ES2710748T3 - Compuestos para tratar el bloqueo de la remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W - Google Patents

Compuestos para tratar el bloqueo de la remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende al menos un ligando anti-Env de MSRV/HERV-W y al menos un fármaco inhibitorio de radicales de Óxido Nítrico, en la que: - dicho ligando anti-Env de HERV-W es un anticuerpo, más particularmente un anticuerpo quimérico, modificado por ingeniería genética o humanizado, e incluso más particularmente una IgG, tal como una lgG1 o una lgG4, en la que dicho anticuerpo comprende cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que se presentan en las SEQ ID N.º 1, SEQ ID N.º 2, SEQ ID N.º 3, SEQ ID N.º 4, SEQ ID N.º 5, y SEQ ID N.º 6; - dicho fármaco inhibitorio de radicales de Óxido Nítrico se selecciona entre el grupo que consiste en Ng-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT) y fumarato de dimetilo (DMF).

Description

DESCRIPCION
Compuestos para tratar el bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W.
Sector de la tecnica
La presente solicitud se refiere a compuestos y composiciones innovadores para prevenir y/o tratar un mecanismo perjudicial recien descubierto, que bloquea la capacidad de reparacion de mielina endogena del sistema nervioso adulto (SN) en enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.
Estado de la tecnica
Este nuevo enfoque terapeutico combina una inhibicion de los efectos patogenicos cadena arriba de Env en celulas precursoras de oligodendrocitos (OPCs) junto con una inhibicion de los efectores finales cadena abajo de la patogenicidad de Env en la diferenciacion de OPC (radicales NO), que ahora se muestra que bloquean la remielinizacion de enfermedades asociadas con HERV-W que afectan al sistema nervioso.
La presente invencion se refiere a composiciones terapeuticas que comprenden (i) al menos un ligando anti-Env de HERV-W y/o (ii) al menos un farmaco inhibitorio de radicales libres de Oxido Nftrico (NO) para su uso para la prevencion y/o el tratamiento del bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion of protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.
La composicion, cuando se combina tanto con ligando como con farmaco(s) inhibitorio de NO, se dirige al inductor de Env cadena arriba asf como a los efectores de NO cadena abajo en este proceso recien descifrado produciendo el bloqueo de la remielinizacion en lesiones del SN.
Ademas, la accion sinergica de los dos tipos de compuestos (Env y NO de direccionamiento, respectivamente) aumenta la rapidez y la eficacia de una terapia en pacientes con lesiones no remielinizantes inducidas por la activacion de HERV-W (en particular cuando se asocia con el subtipo MSRV, aislado en partfculas de viriones de celulas MS1) y mediante la expresion de su protefna Env en el sistema nervioso.
El documento WO2010/003977A1 describe el tratamiento de enfermedades asociadas a MSRV usando el anticuerpo GNbACI dirigido contra la protefna MSRV-Env. El documento US2008/038279A1 describe el uso de anticuerpos de Env anti-MSRV/HERV-W o anticuerpos anti-TLR4 para el tratamiento de EM y esquizofrenia.
El documento WO2011/100589 describe la combinacion de DMF u otros derivados de acido fumarico y acetato de glatiramer o IFN-beta para el tratamiento de Esclerosis Multiple, Polineuropatfa Desmielinizante Inflamatoria Cronica (CIDP) y Leucoencefalopatfa Multifocal Progresiva (PML).
Objeto de la invencion
La presente invencion esta como se define en las reivindicaciones.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente divulgacion se refiere a un ligando anti-Env de HERV-W para su uso para la prevencion y/o el tratamiento del bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.
En la presente divulgacion, las expresiones "bloqueo de la diferenciacion", "bloqueo de la remielinizacion" u "obstruccion de la remielinizacion" se usan para resumir el fenomeno recien descubierto que consiste en (i) la inhibicion de la diferenciacion de Celulas Precursoras de Oligodendrocitos (OPCs) inducida por la protefna de envoltura HERV-W (en particular del subtipo MSRV), (ii) la produccion resultante de NO a partir de las OPC y (iii) la inhibicion resultante de la produccion de Mielina por las OPC, como se describe en el Ejemplo 1.
Las enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV se definen como enfermedades asociadas a HERV-W que afectan al sistema nervioso y mas particularmente, pero no de una manera limitante: Esclerosis Multiple (EM), mas particularmente Esclerosis Multiple Remitente-Recurrente (RRMS), la Esclerosis Multiple progresiva tal como Esclerosis Multiple Progresiva Secundaria (SPMS) o Esclerosis Multiple Progresiva Primaria (PPMS), Polineuropatfa Desmielinizante Inflamatoria Cronica (CIDP2), psicosis tales como Esquizofrenia y Trastorno bipolar6, en los que tan y se describe la alteracion de la mielina3-5.
De forma clasica, las lesiones por la esclerosis multiple (EM) se atribuyen a una perdida mediada por el sistema inmunologico de oligodendrocitos y vainas de mielina con dano axonal. Los efectos en las celulas inmunologicas que estan mediados por la protefna de envoltura (Env) del retrovirus asociado a la Esclerosis Multiple (MSRV) de la familia HERV-W de retrovirus endogenos en asociacion con lesiones inflamatorias del sistema nervioso (SN) se han descrito7. Sin embargo, una patogenicidad directa de MSRV-Env en celulas de la glia que implican el bloqueo de la remielinizacion de placas de EM por celulas precursoras de Oligodendrocitos (OPCs) se desconocfa previamente y nunca se habfa mostrado.
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgacion, la inhibicion de los efectos patogenicos cadena arriba de Env en celulas precursoras de oligodendrocitos (OPCs) se realiza usando un ligando anti-Env de HERV-W. El ligando anti-Env de HERV-W de la presente invencion se define por su capacidad para unirse a la protefna Env.
El termino "unir" o "que se une" al ligando se refiere a una interaccion o asociacion al menos temporal con o a un antfgeno diana, por ejemplo ENV, que comprende fragmentos del mismo que contiene un epftopo.
De acuerdo con la presente invencion, ENV de HERV-W se refiere a protefna codificada por el gen env de cualquier miembro de la familia HERV-W, incluyendo al subgrupo MSRV como se define a partir de las secuencias identificadas en ARN de partfculas retrovirales de EM14, 23
El ligando de la presente invencion es, un anticuerpo, dicho anticuerpo puede ser anticuerpo policlonal, monoclonal, oligoclonal, un anticuerpo quimerizado, modificado por ingenierfa genetica o humanizado o un anticuerpo humano. En un aspecto particular de la invencion, el anticuerpo que comprende el ligando es humanizado o una IgG humana, y mas particularmente una lgG1 o una lgG4.
Mas particularmente, el ligando de la presente invencion comprende cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen las secuencias de aminoacidos SEQ ID N.° 1, SEQ ID N.° 2, SEQ ID N.° 3, SEQ ID N.° 4, SEQ ID N.° 5 y SEQ ID N.° 6.
El ligando que se ha mencionado anteriormente comprende al menos una y mas preferentemente cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) codificadas por las SEQ ID N.° 25, SEQ ID N.° 26, SEQ ID N.° 27, SEQ ID N.° 28, SEQ ID N.° 29, SEQ ID N.° 30.
Como se ha indicado anteriormente, el bloqueo de la remielinizacion tambien da como resultado la produccion de NO a partir de las celulas OPC. A continuacion, de acuerdo con un aspecto adicional, la presente divulgacion Canning se refiere a un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico para su uso para la prevencion y/o el tratamiento del bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.
Las enfermedades asociadas con la expresion de ENV de HERVW son las que se han definido anteriormente. En un aspecto mas especffico de la invencion, un farmaco inhibitorio de radicales libres de Oxido Nftrico (NO), farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico o farmaco inhibitorio de NO es un farmaco que puede inhibir los efectos biologicos de moleculas de NO, tambien denominadas radicales NO. Los farmacos inhibitorios de NO se eligen entre Ng-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT), o fumarato de dimetilo (DMF).
La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que combina al menos un ligando de Env anti-MSRV/H ERV-W como se ha definido anteriormente y al menos un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico como se ha definido anteriormente. Esta composicion se va a usar para la prevencion y/o el tratamiento del bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV, siendo las enfermedades las que se han definido anteriormente.
El producto farmaceutico que contiene un ligando anti-Env de HERV-W como se ha definido anteriormente; y un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico como se ha definido anteriormente se consideran como un producto de combinacion para una administracion simultanea, separada o prolongada en el tiempo para la prevencion y/o el tratamiento del bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.
De acuerdo con los resultados que se describen a continuacion en modelos de raton de encefalomielitis alergica experimental (EAE) inducida por Env, se mostro un efecto sinergico de la combinacion de un ligando anti-Env de MSRV/H ERV-W con al menos una de estas moleculas de inhibicion de NO, en comparacion con cualquiera de estos agentes terapeuticos administrados solos. Incluso cuando se administra solo, el farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico o el ligando anti-Env de MSRV/H ERV-W muestran eficacia terapeutica con recuperacion de deficiencia clfnica que se sabe que esta asociada con las lesiones de mielina en EAE8. Sin embargo, la comparacion entre (i) farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico fue ligando anti-Env de MSRV/H ERV-W y la (ii) combinacion de al menos un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico y al menos un ligando anti-Env de MSRV/HERV-W pone en evidencia una gran ventaja del uso de esta combinacion en el transcurso del tratamiento. Por lo tanto, la ausencia de infiltrados y/o lesiones inflamatorios con actividad inflamatoria (por ejemplo, placas inactivas de EM) no excluye el tratamiento del bloqueo de la remielinizacion inducido por Env en pacientes afectados. Esto es de particular relevancia en pacientes con EM progresiva (formas progresivas primarias o secundarias) conocidas por tener numerosas lesiones sin actividad inflamatoria, que ya no muestran un aumento de gadolinio en la senal de formacion de imagenes por resonancia magnetica en la mayorfa de las lesiones cerebrales y de la medula espinal.
La presente divulgacion tambien describio un metodo para prevenir y/o tratar el bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV que comprende la administracion de al menos un ligando anti-Env de MSRV/HERV-W a un ser humano.
En un aspecto especffico, el metodo comprende adicionalmente la administracion de al menos un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico.
En otro aspecto, la divulgacion describio un metodo para prevenir y/o tratar el bloqueo de la remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV que comprende la administracion de al menos un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico a un ser humano.
Descripcion de las figuras
Figura 1. Deteccion de protefna Env y expresion del receptor TLR4 en tejido de EM. (A, B) La inmunohistoqufmica anti-Env desvelo protefna Env (flechas) en NAWM cerca de una lesion activa cronica (B) pero no en materia blanca del cerebro sano (A). (C) OPCs positivas para Olig2 en proximidad cercana a celulas de la microglia positivas para Env en el borde de una lesion activa cronica. (D-D'") Tejido cerebral de control sano con las celulas OPC positivas para PDGFRa presentando co-expresion de TLR4 (flechas). (E-E'") OPCs en NAWM cerca de una lesion activa de un paciente con EM que expresa tanto TLR4 como PDGFRa (flechas). Barras de escala: 50 pm.
Figura 2. Regulacion de la expresion de TLR4 durante la diferenciacion de OPC. (A) RT-PCR cuantitativa que muestra una regulacion negativa progresiva de la expresion de TLR4 durante la diferenciacion espontanea de OPC en trata en cultivo durante un periodo de nueve dfas. La expresion de GAPDH se uso como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar obtenida a partir de 3 experimentos independientes, ensayo t (***P < 0,001). (B, B') La inmunotincion anti-TLR4 demostro que despues de supresion de TLR4 mediada por ARN horquillado corto (ARNsh), las OPC transfectadas fueron desprovistas de expresion de TLR4 (flecha) asegurando la especificidad del anticuerpo. Las OPC mostradas se fijaron tres dfas despues de la transfeccion y las celulas transfectadas se marcaron con expresion de eGFP. Observar que las celulas sin transfectar vecinas eran positivas para TLR4. (C-D') Ejemplos representativos de las celulas OPC doble positivas para galactocerebrosido (GalC)/TLR4 despues de tres dfas (C, C) y las OPC doble positivas para (MBP)/TLR4 de protefna basica de mielina despues de seis dfas (D, D') de diferenciacion espontanea en cultivo. Las cabezas de la flecha en (D) apuntan a las OPC mas altamente diferenciadas que presentan solamente niveles reducidos de expresion de TLR4 reflejando de ese modo datos de expresion genetica que se muestran en (A). Las flechas indican celulas menos maduras que se expresan fuertemente.
Figura 3. Efectos proinflamatorios de Env recombinante en las OPC de rata cultivada. (A, B, C) Todas las estimulaciones de las OPC por Env recombinante en solucion (A, soluble en Env), Env recombinante unida a la superficie (B; Env solida) y Env unida a la membrana (C) expresada en celulas U343 de glioblastoma transfectadas con pV14Env (D-D') conducen a una fuerte induccion de expresion de iNOS despues de ocho horas de estimulacion en comparacion con los respectivos controles de tampon o con respecto a las OPC cultivadas en presencia de celulas U343 de glioblastoma transfectadas con pV14ctrl (E-E'). En la preparacion de Env recombinante, los niveles de endotoxina fueron < 5 EU/ml tal como se mide con el ensayo LAL. (D-E') Inmunotinciones de anti-Env de celulas U343 transfectadas con pV14Env y con pV14ctrl que desvelan expresion superficial de Env. (F-G') La morfologfa oligodendroglial tal como se evalua mediante 04 inmunotinciones permanece sin alterar despues de estimulacion con Env recombinante unira a la superficie mostrada despues de un dfa (F, F') asf como despues de cinco dfas (G, G') en cultivo. (H) Analisis espectrometrico indirecto de sobrenadantes de cultivo celular midiendo el nitrito producto de desintegracion de NO desvelo un aumento significativo de los niveles dependientes de la dosis de NO en muestras de OPC estimuladas con Env recombinante soluble durante 24 h. (I-K) Las citoquinas proinflamatorias tales como TNFa, IL-1p e IL-6 que se somete la regulacion positiva despues de estimulacion con Env recombinante unira a la superficie. GAPDH se uso como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar y representan 1 de 6 (A), 8 (B), 3 (C), 3 (H) y 8 (l-K) experimentos independientes, respectivamente, ensayo t (***P < 0,001). Barras de escala: 50 pm.
Figura 4. Comparacion de sensibilidad a Env de HERV-W en las celulas OPC de rata inmadura (un dfa de edad = OPC) y madura (siete dfas de edad; "OPCs maduras" u Oligodendrocitos = OL;). Ambos tipos de celulas se sometieron a estimulacion con 100 ng/ml de Env recombinante soluble. Aunque era significativa en comparacion con los controles de tampon iNOS y citoquina, la regulacion positiva despues de estimulacion con Env en los OLs es menos pronunciada en comparacion con las celulas OPC. La expresion de GAPDH se uso como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar y se obtienen a partir de uno de 3 experimentos representativos independientes, ensayo t (***P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05).
