TR201903008T4 - Kollajen-aracılı hastalıkları tedavi etmek için uygun bileşimler. - Google Patents

Kollajen-aracılı hastalıkları tedavi etmek için uygun bileşimler. Download PDF

Info

Publication number
TR201903008T4
TR201903008T4 TR2019/03008T TR201903008T TR201903008T4 TR 201903008 T4 TR201903008 T4 TR 201903008T4 TR 2019/03008 T TR2019/03008 T TR 2019/03008T TR 201903008 T TR201903008 T TR 201903008T TR 201903008 T4 TR201903008 T4 TR 201903008T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
collagenase
fermentation
sample
sds
post
Prior art date
Application number
TR2019/03008T
Other languages
English (en)
Inventor
L Sabatino Gregory
J Del Tito Benjamin Jr
J Bassett Phillip
A Tharia Hazel
G Hitchcock Antony
Yu Bo
L Wegman Thomas
Original Assignee
Biospecifics Tech Corporation
Endo Global Ventures
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biospecifics Tech Corporation, Endo Global Ventures filed Critical Biospecifics Tech Corporation
Publication of TR201903008T4 publication Critical patent/TR201903008T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24007—Interstitial collagenase (3.4.24.7), i.e. matrix metalloprotease 1 or MMP1

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Colostridium histolyticum'dan hayli saflaştırılmış kollajenaz I'in ve kollajenaz II'nin bir kombinasyonunu içeren bir ilaç ürünü açıklanır. İlaç ürünü en az %95'ten daha fazla olan bir saflık ile, yaklaşık 1 ila 1'lik bir oranda kollajenaz I ve kollajenaz II içerir. Buluş ilaveten, söz konusu ilaç ürününü hazırlamak için iyileştirilmiş fermantasyon ve saflaştırma proseslerini açıklamıştır.

Description

TARIFNAME KOLLAJEN-ARACILI HASTALIKLARI TEDAVI ETMEK içiN UYGUN BILESIMLER BULUSUN ALT YAPISI Kollajen memeli organizmalarin majör yapisal bilesenidir ve hayvan vücudunun cildinin ve diger parçalarinin toplam protein içeriginin büyük bir kismini olusturur. Insanlarda, bu özellikle yara iyilesmesi prosesinde ve dogal yaslanma prosesinde önemlidir. Çesitli cilt travmalari, örnegin, yaniklar, cerrahi, enfeksiyon ve kaza siklikla kollajen açisindan zengin olan ve arttirilmis proteoglikan içerigine sahip olan fibröz dokunun erratik birikimi ile karakterize edilir. Hasar görmüs veya yok edilmis normal dokunun degistirilmesine ek olarak, yeni dokunun asiri ve çirkinlestiren depolari bazen iyilesme prosesi sirasinda olusur. Asiri kollajen depolanmasi kollajen sentezi ve kollajen parçalanmasi arasindaki dengedeki bir bozulmaya atfedilmistir. Çok sayida hastalik ve rahatsizlik kollajen depolanmasi ve kollajen açisindan zengin fibröz dokunun erratik birikimi ile iliskilendirilir. Bu tarz hastaliklar ve rahatsizliklar kolektif bir sekilde burada "kollajen-aracin hastaliklar" olarak ifade edilir. Kollajenaz, çesitli kollajenaz-aracin hastaliklari tedavi etmek için kullanilmaktadir. Kollajenaz, kollajeni sindirmeye yönelik spesifik yetiye sahip olan bir enzimdir. Terapide kullanim için kollajenaz memeliyi (örn., insani), kabuklulari (örn., yengeci, karidesi), fungali ve bakteriyeli içeren çesitli kaynaklardan (örn., Clostridium, Streptomyces, Pseudomonas veya Vibrio fermantasyonundan) elde edilebilir. Kollajenaza ayrica genetik olarak mühendislik uygulanmistir. Ham kollajenazin bir yaygin kaynagi, bir bakteriyel fermantasyon prosesinden, spesifik olarak C. histolyti'cum (C. his) fermantasyonundan, elde edilir. C. his'ten elde edilen ham kollajenaz çok sayida kromatografik teknigin herhangi biri kullanilarak saflastirilabilir. C. his'ten fermantasyon prosesinin bir dezavantaji, bunun, siklikla kollajen aracili rahatsizliklari tedavi etmek için terapötik bilesimlerde kullanilan, çesitli kollajenazlarin, örnegin, kollajenaz I'n ve kollajenaz II'nin belirsiz oranlarini üretmesidir. Ilaveten, kültür tarihsel olarak et ürünlerinin kullanimini gerektirir. Bu et kültürü orijinal olarak Clostridium histolyticum'un H4 susundan, 1956'da Kolombiya Üniversitesi'nde Dr. I. Mandl'in laboratuvarinda, türetilmistir ve ATCC ile depolanmistir. Liyofilize edilmis viyaller pisirilmis et kültüründen yapilmistir ve ABC olarak adlandirilmistir. Clostridium histolyticum master hücre bankasi. Bir terapötik kollajenaz preparasyonunda kollajenaz I'in kollajenaz Il'ye çesitli oranlari farkli biyolojik etkilere sahiptir. Bundan dolayi, burada preparasyon içinde kollajenaz I'in kollajenaz ll'ye oraninin üstün ve tutarli enzim aktivitesi ve terapötik etki elde etmek için kolaylikla ve etkili bir sekilde belirlenebildigi ve kontrol edilebildigi bir terapötik kollajenaz preparasyonu arzu edilebilecektir. WO 98/24889, kollajenaz I, kollajenaz II ve bir endoproteaz içeren bilesimleri açiklar. Bilesimler doku yeniden-modellemesine olanak saglamak için ekstraselüler doku matrikslerinin enzimatik ayrilmasi ve dokudan canli hücrelerin ve hücre kümelerinin fermantasyonunda elde edilen en az bir enzimi saflastirmanin bir yöntemini açiklar. kollajenaz tarif edilir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus bir ilaç olarak kullanim için, 1 ila 1'Iik bir kütle oranina sahip olan, sirasiyla Clostridium histo/yti'cum kollajenazi I'den ve kollajenazi Il'den olusan bir kollajenaz bilesimi saglar, burada kollajenaz bilesimi, ters fazli yüksek performansli sivi kromatografi ile ölçüldügü üzere, alan olarak en az %95 olan bir safliga sahiptir. Bir baska yönünde, bulusun kollajenaz bilesimi, Dupuytren hastaligindan; Peyronie hastaligindan; donuk omuzdan (adheziv kapsülitten): keloidlerden; hipertrofik skarlardan; deprese skarlardan, örnegin, enflamatuvar aknelerden kaynaklananlardan; cerrahi-sonrasi adezyonlardan; akne vulgaristen; Iipomlardan ve neoplastik fibrözden olusan gruptan seçilen bir kollajen-aracin hastaliktan muzdarip olan bir süjeyi tedavi etmede kullanim içindir. Kollajen-aracili hastaliklari tedavi etmek için bir farmasötik bilesim olarak kullanildiginda, bulusun bilesimi, yan etkiler için potansiyeli düsürürken, iyilestirilmis ve Bir baska yönünde, bulus bir farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan ve sirasiyla Clostridi'um histolyticum kollajenazi I'in ve kollajenazi Il'nin dizisine sahip olan kollajenaz I'den ve kollajenaz Il'den olusan bir kollajenaz bilesimi içeren bir farmasötik formülasyon saglar, burada kollajenaz I ve kollajenaz ll yaklasik 1 ila 1'lik bir kütle oranina sahiptir ve kollajenaz bilesimi ters fazli yüksek performansli sivi kromatografi ile ölçüldügü üzere alan olarak en az %95'tir. Bir baska yönünde, bulus bir ilaç olarak kullanim için bulusun formülasyonunu saglar. Bir baska yönünde, bulusun formülasyonu, Dupuytren hastaligindan; Peyronie hastaligindan; donuk omuzdan (adheziv kapsülitten); keloidlerden; hipertrofik skarlardan; deprese skarlardan, örnegin, enflamatuvar aknelerden kaynaklananlardan; cerrahi-sonrasi adezyonlardan; akne vulgaristen; Iipomlardan ve neoplastik fibrözden olusan gruptan seçilen bir kollajen-aracin hastaliktan muzdarip olan bir süjeyi tedavi etmede kullanim içindir. Bir baska yönünde, bulus bir süjede kirisiklik veya selülit olusumunu tedavi etmek için bir terapötik-olmayan kozmetik yöntem saglar, bu yöntem süjeye bulusun kollajenaz bilesimini veya bulusun formülasyonunu uygulamayi içerir. Bir baska yönünde, bulus bir ilaç olarak kullanim için, ters fazli yüksek performansli sivi kromatografi ile ölçüldügü üzere, alan olarak en az %95 olan bir safligi olan Clostridium histolyticum kollajenaz l'i saglar. Bir baska yönünde, bulus bir ilaç olarak kullanim için, ters fazli yüksek performansli sivi kromatografi ile ölçüldügü üzere, alan olarak en az %95 olan bir safligi olan Clostridium histolyticum kollajenaz ll'si saglar. Ayrica burada, bulusun bir kollajenaz bilesimini, bulusun bir bilesimini içeren farmasötik formülasyonlari hazirlamak için yöntemler ve bir kollajen-aracili hastaliktan muzdarip olan hastalari bulusun bir kollajenaz bilesimini kullanarak tedavi etmek için yöntemler de açiklanir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Bulusun yukaridaki ve baska amaçlari, özellikleri ve avantajlari, burada benzer referans karakterlerin farkli görüsler boyunca ayni parçalari ifade ettigi, eslik eden sekillerde gösterildigi üzere, bulusun tercih edilen uygulamalarinin asagidaki daha özel açiklamasindan asikâr olacaktir. Sekiller ister istemez ölçeksizdir, bunun yerine bulusun prensiplerini göstermeye önem verilmistir. Sekil 1, 5 L DCFT24a,b fermantasyonlari içinde C. histolyticum'un büyüme egrilerini (zamana karsi OD) gösterir. Sekil 2, 5 L DCFT24a,b fermantasyonlari içinde C. histolytioum'un net büyüme egrilerini (zamana karsi Net OD) gösterir. Sekil 3, ikinci fermantasyondan bir %8'Iik Tris-glisin SDS PAGEjelidir: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: Kollajenaz I - 0,27 ug Serit 3: Kollajenaz lI - 0,29 ug Serit 4: 20 saat ( - Hasat noktasi Serit 5: 19 saat ( Serit 6: 17 saat ( Serit 7: 16 saat ( Serit 8: 15 saat ( Serit 9: 14 saat ( Serit 10: 13 saat ( Serit 12: 10,5 saat (; Sekil 4, birinci fermantasyondan bir %8'Iik Tris-glisin SDS PAGE jelidir: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 3: Kollajenaz II - 0.29ug Serit 4: 20 saat ( - Hasat noktasi Serit 5: 19 saat ( Serit 6: 17 saat ( Serit 7: 16 saat ( Serit 8: 15 saat ( Serit 9: 14 saat ( Serit 10: 13 saat ( Serit 11: 11.4 saat ( Serit 12: 10,4 saat (; Sekil 5, ikinci fermantasyon için bir yari-kantitatif SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 6: 0,27 pg Kollajenaz I Serit 7: 0,18 pg Kollajenaz I Serit 9: 0,29 iJg Kollajenaz II Serit 10: 0,193 pg Kollajenaz Il Serit 11: 0,145 pg Kollajenaz II; Sekil 6, DCFT26a ve DCFT26b için kullanilan fermantasyon stratejisini temsil eder; Sekil 7, 5 L DCFT26a,b fermantasyonlarinda C. histolyticum'un büyüme egrilerini (zamana karsi OD) gösterir; Sekil 8, 5 L DCFT26a,b fermantasyonlarinda C. histolyticum'un net büyüme egrilerini (zamana karsi Net OD) gösterir; Sekil 9, DCFT26a için bir SDS PAGE jelidir: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 4: 20 saat ( - Hasat noktasi Serit 5: 19 saat ( Serit 6: 18 saat ( Serit 7: 17 saat ( Serit 8: 16 saat ( Serit 9: 14 saat ( Serit 10: 13 saat ( Serit 11: 11 saat (; Sekil 10, DCFT26b için bir SDS PAGE jelidir: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: 20 saat ( - Hasat noktasi Serit 3: 19 saat ( Serit 4: 18 saat ( Serit 5: 17 saat ( Serit 6: 16 saat ( Serit 7: 15 saat ( Serit 8: 14 saat ( Serit 9: 13 saat ( Serit 10: 11 saat ( Serit 11: Kollajenaz I - 0,67 pg Serit 12: Kollajenaz ll - 0,72 ug; Sekil 11, DCFT26a için bir yari-kantitatif SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: 0,27 09 Kollajenaz I Serit 3: 0,18 ug Kollajenaz I Serit 4: 0,135 iJg Kollajenaz I Serit 6: 0,193 pg Kollajenaz II Serit 7: 0,145 pg Kollajenaz II Sekil 12, DCFT26b için bir yari-kantitatif SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: 0,27 pg Kollajenaz l Serit 3: 0,18 pg Kollajenaz I Serit 6: 019309 Kollajenaz II Serit 7: 0,145 09 Kollajenaz II Sekil 13, diyaliz-sonrasi amonyum sülfat ile çökeltilmis (100 g/L ve 150 g/L) örnekler, DCFTZGa için bir SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 0,67 ug Kollajenaz l ve 0,72 pg Kollajenaz ll 0,27 pg Kollajenaz I ve 0,29 ug Kollajenaz ll 8011'den 6,12 pL süpematant örnegi diyaliz-sonrasi örnek - 100 g/L AS (susuz) diyaliz-sonrasi örnek - 100 g/L AS (1/5) diyaliz-sonrasi örnek - 100 g/L AS (1110) diyaliz-sonrasi örnek - 150 g/L AS (susuz) diyaliz-sonrasi örnek - 150 g/L AS (1/5) diyaliz-sonrasi örnek - 150 g/L AS (1/10); Sekil 14, diyaliz-sonrasi amonyum sülfat ile çökeltilmis (200 g/L ve 250 g/L) örnekler, DCFT263 için bir SDS PAGE jelidir, hasat noktasi: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 0,67 ug Kollajenaz I ve 0,72 pg Kollajenaz II 0,27 pg Kollajenaz I ve 0,29 pg Kollajenaz Il SC11'den 6,12 pL süpernatant örnegi diyaliz-sonrasi örnek - 200 g/L AS (susuz) diyaliz-sonrasi örnek - 200 g/L AS (1/5) diyaliz-sonrasi örnek - 200 g/L AS (1/10) diyaliz-sonrasi örnek - 250 g/L AS (susuz) diyaliz-sonrasi örnek - 250 g/L AS (1/5) diyaliz-sonrasi örnek - 250 g/L AS (1/10); Sekil 15, diyaliz-sonrasi amonyum sülfat ile çökeltilmis (300 g/L ve 400 g/L) örnekler, DCFT26a için bir SDS PAGE jelidir, hasat noktasi: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 0,67 pg Kollajenaz I ve 0,72 pg Kollajenaz II 0,27 pg Kollajenaz I ve 0,29 pg Kollajenaz II SC11'den 6,12 iJL süpernatant örnegi diyaliz-sonrasi örnek - 300 g/L AS (Susuz örnek) diyaliz-sonrasi örnek - 300 g/L AS (1/5 seyreltme) diyaliz-sonrasi örnek - 300 g/L A8 (1/10 seyreltme) diyaliz-sonrasi örnek - 400 g/L AS (susuz) diyaliz-sonrasi örnek - 4000 g/L AS (1/5 seyreltme) diyaliz-sonrasi örnek - 400 g/L AS (1/10 seyreltme); Sekil 16, PBFT57 fermantasyonunda C. histolyticum'un bir Büyüme egrilerini (zamana karsi CD ve zamana karsi net OD) gösterir. Sekil 17, bir yari-kantitatif SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 0,27 pg Kollajenaz I 0,18 09 Kollajenaz l 0,135 09 Kollajenaz I 0,29 pg Kollajenaz II 0,193 ug Kollajenaz II 0,145 09 Kollajenaz II Sekil 18a, PBFT57 fermantasyonundan diyaliz-sonrasi 500 mL örnek için bir kantitatif SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi. 400 g/L amonyum sülfat eklenmistir: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 0,272 pg Kollajenaz I ve 0,286 pg Kollajenaz ll Serit 3: 0,181 pg Kollajenaz I ve 0,190 pg Kollajenaz Il Serit 6: diyaliz-sonrasi örnek - 400 g/L AS (1/15 seyreltme) Serit 7: diyaliz-sonrasi örnek - 400 g/L AS (1/20 seyreltme) Serit 8: diyaliz-sonrasi örnek - 400 g/L AS (1/25 seyreltme) Serit 9: diyaliz-sonrasi örnek - 400 g/L AS (1/30 seyreltme) Serit 10: diyaliz-sonrasi örnek - 400 g/L AS (1/35 seyreltme) Serit 11: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci; Sekil 18b, amonyum sülfat ile çökeltilmis örneklerin santrifügasyonundan sonra süpernatantlarin bir SDS PAGE'idir: Serit Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 0,27 ug Kol I ve 0,29 pg Kol II Serit Amonyum sülfat ile presipitasyon sonrasi örnegin süpernatanti (susuz) 3: (400 g/L yavas eklenme) Serit Amonyum sülfat ile presipitasyon sonrasi örnegin süpernatanti (susuz) 4: (400 g/L çabuk eklenme) Serit Amonyum sülfat ile presipitasyon sonrasi örnegin süpernatanti (susuz) : (440 g/L yavas eklenme) Serit Amonyum sülfat ile presipitasyon sonrasi örnegin süpernatanti (susuz) 6: (480 g/L yavas eklenme) Serit Amonyum sülfat ile presipitasyon sonrasi örnegin süpernatanti (susuz) 7: (520 g/L yavas eklenme) Serit Amonyum sülfat ile presipitasyon sonrasi örnegin süpernatanti (susuz) 8: (400 g/L, pH 6) Serit Amonyum sülfat ile presipitasyon sonrasi Örnegin süpernatanti (susuz) 9: (400 g/L, oksijenlenmis); Sekil 19, hasat noktasi süpernatantindan ve diyaliz-sonrasi amonyum sülfat ile (400 g/L - çabuk eklenme ile) çökeltilmis örnekten elde edilen seyreltilmis örnekleri gösteren bir yari-kantitatif SDS PAGE jelidir: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: Fermantasyon örnegi - hasat (susuz) Serit 3: Fermantasyon örnegi - hasat (1/1 seyreltme) Serit 4: Fermantasyon örnegi - hasat (1/2 seyreltme) Serit 5: Fermantasyon örnegi - hasat (1/3 seyreltme) Serit 6: Fermantasyon örnegi - hasat (1/4 seyreltme) Serit 7: Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/17,54 seyreltme) serit 1'e karsilik Serit 8: Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/35,08 seyreltme) serit 2'ye karsilik Serit 9: Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/52,62 seyreltme) serit 3'e karsilik Serit Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/70,16 seyreltme) serit 4'e karsilik : gelir Serit Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/87,70 seyreltme) serit 5'e karsilik 11: gelir Sekil 20, PBFT57 için hasat noktasi süpernatantindan ve diyaliz sonrasi amonyum sülfat ile (520 g/L ile) çökeltilmis Örnekten seyreltilmis örnekleri gösteren bir yari- kantitatif SDS PAGE jelidir: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: Fermantasyon örnegi - hasat (susuz) Serit 3: Fermantasyon örnegi - hasat (1/1 seyreltme) Serit 4: Fermantasyon örnegi - hasat (1/2 seyreltme) Fermantasyon örnegi - hasat (1/3 seyreltme) Fermantasyon örnegi - hasat (1/4 seyreltme) Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/15.63) serit 1`e karsilik gelir Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/3126) serit 2'ye karsilik gelir Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/46.89) serit 3'e karsilik gelir Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/62.52) serit 4'e karsilik gelir Diyaliz-sonrasi örnek - hasat (1/78.15) serit 5'e karsilik gelir; Sekil 21, PBFT58c,d fermantasyonlarinda C. histolyt/'cum suslari 004'ün ve O13'ün büyüme egrilerini (zamana karsi Net OD) gösterir; Sekil 22, PBFT58C (Sus 004) için bir SDS PAGE jelidir: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Kollajenaz I - 1,00 pg Kollajenaz l - 0,67 09 Kollajenaz Il - 1,08 iJg Kollajenaz lI - 0,72 pg 16,25 saat ( 17 saat ( 18 saat ( 19 saat ( ,5 saat (: Sekil 23, PBFT58d (Sus 013) için bir SDS PAGEjelidir: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Kollajenaz l - 1,00 pg Kollajenaz I - 0,67 pg Kollajenaz Il - 1,08 09 Kollajenaz ll - 0,72 09 Serit 6: 16,25 saat ( Serit 7: 17 saat ( Serit 8: 18 saat ( Serit 9: 19 saat ( Serit 10: 20,5 saat (; Sekil 24, PBFT580 (sus 004) için bir yari-kantitatif SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: 0,27 ug Kollajenaz I ve 0,29 ug Kollajenaz ll Serit 3: 0,18 pg Kollajenaz I ve 0,19 ug Kollajenaz ll Serit4: 0,135 pg Kollajenaz I ve 0,145 ug Kollajenaz II Serit 6: 6,12 pL örnek Serit 7: 3,06 pL örnek Serit 8: 2,04 pL örnek Serit 9: 1,53 pL örnek Serit 10: 1,22 pL örnek; Sekil 25, PBFT58d (sus 013) için bir yari-kantitatif SDS PAGE jelidir, hasat noktasi örnegi: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: 0,27 pg Kollajenaz I ve 0,29 pg Kollajenaz II Serit 3: 0,18 pg Kollajenaz I ve 0,19 pg Kollajenaz ll Serit 4: 0,135 pg Kollajenaz I ve 0,145 pg Kollajenaz II Serit 5: 0,108 pg Kollajenaz I ve 0,116 pg Kollajenaz II Serit 6: 6,12 pL örnek Serit 7: 3,06 pL örnek 2,04 uL örnek 1,53 uL örnek 1,22 uL örnek; Sekil 26, PBFT580 fermantasyonunun (sus 004) diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi (520 g/L amonyum sülfat) için SDS PAGE jelidir: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 0,27 ug Kollajenaz I ve 0,29 ug Kollajenaz Il 0,18 ug Kollajenaz I ve 0,19 ug Kollajenaz lI 0,135 ug Kollajenaz I ve 0,145 ug Kollajenaz Il 0,108 ug Kollajenaz I ve 0,116 ug Kollajenaz Il diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - Susuz diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - (1/5 seyreltme) diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - (1/10 seyreltme) diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - (1/15 seyreltme) diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - (1/20 seyreltme); Sekil 27, PBFT58d fermantasyonunun (sus 013) diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi (400 g/L amonyum sülfat) için SDS PAGE jelidir: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 0,27 ug Kollajenaz I ve 0,29 ug Kollajenaz lI 0,18 ug Kollajenaz I ve 0,19 ug Kollajenaz II 0,135 ug Kollajenaz I ve 0,145 ug Kollajenaz II 0,108 ug Kollajenaz I ve 0,116 ug Kollajenaz II diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - Susuz diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - (1/5 seyreltme) diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - (1/10 seyreltme) diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi - (1/15 seyreltme) Serit 10: diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi- (1/20 seyreltme); Sekil 28, alternatif bitkisel peptonlari taramak için kullanilan Deneysel prosedürün bir akis çizelgesini gösterir; Sekil 29, DCFT27a,b fermantasyonlari için bir beslemeIi-seri stratejiyi gösterir; Sekil 30, 5 L DCFT27a ve DCFT27b beslemeli-seri fermantasyonlarda C. histolyticum'un büyüme egrilerini (zamana karsi Net 0D) gösterir; Sekil 31, 5 L PBFT59a,b,c seri fermantasyonlarinda C. histolyti'cum'un büyüme egrilerini (zamana karsi Net OD) gösterir; Sekil 32, 5 L DCFT27d beslemeIi-seri fermantasyonunda C. histo/yti'cum'un bir büyüme egrisini (zamana karsi Net OD) gösterir; Sekil 33a, DCFT27d (amino asitler ile takviye edilmis Phytone) için bir SDS PAGE jelidir: Serit 1: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit 2: 18 saat ( Serit 3: 17 saat ( Serit 4: 15 saat ( Serit 5: 14 saat ( Serit 6: 13 saat ( Serit 7: 11.3h ( Serit 8: 0,27 pg Kollajenaz I ve 0,29 pg Kollajenaz II; Sekil 33b, inokülasyon prosedürünün bir sematik diyagramini temsil eder; Sekil 33c, bir yaklasik olarak 200 L'Iik beslemeIi-seri inokülasyon prosesinin bir akis çizelgesini temsil eder; Sekil 34, hidroksiapatit kromatografisinden sonra bir kromatogrami gösterir; Sekil 35, bir fraktojel TMAE anyon degisiminden sonra bir kromatogrami gösterir; Sekil 36, 5 L'Iik ölçek prosesinden HA Öncesi, HA Sonrasi ve TMAE Sonrasi malzemesinin bir %8'Iik Tris-Glisin SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek Yükleme hacmi, pl 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 20 Kollajenaz ABC Il referans 1 ug HA Öncesi -1 ug HA Sonrasi - 1 iJg TMAE Sonrasi - 1 pg Yükleme hacmi, pl2020 Sekil 37, bir fraktojel TMAE anyon degisiminden sonra bir kromatogrami gösterir; Sekil 38, löpeptin varliginda TMAE sonrasi malzeme çalismasinin Q Sepharose IEX kromatografisinin bir %8'Iik Tris-Glisin SDS-PAGE analizidir: Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Kollajenaz ABC II referans 1 pg TMAE Sonrasi/Diyaliz Sonrasi - 1 pg Fraksiyon DG - susuz Fraksiyon E6 - susuz Fraksiyon F7 - 1 ug Fraksiyon F6 - 1 09 Fraksiyon F5 - 1 ug Fraksiyon F4 - susuz Yükleme hacmi, pl20202020 Sekil 39, löpeptin varliginda TMAE sonrasi malzeme çalismasinin Q Sepharose IEX kromatografisinin bir %8'Iik Tris-Glisin SDS-PAGE analizidir. Jel 2- Pik 2 (ABCI): Örnek Yükleme hacmi, pl Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Kollajenaz ABC II referans 1 ug Yükleme hacmi, pl2017 Serit Örnek Yükleme hacmi, ul Yükleme hacmi, pl 4 Fraksiyon 82 - susuz 20 Fraksiyon C1 - 1 ug 20 6 Fraksiyon C2 - 1 ug 20 7 Fraksiyon C3 - 1 09 20 8 Fraksiyon C4 - 1 ug 20 9 Fraksiyon C5 - susuz 20 Fraksiyon C6 - susuz 20; Sekil 40, modifiye edilmis gradyanli bir Q Sepharose HP anyon degisiminden sonra bir kromatogrami gösterir; Sekil 41, ABCII'nin bir Superdex 75 Jel Geçirgenlik kromatograsinden sonra bir kromatogrami gösterir; Sekil 42, arjinin varliginda konsantre edilmis ABC II çalismasinin Superdex 75 GPC'nin bir %12'lik Bis-Tris SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek Yükleme hacmi, pl 1 Mark 12 belirteci 10 2 Kollajenaz ABC l referans 1 ug 15 3 Kollajenaz ABC ll referans 1 pg 15 4 GPC yüklemesi 1 ug 15 Fraksiyon D4 15 6 Fraksiyon D3 15 7 Fraksiyon D2 15 8 Fraksiyon D1 Susuz 15 9 Fraksiyon E1 15 Fraksiyon E2 15 11 Fraksiyon E3 15 12 Fraksiyon E4 15; Sekil 43, ABCI'in bir Superdex 75 Jel Geçirgenlik kromatografisinden sonra bir kromatogrami gösterir; Sekil 44, arjinin varliginda konsantre edilmis ABC I çalismasinin Superdex 75 GPC'nin bir %4-12'Iik Bis-Tris SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek Yükleme hacmi, pl 1 Mark 12 belirteci 10 2 Kollajenaz ABC l referans 1 ug 15 3 Kollajenaz ABC II referans 1 pg 15 4 GPC yüklemesi 1 pg 15 Fraksiyon D4 15 6 Fraksiyon D3 15 7 Fraksiyon D2 15 8 Fraksiyon D1 15 9 Fraksiyon E1 15 Fraksiyon E2 15 11 Fraksiyon ES 15 12 Fraksiyon E4 15; Sekil 45, bir önerilen üretme prosesinin bir akis çizelgesini temsil eder; Sekil 46, proses 3 için fermantasyon prosedürünün bir akis çizelgesini temsil eder; Sekil 47, proses 3 içim saflastirma prosesinin bir akis çizelgesini temsil eder; Sekil 48, AUXI ve AUXII Ara-Ürünleri için Coomasie ile boyanmis bir SDS-PAGE'dir (indirgenmis): 1. Yüksek Moleküler Agirlik Belirteçleri 3. 0,0265 mg/ml ABC-l Referansi . 0,0265 mg/ml AUX-I Ara-ürünü 6. 0,132 mg/ml ABC-II Referansi 7. 0,0265 mg/ml ABC-II Referansi 8. 0,132 mg/ml AUX-Il Ara-ürünü 9. 0,0265 mg/ml AUX-II Ara-ürünü; Sekil 49, Etkin Madde için Coomasie ile boyanmis bir SDS-PAGE'dir (indirgenmis): 1. Yüksek Moleküler Agirlik Belirteçleri 2. 0,132 mg/ml Karma BTC Referansi 3. 0,0265 mg/ml Karma BTC Referansi 4. 0,132 mg/ml Etkin Madde . 0,0265 mg/ml Etkin Madde; Sekil 50, Gümüs ile boyanmis Etkin Madde SDS-PAGE'idir (indirgenmis): . HMW belirteci . Karma BTC referansi 1,3 09 . Etkin Madde 1,3 pg . Etkin Madde 0,27 09 . Etkin Madde 0,13 pg. 03014›pr Sekil 51, bir seri fermantasyonda Proteoz Peptonu #3 üzerinde büyütülen C. histolyticum'un beslemeIi-seri yetistirme sirasinda Phytone pepton kullanilan var olan fermantasyon prosesi ile bir karsilastirmasini gösterir; 4* GCFT03b PP3 serisi + GCFT03d Phytone beslemeIi-seri. Sekil 52, bir 5 L'lik Proteoz Peptonu #3 seri fermantasyonunun (GCFTOBb) (%81ik Tris- Glisin) hasat noktasinda (20 saat) Kollajenaz ürününün bir SBS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 0,27 pg AUXI 3 0,18 09 AUXI 4 0,135 pg AUXI 0,29 09 AUXII Serit Örnek 6 0,193 iig AUXII 7 0,145 pg AUXII Tahminler AUXI ~ 176 mg/L AUXII ~ 190 mg/L Sekil 53, bir 5 L'Iik Phytone beslemeIi-seri fermantasyonun (GCFT03d) (%8'Iik Tris- Glisin) hasat noktasinda (20 saat) Kollajenaz ürününün bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 0,27 pg AUXI 3 0,18 pg AUXI 4 0,135 iJg AUXI 0,29 pg AUXII 6 0,193 pg AUXII 7 0,145 09 AUXII Tahminler AUXI ~ 88 mg/L AUXII ~ 142 mg/L Sekil 54, 50 g/L PP3 üzerinde büyütülen Clostridium histolyticum'un, bir yeniden- üretilebilen büyüme profili gösteren, üç fermantasyonunu gösterir: + Sekil 55, GCFT05d'nin (Proteoz Peptonu #3 ile seri fermantasyon), %8'Iik Tris Glisin jeli, koloidal ile boyanmis) zaman seyrini gösteren bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 Referans, AUXI ve AUXlI 3 3 saat 4 4 saat 5 saat 6 6 saat 7 7 saat 8 8 saat 9 9 saat 10 saat 11 11 saat Sekil 56, GCFT05d'nin (Proteoz Peptonu #3 ile seri fermantasyon), (%8'Iik Tris Glisin jeli, gümüs ile boyanmis) zaman seyrini gösteren bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 Referans, AUXI ve AUXII 3 3 saat 4 4 saat 5 saat 6 6 saat Serit Örnek 7 7 saat 8 8 saat 9 9 saat 10 saat 11 11 saat Sekil 57, DCFT24b'nin (Phytone pepton kullanilan beslemeIi-seri fermantasyon), (%8'lik Tris Glisin jeli, gümüs ile boyanmis) zaman seyrini gösteren bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 AUXI - 0,27 pg 3 AUXII - 0,29 pg 4 20 saat- Hasat noktasi 19 saat 6 17' saat 7 16 saat 8 15 saat 9 14 saat 13 saat 11 11.6 saat 12 10.5 saat Sekil 58, PP3'ün farkli Iotlari kullanilan C. histolyticum fermantasyonlarindan elde edilen büyüme egrilerinin bir karsilastirmasini gösterir: serisi (100 g/L) degerlendirmesini gösterir. Sekil 60, 100 g/L'de PP3'ten yararlanilan iki 5 L'Iik fermantasyonun bir büyüme profilini zaman seyrinin bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 Referans, 0,4 pg AUXI ve AUXII 3 3.1 saat 4 4.4 saat 5.5 saat 6 6.6 saat 7 8.0 saat 8 9.1 saat 9 10.1 saat 11.4 saat 11 12.0 saat zaman seyrinin bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci Serit Örnek 2 Referans, 0,4 ug AUXl ve AUXII 3 3.1 saat 4 4.3 saat 5.5 saat 6 6.6 saat 7 7.8 saat 8 9.1 saat 9 10.1 saat 11.3 saat 11 12.0 saat Sekil 63, hücre büyümesini 5 L'Iik fermantasyon PBFT70c'den ürün olusumu ile karsilastirmak için SDS-PAGE'in bir dansitometri analizini gösterir: --<~-- Öncül ***Aux1 `***Aux2 OD. Sekil 64, 5 L'Iik ve 200 L'Iik ölçekteki 100 g/L PPS prosesinin bir karsilastirmasini gösterir: ~û- PBFT7OC **r PBFT70d -0- 200 L'Iik Ölçek-büyütme fermantasyonu Sekil 65, 200 L fermantasyonun (%8'Iik Tris-Glisin) zaman seyrinin bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 AUXI ve AUXII karma referans (1,2 pg) 3 4 saat 4 6 saat 8 saat 6 9.4 saat 7 12 saat 8 14 saat Sekil 66, hücre büyümesini 200 L'Iik fermantasyondan ürün olusumu ile karsilastirmak için SDS-PAGE'in bir dansitometri analizini temsil eder: "0-- Öncül + Aux1 + Aux 2 0D. Sekil 67, 200 L'Iik fermantasyonun (%4-12'Iik Bis-Tris) zaman seyrinin bir SDS-PAGE analizidir: Serit Örnek 1 Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci 2 AUXI ve AUXII karma referans (1,2 ug) 3 4 saat 4 6 saat 8 saat 6 9.4 saat 7 12 saat 8 14 saat Sekil 68, Kollajenaz konsantrasyonunun dansitometri kantifikasyonu için bir standart egriyi gösterir. Sekil 69, Clostridium histolyticum'un fermantasyonunun ve hasadinin bir sematik gösterimini temsil eder. Sekiller 70(a) ve (b), Fenil Sefaroz FF (düsük sub) kullanilan Hidrofobik etkilesim kromatografisinden kaynaklanan kromatogramlardir: (a) tam ölçekteki kromatogramdir ve (b) fraksiyon toplanmasini gösteren bir genisletilmis kromatogramdir. Sekil 71, Mustang Q adimindan TFF1 adimina proses-içi örneklerin bir %4-12'lik Bis- Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir ve kontaminant bantlari göstermek için asiri-yüklenir (2,5 ug toplam protein/serit ): Serit Örnek Yükleme hacmi, 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 12 3 HIC Öncesi Torba 1 15 Serit Örnek Yükleme hacmi, 4 HIC Öncesi Torba 2 15 HIC'den sürekli akisi Torba 1 15 6 HIC'den sürekli akisi Torba 2 15 7 HIC Piki 1 (0,3 M AS yikama) 15 8 HIC sonrasi havuzu (pik 2) 15 9 TFF öncesi (HIC sonrasi havuzu + 2 günlük 15 muhafaza etme) TFF sonrasi 15 11 Q-AEX öncesi (TFF sonrasi + gece boyu muhafaza 15 Sekil 72, konsantrasyondan ve 10 mM Tris, 200 (M Iöpeptin, pH 8, içine diyafiltrasyondan sonra HIC sonrasi malzemenin bir iyon degisim kromatogramidir (Q Sepharose HP) Sekil 73, iyon degisim kolonu (Sekil 5) sirasinda ayristirilmis pik 1'den (AUXII'den) fraksiyonlarin bir %4-12'Iik Bis Tris SDS-PAGE analizidir. Jel 1: Jel Koloidal mavi ile boyanir: Serit Örnek Yükleme hacmi, pl 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 10 2 Kollajenaz ABC I referansi lpg 15 3 Kollajenaz ABC II referansi lpg 15 4 Yükleme liig 15 Fraksiyon i saf 15 6 Fraksiyon 2 saf 15 7 Fraksiyon '3 saf 15 S Fraksiyon 4 AUXII lilg 15 9 Fraksiyori S fraksiyonlari lug 15 Fraksiyon 6 liig 15 11 Fraksiyon 7 111% 15 13 Fraksiyon 8 liig 15 Sekil 74, iyon degisim kolonu (Sekil 5) sirasinda ayristirilmis pik 1'den (AUXIl'den) fraksiyonlarin bir %4-12'lik Bis Tris SDS-PAGE analizidir. Jel 2: Jel Koloidal mavi ile boyanir: Serit Örnek Yükleme hacmi, m 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 10 2 Kollajenaz ABC I referansi lpg 15 3 Kollajenaz ABC II referansi lpg 15 4 Fraksiyon 9 liig 15 Fraksiyon 10 liig 15 6 Fraksiyon 11 AUXH lag IS 7 Fraksiyon 12 fraksiyonlari liig 15 8 Pik1 Kuyruk liig 15 Sekil 75, iyon degisim kolonu (Sekil 5) sirasinda ayristirilmis pik 2'den (AUXI'den) fraksiyonlarin bir %4-12'Iik Bis Tris SDS-PAGE analizidir. Jel 3: Jel Koloidal mavi ile boyanir: Serit Örnek Yükleme hacmi,iil l Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 10 3 Kollajenaz ABC lI referansi lpg 15 4 Fraksiyon 13 saf 15 Fraksiyon 14 'lpg 15 6 Fraksiyon 15 mg 15 7 Fraksiyon 16 AIDCI ~Hg 15 S Fraksiyon 17 fraksiyonlari .Lig 15 9 Fraksiyon 18 lpg 15 Fraksiyon 19 lug 15 11 Fraksiyon 20 mg 15 12 Fraksiyon 21 lpg 15 Sekil 76, iyon degisim kolonu (Sekil 5) sirasinda ayristirilmis pik Z'den (AUXI'den) fraksiyonlarin bir %4-12'Iik Bis Tris SDS-PAGE analizidir. Jel 4: Jel Koloidal mavi ile boyanir: 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 10 2 Kollajenaz ABC I referansi lpg 15 3 Kollajenaz ABC Il referansi lpg 15 4 Fraksiyon 22 lpg 15 Fraksiyon 23 lpg 15 6 Fraksiyon 24 lpg 15 7 Fraksiyon 25 f 'Im i mg 15 8 Fraksiyon 26 ra S'yon 3" lpg 15 9 Fraksiyon 27 mg 15 Pik 2 Kuyruk lpg 15 Sekil 77, anyon degisim adimindan nihai ürüne proses-içi örneklerin bir %4-12'lik Bis- Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir. Jel 1: 1 pg/serit yükleme: Serit Örnek Yükleme hacmi, pl 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 10 2 ABC I Referansi 15 3 ABC II Referansi 15 Serit Örnek Yükleme hacmi, pl 4 Post lEX AUX I Havuzu 15 Post IEX AUX lI Havuzu 15 6 AUX I Ara Ürünü (DOM: 12MAY06) 15 7 AUX II Ara Ürünü (DOM: 1OMAY06) 15 8 AUX I Ara Ürünü (Ön Karisim) 15 9 AUX lI Ara Ürünü (Ön Karisim) 15 Etkin Madde (DOM: 15MAY06) 15 Sekil 78, anyon degisim adimindan nihai ürüne proses-içi örneklerin bir %4-12'Iik Bis- Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir. Jel 2: 2,5 ug/serit yükleme: Serit Örnek Yükleme hacmi, pl 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 10 2 ABC I Referansi 15 3 ABC II Referansi 15 4 IEX Sonrasi AUX I Havuzu 15 6 AUX I Ara Ürünü (DOM: 12MAY06) 15 7 AUX Il Ara Ürünü (DOM: 1OMAY06) 15 8 AUX l Ara Ürünü (Ön Karisim) 15 9 AUX II Ara Ürünü (Ön Karisim) 15 Etkin Madde (DOM: 15MAY06) 15 1. Yüksek Moleküler Agirlik Belineçleri 2. Bos Serit 3. 