ES2692544T3 - Variantes de alfa-amilasa - Google Patents

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ES2692544T3 ES12730567.0T ES12730567T ES2692544T3 ES 2692544 T3 ES2692544 T3 ES 2692544T3 ES 12730567 T ES12730567 T ES 12730567T ES 2692544 T3 ES2692544 T3 ES 2692544T3
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Jens Oebro
Signe Eskildsen Larsen
Allan Svendsen
Annette Helle Johansen
Michael Skjoet
Carsten Andersen
Lars Beier
Esben Peter Friis
Miguel Duarte Guilherme Pereira TOSCANO
Mads Bjoernvad
Frank Winther Rasmussen
Liv Spaangner Christiansen
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Abstract

Variante aislada dotada de actividad de alfa-amilasa, de una alfa-amilasa parental, comprendiendo una modificación en dos o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476, y G477 del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1, donde cada modificación es independientemente una sustitución, deleción o inserción, y donde la variante tiene al menos un 80%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID N.º 1, y donde la variante comprende sustituciones en las posiciones de residuos seleccionadas de: W140 + E260; W140 + W189 + E260; W140 + W189 + G477; W140 + W189 + G476; W140 + W189 + W439; y W140 + E260 + G476.

Description

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DESCRIPCION
Variantes de alfa-amilasa Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere a variantes de una alfa-amilasa, polinucleotidos que codifican las variantes, metodos para producir las variantes y metodos para el uso de las variantes.
Descripcion de la tecnica relacionada
[0002] Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas, que cataliza la hidrolisis de almidon y otros oligo y polisacaridos 1,4-gluos^dicos lineales y ramificados.
[0003] Hay una larga historia de uso industrial de alfa-amilasas en diferentes aplicaciones conocidas tales como detergentes, panaderia, elaboracion de cerveza, licuefaccion y sacarificacion de almidon, por ejemplo, en la preparacion de jarabes con alto contenido de fructosa o como parte de la produccion de etanol a partir de almidon. Estas y otras aplicaciones de las alfa-amilasas se conocen y utilizan alfa-amilasas derivadas de microorganismos, en particular alfa-amilasas bacterianas.
[0004] Entre las primeras alfa-amilasas bacterianas en ser usadas se encontraba una alfa-amilasa de B. licheniformis, conocida tambien como Termamyl que se ha caracterizado extensivamente y se ha determinado la estructura cristalina para esta enzima. Las amilasas alcalinas, tales como la AA560, forman un grupo particular de alfa-amilasas que han hallado uso en detergentes. Muchas de estas amilasas bacterianas conocidas se han modificado para mejorar su funcionalidad en una aplicacion particular.
[0005] Los metodos para aumentar la termoestabilidad de alfa-amilasas han sido bien estudiados. Suzuki et al. (1989) revelan alfa-amilasas quimericas, en las que se han sustituido regiones especificas de una alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens por las regiones correspondientes de una alfa-amilasa de B. licheniformis. Las alfa-amilasas quimericas se construyeron con el fin de identificar regiones responsables de la termoestabilidad. Se descubrio que tales regiones incluian los residuos aminoacidicos 177-186 y los residuos aminoacidicos 255-270 de la alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens. Igarashi et al. 1998 muestran que la termoestabilidad de amilasas de tipo AmyS se puede aumentar mediante la delecion de dos residuos aminoacidicos, R179-G180, (numeracion de AmyS) de un bucle (F 178 a A184). Sin embargo, Shiau et al. (2003) mostraron que una enzima AmyS con delecion en el mismo bucle tiene una actividad especifica para la hidrolisis de almidon de maiz a alta temperatura menor que la enzima parental, refutando una de las ventajas principales de las amilasas AmyS.
[0006] Debido a cuestiones medioambientales ha aumentado la importancia de disminuir la temperatura en los procesos de lavado, de lavado de vajillas y/o de limpieza. Sin embargo, la mayoria de enzimas incluidas las amilasas tienen una temperatura optima que supera la temperatura usada normalmente en el lavado a baja temperatura. La alfa-amilasa es una enzima clave para el uso en composiciones detergentes y su uso se ha vuelto cada vez mas importante para la eliminacion de manchas amilaceas durante el lavado de ropa o de vajillas. Por lo tanto, resulta importante encontrar variantes de alfa-amilasa que retengan su rendimiento de lavado, efecto de eliminacion de manchas y/o actividad cuando se reduce la temperatura. Sin embargo, a pesar de la eficiencia de las composiciones detergentes con enzimas actuales, hay muchas manchas que son dificiles de eliminar completamente. Estos problemas se agravan con el mayor uso de temperaturas de lavado bajas (por ejemplo, agua fria) y ciclos de lavado mas cortos. Asi, es deseable tener enzimas amiloliticas que puedan funcionar a baja temperatura y al mismo tiempo conservar o aumentar otras propiedades deseables tales como la actividad especifica (actividad amilolitica), estabilidad y/o rendimiento de lavado.
[0007] Asi, es un objeto de la presente invencion proporcionar variantes de alfa-amilasa que podrian usarse en procesos de lavado, lavado de vajillas y/o limpieza a baja temperatura, tales como temperaturas de 5-35°C. Otro objeto de la presente invencion es proporcionar variantes de alfa-amilasa que tienen un rendimiento de lavado a baja temperatura mejorado en comparacion con la alfa-amilasa parental o en comparacion con la alfa-amilasa de cualquiera de las SEQ ID N.°: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 o 12.
Resumen de la invencion
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[0008] La presente invencion se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa parental, que incluye una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, donde cada modificacion es independientemente una sustitucion, delecion o insercion, y donde la variante tiene al menos un 80% pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.° 1, y donde la variante
comprende sustituciones en las posiciones de residuo seleccionadas de:
W140 + E260;
W140 + W189 + E260;
W140 + W189 + G477;
W140 + W189 + G476;
W140 + W189 + W439; y W140 + E260 + G476.
[0009] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que codifican las variantes; constructos de acido nucleico, vectores y celulas hospedadoras que incluyen los polinucleotidos; y metodos para producir las variantes.
[0010] La presente invencion tambien se refiere a metodos para preparar tales variantes.
Descripcion detallada de la invencion
[0011] La presente invencion se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa parental, que incluye una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, donde cada modificacion es independientemente una sustitucion, delecion o insercion, y donde la variante tiene al menos un 80% pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.° 1, y donde la variante comprende sustituciones en las posiciones de residuo seleccionadas de:
W140 + E260;
W140 + W189 + E260;
W140 + W189 + G477;
W140 + W189 + G476;
W140 + W189 + W439; y W140 + E260 + G476.
Definiciones
[0012] Actividad de alfa-amilasa: el termino "actividad alfa-amilasa" se refiere a la actividad de alfa-1,4-glucan-4- glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1, que constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrolisis de almidon y otros oligo y polisacaridos 1,4-gluosidicos lineales y ramificados.
[0013] Variante: el termino "variante" se refiere a un polipeptido con actividad de alfa-amilasa que incluye una modificacion, es decir, una sustitucion, insercion y/o delecion, en una o mas (varias) posiciones. Una sustitucion se refiere a una sustitucion de un aminoacido que ocupa una posicion por un aminoacido diferente; una delecion se refiere a la eliminacion de un aminoacido que ocupa una posicion; y una insercion se refiere a la adicion de 1-3 aminoacidos adyacentes a un aminoacido que ocupa una posicion.
[0014] Mutante: el termino "mutante" se refiere a un polinucleotido que codifica una variante.
[0015] Enzima de tipo salvaje: el termino alfa-amilasa "de tipo salvaje" se refiere a una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tales como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrados en la naturaleza.
[0016] Progenitor o alfa-amilasa parental: el termino "progenitor" o "alfa-amilasa parental" se refiere a una alfa- amilasa a la que se le hace una modificacion para producir las variantes enzimaticas de la presente invencion. El progenitor puede ser un polipeptido de origen natural (de tipo salvaje) o una variante de la misma.
[0017] Variante aislada: el termino "variante aislada" se refiere a una variante que esta modificada por la mano del 5 hombre. En un aspecto, la variante es al menos un 1% pura, por ejemplo, al menos un 5% pura, al menos un 10%
pura, al menos un 20% pura, al menos un 40% pura, al menos un 60% pura, al menos un 80% pura y al menos un 90% pura, como se determina por SDS-PAGE.
[0018] Variante sustancialmente pura: el termino "variante sustancialmente pura" se refiere a una preparacion que contiene como maximo un 10%, como maximo un 8%, como maximo un 6%, como maximo un 5%, como maximo un
10 4%, como maximo un 3%, como maximo un 2%, como maximo un 1% y como maximo un 0,5% en peso de otro
material polipeptidico con el cual se asocia originalmente o por recombinacion. Preferiblemente, la variante es al menos un 92% pura, por ejemplo, al menos un 94% pura, al menos un 95% pura, al menos un 96% pura, al menos un 97% pura, al menos un 98% pura, al menos un 99%, al menos un 99,5% pura y el 100% pura en peso del material polipeptidico total presente en la preparacion. Las variantes de la presente invencion estan preferiblemente en una 15 forma sustancialmente pura. Esto puede conseguirse, por ejemplo, preparando la variante por metodos
recombinantes bien conocidos o por metodos tradicionales de purificacion.
[0019] Polipeptido maduro: el termino "polipeptido maduro" se refiere a un polipeptido en su forma final tras la traduccion y cualquier modificacion postraduccional, tal como procesado del extremo N-terminal, truncamiento del extremo C-terminal, glicosilacion, fosforilacion, etc.
20 [0020] Secuencia codificante del polipeptido maduro: el termino "secuencia codificante del polipeptido maduro" se
refiere a un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro con actividad de alfa-amilasa.
[0021] Identidad de secuencia: la relacion entre dos secuencias de aminoacidos o entre dos secuencias de nucleotidos se describe con el parametro "identidad de secuencia".