Figura 5. Reacciones dependientes de Env de las celulas OPC humanas. (A) La estimulacion de las celulas OPC humanas cultivadas con Env unida a la superficie (solida) y recombinantes soluble (soluble) condujo a una fuerte induccion de la expresion de iNOS despues de 24 h de estimulacion en comparacion con las celulas tratadas con tampon. La expresion de GAPDH se uso como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar y se obtienen a partir de uno de 3 experimentos representativos independientes, ensayo t (***P < 0,001). (B, B') Las tinciones con inmunofluorescencia de las celulas OPC humanas positivas para GalC cultivadas desvelan una fuerte senal para TLR4 (que se muestra despues de tres dfas en cultivo). Barras de escala: 50 pm.
Figura 6. Experimentos de neutralizacion de la ruta de Env. (A) La inactivacion por calor de Env recombinante condujo a una induccion genetica de iNOS en comparacion con la Env recombinante nativa despues de 8 h de estimulacion de las OPC. Ambas preparaciones, Env nativa y Env desnaturalizada (calentar Env) se aplicaron a una concentracion de 1000 ng/ml. (B, C) Reduccion de la expresion de iNOS en las OPC despues de inhibicion farmacologica de IRAK1/4 y TRIF, respectivamente. Despues de una etapa de incubacion previa de 2 h con el inhibidor I, IRAK1/43200 nM, o el peptido inhibitorio de TRIF 50 pM, las OPC se estimularon con Env recombinante unida a la superficie (solida) durante 8 h y posteriormente se sometieron a lisis. (D) Reduccion de la expresion de iNOS en las OPC despues de bloqueo mediado por anticuerpo del receptor de Env, TLR4. Despues de la etapa de incubacion previa de 2 h con anticuerpo anti-TLR4 a una concentracion de 15 pg/ml a 37 °C, las OPC se estimularon con rEnv solida durante 8 h y a continuacion se sometieron a lisis. La expresion de GAPDH se uso como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios /-desviacion estandar y se obtuvieron a partir de uno de 3 experimentos independientes representativos cada uno, ensayo t (***P < 0,001, **P < 0,01). (E) Aumento de la localizacion nuclear de NFkB despues de estimulacion de las celulas OPC con Env recombinante unida a la superficie (solida) durante 8 h. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar y se obtienen a partir de uno de 3 experimentos independientes representativos cada uno, ensayo t (***p < 0.001). (F-G') Inmunotinciones de NFkB representativas de las celulas OPC estimuladas con tampon (control) y con Env. Barras de escala: 50 pm.
Figura 7. Generacion de las celulas OPC positivas para 3-nitrotirosina (3-NT). (A) Las tinciones con inmunofluorescencia desvelaron que despues de 24 h de estimulacion con Env (Env recombinante unida a la superficie) una cantidad significativamente mayor de las celulas OPC expresaron el marcador de estres nitrosativo dependiente de NO, 3-NT, en comparacion con las celulas tratadas con tampon. Como control positivo se uso S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), un donante de NO fuerte. Sin embargo, cuando las celulas OPC se incubaron con L-NAME, una molecula inhibitoria de iNOS, a una concentracion de 100 pM durante 30 min a 37 °C antes de la estimulacion con Env, la positividad de 3-NT se redujo a niveles de control. El enantiomero inactivo D-NAME no pudo anular la induccion de 3-NT dependiente de Env. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar y se obtienen a partir de uno de 3 experimentos independientes representativos, ensayo t (***P < 0,001). (B-F') Inmunotinciones representativas de anti-3-NT de celulas de control (B, B'), celulas OPC estimuladas con Env (C, C), celulas OPC incubadas previamente con L-NAME (D, D'), D-NAME (E, E') y celulas OPC expuestas a SNAP (F, F'). Barras de escala: 50 pm. (G-G"') Las tinciones con inmunofluorescencia de secciones de tejido de NAWM en paciente con EM demostraron que las celulas OPC presidentes (marcadas por su expresion del marcador precursor PDGFRa, flechas) pueden experimentar estres nitrosativo tal como se desvela por su positividad para 3-NT.
Figura 8. Inhibicion dependiente de Env de diferenciacion de OPC. (A, B) Analisis de inmunofluorescencia que demuestra despues de un dfa y tres dfas de estimulacion con Env recombinante unida a la superficie, una numero significativamente reducido del numero de celulas OPC expresaban el marcador de mielina temprano CNPasa asf como el marcador de mielina tardfo MBPas en comparacion con celulas de control. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar y se obtienen a partir de uno de 4 experimentos independientes representativos, ensayo t (***P < 0,001). (C-C") y (D-D'") muestran inmunotinciones de anti-CNPasa y anti-MBP representativas de celulas OPC estimuladas con control y con Env. (E) La incubacion de las celulas OPC con L-NAME 100 pM en combinacion con Env recombinante unida a la superficie durante tres dfas condujo a la anulacion del bloqueo de la diferenciacion de OPC mediado por Env como se desvela mediante inmunotinciones anti-MBP. La aplicacion de D-NAME no fue capaz de rescatar la expresion de mielina. Los datos se muestran como valores medios /- desviacion estandar y se obtienen a partir de uno de 4 experimentos independientes representativos, ensayo t (***P < 0,001; n.s. no significativo). (F-H') Inmunotinciones de MBP representativas de celulas OPC estimuladas con Env solo, una combinacion de Env y L-NAME y una combinacion de Env y D-NAME, respectivamente. Barras de escala: 50 pm.
Figura 9. Expresion de marcadores de maduracion de OPC despues de 24 y 72 horas de estimulacion en labteks revestidos previamente con MSRV-Env. MSRV-Env revestido (+ Env-T) indujo una disminucion del porcentaje de OPC positivas para CNPasa despues de 24 horas de estimulacion (A), asf como una disminucion del porcentaje de o Pc positivas para MBP despues de 72 horas de estimulacion (B), cuando se compara con su tampon de dilucion (tampon). Los datos se presentan como Media ± ETM de un experimento evaluado en decaplicados (recuento de de 410 a 563 celulas por un grupo; *p < 0,05 ensayo t (A) y recuento de 364 a 491 celulas por grupo; *p < 0,001 ensayo de Suma de Rango de Mann-Whitney (B)).
Figura 10. Expresion de CNPasa en OPC humanas despues de 24 horas de estimulacion con MSRV-Env y GNbAcl.
(A) MSRV-Env induce una disminucion del porcentaje de OPC positivas para CNPasa despues de 24 horas de estimulacion. GNbACI a 50 nM o 200 nM inhibe totalmente el efecto de MSRV-Env, en ambos protocolos de tratamientos de GNbACI sometidos a ensayo (GNbAC1-A o GNbAC1-B). Los datos se presentan como Media ± ETM de 2 a 8 experimentos independientes (recuento de 705 a 3878 celulas por grupo). (B) GNbAC1 (50 nM o 200 nM) revestido solo o junto con BSA (1 pg/ml), en ambos protocolos de tratamientos de GNbAC1 sometidos a ensayo (GNbAC1-A o GNbAC1-B) no tiene efecto en el porcentaje de OPC positivas para CNPasa. Los datos se presentan como Media ± ETM de un experimento evaluado en decaplicados (recuento de 399 a 512 celulas por grupo; p > 0,05; ANOVA de una via).
Figura 11. Expresion de CNPasa en cultivos de OPC humanas despues de 24 horas de estimulacion con MSRV-Env y GNbACI anadidos al medio de cultivo. MSRV-Env (3 nM) diluido en el medio de cultivo celular disminuyen de forma significativa la expresion de CNPasa despues de 24 horas de tratamiento. GNbAC1 (200 nM) inhibe completamente este efecto, mientras que no muestra ningun efecto solo. Los datos se presentan como Media ± ETM de 2 a 4 experimentos independientes (recuento de 927 a 1913 celulas por grupo); *p < 0,001 con respecto a Tampon; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer).
Figura 12. Expresion de MBP en cultivos de OPC humanas despues de 72 horas de estimulacion con MSRV-Env y GNbACI. (A) MSRV-Env (Env-T) revestido induce una disminucion en el porcentaje de OPC positivas para MBP despues de 72 horas de estimulacion. GNbAC1 a 50 nM inhibe parcialmente el efecto de MSRV-Env, y esta inhibicion es completa a 200 nM, en ambos protocolos de tratamientos de GNbAC1 sometidos a ensayo (GNbAC1-A o GNbAC1-B). (B) MSRV-Env (3 nM) anadido en el medio de cultivo celular disminuyen de forma significativa la expresion de MBP despues de 72 horas de tratamiento. GNbAC1 (200 nM) inhibe completamente este efecto (B).
Los datos se presentan como Media ± ETM de (A) 2 a 8 experimentos independientes (recuento de 924 a 4156 celulas por grupo) *p < 0,05; **p < 0,001 con respecto a tampon; Wp < 0,001 con respecto a Env-T; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer, y de (B) 2 a 4 experimentos independientes (recuento de 1013 a 1834 celulas por grupo; * p < 0,001 con respecto a tampon; Wp < 0.001 con respecto a Env-T; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer).
Figura 13. Expresion de marcadores de maduracion de OPC despues de 24 y 72 horas de estimulacion con MSRV-Env y GNbACI revestidos. MSRV-Env revestido induce (A) una disminucion del porcentaje de OPC humanas positivas para CNPasa despues de 24 horas de estimulacion asf como (B) una disminucion del porcentaje de OPC humanas positivas para MBP despues de 72 horas de estimulacion. (A) GNbAC1 (200 nM) inhibe totalmente el efecto de MSRV-Env, en ambos protocolos de tratamientos de GNbAC1 sometidos a ensayo (GNbAC1-A o GNbAC1-B). Los datos se presentan como Media ± ETM de 6 experimentos independientes (recuento de 2805 a 3039 celulas por grupo; * p < 0,05 con respecto a tampon; Wp < 0,05 con respecto a MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Student Newman Keuls y (B) de 5 a 6 experimentos independientes (recuento de 1671 a 2066 celulas por grupo; *p < 0,05 con respecto a tampon; Wp < 0,05 con respecto a MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Dunn).
Figura 14. La inhibicion de la maduracion de OPC humanas inducida por MSRV-Env se revierte completamente con GNbACI.
MSRV-Env revestido (Env) induce (A) una disminucion del porcentaje de OPC humanas positivas para CNPasa despues de 24 horas de estimulacion asf como (B) una disminucion del porcentaje de OPC humanas positivas para MBP despues de 72 horas de estimulacion. GNbAC1 (200 nM) inhibe totalmente el efecto de MSRV-Env, en ambos protocolos de tratamientos de GNbAC1 sometidos a ensayo (+ GNbAC1 A o GNbAC1 B). Los resultados se expresan como el porcentaje de celulas positivas para CNPasa (A) o MBP (B) y representan la Media ± ETM de 8-14 experimentos independientes (recuento de 3600 a 6800 celulas por grupo (A) y recuento de 2700 a 5800 celulas por grupo (B)). *p < 0,05 con respecto a CTRL; Wp < 0,con respecto a MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Dunn.
Figura 15. La inhibicion de maduracion de OPC humanas inducida por MSRV-Env se revierte completamente con GNbACI (datos normalizados). MSRV-Env se revistio en portaobjetos de camaras de cultivo antes de sembrar las OPC. GNbAC1 (200 nM) se mezcla con MSRV-Env antes del revestimiento (GNbAC1-A) o se incuba en camaras de cultivos revestidas con MSRV-Env (GNbAC1-B). Los datos se cuantifican como el porcentaje de celulas positivas para (A) CNPasa o (B) MBP y se expresa como el porcentaje de cambio de la condicion de CTRL (Tampon MSRV-Env). Los resultados representan la Media ± ETM de 8-14 experimentos independientes (recuento de 3600 a 6800 celulas por grupo (A) y recuento de 2700 a 5800 celulas por grupo (B)). *p < 0,05 con respecto a CTRL; Wp < 0,05 con respecto a MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Dunn.
Figura 16. Cinetica de puntuacion cifnica de EAE los Grupos A, B, C y F (Controles positivos para EAE sin tratar con A, EAE tratada con B con 200 pg de GNbAcI, EAE tratada con C con L-NAME, EAE tratada con F con 200 pg de GNbAc L-NAME)
Figura 17. Cinetica de puntuacion cifnica de EAE los Grupos A, B, D y G (Controles positivos para EAE sin tratar con A, EAE tratada con B con 200 pg de GNbAcI, EAE tratada con D con SMT, EAE tratada con G con 200 pg de GNbAc SMT)
Figura 18. Cinetica de puntuacion cifnica de EAE los Grupos A, B, E y H (Controles positivos para EAE sin tratar con A, EAE tratada con B con 200 pg de GNbAcI, EAE tratada con E con DMF, Ea E tratada con H con 200 pg de GNbAc DMF)
Figura 19. Cinetica del Tiempo en Rotarod a 23 rpm
Eje X: Dias de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.
Eje Y: Aumento o perdida de tiempo en Rotarod, con respecto al Dfa -7.
A: Grupos A, B, "1 inyeccion" y "2 inyecciones" de Env; B: Grupos A, B, C y F;
C: Grupos A, B, D y G; D: Grupos A, B, E y H.
Figura 20. Cinetica del Tiempo en Rotarod a 26 rpm
Eje X: Dias de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.
Eje Y: Aumento o perdida de tiempo en Rotarod, con respecto al Dfa -7.
A: Grupos A, B, "1 inyeccion" y "2 inyecciones" de Env; B: Grupos A, B, C y F;
C: Grupos A, B, D y G; D: Grupos A, B, E y H.
Figura 21. Cinetica del Tiempo en Rotarod a 29 rpm
Eje X: Dias de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.
Eje Y: Aumento o perdida de tiempo en Rotarod, con respecto al Dfa -7
A: Grupos A, B, "1 inyeccion" y "2 inyecciones" de Env; B: Grupos A, B, C y F;
C: Grupos A, B, D y G; D: Grupos A, B, E y H.
Figura 22. Cinetica de puntuacion clfnica de EAE los Grupos A, B, C y D (Controles negativos para EAE simulados con A, Controles positivos para EAE sin tratar con B, EAE tratada con C con 200 pg de GNbAc, EAE tratada con D con 500 pg de GNbAc)
Figura 23. Cinetica de puntuacion clfnica de EAE los Grupos A, B, E y F (Controles negativos para EAE simulados con A, Controles positivos para EAE sin tratar con B, EAE tratada con D con SMT, EAE tratada con G con 200 pg de GNbAc SMT)
Figura 24. Cinetica de puntuacion clfnica de EAE los Grupos A, B, G y H (Controles negativos para EAE simulados con A, Controles positivos para EAE sin tratar con B, EAE tratada con E con DMF, EAE tratada con H con 200 pg de GNbAc DMF)
Figura 25. La cinetica de aumento de peso durante el periodo de estudio (Aumento de peso relativo en comparacion con el dfa antes de la primera inyeccion de inmunogenos): Grupos A, B, C y D (Controles negativos para EAE simulados con A, Controles positivos para EAE sin tratar con B, C- EAE tratados con 200 pg de GNbAc, EAE tratada con D con 500 pg de GNbAc)
Figura 26. La cinetica de aumento de peso durante el periodo de estudio (Aumento de peso relativo en comparacion con el dfa antes de la primera inyeccion de inmunogenos): Grupos A, B, E y F (Controles negativos para EAE simulados con A, Controles positivos para EAE sin tratar con B, EAE tratada con D con SMT, G- EAE tratados con 200 pg de GNbAc SMT)
Figura 27. La cinetica de aumento de peso durante el periodo de estudio (Aumento de peso relativo en comparacion con el dfa antes de la primera inyeccion de inmunogenos): A, B, G y H (Controles negativos para EAE simulados con A, Controles positivos para EAE sin tratar con B, EAE tratada con E con DMF, EAE tratada con H con 200 pg de GNbAc d Mf )
Figura 28. Cinetica del Tiempo en Rotarod a 16 rpm
Eje X: Dias de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.
