RS58320B1 - Jedinjenja za lečenje blokade remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom herv-w proteina omotača - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ova prijava odnosi se na inovativna jedinjenja i kombinacije za sprečavanje i/ili lečenje novog otkrivenog štetnog mehanizma, koji blokira endogeni mijelinski kapacitet oporavka nervnog sistema (NS) odrasle osobe kod bolesti povezane sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste.

[0002] Ovaj novi terapeutski pristup kombinuje inhibiciju ushodni patogeni efekat Env na ćelije prekursore oligodendrocita (OPC) zajedno sa inhibicijom krajnjim nishodnim efektorima Env patogenosti na OPC diferencijaciju (NO radikali), za koje se pokazalo da blokiraju remijelinizaciju HERV-W povezanih bolesti koje utičua na nervni sistem.

[0003] Ovaj pronalazak odnosi se na terapeutske kombinacije koje obuhvataju (i) najmanje jedan anti-HERV-W Env ligand i/ili (ii) najmanje jedan lek sa inhibitornim efektom na slobodni azotmonoksidni radikal (NO) za njihovu upotrebu za prevenciju i/ili lečenje blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste.

[0004] Kombinacija kada kombinuje i ligand i lek(ove) sa inhibitornim efektom na NO cilja ushodni Env induktor kao i nishodne NO efektore u ovom novo dešifrovanom procesu koji izaziva blokadu remijelinizacije u NS lezijama.

[0005] Štaviše, sinergističko dejstvo dve vrste jedinjenja (koje ciljaju Env i NO, respektivno) poboljšava rapidity i efikasnost terapije kod pacijenata sa lezijama bez remijelinizacije indukovane aktivacijom HERV-W (naročito kada je povezan sa MSRV podvrstom, izolovanom kao čestice viriona iz MS ćelija<1>) i ekspresijom njegovog Env proteina u nervnom sistemu.

[0006] Dokument WO2010/003977A1 opisuje lečenje MSRV-povezanih bolesti upotrebom GNbAC1 antitela usmerenog protiv MSRV-Env proteina. Dokument US2008/038279A1 opisuje upotrebu anti-MSRV/HERV-W Env antitela ili anti-TLR4 antitela za lečenje MS i šizofrenije.

[0007] Dokument WO2011/100589 opisuje kombinaciju DMF ili ostalih derivata fumarne kiseline i glatiramer acetata ili IFN-beta za lečenje multiple skleroze, hronične inflamatorne demijelinizacione polineuropatije (CIDP) i progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML).

Detaljan opis pronalaska

Ovaj pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima.

[0008] Prema prvom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na anti-HERV-W Env ligand za njegovu upotrebu za prevenciju i/ili lečenje blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste.

[0009] U ovom pronalasku, izrazi "blokada diferencijacije", "blokada remijelinizacije" ili "blokiranje remijelinizacije" koriste se za rezimiranje novo otkrivenog fenomena kojeg čini (i) inhibicija diferencijacije ćelija prekursora oligodendrocita (OPC) indukovane HERV-W proteinom omotača (naročito iz MSRV podvrste), (ii) rezultujuća proizvodnja NO iz OPC i (iii) rezultujuća inhibicija proizvodnje mijelina od strane OPC, kao što je opisano u primeru 1.

[0010] Bolesti povezane sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste, definisane su ako HERV-W povezane bolesti koje deluju na nervni sistem i određenije, ali na neograničavajući način: multipla skleroza (MS), određenije relapsno remitentni oblik multiple skleroze (RRMS), progresivna multipla skleroza kao što je sekundarna progresivna multipla skleroza (SPMS) ili primarna progresivna multipla skleroza (PPMS), hronična inflamatorna demijelinizaciona polineuropatija (CIDP<2>), psihoze kao što je šizofrenija i bipolarni poremećaj<6>, u kojima je takođe opisano oštećenje mijelina<3-5>.

[0011] Klasično, lezije multiple skleroze (MS) pripisuju se imunološki posredovanom gubitku oligodendrocita i mijelinskih ovojnica sa oštećenjem aksona. Efekti na imunske ćelije koji su posredovani proteinom omotača (Env) retrovirusa povezanog sa multipla sklerozom (MSRV) iz HERV-W familije endogenih retrovirusa u vezi sa inflamatornim lezijama nervnog sistema (NS) su opisani<7>. Međutim, direktna patogenost MSRV-Env na glijalne ćelije koja uključuje blokadu remijelinizacije MS plakova ćelijama prekursora oligodendrocita (OPC) bila je prethodno nepoznata i nikada nije bila prikazana.

[0012] Prema jednom aspektu ovog pronalaska, inhibicija ushodno patogenih efekata Env na ćelije prekursora oligodendrocita (OPC) vrši se upotrebom anti-HERV-W Env liganda. Anti-HERV-W Env ligand ovog pronalaska definisan je svojom sposobnošću da se veže za Env protein.

[0013] Pojam "veže" ili "vezivanje" liganda znači najmanje trenutnu interakciju ili vezu sa ili za ciljni antigen, npr. ENV, koji obuhvata njegove fragmente koji sadrže neki epitop.

[0014] Prema ovom pronalasku, HERV-W ENV znači protein kodiran env genom bilo kog člana HERV-W familije, uključujući MSRV podgrupu kao što je definisano iz sekvenci identifikovanih u RNK retrovirusnih čestica iz MS<14, 23>.

[0015] Ligand ovog pronalaska je neko antitelo, pri čemu pomenuto antitelo može biti poliklonalno, monoklonalno, oligoklonalno, himerizovano, modifikovano ili humanizovano ili humano antitelo. U određenom postupku ovog pronalaska, antitelo koje obuhvata ligand je humanizovan ili human IgG, a određenije IgG1 ili IgG4.

[0016] Određenije, ligand ovog pronalaska obuhvata svaki od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5 i SEQ ID No.6.

[0017] Gore pomenuti ligand obuhvata najmanje jedan i više poželjno svaki od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) kodiranih sa SEQ ID No.25, SEQ ID No.26, SEQ ID No.27, SEQ ID No.28, SEQ ID No.29, SEQ ID No.30.

[0018] Kao što je navedeno gore, blokada remijelinizacije takođe rezultuje proizvodnjom NO iz OPC. Onda prema daljem aspektu, ovaj pronalazak takođe se odnosi na lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal za njihovu upotrebu za prevenciju i/ili lečenje blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste.

[0019] Bolesti povezane sa ekspresijom HERVW ENV su one koje su definisane gore.

[0020] U određenijem aspektu ovog pronalaska, lek sa inhibitornim efektom na slobodni azotmonoksidni radikal (NO), lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal ili lek sa inhibitornim efektom na NO je neki lek koji može da inhibira biološke efekte NO molekula, koji se takođe nazivaju NO radikali. Lekovi sa inhibitornim efektom na NO odabrani su od N<g>-nitro-L-argininmetilestra (L-NAME), S-metil-izotiouree (SMT), ili dimetil fumarata (DMF).

[0021] Ovaj pronalazak odnosi se na farmaceutsku kombinaciju koja kombinuje najmanje neki anti-MSRV/HERV-W Env ligand kao što je definisan gore i najmanje jedan lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal kao što je definisan gore. Ova kombinacija koristi se prevenciju i/ili lečenje blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste, pri čemu su bolesti one koje su definisane gore.

[0022] Farmaceutski proizvod koji sadrži anti-HERV-W Env ligand kao što je definisan gore; i lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal kao što je definisan gore smatra se kao kombinovani proizvod za istovremeno, odvojeno ili raspoređeno tokom vremena davanje za prevenciju i/ili lečenje blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste.

[0023] Prema rezultatima opisnim dole na mišje modele eksperimentalnog alergijskog encefalomijelitisa (EAE) indukovanog sa Env, sinergistički efekat kombinacije anti-MSRV/HERV-W Env liganda sa najmanje jednim od ovih NO-inhibirajućih molekula je prikazan, u poređenju sa bilo kojim od ovih terapeutskih agenasa kada se daju sami. Čak i kada se daju sami, lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal ili anti-MSRV/HERV-W Env ligand pokazuju terapeutsku efikasnost sa oporavkom kliničkog deficita poznatog da je povezan sa mijelinskim lezijama u EAE<8>. Pored toga, poređenje između (i) leka sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal ili anti-MSRV/HERV-W Env liganda i (ii) kombinacije najmanje jednog leka sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal i najmanje jednog anti-MSRV/HERV-W Env liganda dokazuje veliku prednost upotrebe ove kombinacije u toku lečenja.

[0024] Tako, odsustvo inflamatornih infiltrata i/ili lezija sa inflamatornom aktivnošću (npr. neaktivni plakovi MS) ne sprečava lečenje blokade remijelinizacije indukovane Env kod zaraženih pacijenata. Ovo je od naročitog značaja kod pacijenata sa progresivnom MS (primarni ili sekundarni progresivni oblici) za koju je poznato da ima brojne lezije bez inflamatorne aktivnosti, koji više ne pokazuju pojačanje signala magnetne resonantne tomografije gadolinijumom kod većine lezija mozga i kičmene moždine.

[0025] Ovaj pronalazak takođe opisuje postupak za prevenciju i/ili lečenje blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste, koji obuhvata davanje najmanje jednog anti-MSRV/HERV-W Env liganda čoveku.

[0026] U određenom aspektu, postupak dalje obuhvata davanje najmanje jednog leka sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal.

[0027] U drugom aspektu, ovaj pronalazak opisuje postupak za prevenciju i/ili lečenje blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezanih sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste, koji obuhvata davanje najmanje jednog leka sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal čoveku.

Opis slika

[0028]

FIG.1. Detekcija ekspresije Env proteina i TLR4 receptora u MS tkivu. (A,B) Anti-Env imunohistohemijski otkriven Env protein (strelice) u NAWM blizu hronične aktivne lezije (B) ali ne u beloj materiji zdravog mozga (A). (C) Olig2-pozitivne OPC u neposrednoj blizini Envpozitivnih mikroglijalnih ćelija na obodu hronične aktivne lezije. (D-D"') Zdravo kontrolno tkivo mozga sa PDGFRα-pozitivnim OPC koji se karakterišu ko-ekspresijom TLR4 (strelice). (E-E"') OPC u NAWM blizu aktivne lezije MS pacijenta, koje eksprimiraju i TLR4 i PDGFRα (strelice). Stubići skale: 50 µm.

FIG.2. Regulacija TLR4 ekspresije tokom OPC diferencijacije. (A) Kvantitativni RT-PCR koji prikazuje progresivnu nishodnu regulaciju TLR4 ekspresije tokom spontane OPC diferencijacije kod pacova u kulturi tokom perioda od devet dana. GAPDH ekspresija korišćena je kao referentni gen. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /- standardna devijacija dobijeni iz 3 nezavisna eksperimenta. t-test (***P < 0,001). (B,B') Anti-TLR4 imunobojenje pokazali su da su nakon supresije TLR4 posredovane malom ukosničastom RNK (shRNA), transfektovane OPC bile lišene TLR4 ekspresije (strelica) koja osigurava specifičnost antitela. Prikazane OPC fiksirane su tri dana nakon transfekcije i transfektovane ćelije označene su ekspresijom eGFP. Treba napomenuti da su susedne netransfektovane ćelije bile TLR4 pozitivne. (C-D') Reprezentativni primeri galaktocerebrozid (GalC)/TLR4 dvostruko-pozitivnih OPC nakon tri dana (C,C') i mijelinski bazni protein (MBP)/TLR4 dvostruko-pozitivnih OPC nakon šest dana (D,D') spontane diferencijacije u kulturi. Glave strelica u (D) tački na više diferenciranim OPC koje se karakterišu samo smanjenim nivoima TLR4 ekspresije tako reflektujući podatke ekspresije gena prikazane u (A). Strelice ukazuju na jače eksprimirajuće manje zrele ćelije.

FIG.3. Proinflamatorni efekti rekombinantnog Env na kultivisane OPC pacova. (A, B, C) Stimulacija OPC rekombinantnim Env u rastvoru (A, Env rastvorljiv), površinski vezan rekombinantni Env (B; Env čvrst) i membranski vezan Env (C) eksprimiran na pV14Envtransfektovanim U343 ćelijama glioblastoma (D-D') , svi su doveli do snažne indukcije iNOS ekspresije nakon osam sati stimulacije u poređenju sa respektivnim puferskim kontrolama ili sa OPC koje su rasle u prisustvu pV14ctrl-transfektovanih U343 ćelija glioblastoma (E-E'). U preparatu rekombinantnog Env nivoi endotoksina bili su <5 EU/mL kako je izmereno LAL testom. (D-E') anti-Env imunobojenja pV14Env i pV14ctrl transfektovanih U343 ćelija otkrilo je Env površinsku ekspresiju. (F-G') Oligodendroglijalna morfologija kako je procenjena sa 04 imunobojenja ostaje nepromenjena nakon stimulacije sa površinski vezanim rekombinantnim Env što se pokazalo nakon jednog dana (F,F') kao i nakon pet dana (G,G') u kulturi. (H) Indirektna spektrometrijska analiza supernatanata ćelijske kulture koja meri proizvod NO razgradnje nitrita otkrila je značajno povećanje dozno zavisnih nivoa NO u OPC uzorcima stimulisanim rastvorljivim rekombinantnim Env za 24h. (I-K) Proinflamatorni citokini kao što je TNFα, IL-1β i IL-6 podvrgnuti su ushodnoj regulaciji nakon stimulacije sa površinski vezanim rekombinantnim Env. GAPDH korišćena je kao referentni gen. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /-standardna devijacija i predstavljaju 1 od 6 (A), 8 (B), 3 (C), 3 (H) i 8 (I-K) nezavisnih eksperimenata, respektivno. t-test (***P < 0,001). Stubići skale: 50 µm.

FIG.4. Poređenje osetljivosti na HERV-W Env u nezrelim (jedan dan stare = OPC) i zrelim OPC pacova (sedam dana stare; "zrele OPC" ili Oligodendrociti = OL ;). Oba ćelijska tipa podvrgnuta su stimulaciji sa 100 ng/ml rastvorljivog rekombinantnog Env. Iako značajno u poređenju sa puferskim kontrolama iNOS i citokina, ushodna regulacija nakon Env stimulacije u OL je manje izražena u odnosu na OPC. GAPDH ekspresija korišćena je kao referentni gen. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /- standardna devijacija i dobijeni su iz jednog reprezentativnog od 3 nezavisna eksperimenta. t-test (***P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05).

FIG.5. Env zavisne reakcije humanih OPC. (A) Stimulacija kultivisanih humanih OPC sa površinski vezanim (čvrst) i rastvorljivim rekombinantnim (rastvorljiv) Env dovodi do snažne indukcije iNOS ekspresije nakon 24h stimulacije kada se uporedi sa ćelijama tretiranih puferom. GAPDH ekspresija je korišćena kao referentni gen. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /-standardna devijacija i dobijeni iz jednog reprezentativnog od 3 nezavisna eksperimenta. t-test (***P < 0,001). (B,B') Imunofluorescentna bojenja kultivisanih GalC pozitivnih humanih OPC otkrivaju snažan signal za TLR4 (pokazan nakon tri dana u kulturi). Stubići skale: 50 µm.