[0022] Para los fines de la presente invencion, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de
25 aminoacidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la version 3.0.0 o posterior. Los parametros opcionales usados son una penalizacion por apertura de espacio de 10, una penalizacion por extension de espacio de 0,5 y y la matriz de sustitucion EBLOSUM62 (version de EMBOSS de 30 BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos identicos x 100)/(Longitud del alineamiento - Numero total de espacios en el alineamiento)
[0023] Para los fines de la presente invencion, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleotidas se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970,
35 supra) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la version 3.0.0 o posterior. Los parametros opcionales usados son una penalizacion por apertura de espacio de 10, una penalizacion por extension de espacio de 0,5 y la matriz de sustitucion EDNAFULL (version de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se 40 calcula de la siguiente manera:
(Desoxirribonucleotidos identicos x 100)/(Longitud del alineamiento - Numero total de espacios en el
alineamiento)
[0024] Fragmento: el termino "fragmento" se refiere a un polipeptido con uno o mas (varios) aminoacidos eliminados del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipeptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de alfa-
45 amilasa.
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[0025] Subsecuencia: el termino "subsecuencia" se refiere a un polinucleotido con uno o mas (varios) nucleotidos eliminados del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipeptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de alfa-amilasa.
[0026] Variante alelica: el termino "variante alelica" se refiere a cualquiera de dos o mas formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosomico. La variacion alelica surge naturalmente a traves de mutaciones y puede resultar en polimorfismos dentro de poblaciones. Las mutaciones genicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipeptido codificado) o pueden codificar polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos alteradas. Una variante alelica de un polipeptido es un polipeptido codificado por una variante alelica de un gen.
[0027] Polinucleotido aislado: el termino "polinucleotido aislado" se refiere a un polinucleotido que esta modificado por la mano del hombre. En un aspecto, el polinucleotido aislado es al menos un 1% puro, por ejemplo, al menos un 5% puro, al menos un 10% puro, al menos un 20% puro, al menos un 40% puro, al menos un 60% puro, al menos un 80% puro, al menos un 90% puro y al menos un 95% puro, como se determina por electroforesis de agarosa. Los polinucleotidos pueden ser de origen genomico, de ADNc, de ARN, semisintetico, sintetico o cualquier combinacion de los mismos.
[0028] Polinucleotido sustancialmente puro: el termino "polinucleotido sustancialmente puro" se refiere a una preparacion de polinucleotido libre de otros nucleotidos extranos o no deseados y en una forma adecuada para el uso en sistemas de produccion de polipeptidos geneticamente modificados. Asi, un polinucleotido sustancialmente puro contiene como maximo un 10%, como maximo un 8%, como maximo un 6%, como maximo un 5%, como maximo un 4%, como maximo un 3%, como maximo un 2%, como maximo un 1% y como maximo un 0,5% en peso de otro material polinucleotidico con el cual se asocia originalmente o por recombinacion. Un polinucleotido sustancialmente puro puede incluir, no obstante, regiones 5'- y 3'- no traducidas de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleotido sustancialmente puro sea al menos un 90% puro, por ejemplo, al menos un 92% puro, al menos un 94% puro, al menos un 95% puro, al menos un 96% puro, al menos un 97% puro, al menos un 98% puro, al menos un 99% puro y al menos un 99,5% puro en peso. Los polinucleotidos de la presente invencion estan preferiblemente en una forma sustancialmente pura.
[0029] Secuencia codificante: el termino "secuencia codificante" se refiere a un polinucleotido, que especifica directamente la secuencia de aminoacidos de su producto polipeptidico. Los limites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el codon de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codon de terminacion tal como, TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un polinucleotido de ADN, ADNc, sintetico o recombinante.
[0030] ADNc: el termino "ADNc" se refiere a una molecula de ADN que se puede preparar por transcripcion inversa a partir de una molecula de ARNm madura y empalmada, obtenida de una celula eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genomico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a traves de una serie de pasos, incluyendo el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
[0031] Constructo de acido nucleico: el termino "constructo de acido nucleico" se refiere a una molecula de acido nucleico, ya sea mono- o bicatenario, que se aisla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de acidos nucleicos de manera que de otro modo no existiria en la naturaleza o que es sintetico. El termino constructo de acido nucleico es sinonimo del termino "casete de expresion" cuando el constructo de acido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresion de una secuencia codificante de la presente invencion.
[0032] Secuencias de control: el termino "secuencias de control" se refiere a todos los componentes necesarios para la expresion de un polinucleotido que codifica una variante de la presente invencion. Cada secuencia de control puede ser nativa o exogena al polinucleotido que codifica la variante o nativa o exogena entre si. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, una secuencia lider, una secuencia de poliadenilacion, una secuencia de propeptido, un promotor, una secuencia de peptido senal y un terminador de la transcripcion. Como minimo, las secuencias de control incluyen un promotor y senales de terminacion transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el proposito de introducir sitios de restriccion especificos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la region codificante del polinucleotido que codifica una variante.
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[0033] Operativamente unido: el termino "operativamente unido" se refiere a una configuracion en la que una secuencia de control se coloca en una posicion apropiada con relacion a la secuencia codificante de un polinucleotido tal que la secuencia de control dirige la expresion de la secuencia codificante.
[0034] Expresion: el termino "expresion" incluye cualquier paso implicado en la produccion de la variante incluyendo, pero de forma no limitativa, la transcripcion, la modificacion postranscripcional, la traduccion, la modificacion postraduccional y la secrecion.
[0035] Vector de expresion: el termino "vector de expresion" se refiere a una molecula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleotido que codifica una variante y esta operativamente unido a nucleotidos adicionales que proveen a su expresion.
[0036] Celula hospedadora: el termino "celula hospedadora" se refiere a cualquier tipo celular que es susceptible de transformacion, transfeccion, transduccion y similar con un constructo de acido nucleico o vector de expresion que comprende un polinucleotido de la presente invencion. El termino "celula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una celula parental que no es identica a la celula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicacion.
[0037] Proceso de eliminacion de almidon: la expresion "proceso de eliminacion de almidon" se refiere a cualquier tipo de proceso por el cual se elimina (o convierte) el almidon tal como en procesos de lavado donde el almidon se elimina de tejidos, por ejemplo, limpieza textil tal como lavado de ropa. Un proceso de eliminacion de almidon podria ser tambien la limpieza de superficies duras tal como lavado de vajillas o podria consistir en procesos de limpieza en general tales como la limpieza industrial o institucional. La expresion tambien comprende otros procesos de eliminacion o conversion de almidon, produccion de etanol, licuefaccion de almidon, desaprestado textil, produccion de papel y pulpa, fabricacion de cerveza y detergentes en general.
[0038] Propiedad mejorada: el termino "propiedad mejorada" se refiere a una caracteristica asociada a una variante que se ha mejorado en comparacion con el progenitor. Tales propiedades mejoradas incluyen, pero de forma no limitativa, actividad termica, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad por sustrato/cofactor, propiedades superficiales mejoradas, especificidad por el producto, estabilidad aumentada o solubilidad en presencia de biomasa pretratada, estabilidad mejorada en condiciones de almacenamiento y estabilidad quimica.
[0039] Rendimiento de lavado: en el presente contexto el termino "rendimiento de lavado" se usa como la capacidad de una enzima para eliminar almidon o manchas que contienen almidon presentes en el objeto que va a limpiarse durante, por ejemplo, el lavado de ropa o la limpieza de superficies duras, tal como el lavado de vajillas. El rendimiento de lavado se puede cuantificar calculando el denominado valor de intensidad (Int) definido en la descripcion de AMSA o en la prueba de rendimiento de lavado de vaso de precipitados en la seccion Metodos de mas adelante.
[0040] Rendimiento de lavado mejorado: el termino "rendimiento de lavado mejorado" se define en la presente como una enzima variante que exhibe una modificacion del rendimiento de lavado de una variante de amilasa con respecto al rendimiento de lavado de la amilasa parental o con respecto a una alfa-amilasa con la secuencia de aminoacidos identica a dicha variante pero sin la delecion en una o mas de las posiciones especificas o con respecto a la actividad de una alfa-amilasa con la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID N.° 4, por ejemplo, con una mayor eliminacion de manchas. El termino "rendimiento de lavado" incluye limpiezas en general, por ejemplo, limpieza de superficies duras como en el lavado de vajillas, pero tambien rendimiento de lavado en tejidos tales como lavado de ropa, y tambien limpieza industrial e institucional.
[0041] Baja temperatura: "baja temperatura" es una temperatura de 5-35°C, preferiblemente 5-30°C, mas preferiblemente 5-25°C, mas preferiblemente 5-20°C, de la forma mas preferible 5-15°C y en particular 5-10°C. En una forma de realizacion preferida, "baja temperatura" es una temperatura de 10-35°C, preferiblemente 10-30°C, mas preferiblemente 10-25°C, de la forma mas preferible 10-20°C y en particular 10-15°C.
Convenciones para la designacion de variantes
[0042] Para los fines de la presente invencion, el polipeptido maduro descrito en SEQ ID N.°: 1 se usa para determinar el residuo aminoacidico correspondiente en otra alfa-amilasa. La secuencia de aminoacidos de otra alfa-amilasa se
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alinea con el polipeptido maduro descrito en SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, y en base al alineamiento, el numero de posicion aminoacidica que corresponde con cualquier residuo de aminoacido en el polipeptido maduro descrito en SEQ ID N.°: 1 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EmBOSS (eMbOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la version 3.0.0 o posterior.
[0043] La identificacion del residuo aminoacidico correspondiente en otra alfa-amilasa se puede confirmar con un alineamiento de multiples secuencias polipeptidicas utilizando "ClustalW" (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 29472948).
[0044] Cuando la otra enzima ha divergido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5 o SEQ ID N.°: 6 de manera tal que la comparacion tradicional de secuencias no consigue detectar su relacion (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparacion de secuencia por pares. Se puede lograr una sensibilidad superior en la busqueda de secuencias utilizando programas de busqueda que utilicen representaciones probabilisticas de familias de polipeptidos (perfiles) para buscar en las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a traves de un proceso de busqueda reiterativa en bases de datos y es capaz de detectar homologos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede conseguir incluso una mayor sensibilidad si la familia o superfamilia del polipeptido tiene uno o mas representantes en las bases de datos de estructura de proteinas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan informacion de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, prediccion de estructura secundaria, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de solvatacion) como entrada a una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De forma similar, el metodo de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903919, puede utilizarse para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de la superfamilia presentes en la base de datos de SCOP. Estos alineamientos pueden usarse sucesivamente para generar modelos de homologia para el polipeptido, y tales modelos se pueden evaluar para determinar su exactitud utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese fin.