Eje Y: Aumento o perdida de tiempo en Rotarod, con respecto al Dfa -7
A: Grupos A, B, C y D; B: Grupos A, B, E y F; C: Grupos A, B, G y H.
Figura 29. Cinetica del Tiempo en Rotarod a 26 rpm
Eje X: Dias de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.
Eje Y: Aumento o perdida de tiempo en Rotarod, con respecto al Dfa -7
A: Grupos A, B, C y D; B: Grupos A, B, E y F; C: Grupos A, B, G y H.
Figura 30. Cinetica del Tiempo en Rotarod a 29 rpm
Eje X: Dias de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.
Eje Y: Aumento o perdida de tiempo en Rotarod, con respecto al Dfa -7
A: Grupos A, B, C y D; B: Grupos A, B, E y F; C: Grupos A, B, G y H.
Figura 31. Cinetica de puntuacion clfnica de EAE de todos los grupos durante el periodo de estudio (Controles negativos para EAE simulados con A, controles positivos para EAE tratada de forma simulada con anticuerpos de Isotipo B, EAE tratada con C con 500 pg de GNbAc, EAE tratada con D con Fumarato Sodico y EAE tratada con E con 500 pg de GNbAc Fumarato Sodico)
Sumario de las abreviaturas usadas
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Descripcion detallada de la invencion
Ejemplo 1: El bloqueo de la remielinizacion inducido por la protefna de envoltura de la familia HERV-W (inhibe la diferenciacion de celulas precursoras oligodendrogliales en lesiones desmielinizadas del sistema nervioso.
1.1 Material y Metodos
1.1.1 Cultivo de celulas precursoras de oligodendrocitos
Las celulas precursoras de oligodendrocitos de rata (OPCs) se purificaron como se ha descrito anteriormente22. Las OPCs se mantuvieron en medio de proliferacion (medio Sato suplementado con 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico humano recombinante y 10 ng/ml de factor AA de crecimiento obtenido a partir de plaquetas humanas recombinantes; R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania), mientras que la diferenciacion se inicio con medio Sato suplementado con suero bovino fetal al 0,5 %. Las celulas precursoras de oligodendrocitos (hOPC) fetales humanas y los respectivos medios se adquirieron en 3H Biomedical, Uppsala, Suecia. La Env recombinante se produjo y se purifico en PX-Therapeutics (Grenoble, Francia) de acuerdo con las especificaciones de QC de GeNeuro (Ginebra, Suiza) que suministro los lotes de protefna. los niveles de endotoxina fueron < 5 EU/ml tal como se mide con el ensayo de lisado de amebocito Limulus (LAL). La estimulacion de Env se realizo usando tres enfoques diferentes usando i) protefna Env de longitud completa recombinante diluida en medio de diferenciacion a 10 ng/ml, 100 ng/ml y 1000 ng/ml, ii) protefna Env recombinante revestida sobre placas de cultivo celular a una concentracion superficial de 17,53 ng/cm2 y iii) mediante siembra de las OPC en celulas de glioblastoma U343 transfectadas que sobreexpresan Env, respectivamente. Los experimentos de estimulacion de control se realizaron usando la preparacion de tampon de Env recombinante (histidina 20 mM, sacarosa al 5 % (p/v), polisorbato 20 al 0,01 % (p/v), pH 6,0) a dilucion desiguales. Las mediciones de concentracion de NO en sobrenadantes de OPC se realizaron usando un kit de ensayo de oxido nftrico colorimetrico (Merck-Millipore/Calbiochem, Darmstadt, Alemania) y la absorbancia se determino 540 nm usando colector de placas Anthos 2001 (Anthos labtec instruments, Salzburgo, Austria). La evaluacion de la morfologfa de OPC se realizo usando un anticuerpo anti-O4 de Merck-Millipore/Chemicon, Darmstadt, Alemania) teniendo en cuenta el diametro celular y el grado de ramificacion del proceso. Los experimentos de inhibidor I de IRAK-1/4 (1-(2-(4-Morfolinil)etil)-2-(3-nitrobenzoilamino)bencimidazol, N-(2-Morfoliniletil)-2-(3-nitrobenzoilamido)-bencimidazol; SigmaAldrich, Hamburgo, Alemania) experiments se realizaron a una concentracion de 2400 nM, los experimentos de peptido inhibitorio de TRIF (Invivogen, San Diego, USA) se realizaron a una concentracion de 50 pM de acuerdo con los protocolos del fabricante. La inactivacion de Env se realizo por exposicion de Env recombinante a una temperatura de 123 °C durante 1 h. Los experimentos del bloqueo del receptor de anticuerpo TLR4 se realizaron a una concentracion de anticuerpo de 15 pg/ml. Los experimentos del bloqueo de L-NAME/D-NAME se realizaron a una concentracion de 100 pM cada uno; S-Nitroso-N-acetil-DL-penicilamina (SNAP) se uso a una concentracion de 100 ng/ml.
1.1.2 Precursor de Oligodendrocitos y Transfeccion de Celulas de Glioblastoma U343
Las OPCs se cultivaron durante 24 h en medio de proliferacion y la transfeccion se realizo usando el reactivo NanoJuice (Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania) usando un ARNsh que codifica vector de supresion de TLR4 basado en el vector HuSH 29 pGFP-V-RS (OriGene, Rockville, Maryland, USA) para prueba de especificidad del anticuerpo anti-TLR4. Para expresion de Env unida a membrana en celulas de glioblastoma U343, un vector de expresion de citrina9 para visualizacion de celulas transfectadas se combino con un vector de sobreexpresion de Env (pV14 vector con el nt 1 al nt 1629 de la secuencia de codificacion genetica de env de tipo HERV-W MSRV -GenBank AF331500.1 - suministrado por Geneuro SA, Suiza) en una proporcion de 1:5. Un vector vacfo correspondiente se uso como control. La transfeccion de celulas de glioblastoma U343 se consiguio usando Lipofectamina (Life Technologies, Darmstadt, Alemania).
1.1.3 Tinciones de Tejido de Esclerosis Multiple
Para tinciones dobles de Olig2/Env, se corto tejido de EM humano embebido en parafina fijado con formalina y secciones de 5 pm se desparafinizaron en xileno y se rehidrataron a traves de alcohol de calidad de laboratorio en agua destilada. La actividad de peroxidasa endogena se interrumpio por incubacion de los portaobjetos en peroxido de hidrogeno al 0,3 % en metanol. A continuacion dos portaobjetos se aclararon con agua destilada y se transfirieron a una solucion de Tris 10 mM, EDTA 1 mM (pH 9) para conseguir la retirada del antfgeno inducido por calor. A partir de ese momento, los portaobjetos se enfriaron a temperature ambiente, se aclararon en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron tanto con anticuerpo 3B2H4 tanto anti-Olig2 (1:300; Merck-Millipore) como anti-Env (1:500, GeNeuro, Ginebra, Suiza) durante una noche a 4 °C. A continuacion, las secciones se incubaron con anticuerpo de burro-anti-conejo etiquetado con Alexa 488 (1:400; Life Technologies/Molecular Probes, Darmstadt, Alemania) para detectar anticuerpos de cabra-anti-raton etiquetado con Olig2 y Alexa 555 para visualizar Env. Para dobles tinciones de TLR4/PGRFRa, se corto tejido congelado de forma instantanea y secciones de 5 pm se incubaron con anticuerpo anti-TLR4 (1:100; Merck-Millipore) y anti-PDGFa (1:50; eBiosciences, San Diego, California, USA) durante una noche a 4 °C. TLR4 se detecto usando anticuerpos de cabra-anti-raton etiquetado con Alexa 488 (1:400; Life Technologies/Molecular Probes) y PDGFRa con anticuerpo de conejo-anti-rata biotinilado (1:500; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y estreptavidina etiquetada con Alexa 647 (1:400; Life Technologies/Molecular Probes), respectivamente. Para tinciones nucleares, las secciones se incubaron con solucion de tincion de Hoechst (1:100; Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemania) durante 1 minuto y se cubrieron con Vectashield (Vector Laboratories). El analisis microscopico se realizo con un microscopio de barrido laser confocal TCS SP2 AOBS de Leica (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania).
1.1.4 Tinciones de Celulas Cultivadas
Las tinciones de celulas cultivadas fijadas con paraformaldehfdo se realizaron como se ha descrito anteriormente22. Los anticuerpos primarios se diluyeron como sigue a continuacion: anticuerpo anti-TLR4 (1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania), anticuerpo 3B2H4 anti-Env (1/500; GeNeuro, Ginebra, Suiza), anticuerpo anti-3'-fosfodiesterasa nucleotfdica 2',3'-cfclica (CNPasa) (1/1000; Covance, Princeton, New Jersey, USA), protefna basica anti-mielina monoclonal (MBP; 1/1000; Convance, Princeton, New Jersey, USA), anticuerpo de protefna basica antimielina policlonal (1:1000; Millipore, Schwalbach, Alemania), anticuerpo anti-galactrocerebrosido (GalC), anticuerpo anti-O4 (ambos a 1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania); anticuerpo anti-3-NT (1/1000; Abeam, Cambridge, MA, USA) y anticuerpo anti-NFicB (1/1000; Abeam, Cambridge, MA, USA). Anticuerpos conjugados con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594 (ambos a 1:500,) se usaron para visualizacion de senales. Los nucleos se tineron con 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI; Roche, Basilea, Suiza).
1.1.5 Preparacion de ARN, Sintesis de ADNc, y Reaccion en Cadena de Polimerasa de Transcripcion Inversa Cuantitativa
La purificacion de ARN de celulas cultivadas se realizo usando el procedimiento de RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN aislado se transfirio de forma inversa usando el Kit de Transcripcion Inversa de ADNc de alta capacidad (Life Technologies/Applied Biosystems). La determinacion cuantitativa de los niveles de expresion genetica se realizo en un sistema de deteccion de secuencias 7900HT (Life Technologies/Applied Biosystems) usando la mezcla maestra universal Power SybrGreen (Life Technologies/Applied Biosystems). Las secuencias de cebadores se determinaron usando el software PrimerExpress 2.0 (Life Technologies/Applied Biosystems) y se sometieron al ensayo para la generacion del amplicon especffico:
TLR4_dir: CTGGGTTTCTGCTGTGGACA (SEQ ID N.° 7)
TLR4_inv: AGGTTAGAAGCCTCGTGCTCC (SEQ ID N.° 8)
riNOS_dir: CTCAGCACAGAGGGCTCAAAG (SEQ ID N.° 9)
riNOS_inv: TGCACCCAAACACCAAGGT (SEQ ID N.° 10)
huiNOS_dir: TGAGGAGCAGGTCGAGGACT (SEQ ID N.° 11)
huiNOS_inv: TGATAGCGCTTCTGGCTCTTG (SEQ ID N.° 12)
huGAPDH_dir: TGGACCTGACCTGCCGTCTA (SEQ ID N.° 13)
huGAPDH _inv: AGGAGTGGGTGTCGCTGTTG (SEQ ID N.° 14)
TNFa_dir: AGCCCTGGTATGAGCCCATGTA (SEQ ID N.° 15)
TNFa_inv: CCGGACTCCGTGATGTCTAAG (SEQ ID N.° 16)
IL1p_dir: GAAACAGCAATGGTCGGGAC (SEQ ID N.° 17)
IL1p_inv: AAGACACGGGTTCCATGGTG (SEQ ID N.° 18)
IL6_dir: GTTGTGCAATGGCAATTCTGA (SEQ ID N.° 19)
IL6_inv: TCTGACAGTGCATCATCGCTG (SEQ ID N.° 20)
GAPDH_dir: GAACGGGAAGCTCACTGGC (SEQ ID N.° 21)
GAPDH_inv: GCATGTCAGATCCACAACGG (SEQ ID N.° 22)
ODC_dir: GGTTCCAGAGGCCAAACATC (SEQ ID N.° 23)
ODC_inv: GTTGCCACATTGACCGTGAC (SEQ ID N.° 24)
GAPDH y ODC se usaron como genes de referencia, y los niveles relativos de expresion genetica se determinaron de acuerdo con el metodo de AACt (Life Technologies/Applied Biosystems). Cada muestra se midio por cuadruplicado; los datos se muestran como valores de media ± desviacion estandar, y el ensayo t se aplico para determinar la significancia estadfstica.
1.2 Resultados
1.2.1 Localizacion de protefna Env cerca de lesiones de EM activas cronicas y en las cercanfas de OPCs residentes
Usando analisis inmunohistologicos los investigadores estudiaron la localizacion de la protefna Env en muestras de tejido cerebral humano. Esto revelo la presencia de una protefna Env bastante abundante en NAWM cerca de las lesiones de EM activas cronicas (CAL, Fig. 1B), asf como en los bordes de CALs cerca de las OPCs positivas para Olig2 (Fig. 1C). NAWM en una distancia adicional a las lesiones no mostro una inmunorreactividad de Env discernible (Fig. 1 A). Con el fin de poner en evidencia el impacto potencial de la protefna Env en las OPC residentes y, por lo tanto, en la reparacion de la mielina relevante, los investigadores buscaron adicionalmente celulas OPC doble positivas para TLR4 y receptor alfa del factor de crecimiento obtenido a partir de plaquetas (PDGFRa). Los investigadores pudieron detectar las en cerebros sanos (Fig. 1 D-D'") y en NAWM de pacientes con EM (Fig. 1E-E'"). esto demostraba claramente que en el cerebro con EM, las OPCs positivas para TLR4 se pueden detectar en las proximidades de celulas que expresan Env de HERV-W o de la correspondiente protefna secretada, que las convierte en dianas susceptibles de este agonista patogenico de TLR-4 tal como se ha descrito10. Sin embargo, esto constituye un hallazgo inesperado y abre perspectivas de aplicacion aun no vistas, ya que previamente se desconocfa que TLR4 se expresaba en tales condiciones en las OPCs y aun mas, como se resolvio adicionalmente, porque por lo tanto podrfa no anticiparse que en la protefna de envoltura HERV-W tal como MSRV-Env interactua directamente con las OPC en esta etapa precisa de diferenciacion con efectos impresionantes finales sobre su potencial mielinizante.
1.2.2 Expresion de TLR4 por OPCs de rata y ser humano cultivadas
Los estudios previos habfan evidenciado esencialmente un efecto proinflamatorio dependiente de TLR4 en monocitos y celulas dendrfticas10 El etiquetado inmunitario anti-TLR4 confirmo la expresion de este receptor en la superficie de las celulas precursoras oligodendrogliales humanas y de rata (Figs. 2C, C' y 5B). Ademas, la supresion genetica especffica mediada por ARNsh de TLR4 en las OPCs de rata confirmo la especificidad del inmunoetiquetado previo (Fig. 2B, B'). Con el fin de evaluar la cinetica de la expresion del receptor TLR4 de OPC jovenes a maduras, los investigadores realizaron una tincion conjunta usando anticuerpo anti-galactocerebrosido (GalC), asf como anticuerpos anti-protefna basica de mielina (MBP), un marcador para OPC mas maduras, despues de tres y seis dfas de diferenciacion en cultivo (Fig. 2C-D'). De forma interesante, se encontro que la expresion genetica del receptor TLR4 a lo largo del tiempo estaba regulada de forma negativa durante el curso de la diferenciacion celular (Fig. 2A), mientras que la deteccion de protefnas TLR4 especfficas solo produjo una senal debil en los puntos de tiempo finales en las OPCs de rata morfologicamente madura (Fig. 2D) en comparacion con celulas mas jovenes.
