ES2717377T3 - Secuencias de serotipo 8 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas - Google Patents

Secuencias de serotipo 8 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Secuencias de serotipo 8 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas Antecedentes de la invención
Un virus adenoasociado (AAV), un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineal de cadena simple de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al género Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como contaminante en reservas de adenovirus purificadas. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que, tras la infección, los genomas de AAV son el sitio específicamente integrado en cromosomas hospedadores, y una fase infecciosa en la que, tras la infección, ya sea por virus del herpes simple o por adenovirus, los genomas integrados se rescatan, se replican y se empaquetan posteriormente en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, la amplia gama de infectividad de hospedador, incluyendo las células que no se dividen, y la posible integración cromosómica específica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para la transferencia de genes.
Recientes estudios sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehículo preferido para la administración de genes. Hasta ahora, se han aislado 6 serotipos diferentes, y bien caracterizados, de AAV, a partir de seres humanos o primates no humanos (PNH). Entre estos, el serotipo 2 humano es el primer AAV que se desarrolló como un vector de transferencia de genes; dicho serotipo se ha usado mucho en experimentos eficaces de transferencia de genes en diferentes tejidos y modelos animales diana. Se están realizando ensayos clínicos de la aplicación experimental de los vectores basados en AAV2 en algunos modelos de enfermedad humana, e incluyen enfermedades tales como fibrosis quística y hemofilia B.
Lo que es deseable son construcciones basadas en AAV para la administración de genes.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención proporciona nuevas secuencias de AAV y composiciones que contienen estas secuencias. Ventajosamente, estas composiciones son particularmente muy adecuadas para su uso en composiciones que requieren la readministración de AAVr para fines terapéuticos o profilácticos.
Estos y otros aspectos de la invención se harán rápidamente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.
La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de cápside vp1 del AAV8 que tiene una secuencia que comprende los aminoácidos 1 a 738 de la SEQ ID NO: 2. Como alternativa, en el presente documento, se proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende los nucleótidos 2121 a 4337 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleótidos al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 2121 a 4337 de la SEQ ID NO: 1. La cápside del AAV de las moléculas de ácido nucleico recombinante de la invención puede codificar además los aminoácidos 138 a 738 de la SEQ ID NO: 2 o comprenden los nucleótidos 2532 a 4337 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleótidos al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 2532 a 4337 de la SEQ ID NO: 1. La cápside de AAV de las moléculas de ácido nucleico recombinante de la invención puede codificar además, como alternativa, los aminoácidos 204 a 738 de la SEQ ID NO: 2 o comprenden los nucleótidos 2730 a 4337 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleótidos al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 2730 a 4337 de la SEQ ID NO: 1. La molécula de ácido nucleico recombinante de la invención puede comprender una secuencia seleccionada de: vp1, nt 2121 a 4337; vp2, nt 2532 a 4337; o vp3, nt 2730 a 4337 de la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico recombinante es un plásmido. También se proporciona en el presente documento una célula hospedadora transfectada con una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. La célula hospedadora de la invención puede comprender además un gen rep funcional, un minigén que comprende repeticiones terminales de AAV (ITR) y un transgén, y suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del minigén en la cápside de AAV. También se proporciona en el presente documento un AAV8 recombinante producido por la célula hospedadora de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una proteína de la cápside del AAV8 codificada por una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención. Además, se incluye en la invención una composición que comprende el AAV de la invención y un vehículo fisiológicamente compatible.
Breve descripción de los dibujos
Las Fig. 1A a 1C son las secuencias de ácido nucleico de las regiones rep y cap del VAA8 [SEQ ID NO: 1]. Las Fig. 2A a 2C son las secuencias de aminoácidos de la proteína vp1 de la cápside del VAA8 [SEQ ID NO: 2], proporcionada en alineamiento con la vp1 de las secuencias publicadas del VAA2 [SEQ ID NO: 4], VAA1 [SEQ ID NO: 5] y VAA3 [SEQ ID NO: 6], y los serotipos de VAA recientemente identificados, VAA7 [SeQ ID NO: 8] y VAA9 [SEq ID NO: 7]. El alineamiento se realizó usando el programa Clustal W, usando el número de VAA2 como referencia. El subrayado y la negrita en la secuencia inferior del alineamiento indican casetes de identidad. Los puntos en el alineamiento indican que faltan aminoácidos en las posiciones en el alineamiento en comparación con la VP1 del VAA2.
Las Fig. 3A a 3C son las secuencias de aminoácidos de las proteínas rep del VAA8 [SEQ ID NO: 3].
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican un nuevo serotipo de AAV, el AAV8. También se proporcionan fragmentos definidos de estas secuencias de AAV. Cada uno de estos fragmentos puede utilizarse fácilmente en diversos sistemas de vectores y células hospedadoras. Entre los fragmentos de AAV8 deseables están las proteínas cap, incluyendo la vp1, vp2, vp3 y las regiones hipervariables, las proteínas rep, incluyendo rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40 y las secuencias que codifican estas proteínas. Estos fragmentos pueden utilizarse fácilmente en diversos sistemas de vectores y células hospedadoras. Dichos fragmentos pueden usarse solos, en combinación con otras secuencias o fragmentos de AAV8, o en combinación con elementos de otras secuencias víricas de AAV o que no son de AAV. La molécula de ácido nucleico recombinante puede codificar las secuencias de cap y rep del AAV8.
Las secuencias de AAV8 y fragmentos definidos de las mismas, son útiles en la producción de AAVr, y también son útiles como vectores de administración no codificantes, vectores genoterapéuticos o vectores de vacunas. La invención proporciona moléculas de ácido nucleico y células hospedadoras que contienen las secuencias de AAV8 de la invención.
Los alineamientos se realizan usando cualquiera de una diversidad de Programas de Alineamiento de Secuencias Múltiples disponibles pública o comercialmente, tal como el programa “Clustal W”, accesible a través de Servidores Web en internet. Como alternativa, también se utilizan los programas utilitarios de Vector NTI. También hay diversos algoritmos conocidos en la técnica que pueden utilizarse para medir la identidad de las secuencias de nucleótidos, incluyendo los contenidos en los programas descritos anteriormente. En otro ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden compararse usando Fasta, un programa en GCG versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de ácido nucleico puede determinarse usando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación), como se proporciona en el programa GCG versión 6.1. Para las secuencias de aminoácidos se dispone de programas similares, por ejemplo, el programa “Clustal X”. Generalmente, en configuraciones por defecto se utiliza cualquiera de estos programas, aunque si fuera necesario un experto en la materia puede modificar estas configuraciones. Como alternativa, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa informático que proporcione al menos el nivel de identidad o alineamiento como lo proporcionan los algoritmos y programas a los que se hace referencia.
La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se hace referencia a un ácido nucleico, o a un fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas con otro ácido nucleico (o con su cadena complementaria), hay una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente de 95 a 99 % de las secuencias alineadas. Preferentemente, la homología es sobre la secuencia de longitud completa, o sobre una fase de lectura abierta de la misma. En el presente documento, se describen fragmentos específicos.
La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se hace referencia a aminoácidos o a fragmentos de los mismos, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones aminoacídicas apropiadas con otros aminoácidos (o con su cadena complementaria), hay una identidad de secuencia de aminoácidos en al menos aproximadamente de 95 a 99 % de las secuencias alineadas. Preferentemente, la homología es sobre la secuencia de longitud completa, o sobre una proteína de la misma, por ejemplo, una proteína cap, una proteína rep, o un fragmento definido de la misma. En el presente documento, se describen fragmentos específicos.
Por la expresión “altamente conservada” se entiende una identidad de al menos 80 %, preferentemente una identidad de al menos 90 %, y más preferentemente, una identidad por encima de 97 %. El experto en la materia determina fácilmente la identidad recurriendo a algoritmos y a programas informáticos conocidos por los expertos en la materia.
La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o el término “idéntico/a” en el contexto de secuencias de ácido nucleico se refiere a los restos que son iguales en las dos secuencias cuando se alinean para obtener una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de la identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia génica codificante o uno de sus fragmentos definidos. De igual manera, “porcentaje de identidad de secuencia”, puede determinarse fácilmente para secuencias de aminoácidos, sobre la longitud completa de una proteína, o uno de sus fragmentos. Lo adecuado es que un fragmento sea de al menos 8 aminoácidos de longitud, y puede ser de hasta aproximadamente 700 aminoácidos. En el presente documento, se describen ejemplos de fragmentos adecuados.
Como se describe en el presente documento, las moléculas de ácido nucleico recombinante de la invención que contienen la proteína de la cápside del AAV8 son particularmente muy adecuadas para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la efectividad de otros vectores basados en serotipos del AAV, así como de otros vectores víricos. Las moléculas de ácido nucleico recombinante de la invención son particularmente ventajosas en la readministración de AAVr y la genoterapia repetida.
Estas y otras realizaciones y ventajas de la invención se describen con más detalle más adelante. Como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión “que comprende” incluye otros componentes, elementos, números enteros, etapas y similares. Por el contrario, la expresión “que consiste” y sus variantes, excluye otros componentes, elementos, números enteros, etapas y similares.
I. Secuencias de serotipo 8 del AAV
A. Secuencias de ácido nucleico
Las secuencias de ácido nucleico de AAV8 de la invención incluyen las secuencias de ADN de la Fig. 1 [SEQ ID NO: 1], que consta de 4393 nucleótidos. En el presente documento, se describen secuencias de ácido nucleico que son complementarias a la Fig. 1 [SEQ ID NO: 1], así como las secuencias de ARN y ADNc correspondientes a la Fig. 1 [SEQ ID NO: 1] y su cadena complementaria. También se describen en el presente documento las secuencias de ácido nucleico de la invención, variantes naturales y modificaciones diseñadas por ingeniería genética de la Fig. 1 [SEQ ID NO: 1] y su cadena complementaria. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores que se conocen en la técnica, metilación, y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un nucleótido degenerado.
En el presente documento, se describen secuencias de ácido nucleico que tienen una identidad u homología mayor que aproximadamente 90 %, más preferentemente de al menos 95 %, y lo más preferentemente de al menos aproximadamente 98 a 99 % con la Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]. En el presente documento, se describen fragmentos de la Fig. 1 [SEQ ID NO: 1], su cadena complementaria, el ADNc y ARN complementario a estos. Dichos fragmentos tienen al menos 15 nucleótidos de longitud, e incluyen fragmentos funcionales, es decir, fragmentos que son de interés biológico. Los fragmentos definidos incluyen las secuencias que codifican las tres proteínas variables (vp) de la cápside de AAV8 que son variantes de corte y empalme alternativas: la vp1 [nt 2121 a 4337 de la Fig. 1, SEQ ID NO: 1]; la vp2 [nt 2532 a 4337 de la Fig. 1, SEQ ID NO: 1]; y la vp 3 [nt 2730 a 4337 de la Fig. 1, SEQ ID NO: 1]. Otros fragmentos descritos adecuados de la Fig.1 [SEQ ID NO: 1], incluyen el fragmento que contiene el codón de inicio para la proteína de cápside del AAV8 y los fragmentos que codifican las regiones hipervariables de la proteína de cápside vp1, que se describen en el presente documento.
Otros fragmentos adicionales incluyen los que codifican las proteínas rep, incluyendo rep 78 [codón de iniciación localizado en el nt 227 de la Fig. 1, SEQ ID NO: 1], rep 68 [codón de iniciación localizado en el nt 227 de la Fig. 1, SEQ ID NO: 1], rep 52 [codón de iniciación localizado en el nt 905 de la Fig. 1, SEQ ID NO: 1] y rep 40 [codón de iniciación localizado en el nt 905 de la Fig. 1, SEQ ID NO:1]. Otros fragmentos de interés pueden incluir la repetición terminal invertida del AAV8 que puede identificarse mediante los métodos descritos en el presente documento, secuencias P 19 de AAV, secuencias P40 de AAV8, el sitio de unión a rep y el sitio de resolución terminal (SRT). Para los expertos en la materia serán fácilmente obvios otros fragmentos adecuados adicionales.
Además de incluir las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en las figuras y en el Listado de Secuencias, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico y secuencias que se diseñan para expresar las secuencias de aminoácidos, proteínas y péptidos de los serotipos de AAV de la invención. Por tanto, la invención incluye secuencias de ácido nucleico que codifican las siguientes secuencias de aminoácidos nuevas de AAV generadas usando estas secuencias y/o fragmentos únicos de las mismas.
Como se usa en el presente documento, los serotipos de AAV artificiales incluyen, sin limitación, AAV con una proteína de cápside de origen no natural. Dicha cápside artificial puede generarse mediante cualquier técnica adecuada, usando una secuencia de AAV nueva de la invención (por ejemplo, un fragmento de una proteína de cápside vp1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse a partir de otro serotipo de AAV (conocido o nuevo), de partes no contiguas del mismo serotipo de AAV, de una fuente vírica que no es de AAV, o de una fuente no vírica. Un serotipo de AAV artificial puede ser, sin limitación, una cápside de AAV quimérica, una cápside de AAV recombinante, o una cápside de AAV “humanizada”.
B. Secuencias de aminoácidos, proteínas y péptidos de AAV8
En el presente documento, se describen proteínas y fragmentos de las mismas que están codificados por los ácidos nucleicos de AAV8 de la invención, y aminoácidos de AAV8 que se generan por otros métodos. También se describen en el presente documento serotipos de AAV generados usando secuencias del nuevo serotipo de AAV de la invención, que se generan usando técnicas sintéticas, recombinantes u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. La descripción del presente documento a nuevas secuencias de aminoácidos, péptidos y proteínas de AAV que se expresan a partir de las nuevas secuencias de ácido nucleico de AAV de la invención, e incluye secuencias de aminoácidos, péptidos y proteínas que se generan mediante otros métodos conocidos en la materia, incluyendo, por ejemplo, síntesis química, mediante otras técnicas sintéticas o mediante otros métodos. Por ejemplo, las secuencias de cualquiera de pueden generarse fácilmente usando una variedad de técnicas.
Los expertos en la materia conocen bien técnicas de producción adecuadas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Como alternativa, también pueden sintetizarse péptidos mediante los métodos bien conocidos de síntesis peptídica en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1962); Stewart y Young, “Solid Phase Peptide Synthesis” (Freeman, San Francisco, 1969) pág. 27-62). Estos y otros métodos de producción adecuados se encuentran dentro del conocimiento del experto en la materia.
Las proteínas particularmente deseables incluyen las proteínas de cápside de AAV, que están codificadas por las secuencias de nucleótidos identificadas anteriormente. La cápside de AAV está compuesta por tres proteínas, la vp1, la vp2 y la vp3, que son variantes de corte y empalme alternativas. La secuencia de longitud completa proporcionada en la figura 2 es la de la vp1. Las proteínas de cápside de AAV8 incluyen la vp1 [aa 1,738, 738, 204 a 738a 738 de SEQ ID NO: 2], la vp2 [aa 138 a 738 de SEQ ID NO: 2] y la vp3 [aa 204 a 738 de SEQ ID NO: 2] y sus fragmentos funcionales. Otros fragmentos deseables de la proteína de cápside incluyen las regiones constantes y variables, localizadas entre regiones hipervariables (HPV). Otros fragmentos deseables de la proteína de cápside incluyen las propias HPV.