1 ug Fermantasyon Filtrati Gün 4 4. 1 ug Fermantasyon Filtrati Gün 5 5. 1 ug Mustang Q Sonrasi Gün 4 6.1 pg HIC Sonrasi Gün 3 7. 1 pg HIC Sonrasi Gün 6 8. 1 üç; TFF Sonrasi Gün 2 9. 1 pg TFF Sonrasi Gün 4 Sekil 80, %8'Iik Tris Glisin ile bir SDS-PAGE'dir: . Yüksek Moleküler Agirlik Belirteçleri . 1 pg AUX-l Referans . 1 pg AUX-II Referans . 1 ug IEX AUX-l Sonrasi Gün 12 .1 ug IEX AUX-Il Sonrasi Gün 12 . Yüksek Moleküler Agirlik Belirteçleri . 1 ug AUX-l Referans . 1 pg AUX-II Referans . 1 ug AUX-I Ara-Ürünü Gün 5 . 1 ug AUX-I Ara-Ürünü Gün 12 . 1 pg AUX-ll Ara-Ürünü Gün 5 Sekil 82, analitik kromatografi analizini temsil eder. Sekil 83, UV ile protein konsantrasyonu belirlenmesini gösterir. Sekil 84, üretim noktasinda alinan ve -20°C'de saklanan 20 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen proses-içi örneklerin bir %4-12'Iik Bis-Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir. 1 iJg yükleme: Serit Örnek Yükleme hacmi, 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 12 3 HIC Öncesi Torba 1 15 Serit Örnek Yükleme hacmi, 4 HIC Öncesi Torba 2 15 HIC'den sürekli akisi Torba 1 15 6 HIC'den sürekli akisi Torba 2 15 7 HIC Piki 1 (0,3 M AS yikama) 15 8 HIC sonrasi havuzu 15 9 TFF1 öncesi (HIC sonrasi havuzu + hafta sonu 15 muhafaza etme) TFF1 sonrasi 15 11 Q-AEX öncesi (TFF sonrasi + gece boyu muhafaza 15 Sekil 85, Oda Sicakliginda 22 saatten sonra 20 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen proses-içi örneklerin bir %4-12'Iik Bis-Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir: 2 Mustang Q öncesi filtrat 15 4 HIC öncesi Torba 1 15 HIC öncesi Torba 2 15 6 HIC sonrasi Havuzu 15 3 TFF1 Sonrasi 15 9 IEX AUXI Sonrasi Havuzu 15 11 Aux I Araürünü 15 12 Aux II Araürünü 15 Sekil 86, 37°C'de 22 saatten sonra 20 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen proses- içi örneklerin bir %4-12'lik Bis-Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir: 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 12 2 Mustang Q öncesi filtrat 15 4 HIC öncesi Torba 1 15 HIC öncesi Torba 2 15 HIC sonrasi Havuzu 15 7 TFF1 öncesi lpg yükleme 15 g TFF1 sonrasi 15 9 IEX AUX I sonrasi Havuzu 15 IEX AUX II sonrasi Havuzu 15 11 AUX I Araürünü 15 12 AUX II Araürünü 15 Sekil 87, Oda Sicakliginda 94 saatten sonra 20 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen proses-içi örneklerin bir %4-12'lik Bis-Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir: Serit Örnek Yükleme hacmi,iil 1 Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 12 2 Mustang Q öncesi filtrat 15 4 HIC öncesi Torba 1 15 HIC öncesi Torba 2 15 6 HIC sonrasi Havuzu 15 7 TFF1 öncesi lpg yükleme 15 g TFF1 sonrasi 15 9 IEX Aux I sonrasi Havuzu 15 IEX Aux II sonrasi Havuzu 15 11 AUX I Araürünü 15 12 AUX Il Araürünü 15 Sekil 88, 37°C'de 94 saatten sonra 20 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen proses- içi örneklerin bir %4-12'Iik Bis-Tris SDS-PAGE analizidir. Jel Koloidal mavi ile boyanir: Serit Örnek Yükleme hacmi,iil l Mark 12 Moleküler Agirlik Belirteci 12 2 Mustang Q öncesi filtrat 15 4 HIC öncesi Torba 1 15 HIC öncesi Torba 2 15 6 HIC sonrasi Havuzu 15 7 TFF1 ÖNCESI lugyükleme 15 3 TFF1 sonrasi 15 9 IEX Aux I sonrasi Havuzu 15 11 AUX I Araürünü 15 12 AUX II Araürünü IS Sekil 89, seçilen IEX AUX I sonrasi ve IEX AUX II sonrasi fraksiyonlarin bir %8'Iik Tris- Glisin SD-PAGE analizidir. Fraksiyonlar gerekli olan kontaminant protein açisindan zenginlestirilmis 20 L'Iik gösterim çalismasindan seçilmistir. Jel Koloidal mavi ile boyanir: Serit Ornek Yükleme hacmi , ;Il 1 IEX AUX l sonrasi Fraksiyonlö ;0 2 IEX AUX I sonrasi Fraksiyonlö , 20 3 iiax AUX i sonrasi Fraksiyonlö Am" "e 20 IEX AUX I sonrasi Fraksiyoniö 20 6 IEX AUX ll sonrasi Fraksiyon 2 20 7 IEX AUX II sonrasi Fraksiyon 24 Ah" ile 20 8 IEX AUX Il sonrasi Fraksiyon `2 elite edilmistir '20 9 IEX AUX II sonrasi Fraksivon 2 20 IEX AUX II sonrasi Fraksiyon 2 20 Sekil 90, seçilen IEX AUX I sonrasi ve IEX AUX Il sonrasi fraksiyonlarin bir %8'Iik Tris- Glisin SD-PAGE analizidir. Fraksiyonlar 20 L'Iik PP3 fermantasyonundan üretilmis ve ~90 kDa'Iik kontaminant protein açisindan zenginlestirilmis saflastirilmis malzemeden seçilmistir. Jel Koloidal mavi ile boyanir: 1 Yüksek Moleküler Agirlik belirteci 20 2 IEX sonrasi Fraksiyon B7 R2 20 3 IEX sonrasi Fraksiyon BTRZ AIDCI ile 20 4 IEX sonrasi Fraksiyon B7R2 elite edilmistir 20 IEX sonrasi Fraksiyon 37132 20 6 IEX sonrasi Fraksiyon D1 20 7 IEX sonrasi Fraksiyon Dl . 20 8 IEX sonrasi Fraksiyon Dl elîgjggillriiiiestir 20 9 IEX sonrasi Fraksiyon D1 20 BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bulus, bir ilaç olarak kullanim için, 1 ila 1'Iik bir kütle oranina sahip olan, sirasiyla Clostridium histolyticum kollajenazi l'den ve kollajenazi Il'den olusan bir kollajenaz bilesimi saglar, burada kollajenaz bilesimi, ters fazli yüksek performansli sivi kromatografi ile ölçüldügü üzere, alan olarak en az %95 olan bir safliga sahiptir. 1 ila 1'Iik bir yapay kütle oraninda kollajenaz l'in ve kollajenaz ll'nin bir karisimini içeren bir bilesimin hayli yeniden-üretilebilen ve optimal enzimatik aktivite sagladigi ve yan etkiler için potansiyeli düsürürken, üstün terapötik etki verdigi kesfedilmistir. "Etkin madde", "ilaç ürünü" veya "kollajenaz bilesimi" terimleri birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilabilir. Burada, alan olarak en az %95 olan bir saflik ve tercihen alan olarak en az %98 olan bir saflik, ile yaklasik 1 ila 1'Iik bir kütle oranina sahip olan sirasiyla Clostr/'d/'um histolyticum kollajenaz I'inin ve kollajenaz II'sinin dizisine sahip olan kollajenaz l'den ve kollajenaz II'den olusan bir etkin madde açiklanir. Ayrica burada, bir etkin madde de açiklanir, burada etkin madde asagidaki Tablo A'dan seçilen en az bir spesifikasyona sahiptir: Tablo A Spesifikasyon Gorunus maddeden yoksun Çözeltinin . .. 7,5 ila 8,5 pH'sininPotansiyometrik Olçümü Endotoksin < 10 EU/mL 97 - 200 kDa arasinda 98 - 188 kDa _ . , , _ _ Major Kollaienaz bandi; SDS-PAGE (Indirgenmis MW belirteçleri . __ __ _ MW belirteçleri; referans Kosullar, Coomasie ve gumus ile arasinda Major _ i __ _ _ standart ile boyanmis) ile ozdeslik (ve saflik) Kollaienaz _ karsilastirilabilen major Absorbans Spektroskopisi ile 0,8 - 1,2 mg/mL Toplam Protein 13 000 - 23 SRC analizi (AUX-I) 000 fSRC NA GPA analizi (AUX-Il) NA Referans standart ile karsilastirilabilir; %1 Reziduel konak hucre proteini yogunluk gösteren herhangi bir münferit safsizlik bandi yoktur Rezidüel konak hücre DNA'si s 10 pg/doz Proteinlerin Agilent 1100 HPLC alan olarak 2 %98 ana pik; s %2 agregatlar Spesifikasyon System (Boyut dislama kullanilarak analizi 2 majör pik (AUX I& AUX II), alan olarak System (Ters fazli sivi birlestirilmis 2 %97; AUX-I'in ve AUX-Il'nin kromatografi ile özdeslik ve __ i . . _ , alikonma sureleri referansin %5'i içindedir saflik) kullanilarak analizi System (Ters fazli sivi alan olarak 5 %1 kromatografi ile rezidüel klostripain) kullanilarak analizi S stem An on de"i im y ( y 9 s alan olarak 5 %1 kromatografisi ile rezidüel jelatinaz) kullanilarak analizi Ters fazli kromatografisi ile V V . .. .. . ag/ag S1 tig/mg reziduel Iopeptin Biyo-yük < 1 cfu/mL Burada ayrica alan olarak en az %95 olan bir saflik ile yaklasik 1 ila 1'lik bir kütle oranina sahip olan sirasiyla CIostr/dium histo/yt/'cum kollajenaz I'inin ve kollajenaz üretmek için, asagidaki adimlari içeren, bir proses de açiklanir: a) Clostridium histolyti'cum'u fermente etme; b) kollajenaz I ve kollajenaz II içeren bir ham ürünü hasat etme; c) kollajenaz l'i ve kollajenaz ll'yi filtrasyon ve kolon kromatografisi vasitasiyla ham hasattan saflastirma ve d) adim (0)'den saflastirilan kollajenaz I'i ve kollajenaz Il'yi yaklasik 1 ila 1'lik bir oranda birlestirme. Fermantasyon adimi bir domuz kaynakli, bir phytone peptonu veya bir bitkisel pepton ortami varliginda gerçeklestirilebilir. Daha tercihen, domuz kaynakli ortam, proteoz peptonu #3'tür. Burada asagidaki adimlari içeren bir fermantasyon prosedürü açiklanir: a) ortami bir birinci evrede Clostri'dium histolyticum ile inoküle etme ve karisimi ajite b) bir alikuot elde etmek için adim (a)'dan elde edilen karisimi inkübe etme; c) ortami bir ikinci evrede adim (b)'den elde edilen alikuotlar ile inoküle etme ve karisimi ajite etme; d) adim (c)'den karisimlari inkübe etme; e) ortami bir üçüncü evrede adim (d)'den elde edilen alikuotlar ile inoküle etme ve ajite f) adim (e)'den karisimlari inkübe etme; g) ortami bir dördüncü evrede adim (f)'den elde edilen bir alikuot ile inoküle etme ve ajite etme; h) adim (g)'den karisimlari inkübe etme ve i) adim (h)'den elde edilen kültürü filtrasyon ile hasat etme. Fermantasyon prosedürü asagidakileri adimlari içerebilir: a) 3 x 25 mL PP3 (proteoz peptonu) ortamini 3 x 250 pL WCB (Anaerob gaz kavanozu içinde 3 x ile 37°C'lik bir sicaklik ayar noktasinda inoküle etme ve karisimi 125 rpm'de ajite etme; b) adim (a)'dan elde edilen karisimi 12 saat boyunca inkübe etme; alikuotlari (Anaerob gaz kavanozu içinde 4 x 500 mL çalkalama balonlari içinde ile 37°C'Iik bir sicaklik ayar noktasinda inoküle etme ve karisimi 125 rpm'de ajite etme; d) adim (e)'den elde edilen karisimi 12 saat boyunca inkübe etme; e) 14,4 L PP3 ortamini 3 x ile 37°C'Iik bir sicaklik ayar noktasinda ve 7,00'Iik pH ayar noktasinda inoküle etme ve karisimi 125 rpm'de ajite etme; f) adim (e)'den elde edilen karisimi 12 saat boyunca inkübe etme; ile 37°C'Iik bir sicaklik ayar noktasinda ve 7,00'Iik pH ayar noktasinda inoküle etme ve karisimi 125 rpm'de ajite etme; h) adim (g)'den elde edilen karisimi 14 saat boyunca inkübe etme ve filtre (2 x Millipore Express XL 10 filtresi) vasitasiyla filtrasyon (derin akabinde 0,2 um) ile hasat etme. Burada asagidaki adimlari içeren bir saflastirma prosedürü açiklanir: a) ham hasadi bir Mustang Q anyon-degisim kapsül filtre vasitasiyla filtreleme; b) tercihen 1 M olan bir nihai konsantrasyona kadar, amonyum sülfat ekleme; c) ham hasadi, tercihen bir 0,45 pm'lik filtreden, filtreleme; d) filtrati bir HIC kolonuna, tercihen bir fenil sefaroz 6FF'ye (düsük sub), tabi tutma; e) filtrata, tercihen HIC sonrasi ayristirilmis ürün için 0,2 M olan bir nihai konsantrasyona kadar, Iöpeptin ekleme; f) TFF ile tampon degistirme ile, tercihen TFF ile tampon degistirme ile, amonyum sülfati uzaklastirma ve Iöpeptini kollajenaz I'in ve kollajenaz Il'nin dogru baglamasi için idame ettirme; 9) adim (f)'nin karisimi, tercihen bir 0,45 pm'lik filtreden, filtreleme; h) kollajenaz l'i ve kollajenaz Il'yi Q-Sefaroz HP kullanarak ayirma; i) kollajenaz I ve kollajenaz II için ayri ayri TFF konsantrasyonu ve formülasyonu hazirlama; burada TFF 10 ve/veya 30 K MWCO (moleküler agirlik kesim-degeri) PES veya RC - polietersülfon veya yeniden-üretilmis selüloz filtre membranlar kullanilarak bir tegetsel akisli filtrasyondur. Proteini alikoymak ve konsantre etmek, seçmek ve proteini bir tam çözeltisinden digerine degistirmek için araçlar saglama ve j) bir 0,2 pm'lik filtrasyon sisteminden filtreleme. Mevcut bulusun kollajenaz bilesimi, hem kollajenaz I hem de kollajenaz II içerir. Ham kollajenazin bir tercih edilen kaynagi, bir bakteriyel fermantasyon prosesindendir, özellikle C. histolyticum'un (C. his'in) fermantasyonundandir. Bir fermantasyon prosesi burada tarif edilir. C. his'den elde edilen ham kollajenaz, boya ligand afinite kromatografisini, heparin afinite kromatografisini, amonyum sülfat presipitasyonunu, hidroksiapatit kromatografisini, boyut dislama kromatografisini, iyon degisim kromatografisini ve metal selasyon kromatografisini içeren, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen çesitli yöntemler ile saflastirilabilir. Ham ve kismen saflastirilmis kollajenaz Advance Biofactures Corp.. Lynbrook, New York, firmasini içeren çok sayida kaynaktan ticari olarak elde edilebilir. Hem kollajenaz I hem de kollajenaz ll metaloproteazlardir ve bunlarin aktivitesi için siki bir sekilde baglanmis çinko ve gevsek bir sekilde baglanmis kalsiyum gereklidir (Eddie kollajenin tüm tiplerine dogru genis özgüllüge sahiptir (Steinbrink, D; Bond, M ve Van Wart, H; (. Kollajenaz I ve Kollajenaz lI kollajeni fizyolojik kosullar altinda Kollajenin üçlü-helikal bölgesini hidrolize etme ile sindirir (Steinbrink, D; Bond, M ve Van Wart, H; (. Her bir kollajenazin farkli özgüllük göstermesine (örn., her birinin klevaj için bir farkli tercih edilen amino dizisine sahip olmasina) ragmen, birlikte, bunlar kollajene dogru sinerjistik aktiviteye sahiptir Transplantation, 6: p.403-412]. Kollajenaz lI, Iiteratürlerde sinif II ve sinif I kollajenaz için bildirildigi üzere kollajenaz l'e kiyasla sentetik peptit substratlarinin tüm çesitlerine dogru bir daha yüksek aktiviteye Bulusun bilesimleri ve burada açiklanan yöntemler ile tedavi edilebilen kollajen aracili- hastaliklarin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, asagidakileri, içerir: Dupuytren hastaligi; Peyronie hastaligi; donuk omuz (adheziv kapsülit), keloidler; hipertrofik skarlar; deprese skarlar, örnegin, enflamatuvar aknelerden kaynaklananlar; cerrahi-sonrasi adezyonlar; akne vulgaris; Iipomlar ve çirkinlestiren rahatsizliklar, ABD Patentleri, Dupuytren hastaliginin tedavisinde kollajenaz preparasyonlarinin kullanimini açiklar. 6,022,539 Numarali ABD Patenti, Peyronie hastaliginin tedavisinde kollajenaz preparasyonlarinin kullanimini açiklar. Bunun kollajen-aracili hastaliklari tedavi etmede kullanimina ek olarak, bulusun bilesimleri ayrica, çok çesitli laboratuvar, tanisal ve terapötik uygulamada kullanisli oldugu gibi, dokunun münferit hücrelere ve hücre kümelerine parçalanmasi için de kullanislidir. Bu uygulamalar, küçük çapli sentetik vasküler greft ekimi için mikrovasküler endotelyal hücreleri, gen terapisi, ilaç toksikoloji taramasi ve ekstrakorporeal karaciger destek cihazlari için hepatositleri, kikirdak yenilenmesi için kondrositleri ve insüline-bagimli diabetes mellitusun tedavisi için Langerhans adaciklarini içeren, çesitli kullanimlar için çok sayida hücre tipinin izolasyonunu içerir. Enzim muamelesi, ekstraselüler matriks proteinlerini ve hücre-hücre temasini idame ettiren proteinlerin fragmanlastirilmasi için çalisir. Kollajen doku ultra-yapisinin ana protein bileseni oldugundan, kollajenaz enzimi arzu edilen doku dagilmasini basarmak için siklikla kullanilmistir. Genel olarak, mevcut bulusun bilesimi burada hücrelerin uzaklastirilmasinin veya ekstraselüler matriksin modifikasyonunun arzu edildigi herhangi bir uygulama için kullanislidir. Bulusun kollajenaz bilesimleri ayrica, tercih edilen saflastirilmis enzimlerin bir spesifik sayidaki aktivite birimini veya spesifik kütlelerini karistirma ile de hazirlanabilir. Kollajenaz aktivitesi enzimin sentetik peptidi veya kollajen substratini hidrolize etme yetisi ile ölçülebilir. Teknikte uzmanligi olan kisiler burada açiklananlar disindaki enzim analizlerinin ayrica fonksiyonel olarak es-deger enzim bilesimlerini tanimlamak ve hazirlamak için de kullanilabilecegini fark edecektir. Ayrica burada, bulusun bilesiminde kollajenaz l'in kollajenaz ll'ye 1 ila 1'Iik kütle oraninin yeniden-üretilebilen optimizasyonu da açiklanir. Kollajenaz I'in kollajenaz ll'ye oraninin yeniden-üretilebilirligi bir kaç faktörden dolayi önceden beri bir zorluk olmustur. Ilk olarak, Clostridium'un ticari fermantasyonu genel olarak kollajenaz I'in ve kollajenaz Il'nin bir 1 ila 2 olan orani ile sonuçlanir. Ikinci olarak, saflastirma prosedürlerinin bu orani degistirdigi bunun anlamli bir sekilde saflastirilmis ürünün tutarli-olmayan oranlari ile sonuçlandigi bilinir. Mevcut bulusun bilesiminin optimize edilmis sabitlenmis kütle orani iki farkli kollajenaz tarafindan saglanan sinerjistik aktiviteyi maksimuma çikarir bu üstün terapötik etki ile sonuçlanir. Bulus ayrica, bulusun bilesimlerinin farmasötik formülasyonlarini da saglar. Mevcut bulusun farmasötik formülasyonlari bir veya birden fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici veya eksipiyan ile birlikte formüle edilmis mevcut bulusun bir kollajenaz bilesiminin birterapötik olarak etkili miktarini içerir. Burada kullanildigi sekliyle, "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici veya eksipiyan terimi, bir toksik-olmayan, inert kati, yari-kati veya sivi dolgu, diluent, enkapsüle etme malzemesi veya herhangi bir tipteki formülasyon yardimci maddesi anlamina gelir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar görevi görebilen malzemelerin bazi örnekleri, sekerlerdir, örnegin, Iaktozdur, glikozdur ve sükrozdur; nisastalardir, örnegin, misir nisastasidir ve patates nisastasidir; selülozdur ve bunun türevleridir, örnegin, sodyum karboksimetil selülozdur, etil selülozdur ve selüloz asetattir; pudra hâline getirilmis kitredir; lattir; jelatindir; talktir, glikollerdir, örnegin, propilen glikoldür; esterlerdir, örnegin, etil oleattir ve etil laurattir; agardir; tamponlama ajanlaridir, örnegin, magnezyum hidroksittir ve alüminyum hidroksittir; aljinik asittir; pirojensiz sudur; izotonik salindir, Ringer çözeltisidir; etil alkoldür ve fosfat tampon çözeltilerdir, ayni zamanda baska toksik-olmayan uyumlu yaglayicilardir, örnegin, sodyum Iauril sülfattir ve magnezyum stereattir ayni zamanda, formülü yapan kisinin yargisina bagli olarak, renklendirme ajanlari, salma ajanlari, kaplama ajanlari, koku veren ajanlar, koruyucular ve antioksidanlar da bilesim içinde bulunabilir. Bu bulusun farmasötik bilesimleri parenteral olarak, topikal olarak veya bir implante edilmis rezervuar vasitasiyla uygulanabilir. Burada kullanildigi sekliyle parenteral terimi, subkütan, intrakütanöz, intravenöz, intramüsküler, intraartiküler, intraarteriyel, intrasinoviyal, Intrasternal, intratekal, intralezyonel ve intrakraniyal enfeksiyon ve infüzyon tekniklerini içerir. Bir tercih edilen uygulamada, bilesim çirkinlesen dokuya enjekte edilir. Peyronie veya Duputyren hastaliklari veya adheziv kapsülit olgusunda, bilesim kordona veya plaga enjekte edilir. "Lokal uygulama" terimi burada, bu tarz dogrudan enjeksiyonu kapsayacak sekilde tanimlanir. ilaveten, özel olarak iyi sonuçlar uygulamadan sonra enjeksiyon yerini immobilize etme ile elde edilebilir. Örnegin, uygulama yeri 4 veya daha fazla saat boyunca immobilize edilebilir. Enjektabl preparasyonlar, örnegin, steril enjektabl sulu veya oleajinöz süspansiyonlar, uygun dagitma veya islatma ajanlari ve süspanse etme ajanlari kullanilarak bilinen teknige göre formüle edilebilir. Steril enjektabl preparasyon ayrica, bir toksik-olmayan parenteral olarak kabul edilebilir diluent veya çözücü içinde bir steril enjektabl çözelti, süspansiyon veya emülsiyon, örnegin, 1,3-bütandiol içinde bir çözelti olarak, bulunabilir. Su, Ringer çözeltisi, U.S.P. ve izotonik sodyum klorür çözeltisi kullanilabilen kabul edilebilir vehiküller ve çözücü arasindadir. Buna ek olarak, steril, fikse edilmis sivi yaglar, bir çözücü veya süspanse etme ortami olarak geleneksel olarak kullanilir. Bu amaçlar için, sentetik mono- veya digliseritleri içeren herhangi bir orta dereceli fikse edilmis sivi yag kullanilabilir. Buna ek olarak, yag asitleri, örnegin, oleik asit, enjektabllarin preparasyonunda kullanilir. Enjektabl formülasyonlar, örnegin, bir bakteriyel-alikoyucu filtre vasitasiyla filtrasyon ile veya sterilize etme ajanlarini kullanimdan önce steril su veya baska steril enjektabl ortam içinde çözündürülebilen veya dagitilabilen steril kati bilesimler formunda katma ile, sterilize edilebilir. Steril çözeltiler ayrica daha sonra kullanim için Iiyofilize edilebilir. Bu bulusun bir bilesiginin topikal veya transdermal uygulamasi için dozaj formlari, merhemleri, macunlari, kremleri, Iosyonlari, jelleri, pudralari, çözeltileri, spreyleri, inhalanlari veya yamalari içerir. Aktif bilesen steril kosullar altinda bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici veya gerekli olabildigi üzere herhangi bir ihtiyaç duyulan koruyucu veya tampon ile karistirilir. Merhemler, macunlar, kremler ve jeller, bu bulusun bir aktif bilesigine ek olarak, eksipiyanlar, örnegin, hayvansal veya bitkisel kati yaglar, sivi yaglar, mumlar, parafinler, nisasta, kitre, selüloz türevleri, polietilen glikoller, silikonlar, bentonitler, silisik asit, talk ve çinko oksit veya bunlarin karisimlarini içerebilir. Pudralar ve Spreyler, bu bulusun bilesiklerine ek olarak, eksipiyanlar, örnegin, Iaktoz, talk, silisik asit, alüminyum hidroksit, kalsiyum silikatlar ve poliamid pudra veya bu maddelerin karisimlarini içerebilir. Spreyler ilave olarak, geleneksel itici gazlar, örnegin, kloroflorohidrokarbonlar, içerebilir. Transdermal yamalar vücuda bir bilesigin kontrollü aktarimini saglamaya yönelik eklenmis avantaja sahiptir. Bu tarz dozaj formlari bilesigi uygun ortam içinde çözündürme veya dagitma ile yapilabilir. Emilim hizlandiricilar ayrica, bilesigin cilt boyunca akisini arttirmak için de kullanilabilir. Hiz bir hiz kontrol etme membrani saglama ile veya bilesigi bir polimer matriksi veya jel içinde dagitma ile kontrol edilebilir. Bir tercih edilen uygulamada, bulusun kollajenaz bilesimi Iaktoz ile formüle edilmis bir miligrami 1.9 mg Iaktoz ile formüle edilir. Bir baska uygulamada, enjektabl kollajenazin her bir miligrami tercihen, bir sentetik substrat, pzGPGGPA, kullanilan bir potens analizi ile ölçülen yaklasik olarak 2800 SRC birimine ve 51000 birime sahiptir. Bir baska tercih edilen uygulamada, bulusun kollajenaz bilesimi, Sükroz, yaklasik 8,0 olan bir pH düzeyinde Tris ile formüle edilmis bir Iiyofilize edilmis enjektabl bilesimdir. Daha tercihen, bulusun kollajenaz bilesiminin 1,0 mg'i 60 mM Sükroz, 10 mM Tris, yaklasik 8,0 olan bir pH'ta, formüle edilir (bu, formülasyon tamponu içinde 20,5 mg/mL sükroza ve 1,21 mg/mL Tris'e esittir). Formülasyonlarin bazilarinin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, asagidakileri, içerir: bir 0,58 mg'lik etkin madde dozu için, 18,5 mg sükroz ve 1,1 mg Tris her bir viyale eklenir, burada hedeflenen bir viyal dolum hacmi 0,9 mL'dir ve bir 0,58 mg'lik etkin madde dozu için, 12,0 mg sükroz (çoklu- kompendial) ve 0,7 mg Tris (çoklu-kompendial). Kollajen-aracili hastaliklari tedavi etmek için, buna ihtiyaci olan bir hastaya bulusun bir bilesiminin bir terapötik olarak etkili miktarini veya bulusun bir farmasötik formülasyonunun bir terapötik olarak etkili miktarini uygulama adimini içeren yöntemler saglanir. Bulusun bir bilesiginin bir "terapötik olarak etkili miktari" ile, bilesigin tedavi edilen süje üzerinde, herhangi bir tibbi tedavi için uygulanabilen bir makul yarar/risk oraninda, bir terapötik etki saglayan bir miktari kastedilir. Terapötik etki, objektif (yani, bazi test veya belirteç ile ölçülebilen) veya sübjektif (yani, süje bir etkinin bir endikasyonunu verir veya bir etki hisseder) olabilir. Etkili dozlar ayrica, uygulama yoluna ayni zamanda baska ajanlar ile birlikte-kullanima bagli olarak da çesitlilik gösterecektir. Bununla birlikte, mevcut bulusun bilesimlerinin toplam günlük kullanimina saglam tibbi muhakeme kapsaminda ilgili hekim tarafindan karar verilecegi anlasilacaktir. Herhangi bir özel hasta için spesifik terapötik olarak etkili doz düzeyi, tedavi edilmekte olan bozuklugu ve bozuklugun siddetini; kullanilan spesifik bilesigin aktivitesini; kullanilan spesifik bilesimi; hastanin yasini, vücut agirligini, genel sagligini, cinsiyetini ve diyetini; kullanilan spesifik bilesigin uygulama zamanini, uygulama yolunu ve atilim hizini; tedavi süresini; kullanilan spesifik bilesik ile kombinasyon hâlinde veya es zamanli olarak kullanilan ilaçlari ve tibbi tekniklerde iyi bilinen benzer faktörleri içeren çesitli faktörlere bagli olacaktir. Enjektabl kollajenaz için etkin madde, Kollajenaz AUX I ve Kollajenaz ABC I ve Kollajenaz AUX II ve Kollajenaz ABC II olarak ifade edilen. iki mikrobiyal kollajenazdan olusur. "Kollajenaz I", "ABC I", "AUX l", "kollajenaz AUX I" ve "kollajenaz ABC l" terimlerinin ayni anlama geldigi ve birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilabildigi anlasilir. Benzer sekilde, "Kollajenaz II", "ABC II", "AUX II", "kollajenaz AUX II" ve sekilde de kullanilabilir. Bu kollajenazlar bakteriyel hücreler tarafindan salgilanir. Bunlar kromatografik yöntemler ile Clostridium histolyticum kültür süpernatantindan izole edilir ve saflastirilir. Her iki kollajenaz da özel proteazlardir ve ayni EC numarasini (E.C 3.4.24.3) paylasir. Kollajenaz AUX I, 115 kDa'lik bir moleküler agirligi olan yaklasik olarak 1000 amino asitten olusan bir tek polipeptit zincirine sahiptir. Kollajenaz AUX II de, 110 kDa'lik bir moleküler agirligi olan yaklasik 1000 amino asitten olusan bir tek polipeptit zincirine sahiptir. Literatürün kollajenaz AUX I'in ve AUX Il'nin bölgelerinde dizi homolojileri oldugunu göstermesine ragmen, iki polipeptidin Western blot analizi ile gösterildigi üzere immünolojik olarak çapraz reaktif olmadigi görülür. Etkin madde (kollajenaz konsantresi) kollajenaz AUX I ve AUX II için bir yaklasik olarak 1 ila 1'Iik kütle oranina sahiptir. Kollajenaz konsantresi 1,528 olan bir ekstinksiyon katsayisina sahiptir. Örnekler Mevcut bulusun bilesimleri ve prosesleri yalnizca bir örneklendirme olarak amaçlanan ve bulusun kapsamini sinirlamayan, asagidaki örnekler ile baglantili olarak daha iyi anlasilacaktir. Açiklanan uygulamalara çesitli degisimler ve modifikasyonlar teknikte uzmanligi olan kisiler için asikâr olacaktir ve sinirlandirma olmaksizin, bulusun formülasyonlari ile ilgili olanlari, içeren, bu tarz degisimler ve modifikasyonlar ekli istemlerin kapsamindan ayrilmadan yapilabilir. Fermantasyon Prosesi Bu çalisma, bir hayvansal bilesenden yoksun büyüme ortamlari içinde 5 L'Iik fermantasyon ölçegi prosesinden toplam kollajenazlar ABC l'in & Il'nin 250 mg/L'Iik bir hedef verimini aktarmayi amaçlayan bir fermantasyon prosesi gelistirmek için düzenlenmistir. Çesitli potansiyel alternatif nitrojen kaynagi, bunlarin kollajenaz ekspresyonu üzerinde büyüme ortamlarinda güncel olarak kullanilan phtyone bilesenine kiyasla veya bunun üstünde herhangi bir etkiye sahip olup olmadigini görmek için taranmistir. C. histo/yticum'un iki susundan, OO4'ten ve 013'ten, üretkenlikleri karsilastiran bir deney, büyüme kinetikleri, kollajenaz üretkenligi ve bir hayvan kaynakli ortamlarda büyütülen kontamine eden proteazlarin üretimi açisindan iki sus arasindaki herhangi bir farkliligi belirlemektir. Bu karsilastirma, hayvansal açidan yoksun olan büyüme ortamlarinin aksine hayvan kaynakli ortamlarda büyümekte olan C. histolyti'cum susu arasindaki anlamli farkliliklari vurgulamistir. Önceki çalisma, phytone'un ve maya ekstraktinin arttirilmis konsantrasyonlarinin daha yüksek biyo-kütle konsantrasyonlarini ve bundan dolayi daha yüksek düzeylerde toplam kollajenaz ekspresyonunu destekledigi gösterilmistir. Optimize edilmis seri fermantasyon oitamlarinin biyo-kütle konsantrasyonlarini ve toplam kollajenaz üretkenligini ilaveten arttirmaya yönelik bir girisimde, bir beslemeli-seri fermantasyon stratejisi tasarlanmistir. Biri seri fazda bir yüksek konsantrasyonda ortam akabinde bir düsük konsantrasyonda besleme fazi ile, ikincisi seri fazda bir düsük konsantrasyonda ortam akabinde bir yüksek konsantrasyonda besleme fazi ile olan, iki 5 L'Iik fermantasyon gerçeklestirilmistir. Her iki fermantasyon da yüksek biyo-kütle konsantrasyonlari üretmistir, bununla birlikte, yükse konsantrasyonda seri faz görece düsük düzeylerde kollajenaz ekspresyonu göstermistir. Düsük konsantrasyonda seri fermantasyon çok yüksek düzeylerde kollajenaz ekspresyonu (~280 mg/L) göstermistir, bununla birlikte, bu kültür ayrica kontamine eden proteazin, klostripainin, anlamli miktarlarini da üretmistir. Düsük konsantrasyonda seri fermantasyonun kollajenazlarin ekspresyonu açisindan çok iyi sonuçlari vermesine ragmen, hayli konsantre edilmis phytone ve maya ekstrakti besin çözeltisini hazirlamak çok zordur. Iki ilave fermantasyon hazirlanmistir, birincisi önceki basarili beslemeli-seri fermantasyonun bir tekraridir ve ikincisi bir daha düsük konsantre edilmis besin çözeltisi ile hafif bir derecede daha yüksek konsantrasyonda seri faz ortam bilesimine sahiptir. Her iki fermantasyon da benzer biyo-kütle konsantrasyonlari saglamistir ve kollajenazlarin ve klostripainin ayni ekspresyon profilini göstermistir. Üretilen kollajenazin miktarinin yine her iki fermantasyonda da yaklasik olarak 280 mg/L'de tahmin edilmistir. Bununla birlikte, bu fermantasyonlar kontamine eden klostripain proteazinin anlamli miktarlarini üretmistir. Alternatif nitrojen kaynaklarinin bir seleksiyonu bunlarin beslemeIi-seri fermantasyon stratejisine kullanilan phytone peptonunu degistirme yetisi için degerlendirilmistir. C. histo/yticum bitkisel peptonlar üzerinde hayli iyi büyüyerek 4 ila 5 birim olan optik yogunluklara (600 nm) ulasmistir. Bununla birlikte. bu fermantasyonlarin SDS-PAGE analizi ne kollajenazin ne de klostripainin herhangi bir ekspresyonunu göstermemistir. Bu peptonlar üzerinde gözlemlenen bol hücre büyümesinden dolayi, kompleks nitrojen kaynaginin konsantrasyonunun çok yüksek oldugu bunun proteaz ekspresyonunun bir inhibisyonu ile sonuçlandigi düsünülmüstür. Bundan dolayi fermantasyonlarin bir ikinci grubu, bir seri stratejide 50 g/L'de alternatif peptonlar kullanilarak gerçeklestirilmistir. Fermantasyonlar SDS-PAGE ile analiz edildiginde, kollajenazin veya klostripainin herhangi bir ekspresyonu yine görülmemistir. Phytone peptonu kullanilan bir beslemeli- seri fermantasyon üç amino asit, glutamin, triptofan ve asparajin, ile takviye edilmistir. Bu amino asitlerin hayvansal-olmayan ortamlarda daha düsük miktarlarda bulundugu tanimlanmistir. Fermantasyonun büyüme profili amino asit takviyesi olmadan beslemeIi-seri fermantasyonunki ile çok benzerdir. SDS-PAGE analizi, kollajenazin bir benzer verimini ancak klostripainin hafif bir derecede daha düsük düzeyini göstermistir. Klostripain analizi, kontrol beslemeli-seri fermantasyon ile karsilastirildiginda amino takviye edilmis fermantasyonda azaltilmis aktivite göstermistir. Yine de hâlâ anlamli iken klostripain aktivitesindeki azalma hayvansal ve hayvansal-olmayan ortamlar arasindaki fark kadar büyük degildir. Amonyum sülfat presipitasyonu kullanilarak kollajenazlarin primer geri-kazanim adiminin degerlendirilmesi, ham fermantasyon süpernatantlarinin 0,2 um'lik filtratlari üzerinde gerçeklestirilmistir. Burada amaç, proses boyunca gerçeklestirilen kollajenaz verimini arttirmaya ve ideal olarak klostripain miktarini azaltmaya yardimci olmaktir. Ilk olarak 100 - 400 g/L olan amonyum sülfat konsantrasyonlari degerlendirilmistir. 