1.2.3 La estimulacion de OPC por Env induce la expresion de citoquinas proinflamatorias y la NO sintasa inducible
La estimulacion de las OPCs de rata por protefna Env recombinante disuelta en medio (Env soluble; 100 ng/ml; Fig. 3A), revestida en placas de cultivo celular (Env solida; Fig. 3B) o sobreexpresada en la superficie de celulas de glioblastoma U343 transfectadas (pV14Env La Fig. 3C-E') condujo a un fuerte aumento transcripcional de la oxido nftrico sintasa inducible (iNOS), asf como a la induccion de citoquinas proinflamatorias tales como TNFa, IL-1p e IL-6 (Fig. 2I-K) en comparacion con las condiciones de control (tampon o vector vacfo tratado). A su vez, el aumento de la expresion de iNOS condujo a un aumento dependiente de la concentracion de Env de su estres nitrosativo inductor de oxido nftrico (NO) en los sobrenadantes celulares (Fig. 3H). De forma interesante, la morfologfa de OPC de rata permanecio inalterada durante la estimulacion de Env, tal como se muestra con tinciones 04 de oligodendroglfa realizadas despues de un dfa y cinco dfas de exposicion a Env (Fig. 3F-G'). Tambien se encontro que las OPC positivas para GalC humanas expresaban TRL4 (Fig. 5B, B') y la estimulacion con Env recombinante (tanto en solucion como revestida en la superficie de la placa) de forma similar indujo la transcripcion de iNOS (Fig. 5A). Ademas, investigadores observaron que la estimulacion de Env no afectaba a la supervivencia de OPC (como se desvelo con TUNEL y mediante la cuantificacion del numero total de celulas; los datos no se muestran) ni indujo un fenotipo senescente de OPC (investigado por tinciones de p-galactosidasa; los datos no se muestran). La estimulacion con Env de OPC de ratas maduras (matOPCs; mantenidas en medio de diferenciacion durante seis dfas) condujo a una reaccion proinflamatoria sustancialmente mas debil segun lo determinado por los niveles de transcripcion de iNOS, TNFa, IL-1b e IL-6, en comparacion con los efectos sobre OPC inmaduras (Fig. 4). Esta observacion esta en lfnea con los niveles de expresion de TLR4 mas bajos encontrados en OPC maduras (Fig. 2) y sugiere una sensibilidad superior de las celulas inmaduras hacia Env en paralelo al nivel de expresion de TLR-4.
1.2.4 Env media sus efectos a traves de TLR4 y la respuesta proinflamatoria implica a IRAK-1/4, TRIF y NFkB
Para probar la especificidad de Env hacia TLR4 y arrojar mas luz sobre la senalizacion cadena abajo, los investigadores realizaron una serie de experimentos de control (Fig. 6). La inactivacion por calor de Env recombinante antes de la estimulacion con OPC condujo a una disminucion altamente significativa de la induccion de iNOS en comparacion con los controles (Fig. 6A). Se pudo observar una reduccion significativa similar de la transcripcion de iNOS mediante el bloqueo mediado por anticuerpos de TLR4, confirmando de ese modo la especificidad de Env hacia este receptor y su relevancia con respecto a los efectos proinflamatorios posteriores observados (Fig. 6D). Con el fin de arrojar luz sobre las vfas intracelulares despues de la activacion de TLR4 por Env, los investigadores investigaron las funciones de las dos rutas posteriores conocidas despues de la activacion de TLR4, la ruta dependiente de MyD88 que implica a IRAK-1/4 (quinasa-1/4 asociada al receptor de interleuquina-1) y la ruta independiente de MyD88 que implica a TRIF (interferon-p inductor del adaptador que contiene dominio TlR). La aplicacion del 4 inhibidor I de IRAK-1/ o un peptido inhibidor de TRIF dio como resultado una disminucion significativa de los niveles de expresion de iNOS en presencia de Env (Fig. 6B, C) demostrando que la activacion de TLR4 mediada por Env conduce a la activacion de ambos, dependiente de MyD88 asf como la ruta de transduccion de senales independiente de MyD88. Ambas rutas pueden converger en la translocacion nuclear de NFkB (potenciador de la cadena ligera k del factor nuclear de linfocitos B activados). Usando anticuerpos anti-NFKB, los investigadores confirmaron que la estimulacion de Env conduce a un fuerte aumento de las OPCs con la localizacion nuclear de NFkB (Fig. 6E-G') proporcionando una explicacion para la regulacion positiva transcripcional observada de citoquinas proinflamatorias.
1.2.5 Induccion mediada por env del marcador de estres nitrosativo nitrotirosina
El NO, que aumento de forma significativa despues de la estimulacion de Env (vease la Fig. 3H), es una especie reactiva del nitrogeno (RNS). El NO puede reaccionar con una multitud de moleculas intracelulares que incluyen protefnas, acidos nucleicos y lfpidos, que da como resultado la formacion de restos de 3-nitrotirosina (3-NT). Los investigadores encontraron que la exposicion de las OPCs de rata a la protefna Env recombinante conducfa a un fuerte aumento de celulas positivas para 3-NT en comparacion con los controles de tampon (Fig. 7B, B' y C, C') que indican la induccion de estres nitrosativo mediado por NO. Sin embargo, despues de la incubacion previa con la molecula inhibidora de iNOS, L-NAME (Ng-nitro-L-arginina metil ester), se observo que la produccion de NO disminufa de forma significativa (los datos no se muestran), al igual que la formacion de OPC positivas para 3-NT (Fig. 7D, D'). Cuando D-NAME, el enantiomero inactivo de L-NAME, se uso como control negativo, la formacion de 3-NT mediada por Env no se verfa afectada (Fig. 7E, E'). Por otro lado, la aplicacion de SNAP (S-nitroso-N-acetilpenicilamina), un donante fuerte de NO, sirvio como control positivo y dio como resultado la nitrotirosinilacion de casi todas las OPC (Fig. 7F, F'). De manera importante, las OPC positivas para 3-nitrotirosina, desveladas por su expresion del marcador precursor PDGFRa, tambien se podrfan detectar en la NAWM de los cerebros de pacientes con EM (Fig. 7G-G'") indicando que este mecanismo de estres es de relevancia patologica en la EM.
1.2.6 Env influye en la expresion de mielina de las OPCs
Siguiendo estas observaciones, los investigadores investigaron si la protefna Env puede influir en los procesos de diferenciacion oligodendroglial que se muestran necesarios para las actividades de reparacion de la mielina. Para esta finalidad, se evaluaron las OPC de rata simuladas por Env para la expresion de las protefnas de mielina CNPasa (3'-fosfodiesterasa nucleotfdica 2',3'-cfclica) despues de tres dfas de estimulacion con Env y MBP (protefna basica de mielina) despues de seis dfas de estimulacion, respectivamente. Los resultados revelaron que Env reducfa fuertemente el numero de CNPasa y celulas positivas para MBP (Fig. 8A-D'") a diferencia de la expresion sin cambios del marcador precursor 04 (Fig. 3F-G'). Esto demostro una reaccion de diferenciacion celular alterada de forma significativa en presencia de la protefna Env. Sin embargo, la adicion de L-NAME pero no de D-NAME en paralelo a la estimulacion con Env podrfa rescatar la expresion de MBP (Fig. 8E-H'), lo que evidencia un enlace directo entre la formacion de 3-NT a traves del estres nitrosativo y una reduccion de la capacidad de diferenciacion de OPC.
1.3 Analisis de resultados
Se cree que la remielinizacion del SN ineficaz en enfermedades desmielinizantes neuroinflamatorias tales como EM se debe principalmente a una capacidad i-educida de las OPC residentes para diferenciarse adecuadamente y para remielinizar los axones desmielinizados , pero no se sabfa que una molecula patogena principal y cadena arriba causara este bloqueo de la remielinizacion. Los estudios previos ya han mostrado que la protefna de envoltura Env de HERV-W, tambien denominada "elemento retroviral asociado a Esclerosis Multiple" (MSRV) cuando se obtiene a partir de las correspondientes partfculas retrovirales14, ejerce un efecto proinflamatorio en el sistema inmunitario innato activando celulas mononucleares que, a su vez , producen citoquinas proinflamatorias importantes10. Sin embargo, una relacion directa entre Env y una reduccion de la capacidad de diferenciacion de OPC no se ha previsto hasta ahora, y podrfa no haberse previsto. En el presente documento los investigadores demuestran que esta protefna Env se puede detectar en tejido del SN afectado por EM y que Env es capaz de interferir con la diferenciacion de OPC a traves de una presencia desconocida previamente del receptor Env, TLR4, en las OPCs en cierta(s) etapa(s) de diferenciacion. Este efecto perjudicial se produce a traves de iNOS. Esta respuesta al estres da como resultado la formacion de nitrotirosina y afecta directamente a la expresion de la protefna mielina. De manera interesante, la estimulacion de Env no influyo en las tasas de supervivencia de las celulas OPC y las morfologfas celulares permanecieron sin alterar, lo que sugiere que las senales mediadas por Env no se dirigen a elementos del citoesqueleto. Destacando y confirmando la novedad de los presentes hallazgos inesperados, estudios previos han reivindicado una ausencia de TLR4 en celulas oligodendrogliales en el cerebro humano15. Sin embargo, a diferencia de este conocimiento anterior del campo, los investigadores podrfan demostrar claramente que TLR4 no solo se expresa en OPC primarias cultivadas (tanto de origen humano como de rata) sino tambien en OPCs humanas residentes positivas para PDGFRa en tejido de EM. Las diferencias de ese tipo podrfan surgir a partir del hecho de que Lehnhardt y sus colaboradores usaron el marcador 04 mas general para la deteccion de celulas oligodendrogliales, mientras que en su lugar los investigadores conffan en el marcador de percursor PDGFR-a recientemente aceptado. Sin embargo, por lo tanto, los investigadores han puesto en evidencia este patron peculiar de expresion de TLR4 en las OPCs por primera vez, cuando todavfa se crefa que esto no existfa. Ademas, los investigadores observaron una fuerte regulacion negativa de TLR4 durante la maduracion de OPC, lo que sugiere que la expresion del receptor y, en consecuencia, la susceptibilidad a Env, se limitan a celulas inmaduras. Sin embargo, este hallazgo es de relevancia patologica ya que hace que estas celulas sean capaces de interactuar directamente con la protefna Env que se ha mostrado que se expresa y se libera en lesiones de EM. En vista de estos hallazgos, los investigadores llegan a la conclusion de que la protefna Env de MSRV/HERV-W no solo es un componente inmunopatologico de la EM, sino que tambien puede ejercer un impacto negativo significativo en las actividades de reparacion endogena de la mielina. Por lo tanto, se llega a la conclusion de que una disminucion de la capacidad de reparacion como se observa en muchos pacientes con EM durante el curso de la enfermedad se debe a la activacion de los elementos MSRV/HERV-W2. Es de destacar que un estudio anterior describio los efectos experimentales de una protefna Env de HERV-W codificada por una copia defectuosa (incapaz de producir actividad ni partfculas de RT ya que no tenia secuencias codificantes en los genes gag y pol) con insercion estable en el cromosoma 716. Esta protefna Env se puede expresar mediante el unico gen codificante del elemento 7q de HERV-W (env, o locus ERVW-E1), tiene cuatro aminoacidos de delecion en la parte C-terminal de su dominio de superficie causando aparentemente un enrutamiento celular peculiar y se sabe que tiene expresion in vivo al nivel de protefna 1 7 1 f t 17limitada a la placenta , . Esta protefna es, de hecho, un ejemplo de una protefna HERV "domesticada" , que ahora desempena un papel fisiologico en la formacion de tejido de sincitiotrofoblastos y, por lo tanto, se denomina "Sincitina"19. El correspondiente dominio fusogenico en Env de HERV-W, asf como el dominio de union a TLR4, se pueden conservar mas o menos entre los subtipos HERV-W (por ejemplo, MSRV-Env o Sincitina). Su disponibilidad como una protefna de superficie o extracelular con exposicion conformacional de un dominio activo esta altamente regulada y el papel fisiologico de la Sincitina permanece enterrado en el sincitiotrofoblasto y se limita a la presencia de una placenta. Por lo tanto, parece que una patogenicidad asociada es el sello distintivo de la activacion no fisiologica, por ejemplo, por ciertos agentes infecciosos ambientales20 , 21 en seres humanos, o de condiciones transgenicas experimentales in vitro o in vivo. Se informo que la sincitina se encontraba en la astroglia del SN de individuos con esclerosis multiple (EM), pero usando un anticuerpo encontrado en cualquier otro lugar se informo de la deteccion del subtipo MSRV-Env de HERV-W y no Sincitina22. Sin embargo, la secuencia de sincitina se podrfa expresar mediante transgenesis en astrocitos de raton produciendo la liberacion de citoquinas daninas para los oligodendrocitos16, pero se desvelo que los ratones transgenicos no son viables (comunicacion personal de C. Power a H. Perron, simposio de Neurovirologa, San Diego, 2007). Sin embargo, aunque Antony y sus colaboradores encontraron que los oligodendrocitos mielinizantes positivos para adomatosis poliposis coli (APC) eran vulnerables a la citotoxicidad mediada por Sincitina en tales cerebros de ratones transgenicos, los investigadores fueron capaces de demostrar que solamente las OPCs inmaduras son significativamente propensas a senales proinflamatorias mediadas por Env cuando las celulas maduras no estan. Por lo tanto, los resultados de este estudio ahora estan apareciendo en resultados de condiciones experimentales usadas relacionadas con sus condiciones de expresion forzada transgenica de una protefna placentaria en celulas cerebrales. Aunque estos resultados se dedujeron a partir de condiciones artificiales, los investigadores ahora han desvelado un mecanismo perjudicial que se dirige a la capacidad de reparacion endogena del sistema nervioso adulto (SN) y no a la patologfa de la EM como tal, que presenta principalmente una perdida mediada por el sistema inmunologico de oligodendrocitos y vainas de mielina con dano axonal. De hecho, en la actualidad los efectos mediados por Env en celulas inmunes en asociacion con lesiones inflamatorias del SN estan bien documentados 7 10 23 25 1
, , ' , pero ningun estudio previo habfa evidenciado una patogenicidad directa de ese tipo de Env de HERV-W en celulas gliales con una implicacion en el bloqueo de la remielinizacion de placas de EM por las OPC. Los presentes resultados que asocian la inmunohistologfa cerebral de la EM que muestran una amplia expresion de la protefna Env en placas activas de EM o en el golpe de lesiones menos activas ahora apoyan un papel de ese tipo en el defecto conocido en la remielinizacion por OpC en lesiones de EM.
Ejemplo 2: El bloqueo de la remielinizacion inducido por la protefna de envoltura de la familia HERV-W se trata de forma eficaz con un anticuerpo especffico anti-Env.
