ES2809232T3 - Composición para inducir la proliferación o acumulación de células reguladoras - Google Patents

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Abstract

Composición farmacéutica para su uso en un método de supresión de la inmunidad de un sujeto para prevenir o tratar una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad alérgica mediante la inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3, comprendiendo la composición, como principio activo, bacterias pertenecientes al género Clostridium, en la que las bacterias inducen dicha proliferación o acumulación de células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para inducir la proliferación o acumulación de células reguladoras
Campo técnico
En el presente documento se describe una composición que tiene un efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras, y que comprende, como principio activo, bacterias pertenecientes al género Clostridium, una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias, esporas bacterianas, o similares.
También se describe un método para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras, así como un método para inhibir tal proliferación o acumulación. También se describe una composición de vacuna que contiene al menos una cepa de bacterias pertenecientes al género Clostridium o una espora de bacterias, así como un método para tratar o prevenir al menos una enfermedad o un estado seleccionados de enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias mediante la administración de la composición de vacuna a un individuo que lo necesita.
También se describe un método para seleccionar un compuesto que fomente la proliferación o acumulación de células T reguladoras, así como un mamífero no humano que se use en este método, y en el que un gen indicador se expresa bajo el control de la expresión del gen de IL-10.
Antecedentes de la técnica
Cientos de especies de microorganismos comensales se encuentran en los tractos gastrointestinales de mamíferos, e interactúan de manera íntima con los sistemas inmunitarios del huésped. Algunos resultados de investigaciones que usan animales asépticos (GF, germ-free) han demostrado que los microorganismos comensales ejercen una gran influencia sobre el desarrollo de sistemas inmunitarios de la mucosa tales como histogénesis de placas de Peyer (PP) y folículos linfáticos aislados (ILF), secreción de péptidos antimicrobianos del epitelio y acumulación de linfocitos únicos en tejidos mucosos, incluyendo los linfocitos únicos plasmocitos que producen inmunoglobulina A, linfocitos intraepiteliales, células T positivas para CD4 que producen IL-17 (Th 17) y células similares a linfocitos citolíticos naturales que producen IL-22 (documentos no de patente 1 a 7). En consecuencia, la presencia de bacterias intestinales potencia las funciones protectoras de las membranas mucosas, dotando a los huéspedes con respuestas inmunitarias robustas frente a microbios patógenos que invaden los organismos. Por otro lado, los sistemas inmunitarios de la mucosa mantienen la falta de respuesta a antígenos alimentarios y microbios inofensivos (documento no de patente 3). Por este motivo, una anomalía en la regulación de la interferencia entre bacterias comensales y un sistema inmunitario (disbiosis intestinal) puede conducir a una respuesta inmunitaria demasiado robusta a antígenos medioambientales, de modo que se provoca enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (documentos no de patente 8 a 10).
Algunos resultados de estudios recientes han demostrado que bacterias comensales individuales controlan la diferenciación de sus células inmunitarias específicas en el sistema inmunitario de la mucosa. Por ejemplo, Bacteroides fragilis, que es una bacteria comensal en humanos, induce específicamente una respuesta de células Th1 sistémica y una respuesta de células T que producen IL-10 en la mucosa en ratones, y desempeña un papel en la protección del huésped contra la colitis, que de otro modo se provocaría por un patógeno (documento no de patente 3). Se ha demostrado que las bacterias filamentosas segmentadas, que son bacterias comensales intestinales en ratones, inducen una respuesta de células Th17 en la mucosa y, por tanto, potencian la resistencia frente a la infección de los tractos gastrointestinales del huésped con un patógeno (documentos no de patente 11 a 13). Además, se sabe que los ácidos grasos de cadena corta derivados de varias bacterias comensales suprimen la inflamación intestinal (documento no de patente 14). Además, se presume que la presencia de algunas especies de microbiota intestinal ejerce una gran influencia sobre la diferenciación de células T reguladoras (denominadas a continuación en el presente documento “células Treg”) que mantienen la homeostasis del sistema inmunitario.
Mientras tanto, las células T reguladoras que se han identificado como un subconjunto que suprime la inmunidad son células T CD4+ en las que se expresa un factor de transcripción Foxp3, y se sabe que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmunológica (documentos no de patente 8 , 9, 15 y 16). Además, se sabe que las células que expresan Foxp3 están presentes en un gran número, especialmente en el colon, y sólo las células Treg presentes de manera local en el colon expresan de manera constante IL-10, que es una citocina inmunosupresora, a un nivel alto (documento no de patente 17). También se sabe que los animales que tienen células CD4+ Foxp3+, a partir de las cuales se elimina específicamente IL-10, desarrollan enfermedad inflamatoria del intestino (documento no de patente 18).
Por consiguiente, si se esclarece el mecanismo de la inducción de células Treg que producen IL-10 en el colon a un nivel alto, puede potenciarse la inmunosupresión, que a su vez puede aplicarse al tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como enfermedad inflamatoria del intestino, así como a trasplante de órganos.
Sin embargo, los mecanismos de cómo un gran número de células Treg llegan a estar presentes en el colon y cómo las células Treg producen IL-10 en el colon a un nivel alto aún permanecen poco claros. Además, todavía permanece poco claro qué especies de bacterias que constituyen la flora bacteriana comensal intestinal ejercen la influencia sobre la inducción de células T reguladoras.
Lista de referencias
Bibliografía no de patentes
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[NPL 6 ] Ivanov, II et al., “Cell Host Microbe”, 16 de octubre de 2008, 4, 337
[NPL 7] S. L. Sanos et al., “Nat Immunol”, enero de 2009, 10, 83
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[NPL 10] W. S. Garrett et al., “Cell”, 5 de octubre de 2007, 131, 33
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[NPL 13] N. H. Salzman et al., “Nat Immunol”, 11, 76.
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[NPL 16] S. Sakaguchi, T. Yamaguchi, T. Nomura, M. Ono, “Cell”, 30 de mayo de 2008, 133, 775
[NPL 17] C. L. Maynard et al., “Nat Immunol”, septiembre de 2007, 8 , 931
[NPL 18] Y. P. Rubtsov et al., “ Immunity”, abril de 2008, 28, 546
GABORIAU-ROUTHIAU et al. (2009), Immunity 31:677 describen bacterias filamentosas segmentadas (SFB) que no pertenecen al género Clostridium, y que de hecho son filogenéticamente lejanas de las mismas.
SOKOL et al. (2008-10-28) “Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients”, Proc Natl Acad Sci USA 105 (43): 16731-16736, proponen a Faecalibacterium prausnitzii (perteneciente al grupo IV de Clostridium) como agente probiótico candidato en el tratamiento de enfermedad de Crohn (EC).
KARIMI et al. (2009), “Lactobacillus reuteri-induced regulatory T cells protect against and allergic airway response in mice” American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 17(3):186-193, describen que Lactobacillus reuteri induce células T reguladoras Foxp3+ que tienen potencial de proteger frente a y respuesta de las vías respiratorias alérgicas en ratones.
El documento EP 1955706 A1 se refiere a una composición que contiene interferón alfa y pigmento biliar natural C-ficocianina para tratar enfermedades autoinmunitarias, alergia y cáncer mediante la inducción de células T reguladoras.
ITOH K et al. (1985) “Characterization of clostridia isolated from faeces of limited flora mice and their effect on caecal size when associated with germ-free mice.” Laboratory Animals 19(2): 111-118, divulgan la caracterización de 115 cepas de Clostridium acumuladas de 3 aislamientos separados de las heces de 1 ratón con flora limitada (LF) producidos mediante la inoculación de ratones asépticos con heces tratadas con cloroformo de ratones convencionales, y se estudió el efecto sobre el tamaño del ciego cuando se asocian con ratones asépticos.
BAKKEN (2009) Anaerobe 15:285-289 se refiere a bacterioterapia fecal como tratamiento para infección recurrente por Clostridium difficile.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones, y proporciona una composición farmacéutica para su uso en un método de supresión de la inmunidad de un sujeto para prevenir o tratar una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad alérgica mediante la inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3, comprendiendo la composición, como principio activo, bacterias pertenecientes al género Clostridium, en la que las bacterias inducen dicha proliferación o acumulación de células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3. Otros aspectos de la invención también se definen en las reivindicaciones.
Los presentes inventores han descubierto que una fracción tratada con cloroformo y una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero induce la acumulación de células T reguladoras (células Treg) en el colon. Además, los presentes inventores han descubierto que bacterias pertenecientes al género Clostridium inducen proliferación o acumulación de células T reguladoras en el colon. Los presentes inventores también han descubierto que las células T reguladoras inducidas por estas bacterias suprimen la proliferación de células T efectoras. Además, los presentes inventores también han descubierto que la colonización de bacterias pertenecientes al género Clostridium y la proliferación o acumulación resultante de células Treg regulan las respuestas inmunitarias locales y sistémicas.
A partir de estos hallazgos, los presentes inventores han descubierto que el uso de bacterias pertenecientes al género Clostridium, esporas de las mismas o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las mismas permite inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras (células Treg), y además suprimir funciones inmunitarias.
Efectos ventajosos
Las composiciones descritas en el presente documento, que contienen como principio activo bacterias pertenecientes al género Clostridium o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias, sirven como una excelente composición para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras (células Treg). La inmunidad en un organismo vivo puede suprimirse, según las reivindicaciones, a través de la administración de la composición de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones como producto farmacéutico o de la ingesta de la composición como un alimento o una bebida. Por consiguiente, la composición de la presente invención puede usarse para prevenir o tratar enfermedades autoinmunitarias o enfermedades alérgicas, tal como se define en las reivindicaciones. También se divulga para suprimir el rechazo inmunológico en un trasplante de órgano o similar. Además, si un alimento o una bebida, tal como un alimento saludable, comprende la composición de la presente invención, los individuos sanos pueden ingerir la composición de manera fácil y rutinaria. Como resultado, es posible inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras y, por tanto, mejorar las funciones inmunitarias, tal como se define en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un método de producción de un ratón ]l10venus.
[Figura 2] La figura 2 es un diagrama que muestra los resultados de transferencia de tipo Southern realizada para el análisis en cuanto a si los ratones ] l10venus tienen o no un alelo ] l10venus.
[Figura 3] La figura 3 es un diagrama de gráfico de puntos de FACS que muestra los resultados obtenidos cuando se clasificaron células positivas para Venus y células negativas para Venus de los ratones ]l10venus.
[Figura 4] La figura 4 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se analizaron las cantidades de ARNm de IL-10 expresado en células positivas para Venus y células negativas para Venus de los ratones ]l10venus mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 5] La figura 5 es un gráfico que muestra el cambio en la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ de ratones SPF.
[Figura 6 ] La figura 6 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF y ratones SPF.
[Figura 7] La figura 7 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF y ratones SPF.
[Figura 8] La figura 8 muestra gráficos que muestran los resultados del análisis de los números de células CD4+ Foxp3+ aisladas del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF y ratones SPF.
[Figura 9] La figura 9 es un diagrama de gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Venus+ en células CD4+ en diversos tejidos de ratones SPF tratados con antibióticos.
[Figura 10] La figura 10 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones GF a los que se les administró una suspensión fecal de ratones SPF.
[Figura 11] La figura 11 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon y la lámina propia del intestino delgado de ratones GF a los que se les administró una suspensión fecal de ratones SPF.
[Figura 12] La figura 12 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia de ratones deficientes en ILF, PP y placas del colon.
[Figura 13] La figura 13 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones GF a los que se les administraron bacterias comensales específicas.
[Figura 14] La figura 14 muestra gráficos que muestran los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones GF a los que se les administraron bacterias comensales específicas.
[Figura 15] La figura 15 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células IFN-y+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 16] La figura 16 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células IL-17+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 17] La figura 17 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados del colon de tipos de ratones SPF siendo cada uno deficiente en un factor asociado al receptor de reconocimiento de patrones moleculares asociado a patógenos.
[Figura 18] La figura 18 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones Myd88'/_ en los que se colonizó Clostridium.
[Figura 19] La figura 19 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de las razones de células Venus+ en linfocitos aislados de diversos tejidos de ratones Il10venus.
[Figura 20] La figura 20 es un diagrama de gráfico de puntos de FACS que muestra los resultados del análisis de la expresión de una cadena p del receptor de células T en superficies celulares de linfocitos aislados de la lámina propia del colon de ratones Il10venus.
[Figura 21] La figura 21 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de IL-17, IL-4 e IFN-y en linfocitos aislados de la lámina propia del colon de ratones Il10venus.
[Figura 22] La figura 22 muestra gráficos que muestran los resultados del análisis de las cantidades de ARNm de IL-10, CTLA4, Foxp3 y GITR expresados en células Foxp3‘ CD4+ del bazo, células CD4+ Foxp3+ del bazo, células Venus+ de la lámina propia del colon y células Venus+ de la lámina propia del intestino delgado.
[Figura 23] La figura 23 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de CD4, Foxp3 y Venus en la lámina propia del intestino delgado y la lámina propia del colon de ratones Il10venus GF y ratones Il10venus SPF.
[Figura 24] La figura 24 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de Venus y Foxp3 de células CD4 en diversos tejidos de ratones SPF Il10venus.
[Figura 25] La figura 25 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de Foxp3 y Venus en ratones Il10venus en los que se colonizaron bacterias comensales específicas. [Figura 26] La figura 26 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de la expresión de Foxp3 y/o Venus de células CD4+ en el intestino delgado de ratones ]!1Qvenus en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 27] La figura 27 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de la expresión de Foxp3 y/o Venus de células CD4+ en el colon de ratones ]l10venus en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 28] La figura 28 es un diagrama de gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Venus+ en células CD4+ aisladas de diversos tejidos de ratones ]l10venus tratados con antibióticos.
[Figura 29] La figura 29 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de funciones inmunorreguladoras de células CD4+ Venus+ de la lámina propia del colon de ratones ]l10venus GF en los que se colonizó el género Clostridium, células CD4+ Venus+ de la lámina propia del colon de ratones ]l10venus SPF y células CD4+ GFP+ del bazo de ratones indicadores de Foxp3eGFP
[Figura 30] La figura 30 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se trataron ratones SPF B6 con polimixina B o vancomicina durante 4 semanas, y luego se analizaron para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+.
[Figura 31] La figura 31 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se administraron por vía oral heces tratadas con cloroformo derivadas de ratones SPF a ratones GF, y luego se analizaron para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+.
[Figura 32] La figura 32 es un gráfico que muestra los resultados generales del análisis por citometría de flujo de la expresión de Helios en linfocitos LP en el timo o el colon de ratones SPF, ratones GF, ratones colonizados con Lactobacillus o ratones colonizados con Clostridium.
[Figura 33] La figura 33 muestra diagramas de gráficos que muestran resultados representativos del análisis por citometría de flujo de la expresión de CD4, la expresión de Foxp3 y la expresión de Helios en los linfocitos LP en el timo o el colon de los ratones SPF, los ratones GF, los ratones colonizados con Lactobacillus o los ratones colonizados con Clostridium.
[Figura 34] La figura 34 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se cultivaron los cólones completos derivados de ratones GF, ratones colonizados con Lactobacillus o ratones colonizados con Clostridium, y se analizaron los sobrenadantes de cultivo de los mismos para determinar la concentración de TGF-P1 mediante ELISA.