[0045] Para proteinas de estructura conocida, hay disponibles diferentes herramientas y recursos para recuperacion y generacion de alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteinas de SCOP han sido estructuralmente alineadas, y esos alineamientos son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o mas estructuras de proteinas utilizando una variedad de algoritmos tales como la matriz de alineamiento de distancias (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extension combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y se pueden utilizar adicionalmente implementaciones de estos algoritmos para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interes para descubrir posibles homologos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
[0046] Al describir las variantes de alfa-amilasa de la presente invencion, la nomenclatura descrita mas adelante se adapta para facilitar la referencia. Se emplean las abreviaturas de una o tres letras de los aminoacidos aceptadas por la IUPAC.
[0047] Sustituciones. Para una sustitucion aminoacidica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoacido original, posicion, aminoacido sustituido. Por consiguiente, la sustitucion de treonina por alanina en la posicion 226 se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones multiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg + Ser411Phe" o "G205R + S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.
[0048] Deleciones. Para una delecion aminoacidica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoacido original, posicion*. Por consiguiente, la delecion de glicina en la posicion 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones multiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195* + Ser411*" o "G195* + S411*".
[0049] Inserciones. Para una insercion aminoacidica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoacido original, posicion, aminoacido original, aminoacido insertado. Por consiguiente, la insercion de lisina despues de glicina en la posicion 195 se designa como "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una insercion aminoacidica multiple se designa [aminoacido original, posicion, aminoacido original, aminoacido insertado n.° 1, aminoacido insertado n.° 2; etc.]. Por ejemplo, la insercion de lisina y alanina despues de glicina en la posicion 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".
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[0050] En tales casos el/los residuo(s) de aminoacido insertado(s) se numera(n) mediante la adicion de letras minusculas al numero de posicion del residuo de aminoacido precedente al/a los residuo(s) de aminoacido insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia seria asi:
Progenitor:
Variante:
195
195 195a 195b
G
CD i 1 >
[0051] Modificaciones multiples. Las variantes que comprenden modificaciones multiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" representan una sustitucion de tirosina y acido glutamico por arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, respectivamente.
[0052] Sustituciones diferentes. Cuando se puedan introducir sustituciones diferentes en una posicion, las sustituciones diferentes se separan con una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitucion de arginina por tirosina o acido glutamico en la posicion 170. Asi, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167AIa+Arg170Gly", y "Tyr167 Ala+Arg170Ala".
Alfa-amilasas parentales
[0053] La alfa-amilasa parental puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1.
[0054] En un aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1.
[0055] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 1. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1.
[0056] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1.
[0057] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 2.
[0058] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 2 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 2.
[0059] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 2.
[0060] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 2.
[0061] La alfa-amilasa parental puede ser tambien un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ iD N.°: 3.
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[0062] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 3 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 3.
[0063] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 3. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 3.
[0064] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 3.
[0065] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 4.
[0066] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 4 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 4.
[0067] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 4. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 4.
[0068] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 4.
[0069] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5.
[0070] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5.
[0071] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 5. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5.
[0072] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5.
[0073] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6.
[0074] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6.
[0075] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 6. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6.
[0076] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6.
[0077] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 7.
[0078] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 7 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos
5 un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 7.
[0079] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 7. En otro 10 aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 7.
[0080] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 7.
[0081] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 8.
[0082] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 8 de 15 al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos
un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 8.
20 [0083] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 8. En otro
aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 8.
[0084] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 8.
[0085] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 9.
25 [0086] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 9 de
al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido desde el 30 polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 9.
[0087] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 9. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 9.
[0088] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 9.
[0089] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con 35 el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 10.
[0090] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 10 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en
40 cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 10.
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[0091] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 10. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 10.
[0092] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 10.
[0093] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 11.
[0094] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 11 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 11.
[0095] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 11. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 11.
[0096] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 11.
[0097] La alfa-amilasa parental tambien puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 12.
[0098] En otro aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 12 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en no mas de diez aminoacidos, por ejemplo, en cinco aminoacidos, en cuatro aminoacidos, en tres aminoacidos, en dos aminoacidos y en un aminoacido del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 12.
[0099] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 12. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 12.
[0100] En otra forma de realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 12.
[0101] La secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, o un fragmento de la misma, se puede utilizar para disenar sondas de acido nucleico para identificar y clonar ADN que codifica un progenitor de cepas de diferentes generos o especies segun metodos bien conocidos en la tecnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridar con el ADN genomico o el ADNc del genero o especies de interes, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estandares, para identificar y aislar el gen correspondiente en los mismos. Tales sondas pueden ser considerablemente mas cortas que la secuencia entera, pero deberian ser de al menos 14, por ejemplo, al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleotidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de acidos nucleicos es de al menos 100 nucleotidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleotidos, al menos 300 nucleotidos, al menos 400 nucleotidos, al menos 500 nucleotidos, al menos 600 nucleotidos, al menos 700 nucleotidos, al menos 800 nucleotidos o al menos 900 nucleotidos de longitud. Se pueden usar tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas se marcan tipicamente para la deteccion del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). La presente invencion abarca tales sondas.
[0102] Se puede cribar una genoteca de ADN genomico o ADNc obtenido a partir de tales otros organismos para seleccionar ADN que hibride con las sondas anteriormente descritas y que codifique un progenitor. El ADN genomico u de otro tipo de tales otros organismos se puede separar por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras tecnicas de separacion. El ADN de las genotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado, que se usa en una transferencia de Southern.
[0103] Para los fines de la presente invencion, la hibridacion indica que el polinucleotido hibrida con una sonda nucleotidica marcada que corresponde a un polinucleotido que codifica SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3,
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SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12 o una subsecuencia del mismo, en condiciones de astringencia de baja a muy alta. Las moleculas con las que la sonda hibrida se pueden detectar utilizando, por ejemplo, peKcula radiografica o cualquiera de los otros medios de deteccion conocidos en la tecnica.
[0104] En un aspecto, la sonda de acido nucleico es un polinucleotido que codifica el polipeptido de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12 o un fragmento del mismo.
[0105] Para sondas largas de al menos 100 nucleotidos de longitud, se definen las condiciones de astringencia muy bajas a muy altas como prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado y o bien formamida al 25% para astringencias muy bajas y bajas, o bien formamida al 35% para astringencias medias y medias-altas o bien formamida al 50% para astringencias altas y muy altas, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estandares durante 12 a 24 horas optimamente. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 45°C (astringencia muy baja), 50°C (astringencia baja), 55°C (astringencia media), 60°C (astringencia media-alta), 65°C (astringencia alta) o 70°C (astringencia muy alta).
[0106] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleotidos a aproximadamente 70 nucleotidos de longitud, las condiciones de astringencia se definen como prehibridacion e hibridacion a aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 10°C por debajo de la Tm calculada utilizando el calculo segun Bolton y McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390) en 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, NP-40 al 0,5%, solucion de Denhardt 1X, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobasico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estandares durante 12 a 24 horas optimamente. El material portador se lava finalmente una vez en SCC 6X mas SDS al 0,1% durante 15 minutos y dos veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 6X a desde 5°C hasta 10°C por debajo de la Tm calculada.
[0107] El progenitor puede obtenerse a partir de microorganismos de cualquier genero. Para los fines de la presente invencion, el termino "obtenido de" como se utiliza en la presente en relacion con una fuente dada significara que el progenitor codificado por un polinucleotido lo produce una fuente o una celula en la que se ha insertado el polinucleotido de la fuente. En un aspecto, el progenitor es secretado extracelularmente.
[0108] El progenitor puede ser una alfa-amilasa bacteriana. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipeptido bacteriano grampositivo tal como una alfa-amilasa de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus o Streptomyces, o un polipeptido bacteriano gramnegativo tal como una alfa-amilasa de Campylobacter, E. Coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella o Ureaplasma.
[0109] En un aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.
[0110] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.
[0111] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans.
[0112] El progenitor puede ser una alfa-amilasa fungica. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de levadura tal como una alfa-amilasa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de hongos filamentosos tal como una alfa-amilasa de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor,
Schizophylum, Scytalidium, Talaromyces, Termoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.
[0113] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces
5 norbensis o Saccharomyces oviformis.
[0114] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium
10 tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, 15 Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
20 [0115] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus sp., por ejemplo, la alfa-amilasa de SEQ ID N.°:
1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5 o SEQ ID N.°: 6.
[0116] Se entiende que, para las especies anteriormente mencionadas, la invencion abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos, y otros equivalentes taxonomicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la tecnica reconoceran facilmente la identidad de
25 equivalentes apropiados.
[0117] Las cepas de estas especies son facilmente accesibles al publico en varias colecciones de cultivo, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
30 [0118] El progenitor se puede identificar y obtener de otras fuentes, que incluyen microorganismos asilados de la
naturaleza (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las tecnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de habitats naturales son bien conocidas en la tecnica. Puede obtenerse entonces de forma similar un polinucleotido que codifique un progenitor cribando una genoteca de ADNc o 35 genomica de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez ha sido detectado con una(s) sonda(s) un polinucleotido que codifica un progenitor, el polinucleotido se puede aislar o clonar utilizando tecnicas que conocen los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
[0119] El progenitor puede ser un polipeptido hibrido en el cual se fusiona una porcion de un polipeptido en el extremo N-terminal o el C-terminal de una porcion de otro polipeptido.
40 [0120] El progenitor tambien puede ser un polipeptido fusionado o polipeptido de fusion escindible en el cual se
fusiona un polipeptido en el extremo N-terminal o el C-terminal de otro polipeptido. Un polipeptido fusionado se produce por fusion de un polinucleotido que codifica un polipeptido con un polinucleotido que codifica otro polipeptido. Las tecnicas para producir polipeptidos de fusion se conocen en la tecnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipeptidos de modo que estas esten en marco y que la expresion del polipeptido fusionado este 45 bajo control del mismo promotor(es) y terminador. Las proteinas de fusion tambien se pueden construirse usando tecnologia de interna en la cual las fusiones se crean postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 25752583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-7799).