Un algoritmo desarrollado para determinar áreas de divergencia de secuencia en AAV2 ha dado lugar a 12 regiones hipervariables (RHV), de las cuales 5 solapan o son parte de las cuatro regiones variables previamente descritas [Chiorini et al, J. Virol, 73: 1309-19 (1999); Rutledge et al, J. Virol., 72: 309-319] Usando ese algoritmo y/o las técnicas de alineamiento descritas en el presente documento, se determinan las RHV de los nuevos serotipos de AAV. Por ejemplo, con respecto al número de la vp1 de AAV2 [SEQ ID NO: 4], la RHV se localiza de la siguiente manera: RHV1, aa 146-152; RHV2, aa 182-186; RHV3, aa 262-264; RHV4, aa 381-383; RHV5, aa 450-474; RHV6, aa 490-495; RHV7, aa 500-504; RHV8, aa 514-522; RHV9, aa 534-555; RHV10, aa 581-594; RHV11, aa 658-667 y RHV12, aa 705-719. Usando el alineamiento proporcionado en el presente documento realizado usando el programa Clustal X con parámetros por defecto, o usando otros programas de alineamiento comercial o públicamente disponibles con parámetros por defecto, un experto en la materia puede determinar fácilmente fragmentos correspondientes de las nueva cápsides de AAV de la invención.
Otros fragmentos deseables de la proteína de cápside de AAV8 incluyen los aminoácidos 1 a 184 de SEQ ID NO: 2, los aminoácidos 199 a 259; los aminoácidos 274 a 446; los aminoácidos 603 a 659; los aminoácidos 670 a 706; los aminoácidos 724 a 736 de SEQ ID NO: 2; los aa 185 - 198; los aa 260-273; los aa 447-477; los aa 495-602; los aa 660-669 y los aa 707-723. Además, como ejemplos de otros fragmentos adecuados de cápsides de AAV se incluyen, con respecto a la numeración de AAV2 [SEQ ID NO: 4], los aa 24 - 42, los aa 25 - 28; los aa 81 - 85; los aa 133-165; los aa 134 - 165; los aa 137-143; los aa 154-156; los aa 194-208; los aa 261-274; los aa 262-274; los aa 171-173; los aa 413-417; los aa 449-478; los aa 494-525; los aa 534-571; los aa 581-601; los aa 660-671 y los aa 709-723. Incluso otros fragmentos deseables incluyen, por ejemplo, en AAV7, los aminoácidos 1 a 184 de SEQ ID NO: 2, los aminoácidos 199 a 259; los aminoácidos 274 a 446; los aminoácidos 603 a 659; los aminoácidos 670 a 706; los aminoácidos 724 a 736; los aa 185 a 198; los aa 260 a 273; los aa 447 a 477; los aa 495 a 602; los aa 660 a 669 y los aa 707 a 723. Usando el alineamiento proporcionado en el presente documento realizado usando el programa Clustal X con parámetros por defecto, o usando otros programas de alineamiento comercial o públicamente disponibles con parámetros por defecto, un experto en la materia puede determinar fácilmente fragmentos correspondientes de las nuevas cápsides de AAV de la invención.
Otras proteínas deseables más de AAV8 incluyen las proteínas rep, que incluyen rep68/78 y rep40/52 [localizadas dentro del aa 1 a 625 de SEQ ID NO: 3]. Como fragmentos adecuados de las proteínas rep pueden incluirse el aa 1 a 102; aa 103 a 140; aa 141 a 173; aa 174 a 226; aa 227 a 275; aa 276 a 374; aa 375 a 383; aa 384 a 446; aa 447 a 542; aa 543 a 555; aa 556 a 625, de SEQ ID NO: 3.
Dichos fragmentos pueden producirse de una manera recombinante o mediante otros medios adecuados, por ejemplo, síntesis química.
La invención proporciona además otras secuencias de AAV8 que se identifican usando la información de secuencias proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, dadas las secuencias de AAV8 proporcionadas en el presente documento, el AAV8 infeccioso puede aislarse usando tecnología del paseo genómico (Siebert et al., 1995, Nucleic Acid Research, 23: 1087-1088, Friezner-Degen et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). El paseo genómico es particularmente muy adecuado para identificar y aislar las secuencias adyacentes a las nuevas secuencias identificadas de acuerdo con el método de la invención. Esta técnica es también útil para el aislamiento de repeticiones terminales invertidas (ITR) del nuevo serotipo AAV8, basándose en las nuevas secuencias de cápside y rep del AAV proporcionadas en el presente documento.
Las secuencias de la invención pueden producirse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la producción recombinante, la síntesis química, u otros medios sintéticos. Dichos métodos de producción se encuentran dentro del conocimiento del experto en la materia.
IV. Producción de AAVr con cápsides de AAV8
La invención incluye nuevos AAV8 de tipo silvestre, cuyas secuencias carecen de ADN y/o de material celular con estos virus que están asociados en la naturaleza. En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas que utilizan las nuevas secuencias de AAV de la invención, incluyendo fragmentos de las mismas, para la producción de moléculas útiles en la administración de un gen heterólogo u otras secuencias de ácido nucleico a una célula diana. En el presente documento, se describen moléculas que utilizan las secuencias de AAV8 de la invención, incluyendo fragmentos de las mismas, para la producción de vectores víricos útiles en la administración de un gen heterólogo u otras secuencias de ácido nucleico a una célula diana.
Las moléculas de ácido nucleico recombinante de la invención que contienen secuencias de AAV8 incluyen cualquier elemento genético (vector) que puede administrarse a una célula hospedadora, por ejemplo, ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, episoma, una proteína en un vehículo de administración no vírico (por ejemplo, un transportador basado en lípidos), virus, etc., que transfieren las secuencias que llevan en su interior. El vector seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, administración de liposomas, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos a alta velocidad con ADN, infección vírica y fusión de protoplastos. Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por expertos en la manipulación de ácido nucleico e incluyen modificación por ingeniería genética, modificación por ingeniería genética recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. En una realización, los ácidos nucleicos recombinantes de la invención contienen, como mínimo, secuencias que codifican la proteína de la cápside vp1 del AAV8. Estos ácidos nucleicos recombinantes también pueden contener secuencias que codifican una proteína rep de AAV8 o un fragmento de la misma. Dichos ácidos nucleicos recombinantes contienen ambas proteínas cap y rep de AAV. En vectores en los que se proporcionan tanto rep como cap de AAV, ambas secuencias cap de AAV y rep de AAV pueden ser de origen AAV8. Como alternativa, las secuencias de rep pueden ser de un serotipo de AAV que difiere de los que proporcionan las secuencias cap. Las secuencias de rep y cap se pueden expresar a partir de fuentes distintas (por ejemplo, vectores, o una célula hospedadora y un vector distintos). Como alternativa, estas secuencias de rep se fusionan en fase con secuencias cap de un serotipo de AAV diferente para formar un vector de AAV quimérico. Opcionalmente, las moléculas de ácido nucleico recombinante de la presente invención pueden contener además un minigén que comprende un transgén seleccionado que está flanqueado por una ITR de AAV en 5' y una ITR de AAV en 3'.
Por tanto, en una realización, los ácidos nucleicos recombinantes descritos en el presente documento contienen secuencias de ácido nucleico que codifican una cápside de AAV intacta que puede ser de un solo serotipo de AAV (por ejemplo, AAV8). Dicha cápside puede comprender los aminoácidos 1 a 738 de SEQ ID NO: 2. Como alternativa, estos ácidos nucleicos recombinantes contienen secuencias que codifican una proteína de cápside que comprende una o más de las regiones de cápside de AAV8 seleccionadas de la vp2 y/o vp3, o de la vp1, de SEQ ID NO: 2. En otro ejemplo, puede ser deseable modificar el codón de inicio de la proteína vp3 por GTG. Como alternativa, el AAVr puede contener una o más de las regiones hipervariables de la proteína de cápside de serotipo 8 de AAV que se identifican en el presente documento, incluyendo, aa 185 - 198; aa 260-273; aa 447-477; aa 495-602; aa 660-669; y aa 707-723 de la cápside de AAV8. Véase, la SEQ ID NO: 2. Estas modificaciones pueden realizarse para aumentar la expresión, el rendimiento y/o mejorar la purificación en los sistemas de expresión seleccionados, o para otro fin deseado (por ejemplo, cambiar el tropismo o modificar epítopos de anticuerpos neutralizantes).
Los vectores descritos en el presente documento, por ejemplo, un plásmido, son útiles para diversos fines, pero son particularmente muy adecuados para su uso en la producción de un AAVr que contiene una cápside que comprende secuencias de AAV o un fragmento de las mismas. Estos vectores, incluyendo AAVr, sus elementos, construcción y usos se describen con detalle en el presente documento.
En el presente documento, se describe un método de generación de un virus adenoasociado (AAV) recombinante que tiene una cápside de serotipo 8 de AAV, o una parte de la misma. Dicho método implica cultivar una célula hospedadora que contenga una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de cápside de serotipo 8 de virus adeno-asociado (AAV), o fragmento del mismo, como se define en el presente documento; un gen de rep funcional; un minigén compuesto de, como mínimo, repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgén; y funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV8. Los componentes necesarios para cultivar en la célula hospedadora para empaquetar un minigén de AAV en una cápside de AAV pueden proporcionarse a la célula hospedadora en trans. Como alternativa, uno cualquiera o más de los componentes necesarios (por ejemplo, minigén, secuencias de rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares) pueden proporcionarse mediante una célula hospedadora estable que se ha modificado por ingeniería genética para contener uno o más de los componentes necesarios usando métodos conocidos por los expertos en la materia. Más adecuadamente, dicha célula hospedadora estable contendrá uno o más componentes necesarios bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el componente, o los componentes necesarios, pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo. En el presente documento se proporcionan ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados en la exposición de elementos reguladores adecuados para su uso con el transgén. En otra alternativa más, una célula hospedadora estable seleccionada puede contener uno o más componentes seleccionados bajo el control de un promotor constitutivo u otro componente, o componentes, seleccionados bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, puede generarse una célula hospedadora estable que derive de células 293 (que contenga funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contiene las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Un experto en la materia puede generar incluso otras células hospedadoras estables.
El minigén, las secuencias de rep, las secuencias cap, y las funciones auxiliares necesarias para la producción del AAVr de la invención, pueden administrase a la célula hospedadora de empaquetamiento en forma de cualquier elemento genético que transfiera las secuencias que el mismo porta. El elemento genético seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo los descritos en el presente documento. Los expertos en manipulación de ácido nucleico conocen métodos que se utilizan para construir cualquier realización de la presente invención e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. De manera similar, los métodos de generación de viriones de AAVr son muy conocidos. Véase, por ejemplo, K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520-532 (1993) y la patente de EE.UU. n.25.478.745.
A menos que se especifique otra cosa, las ITR de AAV, y otros componentes de AAV seleccionados descritos en el presente documento, pueden seleccionarse fácilmente a partir de cualquier serotipo de AAV, incluyendo, sin limitación, los AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9 y el nuevo serotipo de la invención, el AAV8. Estas ITR u otros componentes de AAV pueden aislarse fácilmente usando técnicas disponibles para los expertos en la materia a partir de un serotipo de AAV. Dicho AAV puede aislarse u obtenerse de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA). Como alternativa, las secuencias de AAV pueden obtenerse a través de medios sintéticos o de otros medios adecuados en referencia a secuencias publicadas, tales como las disponibles en la bibliografía o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank, PubMed, o similares.
A. El minigén
El minigén está compuesto, como mínimo, por un transgén y sus secuencias reguladoras, y por repeticiones terminales invertidas (ITR) 5' y 3' de AAV. En una realización deseable, se usan las ITR del serotipo 2 de AAV. Sin embargo, pueden seleccionarse ITR de otros serotipos adecuados. Este minigén es el que se empaqueta en una proteína de cápside y se suministra a una célula hospedadora seleccionada.
1. El transgén
Un transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga respecto a las secuencias de vector que flanquean el transgén que codifica un polipéptido, una proteína u otro producto de interés. La secuencia codificante de ácido nucleico está unida operativamente a componentes reguladores de una manera tal que permite la transcripción, traducción y/o expresión de transgén en una célula hospedadora.
La composición de la secuencia transgénica dependerá del uso que deba darse al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia transgénica incluye una secuencia indicadora, que con su expresión produce una señal detectable. Dichas secuencias indicadoras incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican p-lactamasa, pgalactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina quinasa, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas unidas por membrana incluyendo, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína de hemaglutinina de la gripe y otras bien conocidas en la técnica, respecto a las que pueden existir o producirse anticuerpos de alta afinidad dirigidos a las mismas con medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína unida por membrana fusionada apropiadamente con un dominio de etiqueta de antígeno procedente, entre otros, de hemaglutinina o de Myc.
Estas secuencias codificantes, cuando se asocian a elementos reguladores que activan su expresión, proporcionan señales detectables por medios convencionales, incluyendo ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros espectrográficos, ensayos de clasificación de célula activada por fluorescencia y ensayos inmunológicos, incluyendo el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, la presencia del vector portador de la señal se detecta mediante ensayos con respecto a la actividad de la beta-galactosidasa. Cuando el transgén es la proteína verde fluorescente o la luciferasa, el vector portador de la señal puede medirse visualmente en un luminómetro mediante la producción de color o de luz.
Sin embargo, deseablemente, el transgén es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tales como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, o ARN catalíticos. Las moléculas de ARN deseables incluyen ARNt, ARNbc, ARN ribosómico, ARN catalíticos y ARN no codificante. Un ejemplo de una secuencia de ARN útil es una secuencia que extingue la expresión de una secuencia de ácido nucleico diana en el animal tratado.
El transgén puede usarse para corregir o mejorar insuficiencias génicas, que pueden incluir insuficiencias en las que los genes normales se expresan a niveles menores que los normales o insuficiencias en las que el producto génico funcional no se expresa. Un tipo preferido de secuencia transgénica codifica una proteína o un polipéptido terapéuticos múltiples que se expresan en una célula hospedadora. se pueden usar múltiples transgenes, por ejemplo, para corregir o mejorar un defecto génico causado por una proteína multi-subunidad. En determinadas situaciones, puede usarse un transgén diferente para codificar cada subunidad de una proteína, o codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de la proteína es grande, por ejemplo, para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas o una proteína distrofina. Para que la célula produzca la proteína multi-subunidad, una célula se infecta con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Como alternativa, las diferentes subunidades de una proteína pueden codificarse con el mismo transgén. En este caso, un solo transgén incluye el ADN que codifica cada una de la subunidades, estando el ADN para cada subunidad separado mediante un sitio de entrada de ribozima interna (IRES). Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y los IRES es menor de cinco kilobases. Como una alternativa a un IRES, el ADN puede separarse mediante secuencias que codifican un péptido 2A, que se autoescinde en un evento posterior a la traducción. Véase, por ejemplo, M. L. Donnelly, et al, J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (enero 1997); Furler, S., et al, Gene Ther., 8(11): 864-873 (junio de 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10): 811-817 (mayo 2001). Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, lo que hace que sea muy adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitante. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar cualquier producto biológicamente activo, u otro producto, por ejemplo, un producto deseable para su estudio.
Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente transgenes adecuados.
2. Elementos reguladores
Además a los elementos principales identificados anteriormente para el minigén, el vector incluye también elementos de control convencionales que están unidos operativamente al transgén de una manera que permiten su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con las moléculas de ácido nucleico de la invención o infectada con el virus que contiene estas moléculas de ácido nucleico. Como se utiliza en la presente memoria, secuencias “unidas operativamente” incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.
Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de transcripción, iniciación, promotoras y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento eficiente de ARN tal como señales de corte y empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, secuencias consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. En la técnica se conoce y puede utilizarse un gran número de secuencias de control de expresión, incluyendo las promotoras que son naturales, constitutivas, inducibles y/o específicas del tejido.
