UA119032C2 - Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки herv-w - Google Patents

Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки herv-w Download PDF

Info

Publication number
UA119032C2
UA119032C2 UAA201504292A UAA201504292A UA119032C2 UA 119032 C2 UA119032 C2 UA 119032C2 UA A201504292 A UAA201504292 A UA A201504292A UA A201504292 A UAA201504292 A UA A201504292A UA 119032 C2 UA119032 C2 UA 119032C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
epm
shk
shi
ors
still
Prior art date
Application number
UAA201504292A
Other languages
English (en)
Inventor
Ерве Перрон
Реза Фірузі
Патрік Кьюрі
Рафаель Фокар
Александра Мадейра
Жюлі Жоану
Original Assignee
Женеро Са
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Женеро Са filed Critical Женеро Са
Publication of UA119032C2 publication Critical patent/UA119032C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/194—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having two or more carboxyl groups, e.g. succinic, maleic or phthalic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/221—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin with compounds having an amino group, e.g. acetylcholine, acetylcarnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/223—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of alpha-aminoacids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/225—Polycarboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується фармацевтичної композиції для профілактики і/або лікування знову виявленого пошкоджуючого механізму, що блокує здатність відновлення ендогенного мієліну зрілої нервової системи (НС) при захворюваннях, пов'язаних з експресією білка оболонки (ENV, envelope protein) HERV-W (human endogenous retrovirus, ендогенний ретровірус типу W людини), а саме його підтипу MSRV (multiple sclerosis-associated retrovirus, ретровірус, асоційований з розсіяним склерозом).

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується фармацевтичної композиції для профілактики і/або лікування знову виявленого пошкоджуючого механізму, що блокує здатність відновлення ендогенного мієліну зрілої нервової системи (НС) при захворюваннях, пов'язаних з експресією білка оболонки (ЕММ, епмеіоре ргоїєїп) НЕВМУ-М/ (питап епдодепоиз геїгоміги5, ендогенний ретровірус типу УМ людини), а саме його підтипу МКМ (тийіріе зсіегов5із-аззосіаїей геїгоміги5, ретровірус, асоційований з розсіяним склерозом).
Область винаходу
Даний винахід належить до інноваційних сполук і композицій для профілактики і/або лікування нововиявленого ушкоджуючого механізму, що блокує здатність відновлення ендогенного мієліну в зрілій нервовій системі (НС) при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ, епмеІоре ргоївіп) НЕКМ-М/ (питап епдодепоив5 геїгоміги5, ендогенний ретровірус типу МУ людини), зокрема, його підтипу М5КМ (тийріе 5сіеговіз-аззосіаїей геїгомігив, ретровірус, асоційований з розсіяним склерозом).
Даний новий терапевтичний підхід поєднує в собі інгібування верхніх патогенних впливів Епм на клітини попередники олігодендроцитів (ОРС5, оїЇїдодепагосуїе ргесигбог сеїї5) разом з інгібуванням нищерозміщених ефекторів патогенності Епм на диференціацію ОРС (МО радикали), які, як в даний час показано, блокують ремієлінізацію при НЕНКУ-МУ асоційованих захворюваннях, що впливають на нервову систему.
Даний винахід відноситься до терапевтичних композицій, які містять (і) принаймні один ліганд анти-НЕВМУ-МУ Епм, і/або (ії) принаймні один лікарський засіб, який інгібує вільні радикали окису азоту (МО, Міїгіс Охуде), що застосовуються для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його підтипу МБ5КМ.
Композиція, при якій поєднані як ліганд, так і лікарський засіб, який інгібує МО, впливає на вищерозміщений індуктор Епу, так само як і на нищерозміщені МО ефектори, в вищеописаному процесі, який викликає блокаду ремієлінізації при ураженнях НС.
Крім того, синергічна дія двох типів сполук (націлених на Епм і МО, відповідно) підвищує швидкість і ефективність терапії у пацієнтів з не-ремієлінізуючими ураженнями, які викликані активацією НЕКМ-М/ (зокрема, асоційованих з МЗКМ підтипом, який виділений як частинка віріонів з клітин М5') і експресією його Епм білка в нервовій системі.
Докладний опис винаходу
У відповідності з першим аспектом, даний винахід відноситься до ліганду анти-НЕНМ-М/ Епу, що застосовується для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при хворобах, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його підтипу МЕМ.
У даному винаході, терміни "блокада диференціювання" або "блокада ремієлінізації"
Зо застосовують для узагальнення нещодавно виявленого явища, що складається в (ії) інгібуванні диференціації клітин попередників олігодендроцитів (ОРС»5, оЇїдодепагосуїге ргесигзог сеїїв5), яке викликано білююм оболонки НЕКМ-М/ (зокрема МКМ підтипом), (ії) в кінцевій продукції МО з
ОРСЗ, і (ії) кінцевому інгібуванні продукції мієліну ОРС»5, як описано в Прикладі 1.
Хвороби, пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його підтипу М5КМ, визначають як НЕКМ-М/ асоційовані захворювання, що вражають нервову систему, які переважно є, але не обмежуються ними, розсіяним склерозом (М5, тийПіріє 5сіІегоб5ів), переважно рецидивуючим ремітуючим розсіяним склерозом (ККМ5, гетійіпд-геІарзіпуд тийПіріе 5сІего5із), прогресуючим розсіяним склерозом, таким як вторинний прогресуючий розсіяний склероз (5РМ5, зесопаагу ргодгебвзіме тийКіріє зсіего5і5) або первинний прогресуючий розсіяний склероз (РРМ5, ргітагу ргодгеззіме тийіріє зсіего5із), хронічною запальною демієлінізуючою полінейропатією (СІОР?, сПпгопіс іпПйаттайогу аетуеїїпайпуд роїупеигораїйу), психічними розладами, такими як шизофренія або біполярні розладит, для яких також описано пошкодження мієліну»,
Зазвичай, ураження при розсіяному склерозі (М5) пов'язані з імуно-опосередкованою втратою олігодендроцитів і мієлінових оболонок при пошкодженні аксонів. Так само описано вплив на імунні клітини, який опосередкований білком оболонки (ЕММ) ретровірусу, що асоційований з розсіяним склерозом (М5КМ, Мийіріеє Зсіегов5іб5 аззосіатейд геїгоміги5) з НЕКМ-МУ/ сімейства ендогенних ретровірусів, в асоціації з запальними ураженнями нервової системи (НС). Однак, безпосередня патогенність МОЕМ-Епм на гліальні клітини, що включає блокаду ремієлінізації бляшок М5 клітинами попередників олігодендроцитів (ОРС), раніше не була відома і ніколи не була показана.
Відповідно до одного аспекту даного винаходу, інгібування верхніх патогенних впливів Епм на клітини попередники олігодендроцитів (ОРС5) здійснюється за рахунок ліганду анти-НЕНМ-М/
Епу. Ліганд анти-НЕНУ-МУ/ Епм за даним винаходом визначається його здатністю зв'язуватися з білком Епу.
Термін "зв'язування" або "приєднання" ліганду означає щонайменше тимчасову взаємодію або об'єднання з антигеном-мішенню, наприклад ЕММ, що включає фрагменти, що містять епітоп.
Згідно з даним винаходом, НЕКМ-УМ ЕММ означає білок, який кодується геном епм будь-якого члена родини НЕКМ-МУ, в тому числі підтипу МКМ, як визначено з послідовностей, які визначені у РНК ретровірусних частинок з М5"»- 27,
Ліганд за даним винаходом також може бути визначений, як такий, що міститься всередині рекомбінантного білка 5сЕм (зіпдіе-спаіп їтадтепі ої магіаріе гедіоп, одноланцюговий фрагмент варіабельної області), Рар-фрагменти (їГадтепі апіїдеп Бріпаїпо, ділянка зв'язування антигену), антитіла, при цьому зазначене антитіло може бути поліклональним, моноклональним, олігоклональним, химеризованим, синтетичним, або гуманізованим, або людським антитілом. У конкретному аспекті винаходу, антитіло, що містить ліганд, є гуманізованим або людським Ід (імуноглобулін) С, і, більш переважно Ідс1 або Ідо4.
Більш конкретно, ліганд за даним винаходом містить щонайменше один, і більш переважно кожну з ділянок, які визначають комплементарність (СОК»5, сотріетепіагу-деїептіпіпу гедіопв), що мають амінокислотні послідовності зХЕО ІЮ Мо. 1, БЕО ІЮ Мо. 2, 5ЕО ІЮО Мо. 3, 5ЕО ІЮО Мо. 4,
ЗЕО ІЮ Мо. 5 і ЗЕО ІЮ Мо. 6.
Вищезгаданий ліганд містить щонайменше один і, більш переважно, кожну з ділянок, які визначають комплементарність (СОК»5), які кодуються ЗЕО ІО Мо. 25, 5ЕО ІО Мо. 26, 5ЕО ІО Мо. 27, ЗЕО І Мо. 28, 5ЕО ІО Мо. 29, 5ЕО ІО Мо. 30.
Як зазначено вище, блокада ремієлінізації також призводить до продукції МО клітинами
ОРОС. Згідно з подальшим аспектом даний винахід також відноситься до лікарського засобу, який інгібує радикал окису азоту, що застосовується для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його підтипу МБ5КМ.
Хвороби, пов'язані з експресією НЕКМ-М ЕММ визначені вище.
У більш конкретному аспекті винаходу, лікарський засіб, який інгібує вільні радикали окису азоту, або лікарський засіб, який інгібує МО є будь-яким лікарським засобом, який може інгібувати біологічний вплив МО молекул, які також називають МО радикалами. Лікарський засіб, який інгібує МО вибирають з Ме-нітро-І -аргінін метилового ефіру (І-МАМЕ), 5-метил- ізотіосечовини (З5МТ), фумарової кислоти і диметилфумарату (ОМЕ).
В іншому аспекті, даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка об'єднує щонайменше ліганд анти-МОНАМ/НЕНМ-УУ Епм, як визначено вище, і щонайменше один лікарський засіб, який інгібує радикал окису азоту, як визначено вище. Зазначену композицію застосовують для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-М/, зокрема його підтипу М5КУ, захворювань визначених вище.
Фармацевтичний продукт, що містить ліганд анти-НЕНМ-УМ Епм, як визначено вище, і лікарський засіб, який інгібує окис азоту, як це визначено вище, розглядається як комбінований продукт для одночасного, роздільного або рознесеного в часі введення для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕНУ-МУ, зокрема його підтипу МОКУ.
Згідно з результатами, які описані нижче на мишачих моделях експериментального алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ, ехрегітепіа!І ашоійттипе епсерпаїпотуеїйі5), що індукований
Епу, був показаний синергетичний ефект комбінації ліганду анти-М5АМ/НЕНМ-УМ Епм з щонайменше однією з МО-інгібуючих молекул, порівняно з будь-яким з цих терапевтичних агентів застосовуються окремо. Навіть при призначенні окремо, лікарські засоби, які інгібують радикали окису азоту, або ліганди анти-М5АМ/НЕВНМ-УМ Епм демонструють терапевтичну ефективність при відновленні клінічного дефіциту, як відомо, що пов'язаний з ураженням мієліну в ЕАЕВ. Тим не менше, порівняння між (ї) лікарським засобом, який інгібує радикал окису азоту або лігандом анти-М5АМ/НЕВУ-МУ/ Епм і (ії) комбінацією щонайменше одного лікарського засобу, який інгібує радикали окису азоту, і щонайменше одного анти-М5АМ/НЕВНМ-УУ Епхм ліганду, демонструє велику перевагу у застосуванні даної комбінації в процесі лікування.
Таким чином, відсутність запальних інфільтратів і/або пошкоджень з запальною активністю (наприклад, неактивні бляшки М5) не виключає лікування блокади ремієлінізації, яку індуковано
Епм у хворих. Дане особливо актуально у пацієнтів з прогресуючим М5 (первинної або вторинної прогресуючої форми), яке, як відомо, призводить до численних пошкоджень без запальної активності, які довго не виявляються при магнітно-резонансній візуалізації сигналу з контрастуванням гадолінієм при більшості ушкоджень головного і спинного мозку.
Даний винахід відноситься до способу профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його
МАМ підтипу, що включає введення щонайменше одного ліганду анти-М5ВМ/НЕНМУ-М/У Епу 60 людині.
У конкретному аспекті, спосіб додатково включає в себе введення щонайменше одного лікарського засобу, який інгібує радикали окису азоту.
В іншому аспекті, винахід відноситься до способу профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією НЕКМ-МУМ білка оболонки (ЕММ), зокрема його М5ЕМ підтипу, що включає введення щонайменше одного лікарського засобу, який інгібує радикал окису азоту, людині.
Короткий опис графічних матеріалів
Фігура 1. Виявлення білка Епм і експресія рецептора ТІ К4 у тканинах М5. (А, Б) Анти-Епу імуногістохімія показала наявність Епм білка (стрілки) в МАМУМ, що близька до активних хронічних уражень (Б), але не в білій речовині здорового мозку (А). (В) ОїЇїд2-позитивні ОРС5 в безпосередній близькості від Епум-позитивних клітин мікроглії в області хронічного активного ураження. (Г-Г") Контрольна здорова мозкова тканина з РОСЕКа (рецептор до фактору росту тромбоцитів с) -позитивними ОРОС, що демонструють ко-експресію ТІ К4 (толл-подібний рецептор 4) (стрілки). (Д-Д")У ОРС5 в МАМУМ близькі до активного ураження М5 хворих, що експресують як ТІ К4, так і РОСЕКа (стрілки). Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 2. Регуляція експресії ТІ К4 під час ОРС диференціювання. (А) Кількісна ЗТ-ПЛР, що показує прогресивну знижувальну регуляцію експресії ТІК4 у процесі спонтанного диференціювання ОРС щура в культурі протягом періоду дев'яти днів. Як ген для контролю експресії застосовували САРОН. Дані показані як середнє значення ч/-стандартне відхилення, яке отримано з 3 незалежних експериментів. ї--ест ("7Р«0,001). (Б, Б) Анти-ТІК4 імуно- фарбування показало, що при подавленні ТІ К4, що опосередкований малими шпильковими
РНК (зПЕМА, 5таїїІ-Наїгріп ЕМА), трансфековані ОРС» були позбавлені експресії ТІ К4 (стрілка), що говорить про специфічність антитіл. Показані ОРС були зафіксовані через три дні після трансфекції, і трансфековані клітини виявляли експресію есЕР (зелений флуоресцентний білок). Цікаво, що сусідні нетрансфековані клітини були ТІК4 позитивним. (В-Г)
Репрезентативні приклади галактоцереброзидази (саІС)/Т1К4 -позитивних ОРС після трьох днів (В, В) ї основний білок мієліну (МВР)/ТІК4 - позитивні ОРС5 після шести днів (Г, Г") спонтанного диференціювання в культурі Стрілки в (Г) вказують на більш високо диференційовані ОРС тільки зі зниженим рівнем експресії ТІ 4, таким чином, відображаючи
Зо дані про експресію генів, які показано в (А). Стрілками вказана сильна експресія менш зрілих клітин.
Фігура 3. Запальні ефекти рекомбінантного Епм на культурі ОРС щура. (А, Б, В)
Стимулювання ОРС рекомбінантним Епм в розчині (А, розчинний Епу), рекомбінантним Епм, що зв'язаний з поверхнею (Б; Епм твердий) і Епм, що зв'язаний з мембраною, (В) експресованих в рМІ4Епм трансфекованих 0343 клітинах гліобластоми, (Г-Г) призводить до сильної індукції експресії МОЗ після восьми годин стимуляції в порівнянні з відповідними буферними контролями або ОРС, які вирощені в присутності рмі4сіг! трансфекованих 343 клітин гліобластоми (Д-Д). У пробі рекомбінантного Епм рівень ендотоксину складав «5 ЕШ/мл (Епдоїохіп Опіїє5 в мл) як виміряно за допомогою тесту ГАЇ. (Г-Д) анти-Епм імуно-фарбування трансфекованих рмідЕпм і рмі4ені 0343 клітин, що демонструють поверхневу експресію Епм. (Е-
Ж) Олігодендрогліальна морфологія, як було оцінено шляхом 04 імуно-фарбування залишається незмінною при стимуляції зв'язаним з поверхнею рекомбінантним Епм, як було показано після одного дня (Е, Е), також як після п'яти днів (Ж, Ж) в культурі. (3) Непрямий спектрометричний аналіз супернатантів клітинної культури для вимірювання продукту розпаду
МО-нітриту показав значне збільшення дозозалежних рівнів МО в пробах ОРС, які стимульовані розчинним рекомбінантним Епм протягом 24 год. (І-Л) Прозапальні цитокіни, такі як ТМЕ(фактор некрозу пухлин-а, ІІ (інтерлейкін)-18 і І1/-6 піддаються регуляції при стимуляції поверхнево- зв'язаним рекомбінантним Епу. (ЗАРОН застосовували як контрольний ген. Дані показані як середні значення ч-/- стандартне відхилення, і є 1 із 6 (А), 8 (Б), З (В), З (3) і 8 (І-К) незалежних експериментів, відповідно. і-тест (""Р«0,001). Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 4. Порівняння чутливості до НЕКМ-МУ Епм у незрілих (у віці одного дня -ОРС) і зрілих
ОРСз» щура (у віці семи днів; "зрілі ОРС5" або олігодендроцити - ОЇ).
Обидва типи клітин стимулювали 100 нг/мл розчинного рекомбінантного Епу. Незважаючи на значну, порівняно з буферними контролями, активацію іМО5 і цитокінів у відповідь на Епм стимуляцію в ОЇ 5 є менш вираженою порівняно з ОРС. Для контролю експресії застосовували ген САРОН. Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартне відхилення, отриманого з одного із трьох незалежних експериментів. Її-тест (Р«к0,001, иР«к0,01, РО,05).
Фігура 5. Епм залежні реакції ОРС людини. (А) Стимулювання культивованих людських ОРС, зв'язаним з поверхнею (твердим) і розчинним рекомбінантним (розчинним) Епм, призводить до бо сильної індукції експресії ІМО5 через 24 год. стимуляції порівняно з клітинами, які оброблені буфером. Для контролю експресії застосовували ген ЗАРОН. Дані представлені у вигляді середніх значень ж/- стандартне відхилення, отриманого з одного із трьох незалежних експериментів. І-тест ("Р«0,001). (Б, Б) Імунофлуоресцентне фарбування культивованих саЇС позитивних ОРС людини виявило сильний сигнал для ТІ К4 (показано після трьох днів в культурі). Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 6. Експерименти по нейтралізації Епм шляху. (А) Теплова інактивація рекомбінантного Епм призводить до усунення індукції гену ЇМО5 порівняно з нативним рекомбінантним Епму після 8 год. стимуляції ОРС. Два зразки, нативний Епму і денатурований Епм (Епи, оброблений температурою), наносили в концентрації 1000 нг/мл. (Б, В) Зниження експресії
ЇМО5З в ОРС при фармакологічному інгібуванні ІКАК1/4 і ТКІР, відповідно. Після етапу 2 год. попередньої інкубації з 3200 нМ інгібітора І ІКАК1/4 (кіназа, асоційована з рецептором 1І--1) або 50 мкМ ТКІЕ інгібуючого пептиду ОРС стимулювали зв'язаним з поверхнею (твердим) рекомбінантним Епм протягом 8 год. і згодом лізували. (Г) Зниження експресії ІМО5 в ОРС після опосередкованої антитілом блокади рецепторів ТІ К4. Після етапу 2 год. преінкубації з антитілом до ТІ КА у концентрації 15 мг/мл при 37 "С, ОРС стимулювали твердим Епм протягом 8 год. і потім лізували. Для контролю експресії застосовували ген САРОН. Дані представлені у вигляді середніх значень ч/- стандартне відхилення, і отримані з одного із трьох незалежних експериментів кожен. ї-тест (Р«0,001, Р«О0,01). (Д) Збільшення ядерної локалізації МЕКВ після стимуляції ОРС зв'язаним з поверхнею (твердим) рекомбінантним Епм протягом 8 годин.
Дані представлені у вигляді середніх значень ч/- стандартне відхилення, і отримані з одного із трьох незалежних експериментів кожен. ї--ест (""Р«0,001). (Е-Ж) Репрезентативне МЕКВ імунофарбування буфера (контроль) і стимульовані Епм ОРС5. Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 7. Генерація З-нітротирозин (3-МТ) позитивних ОРС5. (А) Імунофлуоресцентне фарбування показало, що після 24 год. Епм стимуляції (зв'язаний з поверхнею рекомбінантний
Епу) значно більше ОРС експресували МО-залежний маркер нітрозильного стресу 3-МТ порівняно з обробленими буфером клітинами. Як позитивний контроль був використаний 5- нітрозо-М-ацетилпеніциламін (ЗМАР), сильний МО донор. Однак, коли ОРС інкубували з І-
МАМЕ, їЇМО5 інгібуючими молекулами, у концентрації 100 мкМ протягом 30 хв при 37 "С до Епм стимуляції, 3-МТ позитивність була знижена до контрольного рівня. Неактивний енантіомер О-
Зо МАМЕ не може усунути Епм залежну індукцію 3-МТ. Дані представлені у вигляді середніх значень «х/- стандартне відхилення, і випливають з одного з трьох незалежних експериментів. 1- тест (Р«0,001). (Б-Е") Репрезентативне анти-3-МТ імунофарбування контрольних клітин (Б,
Е), Епм стимульовані ОРСз (В, ВУ, ОРСз» пре-інкубовані з І -МАМЕ (Г, Г), О-МАМЕ (Д, Д» і ОРС»5, які піддаються ЗМАР (Е, ЕЕ). Масштабна смужка: 50 мкм. (Ж-Ж"). Імуногістофлуоресцентне фарбування зрізів тканини МАМУМ Мб5-пацієнтів показало, що резидентні ОРС (відмічені експресією їх маркера попередника РОСЕКа, стрілки) можуть піддаватися нітрозивному стресу, як показала їх 3-МТ позитивність.
Фігура 8. Епм залежне інгібування ОРС диференціювання. (А, Б) Імунофлюоресцентний аналіз, який демонструє, що після одного - трьох днів стимуляції зв'язаним з поверхнею рекомбінантним Епм, значно знижене число ОРС експресувало ранній мієліновий маркер
СМРавзе, також як пізній мієліновий маркер МВРах порівняно з контрольними клітинами. Дані показані у вигляді середніх значень -7/- стандартне відхилення, і отримані з одного з чотирьох незалежних експериментів. Її-тест (""Р«0,001). (8-В") ії (Г-ГУ) демонструють репрезентативне анти-СМРавхе і анти-МВР імунофарбування контролю і Епм стимульованих ОРС»5. (Д) Інкубація
ОРС» з 100 мкМ І-МАМЕ у поєднанні зі зв'язаним з поверхнею рекомбінантним Епм протягом трьох днів, призводить до припинення існування Епу-опосередкованої блокади ОРС диференціювання, як показано анти-МВР імунофарбуванням. Застосування О-МАМЕ виявилося не в змозі врятувати експресію мієліну. Дані представлені у вигляді середніх значень ж/- стандартне відхилення, і отримані з одного з чотирьох незалежних експериментів. ї-тест (РКО, 001, п.5. не суттєво). (Е-3) Репрезентативне МВР імунофарбування ОРС, які стимульовані тільки Епм, поєднанням Епм і Г-МАМЕ та поєднанням Епм і О-МАМЕ, відповідно.
Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 9. Експресія ОРС маркерів дозрівання через 24 і 72 годин стимуляції в камерах (Іабіекз) попередньо покритих М5КМ-Епи. Нанесений М5КМ-Епм (-Епу-Т), індукував зниження частки СМРазе позитивних ОРС після 24 год. стимуляції (А), а також зниження у відсотках МВР позитивних ОРС після 72 год. стимуляції (Б), порівняно з його розбавленим буфером (буфер).
Дані представлені у вигляді середнього значення -/-стандартна похибка одного експерименту оцінена в 10 повторах (від 410 до 563 порахованих клітин в групі; "р-«е0,05 І-тест (А) і з 364 по 491 порахованих клітин в групі; "р«0,001 ранговий критерій Манна-Уітні (Б)).
Фігура 10. Експресія СМРазе в ОРС людини після 24 годин стимуляції МБКМ-Епм і ЗМБАС1 (гуманізоване моноклональне антитіло у порівнянні з МКМ). (А) Нанесений М5ЕМ-Епи викликає зниження відсотка СМРазе позитивних ОРС після 24 год. стимуляції. (ЗМБАСІ1 при 50
НМ або 200 нМ повністю пригнічує ефект М5КМ-Епуи, при обох тестованих протоколах ЗМБАСІ1 обробки (ЗМБАС1-А або СМрАС1-В). Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартна похибка від 2 до 8 незалежних експериментів (від 705 до 3878 порахованих клітин в групі). (Б) ОМБАСІ (50 пМ або 200 пМ), які нанесені поодинці або разом з В5А (бичачий сироватковий альбумін) (1 мкг/мл), при обох тестованих протоколах обробки ЗМБАС1 (ЗМБАСІ1-
А або СМБАС1-В) не має ніякого впливу на відсоток СМРазе позитивних ОРОС. Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартна похибка одного експерименту оцінена в 10 повторностях (399 до 512 порахованих клітин в групі; р»0,05; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА)).
Фігура 11. Експресія СМРавзе в культурі ОРС людини після 24 годин стимуляції М5КМ-Епм і
СМБАСТ, які додані в культуральне середовище.
М5АМ-Епум (3 нМ), які розведені в клітинному культуральному середовищі, значно знижує
СМРахе експресію після 24 год. обробки. СМБАСІ1 (200 нМ) повністю інгібує даний ефект, в той час як він не показує ніякого ефекту самостійно. Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартна похибка від 2 до 4 незалежних експериментів (від 927 до 1913 порахованих клітин у групі); "р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА) з подальшим апостеріорним методом І 50 (Іез5 зідпійсапсе дібїапсе, найменш значна різниця) Фішера.
Фігура 12. Експресія МВР в культурах ОРС людини після 72 годин стимуляція М5КМ-Епм і
СМЬАСІ. (А) Нанесений МЗКМ-Епм (Епу-Т) індукує зниження у відсотках МВР позитивних ОРС після 72 год. стимуляції. ЗМБАСІ1 при 50 нМ частково інгібує дію МОКМ-Епм, і дане інгібування є повним при 200 нМ, в обох тестованих протоколах обробки ОМБАС1 (ЗМрАС1-А або СМЬБАС1-
В). (БУ МБКМ-Епм (З нМ), доданий в середовище клітинної культури, значно знижує експресію
МВР після 72 год. обробки. ЗМБАСТ1 (200 нМ) повністю інгібує даний ефект (Б).
Дані представлені у вигляді середнього значення -/- стандартна похибка (А) від 2 до 8 незалежних експериментів (від 924 до 4156 порахованих клітин у групі) "р«е0,05; ""р-«0,001
Зо порівняно з буфером; фр«0001 порівняно з Епу-Т; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА) з подальшим апостеріорним методом І 5О Фішера, і (Б) від 2 до 4 незалежних експериментів (1013 до 1834 порахованих клітин в групі; "р«0,001 у порівнянні з буфером; фр«0,001 у порівнянні з Епу-Т; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА) з подальшим апостеріорним методом І 50 Фішера).
Фігура 13. Експресія маркерів дозрівання ОРС через 24 і 72 години стимуляції за допомогою нанесення М5КМ-Епм і СМБАС1. Нанесений МО5КМУ-Епм індукує (А) зменшення відсотка СМРазе позитивних ОРС людини після 24 год. стимуляції, а також (Б) зменшення у відсотках МВР позитивних ОРС людини після 72 год. стимуляції. (А) ОМБАСІ1 (200 нМ) повністю інгібує дію
М5АМ-Епу, при обох тестованих протоколах обробки СМБАС1 (ЗМБАС1-А або СМБАС1-В). Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартна похибка б незалежних експериментів (від 2805 до 3039 порахованих клітин в групі; "р«0,05 у порівнянні з буфером; фр«0,05 у порівнянні з М5КМ-Епум; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом Стьюдент-Ньюман-Кейля і (Б) від 5 до б незалежних експериментів (1671 до 2066 порахованих клітин на групу; "р«0,05 у порівнянні з буфером; фр«0,05 у порівнянні з М5КМ-Епм; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом критерію Данна).
Фігура 14. Інгібування дозрівання ОРС людини, яке викликане М5КМ-Епум, повністю усувається ЗМБАСІ. Нанесений М5АКМ-Епм (ЕММ) індукує (А) зниження відсотка СМРазе позитивних ОРС людини після 24 год. стимуляції, а також (Б) зменшення у відсотках МВР позитивних ОРС людини після 72 год. стимуляції. ЗМБАСІ1 (200 нМ) повністю інгібує МБЕКМ-Епху ефект, в обох тестованих протоколах обробок ОМБАСІ (яЗМрАСІ А або їОМрАС1 В).
Результати виражені як відсоток СМРазе (А) або МВР (Б) позитивних клітин, і є середнім значенням -7- стандартна похибка 8-14 незалежних експериментів (3600 до 6800 порахованих клітин у групі (А) ї 2700 до 5800 порахованих клітин в групі (Б)) "р«0,05 у порівнянні з СТЕК; тр«0,05 у порівнянні з МБЕКМ-Епм; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом критерію Данна.
Фігура 15. Інгібування дозрівання ОРС людини, яке викликане М5КМ-Епум, повністю усувається СМБАСІ1 (нормалізовані дані). М5АМ-Епм наносили на скло культуральних камер перед посівом ОРС. СМБАСІ1 (200 нМ), змішували з МОКМ-Епм перед нанесенням (СМБАС1-А) 60 або інкубували на культуральних камерах, які покриті М5ЕМ-Епм (С.СМБАС1-В). Дані розраховуються як відсоток (АХ) СМРазе або (Б) МВР-позитивних клітин і виражені у вигляді відсотка зміни умовам СТКІ (М5КМ-Епм буфер). Результати є середнім значенням «/- стандартна похибка 8-14 незалежних експериментів (від 3600 до 6800 порахованих клітин у групі (А) і від 2700 до 5800 порахованих клітин в групі (Б)). "р«0,05 у порівнянні з СТЕК, "р«е0,05 у порівнянні з МЗКМ-ЕММ; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом критерію Данна.
Фігура 16. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, В і Е (А - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Б - ЕАЕ, оброблений ЗМБАс1 200мкг, В - ЕАЕ, оброблений ЇЇ - МАМЕ, Г - ЕАЕ, оброблений СМБАс 200 мкг «ж І -МАМЕ).
Фігура 17. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, Г їі Ж (А - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Б - ЕАЕ, оброблені ЗМрБАс1 200 мкг, Г - ЕАЕ, оброблені 5МТ, Ж - ЕАЕ, оброблені
СМБАс 200 мг я 5МТ).
Фігура 18. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, Д і З (А - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Б - ЕАЕ, оброблений СМБАСсІ1 200 мкг, Д - ЕАЕ, оброблений ОМЕ, З - ЕАЕ, оброблений 200 мкг ЗМБАсС-ОМЕ).
Фігура 19. Кінетика часу на Коїагой при 23 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо 7 дня. А: Групи А, Б, "1 ін'єкція" і "2 ін'єкції" Епм; Б: Групи А, Б,
ВІЕЄ:; В: Групи А,Б, ГІЖ; Г. Групи А, Б, Ді 3.
Фігура 20. Кінетика часу на Коїагой 26 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо 7 дня. А: Групи А, Б, "1 ін'єкція" і "2 ін'єкції" Епм; Б: Групи А, Б,
ВІЕЄ:; В: Групи А,Б, ГІЖ; Г. Групи А, Б, Ді 3.
Фігура 21. Кінетика часу на Коїагой при 29 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо 7 дня. А: Групи А, Б, "1 ін'єкція" і "2 ін'єкції" Епм; Б: Групи А, Б,
ВІЕ; В: Групи А, Б, Гі Ж; Р: Групи А, Б, Ді 3.
Фігура 22. Кінетика клінічного показника ЕАЕ ГрупА, Б, ВІГ (А-ЕАЄЕ хибно-негативні контролі, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Г - ЕАЕ,
Зо оброблений СМБАс 200 мкг, Г - ЕАЕ, оброблений СМБАс 500 мкг).
Фігура 23. Кінетика клінічного показника ЕАЕ ГрупА, Б, Ді Е (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Г - ЕАЕ, оброблений ЗМТ, Ж - ЕАЕ, оброблений СМБАс 200 мкг-ЗМТ)
Фігура 24. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, Ж і З (А - хибно-негативні контролі
ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Д - ЕАЕ, оброблений ЮМЕ, З - ЕАЕ, оброблений
СМБАс 200 мкг-ОМЕ).
Фігура 25. Кінетика збільшення маси за період дослідження (Відносне збільшення маси порівняно з днем до першої ін'єкції імуногенів): Групи А, Б, Ві Г (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, В - ЕАЕ, оброблений
СМБАс 200 мкг, Г - ЕАЕ, оброблений СМрАс 500мкг).
Фігура 26. Кінетика збільшення маси за період дослідження (Відносне збільшення маси порівняно з днем до першої ін'єкції імуногенів): Групи А,Б, Ді Е (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Г - ЕАЕ, оброблені
ЗМТ, Ж - ЕАЕ, оброблені ОМрАс 200мкг ж 5МТ).
Фігура 27. Кінетика збільшення маси за період дослідження (Відносне збільшення маси порівняно з днем до першої ін'єкції імуногенів): А, Б, Ж і З (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Д - ЕАЕ, оброблені ОМЕ,
З - ЕАЕ, оброблені СМБАс 200 мкг ї- ОМЕ).
Фігура 28. Кінетика часу на Коїагой при 16 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо Дня 7. А: Групи А, Б, Ві Г; Б: Групи А, Б, Ді Е; В: Групи А, Б,
ЖІіз.
Фігура 29. Кінетика часу на Коїагоа 26 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо Дня 7. А: Групи А, Б, В і Г; В: Групи А, Б, Ді Е; С: Групи А, Б,
ЖІіз.
Фігура 30. Кінетика часу на Коїагой при 29 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо Дня 7. А: Групи А, Б, В і Г; В: Групи А, Б, Ді Е; С: Групи А, Б, бо ЖІ 3. б
Фігура 31. Кінетика клінічного показника ЕАЕ всіх груп протягом періоду дослідження (А - хобно-негативні контролі ЕАЕ, Б-позитивні контролі хибно-оброблені ізотипом антитіла, В - ЕАЕ оброблений ОМБАс 500 мкг, Г - ЕАЕ, оброблений фумаратом натрію і Д - ЕАЕ, оброблені ОМБАс 500 мкг - фумарат натрію).
Список використаних скорочень о Абреватураї/ | 77777711
Наступні приклади є ілюстративними і не обмежують винахід.
Приклад 1: Блокада ремієлінізації, індукована білююм оболонки НЕКМ-М/ сімейства (інгібує диференціювання олігодендрогліальних клітин попередників при демієлінізованих ураженнях нервової системи). 111 Матеріали і методи 1.1.1. Культура клітин-попередників олігодендроцитів
Клітини-попередники олігодендроцитів щура (ОРС5) очищали, як описано раніше??. ОРС зберігали в середовищі для проліферації (середовище За, яке доповнено 10 нг/мл рекомбінантного основного фактору росту фібробластів людини і 10 нг/мл рекомбінантного тромбоцитарного фактору росту людини -АА; КО Зузіет5, УМезбадеп-Могаєпзіайії, Німеччина), в той час як диференціацію ініціювали середовищем за, яке доповнено 0,5 95 фетальної телячої сироватки. Фетальні клітини попередники олігодендроцитів людини (ПОРС) і відповідне середовище були отримані від ЗН ВіотеаїйїсаЇ, Оррзаїа, Швеція. Рекомбінантний Епм був отриманий і очищений за допомогою РХ РХ-Тпегарешіісвз (Сгепобріє, Франція) відповідно до вимог ОС бСеМешишго (Сепема, Швейцарія) поставляли білкові партії. Рівні ендотоксину становили «5 ОБ/мл, як виміряно за допомогою тесту лізату амебоцитів ІГітиїш5 (ГА). Епм стимуляцію проводили за допомогою трьох різних підходів із застосуванням і) рекомбінантного повнорозмірного Епм білка, що розведений в середовищі для диференціації при 10 нг/мл, 100 нг/мл і 1000 нг/мл, її) рекомбінантного білка Епу, що нанесений на культуральні чашки для клітин при поверхневій концентрації 17,53 нг/см: і ії) шляхом посіву ОРС на трансфековані 0343 клітини гліобластоми з гіперекспресією Епм відповідно. Контрольні експерименти по стимуляції проводили за допомогою отримання буфера рекомбінантного Епм (20 мМ гістидин, 5 мас/об. 9) сахароза, 0,01 мас/об. 96 полісорбат 20, рН 6,0) при рівних розведеннях. Вимірювання МО концентрації в супернатанті ОРС проводили із застосуванням колориметричного набору для аналізу окису азоту (Метгок-МійПіроге/СаІБіоспет, баптвзіайдії, Німеччина), а поглинання визначали при 540 нм з використанням планшетного рідера Апіпо5 2001 (Апіпйо5 Іабієс іпзігитепів, заіІ27бигу, Австрія). Оцінку морфології ОРС проводили за допомогою анти-0О4 Мегск-
МіПіроге/Снетісоп, багтвіадії, Німеччини) з урахуванням діаметра клітин і ступеня розгалуження
Зо процесу. ІКАК-1/4 інгібітор І (1-(2-(4-морфолініл)етил)-2-(З-нітробензоіламідо)бензимідазол, М- (2-морфолінілетил)-2-(3- нітробензоіламідо) бензимідазол; Зідталіагісй, Натбиго, Німеччина). експерименти проводилися при концентрації 2400 нМ, ТРЇІЕ інгібуючого пептиду (Іпмімодеп, Сан-
Дієго, США) експерименти проводили при концентрації 50 мкМ відповідно до протоколів виробників. Епм інактивацію проводили за допомогою впливу на рекомбінантний Епм при температурі 123 "С протягом 1 години. Експерименти з блокування рецептора ТІ К4-антитілом проводили при концентрації антитіла 15 мкг/мл. Експерименти з блокування І-МАМЕ/О-МАМЕ проводили при концентрації 100 мкМ кожного; 5З-нітрозо-М-ацетил-ОІ - пеніциламін (ЗМАР) застосовували в концентрації 100 нг/мл. 1.1.2 Попередники олігодендроцитів і трансфекція 0343 клітин гліобластоми
ОРС вирощували протягом 24 год. в середовищі для проліферації, а трансфекцію проводили за допомогою реагенту Маподиїсе (Метек-Міййроге, Дармштадт, Німеччина) із застосуванням кодуючого 5ПЕМА ТІ К4 супресуючого вектора на основі Ни5Н 29 рогрР-У-Н5 вектора (Огісепе, Роквілл, штат Меріленд, США) для доказу специфічності анти-ТІ КА антитіл.
Для експресії зв'язаного з мембраною Епм в 0343 клітинах гліобластоми вектор", який експресує цитрин для візуалізації трансфекованих клітин комбінували з підвищеною експресією Епм (рм14 вектор з 1 по 1629 п.н. НЕКЕУ-М/ МЕМ типу кодує послідовності епм гена-сепВапк АЕЗ331500.1- поставлених Сепецйго ЗА, Швейцарія) у співвідношенні 1:5. Відповідний порожній вектор застосовували як контроль. Трансфекцію 0343 клітин гліобластоми проводили за допомогою
Проїтесіатіпе (І їе Тесппоіодієх, Дармштадт, Німеччина). 1.1.3 Фарбування тканин розсіяного склерозу
Для Оїїд2/Епм подвійного фарбування фіксовані формаліном оброблені парафіном М5 тканини людини нарізали і 5 мкм зрізи депарафінірували ксилолом і регідратували проводкою через різні концентрації спирту і дистильованої води. Ендогенну пероксидазну активність пригнічували за допомогою інкубування предметного скла в 0,3 9У5-ний перекису водню в метанолі. Потім скло промивали дистильованою водою і переносили в 10 мМ Тріс, розчин 1 мМ
ЕДТА (рн 9) для досягнення індукованої теплом демаскування антигену. Далі, зрізи охолоджували до кімнатної температури, промивали в фосфатно-сольовому розчині (РВ5) і інкубували з анти- Оїїд2 (1:300; Метгек-МійПіроге) і анти-Епм антитілами ЗВ2НА (1:500, СеМеиго,
Женева, Швейцарія) протягом ночі при 4 "С. Потім зрізи інкубували з АЇеха 488-міченими антитілами осла проти кролика (1:400; Ійе ТесппоІодіез/МоІесціаг Ргобе5, Дармштадт,
Німеччина) з метою виявлення Оїїд2 і АІеха 555-міченого антитіла осла проти миші для візуалізації Епу. Для ТІ К4/РОКЕКа подвійного фарбування готували зрізи із замороженої тканини, і 5 мкм зрізів інкубували з анти-ТІ Н4 (1:100; Мегок-МійПіроге) і анти-РОсСгса антитілом (1:50; еВіозсіепсе5, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) протягом ночі при 4 "С. ТІ К4 детектували за допомогою АїЇеха 488-міченого антитіла осла проти миші (1:400; (теє Тесппоіодієз/Моіесшіаг
Ргобез) і РОСЕКа біотинільованим антитілом кролика проти щура (1:500; Месіог І арогайгогієв5,
Вигіпдате, СА, США) і АІеха 647-міченим стрептавідином (1:400; І їе ТесппоІодіез/МоІесшаг
Ргоревз), відповідно. Для фарбування ядер зрізи інкубували з розчином барвника Ноеспві (1:100;
Зідта-АїІдгісй, Гамбург, Німеччина) протягом 1 хвилини і покриваючи МесіазпівеїЯй (мМесіог
І арогагогіе5). Мікроскопічний аналіз проводили на Геіса ТСб5 5Р 2 АОВ5 конфокальному лазерному скануючому мікроскопі (І еіса Місгозузіетв, НеїдеїІрего, Німеччина). 1.1.4 Фарбування культивованих клітин
Фарбування фіксованих у формальдегіді культивованих клітин проводили, як описано ранішег22. Первинні антитіла були розбавлені наступним чином: анти-ТІ К4 антитіла (1/1000;
Мегок-Міййроге, Дармштадт, Німеччина), антитіло до Епм ЗВ2Н4А4 (1/500; СеМеиго, Женева,
Швейцарія), антитіло до 2", 3'-циклічний нуклеотид 3-фосфодіестерази (СМРазе) (1/1000;
Сомапсе, Прінстон, Нью-Джерсі, США), моноклональні антитіла проти основного мієлінового білка (МВР; 1/1000; Сопмапсе, Прінстон, Нью-Джерсі, США), поліклональні антитіла проти основного мієлінового білка (1:1000; Мійроге, Швальбаха, Німеччина), антитіла проти галактоцереброзіда (СаїЇс), анти-04 антитіла (обидва 1/1000; Мегок-Мійроге, Дармштадт,
Німеччина); анти-3-МТ антитіла (1/1000; Абсат, Кембридж, Массачусетс, США) їі анти-МЕКВ антитіла (11000; Арсат, Кембридж, Массачусетс, США). АІеха РіІцог 488- і АІеха РіІцог 594- кон'юговані антитіла (обидва 1:500,) застосовували для візуалізації сигналу. Ядра фарбували 4, б-діаміно-2-феніліндолом (САРІ; Коспе, Базель, Швейцарія). 1.1.5 Отримання РНК, синтез кДНК і кількісна полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією
Очищення РНК з культивованих клітин проводили за допомогою методу КМеазу (Оіадеп,
Ніїдеп, Німеччина). Виділену РНК піддавали зворотній транскрипції за допомогою високо- ефективного набору для зворотної транскрипції кКДНК (Ге Тесппоіодіез/Арріїєей Віозувзіетв).