[Figura 35] La figura 35 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se cultivaron células epiteliales intestinales (IEC) derivadas de ratones GF o ratones colonizados con Clostridium, y se analizaron los sobrenadantes de cultivo de las mismas para determinar la concentración de TGF-P1 mediante ELISA.
[Figura 36] La figura 36 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se cultivaron células T CD4+ del bazo junto con un anticuerpo anti-CD3 y con un sobrenadante de cultivo de IEC aisladas de ratones GF o ratones colonizados con 46 cepas bacterianas del género Clostridium (Clost.) en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TGF-p, y se recogieron las células T en el día 5 del cultivo y se analizaron para determinar la expresión de Foxp3 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 37] La figura 37 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del género Clostridium (Clost.) o tres cepas bacterianas del género Lactobacillus (Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de MMP2 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 38] La figura 38 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del género Clostridium (Clost.) o tres cepas bacterianas del género Lactobacillus (Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de MMP9 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 39] La figura 39 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del género Clostridium (Clost.) o tres cepas bacterianas del género Lactobacillus (Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de MMP13 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 40] La figura 40 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del género Clostridium (Clost.) o tres cepas bacterianas del género Lactobacillus (Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de IDO mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 41] La figura 41 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando ratones de control (SPF) y ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se trataron con DSS al 2%, se observaron y se midieron para determinar la pérdida de peso corporal, la dureza de las deposiciones y sangrado durante seis días, y luego se evaluaron de forma numérica.
[Figura 42] La figura 42 es una fotografía que muestra el estado de los cólones recogidos en el día 6 después de que los ratones de control (SPF) y los ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se trataron con DSS al 2%. [Figura 43] La figura 43 muestra fotomicrografías que muestran los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se trataron con DSS al 2%, y se recogieron los cólones de los mismos en el día 6 y se analizaron de manera histológica mediante tinción con HE.
[Figura 44] La figura 44 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando ratones de control (SPF) y ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se sensibilizaron con oxazolona, y posteriormente se trató el interior de cada recto con una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50%, y se midió la pérdida de peso corporal.
[Figura 45] La figura 45 muestra fotomicrografías que muestran los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se sensibilizaron con oxazolona, y posteriormente se trató el interior de cada recto con una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50%, y se analizaron de manera histológica los cólones obtenidos por el tratamiento mediante tinción con HE.
[Figura 46] La figura 46 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando ratones de control (SPF) y ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se inmunizaron mediante la administración de ovoalbúmina (OVA) absorbida con alumbre dos veces en un intervalo de 2 semanas, y se recogieron los sueros de los mismos y se analizaron para determinar la concentración de IgE específica de OVA en estos sueros mediante ELISA.
[Figura 47] La figura 47 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se inmunizaron mediante la administración de OVA absorbida con alumbre dos veces en un intervalo de 2 semanas, y se recogieron las células del bazo y se analizaron para determinar la producción de IL-4 de estas células del bazo mediante reestimulación con OVA in vitro.
[Figura 48] La figura 48 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados con Clostridium (SPF+Clost.) se inmunizaron mediante la administración de OVA absorbida con alumbre dos veces en un intervalo de 2 semanas, y se recogieron las células del bazo y se analizaron para determinar la producción de IL-10 de estas células del bazo mediante reestimulación con OVA in vitro.
[Figura 49] La figura 49 es un árbol filogenético construido mediante el método de unión de vecinos con las secuencias resultantes de las 41 cepas de Clostridium y aquellas de bacterias conocidas obtenidas de la base de datos de Genbank usando el software Mega.
[Figura 50] La figura 50 son histogramas que muestran la expresión de Foxp3 por células CD4 seleccionadas de ratones g F (ratón aséptico n.° 1 y n.° 2) o ratones GF colonizados con tres cepas de Clostridium pertenecientes al grupo IV (ratón con 3 cepas de Clost. n.° 1 y n.° 2).
[Figura 51] La figura 51 son histogramas que muestran la expresión de Foxp3 por linfocitos positivos para CD4 de ratones g F (GF) o ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.) [Figura 52] La figura 52 es un gráfico que muestra la expresión de Foxp3 por linfocitos positivos para CD4 de ratones GF (GF) o ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.) [Figura 53] La figura 53 es un gráfico que muestra las cantidades de Clostridium y Bacteroides en heces de ratones alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo.
Descripción
<Composición que tiene efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras>
En el presente documento se describe una composición que induce la proliferación o acumulación de células T reguladoras, comprendiendo la composición, como principio activo, al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) bacterias pertenecientes al género Clostridium o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias; (b) una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción; y
(c) una fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción.
En el presente documento, “células T reguladoras” significa células T que tienen una función de supresión de una respuesta inmunitaria anómala o excesiva, y que desempeñan un papel en la tolerancia inmunitaria. Las células T reguladoras de la invención son células T positivas para CD4 positivas para el factor de transcripción Foxp3. Sin embargo, otras células T reguladoras también incluyen células T reguladoras negativas para el factor de transcripción Foxp3 que son células T positivas para CD4 que producen IL-10.
El significado de “ induce la proliferación o acumulación de células T reguladoras” en la presente invención incluye un efecto de inducción de la diferenciación de células T inmaduras en células T reguladoras, cuya diferenciación conduce a la proliferación o la acumulación de células T reguladoras. Además, el significado de “induce la proliferación o acumulación de células T reguladoras” en la presente invención incluye efectos in vivo, efectos in vitro y efectos ex vivo. Por consiguiente, se incluyen la totalidad de los siguientes efectos: un efecto de inducción de proliferación o acumulación in vivo de células T reguladoras a través de la administración o ingesta de las bacterias pertenecientes al género Clostridium o la sustancia fisiológicamente activa o similar derivada de las bacterias; un efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras cultivadas provocando que las bacterias pertenecientes al género Clostridium o la sustancia fisiológicamente activa o similar derivada de las bacterias actúen en las células T reguladoras cultivadas; y un efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras que se recogen de un organismo vivo y que posteriormente pretenden introducirse en un organismo vivo, tal como el organismo a partir del cual se obtuvieron u otro organismo, provocando que las bacterias pertenecientes al género Clostridium o la sustancia fisiológicamente activa o similar derivada de las bacterias actúen en las células T reguladoras. El efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras puede evaluarse, por ejemplo, de la siguiente manera. Específicamente, las bacterias pertenecientes al género Clostridium o la sustancia fisiológicamente activa o similar derivada de las bacterias se administra por vía oral a un animal de experimentación tal como un ratón aséptico, luego se aíslan las células positivas para CD4 en el colon y se mide la razón de células T reguladoras contenidas en las células positivas para CD4 mediante citometría de flujo (véase el ejemplo 7).
Las células T reguladoras cuya proliferación o acumulación se induce mediante la composición de la presente invención son células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3.
Las “bacterias pertenecientes al género Clostridium", que son el principio activo en la composición de la presente invención, no están particularmente limitadas siempre que las bacterias tengan el efecto de inducción de proliferación 0 acumulación de células T reguladoras. Las bacterias pertenecen preferiblemente al grupo XIVa o al grupo IV. Puede usarse una cepa de las bacterias sola para la composición de la presente invención, pero pueden usarse dos o más cepas de las bacterias juntas para la composición de la presente invención. El uso de múltiples cepas de bacterias pertenecientes al grupo XIVa o el grupo IV en combinación puede lograr un excelente efecto sobre las células T reguladoras. Además de las bacterias pertenecientes a estos grupos, también pueden usarse bacterias pertenecientes a otros grupos (por ejemplo, bacterias pertenecientes al grupo III) en combinación. Si se usa más de una cepa de bacterias (por ejemplo, una o más cepas pertenecientes al grupo XIVa, una o más cepas pertenecientes al grupo IV, una o más cepas pertenecientes a un grupo distinto del grupo XIVa o el grupo IV, tal como una o más cepas pertenecientes al grupo III), el tipo y número de cepas usadas puede variar ampliamente. El tipo y número que va a usarse puede determinarse basándose en una variedad de factores (por ejemplo, el efecto deseado, tal como la inducción o inhibición de proliferación o acumulación de células T reguladoras; la enfermedad o el estado que va a tratarse, prevenirse o reducirse en gravedad; la edad o el género del receptor). Las cepas pueden estar presentes en una sola composición, en cuyo caso se consumirán o ingerirán juntas, o pueden estar presentes en más de una composición (por ejemplo, cada una puede estar en una composición separada), en cuyo caso pueden consumirse de manera individual o las composiciones pueden combinarse y la combinación resultante (composiciones combinadas) consumirse o ingerirse. Puede administrarse cualquier número o combinación de cepas que sea eficaz (por ejemplo, cualquier número desde uno hasta 200, tal como de 1 a 100, de 1 a 50, de 1 a 40, de 1 a 30, de 1 a 20, de 1 a 10, de 1 a 5 y cualquier número entre los mismos). En determinadas realizaciones de la presente invención, se usa una combinación de algunas o la totalidad de las 46 cepas descritas en el documento (Itoh, K., y Mitsuoka, T. Characterization of clostridia isolated from faeces of limited flora mice and their effect on caecal size when associated with germ-free mice. Lab. Animals 19: 111-118 (1985)). Por ejemplo, puede usarse al menos una, dos o más, tres, tres o más, cuatro, cuatro o más, cinco, cinco o más, seis, seis o más, o cualquier otro número de las 46 cepas descritas, incluyendo las 46 cepas. Pueden usarse en combinación entre sí y en combinación con cepas no descritas en la referencia citada (por ejemplo, en combinación con una o más cepas pertenecientes al grupo III). Obsérvese que el grupo de “bacterias pertenecientes al género Clostridium” puede identificarse, por ejemplo, de la siguiente manera. Específicamente, las bacterias pertenecientes al género Clostridium se clasifican mediante PCR usando un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID NO: 64 y 65 (para Clostridium spp. pertenecientes al grupo XIVa) o un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID NO: 66 y 67 (para Clostridium spp. pertenecientes al grupo IV) (véase el ejemplo 18). Además, las bacterias pertenecientes al género Clostridium se clasifican mediante secuenciación del gen de ARNr 16S amplificado usando un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID NO: 19 y 20 (véase el ejemplo 7).
Pueden usarse células viables de las bacterias pertenecientes al género Clostridium para la composición de la presente invención, y también pueden usarse células inactivadas de las mismas para la composición. Además, desde el punto de vista de estabilidad frente al calor, resistencia al tratamiento con antibióticos y similares, y periodo de almacenamiento prolongado, las bacterias pertenecientes al género Clostridium están preferiblemente en forma de espora.
El significado de la “sustancia fisiológicamente activa derivada de bacterias pertenecientes al género Clostrídium" de la presente invención incluye sustancias contenidas en las bacterias, productos de secreción de las bacterias y metabolitos de las bacterias. Una sustancia fisiológicamente activa de este tipo puede identificarse mediante purificación de un componente activo de las bacterias, un sobrenadante de cultivo de las mismas o el contenido del tracto intestinal en el tracto intestinal de un ratón en el que sólo se colonizan bacterias pertenecientes al género Clostridium mediante un método de purificación ya conocido.
El principio activo “fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero” en una composición descrita en el presente documento no está particularmente limitado, siempre que la fracción incluya bacterias de formación de esporas presentes en las heces de un mamífero, y tiene el efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras.
El principio activo “fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero” en la composición descrita en el presente documento no está particularmente limitado, siempre que la fracción se obtenga mediante el tratamiento de las heces de un mamífero con cloroformo (por ejemplo, cloroformo al 3%), y tiene el efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras.
Obsérvese que el “mamífero” en el presente documento incluye humanos, ratones, ratas, ganado bovino, caballos, cerdos, ovejas, monos, perros y gatos.
Mientras tanto, cuando la “fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero” o la “fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero” se cultiva en un medio, las sustancias contenidas en las bacterias, los productos de secreción de las bacterias y los metabolitos de las bacterias se liberan de las bacterias y similares contenidas en la fracción. El significado del principio activo “sobrenadante de cultivo de la fracción” en la composición descrita en el presente documento incluye tales sustancias, productos de secreción y metabolitos. El sobrenadante de cultivo no está particularmente limitado, siempre que el sobrenadante de cultivo tenga el efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras. Los ejemplos del sobrenadante de cultivo incluyen una fracción de proteínas del sobrenadante de cultivo, una fracción de polisacáridos del sobrenadante de cultivo, una fracción de lípidos del sobrenadante de cultivo y una fracción de metabolitos de peso molecular bajo del sobrenadante de cultivo.
La composición de la presente invención puede estar en forma de una composición farmacéutica, un alimento o una bebida (que también puede ser un pienso), o un reactivo usado para un experimento de modelo animal, teniendo la composición farmacéutica, el alimento o la bebida, y el reactivo el efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras. Un ejemplo en el presente documento reveló que las células T reguladoras (células Treg) inducidas por bacterias o similares pertenecientes al género Clostridium suprimieron la proliferación de células T efectoras. Por consiguiente, la composición de la presente invención puede usarse de manera adecuada tal como se define en las reivindicaciones como una composición que tiene un efecto inmunosupresor. El efecto inmunosupresor puede evaluarse, por ejemplo, de la siguiente manera. Específicamente, se provoca que células T reguladoras aisladas de un animal de experimentación, tal como un ratón, al que se le administra por vía oral la composición de la presente invención actúen en las células T efectoras (células CD4+ CD25-) aisladas del bazo, y luego se mide la capacidad de proliferación de las mismas usando la cantidad de ingesta de [3H]-timidina como índice (véase el ejemplo 14).
La composición de la presente invención puede usarse, por ejemplo, tal como se reivindica, como una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad autoinmunitaria, tal como enfermedad inflamatoria del intestino crónica, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, esclerosis múltiple o enfermedad de Hashimoto, o una enfermedad alérgica, tal como polinosis o asma. También se divulga una composición farmacéutica para suprimir el rechazo en un trasplante de órgano o similar; un alimento o una bebida para mejorar las funciones inmunitarias; o un reactivo para suprimir la proliferación o función de las células T efectoras.
Las enfermedades autoinmunitarias, las enfermedades alérgicas y el rechazo en trasplantes de órganos, y similares, incluyen enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, esprúe, artritis autoinmunitaria, artritis reumatoide, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad injerto contra huésped tras un trasplante de médula ósea, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependiente de la insulina, tiroiditis,. asma, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, dermatitis atópica, enfermedad injerto contra huésped, enfermedad inmunitaria aguda o crónica asociada con trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlejn, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome del choque tóxico, síndrome séptico, caquexia, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, síndrome de deficiencia poliglandular tipo I y síndrome de deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) de adultos, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, clamidia, espondiloartropatía artropatía asociada con Yersinia y Salmonella, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, alergias alimentarias, enfermedad ampollosa autoinmunitaria, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, dermatosis con depósitos lineales de IgA, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica con prueba de Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad del Royal Free, candidosis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmunitaria criptogénica, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia común variable (hipogammaglobulinemia común variable), miocardiopatía dilatada, fibrosis pulmonar, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial posinflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad del tejido conjuntivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad mixta del tejido conjuntivo, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar inducida por fármacos, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial tras infección, artritis gotosa, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria tipo l (hepatitis lupoide o autoinmunitaria clásica), hepatitis autoinmunitaria tipo 2 (hepatitis por anticuerpos anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmunitaria, resistencia a la insulina de tipo B con acantosis pigmentaria, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunitaria aguda asociada con trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria crónica asociada con trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, leucocitopenia idiopática, neutrocitopenia autoinmunitaria, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad del esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), diabetes mellitus dependiente de la insulina, oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conjuntivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmunitario por bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmunitario atrófico, mixoedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitiligo, rinitis alérgica (alergias al polen), anafilaxis, alergias a mascotas, alergias al látex, alergias a fármacos, rinoconjuntivitis alérgica, esofagitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico, gastroenteritis eosinofílica, lupus eritematoso cutáneo, esofagitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico y gastroenteritis eosinofílica.