Como ejemplos de promotores constitutivos se incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retrovírico (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1 [Invitrogen]. Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y pueden regularse mediante compuestos suministrados exógenamente, mediante factores ambientales tales como la temperatura, o por la presencia de un estado fisiológico específico, como por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o en células replicantes solamente. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles se pueden obtener de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas, y un experto en la materia puede seleccionarlos fácilmente. Como ejemplos de promotores inducibles regulados por compuestos suministrados exógenamente se incluyen el promotor de metalotioneína (MT) de oveja inducible por cinc, el promotor del virus de tumor de mama de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de polimerasa T7 [publicación de patente internacional n.°. WO 98/10088]; el promotor de insecto de ecdisoma [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.U., 93: 3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)], el sistema inducible por RU486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que se regulan mediante un estado fisiológico específico, por ejemplo, la temperatura, una fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o en células replicantes solamente.
Se puede usar el promotor natural para el transgén. El promotor natural puede ser el preferido cuando se desea que la expresión del transgén mimetice la expresión natural. El promotor natural puede usarse cuando la expresión del transgén debe regularse temporalmente o durante el desarrollo, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos de la transcripción específicos. También se pueden usar otros elementos naturales de control de expresión, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak, para mimetizar la expresión natural.
El transgén puede incluir un gen unido operativamente a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en el músculo esquelético, se deberá usar un promotor activo en el músculo. Esto incluye los promotores procedentes de genes que codifican la p-actina esquelética, la cadena ligera 2A de miosina, la distrofina, la creatina quinasa de músculo, así como promotores de músculo sintéticos con actividades más altas quelas de los promotores que se producen de forma natural (véase Li et al., Nat. Biotech. 17: 241-245 (1999)). Ejemplos de promotores que son específicos del tejido son conocidos para el hígado (albúmina, Miyatake et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor de núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfafetoproteína (AFP), Arbunthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de linfocito T), promotor neuronal tal como promotor de enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell Mol. Neurobiol., 13: 503­ 15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88: 5611 -5 (1991)), y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros.
Opcionalmente, los plásmidos portadores de transgenes terapéuticamente útiles pueden incluir también genes marcadores o indicadores seleccionables que pueden incluir secuencias que codifican resistencia a geneticina, higromicina o puromicina, entre otros. Dichos genes marcadores o indicadores seleccionables (situados preferentemente fuera del genoma vírico que va a rescatarse mediante el método descrito en el presente documento) pueden usarse para indicar la presencia de los plásmidos en las células bacterianas, tal como por resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación. La selección de estos y otros promotores y elementos de vector, se hace de manera convencional y muchas de esas secuencias están disponibles [véase, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en la misma].
La combinación del transgén, de promotor/potenciador, y de las ITR 3' y 5', se menciona como “minigén” por facilidad de referencia en la presente memoria. El diseño de dicho minigén puede realizarse recurriendo a técnicas convencionales.
3. Administración del minigén a una célula hospedadora de empaquetamiento
El minigén puede ser portado sobre cualquier vector adecuado, por ejemplo, un plásmido, que se administre a una célula hospedadora. Los plásmidos útiles en la presente invención pueden estar diseñados de manera que sean adecuados para replicación y, opcionalmente, para la integración en células procariotas, en células de mamíferos, o en ambas. Estos plásmidos (u otros vectores portadores de la ITR 5' de AAV - molécula heteróloga - ITR 3' de AAV) contienen secuencias que permiten la replicación del minigén en marcadores eucariotas y/o procariotas y de selección para esos sistemas. Los genes marcadores o indicadores seleccionables pueden incluir secuencias que codifican la resistencia a la geneticina, a la higromicina o a la puromicina, entre otras. Los plásmidos pueden contener también ciertos genes indicadores o marcadores seleccionables que pueden usarse para indicar la presencia del vector en células bacterianas, tal como por resistencia a ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón, tal como el sistema de amplicón que emplea el antígeno nuclear del virus de Epstein Barr. Este sistema de amplicón, u otros componentes de amplicón similares, permiten una replicación episómica de alta copia en las células. Preferentemente, la molécula que porta el minigén se transfecta en la célula, donde puede existir de manera transitoria. Como alternativa, el minigén (que porta la ITR 5' de AAV - molécula heteróloga - ITR 3' de AAV), puede estar integrado de forma estable en el genoma de la célula hospedadora, ya sea cromosómicamente o como un episoma. En algunas realizaciones, el minigén puede estar presente en múltiples copias, opcionalmente en concatámeros de cabeza con cabeza, cabeza con cola, o cola con cola. Las técnicas de transfección adecuadas son conocidas y pueden utilizarse fácilmente para administrar el minigén a la célula hospedadora.
En general, cuando el vector que comprende el minigén se suministra por transfección, el vector se suministra en una cantidad de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 100 pg de ADN, de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 50 pg de ADN, en aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células, o en aproximadamente 1 x 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN de vector en células hospedadoras puede ajustarlas un experto en la materia, teniendo en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de suministro y las células hospedadoras seleccionadas.
B. Secuencias de rep y cap
Además del minigén, la célula hospedadora contiene las secuencias que activan la expresión de la proteína de cápside de AAV8 (o una proteína de cápside que comprende un fragmento de la cápside de AAV8) en la célula hospedadora y secuencias de rep del mismo serotipo que el serotipo de las ITR de AAV encontradas en el minigén, o de un serotipo de complementación cruzada. Las secuencias de cap y rep de AAV pueden obtenerse, de forma independiente, a partir de una fuente de AAV como se ha descrito anteriormente, y pueden introducirse en la célula hospedadora de cualquier manera conocida por un experto en la materia, como se ha descrito anteriormente. Además, cuando se seudotipifica un vector de AAV en una cápside de AAV9, las secuencias que codifican cada una de las proteínas rep esenciales pueden administrarse mediante AAV 8, o las secuencias que codifican las proteínas rep pueden administrarse por diferentes serotipos de AAV, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6,). Por ejemplo, las secuencias de rep78/68 pueden proceder del AAV2, mientras que las secuencias de rep52/40 pueden proceder del AAV8.
En una realización, la célula hospedadora contiene de forma estable la proteína de cápside bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito con anterioridad. Más deseablemente, en esta realización, la proteína de cápside se expresa bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, la proteína de cápside se suministra a la célula hospedadora en trans. Cuando se suministra a la célula hospedadora en trans, la proteína de cápside puede administrarse por medio de un plásmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresión de la proteína de cápside seleccionada en la célula hospedadora. Más deseablemente, cuando se administra a la célula hospedadora en trans, el plásmido que porta la proteína de cápside porta también otras secuencias necesarias para empaquetar el AAVr, por ejemplo, las secuencias de rep.
En otra realización, la célula hospedadora contiene de forma estable las secuencias de rep bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito anteriormente. De manera más deseable, en esta realización, las proteínas rep esenciales se expresan bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, las proteínas rep se administran a la célula hospedadora en trans. Cuando se suministran a la célula hospedadora en trans, las proteínas rep pueden administrarse por medio de un plásmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresión de las proteínas rep seleccionadas en la célula hospedadora. Más deseablemente, cuando se administran a la célula hospedadora en trans, el plásmido que porta la proteína de cápside porta también otras secuencias necesarias para empaquetar el AAVr, por ejemplo, las secuencias de rep y cap.
Por tanto, en una realización, las secuencias de rep y cap pueden transfectarse en la célula hospedadora en una sola molécula de ácido nucleico y existir de manera estable en las células como un episoma. En otra realización, las secuencias de rep y cap están integradas de manera estable en el cromosoma de la célula. Otra realización tiene las secuencias de rep y cap expresadas de manera transitoria en la célula hospedadora. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico útil para dicha transfección comprende, desde el extremo 5' al extremo 3', un promotor, un espaciador opcional intercalado entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia del gen rep, una secuencia del gen rep de AAV, y una secuencia del gen cap de AAV.
Opcionalmente, las secuencias de rep y/o cap pueden administrarse en un vector que contiene otras secuencias de ADN que van a introducirse en las células hospedadoras. Por ejemplo, el vector puede contener la construcción de AAVr que comprende el minigén. El vector puede comprender uno o más de los genes que codifican las funciones auxiliares, por ejemplo, las proteínas adenovíricas E1, E2a y E40RF6, y el gen para ARN de VAI.
Preferentemente, el promotor utilizado en esta construcción puede ser cualquiera de los promotores constitutivos, inducibles o naturales conocidos por el experto en la materia o como se ha expuesto anteriormente. En una realización, se emplea una secuencia de promotor P5 de AAV.
En otra realización preferida, el promotor para rep es un promotor inducible, tal como los que se han expuesto anteriormente en relación con los elementos reguladores de transgén. Un promotor preferido para expresión de rep es el promotor de T7. El vector que comprende el gen rep regulado por el promotor de T7 y el gen cap, se transfecta o transforma en una célula que expresa, ya sea de manera constitutiva o ya sea de manera inducible, la polimerasa de T7. Véase el documento WO 98/10099, publicado el 12 de Marzo de 1998.
El espaciador es un elemento opcional en el diseño del vector. El espaciador es una secuencia de ADN intercalada entre el promotor y el sitio de inicio ATG de gen rep. El espaciador puede tener cualquier diseño deseado; es decir, puede ser una secuencia aleatoria de nucleótidos, o como alternativa, puede codificar un producto génico, tal como un gen marcador. El espaciador puede contener genes que incorporen normalmente sitios de inicio/terminación y poliA. El espaciador puede ser una secuencia de ADN no codificante, procedente de una procariota o eucariota, una secuencia no codificante repetitiva, una secuencia codificante sin controles de la transcripción, o una secuencia codificante con controles de la transcripción. Dos ejemplos de fuentes de secuencias espaciadoras son las secuencias escalera de fago o las secuencias escalera de levadura, que están disponibles en el comercio, por ejemplo, en Gibco o Invitrogen, entre otros. El espaciador puede tener un tamaño cualquiera suficiente para reducir la expresión de los productos génicos rep78 y rep68, dejando los productos génicos rep52, rep40 y cap expresados a niveles normales. La longitud del espaciador puede variar, por lo tanto, de aproximadamente 10 pb a aproximadamente 10,0 kpb, con preferencia en el intervalo de aproximadamente 100 pb a aproximadamente 8,0 kbp. Para reducir la posibilidad de recombinación, el espaciador tiene preferentemente una longitud menor de 2 kbp.
Aunque la(s) molécula(s) que proporciona(n) rep y cap pueden existir en la célula hospedadora de manera transitoria (es decir, mediante transfección), se prefiere que una o ambas proteínas rep y cap y el (los) promotor(es) que controla(n) su expresión esté(n) expresado(s) de forma estable en la célula hospedadora, por ejemplo, como un episoma o mediante la integración en el cromosoma de la célula hospedadora. Los métodos empleados para construir las realizaciones de la presente invención son técnicas convencionales de ingeniería genética o de ingeniería recombinante tales como las descritas en las referencias anteriores. Mientras que la presente memoria descriptiva proporciona ejemplos ilustrativos de construcciones específicas, usando la información proporcionada en la presente memoria, un experto en la materia puede seleccionar y diseñar otras construcciones adecuadas, usando una elección de espaciadores, promotores P5 y otros elementos, incluyendo al menos una señal de inicio y terminación de la traducción, y la adición opcional de sitios de poliadenilación.
Una célula hospedadora puede proporcionar la proteína rep o cap de forma estable.
C. Las funciones auxiliares
La célula hospedadora de empaquetamiento también necesita funciones auxiliares para empaquetar el AAVr de la invención. Opcionalmente, esas funciones puede suministrarlas un virus del herpes. Más deseablemente, las funciones auxiliares necesarias se proporcionan, cada una de ellas, a partir de una fuente de adenovirus de primate humano o no humano, tal como las que se han descrito con anterioridad y/o están disponibles a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo la colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, VA (US). La célula hospedadora se puede dotar de y/o contiene un producto de gen E1a, un producto de gen E1b, un producto de gen E2a, y/o un producto de gen E4 ORF6. La célula hospedadora puede contener otros genes adenovíricos tal como ARN de VAI, pero esos genes no se necesitan. Como alternativa, no hay ningún otro gen de adenovirus o funciones de gen presentes en la célula hospedadora.
Por “ADN adenovírico que expresa el producto de gen E1a”, se entiende cualquier secuencia de adenovirus que codifique E1a o cualquier porción de E1a funcional. El ADN adenovírico que expresa el producto de gen E2a y el ADN adenovírico que expresa los productos génicos E4 ORF6 se definen de forma similar. También se incluye cualquiera de los alelos u otras modificaciones del gen adenovírico o de la porción funcional del mismo. Dichas modificaciones pueden introducirse deliberadamente recurriendo a técnicas mutagénicas o de ingeniería genética convencionales para potenciar la función adenovírica de alguna manera, así como las variantes alélicas de las mismas que se producen de forma natural. Los expertos en la materia conocen dichas modificaciones y métodos para manipular ADN para conseguir esas funciones de gen de adenovirus.
Los productos génicos E1a, E1b, E2a y/o E4ORF6 de adenovirus, así como cualquiera de otras funciones auxiliares deseadas, pueden proporcionarse usando cualquier medio que permita su expresión en una célula. Cada una de las secuencias que codifican esos productos puede estar en un vector distinto, o uno o más genes pueden estar en el mismo vector. El vector puede ser cualquier vector conocido en la técnica o desvelado anteriormente, incluyendo los plásmidos, cósmidos y virus. La introducción del vector en la célula hospedadora puede realizarse con cualquier medio conocido en la técnica o desvelado anteriormente, incluyendo transfección, infección, electroporación, suministro de liposoma, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN a alta velocidad, infección vírica y fusión de protoplasto, entre otros. Uno o más de los genes adenovíricos pueden estar integrados de forma estable en el genoma de la célula hospedadora, expresados de forma estable como episomas o expresados de forma transitoria. Todos los productos génicos pueden estar expresados de forma transitoria, en un episoma o integrados de forma estable, o algunos de los productos génicos pueden estar expresados de forma estable mientras otros están expresados de forma transitoria. Además, el promotor para cada uno de los genes adenovíricos puede seleccionarse independientemente a partir de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenovírico natural. Los promotores pueden estar regulados por un estado fisiológico específico del organismo o de la célula (es decir, por el estado de diferenciación o en células replicantes o quiescentes) o por factores añadidos exógenamente, por ejemplo.
D. Células hospedadoras y estirpes celulares de empaquetamiento
La propia célula hospedadora puede seleccionarse a partir de cualquier organismo biológico, incluyendo las células procariotas (por ejemplo, bacterianas) y células eucariotas, incluyendo células de insecto, células de levadura y células de mamífero. Las células hospedadoras particularmente deseables se seleccionan de entre cualquier especie de mamífero, incluyendo, sin limitación, células tales como A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, c Os 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293 (que expresan E1 adenovírico funcional), Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2, y fibroblasto primario, hepatocito y células de mioblastos derivadas de mamíferos incluyendo el ser humano, el mono, el ratón, la rata, el conejo y el hámster. La selección de la célula de mamífero puede ser un fibroblasto, un hepatocito, una célula tumoral, etc. Los requisitos para la célula utilizada son que no porte ningún gen de adenovirus distinto de E1, E2a y/o E4 ORF6; que no contenga ningún otro gen de virus que pudiera dar como resultado la recombinación homóloga de un virus contaminante durante la producción de AAVr; y que sea capaz de realizar la infección o transfección del ADN y la expresión del ADN transfectado. La célula hospedadora puede ser una que tiene rep y cap transfectadas de manera estable en la célula.