La protefna de Envoltura de la envoltura de la familia HERV-W (Env, en particular a partir del subtipo de RetroVirus asociado a Esclerosis Multiple, MSRV-Env) es un inhibidor potente de la capacidad de las OPC no mielinizantes para diferenciarse en oligodendrocitos maduros productores de mielina, que aparece como una etapa crftica en el proceso de remielinizacion. Los investigadores han investigado el efecto de la protefna MSRV-Env en la expresion de dos marcadores diferentes de la diferenciacion de oligodendrocitos:
- CNPasa (3'-fosfohidrolasa nucleotfdica 2',3'-cfclica) representa un 4 % de protefnas de mielina totales y esta presente en el citoplasma de la vaina oligodendroglial no compactada de axones. La CNPasa es la protefna especffica de mielina de la que se supo antes que se sintetizaba mediante el desarrollo de oligodendrocitos. - MBP (protefna basica de mielina) constituye tanto como un 30 % de protefnas de mielina y desempeno papel principal en la compactacion de mielina en los sistemas nerviosos central y periferico. Aparece de forma secuencial despues de la CNPasa tanto in vivo con o in vitro y es un marcador especffico de oligodendrocitos maduros. El objeto del presente estudio fue determinar si el anticuerpo anti-Env especffico tal como GNbACI, un anticuerpo monoclonal lgG4 anti-Env humanizado recombinante, puede bloquear la inhibicion de la maduracion de OPC inducida por MSRV-Env. De hecho, un efecto de GNbACI de ese tipo podrfa ser indicativo de propiedades de "anti-bloqueo de celulas remielinizantes" del anticuerpo. con el fin de someter a ensayos de hipotesis, las OPC humanas en cultivo primario se incubaron con MSRV-Env, con o sin GNbACI, ya fuera mediante revestimiento de la protefna recombinante en la superficie del cultivo por adicion de la protefna en el medio de cultivo. Las expresiones de CNPasa (como un marcador de maduracion temprano) y MBP (como un marcador de maduracion tardfo), se evaluaron mediante inmunocitoqufmica despues de uno o tres dfas de estimulacion, respectivamente.
En el presente ejemplo, MSRV-Env se refiere a la protefna recombinante MSRV-Env de longitud completa que contiene dominios intracelulares, transmembrana, y extracelulares de la protefna de Envoltura de HERV-W.
Los resultados presentados aquf muestran que las OPC humana se expresan TLR4 de forma especffica en su membrana plasmatica y demuestran que la protefna recombinante MSRV-Env disminuye de forma especffica y significativa el numero de celulas positivas para CNPasa y MBP. Estas observaciones estan en lfnea con las del Ejemplo 1 en OPC humanas y de rata. Ademas, los experimentos de los investigadores muestran por primera vez que la inhibicion (bloqueo) de la maduracion de OPC humanas inducida por MSRV-Env se revierte completamente mediante un tratamiento con GNbACI, lo que demuestra sus propiedades terapeuticas nuevas y previamente inesperadas. En consecuencia esto proporciona una indicacion adicional en el tratamiento de formas progresivas de esclerosis multiple.
2.1 Material y Metodos
2.1.1 Materiales
Materiales usados para cultivo primario de OPC Humanas
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0002
Materiales usados para la evaluacion de la expresion de marcadores de maduracion en OPC Humanas
Figure imgf000016_0001
Materiales usados para la estimulacion de OPC con MSRV-Env, GNbAC1 y Tampon MSRV-Env
Figure imgf000016_0003
2.1.2 Protocolos
Incubacion de OPC humanas con MSRV-Env, Tampon MSRV-Env y GNbACI
La MSRV-Env recombinante de longitud completa se produjo y se purifico en PX'Therapeutics (548 aa; 61,44 KDa) (lote 110719-1). La concentracion inicial fue 0,6 mg/ml (9,76 pM). El Tampon MSRV-Env (Trizma-HCI 20 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, SDS al 1,5 %, DTT 10 mM) fue proporcionado por PX'Therapeutics. Esta solucion se uso como un control negativo. GNbAC1 (Lote T96/bAC1/B1; produccion de GMP) se produjo y se purifico en Polymun Scientific, Viena, Austria. La concentracion inicial fue 10 mg/ml (68,03 pM).
Las OPC humanas se estimularon con los diferentes tratamientos con soluciones de revestimiento en la superficie de la placa de cultivo celular antes de sembrar las celulas o anadiendolas en el medio de cultivo celular despues de sembrar las celulas. En cualquier caso, los portaobjetos de camara de 8 pocillos Labtek (Nunc) se revistieron previamente con poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante una noche a 37 °C.
Revestimiento de los portaobjetos de camara de 8 pocillos Labtek
Los diferentes tratamientos se diluyeron en PBS en una campana de flujo laminar esteril (Fischer Bioblock, Francia) y los portaobjetos de camaras de 8 pocillos Labtek 8 (Nunc; 250 pl por pocillo) se revistieron como sigue a continuacion:
- MSRV-Env (1 pg/ml) revestido durante 2 horas a 37 °C
- TAMPON MSRV-Env (misma dilucion que MSRV-Env) revestido durante 2 horas a 37 °C
- MSRV-Env GNbAC1 A1 : mezcla de MSRV-Env (1 pg/ml) y GNbACI (7,35 pg/ml = 50 nM) revestida durante 2 horas a 37 °C
- MSRV-Env GNbAC1 A2 : mezcla de MSRV-Env (1 pg/ml) y GNbAC1 (29,4 pg/ml = 200 nM) revestida durante 2 horas a 37 °C
- MSRV-Env GNbAC1 B1 : MSRV-Env (1 pg/ml) revestido durante 2 horas a 37 °C, lavado con PBS y posteriormente revestido con GNbAC1 (7,35 pg/ml = 50 nM) durante 1 hora a 37 °C
- MSRV-Env GNbAC1 B2 : MSRV-Env (1 pg/ml) revestido durante 2 horas a 37 °C, lavado con PBS y posteriormente revestido con GNbAC1 (29,4 pg/ml = 200 nM) durante 1 hora a 37 °C
- GNbAC1 A1 solo : GNbAC1 (7,35 pg/ml = 50 nM) revestido durante 2 horas a 37 °C
- GNbAC1 A2 solo: GNbAC1 (29,4 pg/ml = 200 nM) revestido durante 2 horas a 37 °C
- GNbAC1 B1 solo: PBS durante 2 horas a 37 °C, a continuacion revestido con GNbAC1 (7,35 pg/ml = 50 nM) durante 1 hora a 37 °C
- GNbAC1 B2 solo: PBS durante 2 horas a 37 °C, a continuacion revestido con GNbAC1 (29,4 pg/ml = 200 nM) durante 1 hora a 37 °C
- BSA (1 pg/ml) revestido durante 2 horas a 37 °C
- BSA GNbAC1 A1 : mezcla de BSA (1 pg/ml) y GNbAC1 (7,35 pg/ml = 50 nM) revestida durante 2 horas a 37 °C
- BSA GNbAC1 A2 : mezcla de BSA (1 pg/ml) y GNbAC1 (29,4 pg/ml = 200 nM) revestida durante 2 horas a 37 °C
- BSA GNbAC1 B1 : BSA (1 pg/ml) revestido durante 2 horas a 37 °C, lavado con PBS y posteriormente revestido con GNbAC1 (7,35 pg/ml = 50 nM) durante 1 hora a 37 °C
- BSA GNbAC1 B2 : BSA (1 pg/ml) revestido durante 2 horas a 37 °C, lavado con PBS y posteriormente revestido con GNbAC1 (29,4 pg/ml = 200 nM) durante 1 hora a 37 °C
Cultivo de celulas precursoras de oligodendrocitos humanos
Las OPC, aisladas de tejido cerebral humano, se adquirieron en ScienCell Research Laboratories (a traves de 3H Biomedical, Suecia). Cada vial contiene > 1 x 106 celulas en 1 ml. El medio de cultivo de OPC completo (OPCM) se reconstituyo mediante la adicion de solucion de crecimiento de OPC (OPCGS), y penicilina/estreptomicina (P/S) Al OPCM de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sciencell).
El vial que contenfa las OPC humanas se puso en a 37 °C bano con agua y se agito suavemente mediante rotacion hasta que el contenido se descongelo completamente. Las celulas se volvieron a suspender suavemente con una pipeta Gilson de 1 ml. A continuacion, se diluyeron en OPCM completo, y se sembraron en los recipientes de cultivo Labtek de 8 pocillos (7000 celulas/cm2= 10000 celulas por pocillo) revestidos previamente con poli-L-lisina (0,01 %, Sigma) y con (o sin) los tratamientos que se han descrito anteriormente (vease 3.2.1.1) en una campana de flujo laminar esteril (Fischer Bioblock, Francia). Los cultivos se incubaron a 37 °C; CO2 al 5 % hasta los experimentos de inmunocitoqufmica posteriores. El medio de crecimiento se cambio al dfa siguiente para retirar el DMSO residual y las celulas sin unir en los cultivos se trataron durante 72 horas.
Incubacion con MSRV-Env en el medio de cultivo
Despues de 3 horas de cultivo previo (vease 3.2.1.2) de las OPC humanas en los recipientes de cultivo Labtek De 8 pocillos, las celulas se incubaron a 37 °C durante 24 horas o 72 horas en labteks de 8 pocillos (250 pl/pocillo) con la adicion de las siguientes soluciones:
- Tampon MSRV-Env, usado como un control negativo, anadido en medio de cultivo celular completo
- MSRV-Env anadido a 3 nM (0,184 pg/ml) en medio de cultivo celular completo
- Mezcla de MSRV-Env (3 nM) GNbAC1 (200 nM; 29,4 pg/ml) anadida en medio de cultivo celular completo - GNbAC1 (200 nM) solo anadido en medio de cultivo celular completo
Expresion de TLR4 y marcadores de mielinizacion en OPC in vitro
Despues de 24 o 72 horas de incubacion, el medio de cultivo celular se retiro y las OPC humanas estimuladas con tratamientos que se han descrito anteriormente (vease 3.2.1) se fijaron en una solucion de paraformaldehfdo (PFA al 4 % en PBS, 250 pl por camara) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, se lavaron tres veces en PBS (3 x 250 pl por camara) y los sitios de union no especfficos se saturaron mediante incubacion con una solucion de suero bovino fetal al 10 % (FBS) en PBS que contenfa Triton X100 al 0,1 % (250 pl por camara) durante 1 hora a 37 °C. En el caso de tincion de TLR4, las celulas se incubaron con FBS al 10 % en PBS solo (250 pl por camara). Despues de saturacion, los cultivos de OPC se incubaron con soluciones de anticuerpo primario durante una noche a 4 °C, diluidas en FBS al 10 % en solucion de PBS (200 pl por camara), como sigue a continuacion:
- Anticuerpos anti-TLR4 de raton a 1/1000 (despues de 24 y 72 horas de cultivo)
- Anticuerpos anti-CNPasa de raton a 1/200 (despues de 24 horas de estimulacion)
- Anticuerpos anti-MBP de raton a 1/100 (despues de 72 horas de estimulacion)
Las celulas se lavaron 3 veces en PBS (3 x 250 pl por camara), y se incubaron con soluciones de anticuerpo secundario durante 1 hora a 37 °C (250 pl por camara), como sigue a continuacion:
- Anticuerpos de cabra anti-raton conjugados con FITC a 1/200
Despues de 3 lavados en PBS (3 x 300 pl por camara) a temperatura ambiente, las camaras de plastico se separaron de los portaobjetos. A continuacion los portaobjetos se montaron con medio de montaje Vectastain® que contenfa DAPI (Vectashield). Las tinciones se visualizaron mediante microscopfa de fluorescencia usando un microscopio Axioscope (Zeiss).
Analisis de datos
Despues de 24 horas de estimulacion (o control) con MSRV-Env-T, se hizo el recuento de las celulas inmunorreactivas para CNPasa en 10 campos por camara elegidos de forma aleatoria. El porcentaje de celulas positivas para CNPasa se calculo como:
100 x n CNPasa n CNPasa = numero de OPC inmunorreactivas para CNPasa
□ DARI
Despues de 72 horas de estimulacion (o control) con MSRV-Env-T, se hizo el recuento de las celulas inmunorreactivas para MBP en 10 campos por camara elegidos de forma aleatoria. El porcentaje de celulas positivas para MBP se calculo como:
100 x n MBP n MBP = numero de OPC inmunorreactivas para MBP nDAPt
Los datos se presentaron como Media ± ETM de porcentaje de celulas positivas para CNPasa o MBP. Se realizaron graficos usando el Software GraphPad, version 5.00 para Windows (San Diego California USA). Se realizaron ensayos estadfsticos no parametricos usando Sigma Stat (Chicago, IL, USA).
Los siguientes resultados se recogieron durante tres series de experimentos independientes, cada uno de ellos realizados con un nuevo vial de comercial congelado, OPC: OPC ICC 01, OPC ICC 02, y OPC ICC 03.
2.2 Resultados
2.2.1 Expresion de receptores de TLR4 en OPC humanas in vitro
La expresion de TLR4 se evaluo mediante microscopfa de inmunofluorescencia. La etapa de saturacion realizada sin ningun detergente permite la deteccion de TLR4 solamente en la superficie celular. Este experimento confirmo la presencia del receptor diana de MSRV-Env en la superficie celular de las OPC humanas despues de 24 y 72 horas de cultivo primario (no se muestra).
2.2.2 Expresion de CNPasa y MBP en OPC humanas in vitro
La morfologfa de OPC humanas in vitro se visualizo con microscopfa de campo brillante. Las OPC presentaban un cuerpo celular y generalmente dos extensiones celulares. Las expresiones de CNPasa y MBP se confirmaron mediante microscopfa de inmunofluorescencia despues de 24 horas y 72 horas en cultivo, respectivamente (no se muestra).
2.2.3 Efectos de ENV de MSRV con o sin GNbACI en diferenciacion de OPC humanas
Efecto de MSRV-Env revestida en expresion de marcadores de maduracion en OPC humanas en cultivo primario (OPC ICC 01)
Los objetivos de este primer conjunto de experimentos (OPC ICC 01) fueron establecer las condiciones de cultivo primario de OPC humanas, asf como portaobjetos de camaras de Labtek con revestimiento previo con MSRV-Env y protocolos de inmunotincion de CNPasa y MBP.
Los recipientes de cultivo Labtek se revistieron con 1 pg/ml de MSRV-Env antes de sembrar las OPC humanas. Como un control negativo (tampon), los recipientes de cultivos se incubaron con las mismas condiciones solamente con tampon MSRV-Env.
El porcentaje de celulas positivas para CNPasa disminuye de forma significativa de un 85 ± 4 % en la condicion de control (tampon) a un 69 ± 6 % en las OPC humanas estimuladas durante 24 horas en Labtek revestidas previamente con MSRV-Env (* p < 0,05; ensayo t) (Figura 9A).
Despues de 72 horas de cultivo con el porcentaje de celulas positivas para MBP disminuye de forma significativa de un 74 ± 7 % en la condicion de control (tampon) a un 25 ± 3 % en Labtek revestidos previamente con MSRV-Env (+Env-T) (* p < 0,001 ensayo de Suma de Rango de Mann-Whitney) (Figura 9B). Estos resultados muestran que MSRV-Env inhibe la maduracion de las OPC humanas en celulas mielinizantes in vitro.