400 g/L'deki amonyum sülfat kollajenazin anlamli geri-kazanimi ile sonuçlanmistir. Bir ilave çalisma, amonyum sülfatin bir daha yüksek araligi (400 - 520 g/L) ile gerçeklestirilmistir. Buna ek olarak, presipitasyondan önce pH'i 6,0'a indirmenin ve ortamlari oksijenlemenin etkisi de arastirilmistir. Bu kosullarin herhangi biri altinda süpernatanttan geri-kazanilan kollajenazlarin veya klostripainin miktarinda herhangi bir fark gözlemlenmemistir. 400 g/L'Iik amonyum sülfattan üretilen peleti yeniden- süspanse etmek en kolaydir. C. histo/yticum'un iki susunu (004 ve 013) karsilastirmak için çalisma hayvan kaynakli ortamlardan kollajenazlarin üretkenliginin optimal hayvansal kaynakli olmayan ortamlarinkine kiyasla daha düsük oldugunu göstermistir. Klostripain aktivitesi için bir enzimatik analiz ile desteklenen, SDS-PAGE analizi hayvansal-olmayan ortamlara kiyasla hayvan-kaynakli ortamlarda üretilen malzemede anlamli olarak daha düsük miktarlarda klostripain oldugunu vurgulamistir. Bu, kontamine eden proteazlarin üretimi açisindan hayvansal kaynakli olmayan ortam fermantasyonlarindan üretilen besin stokunun hayvan kaynakli ortamlar kullanilan fermantasyondan elde edilenden bir anlamli olarak farkli besin stoku oldugu gerçegini vurgulamistir. BeslemeIi-seri fermantasyonlarin 1. grubu - DCFT24 Proses gelistirme çalismasindan elde edilen sonuçlar, bir zenginlestirilmis ortam (100 g/L phytone peptonu ve 50 g/L maya ekstrakti) kullaniminin orijinal ortama (50 g/L phytone peptonu ve 8,5 g/L maya ekstrakti) kiyasla kollajenazlarin daha yüksek miktarlarinin ekspresyonu ile sonuçlandigini göstermistir. Buna ek olarak, baslangiçta bunun üretilen klostripain miktarlarini azalttigi görülmüstür. Akabinde, iki 5 L'Iik fermantasyon gerçeklestirilmistir. Ilki, strateji bir uzun seri fazdan/kisa beslemeIi-seri fazdan olusmus iken, ikincisi bir kisa seri fazdan/uzun beslemeIi-seri fazdan olusmustur. Fermantasyonunda sonunda (20 saat sonra) her iki stratejide de, phytone peptonu ve maya ekstrakti konsantrasyonlari, seri fermantasyonlar durumunda oldugu gibi, sirasiyla, 100 g/L'dir ve 50 g/L'dir. Tablo 1 ve 2, kullanilan ortam reçetelerini ve stratejileri detaylandirir. Tablo 1 Ortamlarin reçetesi ve beslemeIi-seri strateji Bilesen Uzun seri - kisa beslemeIi-seri Hasat noktasindaki konsantrasyonlar 100g/L 509/ L 1 Og/L saatte hasat Tablo 2 Ortamlarin reçetesi ve beslemeIi-seri strateji Seri Besleme Phytone 100g/L 1009/L Peptonu Maya ekstrakti SOg/L SOg/L Glikoz 10g/L log/L Filtre sterilize edilmistir KH2PO4 1.929/L K2HPO4 1 .259/ L NazHPO4 3.59/L NaCI 2.5g/L Magnezyum 0.089/L Vitamin 10mL/L çözeltisi Hacim 4L 1 L Seri Fazi BeslemeIi-seri Faz Inokülasyon w..., _au-s saat 10 saat Bilesen Seri Besleme Phytone 40g/L 254g/L Peptonu Maya ekstrakti 10g/L 153g/L Kisa seri - uzun beslemeli-seri Hasat noktasindaki konsantrasyonlar 1009/L 5ûg/L Bilesen Kisa seri - uzun beslemeli-seri Seri Besleme Hasat noktasindaki faz konsantrasyonlar Glikoz 7.5g/L 17.89/L 109/L Filtre sterilize edilmistir KH2PO4 1.929/L K2HPO4 1 .259/ L NazHPO4 3.59/L Magnezyum 0.089/L Vitamin 10mL/L çözeltisi Hacim 4L 1 L ~5L Seri Fazi Beslemeli-seri Faz Inokülasyon : -› 20 saatte hasat 6 saat 14 saat Sekil 1, iki fermantasyondan büyüme egrilerini (zamana karsi ODBOOnm) gösterirken, Sekil 2, net büyüme egrilerini (zaman karsi Net ODGOOnm) gösterir. Birinci fermantasyondan elde edilen hücrelerin çok çabuk büyüdügü ve yaklasik olarak 10 saat sonra bunlarin maksimum OD'sine ulastigi gözlemlenmistir. Bu, seri fazdaki ortamlarin çok zengin oldugu gerçeginden kaynaklanmistir. BeslemeIi-seri faz sirasinda, hücrelerin büyüdügü görülmemistir. OD degerleri hafif bir derecede düsmüstür, bu kismen hücrelerin öldügü gerçegine ve besinin fermentördeki seyreltme etkisine atfedilebilir. Ikinci fermantasyon için, beslemeIi-seri faz 6 saat sonra baslatilmistir. Bu noktada, OD degeri, Sekil 1'deki büyüme egrisi ile öne sürüldügü üzere, düsük olacaktir. Hücreler yaklasik olarak 18 saate kadar yavas bir sekilde büyüme devam etmistir. Sekil 2'deki net büyüme egrilerinin DCFT24b fermantasyonundaki hücre yogunluklarinin DCFT24a fermantasyonundakine kiyasla daha yüksek oldugunu öne sürülmüstür. Inokülasyondan önce ortamlarin ODGOOnm'si yaklasik olarak 1,7 iken, DCFT24b'de bu yaklasik olarak 0,4'tür. Bu farklilik, fermentörler otoklavlandiginda bir çökeltinin olusturuldugu gerçeginden kaynaklanir. DCFT24b'ye kiyasla DCFT24a için daha yüksek miktarlar olusturulmustur. SDS PAGE ielleri: Süpernatant örneklerinin SDS PAGE analizi (%8'Iik Tris-Glisin jelleri) iki fermantasyonun her biri için gerçeklestirilmistir. Jeller Sekil 3'te ve 4'te gösterilir. Bir yari-kantitatif SDS PAGE jeli de ikinci fermantasyonun hasat noktasi örnegi için üretilmistir. Sekil 4'teki SDS PAGE jel analizi, kollajenazlarin çok düsük miktarlarinin eksprese edildigini göstermistir. Bu, hücrelerin seri faz sirasinda çok çabuk büyüdügü ve sonuç olarak maksimum hücre konsantrasyonuna yaklasik olarak 10 saat sonra ulasildigi gerçeginden kaynaklanabilir. Aksine, kollajenaz ekspresyonunun çok yüksek düzeyi, büyük olasilikla hücrelerin kisa seri faz sirasinda daha yavas bir sekilde büyüdügü ve beslemeli-seri faz sirasinda büyümeye devam ettigi gerçeginden dolayi, ikinci fermantasyonda gözlemlenmistir. Böylelikle, C. his için bir iyilestirilmis fermantasyon yöntemi burada açiklanir, burada hücre büyümesi kisa seri faz sirasinda kontrollüdür ve yavastir ve beslemeIi-seri faz sirasinda büyüme devam eder. Yavas büyüme. kisa seri faz sirasinda büyüme hizinin beslemeIi-seri fazdan önce, örnegin, fermantasyon prosesinin baslamasinin yaklasik 10 saati içinde, bir maksimum hücre konsantrasyonu ile sonuçlanmadigi anlamina gelecek sekilde tanimlanir. Büyüme hizi yaklasik olarak burada tarif edilen ikinci fermantasyon siklusundan kaynaklanan olabilir. Ikinci fermantasyon siklusunun hasat noktasinda yari-kantitatif SDS PAGE jelinden (Sekil 5) tahmin edilen kollajenaz üretkenlikleri kollajenaz ABC I için 132 mg/L'dir ve kollajenaz ABC II için 158 mg/L'dir. Bu degerler önceden elde edilenler ile karsilastirildiginda, beslemeIi-seri strateji kullanilan ekspresyon düzeylerinde yaklasik olarak bir 3-katlik artis vardir. Sonraki adim, hafif bir derecede modifiye edilmis beslemeIi-seri stratejiler ve ortamlar kullanilan beslemeIi-seri fermantasyonlarin bir ilave grubunu gerçeklestirmektir. Amaç, fermantasyon prosesinin ölçeklendirilebilirligini ve güçlülügünü iyilestirmektir. Bu fermantasyon için ortam reçetesi, seri fazdaki phytone peptonunun ve maya ekstraktinin otoklavlanmak yerine filtre vasitasiyla sterilize edilmesi disinda yukaridaki ile aynidir. Bu, maya ekstraktini ve phytone'u, bunlarin bilesimini ortamlardaki proteinlerin isitilmasi ve denatürasyonu ile potansiyel olarak etkileyebilen, otoklavlamaktan kaçinmak amaciyla yapilmistir. DCFT26b fermantasyonu için, DCFT26b, maya ekstraktinin ve phytone peptonunun miktari arttirilmistir. Bu, besin içinde maya ekstraktinin ve peptonun konsantrasyonunun DCFT26a içindekine kiyasla daha az olmasi ve böylelikle yapmanin ve filtre vasitasiyla sterilize etmenin daha kolay olmasi için yapilmistir. Her iki fermantasyon için de, izlenen strateji aynidir, bir 6 saatlik seri faz akabinde bir 14 saatlik beslemeIi-seri faz. Tablolar 3 ve 4 ortam reçetelerini sunarken, Sekil 6 her iki fermantasyon için de kullanilan stratejiyi sunar. Tablo 3 DCFT26a Için Ortamlarin reçetesi ve beslemeII-seri strateji Bilesen DCFT26a - (kisa seri - uzun beslemeIi-seri) Seri Besleme Hasat noktasindaki faz konsantrasyonlar Phytone 40g/L 254g/L 1009/L Peptonu Maya ekstrakti 10g/L 153g/L SOg/L Filtre sterilize edilmistir KH2PO4 1.929/L K2HPO4 1.259/L NazHPO4 3.5g/L Bilesen Magnezyum Vitamin çözeltisi 2.5g/L 10mL/L DCFT26a - (kisa seri - uzun beslemeIi-seri) Hasat noktasindaki konsantrasyonlar Tablo 4 DCFT26b için Ortamlarin reçetesi ve beslemeIi-seri strateji Bilesen Phytone Pepton u Maya ekstrakti Glikoz KH2PO4 K2HPO4 NazHPO4 Magnezyum Vitamin çözeltisi 2ûg/L 7.59/L 1 .929/L 1 .259/L 3.5g/L 2.59/L 10mL/L DCFT26b - (kisa seri - uzun beslemeIi-seri) 151 .4g/L 127.1g/L 17.8g/L Filtre sterilize edilmistir Hasat noktasindaki konsantrasyonlar 100g/L 509/L 109/L Sekil 7, iki fermantasyondan büyüme egrilerini (zamana karsi ODGOOnm) gösterirken, Sekil 8 net büyüme egrilerini (zamana karsi Net ODeoonm) gösterir. DCFT26a ve DCFT26b için büyüme egrileri Sekil 2'de gösterilen DCFT24b'ninkine çok benzerdir. Hücreler beslemeIi-seri faz sirasinda yavas bir sekilde büyümüstür ve yaklasik olarak 3,5 olan bir nihai net ODBOOnm'ye ulasmistir. Fermantasvon örneklerinin SDS PAGIg ielleri: Süpernatant örneklerinin SDS PAGE analizi (%8'lik Tris-Glisin jelleri) iki fermantasyonun her biri için gerçeklestirilmistir (Sekil 9 ve Sekil 10). Buna ek olarak, kollajenazlarin miktarinin bir daha iyi tahmine sahip olmak amaciyla, DCFT26a'nin (Sekil 11) ve DCFT26b'nin (Sekil 12) hasat örnegi noktasi için bir yari-kantitatif SDS PAGE jeli gerçeklestirilmistir. Her iki fermantasyonda da, kollajenazlarin düzeyleri DCFT24b'de (Sekil 3) olanlara benzerdir. Yari-kantitatif SDS PAGE jeli DCFT24b'te çok benzer düzeylerin (280 mg/L ila 300 mg/L araliginda toplam kollajenaz) hem DCFT26a hem de DCFT26b için elde edildigini gösterir. DCFT26a fermantasyon siklusunun (Sekil 11) hasat noktasi kollajenaz I Için ~142 mg/L'dir ve kollajenaz ll için ~132 mg/L'dir. DCFT26b fermantasyon siklusunun (Sekil 12) hasat noktasi kollajenaz I için ~147 mg/L'dir ve kollajenaz II için ~158 mg/L'dir. Klostripain düzeyleri, DCFT24b durumunda oldugu gibi, hâlâ yüksektir. Amonyum sülfat presipitasvon adiminin çalismasi: Bu fermantasyonlardan elde edilen sonuçlar, kollajenazlarin düzeylerinin beslemeIi-seri strateji kullanilarak yüksek olmasina ragmen, klostripain düzeylerinin de hâlâ anlamli olarak yüksek oldugunu göstermistir. Bundan dolayi, bir küçük ölçekte deneysel çalisma, amonyum sülfat konsantrasyonunun filtrelenmis fermantasyon süpernatantindan çökeltilmis pelette klostripainin ve kollajenazlarin geri-kazanilmis miktarlari üzerindeki etkisini arastirmak için düzenlenmistir. Amonyum sülfat presipitasyonu adiminin etkililigini degerlendirmek amaciyla, 6 x 100 mL Süpernatant örnegi DCFT263 fermastasyonundan hasat edilmistir. Bu örnekler asagidaki tabloda detaylandirildigi üzere 6 farkli amonyum sülfat konsantrasyonu ile çökeltilmistir. Peletler 3,3 mL WFI içinde yeniden-süspanse edilmistir ve 100 mM K2HPO4'e (pH 6,7) karsi diyaliz uygulanmistir. Tablo 5 DCFT26a'dan 100 mL'Iik süpernatant örneklerini çökeltmek için kullanilmis olan amonyum sülfat konsantrasyonlari. Doygunluk Yüzdesi Amonyum Sülfat Konsantrasyonu (g/L) % 100 g/L 225% 150 g/L % 200 g/L 375% 250 g/L 45% 300 g/L 60% 400g/L Diyaliz-sonrasi örnekler akabinde SDS-PAGE analizi ile analiz edilmistir. Sekil 12: %15 ile çöktürülmüs diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi. Sekil 15: %45 ve %60 ile çöktürülmüs diyaliz-sonrasi hasat noktasi örnegi. Jeller, kullanilan amonyum sülfatin %15 ila %45 doygunluk arasinda oldugu durumda, diyaliz-sonrasi örneklerde kollajenazlarin düzeylerinin çok düsük oldugunu gösterir. Bu durumlarda geri-kazanimin %5'ten az oldugu görülmüstür. örnekte kollajenazlarin düzeyleri çok yüksektir (Sekil 15). Bantlarin yogunlugunu (referansa kiyasla örnegi) karsilastirma ile, kollajenazlarin her biri için yaklasik olarak 70 mg/L'nin diyaliz-sonrasi örnekte bulundugu tahmin edilebilir. Bu, burada hasat noktasi örneginde kollajenazlarin her birinin yaklasik olarak 130 mg/L'sinin oldugu DCFT263 için yari-kantifikasyon jeline göre (Sekil 11) oldugundan, yaklasik olarak %50 ila 60 olan bir geri-kazanim öne sürer. Böylelikle, mevcut açiklama DCFT26b'de yukarida izah edilen ortam reçetesinin kullanimi (elbette, orada izah edilen miktarlar yaklasik miktarlardir) ve kollajenazi çökeltmek için amonyum sülfat kullanimi ile ilgilidir, burada yaklasik 400 g/Iitre amonyum sülfat kollajenaz-içeren ortama eklenir. BeslemeIi-seri fermantasyonlarin 3. grubu Burada, primer amaç gelistirilmis beslemeIi-seri stratejinin yeniden-üretilebilirligini degerlendirmektir. DCFT26b'nin bir tekrarlama fermantasyonu olan bir beslemeIi-seri fermantasyon gerçeklestirilmistir. Buna ek olarak, amonyum sülfat/presipitasyon adimlari öncedeki küçük-ölçekli çalismaya kiyasla daha detayli bir sekilde çesitli amonyum sülfat konsantrasyonlarinin çökeltilmis/diyaliz sonrasi örneklerde kollajenazlarin ve klostripainin geri-kazanimi üzerindeki etkisini incelemektir. Buna ek olarak, hasat edilmis süpernatant örneklerine muamele etmenin iki yöntemi de degerlendirilmistir, yani, pH'yi kaydirma ve ortamlari oksijenleme. Büyüme egrisi: Kullanilan ortamlar ve beslemeIi-seri strateji DCFT26b ile tam olarak aynidir. Sekil 16 fermantasyondan elde edilen büyüme egrisini (zamana karsi ODBOOnm) ve net büyüme egrisini (zamana karsi Net ODBOOnm) gösterir. Büyüme egrisi DCFT26b'ninkine çok benzerdir, bu prosesin iyi yeniden-üretilebilirligini gösterir. Fermantasyon boyunca alinan süpernatant örneklerinin SDS PAGE analizi (%8'Iik Tris- Glisin jelleri) kollajenazlarin ve klostripainin düzeylerinin DCFT26b'ninkine çok benzer oldugunu göstermistir (SDS PAGE jeli gösterilmemistir). Bir yari-kantitatif SDS PAGE jeli (%8'lik Tris-Glisin jeli) hasat noktasi örnegi için gerçeklestirilmistir (Sekil 17). Jel, mevcut kollajenazlarin her birinin, DCFT26b'de gözlemlenen düzeylere benzer olarak, 120 mg/L'den fazlasinin oldugunu öne sürer. Fermantasyon hasat örneklerinin amonyum sülfat presipitasvonu: Amonyum sülfat presipitasyon adiminin etkililigini degerlendirmek amaciyla, 7 x 500 mL'Iik süpernatant örnekleri hasat edilmistir. Bunlar asagidaki alti yöntem kullanilarak çökeltilmistir. Tüm durumlarda, peletler, burada peletin içinde yeniden-süspanse edildigi ve ayni tampona karsi diyaliz uygulandigi yöntem 4 disinda, diyaliz uygulanmistir. SDS PAGE jelleri akabinde, diyaliz-sonrasi örneklerde kollajenazlarin miktarlarini tahmin etmek ve presipitasyon/diyaliz adimlarinin geri- kazanimini degerlendirmek için gerçeklestirilmistir. Takip edilen presipitasyon/diyaliz için yöntemler asagidaki sekildedir: 1. Süpernatant örnegine hepsi bir kerede eklenen 400 g/L amonyum sülfat ile presipitasyon. 100 mM K2HPO4'e, pH 6,7, karsi diyaliz. 2. Süpematant örnegine yavasça (yaklasik 30 dakika) eklenen 400 g/L amonyum sülfat ile presipitasyon. 100 mM K2HPO4'e, pH 6,7, karsi diyaliz. 3. Önceden-oksijenlenmis olan süpernatant örnegine yavasça (yaklasik 30 dakika) eklenen 400 g/L amonyum sülfat ile presipitasyon. Bu fermentörden hasat edilen hücre kültürünün 500 mL'sini yaklasik olarak 10 dakika boyunca oksijenleme ile yapilmistir. Kültür akabinde filtre vasitasiyla sterilize edilmistir. Amonyum sülfat presipitasyonundan sonra olusturulan pelete 100 mM K2HPO4'e, pH 6,7, karsi diyaliz uygulanmistir. 4. pH'i 5 N HCI eklenmesi ile pH 6'ya degistirilmis olan süpernatant örnegine yavasça (yaklasik 30 dakika) eklenen 400 g/L amonyum sülfat ile presipitasyon. Sonra olusturulan pelete 100 mM K2HPO4, pH 6, karsi diyaliz uygulanmistir. . Süpernatant örnegine yavasça (yaklasik 30 dakika) eklenen 440 g/L amonyum sülfat ile presipitasyon. 100 mM K2HPO4'e, pH 6,7, karsi diyaliz. 6. Süpernatant örnegine yavasça (yaklasik 30 dakika) eklenen 480 g/L amonyum sülfat ile presipitasyon. 100 mM K2HPO4'e, pH 6,7, karsi diyaliz. 7. Süpematant örnegine yavasça (yaklasik 30 dakika) eklenen 520 g/L amonyum sülfat ile presipitasyon. 100 mM K2HPO4'e, pH 6,7, karsi diyaliz. Amonyum sülfat süpernatant örneklerine 480 g/L'de ve 520 g/L'de eklendiginde tamamen çözünmemis iken, bu 400 g/L'de ve 440 g/L'de eklendiginde tamamen çözünmüstür. SDS PAGE'den elde edilen sonuçlar, presipitasyon adimi için kullanilan amonyum yöntemlerin (oksijenasyonun, pH kaymasinin) diyaliz-sonrasi örneklerde bulunan kollajenazlarin miktarlari üzerinde bir asikâr etkiye sahip oldugunun görülmedigini göstermistir. Tüm durumlarda, diyaliz-sonrasi örneklerde kollajenazlarin her birinin konsantrasyonu 50 mg/L ila 60 mg/L araligindadir. Sekil 18a, bir temsili SDS PAGE jelini, örnegin, 400 g/L amonyum sülfat ile çökeltilmis olan diyaliz-sonrasi örneginkini, gösterir. Tüm jeller diger SDS PAGE jellerine çok benzer oldugundan bu raporda sunulmaz. Hasat noktasi örneginde (Sekil 17) ve diyaliz-sonrasi örneklerde kollajenazlarin tahmin edilen konsantrasyonlari hesaba katildiginda, presipitasyon/diyaliz adimlarindan sonra kollajenazin geri-kazanimi yaklasik olarak %50'dir. SDS jel ile kollajenaz konsantrasyonunun tahmininde hata genel olarak yüksek oldugundan, %50'Iik geri- kazanim degerinin dogru olup olmadigini arastirmak amaciyla, asagidaki SDS PAGE jelleri gerçeklestirilmistir. o Amonyum sülfat ile çökeltilmis ömeklerin santrifügasyonundan sonra süpernatantlarin tümünün bir SDS PAGE jeli (Sekil 18a). Amaç kollajenazlarinin herhangi bir miktarinin süpernatant içine kaybedilip kaybedilmedigini degerlendirmektir. - Burada hasat noktasi süpernatant örneginin ve diyaliz-sonrasi amonyum sülfat (400 g/L) ile çökeltilmis örnegin kollajenazlarin esit miktarlarini içerecek sekilde uygun olarak seyreltildigi ve ayni jel üzerine yüklendigi bir SDS PAGE jeli (Sekil 0 Burada hasat noktasi süpernatant örneginin ve diyaliz-sonrasi amonyum sülfat (520 g/L) ile çökeltilmis örnegin kollajenazlarin esit miktarlarini içerecek sekilde uygun olarak seyreltildigi ve ayni jel üzerine yüklendigi bir SDS PAGE jeli (Sekil Sekil 18b'den amonyum sülfat ile çökeltilmis örneklerin santrifügasyonundan sonra süpernatantlarda bulunan kollajenazlarin miktarinin çok düsük oldugu görülebilir. Sekil 19'da ve Sekil 20'de, presipitasyon/diyaliz adimlarindan sonra kollajenazlarin miktarinin süpernatant hasat örnegindekine çok benzer oldugu görülmüstür. Bundan dolayi, süpernatant örneklerinin ve diyaliz-sonrasi örneklerin yari-kantitatif SDS PAGE jellerini karsilastirma ile türetilmis olan geri-kazanim degerinin gerçekten yüksek olmasi olasidir. Hayvan kaynakli TSBIProteoz ile temel-ölçüt olan fermantasyon deneyleri: C. histolyti'cum 013 ve 004 suslarinin hayvan kaynakli bilesenler içeren ortamlardaki fermantasyonlari gerçeklestirilmistir. Amaç sus 013'ü sus 004 ile karsilastirmaktir ve hayvansal bilesenlerin hücre büyümesi, kollajenaz ekspresyonu ve kontaminantlarin düzeyleri üzerindeki etkisini degerlendirmektir. C. histolyticum 013: Liyofilize edilmis sus PBS içinde rekonstitüye edilmistir ve TSE/Proteoz agar plakalari (30 g/L TSB, 10 g/L proteoz peptonu, 12 g/L agar) üzerine kaplanmistir. Plakalar anaerobik gaz paketleri varliginda bir anaerobik kavanoz içinde inkübe edilmistir. Tek koloniler toplanmistir ve 5mL TSB/Proteoz ortamlarini inoküle etmek için kullanilmistir. 37°C'de 15 saatlik inkübasyondan sonra, kültürün ODGOOnm'si yaklasik olarak 1,0 birimdir. 5 mL kültür akabinde 1 mL steril ile karistirilmistir ve -70°C'nin altinda saklanmistir. PBFT58 fermantasyonlari Büyüme egrileri: Iki 5 L'Iik seri fermantasyon gerçeklestirilmistir, PBFT580 (sus 004) ve PBFT58d (sus 013). Tablo 6 kullanilan TSB/Proteoz ortamlarinin reçetelerini sunar. Sekil 21, elde edilen büyüme egrilerini (zamana karsi Net ODöÜOnm) gösterir. Tablo 6 TSB/Proteoz ortamlari için reçete Bilesen Konsantrasyon Proteoz peptonu SOg/L MgSO4-7H20 0.089/L KH2P04 1.92g/L NazHPO4 3.59/L Vitamin çözeltisi (Steril filtreden geçirilmis) 10mL/L Sekil 21'den, sus 013'ün sus 004'e kiyasla bir daha yüksek OD'ye büyüdügü görülmüstür. Bununla birlikte, her iki durumda da, nihai ODsoonm 2,5'ten daha yüksektir, bu hayvan kaynakli ortamlarin her iki sus için de iyi büyümeyi destekledigini gösterir. Sus 013'ün hasat noktasina kadar (20 saat) yavasça büyümeye devam etmis iken sus 004'ün yaklasik olarak 2,7 olan bir net ODBOOnm'ye kadar büyüdügü ve akabinde büyümeyi durdurdugu bildirilmistir. Hayvan kaynakli olmayan ortamlarin kullanildigi, önceden sunulan beslemeli-seri fermantasyonlara kiyasla, hayvan kaynakli TSB/Proteoz ortamlari kullanilarak elde edilen nihai OD daha düsüktür. SDS PAGE analizi: Fermantasyonlar boyunca alinan süpernatant örneklerinin SDS PAGE jelleri (%8'lik Tris-Glisin jelleri) Sekil 22'de ve Sekil 23'te gösterilir. Fermantasyon süpernatantlarinda, özellikle sus 013 durumunda, herhangi bir klostripain oldugu görülmemistir. Bu, orijinatörün kollajenazlarin saflastirilmasi sirasinda sorunlara veya azaltilmis sorunlara sahip olmus olabilecegi gerçegini açiklayabildiginden, bir çok önemli bulgudur. Aksine, kollajenazlarin parçalanmasi ile anlamli problemler saflastirma prosesi sirasinda önceden yasanmistir. Bu kismen, fermantasyon içindeki klostripain varligina atfedilebilmistir. Fermantasyonlarda bulunan kollajenazlarin miktarinin bir daha iyi tahminini elde etmek amaciyla, bir yari-kantitatif SDS PAGE jeli hasat noktasi örnekleri için katkida bulundurulmustur (Sekil 24 ve Sekil 25). Jeller, kollajenazlarin daha düsük miktarinin bitkisel ortamlar ile beslemeli-seri fermantasyona (PBFT57) kiyasla TSB/Proteoz ortamlar ile seri fermantasyonlarda (PBFT58C) üretildigini öne sürer. Bu, daha yüksek hücre yogunluklarinin son bahsedilen durumda elde edildigi gerçegine atfedilebilir (ODGOOnm ~ 4 ila ODGDOnm ~ 2,7). Tablo 7, yari-kantitatif jellerinden elde edilen sonuçlari özetler. Tablo 7. PBFT57 ve PBFT58c,d için yari-kantitatif SDS PAGE jellerinden elde edilen sonuçlar PBFT57 (Hayvandan- PBFT58c (Hayvan- PBFT58d (Hayvan- yoksun, sus 004) kaynakli, sus 004) kaynakli, sus 013) 132 88 59 142 95 95 Toplam 274 183 154 Fermantasvon hasat örneklerinin amonvum sülfat presipitasvonu: Her bir fermantasyon için, 2 x ve 520 g/L (%80) amonyum sülfat ile çökeltilmistir. Peletler 16,5 mL WFI içinde yeniden-süspanse edilmistir ve bunlara karsi diyaliz uygulanmistir. Akabinde diyaliz-sonrasi örneklerin SDS PAGE analizi (%8'Iik Tris-Glisin jelleri) gerçeklestirilmistir (Sekil 26 ve Sekil 27). Bu jellerden elde edilen sonuçlar, çok konsantre edilmis diyaliz-sonrasi örneklerde bile (Sekiller 26'nin ve 27'nin seritleri 6'da ve 7'de), klostripain düzeylerinin hayli düsük oldugunu göstermistir. Bu, sus 004'e kiyasla sus 013'te durumda daha asikârdir. Böylelikle, bulus klostripainden yoksun olan kollajenaz bilesimleri, örnegin, burada tarif edilen fermantasyon prosesi ile üretilenler, ile ilgilidir. Klostripain aktivitesinin ölçümü: Klostripainin rolünü ilaveten arastirmak amaciyla, bir enzimatik analiz diyaliz-sonrasi örneklerin klostripain aktivitesini ölçmek için düzenlenmistir. Asagidaki yöntem kullanilmistir: Klostripainin enzimatik analizi: klostripain BAEE + HzO --_› N-a-BenzoiI-L_Arjinin + Etanol BAEE = N-a-BenzoiI-L-Arjinin EtiI Ester Kosullar: T = 25°C, pH = 7,6, A253nm, Isik yolu = 1 cm Yöntem: Sürekli Spektrofotometrik Hiz Belirlemesi Birim tanimi: Bir birim 2,5 mM DTT varliginda 25°C'de pH 7,6'da her bir dakikada 1,0 pmol BAEE hidrolize edecektir. Klostripain aktivitesi için diyaliz-sonrasi örneklerin anal& Klostripain aktivite analizi TSB/Proteoz (PBFT58) ile fermantasyonlardan ve bitkisel temelli beslemeIi-seri fermantasyondan (PBFT57) elde edilen diyaliz-sonrasi örnekleri analiz etmek için kullanilmistir. Tablo 8, sonuçlari özetler. Sonuçlar, TSB/Proteoz fermantasyonlari durumunda çok düsük klostripain aktivitesi oldugunu gösterir. Aksine, beslemeIi-seri PBFT58 durumunda klostripain aktivitesi çok yüksekün Tablo 8 Diyaliz-sonrasi örneklerin enzimatik aktiviteleri PBFT58c PBFT58d (Hayvandan kaynakli, sus kaynakli, sus yoksun, sus 004) 004) 013) Klostripain aktivitesi 56.4* 1.0* 0.1* Spesifik klostripain aktivitesi (toplam 205.8 5.5 0.7 kollajenazin her bir mg'i için U) * Çökeltilmis/diyaliz sonrasi örnekte belirlenen klostripain aktivitesi Alternatif pegtonlarin arastirilmasi Çalkalama balonunda tarama deneyleri: Bu çalismada çesitli bitkisel peptonlar phytone peptonuna alternatif olarak kullanilmistir. Amaç bunlarin kollajenazlarin ve klostripainin ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkisini degerlendirmektir. Test edilen tüm peptonlar bitkisel kaynaklardan türetilir ve Sigma tarafindan pazarlanir. Kullanilan deneysel prosedür Sekil 28'de tarif edilir. Ortam reçeteleri Tablo 9'da detaylandirilirken, kullanilan peptonlarin bir listesi Tablo 10'da gösterilir. Phytone peptonu içeren bir kontrol çalkalama balonu da yapilmistir. Tüm durumlarda, 50 g/L maya ekstrakti ve 100 g/L her bir pepton gelistirilmis beslemeIi-seri fermantasyonun hasat noktasinda bu bilesenlerin konsantrasyonlarini taklit etmek için bir girisimde kullanilmistir (bakiniz, Tablo 4). Tablo 9 Çalkalama balonu deneyinde kullanilan ortamlarin bilesimi. Tüm ortamlarfiltre yoluyla sterilize edilmistir. Bitkisel ortamlar Bilesen Konsantrasyon Alternatif Pepton 100g/L Maya ekstrakti 509/L KH2PO4 1.92g/L K2HPO4 1.2sg/L NazHPO4 3.59/L Magnezyum 0.08g/L Vitamin çözeltisi iOmL/L Glikoz 0.99/L Çalkalama balonlari 18 saat boyunca inkübe edilmistir. Kültürler ODSOOnm ve canli hücre sayimlari için analiz edilmistir. Kültürler filtrelenmistir ve süpernatantlar SDS PAGE ile analiz edilmistir. ODGOOnm ölçümlerinden ve canli hücre sayimlarindan elde edilen sonuçlar Tablo 10'da özetlenir. Bitkisel peptonlarin çogu phytone peptonuna kiyasla daha yüksek net 0D degerleri ile sonuçlanmistir. Bununla birlikte, DD degerleri canli hücre sayimlari ile korele degildir. Bu kismen canli hücre sayim yönteminin degiskenligine veya hücrelerin önceden- seçilmis hasat noktasindan (18 saat) önce halihazirda lize etmeye baslamis olmasi gerçegine atfedilebilir. Ilginç bir sekilde, SDS-PAGE jel kontrolünkini (phytone peptonu) içeren balonlarin tümünde kollajenazin herhangi bir ekspresyonu olmadigini göstermistir (jel gösterilmemistir). Bunun bir olasi nedeni, kullanilan phytone peptonunun ve maya ekstraktinin konsantrasyonlarinin çok yüksek oldugu ve sonuç olarak bunlarin kollajenazlarin ekspresyonunu baskiladigi gerçegi olabilir. Tablo 10 1. tarama deneyinden sonuçlar Pepton Tipi 18 saat büyümeden sonra Net ODGOOnm CFUImL Phytone peptonu (kontrol) 2.65 1.2 x 109 Proteoz peptonu (bitkisel) 2.58 7.4 x 108 Tripton (bitkisel) 3.05 4.8 X 108 Bitkisel ekstrakt 3.22 1.0 x 109 Bitkisel ekstrakt 1 3.11 9.6 x 109 Bitkisel ekstrakt 2 3.05 7.8 x 109 Bitkisel hidrolizat 2 3.01 8.4 X 109 Alternatif @tonlar kullanilan beslemeli-seri fermantasyonlar - DCFT27a,b: Kollajenazlarin herhangi bir ekspresyonunun gözlemlenmedigi önceki çalkalama balonlari deneylerinden elde edilen bilgilere dayanarak, gelistirilmis beslemeIi-seri strateji kullanilarak alternatif peptonlari degerlendirmeye karar verilmistir. Iki beslemeIi-seri fermantasyon gerçeklestirilmistir, DCFT27a (bitkisel ekstrakt 2) ve DCFT27b (bitkisel hidrolizat 2). Her iki fermantasyonda da, phytone peptonu içeren ortamlar için gelistirilmis olan beslemeIi-seri strateji kullanilmistir. Tablo 11 ortam reçetelerini tarif ederken, Sekil 29 kullanilan stratejiyi tarif eder. Tablo 11 BeslemeIi-seri fermantasyonlar DCFT27a ve DCFT27b için ortam reçetesi Bilesen DCFT27a,b Seri Besin Hasat Noktasinda faz Konsantrasyonlar Alternatif GOQ/L 151.4g/L 100g/L Pepton Maya Ekstrakti 209/L 127.1g/L SOg/L Glikoz 7.Sg/L 17.89/L log/L Filtre sterilize edilmistir KH2PO4 1.929/L K2HPO4 1.259/L NazHPO4 3.59/L Magnezyum 0.08g/L Vitamin 10mL/L çözeltisi Hacim 3.6L 1.4L ~5L Büyüme egrileri: DCFT27a ve DCFT27b için büyüme egrileri (zamana karsi Net ODGOOnm) Sekil 30'da gösterilir. Her iki fermantasyonda da, hücreler phytone peptonu içeren ortamlara (fermantasyon PBFT57, Sekil 16) kiyasla hafif bir derecede daha yüksek ODSOOnm'ye kadar büyümüstür. Bu, canli hücre sayimlari ile uyumludur (PBFT57 için 1,5 x . SDS PAGE jelleri: Çalkalama balonu deneyleri ile oldugu gibi, SDS PAGE analizi hem DCFT27a'da hem de DCFT27b'de kollajenazlarin herhangi bir ekspresyonu olmadigini göstermistir (jeller gösterilmemistir). Bu, yüksek miktarlarda peptondan olusan ortamlarin phytone peptonu kullanildiginda kollajenazlarin ekspresyonunu destekledigi ancak bir alternatif pepton kullanildiginda çok fazla zengin oldugu ve böylelikle kollajenazi ve klostripaini içeren herhangi bir metabolitin ekspresyonunu baskiladigi gerçegine atfedilebilir. Hücrelerin alternatif peptonlar içeren ortamlarda çok rahat büyüme kosullarina sahip oldugu ve herhangi bir proteaz üretmeye ihtiyaç duymadigi görülür. Alternatif peptonlar kullanilan seri fermantasyonlar - PBFT59a,b,c: DCFT27a ve DCFT27b beslemeIi-seri fermantasyonlarindan elde edilen sonuçlar, üç ilave alternatif peptonu ancak önceden kullanilana kiyasla daha düsük konsantrasyonlarda kullanarak arastirmak için ilave çalismaya yönlendirmistir. Üç 5 L'Iik seri fermantasyon gerçeklestirilmistir, PBFT59a (bitkisel tripton), PBFT59b (bitkisel ekstrakt) ve PBFT590 (bitkisel ekstrakt n0.1). Fermantasyorilar 18 saat sonra hasat edilmistir. Tüm peptonlar hayvansal ortamlarda (Proteoz/Pepton) proteoz peptonu konsantrasyonunu ve önceden kullanilmis olan phytone peptonu konsantrasyonunu taklit etmek için bir girisimde 50 g/L'Iik konsantrasyonlarda kullanilmistir. Ortam reçetesi Tablo 12'de gösterilir. Tablo 12 5 L'lik fermantasyonlar PBFT59a.b,c için ortam reçetesi ve fermantasyon stratejisi Bilesen Konsantrasyon Alternatif Pepton 509/L Maya Ekstrakti 8.59/L Glikoz 59/ L KH2PO4 1.92g/L Bilesen Konsantrasyon K2HPO4 1.259/L NazHPO4 