Una célula hospedadora útil en la presente invención es una célula hospedadora transformada de manera estable con las secuencias que codifican rep y cap, y que se transfecta con el ADN de E1, E2a, E4 ORF6 de adenovirus y una construcción portadora del minigén como se ha descrito anteriormente. Las estirpes celulares de expresión de rep y/o cap estables, tales como la B-50 (PCT/US98/19463), o las descritas en la patente de EE.UU. n.° 5.658.785, también pueden emplearse de forma similar. Otra célula hospedadora deseable contiene el mínimo ADN adenovírico que sea suficiente para expresar E4 ORF6. Incluso pueden construirse otras líneas celulares usando las secuencias de rep de AAV y/o cap de AAV de la invención.
La preparación de una célula hospedadora de acuerdo con la presente invención implica técnicas tales como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede llevarse a cabo utilizando técnicas convencionales. Dichas técnicas incluyen clonación genómica y de ADNc, muy conocidas y descritas en Sambrook et al., mencionado anteriormente, el uso de secuencias oligonucleotídicas solapantes de los genomas de adenovirus y de AAV, combinado con reacción en cadena de la polimerasa, métodos sintéticos, y cualesquier otro método adecuado que proporcione la secuencia nucleotídica deseada.
La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula hospedadora también puede llevarse a cabo usando técnicas conocidas por los expertos en la materia y comentadas a lo largo de la memoria descriptiva. Se pueden usar técnicas de transfección convencionales, por ejemplo, transfección con CaPO4 o electroporación y/o infección por vectores híbridos de adenovirus/AAV en estirpes celulares tales como la estirpe celular de riñón embrionario humano HEK 293 (una estirpe celular de riñón humano que contiene genes E1 de adenovirus funcional, que proporciona proteínas E1 que actúan en trans).
Los vectores basados en AAV8 generados por un experto en la materia son beneficiosos para la administración de genes a células hospedadoras seleccionadas y a pacientes con genoterapia, ya que no se han encontrado anticuerpos neutralizantes contra AAV8 en la población humana. Un experto en la materia puede preparar fácilmente otros vectores víricos de AAVr que contengan las proteínas de la cápside del AAV8 proporcionadas en el presente documento usando diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Se puede preparar de manera similar otros vectores víricos de AAVr que contengan la secuencia de AAV8 y cápsides de AAV de otro serotipo
Un experto en la materia comprenderá fácilmente que las secuencias de AAV de la invención pueden adaptarse fácilmente para su uso en estos y otros sistemas de vector vírico para la administración de genes in vitro, ex vivo o in vivo. De forma similar, un experto en la materia puede seleccionar otros fragmentos del genoma de AAV de la invención para su uso en una diversidad de sistemas de vector de AAVr y no AAVr. Dichos sistemas de vector pueden incluir, por ejemplo, lentivirus, retrovirus, poxvirus, virus de la vacuna, y sistemas adenovíricos, entre otros. Por lo tanto, la invención proporciona además vectores generados usando las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos del nuevo AAV de la invención. Dichos vectores son útiles para una diversidad de fines, incluyendo la administración de moléculas terapéuticas y el uso en regímenes de vacuna. Particularmente deseables para la administración de moléculas terapéuticas son los AAV recombinantes que contienen cápsides del nuevo AAV de la invención. Estas, u otras construcciones de vector, que contienen nuevas secuencias de AAV de la invención, pueden usarse en regímenes de vacuna, por ejemplo para la administración conjunto de una citocina o para la administración del propio inmunógeno.
V. Virus recombinantes y usos de los mismos
Usando las técnicas descritas en el presente documento, un experto en la materia puede generar un AAVr que tenga una cápside de un serotipo 8 de la invención, o que tenga una cápside que contenga uno o más fragmentos de AAV8. En una realización, se puede utilizar una cápside de longitud completa de un solo serotipo, por ejemplo, AAV8 [SEQ ID NO: 2]. En otra realización, puede generarse una cápside de longitud completa que contenga uno o más fragmentos de AAV8 fusionados en fase con secuencias de otro serotipo de AAV seleccionado, o de partes heterólogas de AAV8. Por ejemplo, un AAVr puede contener una o más de las nuevas secuencias de regiones hipervariables de AAV8. Como alternativa, las secuencias de AAV8 exclusivas de la invención pueden usarse en construcciones que contengan otras secuencias víricas y no víricas. Opcionalmente, un virus recombinante puede portar secuencias de rep de AAV8 que codifiquen una o más de las proteínas rep de AAV8.
A. Administración de virus
En el presente documento, se describe un método para la administración de un gen a un hospedador que implica transfectar o infectar una célula hospedadora seleccionada con un vector vírico recombinante generado con las secuencias de AAV8 (o fragmentos funcionales del mismo) de la invención. Los métodos de administración son muy conocidos por los expertos en la materia, y no constituyen una limitación de la presente invención.
En el presente documento, se describe un método para la administración mediada por AAV8 de un transgén a un hospedador. Este método implica transfectar o infectar una célula hospedadora seleccionada con un vector vírico recombinante que contiene un transgén seleccionado bajo el control de secuencias que dirigen la expresión del mismo y proteínas de la cápside de AAV8.
Opcionalmente, en primer lugar, una muestra del hospedador puede someterse a ensayo para determinar la presencia de anticuerpos contra un serotipo de AAV seleccionado. Los expertos en la materia conocen una diversidad de formatos de ensayo para detectar anticuerpos neutralizantes. La selección de un ensayo de ese tipo no es una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, Fisher et al., Nature Med., 3(3): 306-312 (marzo de 1997), y W.C. Manning et al., Human Gene Therapy, 9: 477-485 (1 de Marzo de 1998). Los resultados de este ensayo pueden usarse para determinar qué vector de AAV que contiene proteínas de cápside de un serotipo particular se prefiere para la administración, por ejemplo, mediante la ausencia de anticuerpos neutralizantes específicos para ese serotipo de cápside.
En un aspecto de este método, la administración del vector con proteínas de cápside de AAV8 de la invención puede preceder o seguir a la administración de un gen por medio de un vector con una proteína de cápside de AAV de diferente serotipo. Por tanto, la administración génica a través de vectores de AAVr puede usarse para repetir la administración génica a una célula hospedadora seleccionada. Deseablemente, los vectores de AAVr administrados posteriormente portan el mismo transgén que el primer vector de AAVr, pero los vectores administrados posteriormente contienen proteínas de cápside de serotipos que difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene proteínas de cápside de AAV8, los vectores administrados posteriormente pueden tener proteínas de cápside seleccionadas de entre otros serotipos.
Los vectores recombinantes descritos anteriormente pueden administrarse a células hospedadoras de acuerdo con métodos publicados. El AAVr, suspendido preferentemente en un vehículo fisiológicamente compatible, puede administrarse a un paciente mamífero humano o no humano. Los vehículos adecuados pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la materia en vista de la indicación para la que se dirija el virus de transferencia. Por ejemplo, un vehículo adecuado incluye solución salina, que puede formularse con una diversidad de soluciones tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros vehículos ilustrativos incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua.
Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del AAVr y de uno o más vehículos, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tal como conservantes o estabilizadores químicos. Los ejemplos adecuados de conservantes incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
Los vectores se administran en cantidades suficientes para transfectar las células y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que pueden ser determinados por los expertos en Medicina. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, la administración directa a un órgano (por ejemplo, el hígado o el pulmón), administración oral, por inhalación, intratraqueal, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, y otras vías de administración parentales. Si se desea, las vías de administración pueden combinarse.
Las dosis de vector vírico dependerán principalmente de factores tales como la afección que vaya a tratarse, el peso y el estado de salud del paciente, y por lo tanto, pueden variar entre los pacientes. Por ejemplo, una dosis humana terapéuticamente eficaz de vector vírico está, por lo general, comprendida en el intervalo de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 100 ml de solución que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 109 a 1 x 1016 genomas de vector vírico. Una dosis humana preferida puede ser de aproximadamente 1 x 1013 a 1 x 1016 genomas de AAV. Las dosis se ajustarán para equilibrar el beneficio terapéutico frente a cualquier efecto secundario, y dichas dosis pueden variar dependiendo de la aplicación terapéutica para la que se emplee el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén pueden monitorizarse para determinar la frecuencia de dosificación resultante en vectores víricos, con preferencia vectores de AAV que contienen el minigén. Opcionalmente, se pueden utilizar regímenes de dosificación similares a los descritos con fines terapéuticos, para inmunización, usando las composiciones de la invención.
A continuación, se proporcionan ejemplos de productos terapéuticos e inmunogénicos para su administración mediante los vectores de la invención que contienen AAV8. Estos vectores pueden usarse para una diversidad de regímenes terapéuticos y de vacuna, como se describe en la presente memoria. Además, estos vectores pueden administrarse en combinación con uno o más de otros vectores o principios activos en un régimen terapéutico y/o de vacuna deseado.
B. Transgenes terapéuticos
Los productos terapéuticos útiles codificados por el transgén incluyen hormonas y factores de crecimiento y de diferenciación incluyendo, aunque sin limitación, insulina, glucagón, hormona del crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberación de hormona de crecimiento (GRF), hormona de estimulación de folículo (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetina, angiostatina, factor de estimulación de colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblasto ácido (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores I y II de crecimiento de Insulina (IGF-I e IGF.II), uno cualquiera de la superfamilia a de factor de crecimiento de transformación, incluyendo TGFa, activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP), las BMP 1-15, uno cualquiera de la familia de factores de crecimiento de herreglulina/neurregulina/ARIA/factor de diferenciación neu (NDF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de estirpe celular glial (GDNF), neurturina, agrina, uno cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrina, nogina, erizo sónico y tirosina hidroxilasa.
Otros productos de transgén útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmunitario incluyendo, sin limitación, citocinas y linfocinas, tales como la trombopoyetina (TPO), interleucinas (IL), IL-1 a IL-18, proteína quimioatrayente de monocito, factor inhibidor de leucemia, factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos, ligando Fas, factores a y p de necrosis tumoral, interferones a, p e y, factor de células madre, ligando flk-2/flt3. Los productos génicos producidos por el sistema inmunitario son también útiles en la invención. Éstos incluyen, sin limitación, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, receptores de linfocitos T, receptores de linfocitos T quiméricos, receptores de linfocitos T de cadena simple, moléculas de MHC de clase I y de clase II, así como inmunoglobulinas de diseño y moléculas de MHC. Los productos génicos útiles incluyen también proteínas reguladoras de complemento tales como proteínas reguladoras de complemento, proteína de cofactor de membrana (MCP), factor acelerador de putrefacción (DAF), CR1, CF2 y CD59.
Otros productos génicos útiles adicionales incluyen uno cualquiera de los receptores para hormonas, factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, proteínas reguladoras y proteínas del sistema inmunitario, por ejemplo, receptores para la regulación del colesterol, incluyendo el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), el receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), el receptor de necrófago, miembros de la superfamilia del receptor de hormona esteroidea, incluyendo los receptores de glucocorticoides y los receptores de estrógeno, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Además, los productos génicos útiles incluyen factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen caja ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, AF5, NFAT, Cr Eb , HNF-4, c/EBP, SP1, proteínas de unión a caja CCa At , factor de regulación de interferón (IRF-1), proteína de tumor de Wilms, por ejemplo, proteína de unión a ETS, STAT, proteínas de unión a caja GATA, por ejemplo, GATA-3, y la familia forkhead de proteínas de hélice alada.
Otros productos génicos útiles incluyen carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, porfobilinógeno desaminasa, factor VIII, factor IX, cistationa beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-coA deshidrogenasa, pripionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvirato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora de transmembrana de fibrosis cística (CFTR), y una secuencia de ADNc de distrofina. Incluso otros productos génicos adicionales incluyen enzimas tales que puedan ser útiles en terapia de reemplazo enzimático, que es útil en una diversidad de afecciones que se producen por una actividad enzimática insuficiente. Por ejemplo, las enzimas que contienen manosa-6-fosfato pueden utilizarse en terapias para enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, un gen adecuado incluye el que codifica la p-glucoronidasa (GUSB)).
Otros productos génicos útiles incluyen los polipéptidos de origen no natural, tal como los polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácidos de origen no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de diseño de cadena simple, podrían ser útiles en determinados pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias génicas de origen no natural, incluyen moléculas no codificantes y ácidos nucleicos catalíticos, tal como ribozimas, que podrían usarse para reducir la sobreexpresión de una diana.
La reducción y/o la modulación de la expresión de un gen es particularmente deseable para el tratamiento de afecciones hiperproliferativas caracterizadas por células hiperproliferativas, como son los cánceres y la psoriasis. Los polipéptidos diana incluyen los polipéptidos que se producen exclusivamente, o a niveles más altos, en células hiperproliferativas en comparación con células normales. Los antígenos diana incluyen polipéptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Además a los productos de oncogén como antígenos diana, los polipéptidos diana para tratamientos contra el cáncer y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos formados por linfomas de linfocito B y regiones variables de receptores de linfocito T de linfomas de linfocito T que, en algunas realizaciones, se usan también como antígenos diana para enfermedad autoinmunitaria. Otros polipéptidos asociados a tumor pueden usarse como polipéptidos diana tal como los polipéptidos que se encuentran a niveles más altos en células tumorales incluyendo el polipéptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1A y los polipéptidos de unión a folato.
Otros polipéptidos y proteínas terapéuticos adecuados incluyen los que pueden ser útiles para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades y trastornos autoinmunitarios, que confieren una amplia respuesta inmunoprotectora frente a dianas que están asociadas a autoinmunidad incluyendo los receptores celulares y las células que producen anticuerpos “autodirigidos”. Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por linfocitos T incluyen la artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple (EM), síndrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmunitaria, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Cada una de esas enfermedades se caracteriza por receptores de linfocito T (TCR) que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunitarias.