Las preparaciones farmacéuticas pueden formularse a partir de la composición de la presente invención mediante métodos de formulación de fármacos ya conocidos. Por ejemplo, la composición de la presente invención puede usarse por vía oral o parenteral en las formas de cápsulas, comprimidos, pastillas, líquidos, polvos, gránulos, gránulos finos, preparaciones recubiertas con película, microgránulos, trociscos, preparaciones sublinguales, chicles, preparaciones bucales, pastas, jarabes, suspensiones, elixires, emulsiones, linimentos, pomadas, emplastos, cataplasmas, sistemas de absorción transdérmica, lociones, inhalaciones, aerosoles, inyecciones, supositorios, y similares.
Para formular estas preparaciones, la composición de la presente invención puede usarse en combinación apropiada con portadores aceptables farmacológicamente o aceptables para un alimento o una bebida, específicamente, con agua estéril, solución salina fisiológica, aceite vegetal, disolvente, un material base, un emulsionante, un agente de suspensión, un tensioactivo, un estabilizante, un agente aromatizante, un compuesto aromático, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante, un diluyente, un agente de ajuste de la tonicidad, un calmante, un agente de carga, un agente disgregante, un agente tamponante, un agente de recubrimiento, un lubricante, un colorante, un edulcorante, un agente espesante, un corrector del sabor, un solubilizante, otros aditivos, o similares.
Mientras tanto, para formular una preparación farmacéutica de la misma, y particularmente para formular una preparación farmacéutica para administración oral, es preferible usar en combinación una composición que permita la administración eficaz de la composición de la presente invención al colon, desde el punto de vista de inducir de manera más eficaz la proliferación o acumulación de células T reguladoras en el colon.
Una composición o un método de este tipo que permite la administración al colon no está particularmente limitado, y pueden emplearse composiciones o métodos conocidos según sea apropiado. Los ejemplos de los mismos incluyen composiciones sensibles al pH, más específicamente, polímeros entéricos que liberan su contenido cuando el pH se vuelve alcalino después de que los polímeros entéricos pasen a través del estómago. Cuando se usa una composición sensible al pH para formular la preparación farmacéutica, la composición sensible al pH es preferiblemente un polímero cuyo umbral de pH de la descomposición de la composición es de 6,8 a 7,5. Un intervalo de valores numéricos de este tipo se encuentra en el intervalo en el que el pH se desplaza hacia el lado alcalino en la parte distal del estómago y, por tanto, es un intervalo adecuado para su uso en la administración al colon.
Además, otro ejemplo de la composición que permite la administración al colon es una composición que garantiza la administración al colon retrasando la liberación del contenido en aproximadamente de 3 a 5 horas, que corresponde al tiempo de tránsito del intestino delgado. En un ejemplo de formulación de una preparación farmacéutica usando la composición para retrasar la liberación, se usa un hidrogel como cubierta. El hidrogel se hidrata y se hincha tras el contacto con el fluido gastrointestinal, de modo que se libera eficazmente el contenido. Además, las unidades de dosificación de liberación retardada incluyen composiciones que contienen fármaco que tienen un material que recubre o recubre de manera selectiva un fármaco. Los ejemplos de un material de recubrimiento selectivo de este tipo incluyen polímeros degradables in vivo, polímeros hidrolizables de manera gradual, polímeros solubles en agua de manera gradual y/o polímeros degradables por enzimas. El material de recubrimiento preferido para retrasar de manera eficaz la liberación no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen polímeros a base de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa, polímeros y copolímeros de ácido acrílico, tales como polímeros y copolímeros de ácido metacrílico, y polímeros y copolímeros de vinilo, tales como polivinilpirrolidona.
Los ejemplos de la composición que permite la administración al colon incluyen además composiciones bioadhesivas que se adhieren específicamente a la membrana mucosa del colon (por ejemplo, un polímero descrito en la memoria descriptiva de la patente estadounidense n.° 6.368.586), y composiciones en las que se incorpora un inhibidor de proteasas para proteger particularmente una preparación biofarmacéutica en los tractos gastrointestinales frente a la descomposición debida a la actividad de una proteasa.
Un ejemplo de un sistema que permite la administración al colon es un sistema de administración de una composición al colon mediante un cambio de presión de tal manera que se libera el contenido utilizando el cambio de presión provocado por la generación de gas en la fermentación bacteriana en la parte distal del estómago. Un sistema de este tipo no está particularmente limitado, y un ejemplo más específico del mismo es una cápsula que tiene el contenido disperso en una base de supositorio y que está recubierta con un polímero hidrófobo (por ejemplo, etilcelulosa).
Otro ejemplo del sistema que permite la administración al colon es un sistema de administración de una composición al colon, descomponiéndose específicamente el sistema por una enzima (por ejemplo, una hidrolasa de hidratos de carbono o una reductasa de hidratos de carbono) presente en el colon. Un sistema de este tipo no está particularmente limitado, y los ejemplos más específicos del mismo incluyen sistemas que usan componentes alimenticios tales como polisacáridos no amiláceos, amilosa, goma xantana y polímeros azoicos.
Cuando se usa como composición farmacéutica, la composición de la presente invención puede usarse en combinación con una composición farmacéutica ya conocida para su uso en inmunosupresión. Una composición farmacéutica conocida de este tipo no está particularmente limitada, y puede ser al menos una composición terapéutica seleccionada del grupo que consiste en corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, antihistaminas, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolina sódica, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para la rinitis, descongestivos anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos anti-IgE monoclonales, vacunas (preferiblemente vacunas usadas para la vacunación en las que la cantidad de alérgeno se aumenta de manera gradual), y combinaciones de los mismos. Es preferible usar estas composiciones terapéuticas en combinación con la composición de la presente invención.
Cuando la composición de la presente invención se usa como un alimento o una bebida, el alimento o la bebida puede ser, por ejemplo, un alimento saludable, un alimento funcional, un alimento para uso saludable especificado, un suplemento alimenticio, un alimento para pacientes o un pienso. El alimento o la bebida de la presente invención puede ingerirse en las formas de las composiciones tal como se describió anteriormente, y también puede ingerirse en las formas de diversos alimentos y bebidas. Los ejemplos específicos de los alimentos y las bebidas incluyen diversas bebidas tales como zumos, bebidas refrescantes, bebidas de té, preparaciones de bebidas, bebidas de gelatina y bebidas funcionales; bebidas alcohólicas tales como cervezas; alimentos que contienen hidratos de carbono tales como productos alimenticios de arroz, fideos, panes y pastas; productos de pasta tales como jamones de pescado, salchichas, productos de pasta de marisco; productos en bolsa esterilizados tales como curry, alimentos aderezados con salsas amiláceas espesas y sopas chinas; sopas; productos lácteos tales como leche, bebidas lácteas, helados, quesos y yogures; productos fermentados tales como pastas de soja fermentada, yogures, bebidas fermentadas y pepinillos; productos de judías; diversos productos de confitería tales como productos de confitería occidentales incluyendo panecillos, galletas, y similares, productos de confitería japoneses incluyendo bollos de mermelada de judías al vapor, gelatinas blandas de soja roja, y similares, caramelos, chicles, gominolas, postres fríos incluyendo gelatinas, flanes y postres congelados; alimentos instantáneos tales como sopas instantáneas y sopas de soja instantáneas; alimentos para cocinarse en microondas; y similares. Además, los ejemplos también incluyen alimentos y bebidas saludables preparados en las formas de polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, líquidos, pastas y gelatinas. La composición de la presente invención puede usarse para animales incluyendo humanos. Los animales, distintos de humanos, no están particularmente limitados, y la composición puede usarse para diversos ganados, aves de corral, mascotas, animales de experimentación, y similares. Los ejemplos específicos de los animales incluyen cerdos, ganado bovino, caballos, ovejas, cabras, gallinas, patos silvestres, avestruces, patos domésticos, perros, gatos, conejos, hámsteres, ratones, ratas, monos, y similares, pero los animales no se limitan a los mismos.
Sin desear limitarse a la teoría, los individuos en los que la abundancia relativa de bacterias pertenecientes al grupo Firmicutes (el grupo al que pertenecen los grupos IV y XlVa de Clostridium) es mayor, ganan más peso corporal que los individuos en los que la abundancia relativa de bacterias pertenecientes al grupo Bacteroidetes es mayor. Por consiguiente, la composición de la presente divulgación es capaz de condicionar la absorción de nutrientes y mejorar la eficacia de alimentación. Desde tal punto de vista, la composición de la presente divulgación puede usarse para fomentar la ganancia de peso corporal, o para un pienso con buena eficacia de alimentación.
Además, la adición de la composición de la presente divulgación a un pienso libre de antibióticos permite aumentar el peso corporal de un sujeto que ingiere el pienso hasta un nivel igual a o mayor que los logrados por piensos que contienen antibióticos, y también permite reducir las bacterias patógenas en el estómago hasta un nivel igual a los logrados por piensos que contienen antibióticos típicos. Por consiguiente, la composición de la presente divulgación puede usarse para un pienso que no necesita la adición de antibióticos.
Además, a diferencia de las bacterias convencionales (Lactobacillus y Bifidobacterium) en uso comercial que no son fáciles de incorporar en la producción de ganado, la composición de la presente invención en forma de esporas puede microgranularse, pulverizarse o mezclarse fácilmente con un pienso, y también puede añadirse a agua potable.
La alimentación de un pienso de este tipo que usa la composición descrita en el presente documento no está particularmente limitada, y el pienso puede alimentarse a un sujeto a intervalos regulares de manera selectiva, o puede alimentarse durante un determinado periodo (por ejemplo, en su nacimiento, durante el destete o cuando el sujeto que va a alimentarse se reubica o envía).
Además, desde el punto de vista descrito anteriormente, la composición de la presente divulgación puede usarse preferiblemente para humanos desnutridos. Dicho de otro modo, también cuando el sujeto que ingiere la composición es un humano, la composición puede usarse para fomentar la ganancia de peso corporal y potenciar la absorción de energía de los alimentos.
El alimento o la bebida puede fabricarse mediante una técnica de fabricación que se conoce bien en el campo técnico. Al alimento o a la bebida pueden añadírsele uno o más componentes (por ejemplo, un nutriente) que sean eficaces para la mejora de una función inmunitaria mediante un efecto inmunosupresor. Además, el alimento o la bebida puede combinarse con otro componente u otro alimento funcional que presente una función distinta de la función de la mejora de una función inmunitaria para servir de ese modo como alimento o bebida multifuncional.
Además, la composición descrita en el presente documento puede incorporarse en alimentos que requieren una etapa de procesamiento que puede destruir las cepas probióticas ordinarias. Específicamente, la mayoría de cepas probióticas que pueden usarse comercialmente no pueden incorporarse en alimentos que necesiten procesarse mediante uno cualquiera de tratamiento térmico, almacenamiento a largo plazo, tratamiento de congelación, tratamiento de esfuerzo mecánico y tratamiento de alta presión (por ejemplo, extrusión o perfilado). Por otro lado, debido a una naturaleza ventajosa de formación de esporas, la composición de la presente invención puede incorporarse fácilmente en tales alimentos procesados.
Por ejemplo, las composiciones en forma de esporas pueden sobrevivir incluso en un alimento seco, y pueden permanecer vivas incluso después de ingerirse. Del mismo modo, la composición descrita en el presente documento puede soportar procedimientos de esterilización a baja temperatura, normalmente procedimientos a una temperatura en un intervalo de desde 70°C hasta el punto de ebullición, ambos inclusivos. Por tanto, la composición descrita en el presente documento puede incorporarse en todas las clases de productos lácteos. Además, la composición descrita en el presente documento puede soportar almacenamiento a largo plazo de muchos años; procesamiento a alta temperatura tal como horneado y ebullición; procesamiento a baja temperatura tal como congelación y almacenamiento en frío; y tratamientos de alta presión tales como extrusión y perfilado.
Los alimentos que necesitan procesarse en tales condiciones rigurosas no están particularmente limitados, y los ejemplos de los mismos incluyen alimentos que necesitan procesarse en un horno microondas para ser comestibles (por ejemplo, avena), alimentos que necesitan hornearse para ser comestibles (por ejemplo, magdalenas), alimentos que necesitan someterse a un tratamiento de esterilización a alta temperatura durante un corto periodo de tiempo para ser comestibles (por ejemplo, leche) y alimentos que necesitan calentarse para ser bebibles (por ejemplo, té caliente).
Cuando la composición se administra o ingiere, la cantidad de la misma para la administración o ingestión se selecciona según sea apropiado dependiendo de la edad, el peso corporal, los síntomas, los problemas de salud del sujeto, la clase de composición (un producto farmacéutico, un alimento o una bebida, o similares), y similares. Por ejemplo, la cantidad por administración o ingestión es generalmente de 0,01 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, y preferiblemente de 1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal. La presente divulgación también incluye un método para suprimir la inmunidad de un sujeto, caracterizándose el método porque las bacterias pertenecientes al género Clostridium o la sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias se administra en o ingiere por el sujeto tal como se describió anteriormente.
Puede proporcionarse un producto de la composición de la presente invención (un producto farmacéutico, un alimento o una bebida o un reactivo) o un manual del mismo con una nota que indique que el producto puede usarse para suprimir la inmunidad (incluyendo una nota que indique que el producto tiene un efecto inmunosupresor y una nota que indique que el producto tiene un efecto de supresión de la proliferación o función de células T efectoras). En este caso, la “provisión al producto o al manual del mismo con la nota” significa que la nota se proporciona a un cuerpo principal, un recipiente, un envase, o similares del producto, o la nota se proporciona a un manual, un prospecto del envase, un folleto u otros materiales impresos, que divulgan información sobre el producto.
<Método para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras>
Tal como se describió anteriormente, y tal como se mostrará en los ejemplos, la administración de la composición descrita en el presente documento a un individuo permite inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras en el individuo. Por tanto, la presente divulgación incluye un método para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras en un individuo, comprendiendo el método una etapa de administrar, al individuo, al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) bacterias pertenecientes al género Clostridium o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias;
(b) una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción; y
(c) una fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción.
Obsérvese que, el “ individuo” en la presente divulgación no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen humanos, diversas clases de ganado, aves de corral, mascotas, animales de experimentación, y similares. El “ individuo” puede estar en un estado sano o un estado enfermo.