FIG.6. Eksperimenti neutralizacije Env puta. (A) Inaktivacija toplotom rekombinantnog Env dovodi do ukinute indukcije iNOS gena kada se uporedi sa nativnim rekombinantnim Env nakon 8h OPC stimulacije. Oba preparata, nativni Env i denaturisani Env (Env toplote) primenjeni su u koncentraciji od 1000 ng/ml. (B,C) Smanjenje iNOS ekspresije u OPC usled farmakološke inhibicije IRAK1/4 i TRIF, respektivno. Nakon 2h faze preinkubacije sa 3200 nM IRAK1/4 inhibitorom I ili 50 µM TRIF inhibitornim peptidom, OPC su stimulisane sa površinski vezanim (čvrst) rekombinantnim Env za 8h i naknadno lizirane. (D) Smanjenje iNOS ekspresije u OPC nakon antitelo-posredovane blokade Env receptora TLR4. Nakon 2h faze preinkubacije sa anti-TLR4 antitelom u koncentraciji od 15 µg/ml na 37°C, OPC su stimulisane sa čvrstim rEnv za 8h i zatim lizirane. GAPDH ekspresija korišćena je kao referentni gen. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /standardna devijacija i dobijeni iz jednog reprezentativnog od 3 nezavisna eksperimenta svaki. t-test (***P < 0,001, **P < 0,01). (E) Porast jedarne lokalizacije NFκB nakon stimulacije OPC sa površinski vezanim (čvrst) rekombinantnim Env za 8h. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /- standardna devijacija i dobijeni iz jednog reprezentativnog od 3 nezavisna eksperimenta svaki. t-test (***P < 0,001). (F-G') Reprezentativna NFκB imunobojenja pufera (kontrola) i Env stimulisanih OPC. Stubići skale: 50 µm.

FIG.7. Generisanje 3-nitrotirozin (3-NT) pozitivnih OPC.(A) Imunofluorescentna bojenja otkrila su da nakon 24h Env stimulacije (površinski vetani rekombinantni Env), značajno više OPC je eksprimiralo NO-zavisni marker 3-NT nitrozativnog stresa u poređenju sa ćelijama tretiranih puferom. Kao pozitivna kontrola S-nitrozo-N-acetilpenicilamin (SNAP), snažan NO donor, je korišćen. Međutim, kada su OPC inkubirane sa L-NAME, iNOS inhibitorni molekul, u koncentraciji od 100 µM za 30 min na 37°C pre Env stimulacije, 3-NT pozitivnost je smanjena do kontrolnih nivoa. Neaktivni enantiomer D-NAME nije mogao da ukine Env zavisnu 3-NT indukciju. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /- standardna devijacija i dobijeni iz jednog reprezentativnog od 3 nezavisna eksperimenta. t-test (***P < 0,001). (B-F') Reprezentativna anti-3-NT imunobojenja kontrolnih ćelija (B,B'), Env stimulisane OPC (C,C'), OPC prethodno inkubirano sa L-NAME (D,D'), D-NAME (E,E') i OPC izložene sa SNAP (F,F'). Stubići skale: 50µm. (G-G"') Imunohistofluorescentna bojenja delova NAWM tkiva MS pacijenta pokazala su da rezidentne OPC (označene njihovom ekspresijom prekursor markera PDGFRα, strelice) mogu da podnesu nitrozativni stres kao što je otkriveno njihovom 3-NT pozitivnošću.

FIG.8. Env zavisna inhibicija OPC diferencijacije.(A,B) Imunofluorecentna analiza koja je pokazala da se nakon jednog dana i tri dana stimulacije sa površinski vezanim rekombinantnim Env, značajno smanjio broj OPC koje su eksprimirale rani mijelinski marker CNPase kao i kasni mijelinski marker MBPas u poređenju sa kontrolnim ćelijama. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /- standardna devijacija i dobijeni iz jednog reprezentativnog od 4 nezavisna eksperimenta. t-test (***P < 0,001). (C-C"') i (D-D"') prikazuju reprezentativna anti-CNPase i anti-MBP imunobojenja kontrole i Env-stimulisanih OPC. (E) Inkubacija OPC sa 100 µM L-NAME u kombinaciji sa površinski vezanim rekombinantnim Env za tri dana dovela je do ukidanja blokiranja Env-posredovane OPC diferencijacije kao što je otkriveno anti-MBP imunobojenjima. Primena D-NAME nije mogla da spasi mijelinsku ekspresiju. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti /- standardna devijacija i dobijeni iz jednog reprezentativnog od 4 nezavisna eksperimenta. t-test (***P < 0,001; n.s. bez značaja). (F-H') Reprezentativna MBP imunobojenja OPC stimulisanih sa Env samo, kombinacijom Env i L-NAME i kombinacijom Env i D-NAME, respektivno. Stubići skale: 50 µm.

FIG.9. Ekspresija markera OPC sazrevanja nakon 24 i 72 sata stimulacije u labtek-ovima prethodno obloženom sa MSRV-Env. Obloženi MSRV-Env (+ Env-T) indukovao je smanjenje procenta CNPase pozitivne OPC nakon 24 sata stimulacije (A), kao i smanjenje procenta MBP pozitivne OPC nakon 72 sata stimulacije (B), kada se uporedi sa svojim puferom za razblaženje (pufer). Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM jednog eksperimenta procenjenog u duplikatima (410 do 563 izbrojanih ćelija po grupi; *p<0,05 t-test (A) i 364 do 491 izbrojanih ćelija po grupi; *p<0,001 Mann-Whitney Rank Sum test (B)).

FIG.10. Ekspresija CNPase u humanoj OPC nakon 24 sata stimulacije sa MSRV-Env i GNbAC1. (A) Obloženi MSRV-Env indukuje smanjenje procenta CNPase pozitivne OPC nakon 24 sata stimulacije. GNbAC1 sa 50 nM ili 200 nM potpuno inhibira MSRV-Env efekat, u oba testirana protokola GNbAC1 tretiranja (GNbAC1-A ili GNbAC1-B). Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM 2 do 8 nezavisna eksperimenta (705 do 3878 izbrojanih ćelija po grupi). (B) GNbAC1 (50 nM ili 200 nM) obložen sam ili zajedno sa BSA (1µg/ml), u oba testirana protokola GNbAC1 tretiranja (GNbAC1-A ili GNbAC1-B) nije imao efekat na procenat CNPase pozitivne OPC. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM jednog eksperimenta procenjenog u duplikatima (399 do 512 izbrojanih ćelija po grupi; p>0,05; Jednosmerna ANOVA).

FIG.11. Ekspresija CNPase u humanim OPC kulturama nakon 24 sata stimulacije sa MSRV-Env i GNbAC1 dodatih podlozi za kulturu. MSRV-Env (3 nM) razblažen u podlozi za ćelijsku kulturu značajno smanjuje CNPase ekspresiju nakon 24 sata tretiranja. GNbAC1 (200 nM) inhibira potpuno ovaj efekat, dok ne pokazuje bilo kakvo dejstvo sam. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM 2 do 4 nezavisna eksperimenta (927 do 1913 izbrojanih ćelija po grupi); *p<0,001 vs pufer; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testovima).

FIG.12. Ekspresija MBP u humanim OPC kulturama nakon 72 sata stimulacije sa MSRV-Env i GNbAC1. (A) Obložen MSRV-Env (Env-T) indukuje smanjenje u procentu MBP pozitivne OPC nakon 72 sata stimulacije. GNbAC1 od 50 nM delimično inhibira MSRV-Env efekat, a ova inhibicija je potpuna sa 200 nM, u oba testirana protokola GNbAC1 tretiranja (GNbAC1-A ili GNbAC1-B). (B) MSRV-Env (3 nM) dodat u podlogu za ćelijsku kulturu značajno smanjuje MBP ekspresiju nakon 72 sata tretiranja. GNbAC1 (200 nM) inhibira potpuno ovaj efekat (B).

Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM od (A) 2 do 8 nezavisna eksperimenta (924 do 4156 izbrojanih ćelija po grupi) *p<0,05 ; **p<0,001 vs pufer; Ψp<0,001 vs Env-T;

Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testom, i od (B) 2 do 4 nezavisna eksperimenta (1013 do 1834 izbrojanih ćelija po grupi; * p<0,001 vs pufer; Ψp<0.001 vs Env-T; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testom).

FIG.13. Ekspresija markera OPC sazrevanja nakon 24 i 72 sata stimulacije obloženim MSRV-Env i GNbAC1. Obloženi MSRV-Env indukuje (A) smanjenje u procentu CNPase pozitivne humane OPC nakon 24 sata stimulacije kao i (B) smanjenje u procentu MBP pozitivne humane OPC nakon 72 sata stimulacije. (A) GNbAC1 (200 nM) potpuno inhibira MSRV-Env efekat, u oba testirana protokola GNbAC1 tretiranja (GNbAC1-A ili GNbAC1-B). Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM 6 nezavisnih eksperimenata (2805 do 3039 izbrojanih ćelija po grupi; * p < 0,05 vs pufer; Ψp<0,05 vs MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Studentovim Newman Keuls post-hoc testom i (B) 5 do 6 nezavisnih eksperimenata (1671 do 2066 izbrojanih ćelija po grupi; *p<0,05 vs pufer; Ψp<0,05 vs MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Dunn post-hoc testom).

FIG.14. Inhibicija sazrevanja humanih OPC indukovana sa MSRV-Env je potpuno preokrenuta sa GNbAC1. Obloženi MSRV-Env (Env) indukuje (A) smanjenje u procentu CNPase pozitivne humane OPC nakon 24 sata stimulacije kao i (B) smanjenje u procentu MBP pozitivne humane OPC nakon 72 sata stimulacije. GNbAC1 (200 nM) potpuno inhibira MSRV-Env efekat, u oba testirana protokola GNbAC1 tretiranja (+ GNbAC1 A ili GNbAC1 B). Rezultati su izraženi kao procenat CNPase (A) ili MBP (B) pozitivnih ćelija i predstavljaju srednju vrednost ± SEM od 8-14 nezavisnih eksperimenata (3600 do 6800 izbrojanih ćelija po grupi (A) i 2700 do 5800 izbrojanih ćelija po grupi (B)) . *p< 0,05 Vs CTRL ;<Ψ>p<0,05 Vs MSRV-Env ; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Dunn post-hoc testom.

FIG.15. Inhibicija sazrevanja humanih OPC indukovana sa MSRV-Env je potpuno preokrenuta sa GNbAC1 (normalizovani podaci). MSRV-Env je bio obložen na slajdovima kulture u komorama pre zasejavanja OPC. GNbAC1 (200 nM) je umešano sa MSRV-Env pre oblaganja (GNbAC1-A) ili inkubirano na komore za kulturu obložene sa MSRV-Env (GNbAC1-B). Podaci su kvantifikovani kao procenat od (A) CNPase ili (B) MBP pozitivnih ćelija i izraženi su kao procenat promene u odnosu na CTRL uslov (MSRV-Env pufer). Rezultati predstavljaju srednju vrednost ± SEM od 8-14 nezavisnih eksperimenata (3600 do 6800 izbrojanih ćelija po grupi (A) i 2700 do 5800 izbrojanih ćelija po grupi (B)). *p< 0,05 Vs CTRL ;<Ψ>p<0,05 Vs MSRV-Env ; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Dunn post-hoc testom.

FIG.16. EAE kinetika kliničkih ocena grupa A, B, C i F(A-Netretirane EAE pozitivne kontrole, B-EAE tretiran sa GNbAc1200µg, C- EAE tretiran sa L-NAME, F- EAE tretiran sa GNbAc 200µg+L-NAME)

FIG.17. EAE kinetika kliničkih ocena grupa A, B, D i G (A-Netretirane EAE pozitivne kontrole, B-EAE tretiran sa GNbAc1200µg, D- EAE tretiran sa SMT, G- EAE tretiran sa GNbAc 200µg SMT) FIG.18. EAE kinetika kliničkih ocena grupa A, B, E i H(A-Netretirane EAE pozitivne kontrole, B-EAE tretiran sa GNbAc1200µg, E- EAE tretiran sa DMF, H- EAE tretiran sa GNbAc 200µg DMF) FIG.19. Kinetika vremena na Rotarod-u pri 23 o/min

X Osa: Dani izmerenih vrednosti, prema protokolu.

Y osa: Dobitak ili gubitak vremena na Rotarod-u, u odnosu na dan -7.

A: Grupe A, B, "1injekcija" i "2 injekcije" Env; B: Grupe A, B, C i F;

C: Grupe A, B, D i G; D: Grupe A, B, E i H.

FIG.20. Kinetika vremena na Rotarod-u pri 26 o/min

X Osa: Dani izmerenih vrednosti, prema protokolu.

Y osa: Dobitak ili gubitak vremena na Rotarod-u, u odnosu na dan -7.

1

A: Grupe A, B, "1injekcija" i "2 injekcije" Env; B: Grupe A, B, C i F;

C: Grupe A, B, D i G; D: Grupe A, B, E i H.

FIG.21. Kinetika vremena na Rotarod-u pri 29 o/min

X Osa: Dani izmerenih vrednosti, prema protokolu.

Y osa: Dobitak ili gubitak vremena na Rotarod-u, u odnosu na dan -7

A: Grupe A, B, "1injekcija" i "2 injekcije" Env; B: Grupe A, B, C i F;

C: Grupe A, B, D i G; D: Grupe A, B, E i H.

FIG.22. EAE kinetika kliničkih ocena grupa A, B, C i D(A-Lažne EAE negativne kontrole, B-Netretirane EAE pozitivne kontrole, C- EAE tretiran sa GNbAc 200µg, D- EAE tretiran sa GNbAc 500µg)

FIG.23. EAE kinetika kliničkih ocena grupa A, B, E i F(A-Lažne EAE negativne kontrole, B-Netretirane EAE pozitivne kontrole, D- EAE tretiran sa SMT, G- EAE tretiran sa GNbAc 200µg SMT)

FIG.24. EAE kinetika kliničkih ocena grupa A, B, G i H (A-Lažne EAE negativne kontrole, B-Netretirane EAE pozitivne kontrole, E- EAE tretiran sa DMF, H- EAE tretiran sa GNbAc 200µg DMF)

FIG.25. Kinetika dobitka mase tokom perioda ispitivanja(Relativni dobitak mase u odnosu na dan pre prve injekcije imunogena): Grupe A, B, C i D (A-Lažne EAE negativne kontrole, B-Netretirane EAE pozitivne kontrole, C- EAE tretiran sa GNbAc 200µg, D- EAE tretiran sa GNbAc 500µg)

FIG.26. Kinetika dobitka mase tokom perioda ispitivanja(Relativni dobitak mase u odnosu na dan pre prve injekcije imunogena): Grupe A, B, E i F (A-Lažne EAE negativne kontrole, B-Netretirane EAE pozitivne kontrole, D- EAE tretiran sa SMT, G- EAE tretiran sa GNbAc 200µg SMT)

FIG.27. Kinetika dobitka mase tokom perioda ispitivanja(Relativni dobitak mase u odnosu na dan pre prve injekcije imunogena): A, B, G i H (A-Lažne EAE negativne kontrole, B- Netretirane EAE pozitivne kontrole, E- EAE tretiran sa DMF, H- EAE tretiran sa GNbAc 200µg DMF) FIG.28. Kinetika vremena na Rotarod-u pri 16 o/min

X Osa: Dani izmerenih vrednosti, prema protokolu.

Y osa: Dobitak ili gubitak vremena na Rotarod-u, u odnosu na dan -7

A: Grupe A, B, C i D; B: Grupe A, B, E i F; C: Grupe A, B, G i H.

FIG.29. Kinetika vremena na Rotarod-u pri 26 o/min

X Osa: Dani izmerenih vrednosti, prema protokolu.

Y osa: Dobitak ili gubitak vremena na Rotarod-u, u odnosu na dan -7

A: Grupe A, B, C i D; B: Grupe A, B, E i F; C: Grupe A, B, G i H.

FIG.30. Kinetika vremena na Rotarod-u pri 29 o/min

X Osa: Dani izmerenih vrednosti, prema protokolu.

Y osa: Dobitak ili gubitak vremena na Rotarod-u, u odnosu na dan -7

A: Grupe A, B, C i D; B: Grupe A, B, E i F; C: Grupe A, B, G i H.

FIG.31. EAE kinetika kliničkih ocena svih grupa tokom perioda ispitivanja (A-Lažne EAE negativne kontrole, B- EAE pozitivne kontrole tretirane lažnim izotipskim antitelom, C- EAE tretiran sa GNbAc 500µg, D- EAE tretiran sa natrijum fumaratom i E- EAE tretiran sa GNbAc 500µg natrijum fumarat)

Pregled korišćenih skraćenica

[0029]

hi h id ibil kid i

1

Primer 1: Blokada remijelinizacije indukovana proteinom omotača HERV-W familije (inhibira diferencijaciju oligodendroglijalnih prekursor ćelija u demijelizovanim lezijama nervnog sistema.