[0121] Un polipeptido de fusion puede ademas comprender un sitio de escision entre los dos polipeptidos. Cuando se secreta la proteina de fusion, el sitio se escinde y se liberan los dos polipeptidos. Los ejemplos de sitios de escision
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incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Preparacion de variantes
[0122] La presente invencion se refiere a un metodo para obtener una variante de una alfa-amilasa parental, que comprende la introduccion en la alfa-amilasa parental una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, donde cada modificacion es independientemente una sustitucion, delecion o insercion y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y para recuperar la variante, donde las modificaciones comprenden modificaciones en las posiciones seleccionadas entre:
W140 + E260;
W140 + W189 + E260;
W140 + W189 + G477;
W140 + W189 + G476;
W140 + W189 + W439; y
W140 + E260 + G476.
[0123] La presente descripcion tambien se refiere a metodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprende: (a) la introduccion en una alfa-amilasa parental de una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 140, 181, 189, 134, 195, 206, 243, 260, 262, 284, 304, 347, 439, 469, 476 y 477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11 o SEQ ID N.°: 12, donde la numeracion corresponde a la SEQ ID N.° 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperacion de la variante.
[0124] En un aspecto la invencion se refiere a un metodo para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprende: (a) la introduccion en una alfa-amilasa parental de una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a W140, R181, W189, D134, N195, V206, Y243, E260, F262, W284, G304, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11 o SEQ ID N.°: 12, donde la numeracion corresponde a la SEQ ID N.° 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperacion de la variante.
[0125] En una forma de realizacion la modificacion introducida es una sustitucion.
[0126] En otra forma de realizacion se refiere a un metodo para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprende: (a) la introduccion en una alfa-amilasa parental de una sustitucion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a G304RKEQ, W140YF, W189EGT, D134E, E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY, F262GP, W284DHFYR, W347HFY, W439RG, G476EQRK, G477EQKMR del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11 o SEQ ID N.°: 12, donde la numeracion esta segun SEQ ID N.° 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperacion de la variante.
[0127] En una forma de realizacion preferida, las sustituciones introducidas son dos o mas de G304R, W140YF, W189EGT, D134E, E260GHIKNRTY, W284DFR, W439RG, G476EK, G477EKMR. En una forma de realizacion con mayor preferencia, las sustituciones introducidas son G304R, W140YF, E260GHIKNPRTY y G476EQRK. En una forma de realizacion aun con mayor preferencia, el metodo para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, comprende: (a) la introduccion en una alfa-amilasa parental sustituciones de G304R, W140Y, E260G y G476K en cualquiera de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11 o SEQ ID N.°: 12, donde la numeracion corresponde a la SEQ ID N.° 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperacion de la variante. Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagenesis conocido en la tecnica, tal como mutagenesis
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dirigida, construccion de gen sintetico, construccion de gen semisintetico, mutagenesis aleatoria, recombinacion aleatoria, etc.
[0128] La mutagenesis dirigida es una tecnica en la que una o mas (varias) mutaciones se crean en uno o mas sitios definidos en un polinucleotido que codifica el progenitor.
[0129] La mutagenesis dirigida se puede realizar in vitro mediante PCR empleando cebadores oligonucleotidos con la mutacion deseada. La mutagenesis dirigida tambien puede realizarse in vitro mediante mutagenesis de casete, que implica la escision por una enzima de restriccion en un sitio del plasmido que comprende un polinucleotido que codifica el progenitor y el ligamiento posterior de un oligonucleotido con la mutacion con el polinucleotido. Normalmente la enzima de restriccion que digiere el plasmido y el oligonucleotido es la misma, permitiendo que los extremos cohesivos del plasmido y del inserto se enlacen uno con otro. Vease, por ejemplo, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 76: 4949-4955; and Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.
[0130] La mutagenesis dirigida al sitio tambien puede realizarse in vivo mediante metodos conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, U.S. Patent Application Publication No. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; and Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 1516.
[0131] Se puede usar cualquier procedimiento de mutagenesis dirigida en la presente invencion. Hay muchos kits comerciales disponibles que pueden utilizarse para preparar variantes.
[0132] La construccion de genes sinteticos implica la sintesis in vitro de una molecula de polinucleotido disenada para codificar un polipeptido de interes. La sintesis genica se puede realizar utilizando varias tecnicas, tales como la tecnologia con microchip de sintesis multiple descrita por Tian et al. (004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologias similares en las que los oligonucleotidos se sintetizan y se ensamblan en chips microfluidicos fotoprogramables.
[0133] Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoacidos unicas o multiples se pueden realizar y evaluar usando metodos conocidos de mutagenesis, recombinacion y/o recombinacion aleatoria, seguido de un procedimiento de cribado pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros metodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a errores, presentacion en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagenesis dirigida a la region (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0134] Los metodos de mutagenesis/recombinacion aleatoria pueden combinarse con metodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipeptidos mutagenizados clonados expresados por celulas hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moleculas de ADN mutagenizadas que codifican polipeptidos activos se pueden recuperar de las celulas hospedadoras y secuenciar rapidamente usando metodos estandar en la tecnica. Estos metodos permiten determinar rapidamente la importancia de residuos de aminoacidos individuales de un polipeptido.
[0135] La construccion de genes semisinteticos se realiza combinando aspectos de la construccion de genes sinteticos, y/o mutagenesis dirigida al sitio, y/o mutagenesis aleatoria, y/o recombinacion aleatoria. La construccion semisintetica se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleotidos que son sintetizados, en combinacion con tecnicas de PCR. Regiones definidas de genes se pueden sintetizar asi de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores de mutagenesis dirigida al sitio, mientras que otras regiones mas se pueden someter a amplificacion por PCR propensa a errores o no propensa a errores. Las subsecuencias de polinucleotido pueden entonces recombinarse.
Variantes
[0136] La presente descripcion tambien proporciona variantes de una alfa-amilasa parental que incluye una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, y en la que cada modificacion es independientemente una sustitucion, insercion o delecion (preferiblemente una sustitucion) y la variante tiene actividad de alfa-amilasa. Por la presente, se proporcionan variantes que tienen un rendimiento de
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lavado a baja temperatura mejorado, en comparacion con la alfa-amilasa parental o en comparacion con la alfa- amilasa de SEQ ID N.°: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12.
[0137] En una forma de realizacion, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, con la secuencia de aminoacidos de la alfa-amilasa parental.
[0138] En otra forma de realizacion, la divulgacion se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa, que incluyen una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, en las que cada modificacion es independientemente una sustitucion, delecion o insercion, y en la que la variante tiene al menos un 80% pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de cualquiera de SEQ ID N.° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, y en la que la variante tiene actividad de alfa-amilasa.
[0139] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1.
[0140] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 2.
[0141] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 3.
[0142] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 4.
[0143] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5.
[0144] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6.
[0145] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 7.
[0146] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 8.
[0147] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 9.
[0148] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 10.
[0149] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 11.
[0150] En otra forma de realizacion, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos 5 un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%,
de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 12.
[0151] En un aspecto, el numero de modificaciones en las variantes de la presente invencion es de 2-20, por ejemplo, 2-10 y 2-5, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones.
[0152] En un aspecto, una variante comprende una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a 10 las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477. En otro aspecto,
una variante comprende una modificacion en dos posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477. En otro aspecto, una variante comprende una modificacion en tres posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477. En otro aspecto, una variante comprende una modificacion en 15 cuatro posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477. En otro aspecto, una variante comprende una modificacion en cinco posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones G304, W140, W189, d134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477. En otro aspecto, una variante comprende una modificacion en seis posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477. En 20 otro aspecto, una variante comprende una modificacion en cada posicion correspondiente a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477. Las posiciones corresponden a las posiciones de la SEQ ID N.°: 1. Se prefiere que las modificaciones sean sustituciones.
[0153] En una forma de realizacion, la variante comprende una sustitucion en dos, tres o cuatro posiciones seleccionadas del grupo constituido por G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y
25 G477.
[0154] En una forma de realizacion preferida, la variante comprende una sustitucion en dos, tres o cuatro posiciones seleccionadas del grupo constituido por G304, W140, E260 y G476.
[0155] En un aspecto de la invencion, la variante comprende dos o mas (varias) sustituciones seleccionadas del grupo constituido por G304RKEQ, W140YF, W189EGT, D134E, E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY, F262GP, W284DHFYR,
30 W347HFY, W439RG, G476EQRK, G477EQKMR.
[0156] Se prefiere que la variante segun la invencion comprenda sustituciones en dos, tres o cuatro posiciones seleccionadas del grupo constituido por G304R, W140YF, E260GHIKNPRTY y G476EQRK. En una forma de realizacion con mayor preferencia, las sustituciones en las posiciones dos, tres o cuatro se seleccionan del grupo constituido por G304R, W140Y, E260G y G476K.
35 [0157] En una forma de realizacion, la variante comprende ademas una o mas sustituciones seleccionadas del grupo
constituido por T51IL, S52Q, N54K, G109A, E194D, N195F, V206Y, Y243F, G109A, G273DV, G337N, K72R, R181H, S303G y Y100I. En una forma de realizacion preferida, la sustitucion o sustituciones adicionales se seleccionan del grupo constituido por N195F, V206Y, Y243f. Preferiblemente, la variante comprende dos o tres de estas sustituciones. Por la presente, se proporcionan variantes que tienen un rendimiento de lavado a baja temperatura 40 mejorado ademas de una estabilidad a la deplecion de Ca2+ mejorada, en comparacion con la alfa-amilasa parental o en comparacion con la alfa-amilasa de SEQ ID N.°: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12.
[0158] En otro aspecto de la invencion, la variante comprende dos o mas (varias) sustituciones del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11 o SEQ ID N.°: 12, seleccionados del grupo constituido por 45 D134E, E260G, E260H, E260I, E260K, E260N, E260R, E260T, G109A, G273D, G273V, G337N, G476E, G477E,
G477M, G477R, K72R, R181H, S303G, W140F, W140Y, W189E, W189G, W189T, W284D y Y100I.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0159] Las variantes pueden comprender ademas una modificacion en una o mas (varias) posiciones distintas. Por ejemplo, las variantes pueden comprender una modificacion en una posicion que corresponde con las posiciones G182*+D183* o D183*+G184*.
[0160] En otro aspecto, la invencion se refiere a variantes que comprenden sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T +W284D,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D134E+G476E,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R, y
N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D.