Además, tal como se mostrará en el ejemplo 5 que se describirá más adelante, las bacterias comensales Gram positivas desempeñan papeles principales en la proliferación o acumulación de células T reguladoras. Por consiguiente, la presente divulgación incluye un método para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras en un individuo, comprendiendo el método una etapa de administrar un antibiótico contra bacterias Gram negativas al individuo.
Tal como se usa en el presente documento, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen antibióticos de aminoglucósido (amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina y paromomicina), antibióticos de cefalosporina (cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona y cefoxotina), sulfonamidas, ampicilina y estreptomicina. Sin desear estar unido a una teoría, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” según la presente invención es preferiblemente uno que reduce las bacterias Gram negativas y contribuye a la colonización de bacterias Gram positivas.
Además, una composición prebiótica tal como piel de almendra, inulina, oligofructosa, rafinosa, lactulosa, pectina, hemicelulosa (tal como xiloglucano y alfa-glucanos), amilopectina y almidón resistente que no se descomponen en la parte alta del tracto gastrointestinal y fomentan el crecimiento de microbios intestinales en el tracto intestinal, así como factores de crecimiento tales como acetil-CoA, biotina, melazas de remolacha y extractos de lavadura, contribuyen a la proliferación de bacterias pertenecientes al género Clostridium. Por consiguiente, la presente divulgación incluye un método para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras en un individuo, comprendiendo el método una etapa de administrar, al individuo, al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en estas sustancias.
Mientras tanto, en un “método para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras”, la composición de la presente divulgación, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” descrito anteriormente y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” descrito anteriormente pueden usarse en combinación. Tal uso combinado no está particularmente limitado, y los ejemplos del uso combinado son los siguientes: el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” se administra a un individuo de antemano, y luego se administra la composición de la presente invención; el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la composición de la presente invención se administran simultáneamente a un individuo; la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” se administra a un individuo de antemano, y luego se administra la composición de la presente invención; la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” y la composición de la presente invención se administran simultáneamente a un individuo; la composición de la presente invención, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” se administran a un individuo simultáneamente o de manera individual en cualquier momento apropiado.
Además, una composición terapéutica puede administrarse a un individuo junto con al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en la composición de la presente divulgación, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento”.
Una composición terapéutica de este tipo no está particularmente limitada, y puede ser al menos una composición terapéutica seleccionada del grupo que consiste en corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, antihistaminas, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolina sódica, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para la rinitis, descongestivos anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos anti-IgE monoclonales, vacunas (preferiblemente, vacunas usadas para la vacunación en las que la cantidad de alérgeno se aumenta de manera gradual), y combinaciones de los mismos. Es preferible usar estas composiciones terapéuticas en combinación con la sustancia descrita anteriormente.
Además, no hay particular limitación impuesta sobre el uso combinado de la composición terapéutica con al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en la composición de la presente divulgación, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento”. Por ejemplo, la “una sustancia” y la composición terapéutica se administran por vía oral o parenteral a un individuo simultáneamente o de manera individual en cualquier momento apropiado.
Además, en el “método para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras” descrito anteriormente, puede determinarse si la administración de la composición descrita en el presente documento o similar induce realmente o no la proliferación o acumulación de células T reguladoras, usando como índice, aumento o refuerzo de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en el número de células T reguladoras, la razón de células T reguladoras en el grupo de células T del colon, una función de células T reguladoras y la expresión de un marcador de células T reguladoras. Es preferible usar una medición seleccionada del grupo que consiste en fomento de la expresión de IL-10, fomento de la expresión de CTLA4, fomento de la expresión de IDO y supresión de la expresión de IL-4 expresión, como índice de la inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras.
Obsérvese que los ejemplos de un método para detectar tal expresión incluyen transferencia de tipo Northern, RT-PCR y transferencia por puntos para la detección de la expresión génica a nivel de transcripción; y ELISA, radioinmunoensayo, inmunotransferencia, inmunoprecipitación y citometría de flujo para la detección de la expresión génica a nivel de traducción.
Mientras tanto, una muestra usada para medir un índice de este tipo no está particularmente limitada, y los ejemplos de la misma incluyen sangre muestreada de un individuo y partes de tejido obtenidas en una biopsia.
<Método para predecir la respuesta de un individuo a la composición de la presente invención y/o el pronóstico de un individuo>
En el presente documento se describe un método en el que se determina la cantidad absoluta o la razón de bacterias pertenecientes al género Clostridium en una microbiota de un individuo, y cuando la razón o el valor absoluto de las bacterias pertenecientes al género Clostridium se reduce en comparación con un valor de referencia obtenido realizando una determinación similar en un individuo con un estado de salud típico, se determina que posiblemente el individuo es sensible a la composición descrita en el presente documento.
También se describe un método para predecir la respuesta de un sujeto a una sustancia y/o el pronóstico de un sujeto. El método comprende medir el porcentaje o las cantidades absolutas de los grupos IV y XIV de Clostridium en la microbiota del sujeto y compararlos con un valor de referencia de las mismas mediciones en un sujeto sano prototipo, en el que una cantidad absoluta o un nivel de porcentaje disminuido de los grupos IV y/o XIV de Clostridium indica que el sujeto puede responder de manera favorable a las composiciones descritas en el presente documento.
El método puede comprender además medir la composición de la microbiota del sujeto después de la administración de la sustancia, en el que un aumento del porcentaje o número absoluto de Clostridium spp. pertenecientes a los grupos IV, XIV después de la administración de las composiciones de la presente invención con respecto a antes de la administración es un indicador positivo de inmunosupresión (o inmunorregulación) potenciada. La medición de la composición de la microbiota de un sujeto puede realizarse con técnicas conocidas en la técnica, tal como secuenciación de ARNr 16S.
Obsérvese que, en estos métodos, la sustancia es al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (e):
(a) bacterias pertenecientes al género Clostridium o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias;
(b) una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción;
(c) una fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción;
(d) un antibiótico contra bacterias Gram negativas; y
(e) al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en piel de almendra, inulina, oligofructosa, rafinosa, lactulosa, pectina, hemicelulosa (tal como xiloglucano y alfa-glucanos), amilopectina, acetil-CoA, biotina, melazas de remolacha, extractos de levadura y almidón resistente.
<Método para inhibir la proliferación o acumulación de células T reguladoras>
Tal como se mostrará en el ejemplo 5 que se describirá más adelante, las bacterias comensales Gram positivas desempeñan papeles principales en la proliferación o acumulación de células T reguladoras. Por consiguiente, la presente divulgación también incluye un método para inhibir la proliferación o acumulación de células T reguladoras en un individuo, comprendiendo el método una etapa de administrar un antibiótico contra bacterias Gram positivas al individuo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “antibiótico contra bacterias Gram positivas” no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen antibióticos de cefalosporina (cefalexina, cefuroxima, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil y ceftobiprol); antibióticos de fluoroquinolona (Cipro, Levaquin, floxina, tequina, Avelox y Norflox); antibióticos de tetraciclina (tetraciclina, minociclina, oxitetraciclina y doxiciclina); antibióticos de penicilina (amoxicilina, ampicilina, penicilina V, dicloxacilina, carbenicilina, vancomicina y meticilina); y antibióticos de carbapenem (ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina y meropenem).
Tal como se describió anteriormente, el término “individuo” no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen humanos, diversas clases de ganado, aves de corral, mascotas, animales de experimentación, y similares. El “ individuo” puede estar en un estado sano o un estado enfermo. Un estado enfermo de este tipo no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen estados de estar sometido a inmunoterapia contra el cáncer y de padecer una enfermedad infecciosa.
Además, como otro modo del “método para inhibir la proliferación o acumulación de células T reguladoras”, la presente divulgación incluye un método para inhibir la proliferación o acumulación de células T reguladoras en un individuo, comprendiendo el método una etapa de administrar, al individuo, uno cualquiera de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y un péptido, que son contra un antígeno que es al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) bacterias pertenecientes al género Clostridium o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias;
(b) una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción; y
(c) una fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción.
<Composición de vacuna y método para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa o una enfermedad autoinmunitaria usando la composición de vacuna >
Tal como se describió anteriormente, y tal como se mostrará en el ejemplo 15 que se describirá más adelante, la inducción de células Treg en el colon por Clostridium tiene un papel importante en respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Por consiguiente, la presente divulgación incluye una “composición de vacuna que comprende al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c) : (a) bacterias pertenecientes al género Clostridium; (b) una espora de bacterias en una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero; y (c) bacterias en una fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero”, y un “método para tratar, ayudar en el tratamiento, reducir la gravedad de o prevenir al menos una enfermedad seleccionada de enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias en un individuo, comprendiendo el método administrar la composición de vacuna al individuo”.
Obsérvese que tales “enfermedades autoinmunitarias” no están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen aquellas descritas como los “ejemplos específicos de enfermedades objetivo” en <Composición que tiene efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras>. Las “enfermedades infecciosas” tampoco están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen enfermedades infecciosas asociadas con los “patógenos infecciosos” descritos como los “ejemplos de patógenos infecciosos” en < Composición que tiene efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras>.
<Método para seleccionar un compuesto que tiene actividad para fomentar la proliferación o acumulación de células T reguladoras>
También se describe un método para seleccionar un compuesto que tiene una actividad para fomentar la proliferación o acumulación de células T reguladoras, comprendiendo el método:
(1) preparar una sustancia de prueba a partir de al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) bacterias pertenecientes al género Clostridium o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias;
(b) una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción; y
(c) una fracción tratada con cloroformo de una muestra fecal obtenida de un mamífero o un sobrenadante de cultivo de la fracción.
(2 ) preparar mamíferos no humanos en los que va a expresarse un gen indicador bajo el control de la expresión del gen de IL-10;
(3) poner la sustancia de prueba en contacto con el mamífero no humano;
(4) después del contacto con la sustancia de prueba, detectar células que expresan el gen indicador en un grupo de células CD4+ Foxp3+ del mamífero no humano, y determinar el número de células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador o una razón de células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador con respecto a células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que no expresan el gen indicador;
(5) detectar células que expresan el gen indicador en un grupo de células CD4+ Foxp3+ del mamífero no humano que no ha estado en contacto con la sustancia de prueba, y determinar el número de células en el grupo de células c D4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador o una razón de células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador con respecto a células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que no expresan el gen indicador; y
(6) comparar los números absolutos o las razones determinadas en las etapas (4) con el número o la razón determinada en (5), y determinar, cuando el número o la razón determinada en (4) es mayor que la determinada en (5), que la sustancia de prueba es un compuesto que fomenta la proliferación o acumulación de células Treg.
El término “sustancia de prueba”, tal como se usa en el presente documento, no está particularmente limitado, siempre que la sustancia de prueba sea una sustancia preparada a partir de al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en las sustancias (a) a (c). Los ejemplos de la sustancia de prueba incluyen proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos que se derivan de al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en las sustancias (a) a (c) descritas anteriormente.
El término “mamífero no humano en el que va a expresarse un gen indicador bajo el control de la expresión del gen de IL-10”, tal como se usa en el presente documento, no está particularmente limitado, siempre que el mamífero no humano sea un mamífero no humano que tiene un gen indicador cuya expresión está controlada por una región de controla de la expresión del gen de IL-10 (por ejemplo, un promotor o un potenciador). Los ejemplos de un gen indicador de este tipo incluyen genes que codifican para proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) y genes que codifican para luciferasa. Como “mamífero no humano en el que va a expresarse un gen indicador bajo el control de la expresión del gen de IL-10” según la presente invención, puede usarse preferiblemente un ratón Il10venus que se mostrará más adelante en los ejemplos.
El término “contacto”, tal como se usa en el presente documento, no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen la administración de la sustancia de prueba al mamífero no humano por vía oral o parenteral (por ejemplo, inyección intraperitoneal o inyección intravenosa).
También se describe un mamífero no humano que se usa para el método, y en el que el gen indicador va a expresarse bajo el control de la expresión del gen de IL-10.
Además, en el presente documento se describe un método para aislar, a partir de una muestra de bacterias pertenecientes al género Clostridium, un compuesto que tiene una actividad para fomentar la proliferación o acumulación de células T reguladoras, comprendiendo el método las siguientes etapas (1) a (3):
(1) preparar un ADN genómico a partir de la muestra de bacterias pertenecientes al género Clostridium;
(2) insertar el ADN genómico en un sistema de clonación, y preparar una genoteca derivada de la muestra de bacterias pertenecientes al género Clostridium; y
(3) aislar un compuesto que tiene una actividad para fomentar la proliferación o acumulación de células T reguladoras, mediante el uso de la genoteca obtenida en la etapa (2).
En tales etapas, los métodos para la preparación y el aislamiento no están particularmente limitados, y pueden usarse técnicas conocidas para un sistema in vitro o in vivo según sea apropiado. Además, el compuesto aislado mediante este método no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, un ADN, un ARNm y un ARNr) derivados de bacterias pertenecientes al género Clostridium, así como polipéptidos y proteínas derivados de las bacterias pertenecientes al género Clostridium.
También se describe un método para determinar la composición de una microbiota en un individuo, en el que el aumento de la razón o el número absoluto de bacterias pertenecientes al género Clostridium después de la administración de la composición de la presente invención al individuo con respecto a la razón o el número absoluto antes de la administración se usa como índice de inmunosupresión aumentada. En un método de este tipo, el método para determinar la composición de la microbiota no está particularmente limitado, y pueden usarse técnicas conocidas (por ejemplo, secuenciación de ARNr 16S) según sea apropiado.
También se describe un método para medir la diferenciación de células Treg, en el que el aumento de la diferenciación de células Treg en un individuo después de la administración de la composición descrita en el presente documento al individuo con respecto a aquella antes de la administración se usa como índice de inmunosupresión (o inmunorregulación) aumentada.
Además, la composición descrita en el presente documento también puede administrarse a un individuo bajo un tratamiento con antibióticos. La programación temporal de la administración no está particularmente limitada, y la composición puede administrarse, por ejemplo, antes de o simultáneamente con el tratamiento con antibióticos. Mientras tanto, la composición se administra preferiblemente en la forma de esporas desde el punto de vista de resistencia al tratamiento con antibióticos.
Además, en un modo preferido de tal administración, la composición se administra, por ejemplo, después de o simultáneamente con la administración de un antibiótico contra bacterias Gram positivas. Obsérvese que un “antibiótico contra bacterias Gram positivas” de este tipo no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen antibióticos de cefalosporina (cefalexina, cefuroxima, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil y ceftobiprol); antibióticos de fluoroquinolona (Cipro, Levaquin, floxina, tequina, Avelox y Norflox); antibióticos de tetraciclina (tetraciclina, minociclina, oxitetraciclina y doxiciclina); antibióticos de penicilina (amoxicilina, ampicilina, penicilina V, dicloxacilina, carbenicilina, vancomicina y meticilina); y antibióticos de carbapenem (ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina y meropenem).
Mientras tanto, en otro modo preferido de tal administración, la composición se administra, por ejemplo, después de (o simultáneamente con) un tratamiento usando vancomicina, metronidazol, linezolid, ramoplanina o fidaxomicina.