1.1 Materijal i postupci

1.1.1 Ćelijska kultura prekursora oligodendrocita

[0030] Ćelije prekursori oligodendrocita (OPC) pacova prečišćene su kao što je prethodno opisano<22>. OPC ili su držane u podlozi za proliferaciju (Sato podloga obogaćena sa 10 ng/ml rekombinantnim humanim osnovnim faktorom rasta fibroblasta i 10 ng/ml rekombinantnim humanim trombocitnim faktorom rasta-AA; R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Nemačka), dok je diferencijacija inicirana Sato podlogom obogaćenom sa 0,5% fetalnog telećeg seruma. Humane fetalne ćelije prekursora oligodendrocita (hOPC) i odgovarajuće podloge nabavljeni su od 3H Biomedical, Uppsala, Švedska. Rekombinantni Env je proizveden i prečišćen od strane PX-Therapeutics (Grenoble, Francuska) prema QC specifikacijama od GeNeuro (Geneva, Švajcarska) koji su isporučili šarže proteina. Nivoi endotoksina bili su <5 EU/mL kako je izmereno testom sa limulus amebocit lizatom (LAL). Env stimulacija je izvedena upotrebom tri različita pristupa gde se koristi i) rekombinantni Env protein pune dužine razblažen u podlozi za diferencijaciju sa 10 ng/ml, 100 ng/ml i 1000 ng/ml, ii) rekombinantni Env protein obložan na posude za ćelijsku kulturu u površinoj koncentraciji 17,53 ng/cm<2>i iii) zasejavanjem OPC na transfektovane U343 ćelije glioblastoma koje prekomerno eksprimiraju Env, respektivno. Kontrolni eksperimenti stimulacije sprovedeni su upotrebom preparata rekombinantnog Env pufera (20mM histidin, 5% (mas./vol.) saharoze, 0,01% (mas./vol.) polisorbata 20, pH 6,0) pri jednakim razblaženjima. Merenja NO koncentracija u OPC supernatantima izvedena su upotrebom kompleta za kolorimetrijsku analizu azot-monoksida (Merck-Millipore/Calbiochem, Darmstadt, Nemačka) i apsorbancija je određena na 540 nm upotrebom Anthos čitača ploča 2001 (Anthos labtec instruments, Salzburg, Austrija). Procena OPC morfologije izvedena je upotrebom anti-O4 antitela Merck-Millipore/Chemicon, Darmstadt, Nemačka) uzimajući u obzir prečnik ćelija i stepen granjanja. Eksperimenti sa IRAK-1/4 inhibitorom I (1-(2-(4-Morfolinil)etil)-2-(3-nitrobenzoilamino)benzimidazol,N-(2-Morfoliniletil)-2-(3-nitrobenzoilamido)-benz-imidazol; SigmaAldrich, Hamburg, Nemačka) izvedeni su u koncentraciji od 2400 nM, TRIF inhibitory peptide (Invivogen, San Diego, USA) izvedeni su u koncentraciji od 50 µM prema protokolima proizvođača. Env inaktivacija izvedena je izlaganjem rekombinantnog Env temperaturi od 123°C tokom 1h. Eksperimenti blokiranja receptora TLR4-antitela izvedeni su pri koncentraciji antitela od 15 µg/ml. Eksperimenti L-NAME/D-NAME blokiranja izvedeni su u koncentraciji od 100 µM svaki; S-Nitrozo-N-acetil-DL-penicilamin (SNAP) je korišćen u koncentraciji od 100 ng/ml.

1.1.2 Transfekcija ćelija prekursora oligodendrocita i U343 glioblastoma

[0031] OPC uzgajane su tokom 24h u podlozi za proliferaciju i izvedena je transfekcija upotrebom NanoJuice reagensa (Merck-Millipore, Darmstadt, Nemačka) korišćenjem shRNA kodirajućeg TLR4 supresionog vektora na bazi HuSH 29 pGFP-V-RS vektora (OriGene, Rockville, Maryland, SAD) za dokaz specifičnosti anti-TLR4 antitelo. Za ekspresiju membranski vezanog Env u U343 ćelijama glioblastoma, vektor<9>za ekspresiju citrina za vizuelizaciju transfektovanih ćelija kombinovan je sa prekomernom ekspresijom Env (pV14 vektor sa nt 1 do nt 1629 kodirajuće sekvence HERV-W MSRV-tip env gena -GenBank AF331500.1- nabavljen od Geneuro SA, Švajcarska) u odnosu 1:5. Odgovarajući prazan vektor korišćen je kao kontrola. Transfekcija U343 ćelija glioblastoma je ostvarena upotrebom Lipofektamina (Life Technologies, Darmstadt, Nemačka).

1.1.3 Bojenja tkiva multiple skleroze

[0032] Za Olig2/Env dvostruka bojenja, formalin-fiksirano parafin-ugrađeno humano MS tkivo je isečeno i delovi od 5 µm su deparafinirani u ksilenu i rehidrirani kroz alkohol određenog kvaliteta u destilovanu vodu. Aktivnost endogene peroksidaze ugašena je inkubiranjem sladova u 0,3% vodonik peroksida u metanolu. Slajdovi su zatim isprani destilovanom vodom i preneti u 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 9) rastvor da bi se postiglo toplotno indukovano demaskiranje antigena. U nastavku, slajdovi su ohlađeni

1

do sobne temperature, isprani u slanom rastvoru fosfatnog pufera (PBS) i inkubirani i sa anti-Olig2 (1:300; Merck-Millipore) i sa anti-Env antitelom 3B2H4 (1:500, GeNeuro, Geneva, Švajcarska) preko noći na 4°C. Dalje, delovi su inkubirani sa Alexa 488-obeleženim magarećim-anti-zečjim (1:400; Life Technologies/Molecular Probes, Darmstadt, Nemačka) radi detektovanja Olig2 i Alexa 555-obeleženog kozjeg-anti-mišjeg za vizuelizaciju Env. Za TLR4/PGRFRα dvostruka bojenja, naglo zamrznuto tkivo je isečeno i delovi od 5 µm su inkubirani sa anti-TLR4 (1:100; Merck-Millipore) i anti-PDGFα antitelom (1:50; eBiosciences, San Diego, California, SAD) preko noći na 4°C. TLR4 je detektovan upotrebom Alexa 488-obeleženog kozjeg-anti-mišjeg (1:400; Life Technologies/Molecular Probes) i PDGFRα sa biotinilovanim zečjim-anti-pacovskim (1:500; Vector Laboratories, Burlingame, CA, SAD) i Alexa 647-obeleženim streptavidinom (1:400; Life Technologies/Molecular Probes), respektivno. Za jedarna bojenja, delovi su inkubirani sa rastvorom Hoechst boje (1:100; Sigma-Aldrich, Hamburg, Nemačka) tokom 1 minuta i prekriveni sa Vectashield (Vector Laboratories). Mikroskopska analiza izvedena je sa Leica TCS SP2 AOBS konfokalnim laser-skenirajućim mikroskopom (Leica Microsystems, Heidelberg, Nemačka).

1.1.4 Bojenja kultivisanih ćelija

[0033] Bojenja kultivisanih fiksiranih ćelija paraformaldehidom izvedena su kao što je opisano prethodno<22>. Primarna antitela razblažena su kao što sledi: anti-TLR4 antitelo (1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Nemačka), anti-Env antitelo 3B2H4 (1/500; GeNeuro, Geneva, Švajcarska), anti-2',3'-Cikličninukleotid 3'-fosfodiesteraza (CNPase) antitelo (1/1000; Covance, Princeton, New Jersey, SAD), monoklonalno antitelo protiv mijelinskog baznog proteina (MBP; 1/1000; Convance, Princeton, New Jersey, SAD), poliklonalno antitelo protiv mijelinskog baznog proteina (1:1000; Millipore, Schwalbach, Nemačka), anti-galaktrocerebrozid (GalC) antitelo, anti-O4 antitelo (oba 1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Nemačka); anti-3-NT antitelo (1/1000; Abcam, Cambridge, MA, SAD) i anti-NFκB antitelo (1/1000; Abcam, Cambridge, MA, SAD). Alexa Fluor 488- i Alexa Fluor 594-konjugovana antitela (oba 1:500,) korišćena su za signalnu vizuelizaciju. Jedra su obojena sa 4',6-diamino-2-fenilindolom (DAPI; Roche, Basel, Švajcarska).

1.1.5 RNK preparat, cDNK sinteza, i kvantitativna polimerazna lančana reakcija reverzne transkripcije

[0034] RNK prečišćavanje iz kultivisanih ćelija izvedeno je upotrebom RNeasy procedure (Qiagen, Hilden, Nemačka). Izolovana RNK je reverzno transkriptovana upotrebom kompleta cDNK reverzne transkripcije visokog kapaciteta (Life Technologies/Applied Biosystems). Kvantitativno određivanje nivoa ekspresije gena izvedeno je na 7900HT detekcionom sistemu sekvenci (Life Technologies/Applied Biosystems) upotrebom Power SybrGreen universal master mix (Life Technologies/Applied Biosystems).

1

Sekvence prajmera određene su upotrebom PrimerExpress 2.0 softvera (Life Technologies/Applied Biosystems) i testirane za generisanje specifičnih amplikona:

TLR4_fwd: CTGGGTTTCTGCTGTGGACA (SEQ ID No.7)

TLR4_rev: AGGTTAGAAGCCTCGTGCTCC (SEQ ID No.8)

riNOS_fwd: CTCAGCACAGAGGGCTCAAAG (SEQ ID No.9)

riNOS_rev: TGCACCCAAACACCAAGGT (SEQ ID No.10)

huiNOS_fwd: TGAGGAGCAGGTCGAGGACT (SEQ ID No.11)

huiNOS_rev: TGATAGCGCTTCTGGCTCTTG (SEQ ID No.12)

huGAPDH_fwd: TGGACCTGACCTGCCGTCTA (SEQ ID No.13)

huGAPDH _rev: AGGAGTGGGTGTCGCTGTTG (SEQ ID No.14)

TNFa_fwd: AGCCCTGGTATGAGCCCATGTA (SEQ ID No.15)

TNFα_rev: CCGGACTCCGTGATGTCTAAG (SEQ ID No.16)

IL1β_fwd: GAAACAGCAATGGTCGGGAC (SEQ ID No.17)

IL1β_rev: AAGACACGGGTTCCATGGTG (SEQ ID No.18)

IL6_fwd: GTTGTGCAATGGCAATTCTGA (SEQ ID No.19)

IL6_rev: TCTGACAGTGCATCATCGCTG (SEQ ID No.20)

GAPDH_fwd: GAACGGGAAGCTCACTGGC (SEQ ID No.21)

GAPDH_rev: GCATGTCAGATCCACAACGG (SEQ ID No.22)

ODC_fwd: GGTTCCAGAGGCCAAACATC (SEQ ID No.23)

ODC_rev: GTTGCCACATTGACCGTGAC (SEQ ID No.24)

[0035] GAPDH i ODC su korišćeni kao referentni geni, a relativni nivoi ekspresije gena određeni su prema ΔΔCt postupku (Life Technologies/Applied Biosystems). Svaki uzorak je izmeren četvorostruko; podaci su prikazani kao srednje vrednosti ± standardna devijacija, i t-test je primenjen za određivanje statističkog značaja.

1.2 Rezultati

1.2.1 Lokalizacija Env proteina blizu hroničnih aktivnih MS lezija i u blizini rezidentnih OPC

[0036] Upotrebom imunohistoloških testova ispitana je lokalizacija Env proteina u uzorcima humanih tkiva mozga. Ovo je otkrilo prisustvo Env protein u priličnom izobilju u NAWM blizu hroničnih aktivnih MS lezija (CAL, Fig.1B) kao i na obodima CAL u blizini Olig2-pozitivnih OPC (Fig.1C). NAWM na većoj udaljenosti od lezija nije pokazala primetnu Env imunoreaktivnost (Fig.1A). Kako bi se dalje dokazao potencijalni uticaj Env proteina na rezidentne OPC a, time, na relevantnu popravku mijelina, dalje je tragano za TLR4 i receptor trombocitnog faktora rasta alfa (PDGFRa)-dvostruko-pozitivnim OPC. Mogli su se detektovati u zdravim mozgovima (Fig.1D-D'") i u NAWM MS pacijenata (Fig.1E-E"'). Ovo jasno

1

demonstrira da u MS mozgu, TLR4-pozitivne OPC mogu da se detektuju u blizini ćelija koje eksprimiraju HERV-W Env ili odgovarajućih izlučenih proteina, što ih čini podložnim metama ovog TLR-4 patogenog agonista kao što je opisano<10>. Pored toga, ovo predstavlja neočekivno otkriće i otvara još neviđene perspektive primene jer je za TLR4 bilo prethodno nepoznato da se eksprimira u takvim uslovima u OPC i sve više, kao što je dalje otkriveno, jer za HERV-W protein omotača kao što je MSRV-Env, prema tome, nije moglo da se vidi da direktno uzajamno deluje sa OPC u ovom preciznom koraku diferencijacije sa krajnjim dramatičnim efektima na njihov potencijal mijelinizacije.

1.2.2 TLR4 ekspresija kultivisanim OPC pacova i ljudi

[0037] Prethodna ispitivanja suštinski su dokazala TLR4-zavisni proinflamatorni efekat na monocite i dentritske ćelije<10>. Anti-TLR4 imunoobeležavanje potvrdilo je ekspresiju ovog receptora na površini oligodendroglijalnih precursor ćelija i pacova i ljudi (Fig.2C,C' i 5B). Štaviše, specifični shRNK-posredovani nokdaun TLR4 u OPC pacova potvrdio je specifičnost prethodnog imunobojenja (Fig.2B,B'). Kako bi se ocenila kinetika ekspresije TLR4 receptora od mladih do zrelih OPC, izvedeno je ko-bojenje upotrebom anti-galaktocerebrozid (GalC) antitela, kao i antitela protiv mijelinskog baznog proteina (MBP), marker za zrelije OPC, nakon tri i šest dana diferencijacije u kulturi(Fig.2C-D'). Zanimljivo, otkriveno je da će ekspresija gena za TLR4 receptor tokom vremena biti nishodno regulisana tokom diferencijacije ćelija (Fig.2A), dok detekcija specifičnog TLR4 proteina daje samo slab signal u kasnijim vremenskim tačkama u morfološki zrelim OPC pacova (Fig.2D) u poređenju sa mlađim ćelijama.

1.2.3 OPC stimulacija pomoću Env indukuje ekspresiju proinflamatornih citokina i inducibilne NO sinteze

[0038] Stimulacija OPC pacova rekombinantnim Env proteinom rastvorenim u podlozi (Env rastvorljiv; 100 ng/ml; Fig.3A), obložen na posude za ćelijsku kulturu (Env čvrst; Fig.3B) ili prekomerno eksprimiran na površini transfektovanih U343 ćelija glioblastoma (pV14Env; Fig.3C-E') dovela je do velikog transkripcionog povećanja inducibilne azot-monoksid sintaze (iNOS) kao i do indukcije proinflamatornih citokina kao što su TNFα, IL-1β i IL-6 (Fig.2I-K) u poređenju sa kontrolnim (tretiran puferom ili praznim vektorom) uslovima. Zauzvrat, poboljšana iNOS ekspresija dovodi do Env koncentracija-zavisnog porasta njegovog nitrozativnog stresa koji indukuje proizvodnju azot-monoksida (NO) u supernatantima ćelija (Fig.3H). Zanimljivo, morfologija OPC pacova ostala je nepromenjena tokom Env stimulacije kao što se pokazalo sa 04 bojenja oligodendroglijalnih ćelija izvedena nakon jednog dana i pet dana Env izlaganja (Fig.3F-G'). Takođe je otkriveno da humane GalC-pozitivne OPC eksprimiraju TRL4 (Fig.5B,B'), a stimulacija sa rekombinantnim Env (i u rastvoru kao i obložen na površini posude) slično je indukovala iNOS transkripciju (Fig.5A). Dalje, primećeno je da Env stimulacija nije uticala na OPC preživljavanje (kao što je otkriveno pomoću TUNEL i kvantifikacijom ukupnih brojeva ćelija; podaci nisu prikazani) niti je

1

indukovala fenotipom senescentnih OPC (ispitano bojenjima β-galaktozidazom; podaci nisu prikazani). Env stimulacija zrelih OPC pacova (matOPC; čuvane u podlozi za diferencijaciju tokom šest dana) dovodi do suštinski slabije proinflamatorne reakcije kao što je određeno nivoima transkripcije iNOS, TNFα, IL-1b i IL-6, u poređenju sa efektima na nezrele OPC (Fig.4). Ovo zapažanje je u redu sa nižim nivoima TLR4 ekspresije otkrivenim u zrelim OPC (Fig.2) i ukazuje na superiornu osetljivost nezrelih ćelija ka Env paralelnom nivou ekspresije TLR-4.