Кількісне визначення рівня експресії генів виконували на системі 7900 НТ виявлення послідовності (І їе ТесппоІодіез/Арріюєй Віозубіет5) за допомогою Ромжег Зургогееп ипімегзаї тавзіег тіх (Ше Тесппоіодіеєз/Арріюєй Віозузіет5). Послідовності праймерів визначали за допомогою програмного забезпечення РгітегЕхргев55 2.0 (І їе ТесппоІодіез/Арріїей Віозувзіетв) і перевіряли специфічність ампліконів:
ТВА ма: стасатттота,астатаацАсСА (5ЕО ІЮ Мо: 7)
ТВ4 тєм: АВДЕСТТАсСАДОаСсСсТоатТастос (5ЕО ІО Мо: 8)
МОЗ ма: сСТСАаСАСАспАасастСАдАа (ЗЕО ІО Мо: 9)
МОБ тех: ТАСАСССАААСАССААСИат (5ЕО 0 Мо: 10) пиїМО5 йма: ТадапсАаСАса7атСаАасАСТ (ЗЕО ІО Мо: 11) пиїМО5 тех: ТаАТАаСсСаСстТтСтаасСтТОоТта (5ЕО ІО Мо: 12) писСАРОН пма: ТасАсСстТадсСстТассатстА (5ЕО ІО Мо: 13) писАРОН. гєу: АаСЯСЮЬСТОСОаТтаИатСастатта (5ЕО І Мо: 14)
ТМЕса ма: АССССТОСТАТОАССССАТОТА (ЗЕО ІЮ Мо: 15)
ТМЕса гєеу: СОСЕОСАСТОСатаАТИатсСтТААда (5ЕО ІО Мо: 16)
Ш1В йма: зАААСАССААТОСТСОСОАС (5ЕО ІЮ Мо: 17)
ШІ'В геу: ААВАСАСОСОСТТССАТОСТО (ЗЕО ІО Мо: 18)
І.6 ма: атТатасСААТааСААТТОСТИаА (5ЕО І Мо: 19)
І 6 тєу: ТСТИАСАаТасСсАТСАТСИЯСтТОа (5ЕО ІО Мо: 20)
САРОН ма: ваААС,аапААасСсТСАСтТасо (ЗЕО ІЮ Мо: 21)
САРОН гехк: ЧаСАТаТтСАСаАТССАСАдСОСИ (5ЕО ІО Мо: 22)
ОС ма: пат оСАспАсассСАААСАТС (5ЕО І Мо: 23) (510) ОрсС тех: атТТаССАСАТТОаАСССИтаАс (5ЕО І Мо: 24)
САРОН ії ОС були використані як референсні гени, а відносні рівні експресії генів були визначені відповідно до ДАСІ (І їе ТесппоІодіез/Арріїеа Віозув(етв5). Кожен зразок вимірювали в чотирьох повторностях; дані представлені у вигляді середніх значень ж/-стандартне відхилення, і ї-тест застосовували для визначення статистичної значущості. 1.2 Результати 1. 2. 1 Локалізація Епм білка близька до хронічних активних М5 пошкоджень і в околицях резидентних ОРС
Застосовуючи імуногістологічний аналіз ми вивчали локалізацію білка Епм у зразку тканин людського мозку. Дане показало досить численну наявність Епм білка в МАМУМ близько до хронічних активних М5 пошкоджень (САЇ, фіг. 1Б), а також в околицях САЇ в безпосередній близькості від ОЇїд2-позитивних ОРС (Фіг. 1Г). МАМУМ на більш далекій відстані до уражень не показує помітним Епм імунореактивності (Фіг. 1А.). З метою подальшого доведення, потенційного впливу білка Епм на резидентні ОРС і, таким чином, на відповідне лагодження мієліну, ми, крім того, шукали ТІ К4 і тромбоцитарний альфа фактор росту рецепторів (РОСЕКа) - двічі позитивних ОРС5. Ми могли виявити їх у здоровому мозку (Фіг. 1Г-Г") Її в
МАМУМ М5 (Фіг. 1Д-Д"). Наочно було продемонстровано, що в М5 мозку, ТІ К4-позитивні ОРС5 можуть бути виявлені в безпосередній близькості від НЕКМ-ММ Епм експресуючих клітин або відповідного секретованого білка, що робить їх прийнятними мішенями даних ТІ К-4 патогенних агоністів, як було описано 10. Тим не менше, дане є несподіваним висновком і відкриває ще небачені перспективи для застосування, тому що раніше було невідомо, що ТіКк4 експресується при таких умовах в ОРС і, більше того, як продемонстрували пізніше, тому що
НЕВУ-МУ білок оболонки, такий як МОАКМ-Епм, не може, отже, розглядатися для безпосередньої взаємодії з ОРС на даному конкретному етапі диференціювання з остаточними драматичним впливом на їх потенціал мієлінізації. 1.2.2 ТІ К4 експресія культивованими ОРС щура і людини
Попередні дослідження, по суті, свідчили про ТІ К4-залежну прозапальну дію на моноцити і клітини дендритів"о. Апіії-ТІК4 імуномічення підтвердило експресію даного рецептора на поверхні олігодендрогліальних клітин попередників щура і людини (Фіг. 28, В'ї 5Б). Крім того, специфічний 5ПЕМА-опосередкований нокдаун ТІ К4 в ОРС щурів обгрунтував специфічність
Зо попереднього імуномічення (Фіг. 2Б, Б). Для того щоб оцінити кінетику експресії рецептора
ТІК4, від молодих до зрілих ОРС, ми провели ко-фарбування з використанням антитіл до галактоцереброзиду (саї!С), а також антитіл до основного білка мієліну (МВР), маркера для більш зрілих ОРС, після трьох і шести днів диференціювання в культурі (Фіг. 28-Г). Несподівано було виявлено, що експресія гену рецептора ТІ К4 через деякий час пригнічувалася в процесі клітинного диференціювання (Фіг.2А), у той час як специфічна детекція білка ТІ К4 дала тільки слабкий сигнал на пізніх тимчасових точках в морфологічно зрілих ОРС щура (Фіг. 2Г), в порівнянні з більш молодими клітинами. 1.2.3 Стимуляція ОРС Епм індукованою експресією прозапальних цитокінів та індукованої
МО-синтази
Стимуляція ОРС щура рекомбінантним Епм білком, що розчинений у середовищі (розчинний
Епу; 100 нг/мл; Фіг. ЗА), що нанесений на культуральні чашки для клітин (твердий Епу;. Фіг. ЗБ) або надекспресуючим на поверхні трансфекованих клітин гліобластоми 0343 (РМ14Епу; фіг. З
В-Д) призвела до сильного збільшення транскрипції індуцибельної синтази оксиду азоту (МОБ), також як до індукції прозапальних цитокінів, таких як ТМЕса; І -18 ії 11/-6 (Фіг. З І-Л) порівняно з контрольними (буфер або порожній вектор для обробки) умовами. У свою чергу, підвищена експресія ІМО5 призводить до залежного від концентрації Епм підвищення її нітрозивного стресу, утворюючи продукт оксиду азоту (МО) в клітинних супернатантах (Фіг. 33). Цікаво, що морфологія ОРС щура залишалася незмінною протягом Епм стимуляції, як було показано 04 фарбуванням олігодендроглії, що здійснювалася через один і п'ять днів впливу Епм (Фіг. З Е-Ж).
СаІС-позитивні ОРС людини також були знайдені, експресуючими ТК 4 (фіг 5Б, Б») і стимуляція рекомбінантним Епм (як у розчині, так і як нанесеним на поверхню тарілки) аналогічно індукувала іЇМО5 транскрипцію (Фіг. 5А). Крім того, ми виявили, що Епм стимуляція не впливає ні на виживання ОРС (як показано за допомогою ТИМЕЇ і кількісної оцінки загального числа клітин; дані не представлені), ні на індуковане старіння фенотипу ОРС (досліджуваного шляхом фарбування на В-галактозидазу; дані не показані) Епм стимуляція дозрілих ОРС щурів (таюрРс»; зберігали в середовищі для диференціювання протягом шести днів) призводять до істотно більш слабкої, прозапальної реакції, яку було визначено рівнем транскрипції ЇМО5,
ТМЕа, 1-16 та ІС-б6, у порівнянні з впливом на незрілі ОРС (Фіг. 4). Це спостереження у відповідності 3 даними про більш низький рівень експресії ТІ К4, що виявлений в зрілих ОРС
(Фіг. 2), і підтверджує відмінну чутливість незрілих клітин у відношенні Епм, що відповідає Ті К-4 рівнем експресії. 1.2.4 Епм, що опосередковує свій вплив через ТІ К4 і прозапальна відповідь включає в себе
ІРАК 1/4, ТАІЕ ії МЕКВ
Для того, щоб довести специфічність Епм до ТІК4 і пролити додаткове світло на нижчерозташований сигналінг ми провели ряд контрольних дослідів (Фіг. 6). Термоінактивація рекомбінантного Епм перед ОРС стимуляцією призводить до дуже значного зниження індукції
ЇМО в порівнянні з контрольною групою (Фіг. бА). Аналогічне значне скорочення іМО5 транскрипції може спостерігатися при використанні опосередкованої антитілом блокади ТІ КА тим самим підтверджуючи специфічність Епм до даного рецептора і його актуальність щодо спостережуваних нижчерозташованих прозапальних ефектів (Фіг. 6Г). Для того, щоб пролити світло на внутрішньоклітинні шляхи ТІ К4 активації за допомогою Епм, ми досліджували роль двох відомих нижчерозташованих шляхів, що слідують за ТІ К4 активацією, Мур88-залежний шлях за участю ІКАК-1/4 (інтерлейкіновий рецептор 1-асоційованої кінази-1/4) і мМурв8- незалежний шлях за участю ТНІЕ (ТІВ-домено-вмісний адаптер, індукуючий інтерферон-В).
Застосування ІКАК-1/4 інгібітора І або ТКІР інгібіторного пептиду призвело до значного зниження рівня експресії ІМО5 у присутності Епм (Фіг. 6Б, В) демонструючи, що Епум- опосередкована активація ТІ К4 призводить до активації обох Мур88-залежного, так само як
Мурев8- незалежного шляху передачі сигналу. Обидва шляхи можуть сходиться на МЕкКВ (ядерний фактор енхансер легкого ланцюга типу К активованих В-клітин) ядерної транслокації.
За допомогою анти-МЕКкКВ антитіла, ми підтвердили, що Епм стимуляція призводить до сильного збільшення ОРС з ядерною локалізацією МЕКВ (Фіг. 6Д-Ж), надаючи пояснення активації транскрипції, яка спостерігається прозапальних цитокінів. 1.2.5 Епу-опосередкована індукція маркера нітрозивного стресу нітротирозину
МО, рівень якого був підвищений після Епм стимуляції (див. Фіг З 3), є активною формою азоту (ЕМ5). МО може реагувати з безліччю внутрішньоклітинних молекул, включаючи білки, нуклеїнові кислоти і ліпіди, що призводить до формування З-нітротирозинових залишків (3-МТ).
Ми виявили, що дія рекомбінантних білків Епм на ОРС щура призводить до сильного збільшення 3-МТ-позитивних клітин в порівнянні з буферними контролями (Фіг. 7Б, Б' і В, В), яка вказує на
Зо МО-опосередковану індукцію нітрозивного стресу. Однак, після попередньої інкубації з інгібуючими ЇІМО5 молекулами Г-МАМЕ (метиловий ефір І-Ме-нітроаргініну) продукція МО, як було встановлено, була значно знижена (дані не показані), як і формування 3-МТ позитивних
ОРС (Фіг. 7 Г, Г). При застосуванні О-МАМЕ, неактивного енантіомера І -МАМЕ, як негативний контроль, ЕММ-опосередковане 3-МТ формування не було порушено (Фіг. 7 Д, ДУ). З іншої сторони, застосування 5МАР (5-нітрозо-М-ацетилпеніциламін), сильного МО донора, служило як позитивний контроль, і призвело до нітротирозинілюванню майже всіх ОРС (Фіг. 7Е, Е).
Важливо відзначити, що З-нітротирозин позитивні ОРС, що виявлені за рахунок експресії їх маркера попередника РОСЕКа, також можуть бути виявлені в МАМУМ мозку хворих (Фіг. 7 Ж-
Ж"), що вказує на патологічно схожий стресорний механізм в М5. 1.2.6 Епм впливає на експресію мієліну в ОРС
Після вказаних знахідок ми досліджували, чи може Епм білок впливати на процеси олігодендрогліального диференціювання, які, як показано, є необхідними для можливості відновлення мієліну. Для даної мети, Епм стимульовані ОРС щурів оцінювали відносно рівня експресії мієлінових білків СМРавхе (2", 3'-циклічний нуклеотид 3-фосфодіестерази) після трьох днів Епм стимуляції і МВР (основний білок мієліну) після шести днів стимуляції, відповідно.
Результати показали, що Епм сильно скорочував кількість СМРазе і МВР позитивних клітин (Фіг. 8А-Г") на відміну від незмінної експресії маркера попередника 04 (Фіг. З Е-Ж). Дане свідчить про значно порушену реакцію клітинного диференціювання при наявності білка Епм. Проте, додавання Г-МАМЕ, але не О-МАМЕ паралельно з Епм стимуляцією може відновити експресію
МВР (Фіг. 8 Д-3), що свідчить про прямий зв'язок між утворенням 3-МТ через нітрозивний стрес і зменшену здатність до диференціації ОРС. 1.3 Аналіз результатів
Неефективна ремієлінізація НС в нейрозапальних демієлінізуючих захворюваннях, таких як
М5, як вважають, в першу чергу викликається зниженням здатності резидентних ОРС до правильного диференціювання і ремієлінізації демієлінізувальних аксонів!!"З, але не було відомо ні однієї основної і вищерозміщеної патогенної молекули, що викликає блокаду такої ремієлінізації. Попередні дослідження вже показали, що білок оболонки Епм з НЕКЕМ-МУ, також названий "Асоційованим з розсіяним склерозом ретровірусним елементом" (МКУ), при отриманні з відповідних ретровірусних частинок'"", надає прозапальний вплив на одноядерні бо клітини, активують вроджену імунну систему, які, в свою чергу, виробляють основні прозапальні цитокіни!"!о. Однак, прямий зв'язок між Епм і зниженням здатності до диференціювання ОРС досі не була показана, і не могла бути припущена. Тут ми показали, що даний білок Епм може бути виявлений в М5-ураженої тканини НС, і що Епм може заважати диференціювання ОРС через раніше невідому наявність Епм рецептора, ТІ К4, на ОРС на певній стадії диференціювання.
Даний шкідливий ефект обумовлений іМО5. Дана стресорна відповідь призводить до формування нітротирозину і безпосередньо впливає на експресію мієлінового білка. Цікаво, що
Епм стимуляція не впливає на ступінь виживання ОРС клітин, а клітинна морфологія залишалася незмінною на основі чого можна припустити, що Епм-опосередковані сигнали націлені на елементи цитоскелету. Слід відзначити і підтвердити новизну несподіваних результатів, попередні дослідження стверджують відсутність ТІ! К4 в олігодендрогліальних клітинах в людському мозку"». Однак, на відміну від даної думки ми могли б чітко показати, що
ТІК. експресується не тільки на культивованих первинних ОРС (як щурячого, так і людського походження), але також на РОСЕКа-позитивних резидентних ОРС в М5 тканині людини. Такі відмінності можуть відбуватися з того, що Ленхардт і його колеги використовували більш загальний маркер 04 для детекції олігодендрогліальних клітин, а ми спиралися натомість на нещодавно прийнятий маркер попередника РОСЕК-й. Тим не менше, ми вперше показали даний своєрідний патерн експресії ТІ К4 в ОРС, в той час як в його існування не вірили. Крім того, ми виявили, сильне пригнічення ТІ К4 при дозріванні ОРС, що дозволяє припустити, що експресія рецептора і, отже, схильність до Епм, обмежені незрілими клітинами. Тим не менше, дане відкриття є патологічно значущим, оскільки робить дані клітини здатними взаємодіяти безпосередньо з білком Епм, який, як показано, експресується і вивільняється при М5 ураженнях. У світлі даних висновків ми зробили висновок, що, МОЕМ/НЕКМ-УМ Епм є не тільки імунопатологічним компонентом М5, але також може чинити істотний негативний вплив на ендогенну здатність відновлення мієліну. Тому було зроблено висновок, що втрата здатності лагодження, як це спостерігається у багатьох пацієнтів з МЗ під час хвороби, пов'язана з активацією МОЕМ/НЕКУ-МУ елементів2. Слід зазначити, що попереднє дослідження, яке описує експериментальний вплив біль»а НЕКМ-М/ Епм кодованого дефектною копією (яка не проявляє
ВТ-активності, не утворює частинки, через відсутність послідовностей кодування в генах дад і рої) зі стабільною вставкою на хромосомі 775. Даний білок Епм може бути експресований єдиним
Зо кодованим геном НЕКМУ-МУ/ 74 елементу (епу, або ЕКММУ-Е1 локус), має чотирьох амінокислотну делецію в С-кінцевій частині свого поверхневого домену, очевидно, викликаючи властиву клітинну маршрутизацію і, як відомо, володіє іп мімо експресією на рівні білка, що обмежений плацентою!" 18. Даний білок дійсно є прикладом "одомашненого" НЕКМ білка", який тепер грає фізіологічну роль у формуванні синцитіотрофобластичної тканини і тому названий "Синцитін""9,
Відповідний домен злиття в НЕКМ-МУ Епу, а також як і ТІ К4-зв'язуючий домен, можуть бути більш-менш консервативними між НЕВМ-М/ підтипами (наприклад, МОВЕМ-Епм або Сінтіцин). Їх доступність як поверхневий білок або позаклітинний білок з конформаційною експозицією активного домену строго регулюється, і фізіологічна роль синцитіну залишається в межах синцитіотрофобласту і обмежується присутністю в плаценті. Таким чином, пов'язана патогенність, очевидно, є відмітною ознакою не фізіологічної активації, наприклад, за рахунок певних інфекційних агентів навколишнього середовища?» "! у людей, або в експериментальних трансгенних умовах іп мімо або іп міо. Як повідомляється, синцитін знаходиться в астроглії НС у пацієнтів з розсіяним склерозом (М5), але використання антитіл в іншому сполученні дозволило виявити НЕКМ-М/ М5АМ-Епм підтип, а не синцитінег-. Послідовність синцитіну може, тим не менше, бути експресованою шляхом трансгенезу в астроцитах миші, викликаючи вивільнення цитокінів, шкідливих для олігодендроцитів'х, але трансгенні миші показали нежиттєздатність (особисте спілкування С. Роуег до Н. Реїтоп, Меигомігоїоду зутрозішт, Сан-Дієго, 2007). Тим не менше, в той час як Апіопу і колеги виявили, що паличка аденоматозного поліпозу (АРС)- позитивні мієлінізуючі олігодендроцити є уразливими до синцитін-опосередкованої цитотоксичності в таких мізках трансгенних мишей, ми змогли продемонструвати, що тільки незрілі ОРС5 значно схильні Епу-опосередкованим прозапальним сигналам, тоді як у зрілих клітин такого немає. Таким чином, результати даного дослідження, по всій видимості, є результатами артефактних експериментальних умов, які пов'язані з їх умовами експресії, яку викликано трансгенезом плацентарного білка в клітинах головного мозку. На відміну від даних результатів, які виведені з штучних умов, авторами показаний ушкоджуючий механізм, який спрямований на здатність ендогенного ремонту нервової системи (НС) дорослого, а не патологію М5, таку, яка помітно показує імуноопосередковану втрату олігодендроцитів і мієлінової оболонки при пошкодженні аксонів. Дійсно, ЕММ-опосередковані ефекти на клітини імунної системи в асоціації із запальними ураженнями М5 є тепер добре документованими 719295- 60 25, але ніякі попередні дослідження не свідчать про таку пряму патогенність НЕКМ-М/ Епм на гліальних клітинах з участю в блокаді ремеїлінізаці Ме бляшок за рахунок ОРС5. Дані результати, що зв'язують імуногістологію мозку при М5, показують сильну експресію білка Епм в активних М5 бляшках або на краю менш активних уражень, тепер підтримують таку роль у відомому дефекті ремієлінізації за рахунок ОРС при М5 ураженнях.
Приклад 2: Блокада ремеліенізації, яка індукована білюоом оболонки НЕКМ-УМ сімейства ефективно лікуватися антитілом специфічним до Епм
Білок оболонки НЕКМ-М/ сімейства оболонки (Епм, зокрема, із асоційованого з розсіяним склерозом ретровірусного підтипу, МОКМ-Епу) є потужним інгібітором здатності не мієлінізуючих
ОРС диференціюватися в мієлін виробляють зрілі олігодендроцити, які Є важливим етапом у процесі ремеліенізації. Ми досліджували вплив МЗКМ-Епм білка на експресію двох різних маркерів диференціювання олігодендроцитів: - СМРаве (27, 3'-циклічний нуклеотид-3'--фосфогідролазу) є 4 95 загального білка мієліну і присутній у цитоплазмі не компактизованої олігодендрогліальної оболонки аксонів. СМРавзе є найбільш раннім відомим мієлін-специфічним білком, який синтезується шляхом розвитку олігодендроцитів. - МВР (основний білок мієліну) є цілих 30 95 білків мієліну і відіграє важливу роль при ущільненні мієліну в центральній і периферичній нервовій системі. Він з'являється послідовно після СМРаве як іп міїго, так і іп мімо, і є специфічним маркером зрілих олігодендроцитів. Метою даного дослідження було визначення того, чи можуть специфічні антитіла до Епм, такі як
СМрБАСІ, рекомбінантне гуманізоване Ідс54 моноклональне антитіло до Епу, блокувати інгібування дозрівання ОРС, що індуковане М5АМ-Епу. Справді, такий ефект СМБАСІ1 буде свідчити про те, що антитіла здійснюють "анти-блокаду реміелінізуючих клітин". Для того, щоб перевірити дану гіпотезу, первинну культуру ОРС5 людини інкубували з М5ЕМ-Епу, з або без
СМБАСІ, або шляхом нанесення рекомбінантного білка на поверхню культури або шляхом додавання білка в культуральне середовище. Експресію СМРаве (як ранній маркер дозрівання) і
МВР (як пізній маркер дозрівання) оцінювали шляхом імуноцитохімії після одного або трьох днів стимуляції, відповідно.
У даному прикладі, М5КМ-ЕММ відноситься до повнорозмірного рекомбінантного МБЕМ-Епм білка, який містить внутрішньоклітинні, трансмембранні і позаклітинні домени білка оболонки
Коо) НЕНУ-МУ.
Представлені тут результати показують, що ОРС людини специфічно експресують ТІ КА на своїй плазматичній мембрані, і демонструють, що рекомбінантний білок МОКМ-Епм специфічно і суттєво зменшує кількість СМРазе і МВР-позитивних клітин. Дані спостереження знаходяться у відповідності з наведеними Прикладом 1 на ОРС людини і щура. Крім того, наші експерименти показують, для початкового часу, що гальмування (блокада) дозрівання ОРС людини, яке індуковано за рахунок М5КМ-Епм, який повністю усувається шляхом обробки ОМБАСІ1, демонструючи дані нові і раніше несподівані лікувальні якості. Дане в свою чергу забезпечує додаткову ознаку в лікуванні прогресуючих форм розсіяного склерозу. 2.1 Матеріали і методи 2. 1.1.Матеріали
Матеріали, які використовуються для первинної культури ОРС людини 01111111 | Постачальник | Посилання | Серійнийномер,.0// (Клітиннийінкубатор | Тпептобсівпійс | НеРАСіавб6100 | - сттлненян | Мер визенсяи 2 сівпійіс
ЗН Віотеаісаї!