3.Sg/L NaCI 2.5g/L Magnezyum 0.089/L Vitamin çözeltisi 10mL/L Hacim 5L Büyüme egrileri: PBFT59a,b,c fermantasyonlarindan elde edilen büyüme egrileri Sekil 31'de gösterilir. Tüm durumlarda, hücreler DCFT27 beslemeli-seri fermantasyonlara kiyasla bir daha düsük (1,8 ila 2,8 arasinda) ODBOOnm'ye kadar büyümüstür. Bu ayrica, canli hücre sayimlari ile uyumludur (DCFT27a,b için 2 x 109 CFU/mL'ye kiyasla PBFT59a,b,c için . Tripton içeren ortamlarda, hücreler en yavas büyüme hizini göstermistir ve 18 saat sonra en düsük hücre yogunlugunu vermistir. SDS PAGE jelleri: Çalkalama balonu deneyi ve DCFT27a,b beslemeIi-seri fermantasyonlar için oldugu gibi, SDS PAGE jellerinde herhangi bir kollajenaz ekspresyonu görülmemistir (jeller gösterilmemistir). Bu sonuçlar, alternatif peptonlarin, bunlarin hücre büyümesini desteklemesine ragmen, kollajenazlarin ekspresyonuna izin vermedigini gösterir. Önceden öne sürüldügü üzere, bu, bu peptonlarin besleyici maddeler, örn., serbest amino asitler, küçük peptitler, açisindançok zengin oldugu gerçeginden kaynaklanabilir. BeslemeIi-seri fermantasyonlarin 4. grubu - DCFT27d Alternatif bitkisel peptonlarin kullanildigi deneylerden elde edilen sonuçlar basarili olmadigindan, bu çalismanin sonraki amaci phytone peptonu ortamlari kullanilan gelistirilmis beslemeIi-seri fermantasyonda klostripainin düzeylerini azaltma olasiligini arastirmaktir. Önceden tarif edildigi üzere, klostripain büyük olasilikla saflastirma prosesi sirasinda kollajenazlarin parçalanmasina neden olmustur. Bir beslemeIi-seri fermantasyon üç amino asit, yani, glutamin, triptofan ve asparajin, ile takviye edilmis standart phtyone peptonu ortamlari kullanilarak gerçeklestirilmistir. Bu özel amino asitlerin konsantrasyonlari, üreticiler tarafindan saglanan, bu bilesenlerin amino asit bilesimine göre, hayvan TSB/Proteoz ortamlarin kiyasla phytone peptonunda daha düsük oldugundan, bu fermantasyon gerçeklestirilmistir. Burada amaç bu amino asitlerin eklenmesinin klostripainin ekspresyonu için bir etken faktör olabilen herhangi bir besleyici madde sinirlamasini azaltabilip azaltamayacagini arastirmaktir. Ortam reçetesi Tablo 13'te gösterilir. Kullanilan fermantasyon stratejisi DCFT26 ve PBFT57 fermantasyonlari için kullanilan standart beslemeIi-seri stratejidir (bakiniz, Sekil 6). Tablo 13 Beslemeli-seri fermantasyon DCFT27d ortam reçetesi Bilesen DCFT27d Seri Besleme Hasat noktasinda faz konsantrasyonlar Peptonu Maya ekstrakti 209/L 127.1g/L SOg/L Glikoz 7.Sg/L 17.8g/L 10g/L Amino asitler Glutamin 2.89/L Filtre sterilize Triptofan 0.359/L edilmistir Asparajinin 0.18g/L KH2PO4 1 .929/L K2HPO4 1 .259/L Na2HP04 3.Sg/L Bilesen DCFT27d Seri Besleme Hasat noktasinda faz konsantrasyonlar Magnezyum 0.08g/L Vitamin 10mL/L çözeltisi Hacim 3.6L 1.4L ~5L Büyüme egrisi: DCFT27d fermantasyonundan elde edilen büyüme egrisi Sekil 32'de gösterilir. Elde edilen büyüme profili, önceden gösterilen amino asitler yoklugunda standart beslemeli- seri fermantasyon (DCFT26b ve PBFT57) için elde edilene çok benzerdir. sos PAGE jeli: Sekil 33a, fermantasyon boyunca alinan süpernatant örneklerinin SDS PAGE jelini gösterir. Kollajenazlarin düzeyi, standart beslemeIi-seri fermantasyon için görülene benzerdir (bakiniz, DCFT26b'den SDS PAGE jeli için Sekil 10). Klostripainin fermantasyonda hâlâ bulunmasina ragmen, bunun düzeyinin DCFT26b'dekine kiyasla Bunu ilaveten arastirmak amaciyla, diyaliz-sonrasi hasat noktasi örneginin klostripain aktivitesi klostripain aktivite analizi kullanilarak tahmin edilmistir. Buna ek olarak, 20 L'Iik Iiyofilizasyon serisinden alinan diyaliz-sonrasi hasat noktasi örneginin klostripain aktivitesi de tahmin edilmistir. Bu özel seri anlamli kollajenaz parçalanmasi göstermeden saflastirildigindan, bu klostripain aktivitesi bilgisi bilgi vericidir. Tablo 14, diyaliz-sonrasi örneklerin enzimatik aktivitelerini özetler. Bu ayrica, karsilastirma amaçlari için, Tablo 8'de sunulan standart beslemeIi-seri fermantasyon PBFT57 ve hayvan TSB/Proteoz peptonu için enzimatik aktiviteleri de içerir. Tablo 14 Diyaliz-sonrasi örneklerin enzimatik aktiviteleri PBFT57 DCFT27d Standart Beslemeli-seri O L PBFT580 Lyo Hayvansal beslemeli- arti amino seri asitler Klostripain aktivitesi (UImL) Spesifik klostripain kollajenazin her bir mg'i için U) DCFT27d'den elde edilen sonuçlar, amino asitlerin eklenmesinin sus tarafindan üretilen klostripainin aktivitesini azalttigini gösterir. Klostripainin kollajenaza orani kontrol beslemeIi-seri fermantasyona kiyasla amino asit ile takviye edilmis fermantasyonda yaklasik olarak dört kat daha düsüktür. Hayvan-kaynakli fermantasyonda klostripainin kollajenaza orani amino asit ile takviye edilmis beslemeli- seri fermantasyona kiyasla on kat daha düsüktür. Klostripain aktivitesinin azalmasinin saflastirma sirasinda kollajenazlarin parçalanmasinda anlamli azalma ile sonuçlanabilmesi olasidir. Bir grup 5 L'Iik fermantasyon bir kaç beslemeIi-seri fermantasyon stratejisini degerlendirmek için gerçeklestirilmistir. Stratejiler bunlarin kollajenaz verimine, kontaminantlarin miktarina ve ölçeklendirilebilirligine göre degerlendirilmistir. Bu sonuçlara göre, yaklasik olarak 280 mg/L olan toplam kollajenazlarin bir üretkenligi ile sonuçlanan bir optimum beslemeIi-seri strateji tanimlanmistir. Fermantasyon stratejisi bunun ölçeklendirilebilirligini iyilestirmek için seri ortam konsantrasyonunu hafif bir derecede arttirma ve beslemeli-seri ortam konsantrasyonunu azaltma ile modifiye edilmistir. Fermantasyon stratejine bu degisim, kontaminantlarin üretkenligi veya düzeyleri üzerinde herhangi bir etkiye sahip degildir. Ikinci amaç, kollajenazlarin primer geri-kazanim adimini optimize etmektir. Bu adimin optimizasyonu proses adiminin verimindeki iyilestirmeyi veya geri-kazanilmis kontaminantlarin miktarindaki bir azalmayi veya ölçeklendirilebilirlikteki bir artisi içermistir. Amonyum sülfat konsantrasyonlarinin 100 ila 520 g/L araligindaki bir araligi degerlendirilmistir. pH'i 6,0'a düsürmenin ve ortami oksijenlemenin etkisi de degerlendirilmistir. 400 g/L'nin altindaki tüm amonyum sülfat konsantrasyonlari kollajenazlarin çok düsük geri-kazanimlarini göstermistir. 400 ila 520 g/L araligindaki amonyum sülfat konsantrasyonlarinin herhangi birinde kollajenazin veya klostripainin geri-kazaniminda herhangi bir fark gözlemlenmemistir. 400 g/L'Iik presipitasyondan elde edilen peleti yeniden-süspanse etmek en kolaydir ve bu konsantrasyon bundan dolayi optimum düzey olarak tanimlanmistir. Bir temel-ölçüt olan deneyi, C. histolyticum suslari 013 ve 004 ile bir hayvan-kaynakli ortamda kollajenazlarin ve klostripainin büyümesini ve üretimini belirlemek ve karsilastirmak amaciyla gerçeklestirilmistir. Hayvan-kaynakli ortam reçetesi, TSB'den ve proteaz peptonundan yararlanilan, Proses 1 fermantasyon ortamindan alinmistir. Bu deney ayrica, hayvansal ve hayvansal-olmayan ortamlarda büyütülen sus OO4'ün bir karsilastirmasina da olanak saglamistir. SDS-PAGE analizinden elde edilen sonuçlar, hayvan-kaynakli ortamlarda büyütülen C. histolyticum'dan elde edilen klostripainin çok daha düsük miktarlarini göstermistir. Bu sonuçlar, klostripain aktivitesi için bir enzimatik analiz kullanilarak konfirme edilmistir. Analiz hayvan-kaynakli ortamlar kullanilan fermantasyonlarda klostripainin aktivitesinde bir anlamli azalma göstermistir. Iki sus karsilastirildiginda, 004, 013'e kiyasla bir daha yüksek klostripain aktivitesi göstermistir. Alternatif nitrojen kaynaklarinin seleksiyonlari bunlarin beslemeIi-seri fermantasyon stratejisine kullanilan Phytone peptonunu degistirme yetisi için degerlendirilmistir. Bu peptonlar Bitkisel Ekstrakt No. 2'dir (Sigma, 49869) ve Bitkisel Hidrolizat No. 2'dir (Sigma, 07436). C. histo/yticum bitkisel peptonlar üzerinde hayli iyi büyüyerek 4 ila 5 birim olan optik yogunluklara (600 nm) ulasmistir. Bu fermantasyonlarin SDS-PAGE analizi ne kollajenazin ne de klostripainin herhangi bir ekspresyonunu göstermemistir. Bu peptonlar üzerinde gözlemlenen bol hücre büyümesinden dolayi, kompleks nitrojen kaynaginin konsantrasyonunun çok yüksek oldugu bunun proteaz ekspresyonunun bir inhibisyonu ile sonuçlandigi düsünülmüstür. Bundan dolayi fermantasyonlarin bir ikinci grubu, bir seri stratejide 50 g/L'de alternatif peptonlar kullanilarak gerçeklestirilmistir. 1 (Sigma, 04316) bu deneyler için alternatif peptonlar olarak kullanilmistir. Fermantasyonlar SDS-PAGE ile analiz edildiginde, kollajenazin veya klostripainin herhangi bir ekspresyonu görülmemistir. Phytone peptonu kullanilan bir beslemeIi-seri fermantasyon üç amino asit, glutamin, triptofan ve asparajin, ile takviye edilmistir. Bu amino asitlerin hayvansal-olmayan ortamlarda daha düsük miktarlarda bulundugu tanimlanmistir. Fermantasyonun büyüme profili amino asit takviyesi olmadan beslemeIi-seri fermantasyonunki ile çok benzerdir. SDS-PAGE analizi, kollajenazin bir benzer verimini ancak klostripainin hafif bir derecede daha düsük düzeyini göstermistir. Klostripain analizi, kontrol beslemeIi-seri fermantasyon ile karsilastirildiginda amino takviye edilmis fermantasyonda azaltilmis aktivite göstermistir. Yine de hâlâ anlamli iken klostripain aktivitesindeki azalma hayvansal ve hayvansal-olmayan ortamlar arasindaki fark kadar büyük degildir. Malzemeler ve Yöntemler: Bitkisel ortamlar kullanilan fermantasvon için inokiiim ortamlari Bu gelistirme çalismasi boyunca, inokülüm ortamlari için asagidaki reçeteler kullanilmistir. inokülüm ortamlari - Bitkisel Bilesen Konsantrasyon Bitkisel Pepton 509/L Maya ekstrakti 8.59/L Glikoz 0.99/L KH2P04 1.929/L K2HPO4 1.259/L Na2HPO4 3.59/L NaCI 2.5g/L Magnezyum 0.08g/L Vitamin çözeltisi 10mL/L Ortamlar filtre vasitasiyla sterilize edilmistir. inokülasyon prosedürü Iç hücre bankasindan bir viyalin buzu çözülmüstür ve 0,025 mL bir 30 mL'Iik universal içinde 5 mL'Iik inokülüm ortamini inoküle etmek için kullanilmistir. 5 mL'lik kültür anaerobik gaz jeneratörleri varliginda bir anaerobik kavanoz içinde 37°C'de inkübe edilmistir. Yaklasik olarak 13 ila 15 saatlik inkübasyondan sonra, 4 mL'Iik kültür bir 500 mL'Iik balon içinde 200 mL'Iik inokülüm ortamini inoküle etmek için kullanilmistir. Önceden oldugu gibi, balon anaerobik gaz jeneratörleri varliginda bir anaerobik kavanoz içine yerlestirilmistir. 37°C'de ve 5 rpm'de yaklasik olarak 13 ila 15 saatlik inkübasyondan sonra, balonun tüm içerigi fermentörü inoküle etmek için kullanilmistir. Fermentörlerin pH'i ve sicakligi sirasiyla 7,0'da ve 37°C'de kontrol edilmistir. Nitrojen akis hizi, 1 L/dakika'ya (~ 0,2 vvm'ye) ve karistiricinin hizi 100 rpm'ye ayarlanmistir. Fermentörden OD600nm ölçümleri ve canli hücre sayimlari için düzenli zaman araliklarinda örnekler alinmistir. Örnekler bir 0,22 um'lik filtre vasitasiyla filtreden geçirilmistir. Filtratlar -20°C'de saklanmistir ve SDS PAGE analizi için -20°C'de dondurulmustur. Sekil 33b, inokülasyon prosedürünün bir sematik diyagramini gösterir. Beslemeli-seri fermantasyon için bir tercih edilen reçete asagida izah edilir. Bilesen Miktar Seri Faz KH2PO4 2.91 g/L K2HPO4 1.89 g/L NazHPO4 5.30 g/L NaCI 3.79 g/L Phytone 65.45 g/L FeSO4 x 7H20 18.18 mg/L Riboflavin 0.758 mg/L Bilesen Miktar Niasin 1.52 mg/L Kalsiyum Pantotenat 1.52 mg/L Pimelik asit 1.52 mg/L Piridoksin 1.52 mg/L Tiyamin 1.52 mg/L L'lik fermantasyon için hacim 3.3 L BeslemeIi-seri Faz Glikoz 17.86 g/L Phytone 151.43 g/L Bacto Maya Ekstrakti 127.14 g/L L'lik fermantasyon için hacim 1.4 L Ayrica, kollajenaz ürünlerinin kalitesini veya verimlerini azaltmadan fermantasyon prosesinin ilaveten ölçegini-büyütmek de arzu edilebilir. Böylelikle, mevcut açiklama ilaveten, Sekil 33c'deki akis çizelgesinde tarif edildigi üzere bir yaklasik olarak 200 litrelik beslemeli-seri proses ile ilgilidir. Canli hücre sayma yöntemi Çalkalama balonlarindan alinan örnekler 10'4 ila 10'7 olan bir katsayi ile seyreltilmistir ve TB agar plakalari üzerinde kaplanmistir. Plakalar bir Genbox Kavanoz içinde 37°C'de yaklasik olarak 48 saat boyunca inkübe edilmistir. Bir Anaerobik Gaz Paketli kullanilmistir. Akabinde kolonilerin sayisi sayilmistir. Jeneratörü Kavanoz içinde anaerobik kosullar olusturmak amaciyla Malzemeler: Sorvall Evolution santrifüj Kimyasallar: Amonyum Sülfat, GPR gradinda (BDH) Süpernatant örnekleri ( bir 0,22 um'lik filtre vasitasiyla filtrelenmistir. Deneye bagli olarak, amonyum sülfatin çesitli miktarlari eklenmistir (%15 ila %80 doygunluk). Çözelti yaklasik 15 dakika boyunca, amonyum sülfatin tümü çözünene kadar, bir manyetik karistirici ile yavasça karistirilmistir. Bu akabinde, +2- 8°C'de ~3,5 saat boyunca karistirilmadan bekletilmistir. Bekleme adimini takiben, anlamli miktarda çökelti olusturulmustur. Çözelti akabinde 4°C'de 7.200 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj edilmistir. Süpernatant dökülmüstür ve pelet -20°C'de saklanmistir. Diyaliz Malzemeler: 10kDa MWCO SnakeSkin Diyaliz Tüpleri (68100, Pierce) Manyetik Karistirici Kimyasallar: Potasyum Dihidrojen Ortofosfat AnalaR (BDH) Enjeksiyonluk Su Bir 100 mL'Iik amonyum sülfat örneginden elde edilen peletler 3,3 mL WFI içinde yeniden-süspanse edilmistir. Rekonstitüye edilmis pelet bir önceden-islatilmis 10 kDa MWCO SnakeSkin diyaliz tüplerine transfer edilmistir ve 2-8°C'de ~12 ila 16 saat boyunca karsi diyaliz uygulanmistir. WFI akabinde degistirilmistir ve diyaliz 2 ila 4 saat boyunca devam ettirilmistir. Diyaliz uygulanmis malzeme geri-kazanilmistir ve hacim belirlenmistir. Diyaliz-sonrasi örnek -20°C'de saklanmistir. SDS-PAGE Analizi (%8'Iik Tris-Glisin ielleri) Malzemeler: Xcell SureLock Mini-Cell Kimyasallar: SDS-PAGE Yüksek Moleküler Agirlik Standartlari (161-0303, Bio Rad) Novex %8'Iik Tris-Glisin jelleri, Novex Tris-Glisin SDS Çalisma Tamponu (10x) (LC2675, Invitrogen) Novex Tris-Glisin SDS Örnek Tamponu (2x) (L02676, Invitrogen) NuPAGE Örnek indirgeme Ajani (10x) (NP0009, Invitrogen) Kollodial Mavi Boyama kiti (LC6025, Invitrogen) Etilendiamintetra-asetik asit disodyum tuzu Analar R (BDH) EDTA'ya (10 mM'Iik nihai konsantrasyon elde etmek için) 10 pl örnek ekleme ile indirgeme SDS-PAGE'i için hazirlanmistir. Yüksek moleküler agirlik (HMW) belirteci 80 konsantre edilmis stok ekleme ile hazirlanmistir. Akabinde seyreltilmis HMW standardi alikuotlamadan ve müteakip jellerde kullanim için -20°C'de saklanmadan önce 5 dakika boyunca 95°C'de isitilmistir. Kollajenazlar içeren örnekler (15 pl) ~1 saat 50 dk boyunca 130 V'ta Tris-Glisin çalisma tamponu kullanilarak %8'lik Tris-Glisin jeller üzerinde dogrudan (yani, herhangi bir ön isi muamelesi olmadan) yürütülmüstür. Elektroforezden sonra, jeller üreticinin talimatlari uyarinca koloidal mavi boya reaktifi ile boyanmistir. Saflastirma Prosesi Saflastirmanin 5 L'lik prosesi için yöntem özeti: Adim 1. Kültür ortam süpernatantinin (salgilanmis proteinin) amonyum sülfat presipitasyonu. 0,1 M potasyum fosfat, 0,1 M arjinin, pH 6,7, içine rekonstitüsyon ve diyaliz. Adim 2. Hidroksiapatit kromatoqrafisi ( 4 CV boyunca 0,264 M potasyum fosfatin, pH 6,7, %0-100 gradyani ile ayristirilir. Havuz 2 geç-ayrisan pikler, burada A230 A260, dogrudan TMAE Adimina yüklenir. Adim 3. Fraktoiel TMAE iyon degisimi ( Nükleik asit uzaklastirilmasi (bir Pall Mustang Q filtre de kullanilabilir) Baglanmamis sürekli akis toplanir ve havuzlanir. Adim 4. 10 mM Tris, pH 8,0, içine diyaliz Adim 5. O Sepharose HP ivon degisimi ( AUXII'den AUXI ayristirilir. 2 pik toplanmistir: Pik 1 = AUXII Pik 2 = AUXI Arjinin 0,1 M AUXI ve AUXII içeren fraksiyonlara eklenir Adim 6. AUXI ve AUXII havuzlari basinçlandirilmis karistirilmis-hücre ile konsantre Adim 7. Superdex 75 Jel Filtrasvonu AUXI'den ve AUXII'den klostripainin ve jelatinazin uzaklastirilmasi. AUXI ve AUXII ayri kolonlar üzerinde münferit olarak yürütülür. Örnekler %5 CV'de yüklenir. Adim 8. AUXI ve AUXII münferit olarak havuzlanir ve konsantre edilir, su içine diyafiltre edilir ve akabinde nihai ilaç ürününü olusturmak için havuzlanmistir. Kolon detaylari: Tablo 15. 5 L'lik proses icin kolon spesifikasvonlari Hacim Kolon Yatak Asimetri Ortamlar (mL) yüksekligi Plakalarlmetre Sepharose Kolon Dolgulama . Kolonlar mümkün oldugunda üreticinin talimatlari uyarinca dolgulanmistir. . TMAE kolonu - herhangi bir problem ile karsilasilmamistir. . Q Sepharose ve Superdex 75 - kolonun boyutundan dolayi basinci düzeltmek için dolgulamada zorluklarla karsilasilmistir. Bununla birlikte. kolonlar tavsiye edilen basinçta yürütülebilir. - HA- bir %50'Iik bulamaç olarak dolgulanir ve 10 mL/dakika'da yürütülür. Tablo 16: Koyu renkte AS ppt'den Q-Sefaroz IEX Kromatografisine Saflastirma Adim Verimleri Proses Adimi Protein Yöntem Hacim Toplam Adim Konsantrasyonu (g) Protein Verimi diyaliz sonrasi Üöpepün eklenmesi sonrasi) Tablo 17: Q-Sefaroz IEX'den Superdex 75 GPC'ye saflastirma. Proses Adimi Protein Yöntem Hacim Toplam Adim Konsantrasyonu (g) Protein Verimi önce hücre ABC I sonra hücre ABC önce hücre ABC sonra hücre ABC Bir 5 L'lik proseste verimler ABCI'in ve ABClI'nin her biri yaklasik olarak 60-75 mg'dir. 2500-3000 mg olan verimler beklenebilir. L'lik ölcekteki prosesin münferit Kromatografi adimlari: Hidroksiapatit kromatoqrafisi Kolon XK50/30 içinde 2 x Tampon A: 0,1 M potasyum fosfat, 200 pM Iöpeptin, pH 6,7 Tampon B: 0,264 M potasyum fosfat, 200 uM Iöpeptin, pH 6,7 <1,0 mg/mL ortam* olarak yüklenmistir Akis hizi: 9,8 mL/dakika Sekil 34, 1,0 mg/L ortam olan bir yükleme ile hidroksiapatitten sonra bir kromatogrami gösterir, burada rezolüsyonun bir kayda deger kaybi ve hedef parçalanmasi gerçeklesir. Fraktojel TMAE anyon degisimi Kolon XK26/20 içinde 58 mL (10 cm'lik yatak yüksekligi) Tampon A: 10 mM Potasyum fosfat, 0,2 M NaCI, 200 uM Iöpeptin, pH 6,7 Tampon B: 10 mM Potasyum fosfat, 2 M NaCI, pH 6,7 Örnek: 0,5 mg/mL'de ~650 mL (Potasyum fosfat, pH 6,?, içinde, HA kolonundan dogrudan) ~5,5 mg/mL ortam olarak yüklenmistir Akis hizi: 8,8 mL/dakika Elüsyon: (nükleik asidi ayristirmak için %100 B) Sekil 35, Fraktojel TMAE anyon degisiminden sonra bir kromatogrami gösterir. Baglanmamis fraksiyon, 0,5 mg/mL'de ~650 mL verecek sekilde havuzlanmistir. pH 8'de 10 mM Tris içinde diyaliz uygulanmistir. Sekil 36, 5 L'lik ölçek prosesinden HA öncesi, HA sonrasi ve TMAE sonrasi malzemenin bir SDS-PAGE jelini gösterir. Jel, Koloidal mavi ile boyanir. Orijinal elüsvon gradyani ile Q Sepharose HP anyon degisimi Kolon XK50/20 içinde Tampon A: 10 mM Tris, 3 mM CaCIz, 200 pM Iöpeptin, pH 8,0 içinde) ~3,0 mg/mL ortam olarak yüklenmistir Akis hizi: 18,0 mL/dakika Sekil 37, orijinal elüsyon gradyani ile Q Sepharose HP anyon degisiminden sonra bir kromatogrami gösterir. Arjinin 0,1 M ABCI ve ABCII içeren fraksiyonlara eklenir. Pik 1 fraksiyon (ABCII) 2,8 mg/mL'de ~45 mL verecek sekilde karistirilmis-hücre ile konsantre edilmis 0,55 mg/mL'de ~22O mL verecek sekilde havuzlanmistir. Pik 2 fraksiyon (ABCI, jelatinaz omuzu disinda) 2 mg/mL'de ~42 mL verecek sekilde karistirilmis-hücre ile konsantre edilmis 0,45 mg/mL'de ~190 mL verecek sekilde havuzlanmistir. Sekil 38, Pik 1 (ABCII) için Iöpeptin varliginda TMAE sonrasi malzeme çalismasinin Q Sepharose IEX kromatografisinin bir SDS-PAGE jelini gösterir. `Jel Koloidal mavi ile boyan ir. Sekil 39, Pik 2 (ABCI) için Iöpeptin varliginda TMAE sonrasi malzeme çalismasinin Q Sepharose lEX kromatografisinin bir SDS-PAGE jelini gösterir. Jel Koloidal mavi ile boyanir. Modifiye edilmis gradyan ile Q Sepharose HP anyon degisimi Tampon A'ya NaCl eklenmesi ve bir daha dik/hizlandirici gradyan kullanilan küçük ölçekte test. Örnek, öncede dondurulmus (-20°C), bir 1/3 5 L'lik prosesteri, TMAE sonrasindan, elde edilmistir. Kolon boyutu: 1 mL. Örnek: TMAE sonrasi, 10 mM Tris, 30 mM NaCI, 200 pM Iöpeptin, pH 8,0, içine diyaliz sonrasi 3 mg. 3 mg/mL ortamda yüklenir Sekil 40, modifiye edilmis elüsyon gradyani ile Q Sepharose HP anyon degisiminden sonra bir kromatogrami gösterir. ABCI'in ve ABCII'nin iyi ayrilmasi gözlemlenir. Gradyanin ikinci parçasi ABCI pikini sivriltmek için daha dik yapilabilir. Pikin iyilestirilmesi ayrica 5 mL CV kullanilarak da yapilabilir ve 3 ve 10 mg/mL ortamda yüklenebilir. ABCII'nin (lEX'ten Pik 1'in) Superdex 75 Jel Geçirqenlik kromatografisi Kolon XK50/60 içinde Örnek: 2,5 mg/mL'de (10 mM Tris, 3 mM CaCIz, ~60 mM NaCI, 0,1 M arjinin, pH 8,0, içinde) ~44 mL (%5 CV) Akis hizi: 8,8 mL/dakika Sekil 41, ABCII'nin (lEX'ten Pik 1'in) superdex 75 jel geçirgenlik kromatografisinden sonra bir kromatogrami gösterir. Pik, 1,2 mg/mL'de ~60 mL ABC lI verecek sekilde havuzlanmistir. Sekil 42, arjinin varliginda konsantre edilmis ABC II çalismasinin superdex 75 jel geçirgenlik kromatografisinin bir SDS-PAGE jelini gösterir. Jel, Koloidal mavi ile boyan ir. ABCI'in (IEX'ten Pik 2'nin) Superdex 75 Jel Geçirgenlik kromatografisi Kolon XK50/60 içinde arjinin, pH 8,0, içinde) ~42 mL (%5 CV) Akis hizi: 8,8 mL/dakika Sekil 43, ABCI'in (IEX'ten Pik 2'nin) superdex 75 jel geçirgenlik kromatografisinden sonra bir kromatogrami gösterir. Pik, 1,1 mg/mL'de ~60 mL ABC l verecek sekilde havuzlanmistir. Sekil 44, arjinin varliginda konsantre edilmis ABC I çalismasinin superdex 75 jel geçirgenlik kromatografisinin bir SDS-PAGE jelini gösterir. Jel, Koloidal mavi ile boyanir. Sekil 44b, bir 5 L'Iik saflastirma prosesi akis semasini gösterir. Yukarida tarif edilen saflastirma prosesinin diyaliz adimlari diyaliz kullanilarak uItrafiltrasyon/diyafiltrasyon (U F/DF) operasyonlari ile sübstitüe edilebilir ve karistirilmis hücreler TFF, tegetsel akisli filtrasyon, ile degistirilecektir. Yukarida tartisilan TMAE adimi opsiyoneldir. Bulus yukaridaki saflastirma prosesleri ile üretilen (veya üretilebilen) kollajenaz ürünlerini içerir. Bu tarz kollajenaz ürünleri olaganüstü yüksek derecelerde safliga ve muhafaza edilmis enzimatik aktiviteye sahiptir. Örnegin, bilesimler klostripainden yoksundur (örn., ihmal edilebilen veya saptanamayan klostripain düzeylerine sahiptir). Üretim Prosesinin Optimizasyonu: Klinik çalismalari desteklemek ve bir ticari-Ölçekte proses saglamak amaciyla, daha önceden gelistirilmis olan üretim prosesinin optimizasyonu tamamlanmistir. Proses degisimleri asagida kisaca tarif edilir ve Tablo 19'da genel hatlariyla özetlenir. Tablo 19: BTC (Proses 1) ve Auxilium Tedarikleri (Proses 2 ve 3) arasinda Proses Fermantasyon ve Primer Geri-Kazanim Degisimlerinin Özeti Hücre hatti Hücre hatti saklama Hücre bankasi ortami Tohum ortami Tohum ölçek- büyütme stratejisi Üretim ortami Üretim ortami sterilizasyonu 013 ve 004 Liyofilize edilmis kaynakli kaynakli 1 WCB viyali mL'Iik sise fermentör kaynakli Otoklavlanmis Dondurulmus sivi kültür olmayan kaynakli olmayan 2 WCB viyali balonlar-› 1x20 L'Iik fermentör kaynakli olmayan Sartoclear maxicap ve 0,2 um'lik Dondurulmus sivi kültür kaynakli olmayan Proteoz peptonu kaynakli) 1 WCB viyali -›3X25 mL -› 4x200 mL'Iik balonlar _› 1x20 L'Iik fermentör fermentör Proteoz peptonu kaynakli) sterilizasyonu Fermantasyon ve Primer Geri-Kazanim Üretim stratejisi Üretim ölçegi Hasat yöntem Amonyum Sülfat Presipitasyonu (AS Yeniden-süspanse edilmis AS ppt tampon degisimi Sicaklik kontrolü Saflastirma kromatografi/filtrasyon Yeni kromatografi pm'lik ve 1 um'lik filtre doygunluk Diyaliz filtreler Beslemeli- Millipore Millistak HC Koruyucu doygunluk Diyaliz 2-8°C'Iik çözeltiler Mustang Q Superdex 75 mikronluk filtrasyon Millipore Millistak HC Koruyucu filtre Fenil Sefaroz Sübstitüsyon kromatografi ortamlari kullanilarak proteinleri 2-8°C'Iik çözeltiler Mustang Q Hidroksiapatitin (HA'nin) ve Evre Proses 1 Fermantasyon ve Primer Geri-Kazanim HA ve O HP tampon eksi löpeptin sistemleri Sicaklik kontrolü Yok Tampon degisimi Q Diyaliz HP öncesi Tampon degisimi Q Diyaliz HP sonrasi Nihai formülasyona Diyaliz konsantre etme/diyafiltre etme 200 L'Iik NA fermantasyon için tüm adimlarin ölçegini- büyütme Formülasyon Etkin Madde'nin WFI seyreltik Formülasyonu (DS) ag/Laktoz içinde DS Fermantasyon Optimizasyonu 200 ;M löpeptin 2-8°C'Iik tamponlar ve dolgulari Diyaliz Diyaliz Diyaliz WFI seyreltik ag/Laktoz içinde DS eliminasyonu 200 pM 2-8°C'Iik tamponlar ve kolon dolgulari 4,5 kat mM Tris, 60 mM Sükroz, pH 8,0 içinde Orijinal hücre bankasindan ve fermantasyon prosesinden bovin-kaynakli ham malzemelerin çikarilmasi gerçeklestirilmistir. Clostridi'um histolyticum'un susu 004 ölçek-büyütme için gerekli olan geçis viabilitesine göre master hücre bankasi olarak kullanim için çogaltilmistir. Master hücre bankasi için Spesifikasyonlar ve analitik sonuçlar Tablo 20'de tutulur. Kollajenazin biyo-kütlesini ve üretimini arttirmak amaciyla, bir 20 Litrelik fermantasyon ölçeginde büyüme ortami içinde hayvansal-olmayan ham malzemelerden yararlanilan bir beslemeIi-seri fermantasyon stratejisi gelistirilmistir. 200 Litreye ilave fermantasyon ölçegi-büyütmenin tutarli hücre büyümesini, kollajenaz ekspresyonunu ve bir iyilestirilmis safsizlik profilini temin etmek için bir domuz-kaynakli ortam bileseni (yani, Proteoz Peptonu #3, infra) kullanimini gerektirdigi gözlemlenmistir. Müteakip degisimler üretim sonrasi prosese kiyasla kollajenazin verimini ve safligini arttirmak için yapilmistir. Bu degisimler yeni ayirma ve filtrasyon stratejilerinin eklenmesini ayni zamanda 20 Litrelik seri fermantasyon ölçegini desteklemek için üretim ekipmaninin ölçegini-büyütmeyi içerir. Sekil 45, proses 3 için fermantasyonun bir akis diyagramini gösterir. Tablo 20: Master Hücre Bankasi için Analitik Spesifikasyonlar ve Test Sonuçlari Test Spesifikasyon Sonuç Özdeslik Beklenen profil, %95 Beklenen profil, %99,9 lD Canli Sayim TB agari üzerinde 2 TB agari üzerinde 1x106 cfu/mL 1,3x107 cfu/mL Saflik Testi Herhangi bir ekstranöz Herhangi bir ekstranöz organizma organizma gözlemlenmedi gözlemlenmedi Koloni Morfolojisi Düzensiz sekil, 1-2 mm Düzensiz, düz yükselme, (37°C'de anaerobik) boyutunda, gri ila beyaz undulat marjinli 1-2 mm renkte çapinda (48 saat), gri, beyaz Gram Susu Gram pozitif çubuklar Gram pozitif çubuklar Fenol Kirmizisi Negatif Negatif Dekstroz fermantasyonu Hidrojen Sülfit Pozitif Pozitif Test Spesifikasyon Sonuç üretimi Jelatinaz Testi Pozitif Pozitif Spor Testi Negatif Tüm ortamlarda negatif Pisirilmis et Pozitif Pozitif ortaminda büyüme Tiyoglikolat Parmak-benzeri uzanti Parmak-benzeri uzanti olarak ortaminda büyüme olarak büyüme büyüme Motilite Testi (MIO Hareketsiz Hareketsiz ortami) Bakteriyofaj Saptanmadi Herhangi bir konfirme edilmis faj bulgusu yok Primer Geri-Kazanim ve Saflastirma Optimizasyonu Primer geri-kazanim ve üretim sonrasi saflastirma prosesini optimize etmek için ilave gelistirme yapilmaktadir. Amonyum sülfat presipitasyonunun kollajenazlari yakalamak için fenil sefaroz çabuk akisli düsük sub kolon kromatografisi ile sübstitüsyonu verimleri arttirmak, yigin alüminyum sülfat kullanimini elimine etmek ve aseptik prosesleri iyilestirmek için uygulanmaktadir. Saflastirma açisindan, Pall Mustang Q filtre verimleri ilaveten arttirmak ve üretim proses zincirini ve validasyon gerekliliklerini basitlestirmek amaciyla rezidüel DNA ve safsizlik klirensi için uygulanmaktadir. Kuaterner Amin Sefaroz Yüksek Performansli (Q HP) çalisma parametreleri Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) adimini elimine etmek için optimize edilmistir. Yukarida bahsedilen proses degisimlerine ek olarak, etkin madde formülasyonlari 10 mM Tris, 60 mM Sükroz, pH 8,0, içerecek sekilde modifiye edilmistir böylece hem ürün çözünürlügü hem de etkin madde ve ilaç ürünü kararliligi iyilestirilmistir. Optimizasyon prosesi iki evrede gerçeklesmistir. Ilk proses (Proses 2) 20 Litrelik ölçekte gerçeklestirilen beslemeIi-seri fermantasyon ile tüm hücre bankalama ve fermantasyon evreleri için bir hayvansal-olmayan ortamdan yararlanir. Üretim sonrasi proses rezidüel DNA'nin uzaklastirilmasi için Mustang Q filtrasyonunu ve ilave konak hücre kontaminant klirensi için Superdex 75 GPC'yi içerecek sekilde Proses 1'den uyarlanmistir. Löpeptin ayrica, proteolitik parçalanmayi önlemek için kromatografi tampon sistemlerine de eklenmistir. Proses 2 malzemesi ile Proses 1 malzemesi arasinda analitik olarak köprü kurulmustur (Tablo 21A) ve burada genel hatlariyla özetlenen bir yan yana preklinik çalismada test edilmistir. Proses 2 malzemesi Paz 3 klinik programin erken evresinde kullanim için Önerilmistir. Proses 2 ara-ürünleri ve etkin madde için spesifikasyonlar sirasiyla Tablo 22'de ve 23'te detaylandirilir. Ilave proses, formülasyon ve Iiyofilizasyon gelistirme bir Optimize edilmis üretim prosesi (Proses 3) saglamistir. Bu degisimler Tablo 19'da genel hatlariyla özetlendigi üzere yeni ayirma ve filtrasyon stratejilerinin eklenmesini ayni zamanda 200 Litrelik seri fermantasyonu desteklemek için üretim ekipmaninin ölçegini-büyütmeyi içerir. Sekil 46, proses 3 için saflastirmanin bir akis diyagramini gösterir. Doz deklarasyonu: Baslangiçtaki in vitro potens analizi bir bovin kollajenaz analizidir ve kollajenaz tipleri H ve Il'yi ayirt etmemistir. Bu analizden, tipik olarak 10.000 Birim olan bir potens ile sonuçlanan 0,58 mg'lik doz ile, yalnizca açik etiketli DUPY101 ve DUPY 202 klinik çalismalarina kullanilan malzeme için yararlanilmistir. Tip I kollajenaz ve tip lI kollajenaz için güncel ayri in vitro potens analizlerinden yararlanilan Proses 1 in vitro potens analizlerinden yararlanilan Proses 2 malzemesinin analizi tipik olarak Proses 1 malzemesine kiyasla benzer bagil potens degerlerinin elde edildigini konfirme etmistir. Proses 1 ve Proses 2 arasindaki analitik karsilastirilabilirligin qösterilmesi: Proses 1 ve Proses 2 arasindaki degisimleri desteklemek amaciyla, karsilastirilabilirlik verileri salim testleri ve analitik karakterizasyon formunda teslim edilmistir. Bu veriler Tablo 21'de Önceki prosesten (Proses 1; Referans) AUX-I ve AUX-II olarak tarif edilen ara-ürünlerin ve etkin maddenin burada açiklanan bir proses (Proses 2) ile karsilastirilmasi. Bu analitik karsilastirma Proses 2'den üretilen malzemenin Proses 1 ile yapilan ile karsilastirilabilir oldugunu gösterir (Tablo 21). Özel olarak, bu malzemeler arasindaki özdeslik, potens ve saflik karsilastirilabilirdir. Proses 2 ara-ürünlerinin saflik düzeyi Sekil 47'de, Coomasie ile boyanmis bir indirgenmis SDS-PAGE jelinde, gösterilir. Jel belirgin herhangi bir baska minör bant olmadan her bir ara-ürün için bir tek bant gösterir. AUX-l, 115 kDa olan bir görünür MW'ye sahip ve referans (ABC I) ile karsilastirilir iken. AUX-ll 110 kDa olan bir görünür MW'ye sahiptir ve referans (ABC Il) ile karsilastirilir. Sekil 48, etkin maddeyi gösteren Coomasie ile boyanmis bir indirgenmis SDS-PAGE jelini gösterir. Ara-ürünler ile oldugu gibi, Proses 2 ile üretilmis etkin madde referans (Proses 1) ile karsilastirilir. Bir gümüs ile boyanmis SDS-PAGE jeli, Proses 2 etkin maddesinin yüksek saflik düzeyini ilaveten dogrulayan Sekil 49'a gösterilir. Özet olarak, Proses 2 kullanilarak üretilen ara-ürünler (AUX-I ve AUX-II) ve etkin madde için salim testleri ve analitik karakterizasyon açik bir sekilde Proses 1 (Referans) malzemeleri ile karsilastirilabilirligi gösterir. Ek olarak, ilave salim testleri Proses 2 malzemesi üzerinde gerçeklestirilmistir ve Tablo 21B'de listelenir. Sonuç olarak, Proses 1 ve Proses 2 malzemeleri arasindaki dogrudan analitik karsilastirma (Tablo 21) ve ilave ara-ürün ve salim testleri (Tablo 22), Proses 2 malzemesinin beseri çalismalarda kullanim için uygun oldugunu gösterir. Tablolar 23 ve 24 ilaveten Proses 2 üretim prosesinden kaynaklanan analitik spesifikasyonlari listeler. Tablo 21: (Proses 1) ve Auxilium (Proses 2) ara-ürünleri ve Etkin Madde arasinda analitik karsilastirilabilirlik Ara-ürün Ara-ürün Etkin Test Etkin Madde Spesifikasyonu AUX-l AUX-Il Madde 100- 115 SDS-PAGE ile özdeslik Potens için Siçan Kuyruk Tendonu Kollajen Analizi kDa arasinda 107 - 110 kDa Referans'a Referans`a Referans'a Majör arasinda Majör uygundur uygundur uygundur Kollajenaz Kollajenaz (eke (eke (eke bandi; bandi; herhangi bakiniz) bakiniz) bakiniz) herhangi bir bir minör bant minör bant yok 2310 2866 Referans birim/mg Sinif Il Kollajenazlar için - Potens (AUX-II) Referans Proteinlerin Agilent 1100 HPLC S stem Bo ut dislama _ kromatografisi ile agregatlar saflik ve agregasyon) kullanilarak analizi Referans agregatlar Proteinlerin Agilent 1100 HPLC System (Ters fazli sivi kromatografi ile özdeslik ve saflik) kullanilarak Ara-ürün Etkin Etkin Madde Spesifikasyonu AUX-ll Madde 2018 * birim/mg birimlmg agregatlar agregatlar alan olarak 2 %99 ana pik; s agregatlar ürünler** 2 majör pik (AUX I & AUX II), süreleri referansin %5'i içindedir Ara-ürün Ara-ürün Etkin Test Etkin Madde Spesifikasyonu AUX-l AUX-ll Madde ABC-II; ABC-I; ara- * Referans .. .. digerleri digerleri Proteinlerin Agilent 1100 HPLC System (Anyon degisim < %1 < %1 < %1 alan olarak < %1 kromatografisi ile jelatinaz) kullanilarak analizi < %1 < %1 < %1 * Referans Triptik Sindirim ve Pik paterni Pik paterni Ters fazli HPLC ile Referans'a N/A Referans'a Referans'a uygundur Peptit Haritalama uygundur uygundur Referans'a N- & C-ucu __ _ _ Referans'a Gerekli ozdes Dizi ._ Referans'a uygundur dizileme ozdes Dizi degil *Proses 1 preliminer spesifikasyonlari burada dâhil edilmemistir **Bu testler Için Etkin Madde mevcut degildir, eldeki tedarik sinirlidir ancak N-ucunun bloke edildigi görüldügünden AUX-II için ilave gelistirme gereklidir. Tablo 22: Proses 2 ara-ürünleri ve Etkin Madde için analitik sonuçlar Test Ara-ürün Ara-ürün Etkin Madde .. Gerekli Gerekli Çozeltinin pH'i 6,8 Bradford Analizi ile Protein Gerekli 1,54 Konsantrasyonu degil mg/mL Absorbans Spektrofotometrisi 1,36 1,39 . . 