1.2.4 Env posreduje njegove efekte preko TLR4 i proinflamatorni odgovor uključuje IRAK-1/4, TRIF i NFκB

[0039] Kako bi se dokazala specifičnost Env ka TLR4 i kako bi se dalje rasvetlila nishodna signalizacija sprovedeni su brojni kontrolni eksperimenti (Fig.6). Toplotna inaktivacija rekombinantnog Env pre OPC stimulacije dovodi do veoma značajno smanjenje iNOS indukcije u poređenju sa kontrolama (Fig.6A). Slično značajno smanjenje iNOS transkripcije može se posmatrati upotrebom antitelo-posredovane blokade TLR4 čime se potvrđuje specifičnost Env ka ovom receptoru i njegova relevantnost koja se odnosi na primećene proinflamatorne nishodne efekte (Fig.6D). Kako bi se rasvetlili intracelularni putevi nakon TLR4 aktivacije sa Env, ispitivane su uloge dva poznata nishodna puta nakon TLR4 aktivacije, MyD88-zavisni put koji uključuje IRAK-1/4 (kinaza-1/4 povezana sa receptorom za interleukin-1) i MyD88-nezavisni put koji uključuje TRIF (TIR-domen sadržavajući adapter-indukujući interferon-β). Primena IRAK-1/4 inhibitora I ili TRIF inhibitornog peptida rezultovala je značajno smanjenim nivoima iNOS ekspresije u prisustvu Env (Fig.6B,C) prikazujući da Env-posredovana aktivacija TLR4 dovodi do aktivacije i MyD88-zavisnog kao i MyD88-nezavisnog puta signalne transdukcije. Oba puta mogu da konvergiraju NFκB (jedarni faktor pojačavač κ-lakog lanca aktiviranih B ćelija) jedarnoj translokaciji. Upotrebom anti-NFκB antitela potvrđeno je da Env stimulacija dovodi do velikog porasta OPC sa jedarnom NFκB lokalizacijom (Fig.6E-G') što obezbeđuje objašnjenje za primećenu transkripcionu ushodnu regulaciju proinflamatornih citokina.

1.2.5 Env-posredovana indukcija markera nitrozativnog stresa nitrotirozina

[0040] NO, koji se značajno povećao nakon Env stimulacija (videti Fig.3H), je reaktivne vrste azota (RNS). NO može da reaguje sa mnoštvo intracelularnih molekula uključujući proteine, nukleinske kiseline i lipide, što rezultuje formiranjem 3-nitrotirozinskih ostataka (3-NT). Otkriveno je da izlaganje OPC pacova rekombinantnom Env proteinu dovodi do velikog porasta 3-NT-pozitivnih ćelija u poređenju sa puferskim kontrolama (Fig.7B,B' i C,C') što ukazuje na NO-posredovane indukcije nitrozativnog stresa. Međutim, nakon preinkubacije sa iNOS koja inhibira molekul L-NAME (L-N<G>-nitroarginin metil estar), otkriveno je da će se NO proizvodnja značajno smanjiti (podaci nisu prikazani), kao i formiranje 3-NT pozitivnih OPC (Fig.7D,D'). Kada se D-NAME, neaktivni enantiomer L-NAME, koristio kao negativna

1

kontrola, Env-posredovano 3-NT formiranje nije pogođeno (Fig.7E,E'). Sa druge strane, primena SNAP (S-nitrozo-N- acetilpenicilamin), snažan NO donor, služila je kao pozitivna kontrola i rezultovala je nitrotirozinilacijom skoro svih OPC (Fig.7F,F'). Važno, 3-nitrotirozin pozitivne OPC, otkrivene njihovom ekspresijom prekursora markera PDGFRα, takođe su mogle da se detektuju u NAWM mozgova MS pacijenata (Fig.7G-G'") što ukazuje da je ovaj mehanizam stresa od patološke relevantnosti u MS.

1.2.6 Env utiče na mijelinsku ekspresiju OPC

[0041] Nakon ovih zapažanja, otkriveno je da li Env protein može da deluje na postupke oligodendroglijale diferencijacije za koje se pokazalo da su neophodni za popravku mijelinskih aktivnosti. Za ovu svrhu, Env stimulisane OPC pacova ocenjene su za ekspresiju mijelinskih proteina CNPase (2',3'-ciklični-nukleotid 3'-fosfodiesteraza) nakon tri dana od Env stimulacije i MBP (mijelinski bazni protein) nakon šest dana stimulacije, respektivno. Rezultati su otkrili da je Env veoma smanjio broj CNPase i MBP pozitivnih ćelija (Fig.8A-D'") za razliku od nepromenjene ekspresije prekursor markera 04 (Fig.3F-G'). Ovo je demonstriralo značajno oštećenu reakciju ćelijske diferencijacije u prisustvu Env proteina.

Međutim, dodatak L-NAME ali ne D-NAME paralelno Env stimulaciji moglo je da spase MBP ekspresiju (Fig.8E-H'), što dokazuje direktnu vezu između 3-NT formiranja preko nitrozativnog stresa i smanjenog kapaciteta OPC diferencijacije.

1.3 Analiza rezultata

[0042] Smatra se da će neefikasna NS remijelinizacija kod bolesti neuroinflamatorne demijelinizacije kao što je MS biti primarno izazvana smanjenim kapacitetom rezidentnih OPC da se diferenciraju ispravno i da remijelinizuju demijelizovane aksone<11-13>, ali nije poznato da glavni i ushodni patogeni molekul izaziva ovu blokadu remijelinizacije. Prethodna ispitivanja već su pokazala da protein omotača Env od HERV-W, koji se takođe naziva "retrovirusni element povezan sa multiple sklerozom" (MSRV), kada se dobija iz odgovarajućih retrovirusnih čestica<14>, ispoljava proinflamatorni efekat na urođen imuni sistem koji aktivira mononuklearne ćelije koje, zauzvrat, proizvode glavne proinflamatorne citokine<10>. Međutim, direktna veza između Env i smanjenog kapaciteta OPC diferencijacije capacity do sada nije, i nije mogla da bude, predviđena. Ovde je demonstrirano da ovaj Env protein može da se detektuje u MS-pogođenom NS tkivu i da Env može da ometa OPC diferencijaciju prethodno nepoznatim prisustvom Env receptora, TLR4, na OPC u određenoj fazi(ama) diferencijacije. Ovaj štetni efekat izazvan je preko iNOS. Ovaj stresni odgovor rezultuje formiranjem nitrotirozina i direktno deluje na ekspresiju mijelinskog proteina. Zanimljivo, Env stimulacija ne deluje na stope preživljavanja OPC ćelija i ćelijske morfologije ostale su nepromenjene što ukazuje na to da Env-posredovani signali ne ciljaju citoskeletne elemente. Napomena i potvrda novosti ovih neočekivanih otkrića, prethodna ispitivanja potvrdila su odsustvo TLR4 na oligodendroglijalnim ćelijama u humanom mozgu<15>. Međutim, nasuprot ovom prethodnom znanju o

2

domenu, jasno je demonstrirano da TLR4 ne eksprimira samo na na kultivisanim primarnim OPC (i pacovskog i humanog porekla) već i na PDGFRα-pozitivnim rezidentnim humanim OPC u MS tkivu. Takve razlike mogu da proizlaze iz činjenice da su Lehnhardt i kolege koristili opštiji marker 04 za detekciju oligodendroglijalnih ćelija dok se ovde umesto toga oslanjalo na novo prihvaćeni percursor marker PDGFR-α. Pored toga, stoga je prvi put dokazan ovaj čudan obrazac TLR4 ekspresije u OPC, kada je i dalje postojalo verovanje da ne postoji. Dodatno, primećena je jaka nishodna regulacija TLR4 tokom OPC sazrevanja što ukazuje da su ekspresija receptora i, posledična osetljivost na Env, ograničene na nezrele ćelije. Ipak, ovo otkriće je od patološke relevantnosti jer pruža ovim ćelijama sposobnost da direktno uzajamno deluju sa Env proteinom za koji se pokazalo da se eksprimira i oslobađa u MS lezijama. U svetlu ovih otkrića zaključuje se da MSRV/HERV-W Env protein nije samo imunopatološka komponenta MS već isto tako može da vrši značajan negativni uticaj na endogenu popravku mijelinskih aktivnosti. Prema tome je zaključeno da je smanjeni kapacitet popravke kao što je primećeno kod mnogih MS pacijenata tokom bolesti zbog aktivacije MSRV/HERV-W elemenata<2>. Napomena, prethodno ispitivanje opisalo je eksperimentalne efekte HERV-W Env proteina kodiranog defektivnom kopijom (nesposobnom da proizvede RT-aktivnost nikakvih čestica od tada bez kodirajućih sekvenci u gag i pol genima) sa stabilnim umetanjem u hromozom 7<16>. Ovaj Env protein može da se eksprimira jedinim kodirajućim genom HERV-W 7q elementa (env, ili ERVW-E1 lokus), koji ima četiri delecije aminokiselina u delu C-terminusa njegovog površinskog domena što očigledno uzrokuje specifično ćelijsko rutiranje i poznato je da ima in vivo ekspresiju na nivou proteina ograničenom na posteljicu<17, 18>. Ovaj protein je zaista primer "pripitomljenog" HERV proteina<17>, koji sada ima fiziološku ulogu u formiranju tkiva sincitiotrofoblasta a koji se zbog toga naziva "Syncytin"<19>. Odgovarajući fuzogeni domen u HERV-W Env, kao i TLR4-vezujući domen, može biti manje više sačuvan između HERV-W podvrsta (npr. MSRV-Env ili Syncytin). Njihova dostupnost kao površinskog ili ekstraćelijskog proteina sa konformacionom izloženošću aktivnog domena visoko je regulisana i fiziološka uloga Syncytin ostaje zakopana u sincitiotrofoblastu i ograničena na prisustvo posteljice. Tako, izgleda da je povezana patogenost obeležje nefiziološke aktivacije, npr., određenim ekološki infektivnim agensima<20, 21>kod ljudi, ili eksperimentalnih transgenih in vitro ili in vivo uslova. Prijavljeno je da je Syncytin otkriven u NS astroglijalnim ćelija pojedinaca sa multipla sklerozom (MS), ali korišćenjem antitela na drugom mestu izveštava se da se detektuje HERV-W MSRV-Env podvrsta a ne Syncytin<22>. Syncytin sekvenca može, pored toga, da se eksprimira transgenezom u mišjim astrocitima što izaziva oslobađanje citokina štetnih za oligodendrocite<16>, ali transgeni miševi su pokazali da nisu održivi (C. Power's personal communication to H. Perron, Neurovirology symposium, San Diego, 2007). Međutim, dok su Antony i kolege otkrili da su adenomatozna polipoza kolona (APC)-pozitivni oligodendrociti mijelinizacije podložni na Syncytinposredovanu citotoksičnost u tim mozgovima transgenih miševa, moglo je da se demonstrira da su samo nezrele OPC značajno sklone Env-posredovanim proinflamatornim signalima kada zrele ćelije nisu. Prema tome, sada izgleda da rezultati ovog ispitivanja rezultuju iz artefaktualnih eksperimentalnih uslova povezanim sa uslovima njihove transgene prisiljene ekspresije placentnog proteina u ćelijama mozga. Za razliku od ovih rezultata izvedeni iz veštačkih uslova, sada je otkriven štetni mehanizam koji se odnosi na kapacitet endogene popravke nervnog sistema (NS) odrasle osobe a ne na MS patologiju kao takvu, što se izraženo karakteriše imunski-posredovanim gubitkom oligodendrocita i mijelinskim ovojnicama sa oštećenjem aksona. Zaista, Env-posredovani efekti na imunske ćelije u vezi sa NS inflamatornim lezijama sada su dobro dokumentovani<7, 10, 23-25>, ali nikakvo prethodno ispitivanje nije dokazalo takvu direktnu patogenost HERV-W Env na glijalne ćelije sa učešćem u blokadi remijelinizacije MS plakova od strane OPC. Dobijeni rezultati koji ukazuju na imunohistologiju MS mozga koji pokazuju obimnu Env proteinsku ekspresiju u aktivnim MS plakovima ili na obodu manje aktivnih lezija sada podržavaju takvu ulogu u poznatom defektu remijelinizaciji od strane OPC u MS lezijama.

Primer 2: Blokada remijelinizacije indukovana proteinom omotača HERV-W familije efikasno je tretirana sa anti-Env specifičnim antitelom.

[0043] Protein omotača iz omotača HERV-W familije (Env, naročito iz podvrste retrovirusa povezanog sa multipla sklerozom, MSRV-Env) je snažan inhibitor kapaciteta nemijelinizirajućih OPC da se diferenciraju u zrele oligodendrocite koje proizvode mijelin, što se javlja kao kritična faza u postupku remijelinizacije. Ispitivan je efekat MSRV-Env proteina na ekspresiju dva različita markera diferencijacije oligodendrocita:

- CNPase (2',3'-Ciklični-nukleotid-3'-fosfohidrolaza) predstavlja 4% od ukupnih mijelinskih proteina i prisutna je u citoplazmi nezbijeno oligodendroglijalnih obmotanih aksona. CNPase je najranije poznat mijelin-specifični protein koji se sintetiše razvojem oligodendrocita.

- MBP (Mijelinski bazni protein) čini čak 30% mijelinskih proteina i ima glavnu ulogu u sabijanju mijelina u centralnim i perifernim nervnim sistemima. Javlja se uzastopno nakon CNPase i in vivo i in vitro i specifičan je marker zrelog oligodendrocita. Cilj ovog ispitivanja bio je da odredi da li specifično anti-Env antitelo kao što je GNbAC1, rekombinantno humanizovano anti-Env IgG4 monoklonalno antitelo, može da blokira inhibiciju OPC sazrevanja indukovanu od strane MSRV-Env. Zaista, takav efekat GNbAC1 bio bi indikativan za "anti-blokada remijelinizirajućih ćelija" svojstva antitela. Kako bi se testirala ova hipoteza, humana OPC u primarnoj kulturi inkubirana je sa MSRV-Env, sa ili bez GNbAC1, ili oblaganjem rekombinantnog proteina na površini kulture ili dodavanjem proteina u podlogu za kulturu. Ekspresije CNPase (kao rani marker sazrevanja) i MBP (kao kasni marker sazrevanja), procenjene su imunocitohemijom nakon jednog ili tri dana stimulacije, respektivno.

[0044] U ovom primeru, MSRV-Env odnosi se na rekombinantni MSRV-Env protein pune dužine koji sadrži intracelularne, transmembranske, i ekstracelularne domene HERV-W proteina omotača.

[0045] Ovde prikazani rezultati pokazuju da humane OPC eksprimiraju specifično TLR4 na svojoj plazmatičnoj membrani i demonstriraju da MSRV-Env rekombinantni protein specifično i značajno smanjuje broj CNPase i MBP pozitivnih ćelija. Ova zapažanja su u skladu sa onima iz Primera 1 na humane i pacovske OPC. Štaviše, ovi eksperimenti prvi put pokazuju da je inhibicija (blokada) sazrevanja humanih OPC indukovanog MSRV-Env potpuno obrnuta tretiranjem sa GNbAC1, što demonstrira njegova nova i prethodno neočekivana unexpected terapeutska svojstva. Ovo posledično obezbeđuje dodatnu indikaciju u lečenju progresivnih oblika multiple skleroze.