ЗсіепСеїЇ
Середовище 00000000 : 081711-8-0
Матеріали, які використовуються для оцінки експресії маркерів дозрівання в ОРС людини 11111111 | Постачальник | Посилання | Серійнийномер./0/
Фетальна бичача . ! проти миші
Середовище для заливки Месіог І арогайогієв5 НІтТ500 Х1118
Месіазпівід-ОАРІ
Ахіозсоре мікроскоп | 0 йеівв//// 17777111
Ахобат 77777711 17111111йвівв/ 17777711 (Ахіомівт 711111 йвівв 17777717 -1 ЇЇ
Матеріали, які використовуються для стимуляції ОРС М5КМ-Епм, ОМБАСІ і МЗКМ-Епм буфером 11110100 | Постачальник | Посилання | Серійнийномер,.0//
МБАМ-Епу-Т буфер | оРХТпегарейісвї | -111117111111111111н1 2.1.2 Протоколи
Інкубація ОРС людини з МОКМ-Епим, МОНМУ-Епм буфером і СМБЬАС1
Повно-розмірний рекомбінантний МЗЕМ-Епм був отриманий і очищений за допомогою РХ "Тпегарешісв (548 ак., 61, 44 кДа) (серія 110719-1). Початкова концентрація становила 0,6 мг/мл (9,76 мкм). МБКЕМ-ЕММ буфер (20 мМ Ттідта-НСІ, рН 7,5, 150 мМ Масі, 1,5 95 505, 10 мм ОТ) був наданий РХ'"Ппегарешіс5. Даний розчин використовували як негативний контроль. ЗМБАСІ1 (Ваїсп Т96/БАС1/81, виробництво ЗМР) був отриманий і очищений за допомогою РоІутип зсієепійіс, Відень, Австрія. Початкова концентрація становила 10 мг/мл (68,03 мкМ).
ОРС людини стимулювали різними способами, або шляхом нанесення розчинів на поверхню тарілки для культивування клітин до висіву клітин, або шляхом додавання їх в клітинне культуральне середовище після посіву клітин. У будь-якому випадку 8-лункову слайд- камеру Іабтек (Мипс) попередньо покривали полі-І -лізином (Зідта-Аїйдгіс"й) протягом ночі при 203776.
Покриття скла 8-лункової камери І абіек
Різні речовини розводили в РВ5 в стерильному ламінарному боксі (Різспег Віобіоск,
Франція), 8 лункові слайд-камери Гаріек (Мипс; 250 мкл на лунку) покривали наступним чином: - МБВУ-Епм (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С. - М5АУ-Епм буфер (таке ж розведення, ніж МЗЕМ-Епу) з покриттям протягом 2 год. при 37 76. - М5АУ-Епу-аМБАСІ Ат: МОАМ-Епм (1 мкг/мл) і СМБАСІ1 (7,35 мкг/мл - 50 нМ) суміш з покриттям протягом 2 год. при 37 70. - М5АМ-Епу-СМБАСІ Аг: МЗАМ-Епу (1 мкг/мл) і ОМБАСІ1 (29,4 мкг/мл - 200 нм) суміш з
Зо покриттям протягом 2 год. при 37 "70. - М5АУ-ЕпуОМрАСІ ВІ: М5КМ-Епм (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті РВ5 і потім покриті ЗМБАСТ1 (7,35 мкг/мл - 50 нМ) протягом 1 год. при 37 "С. - М5АУ-ЕпуОМрАСІ В2: М5КМ-Епм (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті РВ5 і потім покриті ЗМБАСТ1 (29,4 мкг/мл - 200 нМ) протягом 1 години при 37 "С. - СМБАСІ А! тільки: ОМБАСТ (7,35 мкг/мл - 50 нМ) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С - ОМБАСІ А2 тільки: ЗМБАСТ1 (29,4 мкг/мл - 200 нМ), з покриттям протягом 2 год. при 37 70.
- СМБАСІ ВІ тільки: РВ5 протягом 2 год. при 37 "С, потім покриті ЗМБАСІ1 (7,35 мкг/мл - 50
НМ) протягом 1 год. при 37 "С. - ОМБАСІ В2 тільки: РВ5 протягом 2 год. при 37 "С, потім покриті ЗМЬБАСІ (29,4 мкг/мл - 200
НМ) протягом 1 год. при 37 "С. - ВБА (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С. - ВБАОМрАСІ Ат: суміш ВЗА (1 мкг/мл) і ОМБАС1 (7,35 мкг/мл - 50 нМ) з покриттям протягом 2 годин при 37 "С. - ВБАОМБАСІТ А2: ВБА (1 мкг/мл) і ЗМБАСІ1 (29,4 мкг/мл - 200 нм) суміш з покриттям протягом 2 год. при 37 "С. - ВБАЖОМБАСІ1 ВІ: В5А (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті РВ5, а потім покриті ЗМБАСТ1 (7,35 мкг/мл - 50 нМ) протягом 1 год. при 37 "С. - ВБАЖОМрАСІ1 В2: ВЗА (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті РВ5, а потім покриті ЗМБАСІ1 (29,4 мкг/мл - 200 нМ) протягом 1 год. при 37 "С.
Клітини-попередники культури олігодендроцитів людини
ОРС, виділені з головного мозку людини, були придбані у 5сіепСеї! Кезеагсі І арогайгієе5 (через З Н Віотеаїйса!І, Швеція). Кожен флакон містить » 1 х 105 клітин в 1 мл. Повне ОРС культуральне середовище (ОРСМ) було відновлено шляхом додавання розчину для зростання
ОРС (ОРСОЗ) і пеніциліну/стрептоміцину (Р/5) в ОРСМ, відповідно до рекомендації виробника (ЗсіепсеїЇ).
Флакон, що містить ОРС людини, поміщали на водяну баню при 37 "С і обережно перемішували шляхом обертання до повного розморожування вмісту. Клітини обережно ресуспендували за допомогою піпетки Сіїоп 1 мл. Потім вони розбавляли повною ОРСМ і засівали у 8-лунковий посудини для культивування Іаріек (7000 клітин/см2-10000 клітин на лунку) попередньо покриті полі-І -лізином (0,01 95, бідта) і з (або без) обробок, описаних вище (див 3.2.1.1) в стерильному ламінарному боксі (Різпег ВіоріосК, Франція). Культури інкубували при 37 "С; 5956 СО: до подальших імуноцитохімічних експериментів. Живильне середовище міняли на наступний день для видалення залишкового ЮОМ5БО і неприкріплених клітин в культурах, які обробляються протягом 72 год.
Інкубація в культуральному середовищі з МБЕМ-Епу
Зо Після З годин попереднього культивування (див 3.2.1.2) ОРС людини в 8-лункових камерах для культивування ІабіеКк, клітини інкубували при 37 "С протягом 24 год. або 72 год. у 8- лункових камерах Іабіекз (250 мкл/лунка) з додаванням наступних розчинів: - М5АМ-Епм буфер, який застосовується як негативний контроль, додавали в повне середовище для культивування клітин. - М5АМУ-Епи, що доданий при З нМ (0184 мкг/мл) в повне середовище для культивування клітин. - М5АУ-Епу (3 нМ) ї- ОМБАСІ1 (200 нм; 29,4 мкг/мл) суміш, яка додана в повне середовище для культивування клітин. - ОМБАСТ1 (200 нМ), що доданий поодинці в повне середовище для культивування клітин.
Експресія ТІ КА і маркери мієлінізації в ОРС іп міо
Після 24 або 72 год. інкубації, середовище для культивування клітин видаляли і ОРС людини, що стимульовані шляхом обробок, які описані вище (див 3.2.1) фіксували в розчині параформальдегіду (4 95 РЕА в РВ5, 250 мкл на камеру) при кімнатній температурі протягом 1 години. Потім їх промивали три рази РВ5 (3 х 250 мкл на камеру), неспецифічні сайти зв'язування насичували шляхом інкубації з 1095 фетальною бичачою сироваткою (ЕВ5) в розчині РВ5, що містить 0,1 96 Тритон Х100 (250 мкл на камеру) протягом 1 год. при 37 "С. У разі ТІ К4 фарбування, клітини інкубували з 10 95 ЕВ5 в РВ5 тільки (250 мкл на камеру). Після насичення, культури ОРС інкубували з розчином первинного антитіла протягом ночі при 4 "с, що розведений в 10 95 ЕВ5З в розчині РВЗ (200 мкл на камеру), наступним чином: - Мишачі антитіла до ТІ К4 1/1000 (після 24 і 72 год. культивування) - Мишачі антитіла до СМРавзе 1/200 (після 24 год. стимуляції) - Мишачі антитіла до МВР 1/100 (після 72 год. стимуляції)
Клітини промивали З рази в РВ5 (3 х 250 мкл на камеру), і інкубували з розчином вторинного антитіла протягом 1 год. при 37 "С (250 мкл на камеру), наступним чином: - НІТО-кон'юговані антитіла осла проти миші 1/200.
Після З промивок в РВЗ (3 х 300 мкл на камеру) при кімнатній температурі, пластикові камери відокремлювали від предметного скла. Потім предметне скло поміщали в середовище для заливки Месіавзіаіп?, що містить САРІ (Месіахйпівеід). Фарбування візуалізували методом флуоресцентної мікроскопії з використанням Ахіозсоре мікроскопа (7 еїів55). (510)
Аналіз даних
Після 24 годин стимуляції МОКМ-Епу-Т (або контролем), СМРавзе імунореактивність клітини підраховували в 10 кадрах випадково вибраних в камері. Відсоток СМРазе-позитивних клітин роз| 100 х п СюмРазе як п САРІ п СМРаве « - кількість імунореактивних ОРС для СМРазе
Після 72 годин стимуляції М5КМ-Епу-Т (або контролем), МВР імунореактивність клітини підраупомоопи о 10 сиполково вибраних кадрах в камері. Відсоток МВР-позитивних клітин був розі 100 х п МЕР жк п ОСАРІ п МВР я - кількість імунореактивних ОРС для МВР
Дані представлені як середнє значення -/- стандартна похибка відсотка СМРазе або МВР позитивних клітин. Графіки отримували за допомогою СгарпРай БЗойуаге, 5.00 версії для
УММіпдому5 (Сан-Дієго Каліфорнія, США). Непараметричні статистичні тести проводили за допомогою 5ідта гаї (Чикаго, Іллінойс, США).
Наступні результати були отримані протягом трьох незалежних серій експериментів, кожен з яких виконаний з новою ампулою заморожених комерційних ОРС: ОРС ІСС 01, ОРСІСС 02 і
ОРС ІСС 03. 2.2 Результати 2.2.1 Експресія ТІ КА рецепторів у ОРС людини іп міго
Експресію ТІ К4 оцінювали за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії. Етап насичення, що зроблений без будь-яких детергентів, дозволяв виявити ТІ К4 тільки на поверхні клітин.
Даний експеримент підтвердив присутність рецептора мішені М5КМ-Епм на клітинній поверхні
ОРС людини через 24 і 72 год. первинної культури (не показано). 2.2.2 Експресія СМРавзе і МВР в ОРС людини іп міїто
Морфологію ОРС людини іп міо візуалізували за допомогою мікроскопії в світлому полі.
ОРС представляло тіло клітини і в цілому два клітинних розширення. СМРазе і МВР експресії були підтверджені за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії після 24 год. і 72 год. в культурі, відповідно (не показані). 2.2.3 Вплив М5КМ-Епм з або без ЗМБАСІ на диференціювання ОРС людини Вплив нанесеного М5КМ-Епм на експресію маркерів дозрівання ОРС людини в первинній культурі
Коо) (ОРС ІСС 01)
Метою даної першої серії експериментів (ОРС ІСС 01) було встановлення умов для первинної культури ОРС людини, а також протоколів імунофарбування слайд-камер Іабіекв, які попередньо покриті МОКМ-Епм і СМРазхе і МВР.
Гаріек посудини для культивування покривали 1 мкг/мл М5КМ-Епм перед посівом ОРС людини. Як негативний контролю (буфера), культуральні посудини інкубували при тих же умовах, тільки з буфером МЗКМ-Епу.
Відсоток СМРазе позитивних клітин був значно знижений з 85:24 95 в контрольних умовах (буфер) до 6926 95 в ОРС людини, які стимульовані протягом 24 год. в Іабїек5 попередньо покритих М5КМ-Епм ("р«0,05; І-тест) (Фіг. 9А).
Після 72 год. культивування, відсоток МВР-позитивних клітин значно знизився з 74:27 95 при контрольних умовах (буфер) до 25:23 95 в Іабіекхе попередньо покритих М5АМ-Епм (4Епу-Т) ("р«0001 ранговий критерій Манна-Уїтні) (Фіг. 9Б). Дані результати показують, що М5КМ-Епм інгібує дозрівання ОРС людини в мієлінізуючих клітинах іп міїго.
Вплив СМБАСТ на інгібування дозрівання ОРС, що індукований МЗКМ-Епм (ОРОС ІСС 02)
Метою даної другої серії експериментів (ОРС ІСС 02) було підтвердження ефекту МБ5КМ-
ЕММ на диференціювання ОРС людини і визначення того, чи можуть МО5КМ-Епм інгібувати диференціювання ОРС людини при додаванні білка безпосередньо в середовище для культивування клітин. Крім того, ми також протестували, чи може ЗМБАСІ1 інгібувати вплив
М5ВУ-Епм в даній моделі.
У разі стимуляції ОРС людини в Іабїек5 попередньо покритих М5КМ-Епм, ЗМБАС1 обробки оцінювали при двох різних протоколах. По-перше, Іарїек культуральне предметне скло попередньо інкубували з сумішшю М5КМ-Епм (1 мкг/мл) і ЗМБАСТІ (50 нМ або 200 нМ) до посіву
ОРС (умова СМЬБАСТ1-А).
Другий протокол включав в себе послідовне покриття з М5ЕМ-Епм (мкг/мл) з подальшим покриттям СМБАСТ (50 нМ або 200 нМ) перед посівом ОРС (умова ОМБАС1-В).
Вплив М5КМ-ЕММ і ОМБАСІ1 на експресію СМРазе ОРС людини
Після 24 год. стимуляції, значне зниження відсотка СМРазе позитивних клітин з 75:52 95 в контрольних умовах (буфер) до 5522 95 спостерігали в Іабіек5, попередньо покритих 1 мкг/мл
М5АМ-Епм ("р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Крім того, стимуляція в Іабіекв5, які попередньо покриті 1 мкг/мл ВЗА, не робить впливу на СМРазе експресію (7152 95), демонструючи, що ефект, який спостерігається з МОКМ-Епм є специфічним, оскільки він не був помічений з контрольним білком (Фіг. 10А).
СМБАСІ значно інгібує зниження СМРабзе позитивних клітин, що індуковані в Іабіекв, попередньо покритих М5КМ-Епм (Фіг. 10А). Ефект СМБАСІ1 видно при 50 нМ і 200 нМ, а в двох тестованих протоколах обробки: (І) умова СМБАС1-А, 50 нМ (6954 95), 200 нМ (80:42 95); (Ії) умова СМрБАС1-В 50нМ (96-23 90) і 200 нМ (76-24 95) (шр«е0,001, однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Крім того, ефект
СМБАСТ, очевидно, залежить від концентрації (Фіг. 10 А).
Додаткові контрольні експерименти показали, що ОРС людини, що стимульовані протягом 24 год. в Іабїек5, попередньо покритих одним ЗМБАСІ (50 нМ або 200 нМ), або сумішшю
СМБАСТІ (50 нМ або 200 нМ) - В5А (1 мкг/мл), не робить ніякого впливу на експресію СМРазе в порівнянні з контрольною умовою (буфер) (р»0,05; Опе-мау АМОМА) (Фіг. 10Б). Дані спостереження були зроблені по двох протоколах обробки СМБАСІ1, які описані раніше (СМБАС1-А 50 нм, СМБАСІ1 200 нМ ії ОМБАС1-В 50 Нм).
Даний експеримент також показує, що навіть низькі концентрації М5КМ-Епм в розчині викликають значне зниження відсотка СМРазе позитивних клітин після 24 год., з 7852 95 в контрольних умовах (буфер) до 5752 95 у групі МОКМ-Епм ("р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 11). Крім того, обробка СМБАСІ1 (200 нм) повністю протидіє зниженню експресії СМРазе, що викликана М5АЕМ-ЕММ (7622 90; фр«0001 у порівнянні з ЕММ-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Цікаво відзначити, що 200 нМ СМБАСІ1 поодинці (7422 95) не робить ніякого впливу на експресію СМРаве в порівнянні з контрольною умовою (буфер) (Фіг. 11).
Вплив М5КМ-Епм і ОМБАСІ на експресію МВР в ОРС людини
Після 72 годин стимуляції, значне зниження відсотка МВР позитивних клітин з 762 95 в контролях (буфер) до 571 95 спостерігається в Іаріеквх, які попередньо покриті 1 мкг/мл М5КМ-
Епм ("р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 12А). У даному експерименті було показано, що відсоток МВР-позитивних клітин в ОРС-культурі в Іартекх, попередньо покритих
ВЗА (1 мкг/мл), дещо відрізнявся від контролю (буфер) (69:22 95). Однак, ВЗА також показував істотно інший вплив у порівнянні з М5КМ-Епм (р«0,001 у порівнянні з Епми-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера), і, таким чином, показував, що повинні бути ізольовані і не впливати тільки в даній серії експериментів, оскільки не спостерігаються в інших експериментах або з СМРазе в даній же серії.
СМЬБАСІ значно інгібує зменшення МВР-позитивних клітин, які індуковані в Іабіекв, попередньо покритих МЗКМ-Епм (Фіг. 12А). Частковий ефект СОМБАСТІ з'являється при 50 нМ, а повне інгібування досягається при 200 нм, і в обох тестованих протоколах обробки: (ї) ЗМЬБАС1-
А 50 нМ (69:2 95) і 200 нМ (73:52 9б) і (ї) ЗМБАС1-В 50 нМ (68:22 95) і 200 нМ (742 95) (фр«0001 у порівнянні з Епх-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Крім того, ефект ОМБАС1 очевидно, залежить від концентрації (Фіг. 12А).
Даний експеримент також демонструє значне зменшення відсотка МВР-позитивних клітин від 76:22 95 в контрольних умовах (буфер) до 55:22 95 в клітинах, які стимульовані додаванням
М5АМ-Епм в культуральне середовище (3 нМ) протягом 72 год. ("р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 12Б). Крім того, обробка СМБАСІ (ЗМБАСІ 200 нм) повністю інгібує зменшення МВР експресії індукованої МОВ М-Епм (76:22 95; фр«0001 у порівнянні з Епх-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 12Б).
Підтвердження СМБАСІ1 ефектів на інгібування диференціювання ОРС індукованого МБ М-
Епм (ОРС ІСС 03)
Хоча описані вище результати були отримані із значної кількості зібраних даних, метою даної третьої серії експериментів (ОРС ІСС 03) була повне відтворення ефекту ОМБАСІ1 при бо абсолютно самостійній серії експериментів.
Вплив М5КМ-ЕММ і ОМБАСІ1 на СМРавзе і МВР експресію в культурі ОРС людини
Після 24 год. стимуляції, значне зниження відсотка СМРазе позитивних клітин з 90:51 95 в контрольних умовах (буфер) до 71:51 95 спостерігається в Іабіек5, попередньо покритих М5КМ-
Епм (1 мкг/мл) ("р«0,05; ранговий дисперсійний аналіз Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Стьюдента-Ньюмана-Кейлса) (Фіг. 13А). Як описано вище, СМБАС1 (200 нм) повністю звертає інгібування експресії СМРазхе, що викликане МЗЕМ-Епм при двох
СМрРАСІ тестованих протоколах обробок (ЗМБАС1-90ж2 95, СМЬБАС1-В: 914 95) (фр«0,05 у порівнянні з Епх-Т; ранговий дисперсійний аналіз Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Данна) (Фіг. 13А).
Після 72 год. стимуляції, значне зниження відсотка МВР позитивних клітин з 78:22 95 при контрольних умовах (буфер) до 55:53 95 спостерігається в Іабіек5, попередньо покритих М5КМ-
ЕММ (1 мкг/мл) протягом 72 год. ("р«0,05 у порівнянні з буфером; ранговий дисперсійний аналіз
Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Данна) (Фіг. 13Б). Як описано вище,
СМБАСТІ (200 нМ) повністю змінює інгібування МВР експресії, що викликане МБЕЕМ-ЕММ у двох
СМрБАСІ1 тестованих протоколах обробок (ЗМБАС1-А: 80ж2 95, СМЬАС1-В: 75:22 95) (МУР«0,05 у порівнянні з Епх-Т; ранговий дисперсійний аналіз Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Данна) (Фіг. 13Б).
Об'єднання даних експериментів ОРС ІСС 02 і ОРС ІСС 03
Результати, що отримані в двох різних серіях експериментів (ОРСІССО2 і ОРСІССОЗ), представлені вище, були об'єднані в одному аналізі. Таким чином, дані нанесені на Фіг. 14 є від 8 до 14 незалежних експериментів для СМРазвзе (Фіг. 14А) і МВР (Фіг. 14Б). Даний аналіз показує, що М5КМ-Епм ії ЗМЬБАСІ вплив на диференціювання ОРС людини є високо відтворюваними і послідовними.
Для того, щоб нормалізувати експресію даних, контрольна умова (буфер) була використана як референс, і вважається 100 95. Таким чином, дані результати показують, що концентрації
М5АМ-Епу, які використовуються в даній серії, інгібують 24 95 кількості СМРабзе позитивних клітин (СТК: 10051 90; ЕММ: 7621 90) ії 27 9о кількості МВР- позитивних клітин (Сг: 10052 9о;
ЕММ: 7З3ж2 95). ЗМБАСІ (200 нМ) повністю змінює ефект МЗКМ-ЕММ на експресію СМРазе (СМБАС1-А: 10251 95; СМЬАС1-В 10151 95) (Фіг. 15А), але також і ефект на експресію МВР
Коо) (СМБАС1-А: 10152 95; ЯМЬАС1-В 97: ж 2 9) (Фіг. 155). 2.3 Аналіз результатів
Отже, дані з цього прикладу показують, що М5КМ Епм індукує міцне і високо відтворюване зниження експресії двох різних специфічних маркерів дозрівання олігодендроцитів. Таким чином, МКМ Епм інгібує диференціювання попередників олігодендроцитів людини в мієлінізуючі клітини. Крім того, ми наочно продемонстрували тут, що ОМБАСІ1 повністю усуває даний шкідливий вплив М5КУМ Епм і відновлює нормальний рівень СкРавзе і МВР в даній моделі.
Вказані результати показують, що СМБАСІ1 лікує блокаду диференціювання ОРС, індукованої
НЕВМУ-М/М5АМ-Епу. Таким чином, дані результати підкріплюють інноваційне показання
СМрАСІ1 для лікування демієлінізованих уражень, які викликані НЕКМ-М/-Епу. Вони, зокрема відносяться до прогресивних форм розсіяного склерозу, для яких ремієлінізація є критичною, але не походить від оточуючих ОРС М5 уражень, у зв'язку зі зберігаючими Епу-позитивними клітинами і секрецією, як показано в Прикладі 1.
Приклад 3: Дослідження терапевтичних ефектів ЗМБАСІ1 антитіла, І -МАМЕ, 5МТ, ОМЕ або фумарату натрію при Експериментальному Алергічному Енцефаломієліті (ЕАЕ) на мишачій моделі індукованого глікопротеїном олігодендроцитів мієліну (МОСС, Муеїїйп оїїдодепагосуїе діусоргоїгіпе) і МБЕМ/НЕКМ-МУ білком оболонки (Епм).