1,41 mg/mL Gerekli Gerekli Referans'a benzer Rezidüel Konak Proteini degil degil bant paterni Gerekli Gerekli Rezidüel Konak DNA'si 2,9 ng/mL* Gerekli Gerekli Endotoksin _ _ 8,7 EU/mg Reziduel Lopeptin _ 1 < 1 pg/mL *Sonuç önceki rezidüel DNA yönteminin LOQ'sundadir. Tablo 23: Proses 2 AUX-I ve AUX-ll Ara-ürünleri için Analitik Spesifikasyonlar Spesifikasyon Berrak renksiz ve Berrak renksiz ve Görünüs partikülat maddeden partikülat maddeden yoksun yoksun *Endotoksin < 10 EU/mL < 10 EU/mL Kosullar, Coomasie ve gümüs arasinda majör bant arasinda majör bant ile boyanmis) ile özdeslik (ve ve herhangi bir minör ve herhangi bir minör saflik) bant yok bant yok * Absorbans Spektroskopisi ile 1,0 - 1,5 mg/mL 1,0 - 1,5 mg/mL Spesifikasyon Toplam Protein SRC analizi (AUX-I) 1900 - 3300 birim/mg Uygulanamaz GPA analizi (AUX-II) Uygulanamaz 4300 - 6400 birim/mg Proteinlerin Agilent 1100 HPLC System (Boyut dislama alan olarak 2 %99 ana alan olarak 2 %99 ana kromatografisi ile agregasyon) pik; s %1 agregatlar pik; s %1 agregatlar kullanilarak analizi * Proteinlerin Agilent 1100 HPLC System (Ters fazli sivi kromatografi ile saflik) kullanilarak analizi Proteinlerin Agilent 1100 HPLC System (Anyon degisim kromatografisi ile reziduel jelatinaz) kullanilarak analizi Proteinlerin Agilent 1100 HPLC System (Ters fazli sivi kromatografi ile rezidüel alan olarak < %1 alan olarak < %1 klostripain) kullanilarak Peptit Haritalama ile özdeslik Referans'a uygundur Referans'a uygundur Biyo-yük < 100 CFU/mL < 100 CFU/mL *Ilave üretim için ara-ürünlerin sartli salimi için gerekli olarak testler Tablo 24: Proses 2 Etkin Maddesi için Analitik Spesifikasyonlar Spesifikasyon Görünüs Berrak renksiz ve esasen partikülat Çözeltinin pH'sinin Potansiyometrik Ölçümü Endotoksin SDS-PAGE (Indirgenmis Kosullar, Coomasie ve gümüs saflik) Toplam Protein *SRC analizi (AUX-l) *GPA analizi (AUX- II) Rezidüel konak hücre proteini Rezidüel konak hücre DNA'si System (Boyut dislama kullanilarak analizi Spesifikasyon maddeden yoksun 6,0 ile 7,0 < 10 EU/mL 100- 115 kDa arasinda Majör 107 - 110 kDa arasinda Majör Kollajenaz; herhangi Kollajenaz; herhangi bir minör bant yok bir minör bant yok 1,1 - 1,5 mg/mL 1700 - 3500 birim/mg NA < 10 ppm < 10 pg/doz Alan olarak 2 %99 ana pik; S %1 agregatlar * Proteinlerin Agilent , alan olarak System (Ters fazli sivi kromatografi ile özdeslik ve saflik) kullanilarak analizi System (Ters fazli sivi kromatografi ile rezidüel klostripain) kullanilarak analizi birlestirilmis 2 %97; AUX-I'in ve AUX-ll'nin alikonma süreleri AA4500 referansinin %5'i içindedir alan olarak < %1 alan olarak < %1 Spesifikasyon System (Anyon degisim kromatografisi ile rezidüel jelatinaz) kullanilarak analizi Ters fazli kromatografisi ile .. .. alan olarak < %1 reziduel lopeptin *Biyo-yük < 1 CFU/mL * Ilave üretim için Etkin Madde'nin sartli salimi için gerekli olarak testler PROSES 3 IÇIN DETAYLI DENEYLER: PROSES 3 FERMANTASYONU: Proses 2 boyunca kullanilan Phytone peptonu kullanilan fermantasyon prosesi DSP gelistirilmesi ve GMP üretimi için her iki tedarik boyunca anlamli degiskenlik göstermistir. Önceki çalisma boyunca, bir hayvan kaynakli Proteoz Peptonu'nun C. histolyticum'un büyümesini çok iyi destekledigi gösterilmistir. Hayvan kaynakli Proteoz Peptonu kültürü Proses 2 sirasinda gözlemlenene kiyasla anlamli olarak daha az klostripain üretmistir ve bir 1:1'Iik oranda AUXI ve AUXII eksprese etmistir. Sonuç olarak, bir regülatör kabul edilebilir hayvan kaynakli pepton, Becton Dickinson'da Proteoz Peptonu #3 (PP3), 5 L'Iik fermentörlerde degerlendirilmistir. Var olan Phytone temelli proses (Proses 2) ile ilk karsilastirma, 50 g/L'de PP3 kullanmanin bir çabuk üssel büyüme hizi ile bir yüksek biyo-kütle konsantrasyonu ürettigini göstermistir. Fermantasyon (yari kantitatif SDS- PAGE analizi ile) Proses 2'den ~230 mg/L'nin aksine 350 mg/L toplam kollajenaz olan bir daha yüksek ürün verimi ile sonuçlanmistir. PPS kullanilan ilave fermantasyonlar hayvan kaynakli fermantasyon ortami kullanilarak anlamli olarak daha az klostripainin üretildigini göstermistir. (PP3'ün bir serisi kullanilan) ilk üç fermantasyon çok tutarli büyüme profilleri göstermistir. Ürün SDS-PAGE ile analiz edildiginde, kollajenazin veriminin ve safliginin üç fermantasyon arasinda çok yeniden-üretilebilir oldugu bulunmustur. Proses gelistirme için malzeme ile DSP tedarik etmek amaciyla, bir kaç fermantasyon PP3 kullanilarak gerçeklestirilmistir. Bu tedarik malzemesi için, PP3'ün üç farkli serisi kullanilmistir. Bu serilerin ikisi kullanildiginda, kültivasyonlarin büyüme profillerinin önceki PP3 fermantasyonlari ile tutarli olmadigi ve fermantasyonlar arasinda büyüme profilinde degiskenlik gösterdigi bildirilmistir. Bir küçük ölçekte arastirma, PP3'teki seriden seriye degiskenligin bu varyasyona neden oldugunu göstermistir. Küçük ölçekte çalisma ayrica, PP3 konsantrasyonunda 100 gFL'ye bir artisin bu varyasyonu önleyecegini de göstermistir. Iki 5 L'Iik fermantasyon peptonun seri serisi kullanilarak 100 g/L PP3 ile gerçeklestirilmistir, (küçük ölçekli deney sirasinda gösterildigi üzere) bunlarin biri tipik büyüme profili ile sonuçlanmistir ve biri böyle sonuçlanmamistir. Deney, konsantrasyondaki artisin PP3'ün farkli serileri ile iki fermantasyonun yeniden- üretilebilir oldugunu garantiledigini göstermistir. Büyüme profilleri hayli benzerdir ve ürün bir benzer verimde ve saflikta eksprese edilmistir. 100 g/L PP3'ten yararlanilan optimize edilmis fermantasyon prosesi son olarak 200 L'ye ölçeklendirilmistir. 200 L'Iik büyüme profili, 5 L'Iik ölçekte görülene çok benzerdir. Fermantasyon filtratinin SDS-PAGE analizi 200 L'Iik fermantasyondan bir yüksek verim, (kantitatif dansitometri analizi ile) ~320 mg/L toplam kollajenaz, göstermistir. (Fermantasyon sonrasi) kollajenaz ürününün safligi hem 5 L'Iik hem de 200 L'Iik ölçekte benzerdir. 200 L'Iik fermantasyon filtratinin 20 L'si üretim sonrasi proses (infra) için bir kismi ölçek-büyütmeyi temsil etmesi için DSP grubu tarafindan islenmistir. Proteoz Peptonu #3 fermantasyon prosesi (Proses 3) var olan Phytone prosesine kiyasla bir daha yüksek verim ile ve daha az klostripain ile kollajenaz üretmistir. 100 g/L'de, PP3'ün, PP3'ün çesitli serilerinin kullanilmasina ragmen yeniden-üretilebilen büyüme egrileri ile C. histo/yticum kültivasyonlari sagladigi gösterilmistir. Kollajenazin hem veriminin hem de safliginin ayrica PP3'ün çesitli Iotlari kullanildiginda da yeniden- üretilebilir oldugu gösterilmistir. Clostridium histolyticum'dan kollajenazin üretimi için bir ham malzeme olarak Proteoz Peptonu #3'ün degerlendirilmesi. Bir kompleks nitrojen kaynagi olarak Phytone peptonundan yararlanilan fermantasyonlarda gözlemlenen degiskenlikten dolayi, Proteoz Peptonu #3'ün (Becton g/L PP3 ile bir basit seri stratejisi kullanilmistir. Tam ortam bilesimi malzemeler ve yöntemler bölümünde bulunabilir. Sekil 51, 50 g/L PP3 fermantasyonun (Proses 2'deki Phytone konsantrasyonuna kiyasla bir daha düsük konsantrasyon) büyüme egrisini Phytone beslemeIi-seri fermantasyon ile karsilastirir. PP3 kültivasyonu inokülasyondan yaklasik olarak 8 saat sonra duragan faza girmeden önce üssel büyüme sirasinda bir çok çabuk spesifik büyüme hizi gösterir. PP3 fermantasyonu 4,7 birim olan bir maksimum optik yogunluga (600 nm) ulasmistir. Kültür ürün olusumunu/parçalanmasini izlemek için duragan fazda bir ilave 12 saat boyunca birakilmistir. Sekil 52, PP3 kültivasyonunun 20 saatlik noktasindan elde edilen kollajenaz ürünlerinin konsantrasyonunun SDS-PAGE yari-kantitatif analizini gösterir. Sekil 53, Phytone beslemeIi-seri prosesi için ayni analizi gösterir. PP3 fermantasyonunun Phytone temelli prosese kiyasla daha çok ürün ürettigi (Sekiller 52'deki ve 53'yeki yari-kantitatif analize göre, 230 mg/L'den 360 mg/L'ye bir toplam kollajenaz artisi) gözlemlenebilir. PP3 kültürü ayrica, bir 1:1'Iik oranda AUXI ve AUXII de eksprese ederken, Proses 2 iki proteini bir 1:1,6'Iik oranda üretmistir. Proteoz Peptonu #3 seri fermantasyonunun yeniden-üretilebilirligi. PP3 seri prosesinin yeniden-üretilebilirligi ilaveten Proteoz Peptonu #3'ün # 5354796 elde edilen yaklasik olarak 4,5 olan bir maksimal optik yogunluk (600 nm) ile tutarli büyüme profilleri gösterir. Fermantasyonun hasat noktalarinin yari-kantitatif SDS-PAGE analizi, toplam kollajenazin veriminin ~350 - 400 mg/L oldugunu göstermistir. Fermantasyonun hasat noktasi ayrica bu çalisma sirasinda da degerlendirilmistir. edilen) PP3 fermantasyonu GCFT05d'nin zaman seyrinin SDS-PAGE analizini gösterir. Sekil 55'te gösterilen jel koloidal mavi ile boyanmistir ve Sekil 56'da jel gümüs ile boyanmistir. Bir üçüncü daha yüksek moleküler agirlik bandi Sekiller 55'teki ve 56'daki jellerde iki kollajenaz bandinin üstünde gözlemlenebilir. Bu bandin literatürde bildirilen bir AUXI öncül proteinine karsilik geldigi düsünülür. Öncül bant üssel büyüme fazi sirasinda bulunur. Üssel büyümenin sonunda, öncül bantlarin yogunlugun azalir ve bunlar 11 saat sonra (GCFT05d'de) bulunmaz. Ana daha düsük moleküler agirlik görülebilir. Bu kontaminantlarin bir düsük düzeyde bulundugu ve yalnizca gümüs ile boyanmis jelde saptandigi bildirilmelidir. Fermantasyon için optimal hasat noktasinin gelistirmenin bu evresinde ~11 saat oldugu belirlenmistir. Sekil 57, bir standart Phytone beslemeli-seri fermantasyonunun zaman seyrinden elde edilen örneklerin SDS-PAGE analizini gösterir. Bir 40 kDa'Iik kontaminant Sekil 57'deki jelde gözlemlenebilir. Phytone beslemeIi-seri prosesinden bu 40 kDa'Iik kontaminant bant klostripain proteazi olarak tanimlanmistir. Sekil 55'teki ve 57'deki jelleri karsilastirma ile, PP3 fermantasyon prosesi kullanilarak üretilen klostripainin miktarinin Phytone temelli fermantasyona kiyasla anlamli olarak daha düsük oldugunu belirlemek mümkündür. Üretim Sonrasi Proses Gelistirme için tedarik malzemesinin üretilmesi. Üretim sonrasi proses (DSP) gelistirmeyi desteklemek için, 50 g/L PP3 kullanilan bir kaç fermantasyon gerçeklestirilmistir. Bu fermantasyonlar sirasinda, PP3'ün iki farkli fermantasyona (GCFTOSd) kiyasla bu fermantasyonlarin (karo seklinde gösterilen) büyüme egrilerini gösterir. PP3'ün yeni serileri ile fermantasyonlar hayli degiskenlik gösteren büyüme profilleri gösterir. Kültürlerin baslangiçtaki büyüme hizlarinin hepsinin çok benzer olmasina ragmen, bunlarin duragan faza girdigi nokta ve bundan dolayi maksimum biyo-kütle konsantrasyonlari kayda deger ölçüde farklilik gösterir. Inokülüm inokülümlerden çok az varyasyon (5 mL'Iik evrede ODsoo, 2,9 - 3,6 birim, 200 mL'Iik evrede ODeoo; 4,5 - 5,9 birim) göstermistir ve herhangi bir azalma göstermemistir. Varyasyon ve azaltilmis optik yogunluk (600 nm) yalnizca kendisini kültivasyonun nihai (fermantasyon) evresinde göstermistir. Bu, varyasyonun nedeninin PP3'teki bir besleyici madde sinirlamasi oldugunu ve sinirlayici besin maddesinin miktarinin PP3'ün serileri arasinda degiskenlik gösterdigini öne sürer. Bu fermantasyonlarin DSP gelistirme ve üretilen kollajenazin miktarinda bir büyük varyasyonun olmadigini (yari-kantitatif SDS-PAGE analizine göre 350 - 400 mg/L toplam kollajenaz. veriler gösterilmemistir) gösteren SDS-PAGE analizi için basarili bir sekilde kullanilmis olmasina ragmen, varyasyonun nedenini arastirmanin hâlâ kritik olduguna karar vermistir. Büyüme profilindeki varyasyon fermantasyonun bir hasat noktasini tahmin etmeyi çok zor hâle getirecektir. Burada ayrica, besleyici madde sinirlamasinin Phytone beslemeli-seri prosesi ile görüldügü üzere baska proteazlarin ve spesifik olarak klostripain proteazinin ekspresyonunu indükleyebilecegine yönelik endiseler de vardir. Proteoz Peptonu #3'ün serileri arasindaki varyasyonu arastirma. PP3 ile ilk çalisma bir daha yüksek ürün verimi ve klostripain proteazinin daha düsük düzeyleri ile bir hayli güçlü proses göstermistir. PP3'ün yeni serileri kullanildiginda, prosesin güçlülügünün hayli degisken büyüme profilleri ile anlamli bir sekilde azaldigi gözlemlenmistir. Bir çalkalama balonu deneyi simdiye kadar kullanilan PP3'ün üç gerçeklestirilmistir. Deney 5 L'Iik prosesteri iki evreli inokülüm prosesini tekrarlamistir ancak nihai fermantasyon fazini bir baska 200 mL'Iik kültür ile degistirmistir. Varyasyon yalnizca önceki deneylerde prosesin nihai fermantasyon evresinde gözlemlendiginde, bu üçüncü evreye sahip olmak kritiktir. Kültürlerin optik yogunluklari (600 nm) her bir transfer evresinde ölçülmüstür ve kültürler sonraki evreyi inoküle etmek için kullanilmistir. Ortamlar 50 g/L'de PP3'ün üç serisi kullanilarak hazirlanmistir. 5 L'Iik deneyler sirasinda (#5332398 Iotu) C. histo/yti'cum'un daha düsük biyo-kütle konsantrasyonlari ile sonuçlanmis olan iki seriden biri 100 g/L'de de hazirlanmistir. lotlarinin üçüncü evrede yaklasik olarak 2,5 birim olan azaltilmis optik yogunluklar (600 nm) gösterdigi gözlemlenebilir, bunlar PP3'ün "kötü" serileri olarak addedilmistir. idame ettirir, bu PP3'ün bir "iyi" serisi olarak addedilmistir. Ilginç bir sekilde, PP3'ün bir yogunluk (600 nm) kültivasyonun ikinci ve üçüncü evresinde basarilmistir. Bu veriler büyüme profillerindeki sapmalarin PP3'ün serileri arasinda bir sinirlayici besin maddesinin miktarindaki varyasyondan kaynaklandigina yönelik teoriyi destekler. PP3'ün serilerinin analitik testleri ile bu besin maddesini tanimlamak mümkün degildir. L'Iik fermantasyonda 100 glL'de Proteoz Peptonu #3'ün degerlendirilmesi Küçük ölçekli çalismanin sonuçlari, PP3'ün konsantrasyonunu 50'den 100 g/L'ye arttirmanin seriden seriye degiskenlik sorununu ortadan kaldirdigini göstermistir. Bu proses degisimi, PP3 degiskenligini küçük ölçekte arastirma sirasinda belirlendigi L'lik ölçekte test edilmistir. Sekil 60, iki fermantasyonun büyüme profillerini gösterir. Iki kültür üssel faz sirasinda özdes spesifik büyüme hizlari gösterir. Fermantasyon duragan faza girer ve yaklasik olarak 6,5 birim olan çok benzer maksimal optik yogunluklara (600 nm) ulasir. Bu veriler, PP3'ün konsantrasyonu arttirmanin PP3'ün seriden seriye degiskenlik sorununu hafiflettigini gösterir. Fermantasyonda saglanan daha yüksek biyo-kütle konsantrasyonundan ve daha uzun üssel fazdan dolayi, hasat Sekiller 61 ve 62, 100 g/L PP3'ten yararlanilan iki fermantasyonun SDS-PAGE analizini gösterir. Jeller, her iki fermantasyonda da kollajenazin tutarli ekspresyonunu gösterir. PBFT70d'nIn 40 kDa'Iik bandin (klostripainin) hafif bir derecede daha fazlasini içerdiginin görülmesine ragmen, her iki fermantasyondan elde edilen örneklerin Sekil 56'da tarif edilen kontaminantin benzer düzeylerini içerdigi görülür. Bu küçük farkliliklarin boyama veya yükleme farkliliklarindan kaynaklanmasi mümkündür. Yine PPS prosesi kullanilarak üretilen klostripainin miktari Phytone prosesine kiyasla anlamli olarak daha düsüktür. Öncül bandin fermantasyonun zaman seyrinde daha uzun süre devamlilik gösterdigi görülür. 100 g/L'de yapilan gelecekteki fermantasyonlarin bir 14 saatlik hasada uzatilmasi gerektigi tavsiye edilmistir. Öncül bandin varligi proses validasyonu sirasinda hasat noktasi taniminin ve bunun kalifikasyonunun önemini vurgular. Sekil 63, Sekil 61'deki jelin dansitometri analizinden elde edilen verileri gösterir. Çizelge ürün ve öncül olusumunu (dansitometri pik alanini) hücre büyümesi (ODGOO nm) ile karsilastirir. Ürün olusumunun hücre büyümesi ile tutarli oldugu görülür ve kültivasyon duragan faza girdikçe üretim hizi düser. Öncül bandin yogunlugu üssel büyüme bittiginden azalir ancak bu bant fermantasyonun hasat noktasinda hâlâ vardir. 100 glL Proteoz Peptonu #3 fermantasyonunun 200 L'ye ölçegini-büyütme. PP3 konsantrasyonunda 100 g/L'ye artisi takiben, proses 200 L'ye ölçeklendirilmistir. 200 L'lik kanal için inokülümün gerekli olan miktarini üretmek amaciyla, bir üçüncü inokülüm evresi bir 15 L'lik çalisma hacmi olan fermentör kullanilarak uygulanmistir. 3 x 200 mL'Iik kültürler 10 L'lik fermentörü inoküle etmek için kullanilmistir ve 12 saatlik karsilastirir. Tavsiye edildigi üzere, büyüme profilleri öncül bandinin isleme baslamadan önce tamamen kaybolmasini garanti etmek için 14 saate uzatilmistir. 200 L'lik fermantasyonun büyüme profili 5 L'lik ölçekteki fermantasyona çok benzerdir bu kültivasyonun basarili ölçek-büyütmesini gösterir. Sekil 65, 200 L'lik fermantasyonun zaman seyrinin SDS-PAGE analizini gösterir. Jel, fermantasyonun seyri boyunca ürün olusumunu gösterir. 14 saatlik hasat noktasinda malzeme herhangi bir saptanabilen öncül içermez ve kontaminantlarin çok düsük düzeylerini içerir. 200 L'lik fermantasyondan üretilen ürünün 5 L'lik prosesten üretilene çok benzer oldugu görülür, bu 200 L'lik prosesin arttirilmis üretim sayisinin bir zararli etkiye sahip olmadigini gösterir. Sekil 66, Sekil 64'teki jelin dansitometri analizinden elde edilen verileri gösterir. Çizelge ürün ve öncül olusumunu (dansitometri pik alanini) hücre büyümesi (ODGOO) ile karsilastirir. Ürün olusumunun hücre büyümesi ile tutarli oldugu görülür ve kültivasyon duragan faza girdikçe üretim hizi düser. Öncül bandin yogunlugu üssel büyüme bittikçe azalir. Öncül bandin yogunlugu 5 L'lik kültivasyona, PBFT7OC, kiyasla 200 L'lik fermantasyonda daha çabuk bir sekilde azalir (Sekil 63). Sekil 67, 200 L'lik fermantasyon zaman seyrinde bir %4-12'Iik Bis-Tris jeli kullanilan SDS-PAGE analizini gösterir. Saptanan kontaminantlarin yaklasik moleküler agirliklari jel üzerinde açiklanir. Proses 2 için gelistirilmis hasat prosesi (filtrasyon ile berraklastirma) 200 L'lik ölçek büyütme fermantasyonu sirasinda degerlendirilmistir. Hücre kültürü filtre zincirinin herhangi bir blokaji olmadan var olan proses kullanilarak basarili bir sekilde berraklastirilmistir. Hasat prosesi malzemeler ve yöntemler bölümünde tarif edilir. 200 L'lik fermantasyondan elde edilen filtratin 20 L'si üretim sonrasi Proses 3'ün (infra) bir kismi ölçek-büyütmesini göstermek için DSP ile islenmistir. Dansitometri analizi ile ürün veriminin kantifikasyonu Bir daha dogru ve kantifiye edilebilen yöntem, yari-kantitatif SDS-PAGE analizine kiyasla üretim öncesi proses adimi sirasinda ürün konsantrasyonunu belirlemek için gerekli olmustur (Sekiller 62 ve 63). Fermantasyon filtrati standart protein kantifikasyon tekniklerini, örnegin, UV'yi ve Bradford analizini, kullanilamaz yapan büyüme ortamindan pigmentin ve peptitlerin bir yüksek miktarina sahiptir. Önceden gerçeklestirilen yari-kantitatif analiz Coomassie ile boyanmis jellerin dansitometri analizini gerçeklestirme ile modifiye edilmistir ve güncellenmistir. Yöntem karistirilmis AUXI ve AUXII referans malzemesinin miktarlarinin bir araligini (0,2- 1,2 pg/serit ) ve kantifiye edilecek olan örnegin seyreltmelerini bir Tris Glisin jeli üzerine yüklemeyi içermistir. Taranmis görüntü akabinde analiz edilmistir ve standartlar ve örnekler için pik alani tahmin edilmistir. Akabinde bir standart egri yapilmistir (toplam kollajenaz) ve örnek seyreltmeleri içinde toplam kollajenazin miktarini kantifiye etmek için kullanilmistir. Sekil 68, bir kollajenaz standart egrisinin bir örnegini gösterir ve örneklerin beklenen araligi içinde kantifikasyon yönteminin Iineerligini vurgular. Tris Glisin jelleri AUXI'i ve AUXII'yi tamamen çözmemistir bundan dolayi iki proteini ayri ayri kantifiye etmeye tesebbüs etmekten ziyade toplam kollajenaz kantifiye edilmistir. Kollajenazlarin miktari PBFT7ÜC, PBFT70d ve 200 L'lik ölçek-büyütme fermantasyonlari için analiz edilmistir. Miktarin üç fermantasyonun tümü için ~280 - 350 mg/L toplam kollajenaz oldugu bulunmustur. Malzemeler ve Yöntemler Ortam Preparasyonu: 1 L'lik ortam preparasyonu Inokülüm preparasyonu için fosfatlar (Tablo 25) 121°C'de 20 dakika boyunca bir 1 L'lik sisede otoklavlanmistir. Yigin ortam (Tablo 26), 121°C'de 20 dakika boyunca bir 1 L'lik siseyi otoklavlamadan önce Bilesenleri tam olarak çözmek için ilk olarak bir mikro- filtre vasitasiyla bir 250 mL'Iik steril siseye filtrelenmistir. 300 mL otoklavlanmis fosfat, 600 mL otoklavlanmis yigin ortam ve 100 mL steril filtrelenmis PSA 1, 30 mL'lik gama irradyasyona ugratilmis universaller ( ve 500 mL'Iik Erlenmeyer balonlara ( alikuotlanmadan önce havuzlanmistir. Tablo 25: Inokülüm preparasyonu için fosfat bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar KH2PO4 1.929 K2HPO4 1.259 Na2HPO4 3.59 Deiyonize Edilmis Su 300 mL'ye kadar Tablo 26: Bulk Inokülüm preparasyonu için yigin ortam bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar Proteoz peptonu # 3 50 9 veya 100 g * Maya ekstrakti 8,5 9 Deiyonize Edilmis Su 600 mL'ye kadar *Ortam reçetesi 50 ve 100 g/L'de PP3 içerir.Tablo 27: Inokülüm preparasyonu için PSA 1 Magnezyum/Glikoz bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar Glikoz 5 g Vitamin çözeltisi 10 mL Deiyonize Edilmis Su 100 mL'ye kadar Tablo 28: Inokülüm preparasyonu için vitamin çözeltisi Bilesen Gerekli Olan Miktar FeSO4 x 7H20 1.2g Riboflavin 50mg Niasin 100mg Kalsiyum Pantotenat 100mg Pimelik asit 100mg Piridoksin 100mg Tiyamin 100mg Deiyonize Edilmis Su 1 litreye kadar L'Iik ortam preparasvonu L'Iik ölçek için fosfat çözeltisi (Tablo 29) 121°C'de 20 dakika boyunca bir 1 L'Iik sise içinde otoklavlanmistir. Yigin ortam (Tablo 30) 5 L'Iik kanala dogrudan eklenmistir ve bir 0,2 pm'lik mL'Iik fosfat çözeltisi ve 200 mL'Iik PSA 1, kanalin otoklavlanmasinin ve sogutulmasinin tamamlanmasi üzerine 5 L'Iik kanala ayri ayri pompalanmistir.Tablo 29: 5 L'Iik fermantasyon için fosfat bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar KH2P04 9.229 K2HPO4 69 NazHPO4 16.59 Deiyonize Edilmis Su 250 mL'ye kadar/278,35 9 Tablo 30: 5 L'Iik fermantasyon için yigin ortam bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar Bilesen Gerekli Olan Miktar Proteoz peptonu #3 240 9 veya 480 g * Bacto Maya ekstrakti 40,8 9 Deiyonize Edilmis Su 4,35 L'ye kadar *Ortam reçetesi 50 ve 100 g/L'de PPS içerir. Tablo 31: 5 L'Iik fermantasyon için PSA 1 Magnezyum/Glikoz bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar MgSO4x7H20 0.38g Glikoz 24g Vitamin çözeltisi 48mL Deiyonize Edilmis Su 200 mL'ye kadar/200 9 Tablo 32: 5 L'Iik fermantasyon için vitamin çözeltisi Bilesen Gerekli Olan Miktar FeSO4 x 7H20 1.29 Riboflavin 50mg Niasin 100mg Kalsiyum Pantotenat 100mg Pimelik asit 100mg Piridoksin 100mg Tiyamin 100mg Deiyonize Edilmis Su 1 litreye kadar 15L'Iik ortam preparasyonu L'lik siseye filtrelenmistir. Yigin ortam (Tablo 34) kanalin Steam-In-Place (SIP) sterilizasyonundan önce 20 L'Iik kanala dogrudan eklenmistir. PSA 1 (Tablo 35) bir 0,2 pm'lik Sartopore 2 300 cm2 filtre vasitasiyla bir steril 1 L'Iik siseye filtrelenmistir. 750 mL'lik fosfatlar ve 600 mL'lik PSA 1, kanalin SIP'inin ve sogutulmasinin tamamlanmasi üzerinde 20 L'Iik kanala ayri ayri pompalanmistir. Tablo 33: 15 L'Iik fermantasyon için fosfat bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar KH2PO4 27.669 K2HPO4 18g NazHPO4 50.49 Deiyonize Edilmis Su 750 mL'ye kadar/835,05 9 Tablo 34: 15 L'Iik fermantasyon için yigin ortam bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar Proteoz peptonu #3 1,44 kg Bacto Maya ekstrakti 122,4 9 Deiyonize Edilmis Su 13,05 L'ye kadar Tablo 35: 15 L'Iik fermantasyon için PSA 1 Magnezyum/Glikoz bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar MgSO4x7HsO 1,14 9 Glikoz 72 g Vitaminler çözeltisi 144 mL Bilesen Gerekli Olan Miktar FeSO4 x 7H20 1.2g Riboflavin 50mg Bilesen Gerekli Olan Miktar Niasin 100mg Kalsiyum Pantotenat 100mg Pimelik asit 100mg Piridoksin 100mg Tiyamin 100mg Deiyonize Edilmis Su 1 litreye kadar 200L'Iik ortam preparasyonu Fosfat çözeltisi (Tablo 37) bir 0,2 pm'lik Sartopore 2 300 cm2 filtre vasitasiyla bir Gammasart Biosystem SA10 10L torbasina filtrelenmistir. Yigin ortamlar (Tablo 38) kanalin SIP sterilizasyonundan önce 200 L'Iik kanala dogrudan eklenmistir. PSA 1 çözeltisi (Tablo 39) bir 0,2 pm'lik 300 cm2 filtre vasitasiyla bir Gammasart Biosystem SA10 10L torbasina filtrelenmistir. 10 L'Iik fosfatlar ve 8 L`Iik PSA 1, kanalin SIP'inin ve sogutulmasinin tamamlanmasi üzerine 200 L'Iik kanala ayri ayri pompalanmistir. Tablo 37: 200 L'Iik fermantasyon için fosfat bilesimi Bilesen 4 x Fermentör KH2P04 368.89 K2HPO4 2409 Deiyonize Edilmis Su 10 L'ye kadar/11,134 kg Tablo 38: 200 L'Iik fermantasyon için yigin ortam bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar Proteoz peptonu #3 19,2 kg Bacto Maya ekstrakti 1,632 kg Bilesen Gerekli Olan Miktar Deiyonize Edilmis Su 174 L'ye kadar Tablo 39: 200 L'Iik fermantasyon için PSA 1 Magnezyum/Glikoz bilesimi Bilesen Gerekli Olan Miktar MgSO4x7H20 15.29 Glikoz 9609 Vitaminler çözeltisi 1.92L Deiyonize Edilmis Su 8 L'ye kadar/Sk 9 Tablo 40: 200 L'Iik fermantasyon için Vitamin çözeltisi Bilesen Gerekli Olan Miktar FeSO4 x 7H20 2.4g Riboflavin 100mg Niasin 200mg Kalsiyum Pantotenat 200mg Pimelik asit 200mg Piridoksin 200mg Tiyamin 200mg Deiyonize Edilmis Su 2 L'ye kadar/2 kg Fermantasyon Sekil 69, 5 ve 200 L'Iik ölçekte Phytone ve PP3 fermantasyon prosesleri için proses akislarinin genel özetlerini gösterir. L'Iik ölçekte fermantasyon gama irradyasyona ugratilmis universallerde 8 x 5 mL'Iik inokülüm ortamlarini inoküle etmek için kullanilmistir. 5 mL'Iik kültürler 3 anaerobik gaz paketi varliginda bir anaerobik kavanoz içinde 37°C'de inkübe edilmistir. Yaklasik olarak 12 saatlik Erlenmeter balonlar içinde 2x200 mL inokülüm ortamlarini inoküle etmek için kullanilmistir. Iki balon birlikte 3 gaz paketi içeren bir anaerobik kavanoz içine yerlestirilmistir ve bir çalkalama inkübatöründe (70 rpm'de) 12 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmistir. 12 saatlik inkübasyondan sonra (ODSOO 6,0-7,0) her bir 200 mL'Iik inokülüm bir 5 L'Iik kanali inoküle etmek için kullanilmistir. /7 L'Iik kanalli FT Applikon kanallarinin çalisma hacmi, bunlarin (hacim/hacim) ayarlanmistir. pH, d02 ve sicaklik sirasiyla 7,00 birimde, %O'Iik duygunlukta ve 37°C'de kontrol edilmistir. pH, HCI (5 M) veya NaOH (5 M) eklemeleri ile kontrol edilmistir. d02 konsantrasyonu 1 L/dakika olan bir akis hizi ile, sürekli nitrojen dagitma ile %O'da idame ettirilmistir. Örnekler fermantasyon sirasinda alinmistir ve analitik amaçlar için - °C'de saklanmadan önce 0,2 um'lik filtreler yoluyla filtreden geçirilmistir. Fermantasyonlar 6,0-7,0 olan bir ODGOO'de duragan faza girmeye baslamistir. 12 saat sonra, fermentör hasat geri-kazanimi baslamadan önce 10-20°C'ye sogutulmustur. buzu çözülmüstür ve 50 uL'Iik alikuotlar 30 mL'Iik gama irradyasyona ugratilmis universallerde 8 x 5 mL'Iik inokülüm ortamlarini inoküle etmek için kullanilmistir. 5 mL'Iik kültürler 3 anaerobik gaz paketi varliginda bir anaerobik kavanoz içinde 37°C'de inkübe edilmistir. Yaklasik olarak 12 saatlik Erlenmeter balonlar içinde 4x200 mL inokülüm ortamlarini inoküle etmek için kullanilmistir. Iki balon birlikte 3 gaz paketi içeren bir anaerobik kavanoz içine yerlestirilmistir ve bir çalkalama inkübatöründe (70 rpm'de) 12 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmistir. 12 saatlik inkübasyondan sonra (OD600 6,0-7,0), dört balonun üçü birlikte havuzlanmistir ve 20 L'Iik kanali inoküle etmek için kullanilmistir. L'Iik kanallarin çalisma hacmi, bunlarin (hacim/hacim) %4'ünün 200 mL'Iik evreden inokülüm oldugu 15 L'dir. Ajitasyon hizi 100 rpm'ye ayarlanmistir. pH. d02 ve sicaklik sirasiyla veya NaOH (5 M) eklemeleri ile kontrol edilmistir. d02 konsantrasyonu 20 L/dakika olan bir akis hizi ile, sürekli üst-katman nitrojen dagitma ile %O'da idame ettirilmistir. kanali inoküle etmek için kullanilmistir. Çalisma kosullari 20 L'lik ölçege özdestir. Hasatta nihai optik yogunluk (600 nm) 6,0-7,0'dir. 14 saat sonra, fermentör hasat geri- kazanimi baslamadan önce 10-20°C'ye sogutulmustur. L'lik Hasat L'lik kültürler 5 L/sa olan bir akis hizi ile bir Millistak + 10" Opticap derin filtre 250 mL'Iik biyo-kaplara pompalanmistir. islenmis malzeme ya -20°C'de saklanmistir ya da DSP ile islenmeden önce 4°C'de gece boyu saklanmistir. 