2.1 Materijal i postupci

2.1.1 Materijali

Materijali korišćeni za humane OPC primarne kulture

[0046]

Materijali korišćeni za procenu ekspresije markera sazrevanja u humanim OPC

2

Materijali korišćeni za stimulaciju OPC sa MSRV-Env, GNbAC1 i MSRV-Env puferom [0048]

2.1.2 Protokoli

Inkubacija humanih OPC sa MSRV-Env, MSRV-Env puferom i GNbAC1

[0049] Rekombinantni MSRV-Env pune dužine je proizveden i prečišćen pomoću PX'Therapeutics (548 aa; 61,44 KDa) (šarža 110719-1). Početna koncentracija bila je 0,6 mg/ml (9,76 µM). MSRV-Env pufer (20 mM Trizma-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5% SDS, 10 mM DTT) nabavljen je od PX'Therapeutics. Ovaj rastvor je korišćen kao negativna kontrola. GNbAC1 (Šarža T96/bAC1/B1; GMP production) je proizvedeno i prečišćeno od strane Polymun Scientific, Vienna, Austija. Početna koncentracija bila je 10 mg/ml (68,03 µM).

[0050] Humane OPC stimulisane su sa različitim tretmanima ili rastvorima koji su obloženi na površinu ploče za ćelijsku kulturu pre zasejavanja ćelija ili njihovim dodavanjem u podlogu za ćelijsku kulturu nakon što su ćelije zasejanje. U bilo kom slučaju, slajdovi labtek komore sa 8-bazenčića (Nunc) prethodno su obloženi poli-L-lizinom (Sigma-Aldrich) preko noći na 37°C.

Oblaganje slajdova Labtek komore sa 8 bazenčića

[0051] Različiti tretmani bili su razblaženi u PBS pod sterilnim poklopcem laminarnog toka (Fischer Bioblock, Francuska) i slajdovi Labtek komora sa 8 bazenčića (Nunc; 250 µl po bazenčiću) obloženi su kao što sledi:

● MSRV-Env (1µg/ml) obložen tokom 2 sata na 37°C

● MSRV-Env pufer (isto razblaženje kao MSRV-Env) obložen tokom 2 sata na 37°C

● MSRV-Env GNbAC1 A1 : mešavina MSRV-Env (1µg/ml) i GNbAC1 (7,35 µg/ml = 50 nM) obložena tokom 2 sata na 37°C

● MSRV-Env GNbAC1 A2 : mešavina MSRV-Env (1µg/ml) i GNbAC1 (29,4 µg/ml = 200 nM) obložena tokom 2 sata na 37°C

● MSRV-Env GNbAC1 B1 : MSRV-Env (1µg/ml) obložen tokom 2 sata na 37°C, ispran sa PBS i naknadno obložen sa GNbAC1 (7,35 µg/ml = 50 nM) tokom 1 sata na 37°C

● MSRV-Env GNbAC1 B2 : MSRV-Env (1 µg/ml) obložen tokom 2 sata na 37°C, ispran sa PBS i naknadno obložen sa GNbAC1 (29,4 µg/ml = 200 nM) tokom 1 sata na 37°C

● GNbAC1 A1 sam : GNbAC1 (7,35 µg/ml = 50 nM) obložen tokom 2 sata na 37°C

● GNbAC1 A2 sam : GNbAC1 (29,4 µg/ml = 200 nM) obložen tokom 2 sata na 37°C

● GNbAC1 B1 sam : PBS tokom 2 sata na 37°C, zatim obložen sa GNbAC1 (7,35 µg/ml = 50 nM) tokom 1 sata na 37°C

● GNbAC1 B2 sam : PBS tokom 2 sata na 37°C, zatim obložen tokom GNbAC1 (29,4 µg/ml = 200 nM) tokom 1 sata na 37°C

● BSA (1µg/ml) obložen tokom 2 sata na 37°C

2

● BSA GNbAC1 A1 : mešavina BSA (1µg/ml) i GNbAC1 (7,35 µg/ml = 50 nM) obložena tokom 2 sata na 37°C

● BSA GNbAC1 A2 : mešavina BSA (1µg/ml) i GNbAC1 (29,4 µg/ml = 200 nM) obložena tokom 2 sata na 37°C

● BSA GNbAC1 B1 : BSA (1µg/ml) obložen tokom 2 sata na 37°C, isprana sa PBS i naknadno obložen sa GNbAC1 (7,35 µg/ml = 50 nM) tokom 1 sata na 37°C

● BSA GNbAC1 B2 : BSA (1µg/ml) obložen tokom 2 sata na 37°C, ispran sa PBS i naknadno obložen sa GNbAC1 (29,4 µg/ml = 200 nM) tokom 1 sata na 37°C

Humane ćelijske kulture prekursori oligodendrocita

[0052] OPC, izolovane iz tkiva humanog mozga, nabavljene su od ScienCell Research Laboratories (preko 3H Biomedical, Švedska). Svaka fiolica sadržala je >1 x 10<6>ćelija u 1 ml. Kompletna podloga za OPC kulturu (OPCM) rekonstituisana je dodavanjem rastvora za OPC rast (OPCGS), i penicilin/streptomicin (P/S) u OPCM prema preporukama proizvođača (Sciencell).

[0053] Fiolica koja sadrži humane OPC stavljena je u vodeno kupatilo sa 37°C i nežno mešana rotiranjem dok se sadržaj nije potpuno otopio. Ćelije su nežno resuspendovane sa Gilson pipetom od 1 ml. Onda, razblažene su u kompletnoj OPCM, i zasejane u labtek posudama sa 8-bazenčića za kulturu (7000ćelija/cm<2>= 10000 ćelija po bazenčiću) prethodno obložena sa poli-L-lizinom (0,01%, Sigma) i sa (ili bez) tretiranja opisanih gore (videti 3.2.1.1) pod sterilnim poklopcem laminarnog toka (Fischer Bioblock, Francuska). Kulture su inkubirane na 37°C; 5% CO2do naknadnih eksperimenata imunocitohemije. Podloga za rast je zamenjena sledeći dan kako bi se uklonio zaostali DMSO i nevezane ćelije u kulturi tretirane tokom 72 sata.

Inkubacija sa MSRV-Env u podlozi za kulturu

[0054] Nakon 3 sata predkultivacije (videti 3.2.1.2) humanih OPC u labtek posudama za kulturu sa 8-bazenčića, ćelije su inkubirane na 37°C tokom 24 sata ili 72 sata u labtek-ovima sa 8-bazenčića (250 µl / bazenčić) sa dodatkom sledećih rastvora:

● MSRV-Env pufer, korišćen kao negativna kontrola, dodat u kompletnoj podlozi za ćelijsku kulturu

● MSRV-Env dodat pri 3 nM (0,184 µg/ml) u kompletnoj podlozi za ćelijsku kulturu

● MSRV-Env (3 nM) GNbAC1 (200 nM; 29,4 µg/ml) mešavina dodata u kompletnu podlogu za ćelijsku kulturu

● GNbAC1 (200 nM) samo dodato u kompletnu podlogu za ćelijsku kulturu

2

Ekspresija TLR4 i markeri mijelinizacije u OPC in vitro

[0055] Nakon 24 ili 72 sata inkubacije, podloga za ćelijsku kulturu je uklonjena i humane OPC stimulisane tretmanima opisanim gore (videti 3.2.1) fiksirane su u rastvoru paraformaldehida (4% PFA u PBS, 250 µl po komori) na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Zatim, isprane su tri puta u PBS (3 x 250 µl po komori) i nespecifična vezujuća mesta zasićena su inkubiranjem sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS) u PBS rastvoru koji sadrži 0,1% Triton X100 (250 µl po komori) tokom 1 sata na 37°C. U slučaju TLR4 bojenja, ćelije su inkubirane sa 10% FBS u PBS samo (250 µl po komori). Nakon zasićenja, OPC kulture su inkubirane sa rastvorima primarnih antitela preko noći na 4°C, razblažena u 10% FBS u PBS rastvoru (200 µl po komori), kao što sledi:

- Mišja anti-TLR4 antitela pri 1/1000 (nakon 24 i 72 sata kultivisanja)

- Mišja anti-CNPase antitela pri 1/200 (nakon 24 sata stimulacije)

- Mišja anti-MBP antitela pri 1/100 (nakon 72 sata stimulacije)

[0056] Ćelije su isprane 3 puta u PBS (3 x 250 µl po komori), i inkubirane sa rastvorima sekundarnih antitela tokom 1 sata na 37°C (250 µl po komori), kao što sledi:

● FITC konjugovan sa kozjim anti-mišjim antitelima pri 1/200

[0057] Nakon 3 ispiranja u PBS (3 x 300 µl po komori) na sobnoj temperaturi, plastične komore su razdvojene od slajdova. Slajdovi su potom optočene Vectastain® hranljivom podlogom koja sadrži DAPI (Vectashield). Bojenja su vizuelizovana fluorescentnim mikroskopom upotrebom mikroskopa Aksioskop (Zeiss).

Analiza podataka

[0058] Nakon 24 sata MSRV-Env-T stimulacije (ili kontrole), CNPase imunoreaktivne ćelije izbrojane su u 10 polja po komori nasumično izabranim. Procenat CNPase pozitivnih ćelija izračunat je kao:

[0059] Nakon 72 sata MSRV-Env-T stimulacije (ili kontrole), MBP imunoreaktivne ćelije izbrojane su u 10 polja po komori nasumično izabranim. Procenat MBP pozitivnih ćelija izračunat je kao:

2

[0060] Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM procenta CNPase ili MBP pozitivnih ćelija. Grafici su izrađeni upotrebom GraphPad softvera, verzija 5.00 za Windows (San Diego California SAD). Neparametrijski statistički testovi izvedeni su upotrebom Sigma Stat (Chicago, IL, SAD).

[0061] Sledeći rezultati prikupljeni su tokom tri nezavisne serije eksperimenata, pri čemu je svaka od njih izvedena sa novom fiolicom zamrznutih komercijalnih OPC: OPC ICC 01, OPC ICC 02, i OPC ICC 03.

2.2 Rezultati

2.2.1 Ekspresija TLR4 receptora u humanim OPCin vitro

[0062] TLR4 ekspresija ocenjena je imunofluorescentnim mikroskopom. Faza zasićena izvedena bez bilo kakvog deterdženta omogućava detekciju TLR4 na ćelijskoj površini samo. Eksperiment je potvrdio prisustvo ciljnog receptora MSRV-Env na ćelijskoj površini humanih OPC nakon 24 i 72 sata primarne kulture (nije prikazano).

2.2.2 Ekspresija CNPase i MBP u humanim OPC in vitro

[0063] Morfologija humanih OPC in vitro vizuelizovana je sa mikroskopom svetlog polja. OPC predstavljala je ćelijsko telo i uopšteno dve ćelijske ekstenzije. CNPase i MBP ekspresije potvrđene su imunofluorescentnim mikroskopom nakon 24 sata i 72 sata u kulturi, respektivno (nije prikazano).

2.2.3 Efekti MSRV ENV sa ili bez GNbAC1 na diferencijaciju humanih OPC

Efekat obloženog MSRV-Env na ekspresiju markera sazrevanja u humanim OPC u primarnoj kulturi (OPC ICC 01)

[0064] Ciljevi ovog prvog skupa eksperimenata (OPC ICC 01) bio je da podesi uslove humanih OPC primarih kultura, kao i slajdova labtek komora prethodno obloženih protokolima MSRV-Env i CNPase i MBP immunobojenja.

[0065] Labtek posude za kulturu obložene su sa 1 µg/ml MSRV-Env pre zasejavanja humanih OPC. Kao negativna kontrola (pufer), posude sa kulturama inkubirane su u istim uslovima sa MSRV-Env puferom samo.

[0066] Procenat CNPase pozitivnih ćelija se značajno smanjio od 85 ± 4 % u kontrolnim uslovima (pufer)

2

na 69 ± 6 % u humanim OPC stimulisanim tokom 24 sata u labtek-ovima prethodno obloženim sa MSRV-Env (* p<0,05; t-test) (FIG.9A).

[0067] Nakon 72 sata kulture, procenat MBP pozitivnih ćelija značajno se smanjio od 74 ± 7% u kontrolnim uslovima (pufer) na 25 ± 3% u labtek-ovima prethodno obloženim sa MSRV-Env (+Env-T) (* p<0,001 Mann-Whitney Rank Sum test) (FIG.9B). Ovi rezultati pokazuju da MSRV-Env inhibira sazrevanje humanih OPC u mijelinizirajuće ćelije in vitro.

Efekat GNbAC1 na inhibiciju OPC sazrevanja indukovanog sa MSRV-Env (OPC ICC 02)

[0068] Ciljevi ovog drugog skupa eksperimenata (OPC ICC 02) bili su da se potvrdi MSRV-Env efekat na diferencijaciju humanih OPC, i da se odredi da li MSRV-Env može takođe da inhibira diferencijaciju humanih OPC kada se protein direktno doda u podlogu za ćelijsku kulturu. Dalje, takođe je testirano da li GNbAC1 može da inhibira MSRV-Env efekte u ovom modelu.

[0069] U slučaju stimulacije humanih OPC u labtek-ovima prethodno obloženim sa MSRV-Env, GNbAC1 tretmani su procenjeni u dva različita protokola. Prvo, labtek slajdovi kulture su predinkubirani sa mešavinom MSRV-Env (1 µg/mL) i GNbAC1 (50 nM ili 200 nM) pre zasejavanja OPC (uslov GNbAC1-A). Drugi protokol sastojao se od sekvencijalnog oblaganja sa MSRV-Env (1 µg/mL) praćenim oblaganjem sa GNbAC1 (50 nM ili 200 nM) pre zasejavanja OPC (uslov GNbAC1-B).

Efekti MSRV-Env i GNbAC1 na CNPase ekspresiju u humanim OPC

[0070] Nakon 24 sata stimulacije, značajno smanjenje procenta CNPase pozitivnih ćelija od 75 ± 2 % u kontrolnim uslovima (pufer) do 55 ± 2 % primećeno je u labtek-ovima prethodno obloženim sa 1 µg/ml MSRV-Env (*p<0,001 vs pufer; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testovima).

Štaviše, stimulacija u labtek-ovima prethodno obloženim sa 1 µg/ml BSA nije imala efekat na CNPase ekspresiju (71 ± 2 %), pokazujući da je efekat primećen sa MSRV-Env specifičan budući da nije primećen sa kontrolnim proteinom (FIG.10A).

[0071] GNbAC1 značajno inhibira smanjenje CNPase pozitivnih ćelija indukovano u labtek-ovima prethodno obloženim sa MSRV-Env (FIG.10A). Efekat GNbAC1 je primećen pri 50 nM i 200 nM, i u dva testirana protokola tretiranja: (i) uslov GNbAC1-A, 50 nM (69 ± 4 %), 200 nM (80 ± 2 %); (ii) uslov GNbAC1-B 50 nM (96 ± 3 %) i 200 nM (76 ± 4 %) (Ψp<0,001,Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc analizama). Dalje, igleda da je efekat GNbAC1 zavisan od koncentracije (FIG.10A).

[0072] Dodatni kontrolni eksperimenti pokazali su da humane OPC stimulisane tokom 24 sata u labtek-

2

ovima prethodno obloženim sa GNbAC1 samo (50 nM ili 200 nM), ili sa mešavinom GNbAC1 (50 nM ili 200 nM) BSA (1µg/ml) nisu imale efekat na ekspresiju CNPase kada se uporedi sa kontrolnim uslovom (pufer) (p > 0,05; Jednosmerna ANOVA) (FIG.10B). Ova opažanja izvedena su sa dva protokola tretiranja GNbAC1 prethodno opisana (GNbAC1-A 50 nM, GNbAC1 A 200 nM i GNbAC1-B 50 nM).