З.А Порівняння між окремими молекулами (монотерапія) і асоціації антитіла анти-Епм з малими молекулами, що інгібують Епу-індуковані ефектори при ОРС блокаді (комбінована терапія). 3.А.1. Матеріали
С57ВГ/6 миші з Спагіез Кімег.
МОа 35-55 ЕзрікКет, 5 (Роїурерііде сотрапу); посилання: ЗС1272.
СМрБАСІ1; партія Т950111-8 (Анти М5КМ/НЕКМ-М/ гуманізовані Ідс4 антитіла, що включають кожну з ділянок, що визначають комплементарність (СОР), які наведені у ЗЕО ІЮ Мо: 1, ЗЕО ІЮ
Мо: 2, ЗЕО ІЮ Мо.3 ЗЕО ІЮ Мо: 4, ЗЕО ІО Мо 5 і ЗЕО ІО Мо 6.
І-МАМЕ (Ма-нітро-І -аргінін метиловий ефір) Зідта; посилання: М5751-555 партія вВСвЕ4375У
ЗМТ (5) Метилізотіо сечовина (Зідта); посилання: М84445-1000 партія 5ЗТВС1003М
Диметилфумарат (ОМЕ) Зідта; посилання: 242926-1000 партія 2507УвСсВвн бо Метоцел МС 5ідта; посилання: 64605-1000 партія ВСВО9989У
ІРА (Зідта) Зідта; посилання: Е5506-10МІ. партія: 061М8728
РТХ (Коклюшний токсин; СаїІріоспет); посилання: 516561 партія 000128881
РВЗ (фосфатно-сольовий буфер; І опа); посилання 516561; партія; 000128881
Епм (Р'Х Тпегарешіісв); виробничі партії очищеного білка, перевірені на відсутність ендотоксину (тест І 0ОІ «5ЇЦІ /мл) і біоактивні (сепейго внутрішні тести 2С). Прилад Коїагой (І Е8200; Віозеб Франція) 3.А.2. Методи
Вільні від патогенів миші жіночої статі С57ВІ /6 (6-8 тижнів) були придбані у Спагіеє5 Кімег
І арогафогієз і підтримувалися на апаратурі для тварин протягом одного тижня до імунізації. За один день до імунізації, всі миші були зважені, а потім оцінювалися на тесті обертового барабана.
Обертовий барабан
Дні тестування: 9 і 8 днів до імунізації. Мишей транспортували в їхніх домашніх клітках, з кімнати, в якій тварини утримувалися, в експериментальну кімнату. Миші звикали до експериментальної кімнаті протягом 15 хв. В період навчання, кожну мишу поміщали на барабан, що обертається з постійною швидкістю (4 оберти за хвилину), якщо одна миша падала, то її повертали на обертовий барабан, до тих пір, поки миші не ставало комфортно на обертовому барабані, миші бігали протягом 120 с. Всіх мишей повертали в їх клітки, швидкість збільшували до 13 об/хв, і мишей знову поміщали на обертовий барабан на 120 с. Всіх мишей повертали в їх клітки, швидкість збільшували до 19 об/хв, і мишей знову поміщали на обертовий барабан на 120 с. Середовище приміщення для дослідів залишалося постійним між тестовими сесіями щодо температури, і інтенсивності світла.
Тестові дні: 1 день до кожної імунізації мишей транспортували в їх клітках з кімнати, в яких їх тримали, в експериментальну кімнату. Мишей привчали до експериментальної кімнати протягом 15 хв.
Потім мишей піддавали двом випробуванням при 10 збільшуючих рівнях швидкості, починаючи з 7 до 40 об/хв. Окремі затримки перед падінням з обертового барабана (для двох випробувань на кожному рівні швидкості) реєстрували до 60 с. Таким чином, для кожної тварини визначали підготовку і продуктивність в системі обертового барабана.
Зо Результати випробувань на обертовому барабані виражаються у вигляді кінетики середньої індивідуальної оцінки для кожної групи зі стандартною похибкою, зазначені в барах, для кожного дня випробування і для кожної тестованої швидкості в необхідному діапазоні для нейромоторного погіршення в даних умовах (від 16 до 29 об/хв).
Вони розраховуються для кожної окремої миші, для кожного дня тестування і для кожного значення швидкості, як відносне збільшення або зменшення часу на обертовому барабані (до падіння), у порівнянні з першим тестовим днем при одній і тій же швидкості (Д-7, перед початком індукції хвороби у відповідних групах). Значення розраховується як "Час на обертовому барабані на день Х" - "Час на 7 день для тієї ж миші з тією ж швидкістю". Цифри показують кінетику для різних груп на весь період навчання, для характерних дискримінаційних значень швидкості, при достовірній диференціації хворих від здорових тварин в наших умовах (наприклад, занадто високі або занадто низькі значеннях швидкості, або здорові падають негайно або хворі здатні підтримувати повільний рух).
Дані про початкову вагу і продуктивність своїм власним контролем, перш ніж середнє значення і стандартне відхилення були розраховані в групі. Різні групи тварин були розміщені однорідно в кожній клітині, відповідно до відповідної інформації, яку надано, перед кожною експериментальною серією.
Клінічна оцінка
Тварин зважували і клінічно оцінювали 5 днів на тиждень у відповідності з наступними критеріями: 0 - без ознак; 1 - параліч хвоста або гіпер-рефлексія задньої кінцівки(ок) або одностороння слабкість задніх кінцівок; 2 - двостороння слабкість задніх або передніх кінцівок;
З плюс односторонній параліч або великий дефіцит; 4 - повний параліч задніх кінцівок або передніх; 5 - плюс частковий параліч або великий дефіцит протилежних кінцівок; 6 - агонія або смерть. Вони були взяті зі стандартних критеріїв з тим, щоб відобразити більш швидку індукцію пошкоджень головного мозку і шийного мозку даною моделлю.
Мишей зважували З рази на тиждень по понеділках, середах і п'ятницях протягом всіх експериментів.
Для серії експериментів Прикладу 3.А, групи визначали наступним чином.
Всім групам 6 (шість) мишей вперше робили щеплення підшкірно в області шиї на день 0, потім збоку спини на 7 і 14 день; 200 мкг МОоС/мишу ї 60 мкг М3ЕАКМ-ЕММ-1ІРЕА.
Група А була позитивною контрольною групою МЗЕМ-Епуи, що індукує ЕАЕ без будь-якого лікування.
Для груп Ж-3, обробку СМБАСсІ, І -МАМЕ, ЗМТ і ОМЕ окремо або разом з СМБАСсСІ при дозах, які зазначені нижче, проводили на 12 день після імунізації, коли вже спостерігалося прогресування клінічних симптомів ЕАЕ. СМБАс1 гуманізоване антитіло вводили один раз, а І -
МАМЕ або 5МТ вводили кожні 4 дні до припинення дослідження на 29 день. Що стосується груп
Д і 3, які відносяться до лікування ЮОМЕ, ми визначили обсяг щоденних витрат води для кожної миші, і встановили, що (в наших умовах), кожна миша споживає близько 3,5 мл питної води в день. Таким чином, на основі даних вимірювань, доза в 1 мг ОМЕ--0,08 95 МейшШосеї! була додана в 3,5 мл питної води на мишу щодня. 350 нг коклюшного токсину (РТХ) на тварину, вводили (і.р.) у всіх групах на той же день після кожної ін'єкції імуногену, і відтворювали через 2 дні, як звичайно в протоколах ЕАЕ, щоб полегшити міграцію лімфоцитів через кров - гематоенцефалічний бар'єр.
Узагальнена презентація експериментальних груп в Прикладі 3.А
А 612001 Ї111171Г111711111171Сг1111171с1111111111в
Необроблений ви || 111 1
БОМоАСІ | 200) я | ІА | ях | ях | - | - - | 6 600 мкг/ вам 20) 5 | Ах 0 боомар | 76 1мг в г. ЗМ 200 ни ІРА ни 500 мкл ІР 1мг ж 0,08 95
Меїшйос
ДО ОМЕ 200) | БА С | з ві в 3,5 мл питної води.
Щодня
Е: ше ер 1
ІГ-МАМЕ
Ж. 1мг в
СМЬАс1 200 ни ІРА ни ни 500
ЗМ мкл ІР 1мг ж 0,08 95 , Меїшйос
З: еі в 3.5
СМрАс1-- 200 ня ІРА ня я І
ОМЕ МЛ. питної води.
Щодня
З.А.З Результати
Клінічні спостереження
Оцінку клінічних ознак і маси регулярно проводили, як описано вище. Рахунок кінетики ЕАЕ за досліджуваний період представлений на Фіг. 16, 17 і 18.
Регулярний і постійний розвиток ЕАЕ клінічних показників, таких як гіпер-рефлексія, параліч хвоста, слабкість задніх кінцівок, передніх кінцівок і частковий параліч, міг бути зафіксований у всіх мишей до кінця дослідів в групі А (ЕАЕ позитивний контроль) і до 12 дня в інших групах, які були оброблені на 12-й день СМБАс1 гуманізованими антитілами (група Б) або анти-вільних радикалів (група В, Г, Д) окремо або групами, які були оброблені одночасно СМБАСсСІ1 і анти- вільними радикалами (групи Е, Ж, 3).
Спостереження після обробки: клінічні ознаки у групі Б, яку оброблено тільки 1 раз з
СМБАсС1, злегка зменшувалися до дня 29. У групах, які оброблені тільки Г-МАМЕ, 5МТ, нерегупярне відновлення можна було спостерігати, але зі зменшенням прогресування ЕАЕ.
Слід зазначити, що на «16 день, введення 5МТ було перервано.
Що стосується груп Д, Ж і 3, які оброблені одночасно СМБАсі і І-МАМЕ, ЗМТ і ОМЕ відповідно, відновлення було набагато більш значним і, зокрема, в групах Ж і 3. Дані результати показують, що синергічні ефекти значно прискорюють і збільшують симптоми ЕАЕ. Варто також відзначити, що лікування даними речовинами не викликає яких-небудь відхилень в будь-якій групі мишей (у тому числі контрольних мишей, які досліджувались окремо).
По результатам, які представлені на Фіг. 16, 17 і 18, можна резюмувати, що: - найбільш підвищений клінічний показник (при найгіршому розвитку захворювання) засвідчений у необроблених тварин (група А). Тваринам, які оброблені тільки СМБАСТІ (група Б), стає краще після його введення (починаючи з 12-го дня). - групи, що оброблені Ї-МАМЕ або 5МТ тільки, мали більш низькі показники відновлення і кінетику, ніж група Б. - група Д, що оброблена ЮМЕ, і група Е, оброблена СМБАс1 (200 мкг разова доза) в поєднанні з І -МАМЕ мали еквівалентне відновлення до кінця дослідження. - група Ж, що оброблена антитілами СМБАСІ1 в поєднанні з ЗМТ, і група Н, що оброблена
СМБАСІ1 антитілами в поєднанні з ОМЕ, мала значно краще відновлення в кінці дослідження і більш ранню кінетику клінічного поліпшення, ніж всі інші групи. Дане демонструє синергічне посилення об'єднання ОМБАСІ і 5МТ або СОМБАСІ і ОМЕ, для значного поліпшення терапевтичного результату.
Випробування на обертовому барабані
Насамперед, має бути чітко зазначено, що групи з надписом "1 ін'єк." ії "2 ін'єк." на Фіг. 19 відповідають контрольним тваринам, яким вводили тільки один раз (1) або два рази (2) Епм білок і МОС антиген, у порівнянні з трьома ін'єкціями Епм білка і МОЄ антигену, які необхідні, щоб викликати клінічний прояв ЕАЕ, як у всіх інших групах. Вони є контрольними мишами, що піддаються Епм нижче патогенного порогу і без індукції клінічної картини захворювання. Вони підтверджують, що для того, щоб всі тварини були протестовані при різних обробках, що
Зо індуковані у розвитку гострої і серйозної ЕАЕ симптоматики і поступової зміни, потрібна подібна картина трьох ін'єкцій. Таким чином, терапевтичні ефекти, які спостерігаються у оброблених тварин, актуальні для ефективності лікування в поточних і прогресуючих захворюваннях.
Відповідно до результатів, які представлені на Фіг. 19, з показниками випробування на обертовому барабані при 23 об/хв, ми можемо побачити, що: - Фізичні зусилля при 23 об/хв досягають достатнього порогу для того, щоб розкрити основні сенсорні і моторні дисфункції у тварин: не оброблена група А має найгірший результат і кінетику, в той час як тварини з одноразовою або дворазовою ін'єкцією ("1 ін'єк. або 2 ін'єк"), мають значно більш слабкі симптоми і більш помітні зміни. Зневажливий і прогресивний клінічний дефіцит в контрольній групі Б підтверджує, що хвороби і відповідні ушкодження М5 були дуже активними при З ін'єкції Епи. Тому всі інші групи з різними обробками піддавалися подібній сильній індукції захворювання Епу. - Група Б з ЕАЕ, оброблена однією ін'єкцією 200 мкг СМБАСТІ, має відновлені показники, що подібні до контрольних мишей без індукції хвороби з низьким впливом на Епу, наприкінці періоду дослідження. - Найбільш примітний ефект, в даних умовах, виявлений для групи Ж, обробленої СМЬАС1 антитілом в поєднанні з 5МТ, яка, здається, має яскраву криву кінетики відновлення, яка закінчується при кращих показниках всіх груп в кінці дослідження. Це демонструє синергічне посилення об'єднання СМБАСІ і МТ для значного поліпшення терапевтичного результату. - Група Г, оброблена 5МТ, також має тільки поліпшені кінетику і результати (остання точка періоду дослідження), хоча і в меншій мірі.
За результатами, які представлені на Фіг. 20, отримані за допомогою обертового барабана з 26 об/хв, ми бачимо, що: - Фізичне зусилля при 26 об/хв підтверджує, що дані умови є вищими за поріг, що необхідний в даному експерименті для виявлення важливої чутливої і моторної дисфункції у тварин: контрольна група А має гірші результати і кінетику, в той час як тварини, яким вводили тільки один раз або двічі ("-1 ін'єкція або 2 ін'єкції"), мають значно більш слабкі симптоми і більш помітні зміни (дуже хороші параметри на кінець досліджуваного періоду для групи "1 ін'єкція"). - Група Б з ЕАЕ, що оброблена однією ін'єкцією 200 мкг ОМЬАСТ, має відновлені параметри, бо схожі на Г, Ж, В, Д і З груп і "2 ін'єкції" контроль, наприкінці періоду дослідження.
- Найбільш примітний ефект, в даних умовах, свідчив про те, що група Е, що оброблена
СМБАСІ1 антитілами в поєднанні з І-МАМЕ, очевидно має хорошу криву кінетики відновлення, що закінчується кращим результатом всіх груп в кінці дослідження. Група В, оброблена тільки 1 -
МАМЕ також має поліпшену кінетику і результат, хоча і в меншій мірі. Дане демонструє синергічне посилення об'єднання ОМБАСІ1 і Г-МАМЕ для значно поліпшеного терапевтичного результату.
По результатам, які представлені на Фіг. 21 при випробуванні на обертовому барабані з 29 об/хв ми бачимо, що: - Фізичні зусилля при 29 об/хв досі підтверджують, що дані умови вищі за поріг, що необхідний для ініціації головних сенсорних і моторних порушень у тварин: контрольна група А має найгірший результат і кінетику, в той час як тварини, що ін'єктовані тільки один або два рази ("7 ін'єк. або 2 ін'єк""), мають значно більш слабкі симптоми і більш помітні зміни з аналогічними хорошими результатами в кінці дослідження. - Група Б з ЕАЕ, обробленою за рахунок однієї ін'єкції 200 мкг ОМБАСІ1, має відновлені показники, які схожі на контрольних мишей без індукції хвороби з низьким впливом на Епу, наприкінці періоду дослідження. - Найбільш примітний ефект, в даних умовах, свідчить, що група Е, що оброблена ОМБАС1 антитілами в поєднанні з Ї-МАМЕ, що досі, здається, має хорошу криву кінетики відновлення, яка закінчується кращим результатом всіх груп (кінець дослідження). Група В оброблена І -
МАМЕ мала поліпшену кінетику і результати, хоча і в меншій мірі. - Ще одним загальним примітним результатом є систематичне поліпшення мишей з групи Б, які оброблені тільки ЗМБАСІ, який завжди показує в значній мірі стабілізовані і/або поліпшені показники в порівнянні з необробленими тваринами (група А) у всіх умовах (від 16 до 29 об/хв тестів).
Тим не менше, дана очевидна ефективність виявляється значно посиленою, шляхом поєднання СМБАсІ1 з ІЇ-МАМЕ або 5МТ. Вона була також поліпшена шляхом поєднання з ЮОМЕ, але з більш повільною кінетикою. В будь-якому випадку, це не виключає поліпшення з оптимізованими дозами і на більш тривалий термін лікування.
Таким чином, у всіх умовах тестування (у тому числі клінічні показники) поєднання ЗМТ, 1 -
Зо МАМЕ або ОМЕ з СМрАСІ забезпечило значну перевагу для клініко-функціонального відновлення в порівнянні з використанням будь-якої терапевтичної молекули, яку випробувано поодинці. Самі по собі малі молекули, очевидно, мають більш низькі і досить перехідні ефекти, в той час як ОМБАСІ1 має довгострокові наслідки, що забезпечують краще відновлення в кінці дослідження у порівнянні з даними невеликими лікарськими засобами, таким чином, показуючи тривалу ефективність.
Кінетика і амплітуда остаточного відновлення, будучи значно покращеною за рахунок комбінацій, тепер показано перевагу використання комбінації даних терапевтичних засобів для їх синергічних і цільових ефектів на функціональне відновлення в умовах іп міїго. Дане демонструє зазначення на ранню і більш потужну клінічну ефективність при захворюванні людини. 3.Б. Порівняння терапевтичної ефективності двох доз анти-Епм антитіла, які дано окремо як монотерапія або в комбінації з анти-МО лікарськими засобами. 3.Б.1 Матеріали і методи:
Якщо не вказано конкретно, всі матеріали і методи, є такими, як описано в Прикладі ЗА.
Експериментальні групи
Узагальнена презентація експериментальних груп Прикладу 3.Б
Всі миші отримували три ін'єкції підшкірно на шиї в СО, на дорсальній стороні з Д7 і Д14. Тут, мишам з групи А вводили тільки МОСС 200мкг/мишу і ІРА без Епм, що є групою негативного контролю без ЕАЕ в даній серії (сіп-). Група позитивного контролю з нелікованим ЕАЕ в даній серії представлена групою Б (сіпк). Іншій групі вводили 200 мкг МОоС/мишу ї- МБАКМ-ЕММ (60 мкг) - ІРА, з процедурами, як зазначено в вищевикладеній презентації. Лікування було розпочато на 12-й день після імунізації у своїх відповідних групах.
Групи В, Д, Ж отримали 200 мкг спрАСсІ1 при 12; Групи Г, Е, З отримали 500 мкг зпрАс1 при 312; Група Б отримала тільки ЗМБАс1 розчин буфера.
Групи Д і Е отримали ІР ін'єкцію 5МТ (200 мг/мишу) два рази на тиждень при 12, 914, 219, 321, 926 і 928.
Для груп Ж і 3, які отримують ОМЕ, ми попередньо визначили обсяг щоденного споживання води кожною мишею, і визначили, що (в наших умовах), кожна миша споживає близько 3,5 мл питної води в день. Таким чином, на основі даних вимірювань, дозу в 2 мг ОМЕж0,08 95 метоцел на мишу додавали до 3,5 мл питної води щодня.
Для кожної тестової швидкості обертового барабана, результати були підтверджені при кривих відповідних необроблених мишей з ЕММ-індукованої ЕАЕ (група Б, що є контролем з необробленою ЕАЕ) показали значний дефіцит в порівнянні з хибними контролями (група А, які імунізовані МОС розведеним у ІРА без Епму білка). Результати вважалися "неінтерпретуючими" всякий раз, коли такі критерії не були підібрані, як відповідні технічні і експериментальні умови, отже, як такі, що не проходять контроль якості на основі даної значної розбіжності кривих "Позитивних у порівнянні з негативними ЕАЕ" групами.
Після 20-ого дня, була зроблена внутрішньовенна (ІМ) ін'єкція 20 мкг МеКМ-Епм у фізіологічному розчині, для створення системної гострої проблеми за допомогою М5ЕМ-Епму білка у всіх мишей, коли значне клінічне поліпшення (ремісія- подібне) було отримано при більшості обробок у мишей ЕАЕ. Це було зроблено на день Д21 для мишей групБ, Г, ЕЕ і 3, або на день Д22, для мишей груп А, В, Д ії Ж, це було виконано з метою вивчення реакції різних груп з гострою Епм антигенемією, і оцінки можливих відмінностей у захисній ефективності різних методів лікування. 3.Б.2 Результати Клінічні спостереження
Показники клінічних показників і вага регулярно оцінювалися, як описано вище. Кінетика клінічних показників ЕАЕ протягом періоду дослідження представлені в Фіг. 22, 23 і 24. Криві маси, що вказують на відносну масу в порівнянні з днем до першої ін'єкції імуногенів, представлені на Фіг. 25, 26 і 27.
Зо Випробування на обертовому барабані
Результати досліджень на обертовому барабані представлені при різних швидкостях (16; 26; 29 об/хв) на фіг. 28, 29 і 30.
Дана серія експериментів стосується впливу середовища (200 мкг) в порівнянні з високою концентрацією (500 мкг) терапевтичного СМБАС1І антитіла як монотерапія, також були проведені аналогічні порівняння при поєднанні з 5МТ і ОМЕ.
Глобальне порівняння кривих клінічного показника за період дослідження було обгрунтовано, оскільки (І) необроблена Епу-індукований ЕАЄЕ (група Б) має найбільш несприятливі зміни і (ІІ) хибні імунізовані контролі без ЕАЕ (група А) не мають клінічних ознак, що виявляються понад період, який передує внутрішньовенній ін'єкції (ІМ) Епм на 20-й день.
До внутрішньовенної ін'єкції на 20-й день, всі оброблені групи значно відрізнялися від необробленого Епу-індукованого ЕАЕ. На 20-й день оброблені групи з різною кінетикою захворювання за період дослідження мали порівняльні показники з середнім значенням нижче 0,5, що вказує на період ремісії у всіх оброблених групах. Дане підтверджує ефективність усіх доз антитіл і всіх протестованих комбінацій як з ОМЕ так і МТ.