Ejemplos
A continuación en el presente documento, la presente invención se describe más específicamente basándose en los ejemplos. Sin embargo, la presente invención se define en las reivindicaciones.
Obsérvese que los ratones usados en los ejemplos se prepararon o produjeron de la siguiente manera. En la siguiente descripción, puede hacerse referencia a los ratones con “SPF” o “GF” unido detrás de los mismos. Estos “SPF” y “GF” indican que los ratones se mantuvieron en ausencia de bacterias patógenas específicas (libres de patógenos específicos, SPF) y que los ratones se mantuvieron en condiciones asépticas (GF, germ-free), respectivamente.
<Ratones>
Los ratones C57BL/6, Balb/c e IQI mantenidos en condiciones SPF o GF se adquirieron de Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Japón), JAPAN SLC, INC. (Japón), CLEA JAPAN, Inc. (Japón) o Jackson Laboratory (EE.UU.). Los ratones GF y los ratones gnotobióticos se criaron y mantuvieron dentro de la instalación gnotobiótica de la Universidad de Tokio, Instituto Central de Yakult para investigación microbiológica, o Sankyo Labo Service Corporation, Inc. Los ratones Myd88-/-, Rip2-/- y Card9-/- se produjeron tal como se describe en los documentos no de patente 1 a 3, y se sometieron a retrocruzamiento durante 8 generaciones o más, de modo que se logró un acervo genético C57BL/6. Los ratones Foxp3eGFP se adquirieron de Jackson Laboratory.
<Ratones Il10venus>
Para formar un locus bicistrónico que codifique tanto para Il10 como para Venus bajo el control de un promotor de Il10, se creó en primer lugar un constructo de direccionamiento. Específicamente, se insertó un casete (casete de señales IRES-Venus-SV40 poliA, al que se hace referencia en el documento no de patente 4), que se elaboró a partir de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), una proteína fluorescente amarillo (Venus) y una señal SV40 poliA (SV40 poliA) y que se dispuso a continuación del resistente a la neomicina (neo), entre un codón de parada y una señal poliA (exón 5) de un gen Il10. A continuación, se usó el constructo de direccionamiento obtenido para provocar la recombinación homóloga con la región del gen Il10 en el genoma de ratones. Por tanto, se produjeron ratones Il10venus que tenían alelos Il10venus (a los que se hace referencia en la figura 1). Obsérvese que, en la figura 1, “tk” representa un gen que codifica para timidina cinasa, “neo” representa el gen resistente a la neomicina y “BamH1” representa un sitio de escisión por la enzima de restricción BamH1.
Se extrajeron ADN genómicos de los ratones Il10venus, se trataron con BamH1 y se sometieron a transferencia de tipo Southern mediante el uso de una sonda mostrada en la figura 1. La figura 2 muestra los resultados obtenidos. Se detectaron alelos de tipo natural e ]l10venus como bandas que tenían tamaños de 19 kb y 5,5 kb, respectivamente. Por tanto, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 2 , se encontró que la recombinación homóloga mostrada en la figura 1 se produjo en el genoma de los ratones Il10venus.
Además, se clasificaron células CD4+ Venus- o células CD4+ Venus+ en la lámina propia del colon de los ratones Il10venus mediante el uso de un dispositivo FACSAria. Después se llevó a cabo RT-PCR en tiempo real en un sistema ABI 7300 mediante un método que se describirá más adelante, para determinar la cantidad de ARNm de IL-10 expresado. Las figuras 3 y 4 muestran los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 3 y 4, se encontró que, dado que el desarrollo del ARNm de IL-10 se detectó sólo en las células CD4+ Venus+, la expresión de ARNm de IL-10 en los ratones Il10venus se reflejó de manera correcta en la expresión de Venus. Obsérvese que los estados asépticos de tales ratones Il10venus se establecieron en el Instituto Central para animales de experimentación (Kawasaki, Japón). Los ratones Il10venus en estados asépticos se mantuvieron en aisladores de vinilo en Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Tokio, Japón), y se usaron en los siguientes ejemplos.
Mientras tanto, los experimentos y los análisis en los ejemplos se llevaron a cabo de la siguiente manera.
<Método para la colonización de ratones con bacterias y análisis de los mismos>
Según la descripción en los documentos no de patente 5 y 6 , se produjeron ratones en los que se colonizaron SFB o Clostridium. Se disolvió el contenido del ciego o las heces de los ratones gnotobióticos obtenidos en agua estéril o una disolución de dilución anaerobia. Se administraron por vía oral el contenido del ciego o las heces disueltos tal como eran o después de un tratamiento con cloroformo a ratones GF. Se cultivaron por separado entre sí tres cepas de Lactobacillus y 16 cepas de Bacteroides en un medio de agar EG o BL de manera anaerobia. Se recogieron las bacterias cultivadas, se suspendieron en un caldo TS anaerobio y se administraron por vía oral de manera forzada a ratones GF. Se evaluó el estado de la colonización de las bacterias en los ratones mediante observación por microscopio realizada en una preparación de frotis de microgránulos fecales.
<Separación de células y citometría de flujo>
Con el fin de aislar linfocitos de la lámina propia del colon y de la lámina propia del intestino delgado, se recogieron el intestino delgado y el colon y se abrieron longitudinalmente. Después se lavaron para retirar el contenido fecal y similares del interior de los mismos. Posteriormente, se agitaron el intestino delgado y el colon en HBSS que contenía 5 mM de EDTA a 37°C durante 20 minutos. Después de la retirada del epitelio y del tejido adiposo, se cortaron los tejidos intestinales en trozos pequeños. A los trozos pequeños se les añadió RPMI 1640 (suero bovino fetal (FBS) al 4%, 1 mg/ml de colagenasa D, 0,5 mg/ml de dispasa y 40 |ig/ml de DNasa I (todos ellos se fabricaron por Roche Diagnostics K.K.)), y se agitó la mezcla en un baño de agua mantenido a 37°C durante 1 hora. Se lavaron los tejidos diferidos con HBSS que contenía 5 mM de EDTA, y se resuspendieron en 5 ml de Percoll al 40% (GE Healthcare). Se superpuso la suspensión en 2,5 ml de Percoll al 80% en un tubo Falcon de 15 ml. Después se llevó a cabo la centrifugación a temperatura ambiente y a 2000 rpm durante 20 minutos para llevar a cabo la separación de células mediante centrifugación por gradiente de densidad Percoll. Se recogieron las células en la superficie de contacto y se usaron como linfocitos de la lámina propia. Se suspendieron las células recogidas en un tampón de tinción (PBS, FBS al 2%, EDTA 2 mM y NaN3 al 0,09%) y se tiñeron mediante el uso de un anticuerpo anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) marcado con PE o PE-Cy7. Después de la tinción de CD4, se tiñeron Foxp3 en las células mediante el uso del kit Cytofix/Cytoperm Plus con Golgistop (BD Biosciences) o el conjunto de tampón de tinción de Foxp3 (eBioscience), así como un anticuerpo anti-Foxp3 (FjK-16s, eBioscience) marcado con Alexa647. Se realizó citometría de flujo mediante el uso de un dispositivo FACSCanto II, y los datos se analizaron mediante el software FlowJo (TreeStar Inc.). La clasificación de las células se realizó mediante el uso de un dispositivo FACSAria.
<RT-PCR en tiempo real>
A partir de un ARN preparado usando el kit RNeasy Mini (Qiagen), se sintetizó un ADNc mediante el uso de una transcriptasa inversa m Mv (Promega KK). Se analizó el ADNc obtenido mediante RT-PCR en tiempo real usando la mezcla madre para PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems) y el sistema para PCR en tiempo real ABI 7300 (Applied Biosystems), o RT-PCR en tiempo real usando el reactivo SYBR Premix Ex Taq (TAKARA) y un dispositivo Light Cycler 480. Para cada muestra, se normalizó el valor obtenido con respecto a la cantidad de GAPDH. Se diseñó un conjunto de cebadores usando Primer Express versión 3.0 (Applied Biosystems), y se seleccionaron aquellos que mostraron una identidad de secuencia del 90% o mayor en la evaluación inicial. El conjunto de cebadores usado fue el siguiente:
Foxp3
5'-GGCAATAGTTCCTTCCCAGAGTT-3' (SEQ ID NO: 1)
5'-GGGTCGCATATTGTGGTACTTG-3' (SEQ ID NO: 2)
CTLA4
5'-CCTTTTGTAGCCCTGCTCACTCT-3' (SEQ ID NO: 3)
5'-GGGTCACCTGTATGGCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 4)
GITR
5'-TCAGTGCAAGATCTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 5)
5'-ACACCGGAAGCCAAACACA-3' (SEQ ID NO: 6 )
IL-10
5'-GATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGT-3' (SEQ ID NO: 7)
5'-CTTCTATGCAGTTGATGAAGATGTCAA-3' (SEQ ID NO: 8)
GAPDH
5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3' (SEQ ID NO: 9)
5'-TCTCCACTTTGCCACTGCAA-3' (SEQ ID NO: 10)
Mmp2
5'-GGACATTGTCTTTGATGGCA-3' (SEQ ID NO: 11)
5'-CTTGTCACGTGGTGTCACTG-3' (SEQ ID NO: 12)
Mmp9
5'-TCTCTGGACGTCAAATGTGG-3' (SEQ ID NO: 13)
5'-GCTGAACAGCAGAGCCTTC-3' (SEQ ID NO: 14)
Mmp13
5'-AGGTCTGGATCACTCCAAGG-3' (SEQ ID NO: 15)
5'-TCGCCTGGACCATAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 16)
Idol
5'-AGAGGATGCGTGACTTTGTG-3' (SEQ ID NO: 17)
5'-ATACAGCAGACCTTCTGGCA-3' (SEQ ID NO: 18).
<Preparación y cultivo de células epiteliales del intestino grueso (IEC)>
En primer lugar, se recogió el colon, se abrió longitudinalmente y se enjuagó con PBS. Posteriormente, se trató el colon con ditiotreitol (DTT) 1 mM a 37°C durante 30 minutos en un agitador, y luego se agitó con vórtex durante un minuto para alterar la integridad epitelial. Se recogieron las IEC liberadas y se suspendieron en 5 ml de Percoll al 20%. Se superpuso la suspensión en 2,5 ml de Percoll al 80% en un tubo Falcon de 15 ml. Después se centrifugó el tubo a 25°C y 780 g durante 20 minutos para llevar a cabo la separación de células mediante centrifugación por gradiente de densidad Percoll. Se recogieron las células en la superficie de contacto y se usaron como IEC del colon (pureza: 90% o mayor, viabilidad: 95%). Se suspendieron las IEC obtenidas recogidas de ese modo en RPMI que contenía FBS al 10%, y se cultivaron 1x105 células de las IEC en una placa de 24 pocillos durante 24 horas. Después de eso, se recogió el sobrenadante de cultivo y se midió para determinar el nivel de TGF-P1 activo mediante ELISA (Promega). Mientras tanto, para cultivar las células T in vitro, se cultivaron 1,5x105 células T CD4+ del bazo purificadas mediante MACS en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo, junto con un medio acondicionado al 50% en el que se cultivaron IEC aisladas de ratones GF o ratones colonizados con Clostridium, y con 25 ng/ml de hIL-2 (Peprotech), en presencia o ausencia de 25 |ig/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (R&D). Obsérvese que se unieron 10 |ig/ml de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (BD Bioscience) a la placa de fondo redondo. Después de un cultivo de 5 días, se recogieron las células T CD4+ y se sometieron a PCR en tiempo real.
<Modelo experimental de colitis>
Se administró por vía oral una suspensión fecal de ratones colonizados con Clostridium a ratones C57BL/6 (2 semanas de edad) y se hicieron crecer en un entorno convencional durante seis semanas.
Para preparar un modelo de colitis inducida por DSS, se administró DSS al 2% (p/v) (calidad para reactivo, sal de DSS, peso molecular = de 36 a 50 kD, fabricado por MP Biomedicals), junto con agua potable, a los ratones durante seis días.
Mientras tanto, para preparar un modelo de colitis inducida por oxazolona, se sensibilizaron previamente los ratones mediante la aplicación transdérmica sobre los ratones de 150 |il de una disolución de oxazolona al 3% (4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona, Sigma-Aldrich)/etanol al 100%. Cinco días después de eso, se inyectó por vía intrarrectal 150 |il de una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50% de nuevo a los ratones sensibilizados previamente con una ligera anestesia. Obsérvese que la administración intrarrectal se llevó a cabo usando un catéter de 3,5 F.
Se analizó cada ratón diariamente para determinar el peso corporal, la sangre oculta, el sangrado visible con a simple vista (sangre macroscópica) y la dureza de las deposiciones. Además, se evaluaron numéricamente el porcentaje de pérdida de peso corporal, el sangrado intestinal (no sangrado, sangre oculta (hemoccult+) o sangrado visible a simple vista) y la dureza de las deposiciones (deposición normal, deposición semilíquidas o diarrea) y se calculó el índice de actividad de la enfermedad (DAI, por sus siglas en inglés) según la descripción en “S. Wirtz, C. Neufert, B. Weigmann, M. F. Neurath, Nat Protoc 2, 541 (2007)”.
<Reacción de IgE específica de OVA>
Se inocularon ratones BALB/c SPF con una suspensión fecal de ratones colonizados con Clostridium (2 semanas de edad) y se hicieron crecer en un entorno convencional. Después se inyectó por vía intraperitoneal 1 |ig de OVA (grado V, Sigma) y 2 mg de alumbre (Thermo Scientific), 0,2 ml en total, a los ratones (a sus edades de 4 semanas y 6 semanas). Se recogieron sueros cada semana de los ratones de la raíz de su cola y se midió la IgE específica de OVA mediante ELISA (Chondrex). Después, a sus edades de 8 semanas, se recogieron células del bazo, se inocularon en una placa de 96 pocillos a 1x106 células por pocillo y se estimularon con OVA (100 |ig/ml) durante tres días. Después de eso, se recogió el sobrenadante de cultivo y se midió para determinar los niveles de IL-4 e IL-10 mediante ELISA (R&D).
<Análisis estadístico>
La diferencia entre los grupos de control y experimental se evaluó mediante la prueba de la t de Student.
(Ejemplo 1)
En primer lugar, se investigó si la acumulación de células T reguladoras (células Treg) en la lámina propia del colon era dependiente o no de las bacterias comensales. Específicamente, se aislaron linfocitos de los ganglios linfáticos periféricos (pLN) de ratones Balb/c criados en ausencia de bacterias patógenas específicas (SPF) o de la lámina propia del colon o del intestino delgado (SI) de los ratones. Se tiñeron CD4 y Foxp3 mediante anticuerpos. Después se analizó la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ mediante citometría de flujo. La figura 5 muestra los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 5, se encontró que las células Treg Foxp3+ estaban presentes a una alta frecuencia en la lámina propia de los tractos gastrointestinales, especialmente en la lámina propia del colon, de ratones mantenidos en un entorno libre de microorganismos patógenos específicos (SPF). Además, también se encontró que el número de células Treg Foxp3+ en la lámina propia del colon aumentó de manera gradual hasta tres meses después de su nacimiento, mientras que el número de células Treg Foxp3+ en los ganglios linfáticos periféricos fue básicamente constante desde el momento de dos semanas después de su nacimiento.