[0073] Ovaj eksperiment takođe demonstrira da čak niske koncentracije MSRV-Env u rastvoru indukuju značajno smanjenje procenta CNPase pozitivnih ćelija nakon 24 sata, od 78 ± 2 % u kontrolnom uslovu (pufer) do 57 ± 2 % u MSRV-Env grupi (*p<0,001 vs pufer; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testovima) (FIG.11). Dalje, GNbAC1 (200 nM) tretman potpuno antagonizuje smanjenje CNPase ekspresije indukovane MSRV-Env (76 ± 2 %; Ψp<0,001 vs Env-T; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc analizama). Interesantno je da se primećuje da 200 nM GNbAC1 sam (74 ± 2 %) nema efekat na CNPase ekspresiju u poređenju sa kontrolnim uslovom (pufer) (FIG.11).

Efekti MSRV-Env i GNbAC1 na MBP ekspresiju u humanim OPC

[0074] Nakon 72 sata stimulacije, značajno smanjenje procenta MBP pozitivnih ćelija od 76 ± 2 % u kontrolama (pufer) do 57 ± 1 % primećeno je u labtek-ovima prethodno obloženim sa 1 µg/ml MSRV-Env (**p<0,001 vs pufer; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testovima) (FIG.12A). U ovom eksperimentu, OPC kultura u labtek-ovima prethodno obloženim sa BSA (1 µg/ml) pokazuje procenat MBP pozitivnih ćelija malo drugačiji od kontrole (pufer) (69 ± 2 %). Međutim, BSA efekat je takođe značajno drugačiji od MSRV-Env efekta (p<0,001 vs Env-T; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testom), i, tako, otkriva da je izolovan i efekat bez uticaja u ovim eksperimentalnim serijama samo, budući da nije primećen u ostalim eksperimentima ili sa CNPase u istim serijama.

[0075] GNbAC1 značajno inhibira smanjenje MBP pozitivnih ćelija indukovanih u labtek-ovima prethodno obloženim sa MSRV-Env (FIG.12A). Delimični efekat GNbAC1 viđen je pri 50 nM, i potpuna inhibicija postiže se pri 200 nM, i u oba testirana protokola tretiranja: (i) GNbAC1-A 50 nM (69 ± 2 %) i 200 nM (73 ± 2 %) i, (ii) GNbAC1-B 50 nM (68 ± 2 %) i 200 nM (74 ± 2 %) (Ψp<0,001 vs Env-T;

Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testovima). Dalje, izgleda da je efekat GNbAC1 zavisan od koncentracije (FIG.12A).

[0076] Ovaj eksperiment takođe demonstrira značajno smanjenje procenta MBP pozitivnih ćelija od 76 ± 2 % u kontrolnom uslovu (pufer) do 55 ± 2 % u ćelijama stimulisanim sa MSRV-Env dodatim u podlogu za kulturu (3 nM) tokom 72 sata (*p<0,001 vs pufer; Jednosmerna ANOVA pranćena je Fišerovim LSD posthoc testovima) (FIG.12B). Štaviše, GNbAC1 tretiranje (GNbAC1200 nM) potpuno inhibira smanjenje MBP ekspresije indukovane sa MSRV-Env (76 ± 2 %; Ψp<0,001 vs Env-T; Jednosmerna ANOVA praćena Fišerovim LSD post-hoc testovima) (FIG.12B).

Potvrda GNbAC1 efekata na inhibiciju OPC diferencijacije indukovane sa MSRV-Env (OPC ICC 03)

[0077] Iako rezultati opisani gore proizilaze iz znatne količine prikupljenih podataka, cilj ovog trećeg skupa eksperimenata (OPC ICC 03) bila je puna replikacija GNbAC1 efekta u potpuno nezavisnim serijama eksperimenata.

Efekti MSRV-Env i GNbAC1 na CNPase i MBP ekspresije u humanim OPC kulturama

[0078] Nakon 24 sata stimulacije, značajno smanjenje procenta CNPase pozitivnih ćelija od 90 ± 1 % u kontrolnom uslovu (pufer) do 71 ± 1 % primećen je u labtek-ovima prethodno obloženim sa MSRV-Env (1 µg/ml) (*p<0,05 ; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Studentovim Newman Keuls posthoc testom) (FIG.13A). Kao što je prethodno opisano, GNbAC1 (200 nM) potpuno preokreće inhibiciju CNPase ekspresije indukovane sa MSRV-Env u dva testirana protokola GNbAC1 tretiranja (GNbAC1-A: 90 ± 2 %, GNbAC1-B: 91 ± 4 %) (Ψp<0,05 vs Env-T; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Dunn post-hoc testom) (FIG.13A).

[0079] Nakon 72 sata stimulacije, značajno smanjenje procenta MBP pozitivnih ćelija od 78 ± 2 % u kontrolnom uslovu (pufer) do 55 ± 3 % je primećeno u labtek-ovima prethodno obloženim sa MSRV-Env (1 µg/ml) tokom 72 sata (*p<0,05 vs pufer; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Dunn posthoc testom) (FIG.13B). Kao što je prethodno opisano, GNbAC1 (200 nM) potpuno preokreće inhibiciju MBP ekspresije indukovane sa MSRV-Env u dva testirana protokola GNbAC1 tretiranja (GNbAC1-A: 80 ± 2 %, GNbAC1-B: 75 ± 2 %) (Ψp<0,05 vs Env-T; Kruskal-Wallis ANOVA-1 sa rangovima praćena Dunn posthoc testom) (FIG.13B).

Zbirni podaci iz eksperimenata OPC ICC 02 i OPC ICC 03

[0080] Rezultati dobijeni u dve različite serije eksperimenata (OPCICC02 i OPCICC03) predstavljene gore, bili su zbirni u istom testu. Tako, podaci uneti na FIG.14 predstavljaju 8 do 14 nezavisnin eksperimenata za CNPase (FIG.14A) i MBP (FIG.14B). Ovaj test pokazuje da su MSRV-Env i GNbAC1 efekti na diferencijaciju humanih OPC veoma izvodljivi i dosledni.

[0081] Kako bi se normalizovala ekspresija podataka, kontrolni uslov (pufer) korišćen je kao referenca i uzet je u obzir kao 100 %. U suštini, ovi rezultati prikazuju da koncentracije MSRV-Env korišćene u ovim serijama inhibiraju za 24 % broj CNPase pozitivnih ćelija (CTRL: 100 ± 1 %; ENV: 76 ± 1 %) i za 27% broj MBP pozitivnih ćelija (CTRL: 100 ± 2 %; ENV: 73 ± 2 %). GNbAC1 (200 nM) potpuno preokreće efekat

1

MSRV-Env na CNPase ekspresiju (GNbAC1-A: 102 ± 1 %; GNbAC1-B 101 ± 1 %) (FIG.15A), ali takođe efekat na MBP ekspresiju (GNbAC1-A: 101 ± 2 %; GNbAC1-B 97 ± 2 %) (FIG.15B).

2.3 Analiza rezultata

[0082] Posledično, podaci iz ovog primera prikazuju da MSRV Env indukuje robustan i visoko izvodljivo smanjenje u ekspresiji dva različita specifična markera sazrevanja oligodendrocita. Tako, MSRV Env inhibira diferencijaciju prekursora humanih oligodendrocita u mijelinizirajućim ćelijama. Dalje, jasno je demonstrirano ovde da GNbAC1 potpuno preokreće ovaj štetan MSRV Env efekat, i obnavlja normalne nivoe CNPase i MBP u ovom modelu. Ovi rezultati prikazuju da GNbAC1 tretira blokadu diferencijacije OPC indukovanih HERV-W/MSRV-Env. Prema tome, ovi rezultati snažno podržavaju inovativnu indikaciju GNbAC1 za tretiranje demijelizovanih lezija indukovanih HERV-W proteinima omotača. Ovo se posebno odnosi na progresivne oblike multiple skleroze za koje je remijelinizacija kritična ali se ne javlja od OPC koje okružuju MS lezije, zbog postojanosti Env-pozitivnih ćelija i izlučivanja kao što je prikazano u primeru 1.

Primer 3: Ispitivanje terapeutskih efekata GNbAC1 antitela, L-NAME, SMT, DMF ili natrijum fumarata u mišjem modelu eksperimentalnog alergijskog encefalomijelitisa (EAE) indukovanog sa mijelinskim oligodendrocitnim glikoproteinom (MOG) i MSRV/HERV-W proteinom omotača (Env).

3.A Poređenje između pojedinačnih molekula (monoterapija) i povezanosti anti-Env antitela sa malim molekulima koji inhibiraju Env-indukovane efektore u OPC blokadi (kombinovana terapija).

3.A.1. Materijal

[0083] C57BL/6 miševi iz Charles River.

MOG 35-55 EspiKem,Srl (Polypeptide company); referenca: SC1272.

GNbAc1; šarža T950111-8 (Anti MSRV/HERV-W humanizovano IgG4 antitelo koje obuhvata svaki od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) navedenih u SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3 SEQ ID No.4, SEQ ID No.5 i SEQ ID No.6.

L-NAME (NG-Nitro-L-Arginin Metil Estar) Sigma; referenca: N5751-5G šarža BCBF4375V

SMT (S) Mehtilizotiourea hemisulfat (Sigma); referenca: M84445-100G šarža STBC1003V

Dimetil fumarat (DMF) Sigma; referenca: 242926-100G šarža 2507VBCBH

Methocel MC Sigma; referenca: 64605-100G šarža BCBD9989V

IFA (Sigma) Sigma referenca: F5506-10ML šarža:061M8728

PTX (Pertuzijski toksin; Calbiochem) ; Referenca: 516561 šarža D00128881

PBS (Slani rastvor fosfatnog pufera; Lonza); Referenca 516561; šarža; D00128881

Env (P'X Therapeutics); Proizvodnja šarži prečišćenog proteina potvrđenog kao bez endotoksina (LDL

2

test< 5UI/ml) i bioaktivan (Geneuro internal QC tests).

Rotarod uređaj (LE8200; Bioseb France)

3.A.2. Postupci

[0084] Ženke C57BL/6 miševa bez patogena (6 - 8 nedelja stare) nabavljene su od Charles River laboratories i čuvane u objektima za životinje tokom jedne nedelje pre imunizacije. Jedan dan pre imunizacije, svi miševi su izmereni, i onda ocenjeni na Rotarod Testu. Rotarod:

Dani treninga: 9 i 8 dana pre imunizacije. Prenos miševa, u njihovim kavezima, iz prostora za držanje u eksperimentalni prostor. Miševi su naviknuti na eksperimentalni prostor za 15 min. Tokom perioda treninga, svaki miš stavljen je na rotarod sa konstantnom brzinom (4 o/min), a ako bi neki miš pao, on je vraćen na rotarod, kada je miševima bilo udobno na rotarod-u, miševi su trčali tokom 120 s. Svi miševi su vraćeni u njihove kaveze, brzina je povećana na 13 o/min i miševi su ponovo stavljeni na rotarod tokom 120 s. Svi miševi su vraćeni u njihove kaveze, brzina povećana na 19 o/min i miševi su ponovo stavljeni na rotarod tokom 120 s. Sredina eksperimentalnog prostora bila je konstantna između testnih sesija u odnosu na temperaturu, i intenzitet svetlosti.

Dani testiranja:

[0085] 1 dan pre svake imunizacije, miševi su preneti u njihovim kavezima, iz prostora gde se drže u eksperimentalni prostor. Miševi su naviknuti na eksperimentalni prostor za 15 min. Miševi su potom podvrgnuti dvema probama pri 10 rastućih nivoa brzine, u rangu od 7 do 40 o/min. Pojedinačna kašnjenja pre pada sa rotaroda (za dve probe na svakom nivou brzine) zabeležena su do 60s. Tako, trening i performanca na sistemu Rotarod određeni su za svaku životinju.

[0086] Rezultati ROTAROD testa su izraženi kao kinetika srednje vrednosti pojedinačnih ocena za svaku grupu sa SEM označenim sa stubićima, za svaki dan testa i za svaku brzinu testa unutar diskriminativnog ranga za neuromotorno oštećenje u ovim uslovima (16 do 29 o/min).

[0087] Izračunati su za svakog pojedinačnog miša, za svaki dan testa i za svaku vrednost brzine, kao relativan dobitak ili gubitak vremena na Rotarod-u (pre pada), u poređenju sa prvim danom testa pri istoj brzini (D-7, pre početka indukcije bolesti u relevantnim grupama). Vrednost je izračunata kao "Vreme na Rotarod-u u danuX" - "Vreme u Danu-7 za istog miša pri istoj brzini". Slike ilustruju kinetiku za različite grupe tokom celog perioda ispitivanja, za reprezentativne diskriminativne vrednosti brzine kada se potvrdi da se razlikuju bolesne od zdravih životinja u ovim uslovima (npr., suviše visoke ili suviše niske vrednosti brzine koje su ili dovele do toga da zdravi odmah padnu ili da bolesni mogu da održe sporo kretanje).

[0088] Početni podaci masa i performansi služili su kao reference, u okolnosti gde je svaka životinja bila sopstvena kontrola, pre nego što su izračunate srednje vrednosti i standardne devijacije po grupi. Različite grupe životinja smeštene su homogeno u svaki kavez, prema odgovarajućoj informaciji obezbeđenoj pre svake od eksperimentalnih serija.

Klinička procena

[0089] Životinje su merene i klinički ocenjene 5 dana u nedelji prema sledećim kriterijumima: 0 = bez znakova; 1 = paraliza repa ili hiper-refleks zadnjem(ih) ekstremiteta ili unilateralna slabost zadnjih ekstremiteta; 2 = bilateralna slabost zadnjih ekstremiteta ili prednjih ekstremiteta; 3 = plus unilateralna paraliza ili glavni deficit; 4 = potpuna paralaza zadnjih ekstremiteta ili prednjih ekstremiteta; 5 = plus delimična paraliza ili glavni deficit suprotnih ekstremiteta; 6 = na samrti ili smrt. Oni su prilagođeni iz standardnih kriterijumima, kako bi se reflektovala brža indukcija lezija mozga i cervikalne kičmene moždine sa ovim modelom.

[0090] Miševi su mereni 3 puta nedeljno ponedeljkom, sredom i petkom tokom celog eksperimenta.

[0091] Za eksperimentalne serije primera 3.A, grupe su definisane kao što sledi.

[0092] Sve grupe od 6 (šest) miševa prvo su injektirane s.c. u vrat dana 0 zatim u dorzalne bokove dana 7 i 14; sa 200 µg MOG/miš 60 µg MSRV-Env IFA.

[0093] Grupa A je bila pozitivna kontrolna grupa EAE indukovanog sa MSRV-Env bez bilo kakvog tretiranja.

[0094] Za grupe G do H, tretiranja sa GNbAc1, L-NAME, SMT i DMF samo ili zajedno sa GNbAc1 sa dozama naznačenim dole, su pokrenuta na dan 12 nakon imunizacije kada je progresija EAE kliničkih simptoma već primećena. GNbAc1 humanizovano antitelo dato je jednom, ali L-Name ili SMT su davani svaka 4 dana do završetka ispitivanja na dan 29. Što se tiče grupa E i H, pripisane za tretiranje sa DMF, prethodno je određena zapremina svakodnevnog konzumiranja vode za svakog miša i demonstrirano je da je (u ovim uslovima) svaki miš konzumirao oko 3,5 ml pijaće vode dnevno. Tako, na osnovu ovog merenja, doza od 1mg DMF+ 0,08% Methocel po mišu dodavana je u 3,5 ml pijaće vode svakodnevno.

[0095] 350 ng pertuzijskog toksina (PTX) po životinji je injektirana (i.p.) u sve grupe istog dana nakon

4

svake imunogene injekcije, i ponovljena je 2 dana posle, kao što je uobičajeno u EAE protokolima kako bi se olakšala migracija limfocita kroz krvno-moždanu barijeru.