В подальшому задача з внутрішньовенною (ІМ) ін'єкцією Епм білка на 20 день, мімікрувала пік експресії Епм і його вивільнення в кров, як очікувалося, під час ініціації нового і важкого рецидиву, захворювання, яке природно виникає. На Фіг. 22, 23 і 24, пояснені значні відмінності в терапевтичній активності різних продуктів і доз: 1) СОМБАСІ1 показав високу ефективність в доданні стійкості даного піку Епм антигенемії при дозуванні 500 мкг (група Г), але тимчасові клінічні порушення були виявлені при дозі 200 мкг (група В). 2) У разі комбінації з 5МТ, не було помічено суттєвих варіацій клінічних параметрів при двох дозах СМБАСІ (групи Д і Е). Таким чином, ЗМТ присвоєна підвищена стійкість до ІМ МОКМ-Епу, для мишей, які отримали низьку дозу ЗМБАСІ1 (200 мкг) в порівнянні з мишами, яких лікували тільки антитілом при даній більш низькій дозі (група В). 3) Миші, що оброблені ОМЕ, показали клінічну резистентність до даного піку антигенемії, коли також оброблені більш високим дозуванням СОМБАСІ (група 3), але не змогли запобігти клінічним порушенням при низькому дозуванні (група Ж). ОМЕ, таким чином, не забезпечує підвищену стійкість до ІМ М5КМ-Епм у мишей, які оброблені найменшим дозуванням СМЬБАС1 60 (200 мкг). Миші, що оброблені ОМЕ ії більш високими дозами ЗМБАС1 (500 мкг, в групі 3)
демонстрували порівняльну стійкість, порівняно з мишами, які оброблені тільки СМБАСІ в тій же дозі (група Г). 4) Криві, що показують збільшення маси протягом періоду дослідження у всіх групах несподівано показали, що група Г, що оброблена СМБАСІ1 при 500 мкг, мала кращу кінцеву точку. 5) ОМБАСІ при 200 мкг (група В) або ОМЕ з СМБАСІ але при більш високій дозі (Група 3), дали кінцеві точки, що еквівалентні хибним контролям.
Дане вказує на те, що, крім відносної ефективності різних способів лікування, що показані з показником клінічної кінетики: - СМБАСІ1 антитіла самі по собі у високих дозах (500 мкг) демонструють кращу клінічну ефективність. Вони також чинили позитивний вплив на загальне здоров'я тварин, як показано за допомогою динаміки зростання маси. - У поєднанні з ОМБАСІ при більш низькій дозі (200 мкг), 5МТ показав значно більшу ефективність для лікування, з повною стійкістю до залишкової проблеми М5КМ-Епм ІМ.
Дане вказує на те, що СМБАСІ демонструє найсильніше лікування, оскільки забезпечує кращі результати при більш високій дозі (500 мкг), але, і при своїй низькій дозі (200 мкг), воно значно посилено в поєднанні з ЗМТ, яке ефективно запобігає клінічним загостренням після піку
Епм антигенемії створеної ІМ ін'єкцією в кінці дослідження.
Крім того, дані результати також показують, що більш високі дози СМБАСТІ, самі по собі або в комбінації із даними дозами ОМЕ, забезпечують істотне посилення в терапевтичній ефективності у відношенні загального стану здоров'я (відповідно до кривих зростання маси).
Тим не менше, можлива синергія 5МТ або ОМЕ з СМБАСІ при більш високих дозах, якщо є, неможлива, оскільки антитіло саме по собі вже забезпечує максимальну терапевтичну ефективність при даних умовах індукції захворювання і активності в ЕАЕ у мишей.
Паралельно випробування на обертовому барабані об'єктивно підтверджує, при всіх відповідних швидкостях (Фіг. 28А, 29А і З0А), що більш високе дозування ЗМБАС1 (500 мкг/мишу) є найбільш ефективним продуктом (що призначається окремо) у поліпшенні неврологічного дефіциту оброблених Епму, які індуковані ЕАЕ, мишей.
Випробування на обертовому барабані також підтверджує синергетичні ефекти ЗМТ з
Зо СМрБАСТІ, в той же час, що показує неврологічне поліпшення тварин, що оброблені низькими дозами СМБАСТІ в поєднанні з 5МТ, що демонструють значне нейромоторне поліпшення при 26 і 29 об/хв (Фіг 29Б і ЗОБ). При 16 об/хв (Фіг. 28Б), низька швидкість, здавалося, не забезпечує досить дискримінаційної здатності для підтвердження даного клінічного поліпшення за досліджуваний період.
Нарешті, результати на обертовому барабані показують поліпшення Епу-індукованих ЕАЕ у мишей з ОМЕ при обох дозах СОМБАСІ, але дане стає ясно значущим тільки при 29 об/хв (Фіг. 30
В).
Отже, беручи до уваги результати даної мети і автоматизовані тести, що оцінюють неврологічну продуктивність тварин, ЗМБАСІ1 є очевидно, надійним лікуванням, коли дається як монотерапія, що показано в Прикладі 3.Б. Синергетичні ефекти з молекулами анти-МО, як видно з ЗМБАСІ при більш низькій дозі з МТ, також чітко свідчать і вказують на потужне терапевтичне посилення. Дане має бути при різних дозуваннях СМБАСІ, але не може бути виявлено в нинішніх умовах з уже максимальними ефектами 500 мкг з ЗОМБАС1. 3.В. Порівняння між анти-Епм антитілом або фумаратом натрію поодинці (монотерапія) і анти-Епм антитіла з фумаратом натрію (комбінована терапія). 3. В 1 Матеріали і методи
Матеріал аМрАсї | (бепеию)// | 77717171 теБОТвЮ (СІМАпегівобуресіїї | 77777771 9ло281
Експериментальні групи
ІзотТИП (мкг) : натрію антитіл
А)-сії | 200 | - | ІРА | ях | Рійсеро| -- | - |5/ 500 мкг 200 ни ІРА - | ріасеро/ 7 ї
Маг Фум питної води до кінця щодня дослідження питної води до кінця щодня дослідження 3. В.2 Результати
Клінічні спостереження
Оцінку клінічних ознак і маси регулярно проводили, як описано вище. Показник кінетики ЕАЕ за досліджуваний період представлений на Фіг. 31.
Група А, яка представляє негативні контролі, що ін'єктовані ІРА, МО без Епм білка і ін'єкції плацебо антитіл, що містять його буфер розчинник, не демонструвала значні клінічні симптоми протягом періоду дослідження.
Поступова зміна ЕАЕ клінічних показників може бути зафіксована до 12-ого дня в групах, які були оброблені на 12-й день з СОМБАс1 гуманізованими антитілами (група В) або з фумаратом натрію, ОМЕ-зв'язаними анти вільних радикалів окису азоту (анти-МО), поодинці в групі Г або одночасно з СМБАСІ в групі Е.
Цікаво тут тільки групи, що отримали високі дози СМБАСІ1 антитіла (В і Д) показали значне повернення своїх показників клінічних кривих і значно поліпшену кінцеву точку в кінці дослідження. Група Г, що оброблена тільки фумаратом натрію не показала будь-якого значного клінічного поліпшення в порівнянні з групою Б, яку оброблено неефективним ізотипом контрольного антитіла (Перекриваючі величини похибок на кривих). Регулярний і постійний розвиток ЕАЕ клінічних показників можуть бути записані у всіх мишах аж до кінця досліду в групі
Б (Епу-індукованої ЕАЕ), яку оброблено ізотипом контрольного антитіла без специфічності до білка Епу. Дане вказує на те, що терапевтичні ефекти, які спостерігаються з ЗМБАСІ1, є специфічними для цього, зокрема, антитіла і не мають відношення до ін'єкції будь-якого гуманізованого антитіла з тим же ізотипом який, наприклад, не буде націлений на той же епітоп.
Таким чином, даний останній приклад показує, що: - Контрольна група А без введення Епм білка поводиться як здорові контролі без клінічних ознак, незважаючи на ін'єкції всіх інших компонентів, які необхідні, щоб зводити нанівець Епу- індукцію ЕАЕ (ІРА ї МОСС), а також зводити нанівець ін'єкції антитіла (Розчинник антитіла); хибної доставки водорозчинного фумарату натрію, що є неявно наданою за рахунок нормальної питної води. - Найбільш підвищений клінічний показник (при найгіршому розвитку захворювання) зареєстрований у тварин, які оброблені нерелевантним ізотипом контрольного антитіла (Група
Б). Дана ін'єкція хибного ізотипу антитіл у присутності Епм білка, таким чином, демонструє позитивний контроль ЕАЕ з типовою поступовою зміною ЕАЕ. - Група Г, що оброблена тільки фумаратом натрію, мала несприятливий результат в кінці дослідження, який подібний з групою Б, яка оброблена неефективними контрольними антитілами. - Групи В ї Д, що оброблені високими дозами СМБАСІ1 антитіл окремо або в поєднанні з фумаратом натрію, мали еквівалентне і значно краще відновлення в кінці дослідження. Клінічне поліпшення з'явилося на 15-й день, після початку лікування.
Тут, оскільки фумарат натрію самостійно не чинив ніякого ефекту і, оскільки криві динаміки груп В і Д еквівалентні, терапевтичний ефект, що спостерігається в даних двох групах повинен бути повністю і виключно викликаний СМБАСІ, в той час як фумарат натрію показав неефективність. 3.Г Аналіз загальних результатів Прикладу З
На закінчення, окремо або в комбінації, лікування за допомогою анти-Епм специфічних антитіл, таких як СМБАсСІ і антитіл у порівнянні з вільними радикалами окису азоту (анти-МО) сполук, таких як ОМЕ, ЗМТ або І-МАМЕ, є переважними, завдяки лікуванню і запобіганню блокади потенційної активності ремієлінізації, яку викликано НЕКМ-МУ/ білком оболонки, зокрема,
М5ВМ-Епм, іп міо і іп мімо.
СМБАСІ при високому дозуванні (500 мкг/мишу близько 20-25 г) також показав ефективність у порівнянні з низькою дозою (200 мкг), яку дано як монотерапія в даних прикладах.
Посилання: 1. Реітоп Н, Сагзоп ДА, Веадіп Е, еї а). МоІесшіаг ідепійісайноп ої а помеї! геігоміги5 гереаїваіу івоїаїей їот раїепів м/йп тийіріє зсієговів. Тпе СоїППарогаїме Везеагсп Стоир оп Мийіріє Зсієговів.
Ргос Маї! Асай 5сі 05 А. 1997; 94: 7583-8. 2. Ретоп Н, Септі В, Вегпага С, єї а. Нитап епдодепоив геїгоміги5 їуре М/ епмиеіІоре ехргезвіоп іп ріоса апа бгаїп сеїїІ5 ргомідев5 пем/ іпзіднів іпіо тийіріє 5сіего5із дівеазе. Маїї Зсіег. 2012; 18: 1721-36.
З. Вппо 5, Сегсідпапі М апа ВКоп МА. МУпіе тайег арпоптаїйіев іп Біроїаг адібзогаег: а мохеі!- разеа аіпйивіоп їепзог ітадіпд зішау. Віроїаг Оізога. 2008; 10: 460-8. 4. Ссоднагі ММ, Вепйт К, Сапег С5 апа МасОопаїй АМ/. Зиїса! (піскпе55 аз а миїпегарійу іпаїсайог ог 5спі2горнгепіа. Вг У Рзуспіаїгу. 2007; 191: 229-33. 5. Біємеп5 УВ. Мепгораїпоіоду ої зспі2орнгепіа. Агсй Сієп Рзусніаїгу. 1982; 39:1 131-9. б. Реітоп Н, Натаапі М, Рашйсага Р, єї аї. МоїІесшціаг сНагасієгівіс5 ої Нитап Епдодепойв5
Веїгомігив туре-МУу іп 5спігорнгепіа апа бБіроїаг аізогаег. Т гапві Рзуспіату. 2012; 2: е201. 7. Реітоп Н, дойміп-Магспе Е, Міспе! М, еї аї. Мийіріє зсіего5іб геїгоміги5 рапйісіев апа гесотбіпапі епмеІоре їгіддег ап арпогтаї іттипе гезропвзе іп міїго, Бу іпдисіпа роїусіопа! Мреїа16
Т-Іутрпосуїе асіїмайоп. Мігоіоду. 2001; 287: 321-32. 8. Оеєіагаєзе С, тій Р, ВаКег О апа Атог 5. Моме! раїйодепіс еріоре5 ої туеїїп оЇїдодепагосуїє діусоргоїєїп іпдисе ехрегітепіа! ашоїттипе епсернаіотуєеійів іп С57ВІ /6 тісе.
Іттипоіоду. 2013. 9. Неіпеп А, Ктетег О, СошШе Р, єї аІ. Те сусіїп-дерепаепі Кіпазе іппібйог ро 7Кіре іза педаїїме гедшаюг ої 5спулапп сеї! аїйегепііаноп апа іп мйго туеєїїпайоп. Ргос Маї! Асай 5сі О5А. зо 2008; 105: 8748-53. 10. РоПапа А, Чдоцміп-Магспе Е, Мігеї С, Рацге М, Ретоп Н апа Магсне РМ. Те епиєіІоре ргоївіп ої а питап епдодепошв геїгоміги5-МУ Татіїу асіїматев5 іппаїе іттипйу (годи СО14/ТІ 4 апа ргоотоїев5 ТП1-ІїКе гезропзев. У Іттипої. 2006; 176:7636-44. 11. Спапуд А, Тоишпейоце МУМУ, Видісєк А апа Тгарр ВО. Ргетувеіїпаїйіпу оїїдодепагосуїев іп / сПпгопіс Іевіоп5 ої тийПіріє зсієговів5. М Епді У Меа. 2002; 346:165-73. 12. Кипітапп Т, Мігоп М, Сиі ОО, М/едпег С, Апієї У апа Вгиск МУ. Оійегепііайомп ріоскК ої оїїдодепагодіїа! ргодепіог сеїї5 ах а сайбзе ог гетуеїїпайоп Тайиге іп спгопіс тийріє 5сіеговів.
Вгаїп. 2008; 131: 1749-58. 13. Ктетег О, АКіаз О, Напипд НР апа Кигу Р. Те сотріех уопа ої оїїдодепагоадіїа! адійегепіаноп іппірпог5. Апп Мешгої. 2011; 69: 602-18. 14. Котипап-Ргаде! Р, Рагаппо5-Вассаїа С, Ведіпй НЕ, єї а). МоіІесшіаг сіопіпд апа спагасієгігайоп ої МОВ У-геїіаігед зедиєпсез аззосіаївй м/п геїгоміги5-ЇйКе рапісіє5. Мігоіоду. 1999; 260: 1-9. 15. І енпагаї 5, Маззійоп І, ЕоїПеїй Р, еї аї. Асіїмайоп ої іппаїе іттипйу іп Ше СМ5 іддете пешигодедепегаїйоп Іпгоцай а Тої-ІїКе гесеріог 4-дерепаепі раїпугау. Ргос Маї! Асай сі ОБА. 2003; 100: 8514-9. 16. Апіопу УМ, мап Мате С, Орії МУ, єї аї. Нитап епдодепоиз геїгоміги5 діусоргоїєіїп-тедіаїтей іпдистіоп ої гедох геасіапі5 сайзез оЇїдодепагосуїе аеайй апа детуеїїпаїййоп. Маї Мейговсі. 2004; 7: 1088-95. 17. Воїк Р, Вгом/п МР, Недуї Н апа 5спийа У. Те ргоївїп рпозрНаїазе 2С (РР2С) зирепатіїу: деїесіп ої Басівєїа! потоіодиев. Ргоїєїп сі. 1996; 5: 1421-5. 18. Віопа ЛІ, Везете ЕЕ, Юигеї Ї, єї аЇ. МоІесшціаг сНагасієгігайоп апа ріасепіа! ехргезвіоп ої
НЕНУ-МУ, а пем/ питап епдодепоиз геїоміги5 Тату. / МУгої. 1999; 73: 1 175-85. 19. Мі 5, ее хх, її Х, еї аї. 5упсуїйп і5 а саріїме геїгоміга! епмеіоре ргоївіп іпхоїмей іп питап ріасепіа! тогрподепезвзів. Майте. 2000; 403: 785-9. 20. Виргесні К, Оброї|ез К, УУепаєї! У, єї аІ. Веашаїйоп ої пПитап епдодепоиз геїгоміги5 МУ ргоївїп ехргезвіоп Бу Пегрез 5ітріех мігив їуре 1: ітріїсайоп5 ог тийПіріє 5сіеговів. У Мешгоміго!. 2006; 12: 65-71. 21. Аиргест!ї К апа Ретоп Н. Ехрозиге 0 іпгапі в5іріїпд5 дигіпуд єапу Ше апа ті5К ої тиПіріє 60 5сіегові5. ЧАМА. 2005; 293: 2089; ашпотг геріу-90.
22. ВоерКе С, Ман! 5, І ашег С, єї аІ. Ап М-ІеттпіпаїІу іпопсаївед епуєіІоре ргоївіп епсодейд Бу а
ПпПитап епдодепоиз геїоміги5 М Іоси5 оп спготозоте Хдг22.3. Неїгомігоіоду. 2010; 7: 69. 23. Ретоп Н, Септі В, Вегпага С, Сіагсіа-Мопісїо М, Оеєвішеп С апа Рагіпейй С. Нитап
Епдодепоив Неїгомігив туре МУ ЕпмеІоре ехргезвіоп іп ріоса апа бБгаїп сеїїІв ргоміде5 пем/ іпвіднів іпто Мийіріє Зсієговів дізеазе. Мийіріе Зсіеговів |оитаї. 2012; БОЇ: 10.1177/1 35245851 2441381. 24. Реітоп Н апа І апа А. Те пПитап епдодепоиз геїгомігив5 пк Беїм'єєп депез апа епмігоптепі іп тийіріє 5сіего5іє апа іп тийТасіюгіа! дізеазе5 аззосіайпуд пеигоіпПаттаїйіоп. Сіїп Рем АЇПегду
Іттипої!. 2010; 39: 51-61. 25. Нігои?гі В, НоїЇапа А, Місне! М, єї аІ. Мийіріє 5сієегов5і5-аззосіаїеа геїгомігив рапісіе5 саизе Т
Іутрпосуїе-дерепаєпі авайй міййп Бгаіїп петоітнаде іп питапігед ЗСІЮО тісе тоавеї. ) МеийтгомігоЇ. 2003; 9: 79-93.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Хенеро «1205 СПОЛУКИ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ БЛОКАДИ РЕМІЄЛІНІЗАЦІЇ ПРИ ЗАХВОРЮВАННЯХ,
ЯКІ ПОВ'ЯЗАНІ 3 ЕКСПРЕСІЄЮ БІЛКА ОБОЛОНКИ НЕКМ-М «1305 ВЕО8006б/чо/сси «1505 у 61/708779 «1515 2012-10-02 «1505 ув 61/745792 «1515 2012-12-28 «160х 30 «170» Версія, що патентується 3.5 «210» 1 «2115 10 «125 ПР. «213» Миша хатня «00» і заг Аїа бег Баг бег Уа! Баг тує мак отук 1 5 10 «0» 2 . «2313 У «їй ПРТ «213» Миша хатня «00» 2
Ак Тпгозег АБИ гей Аїа 5ег 1 5 «2» з «2135 9 «219» пет «213» Миша хатня «400» 3 ся біп тук бів вег сен ро ге тАг «2105 4 «ЇЇ» 5 «125 пр. «213» Миша хатня «Ой» 4 др тує від Меї ні 1 ' 5 2105 5 «2ї2з ПРТ «йі3» Миша хатня
«400» 5
Аа уаї АТа РгГО сім тб об1у сб1у те о Аїа туго а5п біп гух вве гу 1 5 10 15
Ф1у «210» 5 «211х5 7 «Ф1й» ПРЕ «2135 Миша хатня «4005 6
ТВеомаї Уа! Рго ває Аїа туг 1 ! к«ві0» 7 «2115 20 «252з ДНК І й «213» Штучна послідовність «220» | й І «223» Праймер для ампліфікації «00х 7 стадЧчаєктся дстагадаса 20 «2105 6 «вії» 21 «24122 ДНК | , «213» Штучна послідовність «Ох о «2232 Праймер для ампліфікації «Ах 8 адоктасаву сстсоатосЕс с 21 «і10» 9 «Ті 21 «219» ДНК «213» Штучна послідовність «тей «223» праймер для ампліфікації «00» 5. І сесавсасва асдчастсана й 21 «10» 10 «11» 39 «2Щ125 ДНК і «213» штучна послідовність «й» «2232 Праймер для ампліфікації «300» 10 тосасссаза сассааочі 19
«2105 11 «211» 720 к212и ДНК «213» Штучна послідовність «ий» с.
І «223» Праймер для ампліфікації «40025 1 тозодадсад оссововасе 20 «2105 «415 21. «гій» ДНК , «2135 Штучна послідовність «25 шк о «223» Праймер для ампліфікації «4005 12 тдатаосдст кстоЗстест о 21 «10» 13 «-2112 79 «212» ДНК й о «213» Штучна послідовність «2205 Й «223» Праймер для ампліфікації «400х 13 тодасстдає седссокста 20 «2105 14 «2115 90 «21225 ДНК | й «213» Штучна послідовність «йо» же23» Праймер для ампліфікації «400» 14 задаттаває дгсастаєсо 20 «ех 15 к1ї» 22 -о1їйх ДНК «213» Штучна послідонність «220» | г «223» Праймер для ампліфікації «400» 15 щ засссєвна тдадсссато та 22 «210» 16 «аїї» 21 «212» ДНК | й 213» Штучна послідовність «вх | І «223» Праймер для ампліфікації
«005 16 ссдозстссо тдатоєссаа 9 21 «205 17 «2115 70 «2125 ДНК І «213» Штучна послідовність «2205 щи «2232» Праймев для ампліфікації «4005 17 ! пааасадсва ховеЕсоаЧає 20 «2105 18 «231» 29 «12» ДНК й «її» Штучна послідовність «2205 и, «223» праймер для ампліфікації «4005 18 зачасасвач кІссасвоє о «210» 19 «211» 21 «12 ж ДНК й «213» Штучна послідовність
Ук «23» Праймер для ампліфікації «400» 19 дуІкосоасває сосавстсто а гі «910» 20 «211» 21 «125 ДНК «2135 штучна послідовність «ВЕ» . І ; «23» Праймер для ампліфікації «00» 20 І хстоаасаутоа сатсаєсост 9 21 «М 71 «2115 19. «2192 ДНК «2135 Штучна послідовність «ве» «2й3х праймер для ампліфікації «00» 2 чаасадааза стсастоас 19 «2105 22 «1їх 20 «2125 ДНК
«213» Штучна послідовність «аа о «ййЗ3» Праймер для ампліфікації «Ой» 22 зв осаєсуєсазда кссасаасод 20 «2105 73 хе1іїх 20. «212» ДНК , , «213» Штучна послідовнасть «0» г, , «2283» праймер для ампліфікації «40025 73 дасессаово оссвавсатс 20 «21025 24 «1і1з 20 «212» ДНК | І «213» Штучна послідовність «гЕ0х «223» Праймер для ампліфікації «4005 24 агтассяасає таассогвас 2а «їй» 25 «211» 30 «219з ДНК «гії» Штучна послідовність «20» ; й «223» Кодуюча послідовність для СОК «аю кадї» тс о Тедтисге «2223 533)..53) кег3з па, с, а, або їх к220» «й2із ті5с, Теахиге «ой (5..5) «23» пе а, с, 9, або ї «2205 М «їх ті5сотвастике «айв» Зк..093 «23» п'є а, с, 9, або «ктедх «Її» тізс Театиге «й» Сир СИ «223» пеє а, с, а, або «ах ! «221ю шті5сотТеакиуке «вада (153..615) «223» пе а, с, чу, або ї кагО» «веї» щті5с, Гвабсиге
«бо?ж 183,18) «003 п'є а, с, 9, або Є «20» «ії» тів ТГеатугае «й» (91). .521) «225» пев, с п, або їх «00» 25 А че5паспизпи 5пузпосляи йсауатотау 539 «73105 26 «2113 71 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2О0х , й «ейі» Кодуюча послідовність для СІ «20» «вії» пізс.ТГеатиге «2222 (33...) «гі» па, с, 9, або «гйх «їх ті5С.Тватиге «922» 63,55) «таіх пеєа, с, о, або ї ково» «г21х щі5с Геаїтцге «фей» (93..19) «23» п'є а, с, 3, 80 «220» «геї» тієс Театиге «ий (153..0153 кг232 па, кс, в, або ї «0» «ваїх тс Єеасуге «дах (183018) «223» па, с, З, або їх «Тер «221» тіб5с о тТедтуге к222з3 (2135..021) «223» пєа, є, а, або ї «4005 265 топаспизпа аууспостух п 21 «210» 77 «2115 57 «217» ДНК «213» штучна послідовність «20» , І «03» Кадуюча послідовність для Со «20» «евї» пізс Театиге «йо» (153..,1153 «гА3З» шеєа, с, 9, бо ХЕ
«в «гії» шті5с.Геатиуге «бах (183..018) «2235 па, с, 9, або ї «2205 «в» ті5с.