(Ejemplo 2)
A continuación, se investigó si la acumulación temporal de células Treg en el colon tal como se encontró en el ejemplo 1 tenía o no una relación con la colonización de la microbiota comensal intestinal. Específicamente, se analizaron la expresión de CD4 y la expresión de Foxp3 en linfocitos aislados del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones criados en un entorno aséptico (GF) o SPF (8 semanas de edad: ratones Balb/c, ratones IQI y ratones C57BL/6). Se obtuvieron resultados similares en tres o más experimentos independientes. Las figuras 6 y 7 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 7, cada círculo blanco representa el número absoluto de células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, y las barras de error representan las desviaciones estándar (DE).
Además, se recogieron linfocitos de la lámina propia de ratones SPF y ratones GF (ratones Balb/c o ratones C57BL/6). Se tiñeron CD4 y Foxp3 con anticuerpos. Después se analizaron los linfocitos de la lámina propia mediante FACS. La figura 8 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 8, cada círculo blanco representa el número absoluto de células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, ** indica que “P < 0,001” y * indica que “P < 0,01”.
Además, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon, de la lámina propia del intestino delgado (SI), de las placas de Peyer (PP) y de los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) de ratones (ratones C57BL/6 SPF) a los que se les administraron por vía oral antibióticos con agua durante ocho semanas. Se tiñeron CD4 y Foxp3 con anticuerpos. Después se analizaron los linfocitos mediante FACS. Se obtuvieron resultados similares en dos o más experimentos independientes. La figura 9 muestra los resultados obtenidos (la razón de células Foxp3+ en células CD4+ de un ratón individual). Obsérvese que se usaron los siguientes antibióticos en combinación según la descripción en el siguiente documento:
ampicilina (A; 500 mg/l, Sigma)
vancomicina (V; 500 mg/l, NACALAI TESQUE, INC.)
metronidazol (M; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
neomicina (N; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
Rakoff-Nahoum, J. Paglino, F. Eslami-Varzaneh, S. Edberg, R. Medzhitov, Cell 118, 229 (23 de julio de 2004)
Fagarasan et al., Science 298, 1424 (15 de noviembre de 2002).
En la figura 9, cada círculo blanco representa el número absoluto de Células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, cada barra horizontal representa el valor promedio de los números absolutos, * indica que “P < 0,01” y “AVMN” representa las clases de antibióticos administrados usando las primeras letras de los antibióticos.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 6 a 9, las frecuencias y los números absolutos de células CD4+ Foxp3+ en el intestino delgado y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF fueron iguales a o mayores que los de ratones SPF (véanse las figuras 6 a 8). Además, los números de células Treg en la del lámina propia del intestino delgado, las placas de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos de ratones SPF a los que se les administraron por vía oral los antibióticos durante ocho semanas fueron iguales a o mayores que los de ratones SPF (véase la figura 9). Mientras tanto, el número de células CD4+ Foxp3+ en la lámina propia del colon de ratones GF disminuyó significativamente en comparación con el de ratones SPF (véanse las figuras 6 y 7). Esta disminución se observó comúnmente entre ratones de diferentes acervos génicos (Balb/c, IQI y C57BL/6), así como entre ratones criados en diferentes instalaciones para animales (véase la figura 7 para los datos en cuanto a los diferentes acervos génicos, los datos en cuanto a los ratones criados en las diferentes instalaciones para animales no se muestran en los dibujos). Además, también se mostró que el número de células Treg en la lámina propia del colon de los ratones C57BL/6 SPF a los que se les administraron los antibióticos disminuyó significativamente (véase la figura 9).
(Ejemplo 3)
A continuación, se comprobó directamente si la disminución en el número de células Treg en la lámina propia del colon de los ratones GF mostrada en el ejemplo 2 se atribuía o no a la ausencia de microbiota. Específicamente, se administró por vía oral una suspensión fecal de ratones B6 SPF adquiridos de Jackson Laboratory a ratones IQI GF (convencionalización). Tres semanas después de la administración, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon y se analizó la expresión de Foxp3 en linfocitos CD4+. Las figuras 10 y 11 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que cada círculo blanco en la figura 11 representa el número absoluto de células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, las barras de error representan las desviaciones estándar (DE), * indica que “P < 0,01” en la prueba de la t de Student y ** indica que “P < 0,001”. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 10 y 11, el número de células Treg en la lámina propia del intestino delgado no cambió. Sin embargo, el número de células Treg en la lámina propia del colon aumentó significativamente. Por tanto, se mostró que la interacción entre el huésped y los microbios desempeñaba un papel importante en la acumulación de células Treg Foxp3+ en la lámina propia del colon, mientras que la acumulación de células Treg en la lámina propia del intestino delgado tenía un mecanismo diferente.
(Ejemplo 4)
A continuación, se investigó la relación entre los tejidos linfáticos asociados al intestino de ratones y el número de células Foxp3+ en la lámina propia del colon de los ratones según el método descrito en M. N. Kweon et al., J Immunol 174, 4365 (1 de abril de 2005). Específicamente, se inyectaron por vía intraperitoneal 100 |ig de una proteína recombinante del dominio extracelular (una proteína de fusión (LTpR-Ig) entre un receptor de linfotoxina p (LTpR) y una región Fc de IgG1 humana, véase Honda et al., J Exp Med 193, 621 (5 de marzo de 2001)) en ratones C57BL/6 gestantes 14 días después de la concepción. Se inyectó de nuevo por vía intraperitoneal LTpR-Ig en los fetos obtenidos de tales ratones, de modo que se produjeron ratones de los que se retiraron por completo folículos linfáticos aislados (ILF), placas de Peyer (PP) y placas del colon (CP). Después se analizaron las razones de células Foxp3+ en células CD4+ en la lámina propia del colon de ratones tratados con LTpR-Ig y de ratones tratados con IgG de rata (control) mediante FACS. La figura 12 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 12, cada círculo blanco representa la razón de células Foxp3+ en un ratón individual y las barras de error representan las desviaciones estándar. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 12, se encontró que la razón de células Foxp3+ en la lámina propia del colon de ratones deficientes en folículos linfáticos aislados, placas de Peyer y placas del colon (ratones tratados con LTpR-Ig) aumentó bastante. Por consiguiente, se sugirió que la disminución en el número de células Treg en la lámina propia del colon de ratones GF y ratones tratados con los antibióticos era debida a la transmisión de señales específicas que fomenta la acumulación de células Treg en la lámina propia del colon y la que está provocada por los microbios intestinales no se produjo, en lugar de simplemente debido a un efecto secundario de tejidos linfáticos asociados al intestino desordenados.
(Ejemplo 5)
Para investigar si la flora intestinal específica inducía o no la acumulación de células Treg del colon, se administró vancomicina como antibiótico contra bacterias Gram positivas o polimixina B como antibiótico contra bacterias Gram negativas a ratones SPF (de 4 semanas de edad) durante cuatro semanas y se analizó para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+ ([%] de Foxp3+ en CD4). La figura 30 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 30, “SPF” indica el resultado de ratones SPF (control), “poli B” indica el resultado de ratones SPF a los que se les administró polimixina B y “Vanco.” indica el resultado de ratones SPF a los que se les administró vancomicina. Mientras tanto, * indica que “P < 0 ,01”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 30, el número de células Treg en el colon de ratones a los que se les administró vancomicina disminuyó de manera notable en comparación con el del control. Por el contrario, no se observó ninguna influencia en el número de células Treg de ratones a los que se les administró polimixina B. Esos hechos sugirieron que las bacterias comensales Gram positivas desempeñaban un papel principal en la acumulación de células Treg.
(Ejemplo 6 )
Un informe reciente ha sugerido que las bacterias que forman esporas desempeñan un papel importante en la respuesta de células T del intestino (véase V. Gaboriau-Routhiau et al., Immunity 31,677 (16 de octubre de 2009)). A este respecto, se administraron por vía oral microorganismos fecales (fracción de formación de esporas) resistentes al tratamiento con cloroformo al 3% a ratones GF, que luego se analizaron para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+ ([%] de Foxp3+ en CD4). La figura 31 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 31, “GF” indica el resultado de ratones GF y “+cloro” indica el resultado de ratones GF a los que se les administraron heces tratadas con cloroformo. Mientras tanto, ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 31, tres semanas después de la administración de las heces tratadas con cloroformo, el número de células Treg en los ratones administrados aumentó de manera notable hasta el mismo nivel que el de ratones SPF y ratones GF a los que se les administró de manera forzada heces sin tratar (véanse las figuras 7 y 11).
Por consiguiente, teniendo en cuenta los resultados mostrados en el ejemplo 5 en combinación, se reveló que los componentes específicos de la microbiota endógena tenían una alta probabilidad de pertenecer al grupo de Gram positivas y que la fracción de formación de esporas desempeñaba un papel importante en la inducción de células Treg.
(Ejemplo 7)
A continuación, se identificaron las especies de la microbiota intestinal que inducían la acumulación de células Treg en el colon tal como se sugirió en los ejemplos 4 a 6. Específicamente, se administraron por vía oral bacterias filamentosas segmentadas (SFB), 16 cepas de Bacteroides spp. (Bactero. (6 cepas de B. vulgatus, 7 del grupo 1 de B. acidifaciens y 3 del grupo 2 de B. acidifaciens)), 3 cepas de Lactobacillus (Lacto. (L. acidophilus, L. fermentum y L. murinum)) y 46 cepas de Clostridium spp. (Clost., véase “ Itoh, K., y Mitsuoka, T. Characterization of clostridia isolated from faeces of limited flora mice and their effect on caecal size when associated with germ-free mice. Lab. Animals 19: 111-118 (1985))”), o microbiota recogida de ratones (SPF) criados en un entorno convencional a ratones Balb/c GF o ratones IQI GF. Los ratones se mantuvieron en aisladores de vinilo durante tres semanas. Después se aislaron células CD4 del colon y del intestino delgado de estos ratones. Se analizaron los números de células Treg en el colon y el intestino delgado mediante citometría de flujo.
La figura 13 muestra gráficos de puntos de FACS obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en células CD4+ de ratones Balb/c. La figura 14 muestra la razón de células Foxp3+ en células CD4+ de cada ratón.
Obsérvese que, las bacterias pertenecientes al género Clostridium se clasifican mediante secuenciación del gen de ARNr 16S de la siguiente manera. Específicamente, se amplificaron los genes de ARNr 16S de las bacterias mediante PCR usando pares de cebadores específicos de genes de ARNr 16S: 5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 19) y 5'-ATTACCGCGGCKGCTG-3' (SEQ ID NO: 20) (véase T. Aebischer et al., Vaccination prevents Helicobacter pilori-induced alterations of the gastric flora in mice. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 46,221-229(2006)). Después se introdujo el producto de PCR de 1,5 kb en el vector pCR-Blunt. Se secuenciaron los insertos y se alinearon usando el programa de software ClustalW. Las secuencias resultantes de los genes de ARNr 16S derivados de la cepa 1-41 de 46 cepas de Clostridium spp. se mostraron en SEQ ID NO: 21-61. El árbol filogenético que se construyó mediante el método de unión de vecinos con las secuencias resultantes de las 41 cepas de Clostridium y las de bacterias conocidas obtenidas de la base de datos Genbank usando el software Mega se mostró en la figura 49.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 13 y 14, no se observó ningún efecto sobre el número de las células Treg en el colon en ratones GF en los que se colonizaron bacterias filamentosas segmentadas (SFB) (véase la figura 14). Además, ratones en los que se colonizó el cóctel de tres cepas de Lactobacillus dieron resultados similares (véase la figura 14). Por otro lado, se mostró que la acumulación de células Foxp3+ en la lámina propia del colon se indujo fuertemente en ratones en los que se colonizaron 46 cepas de Clostridium spp. De manera importante, tal acumulación se fomentó independientemente de los acervos génicos de los ratones, y condujo a un aumento en número similar al de ratones SPF a pesar de que sólo se colonizó microbiota intestinal de un solo género. También se mostró que la colonización de Clostridium no cambió el número de células Treg en la lámina propia del intestino delgado (véase la figura 14). Obsérvese que, cuando se colonizaron las 16 cepas de Bactericides spp., el número de células Treg en el colon aumentó significativamente. Sin embargo, el grado del aumento varió en función del acervo génico de los ratones en los que se colonizaron las bacterias (véanse las figuras 13 y 14).
(Ejemplo 8)
A continuación, se analizaron la expresión de CD4, la expresión de Foxp3 y la expresión de Helios en linfocitos LP del timo y del colon de ratones SPF, ratones GF, ratones colonizados con Lactobacillus y ratones colonizados con Clostridium mediante citometría de flujo.
Las figuras 32 y 33 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 32 y 33, “GF” o “aséptico” indica los resultados de los ratones GF, “SPF” indica los resultados de los ratones SPF, “Lacto.” indica los resultados de los ratones colonizados con Lactobacillus y “Clost.” indica los resultados de los ratones colonizados con Clostridium. En la figura 32, el eje vertical representa la razón de células Helios' en el grupo de células Foxp3+ ([%] de Helios' en Foxp3+) y ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 32 y 33, la mayoría de células Foxp3+ encontradas en ratones SPF o ratones colonizados con Clostridium no expresaron Helios. Obsérvese que Helios es un factor de transcripción que se sabe que se expresa en células Treg naturales derivadas del tiempo (véase A. M. Thornton et al., J Immunol 184, 3433 (1 de abril de 2010)). Por consiguiente, se sugirió que la mayoría de células Treg en ratones SPF y ratones colonizados con Clostridium eran células Treg inducidas en porciones periféricas, es decir, las denominadas células iTreg.
(Ejemplo 9)
A continuación, se investigó si la colonización de Clostridium o similar influía o no en otras células T. Específicamente, se colonizaron SFB, 16 cepas de Bacteroides spp. (Bactero.), 46 cepas de Clostridium spp. (Clost.) o microbiota recogida de ratones criados en un entorno convencional (SPF) en ratones IQI GF. Tres semanas después, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon de estos ratones, y se estimularon con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 |ig/ml) durante cuatro horas en presencia de Golgistop (BD Bioscience). Después de proporcionar estimulación, se tiñeron las citocinas intracelulares usando un anticuerpo anti-IL-17 de PE (TC11-18H10) y un anticuerpo anti-IFN-g de FITC (BD Bioscience) según el manual de un kit Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). Después se analizó la razón de células IFN-y+ o células IL-17+ en leucocitos CD4+ mediante citometría de flujo. Las figuras 15 y 16 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 15 y 16, cada círculo blanco representa el número absoluto de células CD4+ IFN-y+ o el número absoluto de células CD4+ IL-17+ en cada ratón individual y las barras de error representan las desviaciones estándar (DE). Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 15 y 16, la colonización de Clostridium no influyó en células Th1 (células CD4+ IFN-y+) en el colon y sólo provocó un ligero aumento de células Th17 (células c D4+ IL-17+). Por consiguiente, se sugirió que el género Clostridium era un género de bacterias que inducía específicamente células Treg.