Sažeti prikaz eksperimentalnih grupa Primera 3.A

[0096]

3.A.3 Rezultati:

Klinička zapažanja:

[0097] Klinička ocena znakova i masa su ocenji regularno kao što je opisano gore. Kinetika EAE ocena tokom perioda ispitivanja predstavljena je na FIG.16, 17 i 18.

[0098] Regularna i istrajna evolucija EAE kliničkih ocena kao što je hiper-refleksija, paraliza repa, slabost zadnjih ekstremiteta, prednjih ekstremiteta i delimična paraliza mogu da budu zabeleženi u svim miševima do kraja iskustva u grupi A (EAE pozitivna kontrola) i do dana 12 u ostalim grupama koje su tretirane dana 12 sa GNbAc1 humanizovanim antitelom (grupa B) ili anti slobodnim radikalima (grupa C, D, E) samo ili grupama koje su istovremeno tretirane sa GNbAc1 i anti slobodnim radikalima (grupe F, G, H).

[0099] Zapažanja nakon tretiranja: Klinički znaci u grupi B tretirani samo 1 put sa GNbAc1 umanjeni blago do dana 29. U grupama tretiranim samo sa L-NAME, SMT, može da se primeti nepravilan oporavak, ali sa smanjenjem EAE progresije. Treba napomenuti da, na dan+16, injekcija SMT je prekinuta.

[0100] Što se tiče grupa F, G i H tretiranih istovremeno sa GNbAc1 i L-NAME, SMT i DMF respektivno, oporavak je bio mnogo više značajan, a naročito u grupama G i H. Ovi rezultati ukazuju da sinergistički efekti značajno ubrzavaju i poveđavaju oporavak EAE simptoma. Takođe treba napomenuti da tretiranje sa ovim supstancama nije izazvalo bilo kakvu abnormalnost u bilo kojoj grupi (uključujući kontrolne miševe testirane odvojeno).

[0101] Prema rezultatima prikazanim na FIG.16, 17 i 18, može da se sumira da:

- najveća klinička ocena (najgola evolucija bolesti) dokazana je kod netretiranih životinja (grupa A). Životinje tretirane sa GNbAC1 samo (grupa B) poboljšale su se nakon injekcije (počevši od dana 12).

- grupe tretirane sa L-Name ili SMT samo imale su niže ocene oporavka i kinetiku u odnosu na grupu B.

- grupa E tretirana sa DMF i grupa F tretirana sa GNbAC1 antitelom (200µg jedna doza) kombinovano sa L-NAME imale su ekvivalentan oporavak na kraju ispitivanja.

- grupa G tretirana sa GNbAC1 antitelom kombinovano sa SMT i grupa H tretirana sa GNbAC1 antitelom kombinovano sa DMF imale su značajno bolji oporavak na kraju ispitivanja i raniju kinetiku kliničkog poboljšanja u odnosu na sve ostale grupe. Ovo pokazuje sinergističku dobit od kombinovanja GNbAC1 i SMT, ili GNbAC1 i DMF, za značajno poboljšan terapeutski ishod.

Testiranje na Rotarod-u

[0102] Prvo bi trebalo da bude izričito navedeno da grupe obeležene "1 inj" i "2 inj" na FIG.19 odgovaraju kontrolnim životinjama injektiranim samo jednom (1) ili dvaput (2) sa Env proteinom i MOG antigenom, u poređenju sa tri injekcije Env proteina i MOG antigena potrebne da se indukuje klinički očigledan EAE kao u svim ostalim grupama. One predstavljaju kontrolne miševe izložene Env ispod patogenog praga i bez klinički indukovane bolesti. One potvrđuju da, kako bi se sve životinje testirale sa različitim tretiranjima indukovanim da se razvije akutna i ozbiljna EAE simptomatologija i evolucija, ovaj obrazac sa tri injekcije potreban. Prema tome, terapeutski efekti primećeni kod tretiranih životinja su relevantni za efikasnost tretiranja u toku i progresiji stanja bolesti.

[0103] Prema rezultatima predstavljenim na FIG.19 sa ocenjivanjem na Rotarod-u pri 23 o/min, može se videti da:

- Fizički napor pri 23 o/min dostigao je dovoljan prag da se razjasne glavne senzorne i motorne disfunkcije kod životinja: netretirana A grupa ima najgori ishod i kinetiku, dok životinje injektrane samo jednom ili dvaput ("1 inj ili 2inj") imaju značajno blaže simptome i mnogo bolju evoluciju. Pežorativni i progresivni klinički deficit netretirane grupe B potvrđuje da su bolest i odgovarajuće NS lezije bile veoma aktivne sa 3 injekcije Env. Prema tome sve ostale grupe sa različitim tretiranjima podvrgnute su sličnoj jakoj indukciji bolesti sa Env.

- Grupa B sa EAE tretirana jednom injekcijom od 200µg GNbAC1 oporavila je ocenu sličnu kontolnim miševima bez indukcije bolesti sa malim izlaganjem Env, na kraju perioda ispitivanja. - Najznačajniji efekat, pod ovim uslovima, dokazan je za grupu G tretiranu sa GNbAC1 antitelom kombinovano sa SMT za koju se čini da ima upečatljivu krivu kinetike oporavka koja se završava sa najboljom ocenom svih grupa na kraju ispitivanja. Ovo pokazuje sinergističku dobit od kombinovanja GNbAC1 i SMT za značajno poboljšan terapeutski ishod.

- Grupa D tretirana sa SMT samo takođe ima poboljšanu kinetiku i ishod (poslednja tačka perioda ispitivanja), mada u manjoj meri.

[0104] Prema rezultatima predstavljenim na FIG.20 sa ocenjivanjem na Rotarod-u sa 26 o/min, može se videti da:

- Fizički napor pri 26 o/min potvrđuje da su ovi uslovi iznad praga potrebnog u okviru ovog eksperimenta za rasplet glavnih senzornih i motornih disfunkcija kod životinja: netretirana A grupa ima najgori ishod i kinetiku, dok životinje injektirane samo jednom ili dvaput ("1 inj ili 2inj") imaju značajno blaže simptome i bolju evoluciju (veoma dobre ocene na kraju perioda ispitivanja za "1 inj" grupu).

- Grupa B sa EAE tretirana jednom injekcijom od 200µg GNbAC1 je dobila rezultat sličan D,G,C,E i H grupama i "2inj" kontrolama, na kraju perioda ispitivanja.

- Najznačajniji efekat, pod ovim uslovima, dokazan je za grupu F tretiranu sa GNbAC1 antitelom kombinovano sa L-NAME za koju se čini da ima dobru krivu kinetike oporavka koja se završava sa najboljom ocenom od svih grupa na kraju ispitivanja. Grupa C tretiran sa L-NAME samo takođe ima poboljšanu kinetiku i ishod, iako u manjoj meri. Ovo pokazuje sinergističku dobit od kombinovanja GNbAC1 i L-NAME za značajno poboljšan terapeutski ishod.

[0105] Prema rezultatima predstavljenim na FIG.21 sa ocenjivanjem na Rotarod-u sa 29 o/min, može se videti da:

● Fizički napor pri 29 o/min i dalje potvrđuje da su ovi uslovi iznad praga potrebnog za rasplet glavnih senzornih i motornih disfunkcija kod životinja: netretirana A grupa ima najgori ishod i kinetiku, dok životinje injektirane samo jednom ili dvaput ("1 inj ili 2inj") imaju značajno blaže simptome i bolju evoluciju sa sličnim dobrim ocenama na kraju ispitivanja.

● Grupa B sa EAE tretirana jednom injekcijom od 200µg GNbAC1 je dobila rezultat sličan kontrolnim miševima bez indukcije bolesti malim izlaganjem sa Env, na kraju perioda ispitivanja. ● Najznačajniji efekat, pod ovim uslovima, dokazan je za grupu F tretiranu sa GNbAC1 antitelom kombinovano sa L-NAME za koju se i dalje čini da ima dobru krivu kinetike oporavka koja se završava sa najboljom ocenom od svih grupa (kraj ispitivanja). Grupa C tretiran sa L-NAME samo ima poboljšanu kinetiku i ishod, iako u manjoj meri.

● Još jedan opšte vredan rezultat je redovno poboljšanje miševa iz B grupe tretirane sa GNbAC1 samo, koji je uvek pokazivao u velikoj meri stabilizovane i/ili poboljšane ocene u poređenju sa netretiranim životinjama (grupa A) u svim uslovima (testovi sa 16 do 29 o/min).

[0106] Pored toga, ova otkrivena očigledna efikasnost u velikoj meri naglašena je kombinacijom GNbAc1 sa L-NAME ili SMT. Takođe je poboljšana kombinacijom sa DMF, ali sa sporijom kinetikom. Bilo kako, ovo ne isključuje bolje poboljšanje sa optimizovanim dozama i dugoročnim tretiranjem.

[0107] Tako, u svim uslovima testiranja (uključujući kliničko ocenjivanje) kombinacija SMT, L-NAME ili DMF sa GNbAC1 obezbedila je značajnu prednost za klinički i funkcionalni oporavak, u odnosu na upotrebu bilo kog terapeutskog molekula datog samog. Kada se uzmu sami, izgleda da molekuli imaju manje i prilično prolazne efekte, dok GNbAC1 ima dugotrajne efekte koji daju najbolji oporavak na kraju ispitivanja u poređenju sa ovim malim lekovima, čime je pokazana produžena efikasnost.

[0108] Kinetika i amplituda krajnjeg oporavka značajno su poboljšani sa kombinacijama, pri čemu je prednost upotrebe kombinacije ovih terapeutskih agenasa za njihove sinergističke i ciljane efekte na funkcionalni oporavak sada prikazana in vivo. Ovo demonstrira indikaciju za raniju i moćniju kliničku efikasnost kod humane bolesti.

3.B. Poređenje terapeutske efikasnosti dve doze anti-Env antitela koja su data sama kao monoterapija, ili u kombinaciji sa anti-NO lekovima.

3.B.1 Materijali i postupci:

[0109] Kada nije naznačeno, svi materijali i postupci bili su kao što je opisano za primer 3A.

Eksperimentalne grupe

[0110]

Sumrani prikaz eksperimentalnih grupa Primera 3.B

[0111] Svi miševi su primili tri injekcije s.c. na vratu u D0, u dorzalni bok u D7 i D14. Ovde, miševi iz Grupe A injektirani su sa 200µg/miš MOG i IFA samo, bez Env, što predstavlja negativnu kontrolnu grupu bez EAE u predstavljenim serijama (ctrl -). Pozitivna kontrolna grupa sa netretiranim EAE u ovim serijama predstavljena je kao Grupa B (ctrl ). Ostale grupe injektirane su sa 200 µg MOG/miš MSRV-ENV (60 µg) IFA, sa tretiranjima kao što je naznačeno u gore sumiranom prikazu. Tretiranja su započeta dana 12 nakon imunizacije u odgovarajućim grupama.

[0112] Grupe C, E, G primile su 200 µg GnbAc1 u J12; Grupe D, F, H primile su 500 µg GnbAc1 u J12; Grupa B primila je samo GNbAc1 puferski rastvor.

[0113] Grupe E i F primile su I.P. injekciju SMT (200 mg/miš) dvaput nedeljno u J12, J14, J19, J21, J26 i J28.

[0114] Za grupe G i H koje su primile DMF, prethodno je određena zapremina svakodnevnog konzumiranja vode za svakog miša i otkriveno je da je (u tim uslovima), svaki miš konzumirao oko 3,5 ml pijaće vode dnevno. Tako, na osnovu ovog merenja, doza od 2 mg DMF+ 0,08% Methocel po mišu dodavana je u 3,5 ml pijaće vode svakodnevno.

[0115] Za svaku ispitivanu brzinu rotarod-a, rezultati su validirani kada su krive koje odgovaraju netretiranim miševima sa Env-indukovanim EAE (Grupa B, koja predstavlja pozitivne kontrole sa netretiranim EAE) pokazale značajan deficit u poređenju sa lažnim-kontrolama (Grupa A, imunizirana sa MOG razblaženim u IFA bez Env proteina). Rezultati se smatraju kao "ne mogu se interpretirati" kad god se takav kriterijum nije podudarao, kao odgovarajući tehnički i eksperimentalni uslovi, zbog toga, nisu prošli kontrolu kvaliteta koja se bazira na ovoj značajnoj razlici krivih od "pozitivnih versus negativne EAE" grupa.

[0116] Nakon dana 20, intravenozna (I.V.) injekcija sa 20µg MSRV-Env u fiziološkom slanom rastvoru napravljen je da stvori sistemski akutni čelendž MSRV-Env proteinom kod svih miševa, kada je značajno kliničko poboljšanje (poput remisije) dobijeno sa većinom tretmana kod EAE miševa. Ovo je izvedeno na dan D21, za miševe iz grupa B, D, F i H, ili na dan D22, za miševe iz grupa A,C,E i G. Ovo je izvedeno kako bi se ispitao odgovor različitih grupa na akutnu Env antigenemiju i da bi se procenile eventualne razlike u protektivnoj efikasnosti različitih tretmana.

3.B.2 Rezultati:

Klinička zapažanja

[0117] Klinička ocena znakova i masa ocenjeni su regularno kako je opisano gore. EAE kinetika kliničkih ocena tokom perioda ispitivanja prikazana je na FIG.22, 23 i 24. Krive mase, koje naznačavaju relativni dobitak mase u poređenju sa danom nakon prve injekcije imunogena, prikazane su na FIG.25, 26 i 27.

Testiranje Rotarod-a

[0118] Rezultati iz testova na Rotarod-u prikazani su za različite brzine (16; 26; 29 o/min) na FIG.28, 29 i 30.

[0119] Ove serije eksperimenata upućuju na uticaj srednjeg (200µg) versus visoko (500µg) terapeutsko GNbAC1 antitelo kao monoterapija i pravi slična poređenja kada se kombinuje sa SMT i DMF.

4

[0120] Opšte poređenje krivih kliničkih ocena tokom perioda ispitivanja validirano je budući da (i) netretiran Env-indukovan EAE (grupa B) ima najgoru evoluciju i (ii) lažno-imunizovane kontrole bez EAE (grupa A) nemaju detektabilne kliničke znake tokom perioda koji prethodi intravenoznoj injekciji (I.V.) Env na dan 20.

[0121] Do ove iv injekcije na dan 20, sve tretirane grupe značajno i izrazito su se razlikovale od netretirane Env-indukovane EAE. Dana 20, tretirane grupe sa različitom kinetikom bolesti tokom perioda ispitivanja imale su uporedivu ocenu sa srednjom vrednosti ispod 0,5, što ukazuje na period remisije kod svih tretiranih grupa. Ovo je potvrdilo efikasnost svih doza antitela i svih kombinacija ili sa DMF ili sa SMT. Nakon toga, čelendž sa intravenoznom (iv) injekcijom Env proteina dana 20, oponašao je pik Env ekspresije i njegovo oslobađanje u krvotok, kao što je očekivano tokom inicijacije novog i ozbiljnog recidiva bolesti koja se prirodno javila. Kao što je prikazano na FIG.22, 23 i 24, otkrivene su značajne razlike u terapeutskoj potentnosti različitih proizvoda i doza:

1) GNbAC1 pokazao se veoma efikasnim u davanju otpornosti na ovaj pik Env antigenemije pri dozi od 500µg (grupa D), ali prolazno kliničko pogoršanje primećeno je sa dozom od 200 µg (grupa C).

2) U slučaju kombinacije sa SMT, beznačajne varijacije kliničke ocene primećene su za obe GNbAC1 doze (grupe E iF). SMT tako je dodelio poveđanu otpornost na IV MSRV-Env čelendž miševima tretiranim sa najmanjom GNbAC1 dozom (200µg) u poređenju sa miševima tretiranim sa antitelom samo u ovoj manjoj dozi (Grupa C).

