28 德博尔(成都)生物科技有限公司 一种胰弹性蛋白酶的新用途
EP4389913A1 (en) * 2022-12-23 2024-06-26 Universität Heidelberg A pcr-elisa analogous antibody-free method for detecting a target nucleic acid in a sample

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4514388A (en) * 1983-03-22 1985-04-30 Psaledakis Nicholas G Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells
US4978332A (en) * 1987-09-28 1990-12-18 Matrix Pharmaceutical, Inc. Treatments employing vasoconstrictive substances in combination with cytotoxic agents for introduction into cellular lesion areas
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
FR2727107B1 (fr) * 1994-11-21 1996-12-27 Saint Gobain Vitrage Vitrage muni d'au moins une couche mince et son procede d'obtention
CZ283972B6 (cs) * 1995-05-17 1998-07-15 František Mudr. Trnka Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory a jeho použití
CN1121218C (zh) * 2000-03-08 2003-09-17 台湾东洋药品工业股份有限公司 酞胺哌啶酮在治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用
US6670330B1 (en) * 2000-05-01 2003-12-30 Theodore J. Lampidis Cancer chemotherapy with 2-deoxy-D-glucose
AU2002226650A1 (en) * 2001-01-18 2002-07-30 Arnold Hoffman Redox therapy for tumors
CN1471925A (zh) * 2002-08-02 2004-02-04 丛繁滋 更适于硬质肿瘤直接给药的含砷组合物、制剂及制备方法
JP2004182674A (ja) * 2002-12-05 2004-07-02 Kureha Chem Ind Co Ltd バニリル脂肪酸アミドを含む抗腫瘍医薬組成物
WO2004062604A2 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer with 2-deoxyglucose
WO2004103355A1 (en) * 2003-05-13 2004-12-02 Health Research Inc. Method for augmenting the antitumor activity of anti-cancer agents
DE10321725A1 (de) * 2003-05-14 2004-12-02 Mucos Pharma Gmbh & Co Enzymhaltige Zusammensetzungen, daraus hergestellte diätetische Lebensmittel und Arzneimittel und ihre Verwendung für medizinische Zwecke
CN1557482A (zh) * 2004-02-04 2004-12-29 高春平 调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂
JP2006151965A (ja) * 2004-10-28 2006-06-15 Mi Tec:Kk セレン含有組成物及びその製法
WO2006126067A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Council Of Scientific And Industrial Research A pharmaceutical composition useful for the treatment of hepatocellular carcinoma
KR100740989B1 (ko) * 2005-07-22 2007-07-19 넨시스(주) 구형 항염·항암효소 과립제 및 이의 제조방법
CN1944641B (zh) * 2006-10-26 2010-11-03 上海林叶生物科技有限公司 高纯度糜蛋白酶的制备方法
KR101058136B1 (ko) * 2007-11-09 2011-08-24 신동헌 캡시에이트 또는 디하이드로캡시에이트의 신규한 용도
PT3095458T (pt) 2009-10-22 2018-11-09 Propanc Pty Ltd Composição farmacêutica para tratar cancro compreendendo tripsinogénio e quimiotripsinogénio
CZ307195B6 (cs) * 2013-11-18 2018-03-14 František Trnka Farmaceutická kompozice obsahující směs proenzymů a enzymů

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