200 L'lik Hasat 200 L'lik hasat bir filtrasyon hasat zinciri kullanilarak gerçeklestirilmistir. Kültür, 200 L/sa olan bir akis hizi ile tek kullanimlik derin filtre akabinde iki 0,2 um'lik Express Opticap XL 10 filtre, 2x0,49 m2 (Millipore, KHGES10TT1) vasitasiyla pompalanmistir. Primer berraklastirma için proses süresi 1 saattir. Filtrelerde tutulan rezidüel ürünü geri almak için hasadin sonunda bir ilave 10 dk izin verilmistir. Berraklastirilmis süpernatant kaydedilen filtrat agirligi ile bir 200 L'lik Stedim Palletank içine toplanmistir. Filtratin 20 L'si ~6 L/dakika olan bir akis hizi ile bir Mustang Q yüksek afiniteli DNA kolonundan geçirilmistir ve 4°C'de gece boyu saklanmadan önce, iki steril 20 L'lik stedim torba içine toplanmistir. Analiz Optik Yogunluk ölçümleri Spektrofotometre 600 nm dalga boyunda PBS kullanilarak körlestirilmistir. Fermantasyon örnekleri PBS kullanilarak (hücre yogunluguna bagli olarak) 10, 20 veya 100 katsayilari ile seyreltilmistir. Her bir seyreltilmis örnegin 1 mL'si bir 1 mL'Iik küvete transfere edilmistir; üstü sizdirmaz hâle getirilmistir ve 600 nm'Iik dalga boyunda üç kopya hâlinde optik yogunluk okumalarini kaydetmeden önce 5 kere ters çevrilmistir. Tris-Glisin Jelleri Fermantasyon örnekleri bunlari SDS-PAGE analizi için hazirlamadan önce 0,2 um'lik filtreler vasitasiyla filtreden geçirilmistir. 10 pl örnek tamponuna (2x), 2,5 pl indirgeme ajanina (10x) ve 2 ul ul filtrelenmis örnek eklenmistir. Yüksek moleküler agirlik (HMW) belirteci 80 pl indirgeme ajanina (10x), 10 ul konsantre edilmis stok ekleme ile hazirlanmistir. Seyreltilmis HMW standardi akabinde alikuotlamadan ve müteakip jellerde kullanim için -20°C'de saklanmadan önce 5 dakika boyunca 95°'ye isitilmistir. 15 uL fermantasyon örnegi ve 10 uL HMW belirteci ~1 saat 50 dakika boyunca 130 V'de, Tris- Glisin çalisma tamponu kullanilarak %8'Iik Tris-Glisin jel üzerinde yürütülmüstür. Elektroforezden sonra, jeller 100 mL koloidal mavi boya reaktifine (55 mL WFI, 20 mL metanol, 5 mL boyayici A, 20 mL boyayici B) batirilmistir ve bir orbital çalkalayici üzerinde 60 rpm'de 5 saat boyunca boyanmasi için birakilmistir. Jeller 200 mL WFI ile boyasindan arindirilmistir. Jel, 15-20 saat boyunca, fazla boya uzaklastirilana kadar, WFI içinde birakilmistir, bundan sonra jel üreticinin talimatlarina göre taranmistir ve kurutulmustur. Bis-Tris Jeller Fermantasyon örnekleri, 4 i.il örnek tamponuna (4), 1,5 ul indirgeme ajanina (10X) ve ul 0,2 um filtrelenmis örnek ekleme ile indirgeme SDS-PAGE'i için hazirlanmistir. 15 uL of fermantasyon örnegi ve 10 uL Mark 12 belirteci bir %4-12'Iik Bis-Tris jel üzerinde tamponu kullanilarak yürütülmüstür. Elektroforezden sonra, jeller bir ilave 10 dakika boyunca bir 95 mL boyama çözeltisi (55 mL dHzo, 20 mL metanol, 20 mL boyayici A) ile degistirilmeden önce 10 dakika boyunca bir 100 mL fikse etme çözeltisine (40 mL dH20, 50 mL metanol, 10 mL asetik asit) batirilmistir. 5 mL boyayioi B boyama çözeltisine eklenmistir ve jeller 200 mL WFI ile boyasindan arindirilmadan önce bir orbital çalkalayici üzerinde 60 rpm'de 5 saat boyunca boyanmasi için birakilmistir. Jel, -20 saat boyunca, fazla boya uzaklastirilana kadar, WFI içinde birakilmistir, bundan sonra jel üreticinin talimatlarina göre taranmistir ve kurutulmustur. PROSES 3 SAFLASTIRMA: Clostridium histo/yticum'dan kollajenazlarin saflastirilmasi için, 20 L'lik ölçekte GMP için gerçeklestirilmis Proses 2'den modifiye edilmis, bir yeni gelistirilmis prosesin (Proses 3'ün) ilk 20 L'lik ölçekte çalisma. Anlamli proses degisimleri saflastirmayi ölçek büyütme ve müteakip proses validasyonu için daha güçlü ve daha uygun hâle getirmek amaciyla Proses 3'ün gelistirilmesinde uygulanmistir. Bu proses degisimini kolaylastirmadaki bir anlamli faktör, fermantasyon bileseninin seçimindedir. Proses 2, bir phytone temelli fermantasyon ortamlarini idame ettirme gereksinimine dayandirilmis iken, proses 3 için, proteoz peptonu No. 3 kullanilmistir. Proses çalismasi, üretim sonrasi saflastirma ve kollajenazlar AUXI ve AUXII kilit adimlarina ayrilmistir. Bunlar fermantasyon filtratinin bir Mustang Q kapsülü kullanilarak muamelesini, hidrofobik etkilesim kromatografisini, tegetsel akisli filtrasyon adimi 1'i (TFF1 olarak gösterilir), anyon degisim kromatografisini ve tegetsel akisli filtrasyon adimi 2'yi (TFF2 olarak gösterilir) içerir. AUXI ve AUXII saflastirmanin ilk adimlarinda birlikte-saflasir ve yalnizca (Q-Sefaroz HP ortamlari kullanilarak gerçeklestirilen) anyon degisim kromatografisi adimi sirasinda ayrilir. AUXI ve AUXII akabinde ayri ayri islenir ve formüle edilir. Ara-ürünler akabinde (UV ile belirlenen protein içerigine göre) bir 1:1'Iik oranda karistirilir ve etkin maddeyi olusturmak için filtreden geçirilir. Proses 3'ü gelistirmede, proses 2 ile iliskili kilit adimlar çikarilmistir. Göze çarpan bir sekilde, amonyum sülfat presipitasyon adimi, iki kromatografi adimi (hidroksiapatit ve jel geçirgenlik kromatografisi) ve tüm -20°C'de tutma adimlari elimine edilmistir. Ölçeklendirilemeyen adimlarin, Örnegin, karistirilmis hücrelerin ve diyalizin, kullanimi da çikarilmistir ve tegetsel akisli filtrasyon (TFF) ile degistirilmistir. Proses 2'de belirgin olan (ve TFF kullanimini elimine eden) ürün kararsizligi problemi proses 3'ün 20 L'lik ölçekteki çalismasinda görünür degildir. Bununla birlikte, proses 3 ile iliskili kontaminant profili burada klostripainin ve jelatinazin majör bilesenler oldugu proses 2 için farklidir. En göze çarpan sekilde, bir 40 kDa'Iik, 55kDa'Iik ve iki 90 kDa'Iik kontaminant (biri AUXI ile ve digeri AUXII ile birlikte-saflasir) SDS-PAGE ile saptanmistir. Bu yeni kontaminantlarin bir sonucu olarak. QC analizlerinin bazisi (örnegin, RP-HPLC ve SEC-HPLC), bunlar tüm proses 3 safsizliklarini çözmediginden, sinirli kullanimlidir. Proses-içi saflik belirleme Için yerlesik OC analizlerinden yararlanma yetisinin olmamasi hangi malzeme formunun Q-Sefaroz kolonunun ilave saflastirma için uygun oldugunu belirlemek için bir yöntemi tanimlama ihtiyaci ile sonuçlanmistir. Bu, kontaminantlar Q-Sefaroz kolon üzerinde AUXI ve AUXII ürünlerinden bariz bir sekilde çözülmediginden gereklidir ve bundan dolayi retrospektif olarak analiz edilebilen, ayrik fraksiyonlarda ayristirilmis malzemeyi toplamak gereklidir. Analiz SDS PAGE ile gerçeklestirilmistir ve 20 L'lik çalisma için havuzlama karari bir standardize edilmis 1 ug'lik yük kullanilarak ürün için safsizligin bagil boyama yogunlugu tecrübesine dayandirilmistir. SDS-PAGE'in retrospektif dansitometri analizi, havuzlama kriterlerinin ürün safliginin bagil yüzdesine göre tarif edilmesine olanak saglamistir. 200 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen malzemenin kullanildigi ilave dansitometri analizi, bir standardize edilmis yöntemin belirlenmesine ayni zamanda analiz varyasyonunun bir yaklasik olarak bulunmasina olanak saglamistir. Bu proses-içi fraksiyonlarin havuzlanmasi için bir kabul edilmis prosedürün birinci GMP isleminde uygulanmasina yol açmistir. Proses açiklamasina ek olarak, bir tampon kararliligini ve proses-içi örnek kararlilik çalismasini tarif eden preliminer çalisma Proses 3 ile iliskili safsizliklarin bazisinin baslangiçtaki karakterizasyonu ile birlikte sunulur. Proses 3 üç ana alanda proses 2'den farklilik göstermistir. Ilk olarak, amonyum sülfat presipitasyon adimi ve hidroksiapatit kromatografisi adimlari çikarilmistir; ikinci olarak, jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) adimi elimine edilmistir ve üçüncü olarak, tüm tampon degistirme adimlari tegetsel akisli filtrasyon ile gerçeklestirilmistir. Presipitasyon adimi müsteri tavsiyesiyle hidrofobik etkilesim kromatografisi (HIC) kullanimi ile degistirilmistir. Bu adimin gelistirilmesi (i) ürün yakalama (böylece bir konsantrasyon adimi görevi görmesi) ve (ii) bir miktar protein ve pigment kontaminantini uzaklastirma için HlC'in basarili uygulamasi ile sonuçlanmistir. HlC adiminin ayrica bunu takiben dsDNA düzeylerini azalttigi da gösterilmistir. Proses gelistirme programinin bir sonucu olarak, HIC'un uygulanmasi ve bir Mustang Q adiminin dâhil edilmesi hem amonyum sülfat presipitasyonu adimi hem de hidroksiapatit kromatografisi adimi ihtiyacini ortadan kaldirmistir. Toplam etki, ürünün en önde yakalanmasini basitlestirmektir ve Proses 2 ile iliskili bir potansiyel tutma adimini çikarmaktir. Bu son bahsedilen nokta, presipitasyon adimindan kaynaklanan peletler islemeden önce -20°C'de tutulabileceginden, önceden fermantasyonun üretim sonrasi saflastirmadan önce degerlendirilebilecegine yönelik anlamliliga sahiptir. HIC adimini takiben, ürünün tegetsel akisli filtrasyon (TFF) kullanilarak tamponu degistirilmistir. Bu, 30 kDa'Iik moleküler agirlik kesim-degeri (MWCO) membranlari kullanilarak gerçeklestirilmistir ve Proses 2 için kullanilan diyaliz prosedürünün yerini almistir. Mevcut oldugunda AUXII-kaynakli olarak saptanmis olan agregat kontaminasyonunun anyon degisim kromatografisi adimi (IEX) sirasinda ortadan kaldirildigi görülmüstür. Sonuç olarak, GPC adimi hem AUXl hem de AUXII ara- ürünleri IEX'i takiben agregatlar için spesifikasyon içinde oldugundan, elimine edilmistir. Son olarak, AUXl ve AUXII ara-ürünlerinin nihai konsantrasyonu ve formülasyonu karistirilmis hücrelerden yararlanmanin önceki yöntemi yerine TFF kullanilarak gerçeklesti rilmistir. Toplamda, Proses 3, Proses 2'ye kiyasla ölçek büyütme ve validasyon için daha uygun olan bir daha basit prosesi temsil etmistir. Buna ek olarak, tüketilebilen maliyetteki azalma hidroksiapatit ve jel geçirgenlik ortamlarina ihtiyacin eliminasyonu ile ve löpeptin gerektiren adimlarin azaltilmis sayisi ile asikârdir. Proses 3 için saflastirma semasinin bir genel özeti Sekil 46'da verilir. L'lik ölçekte GMP-disi gösterim çalismasi Proses 3, uygun kalitedeki malzemenin 20 L'lik ölçekte bu modifiye edilmis proses kullanilarak üretilebilip üretilemeyecegini göstermek amaciyla proses gelistirme mümkün oldugunda sogutulmus adimlari gerçeklestirme ile ve prosedürdeki kilit evrelerde sistein proteaz inhibitörü löpeptinin dâhil edilmesi ile potansiyel proteaz aktivitesini sinirlandirma yetisidir. Besin stoku 200 L'lik PPS fermantasyonundan üretilmis oldugundan, fermantasyon filtratinin bir tam 20 L'si islenmistir. Fermantasyonun ve müteakip hasadin ve filtrasyonun detaylari bir ayri raporda belgelendirilir. Fermantasyon filtratinin Mustang Q muamelesi 0,2 um'lik filtrasyonu takiben, fermantasyon süpernatantinin yaklasik olarak 22 L'si önceden tarif edildigi üzere bir Mustang Q kromatografisi kapsülüne yüklenmistir. Ilk 10 L'lik Stedim torbasinin ikincisine kiyasla görünür bir sekilde daha az pigmente oldugu görüldügünden, bir miktar görünür pigment kontaminasyonunun (yesil/kahverengi) ilk L'sinin filtrasyonu sirasinda Mustang Q kapsülü tarafindan uzaklastirildigi görülmüstür. Mustang Q kapsülünün dsDNA`yi uzaklastirma yetisi Mustang Q öncesi ve sonrasi örneklerinin piko yesil analiz ile bu adim boyunca izlenmistir (Tablo 41). Küçük-ölçekte önceki verilerden farkli verilerin üretildigini gösteren proses analizinde, yigin nükleik asit uzaklastirilmasi Mustang Q adiminda belirgin degildir. Bundan dolayi, bu adimin güçlülügü ve uygulanmasi ilave arastirma gerektirir. Örnek açiklamasi Sonuç nglml Fermantasyon filtrati 230.65 Mustang Q Sonrasi 216.53 HIC Sonrasi 1.02 TFF Sonrasi 6.34 Hidrofobik etkilesim kromatografisi (HIC) HIC kullanimi saflastirmada üç fonksiyon görevi görmüstür. Ilk olarak, burada kollajenazlarin reçineye baglandigi kosullar tanimlandigindan, ürün hacim açisindan azaltilmistir. Ikinci olarak, bir miktar pigment ve protein kontaminanti bu evrede uzaklastirilmistir ve üçüncü olarak, bu çalismadan piko yesil analiz dsDNA'nin azaltilmasini göstermistir. HIC adimi (Mustang Q muamelesinden sonra) fermantasyondan dogrudan islenmis süpernatant kullanilarak gerçeklestirilmistir ve sonuç olarak bir tutma adimi (amonyum sülfat peleti olarak Proses 2'de asikârdir) Proses 3 için artik mevcut degildir. Kollajenazlara HIC kolonunu baglamasi için kosullar saglamak amaciyla, Mustang Q adimindan ürün (20 L) bir 3 M'Iik amonyum sülfat çözeltisi ile 1 M olan bir nihai konsantrasyona seyreltilmistir. Filtrasyondan sonra, ürün kolona yüklenmistir ve bir 1- adimli izokratik elüsyon kullanilarak ayristirilmistir. HIC yükleme malzemesinin protein konsantrasyonunu dogru bir sekilde belirlemek zor olmustur ve bu iki sekilde tahmin edilmistir. Ilk olarak, amonyum sülfat eklenmesinden önce malzeme üzerinde bir Bradford analizi gerçeklestirilmistir. Bu, fermantasyon ortaminda bulunan, analize müdahale ettigi bilinen, pigmentten gelen katkiyi standardize etmek amaciyla seyreltilmemis malzeme ile gerçeklestirilmistir. Ikinci olarak, tahmin kolon reçinesinin her bir mL'si için yüklenen fermantasyon ortaminin hacmine göredir. Kolon yüklemesinin 5,9 mg toplam protein/mL reçine oldugu Bradford analizi ile veya alternatif olarak reçinenin her bir mL'si için ~13 mL fermantasyon ortami oldugu tahmin edilmistir. Kolondan ayristirilan hedef proteinin toplam miktarinin bir tahmini UV kullanilarak 3,4 9 olarak belirlenmistir (bakiniz, Tablo 42). HIC yüklemesi içinde bulunan toplam proteinin 9 9 oldugu varsayildiginda (Bradford analizi), bu bir örnekler analizin dogru olmamasindan dolayi, bu deger yalnizca bir bagil ölçüm olarak addedilmistir. Bu tahminin (fermantasyonlar arasinda çesitlilik gösterebilen) toplam protein tahmininden ziyade bir kollajenaz Içerigini verecek olmasinin fark edilmis olmasina ragmen, HlC yükleme konsantrasyonunu tahmin etmek Için bir alternatif yöntem dansitometri kullanilarak belirlenmistir. Bu yaklasim kullanilarak, toplam kollajenazlar 40:60 olarak tahmin edilen AUXI'in AUXII'ye bir yaklasik orani ile 360 mg/L olarak tahmin edilmistir. Bu veriler kullanilarak, HIC yüklemesi içinde beklenen toplam kollajenaz %47'lik bir adim verimi vererek 7,2 9 olacaktir. HIC adimindan kaynaklanan kromatogram Sekil 70'te gösterilir. Görünür pigment sürekli akista belirgindir ve ayni zamanda kolona baglanmis durumdadir. Sürekli akis kontaminasyonunu uzaklastirmak için kolon denge tamponu ile yikandiktan sonra, pik 1 bir ara konsantrasyonda amonyum sülfat çözeltisi (0,3 M) kullanilarak ayristirilmistir. Biraz AUXII'nin de bu evrede ayristirilmis olmasina ragmen, bu pikin protein kontaminantlari içerdigi gösterilmistir (Sekil 71). Üründeki bu kayip beklenmistir ve önceden bildirilmistir. Ürün kaybinin miktarini minimuma indirmek amaciyla, safliktan taviz vermeden, pik 1 uzaklastirmasi için elüsyon hacmi 5 kolon hacmine ayarlanmistir. Akabinde, ürünün büyük çogunlugunu içeren, pik 2 herhangi bir amonyum sülfat olmadan tampon kullanilarak ayristirilmistir. Pik 2, toplamanin bir kolon hacminin %'ü kadar elüsyon tamponu kolona uygulandiktan sonra basladigi sekilde programlanmis kromatografi yöntemi ile bir tek havuz olarak toplanmistir. Toplama akabinde toplamda 4 kolon hacmi toplandiktan sonra sonlandirilmistir. Proseste bu evrede üründeki potansiyel proteolizi minimuma indirmek amaciyla. Iöpeptin HIC sonrasi eluata eklenmistir ve malzeme 2-8°C'de tutulmustur. HIC sonrasi eluat için tutma süresi 2 günlük süredir. Tegetsel akisli filtrasyon 1 (TFF1) kDa'Iik membranlar kullanilan TFF ürünün hacmini (5-kat) azaltmak ve tamponu anyon degisim kolonunu baglama için uygun kosullara degistirmek amaciyla HIC'i takiben uygulanmistir. Amonyum sülfattaki yeterli azalma böylece IEX yükleme örneginin Iletkenliginin <1,8 mS olmasi özel öneme sahiptir. Diyafiltrasyon tamponu sogutulmustur ve proteoliz olasiligini azaltmak için kullanimdan önce Iöpeptin eklenmistir. Bunun TFF1 öncesi malzemede pigment varligindan dolayi proseste bu evrede protein konsantrasyonu tahminindeki dogru olmamayi yansitabilmesine ragmen, bu adim süresince proteinde herhangi bir kayip tahmin edilmemistir (%100 geri-kazanim). Toplam proteinin yaklasik olarak %97,5'i (3325 mg), birinci membran durulamasinda (infra) geri-kazanilan bir ilave 204,8 mg ile filtre edilmeyen kisimda geri- kazanilmistir. Toplam proteinin birlestirilmis filtre edilmemis kisimdan ve durulamadan filtrasyonu malzemeyi 2-8°C'de gece boyu tutmadan önce TFF adiminin sonunda gerçeklestirilmistir. SDS-PAGE analizi, TFF adimindan önce ve sonra herhangi bir anlamli farkliligin saptanmadigini göstermistir (Sekil 71). Q-Sefaroz kromatografisi Q-Sefaroz kolonu reçinenin her bir mL'si için 5 mg toplam protein olan bir maksimum kapasitede yüklenmistir. Sonuç olarak, TFF adimindan elde edilen mevcut malzemenin hepsinden bu adimda yararlanilmamistir (bakiniz, Tablo 421). Q-Sefaroz kolonu beklenildigi üzere AUXI ve AUXII kollajenazlarini çözmüstür (Sekil 72). AUXII elüsyonunun baslamasi, 5,7 mS olan bir kolon sonrasi iletkenlige esit olan, yaklasik olarak %13,6 B'de baslamistir (burada tampon A = 10 mM Tris, 0,2 mM Iöpeptin, pH 8 ve tampon B = Tampon A + absorbans degeri pik yüksekliginin %25'ine ( düsüne kadar AUXII'nin elüsyonu boyunca toplanmistir. AUXII elüsyonunu takiben bir küçük pik yaklasik olarak 8 mS'de (%20,3 B) ayristirilmistir. Önceki küçük-ölçekte deneylerden bu pikin proses-içi analizi, bunun AUXII-kaynakli agregat malzemesi oldugunu göstermistir. AUXI elüsyonu baslamasi, ( yaklasik olarak %27 B'dedir. Önceden oldugu gibi, 100 mL'Iik fraksiyonlar absorbans gerekli %25'lik degere ( düsene kadar toplanmistir. Toplanan her bir AUXI ve AUXII fraksiyonu SDS-PAGE ile analiz edilmistir ve dansitometriye tabi tutulmustur (Sekiller 73-76). Dansitometri retrospektif olarak gerçeklestirilmistir böylece fraksiyon havuzlama karari Koloidal mavi boyama ile görünür olan kontaminant düzeyleri tecrübesine dayandirilmistir. Auxilium ile konsültasyonda, fraksiyonlar 6-12 AUXII ürünü için havuzlanmistir ve fraksiyonlar 19- 26 AUXI için havuzlanmistir. Adim verimleri ve Q-Sefaroz çalismasindan havuzlanmis malzemede bulunan protein konsantrasyonlari Tablo 42'ye dâhil edilir. L'lik gösterim çalismasindan IEX sonrasi AUXI ve AUXII ürünlerinin SBS-PAGE analizi (Sekil 77 ve 78) SDS-PAGE ile görülebilen bir kaç kontaminant göstermistir. Buna ek olarak, burada kontaminantlarin rezolüsyonunda, küçük-ölçekli modelde daha belirlenmis (yani, ayri pikler veya omuzlar) olarak görülmüs olan, bildirilmis farkliliklar olmasina ragmen, saptanan kontaminantlar önceki küçük-ölçekteki deneyler ile uyumludur. Bu kontaminantlar ayrica burada klostripainin ve jelatinazin majör bilesenler oldugu Proses 2 için tanimlanmis olanlar için de farklidir. Sonuç olarak, Proses 2 içi gelistirilmis QC protokoller Proses 3 ile Iliskili yeni kontaminantlarin saptanmasi için optimize edilmemistir. Havuzlanmis malzemenin retrospektif dansitometrisi safligi AUXI için %95,1'de ve AUXII için %99,4'te tahmin etmistir. Bununla birlikte, güncel olarak, 2%97'Iik saflik spesifikasyonu RP-HPLC ile belirtilir ve herhangi bir nihai ürün spesifikasyonu dansitometri kullanilarak belirlenmemistir. AUXI'in ve AUXII'nin konsantrasyonu ve tampon degisimi Q Sepharose kolonundan ayrilmis AUXI ve AUXII ürünleri bir 30 kDa'lik membran kullanilarak TFF ile ayri ayri islenmistir. Bu adim; (i) nihai üründeki löpeptini uzaklastirmayi/azaltmayi, (ii) ara-ürünleri dogru tampona (10 mM Tris, 60 mM sükroz, pH 8) formüle etmeyi ve (iii) O,9-1,1 mg/mL olan gerekli olan hedef protein konsantrasyonunu saglamayi gerektirmistir. Toplam 799 mg (1,17 mg/mL'de ~ AUXII ve 860 mg (1,08 mg/mL'de AUXI 1,75 mg/mL olan bir hedef konsantrasyona konsantre edilmistir. Bu teorik konsantrasyon konsantrasyon adimi sirasinda herhangi bir ürün kaybi olmadigini varsayarak gerekli olan hacimdeki hesaplanan azalmaya göredir. Akabinde, diyafiltrasyon gerekli formülasyon tamponuna uygulanmistir, membranlar minimum hacimdeki TFF sistemi (~ ile yikanmistir ve 0,9-1,1 mg/mL olan gerekli olan hedef konsantrasyonu saglamak için tam miktar konsantre ile birlestirilmistir. Toplamda ve 797,0 mg AUXI (1,09 mg/mL'de) filtrasyondan sonra mevcuttur. Her iki durumda da, ürünlerin büyük çogunlugu filtreden geçirilmemis kisimda geri-kazanilmistir ve AUXII için %95,4 ( olarak tahmin edilmistir. Membranin durulanmasi ile saglanan ilave malzeme AUXII ve AUXI için sirasiyla 153 mg ve 89,6 mg olarak tahmin edilmistir. Ara-ürünlerin etkin maddeye karistiriimasi Her bir ara-ürünün yaklasik olarak 200 mg'i 400 mg etkin madde vermesi için birlestirilmistir. Akabinde bu filtreden geçirilmistir ve yaklasik olarak 26 mg testler için QC'ye saglanmistir. AUXI, AUXII ara-ürünleri ve etkin madde için 00 sonuçlari Tablo 43'te saglanir. Etkin madde ve AUXII ara-ürünü üzerindeki tüm testler gerekli olan spesifikasyonu geçmistir. Bununla birlikte, AUXI ara-ürününün potensi için test, tüm diger testlerin geçmis olmasina ragmen, belirtilen aralik içinde degildir. AUXI potens sonucu istisnasi ile, bu veriler Proses 3'ün 20 L'lik ölçekte saflastirildiginda gerekli olan spesifikasyondaki malzemeyi üretebildigini göstermistir. QC testleri ile ayni zamanda, 20'lik gösterim çalismasindan elde edilen malzemeden KBI BioPharma, Inc.'de yöntem validasyonu için yararlanilmistir. Müsterinin ricasi üzerine, 200 mg etkin madde etkin madde ve ilaç ürünü yöntemleri validasyonu için KBI'ya kuru buz üzerinde nakledilmistir. Son bahsedilen testler KBI'da etkin maddenin liyofilizasyonundan sonra gerçeklestirilmistir. Buna ek olarak, her bir ara-ürünün 25 mg'i analitik yöntemlerin validasyonu için KBl'ya tedarik edilmistir. L'Iik gösterim çalismasi için münferit adim verileri Tablo 42'de verilir. Burada tüm mevcut malzemenin Q-Sefaroz kolonuna yüklendigi verilerin bir dis-deger bulunmasi bu proses çalismasindan mevcut etkin maddenin maksimum toplam miktarinin (alikonmalar yoluyla herhangi bir malzeme kaybi olmadigini varsayarak) 1,6 9 oldugunu göstermistir. Bu, HIC kolonuna yükleme için mevcut toplam proteinin miktari için (Bradford analizi kullanilarak) 9 9 olan ilk tahmine göre %17,8'Iik bir yaklasik genel proses verimine esittir. Q-Setaroz kolonu için yükleme konusundaki sinirlandirma ile, tüm mevcut ara-ürün etkin maddeyi olusturmak için karistirilmis oldugunda, bir maksimum 1,4 9 etkin madde var olan çalismada mevcuttur. Proses Adimi Protein kons. Miktar Toplam Adim (mg/mL) (agirlik/Hacim) Protein Verimi Fermantasyon - 200L - - Mustang Q öncesi - 22L Mustang Q sonrasi 0.45 22L 9000 - (Bradford) 1 ile ve filtrasyon sonrasi) Proses Adimi Q AUXI havuzu TFF2 öncesi AUXII AUXII ara-ürünü (filtrasyon sonrasi) TFF2 öncesi AUXl AUXI ara-ürünü (filtrasyon sonrasi) Protein kons. Miktar Toplam (mg/mL) (agirlik/Hacim) Protein * amonyum sülfat eklenmesinden sonra seyreltme kat sayisina göre hesaplanmistir Test Yöntem Çözeltinin Görünüsü SOP pH'in Potansiyometrik QCSOP Endotoksin QCSIO Belirlenmesi 018 Coomasie ile QC boyanmis SDS-PAGE SOP ile özdeslik 103 Etkin Madde Berrak, 1 mm uzunlugunda 2-3 küçük ekzojen lif ile renksiz 107 ve 110 kDa ve 110 ve 115 kDa arasinda Majör Kollajenaz bantlari AUXI Ara-Ürünü Berrak, renksiz ve partikülat maddeden yoksun (AK/1573/121) Gerekli degil 110 ve 115kDa arasinda Majör kollajenat bantlari AUXII Ara-Ürünü Berrak, 1 mm uzunlugunda 2-3 küçük ekzojen Iif ile renksiz Gerekli degil 0,136 EU/mL 107 ve 110kDa arasinda Majör Kollajenaz bantlari .. Etkin Madde AUXI Ara-Ürünü AUXII Ara-Ürünü Test Yontem Absorbans Spektrofotometrisi ile Toplam Protein Kollajen Analizi SOP (OOS/KeeIe/2006/0038) Gerek" deg" 57677 GPA birim/mg Sinif II Kollajenazlar birim/mg (79000- SOP Gerekli degil (AS/1597/111) Referans Konak Hücre Protein QCSOP _ _ _ _ Analizi Konak Hücre DNA Analizi Proteinlerin Agilent %100 ana piks %100 ana pik %100 ana pik 1100 HPLC System (%47,70 AUX-l, /00 agregatlar /00 agregatlar kromatografisi ile QC kullanilarak analizi 109 Referans AUX-I %100 AUX-II %100 (Ters fazli sivi kromatografi ile özdeslik ve saflik) kullanilarak analizi Referans Proteinlerin Agilent 1100 HPLC System (Anyon degisim kromatografisi ile jelatinaz) kullanilarak Referans Triptik Sindirim ve Ters fazli HPLC ile Peptit Haritalama Rezidüel Löpeptin B iyo-yü k Etkin Madde AUX-I %0 Jelatinaz AUX-II %0 Jelatinaz Gerekli degil Saptanmamistir Örnek kararliligi çalismasi AUXI Ara-Ürünü AUX-I %0 Jelatinaz AUX-II %0 Jelatinaz Tuesday Gerekli degil AUXII Ara-Ürünü AUX-I %0 Jelatinaz AUX-II %0 Jelatinaz Tuesday Gerekli degil L'Iik gösterim çalismasi boyunca, örnekler kilit proses noktalarinda alinmistir. Gösterim çalismasi (herhangi bir tutma adimi olmadan)bir sürekli proses olarak gerçeklestirildiginden, GMP serileri için beklenen tutma süreleri boyunca proses-içi malzemenin kararliligini degerlendirmek için bir girisimde bulunulmustur. GMP için beklenen uzatilmis çalisma süresi, proses adimlari arasinda ekipman kIirens verileri elde etme gerekliliginden dolayi fark edilmistir. Proses-içi malzeme yaklasik olarak GMP üretimi için beklenen süre boyunca 2-8°C'de tutulmustur. Buna ek olarak, örnekler GMP islemi için beklenenin iki katini temsil eden bir uzatilmis süre boyunca tutulmustur. Ilgili tutma süreleri ile birlikte, alinan örneklerin bir açiklamasi Tablo 44'te verilir. 20 L'lik gösterim çalismasi için isleme süreleri Tablo 45'te sunulur. Tüm örnekler SDS-PAGE, RP-HPLC, SEC-HPLC ve UV analizi için QC'ye teslim edilmistir (Sekiller 79-83). Toplamda, sonuçlar (RP-HPLC ile belirlendigi üzere) saflik, (%8'Iik Tris-Glisin SDS- PAGE ile saptandigi üzere) parçalanma ve (SEC-HPLC ile belirlendigi üzere) agregasyon açisindan birinci tutma noktasina kiyasla üründe herhangi bir saptanabilen bozulma göstermemistir. Bununla birlikte, düsük moleküler kütleli bilesenler %8'lik SDS-PAGE ile saptanamayacagindan ve RP-HPLC analizi Proses 3 ile iliskili 40 kDa'lik, 55 kDa'lik ve 90 kDa'lik kontaminanlari saptamak için gelistirilmemis oldugundan, analizlerin bazilarinin sinirlayici oldugu fark edilmistir. Bazi analizler, örnegin, fermantasyon örneklerinde UV ve SEC-HPLC kullanimi, ayrica ham örnekler için daha az ilgilidir. Bu sinirlandirmalara ragmen, ürün profilindeki saptanan tek degisiklik Q-Sefaroz kolonundan alinan AUXII proses-içi örnek için ikinci tutma noktasi (gün 12) için tanimlanmistir. Bu artisin yalnizca %O'dan 0,62'ye olmasina ragmen, bu gün 5 ve gün 12 arasinda agregat düzeyinde bir artis göstermistir. Bir Ikinci kararlilik çalismasi 20 L'lik gösterim çalismasi boyunca üretim noktasinda alinmis ve -20°C'de saklanmis olan proses-içi alikonmalar üzerinde gerçeklestirilmistir. Bu çalismada, örneklerin buzu çözülmüstür ve bunlar oda sicakliginda ve 37°C'de inkübe edilmistir ve degerlendirilecek olan kontaminantlarin tam moleküler kütle araligina olanak saglamak için %4-12'Iik SDS-PAGE analizi ile izlenmistir (Sekiller 84- 88). Bu veriler, Q-Sefaroz anyon degisiminden önce örneklerin parçalanmaya yatkin oldugunu göstermistir. Kollajenazlar AUXI'in ve AUXII'nin (Q-Sefaroz kolonu ile) ayrilmasini takiben, örneklerin görece kararli oldugu görülmüstür ve örnekler SDS- PAGE ile zaman sifir örnekleri ile karsilastirilabilir gözükmüstür. Bunlarin hepsi birlikte hesaba katildiginda, her iki çalismada da sicakligin 2-8°C araliginda idame ettirilmesi saglandiginda, proses-içi malzemenin arastirilan tutma süreleri boyunca islenme sirasinda bozulmasi beklenmez. Bu, Iöpeptin ve sicaklik kontrolü kullanmanin GMP'de beklenen süreler boyunca isleme sirasinda ürün parçalanma düzeylerini sinirlandirmak için yeterli olduguna yönelik bir güvenirlilik düzeyi verir. Örnek Dondurulmadan önce 2- Hacim Saklama, Kap 8°C'de tutulma süresi Muhafaza etme Fermantasyon GÜN 4 1 x -70°C Torba Filtrati 2mL Mustang Q GÜN 4 1 x -70°C Torba sonrasi 2mL HlC sonrasi GÜN 3 1 x -70°C Torba TFF sonrasi GÜN 2 1 x -70°C Torba AUX I Ara-ürünü GÜN 6 2 x -70°C Biyo- 1mL kap Örnek Dondurulmadan önce 2- Hacim Saklama, Kap 8°C'de tutulma süresi Muhafaza etme AUX II Ara- GÜN 6 2 x -70°C Biyo- ürünü 1mL kap Proses Adimi 20 L'Iik gösterim çalismasi Fermantasyon hasadi Gün 1 Mustang O Gün 1 TFF2 (AUXI) Gün 7 TFF2 (AUXII) Gün 9 DS karistirma Gün 12 Tampon kararliligi çalismasi Tablo 46'da gösterilen tampon örnekleri 20 L'Iik gösterimden ayrilmistir ve 2-8°C'de saklandiktan sonra yeniden-test edilmistir. Tamponlarin pH'i, iletkenligi, sicakligi ve görünüsü tamamlanma zamaninda ve 12-13 günlük saklamadan sonra bildirilmistir. Bu çalismanin sonuçlari Tablo 47'de verilir. pH ve iletkenlik için degerlerde küçük farkliliklar gözlemlenmistir ancak bu orijinal tamponlar ve test edilen alikonulanlar arasinda sicakliktaki farkliliklardan kaynaklanabilir. Özel olarak, HIC tamponlari iletkenlik ve sicakliklarda en genis varyasyonu göstermistir. Sonuç olarak, tampon kararliligi ile ilgili gelecekteki çalismalar tüm parametreleri kaydetmek için bir kabul edilmis sicaklik araliginin spesifikasyonunu içermelidir. Tüm durumlarda, tampon alikonmalari zaman sifirda ve gerekli olan tutma süresinden sonra görünüs açisindan berraktir. TAMPON BILESENLER HIC A 10 mM Tris, 1,0 M Amonyum Sülfat, pH 8,0 HlC A2 10 mM Tris, 0,3 M Amonyum Sülfat. pH 8.0 HIC B 10 mM Tris, pH 8,0 DIYAFILTRASYON 10 mM Tris, 200 pm Löpeptin, pH 8,0 360 mM NaCl pH 8,0 FORMÜLASYON 10 mM Tris, 60 mM Sükroz, pH 8,0 3,0 M AMONYUM SÜLFAT 10 mM Tris, 3,0 M Amonyum Sülfat, pH 8,0 Tampon Hazirlanan Dinlenme Geçen Orijinal Muhafaza Muhafaza Tampon tarih tarihi günlerin tampon edilen edilen Görünüsü sayisi pH'i ve örneklerin örneklerin kosulu pH'i ve pH'inin ve iletkenligi kosulunun tekrarli testleri Tampon Hazirlanan Dinlenme Geçen Orijinal Muhafaza Muhafaza Tampon tarih tarihi günlerin tampon edilen edilen Görünüsü sayisi pH'i ve örneklerin örneklerin kosulu pH'i ve pH'inin ve iletkenligi kosulunun tekrarli testleri 8.5°C 15.1°C 22.0°C 19.4°c @ 16.7°C 22.1°C 19.2°C @ 18.2°C .3°C @ 18.2°C 19.4°C 18.8°C 19.0°C @18.3°C 18.5°C @19.1°C 16.5°C @19.9°C 14.6°C @20.4°C N-ucu dizileme ile kontaminant tanimlanmasi Üç ana safsizlik SDS-PAGE ile Proses 3 için saptanmistir. Bunlarin AUXI ve AUXII kollajenazlari ile birlikte-ayristirildigi görülmüstür ve bunlar yalnizca Q-Sefaroz kolonundan ayristirilmis piklerin fraksiyonasyonu ile çözülmüstür. Kontaminantlar SDS- PAGE üzerinde bunlarin görünür moleküler kütlesi ile 40 kDa'Iik, 55 kDa'Iik ve 90 kDailik kontaminantlar olarak tayin edilmistir. Bir özel kontaminantin yükselmis düzeylerini içeren fraksiyonlar SDS-PAGE'den bandin kesilip çikarilmasindan sonra N- ucu dizileme için gönderilmistir. Dizi analizi 20 L'Iik gösterim çalismasindan izole edilmis hem 55 kDa'Iik hem de 40 kDa'Iik kontaminant için basarilidir. AUXI ile iliskili 55 kDa'Iik kontaminant bandin N- ucunun (Seritler 1-5; Sekil 89) kollajenaz AUXI için CoI G dizisinin bir bölgesi ile eslestigi gösterilmis iken, AUXII'den 40 kDa'Iik kontaminant bandin (Seritler 6-10; Sekil 89) kollajenaz AUXIl için Col H dizisinin bir bölgesine özdestir. Hem AUXI hem de AUXIl ürünleri ile iliskili olan 90 kDa'lik bandi dizilemek için önceden bir girisimde bulunulmustur (Sekil 90). AUXI ile iliskili 90 kDa'Iik kontaminantin dizilenmesi özdesligin AUXI dizisinin N-ucu ile korele edilmesi açisindan basarilidir. Aksine, AUXII