C. Transgenes inmunogénicos
Como alternativa, o además, los vectores de la invención pueden contener secuencias de AAV de la invención y un transgén que codifique un péptido, un polipéptido o una proteína que induzca una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno seleccionado. Por ejemplo, pueden seleccionarse inmunógenos de una diversidad de familias de virus. Como ejemplos de familias de virus deseables frente a las que podría ser deseable una respuesta inmunitaria se incluyen la familia picornavirus, que incluye los géneros rinovirus, que son responsables de aproximadamente el 50 % de los casos de resfriado común; los géneros enterovirus, que incluyen los poliovirus, coxsackievirus, ecovirus y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A; y los géneros aftovirus, que son responsables de las enfermedades de pie y boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de los virus picomavirus, los antígenos diana incluyen las VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. Otras familias de virus incluyen la familia de los calcivirus que abarca el grupo de virus de Norwalk, que son un importante agente causante de gastroenteritis epidémica. Otra familia deseable más para su uso en antígenos de direccionamiento para inducir respuestas inmunitarias en animales humanos y no humanos es la familia togavirus, que incluye los géneros alfavirus, que incluyen el virus de Sindbis, el virus del río Ross, y la encefalitis equina Venezolana, oriental y occidental, y los rubivirus, incluyendo el virus de la rubeola. La familia flaviviridae incluye el dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, la encefalitis de St. Louis y los virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos diana pueden generarse a partir del virus la hepatitis C o de la familia coronavirus, que incluye un número de virus no humanos tales como el virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), el virus gastroentérico transmisible porcino (cerdo), el virus de la encefalomielitis de hemaglutinante porcina (cerdo), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gato), el coronavirus entérico felino (gato), el coronavirus canino (perro) y los coronavirus respiratorios humanos, que pueden causar el resfriado común y/o la hepatitis no A, B o C. Dentro de la familia de coronavirus, los antígenos diana incluyen el E1 (también denominado M o proteína de matriz), E2 (también denominado S o proteína Spike), E3 (también denominado HE o hemaglutina-elterosa), glicoproteína (no presente en todos los coronavirus) o N (nucleocápside). Incluso otros antígenos pueden estar dirigidos contra la familia rabdovirus, que incluye los géneros vesiculovirus (por ejemplo, el virus de la estomatitis vesicular) y los géneros lisavirus (por ejemplo, rabias). Dentro de la familia rabdovirus se pueden obtener antígenos adecuados a partir de la proteína G o de la proteína N. La familia filoviridae, que incluye virus de fiebre hemorrágica tales como los virus de Marburg y de Ébola, puede ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramixovirus incluye el virus paragripal de tipo 1, el virus de paragripal de tipo 3, el virus de paragripal bovino de tipo 3, el rubulavirus (virus de las paperas, virus paragripal de tipo 2, virus paragripal de tipo 4, virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), peste bovina, morbilivirus, que incluye el sarampión y el moquillo canino, y neumovirus, que incluye el virus sincitial respiratorio. El virus de la gripe se clasifica dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antígeno (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N1). La familia bunyavirus incluye los géneros bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), flebovirus (fiebre del Valle de Rift), hantavirus (el puremala es un virus de la fiebre hemahagin), nairovirus (enfermedad de la oveja de Nairobi) y varios bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos frente a LCM y al virus de la fiebre de Lassa. La familia reovirus incluye los géneros reovirus, rotavirus (que causa gastroenteritis aguda en niños), orbivirus y cultivirus (fiebre de la garrapata de Colorado, Lebombo (humanos), encefalitis equina, lengua azul). La familia retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal que abarca enfermedades humanas y veterinarias tales como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye el VIH, el virus de la inmunodeficiencia del simio, el virus de la inmunodeficiencia felina, el virus de la anemia infecciosa equina y espumavirinal). La familia papovavirus incluye la subfamilia poliomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociados a cánceres o progresión maligna de papiloma). La familia adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causan enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia parvovirus incluye el parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felino, parvovirus canino y parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alfaherpesvirinae, que abarca los géneros simplexvirus (HSVI, HSVII), varicellovirus (pseudorrabias, varicela zóster) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los géneros citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los géneros citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye los géneros linfocriptovirus, EBV (linfoma de Burkitss), herpesvirus humano 6A, 6B y 7, herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi y herpesvirus cercopitecino (virus B), rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia cordopoxvirinae, que abarca los géneros ortopoxvirus (Viruela mayor (Viruela) y Vaccinia (Viruela vacuna)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la hepatitis B. Un virus no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antígeno es el virus de la hepatitis delta. Otro virus que es una fuente de antígeno es el virus Nipan. Otras fuentes de virus más pueden incluir el virus de la enfermedad bursal infecciosa aviar y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de arteritis equina y varios virus de encefalitis.
Otros inmunógenos que son útiles para inmunizar un animal humano o no humano frente a otros patógenos incluyen bacterias, hongos, microorganismos parásitos o parásitos multicelulares que infectan vertebrados humanos y no humanos, o procedentes de células cancerígenas o de células tumorales. Los ejemplos de patógenos bacterianos incluyen los cocos patógenos Gram positivos incluyendo los neumococos; estafilococos (y las toxinas producidas por los mismos, por ejemplo, la enterotoxina B); y, estreptococos. Los cocos patógenos Gram negativos incluyen los meningococos; gonococos. Los bacilos entéricos patógenos gramnegativos incluyen enterobacteriáceas; seudomonas, acinetobacterias y eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; hemófilos; moraxella; H. ducreyi (que causa el chancro); especies de Brucella (brucelosis); Francisella tularensis (que causa la tularemia); Yersinia pestis (plaga), y otra yersinia (pasteurella); Streptobacillus moniliformis y spirillum; bacilos grampositivos que incluyen Listeria monocytogenes; Erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphteria (difteria); cólera; B. anthracis (ántrax); donovanosis (granuloma inguinal); y, bartonelosis. Las enfermedades causadas por bacterias anaerobias patógenas incluyen el tétano; botulismo (Clostridium botulimum y su toxina); Clostridium perfringens y su toxina épsilon; otras clostridias; tuberculosis; lepra, y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patógenas incluyen la sífilis; trepanomatosos; sífilis pián, pinta y endémica; y, leptoespirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patógenas y por hongos patógenos superiores incluyen muermo (Burkolderia mallei); actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidiyodomicosis; candidiasis, aspergilosis, y mucomicosis; esporotricosis; paracoccidiyodomicosis, petriellidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones rickettsianas incluyen la fiebre del tifus, la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, la fiebre Q (Coxiella burnetti) y Rickettsialpox. Ejemplos de micoplasma e infecciones clamidiales incluyen: infecciones por Mycoplasma pneumoniae; linfogranuloma venéreo; psitacosis; e infecciones clamidiales perinatales. Los eucariotas patógenos abarcan protozoos y helmintos patógenos y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniosis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; infecciones por Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos, trematodos o fasciolas; e infecciones por cestodos (tenia).
Muchos de esos organismos y/o de las toxinas producidas por los mismos han sido identificados en los Centros de Control de Enfermedades [(CDCE), Departamento de Salud y de Servicios Humanos, USA], como agentes que tienen un posible uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de esos agentes biológicos incluyen el Bacillus anthracis (ántrax), el Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (plaga), Variola major (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y las fiebres hemorrágicas víricas [filovirus (por ejemplo Ébola, Marburg] y arenavirus [por ejemplo, Lassa, Machupo]), todos ellos actualmente clasificados como Agentes de Categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies de Brucella (brucelosis), Burkolderia mallit (muermo), Burkliolderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina épsilon), especies de estafilococos y sus toxinas (enterotoxina B), Chlamydia psittaci (psitacosis), ataques a la seguridad del agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum), fiebre del tifus (Rickettsia powazekii)y encefalitis vírica (alfavirus, por ejemplo, encefalitis equina Venezolana; encefalitis equina oriental; encefalitis equina occidental), todos ellos actualmente clasificados como agentes de Categoría B; y virus Nipan y hantavirus, que están actualmente clasificados como agentes de Categoría C. Además, otros organismos, que están clasificados de ese modo o clasificados de forma diferente, pueden identificarse y/o usados para tal propósito en el futuro. Se comprenderá fácilmente que los vectores víricos y otras construcciones descritas en la presente memoria son útiles para la administración de antígenos a partir de esos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, que impedirán y/o tratarán la infección u otras reacciones adversas con esos agentes biológicos.
La administración de los ácidos nucleicos recombinantes de la invención para administrar inmunógenos frente a la región variable de los linfocitos T provoca una respuesta inmunitaria que incluye CTL para eliminar esos linfocitos T. En la artritis reumatoide (AR), se han caracterizado varias regiones variables específicas de TCR que están implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V-3, V-14, V-17 y V-17. De ese modo, la administración de una secuencia de ácido nucleico que codifique al menos uno de esos polipéptidos provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a los linfocitos T que participan en la AR. En la esclerosis múltiple (EM), se han caracterizado varias regiones variables específicas de TCR que están involucradas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V-7 y V-10. De este modo, la administración de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de esos polipéptidos provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a linfocitos T que participan en la EM. En la escleroderma, se han caracterizado varias regiones variables específicas de TCR que están involucradas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V-6, V-8, V-14 y V-16, V-3C, V7, V-14, V-15, V-16, V-28 y V-12. De ese modo, la administración de una molécula de ácido nucleico que codifica al menos uno de esos polipéptidos proporcionará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a linfocitos T que participan en la escleroderma.
Por tanto, un vector vírico recombinante derivado de AAVr de la invención proporciona un vehículo eficaz de transferencia génica que puede suministrar in vivo o ex vivo un transgén seleccionado a una célula hospedadora seleccionada, incluso cuando el organismo tiene anticuerpos neutralizantes respecto a uno o más serotipos de AAV. El AAVr y las células se pueden mezclar ex vivo; las células infectadas se cultivan usando metodologías convencionales; y las células transducidas se re-infunden en el paciente.
Estas composiciones son particularmente muy adecuadas para la administración de genes a efectos terapéuticos y para inmunización, incluyendo la inducción de inmunidad protectora. Además, las composiciones de la invención también pueden usarse para la producción de un producto génico deseado in vitro. Para la producción in vitro, un producto deseado (por ejemplo, una proteína) puede obtenerse a partir de un cultivo deseado tras la transfección de células hospedadoras con un AAVr que contenga la molécula que codifique el producto deseado y cultivando el cultivo celular en condiciones que permitan la expresión. El producto expresado puede purificarse y aislarse después, según se desee. Las técnicas adecuadas de transfección, cultivo celular, purificación y aislamiento, son muy conocidas por los expertos en la materia.
Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos y realizaciones de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de genomas víricos de AAV8 recombinante dotados de ITR de AAV2
Se generaron construcciones de empaquetamiento quimérico fusionando secuencias de rep de AAV2 con secuencias cap de nuevos serotipos de AAV. Estas construcciones de empaquetamiento quimérico se usan, inicialmente, para el pseudotipificado de genomas de AAV recombinante que son portadores de las ITR de AAV2 por transfección triple de células 293 usando el plásmido auxiliar Ad5. Estos vectores pseudotipificados se usan para evaluar el comportamiento en estudios serológicos basados en transducción y para evaluar la eficacia de la transferencia génica de nuevos serotipos de AAV en diferentes modelos animales, incluyendo PNH y roedores, antes de que los virus intactos e infecciosos de estos nuevos serotipos se aíslen.
A. pAAV2GFP
El plásmido de AAV2 que contiene las ITR de AAV2 y la proteína fluorescente verde se expresó bajo el control de un promotor constitutivo. Este plásmido contiene los siguientes elementos: las ITR de AAV2, un promotor de CMV y las secuencias codificantes de la GFP.
B. Clonación del plásmido en trans
Para construir el plásmido quimérico en trans para la producción de vectores de AAV8 pseudotipificados recombinantes, el plásmido p5E18 (Xiao et al. 1999, J. Virol 73: 3994-4003) se dirigió parcialmente con Xho I para linealizar el plásmido en el sitio Xho I en la posición de 3169 pb solamente. Los extremos cortan Xho I donde después se cargan y vuelven a ligarse. Este plásmido p5E18 modificado se restringió con Xba I y Xho I en una digestión completa para retirar la secuencia génica cap de AAV2 y se reemplazó con un fragmento Spe I/Xho I de 2267 pb que contenía el gen cap de AAV8 que se aisló del plásmido pCRAAV86-5+15-4.
El plásmido resultante contiene las secuencias de rep de AAV2 para Rep78/68 bajo el control del promotor P5 de AAV2 y las secuencias de rep de AAV2 para Rep52/40 bajo el control del promotor P 19 de AAV2. Las secuencias de la cápside de AAV9 están bajo el control del promotor P40 de AAV2, que se ubica dentro de las secuencias de rep. Este plásmido contiene además un espaciador en dirección 5' de la ORF de rep.
Como alternativa, puede construirse un plásmido similar que utilice las secuencias de rep de AAV8 y las secuencias promotoras de AAV8 natural. Este plásmido se usó después para la producción de AAVr8, como se describe en el presente documento.
C. Producción de AAVr pseudotipificado
Las partículas de AAVr (vector de AAV2 en la cápside de AAV8) se generan usando un método sin adenovirus. En resumen, el plásmido en cis (plásmido pAAV2.1 lacZ que contiene las ITR de AAV2) y el plásmido en trans pCRAAV8 6-5+15-4 (que contiene rep de AAV2 y cap de AAV8) y el plásmido auxiliar, respectivamente, se cotransfectaron simultáneamente en células 293 en una proporción de 1:1:2 mediante precipitación con fosfato de calcio.
Para la construcción de los plásmidos auxiliares pAd, el plásmido pBG10 se adquirió en Microbix (Canadá). Un fragmento RsrII que contenía L2 y L3 se suprimió de pBHG10, dando como resultado el primer plásmido auxiliar, pAdA F13. El plásmido AdF1 se construyó clonando al fragmento Asp700/Sall con la supresión Pmel/Sgfl, aislando de pBHG10, en Bluescript. MLP, L2, L2 y L3 se suprimieron en el plásmido pAdAF1. Supresiones adicionales de un fragmento Nrul de 2,3 kb y posteriormente, un fragmento RsrII/Nrul de 0,5 kb generó los plásmidos auxiliares pAdAF5 y pAdAF6, respectivamente. El plásmido auxiliar, denominado pAF6, proporciona las funciones auxiliares esenciales de la ORF6 de E2 y E4 no proporcionadas por la célula auxiliar que expresa E1, pero se suprime de las proteínas de la cápside adenovírica y regiones E1 funcionales).
Por lo general, se transfectaron 50 mg de ADN (cis:trans:auxiliar) sobre una placa de cultivo tisular de 150 mm. Las células 293 se recogieron 72 horas después de la transfección, se sometieron a ultrasonidos y se trataron con desoxicolato sódico al 0,5 % (37 °C durante 10 min). Después, los lisados celulares se sometieron a dos series de gradiente con CsCl. Se recogieron las fracciones máximas que contenían el vector AAVr, se agruparon y se sometieron a diálisis frente a PBS.
Ejemplo 2 - Evaluación de vectores con cápsides de AAV8
Los vectores basados en AAV1 (2/1), AAV5 (2/5) y AAV2 (2/2) se desarrollaron esencialmente como se describe para AAV8 en el Ejemplo 1. Se determinaron títulos de copias de genoma (CG) de vectores de AAV por análisis TaqMan usando sondas y cebadores que se dirigen a la región poli A del SV40 como se describe previamente [Gao, G., et al., (2000) Hum Gene Ther 11,2079-91]. Se recuperaron viriones recombinantes por sedimentación con CsCl2 en todos los casos excepto en el AAV2/2, que se purificó mediante cromatografía con heparina.
Los vectores se construyeron para cada serotipo para diversos estudios in vitro e in vivo. Se incorporaron ocho casetes transgénicos diferentes en los vectores y se produjeron viriones recombinantes para cada serotipo. La recuperación de virus, basándose en copias de genoma, se resume en la Tabla 1. Los resultados de los vectores fueron altos para cada serotipo sin diferencias notables entre los serotipos. Los datos presentados en la tabla son resultados promedio de copias de genoma con una desviación típica x 1013 de lotes de producción múltiples de 50 transfecciones por placa (150 mm).
Tabla 1. Producción de vectores recombinantes
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Ejemplo 3 - Análisis serológico de vectores pseudotipificados
Ratones C57BL/6 recibieron una inyección de vectores de diferentes serotipos de vectores AAVCBA1AT por vía intramuscular (5 x 1011 CG) y se recogieron muestras de suero 34 días después. Para analizar la actividad neutralizante y neutralizante en cruzado de los sueros de cada serotipo de AAV, los sueros se analizaron en un ensayo de anticuerpos neutralizantes basado en transducción [Gao, G. P., et al., (1996) J Virol 70, 8934-43]. Más específicamente, la presencia de anticuerpos neutralizantes se determinó evaluando la capacidad del suero para inhibir la transducción de células 84-31 por virus indicadores (AAVCMVEGFP) de diferentes serotipos. Específicamente, se preincubó el virus indicador AAVCMVEGFP de cada serotipo [a una multiplicidad de infección (MOI) que conduce a una transducción del 90 % de células indicadoras] con suero termoinactivado de animales que recibieron diferentes serotipos de AAV o de ratones sin tratamiento previo. Después de 1 hora de incubación a 37 °C, se añadieron los virus a células 84-31 en placas de 96 pocillos durante 48 o 72 horas, dependiendo del serotipo del virus. La expresión de la GFP se midió con Fluorolmagin (Molecular Dynamics) y se cuantificó con el programa informático Image Quant. Los títulos de los anticuerpos neutralizantes se mostraron como la dilución en suero más alta que inhibía la transducción a menos de 50 %.