Геатиге «діда» 21у..023) «223з па, с, ад, або ї «220» «вх тізс.Тезатиге «дай (243.24) «223» п'є а, с, 9, або х «Ох. «221х тізс театиге «й» (273..(27) «223» па, с, 9, або х «а00х 27 саксаєтауєс агезпусисс пуспаса 27 «2105 728 «211» 15 «2125 ДК «213» Штучна послідовність «Ро0х «2243» Кодуюча послідовність для сок «АВ ВС даутаудага сдсау 15 «2105 29 «11» 5 «12» ДНК «213» Штучна послідовність крЕОх «223» Кодуюча послідовність для СОК «едх «бе1» лизс Театуге «й (3.03) «223» па, с, 9, або «20» | і «221» ті5с Театиге «дййх (63..563 «га3х пєа, с, 9, або т «од» «21» шті5с.Театиге «да (93.9 «га3У па, с, 9, або ї «20» «0213 ті5с.Театуга «вий (193.12) «223» пеєа, с, а, або «году «раї» ті5с Геатиуге
«йййз К18Р..018)3 «223» па, с, 9, або «аа «21» тіб5с о театиуге «йду Си1..(2 «223» п Еє я, с, 9, айО їх «20 «221» тізс Теасиге «йог» (243..024) «3» па, сь, або є «2Йх «221» тізс. Теасицке «дей (273..097) «га3» п еєв, с, 9, Во х кг» «221» ті5с Теасиге «еййм (303..030) «223 па, с, дв, або 5 «2 «агіїю тізс о Тедкуге «аз (53.0 «23» па, с, 9, або Х «005 (29
Чспоаспоаспс спдагаспоя поднаспоасп саудвусага агттуазгоч п 51 «МО» 30 «її» ії «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «КОХ «223» Кодуюча послідовність для СІК «агО» «гі» ті5с. Геасге «рай (33.33 «г23» п ЕВ, с, о, або Ж «ЙО «гаї» тесотеасиге «ай (5.6) «і» па, с, о, або «20» «22із шізс. Театуге «Фей» СК93..(9) хийЗ» п'є а, с, 9, або х «вах «гії» тізс.Гедтиге «2225 (12У..(12) «223» пеєа, с, а, або 5 «вед» «221х ті5с.оТедтиге «222» (1835..018) «223» пев, с, 9, або «-4005 30 аспатпаїпс систудспта у 21

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Фармацевтична композиція, яка містить щонайменше ліганд анти-М5АМ/НЕВУ-УУ Епм і щонайменше однин лікарський засіб, що інгібує радикал окису азоту, де: - вказаний ліганд анти-НЕНУ-МУ/ Епм містить кожну з ділянок, що визначають комплементарність (СО), зазначених в ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІО МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО ІЮО МО: 5 та ЗЕОІО МО: 6, - вказаний лікарський засіб, що інгібує радикали окису азоту, вибраний з групи, що складається 3 Мао-нітро-І -аргінінметилового ефіру (І-МАМЕ), 5-метилізотіосечовини /(ЗМТ) і диметилфумарату (ОМЕ).
2. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що ліганд анти-М5КМ Епм є 5сЕм, Еар-фрагментом або антитілом, більш переважно химерним, синтетичним або гуманізованим антитілом, і більш переважно Ідс, таким як Їдс1 або дві.
3. Фармацевтична композиція за п. 1 або 2, що застосовується для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при розсіяному склерозі (М5), переважно рецидивуючому ремітуючому розсіяному склерозі (ККМ5), прогресуючому розсіяному склерозі, такому як вторинний прогресуючий розсіяний склероз (ЗРМ5) або первинний прогресуючий розсіяний склероз (РРМ5), хронічної запальної демієлінізуючої полінейропатії (СІОР), психічних розладах, таких як шизофренія або біполярні розлади, та інших демієлінізуючих захворюваннях, що пов'язані з експресією білка оболонки (Епм) НЕКМ-МУ.
4. Спосіб профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, що пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-М/, що включає введення щонайменше одного ліганду анти-НЕВМУ-М/ Епм і щонайменше одного лікарського засобу, що інгібує радикали окису азоту, людині, де: - вказаний ліганд анти-НЕНУ-МУ/ Епм містить кожну з ділянок, що визначають комплементарність (СО), зазначених в ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮО МО: 4, ЗЕО ІЮО МО: 5 та ЗЕОІО МО: 6, Зо - вказаний лікарський засіб, що інгібує радикали окису азоту, вибрано з групи, що складається з Ма-нітро-І -аргінін метилового ефіру (СГ-МАМЕ), З-метилізотіосечовини (5МТ), і диметилфумарату (ОМЕ).
5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що ліганд анти-М5ЕМ Епм є зсЕм, Гар-фрагментом або антитілом, більш переважно химерним, синтетичним або гуманізованим антитілом, і більш переважно Ідс, таким як ІдС1 або Ідса4.
6. Спосіб профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації за п. 4 або 5 при розсіяному склерозі (М5), переважно рецидивуючому ремітуючому розсіяному склерозі (КЕКМ5), прогресуючому розсіяному склерозі, такому як вторинний прогресуючий розсіяний склероз (ЗРМ5) або первинний прогресуючий розсіяний склероз (РРМ5), хронічній запальній демієлінізуючій полінейропатії (СІОР), психічних розладах, таких як шизофренія або біполярні розлади, та інших демієлінізуючих захворюваннях, що пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕВМ-МУ.
о м и КК М НН АК КК пп КВ М, ПЕНи ето виш он ВУ ОБ П Е ХК МВ МОЯ МКК ОК НЕ я Ж ШИМИ ТИМ З У ХМК ТІК ви КУ З: "ЗНОВ око но КАМ НН МН М ОН А КЕ В А М і А ОН я ОКХ ФОНИ КК КВ К ОК НК КЕ РКК КК ЗХ ОМ: НИ В вве Ко іону УОЗ оо ПОКИ КЕ ОО я Ку ПІДП, Р он ЕС НКУ ОК ОНИ ОК ОХ ЕК СО АК Кк В НВ МЕЖ и КЕ КК, КО Я ХК о ЕНН ПИЛКИ ЕК Я ІМК В КМ и в Б Он я Он ох Оу ВН и ЕВ се а БО УК я ВЕ в Е ОН ВИ ІМК Ку ВИ Кв по он ОКО а ЕК ФК о ВО А НН ОХ ШМУМТ УК ХК ВИМИ Он ОО ОН ОК М ОК НЯ НО КО Я ПОМ АСУ КК, ВВ ОО М НО М У В НЕК ВТ ХЕ КК КК ЗК ЕЕ о НК С КИТИ ПИЛ ПКТ ВК, ОО НК М ООН: В ЗК БАХ Се НН ВИННА М ЕН КЕ М І ОК Ко ОК КОНЦ ПЕКИ КА КК КК: ЯНОМ ов он увевк оон Он о НН КО ок Ер ДИ ЕК ЕК ОКО в НК о СОС. а ня МН Я не а МН ПМД ХЕ ЛЕ и ПИКА НК нн НК З НИ о ве ЗУ МУЗ УК СКЗ К ОО В В Я МВ ПАК І КОКО В ПЕН УМ Ще АНЯ ОМ ОК М КН В М У СИДТИЕ о В В ЕКО ВК КК ОК 58, 5 пт си ЕЛЕ ПОЛИВ УК Я КО М ВК ЛЕВИ МОВИ І Я ОКО м ко ов СВЙ КК : УК и ПИ МИТ ВАВТЖ ВО оо оо вк в в Ов т в о во ЗБ, врорзацовось посксвнвкох В КЕ І М Я С а НН НЕ о ИН и МО аа полив " хх: ЕК Ах Аа жх . он Ж и Я и ВО я оБ В ин М й НН МНН Ше нн М я о ни ВО о нн ВН нини т. и Ж Ти ли ВЕК о Ж. ОН КН ООН рення пет ДИ ВЕ Тіт во КВ и пит Пи МИ НО ПЕКІН ПЕК ик авт с Е: пн он Я М СЕМИ ЛОЛИ И ТЕ он ення: вини Ж МНЕ о о нь Я - ТИ и ши нн а и и в НН ий й чи НН тен Ви МНК о ни НКИ І я пев Е сов ПЕД ж Ж ві а У ЕЕ У ПЕТИМИ КНТ НИМ ВОВК по ЛШ ОТОЙ т Й пт а ОВЕН а и я п пово В Он Кк НиННо нн З ВВ ВК я М В КОН с. ПОТ ОКей к.с ОК ше МИННИ ша Б - нн Не МО ВН ВИН ее НН г: но денні Мо Ок ов ан Еш зн НИ ік: ДЕОООКЯ ЛИЖ Ви ПИШЕ ВОНИ и ШИТИ Вин новин ЗНИК нн ВВ Й Код шк В КК ву я КО ШТ и ниви м ОО В о ЗЕ Б ас Е Е пох пд В: ШИ ТИ ИЮКИИ ВД ВА я ПИТ В де уко ї, ше щи Ге адек г шу З Й що КРОКВ Оу ВО ма : ЕММ -- білок оболонки РООСЕКИ - рецептор до Фактора росту тромбоцитів й ТУЯ « топл-подібний рецептор 4
ФІГ. 1
14 най сонна ДОМ тт син Та ще Ь Бен ж яв ШИ ПИЛ 08 ще век я хх об г ОО о по І Й Ши Од Їд зд бд 9д тва баб - гапактоцереброзидаза ебЕР ». зелений фнуорасцентний білок ФІГ, 2
А. тех шосе же ро В: Само Ве ШОЕ щй В ше п Що ДІ й Щі Н з : . 0 ше н и в ек ш. В г и Не ри Шона у є ше син До ШОЕ - роя я ов В НЕ 1. вже ше Ф сірі ЕМУ ке зах ще жан , ЕН ЕМУ твердий Б «в розчинний Е і ї що Е шк що В К Й жк ро: ше ни НН о ж - ши: МИ щі жкоОчк ПВ ос ЩИТ " ші ШИ В в ШІ -е: 00 НН бо В : ша в СН 5 Бояриня - МИШІ 5 щ- й ст ЕМУ твердий й ЕМУ твердий в Не : З о : , жЕж Л зах рення ї хжк І | Ї й ПИ плани З . й Ф яв о с: ше Жоеж жо СЕ Ж зв. о :
КБ. : ПО рааіу й : ще а з: й Н шк Зх : ше НЯ з аскА зала сх Що ща Що о вУузасі БМЗАєЕМУ ра с ЕММ твердий Ф ними внгмл ними нм с сп ЕМУ ЕМ МО «оксид азоту МОЗ - індуцибельна синтаза оксиду азота ТМЕ - фактор некрозу пухлини
У
І. інтерпейкін СН - контроль
І. У ожже тю Ж ВЕ Фо о: В рея х ЯН - х ВЕ г то -- о т. «а ЕВ, и. т т в НМ «є ож ож ее. ши НЕ жо ою ОБСе Бе Бе ОБ СОбСе бе ов Сів о - тка ОАЄ ОРСв - клітини попередники олігодендроцитів
ОС. « опігодендроцити
ФІГ. 4 А ка
105. рт зо че ; я і
ФВ. п : я 59 Е ше о | Б по - по не Ше і. о ре Ей Тени С В Ба Е ! о ши шї Фо Я З В о. во и о у ев
З. в о. шх ши ши
520. о Що Ст ЕМУ СІ ЕМУ твердий твердий розчинний розчинний
ФІГ. 5
3 5 вх А й Мов - Ех Тк | рн. не В ТЕ | - Кк н- ФМ вйше 9 жя я 79 вн Го; сг: ЩІ Мо щі ши й ж о» зог ШИ жо ос Ж ї ов. Ж ов м ба ЩИХ во. ШЕ оса о2. ЩО баз. їі ее КАН на ораа ши щ йо я ше Я т а б пикккик ТММ Вик МУ 0 ЕМУ нагрітий ЕМУ інгібітор ЕМНУ інйбіор ТЕ з ве. шк т КЕ КЗ а. ВАК й І 141 з з Д су зах ЖК ! с Евро виш бр в Е - 10 ж т нн ши КВ ш і жи ши ше са й : | 20964 ще Ж Ж ж !
Ве . ше ; | і Н я Б БІ щи НН ЕМУ 00 янв ПНЯ «в МУ 0 МЕ УсКВОАВИ ІКАК 1 - кіназа, що асоційована з рецептором інтерплейкіниї 14 ВАВ - 46 діаміно-2-феніліндол МЕКВ « ядерний фактор енханево легкого ланцюга типу К активованих В-клітин
ФІГ. 6 ді жах До, рент : пек с ВО з й ЗМЗМ кла : Пн ОО і в ї о са ШИПИ СО ОККО ЕТ с о с зга МО по | о с і | - г У КЕ ше . У ОККО ЗОМ ий ЕМУ МАМУ ТеМАМЕЛНИ АВ о а ВКМ Го шу До: ГО хУчя Б бл І шення ро ин о ня ПОЛО УХА Ж М НКЮ В сих шин и и І М а п м а В ав ВА ЗАТ З ВМТ ЗК і; но песни ! ! : К як ве ся й е МИ яюх ї т у рение Е " їй пн ж ни рок КО ши А пише: а щини ес В 1. "НИ шк ви а нм з ва ЕМ я. ваше Б й Во яки МЕ щЩк ії ЩЕ й Ще . СЇМЧАМЕ «1 АМ нітровріїнічу метиловий ефір : З зт дім к САМАМЕ - ВАМ" нітроаргініну метиловий ефір ЗМАР - бЗ«нітрозо-М-ауетип- ОЇ «пеніципамін МТ - З-неропрозин
ФІГ. 7
Ж о н- ЖЖ ра ЗБ ся С ННЯ уж ! А жі --- щи ся, з і зба у не НИ Зк ке
ЕЕ . о ро ох шкі Ух кі о 2 Мен: НН | о. як Б НН я шо о І В ау ММК ЕНН як 1 Ох см МУ Вдома жи 0 ЕМУ 0 БАВАМЕЖЮУ СМАМЕЖМУ Ї, же оое М та ЕК емо ркр овен Р поваьоодесео преокооооюосюок он злі омани: Ман ння ші мив й ЕЕ ЖОВ ох З В... - ще ПА ПМ М Б : й я г ЕЕ : і ще «т му ВАНЯ НН п МВР - основний білок мієліну СіМРавзе - 3 -фосфодівстераза циклічних нуклеотидів ФІГ, 8 онко зони й х ше. . с с о о. о МОХ БІ о до " ри о буфер «ЕН я ЕК д ЗАС : ХХ 5. Еш ВІ - ш е « . . о ОХ С ОКОХ «Ен Т буфер
ФІГ. З щу овавовововавововавосовававвввввовюввавоввгввовослазавалавогавовог - с . «жк д о зх Фе й Ті. І. щі. Ж ОО ке ХУ ЗУ МНЕ В С, У ве ЕЕ щ в ЕЕ: що жи ш ш ш- ее и ЗЕ шк ши . і.
в І. ММ КО СК КЕ С ще МИ Буфер Епу-Т 50 200 чо ВА УОМРАСІ-А кОМБАСІ-В Те р міц «Ин ой ; К ЖК ОО СО ЖЕ ЗО КО ОК ККУ Ж ОО С | п . ОВ не її її ї її, та а І І І. Буфер ЗО АВ БО лБО ДРОВ НВ ОМБАСІ В5АЖОМВАСІ
ФІГ. 10 ш че ОО попів ЕКО ХМК КОМ ОК ги ш- шщ- щ Ки КО І о і КЕ я що о КК. шк шщ- шщщ що Е ОБ ВО КУ ОК ОК хх МОСК о. МКК о. Буфер Бпм-ї ч«ЗМивасї шчиИСя зим заОн одиничний
ФІГ. 11 щ Ж 90 сш. зе ж же Ж г: шк І. ЩІ Ж Її як ШЕ БО 5 щі шини шщ що. щ. т шшииии що Буфер Ептеї за Я 50 яп НА й В ваккнаакккмкиакнкикимий і заванааввннквннваананььькй ЗОМВАСТА ОМВАСТ-В Б -«ПООГОООРОВО ППО ООКН ОО О ТОНИ ВОК оошн -к - В КО ОО ж о З Е З ХАКІ оче К 55 МЕМ їх х ОЗ і " і В ОБО У ! Епе-ї «вив Буфер ЗНМ ООН
ФІГ. 12 т осо овес ов ооо осооооооооооовоодовововосвоі А (8 - - ) Що Гу я Ве В маку рт КК КУ ОК ши що. ше в 5 ШЕ. о в І. щ. .
п. ко і . я КАК ЕХ МОЯ Я В о о. в о Піннйвннн : ПВ ЕКО Буфер Ете Ше і "пу ОМБВАС . І БАС1-А аМвАСІ-В . у : щі шия Е тп м В та К - Б ЕВ «У З. ї ЗУ саше шо ШЕ
ВІ. щ Кк ! о. о о. о БО КО ЗО Б -е ще . і. Фо щ щ і. я ще щ . ОО о 5 БО ЩЕ п Ох Діснйнннння о. о. . чи ше я пер Бо о " м«т амвде 1-А чаМчЬАСЯ-В
ФІГ. 713 чу А чннноніюнцютіннюнісннютинть ще щ бе | о ; а У І о Ох о ще о. о о і-ї І 717 ста ЕпУ А в І вва нн нн оннннниорларварвавтсввавя ий «аМВАС р М що тик» тенту с
5. І. щ в о ЕС: о. о фо шо ії о о в ще щш о о о п о. ст Епу А в Їсаввааоваралав кола првввволаванвовавкоавоввлвног й чаМВАС1
ФІГ. 14 ці о НН день уоенввноея ее е ТЕ о г. ОКХ КО ВО ЕЕ ш но шк ЕЕ щт щ 5 ОМ МН ОККО АМОМ то ШЕ і о Же я У ОХ ОКККЯ ХО Бе | | І с о. КО Х ВО ПХКОККК СтТНі. ЕпУ А в Ко панврвоврвананинванавнннавняннвнняяй ЗМВАСІ чі «
г о. о МОУ ї- у о. ж о . Ф 5 З З ох 75 |. пет о. о щ Ю КО . БО З : о шщ ше. и ш ш Ж в і, ВО ТО р я МЕ ЗК КЕ КЕ: хх 5 хе ОВ МОЯ ВО ВО хе ОК о КОХ о. З що» ВОК ОКО ЗКУ КЕ - ств Епу А В Й ом мимио «анвАС1 5О
Н 5,6 реєст ето тет ТТГ ТКС КН КХ ТКА УААКА КАНА Н нене Н і ж іх хи и в ЗА і 8, 25 Ж ї Ме ся ; Ж ФО рення ж ск м вас КО ей зе жре А І с й а най А. Ж зві то дО хе М Гощі І Я. Є. в в ше ги К і Ж о п чд АЛАНА АААААНКААА НААНУ ААНААЖНАт калж кун кт кч ження і шо се тя є и он ев: В о ах а а й а й в в й й а в й дв 55155555 ! ч що ос с с Б с ос с сс єї і
ФІГ. 16 і З, 5 нн новні . і : : і ож | - і І 5 З п і і : ДЕ ах " х ов | ех Нр Я х ї Ії т-і ій В шк Й Ж ї ШЕ: | ай ій я ЩЕ их ; і | Ех ЩЕ Б Ки ой о зе 1 Ко Йо фено фор С 00оссюрк І: ї х : Сай В ИОХУ я т ж " во А ї ГЕ | й, ; зи МЕ и, рин уві Ж і 1 т ї Ка А С у А меасгедівддин в ї же "А : Н ОВ у у удтнжжляжжтлктаннчньчьк ню кН КАЧАН АЧАКЧАКАКААААНАНААНААААААААЧАЧАААЛАНА, х Н че го: ШЕ Р До В Шк В ов МИ о КО І ! мае ше и Ме Ве В ОВ Ве : Н в в в в о я а а а в й х : ке: сх вх «в аввя з за: З ка: а п я ї Е ФО ФО ШУ Фа шо У ! і с ско ук с с с 3
ФІГ. 17
З тн у що ИН Е х я Ж -авй КУ ж Є у і ПН НК кас ОВУ Аунняе 5) І і КУ й Я йо и шк ; 5 А ооо ОТ ; зай Я у ва 1 БТ о | З ОБ 02 рн ВИ ВВ ен 1 іо й ве ех Ах од 3 ; Е Таж ній ок й Ь й : се й: рез Шк ех й Ж 3 З м Ж : ДИ Ва ей ! Е- ТВ ння ре ов ки а с: п НН й заю іо фон Б 5 4 си і с і но ра вн нини е -х пен», Є зіопіовфенння в Ше нн : ! шк у 5 ї а я жна нн нн ! і - щодо чношонмною ши ДЕ ле в НН в й й ва й й й й й й й й й в ; 55551155 ' че «й с й с я я що о . і З ВН А А
ФІГ. 18
: ЖЕД пр У КТ! т І! і Ва иа я пе с п КК т А Е ї а | нн м ше сивини -- Б ! ! «У є І їж 7 т . сен ї
Х. А рення т зд іо Знай кн пи і і дя и ОН що ще ; Н 5 хо Шея І К 4 ін'єкція Н ав жк Н аа І ши дез у ЕВ ер і о ; ж Шин ; ши І У аа пня -нж- й ін'єкції ! «ЗДО В. пбннннетнннттооооооосттетвогосеьчттеекттт тестового. Н День? дн дк? дню дев зва й нон нн пн пен нн нн нн нн нн ща я нн нн нн нн -ь- в ! 5 і І з ав прєнікнюентететегстеенссіанноундеоновесюнсю ості нн іжснснснтістіннт ке ! до Н ше яенідння і В и тн, 4 Б. Ж аа пня вин Кн ; СТ нн : к Н же й ще як жа й і їх | х ; си й шк зак Я - Н 5 5 хз дян В : ень ЩЕ а. - во Ж : КЗ я од у : БУ ща Тр У тео есте ттенннх ве в в до де ди дев дев
! і ! і ! і те | --ер- В іме і У Кс кмин нин нини у Ж | То -- Б ! й за й ща й кпділкетннннй і Ж зай пн х. Є десни Дод Ж г ре Шк і ; Н кни нн НН Й і : -- Ж ПОП о ДУ дк Де: дея Днев ! -нн А 7 Я ! 5 же нн ОЕ | -- в Ж і ж : Ж ! Ж т джнанвнкатачннй до Ге ДОВ рн не дренфнннннння ше тей В» Ссннннння ее : і 5 | їх я. пр г я ; мч ри Ки ' і Я пен НН НН кДж нй і : я і т Ж маси тт Же З : й Е ш- Е «В нн т в в о и а Де? дя дя дя дев
ФІГ. 19 (продовж)
Е І 8 чі І Бо
КЗ . ! ж ; В р ре ве ес ВИН: бен м ШЕ ШИ я ін'єкців і С) І ок МТ з воеке У «я зу же є й ШЕ СХ Ве нн шин ех вн і І Ку он нн п ння ж я ін екції Н КН ; Кук о жан в. Е і й Н і до? дб 00 Ддеїз де Дав ІЗ с В : й лика АААААААААЛА Я АК АКА НААН ААААААК АН АХ АК АКА АК як ж ААААААА нат нти ААЖАЖНН жен яки пАжАтя І ; - -- А ХЕ Х й, й - УМ ня дру о 200 Т сш-ек ї- хи Я ле ККУ У КК КК Кт КТ А УК КК куки нич ся фунт ї ї ж -- 5 р ї па - нн я І ї е В рана зд і лиш, ШЕ ЕББсввння ск ШЕ ш. з й омани ке ай й тож яки ї РОМ пре Вт т тт т тт ото В ; ГУ ех Ї І : дае: нин нан о о сни ефе ї . ЖЕ . - За веж а но а жна а а а и: Д-ї дб дез дев дев
ФІГ. 20
5, ГІ нн нн нн ехжжюяннн, пеня А : ЗОВ бе ут тв мне нене рт : В ; в: ше в он | о ваш ЕХ х : Ел а в ях ний Є ' я й зов же кр є І : ї -І8й пря МОН: НК нин 15Б М ! т Т - т «5 й нн чо мнаннннн пеня Моя нина -
Е. -200 п бони о М с нан "З і У ! те | м ок Ж. -й5 а і пен нн нн нн нн нн й І ' ! Де дяка Дя12 дяВ дев І І он спи ЧИ - ЖД ДЕ пряна ннванноеоооо посипкою» г ів у поп шин ! і ЖК рення км аиний ми мине фериту Вк о ЗИ Крут і в | ш- о ЩЕ. тре я й о-- В ше о, Ен МК КІ з - " т р а сю Ж і та в в дет дов дяг одне дв ФІГ, 20 (продовж.)