ile iliskili 90 kDa'lik kontaminant için bir tam dizi elde etmek mümkün degildir; bu durum, iki 90 kDa'Iik kontaminantin farkli ürünler oldugunu öne sürmüstür. Proses 3 ile iliskili ana kontaminantlarin ürün ile ilgili oldugu görülmüstür ve bunlar ya AUXI'in (55 kDa) ve AUXII'nin (40 kDa) N-ucundan yarilmis ürünleri ya da AUXI'in bir C-ucundan yarilmis ürünü (90 kDa) olarak tanimlanmistir. Bu kontaminantlar Proses 2'de tanimlananlardan farkli oldugu için; analiz gelistirme Proses 2 etrafinda köken aldigindan, ara-ürünlerin ve etkin maddenin spesifikasyonu için yararlanilan QC analizleri yeni kontaminantlari çözmemistir. Özel olarak, standart saflik analizi (RP- HPLC) 40 kDailik ve 55 kDa'Iik kontaminantlarin düzeylerini saptamak için kullanilamamistir. Dansitometri analizi L'Iik gösterim çalismasi Proses 3 ile iliskili 40 kDallik, 55 kDa'Iik ve 90 kDa`Iik kontaminantlar SDS-PAGE ile tanimlanmistir ve çözülmüstür. Bu kontaminantlar Q-Sefaroz kolonundan ayristirilmis fraksiyonlarda bariz bir sekilde saptanmistir ve bunlarin pik profilinin öndeki ve arkadaki köselerinde ayristigi görülmüstür (bakiniz, Sekiller 72-76). Bunlar için fraksiyonlarin ilave saflastirma için dâhil edilme veya dâhil edilmeme karari Koloidal mavi ile boyanmis jeller üzerinde kontaminantlar ve ürün için boyamanin bagil yogunlugu tecrübesine dayanir. Bunu bir daha az sübjektif tahmin yapmak amaciyla, Q-Sefaroz adimini takiben fraksiyonlar için spesifik havuzlama kriterlerini belirlemek için dansitometriden yararlanilmistir. Bu analiz Proses 3 ile iliskili yeni kontaminantlari çözemediginden, dansitometri saflik için güncel QC analizine (RP-HPLC) tercihen kullanilmistir. L'Iik gösterim çalismalarindan Q sonrasi fraksiyonlardan elde edilen dansitometri verileri lEX-sonrasi fraksiyonlarin 2 ayri analizinden elde edilen dansitometri verilerinin ortalamasi alinmistir ve bunlar Tablo 48'de gösterilir. Fraksiyonlar 1-12 ve pik 1'in son kontaminantlari içerir. Dansitometrik analiz olmadan SDS-PAGE'e göre, seçilmis fraksiyonlarin havuzlari vurgulanir. Fraksiyon numarasi Bant yogunlugunun bagil yüzdesi (%) 1 55.9 44.1 0 0 2 57.8 42.2 0 0 3 68.0 32.0 0 0 4 83.2 16.8 0 0 93.3 6.7 0 0 6 98.3 1.7 0 0 7 100 0 0 0 Fraksiyon numarasi Bant yogunlugunun bagil yüzdesi (%) 200 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen Q sonrasi fraksiyonlardan dansitometri özet belgeleri Dansitometri Analizinin Özeti 200 L'Iik mühendislik çalismasindan elde edilen IEX sonrasi fraksiyonlar GMP islemi için IEX BMR'de belgelenebilen bir havuzlama kriterleri olusturmak için çok kere analiz edilmistir. Bu havuzlama kriteri (i) mühendislik çalismasindan üretilen malzemenin kalitesinin GMP malzemesi için uygun oldugu ve (ii) dansitometri yönteminin yaklasik olarak bulunmasinin kabul edilebilir oldugu varsayima dayandirilir. Amaç GMP isleminde daha yüksek kalitede malzeme üretmek oldugunda. havuzlama kriterleri için spesifikasyonun revize edilmesi gerekecektir. lEX'ten havuzlama için sgesifikasyon Toplamda, 200 L'Iik mühendislik çalismasindan elde edilen örnekler 6 kere (2 operatör ve her bir jelin 3 tekrari) analiz edilmistir ve ortalama veriler Tablo 49'da sunulur. Mühendislik çalismasi için havuzlanmis fraksiyonlar kirmizi renk ile vurgulanir. Bu analizden, asagidaki havuzlama kriterleri belirlenebilir: (i) %88,5'ten daha büyük veya buna esit safliktaki herhangi bir fraksiyon havuzlanabilir (ii) %10'dan daha büyük veya buna esit bir tek safsizlik içeren herhangi bir fraksiyon havuzlanamaz (iii) Havuzlanacak olan fraksiyonlar ardisik fraksiyonlardan olmak zorundadir. (iv) Havuzun hesaplanan teorik safligi asagidaki sekilde olmalidir: AUXI için %93'ten daha büyük veya buna esit teorik saflik AUXIl için %96'dan daha büyük veya buna esit teorik saflik Bu son nokta, burada (tüm fraksiyonlarin AUXI için UV analizi için mevcut olmadigi bir sinirlandirmanin olmasina ragmen) mevcut fraksiyonlardaki toplam proteinin tahmin edildigi 200 L'Iik mühendislik çalismasindan yapilan tahminlere dayandirilmistir. Bu analizden elde edilen veriler Tablo 50'de sunulur. **NOT2 bu kriterlerden, AUXII piki için fraksiyon 7 simdi çikarilacaktir. Analiz vamasyonu 200 L'Iik mühendislik çalismasindan elde edilen IEX sonrasi fraksiyonlarin verilerinden, asagidaki dogruluk düzeyi tahmin edilmistir: (i) ürün (AUXI ve AUXII) için CV %'si % olarak hesaplanmistir. Bundan dolayi, havuzlama için %88,6 olan saflik spesifikasyonu (ii) safsizliklar için, CV %'si daha büyüktür ve safsizligi bagli olarak araligin %18,5-33,7 oldugu tahmin edilmistir. Sonuç olarak, en fazla %10'Iuk bir tek safsizligi olan fraksiyonlari dâhil etmemenin saflik spesifikasyonu %6,63-13,37 olan bir gerçek safsizlik araligi olan fraksiyonlar için olabilir. Bundan dolayi, ürünün (ve safsizliklarin degil) safligi için deger havuzlama spesifikasyonu için en güvenilir degerdir. Nihai malzemenin dansitometri ile tahmin edilen safligi 200 L'Iik mühendislik çalismasi için nihai malzemenin (DS'nin ve ara-ürünlerin) dansitometri analizi ayrica dansitometri ile de belirlenmistir ve asagidaki sekildedir: AUXI = %96,0 (90 kDa'Iik kontaminantin %3,1'i) AUXII = %98,7 (90 kDa'Iik kontaminantin %1,2'si) DS = %97.63 (90 kDa'lik kontaminantin %2,1`i) (Not: Bu, 3 farkli operatör tarafindan 3 kere analiz edilen bir tek SDS-PAGE için belirlenmis araliktir.) Yöntemin standardizasyonu Tekrar analiz seyri boyunca, dansitometri yöntemi operatörler arasinda hatayi ve jeller arasinda varyasyonu minimuma indirmek için standardize edilmistir ve bir SOP'ta belgelenecektir. En göze çarpan sekilde: (i) Jelin her bir seridinde toplam proteinin standart yüklemesi 1 ug olacaktir. (ii) Bir maksimum 16 fraksiyon ürün piklerinin (AUXI ve AUXII) her birinden analiz için seçilecektir. Bu, dansitometri analizi için jellerin sayisini 4 ile sinirlandiracaktir. (iii) Seçilen 16 fraksiyon her bir pik için toplanacak olan son fraksiyondan baslayacaktir ve ardisik bir sekilde ileri dogru çalisacaktir. Bu, (havuzlanacak olan tüm fraksiyonlar büyük olasilikla dâhil edildiginden) ortalama saflik için hesaplanan sayidaki dogrulugu garanti edecektir. Tablo 49: Dansitometri analizi ile belirlendigi üzere. 200 L'Iik Mühendislik çalismasindan elde edilen IEX sonrasi fraksiyonlardaki ürünün ve safsizliklarin ortalama bagil miktarlari. Havuzlanan fraksiyonlar kirmizi renk ile vurgulanir. Fraksiyon # Yüklenen Miktar (pg) Bagil miktar (%) AUXI (pik 2) AUXII (pik 1) Yüklenen Miktar (mg) Bagil miktar (%) Fraksiyon # Yüklenen Miktar (pg) Bagil miktar (%) 9 1 100 0 0 0 0 11 1 100 0 0 O 0 12 1 100 0 0 O 0 Tablo 50: Dansitometri analizi ile belirlendigi üzere, 200 L'Iik Mühendislik çalismasindan elde edilen IEX sonrasi fraksiyonlardaki ürünün ve safsizliklarin teorik bagil miktarlari. Havuzlanan fraksiyonlar kirmizi renk ile vurgulanir. Teorik ortalama ürün safligi %92,3 ve %95,8 AUXI ve AUXIl ara-ürünleri için sirasiyla olarak hesaplanir. Toplam Protein Ürün (AUXI) Tüm Safsizliklarin Toplam Protein miktari (mg) 1524.29 1507.35 1339.47 1256.06 1063.30 972.75 774.62 588.06 Toplam 11270.60 Toplam Protein miktari (mg) 200.20 323.14 533.02 882.09 1226.58 1508.94 1206.73 943.48 684.41 537.35 312.80 Ürün (AUXI) miktari (mg) 1443.16 1418.46 1258.18 1175.32 978.57 889.05 699.46 530.06 1 0404.00 92.31 Ürün (AUXII) miktari (mg) 161.56 283.11 533.02 882.09 1226.58 1508.94 1153.47 882.75 628.99 491.40 281.35 Tüm Safsizliklarin miktari (mg) 81 .13 88.89 81.29 80.74 84.73 83.70 75.15 58.00 866.60 Tüm Safsizliklarin miktari (mg) 38.64 40.02 53.27 60.73 55.43 45.95 31.45 Toplam Protein Ürün (AUXI) Tüm Safsizliklarin Q-Sefaroz Sonrasi Fraksivonlar icin GMP Havuzlama Kriterleri Iyon degisim BMR'de belirtilecek olan detay A. Asagidaki havuzlama kriterleri dansitometri ile analiz edilmis olan hem AUXI hem de AUXIl piklerinden elde edilen fraksiyonlar için belirtilecektir: (i) Bir maksimum 16 fraksiyon ürün piklerinin (AUXI ve AUXII) her birinden analiz için seçilecektir. Bu, dansitometri analizi için jellerin sayisini 4 ile sinirlandiracaktir. (ii) %90.00'dan (iki ondalik hanesin kadar bildirilmis) daha büyük veya buna esit safliktaki herhangi bir fraksiyon havuzlanabilir. (iii) %9,00'dan (2 dp'ye kadar) daha büyük veya buna esit bir tek saflik içeren herhangi bir fraksiyon havuzlanamaz. (iv) Havuzlanacak olan fraksiyonlar ardisik fraksiyonlardan olmak zorundadir. B. Asagidaki havuzlama kriterleri SEC-HPLC ile analiz edilecek olan AUXII pikinden elde edilen fraksiyonlar için belirtilecektir: (i) SEO-HPLC için teslim edilecek olan örneklerin maksimum sayisi 10'dur ve bu pik için toplanan son fraksiyondan ve ileri dogru ardisik fraksiyonlardan olmak zorundadir. (ii) %2,00'dan (2 dp'ye kadar) daha büyük veya buna esit agregati olan herhangi bir fraksiyon havuzlanamaz. Yalnizca bilgi amaciyla kaydedilecek olan detaylar A. Havuzun tahmin edilen teorik safligi yalnizca bilgi amaciyla hesaplanmalidir ve asagidaki sekilde olmasi beklenir: AUXI için %93,00'dan daha büyük veya buna esit teorik saflik AUXII için %97,00'dan daha büyük veya buna esit teorik saflik B. Her bir havuzda proteinin minimum miktari, 0,5 g'dan daha az olan fraksiyonlari dâhil etmemek için kriterlerin gelecekte kullanilabilip kullanilamayacagini belirlemek için bildirilmelidir. C. AUXI piki için fraksiyonlar RP-HPLC için teslim edilecektir ancak retrospektif olarak ve yalnizca bilgi amaciyla analiz edilecektir. Bu veriler havuzlama kriterlerinin parçasi olarak DÜSÜNÜLMEYECEKTIR. Havuzlama üzerindeki beklenen etki Asagidakiler yeni havuzlama kriterlerini takiben verim ve fraksiyon seleksiyonu üzerindeki etkiyi yansitmasi için Tablo 51`de sunulan ortalama veri kümesinden hesaplanmistir: 200 L'Iik mühendislik çalismasindan havuzlanmis fraksiyonlar 200 L'Iik mühendislik çalismasindan elde edilen IEX sonrasi havuzlar için belirlenmis Toplam Protein GMP kriterleri izlenecek havuzlanacak olan fraksiyonlar Toplam Proteinde GMP kriterleri tarafindan dâhil edilmeyen fraksiyonlardan kaynaklanan tahmin edilen azalma 13.189 8.379 0.959 1.189 Tablo 52: Dansitometri analizi ile belirlendigi üzere. 200 L'Iik Mühendislik çalismasindan elde edilen IEX sonrasi fraksiyonlardaki ürünün ve safsizliklarin ortalama bagil miktarlari. Fraksiyon # Yüklenen Miktar (pg) Bagil miktar (%) Fraksiyon # AUXI (pik 2) AUXII (pik 1) Yüklenen Miktar (pg) Yüklenen Miktar (mg) 88.91 85.81 84.57 80.41 80.00 80.61 88.53 90.43 94.68 94.10 93.93 93.57 92.03 91.40 90.30 90.14 68.48 55.51 55.90 67.59 80.70 Bagil miktar (%) Bagil miktar (%) 21.55 36.80 36.73 .09 12.33 12.63 14.54 13.86 Fraksiyon # Yüklenen Miktar (pg) Bagil miktar (%) 9 1 100 0 O 0 0 1 100 0 O 0 0 11 1 100 0 O 0 0 Tablo 53: Dansitometri analizi ile belirlendigi üzere, 200 L'Iik Mühendislik çalismasindan elde edilen IEX sonrasi fraksiyonlardaki ürünün ve safsizliklarin teorik bagil miktarlari. Havuzlanan fraksiyonlar kirmizi renk ile vurgulanir. Teorik ortalama ürün safligi %923 ve %95,8 AUXI ve AUXII ara-ürünleri için sirasiyla olarak hesaplanir. Toplam Protein Ürün (AUXI) Tüm Safsizliklarin Toplam Protein Ürün (AUXI) Tüm Safsizliklarin Toplam Protein Ürün (AUXII) Tüm Safsizliklarin L'Iik çalismada gerçekten havuzlanacak olanlardan bir ilave fraksiyonun (AUXI'den fraksiyon 27'nin) dâhil edilecek olmasina ragmen, 2 veri kümesinin (yani, farkli operatörler tarafindan farkli jeller üzerinde yürütülen ayni proses-içi örneklerin) bir karsilastirmasi asagidaki retrospektif havuzlama kriterlerinin ortalama veri kümesi için bildirilmesine olanak saglamistir: 2%87 olan bir safligi olan ancak 2%10 olan bir tek safsizliga sahip olmayan tüm fraksiyonlar havuzlanir. 2%94 olan bir safligi olan ancak 2%4 olan bir tek safsizliga sahip olmayan tüm fraksiyonlar havuzlanir. 200 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen nihai malzemenin analizinden elde edilen QC verileri, RP-HPLC ile AUXII ara-ürünün %99,4 saf oldugunu, AUXI ara-ürününün Bundan dolayi, havuzlama prosesi için belirtilen kriterlerin nihai malzeme için salim spesifikasyonlarini geçen malzeme ile sonuçlanmasi beklenecektir. 200 L'Iik gösterim çalismasi Önceden bahsedilen 20 L'Iik gösterim çalismasi için belirtilen kriterler 200 L'Iik mühendislik çalismasi için uygulanandan farklidir. Bu durumda, havuzlama 2%86,5 olan bir safligi olan ancak 2%10 olan bir tek safsizlik kontaminantina sahip olmayan fraksiyonlar olarak hem AUXI hem de AUXII ürünleri için belirtilmistir. SEC-HPLC ile saptanan 2%2 olan bir safsizlik düzeyi olan AUXII örnekleri de dâhil edilmemistir. Elde edilen AUXI/AUXII ara-ürünleri ve etkin madde ayrica, bir standardize edilmis yöntem kullanilarak, dansitometri ile de analiz edilmistir ve bunlarin bir tek jelin 3 kere (3 farkli operatör) analizine dayanarak asagidaki tahmin edilen safliga sahip oldugu kDa'Iik kontaminantin %1 ,2'si); DS = %97,6 (90 kDa'Iik kontaminantin %2,1'I). Buna ek olarak, ara-ürünlerin ve etkin maddenin QC ile belirlenmis safliginin spesifikasyonu geçtigi RP-HPLC analizi ile gösterilmistir (AUXI = %982; AUXII = edilen havuzlama kriterleri güncel mevcut analitik yöntemlere göre uygun safliktaki ürünü aktarmada basarili olmustur. Malzemeler ve Yöntemler Mustang& Kromatografisi (20 L'Iik ölçekte calisma_)_ Ekipman: Mustang Q Kromatografisi Kapsülü, 60 mL (CL3MSTGQP1. Pall) Iletkenlik ve pH Ölçer Kimyasallar: Sodyum klorür (USP gradinda, Merck) Sodyum hidroksit çözeltisi (volümetrik 4 M) (AnaIaR, BDH) Tris (hidroksimeti) metilamin (USP gradinda, Merck) Amonyum sülfat (Extra Pure, Merck) Hyclone Enjeksiyonluk Su - Kaliteli Su (WFI-QW) Bir 60 mL'Iik yatak hacmindeki Mustang Q kromatografisi kapsülü 30 mL/dakika olan bir akis hizinda 30 dakika boyunca 1 M naOH ile sanitize edilmistir. Kapsül akabinde 1 M NaCI kullanilarak ayni zaman ve akis-hizi için önceden-sartlandirilmistir. Kapsül 60 mL/dakika olan bir akis hizinda, 2 L Mustang Q Denge tamponu (10 mM Tris, 1 M amonyum sülfat, pH 8), ile dengelenmistir. Çikis akisi pH'in S8 olmasini garantilemek için kontrol edilmistir. (0,2 um ile filtrelenmis olan) 200 L'Iik PP3 fermantasyonundan elde edilen süpernatant (22 L) 540 mL/dakika olan bir akis hizinda (yaklasik olarak 40 dakikalik süre boyunca) kapsüle yüklenmistir. Kapsül için tavsiye edilen maksimum çalisma akis hizi 600 mL/dakika'ir. Filtrelenmis malzeme 2-8°C'de gece boyu 2 x 10 L Stedim torbalar içinde saklanmistir. Hidrofobik etkilesim kromatografisi (20 L'Iik ölçekte çalisma) Ekipman: Unicorn V Vantage S130 kolonu (125 cm2'lik enine kesitsel alan, Millipore) Iletkenlik ve pH Ölçer Sartopore 2 0,8+0,45 um'lik filtre kapsülü (Sartorius) Tibbi Buzdolabi Ünitesi MP Kimyasallar: Fenil Sefaroz 6 FF düsük sub (GE Healthcare) Sodyum hidroksit çözeltisi (volümetrik 4 M) (AnalaR, BDH) Sodyum klorür (USP gradinda, Merck) Tris(hidroksimetil)metilamin (USP gradinda, Merck) Amonyum sülfat (Extra Pure, Merck) Hyclone Enjeksiyonluk su - Kaliteli Su (WFI-QW) HIC kolonu dolgulamasi bulamaç 3 saat boyunca çökeltilmistir ve etanol uzaklastirilmistir ve 1800 mL WFI ile degistirilmistir. Ortam yeniden-bulamaç hâline getirilmistir (%50), çökeltilmistir ve yikamalar arasinda gece boyu çökeltme ile, WFI ile bir kere ve 1800 mL 200 mM NaCI ile iki kere yikanmistir. Ortamlar 1800 mL 200 mM NaCI ile yeniden-bulamaç hâline getirilmistir, kolona dökülmüstür ve 1 saat boyunca bunlarin çökmesine izin verilmistir. Adaptör (tüm hava baloncuklari uzaklastirilarak) reçine yataginin ~1 cm üstüne indirilmistir ve ortamlar olan bir akis hizinda 10 dakika boyunca 200 mM NaCl içinde dolgulanmistir. Bu dolgulama akis hizindan GMP'de mevcut K-prime sistemi için maksimum çalisma akis hizina es-deger olarak yararlanilmistir. Adaptör yatagin üst kismina indirilmistir ve kolon adaptör reçinenin üst kismina vidalanmadan ve bu sirada reçinenin herhangi bir kompresyonunun gözlemlenmedigi bir ilave 10 dakika boyunca 192 cm/saatte dolgulanmadan önce 10 dakika boyunca 192 cm/saatte dolgulanmistir. Dolgu testi AKTA Pilot yöntemi kullanilarak gerçeklestirilmistir: HIC 1500 mL Dolgu Testi. Bunun için, kolon WFI içinde 1 kolon hacmi (CV) 200 mM NaCl ile dengelenmistir NaCl ile dolgu test edilmistir. Kolon 2 CV WFI ile çalkalanmistir ve 2 CV 10 mM NaOH ile saklanmistir. Dolgulanmis kolon 1,2 olan bir simetriye, 2659 plaka/metre olan bir plaka sayimina, 1525 mL olan bir CV'ye ve 12,2 cm olan yatak yüksekligine sahiptir. Kolon sanilizasyonu ve dengelenmesi Fenil Sefaroz 6 FF (düsük sub) kolonu 60 dakika boyunca 0,5 M NaOH ile sanitize edilmistir, 2 kolon hacmi (CV) WFI ile yikanmistir ve 5 CV 10 mM Tris, pH 8 (HIC Tamponu B) akabinde 5 CV 10 mM Tris, 1,0 M amonyum sülfat, pH 8 (HIC Tamponu A) ile dengelenmistir. HIC yüklemesinin preparasyonu muamelesinden sonra 22,1 kg fermantasyon filtratina eklenmistir (bölüm 3.1). Filtrat bir 0,05 m2'lik filtre kapsülü (O,8+0,45 pm) vasitasiyla filtrelenmeden önce 5 dakika boyunca karistirilmistir. Filtrelenmis malzeme (HIC yükleme malzemesi olarak gösterilmistir) kullanilana kadar (yaklasik olarak 30 dakikalik süre boyunca) buz Üzerinde saklanmistir. HIC kolonu çalismasi HIC çalismasi 2-8°C'de idame ettirilen sogutulmus tamponlar kullanilarak 150 cm/saat olan bir sabit lineer akis hizinda gerçeklestirilmistir. 30 L'lik besin stoku (20 L'lik Mustang Q-sonrasi filtrata es-degerdir) önceden 2 CV 10 mM Tris, 1,0 M amonyum sülfat, pH 8, (HIC Tamponu A) ile dengelenmis 1525 mL Fenil Sefaroz 6 FF (düsük sub) kolonu üzerine yüklenmistir. Baglanmamis malzeme 10 CV HIC Tamponu A ile kolondan yikanip akitilmistir. Kolon akabinde 5 CV 10 mM Tris, 0,3 M amonyum sülfat, pH 8, (HIC Tamponu A2) ile yikanmistir ve baglanmis proteinler 10 CV 10 mM Tris, pH 8 (HIC Tamponu B) ile ayristirilmistir. Elüsyon tamponunun ilk dökülmüstür ve 4 CV'Iik bir HIC-sonrasi havuz toplanmistir. Löpeptin (, 10 mM Iöpeptin, 10 mM Tris, pH 8, olan bir stok çözeltisinden 200 pM'Iik bir nihai konsantrasyona kadar HIC-sonrasi havuza (6191,3 g) eklenmistir. Karma çözelti (6,3 kg) tegetsel akisli filtrasyon ile ilave islemeden önce 2-8°C'de 2 gün boyunca saklanmistir. T_egetsel Akisli Filtrasyon adimi 1 (TFF1 20 L'Iik ölçekte çalisma) Ekipman: ProFIux M12 TFF sistemi (Millipore) Iletkenlik ve pH ölçer Sartopore 2 O,8+0,45 um'lik filtre kapsülü (Sartorius) Pellicon 2 "Mini" Filter Tibbi Buzdolabi Ünitesi MP Malzemeler/Kimyasallar: Sodyum hidroksit çözeltisi (volümetrik 4 M) (AnalaR, BDH) Tris(hidroksimetil)metilamin (USP gradinda, Merck) Hyclone Enjeksiyonluk Su Kaliteli Su (WFl-QW) Sistem hizlandirma ProFIux M12 TFF sistemi, 60 dakika boyunca 0,5 M NaOH ile sanitize edilmis ve kullanilana kadar 0,1 M NaOH içinde saklanmis, iki Pellicon 2 "Mini" Filter 30 kDa'Iik MWCO PES membranlari ile üreticinin talimatlarina göre düzenlenmistir. Sistem tahliye edilmistir ve 14 L WFI ile çalkalanmistir ve normal su geçirgenligi (NWP) 25°C'de 15 psig (20 psig olan giris basinci ve 10 psig olan çikis basinci) olan bir trans-membran basincinda (TMP) 23 L/mzlsaat/psi olarak ölçülmüstür. Sistem 0,5 L 10 mM Tris, pH 8, (diyafiltrasyon tamponu) ile çalkalanmistir ve 10 dakika boyunca ayni tamponun 1 L'si ile dengelenmistir. Süzüntünün Iletkenligi ve pH'i belirlenmistir ve membranlarin kullanilmadan önce dengelenmis oldugunu garantilemek için diyafiltrasyon tamponununkine karsi kontrol edilmistir. Konsantrasyon ve diyafiltrasyon Konsantrasyon ve diyafiltrasyon adimlari 200 uM löpeptin içeren sogutulmus diyafiltrasyon tamponu (10 mM Tris, pH 8) ile gerçeklestirilmistir. TFF sistemi kullanimdan hemen önce 1 L sogutulmus tampon ile çalkalanmistir. HIC-sonrasi malzemenin 2 L'si (6,3 L toplam hacim) TFF sistemi rezervuarina pompalanmistir ve membrani sartlandirmak için geri-basinç olmadan 10 dakika boyunca yeniden devir daim yaptirilmistir. Rezervuar üzerindeki düzey sensörü 1,2 L'ye ayarlanmistir ve HIC- sonrasi malzeme, tüm malzeme sisteme girene kadar, 15 psig (20 psig olan giris basinci ve 10 psig olan çikis basinci) olan bir TMP'de konsantre edilmistir. Süzüntü toplanmistir ve analiz için 2-8°C'de saklanmistir. Giris tüpleri diyafiltrasyon tamponuna baglanmistir ve malzemenin diyafiltrasyonu yaklasik olarak için psig (20 psig olan giris basinci ve 10 psig olan çikis basinci) olan bir TMP'de gerçeklestirilmistir böylece rezervuar içinde malzemenin hacmi 1,2 L'de idame ettirilmistir. Süzüntünün iletkenligi ve pH'i 5, 7 ve 8.5 TOV'dan sonra belirlenmistir ve diyafiltrasyon tamponununkine karsi kontrol edilmistir. Süzüntü sistemden tahliye edilmistir ve 2-8°C'de saklanmistir. 250 mL diyafiltrasyon tamponu rezervuar içine pompalanmistir, sistemi durulamak için geri-basinç olmadan 10 dakika boyunca sistem etrafinda yeniden devir daim yaptirilmistir, tahliye edilmistir, durulama tekrarlanmistir ve her iki durulama 2-8°C'de ayri ayri saklanmistir. Süzüntünün ve durulamalarin protein konsantrasyonu (UV ile) belirlenmistir ve (204,8 9 agirligindaki) birinci durulama (1231,4 g agirligindaki) süzüntüye eklenmistir. Bu TF1 sonrasi malzeme (1,4 kg) bir Sartopore 2 0,8+O,45 um'lik filtre kapsülü vasitasiyla filtreden geçirilmistir ve O Sepharose iyon degisim kromatografisi ile ilave islemeye kadar 2-8°C'de gece boyu saklanmistir. Ivon Degisim Kromatoqrafisi (20 L'lik ölçekte calisma) Ekipman: Unicorn Iletkenlik ve pH Ölçer Vantage 890 Kolonu (62 cm2'lik enine kesitsel alan, Millipore) Tibbi Buzdolabi Ünitesi MP Kimyasallar: Sodyum hidroksit çözeltisi (volümetrik 4 M) (AnalaR. BDH) Sodyum klorür (USP gradinda, Merck) Tris(hidroksimetil)metilamin (USP gradinda, Merck) Kalsiyum klorür 2-hidrat (USP gradinda, Merck) Löpeptin (MP Biomedicals, Inc.) Hyclone Enjeksiyonluk Su - Kaliteli Su (WFI-QW) Bir Vantage 890 kolonu bir 10 cm'lik yatak yüksekligi bundan dolayi 620 mL'Iik bir kolon hacmi (CV) olan bir dolgulanmis kolon vermesi için WFI içinde Q Sepharose HP ortamlari ile bir AKTA Pilot kromatografi sistemi kullanilarak dolgulanmistir. Dolgulama üreticinin talimatina uygun sekilde ancak 210 cm/saat olan bir dolgulama akis hizina ve 0,28 MPa olan basinç sinirina esit olan empoze edilmis Vantage kolonu basinç siniri ( ile gerçeklestirilmistir. Dolgulamadan sonra, kolon 2 CV 0,2 M NaCI ile dengelenmistir ve 100 cm/sa ( 1 M NaCI ile dolgu test edilmistir. Dolgulanmis kolon, ortamlar için spesifikasyon içinde simetriye ve 12605 plaka/metre olan bir plaka sayimina sahiptir. Kolon gerekli olana kadar 10 mM NaOH içinde saklanmistir. Kullanimdan önce, Q Sepharose kolonu saklama tamponunu uzaklastirmak için 1,5 kolon hacmi (CV) WFl ile yikanmistir, yine 1,5 CV WFI ile çalkalanmadan önce 40 cm/saatte 60 dakika boyunca 0,5 M NaOH ile sanitize edilmistir. Kolon akabinde üreticinin talimatlarina uygun sekilde 2 CV 10 mM Tris, 3 mM kalsiyum klorür, pH 8, mM Tris, 3 mM C80I2, pH 8, ile yüklenmistir ve dengelenmistir. Kolon çalismasi Örnek kolona yüklenmeden hemen önce, kolon sogutulmus 10 mM Tris, 3 mM CaCI2, 2,55 mg/mL olan bir konsantrasyonda sogutulmus TFF 1 sonrasi malzemenin olan bir akis hizinda kolona yüklenmistir. Bu, ortamin her bir mL'si için 5 mg toplam protein olan bir kolon yüklemesine esittir. Ürünün yüklenmesini takiben, kolon 3 kolon hacmi (CV) IEX Tamponu A ile yikanmistir ve protein %0-40 elüsyon tamponu (A'dan B'ye) olan bir gradyan ile, 70,2 mI/dakika (68 ile ayristirilmistir. Elüsyon 280 nm'de ve 260 nm'de izlenmistir ve AUX Il'yi ve AUX l'i içeren iki ürün piki boyunca 100 mL'Iik fraksiyonlar toplanmistir. Fraksiyon toplama pikin dönüm noktasindan baslatilmistir ve arkadaki kösede pik yüksekliginin %25'ine kadar devam ettirilmistir. Toplamda 12 fraksiyon AUX II piki boyunca ve 15 fraksiyon AUX I piki boyunca toplanmistir. Kullanilan tamponlarin önceden-sogutulmus olmasina ragmen, Q Sepharose HP kromatografisi 18-23°C olan bir standart laboratuvar sicakliginda gerçeklestirilmistir. Fraksiyonlar, SDS-PAGE analizinden bir sonuç elde edilene kadar 2-8°C'de saklanmistir. 6 ila 12 arasindaki fraksiyonlar (pik 1) (örneklemeden sonra) 683 9 olarak belirlenmis hacim ve UV analizi ile 1,17 mg/mL olarak ölçülmüs konsantrasyon ile AUX (örneklemeden sonra) 796 9 olarak belirlenmis hacim ve UV analizi ile 1,08 mg/mL olarak ölçülmüs konsantrasyon ile AUX I kollajenazi olarak havuzlanmistir. Tegetsel Akisli Filtrasvon adimi 2 (TFF2 20 L'Iik ölçekte calisma) Ekipman: ProFlux M12 TFF sistemi (Millipore) Iletkenlik ve pH ölçer Pellicon 2 "Mini" Filter 90 mm'lik Filtre Birimi (1 L) Tibbi Buzdolabi Ünitesi MP Malzemeler/Kimyasal: Sodyum hidroksit çözeltisi (volümetrik 4 M) (AnaIaR, BDH) Tris(hidroksimetil)metilamin (USP gradinda, Merck) Sükroz (BP gradinda, Merck) Löpeptin (MP Biomedicals, Inc.) Hyclone Enjeksiyonluk Su - Kaliteli Su (WFI-QW) Frensius Kabi Enjeksiyonluk Su (WFI) Sistem hizlandirma ProFIux M12 TFF sistemi, 60 dakika boyunca 0,5 M NaOH ile sanitize edilmis ve kullanilana kadar 0,1 M NaOH içinde saklanmis, bir Pellicon 2 "Mini" Filtreli 30 kDa'lik MWCO PES membrani ile üreticinin talimatlarina göre düzenlenmistir. Sistem tahliye edilmistir ve 14 L WFI ile çalkalanmistir ve normal su geçirgenligi (NWP) 25°C'de 15 psig (20 psig olan giris basinci ve 10 psig olan çikis basinci) olan bir trans-membran basincinda (TMP) AUXl için kullanilan membran için 19,5 L/m2/saat/psi olarak ve AUXII için kullanilan membran için 25°C'de 14,5 L/m2/saat/psi olarak ölçülmüstür. Sistem 0,5 L 10 mM Tris, 60 mM sükroz, pH 8, (formülasyon tamponu) ile çalkalanmistir ve 10 dakika boyunca ayni tamponun 1 L'si ile dengelenmistir. Süzüntünün iletkenligi ve pH'i belirlenmistir ve formülasyon tamponununkine karsi kontrol edilmistir. Konsantrasyon ve formülasyon Konsantrasyon ve diyafiltrasyon adimlari AUXl'in ve AUXll'nin IEX sonrasi havuzlarinin her biri üzerinde ayri ayri gerçeklestirilmistir. Tüm adimlar 2-8°C'de idame ettirilen sogutulmus formülasyon tamponu (10 mM Tris, 60 mM sükroz, pH 8) kullanilarak gerçeklestirilmistir. TFF sistemi kullanilmadan hemen önce 1 L'Iik sogutulmus tampon ile çalkalanmistir. IEX-sonrasi havuz (AUXII'nin 683 g'lik agirligi ve AUXl'in 796 g'lik agirligi) TFF sistemi rezervuarina pompalanmistir ve membrani sartlandirmak için geri- basinç olmadan 10 dakika boyunca %10'Iuk pompa hizinda yeniden devir daim yaptirilmistir. Rezervuar üzerindeki düzey sensörü yaklasik olarak 400 mL'ye ayarlanmistir ve AUXl ve AUXII havuzu, rezervuar içindeki hacim yaklasik olarak 360- psig (20 psig olan giris basinci ve 10 psig olan çikis basinci) olan bir TMP'de konsantre edilmistir. Hedef hacim düsüsü konsantrasyon operasyonu sirasinda proteinde herhangi bir kayip olmadigini varsayarak ürün için 1,75 mg/mL olan bir teorik konsantrasyonu elde etmeye dayandirilmistir. Süzüntü toplanmistir ve analiz için 2- 8°C'de saklanmistir. Diyafiltrasyon operasyonu için giris tüpleri formülasyon tamponuna baglanmistir ve diyafiltrasyon 15 psig (20 psig olan giris basinci ve 10 psig olan çikis basinci) olan bir TMP'de gerçeklestirilmistir. Yaklasik olarak 12 devir hacmi (TOV) AUXII için ve 8,5 TOV AUXl için gerçeklestirilmistir böylece rezervuar içinde malzemenin hacmi ~400 mL'de idame ettirilmistir. Süzüntünün iletkenligi ve pH'i AUXlI için 12 TOV'dan sonra ve AUXl için 6, 7 ve 8,5 TOV'dan sonra belirlenmistir ve formülasyon tamponununkine karsi kontrol edilmistir. Süzüntü sistemden tahliye edilmistir ve 2-8°C'de saklanmistir. 