La disponibilidad de los vectores que expresaban la GFP simplificó el desarrollo de un ensayo para anticuerpos neutralizantes que se basó en la inhibición de la transducción en una estirpe celular permisiva (es decir, células 293 que expresan de manera estable E4 de Ad5). Se generaron sueros para seleccionar serotipos de AAV por inyección intramuscular de los virus recombinantes. Se evaluó la neutralización de la transducción de AAV con diluciones de 1:20 y 1:80 de los antisueros (Tabla 2). Los antisueros contra AAV1, AAV2, AAV5 y AAV8 neutralizaron la transducción del serotipo contra el que se generó el antisuero (AAV5 y AVV8 a un menor grado que AAV1 y AAV2) pero no la del otro serotipo (es decir, no hubo pruebas de neutralización en cruzado, lo que sugiere que AAV8 es un serotipo verdaderamente único).
Tabla 2: Análisis seroló ico de nuevos seroti os de AAV
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Los sueros humanos de 52 sujetos normales se exploraron para determinar la neutralización contra serotipos seleccionados. Se descubrió que ninguna muestra de suero neutralizaba al vector AAV2/8 mientras que los vectores AAV2/2 y AAV2/1 se neutralizaron en el 20 % y 10 % de los sueros, respectivamente. Una fracción de IgG agrupada humana, que representaba un conjunto de 60.000 muestras individuales, no neutralizó al vector AAV2/8, mientras que los vectores AAV2/2 y AAV2/1 se neutralizaron a títulos de suero iguales a 1/1280 y 1/640, respectivamente. Ejemplo 4 - Evaluación in vivo de diferentes serotipos de vectores de AAV
En este estudio, 7 genomas de AAV recombinante, AAV2CBhA1AT, AAV2AlbhA1AT, AAV2CMVrhCG, AAV2TBGrhCG, AAV2TBGcFIX, AAV2CMVLacZ y AAV2TBGLacZ se empaquetaron con proteínas de cápside de diferentes serotipos. En las 7 construcciones, los casetes de minigén se flanquearon con las ITR de AAV2. Como genes indicadores se usaron los ADNc de la a-antitripsina humana (A1AT), [Xiao, W., et al., (1999) J Virol 73, 3994­ 4003] las subunidades p de la hormona coriogonadotrópica (GC) de mono rhesus Zoltick, P. W. y Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2,657-9] el factor IX canino[Wang, L., et al., (1997) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 94, 11563-6] y genes de la p-galactosidasa bacteriana (es decir, Lac Z). Para la transferencia de genes dirigida al hígado, se usó bien el promotor del gen de la albúmina (Alb) de ratón [Xiao, W. (1999), citado anteriormente] o el promotor humano del gen la globulina que se une a la hormona tiroidea (TBG) [Wang (1997), citado anteriormente] para conducir la expresión específica de hígado de genes indicadores. En los experimentos de transferencia génica dirigida al músculo, se empleó bien el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) o el promotor de la p-actina de pollo con potenciador de CMV (CB) para dirigir la expresión de los indicadores.
Para la transferencia génica dirigida al músculo, se inyectaron vectores en la tibia derecha anterior de ratones desnudos NCR o C57BL/6 de 4-6 semanas de vida (Taconic, Germantown, NY) a una dosis de 1 x 1011 copias de genoma (CG) por animal. En los estudios de transferencia génica dirigida a hígado, los vectores se infundieron por vía intraportal en ratones desnudos NCR o C57BL/6 de 7-9 semanas de vida (Taconic, Germantown, NY), también a una dosis de 1 x 1011 copias de genoma (CG) por animal. Se recogieron muestras de suero por vía intraorbital a diferentes momentos después de la administración del vector. Los tejidos de músculo e hígado se recogieron en diferentes momentos para la criosección y tinción histoquímica con Xgal de animales que recibieron los vectores lacZ. Para el experimento de re-administración, ratones C56BL/6 recibieron inicialmente los vectores AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/7 y 2/8CBA1AT por vía intramuscular y seguido de expresión del gen A1A7 durante 7 semanas. Después los animales se trataron con AAV2/8TBGcFIX por vía intraportal y se estudiaron para determinar la expresión del gen cFIX.
Para cuantificar los niveles en suero de las proteínas hA1At, rhCG y cFIX, se realizaron ensayos basados en ELISA como se ha descrito anteriormente [Gao, G. P., et al., (1996) J Virol70, 8934-43; Zoltick, P. W. y Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2, 657-9; Wang, L., et al., Proc Natl Acad Sci EE.Uu .94, 11563-6]. Estos experimentos finalizaron cuando los animales se sacrificaron para extraer tejidos de músculo e hígado para la extracción de ADN y para realizar análisis cuantitativos de copias genoma de vectores presentes en tejidos diana, por TaqMan, usando el mismo conjunto de cebadores y sonda que en la titulación de las preparaciones del vector [Zhang, Y., et al., (2001) Mol Ther 3, 697- 707].
El comportamiento de los vectores basado en los nuevos serotipos se evaluó en modelos murinos de transferencia génica dirigida a músculo e hígado y se comparó con los vectores basados en los serotipos conocidos AAV1, AAV2 y AAV5. Los vectores que expresaban proteínas secretadas (A1AT y CG Tabla 3) se usaron para cuantificar eficacias de transducción relativas entre diferentes serotipos a través de análisis ELISA de sueros. La distribución celular de la transducción dentro del órgano diana se evaluó usando vectores que expresaban lacZ e histoquímica con X-gal.
El comportamiento de los vectores de AAV en el músculo esquelético se analizó después de inyección directa en los músculos anteriores de la tibia. Los vectores que contenían el mismo genoma basado en AAV2 con el gen temprano inmediato de CMV o un promotor de p-actina potenciado del CMV conducían la expresión del transgén. Estudios previos indican que los ratones C57BL/6 inmunocompetentes suscitaron respuestas humorales limitadas contra la proteína A1AT humana cuando se expresaba a partir de vectores de AAV [Xiao, W., et al., (1999) J Virol 73, 3994­ 4003].
En cada cepa, el vector AAV2/1 produjo los niveles más altos de A1AT y el vector AAV2/2 los más bajos, siendo los vectores AAV2/8 los que mostraban niveles de expresión intermedios. Los niveles máximos de CG 28 días después de inyección de ratones NCR nu/nu mostraron los niveles más altos de AAV2/7 y los más bajos de AAV2/2 con AAV2/8 y AAV2/1 entre ellos. La inyección de vectores lacZ de AAV2/1 produjo una expresión génica en los sitios de inyección en todas las fibras musculares, observándose sustancialmente menos fibras positivas en lacZ con los vectores AAV2/2 y AAV 2/8.
Se usaron modelos murinos similares para evaluar la transferencia génica dirigida al hígado. Se infundieron dosis idénticas de vector basadas en copias de genoma en las venas porta de ratones que se analizaron posteriormente para determinar la expresión del transgén. Cada vector contenía un genoma basado en AAV2 usando los promotores específicos de hígado descritos anteriormente (es decir, albúmina o globulina de unión a la hormona tiroidea) para conducir la expresión del transgén. Más particularmente, los casetes del minigén CMVCG y TBGCG se usaron para la transferencia génica dirigida a músculo e hígado respectivamente. Los niveles de rhCG se definieron como unidades relativas (Ur x 103). Los datos eran del ensayo de muestras de suero recogidas el día 28, después de la administración del vector (4 animales por grupo). Como se muestra en la Tabla 4, el impacto de las proteínas de cápside sobre la eficacia de la transducción de los vectores A1AT en ratones nu/nu y C57BL/6 y de vectores CG en ratones C57BL/6 era notable, es decir, AAV2/8 es el más eficaz para el pseudotipo para la transferencia génica dirigida a hígado.
Tabla 3. Expresión de la unidad p de la gonadotropina coriónica de mono rhesus (rhCG) en músculo e hígado de ratón .
Vector Músculo Hígado
AAV2/1 4,5 ± 2,1 1,6 ± 1,0
AAV2 0,5 ± 0,1 0,7 ± 0,3
AAV2/5 ND* 4,8 ± 0,8
AAV2/8 4,0 ± 0,7 76,0 ± 22,8
* No determinado en este experimento
En todos los casos, los vectores AAV2/8 produjeron los niveles más altos de expresión de transgén que variaban de 16 a 110 más de lo que se obtuvo con los vectores AAV2/2; la expresión de AAV2/5 fue intermedia. El análisis de secciones de hígado teñidas con X-Gal de animales que recibieron los vectores lacZ correspondientes mostró una correlación entre el número de células transducidas y los niveles totales de la expresión del transgén. Los ADN extraídos de hígados de ratones C57BL/6 que recibieron los vectores A1AT se analizaron con respecto a la abundancia del ADN del vector usando tecnología de PCR en tiempo real.
La cantidad de ADN de vector encontrada en el hígado 56 días después de la inyección se correlacionaba con los niveles de expresión de transgén (Tabla 4). Para este experimento, se usó un conjunto de sonda y cebadores que se dirigía a la región poliA del SV40 del genoma del vector para PCR TaqMan. Los valores que se muestran son las medias de tres animales individuales con desviaciones típicas. Los animales se sacrificaron el día 56 para extraer los tejidos de hígado para la extracción del ADN. Estos estudios indican que AAV8 es el vector más eficaz para la transferencia génica dirigida al hígado debido a un mayor número de hepatocitos transducidos.
Tabla 4. Análisis de PCR en tiempo real para determinar la abundancia de vectores AAV en hígado de ratones nu/nu tras la inyección de 1 x 1011 copias de genoma de vector
Vectores de AAV/Dosis Copias de genoma por célula
AAV2/1AIbA1AT 0,6 ± 0,36 AAV2AIbA1AT 0,003 ± 0,001 AAV2/5AIbA1AT 0,83 ± 0,64 AAV2/8AIbA1AT 18 ± 11
Los datos serológicos descritos anteriormente sugieren que el vector AAV2/8 no debe neutralizarse in vivo tras la inmunización con los otros serotipos. Los ratones C57BL/6 recibieron inyecciones intraportales de vector AAV2/8 que expresaba el factor IX canino (1011 copias de genoma) 56 días después de que recibieran inyecciones intramusculares de vectores A1AT de diferentes serotipos. Se obtuvieron niveles de expresión del factor IX altos 14 días después de la infusión de AAV2/8 en animales sin tratar (17 ± 2 pg/ml, N = 4) que no eran significativamente diferentes a los observados en animales inmunizados con AAV2/1 (31 ± 23 pg/ml, N = 4) y AAV2/2 (16 pg/ml, N = 2). Esto contrasta con lo observado en animales inmunizados con AAV2/8 que se infundieron con el vector AAV2/8 que expresaba el factor IX en los que no se observó factor IX detectable (< 0,1 pg/ml, N = 4).
Oligonucleótidos en regiones conservadas del gen cap amplificaron secuencias de monos rhesus que representaron AAV únicos. Se descubrieron secuencias de identificación de cap idénticas en tejidos múltiples de monos rhesus procedentes de al menos dos colonias diferentes. Se aislaron fases de lectura abierta de rep y cap de longitud completa y se secuenciaron de fuentes sencillas. Solamente las fases de lectura abierta de cap de los nuevos AAV eran necesarias para evaluar su potencial como vectores, porque los vectores con las cápsides de AAV8 se generaron usando las ITR y rep de AAV2. Esto también simplificó la comparación de diferentes vectores dado que el genoma del vector real es idéntico entre diferentes serotipos vector. De hecho, los rendimientos de vectores recombinantes generados usando esta estrategia no difieren entre serotipos.
Los vectores basados en AAV8 parecen ser inmunológicamente distintos (es decir, no son neutralizados por anticuerpos generados contra otros serotipos). Además, los sueros de seres humanos no neutralizan la transducción de vectores AAV8, que es una ventaja sustancial sobre los AAV procedentes de ser humano actualmente en desarrollo para los que una proporción significativa de la población humana tiene inmunidad preexistente que es neutralizante [Chirmule, N., et al., (1999) Gene Ther 6, 1574-83].
El tropismo del nuevo vector es favorable para aplicaciones in vivo. Cabe destacar que el AAV2/8 proporciona una ventaja sustancial frente a los otros serotipos en cuanto a eficacia de la transferencia génica al hígado que hasta ahora había sido relativamente decepcionante en términos de los números de hepatocitos transducidos de manera estable. AAV2/8 consiguió consecuentemente una mejora multiplicada por de 10 a 100 veces en la eficacia de la transferencia génica en comparación con los otros vectores. La base de la eficacia mejorada de AAV2/8 es ambigua, aunque se supone que se debe a la captación mediante un receptor diferente que es más activo en la superficie basolateral de los hepatocitos. Esta eficacia mejorada será bastante útil en el desarrollo de la transferencia génica dirigida al hígado cuando el número de células transducidas es de importancia fundamental, tal como en trastornos del ciclo de la urea e hipercolesterolemia familiar.
Por tanto, la ausencia de inmunidad preexistente contra AAV8 y el tropismo favorable de los vectores para el hígado indican que los vectores con proteínas de cápside AAV8 son adecuados para su uso como vectores en genoterapia humana y en otras aplicaciones in vivo.
Ejemplo 5 - Estudios de tropismo tisular
En el diseño de un esquema de exploración funcional de alto rendimiento para nuevas construcciones de AAV, se seleccionó un promotor muy activo y no específico de tejido, el promotor CB (promotor de p-actina de pollo potenciado por CMV) para conducir un gen indicador fácilmente detectable y cuantificable, el gen de la a-anti-tripsina humana. Por tanto únicamente se necesita preparar un vector para cada nuevo clon de AAV para estudios de transferencia génica que se dirigen a 3 tejidos diferentes, hígado, pulmón y músculo para explorar el tropismo tisular de una construcción de AAV particular. La siguiente tabla resume datos generados de nuevos vectores de AAV en estudios de tropismo tisular (AAVCBA1AT). La Tabla 5 indica datos obtenidos (en pg de A1AT/ml de suero) el día 14 del estudio.
Tabla 5
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Se proporcionaron vectores de AAV que portaban el minigén CC10hA1AT para la expresión específica en pulmón que se pseudotipificaron con cápsides de nuevos AAV a animales inmunodeficientes (desnudos NCR) en igual volumen (cada una de las preparaciones originales sin dilución de 50 pl) mediante inyecciones intratraqueales como se proporciona en la siguiente tabla. Los vectores también se administraron a animales inmunocompetentes (C57BL/6) en iguales copias de genoma (1 x 1011CG) como se muestra en la Tabla 6. (1 x 1011CG por animal, C57BL/6, día 14, límite de detección > 0,033 pg/ml). Como se muestra, AAV8 es el mejor transductor en hígado.
Tabla 6
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Ejemplo 6 - Modelo de hipercolesterolemia
Para evaluar además el efecto de la expresión transgénica mediada por AAVr por las construcciones AAV2/8 de la invención, se realizó un estudio adicional.