(Ejemplo 10)
Se ha informado que 46 cepas de Clostridium spp. influyen en la acumulación de linfocitos intraepiteliales (IEL) CD8+ del tracto intestinal en el colon. Por consiguiente, es concebible que Clostridium regule el sistema inmunitario en diversos aspectos, y que Clostridium presente una capacidad notable para inducir y mantener células Treg especialmente en el colon, tal como se describió anteriormente. Además, se sabe que una clase de citocinas, el factor de crecimiento transformante p (TGF-P), desempeña un papel importante en la regulación de la generación de células Treg.
A este respecto, se examinó si la colonización de Clostridium proporcionaba o no un entorno en el colon rico en TGF-p. Específicamente, en primer lugar, se cultivó el colon completo de ratones GF, ratones colonizados con Clostridium y ratones colonizados con Lactobacillus durante 24 horas, y se midieron los sobrenadantes de cultivo de los mismos para determinar la concentración de TGF-p activo (TGF-p1) mediante ELISA (el número de ratones analizados fue de cuatro por grupo). La figura 34 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 34, “GF” indica el resultado de ratones GF, “Clost.” indica el resultado de ratones colonizados con Clostridium y “Lacto.” indica el resultado de ratones colonizados con Lactobacillus. Mientras tanto, * indica que “P < 0,02”, y ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 34, la cantidad de TGF-p producido en el colon de ratones colonizados con Clostridium era significativamente mayor que las de ratones GF y ratones colonizados con Lactobacillus.
A continuación, se cultivaron células epiteliales intestinales (IEC) de ratones GF y ratones colonizados con Clostridium durante 24 horas, y se midieron los sobrenadantes de cultivo de las mismas para determinar la concentración de TGF-p activo (TGF-p1) mediante ELISA (el número de ratones analizados fue de cuatro por grupo). La figura 35 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 35, “GF” indica el resultado de ratones GF y “Clost.” indica el resultado de ratones colonizados con Clostridium. Mientras tanto, ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 35, se detectó GF-p en el sobrenadante de cultivo de las IEC aisladas de ratones colonizados con Clostridium, mientras que no se detectó TGF-p en el sobrenadante de cultivo de las IEC aisladas de ratones GF.
A continuación, tal como se describió anteriormente, se cultivaron células T CD4+ del bazo durante cinco días junto con un medio acondicionado al 50% en el que se cultivaron IEC aisladas de ratones GF o ratones colonizados con Clostridium, y con el anticuerpo anti-CD3, en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TGF-p. Después se recogieron las células T y se analizaron para determinar la expresión de Foxp3 mediante RT-PCR en tiempo real. La figura 36 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 36, “Medio” indica el resultado de un medio en el que no se cultivaron células, “GF” indica el resultado del medio acondicionado en el que se cultivaron IEC de ratones GF, “Clost.” indica el resultado del medio acondicionado en el que se cultivaron IEC de ratones colonizados con Clostridium y “Clost. aTGFp” indica el resultado del medio acondicionado al que se le añadió el anticuerpo anti-TGF-p y en el que se cultivaron IEC de ratones colonizados con Clostridium. Mientras tanto, ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 36, cuando se añadió el sobrenadante de cultivo de las IEC derivadas de ratones colonizados con Clostridium a células T CD4+ del bazo, se aceleró la diferenciación en células que expresan Foxp3. Mientras tanto, la diferenciación en las células Treg se inhibió mediante el anticuerpo anti-TGF-p.
Además, se investigó la expresión de MMP2, MMP9 y MMP13, que se piensa que contribuyen a la activación de TGF-p latente. También se investigó la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), que se piensa que está implicada en la inducción de células Treg. Específicamente, se administraron por vía oral 46 cepas bacterianas del género Clostridium (Clost.) o tres cepas bacterianas del género Lactobacillus (Lacto.) a ratones C57BL/6 asépticos. Tres semanas después de la administración, se recogieron las IEC y se analizaron para determinar los niveles de expresión relativos de ARNm de los genes de MMP2, MMP9, MMP13 e IDO mediante RT-PCR en tiempo real (el número de ratones analizados fue de tres por grupo). Las figuras 37 a 40 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 37 a 40, “GF n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones GF, “Clost. n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones colonizados con Clostridium y “Lacto. n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones colonizados con Lactobacillus.
Para la relación entre la activación de TGF-p latente y las MMP descritas anteriormente, véanse D'Angelo et al., J. Biol. Chem. 276, 11347-11353, 2001; Heidinger et al., Biol. Chem. 387, 69-78, 2006; Yu et al., Genes Dev. i4, 163­ 176, 2000. Para la relación entre IDO y la inducción de células Treg, véase G. Matteoli et al., Gut 59, 595 (mayo de 2010).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 37 a 39, de acuerdo con la producción de TGF-p descrita anteriormente, se expresaron los productos de transcripción de los genes que codifican para MMP2, MMP9 y MMP13 a niveles más altos en las IEC derivadas de ratones colonizados con Clostridium que los de ratones GF y ratones colonizados con Lactobacillus.
Además, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 40, IDO se expresó sólo en ratones colonizados con Clostridium.
Por consiguiente, se reveló que Clostridium activó las IEC y condujo a la producción de TGF-p y otras moléculas que inducen células Treg en el colon.
(Ejemplo 11)
A continuación, se investigó si la acumulación de células Treg inducidas por la colonización de Clostridium era dependiente o no de la transmisión de señales mediante receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos. Específicamente, se examinaron los números de células Treg en la lámina propia del colon de cada uno de ratones SPF de Myd88-/-(deficiente en Myd88 (adaptador de señalización para el receptor tipo Toll)), Rip2-/-(deficiente en Rip2 (adaptador del receptor NOD)) y Card9-/-(deficiente en Card9 (factor de transmisión de señales esencial para la transmisión de señales Dectina-1)). Además, se provocó que la colonización de Clostridium spp. en ratones Myd88-/- GF, y se investigó el cambio en el número de células Treg. Las figuras 17 y 18 muestran los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 17 y 18, el número de células Treg de cada clase de ratones SPF deficientes en los factores asociados de los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos no cambió con respecto al de ratones de tipo natural de la misma camada, que sirvió como control. Además, también se encontró que cuando se colonizaron Clostridium spp. en ratones GF deficientes en Myd88, se inducía la acumulación de células Treg en la lámina propia del colon. Por consiguiente, se ha sugerido que el mecanismo de inducción de la acumulación de células Treg en la lámina propia del colon no se basa en la activación de la ruta de reconocimiento para patrones moleculares asociados a patógenos principales, tal como se provoca por la mayoría de bacterias, sino en especies de bacterias comensales específicas.
(Ejemplo 12)
Se sabe que las células Treg Foxp3+ del tracto intestinal ejercen algunas funciones inmunosupresoras a través de la producción de IL-10 (véase el documento no de patente 9). Mientras tanto, se sabe que animales que tienen células CD4+ Foxp3+ de las que se elimina específicamente IL-10 desarrollan enfermedad inflamatoria del intestino (véase el documento no de patente 18). A este respecto, en primer lugar, se examinó la expresión de IL-10 en linfocitos de diversos tejidos. Específicamente, se aislaron linfocitos de diversos tejidos de ratones SPF Il10venus, y se analizaron la expresión de CD4 y la expresión de Venus mediante citometría de flujo. La figura 19 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que cada valor numérico en la figura 19 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon de ratones Il10venus, y se detectó la expresión de cadena P del receptor de células T (TCRp) en las superficies de las células mediante FACS. La figura 20 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos de FACS obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+). Obsérvese que cada valor numérico en la figura 20 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon de ratones Il10venus. Se estimularon los linfocitos con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 |ig/ml) durante cuatro horas en presencia de Golgistop (BD Bioscience). Luego, después de proporcionar estimulación, se tiñeron las citocinas intracelulares usando un anticuerpo anti-IL-17 de PE, un anticuerpo anti-IL-4 de APC (11B11) y un anticuerpo anti-IFN-g de FITC (BD Bioscience) según el manual de un kit Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). La figura 21 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos de FACS obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+).
Obsérvese que cada valor numérico en la figura 21 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, se aislaron células CD4+ Foxp3+ y células CD4+ Foxp3‘ del bazo (Spl) de ratones indicadores de Foxp3eGFP, y se aislaron células Venus+ de la lámina propia del colon y de la lámina propia del intestino delgado (SI) de ratones Il10venus. Después se analizaron las células obtenidas en cuanto a la expresión de genes predeterminados. La expresión génica se analizó mediante RT-PCR en tiempo real usando una mezcla madre para PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems) y un sistema de PCR en tiempo real ABI 7300 (Applied Biosystems). En este caso, se normalizó el valor para cada célula con respecto a la cantidad de GAPDH. La figura 22 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 22, las barras de error representan las desviaciones estándar.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 19 a 22, apenas se detectaron células Venus+ (células productoras de IL-10) en los ganglios linfáticos del cuello uterino (ganglios linfáticos periféricos), el timo, la sangre periférica, el pulmón y el hígado de ratones mantenidos en condiciones SPF. Mientras tanto, en el bazo, las placas de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos de los mismos, se detectaron ligeramente células Venus+ (véase la figura 19). Por otro lado, se encontraron muchas células Venus+ en los linfocitos de la lámina propia del intestino delgado y la lámina propia del colon. Además, la mayoría de las células Venus+ en los intestinos eran positivas para CD4, y también positivas para la cadena P del receptor de células T (TCRP) (véanse las figuras 19 y 20). Además, se encontró que las células T CD4+ Venus+ expresaron Foxp3 y otros factores asociados a células Treg, tales como un antígeno de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y una proteína asociada a TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), aunque las células T CD4+ Venus+ no mostraron ninguno de los fenotipos de Th2 (productores de IL-4) y Th17 (productores de IL-17) (véanse las figuras 21 y 22). Además, se mostró que el nivel de expresión de CTLA-4 en células Venus+ del intestino fue mayor que el de células Treg GFP+ del bazo aisladas de ratones indicadores de Foxp3eGFP (véase la figura 22).
(Ejemplo 13)
Las células Venus+ pueden clasificarse en al menos dos subconjuntos, concretamente, células Treg doblemente positivas (DP) Venus+ Foxp3+ y células Treg Venus+ Foxp3- basándose en la expresión de Foxp3 intracelular. Las células del ultimo subconjunto corresponden a células T reguladoras de tipo 1 (Tr1) (véanse los documentos no de patente 8 y 9). A este respecto, se investigaron las células Venus+ (células productoras de IL-10) observadas en el ejemplo 8 en cuanto a la expresión de Foxp3. Específicamente, se analizó la expresión de CD4, Foxp3 y Venus en la lámina propia del colon y la lámina propia del intestino delgado de ratones Il10venus mantenidos en condiciones GF o SPF mediante FACS, y se compararon los números de células Venus+ en la lámina propia del tracto intestinal entre ratones Il10venus SPF y GF. La figura 23 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+).
Además, se analizó la expresión intracelular de Venus y Foxp3 en células CD4 en diversos tejidos de ratones Il10venus SPF mediante citometría de flujo. La figura 24 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+). Obsérvese que cada valor numérico en la figura 24 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, con el fin de investigar si la presencia de bacterias comensales influía o no en la expresión de IL-10 en células reguladoras en los tractos gastrointestinales, se prepararon ratones Il10venus asépticos (GF). Después se provocó la colonización de especies predeterminadas de bacterias en los ratones Il10venusGF obtenidos. Tres semanas después de que se colonizaran las especies de bacterias, se analizó un grupo de células CD4+ (V+F-, células Venus+ Foxp3-; V+F+, células Venus+ Foxp3+; y V-F+, células Venus- Foxp3+) en el que se expresaron Foxp3 y/o Venus en el colon y el intestino delgado mediante citometría de flujo. La figura 25 muestra gráficos de puntos obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+ de colon, y las figuras 26 y 27 muestran las razones en el grupo de células CD4+ de cada ratón. Obsérvese que cada valor numérico en la figura 25 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro. Mientras tanto, las barras de error en las figuras 26 y 27 representan las desviaciones estándar, * indica que “P < 0,02” y ** indica que “P < 0,001”.
Además, con el fin de comprobar si la presencia de bacterias comensales influía o no en la expresión de IL-10 en células reguladoras en los tractos gastrointestinales, se proporcionaron por vía oral antibióticos con agua a cinco o seis ratones Il10venus por grupo durante 10 semanas. Se usaron los siguientes antibióticos en combinación:
ampicilina (A; 500 mg/l, Sigma)
vancomicina (V; 500 mg/l, NACALAI TESQUE, INC.)
metronidazol (M; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
neomicina (N; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
Después se tiñeron CD4 y Foxp3 de linfocitos de la lámina propia del colon, la lámina propia del intestino delgado (SI), los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y las placas de Peyer (PP) con anticuerpos, y se analizaron mediante FACS. Los resultados se obtuvieron a partir de dos o más experimentos independientes que proporcionaron resultados similares. La figura 28 muestra los resultados obtenidos (la razón de células Venus+ en células CD4+ en cada muestra). Obsérvese que cada círculo blanco en la figura 28 representa una muestra individual, cada barra horizontal representa un valor promedio, * indica que “P < 0,02” y “AVMN” representa las clases de los antibióticos administrados usando la primera letra de los antibióticos.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 23 y 24, se mostró que la lámina propia del intestino delgado era rica en células Venus+ Foxp3-, concretamente, células de tipo Tr1, y que las células Treg DP Venus+ Foxp3+ estaban presentes a una alta frecuencia en el colon de ratones SPF (véanse las figuras 23 y 24). Por el contrario, aunque también se observaron números suficientes de células Foxp3+ en otros tejidos, no se observó la expresión de Venus en casi ninguna de las células (véase la figura 24).
Además, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 23 y 25 a 28, se mostró que todas las fracciones de células T reguladoras de Venus+ Foxp3-, Venus+ Foxp3+ y Venus- Foxp3+ en el colon disminuyeron significativamente en condiciones GF (figuras 23 y 26 a 27). Además, también se observó una disminución similar en células Venus+ en ratones Il10venus SPF tratados con los antibióticos (véase la figura 28).
Además, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 25 a 27, la colonización de Clostridium spp. indujo fuertemente todas las fracciones de células T reguladoras de Venus+ Foxp3-, Venus+ Foxp3+ y Venus- Foxp3+ en el colon, y los grados de la inducción de los mismos eran iguales a los de ratones SPF (véanse las figuras 25 y 27). Además, se encontró que la colonización de las tres cepas de Lactobacillus o la colonización de SFB influía extremadamente poco en el número de células Venus+ y/o Foxp3+ en el colon (véanse las figuras 25 y 27). Además, la colonización de 16 cepas de Bacteroides spp. también indujo células Venus+, pero la influencia de la colonización era específica de células similares a Tr1 Venus+ Foxp3-(véanse las figuras 25 y 27). Por otro lado, se encontró que ninguna de las especies bacterianas sometidas aprueba influyó significativamente en el número de células productoras de IL-10 en la lámina propia del intestino delgado (véase la figura 26).
Por tanto, se mostró que el género Clostridium colonizado en el colon o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias proporcionó una señal para inducir la acumulación de células T reguladoras IL-10+ en la lámina propia del colon o la expresión de IL-10 en células T. Mientras tanto, se mostró que el número de células Venus+ en el intestino delgado no se veía influido significativamente por la situación en la que no estaban presentes bacterias comensales o se redujeron las bacterias comensales (véanse las figuras 23 y 26 a 28) y que se acumularon células reguladoras IL-10+ (células de tipo Tr1) en la lámina propia del intestino delgado independientemente de las bacterias comensales.