250 mL formülasyon tamponu (geri-basinç olmadan) 10 dakika boyunca sistem etrafinda yeniden devir daim yapilmasi ile membranlardan rezidüel ürünü yikamak için kullanilmistir. Durulama çözeltisi tahliye edildikten sonra, bir ikinci yikama gerçeklestirilmistir hem durulama 1 hem de durulama 2, 2-8°C'de saklanmistir. Süzüntünün ve durulamalarin UV protein içerigi belirlenmesinden sonra, birinci durulama süzüntüye eklenmistir, karistirilmistir ve karisimin bir UV proteini konsantrasyonu belirlenmistir. AUXII için, ikinci durulamanin 122 g'i ayrica, 1,1 mg/mL olan bir teorik AUXII konsantrasyonu vermesi için Süzüntü arti durulama 1'e de eklenmistir. AUXI için, ikinci durulamanin 94 g'i, 1,1 mg/mL olan bir teorik AUXI konsantrasyonu vermesi için malzemeye eklenmistir. Hem AUXI hem de AUXII malzemesi bir Sinif II dedantör içinde bir 1 L'lik Nalgene 0,2 pm'lik filtre birimi vasitasiyla filtrelenmistir ve filtrelenme sonrasi protein konsantrasyonu belirlenmistir. AUXI ve AUXII ara-ürünleri 2-8°C'de saklanmistir. Protein konsantrasyonu belirlenmesi Absorbans Ekipman: DU8OO Spektrofotometre (Beckman) Proseste örnekler 220 ve 330 nm araliginda örneklerin bir UV taramasini gerçeklestirme ile UV spektrofotometrisi ile analiz edilmistir. Uygun tampon bir kör çözelti olarak kullanilmistir ve kör tamponun bir taramasi örnekleri taramadan önce gerçeklestirilmistir. Gerekli oldugunda, örnekler A250 < 1.0 AU'yu garantilemek için ayni tampon ile seyreltilmistir. Protein konsantrasyonlari (mg/mL) Beer-Lambert kuralina göre belirlenmistir, c = A/b.s, burada A, absorbanstir (A280-A330), b, yol uzunlugudur (1,0 cm) ve 8, proteinin ekstinksiyon katsayisidir. AUXI için 1,48 mg'1cm'1mL ve AUXII için katsayilari karistirilmistir. Bradford Analizi Malzemeler: Liyofilize edilmis BSA (1,4 mg/mL'ye hidratlanmistir) Kimyasallar: Protein Analizi Boya Reaktifi Konsantresi (500-0006, Bio-Rad) Bir BSA standart egrisi BSA'yi su ile bilinen konsantrasyonlara seyreltme ile hazirlanmistir. Bio-Rad protein analizi boya reaktifi bir parça konsantreyi dört parça su ile seyreltme ile hazirlanmistir. Test örnekleri su ile seyreltme ile hazirlanmistir. Aynen veya seyreltilmis 50 uL test örnegi bir küvete eklenmistir ve 2,5 mL seyreltilmis reaktif eklenmistir. Örnekler iki kopya hâlinde hazirlanmistir. Örnekler OD okunmadan önce dakika boyunca inkübe edilmistir. Protein konsantrasyonuna kiyasla ODsgsnm'nin standart egrisi bilinen konsantrasyondaki BSA çözeltilerinin OD595nm'sini ölçme ile elde edilmistir. Test örnekleri akabinde analiz edilmistir ve protein konsantrasyonu standart protein analiz egrisinden belirlenmistir. Mustang Q adimi sonrasi örnekleri daima, pigmentten gelen katkiyi standardize etmek amaciyla seyreltme olmadan analiz edilmistir. Bu durumda, seyreltilmemis Mustang Q sonrasi malzemenin 50 uL'sinden analizde yararlanilmistir. SDS-PAGE Analizi Ekipman: Xcell SureLock Mini-Cell Elektroforez Sistemi (Invitrogen) Elektroforez Güç Saglayicisi EPS 601, (Amersham Pharmacia Biotech) Rocky çalkalama platformu, (Scientific Laboratory Supplies) Kimyasallar: SDS-PAGE Yüksek Moleküler Agirlik Standartlari (161-0303, Bio Rad) Mark 12 Boyanmamis Standart (L05677, Invitrogen) Novex %8'Iik Tris-Glisin jelleri, Novex Tris-Glisin SDS Çalisma Tamponu (10x) (LC2675. Invitrogen) NuPAGE MES SDS Çalisma Tamponu (20x) (NP0002, Invitrogen) Novex Tris-Glisin SDS Örnek Tamponu (2x) (LC2676, Invitrogen) NuPAGE LDS Örnek Tamponu (4x) (NP0007, Invitrogen) NuPAGE Örnek indirgeme Ajani (10x) (NP0009, Invitrogen) Koloidal Mavi Boyama kiti (LCBO25, Invitrogen) Etilendiamintetra-asetik asit disodyum tuzu AnalaR R (BDH) Tris-Glisin Jel/eri Örnekler, 20 pl örnek Tamponu'na (2x), 4 ul indirgeme ajanina (10x) ve 4 ul 0,1 M EDTA'ya (10 mM'Iik nihai konsantrasyon elde etmek için) 12 pl örnek ekleme ile indirgeme SDS-PAGE'i için hazirlanmistir. Yüksek moleküler agirlik (HMW) belirteci 80 konsantre edilmis stok ekleme ile hazirlanmistir. Akabinde seyreltilmis HMW standardi alikuotlamadan ve müteakip jellerde kullanim için -20°C'de saklamadan önce 5 dakika boyunca 95°C'de isitilmistir. Kollajenazlar içeren örnekler (20 ul yükleme hacmi) boyunca 130 V'ta Tris-Glisin çalisma tamponu kullanilarak %8'lik Tris-Glisin jeller üzerinde dogrudan (yani, herhangi bir ön isi muamelesi olmadan) yürütülmüstür. Elektroforezden sonra, jeller üreticinin talimatlari uyarinca koloidal mavi boya reaktifi ile boyanmistir. Bis-Tris Jel/eri Örnekler, 7,5 i.il örnek tamponuna (4x), 3 i.il indirgeme ajanina (10x) ve 3 pl 0,1 M EDTA'ya (10 mM'Iik nihai konsantrasyon elde etmek için) 16-5 pl örnek ekleme ile indirgeme SDS-PAGE'i için hazirlanmistir. MARK 12 belirteci susuz (10 pl) eklenmistir. Kollajenazlar içeren örnekler (15 pl yükleme hacmi), ~40 dk boyunca 200 V'de her bir MES çalisma tamponu kullanilarak %4-12'lik Bis-Tris jeller üzerinde dogrudan (yani, herhangi bir ön isi muamelesi olmadan) yürütülmüstür. Elektroforezden sonra, jeller ya üreticinin talimatlari uyarinca koloidal mavi boya reaktifi ile boyanmistir ya da bir standart prosedür (GE Healthcare) kullanilarak gümüs ile boyanmistir. Ekipman: Xcell SureLock Mini-Cell Elektroforez Sistemi (Invitrogen) Elektroforez Güç Saglayicisi EPS 601, (Amersham Pharmacia Biotech) Rocky çalkalama platformu (Scientific Laboratory Supplies) Flatbed tarayici (Hewlett Packard) Malzemeler/Kimyasallar: NuPAGE Novex %4-12'Iik Bis-Tris jelleri, 1,0 mm, 12 kuyucuklu (NPOSZZBOX, NuPAGE MES SDS Çalisma Tamponu (20x) (NP0002, Invitrogen) NuPAGE LDS Örnek Tamponu (4x) (NP0007, Invitrogen) NuPAGE Örnek Indirgeme Ajani (10x) (NP0009, Invitrogen) Mark 12 Boyanmamis Standart (LC5677, Invitrogen) Koloidal Mavi Boyama kiti (L06025, Invitrogen) Etilendiamintetra-asetik asit disodyum tuzu (EDTA) (AnaIaR, BDH) Saflastirilmis su Indirgeme SDS-PA GE 'i 12'Iik Bis-Tris jeller üzerinde yürütülmüstür. Örnekler 8 pL Örnek Tamponu'na (4x), 3 pL Indirgeme Ajani'na (10x) ve 3,4 uL 0,1 M EDTA'ya 20 uL seyreltilmis IEX-sonrasi malzeme ekleme ile hazirlanmistir. Her bir örnegin, 15 uL'si karistirildiktan sonra (yani, herhangi bir isi muamelesi olmadan) dogrudan kuyucuga yüklenmistir ve 200 V'de 40 dk boyunca yürütülmüstür. Elektroforezden sonra, jeller üreticinin talimatlarina göre ancak boyama varyasyonunu azaltmak için bir sabitlenmis boyama süresi (10 dakika sabitleme, 5 saat boyama, saflastirilmis su ile 15-20 saat boyasindan-arindirma) ile Koloidal Mavi boya reaktifi ile boyanmistir. Jel taramasi ve dansitometri Jeller, tüm hava kabarciklarinin uzaklastirildigindan emin olunarak, 2 asetat levhasi arasina yerlestirilmistir, 600 dip rezolüsyonda bir düz-yatakli tarayicida taranmistir ve HP Image zone yazilimi ile görüntü kirpilmistir, yeniden-boyutlandiriImistir ve rengi düzeltilmistir. Görüntü Alpha EaseFC yazilimi ile bir 8-bitlik gri-ölçekte TIFF görüntüsüne dönüstürülmüstür ve protein bantlari QuantityOne jel belgeleme yazilimi (BioRad) kullanilarak analiz edilmistir. Arka-plan sübstitüsyonundan sonra, seçilmis bantlarin yogunluk pik alanlari her bir seritte ürünün (AUXI'in veya AUXII'nin) ve safsizligin (safsizliklarin) bagil yüzde degerlerine dönüstürülmüstür. Tampon kararliligi Ekipman: Peristaltik Pompa (Watson Marlow) Watson Marlow Peristaltik pompa tüpleri Iletkenlik ve pH ölçer Sartopore 2 300 (0,45/0,2 pm) filtre kapsülü (Sartorius) L'Iik gösterim çalismasi için tamponlar preparasyondan sonra. kullanimdan önce 2- kapsülü vasitasiyla filtrelenmistir. Tamponun büyük çogunlugu filtrelendiginde, geri kalan tamponun yaklasik olarak 75 ml'si önceden-etiketlenmis 125 mL'Iik PETG biyo- kaplara toplanmistir ve 2-8°C'de saklanmistir. Tampon preparasyonunun pH'i, iletkenligi, sicakligi ve tarihi kaydedilmistir. 20 L'Iik gösterim çalismasinin tamamlanmasi üzerine, tampon örnekleri soguk saklamadan geri alinmistir ve pH. iletkenlik ve görünüs için yeniden-test edilmistir. Test edilme zamaninda tamponun sicakligi da kaydedilmistir. N-ucu digiIeme analigi icin örneklerin warasvonu Ekipman: Elektroforez Güç Saglayicisi EPS 601, (Amersham Pharmacia Biotech) Xcell SureLock Mini-Cell Elektroforez Sistemi, (Invitrogen) Rocky çalkalama platformu, (Scientific Laboratory Supplies) Kimyasallar: Novex o/o8'lik Tris-Glisin Jeli, 1,5 mm, 10 kuyuouklu, (lnvitrogen) Yüksek Moleküler Agirlik Belirteci, (BioRad) NuPAGE Örnek Indirgeme Ajani (10x), (lnvitrogen) Novex Tris-Glisin SDS Çalisma Tamponu (10x), (lnvitrogen) Novex Tris-Glisin SDS Örnek Tamponu (2x), (lnvitrogen) Koloidal Mavi Boyama Kiti, (lnvitrogen) Etilendiamintetra-asetik asit disodyum tuzu (EDTA) (AnaIaR, BDH) Metanol, AnaIaR (BDH) Asetik Asit, AnaIaR (BDH) Enjeksiyonluk su (WFI) Saflastirilmis Su U-ucu dizilemeden örnekler hazirlanmistir ve önceden genel hatlariyla özetlendigi üzere %8'Iik Tris-Glisin jelleri üzerinde ayrilmistir. 40 kDa'Iik kontaminant (lEX sonrasi örneklerin her biri dizileme için yeterli malzeme saglamak amaciyla jelin 5 seridine yüklenmistir (Sekil 89). Bir önceki 20 L'Iik fermantasyondan (20 L, PP3), hem AUXI (fraksiyon B7 R2, CTL ile iliskili 90 kDa'Iik kontaminantlar için zenginlestirilmis IEX sonrasi fraksiyonlar da çok sayida seride yüklenmistir (Sekil 90). Elektroforezden sonra, keller üreticinin talimatlarina göre koloidal mavi boya reaktifi ile boyanmistir ve kontaminant bantlari kesip çikarilmistir ve N-ucu dizileme için Alta Bioscience (Birmingham University, UK) firmasina teslim edilmistir. 20 L'Iik gösterim çalismasindan 90 kDa'Iik AUXl iliskili kontaminant (CTL2006#0612H) da dizileme Için teslim edilmistir ancak herhangi bir veri elde edilmemistir. PROSES 3 'ÜN ÜRETIMININ ÖZETI Fermantasyon Clostridium histolyticum'dan kollajenazin üretimi için Phytone beslemeIi-seri fermantasyon prosesinin (Proses 2) Phytone peptonundaki serinden seriye degiskenlikte dolayi hayli degisken oldugu gösterilmistir. Bu nedenle. Proteoz Peptonu spesifik serisi 50 g/L'de kullanildiginda fermantasyon prosesinin güçlü ve yeniden- üretilebilir oldugunu göstermistir. Bununla birlikte, PP3'ün baska serileri 50 g/L'de kullanildiginda, büyük varyasyonlar kültivasyonlarin büyüme profillerinde görülmüstür. PP3'ün çesitli serilerinin destekleyecegi maksimum biyo-kütle konsantrasyonu bir küçük ölçekteki degerlendirmede degerlendirilmistir. Bu seriler bunlarin C. histolyticum'un sirasiyla yüksek veya düsük biyo-kütle konsantrasyonlarini destekleme yetisine göre "iyi" veya "kötü" olarak addedilmistir. Iki fermantasyon 10 g/L'de PP3'ün büyüme profilleri ve ürün verimleri göstermistir. Bu deney PP3'ün konsantrasyonunu 100 g/L'ye arttirmanin peptonda seriden seriye varyasyon ile iliskili problemi hafiflettigini göstermistir. 200 L'de bir ölçek büyütme fermantasyonu gerçeklestirilmistir. Fermantasyon PP3'ün optimize edilmis konsantrasyonunu (100 g/L'yi) kullanmistir. Fermantasyon basarili olmustur ve 5 L'Iik ölçekte gözlemlenen hem büyüme profilini hem de ürün verimini/kalitesini tekrarlamistir. Proses 2 için gelistirilmis hasat prosesi (filtrasyon ile berraklastirma) 200 L`Iik ölçek büyütme fermantasyonu sirasinda degerlendirilmistir. Hücre kültürü filtrasyon zincirinin herhangi bir blokaji olmadan var olan proses kullanilarak basarili bir sekilde berraklastirilmistir. Ham fermantasyon örneklerinde kollajenaz konsantrasyonunun kantifikasyonu Coomassie ile boyanmis Tris Glisin jellerinin dansitometri analizi kullanilarak iyilestirilmistir. Karistirilmis AUXI'in ve AUXll'nin bir standart egrisi fermantasyon örneklerinin seyreltmeleri ile yüklenmistir. Kollajenaz konsantrasyonu ve dansitometri pik alani arasindaki iliskinin örnek seyreltmelerinin araligi içinde lineer oldugu gösterilmistir. Akabinde örneklerde kollajenazin konsantrasyonlarinin bunlarin pik alani ve standart egri kullanilarak dis-degeri bulunmustur. Bu yöntem kollajenazin veriminin etmistir. Optimize edilmis PP3 fermantasyon prosesi, Phytone beslemeIi-seri prosesine kiyasla, bir daha yüksek biyo-kütle konsantrasyonu (OD600 7 birim) ve arttirilmis ürün verimi (280 - 350 mg/L toplam kollajenaz, kantitatif dansitometri ile) üretmistir. Fermantasyon filtrati Phytone prosesine kiyasla anlamli olarak daha az klostripain içermistir. AUXI:AUXII orani Proses 2'nin degerlendirilmesi sirasinda gözlemlenene kiyasla 1'e daha yakindir. Özet olarak, PP3 prosesi fermantasyonun ürün verimini, safligini (fermantasyon-sonrasi) ve yeniden-üretilebilirligini arttirmistir. Saflasti rma Proses 3 Cobra'da önceden gelistirilen prosesleri (Proses 2) iyilestirmek amaciyla bir hizlandirilmis zaman çerçevesinde gelistirilmistir ve GMP'de 20 L'Iik ölçekte yürütülmüstür. Prosese majör iyilestirmeler saflastirma prosedürünü basitlestirmek, güçlülügü kolaylastirmak ayni zamanda prosesi 200 L'ye ölçek büyütmeye daha uygun hâle getirmek amaciyla yapilmistir. Bu iyilestirmelerin ayrica proses validasyonuna yardimci olmak için kilit oldugu da düsünülmüstür. Proses 3, burada fermantasyonun bir tam 20 L'sinin saflastirildigi Clostri'dium histo/yticum'un bir 200 L'lik fermantasyonundan malzeme kullanilarak gerçeklestirilmistir. Malzeme fermantasyondan dogrudan islenmistir ve herhangi bir tutma adimi uygulanmamistir. Filtrasyonu takiben, küçük-ölçekteki deneyler bu prosedürü kullanarak (piko yesili analizi ile saptandigi üzere) dsDNA'nin azalmasini gösterdiginden, ürün bir Mustang Q filtreden geçirilmistir. Bununla birlikte, 20 L'Iik gösterim çalismasindan elde edilen proses-için örneklerin analizi dsDNA'da herhangi bir azalma göstermemistir; bu, bu adimin güçlülügünün ve uygulanmasinin ilave arastirma gerektirdigini öne sürer. 20 L'Iik çalisma ve önceki küçük-ölçekte deneyler için kullanilan parametrelerin bir karsilastirmasi, kapsül (üretici tarafindan tarif edilen 1000 olan bir katsayi ile büyük-boyutlandirildiginda, dsDNA uzaklastirmasi göstermistir. Karsilastirildiginda, 20 L'Iik çalismada kullanilan kapsül yaklasik olarak 177-296 olan bir kat sayi ile büyük-boyutlandirilmistir. Mustang Q kapsülünden elde edilen malzeme 2-8°C'de gece boyu tutulmustur. Proseste bu evrede alinan örnek malzemesi üzerindeki bir çevrimdisi kararlilik çalismasi, RT'de ve 37°C'de inkübe edilmis örnekler SDS-PAGE analizi ile gösterildigi üzere parçalanmaya yatkin oldugundan, bir düsük sicaklik idame ettirmenin proseste bu noktada ürün kararliligi için kilit oldugunu göstermistir. Mustang Q kapsülünden elde edilen ürün 1 M'lik bir nihai konsantrasyon saglamak için bir amonyum sülfat çözeltisinin (3 M) eklenmesi ve karistirilmasi ile hidrofobik etkilesim kromatografisi (HIC) için hazirlanmistir. Bu, kollajenazin Fenil Sefaroz FF (düsük sub) ortamlari baglamasi için uygun kosullar saglamistir. Akabinde protein kontaminantlarinin ve pigmentin bir orani 0,3 M'lik amonyum sülfatin bir adim elüsyonu akabinde herhangi bir amonyum sülfat içermeyen bir çözelti ile kollajenaz ürünü elüsyonu kullanilarak HIC kolonundan ayristirilmistir. Ürün pikinin toplanmasi için kriterler (Bunun daha sonra 200 L'Iik ölçekte gösterim çalismasi için 5 kolon hacmine uzatilmasina ragmen) 4 kolon hacmi olan bir sabitlenmis hacim olarak belirlenmistir. Akabinde, elüsyonu hemen takiben Iöpeptin eklenmistir ve malzeme 2-8°C'de 2 günlük bir periyot boyunca tutulmustur. Besin stokunun kompleks dogasindan dolayi bu adimdan elde edilen verimi dogru bir sekilde belirlemek zordur. Proses adim verimi (i) yüklemenin Bradford analizine veya ayristirilmis malzemenin UV'sine göre %38 veya (ii) dansitometri ile tahmin edilen yükleme içindeki kollajenaz içerigine veya ayristirilmis malzemenin UV'sine göre %47 olarak tahmin edilmistir. Alternatif olarak, 0,17 9 toplam protein uygulanan fermantasyon filtratinin her bir 1 L'sinin es-degeri için HIC kolonundan ayristirilmistir. HIC sonrasi havuz 2 x 0,1m2'lik 30 kDa'Iik membranlar kullanilan tegetsel akisli filtrasyon (TFF1) kullanilarak konsantrasyon (5-kat) ve tampon degisimi ile Q-Sefaroz saflastirma için hazirlanmistir. Bu adim boyunca herhangi bir kayip saptanmamistir ve geri-kazanilan proteinde bildirilen artis prosesin bu noktasinda UV'nin dogru olmamasini yansitabilir. Dogru olmama pigment kontaminasyonuna veya büyük olasilikla proteinlerin bir kompleksi bulundugunda, saflastirmada daha önceki malzeme için daha az dogru olacak olan, kollajenazlar için ekstinksiyon katsayisinin kullanimina atfedilebilir. TFF adimi malzemeyi 2-8°C'de gece boyu tutmadan önce bir ürün filtrasyon adimi ile tamamlanmistir. Proses 2 ile oldugu gibi, Q-Sefaroz kolonu Proses 3'teki bir kilit saflastirma adimidir ve AUXI ve AUXII kollajenazlarinin ayrilmasi ile sonuçlanmistir. Bununla birlikte, Proses 3 ile iliskili kontaminantlar proses 2'dekilerden farklidir ve bunlarin AUXl ve AUXlI ürünleri ile yakin bir sekilde birlikte-saflastigi görülmüstür. Bununla birlikte, kontaminantlarin her iki pikin de öndeki veya arkadaki köselerinde ayristigi görüldügünden, kontaminantlari ürün piklerinin fraksiyonasyonu ile uzaklastirmak mümkündür. Kontaminantlar indirgeme SDS-PAGE'i üzerinde bunlarin bagil moleküler kütlesi ile gösterilmistir. AUXII ürünü (Q-Sefaroz kolonundan ayristirilan birinci pik) ile iliskili olanlar, (i) 40 kDa (pikin öndeki kösesi ile Iliskili) ve (ii) 75 kDa ve 90 kDa (pikin arkadaki kösesi ile iliskili) olarak tanimlanmistir. N-ucu amino asit dizileme, Col I dizisinin bir bölgesi ile dizi eslesmis özdeslikten dolayi, 40 kDa'un AUXII ile ilgili oldugunu göstermistir. Karsilastirildiginda, düsük sinyal problemlerinden olayi 90 kDallik kontaminant için herhangi bir özdeslik konfirme edilmemistir. AUXI ürünü (Q- Sefaroz kolonundan ayristirilan ikinci pik) ile iliskili kontaminantlar, (i) 55 kDa`dur (pikin öndeki kösesi ile iliskili) ve (ii) 90 kDa'dur (pikin arkadaki kösesi ile iliskili). Nu-ucu dizileme, hem 55 kDa'Iik hem de 90 kDa'Iik kontaminantlarin AUXI ile ilgili olarak tanimlandigini göstermistir, burada 55 kDa'Iik kontaminant Col G dizisinin bir orta bölgesi ile dizi özdesligi göstermistir ve 90 kDa AUXI'e özdes N-ucu eslesmesi göstermistir. Sonuç olarak, proseste bu evrede tanimlanan majör safsizliklarin tümü ürün ile ilgilidir ve ya AUXI'in (55 kDa) veya AUXll'nin (40 kDa) iç klevaj ürünleri ya da AUXI'in bir C-ucundan yarilmis ürünü (90 kDa) olarak tanimlanmistir. Q-Sefaroz kolonunu takiben, bir kilit proses adimi hangi fraksiyonlarin ilave saflastirma için ilerlemesi gerektigine iliskin karardadir. 20 L'Iik gösterim çalismasi için, bu kriterler ürüne kiyasla kontaminantlarin bagil boyama yogunluklarina dayandirilmistir. Karar sübjektiftir ve proses gelistirme grubunun kolektif tecrübesine ayni zamanda müsterinin talebine baglidir. Havuzlama prosedürünü tarif eden tanimlanmis kriterleri belirlemek amaciyla, SDS-PAGE üzerinde dansitometri gerçeklestirilmistir. Bundan, havuzlama, AUXI için 2%87 saf (2%10 olan herhangi bir tek safsizlik yok) ve AUXII için 2%94 saf (2%4 olan herhangi bir tek safsizlik yok) olan fraksiyonlari içeriyor seklinde tarif edilmistir. Bu AUXI ve AUXIl için sirasiyla %27,7 ve %25,8 olan UV tahminine göre bir adim verimi ile sonuçlanmistir. Dansitometri yönteminin ilave tasfiyesi ve standardizasyonu, müteakip GMP çalismasi için modifiye edilmis kriterlerin tanimi ile sonuçlanan, 200 L'Iik ölçekte gösterim çalismasindan edinilen verilerden saglanmistir. Q-Sefaroz kolonundan AUXI ve AUXII ürününü içeren fraksiyonlar her bir kollajenaz için 1 x ile ayri ayri formüle edilmistir. 10 mM Tris, 60 mM sükroz, pH 8, olan formülasyon tamponu KBI BioPharma Inc. tarafindan belirlenmistir. Ürün TFF2 adimini takiben filtrelenmistir ve TFF ve filtrasyon için toplam adim verimleri AUXI için %975 ve AUXII için %922 olarak tahmin edilmistir. Bu evrede örnekler ara-ürünler olarak ifade edilmistir ve QC analizi için 2-8°C'de ve etkin maddenin karistirilmasindan önce alikonulmustur. Bir retrospektif kararlilik çalismasi ara-ürünlerin SDS-PAGE, UV, RP-HPLC ve SEC-HPLC analizi ile belirlendigi üzere 2-8°C'de en az 5 günlük bir periyot boyunca kararligi oldugunu göstermistir. Ara-ürünlerde saptanan tek bozulma, bir 12 günlük tutulmadan sonra AUXII ara-ürününde tanimlanmistir, burada agregat düzeyleri %O'dan 0,62'ye yükselmistir. AUXl ve AUXII ara-ürünleri bir nihai ürün filtrasyonu gerçeklestirmeden önce etkin maddeyi üretmek için (UV ile belirlendigi üzere) esit oranda karistirilmistir. Etkin maddenin yalnizca 400 mg'i hazirlanmistir, bunun 200 mg'i her bir ara-ürünün 25 mg'i ile birlikte KBI BioPharma Inc. firmasina nakledilmistir. Toplam proses verimi burada fermantasyon besin stokunun 20 L'sinden mevcut tüm malzemenin islendigi ve tüm malzemenin etkin madde olarak karistirildigi varsayilan 20 L'Iik gösterim çalismasi için tahmin edilmistir. Bu 20 L'Iik ölçekte saflastirma için 1,6 9 etkin madde olan bir tahmin kestirilen verim vermistir. Bu o zaman HIC kolonuna yükleme için mevcut toplam proteinin miktari için (Bradford analizi kullanilarak) 9 9 olan ilk tahminin dogru varsayima göre %17,8 olan bir proses geri-kazanimina esittir. Alternatif olarak, toplam mevcut protein (dansitometri ile tahmin edildigi üzere) HIC yüklemesindeki kollajenaz içerigi ile ilgili oldugunda, toplam proses verimi %22 olarak hesaplanmistir. Proses çalismasina ek olarak, kararliligi degerlendirmek için prosesten alinan örnek ve tampon alikonmalari üzerinde bazi preliminer çalismalar gerçeklestirilmistir. Bu veriler, ürün için, düsük sicakligin parçalanmayi kontrol etmede bir kilit faktör oldugunu ve saflastirmadan erkenden (Q-Sefaroz kolonundan önce) alinan örneklerin proteolize daha yatkin oldugunu göstermistir. Bununla birlikte, bir ürün tutma çalismasi löpeptin ve sicaklik kontrolü (2-8°C) kombinasyonunun GMP prosesi için beklenilen zaman süreci boyunca ürün kalitesini idame ettirmede basarili oldugunu göstermistir. TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.
TR2019/03008T 2006-01-30 2007-01-30 Kollajen-aracılı hastalıkları tedavi etmek için uygun bileşimler. TR201903008T4 (tr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76347006P 2006-01-30 2006-01-30
US78413506P 2006-03-20 2006-03-20
US11/699,302 US7811560B2 (en) 2006-01-30 2007-01-29 Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201903008T4 true TR201903008T4 (tr) 2019-03-21

Family

ID=38328033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/03008T TR201903008T4 (tr) 2006-01-30 2007-01-30 Kollajen-aracılı hastalıkları tedavi etmek için uygun bileşimler.

Country Status (17)

Country Link
US (16) US7811560B2 (tr)
EP (6) EP1987141B8 (tr)
JP (8) JP5309289B2 (tr)
KR (2) KR20110046537A (tr)
CN (2) CN101400788B (tr)
AU (2) AU2007211313C1 (tr)
BR (1) BRPI0708017A2 (tr)
CA (1) CA2637262C (tr)
DK (2) DK2474321T3 (tr)
ES (3) ES2709202T3 (tr)
HU (2) HUE044220T2 (tr)
IL (6) IL291175B2 (tr)
MX (1) MX2008009756A (tr)
NZ (2) NZ593907A (tr)
PT (2) PT2474321T (tr)
TR (1) TR201903008T4 (tr)
WO (1) WO2007089851A2 (tr)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6958150B2 (en) * 1994-12-15 2005-10-25 Advance Biofactures Of Curacao, N.V. Reduction of adipose tissue
US20070224184A1 (en) * 2006-02-22 2007-09-27 The Research Foundation Of The State University Of New York Method for treating cellulite
US7811560B2 (en) * 2006-01-30 2010-10-12 Auxilium Us Holdings, Llc Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
US10071143B1 (en) 2007-05-03 2018-09-11 The Research Foundation For The State University Of New York Methods for non-surgical treatment of carpal tunnel syndrome
WO2009046168A1 (en) 2007-10-02 2009-04-09 Avaxia Biologics, Inc. Antibody therapy for use in the digestive tract
US20100159564A1 (en) * 2007-11-30 2010-06-24 Dwulet Francis E Protease resistant recombinant bacterial collagenases
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
EP2130551B1 (en) 2008-06-02 2012-06-06 Roche Diagnostics GmbH Improved purification of collagenases from clostridium histolyticum liquid culture
US8236356B2 (en) 2008-06-11 2012-08-07 Roche Diagnostics Operations, Inc. Growth medium for Clostridium histolyticum
JP5649589B2 (ja) * 2009-03-06 2015-01-07 ハロザイム インコーポレイテッド マトリックスメタロプロテアーゼ１の温度感受性突然変異体およびその使用
ES2385239B1 (es) 2010-09-30 2013-06-19 Proteos Biotech S.L.U. Uso de colagenasa g recombinante, colagenasa h recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.
US10119131B2 (en) * 2011-03-16 2018-11-06 Biospecifics Technologies Corp. Compositions and methods for producing clostridial collagenases
JP6049714B2 (ja) 2011-07-20 2016-12-21 メディウンド リミテッド 結合組織疾患の治療のためのブロメライン由来タンパク質分解抽出物
JP2014530873A (ja) * 2011-10-21 2014-11-20 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド Ｅｆｐの治療または低減方法
EP4772625A2 (en) * 2012-01-12 2026-07-08 Endo Biologics Limited Clostridium histolyticum enzyme
ITPD20120118A1 (it) * 2012-04-18 2013-10-19 Fidia Farmaceutici "nuovo processo di produzione e purificazione dell'enzima collagenasi da vibrio alginolyticus"
EP2844276B1 (en) 2012-05-01 2019-10-02 Proteolease Ltd. Methods for extracting a tooth
BR102012013110A2 (pt) 2012-05-31 2014-05-27 Cristalia Prod Quimicos Farm Meio de cultura para bactérias do gênero clostridium livre de componentes de origem animal e processo para produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica
US9636385B2 (en) 2012-10-24 2017-05-02 The Research Foundation For The State University Of New York Use of collagenase to treat glaucoma
WO2014107745A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Halozyme, Inc. Metal sensitive mutants of matrix metalloproteases and uses thereof
WO2014144859A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biospecifics Technologies Corporation Treatment method and product for uterine fibroids using purified collagenase
US20160000890A1 (en) 2013-03-15 2016-01-07 Biospecifics Technologies Corp. Thermosensitive hydrogel collagenase formulations
US10383875B2 (en) 2013-06-18 2019-08-20 Harrow Ip, Llc Pharmaceutical formulations of xanthine or xanthine derivatives, and their use
CA2915814A1 (en) * 2013-06-18 2014-12-24 Harrow Ip, Llc Local use of pentoxifylline to treat peyronie's disease
US10117892B2 (en) * 2013-08-29 2018-11-06 Allergan, Inc. Devices and methods for reducing the appearance of cellulite
CN103751102A (zh) 2014-01-15 2014-04-30 上海交通大学 一种胶原酶温敏水凝胶及其制备方法和应用
CN105412916B (zh) * 2014-09-19 2021-04-30 达森生物药业有限公司 治疗乳腺癌的组合物及其用途
CN105477628B (zh) * 2014-09-19 2021-04-30 山东蓝金生物工程有限公司 抗癌组合物及其用途
CN105412917B (zh) * 2014-09-19 2021-04-30 达森生物药业有限公司 治疗实体瘤的抗癌组合物及其用途
CN105477627B (zh) * 2014-09-19 2021-04-30 山东蓝金生物工程有限公司 治疗前列腺癌的组合物及其用途
DE202014105440U1 (de) * 2014-11-12 2016-02-15 Bilz Werkzeugfabrik Gmbh & Co. Kg Werkzeugaufnahme
KR101723168B1 (ko) * 2015-04-28 2017-04-05 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
US10303245B2 (en) * 2015-05-04 2019-05-28 Adobe Inc. Methods and devices for detecting and responding to changes in eye conditions during presentation of video on electronic devices
DK3589204T3 (da) 2017-03-01 2025-06-30 Endo Operations Ltd Apparat og fremgangsmåde til vurdering og behandling af cellulitis
KR20250171475A (ko) 2017-03-28 2025-12-08 엔도 오퍼레이션즈 리미티드 개선된 콜라게나제 생성 방법
WO2020021330A2 (en) 2018-07-12 2020-01-30 Endo Global Aesthetics Limited Injection techniques for the treatment of cellulite
CA3112437A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Endo Global Aesthetics Limited Compositions and methods for treating cellulite
MX2021008017A (es) 2019-01-06 2021-08-05 Endo Global Aesthetics Ltd Formulaciones de colagenasa y metodos de produccion de las mismas.
AU2020366008B2 (en) 2019-10-15 2025-08-28 Biospecifics Technologies Corp. Treatment of uterine fibroids using purified collagenase
WO2023131588A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 Nordmark Pharma Gmbh Culture medium for cultivating hathewaya histolytica (or clostridium histolyticum) and the production of one or more proteases
AU2023269738A1 (en) 2022-05-10 2024-11-21 Endo Global Aesthetics Limited Methods of reducing collagenase-mediated bruising in a subject having cellulite
CN116102638B (zh) * 2023-01-09 2025-05-16 中国农业科学院农产品加工研究所 基于亲和吸附富集骨胶原蛋白成骨活性肽的方法
WO2026028155A1 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Endo Biologics Limited Methods of treating plantar fasciitis
WO2026094005A1 (en) 2024-11-04 2026-05-07 Endo Biologics Limited Compositions comprising collagenase for use in treatment of plantar fasciitis

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61289885A (ja) * 1985-06-14 1986-12-19 Nitta Zerachin Kk コラゲナ−ゼおよびコラゲナ−ゼの製造方法
JP2898022B2 (ja) * 1989-09-05 1999-05-31 株式会社ニッピ コラーゲン分解酵素の製造方法
CA2047306A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-24 Milan Holjevac Mutant bacterium clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase
US5393792A (en) 1991-11-20 1995-02-28 Advance Biofactures Of Curacao, N.V. High dosage topical forms of collagenase
US5462739A (en) * 1991-11-21 1995-10-31 Yeda Research And Development Co., Ltd. Microdelivery device and method for enhanced drug administration to the eye
WO1994000580A1 (en) * 1992-06-22 1994-01-06 Trigen, Inc. Molecular cloning of the genes reponsible for collagenase production from clostridium histolyticum
JP3186881B2 (ja) * 1993-02-18 2001-07-11 倉敷紡績株式会社 肝細胞の分離方法
US5332503A (en) * 1993-04-16 1994-07-26 Baxter International Inc. Process for purifying collagenase
JP3028852B2 (ja) * 1994-06-24 2000-04-04 ロシュ ダイアグノスティックス コーポレーション ヒストリチクス菌から得られるコラゲナーゼおよび２つの他のプロテアーゼの精製混合物
US5589171A (en) 1994-08-22 1996-12-31 Advance Biofactures Of Curacao Treatment of Dupuytren's disease with collagenase
BR9607143A (pt) * 1995-03-16 1997-11-25 Knoll Ag Enzima ibtenível de clostridium histolyticum mistura de enzimas uso da mistura uso de enzimas colagenase hp na forma pura colagenase az na forma pura e elastase na forma pura
US5989888A (en) 1996-01-24 1999-11-23 Roche Diagnostics Corporation Purified mixture of collagenase I, collagenase II and two other proteases
WO1998022574A2 (de) 1996-11-19 1998-05-28 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante collagenase typ i aus clostridium histolyticum und ihre verwendung zur isolierung von zellen und zellverbänden
US5830741A (en) 1996-12-06 1998-11-03 Boehringer Mannheim Corporation Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from clostridium histolyticum and a neutral protease
US6086872A (en) 1997-03-27 2000-07-11 Advance Biofactures Of Curacao, Nv Amelioration of dupuytren's disease
JPH10262658A (ja) * 1997-03-28 1998-10-06 Kikkoman Corp ザルコシン・オキシダーゼの結晶、その製造方法及び三次元構造
US6022539A (en) 1999-06-03 2000-02-08 Advance Biofactures Of Curacao Amelioration of peyronie's disease
CA2447818C (en) * 2001-07-02 2011-01-04 Nordmark Arzneimittel Gmbh & Co. Kg Method for purifying an enzyme and purified enzyme produced according to this method, as well as use of the enzyme
EP1462519A1 (en) * 2003-03-24 2004-09-29 Boehringer Ingelheim Austria GmbH Method and devices for producing biomolecules
JP4205496B2 (ja) * 2003-06-19 2009-01-07 三菱化学株式会社 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
NZ576986A (en) * 2004-01-30 2010-12-24 Shire Pharmaceuticals Ireland Ltd Production and purification of recombinant arylsulfatase A
US7355027B2 (en) * 2004-06-16 2008-04-08 Dynport Vaccine Company Llc Bacillus anthracis protective antigen
EP1781697B1 (en) * 2004-07-07 2009-04-22 H.Lundbeck A/S Novel carbamylated epo and method for its production
EP1773400A2 (en) * 2004-07-08 2007-04-18 Amgen Inc. Therapeutic peptides
US20060204488A1 (en) * 2005-01-21 2006-09-14 Badalamente Marie A Methods for treating adhesive capsulitis
US7811560B2 (en) * 2006-01-30 2010-10-12 Auxilium Us Holdings, Llc Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases

Also Published As

Publication number Publication date
ES2729941T3 (es) 2019-11-07
CN101400788A (zh) 2009-04-01
JP5309289B2 (ja) 2013-10-09
US20110243908A1 (en) 2011-10-06
JP2017218452A (ja) 2017-12-14
WO2007089851A2 (en) 2007-08-09
IL192878A0 (en) 2009-02-11
PT2474321T (pt) 2019-07-25
JP6389493B2 (ja) 2018-09-12
DK1987141T3 (en) 2019-03-25
CN101400788B (zh) 2016-06-29
ES2992881T3 (en) 2024-12-19
AU2007211313C1 (en) 2014-05-22
DK2474321T3 (da) 2019-06-03
HUE041764T2 (hu) 2019-05-28
US20160000889A1 (en) 2016-01-07
EP2474321B1 (en) 2019-04-17
IL277322A (en) 2020-10-29
BRPI0708017A2 (pt) 2011-05-17
EP2474321A1 (en) 2012-07-11
IL264361A (en) 2019-02-28
JP6944989B2 (ja) 2021-10-06
EP1987141A4 (en) 2009-11-18
PT1987141T (pt) 2019-03-04
IL192878A (en) 2013-03-24
JP2012070758A (ja) 2012-04-12
CA2637262C (en) 2014-08-19
JP6851943B2 (ja) 2021-03-31
US20110243919A1 (en) 2011-10-06
IL254184A0 (en) 2017-10-31
CA2637262A1 (en) 2007-08-09
JP2018143258A (ja) 2018-09-20
US20140004094A1 (en) 2014-01-02
EP3508571B1 (en) 2024-08-21
EP3508571A1 (en) 2019-07-10
AU2007211313B2 (en) 2011-12-01
AU2012200863B2 (en) 2014-08-28
EP2474319A1 (en) 2012-07-11
WO2007089851A3 (en) 2008-01-03
US20240299508A1 (en) 2024-09-12
KR20110046537A (ko) 2011-05-04
KR20080093142A (ko) 2008-10-20
US20170087229A1 (en) 2017-03-30
JP7191152B2 (ja) 2022-12-16
IL277322B (en) 2022-04-01
JP2017006143A (ja) 2017-01-12
US20210106659A1 (en) 2021-04-15
US20110189153A1 (en) 2011-08-04
IL245434A (en) 2017-10-31
US20100233151A1 (en) 2010-09-16
JP6230200B2 (ja) 2017-11-15
NZ569882A (en) 2012-03-30
EP2474320A1 (en) 2012-07-11
CN105999244B (zh) 2022-01-11
US20110189163A1 (en) 2011-08-04
JP2009525283A (ja) 2009-07-09
EP1987141B1 (en) 2018-12-05
IL291175B2 (en) 2024-02-01
IL291175A (en) 2022-05-01
CN105999244A (zh) 2016-10-12
IL254184B (en) 2019-02-28
NZ593907A (en) 2013-02-22
ES2709202T3 (es) 2019-04-15
US20230158127A1 (en) 2023-05-25
US20100330065A1 (en) 2010-12-30
IL264361B (en) 2020-09-30
HUE044220T2 (hu) 2019-10-28
US7811560B2 (en) 2010-10-12
EP4483952A3 (en) 2025-04-02
US20110158972A1 (en) 2011-06-30
AU2007211313A1 (en) 2007-08-09
IL245434A0 (en) 2016-06-30
US20070224183A1 (en) 2007-09-27
EP1987141B8 (en) 2019-03-06
US20110243909A1 (en) 2011-10-06
MX2008009756A (es) 2008-12-18
EP1987141A2 (en) 2008-11-05
US20110243920A1 (en) 2011-10-06
AU2012200863A1 (en) 2012-03-08
JP6792596B2 (ja) 2020-11-25
EP4483952A2 (en) 2025-01-01
JP2020039371A (ja) 2020-03-19
JP2021113212A (ja) 2021-08-05
IL291175B1 (en) 2023-10-01
JP2015128447A (ja) 2015-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230158127A1 (en) Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
HK40122399A (en) Compositions suitable for treating collagen-mediated diseases
HK1125400B (en) Compositions suitable for treating collagen-mediated diseases
HK40011456B (en) Compositions suitable for treating collagen-mediated diseases
HK40011456A (en) Compositions suitable for treating collagen-mediated diseases