A. Construcción del vector
Se construyeron vectores de AAV empaquetados con proteínas de cápside de AAV8 usando una estrategia de pseudotipificado [Hildinger M, et al., J. Virol 2001; 75: 6199-6203]. Se empaquetaron genomas de AAV recombinante con repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 mediante triple transfección de células 293 con el plásmido en cis, el plásmido auxiliar de adenovirus y una construcción de empaquetamiento quimérica, una fusión de las cápsides de los nuevos serotipos de AAV con el gen rep de AAV2. El plásmido de empaquetamiento quimérico se construyó como se ha descrito anteriormente [Hildinger et al, citado anteriormente]. Los vectores recombinantes se purificaron mediante el método de sedimentación convencional con CsCl2. Para determinar el rendimiento, se realizó análisis TaqMan (Applied Biosystems) usando sondas y cebadores que se dirigían a la región poli(A) del SV40 de los vectores [Gao Gp, et al., Hum Gene Ther. 10 de octubre de 2000; 11 (15):2 079-91]. Los vectores resultantes expresan el transgén bajo el control del promotor del gen de la globulina que se une a la hormona tiroidea (TBG) humana.
B. Animales
Se adquirieron ratones deficientes en cuanto al receptor de LDL con antecedentes de C57B1/6 procedentes del laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME, EEUU) y se mantuvieron como una colonia en reproducción. Los ratones tuvieron acceso ilimitado a agua y obtuvieron una dieta Western rica en grasa (alto % de colesterol) comenzando tres semanas antes de la inyección del vector. El día -7, así como el día 0, se obtuvo sangre mediante extracciones retroorbitales y se evaluó el perfil lipídico. Los ratones se dividieron al azar en siete grupos. El vector se inyectó mediante una inyección intraportal como se ha descrito previamente ([Chen S. J. et al., Mol Therapy 2000; 2(3), 256­ 261]. Resumiendo, los ratones se anestesiaron con quetamina y xilazina. Se realizó una laparotomía y se expuso la vena porta. Usando una aguja de calibre 30, se inyectó la dosis apropiada de vector diluida en 100 pl de PBS directamente en la vena porta. Se aplicó presión al sitio de inyección para garantizar que se detenía el sangrado. La herida de la piel se cerró y se cubrió, y los ratones se monitorizaron detenidamente al día siguiente. Se realizaron extracciones semanales comenzando el día 14 después de la transferencia génica dirigida al hígado para medir los lípidos en sangre. Se sacrificaron dos animales de cada grupo en momentos de la semana 6 y semana 12 después de la inyección del vector para examinar el tamaño de la placa aterosclerótica, así como la expresión del receptor. Los ratones restantes se sacrificaron a la semana 20 para la medición de las placas y la determinación de la expresión del transgén.
Vector Dosis N
Grupo 1 AAV2/8-TBG-hLDLr 1x 1012 cg 12
Grupo 2 AAV2/8-TBG-hLDLr 3x 1011 cg 12
Grupo 3 AAV2/8-TBG-hLDLr 1x 1011 cg 12
C. Lipoproteína en suero y análisis de la función hepática
Se obtuvieron muestras de sangre de los plexos retroorbitales después de un período de ayunas de 6 horas. El suero se separó del plasma por centrifugación. La cantidad de lipoproteínas plasmáticas y de transaminasas hepáticas en el suero se detectó usando un analizador químico clínico automatizado (ACE, Schiapparelli Biosystems, Alpha Wassermann).
D. Detección de la expresión transgénica
La expresión de receptor de LDL se evaluó mediante tinción con inmunofluorescencia y transferencia de Western. Para la transferencia de Western se homogeneizó tejido hepático congelado con tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 130 mM, Triton X 100 al 1 %, inhibidor completo de proteinasa, sin EDTA, Roche, Mannheim, Alemania). La concentración de proteínas se determinó usando el Kit Micro BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL). Se resolvieron 40 pg de proteína en Geles Ready Tris-HCl al 4-15 % (Biorad, Hercules, CA) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). Para generar anticuerpos contra el receptor de hLDL, un conejo recibió una inyección intravenosa de preparación de AdhLDLr (1 x 1013 cg). Cuatro semanas después, se obtuvo el suero del conejo y se usó para la Transferencia de Western. Se usó una dilución de 1:100 del suero como un anticuerpo primario seguido por un anti-IgG de conejo conjugado con HRP y detección quimioluminiscente de ECL (Kit de Detección de Transferencia de Western ECL, Amersham, Arlington Heights, IL).
D. Inmunohistoquímica
Para la determinación de la expresión del receptor de LDL se realizaron análisis inmunohistoquímicos en secciones de hígado congeladas. Secciones crioestáticas de 10 um se fijaron en acetona durante 5 minutos o no se fijaron. El bloqueo se obtuvo mediante un período de incubación de 1 hora con 10 % de suero de cabra. Después, las secciones se incubaron durante una hora con el anticuerpo primario a temperatura ambiente. Se usó un anticuerpo policlonal de conejo contra LDL humano (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secciones se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo contra IgG de conejo con fluoresceína diluido a 1:100 (Sigma, St. Louis, MO). Los especímenes se examinaron finalmente al microscopio de fluorescencia, Nikon Microphot F-XA. En todos los casos, tras cada incubación se realizó un lavado exhaustivo con PBS. Los controles negativos consistían en una preincubación con PBS, omisión del anticuerpo primario y sustitución del anticuerpo primario por un anticuerpo control no inmunitario del mismo isotipo. Los tres tipos de controles mencionados anteriormente se realizaron para cada experimento el mismo día.
E. Eficacia de la transferencia génica
Se obtuvo tejido de hígado después de sacrificar los ratones en los momentos indicados. El tejido se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservó a -80 °C hasta procesamiento posterior. El ADN se extrajo del tejido de hígado usando un Mini Kit de ADN QIAamp (QIAGEN GmbH, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las copias de genoma de vectores AAV en el tejido de hígado se evaluaron usando análisis Taqman usando sondas y cebadores contra la cola poli(A) de SV40 como se ha descrito anteriormente.
F. Medición de las placas ateroscleróticas
Para la cuantificación de las placas ateroscleróticas en las aortas de ratón, los ratones se anestesiaron (quetamina y xilazina al 10 %, i.p.), el tórax abierto y el sistema arterial se perfundió con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo a través del ventrículo izquierdo. Después, se extrajo la aorta con cuidado, se deslizó a lo largo de la línea media ventral desde el arco aórtico hacia abajo de las arterias femorales y se fijó en formalina. Las placas ateroscleróticas ricas en lípidos se tiñeron con Sudan IV (Sigma, Alemania) y la aorta se sujetó en horizontal en una superficie de cera negra. La imagen se capturó con una cámara de video de color Sony DXC-960 MD. El área de la placa así como la superficie aórtica completa se determinaron usando el sistema Phase 3 Imaging (Media Cybernetics).
G. Eliminación de LDL marcado con I125
Se ensayaron dos animales por grupo experimental. Se infundió un bolo de LDL marcado con I125 (proporcionado generosamente por Dan Rader, Upenn) lentamente a través de la vena de la cola durante un período de 30 segundos (1.000.000 de recuentos de LDL-[I125] diluido en 100 pl de PBS estéril/animal). En los momentos de 3 min, 30 min, 1,5 h, 3 h, 6 h después de la inyección, se obtuvo una muestra de sangre mediante el plexo retroorbital. El plasma se separó de la sangre completa y se contaron 10 pl de plasma en el contador gamma. Finalmente se calculó la tasa catabólica fraccional a partir de los datos de eliminación de lipoproteína.
H. Evaluación de la acumulación de lípidos en el hígado
Se realizó tinción con Oil Red de secciones de hígado congeladas para determinar la acumulación de lípidos. Las secciones de hígado congeladas se aclararon brevemente en agua destilada, seguido de una incubación de 2 minutos en propilenglicol absoluto. Las secciones se tiñeron después en solución de Oil Red (0,5 % en propilenglicol) durante 16 horas, seguido de la tinción por contraste con solución de hematoxilina de Mayer durante 30 segundos y se montaron en una solución gelatinosa de glicerina caliente.
Para la cuantificación del contenido de colesterol y triglicérido hepático, las secciones de hígado se homogeneizaron y se incubaron en cloroformo/metanol (2:1) durante noche. Después de añadir H2SO4 al 0,05 % y de centrifugar durante 10 minutos, la capa inferior de cada muestra se recogió, se dividió en dos alícuotas y se secó con nitrógeno. Para la medición de colesterol, los lípidos secos de la primera alícuota se disolvieron en Triton X-100 al 1 % en cloroformo. Una vez disueltos, la solución se secó con nitrógeno. Después de disolver los lípidos en ddH2O e incubar durante 30 minutos a 37 °C, la concentración de colesterol total se midió usando un Kit de Colesterol Total (Wako Diagnostics). Para la segunda alícuota los lípidos secos se disolvieron en KOH alcohólico y se incubaron a 60 °C durante 30 minutos. Después se añadió MgCl2 1 M, seguido de incubación en hielo durante 10 minutos y centrifugación a 14.000 rpm durante 30 minutos. Finalmente, el sobrenadante se evaluó con respecto a los triglicéridos (Wako Diagnostics).
Todos los vectores pseudotipificados en una cápside de AAV2/8 redujeron el colesterol total, el LDL y los triglicéridos en comparación con el control. Estos vectores de ensayo también corrigieron el fenotipo de hipercolesterolemia de una manera dependiente de la dosis. Se observó una reducción en el área de las placas para los ratones tratados con AAV2/8 en los ratones tratados en el primer ensayo (2 meses) y se observó que el efecto persistía durante todo el experimento (6 meses).
Ejemplo 7 - Expresión del factor IX funcional y corrección de la hemofilia
A. ratones nuligénicos
La expresión del factor IX (FIX) canino funcional se evaluó en ratones con hemofilia B. Se construyeron vectores con cápsides de AAV1, AAV2, AAV5 o AAV8 para administrar la ITR en dirección 5' del AAV2 - el promotor específico de hígado [LPS] - el FIX canino - el elemento post-regulador de la hepatitis de la marmota (WPRE) - la ITR en 3' del AAV2. Los vectores se construyeron como se describe en Wang et al., 2000, Molecular Therapy 2: 154-158), usando las cápsides apropiadas.
Se generaron ratones nuligénicos como se describe en Wang et al, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 11563­ 11566. Este modelo imita fielmente los fenotipos de la hemofilia B en el ser humano.
Los vectores de diferentes serotipos se administraron como una sola inyección intraportal en el hígado de ratones adultos C57B1/6 hemofílicos a una dosis de 1 x 1011 CG/ratón para los cinco serotipos diferentes y también se administró un segundo vector de AAV8 a 1 x 1010 CG/ratón. Se inyectaron al grupo de control 1 x 1011 CG de LacZ3 con TBG en AAV2/8. Cada grupo contenía 5-10 ratones macho y hembra. La sangre de los ratones se extrajo cada dos semanas después de la administración del vector.
1. ELISA
La concentración del FIX canino en el plasma de ratón se determinó mediante un ensayo ELISA específico para el factor IX canino, realizado esencialmente como se describe en Axelrol et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87: 5173-5177 con modificaciones. Se usó anti-factor IX canino de oveja (Enzyme Research Laboratories) como anticuerpo primario y anti-factor IX canino de conejo (Enzyme Research Laboratories) como anticuerpo secundario. Comenzando a las dos semanas después de la inyección, se detectaron niveles en plasma aumentados de cFIX en todos los vectores de ensayo. Los niveles aumentados se mantuvieron a niveles terapéuticos a lo largo del experimento, es decir, hasta 12 semanas. Se consideró que los niveles terapéuticos constituían un 5 % de los niveles normales, es decir, aproximadamente 250 ng/ml.
Los niveles de expresión más altos se observaron para el AAV2/8 (a 1011), con niveles cFIX superfisiológicos sostenidos (diez veces más altos que los niveles normales). Los niveles de expresión para AAV2/8 (1011) resultaron ser aproximadamente 10 veces más altos que los observados para AAV2/2 y AAV2/8 (1010). Los niveles de expresión más bajos, aunque aún por encima del intervalo terapéutico, se observaron para AAV2/5.
2. Ensayo in vitro de tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa)
La actividad del factor IX funcional en plasma de los ratones nuligénicos para FIX se determinó mediante un ensayo in vitro de tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa). Se recogieron muestras de sangre de ratón del plexo retroorbital en un volumen de 1/10 de tampón citrato. El ensayo de TTPa se realizó como describen Wang et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 11563-11566.
Los tiempos de coagulación mediante el TTPa en muestras de plasma de todos los ratones inyectados con el vector, estaban dentro del intervalo normal (aproximadamente 60 s) cuando se midieron dos semanas después de la inyección, y los tiempos de coagulación se mantuvieron en el intervalo normal o más corto que el intervalo normal a lo largo del estudio (12 semanas).
Se observaron tiempos de coagulación mantenidos más bajos en los animales que recibieron AAV2/8 (1011). A la semana 12, el AAV2/2 también indujo tiempos de coagulación similares a los de AAV2/8. Sin embargo, este tiempo de coagulación más bajo no se observó para AAV2/2 hasta la semana 12, mientras que se observaron tiempos de coagulación más bajos (en el Intervalo de 25 a 40 ) para AAV2/8 comenzando a la semana dos.
La tinción inmunohistoquímica de los tejidos del hígado extraídos de algunos de los ratones tratados se realiza del modo habitual. Aproximadamente el 70-80 % de los hepatocitos se tiñeron positivos para el FIX canino en el ratón inyectado con el vector AAV2/8.cFIX.
B. Perros con hemofilia B
Los perros que tienen una mutación puntual en el dominio catalítico del gen F.IX que, basándose en estudios de modelización, parece volver inestable a la proteína, padecen hemofilia B [Evans et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 86: 10095-10099). Durante más de dos décadas, se ha mantenido una colonia de estos perros en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill. Los parámetros homeostáticos de estos perros se describen bien y se incluye la ausencia de antígeno F.IX en plasma, tiempos de coagulación de sangre entera en exceso de 60 minutos, mientras que en los perros normales es de 6-8 minutos, y tiempo de tromboplastina parcial activado prolongado, de 50-80 segundos, mientras que en los perros normales es de 13-28 segundos. Estos perros experimentan hemorragias espontáneas recurrentes. Por lo general, los episodios de sangrado significativos se controlaron satisfactoriamente a través de una infusión intravenosa simple de 10 ml/kg de plasma canino normal; ocasionalmente, se requieren infusiones repetidas para controlar el sangrado.
Cuatro perros recibieron mediante inyección intraportal VAA.cFIX de acuerdo con el siguiente programa. Un primer perro recibió una sola inyección de VAA2/2.cFIX a una dosis de 3,7 x 1011 copias de genoma (CG)/kg y se sacrificó el día 665 debido a una hemorragia espinal grave. Un segundo perro recibió una primera inyección de VAA2/2.cFIX (2,8 x 1011CG/kg), seguido de una segunda inyección de VAA2/2.cFIX (2,3 x 1013 CG/kg) el día 1180. Un tercer perro recibió una sola inyección de VAA2/2.cFIX a una dosis de 4,6 x 1012 CG/kg. El cuarto perro recibió una inyección de VAA2/2.cFIX (2,8 x 1012CG/kg) y una inyección el día 995 de VAA2/8.cFIX (5 x 1012 CG/kg).