Е зав Інн Не пи нн зад фронтони шфрннннння ВД ри ДЕ нн 8 іа. га у «В нн си Й ї й Ж х 5 рН: ; щ ве Е и ДИ к кі . : о -во шини ше пн нн пон «ШЕ. 4 ін'єкція вд. Я ї ; в ай ши рот рт тт Фо плетиво ктючннос : й -5.й пфреоннюнсеноснсстенеснсссно дек У скосу рртююттино шин ке нн Н і ж ям жі Шах Ст 2 я а їзаї у Н у ; ДЯ 0 ДдаВ дна дО одне Е ш З
І
З. прннннтютюттютютюттютотенттттттстстотнесвтососссетнюснні нення ення В ї 15» У ння у рон Е хх і КИ «7 й СУ ве їх що щих за й неси ії Б ща Шини "МИ ЗМИВ: ей ИИНННин і / в - яка бунту хх КУ вис шНе ши ще ни гени пн не М шк МЕ Е ї ш ск а - виш не 2) дллудлуух плахту. Її і не з їх мен чн ие панни нн сен ї -М й оборони що с дуфнювасоя ех пов о дл? дея дей о дане дев
ФІГ. 21
Б грунти нн нути ж І : 8 І фржкетиеньнння в шк і -- ! ! е ща нен моє и Е і Кк во Пи ша есе ШЕ ЖЕ ще А: псоостт сон НЯ ! в -5а -й я пен ня ве кине. Як г ! «й ОН ОК НН нні і є о т х т Я ; ОХ ля п дерен трі -- Ж -па в преннтня : Сон нини ЛИЙ ! «5 ПОМ ОККО НН ' Д-т дев дя? 0 див нин нн нс нс сн ! Й , й й за нив но вн нн інн і : у! З Де Шк нн нн ння -а-. А Е Б НО Шк нині шин шишшни З | шк їо і де. ії Не сис Сон нн но ані : Я -к нн пи но зн нн нах, и кю я і І о І й І ; щи й Ді ГадОфОбф ее дню пен жи нин и МИ ре Ба пня Авт ши ку і ві. зай ен У хо ЗОНИ НН :
-35.8 панна а а а нн а а а а а а ! 000000 Де де дю дев і
ФІГ. 21 (продовж.)
ї й : і й о ХА оч КК АН тА чну. і ще І ж З пиши я в З ли я я ля нія КУ я я Кия я я я янь й отак тчкиитичьчьчи : їх і: їх і і ж ж 25 13 ї жо х нн нн анна 2 Е ж в й п о о ЖЯ ї Продаж но в В кни сте лиже о 0,5 ин вах лай ї о оо ще Я ЩЕ Е; 1 ! ве вч о юк Ї Ф 9» Ж ж в Е ї ї ї 2 й . 3 ! ад о ой живи
К й. Е; 2 ху х і ч щ чо й що ої Е В Пеня жів я ЖК ЖК Ки и я ин ЖК ЖК ОК КК КК лем ян Он Ж МКК КАК Ж нт нти КК ЖЖ кн ни мя вк ЖЖ Ко ЖЖ н чими
ФІГ. 22 І ж 35 пантоннетнтоннтстсстстсенотсснтовснсн ! поко я о в А У Е | а 1,5 пні й ОН ЕД знкннжених ТЗ Е Ф І і і Й д : й й шк ж сш а у і шко сш. ко у айв: і о ОА нан оно зефір ї . іх В: ША, ж я ! з а щ од а 8 й М Ж ся Ж Ж ке і а Фо в 5 5 до о: ШИ ис
ФІГ. 23 повин нин До рентна нення Е і ' нн ! ше Ж ДУ Кеннет пндонннлнонх понти нон дано чк кн упопнн нь кнннкчнснн і о. і ах ; А: я Е уч і у пи сссоосфдрннсоє і п | ЩЕ тік Ж ХЕ 15 шин ех иа "ши ЕК ! Ра ЦІ тещі ЖІ В 1 рення фени ни сани і й | ша Н у -нн З : З Як Б нм ше до У і Е - Фю юю сю ше ви: ВЛ ВО Не о» й ав ва а ва вда й й Е ж в КЕ як | ! ТИЖ осдвдя і і ї 1350 тр Н щі : С есе , ж з тля й
(8. ОЩОЮ. дет рен А ! Ка ; ї ж Ж Я РА у ї як т й і Я нн ої ЕК ЗАД, зроннннянннннннтннннннннннннннннння я. - Шк ся у жейдне (З Еш пе. В Я Е- КЗ | с: ї« ші Кит скіфех ; с Е й і я Б. Ко в ї НИ ще ; З 1 і С; з і З ї роза: де 7 пе Г п р знищення ; Б Н ве ЗБ Яни тя ж одоппдд чн дня доня он пн донна Н и и о КС Ле ВН
ФІГ. 25
Е | ! і ще : Ї Її ЕЕ дае Н Н і їі Ж ї З га : ще и Н х. ї о Я : фосж Н А Кк рн Н ї м с; ШУ Е с Я. й ще Н їв : : і Р о ще і Б мов нн М ЕН В | ши а хв Н -. зак й же вк Ж й : і Е Н тя А ай с; чеку со НІ А : а Е Б я І ше до Дон зерен Є : 8 | ч- ге г ІЗ ха ки кас я Бе шк ЗЕ р їв рт его 015 0910959 055 057 0295 035 035 !
ФІГ. 26 ма ее Бе що она ж т в Її х я З | й Шеея рен К под і КИ: А - ! І я - З Що зю і - і ЩЕ її, сан В Х еу еннй їй и «аж Ї. ч з Ж й а ї т ще Я М г і , ум 5 суд , пе ; Ї че М Х панни р з | У г х Ка чаафрко е й а ле Ж «й і ЕВ МІ " : керу а 5 ша о нн и: М ї НАНЕ- у ви Ди 0. й с. же ; ; Ку А зле кір х І ан ні дит. : в ї оо п пз віх ах геї ов РЕ ОЗ 02 35 вав
ФІГ. 27 нн В і У І Я Н шк я" жу А ВоОо-- ій х ; : ї ЧЕООДДДф ння й миши нини шини ж яння ! ! ХЕ і я Ууї і Ж і ї КЗ ж ник Н й ча ни сн ан с и Е р с р ок Ше І ї 3 і в в тт ї ! ва. ввів ой нн я БНО Н «с ІЗ ше ла й Код ек ой Пт тку ння -х Н Ї ж Ху х ух є де і ! ме Кк не с І ; є а, ГЕ - нн нм Ж Ї ще, : і ї , Е ї ЛЯ Де Ддяії лів пн ї ' і і Е і ха нн нн нні нн нн І З не А і ! ) І Е Вс нн нн нн нн нн Н че ї а ШЕ «ре І б і й ж і ! -- 18. Мр ян С осетер тннчк А Я оре ос ово фін чих Мена саван Б і ! Ж ! а «кт дах Хлжжки я щ с й з Ж С рентних сжснсненс су скккененення пк нн с, ВИ Е ія і ж : Ко Шев й й Е ' З і ях ше я ра ах т д ; Фо во ни хе ! НЕ ї Ше Н ! : і 5 нн а Е - ї д і : «ее КО І ж. ї Орфея ет ее етики усно стеетечн ие екк етики о стек есе етекнк ет еесснснчнютсснксетн і - ; 4» я ! лл лев дя ля і Кокюотієєтнтннякетітет стежите ж жнисюттютнннкнятт тя кждяттт яння дяляяетя ятки кла пн тАЛААААААА АЛ А АААА Аа ААЛА Аля АААААААТКА я КАХ ААА А А КААААЛАЛ АЛЛА план ФІГ, 28 нот 288 нн нн он нн нн А ШИ не ш | о є се янв, ї ВоООо ши мини нн ний Фе ння б : ше р і : ле В г п нн еВ нн В Ж х | ще тя нн ж. 8 ' ДА де де Дяків
ФІГ. 28 (продовж.)
і не ДО. дует од р ротик ; Ї Й . шк ч ряд шо я Може ! Е їай ни нин М Б НИ А 7 й са : й і Н Ж ва ! г дет дев дей ДЗ ! 5 15.2 Конні Інні нн А ШК, | і т рони М Км ї ГЕ ши зн чий ! шт и ен В ! У | Ши ей й Н Е -к.а пн ги нн ан НУ ро . дл дея дн Детв В | ЩО. дення меш ш-внн А ! Ж й : ве Петр щ- 5 «В «ренні КК дання наклад АА НААН КАК У Н шк Н дло дев де? Де !
ФІГ. 29
Ше нення ; б ав ! ! х 5 КЗ 7 ле ле пуужь суку КАК У КУ КАК МЮУ КАЛА АКА ЗАААААХВУ УК ААХАЖАТАННЯ з в Де ЗШ п ех м і і Б ЕН ин и м Й щ Я т В ! ЕК і ЗК Майк ЗНАКИ і ро а і ни : пи а я ї пожиешинн МИНННнй М зн , Н. я і ні у фан жен п Н -Х.а ре тт унне не ом І Ява я . й ! де дн де Ддяо дпниякннннннн АННА НК КАК АКНЕ КАК АКА АННА НК АННА чнКкнннннннй - мА шана аа и кн 7 цей і ї . Ї пнннндрня ЩІ а, в Ж 1 "ї й М леккек ій В | у: дити Се ЛІВ --ж- Д й ' ж: шо ва ЧА
: . Н ож соки и к. : ще зу и ую ук ча чя вч ють квт тж'ятьчв ють фе лев ть тт в вв жтвтю в втьтьтюю мм втавтьтітютютютюжеььни :Фф ОД ек о ПНО МВ і в ! оофуснкттттия ех й пснсесннннойУ Ж є ї Ж да / ду дев дае дя ! - А ше: нн Ся : і і - зва у сення В ї Ж вдос В ще 7 т гі
В. є Н і а а Шк 7 й Ж І Ба пли сх ШИ з феннінненннтунт р о ПН нн іонні ї 8 й пе : М ше о і ж Же Ку ! -3.В фунт дененитя СК снення ення Е -Д К. Й плн вен и а : д-? де Дн: дет ФІГ, 30 фр оадеоі театром ТКАНІ Т РТВ ТК НКР КК ЖЖ ЖК ЖАРТ Ж КЛ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ КК РТ Ж ЖЖ клі тотожною дно» ВуВО, пр ЯК Мо нин о ОО ВК Н Й ай ра аю й ! їй у в я і: 1,50 при і А нано, ни сш пен ши се Ж я й
ОБО. нн Ко ТК оон тин 0ОЮю їх ще Кя в т З їз із «нні ще. тон, сені най: нан юЮ її З 18 Ще Щек. 5 ла Ї пннннннннонссктюстссстиссосочтоетсочгсттхстеетснтікочтнктіоетінесстооюттетсттутксттетктктксететектеттктетотмесетесттстеткетестотвитоокттеттснтенн
UAA201504292A 2012-10-02 2013-01-10 Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки herv-w UA119032C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261708779P 2012-10-02 2012-10-02
US201261746792P 2012-12-28 2012-12-28
PCT/EP2013/070452 WO2014053489A1 (en) 2012-10-02 2013-10-01 Compounds for treating the remyelination blockade in diseases associated with the expression of herv-w envelope protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119032C2 true UA119032C2 (uk) 2019-04-25

Family

ID=49274655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201504292A UA119032C2 (uk) 2012-10-02 2013-01-10 Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки herv-w

Country Status (31)

Country Link
US (2) US9840550B2 (uk)
EP (2) EP3447070B9 (uk)
JP (2) JP6379331B2 (uk)
KR (1) KR102098033B1 (uk)
CN (2) CN105709224B (uk)
AU (2) AU2013326552B2 (uk)
BR (1) BR112015007150A8 (uk)
CA (1) CA2882781C (uk)
CY (2) CY1121237T1 (uk)
DK (2) DK2904009T3 (uk)
EA (2) EA028245B1 (uk)
EC (1) ECSP15014925A (uk)
ES (2) ES2710748T3 (uk)
HR (2) HRP20190274T1 (uk)
HU (2) HUE054051T2 (uk)
IL (3) IL237474A0 (uk)
IN (1) IN2015DN02397A (uk)
LT (2) LT3447070T (uk)
MX (2) MX385003B (uk)
MY (1) MY172209A (uk)
PL (2) PL2904009T3 (uk)
PT (2) PT3447070T (uk)
RS (2) RS58320B1 (uk)
RU (1) RU2636355C2 (uk)
SA (1) SA515360207B1 (uk)
SG (1) SG11201501274VA (uk)
SI (2) SI2904009T1 (uk)
SM (1) SMT201900087T1 (uk)
UA (1) UA119032C2 (uk)
WO (1) WO2014053489A1 (uk)
ZA (1) ZA201501491B (uk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2949342A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-02 Geneuro SA Antiretroviral drug targeting human endogenous retrovirus
EP3351265A1 (en) * 2017-01-20 2018-07-25 Geneuro SA Anti-herv-k envelope antibody and uses thereof
WO2018159787A1 (ja) 2017-03-01 2018-09-07 国立大学法人北海道大学 疾患モデル非ヒト動物の製造方法、疾患モデル非ヒト動物、該動物を用いた薬剤のスクリーニング方法及び疾患リスク判定方法
WO2020045683A1 (ja) * 2018-09-01 2020-03-05 国立大学法人北海道大学 ストレス負荷が関与する疾患を予防及び／又は治療するための医薬
EP4025303A1 (en) * 2019-09-04 2022-07-13 Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE) Herv inhibitors for use in treating tauopathies

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2753098B1 (fr) * 1996-09-06 1998-11-27 Sod Conseils Rech Applic Composition pharmaceutique comprenant au moins un inhibiteur de no synthase et au moins un piegeur des formes reactives de l'oxygene
EP1265989A2 (en) * 2000-03-21 2002-12-18 MS Research A/S An infective endogenous retrovirus in association with demyelinating diseases e.g. multiple sclerosis
RU2420537C2 (ru) * 2001-01-17 2011-06-10 Трабьон Фармасьютикалз Инк. Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин
FR2865403B1 (fr) * 2004-01-23 2009-06-12 Biomerieux Sa Composition pour le traitement d'une pathologie associee a la msrv/herv-w
US20090233888A1 (en) * 2005-03-23 2009-09-17 Usc Stevens, University Of Southern California Treatment of disease conditions through modulation of hydrogen sulfide produced by small intestinal bacterial overgrowth
US8410115B2 (en) * 2006-02-28 2013-04-02 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases with alpha-4 inhibitory compounds
ES2599227T3 (es) * 2007-02-08 2017-01-31 Biogen Ma Inc. Neuroprotección en enfermedades desmielinizantes
WO2009062926A1 (en) * 2007-11-12 2009-05-22 Ares Trading S.A. Taci-immunoglobulin fusion proteins for treatment of relapsing multiple sclerosis
PL3211005T3 (pl) * 2008-07-08 2021-11-29 Geneuro Sa Terapeutyczne zastosowanie specyficznego liganda w chorobach związanych z MSRV
WO2010045265A1 (en) * 2008-10-13 2010-04-22 Biovista, Inc. Compositions and methods for treating multiple sclerosis
WO2010148323A2 (en) * 2009-06-18 2010-12-23 Whittemore Peterson Institute For Neuro-Immune Disease Diagnosis and treatment of diseases or disorders associated with xenotropic murine leukemia virus
EP2982371A1 (en) * 2010-02-12 2016-02-10 Biogen MA Inc. Dimethyl fumarate with glatiramer acetate or interferon-beta for treating multiple sclerosis

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201501274VA (en) 2015-05-28
EP2904009A1 (en) 2015-08-12
PL2904009T3 (pl) 2019-06-28
LT2904009T (lt) 2019-03-12
MX2015003572A (es) 2015-08-20
MY172209A (en) 2019-11-15
AU2018217328B2 (en) 2019-09-19
EA201590678A1 (ru) 2015-07-30
PL3447070T3 (pl) 2021-09-06
PT3447070T (pt) 2021-05-19
IL264382A (en) 2019-02-28
IL264382B (en) 2020-05-31
JP2018065814A (ja) 2018-04-26
CN105709224A (zh) 2016-06-29
RU2015116149A (ru) 2016-11-27
AU2018217328A1 (en) 2018-09-06
RS58320B1 (sr) 2019-03-29
KR20150064147A (ko) 2015-06-10
DK3447070T3 (da) 2021-05-10
JP2016500651A (ja) 2016-01-14
EA037253B1 (ru) 2021-02-26
MX366846B (es) 2019-07-26
IL274047A (en) 2020-06-30
SMT201900087T1 (it) 2019-02-28
JP6538138B2 (ja) 2019-07-03
RS61794B1 (sr) 2021-06-30
HRP20190274T1 (hr) 2019-04-05
BR112015007150A2 (pt) 2017-07-04
JP6379331B2 (ja) 2018-08-29
EP2904009B1 (en) 2018-11-21
LT3447070T (lt) 2021-06-10
DK2904009T3 (en) 2019-03-11
CY1121237T1 (el) 2020-05-29
ES2710748T3 (es) 2019-04-26
CA2882781C (en) 2021-06-15
US9840550B2 (en) 2017-12-12
HUE043419T2 (hu) 2019-08-28
IN2015DN02397A (uk) 2015-09-04
CN104684927A (zh) 2015-06-03
EA201791525A2 (ru) 2018-07-31
CY1124378T1 (el) 2022-07-22
HK1221399A1 (zh) 2017-06-02
EA028245B1 (ru) 2017-10-31
WO2014053489A1 (en) 2014-04-10
EP3447070A1 (en) 2019-02-27
AU2013326552A1 (en) 2015-03-05
HUE054051T2 (hu) 2021-08-30
EP3447070B1 (en) 2021-02-24
US20150218256A1 (en) 2015-08-06
IL274047B (en) 2020-11-30
CN104684927B (zh) 2018-06-19
SA515360207B1 (ar) 2018-09-18
IL237474A0 (en) 2015-04-30
HRP20210779T1 (hr) 2021-09-17
PT2904009T (pt) 2019-02-19
ES2878248T3 (es) 2021-11-18
ZA201501491B (en) 2016-01-27
MX2019008916A (es) 2019-11-11
KR102098033B1 (ko) 2020-04-08
MX385003B (es) 2025-03-14
EA201791525A3 (ru) 2018-12-28
ECSP15014925A (es) 2017-07-31
SI3447070T1 (sl) 2021-08-31
RU2636355C2 (ru) 2017-11-22
US10752675B2 (en) 2020-08-25
AU2013326552B2 (en) 2018-05-24
BR112015007150A8 (pt) 2018-02-06
US20180066040A1 (en) 2018-03-08
CA2882781A1 (en) 2014-04-10
SI2904009T1 (sl) 2019-04-30
CN105709224B (zh) 2020-06-05
EP3447070B9 (en) 2021-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20080114070A1 (en) Compositions and methods for restoring sensitivity of tumor cells to antitumor therapy and inducing apoptosis
UA119032C2 (uk) Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов&#39;язані з експресією білка оболонки herv-w
US8748406B2 (en) Preventive for adhesion following abdominal surgery
JP6306768B2 (ja) 疼痛抑制物質のスクリーニング方法および疼痛の予防または治療用医薬組成物
UA126558C2 (uk) Ліганд анти-msrv/herv-w env для профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу
KR20190040585A (ko) Human Stm1 (hStm1) 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20240124222A (ko) 조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도