[0161] En otro aspecto, la invencion se refiere a variantes que consisten en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T +W284D,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W2840,
G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D134E+G476E,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D, Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R, y
N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0162] En otro aspecto, la invencion se refiere a variantes que comprenden modificaciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D183*+G184*+D134E+G476E,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
D183*+G184*+Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
D183*+G184*+T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
D183*+G184*+T51 I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
D183*+G184*+T51 I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R, y
D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D.
[0163] En otro aspecto, la invencion se refiere a variantes que consisten en modificaciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D183*+G184*+D134E+G476E,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
D183*+G184*+Y1001+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N, D183*+G184*+W140Y+N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E D183*+G184*+T51 I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G D183*+G184*+T51 I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R D183*+G184*+T51 I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R, y D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D
[0164] Los aminoacidos esenciales en un progenitor se pueden identificar segun procedimientos conocidos en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta ultima tecnica, se introducen mutaciones de una unica alanina en cada residuo de la molecula, y se determina la actividad de alfa-amilasa de las moleculas mutantes resultantes para identificar
residuos de aminoacidos que son criticos para la actividad de la molecula. Vease tambien, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la alfa-amilasa u otra interaccion biologica tambien puede determinarse mediante analisis fisico de la estructura, como se determina por tecnicas tales como la resonancia magnetica nuclear, cristalografia, difraccion de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutacion de aminoacidos del posible 5 sitio de contacto. Vease, por ejemplo, dde Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoacidos esenciales tambien puede inferirse a partir de analisis de identidad con polipeptidos relacionados con el progenitor.
Polinudeotidos
[0165] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que codifican cualquiera de las variantes de 10 la presente invencion.
Constructos de acido nucleico
[0166] La presente invencion tambien se refiere a constructos de acido nucleico que comprenden un polinucleotido que codifica una variante de la presente invencion operativamente unido a una o mas (varias) secuencias de control que dirigen la expresion de la secuencia codificante en una celula hospedadora adecuada en condiciones compatibles
15 con las secuencias de control.
[0167] Un polinucleotido se puede manipular en una variedad de maneras para proveer a la expresion de una variante. La manipulacion del polinucleotido antes de su insercion en un vector puede ser deseable o necesaria en funcion del vector de expresion. Las tecnicas para la modificacion de polinucleotidos utilizando metodos de ADN recombinante se conocen en la tecnica.
20 [0168] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, que es reconocida por una celula hospedadora
para la expresion del polinucleotido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que median la expresion de la variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de acido nucleico que muestre actividad transcripcional en la celula hospedadora incluyendo promotores mutantes, truncados e hibridos, y se puede obtener genes que codifican polipeptidos extracelulares o intracelulares bien homologos o bien heterologos a la celula 25 hospedadora.
[0169] Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion de los constructos de acido nucleico de la presente invencion en una celula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de la amilasa maltogenica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de la 30 levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el operon lac de E. coli, el gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen de la beta-lactamasa procariotica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), asi como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; and in Sambrook et al., 1989, supra.
35 [0170] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion de los constructos de acido nucleico de la
presente invencion en una celula hospedadora de hongo filamentoso son los promotores obtenidos de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en medio acido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus orizae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo 40 tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de de Rhizomucor miehei, proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma 45 reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei,
beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, asi como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado incluyendo un gen que codifica una alfa-amilasa neutra de Aspergilli en el que la secuencia lider no traducida se ha sustituido por una secuencia lider no traducida de un gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en Aspergilli; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados incluyendo el gen que codifica la alfa-amilasa neutra en Aspergillus niger en el que 50 la secuencia lider no traducida se ha sustituido por una secuencia lider no traducida del gen que codifica la triosa
5
10
15
20
25
30
35
40
45
fosfato isomerasa en el Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e hforidos de los mismos.
[0171] En un huesped de levadura, se obtienen promotores utiles de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), deshidrogenasa de alcohol dehidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y cinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores utiles para celulas hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[0172] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia terminadora de transcripcion adecuada, que es reconocida por una celula hospedadora para terminar la transcripcion. La secuencia terminadora esta operativamente unida al extremo 3'-terminal del polinucleotido que codifica la variante. Puede utilizarse cualquier terminador que sea funcional en la celula hospedadora.
[0173] Los terminadores preferidos para celulas hospedadoras fungicas filamentosas se obtienen de los genes de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0174] Los terminadores preferidos para celulas hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores utiles para celulas hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.
[0175] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia lider adecuada, una region no traducida de un ARNm que es importante para la traduccion en la celula hospedadora. La secuencia lider esta operativamente unida al extremo 5'-terminal del polinucleotido que codifica la variante. Puede utilizarse cualquier secuencia lider que sea funcional en la celula hospedadora.
[0176] Las secuencias lideres preferidas para celulas hospedadoras fungicas filamentosas se obtienen de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0177] Las secuencias lideres adecuadas para celulas hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
[0178] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia de poliadenilacion, una secuencia operativamente unida al extremo 3'-terminal de la secuencia codificante de la variante y, cuando se transcribe, la celula hospedadora la reconoce como una senal para anadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilacion que sea funcional en la celula hospedadora.
[0179] Las secuencias de poliadenilacion preferidas para celulas hospedadoras fungicas filamentosas se obtienen de los genes de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxisporum.
[0180] Las secuencias de poliadenilacion utiles para celulas hospedadoras de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[0181] La secuencia de control tambien puede ser una region codificante del peptido senal que codifica un peptido senal unido al extremo N-terminal de una variante y dirige la variante a la via secretora de la celula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleotido puede contener intrinsecamente una region codificante del peptido senal naturalmente unida en el marco de lectura de traduccion con el segmento de la region codificante que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una region codificante del peptido senal que es exogena a la secuencia codificante. La region codificante del peptido senal exogena puede requerirse donde la secuencia codificante no contiene de manera natural una region codificante del peptido senal. Alternativamente, la region codificante del peptido senal exogena puede reemplazar simplemente la region codificante
del peptido senal natural para mejorar la secrecion de la variante. Sin embargo, puede utilizarse cualquier region codificante del peptido senal que dirija la variante expresada a la v^a secretora de una celula hospedadora.
[0182] Las secuencias codificantes del peptido senal eficaces para celulas hospedadoras bacterianas son las secuencias codificantes del peptido senal obtenidas de los genes de la amilasa maltogenica de Bacillus NCIB 11837,
5 subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis prsA. Se describen peptidos senal adicionales en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[0183] Las secuencias codificantes del peptido senal eficaces para celulas hospedadoras fungicas filamentosas son las secuencias codificantes del peptido senal obtenidas de los genes de la amilasa neutra de Aspergillus niger,
10 glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei.
[0184] Los peptidos senal utiles para celulas hospedadoras de levadura se obtienen de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otras secuencias codificantes del peptido senal utiles en Romanos et al., 1992, supra.
15 [0185] La secuencia de control tambien puede ser una region codificante del propeptido que codifica un propeptido
situado en el extremo N-terminal de una variante. El polipeptido resultante se conoce como una proenzima o propolipeptido (o un zimogeno en algunos casos). Un propolipeptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipeptido activo por escision catalitica o autocatalitica del propeptido desde el propolipeptido. La region codificante del propeptido se puede obtener de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), la 20 proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), la lacasa de Myceliophthora thermofila (WO 95/33836), la proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei y el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[0186] Cuando tanto el peptido senal como las regiones de propeptido estan presentes en el extremo N-terminal de una variante, la region de propeptido se situa junto al extremo N-terminal de la variante y la region del peptido senal se situa junto al extremo N-terminal de la region de propeptido.
25 [0187] Tambien puede ser deseable anadir secuencias reguladoras que permitan la regulacion de la expresion de la
variante en relacion con el crecimiento de la celula hospedadora. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causa que la expresion del gen se active o se desactive en respuesta a una sustancia quimica o un estimulo fisico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarioticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras, puede utilizarse el sistema ADH2 o GAL1. En hongos filamentosos, 30 pueden usarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus orizae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificacion genica. En sistemas eucarioticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneina que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleotido que codifica la variante estaria operativamente 35 unido a la secuencia reguladora.
Vectores de expresion
[0188] La presente invencion tambien se refiere a vectores de expresion recombinantes que comprenden un polinucleotido de la presente invencion, un promotor y senales de terminacion transcripcional y traduccional. Las varias secuencias de nucleotidos y de control se pueden unir para producir un vector de expresion recombinante que
40 pueden incluir uno o mas (varios) sitios de restriccion convenientes para permitir la insercion o sustitucion del polinucleotido que codifica la variante en tales sitios. Alternativamente, el polinucleotido se puede expresar mediante la insercion del polinucleotido o de un constructo de acido nucleico que comprende el polinucleotido, en un vector apropiado para la expresion. En la creacion del vector de expresion, la secuencia codificante se localiza en el vector, de modo que la secuencia codificante esta operativamente unida a las secuencias de control apropiadas para la 45 expresion.
[0189] El vector de expresion recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plasmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresion del polinucleotido. La eleccion del vector dependera tipicamente de la compatibilidad del vector con la celula hospedadora en la que el vector va a introducirse. El vector puede ser un plasmido lineal o cerrado circular.
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[0190] El vector puede ser un vector de replicacion autonoma, es dedr, un vector que existe como una entidad extracromosomica, la replicacion del cual es independiente de la replicacion cromosomica, por ejemplo, un plasmido, un elemento extracromosomico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicacion. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la celula hospedadora, se integra en el genoma y se replica con el cromosoma(s) en el que se ha integrado. Ademas, se pueden utilizar un vector o plasmido unico o dos o mas vectores o plasmidos que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la celula hospedadora, o un transposon.
[0191] El vector contiene preferiblemente uno o mas (varios) marcadores seleccionables que permiten la seleccion facil de celulas transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia virica o a biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxotrofos y similar.
[0192] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus licheniformis o de Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiotica tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina o tetraciclina. Marcadores adecuados para celulas hospedadoras de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para uso en una celula hospedadora de hongo filamentoso incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), asi como equivalentes de los mismos. Los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus se prefieren para uso en una celula de Aspergillus.
[0193] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite(n) la integracion del vector en el genoma de la celula hospedadora o la replicacion autonoma del vector en la celula independientemente del genoma.