El abdomen de los perros con hemofilia se abrió aséptica y quirúrgicamente con anestesia general y se administró una sola infusión de vector en la vena porta. Los animales se protegieron de la hemorragia en el período perioperatorio mediante administración intravenosa de plasma canino normal. El perro se sedó, se entubó para inducir la anestesia general, y se rasuró el abdomen y se preparó. Después de abrir el abdomen, se extirpó el bazo en el campo operativo. Se localizó la vena esplénica y se colocó una sutura holgada próxima a la incisión distal pequeña en la vena. Rápidamente, se introdujo en la vena un globo de catéter, después se aflojó la sutura y se enroscó una cánula de 5 F en una localización intravenosa cerca de la vena porta roscada en una localización intravenosa cerca de la bifurcación de la vena porta. Después, se aseguró la hemostasis y se infló el globo del catéter, aproximadamente 5,0 ml de vector diluido en PBS se infundió en la vena porta durante un intervalo de 5 minutos. Después de la infusión del vector se infundieron 5,0 ml de solución salina. A continuación se desinfló el globo, se extrajo la cánula y se aseguró la hemostasis venosa. Después, se reemplazó el bazo, se cauterizaron los vasos sangrantes y se cerró la herida quirúrgica. El tubo se extrajo del animal que había tolerado bien el procedimiento quirúrgico. Las muestras de sangre se analizaron como se describe. [Wang et al., 2000, Molecular Therapy 2: 154-158].
Los resultados se resumen en la siguiente tabla. El perro hembra C51, pesaba 13,6 kg y tenía 6,5 meses de vida en el momento de la primera inyección. El perro macho C52, pesaba 17,6 kg y tenía 6,5 meses de vida en la primera inyección; y 17,2 kg y 45,2 meses en la segunda inyección. El perro macho C55, tenía un peso de 19,0 kg y 12,0 meses en la primera inyección. El perro hembra D39 pesada 5,0 kg y tenía 2,8 meses en la primera inyección; 22,6 kg y 35,4 meses de vida en el momento de la segunda inyección. En la tabla, CG se refiere a las copias de genoma de los vectores de AAV. El TCST, fue mayor de 60 minutos (excepto en C52 que fue de 42 minutos) antes de la inyección. El TTPa inicial para C51 fue = 98,4 s, para C52 = 97,7 s; para C55 = 145,1 s y para D39 = 97,8 s. Los sangrados después del tratamiento eran episodios de sangrado espontáneos que se producían en perros con hemofilia B después del tratamiento con el vector de AAV que requerían tratamiento con infusión de plasma.
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1. Tiempo de coagulación de sangre total (TCST)
El TCST después de inyección con los vectores AAV2/2 era algo variable, oscilando de aproximadamente 6,5 min a 30 min. El TCST para un perro normal es de 6-12 min. Se observaron descensos bruscos en el TCST inmediatamente después de la inyección de los vectores AAV2/8 o AAV2/5. También se observó un descenso brusco en el perro C55 inyectado con AAV2 (d2 = 9 min), y para C51 y C52, los puntos de datos iniciales para el TCST no se comprobaron. Se piensa que el descenso brusco se debe a la infusión de plasma de perro antes y después de la cirugía. El TCST es un ensayo muy sensible a nivel bajo de FIX, no es muy sensible a nivel real de FIX (el TTPa es más relevante).
2. Ensayo de TTPa
Los tiempos de coagulación mediante un TTPa en muestras de plasma de todos los perros inyectados con vectores fueron variables durante los primeros aproximadamente 700 días, momento en el que los tiempos de coagulación se igualaron al intervalo normal (40 - 60 s, perro normal: 24-32 s). Se observó un descenso brusco en el intervalo normal después de cada una de las segundas inyecciones (AAV2/8 o AAV2/5). Aunque los tiempos de coagulación no se mantuvieron en el intervalo normal, los tiempos de coagulación se redujeron a niveles por debajo de los observados antes de la segunda inyección.
El TTPa en perros normales era de 24-32 s y en los perros con hemofilia B era de 80-106 segundos. Para los perros C51 y C52, que recibieron una dosis baja de vector AAV2.cFIX, el TTPa promedio después del tratamiento permaneció a 77,5 y 81,5 segundos, sin diferencia significativa con respectos a los perros con hemofilia B sin tratamiento. Una dosis mayor de AAV2 mejoró el TTPa promedio a 59,1 y 46,4 segundos, respectivamente para el perro D39 y el C55. Después del tratamiento con AAV2/5, el TTPa promedio para el perro C52 mejoró significativamente de 81,5 a 41,9 segundos. Y para el perro D39, después del tratamiento con AAV2/8, el TTPa promedio mejora desde 59,1 segundos.
3. ELISA del factor IX canino
Los niveles del cFIX resultaron ser detectables después del primer conjunto de inyecciones, aunque por debajo de los niveles terapéuticos. Después de la inyección de AAV2/8 y AAV2/5, los niveles de cFIX se dispararon en el intervalo terapéutico y después se igualaron dentro del intervalo terapéutico (lo normal es de 5 pg/ml en plasma, el nivel terapéutico es el 5 % del nivel normal que es de 250 ng/ml).
Las tres primeras semanas de TCST, el TTPa y el antígeno cFIX se vieron afectados por la infusión del plasma de perro antes y después de la cirugía. Es complicado llegar a la conclusión de que el descenso del tiempo de coagulación o el aumento del nivel de antígeno cFIX se deba al vector o a la infusión de plasma durante las 3 primeras semanas. Sin embargo, es interesante observar que se produce un aumento rápido y drástico del antígeno cFIX después de la inyección del vector 2/5 y 2/8. Esto es único para los perros inyectados con AAV2/5 y 2/8, y podría atribuirse a los vectores AAV2/5 y 2/8, más que a la infusión de plasma de perro normal, ya que todos los perros recibieron una cantidad similar de infusión de plasma de perro normal para la cirugía. T res días después de la inyección de AAV2/8, el nivel de cFIX en el plasma del perro D39 alcanzó 9,5 pg/ml y ascendió a 10,4 pg/ml el día 6, tanto como el doble del nivel normal (5 pg/ml). El nivel de cFIX disminuyó gradualmente al promedio de 817 ng/ml (C52, AAV2/5) y de 657 ng/ml (D39, AAV2/8). En el perro C52, 3 días después de la inyección del vector AAV2/5, el nivel de cFIX alcanzó 2,6pg/ml y ascendió a 4,6 pg/ml el día 7. En el perro C55, que recibió el vector AAV2 a una dosis similar a la del perro D39 inyectado con AAV2/8, ascendió solo a 2,2 pg/ml el día 3, disminuyendo gradualmente después y se mantuvo al 5 % del nivel normal de cFIX.
Las dosis del vector que recibió el perro C55 (AAV2, 4,6 x 102 CG/kg) y la segunda inyección en el perro D39 (AAV2/8, 5 x 1012CG/kg) eran muy parecidas. Sin embargo, los niveles de expresión de cFIX aumentados en D39 por el vector AAV2/8 (promedio 657-34 = 623 ng/ml, 12,5 % del nivel normal) eran 2,5 veces más altos que los de C55 (promedio 259 ng/ml, 5 % del nivel normal). Esto sugiere que AAV2/8 es 2,5 veces más fuerte que AAV2 en perros inyectados por vía intraportal con una dosis similar de vectores. Y en el mismo perro D39, la segunda inyección de dosis dos veces mayores de AAV2/8 aumentó drásticamente el nivel de cFIX del 0,7 % al 13,1 %, 18,7 veces más alto que la primera inyección. Y en C52, la segunda inyección de 2,3 x 1013 CG/ml de vector AAV2/5 dio como resultado un promedio de 817 ng/ml (16,3 % del nivel normal) de cFIX en el plasma. Esto era solo ligeramente más alto (1,3 veces) que el nivel de cFIX aumentado en D39 mediante AAV2/8 (promedio de 623 ng/ml, 12,5 % del nivel normal). Sin embargo, la dosis de AAV2/5 inyectada en el perro C52 fue 4,6 veces más alta que la dosis de AAV2/8 inyectado en el perro D39. Esto sugiere que el vector AAV2/8 también es más fuerte que el vector AAV2/5 en perros.
La primera inyección de vectores AAV2 no bloqueó el éxito de la transducción con los vectores AAV2/5 y AAV2/8 después de la segunda inyección en perros. La readministración usando un serotipo diferente de vector de AAV puede usarse como una estrategia para tratar animales o seres humanos que previamente se han expuesto a AAV2 o que se han tratado con vectores de AAV2.
Ejemplo 8 - Modelo de ratón de trastorno enzimático de hígado
El vector AAV2/8 generado como se describe en el presente documento se estudió para determinar su eficacia en la transferencia del gen enzimático hepático ornitina transcarbamilasa (OTC) en un modelo animal aceptado de insuficiencia de OTC [X. Ye et al, Pediatric Research, 41(4): 527-534 (1997); X. Ye et al, J. Biol. Chem., 271(7): 3639-3646 (febrero de1996)]. Los resultados de este experimento (datos no mostrados) demuestran que se observó que un vector de AAV2/8 de la invención, que portaba el gen de la ornitina transcarbamilasa (OTC), corregía la insuficiencia de OTC.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a realizaciones particularmente preferidas, se apreciará que pueden realizarse modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.
En el presente documento, se describen los siguientes aspectos.
1. Un virus adeno-asociado (AAV) aislado que comprende una cápside de AAV que tiene una secuencia de aminoácidos de AAV8, los aminoácidos 1 a 738 de la SEQ ID NO: 2.
2. El AAV aislado de acuerdo con el aspecto 1, en el que dicho virus tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.
3. El AAV aislado de acuerdo con el aspecto 1, en el que dicho AAV comprende además un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo unido operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula hospedadora.
4. Una proteína que comprende una proteína AAV8 o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una proteína de la cápside de AAV8 o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en: proteína de la cápside vp1, aminoácidos (aa) 1 a 738;
proteína de la cápside vp2, aa 138 a 738;
proteína de la cápside vp3, aa 204 a 738;
un fragmento que abarca la región hipervariable (HVR) 1 a 12 o un fragmento más pequeño de la misma seleccionado del grupo que consiste en: aa 146 a 152; aa 182 a 187; aa 262 a 264; aa 263 a 266; aa 263 a 266; aa 381 a 383; 383 a 385; aa 450 a 474; aa 451 a 475; aa 490 a 495; aa 491 a 496; aa 500 a 504; aa 501 a 505; aa 514 a 522; aa 533 a 554; aa 534 a 555; aa 581 a 594; aa 583 a 596; aa 658 a 667; aa 660 a 669; y aa 705 a 719; aa 707 a 723;
aa 24 a 42, aa 25 a 28; aa 81 a 85; aa 133 a 165; aa 134 a 165; aa 137 a 143; aa 154 a 156; aa 194 a 208; aa 261 a 274; aa 262 a 274; aa 171 a 173; aa 185 a 198; aa 413 a 417; aa 449 a 478, aa 494 a 525; aa 534 a 571; aa 581 a 601; aa 660 a 671; aa 709 a 723; y
aa 1 a 184, aa 199 a 259; aa 274 a 446; aa 603 a 659; aa 670 a 706; aa 724 a 736; aa 185 a 198; aa 260 a 273; aa 447 a 477; aa 495 a 602; aa 603 a 659; aa 660 a 669; y aa 707 a 723, en el que los números de aminoácido son los de la cápside de AAV2, SEQ ID NO:4 y las regiones correspondientes de la cápside de AAV8, SEQ ID NO:2;
y
(b) una proteína rep de AAV8 o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en: aa 1 a 625; aa 1 a 102; aa 103 a 140; aa 141 a 173; aa 174 a 226; aa 227 a 275; aa 276 a 374; aa 375 a 383; aa 384 a 446; aa 447 a 542; aa 543 a 555; and aa 556 a 625, de SEQ ID NO:3.
5. Una proteína de la cápside del virus adeno-asociado (AAV) artificial que comprende uno o más de los fragmentos de la proteína de la cápside del AAV8 de acuerdo con el aspecto 4a.
6. Un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una cápside artificial de acuerdo con el aspecto 5.
7. Una molécula que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con el aspecto 4.
8. La molécula de acuerdo con el aspecto 7, en la que dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:
vp1, nt 2121 a 4337;
vp2, nt 2532 a 4337; y
vp3, nt 2730 a 4337,
en la que los números de nucleótidos son de AAV8, SEQ ID NO:1.
9. La molécula de acuerdo con el aspecto 7 o el aspecto 8, en la que dicha molécula comprende una secuencia de AAV que codifica una proteína de la cápside de AAV y una proteína rep de AAV funcional.
10. La molécula de acuerdo con cualquiera de los aspectos 7 a 9, en la que dicha secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: los ácidos nucleicos 905 a 2104 de la SEQ ID NO: 1, los ácidos nucleicos 237 a 2104 de la SEQ ID NO: 1; los ácidos nucleicos 905 a 2104 de la SEQ ID N°: 1; y los ácidos nucleicos 237 a 2104 de la SEQ ID NO: 1.
11. La molécula de acuerdo con el aspecto 9, en la que dicha molécula comprende una proteína cap o un gen rep de AAV funcional de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 y AAV6. 12. La molécula de acuerdo con cualquiera de los aspectos 7 a 11, en la que dicha molécula es un plásmido.
13. Un método para generar un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una cápside de serotipo de AAV que comprende las etapas de cultivar una célula hospedadora que contiene; (a) una molécula que codifica una proteína de la cápside de AAV; (b) un gen rep funcional; (c) un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgén; y (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de la cápside de AAV, en el que dicha célula hospedadora comprende una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
14. Una célula hospedadora transfectada con un virus adeno-asociado de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3 o el aspecto 6 o una molécula de acuerdo con cualquiera de los aspectos 7 a 12.
15. Una composición que comprende un AAV de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3 o el aspecto 6, y un vehículo fisiológicamente compatible.
16. Un método para la administración de un transgén a una célula, comprendiendo dicho método la etapa de poner en contacto la célula con un AAV de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3 o el aspecto 6, en el que dicho AAVr comprende el transgén.
17. Uso de un virus adeno-asociado de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3 o el aspecto 6, o una molécula de acuerdo con cualquiera de los aspectos 7 a 11 en la preparación de un medicamento para administrar un transgén a una célula.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico recombinante:
(a) que codifica una proteína de la cápside vp1 de AAV8 que tiene una secuencia que comprende los aminoácidos 1 a 738 de la SEQ ID NO: 2 o
(b) que comprende los nucleótidos 2121 a 4337 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleótidos al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 2121 a 4337 de la SEQ ID NO: 1.
2. La molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, (a) que codifica los aminoácidos 138 a 738 de la SEQ ID NO: 2 o (b) que comprende los nucleótidos 2532 a 4337 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleótidos al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 2532 a 4337 de la SEQ ID NO: 1.
3. La molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 2, (a) que codifica los aminoácidos 204 a 738 de la SEQ ID NO: 2 o (b) que comprende los nucleótidos 2730 a 4337 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleótidos al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 2730 a 4337 de la SEQ ID NO: 1.
4. La molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia seleccionada de:
vp1, nt 2121 a 4337;
vp2, nt 2532 a 4337; o
vp3, nt 2730 a 4337
de SEQ ID NO: 1.
5. La molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha molécula de ácido nucleico recombinante es un plásmido.
6. Una célula hospedadora transfectada con una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además un gen rep funcional, un minigén que comprende repeticiones terminales (ITR) de AAV y un transgén, y funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la cápside de AAV.
8. Un AAV8 recombinante producido por la célula hospedadora de las reivindicaciones 6 o 7.
9. Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una proteína de la cápside AAV8 codificada por una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. Una composición que comprende el AAV de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9 y un vehículo fisiológicamente compatible.
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