Efecto de GNbACI en la inhibicion de la maduracion de OPC inducida por MSRV-Env (OPC ICC 02)
Los objetivos de este segundo conjunto de experimentos (OPC ICC 02) fueron confirmar el efecto de MSRV-Env en la diferenciacion de OPC humanas, y determinar si MSRV-Env tambien puede inhibir la diferenciacion de OPC humanas cuando la protefna se anade directamente en el medio de cultivo celular. Ademas, los investigadores tambien han sometido a ensayo si GNbAC1 puede inhibir los efectos de MSRV-Env en este modelo.
En el caso de estimulacion de las OPC humanas en Labtek revestidas previamente con MSRV-Env, los tratamientos con GNbAC1 se evaluaron en dos protocolos diferentes. En primer lugar, los portaobjetos de cultivo Labtek se incubaron previamente con una mezcla de MSRV-Env (1 pg/ml) y GNbAC1 (50 nM o 200 nM) antes de sembrar las OPC (condicion GNbAC1-A). El segundo protocolo consistfa en un revestimiento secuencial con MSRV-Env (1 pg/ml) seguido de un revestimiento con GNbAC1 (50 nM o 200 nM) antes de sembrar las OPC (condicion GNbAC1-B).
Efectos de MSRV-Env y GNbACI en la expresion de CNPasa en OPC humanas
Despues de 24 horas de estimulacion, una disminucion significativa del porcentaje de celulas positivas para CNPasa de un 75 ± 2 % en la condicion de control (tampon) a un 55 ± 2 % se observa en Labteks revestidos previamente con 1 pg/ml de MSRV-Env (*p < 0,001 con respecto a Tampon; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer). Ademas, la estimulacion en Labteks revestidos previamente con 1 pg/ml de BSA no tiene efecto en la expresion de CNPasa (71 ± 2 %), lo que muestra que el efecto observado con MSRV-Env es especffico ya que no se observo con una protefna de control (Figura 10A).
GNbAC1 inhibe de forma significativa la disminucion de celulas positivas para CNPasa inducida en Labteks revestidos previamente con MSRV-Env (Figura 10A). El efecto de GNbAC1 se observa a 50 nM y 200 nM, y en los dos protocolos de tratamiento sometidos a ensayo: (i) condicion GNbAC1-A, 50 nM (69 ± 4 %), 200 nM (80 ± 2 %); (ii) condicion GNbAC1-B 50 nM (96 ± 3 %) y 200 nM (76 ± 4 %) (Tp < 0,001,ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fisher). Ademas, parece que el efecto de GNbAC1 depende de la concentracion (Figura 10A).
Los experimentos de control adicionales mostraron que las OPC humanas estimuladas durante 24 horas en Labteks revestidos previamente con GNbAC1 solo (50 nM o 200 nM), o con una mezcla de GNbAC1 (50 nM o 200 nM) BSA (1 pg/ml) no tenfan efecto en la expresion de CNPasa cuando se comparaba con la condicion de control (Tampon) (p > 0,05; ANOVA de una via) (Figura 10B). Estas observaciones se realizaron con los con dos protocolos de tratamiento con GNbAC1 que se han descrito anteriormente (GNbAC1-A 50 nM, GNbAC1 A 200 nM y GNbAC1-B 50 nM).
Este experimento tambien demuestra que incluso bajas concentraciones de MSRV-Env en solucion inducen una disminucion significativa del porcentaje de celulas positivas para CNPasa despues de 24 horas, de un 78 ± 2 % en la condicion de control (tampon) a un 57 ± 2 % en el grupo de MSRV-Env (*p < 0,001 con respecto a Tampon; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer) (Figura 11). Ademas, el tratamiento con GNbAC1 (200 nM) antagoniza totalmente la disminucion de la expresion de CNPasa inducida por MSRV-Env (76 ± 2 %; p < 0,001 con respecto a Env-T; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fisher). Es interesante indicar que GNbAC1 200 nM solo (74 ± 2 %) no tiene efecto en la expresion de CNPasa cuando se compara con la condicion de control (tampon) (Figura 11).
Efectos de MSRV-Env y GNbACI en la expresion de MBP en OPC humanas
Despues de 72 horas de estimulacion, una disminucion significativa del porcentaje de celulas positivas para MBP de un 76 ± 2 % en controles (tampon) a un 57 ± 1 % se observa en Labteks revestidos previamente con 1 pg/ml MSRV-Env (**p < 0,001 con respecto a Tampon; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer) (Figura 12A). En este experimento, el cultivo de OPC en Labteks revestidos previamente con BSA (1 pg/ml) muestra un porcentaje de celulas positivas para MBP ligeramente diferente del control (tampon) (69 ± 2 %). Sin embargo, el efecto de BSA tambien es significativamente diferente del efecto de MSRV-Env (p < 0,001 con respecto a Env-T; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer), y por lo tanto desvela que es un efecto aislado y no influyente en esta serie experimental solamente, dado que no se observa en otros experimentos o con CNPasa en la misma serie.
GNbAC1 inhibe de forma significativa la disminucion de celulas positivas para MBP inducida en Labteks revestidos previamente con MSRV-Env (Figura 12A). Un efecto parcial de GNbAC1 se observa la 50 nM, y una inhibicion completa se consigue a 200 nM, y en ambos protocolos de tratamientos sometidos a ensayo: (i) GNbAC1-A 50 nM (69 ± 2 %) y 200 nM (73 ± 2 %) y, (ii) GNbAC1-B 50 nM (68 ± 2 %) y 200 nM (74 ± 2 %) (Tp < 0,001 con respecto a Env-T; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fisher). Ademas, parece que el efecto de GNbAC1 depende de la concentracion (Figura 12A).
Este experimento tambien demuestra una disminucion significativa del porcentaje de celulas positivas para MBP de un 76 ± 2 % en la condicion de control (tampon) a un 55 ± 2 % en las celulas estimuladas con MSRV-Env anadidas en el medio de cultivo (3 nM) durante 72 horas (*p < 0,001 con respecto a Tampon; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fischer) (Figura 12B). Ademas con el tratamiento con GNbAC1 (GNbAC1 200 nM) inhibe completamente la disminucion de la expresion de MBP inducida por MSRV- Env (76 ± 2 %; ^ p < 0,001 con respecto a Env-T; ANOVA de una via seguido de analisis a posteriori de LSD de Fisher) (Figura 12B).
Confirmacion de efectos de GNbACI en la inhibicion de la diferenciacion de OPC inducida por MSRV-Env (OPC ICC 03)
Aunque los resultados que se han descrito anteriormente se obtuvieron a partir de una cantidad considerable de datos recogidos con el objetivo de este tercer conjunto de experimentos (OPC ICC 03) fue la replicacion completa del efecto de GNbAC1 en series de experimentos totalmente independientes.
Efectos de MSRV-Env y GNbAC1 en expresiones de CNPasa y MBP en cultivos de OPC humanas Despues de 24 horas de estimulacion, una disminucion significativa del porcentaje de celulas positivas para CNPasa de un 90 ± 1 % en la condicion de control (tampon) a un 71 ± 1 % se observa en Labteks revestidos previamente con MSRV-Env (1 pg/ml) (*p < 0,05; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Student Newman Keuls) (Figura 13A). Como se ha descrito anteriormente, GNbAC1 (200 nM) revierte completamente la inhibicion de la expresion de CNPasa inducida por MSRV-Env en los dos protocolos de tratamientos con GNbAC1 sometidos a ensayo (GNbAC1-A: 90 ± 2 %, GNbAC1-B: 91 ± 4 %) (^p < 0,05 con respecto a Env-T; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Dunn) (Figura 13A).
Despues de 72 horas de estimulacion, una disminucion significativa del porcentaje de celulas positivas para MBP de un 78 ± 2 % en la condicion de control (tampon) a un 55 ± 3 % se observa en Labteks revestidos previamente con MSRV-Env (1 pg/ml) durante 72 horas (*p < 0,05 con respecto a tampon; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Dunn) (Figura 13B). Como se ha descrito anteriormente, GNbAC1 (200 nM) revierte completamente la inhibicion de la expresion de MBP inducida por MSRV-Env en los dos protocolos de tratamientos con GNbAC1 sometidos a ensayo (GNbAC1-A: 80 ± 2 %, GNbAC1-B: 75 ± 2 %) (Tp < 0,05 con respecto a Env-T; Kruskal-Wallis ANOVA-1 en Rangos seguido de analisis a posteriori de Dunn) (Figura 13B).
Datos combinados de experimentos OPC ICC 02 y OPC ICC 03
Los resultados obtenidos en las dos series de experimentos diferentes (OPCICC02 y OPCICC03) presentados anteriormente, se combinaron en el mismo analisis. Por lo tanto los datos representados de la figura 14 representan de 8 a 14 experimentos independientes para CNPasa (Figura 14A) y MBP (Figura 14B). este analisis muestra que los efectos de MSRV-Env y GNbAC1 en la diferenciacion de las OPC humanas Son altamente reproducible si coherentes.
Con el fin de normalizar la expresion de los datos, la condicion de control (tampon) se uso como referencia y se considero como un 100 %. En resumen, estos resultados muestran que las concentraciones de MSRV-Env usadas en la presente serie inhiben en un 24 % el numero de celulas positivas para CNPasa (CTRL: 100 ± 1 %; ENV: 76 ± 1 %) y un 27 % del numero de celulas positivas para MBP (CTRL: 100 ± 2 %; ENV: 73 ± 2 %). GNbAC1 (200 nM) revierte completamente el efecto de MSRV-Env en la expresion de CNPasa (GNbAC1-A: 102 ± 1 %; GNbAC1-B 101 ± 1 %) (Figura 15A), pero tambien el efecto en la expresion de MBP (GNbAC1-A: 101 ± 2 %; GNbAC1-B 97 ± 2 %) (Figura 15B).
2.3 Analisis de resultados
En consecuencia, los datos del presente ejemplo muestran que Env de MSRV induce una disminucion robusta y altamente reproducible en la expresion de dos marcadores especfficos diferentes de maduracion de oligodendrocitos. Por lo tanto, Env de MSRV inhibe la diferenciacion de precursores de oligodendrocitos humanos en celulas mielinizantes. Ademas, en el presente documento los investigadores demuestran claramente que GNbAC1 revierte completamente este efecto perjudicial de Env de MSRV, y restablecer los niveles normales de CNPasa y MBP en este modelo. Estos resultados muestran que GNbAC1 trata el bloqueo de la diferenciacion de las OPC inducido por HERV-W/MSRV-Env. Por lo tanto, estos resultados apoyan fuertemente una indicacion innovadora de GNbAC1 para tratar lesiones desmielinizadas inducidas por protefnas de envoltura HERV-W. Esto se aplica en particular a las formas progresivas de esclerosis multiple para las cuales la remielinizacion es crftica pero no se produce en OPC que rodean lesiones de EM, debido a celulas positivas para Env persistentes y secrecion como se muestra en el ejemplo 1.
Ejemplo 3: Estudio de los efectos terapeuticos de anticuerpo GNbACI, L-NAME, SMT, DMF o Fumarato sodico en modelo murino Experimental de Encefalomielitis Alergica (EAE) inducida con glicoprotefna oligodendrocftica de Mielina (m Og ) y la protefna de envoltura de MSRV/ h ErV-W (Env).
3.A Comparacion entre moleculas individuales (monoterapia) y asociaciones de un anticuerpo anti-Env con moleculas pequenas que inhiben efectores inducidos por Env en bloqueo de OPC (terapia combinada).
3.A.I. Material
Ratones C57BL/6 de Charles River.
MOG 35-55 EspiKem, Srl (companfa Polypeptide); referencia: SC1272.
GNbAc1; lote T950111-8 (anticuerpo de lgG4 humanizado Anti MSRV/HERV-W que comprende cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que se presentan en las SEQ ID N.° 1, SEQ ID N.° 2, SEQ ID N.° 3 SEQ ID N.° 4, SEQ ID N.° 5 y SEQ ID N.° 6.
L-NAME (NG-Nitro-L-Arginina Metil Ester) Sigma; referencia: N5751-5G lote BCBF4375V
SMT (S) Hemisulfato de metilisotiourea (Sigma); referencia: M84445-100G lote STBC1003V
Fumarato de dimetilo (DMF) Sigma; referencia: 242926-100G lote 2507VBCBH
Methocel MC Sigma; referencia: 64605-100G lote BCBD9989V
IFA (Sigma) Sigma referencia: F5506-10ML lote:061M8728
PTX (Toxina Pertussis; Calbiochem); Referencia: 516561 lote D00128881
PBS (Solucion salina tampon fosfato; Lonza); Referencia 516561; lote; D00128881
Env (P'X Therapeutics); Lotes de produccion de protefna purificada validados como sin endotoxina (ensayo de LDL < 5 UI/ml) y bioactivo (ensayos de QC internos de Geneuro).
Aparato Rotarod (LE8200; Bioseb Francia)
3.A.2. Metodos
Los ratones C57BL/6 hembra sin patogenos (6 - 8 semanas de edad) se adquirieron en los laboratorios Charles River y se mantuvieron en las instalaciones para animales durante una semana antes de su inmunizacion. Un dfa antes de la inmunizacion, todos los ratones se han pesado, y a continuacion se evaluaron en el Ensayo de Rotarod.
Rotarod:
Dias de entrenamiento: 9 y 8 dfas antes de la inmunizacion. Transferencia de los ratones, en sus jaulas de alojamiento, desde la habitacion de mantenimiento a la habitacion experimental. Los ratones se habituan a la habitacion experimental durante 15 min. Durante el periodo de entrenamiento, cada raton se puso en el rotarod a una velocidad constante (4 rpm) si un raton se cafa, se ponfa de nuevo en el rotarod, a continuacion los ratones estaban comodos en el rotarod, los ratones vieron corriendo durante 120 s. Todos los ratones se devolvieron a su jaula, la velocidad se aumento a 13 rpm y los ratones se pusieron de nuevo en el rotarod durante 120 s. Todos los ratones se devolvieron a su jaula, la velocidad se aumento a 19 rpm y los ratones se pusieron de nuevo en el rotarod durante 120 s. El entorno de la habitacion experimental se mantuvo constante entre sesiones de ensayo con respecto a temperature e intensidad de la luz.
Dfas de ensayo:
1 dfa antes de cada inmunizacion, los ratones se transfirieron en sus jaulas de alojamiento, desde la habitacion de mantenimiento a la habitacion experimental. Los ratones se habituaron a la habitacion experimental durante 15 min. A continuacion los ratones recibieron dos ensayos a 10 niveles crecientes de velocidad, que variaban de 7 a 40 rpm. Los retrasos individuales antes de caerse del rotarod (para los dos ensayos a cada nivel de velocidad) se registraron hasta 60 s. Por lo tanto, el entrenamiento y el rendimiento en el sistema Rotarod se determinaron para cada animal. Los resultados del ensayo ROTAROD se expresan como cinetica de la media de puntuaciones individuales para cada grupo con ETM indicada con barras, para cada dfa del ensayo y para cada velocidad del ensayo dentro del rango de discriminacion para alteracion neuromotora en las presentes condiciones (de 16 a 29 rpm).