[0194] Para la integracion en el genoma de la celula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleotido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integracion en el genoma mediante recombinacion homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias nucleotidicas adicionales para dirigir la integracion por recombinacion homologa en el genoma de la celula hospedadora en una ubicacion(es) precisa(s) en el cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integracion en una ubicacion precisa, los elementos integradores deberian contener un numero suficiente de acidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinacion homologa. Los elementos integradores pueden ser cualquier secuencia que sea homologa a la secuencia diana en el genoma de la celula hospedadora. Ademas, los elementos integradores pueden ser secuencias nucleotidicas codificantes o no condificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la celula hospedadora por recombinacion no- homologa.
[0195] Para la replicacion autonoma, el vector puede comprender ademas un origen de replicacion que permite al vector replicarse autonomamente en la celula hospedadora en cuestion. El origen de replicacion puede ser cualquier replicador de plasmido que medie la replicacion autonoma que funcione en una celula. El termino "origen de replicacion" o "replicador de plasmido" significa una secuencia nucleotidica que permite que un plasmido o vector se replique in vivo.
[0196] Ejemplos de origenes bacterianos de replicacion son los origenes de replicacion de los plasmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicacion en E. Coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAM01 que permiten la replicacion en Bacillus.
[0197] Ejemplos de origenes de replicacion para uso en una celula hospedadora de levadura son los origenes de replicacion de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinacion de ARS1 y CEN3, y la combinacion de ARS4 y CEN6.
[0198] Ejemplos de origenes de replicacion utiles en una celula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construccion de plasmidos o vectores que comprenden el gen pueden conseguirse segun los metodos descritos en WO 00/24883.
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[0199] Se pueden insertar mas de una copia de un polinucleotido de la presente invencion en la celula hospedadora para aumentar la produccion de una variante. Se puede obtener un aumento en el numero de copias del polinucleotido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la celula hospedadora o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleotido donde las celulas que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, asi, copias adicionales del polinucleotido, se pueden seleccionar por cultivo de las celulas en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0200] Los procedimientos usados para unir los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresion recombinantes de la presente invencion son bien conocidos por un experto en la materia (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) para obtener variantes sustancialmente puras.
Celulas hospedadoras
[0201] La presente invencion tambien se refiere a celulas hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleotido de la presente invencion operativamente unido a una o mas (varias) secuencias de control que dirigen la produccion de una variante de la presente invencion. Una construccion o vector que comprende un polinucleotido se introduce en una celula hospedadora de modo que la construccion o vector se mantiene como un integrante cromosomico o como un vector extracromosomico que se autorreplica como se ha descrito anteriormente. El termino "celula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una celula progenitora que no es identica a la celula progenitora debido a mutaciones que ocurran durante la replicacion. La eleccion de una celula hospedadora dependera en gran parte del gen codificante de la variante y su fuente.
[0202] La celula hospedadora puede ser cualquier celula util en la produccion recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.
[0203] La celula hospedadora procariotica puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. Coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
[0204] La celula hospedadora bacteriana puede ser cualquier celula de Bacillus, incluyendo, pero de forma no limitativa, celulas de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.
[0205] La celula hospedadora bacteriana tambien puede ser cualquier celula de Streptococcus, incluyendo, pero de forma no limitativa, celulas de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.
[0206] La celula hospedadora bacteriana tambien puede ser cualquier celula de Streptomyces, incluyendo, pero de forma no limitativa, celulas de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.
[0207] La introduccion de ADN en una celula de Bacillus puede, por ejemplo, efectuarse por transformacion de protoplastos (vease, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando celulas competentes (vease, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por electroporacion (vease, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751), o por conjugacion (vease, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introduccion de ADN en una celula de E. coli puede, por ejemplo, efectuarse por transformacion de protoplastos (vease, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporacion (vease, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introduccion de ADN en una celula de Streptomyces puede, por ejemplo, efectuarse por transformacion de protoplastos y electroporacion (vease, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugacion (vease, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 35833585), o por transduccion (vease, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introduccion de ADN en una celula de Pseudomonas puede, por ejemplo, efectuarse por electroporacion (vease, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o por conjugacion (vease, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introduccion de ADN en una celula de Streptococcus puede, por
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ejemplo, ser efectuada por competencia natural (vease, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformacion de protoplastos (vease, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070, por electroporacion (vease, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o por conjugacion (vease, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, puede usarse cualquier metodo conocido en la tecnica para introducir ADN en una celula hospedadora.
[0208] La celula hospedadora tambien puede ser un eucariota, tal como un mamifero, un insecto, una planta o una celula fungica.
[0209] La celula hospedadora puede ser una celula fungica. Los "hongos" como se utilizan en la presente incluyen los filos de Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota asi como los hongos Oomycota y todos los mitosporicos (como se definen en Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edicion, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).
[0210] La celula hospedadora fungica puede ser una celula de levadura. La "levadura" como se utiliza en la presente incluye levadura ascoesporogena (Endomycetales), levadura basidioesporogena y levadura perteneciente a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificacion de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invencion, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
[0211] La celula hospedadora de levadura puede ser una celula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia tal como una celula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.
[0212] La celula hospedadora fungica puede ser una celula fungica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivision Eumycota y Oomycota (como se define en Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacaridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por crecimiento hifal y el catabolismo de carbono es aerobico estricto. En cambio, el crecimiento vegetativo de las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce por gemacion de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0213] La celula hospedadora fungica filamentosa puede ser una celula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.
[0214] Por ejemplo, la celula hospedadora fungica filamentosa puede ser una celula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
[0215] Las celulas fungicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formacion de protoplastos, transformacion de los protoplastos y regeneracion de la pared celular de una manera conocida per se. Se describen procedimientos adecuados para la transformacion de celulas hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma en EP 238023 y Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Se describen metodos adecuados para
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transformar especies de Fusarium en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Se puede transformer levadura utilizando los procedimientos descritos en Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, pags 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Metodos de produccion
[0216] La presente invencion tambien se refiere a metodos de produccion de una variante, que comprende: (a) el cultivo de una celula hospedadora de la presente invencion en condiciones adecuadas para la expresion de la variante; y (b) la recuperacion de la variante.
[0217] Las celulas hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la produccion de la variante utilizando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la celula se puede cultivar mediante cultivo en frascos en agitacion o mediante fermentacion a pequena o gran escala (incluyendo fermentacion en continuo, por lotes, por lotes alimentados o en estado solido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permitan que se exprese y/o se aisle el polipeptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrogeno y carbono y sales inorganicas, utilizando procedimientos conocidos en la tecnica. Los medios adecuados estan disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar segun composiciones publicadas (por ejemplo, en catalogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se segrega en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se segrega, se puede recuperar de lisados celulares.
[0218] La variante se puede detectar utilizando metodos conocidos en la tecnica que son especificos para las variantes. Estos metodos de deteccion pueden incluir el uso de anticuerpos especificos, la formacion de un producto enzimatico o la desaparicion de un sustrato enzimatico. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimatico para determinar la actividad de la variante.
[0219] La variante se puede recuperar por metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero de forma no limitativa, recoleccion, centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion o precipitacion.
[0220] La variante se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo, pero de forma no limitativa, cromatografia (por ejemplo, de intercambio ionico, de afinidad, hidrofobica, cromatoenfoque y de exclusion por tamano), procedimientos electroforeticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitacion de sulfato amonico), SDS-PAGE o extraccion (vease, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.
[0221] En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que una celula hospedadora de la presente invencion que expresa la variante se usa como fuente de la variante.
Composiciones
[0222] La presente invencion tambien se refiere a composiciones que comprenden una variante de la presente invencion. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal variante. El termino "enriquecido" se refiere a que la actividad de alfa-amilasa de la composicion ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de 1.1.
[0223] La composicion puede comprender una variante como el componente enzimatico principal, por ejemplo, una composicion monocomponente. Alternativamente, la composicion puede comprender multiples actividades enzimaticas, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolitica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolitica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La enzima(s) adicional puede ser producida, por ejemplo, por un microorganismo del genero Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Fusarium, por ejemplo,
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Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Humicola, por ejemplo, Humicola insolens o Humicola lanuginosa; o Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
[0224] Las composiciones se pueden preparar conforme a metodos conocidos en la tecnica y pueden estar en forma de un liquido o de una composicion seca. Por ejemplo, la composicion puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. La variante se puede estabilizar conforme a metodos conocidos en la tecnica.
[0225] Segun la invencion, las variantes de alfa-amilasa anteriores pueden tipicamente ser un componente en una composicion de limpieza, tal como una composicion detergente, por ejemplo, una composicion de detergente para ropa o una composicion de detergente de lavado de vajillas. Se prefiere especialmente una composicion liquida de detergente para ropa.
[0226] Tales composiciones de limpieza comprenden un complemento de limpieza/detergente, preferiblemente una mezcla de componentes. Tipicamente, el complemento de limpieza estara presente en la composicion en una cantidad de 0,001 a 99,9% en peso, mas tipicamente de 0,01 a 80% en peso del complemento de limpieza.
[0227] En otro aspecto preferido, la composicion comprende uno o mas tensioactivos, que pueden ser no ionicos, incluyendo semipolares, y/o anionicos y/o cationicos y/o zwitterionicos y/o anfolitico y/o semipolar y/o mezclas derivadas. Los tensioactivos estan presentes tipicamente en una proporcion de un 0,1% a un 60% en peso o de un 0,5 a un 50% en peso o de un 1 a un 40% en peso de la composicion.
Usos
[0228] La presente invencion se dirige tambien a metodos para utilizar las variantes de alfa-amilasa. Las variantes de alfa-amilasa de la invencion son utiles en composiciones detergentes, lavado de ropa, lavado de vajillas y/o procesos de limpieza a bajas temperaturas.
EJEMPLOS
Ensavo pNP-G7 para la determinacion de la actividad de alfa-amilasa
[0229] La actividad de alfa-amilasa se puede determinar por un metodo que utiliza el sustrato G7-pNP. El G7-pNP, que es una abreviatura para 4,6-etilideno(G/)-p-nitrofenil(Gi)-a,D-maltoheptaosido, es un oligosacarido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa, tal como una alfa-amilasa. Despues de la escision, la alfa-glucosidasa incluida en el kit continua digiriendo el sustrato hidrolizado para liberar una molecula de PNP libre que tiene un color amarillo y asi se puede medir por espectrofometria visible a A = 405 nm (400-420 nm). Los kits que contienen el sustrato G7-pNP y alfa-glucosidasa estan fabricados por Roche/Hitachi (N.° cat. 11876473).