(Ejemplo 14)
Se investigó si las células Venus+ inducidas por el género Clostridium tenían o no una función inmunosupresora similar a la de las células Venus+ en el colon de ratones SPF. Específicamente, se sembraron células CD4+ CD25- (células T efectoras, células Teff) aisladas del bazo en una placa de 96 pocillos de fondo plano a 2 x 104/pocillo, y se cultivaron durante tres días junto con 2 x 104 células CD11c+ del bazo (células representadoras de antígeno) sometidas a tratamiento de irradiación con una radiación de 30 Gy, 0,5 |ig/ml de un anticuerpo anti-CD3 y muchas células Treg. Además, durante las últimas seis horas, se cultivaron las células CD4+ CD25-, a las que se le añadió [3H]-timidina (1 |iC¡/pocillo). Obsérvese que, las células Treg usadas en el ejemplo 14 fueron células T CD4+ GFP+ aisladas del bazo de ratones indicadores de Foxp3eGFP, o células T CD4+ Venus+ de la lámina propia del colon de ratones Il10venus GF en los que se colonizaron Clostridium spp. o ratones Il10venus SPF. Después se determinó la proliferación de las células basándose en la cantidad de [3H]-timidina captada, y representada mediante un valor de cuentas por minuto (cpm).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 29, las células Venus+ CD4+ de los ratones en los que se colonizó el género Clostridium suprimieron la proliferación in vitro de células T activadas CD25' CD4+. La actividad de supresión era ligeramente inferior a la de células GFP+ aisladas de ratones indicadores de Foxp3eGFP, pero igual a la de células Venus+ aisladas de ratones Il10venus SPF. Por consiguiente, se ha mostrado que el género Clostridium induce células T que expresan IL-10 que tienen actividades inmunosupresoras suficientes y, por tanto, desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis inmunitaria en el colon.
(Ejemplo 15)
A continuación, se investigó la influencia, en la respuesta inmunitaria local, de la colonización de un gran número de Clostridium y la proliferación resultante de células Treg.
<Modelo de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS)>
En primer lugar, se preparó el modelo de colitis inducida por DSS tal como se describió anteriormente, y se investigó la influencia, en los ratones del modelo, de la inoculación de Clostridium y la proliferación de células Treg. Específicamente, se trataron ratones de control y ratones inoculados con Clostridium con DSS al 2%, luego se observaron y se midieron durante seis días para determinar la pérdida de peso corporal, la dureza de las deposiciones y el sangrado, y luego se evaluaron numéricamente. Además, en el día 6 , se recogió, diseccionó y analizó de manera histológica el colon mediante tinción con HE. Las figuras 41 a 43 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 41 a 43, “SPF+Clost.” o “SPF+Clost. n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones C57BL/6 inoculados con una suspensión fecal de ratones colonizados con Clostridium y hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas, y “SPF” o “SPF n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones C57BL/6 (ratones de control) hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas sin inocularse con la suspensión fecal. Además, en la figura 41, el eje vertical “Puntuación de la enfermedad” representa el índice de actividad de la enfermedad (DAI) descrito anteriormente, y el eje horizontal “después de DSS al 2% (d)” representa los días transcurridos después de la administración inicial de DSS al 2% a los ratones. Además, en la figura 41, * indica que “P < 0,02” y ** indica que “P < 0,001”. Mientras tanto, se sabe que las células Treg inducidas por células dendríticas reguladoras desempeñan un papel preventivo en un modelo de colitis inducida por DSS (véase S. Manicassamy et al., Science 329, 849 (13 de agosto de 2010)).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 41 a 43, se suprimieron significativamente los síntomas de la colitis tales como pérdida de peso corporal y sangrado rectal en los ratones que tenían un gran número de Clostridium (también denominados a continuación en el presente documento “ratones con Clostridium en abundancia”) en comparación con los ratones de control (véase la figura 41). Se observaron de manera notable todas las características típicas de inflamación del colon, tales como acortamiento del colon, edema y hemorragia, en los ratones de control en comparación con los ratones con Clostridium en abundancia (véase la figura 42). Además, las características histológicas, tales como erosión de la mucosa, edema, infiltración celular y perdida de la cripta, fueron menos graves en los ratones con Clostridium en abundancia tratados con DSS que en los ratones de control (véase la figura 43).
<Modelo de colitis inducida por oxazolona>
A continuación, se preparó el modelo de colitis inducida por oxazolona tal como se describió anteriormente, y se investigó la influencia, en los ratones del modelo, de la inoculación de Clostridium y la proliferación de células Treg. Específicamente, se sensibilizaron ratones de control y ratones inoculados con Clostridium con oxazolona, y posteriormente se trató el interior del recto de los mismos con una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50%. Después se observó y midió la pérdida de peso corporal. Además, se diseccionó y analizó de manera histológica el colon mediante tinción con HE. Las figuras 44 y 45 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 44 y 45, “SPF+Clost.” indica los resultados de ratones C57BL/6 (ratones con Clostridium en abundancia) inoculados con una suspensión fecal de ratones colonizados con Clostridium y hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas, y “SPF” indica los resultados de ratones C57BL/6 (ratones de control) hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas sin inocularse con la suspensión fecal. Además, en la figura 44, el eje vertical “Peso (% del inicial)” representa el peso corporal después de la administración de oxazolona al 1% cuando el peso corporal antes de la administración se tomó como el 100%, y el eje horizontal “después de oxazolona al 1% (d)” representa los días transcurridos después de la administración de oxazolona al 1% a los ratones. Mientras tanto, se sabe que las células T de tipo Th2 están implicadas en colitis inducida por oxazolona (véase M. Boirivant, I. J. Fuss, A. Chu, W. Strober, J Exp Med 188, 1929 (16 de noviembre de 1998)).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 44 y 45, la colitis continuó junto con la persistente pérdida de peso corporal en los ratones de control. Mientras tanto, se redujo la pérdida de peso corporal de los ratones con Clostridium en abundancia (véase la figura 44). Además, también se reveló que se redujeron porciones que tenían enfermedades histológicas, tales como erosión de la mucosa, edema infiltración celular y hemorragia, en el colon de los ratones con Clostridium en abundancia (véase la figura 45).
(Ejemplo 16)
A continuación, se investigó la influencia, en la respuesta inmunitaria sistémica (producción sistémica de IgE), de la colonización de un gran número de Clostridium y la proliferación resultante de células Treg. Específicamente, tal como se describió anteriormente, se inmunizaron ratones de control y ratones inoculados con Clostridium mediante la administración de ovoalbúmina absorbida con alumbre (OVA) dos veces en un intervalo de 2 semanas. Después se recogieron sueros de estos ratones y se investigó el nivel de IgE específica de OVA de los mismos mediante ELISA. Además, se recogieron células del bazo de los ratones de cada grupo, y se investigó la producción de IL-4 e IL-10 mediante reestimulación con OVA in vitro. Las figuras 46 a 48 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 46 a 48, “SPF+Clost.” indica los resultados de ratones BALB/c SPF (ratones con Clostridium en abundancia) inoculados con una suspensión fecal de ratones colonizados con Clostridium y hechos crecer en un entorno convencional, “SPF” indica los resultados de ratones BALB/c SPF (ratones de control) hechos crecer en un entorno convencional sin inocularse con la suspensión fecal, y ** indica que “P < 0,001”. Mientras tanto, en la figura 46, el eje vertical “ IgE específica de OVA(ng/ml)” representa la concentración de IgE específica de OVA en los sueros. Además, en la figura 46, el eje horizontal representa los días transcurridos después de la administración inicial de la ovoalbúmina absorbida con alumbre a los ratones con Clostridium en abundancia o los ratones de control (4 semanas de edad), y “OVA+Alum” indica la programación temporal de la administración de la ovoalbúmina absorbida con alumbre. Además, en las figuras 47 y 48, “OVA” en el eje horizontal indica los resultados en el caso en el que se realizó reestimulación con OVA in vitro, y “-” indica los resultados en el caso en el que no se realizó reestimulación con OVA in vitro. Además, en las figuras 47 y 48, los ejes verticales “ IL-4 (pg/ml)” e “ IL-10 (pg/ml)” muestran la concentración de IL-4 y la concentración de IL-10 en sobrenadantes de cultivo de células del bazo, respectivamente.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 46 a 48, el nivel de IgE era significativamente menor en los ratones con Clostridium en abundancia que en los ratones de control (véase la figura 46). Además, se redujo la producción de IL-4 por la reestimulación con OVA (véase la figura 47) y, por tanto, aumentó la producción de IL-10 (véase la figura 48) en las células del bazo de los ratones con Clostridium en abundancia sensibilizados con OVA y alumbre, en comparación con las de los ratones de control.
Por consiguiente, teniendo en cuenta los resultados mostrados en el ejemplo 15 en combinación, se ha revelado que la inducción de células Treg mediante Clostridium en el colon desempeña un papel importante en respuestas inmunitarias locales y sistémicas.
(Ejemplo 17)
A continuación, se colonizaron Balb/c GF con tres cepas de Clostridium pertenecientes al grupo IV (cepas 22, 23 y 32 enumeradas en la figura 49). Tres semanas después, se analizaron las células Treg Foxp3+ del colon mediante FACS. La figura 50 muestra los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 50, los ratones gnotobióticos colonizados con tres cepas de Clostridium mostraron un patrón intermedio de inducción de Treg entre ratones GF y ratones inoculados con las 46 cepas.
(Ejemplo 18)
A continuación, se investigó si una fracción de formación de esporas (por ejemplo, una resistente al tratamiento con cloroformo) de una muestra fecal obtenida de humanos tenía o no un efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras similar a la fracción de formación de esporas de la muestra fecal obtenida de ratones.
Específicamente, se suspendieron las deposiciones humanas de un voluntario sano (japonés, hombre, 29 años de edad) con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se mezclaron con cloroformo (concentración final del 3%) y luego se incubaron en un baño de agua con agitación durante 60 min. Después de la evaporación del cloroformo mediante burbujeo con gas de N2, se inocularon por vía oral alícuotas que contenían fracción (por ejemplo, de formación de esporas) resistente al tratamiento con cloroformo de bacterias intestinales humanas en ratones asépticos (GF) (IQI, 8 semanas de edad). Se mantuvieron los ratones tratados en un aislador de vinilo durante 3 semanas. Se recogió el colon y se abrió longitudinalmente, se lavó para retirar el contenido fecal y se agitó en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) que contenía EDTA 5 mM durante 20 min a 37°C. Después de retirar las células epiteliales y el tejido adiposo, se cortó el colon en trozos pequeños y se incubaron con RPMl 1640 que contenía suero bovino fetal al 4%, colagenasa D 1 mg/ml, dispasa 0,5 mg/ml y DNasa I 40 |ig/ml (todos fabricados por Roche Diagnostics) durante 1 hora a 37°C en un baño de agua con agitación. Se lavó el tejido digerido con HBSS que contenía EDTA 5 mM, se resuspendió en 5 ml de Percoll al 40% (fabricado por GE Healthcare) y se superpuso en 2,5 ml de Percoll al 80% en un tubo Falcon de 15 ml. Se realizó separación por gradiente Percoll mediante centrifugación a 780 g durante 20 min a 25°C. Se recogieron las células de la superficie de contacto y se suspendieron en tampón de tinción que contenía PBS, FBS al 2%, EDTA 2 mM y NaN3 al 0,09% y teñido para CD4 de superficie con Ac anti-CD4 marcado con ficoeritrina (RM4-5, fabricado por BD Biosciences). Se realizó tinción intracelular de Foxp3 usando el Ac anti-Foxp3 marcado con Alexa647 (FJK-16s, fabricado por eBioscience) y conjunto de tampón de tinción de Foxp3 (fabricado por eBioscience). Se analizó el porcentaje de células positivas para Foxp3 dentro de la población de linfocitos positivos para CD4 mediante citometría de flujo. Las figuras 51 y 52 muestran los resultados obtenidos.
En las figuras, se muestran histogramas representativos (figura 51) y datos combinados (figura 52) para la expresión de Foxp3 mediante linfocitos positivos para CD4 de ratones asépticos (GF) o ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.). Además, los números en la figura 51 indican los porcentajes de células en la ventana de adquisición. Cada círculo en la figura 52 representa un animal independiente, las barras de error indican la DE y ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 51 y 52, también se encontró que cuando se colonizó la fracción de formación de esporas (por ejemplo, la resistente al tratamiento con cloroformo) de bacterias intestinales humanas en ratones GF, se indujo la acumulación de células reguladoras (Treg) Foxp3+ en la lámina propia del colon de los ratones.
A continuación, se investigó qué especies de bacterias crecían mediante alimentación por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo.
Específicamente, usando un mini-kit QlAamp DNA Stool (fabricado por QIAGEN), se aisló ADN genómico bacteriano de las deposiciones humanas de un voluntario sano tal como se describió anteriormente (deposiciones humanas) o microgránulos fecales de ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.). Se llevó a cabo análisis mediante PCR cuantitativa usando un dispositivo Light-Cycler 480 (fabricado por Roche). Se calculó la cantidad relativa mediante el método ACt y se normalizó con respecto a la cantidad de bacterias totales, la dilución y el peso de la muestra. Se usaron los siguientes conjuntos de cebadores:
Bacterias totales
5'-GGTGAATACGTTCCCGG-3' (SEQ ID NO: 62) y 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID NO: 63)
Grupo XlVa de Clostridium (subgrupo Clostridium coccoides)
5'-AAATGACGGTACCTGACTAA-3' (SEQ ID NO: 64) y 5'-CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA-3' (SEQ ID NO: 65)
Grupo IV de Clostridium (Clostridium leptum)
5'-GCACAAGCAGTGGAGT-3' (SEQ ID NO: 66) y 5-CTTCCTCCGTTTTGTCAA-3' (SEQ ID NO: 24)
Bacteroides
5'-GAGAGGAAGGTCCCCCAC-3' (SEQ ID NO: 67) y 5'-CGCTACTTGGCTGGTTCAG-3' (SEQ ID NO: 68).
La figura 53 muestra los resultados obtenidos.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 53, los ratones alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo presentaron altas cantidades de bacterias formadoras de esporas,

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica para su uso en un método de supresión de la inmunidad de un sujeto para prevenir o tratar una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad alérgica mediante la inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3, comprendiendo la composición, como principio activo, bacterias pertenecientes al género Clostridium, en la que las bacterias inducen dicha proliferación o acumulación de células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3.
2. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la enfermedad autoinmunitaria es enfermedad inflamatoria del intestino crónica.
3. Composición farmacéutica para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el método es para inducir proliferación o acumulación de dichas células T reguladoras en el colon.
4. Composición farmacéutica para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el uso es en un humano.
5. Composición farmacéutica para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la cantidad de la composición por administración es de 0,01 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal.
6. Composición farmacéutica para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la cantidad de la composición por administración es de 1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal.
7. Composición farmacéutica para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la composición se formula con un agente de recubrimiento.
8. Composición farmacéutica para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la composición se usa por vía oral en forma de una cápsula.
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