3) Miševi tretirani sa DMF pokazali su kliničku otpornost na ovaj pik antigenemije kada su takođe tretirani sa višom GNbAC1 dozom (grupa H), ali nije uspelo da se spreči kliničko pogoršanje u manjoj dozi (grupa G). DMF, prema tome, nije dodelio povećanu otpornost na IV MSRV-Env čelendž miševima tretiranim sa najmanjom GNbAC1 dozom (200µg). Miševi tretirani sa DMF i višom GNbAC1 dozom (500µg, u Grupi H) imali su uporedivu otpornost sa miševima tretiranim sa GNbAC1 samo u istoj dozi (Grupa D).

4) Krive koje označavaju dobitak mase tokom perioda ispitivanja u svim grupama iznenađujuće pokazuju da je grupa D, tretiranu sa GNbAC1 od 500µg, imala najbolju krajnju tačku.

5) GNbAC1 od 200µg (grupa C) ili DMF sa GNbAC1 u višoj dozi samo (grupa H), dali su krajnje tačke ekvivalentne sa lažno-kontrolama.

[0122] Ovo pokazuje da, izvan relativne efikasnosti različitih tretmana prikazanih sa kinetikom kliničkih ocena:

- GNbAC1 antitelo samo u višoj dozi (500µg) pokazalo je najbolju kinetičku efikasnost. Takođe je imalo pozitivan efekat na opšte zdravlje životinja kao što je otkriveno kinetikom dobitka mase. - Kada se poredi sa GNbAC1 u nižoj dozi (200µg), otkrilo se da SMT daje značajno povećanu efikasnost tretmanu, sa potpunom rezistencijom na krajnji MSRV-Env IV čelendž.

[0123] Ovo ukazuje da GNbAC1 otkriva najsnažniji tretman, jer obezbeđuje najbolje rezultate sa višom dozom (500µg) ali da, u nižoj dozi (200µg), da se snažno pojačava kombinacijom sa SMT koji efikasno sprečava kliničko pogoršanje nakon pika Env antigenemije nastalo iv injekcijom na kraju ispitivanja.

[0124] Štaviše, ovi rezultati takođe ukazuju da će veće doze GNbAC1, sam ili u kombinaciji sa predstavljenom dozom DMF, dati značajnu dobit u terapeutskoj efikasnosti na opšte zdravlje (prema krivima dobitka mase).

[0125] Pored toga, eventualna sinergija SMT ili DMF sa GNbAC1 u većoj dozi, ako postoji, ne može se videti budući da antitelo samo već obezbeđuje maksimalnu terapeutsku efikasnost u predstavljenim uslovima indukcije i aktivnosti bolesti kod EAE miševa.

[0126] Paralelno, testovi na Rotarod-u objektivno potvrđuju, pri svim relevantnim brzinama (FIG.28A, 29A i 30A), da je viša doza GNbAC1 (500µg/miš) značajno najefikasniji proizvod (dat sam) u poboljšanju neurološkog deficita tretiranih miševa sa Env-indukovanim EAE.

[0127] Testiranje na Rotarod-u takođe potvrđuje sinergističke efekte SMT sa GNbAC1, dok pokazuje neurološko poboljšanje životinja tretiranih sa nižom dozom GNbAC1 kombinovano sa SMT što pokazuje značajno neuromotorno poboljšanje pri 26 i 29 o/min (FIG.29B i 30B). Pri 16 O/MIN (FIG.28B), izgleda da manja brzina ne obezbeđuje značajnu diskriminantnu potentnost za dokazivanje ove kliničke dobiti tokom perioda ispitivanja.

[0128] Konačno, rezultati Rotarod-a pokazuju poboljšanje kod miševa sa Env-indukovanim EAE sa DMF pri obe GNbAC1 doze, ali ovo postale jasno značajno pri 29 o/min samo (FIG.30C).

[0129] Posledično, uzimajući u obzir rezultate ovog objektivnog i automatizovanog testa kojim se procenjuje neurološka performansa životinja, očigledno je da je GNbAC1 robusni tretman kada se daje na monoterapijskoj osnovi kao sada, u primeru 3.B. Sinergistički efekti sa anti-NO molekulima, kao što se vidi sa GNbAC1 u manjoj dozi sa SMT, takođe se jasno vide i ukazuju na snažnu terapeutsku dobit. Ovo mora da postoji sa raznim dozama GNbAC1, ali se ne može videti u ovim uslovima sa već maksimalnim efektima 500µg GNbAC1.

3.C. Poređenje između anti-Env antitela ili natrijum fumarata samo (monoterapija), i anti-Env antitela sa natrijum fumaratom (kombinovana terapija).

3.C.1 Materijal i postupci

Materijal

[0130]

Eksperimentalne grupe

[0131]

4

3.C.2 Rezultati:

Klinička zapažanja:

[0132] Klinička ocena znakova i masa procenjeni su regularno kao što je opisano gore. Kinetike EAE ocena tokom perioda ispitivanja predstavljene su na FIG.31.

[0133] Grupa A koja predstavlja negativne kontrole injektirane sa IFA, MOG bez Env proteina i placebo injekcijom antitela koji se sastoji od njegovih pufera razblaživača, nikada nije pokazala značajne kliničke simptome tokom perioda ispitivanja.

[0134] Evolucija EAE kliničkih ocena može da se evidentira do dana 12 u grupama koje su tretirane dana 12 sa GNbAc1 humanizovanim antitelom (grupa C) ili sa natrijum fumaratom, DMF-povezani anti slobodni azotmonoksidni radikali (anti-NO), samo u grupi D ili istovremeno sa GNbAc1 u grupi E.

[0135] Ovde je zanimljivo da su samo grupe koje su primile veliku dozu GNbAC1 antitela (C i E) pokazale značajno vraćanje njihovih krivih kliničkih ocena i značajno poboljšanu krajnju tačku na kraju ispitivanja. Grupa D tretirana sa natrijum fumaratom samo nije otkrila bilo kakvo značajno kliničko poboljšanje u poređenju sa Grupom B tretiranom sa neefikasnim izotipskim kontrolnim antitelom (preklapajući stubići grešaka na krivima). Regularna i trajna evolucija EAE kliničkih ocena može da se zabeleži kod svih miševa do kraja iskustva u grupi B (Env-indukovani EAE) tretiranoj sa izotipskim kontrolnim antitelom bez specifičnosti za Env protein. Ovo ukazuje na to da su terapeutski efekti primećeni sa GNbAC1 specifični sa ovim posebnim antitelom i da nisu povezani sa injekcijom bilo kog humanizovanog antitela sa istim izotipom koji, npr., ne cilja isti epitop.

[0136] Ovaj poslednji primer tako pokazuje da:

- Kontrolna grupa A bez injekcije Env proteina koja se ponašala kao zdrave kontrole bez kliničkih znakova, uprkos injekciji svih drugih komponenata potrebnih za lažni Env-indukovani EAE (IFA i MOG) kao i za lažnu injekciju antitela (razblaživač antitela); lažna isporuka u vodi rastvorljivog natrijum fumarata implivitno je obezbeđena normalnom pijaćom vodom.

- Najviša klinička ocena (najgora evolucija bolesti) dokazana je kod životinja tretiranih sa irelevantnim izotipskim kontrolnim antitelom (grupa B). Tako je otkriveno da ova injekcija lažnog-izotipa antitela u prisustvu Env proteina daje pozitivnu EAE kontrolu sa tipičnom EAE evolucijom.

- Grupa D tretiran sa natrijum fumaratom samo je imala loš ishod na kraju ispitivanja, slično Grupi B tretiranoj sa neefikasnim kontrolnim antitelom.

- Grupe C i E tretirana sa visokom dozom GNbAC1 antitela samo ili u kombinaciji sa natrijum fumaratom imala je ekvivalentan i značajno dobar oporavak na kraju ispitivanja. Kliničko poboljšanje pojavilo se od dana 15, od početka tretiranja.

[0137] Ovde, kako natrijum fumarat sam nije imao efekat i kako su se kinetike krivih grupa C i E bile ekvivalentne, terapeutski efekat primećen u ove dve grupe mora da bude potpun i i samo izazvan sa GNbAC1 dok natrijum fumarat otkriva neefikasnost.

3.D Analiza ukupnih rezultata iz primera 3

[0138] Zaključno, sami ili kombinovani, tretmani sa anti-Env specifičnim antitelom, kao što su GNbAc1 i jedinjenja anti-azotmonoksidnih slobodnih radikala (anti-NO), kao što je DMF, SMT ili L-Name, su povoljni zbog lečenja i sprečavanja blokade potencijalne aktivnosti remijelinizacije indukovane HERV-W proteinom omotača, naročito MSRV-Env, in vitro i in vivo.

[0139] GNbAc1 u visokoj dozi (500µg / miš od oko 20-25 g) takođe je otkrilo posebnu efikasnost u poređenju sa manjom dozom (200 µg), kada se daje sam kao monoterapija u ovim primerima.

REFERENCE:

[0140]

4

1. Perron H, Garson JA, Bedin F, et al. Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis. The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis. Proc Natl Acad Sci USA.1997; 94: 7583-8.

2. Perron H, Germi R, Bernard C, et al. Human endogenous retrovirus type W envelope expression in blood and brain cells provides new insights into multiple sclerosis disease. Mult Scler.2012; 18: 1721-36.

3. Bruno S, Cercignani M and Ron MA. White matter abnormalities in bipolar disorder: a voxelbased diffusion tensor imaging study. Bipolar Disord.2008; 10: 460-8.

4. Goghari VM, Rehm K, Carter CS and MacDonald AW. Sulcal thickness as a vulnerability indicator for schizophrenia. Br J Psychiatry.2007; 191: 229-33.

5. Stevens JR. Neuropathology of schizophrenia. Arch Gen Psychiatry.1982; 39: 1131-9.

6. Perron H, Hamdani N, Faucard R, et al. Molecular characteristics of Human Endogenous Retrovirus type-W in schizophrenia and bipolar disorder. Transl Psychiatry.2012; 2: e201.

7. Perron H, Jouvin-Marche E, Michel M, et al. Multiple sclerosis retrovirus particles and recombinant envelope trigger an abnormal immune response in vitro, by inducing polyclonal Vbetal6 T-lymphocyte activation. Virology.2001; 287: 321-32.

8. Delarasse C, Smith P, Baker D and Amor S. Novel pathogenic epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein induce experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Immunology.2013.

9. Heinen A, Kremer D, Gottle P, et al. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57kip2 is a negative regulator of Schwann cell differentiation and in vitro myelination. Proc Natl Acad Sci USA.2008; 105: 8748-53.

10. Rolland A, Jouvin-Marche E, Viret C, Faure M, Perron H and Marche PN. The envelope protein of a human endogenous retrovirus-W family activates innate immunity through CD14/TLR4 and promotes Thl-like responses. J Immunol.2006; 176: 7636-44.

11. Chang A, Tourtellotte WW, Rudick R and Trapp BD. Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med.2002; 346: 165-73.

4

12. Kuhlmann T, Miron V, Cui Q, Wegner C, Antel J and Bruck W. Differentiation block of oligodendroglial progenitor cells as a cause for remyelination failure in chronic multiple sclerosis. Brain.2008; 131: 1749-58.

13. Kremer D, Aktas O, Hartung HP and Kury P. The complex world of oligodendroglial differentiation inhibitors. Ann Neurol.2011; 69: 602-18.

14. Komurian-Pradel F, Paranhos-Baccala G, Bedin F, et al. Molecular cloning and characterization of MSRV-related sequences associated with retrovirus-like particles. Virology.

1999; 260: 1-9.

15. Lehnardt S, Massillon L, Follett P, et al. Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration through a Toll-like receptor 4-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci USA.

2003; 100: 8514-9.

16. Antony JM, van Marle G, Opii W, et al. Human endogenous retrovirus glycoproteinmediated induction of redox reactants causes oligodendrocyte death and demyelination. Nat Neurosci.2004; 7: 1088-95.

17. Bork P, Brown NP, Hegyi H and Schultz J. The protein phosphatase 2C (PP2C) superfamily: detection of bacterial homologues. Protein Sci.1996; 5: 1421-5.

18. Blond JL, Beseme F, Duret L, et al. Molecular characterization and placental expression of HERV-W, a new human endogenous retrovirus family. J Virol.1999; 73: 1175-85.

19. Mi S, Lee X, Li X, et al. Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis. Nature.2000; 403: 785-9.

20. Ruprecht K, Obojes K, Wengel V, et al. Regulation of human endogenous retrovirus W protein expression by herpes simplex virus type 1: implications for multiple sclerosis.

JNeurovirol.2006; 12: 65-71.

21. Ruprecht K and Perron H. Exposure to infant siblings during early life and risk of multiple sclerosis. JAMA.2005; 293: 2089; author reply -90.

22. Roebke C, Wahl S, Laufer G, et al. An N-terminally truncated envelope protein encoded by a human endogenous retrovirus W locus on chromosome Xq22.3. Retrovirology.2010; 7: 69.

4

23. Perron H, Germi R, Bernard C, Garcia-Montojo M, Deluen C and Farinelli L. Human Endogenous Retrovirus type W Envelope expression in blood and brain cells provides new insights into Multiple Sclerosis disease. Multiple Sclerosis journal.2012; DOI:

10.1177/1352458512441381.

24. Perron H and Lang A. The human endogenous retrovirus link between genes and environment in multiple sclerosis and in multifactorial diseases associating neuroinflammation. Clin Rev Allergy Immunol.2010; 39: 51-61.

25. Firouzi R, Rolland A, Michel M, et al. Multiple sclerosis-associated retrovirus particles cause T lymphocyte-dependent death with brain hemorrhage in humanized SCID mice model. J Neurovirol.2003; 9: 79-93.

LISTA SEKVENCI

4

4

1

2

4

Claims (4)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kombinacija koja obuhvata najmanje neki anti-MSRV/HERV-W Env ligand i najmanje jedan lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal,

u kojoj:

- pomenuti anti-HERV-W Env ligand je antitelo, određenije himerno, modifikovano ili humanizovano antitelo, a još određenije IgG, kao što je IgG1 ili IgG4, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata svaki od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) navedenih u SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, i SEQ ID No.6;

- pomenuti lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal odabran je iz grupe koju čine N<g>-nitro-L-arginin-metilestar (L-NAME), S-metil-izotiourea (SMT) i dimetil fumarat (DMF).

2. Farmaceutska kombinacija prema zahtevu 1, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezane sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste,

pri čemu je pomenuta bolest povezana sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV) odabrana iz grupe koju čine multipla skleroza, određenije relapsno remitentni oblik multiple skleroze (RRMS), progresivna multipla skleroza kao što je sekundarna progresivna multipla skleroza (SPMS) ili primarna progresivna multipla skleroza (PPMS), hronična inflamatorna demijelinizaciona polineuropatija (CIDP), i psihoze kao što je šizofrenija ili bipolarni poremećaj.

3. Farmaceutski proizvod koji sadrži:

- najmanje jedan anti-HERV-W Env ligand; i

- najmanje jedan lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal;

kao kombinovani proizvod za istovremeno, odvojeno ili raspoređeno tokom vremena davanje za upotrebu u sprečavanju i/ili lečenju blokiranja remijelinizacije kod bolesti povezane sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV), naročito njegove MSRV podvrste,

u kom:

- pomenuti anti-HERV-W Env ligand je antitelo, određenije himerno, modifikovano ili humanizovano antitelo, a još određenije IgG, kao što je IgG1 ili IgG4, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata svaki od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) navedenih u SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.

4, SEQ ID No.5, i SEQ ID No.6;

- pomenuti lek sa inhibitornim efektom na azotmonoksidni radikal odabran je iz grupe koju čine N<g>-nitro-L-arginin-metilestar (L-NAME), S-metil-izotiourea (SMT) i dimetil fumarat (DMF), i - povezana bolest povezana sa ekspresijom HERV-W proteina omotača (ENV) odabrana je iz grupe koju čine multipla skleroza, određenije relapsno remitentni oblik multiple skleroze (RRMS), progresivna multipla skleroza kao što je sekundarna progresivna multipla skleroza (SPMS) ili primarna progresivna multipla skleroza (PPMS), hronična inflamatorna demijelinizaciona polineuropatija (CIDP), i psihoze kao što je šizofrenija ili bipolarni poremećaj.