REACTIVOS:
[0230] El sustrato G7-pNP de este kit contiene 22 mM de 4,6-etilideno- G7-pNP y 52,4 mM de HEPES (acido 2-[4-(2- hidroxietil)-1-piperazinil]-etanosulfonico), pH 7,0).
[0231] El reactivo de alfa-glucosidasa contiene 52,4 mM de HEPES, 87 mM de NaCl, 12,6 mM de MgCl2, 0,075 mM CaCl2, s 4 kU/L de alfa-glucosidasa).
[0232] La solucion de trabajo del sustrato se prepara mediante la mezcla de 1 mL del reactivo de alfa-glucosidasa con 0,2 mL del sustrato G7-pNp. Esta solucion de trabajo del sustrato se prepara inmediatamente antes de usarla.
[0233] El tampon de dilucion: 50 mM de MOPS, 0,05% de Triton de X100 (p/v) (eter de p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenilo de polietilenglicol (C14H22O(C2H4O)n (n = 9-10))), 1 mM CaCb; pH 8,0.
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PROCEDIMIENTO:
[0234] La muestra de amilasa que se iba a analizar se diluyo en el tampon de dilucion para asegurar que el pH en la muestra diluida era 7. El ensayo se realizo transfiriendo 20 pl de muestras de enzima diluida a una placa de microtitulacion de 96 pocillos y anadiendo 80 pl de solucion de trabajo del sustrato. La solucion se mezclo y preincubo 1 minuto a temperatura ambiente y la absorcion se midio cada 20 s. durante 5 minutos a una DO de 405 nm.
[0235] La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorcion en funcion del tiempo es directamente proporcional a la actividad especifica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestion en el conjunto de condiciones dado. La muestra de amilasa deberia diluirse a una cantidad donde la pendiente sea inferior a 0,4 unidades de absorbancia por minuto.
Ensavo automatico de tension mecanica (AMSA) para lavado de ropa
[0236] Para valorar el rendimiento de lavado en el lavado de ropa se realizan experimentos, utilizando el ensayo automatico de tension mecanica (AMSA). Con el AMSA, se puede evaluar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de volumenes pequenos de soluciones detergentes con enzima. La placa AMSA tiene un numero de ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que presiona firmemente la muestra de lavado de ropa, el tejido que se va a lavar, contra todas las aberturas de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el tejido y la tapa se agitan energicamente para poner la solucion de ensayo en contacto con el tejido y aplicar tension mecanica de una manera regular, con oscilacion periodica. Para una descripcion adicional vease WO02/42740, especialmente el parrafo "Special method embodiments" en la pagina 23-24.
Descripcion general de rendimiento de lavado
[0237] Se prepara una solucion de ensayo que comprende agua (10°dH), detergente, por ejemplo, 5,1 g/L de detergente liquido europeo como se describe a continuacion y la enzima de la invencion, por ejemplo, en una concentracion de 0, 0,8 y/o 1,2 mg de proteina enzimatica/L Se anaden tejidos manchados con almidon (por ejemplo, CS-28 del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Paises Bajos) y se lavan durante 20 minutos a 20°C. Tras enjuagar a fondo con agua del grifo corriente y secar a oscuras, la intensidad de luz o los valores de reflectancia de los tejidos manchados se miden posteriormente como medida del rendimiento de lavado. El ensayo con 0 mg de proteina enzimatica/L se usa como blanco para obtener un valor de remision delta. Se aplica preferiblemente accion mecanica durante la etapa de lavado, por ejemplo, agitando, rotando o removiendo la solucion de lavado con los tejidos. Los experimentos de rendimiento de lavado AMSA se realizaron en las condiciones experimentales especificadas a continuacion:
Tabla 1: condiciones experimentales AMSA
Dosificacion de detergente liquido para ropa
5,7 g/L de detergente liquido europeo (EU) (cf. ejemplo 1A), o 0,8 g/L de detergente liquido estadounidense (EE. UU.) (cf. ejemplo 1B)
Volumen de solucion de ensayo
160 micro L
pH
segun esta
Tiempo de lavado
20 minutos
Temperatura
20°C
Dureza del agua
10°dH, Ca2+:Mg2+: HCOs- = 3:1:6
Concentracion enzimatica en la solucion de ensayo
0,8 y 1,2 Mg/L
Material de ensayo
CS-28 (almidon de arroz en algodon)
[0238] El tampon de dilucion de amilasa: la amilasa se diluyo en agua ultrapura (agua MilliQ) con una concentracion pequena de calcio (0,1 mM) para estabilizar la amilasa durante el almacenamiento y 0,01 % de Triton X-100 para reducir el riesgo de adsorcion de proteina enzimatica a los recipientes y las pipetas.
5
10
15
20
25
30
35
40
[0239] La dureza del agua se ajusto a 10°dH por adicion de CaCl2, MgCl2 y NaHCO3 (Ca2+:Mg2+:HCO3- = 3:1:4,5) al sistema de ensayo. Despues de lavar los tejidos se enjuagaron en agua del grifo y se secaron.
[0240] El rendimiento de lavado se mide como la luminosidad del color del tejido lavado. La luminosidad puede tambien expresarse como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra esta manchada, la intensidad de la luz reflejada es inferior a la de una muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada puede utilizarse para medir el rendimiento de lavado.
[0241] Las mediciones de color se realizan con un escaner plano profesional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29; DK-2605 Br0ndby, Dinamarca), que se utiliza para capturar una imagen del tejido lavado.
[0242] Para extraer un valor de la intensidad de luz de las imagenes escaneadas, valores de 24 bits por pixel de la imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calcula anadiendo los valores RGB juntos como vectores y luego obteniendo la longitud del vector resultante:
imagen1
[0243] Tejidos: la muestra textil CS-28 (almidon de arroz en algodon) se obtiene del Center For P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Paises Bajos.
Los resultados del ensayo AMSA de lavado de ropa con diferentes variantes se muestran en resultado, el mdice es 100. Al resultado de rendimiento de la alfa-amilasa parental se le asigna resultados de las variantes se comparan con este valor.
Rendimiento de lavado AMSA
[0244] El rendimiento de lavado de las variantes y las alfa-amilasas parentales correspondientes se evaluaron con el metodo de ensayo AMSA como se describe en la seccion de metodos. Los resultados se dan como (el rendimiento de la variante menos el rendimiento del blanco) dividido por (el rendimiento del progenitor menos el rendimiento de del blanco) multiplicados por 100, donde el blanco es el rendimiento obtenido mediante el lavado en las mismas condiciones, pero en ausencia de alfa-amilasa. Por ultimo, se calcularon las medias de rendimiento relativo a las dos concentraciones 0,8 y 1,2 Mg/L. Los resultados se presentan en la Tabla 3.
Ensayo de lavado Terg-O-tometer (TOM)
[0245] El Tergo-To-Meter (TOM) es un sistema de lavado modelo a media escala que se puede aplicar para evaluar 12 condiciones de lavado diferentes simultaneamente. Un TOM es basicamente un gran bano de agua con control de temperatura con hasta 12 vasos de precipitados metalicos abiertos sumergidos en el. Cada vaso de precipitados constituye una lavadora pequena del tipo de carga superior y, durante un experimento, cada una de ellas contendra una solucion de un sistema especfico de detergente/enzima y los tejidos sucios y limpios en los que se evalua su rendimiento. La tension mecanica se consigue con un brazo de agitacion rotativa, que remueve el liquido dentro de cada vaso de precipitados. Debido a que los vasos de precipitados del TOM no tienen tapa, es posible retirar muestras durante un experimento TOM y evaluar la information en lmea durante el lavado.
[0246] El sistema de lavado del modelo TOM se usa principalmente en ensayos a media escala de detergentes y enzimas en los EE. UU. o en condiciones de lavado LA/AP. En un experimento TOM, se pueden variar los factores tales como la proportion entre carga y suciedad y la proportion entre tejido y licor de lavado. Por lo tanto, el TOM proporciona la conexion entre los experimentos a pequena escala, tales como AMSA y mini lavado, y los experimentos de mayor duracion a escala real en lavadoras de carga superior.
[0247] Equipo: el bano de agua con 12 vasos de precipitados de acero y 1 brazo rotativo por vaso de precipitados con capacidad de 500 o 1200 mL de solucion detergente. La temperatura varia de 5 a 80°C. El bano de agua tiene que llenarse con agua desionizada. La velocidad de rotation se puede ajustar de 70 a 120 rpm/min.
Testmaterials BV,
la Tabla 3. En el el valor 100 y los
Rendimiento de lavado TOM
[0248] La dureza del agua se ajusto a la fuerza descrita a continuacion por adicion de CaCl2, MgCl2 y NAHCO3. Las soluciones de lavado se prepararon con la cantidad deseada de detergente, temperatura y dureza del agua en un cubo como se describe mas adelante. El detergente se disolvio mediante agitacion magnetica durante 10 min. (La
5 solucion de lavado se uso de 30 a 60 min despues de la preparacion).
[0249] La temperatura y la rotacion (rpm) en el bano de agua en el Terg-O-Tometer se fijaron segun los ajustes indicados mas adelante. Cuando la temperatura se fijo segun los ajustes (la tolerancia es +/- 0,5°C) se anadio la solucion de lavado al vaso de precipitados TOM segun la cantidad descrita mas adelante.
[0250] La agitacion en el vaso de precipitados fue de 120 rpm. 2 muestras de almidon de arroz (CS-28) y carga de 10 tierra se anadieron a cada uno de los vasos de precipitados y el lavado se realizo segun el tiempo declarado mas
adelante. Las muestras se enjuagaron en agua del grifo fria durante 5 min. Las muestras se dejaron secar a oscuras durante la noche.
[0251] Tejido: la muestra de tejido CS-28 (almidon de arroz en algodon) se obtuvo del Center for Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, el Paises Bajos.
15 [0252] Carga de suciedad: algodon/poliester manchado de almidon de arroz (EMPA 162) se obtuvo del Center for
Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Paises Bajos. La salsa de carne Bistro (063KC), el batido de chocolate Frij, los espaguetis Heinz (113KC), el chocolate doble Herseys se obtuvieron de Warwick Equest Ltd, Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham, DH8 6BN Reino Unido
[0253] Los resultados del ensayo de lavado TOM de diferentes variantes se muestran en la Tabla 3. En el resultado el 20 indice es 100. Al resultado de rendimiento de la alfa-amilasa parental (SEQ ID N.°: 7) se le asigna el valor 100 y los resultados de las variantes se comparan con este valor.