Se calculan para cada raton individual, para cada dfa de ensayo y para cada valor de velocidad, como el aumento o perdida relativa de tiempo o en el Rotarod (antes de caer), en comparacion con el primer dfa de ensayo a la misma velocidad (D-7, antes de comenzar la induccion de la enfermedad en los grupos relevantes). El valor se calcula como "Tiempo en Rotarod el dfa X" - "Tiempo el Dfa-7 para el mismo raton a la misma velocidad". Las Figuras ilustran la cinetica para los diferentes grupos en todo el periodo de estudio, para valores de velocidad discriminatoria relativa representativos cuando se validan para diferenciar los animales enfermos de los sanos en las condiciones de los investigadores (por ejemplo, valores de velocidad demasiada elevada o demasiado baja Ya se ha hecho dos para los sanos que caen inmediatamente o para los enfermos capaces de mantener un movimiento lento).
Los datos iniciales de pesos y rendimientos sirvieron como referencias para los investigadores, en un entorno en el que cada animal ha sido su propio control, antes de calcular los valores medios y desviaciones estandar por grupo. En cada jaulas se alojaron de forma homogenea diferentes grupos de animales, de acuerdo con la informacion correspondiente proporcionada antes de cada serie experimental.
Evaluacion Cifnica
Los animales se pesaron y se puntuaron clfnicamente 5 dfas por semana de acuerdo con los siguientes criterios: 0 = sin signos; 1 = paralisis de la cola o hiperreflejo de la pata(s) trasera(s) o debilidad unilateral de la pata trasera; 2 = debilidad bilateral de la pata trasera o la pata delantera; 3 = mas paralisis unilateral o deficit principal; 4 = paralisis completa de la pata trasera o la pata delantera; 5 = mas paralisis parcial o deficit principal de patas opuestas; 6 = moribundo o muerto. Estos se adaptaron a partir de criterios convencionales, con el fin de reflejar la induccion mas rapida de lesiones cerebrales y del cordon cervical con este modelo.
Los ratones expresaron 3 veces a la semana el Lunes, el Miercoles y el Viernes durante todo el experimento.
Para las series experimentales del Ejemplo 3.A, los grupos se definieron como sigue a continuacion.
Todos los grupos de 6 (seis) ratones se han inyectado primero por s.c. en el cuello el dfa 0 y a continuacion en los costados dorsales los dfas 7 y 14; con 200 |jg de MOG/raton 60 |jg de MSRV-Env IFA.
El Grupo A fue el grupo de control positivo de EAE inducida por MSRV-Env sin ningun tratamiento.
Para los Grupos G a H, los tratamientos con GNbAc1, L-NAME, SMT y DMF solos o en combinacion con GNbAc1 con las dosis que se indican a continuacion, se han iniciado el dfa 12 despues de la inmunizacion cuando la progresion de los sfntomas clfnicos de EAE ya se observaba. El anticuerpo humanizado GNbAc1 se administro una vez, pero L-Name o SMT se administro cada 4 dfas hasta la finalizacion del estudio el dfa 29. Con respecto a los Grupos E y H, atribuidos para el tratamiento con DMF, los investigadores han determinado previamente el volumen de consumo diario de agua por cada raton y se ha determinado que ( en la condicion de los investigadores), cada raton consumio aproximadamente 3,5 ml de agua potable al dfa. Por lo tanto, basandose en esta medicion, una dosis de 1 mg de DMF+ Methocel al 0,08 % por raton se a 3,5 ml de agua potable diaria amñeandtieó.
350 ng de toxina Pertussis (PTX) por animal se inyectaron (i.p.) en todos los grupos el mismo dfa despues de cada inyeccion de inmunogeno, y se replico 2 dfas mas tarde, como es habitual en protocolos de EAE con el fin de facilitar la migracion de linfocitos a traves de la barrera hemato - encefalica.
Presentation resumida de los Grupos experimentales del Ejemplo 3.A
Figure imgf000023_0001
3.A.3 Resultados:
Observaciones cifnicas:
La puntuacion de signos clfnicos y el peso se evaluaron regularmente como se ha descrito anteriormente. La cinetica de puntuacion de EAE durante el periodo de estudio se representa en las Figuras 16, 17 y 18.
Una evolucion regular y persistente de puntuaciones clfnicas de EAE tales como hiperreflexia, paralisis de la cola, debilidad de la extremidad posterior, debilidad de la extremidad anterior y paralisis parcial se pudo registrar en todos los ratones hasta el final o la experiencia en el grupo A (control positivo para EAE) y hasta el dfa 12 en otros grupos que se habfan tratado el dfa 12 con anticuerpo humanizado de GNbAc1 (grupo B) o anti radicales libres (grupo C, D, E) solo o los grupos que se han tratado de forma simultanea con GNbAc1 y anti radicales libres (grupos F, G, H). Observaciones despues del tratamiento: Los signos clfnicos en el grupo B tratado solo una vez con GNbAc1 disminuyeron ligeramente hasta el dfa 29. en los grupos tratados solamente con L-NAME, SMT, se pudo observar una recuperacion irregular, pero con una reduccion de la progresion de EAE. Se deberfa mencionar que, en el dfa 16, la inyeccion de SMT se interrumpio.
Con respecto a los grupos F, G y H tratados de forma simultanea con GNbAc1 y L-NAME, SMT and DMF respectivamente, y la recuperacion fue mucho mas significativa y en particular en los grupos G y H. Estos resultados sugieren que los efectos sinergicos aceleran y aumentan de forma significativa la recuperacion de los sfntomas de EAE. Tambien merece la pena mencionar que el tratamiento con estas sustancias no causo ninguna anomalfa en ningun grupo de ratones (incluyendo los ratones de control sometidos a ensayo por separado).
De acuerdo con los resultados que se presentan en las Figuras 16, 17 y 18, los investigadores pueden resumir que:
- la puntuacion clfnica mas elevada (peor evolucion de enfermedad) se pone en evidencia en animales sin tratar (grupo A). Los animales tratados solamente con GNbACI (grupo B) mejoran despues de su inyeccion (comenzando a partir del dfa 12).
- los grupos tratados solamente con L-Name o SMT presentaban puntuaciones de recuperacion y cinetica mas bajas que el grupo B.
- el grupo E tratado con DMF y el grupo F tratado con anticuerpo GNbACI (dosis individual de 200 pg) combinado con L-NAME presentaba una recuperacion equivalente al final del estudio.
- el grupo G tratado anticuerpo GNbACI combinado con SMT y el grupo H tratado con anticuerpo GNbACI combinado con DMF presentaba una recuperacion significativamente mejor al final del estudio y una cinetica mas temprana de mejora clmica que todos los otros grupos. Esto demuestra las ganancia sinergica de la combinacion de GNbACI y SMT, o GNbACI y DMF, para un resultado terapeutico significativamente mejorado.
Ensayo de Rotarod
En primer lugar se debeffa hacer explfcito que los Grupos etiquetados como "1 iny" y "2 iny" en la Figura 19 corresponden a animales de control inyectados solamente una vez (1) o dos veces (2) con protema Env y anffgeno MOG, en comparacion con las tres inyecciones de protema Env y anffgeno MOG necesarias para inducir EAE clmicamente evidente al igual que en todos los otros grupos. Representan ratones de control para Env por debajo del umbral patogenico y sin induccion de enfermedad clmica. confirman que con el fin de tener todos los animales sometidos a ensayo con diversos tratamientos inducidos para desarrollar una sintomatologfa y evolucion de EAE aguda y severa, fue necesario este patron de tres inyecciones. Por lo tanto, los efectos terapeuticos observados en los animales tratados son relevantes para una eficacia del tratamiento en condiciones de enfermedad en desarrollo y evolucionando.
De acuerdo con los resultados que se presentan en la Figura 19 con puntuacion de Rotarod a 23 rpm, los investigadores pueden observar que:
- El esfuerzo ffsico a 23 rpm ha alcanzado un umbral suficiente para resolver las disfunciones sensoriales y motoras principales en animales: el grupo A sin tratar tiene el resultado y cinetica peores, mientras que los animales a los que se les inyecta solamente una o dos veces ("1 iny o 2 iny") tienen smtomas significativamente mas leves y una evolucion mucho mejor. El deficit clmico peyorativo y progresivo del grupo B sin tratar confirma que la enfermedad y las correspondientes lesiones del SN eran muy activas con 3 inyecciones de Env. Por lo tanto, todos los otros grupos con diversos tratamientos se sometieron a una induccion de la enfermedad potente similar con Env.
- El Grupo B con EAE tratada con una sola inyeccion de 200 pg de GNbAC1 ha recuperado una puntuacion similar a la de los ratones de control sin induccion de enfermedad con baja exposicion a Env, al final del periodo de estudio.
- El efecto mas digno de atencion, en estas condiciones, se pone en evidencia para el grupo G tratado con anticuerpo GNbAC1 combinado con SMT que parece que tiene una curva de cinetica de recuperacion sorprendente que termina con la mejor puntuacion de todos los grupos al final del estudio. Esto demuestra el aumento sinergico de la combinacion de GNbAC1 y SMT para un resultado terapeutico significativamente mejorado.
- El Grupo D tratado solamente con SMT tambien presenta una mejora de la cinetica y resultados (ultimo punto del periodo de estudio), aunque en menor medida.
De acuerdo con los resultados que se presentan en la Figura 20 con puntuacion de Rotarod a 26 rpm, los investigadores pueden observar que:
- El esfuerzo ffsico a 26 rpm confirma que estas condiciones estan por encima del umbral requerido dentro del presente experimento para resolver las funciones sensoriales y motoras principales en animales: el grupo A sin tratar tiene el resultado y cinetica peores, mientras que los animales a los que se les inyecta solamente una o dos veces ("1 iny o 2 iny") tienen smtomas significativamente mas leves y una evolucion mejor (puntuaciones muy buenas al final del periodo de estudio para el grupo "1 iny").
- El Grupo B con EAE tratada con una sola inyeccion de 200 pg de GNbAC1 ha recuperado una puntuacion similar a la de los grupos D, G, C, E y H y a la de los controles de "2 iny", al final del periodo de estudio.
- El efecto mas digno de atencion, en estas condiciones, se pone en evidencia para el grupo F tratado con anticuerpo GNbAC1 combinado con L-NAME que parece que tiene una curva de cinetica de recuperacion sorprendente que termina con la mejor puntuacion de todos los grupos al final del estudio. El Grupo C tratado solamente con L-NAME tambien presenta una mejora de la cinetica y resultados, aunque en menor medida. Esto demuestra el aumento sinergico de la combinacion de GNbACI y L-NAME para un resultado terapeutico significativamente mejorado.
De acuerdo con los resultados que se presentan en la Figura 21 con puntuacion de Rotarod a 29 rpm, los investigadores pueden observar que:
- El esfuerzo ffsico a 29 rpm todavfa confirma que estas condiciones estan por encima del umbral requerido para resolver las funciones sensoriales y motoras principales en animales: el grupo A sin tratar tiene el resultado y cinetica peores, mientras que los animales a los que se les inyecta solamente una o dos veces ("1 iny o 2 iny") tienen sfntomas significativamente mas leves y una evolucion mejor con buenas puntuaciones similares al final del estudio.
- El Grupo B con EAE tratada con una sola inyeccion de 200 pg de GNbAC1 ha recuperado una puntuacion similar a la de los ratones de control sin induccion de enfermedad con baja exposicion a Env, al final del periodo de estudio.
- El efecto mas digno de atencion, en estas condiciones, se pone en evidencia para el grupo F tratado con anticuerpo GNbAC1 combinado con L-NAME que todavfa parece que tiene una curva de cinetica de recuperacion buena que termina con la mejor puntuacion de todos los grupos (final del estudio). El Grupo C tratado solamente con L-NAME presenta una mejora de la cinetica y resultados, aunque en menor medida. - Otro resultado digno de atencion general es la mejor a regular de ratones del grupo B tratados solamente con GNbAC1, que siempre presento puntuaciones estabilizadas y/o mejoradas en gran medida en comparacion con los animales sin tratar (grupo A) en todas las condiciones (ensayos de 16 a 29 rpm).
Sin embargo, esta eficacia evidente desvelo en gran medida el enfasis por la combinacion de GNbAc1 con L-NAME o SMT. Tambien se mejoro con la combinacion con DMF, pero con cinetica mas lenta. De todos modos, esto no impide una mejora mas elevada con dosis optimizadas y con un tratamiento a plazo mas largo.
Por lo tanto, en todas las condiciones de ensayo (incluyendo puntuacion clfnica) la combinacion de SMT, L-NAME o DMF con GNbAC1 proporciona una ventaja significativa para recuperacion clfnica y funcional, con respecto al uso de cualquier molecula terapeutica administrada sola. Tomadas de forma individual, parece que las moleculas pequenas tienen efectos mas bajos y bastante transitorios, mientras que el GNbAC1 tiene efectos de larga duracion que proporcionan una mejor recuperacion al final del estudio en comparacion con estos farmacos pequenos, que de ese modo muestran una eficacia prolongada.
Al verse mejorada de forma significativa la cinetica y la amplitud de la recuperacion final con las combinaciones, ahora se muestra una ventaja del uso de una combinacion de los presentes agentes terapeuticos para sus efectos energicos y dirigidos en la recuperacion final in vivo. esto demuestra una indicacion para una eficacia clfnica mas temprana y mas potente en la enfermedad en seres humanos.
3.B. Comparacion de la eficacia terapeutica de dos dosificaciones de anticuerpo anti-Env administrados solo como monoterapia, o en combinacion con farmacos anti-NO.
3.B. 1 Materiales y Metodos:
Cuando no se especifica, todos los materiales y metodos son como se describieron para el Ejemplo 3A.
Grupos experimentales
Pr n i n r mi l r x rim n l l E m .B
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Todos los ratones recibieron tres inyecciones s.c. en el cuello a DO, en el costado dorsal a D7 y D14. Aquf, a los ratones del Grupo A se les inyectaron 200 pg/raton de MOG e IFA solo, sin Env, constituyendo de ese modo un grupo de control negativo sin EAE en la presente serie (ctrl -). El grupo de control positivo con EAE sin tratar en la presente serie se representa con el Grupo B (ctrl ). A otros grupos se les inyectaron 200 pg de MOG/raton MSRV-ENV (60 pg) IFA, con tratamientos como se ha indicado en la presentacion resumida que se ha mencionado anteriormente. Los tratamientos se han comenzado el dfa 12 despues de la inmunizacion en sus grupos correspondientes.
Los Grupos C, E, G recibieron 200 pg de GnbAc1 en J12; los Grupos D, F, H recibieron 500 pg de GnbAc1 en J12; el Grupo B recibio solamente solucion tampon de GNbAc1.
Los Grupos E y F decidieron inyeccion I. P de SMT (200 mg/raton) dos veces a la semana en J12, J14, J19, J21, J26 y J28.
Para los Grupos G y H que reciben DMF, los investigadores han determinado previamente el volumen de Consumo de agua diaria por cada raton y se ha observado que (en la condicion de los investigadores), cada raton consumfa aproximadamente 3,5 ml de agua potable al dfa. Por lo tanto, basandose en esta medicion, una dosis de 2 mg de DMF+ Methocel al 0,08 % por raton se al 3,5 ml de agua po atñaabdleió al dfa.
Para cada velocidad de ensayo de rotarod, los resultados se validaron cuando las curvas que correspondfan a los ratones sin tratar EAE inducida por Env (Grupo B, que representa controles positivos con eAe sin tratar) mostraban un deficit significativo en comparacion con los controles simulados (Grupo A, inmunizado con MOG diluido en IFA sin protefna Env). Los resultados se consideraron "no interpretables" cada vez que tal criterio no se emparejaba, dado que las correspondientes condiciones tecnicas y experimentales no pasaban el control de calidad basandose en esta divergencia significativa de curvas de grupos de "EAE positiva con respecto a negativa".
Despues del dfa 20, se realizo una inyeccion intravenosa (I.V.) con 20 pg de MSRV-Env en solucion salina fisiologica para crear una estimulacion aguda sistemica por la protefna MSRV-Env en todos los ratones, cuando se habfa obtenido una mejora clfnica significativa (similar a una remision) con la mayorfa de los tratamientos en ratones con EAE. Esto se realizo el dfa D21, para ratones de los grupos B, D, F y H, o en el dfa D22, para ratones de los grupos A, C, E y G. Esto se realizo con el fin de estudiar la respuesta de los diferentes grupos a una antigenemia de Env aguda y para evaluar diferencias eventuales en la eficacia protectora de diversos tratamientos.
3.B.2 Resultados:
Observaciones Cifnicas
La puntuacion de signos clfnicos y peso se evaluaron regularmente como se ha descrito anteriormente. La cinetica de puntuacion clfnica de EAE durante el periodo de estudio se representa en las Figuras 22, 23 y 24. Las curvas de peso, que indican un aumento de peso relativo en comparacion con el dfa antes de la primera inyeccion de inmunogenos, se presentan en las Figuras 25, 26 y 27.
Ensayo de Rotarod
Los resultados de los ensayos de Rotarod se presentan a diferentes velocidades (16; 26; 29 rpm) en las Figuras 28, 29 y 30.
Esta serie de experimentos se dirigfan a la influencia de un medio (200 pg) con respecto a elevado (500 pg) de anticuerpo GNbAC1 terapeutico como una monoterapia y se hicieron comparaciones similares cuando se combinaba con SmT y de DMF.
La comparacion global de las curvas de puntuacion clfnica durante el periodo de estudio se han validado dado que (i) la EAE inducida por Env sin tratar (grupo B) tiene la evolucion mas peyorativa y (ii) los controles inmunizados de forma simulada sin EAE (grupo A) no tienen senales clfnicas detectables durante el periodo precedente a la inyeccion intravenosa (I.V.) de Env en el dfa 20.
Hasta esta inyeccion iv en el dfa 20, todos los grupos tratados eran notable y marcadamente diferentes de la EAE inducida por Env sin tratar. En el Dfa 20, los grupos tratados con diferentes simetricas de enfermedad durante el periodo de estudio presentaban una puntuacion comparable con un valor medio por debajo de 0,5, lo que indica un perfodo de revision en todos los grupos tratados. Que confirmo una eficacia de todas las dosificaciones de anticuerpo y de todas las combinaciones sometidas a ensayo con cualquiera de DMF o SMT. A partir de ese momento, la estimulacion con inyeccion intravenosa (iv) de protefna Env en el dfa 20, imito a un pico de expresion de Env y su liberacion en el torrente sangufneo, tal como se esperaba durante el inicio de una recafda nueva y severa de la enfermedad de origen natural. Como se muestra en las Figuras 22, 23 y 24, tiene diferencias significativas en la potencia terapeutica de los diferentes productos y dosis:
1) GNbACI desvelo ser muy eficaz para transmitir resistencia a este pico de antigenemia de Env a dosificacion de 500 pg (grupo D), pero una alteracion clfnica transitoria se observo con una dosificacion de 200 pg (grupo C).
2) En el caso de combinacion con SMT, no se observaron variaciones significativas de la puntuacion clfnica en ambas dosificaciones de GNbACI (grupos E y F). Por lo tanto SMT transmitio un aumento de la resistencia a la estimulacion IV con MSRV-Env a ratones tratados con la dosificacion mas baja de GNbACI (200 pg) en comparacion con los ratones tratados con el anticuerpo solo a esta dosis mas baja (Grupo C).
3) Los ratones tratados con DMF mostraron resistencia clfnica a este pico de antigenemia cuando tambien se trataron con el grupo de dosificacion de GNbACI mas elevado (grupo H) pero fallo en la prevencion de la alteracion clfnica en la dosificacion mas baja (grupo G). Por lo tanto DMF no transmitfa un aumento de la resistencia a la estimulacion IV con MSRV-Env a ratones tratados con la dosificacion mas baja de GNbACI (200 pg). Los ratones tratados con DMF y la dosificacion de GNbACI mas elevada (500 pg, en el Grupo H) presentaban una resistencia comparable con la de los ratones tratados solamente con GNbACI a la misma dosis (Grupo D).
4) Las curvas que indican el aumento de peso durante el periodo de estudio en todos los grupos muestran de manera sorprendente que el grupo D, tratado con GNbACI a 500 pg, presentaba el mejor punto final.
5) GNbACI a 200 pg (grupo C) o DMF con GNbACI solo con la dosificacion mas elevada (grupo H), proporciono puntos finales equivalentes a los de los controles simulados.
Esto indica que, mas alla de una eficacia relativa de diversos tratamientos mostrados con cinetica de puntuacion clfnica:
- el anticuerpo GNbACI solo a la dosificacion mas elevada (500 pg) presento la mejor eficacia clfnica. tambien tenia un efecto positivo en la salud global de animales tal como se desvela con la cinetica de aumento de peso. - cuando se combina con GNbACI a la dosis mas baja (200 pg), se desvelo que SMT transmitfa un aumento significativo de la eficacia al tratamiento, con resistencia completa a la estimulacion final IV con MSRV-Env. Esto indica que GNbACI desvela el tratamiento mas potente, ya que proporcionan los mejores resultados con la dosis mas elevada (500 pg) pero que, a su dosis mas baja (200 pg), esta potenciado fuertemente por la combinacion con SMT que evitaba de forma eficaz el agravamiento clfnico despues del pico de antigenemia de Env creado por la inyeccion iv al final del estudio.
Ademas, estos resultados tambien sugieren que las dosificaciones mas elevadas de GNbACI, solo o en combinacion con la presente dosificacion de DMF, podrfan mejorar un aumento significativo de la eficacia terapeutica en la salud general (de acuerdo con las curvas de aumento de peso).
Sin embargo, una sinergia eventual de SMT o DMF con GNbACI a la dosis mas elevada, si existiera, no se puede observar dado que el anticuerpo solo ya proporciona una eficacia terapeutica maxima en las presentes condiciones de induccion de enfermedad y actividad en ratones con EAE.
En paralelo, los analisis de Rotarod confirman de manera objetiva, a todas las velocidades relevantes (Figuras 28A, 29A y 30A), que la dosificacion mas elevada de GNbACI (500 pg/raton) es significativamente el producto mas eficaz (dado solo) para mejorar el deficit neurologico de los ratones con EAE inducida por Env tratados.
El ensayo de Rotarod tambien confirma los efectos sinergicos de SMT con GNbACI, a la vez que muestra una mejora neurologica de animales tratados con la dosis mas baja de GNbACI combinada con SMT lo que muestra una mejora neuromotora significativa a 26 y 29 rpm (Figura 29B y 30B). A 16 RPM (Figura 28B), no parece que la velocidad mas baja proporcione una potencia discriminatoria suficiente para poner en evidencia este aumento clfnico durante el periodo estudiado.
Por ultimo, los resultados de Rotarod muestran una mejora en ratones con EAE inducida por Env con DMF a ambas dosificaciones de GNbAC1, pero esto llega a ser claramente significativo solamente a 29 rpm (Figura 30C).
En consecuencia, teniendo en cuenta los resultados de este ensayo objetivo y automatizado que evalua el rendimiento neurologico de los animales, parece que GNbACI es claramente un tratamiento robusto cuando se proporciona en una base de inmunoterapia como en este momento, en el ejemplo 3.B. Los efectos sinergicos con moleculas anti-NO, como se observa con GNbACI a la dosis mas baja con SMT, tambien se ponen claramente en evidencia e indican un aumento terapeutico potente. Esto debe existir con diversas dosificaciones de GNbACI, pero no se pudo observar en las presentes condiciones con los efectos ya maximos de 500 pg de GNbACI.
3.C. Comparacion entre anticuerpo anti-Env o Fumarato sodico solo (monoterapia), y anticuerpo anti-Env con Fumarato sodico (terapia combinada).
3.C.1 Material y Metodos
Material
Figure imgf000028_0001
Grupos experimentales
Figure imgf000029_0001
3.C.2 Resultados:
Observaciones clfnicas:
La puntuacion de signos clfnicos y el peso se evaluaron regularmente como se ha descrito anteriormente. La cinetica de puntuacion de EAE durante el periodo de estudio se representa en la Figura 31.
El Grupo A que representa controles negativos inyectados con IFA, MOG sin protefna Env y una inyeccion de placebo de anticuerpo que consistfa en su tampon diluyente, nunca presento sfntomas clfnicos significativos durante el periodo de estudio.
Una evolucion de las puntuaciones clfnicas de EAE se pudo registrar hasta el dfa 12 en grupos que se habfan tratado en el dfa 12 con anticuerpo humanizado GNbAc1 (grupo C) o con Fumarato sodico, radicales libres de anti Oxido Nftrico relacionados con d Mf (anti-NO), solo en el grupo D o de forma simultanea con GNbAc1 en el grupo E.
Aquf de forma interesante, solamente los grupos que han recibido el anticuerpo GNbAC1 a dosis elevada (C y E) han mostrado una reversion significativa de sus curvas de puntuacion clfnica y un punto final mejorado de forma significativa al final del estudio. El Grupo D tratado con solamente Fumarato sodico solamente no desvelo ninguna mejora clfnica significativa en comparacion con el Grupo B tratado con un anticuerpo de control de isotipo ineficaz (solapamiento de las barras de error en las curvas). Una evolucion regular y persistente de las puntuaciones clfnicas de EAE se pudo registrar en todos los ratones hasta el final del experimento en el grupo B (EAE inducida por Env) tratados con el anticuerpo de control de isotipo sin especificidad para la protefna Env. Esto indica que los efectos terapeuticos observados con GNbAC1 son especfficos para este anticuerpo en particular y no se relacionan con la inyeccion de ningun anticuerpo humanizado con el mismo isotipo que, por ejemplo, podrfa no dirigirse al mismo epftopo.
Por lo tanto este ultimo ejemplo muestra que:
- El Grupo A de control sin inyeccion de protefna Env se comporto como controles sanos sin signos clfnicos, a pesar de una inyeccion de todos los otros componentes necesaria para simular la EAE inducida por Env (IFA y MOG) asf como para simular la inyeccion de anticuerpo (Diluyentes del Anticuerpo); la administracion simulada de Fumarato sodico soluble en agua siendo implfcitamente proporcionada por el agua potable normal.
- La puntuacion clfnica mas elevada (peor evolucion de la enfermedad) se pone en evidencia en animales tratados con el con anticuerpo de control de isotipo irrelevante (grupo B). Por lo tanto esta inyeccion de anticuerpo de isotipo simulado en presencia de protefna Env desvelo la produccion de un control de EAE positivo con una evolucion de EAE habitual.
- El Grupo D tratado con Fumarato Sodico solamente tenia un mal resultado al final del estudio, similar al del Grupo B tratado con un anticuerpo de control ineficaz.
- Los Grupos C y E tratados con dosis elevada de anticuerpo GNbAC1 solo o en combinacion con Fumarato Sodico presentaban una recuperacion equivalente y significativamente buena al final del estudio. La mejorfa clfnica aparecio desde el dfa 15, despues de que hubiera comenzado el tratamiento.
En el presente documento, ya que el Fumarato Sodico solo no tenia efecto y ya que parece que la cinetica de la curva de los grupos C y E es equivalente, el efecto terapeutico observado en estos dos grupos debe ser producido total y solamente por GNbAC1 mientras que se desvela que el Fumarato Sodico es ineficaz.
3.D Analisis de Resultados generales del Ejemplo 3
En conclusion, solos o combinados, los tratamientos con anticuerpo especffico anti-Env, tal como GNbAc1 y compuestos de radicales libres anti-oxido nftrico (anti-NO), tales como DMF, SMT o L-Name, son ventajosos porque tratan el bloqueo de la actividad potencial de remielinizacion por la protefna de envoltura HERV-W, en particular MSRV-Env, in vitro y in vivo.
GNbAc1 a dosificacion elevada (500 pg / raton de aproximadamente 20-25 g) tambien desvelo una eficacia particular en comparacion con la dosis mas baja (200 pg), cuando se administraba solo como una monoterapia en los presentes ejemplos.
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Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un ligando anti-Env de MSRV/HERV-W y al menos un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico,
en la que:
- dicho ligando anti-Env de HERV-W es un anticuerpo, mas particularmente un anticuerpo quimerico, modificado por ingenierfa genetica o humanizado, e incluso mas particularmente una IgG, tal como una lgG1 o una lgG4, en la que dicho anticuerpo comprende cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que se presentan en las SEQ ID N.° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N.° 3, SEQ ID N.° 4, SEQ ID N.° 5, y SEQ ID N.° 6; - dicho farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico se selecciona entre el grupo que consiste en Ng-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT) y fumarato de dimetilo (DMF).
2. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 1 para uso en la prevencion y/o el tratamiento del bloqueo de la remielinizacion en una enfermedad asociada con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV,
en el que dicha enfermedad asociada con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV) se selecciona entre el grupo que consiste en esclerosis multiple, mas particularmente Esclerosis Multiple Remitente-Recurrente (RRMS), la Esclerosis Multiple progresiva tal como Esclerosis Multiple Progresiva Secundaria (SPMS) o Esclerosis Multiple Progresiva Primaria (PPMS), Polineuropatfa Desmielinizante Inflamatoria Cronica (CIDP), y psicosis tales como Esquizofrenia o Trastorno bipolar.
3. Un producto farmaceutico que contiene:
- Al menos un ligando anti-Env de HERV-W; y
- Al menos un farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico;
como un producto de combinacion para una administracion simultanea, separada o prolongada en el tiempo para uso en prevencion y/o tratamiento del bloqueo de la remielinizacion en una enfermedad asociada con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV, en el que:
- dicho ligando anti-Env de HERV-W es un anticuerpo, mas particularmente un anticuerpo quimerico, modificado por ingenierfa genetica o humanizado, e incluso mas particularmente una IgG, tal como una lgG1 o una lgG4, en el que dicho anticuerpo comprende cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que se presentan en la SEQ ID N.° 1, SEQ ID N.° 2, SEQ ID N.° 3, SEQ ID N.° 4, SEQ ID N.° 5, y SEQ ID N.° 6; - dicho farmaco inhibitorio de radicales de Oxido Nftrico se selecciona entre el grupo que consiste en Ng-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT) y fumarato de dimetilo (DMF), y
- dicha enfermedad asociada con la expresion de la protefna de envoltura HERV-W (ENV) se selecciona entre el grupo que consiste en esclerosis multiple, mas particularmente Esclerosis Multiple Remitente-Recurrente (RRMS), la Esclerosis Multiple progresiva tal como Esclerosis Multiple Progresiva Secundaria (SPMS) o Esclerosis Multiple Progresiva Primaria (PPMS), Polineuropatfa Desmielinizante Inflamatoria Cronica (CIDP), y psicosis tales como Esquizofrenia o Trastorno bipolar.
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