Tabla 2: condiciones experimentales
Condiciones europeas (EU) Condiciones estadounidenses (EE. UU.)
Dosificacion de detergente
5,77 g/L (detergente liquido) 0,78 g/L (detergente liquido)
Dureza del agua
15°dH (Ca2+:Mg2+: HCO3- = 4:1:7.5) 6°dH (Ca2+:Mg2+: HCO3- = 2:1: 4,5)
Concentracion enzimatica en la solucion de lavado
0,25 mg de proteina enzimatica/L 0,08 mg de proteina enzimatica/L
Volumen de solucion de ensayo
500 ml 800 ml
Tiempo de lavado
30 minutos 18 minutos
Rotacion
120 rpm
pH
segun esta
Temperatura
15°C
[0254] Los detergentes y materiales de ensayo fueron los siguientes:
Detergente para ropa liquido
Condiciones europeas (EU): HDL normal (Heavy Duty Liquid) como se describe en el ejemplo 1A mas adelante. Condiciones estadounidenses (EE. UU.) : HDL normal (Heavy Duty Liquid) como se describe en el ejemplo 1B mas adelante.
Material de ensayo
CS-28 (almidon de arroz en algodon)
Carga de suciedad
Almidon de arroz en poliester/algodon (EMPA 162), salsa de carne Bistro (063KC), batido de chocolate Frij, espaguetis Heinz (113KC), chocolate doble Herseys (2 muestras de cada)
[0255] El rendimiento de lavado se midio como la luminosidad del color del tejido lavado expresado en valores de remision. Las mediciones de remision se realizaron utilizando un espectrofotometro Macbeth 7000 Color Eye. Se midieron cada una de las muestras secas. Como existe un riesgo de interferencia con el fondo, las muestras se colocaron encima de 4 capas de tejido durante la medicion de la remision. La remision se midio a 460 nm. El filtro UV
5 no se incluyo. Se calculo un resultado medio de la remision de las muestras.
Ejemplo 1
Rendimiento de lavado de las alfa-amilasas en detergente liquido europeo (EU) (ejemplo 1A) y estadounidense (ejemplo 1B) (EE. UU.)
[0256] El rendimiento de lavado de la variante evaluada y la alfa-amilasa parental correspondiente (SEQ ID N.°: 7) se 10 evaluaron como se ha descrito anteriormente. Los resultados se dan como (rendimiento de la variante menos
rendimiento del blanco) dividido entre (rendimiento del progenitor menos rendimiento del blanco) multiplicado por 100; donde el blanco es el rendimiento obtenido mediante lavado en las mismas condiciones, pero en ausencia de alfa- amilasa.
Ejemplo 1A: composicion de detergente europeo para ropa Heavy Duty Liquid 15 [0257]
Ejemplo 1A
(% en peso)
Alquilbencenosulfonato sodico
11,7
Acido citrico
2,27
Acido graso C12-18
0,82
Alquil etoxi 3 sulfato sodico
3,9
Alquilo C12-18 1,5-7-etoxilado
2,4
Un compuesto con la siguiente estructura general: bis((C2H5O)(C2H4O)n) (CHs)-N+-CxH2x-N+-(CHs)- bis((C2H5O)(C2H4O)n), donde n = de 20 a 30, y x = de 3 a 8, o variantes sulfatadas o sulfonadas de las mismas
0,66
Copolimero de injerto aleatorio1
0,83
Quelante fosfonado
0,48
Abrillantador
0,091
Hidrotropo
0,95
Componentes minoritarios: tintes, perfumes enzimas, estabilizadores enzimaticos, disolventes, estructurantes. Modificadores del pH
Equilibrio
1Copolimero de injerto aleatorio es un copolimero de oxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de oxido de polietileno y multiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal de oxido de polietileno es aproximadamente 6000 y la proporcion en peso de oxido de polietileno a acetato de polivinilo es aproximadamente 40 a 60 y no mas de 1 punto de injerto por cada 50 unidades de oxido de etileno.
Ejemplo 1B: composicion de detergente estadounidense para ropa Heavy Duty Liquid
[0258]
Ejemplo 1B
(% en peso)
Alquil etoxi 1,8 sulfato sodico
17,29
Alquilbencenosulfonato sodico
7,73
Alquilsulfato ramificado
3,3
Alquil-1,5-9-etoxilado C12-18
1,31
Oxido de dimetilamina C12
1,03
Acido dtrico
0,67
Acido graso C12-18
1,52
Borato sodico (Borax)
2,53
Polietilenimina etoxilada 2
1,44
Quelante fosfonado
0,34
Sal disodica hidratada del acido dihidroxibenceno-3,5-disulfonico
0,19
Abrillantador
0,29
PoHmero limpiador de grasa anfifilico alcoxilado3
1,93
Componentes minoritarios: tintes, perfumes enzimas, estabilizadores enzimaticos, disolventes, estructurantes, modificadores del pH
Equilibrio
2Polietilenimina (PM = 600) con 20 grupos etoxilato por -NH. 3Polimero limpiador de grasa anfifilico alcoxilado es una polietilenimina (PM = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH.
Tabla 3: Rendimiento de lavado
Sustituciones de la SEQ ID N.°: 7 (numeracion segun la SEQ ID N.°: 1)
US 20°C AMSA US 15°C TOM EU 20°C AMSA EU 15°C TOM
N195F + V206Y + Y243F
85 113 94 100
E260I
99 115 103 126
E260K
108 107 119 125
W140Y + N195F + V206Y + Y243F
104 108 110 104
N195F + V206Y + Y243F + W284D
120 107 78 126
W140F + R181H
113 130 122 115
N195F + V206Y + E260R + G273D
94 104 104 95
N195F + V206Y + Y243F + E260K + G273D
102 137 91 125
D134E + G476E
120 137 108 120
K72R + N195F + V206Y + Y243F + E260H + G273V
120 132 118 152
N195F + V206Y + Y243F + E260N + G273V
97 123 107 102
W140Y + N 195F + V206Y + Y243F + E260G
107 149 119 111
N195F + V206Y + Y243F + E260K + W284D
136 209 107 116
W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + W284D
144 111 107 101
W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260T + W284D
138 273 117 120
W189E + N195F + V206Y + Y243F
108 129 128 117
W140Y + N195F + V206Y + Y243F + W284D
147 254 112 123
N195F + V206Y + Y243F + G477R
110 108 110 123
N195F + V206Y + Y243F + G477M
105 110 105 104
W140Y+ W189G + N195F + V206Y + Y243F + E260G
124 132 103 113
W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + G477E
122 313 113 103
W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + G476E
125 114 117 108
W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + S303G
113 112 114 110
W140Y + W189T + N195F + V206Y + Y243F + E260G
119 112 123 111
W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + G337N
110 109 119 113

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    1. Variante aislada dotada de actividad de alfa-amilasa, de una alfa-amilasa parental, comprendiendo una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476, y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, donde cada modificacion es independientemente una sustitucion, delecion o insercion, y donde la variante tiene al menos un 80%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.° 1, y donde la variante comprende sustituciones en las posiciones de residuos seleccionadas de:
    W140 + E260;
    W140 + W189 + E260; W140 + W189 + G477; W140 + W189 + G476; W140 + W189 + W439; y W140 + E260 + G476.
  2. 2. Variante segun la reivindicacion 1, que comprende dos o mas (varias) sustituciones seleccionadas del grupo constituido por G304R, W140YF, W189EGT, D134E, E260GHIKNRTY, W284DFR, W439RG, G476EK, G477EKMR.
  3. 3. Variante segun la reivindicacion 1 o 2, donde el numero de modificaciones es 2-20, por ejemplo, 2-10 y 2-5, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones.
  4. 4. Variante segun la reivindicacion 1 o 2, que tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95% de identidad, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de SEQ ID N.° 1.
  5. 5. Variante segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende sustituciones en las posiciones, correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
    G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
    G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
    G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
    T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
    T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
    T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K, y
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R.
  6. 6. Variante segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene sustituciones solo en las posiciones, correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
    G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
    G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
    G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
    T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
    T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
    T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K, y
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R.
  7. 7. Variante segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende ademas deleciones en las posiciones correspondientes a las posiciones G182*+D183* o D183*+G184* de sEqiD N.°: 1.
  8. 8. Variante segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende modificaciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E, D183*+G184*+140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D, D183*+G184*+109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G, D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    D183*+G184*+Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
    D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
    D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
    D183*+G184*+T51 I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
    D183*+G184*+T51 I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
    D183*+G184*+T51 I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K, y
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R.
  9. 9. Variante segun la reivindicacion 8, que contiene modificaciones solo en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipeptido de SEQ ID N.°: 1, seleccionadas del grupo constituido por:
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
    D183*+G184*+140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
    D183*+G184*+109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    D183*+G184*+Y1001+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
    D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
    5
    10
    15
    20
    25
    D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E D183*+G184*+T51 I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G D183*+G184*+T51 I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R D183*+G184*+T51 I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K, y D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R.
  10. 10. Polinucleotido aislado que codifica la variante segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
  11. 11. Constructo de acido nucleico que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 10.
  12. 12. Vector de expresion que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 10.
  13. 13. Celula hospedadora que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 10.
  14. 14. Metodo de produccion de una variante de una alfa-amilasa parental, que comprende el cultivo de la celula hospedadora segun la reivindicacion 13 en condiciones adecuadas para la expresion de la variante; y la recuperacion de la variante.
  15. 15. Metodo para obtener una variante de una alfa-amilasa parental, que comprende la introduccion en la alfa-amilasa parental una modificacion en dos o mas (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476, y G477 del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 1, donde cada modificacion es independientemente una sustitucion, delecion o insercion y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y la recuperacion de la variante, donde las modificaciones comprenden modificaciones en las posiciones seleccionadas entre:
    W140 + E260;
    W140 + W189 + E260; W140 + W189 + G477; W140 + W189 + G476; W140 + W189 + W439; y W140 + E260 + G476.
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