ES3041643T3 - Composition for inducing proliferation or accumulation of regulatory t cells - Google Patents

Composition for inducing proliferation or accumulation of regulatory t cells

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ES3041643T3
ES3041643T3 ES21205539T ES21205539T ES3041643T3 ES 3041643 T3 ES3041643 T3 ES 3041643T3 ES 21205539 T ES21205539 T ES 21205539T ES 21205539 T ES21205539 T ES 21205539T ES 3041643 T3 ES3041643 T3 ES 3041643T3
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Kenya Honda
Koji Atarashi
Kikuji Itoh
Takeshi Tanoue
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University of Tokyo NUC
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Abstract

Se descubrió que las bacterias del género Clostridium inducen la acumulación de linfocitos T reguladores (células Treg) en el colon. Además, los inventores hallaron que los linfocitos T reguladores (células Treg) inducidos por estas bacterias suprimían la proliferación de linfocitos T efectores. A partir de estos hallazgos, los inventores concluyeron que el uso de bacterias del género Clostridium o de una sustancia fisiológicamente activa derivada de ellas permite inducir la proliferación o acumulación de linfocitos T reguladores (células Treg) y, por consiguiente, suprimir las funciones inmunitarias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición que tiene un efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras, y que comprende, como principio activo, bacterias pertenecientes al géneroClostridium,una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias, esporas bacterianas, o similares. Además, la presente invención se refiere a una composición de vacuna que contiene al menos una cepa de bacterias pertenecientes al géneroClostridiumo una espora de bacterias, así como al tratamiento o a la prevención de al menos una enfermedad o un estado seleccionados de enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias mediante la administración de la composición de vacuna a un individuo que lo necesita.
Antecedentes de la técnica
Cientos de especies de microorganismos comensales se encuentran en los tractos gastrointestinales de mamíferos, e interactúan de manera íntima con los sistemas inmunitarios del huésped. Algunos resultados de investigaciones que usan animales asépticos (GF,germ-free)han demostrado que los microorganismos comensales ejercen una gran influencia sobre el desarrollo de sistemas inmunitarios de la mucosa tales como histogénesis de placas de Peyer (PP) y folículos linfáticos aislados (ILF), secreción de péptidos antimicrobianos del epitelio y acumulación de linfocitos únicos en tejidos mucosos, incluyendo los linfocitos únicos plasmocitos que producen inmunoglobulina A, linfocitos intraepiteliales, células T positivas para CD4 que producen IL-17 (Th 17) y células similares a linfocitos citolíticos naturales que producen IL-22 (documentos no de patente 1 a 7). En consecuencia, la presencia de bacterias intestinales potencia las funciones protectoras de las membranas mucosas, dotando a los huéspedes con respuestas inmunitarias robustas frente a microbios patógenos que invaden los organismos. Por otro lado, los sistemas inmunitarios de la mucosa mantienen la falta de respuesta a antígenos alimentarios y microbios inofensivos (documento no de patente 3). Por este motivo, una anomalía en la regulación de la interferencia entre bacterias comensales y un sistema inmunitario (disbiosis intestinal) puede conducir a una respuesta inmunitaria demasiado robusta a antígenos medioambientales, de modo que se provoca enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (documentos no de patente 8 a 10).
Algunos resultados de estudios recientes han demostrado que bacterias comensales individuales controlan la diferenciación de sus células inmunitarias específicas en el sistema inmunitario de la mucosa. Por ejemplo,Bacteroides fragilis,que es una bacteria comensal en humanos, induce específicamente una respuesta de células Th1 sistémica y una respuesta de células T que producen IL-10 en la mucosa en ratones, y desempeña un papel en la protección del huésped contra la colitis, que de otro modo se provocaría por un patógeno (documento no de patente 3). Se ha demostrado que las bacterias filamentosas segmentadas, que son bacterias comensales intestinales en ratones, inducen una respuesta de células Th17 en la mucosa y, por tanto, potencian la resistencia frente a la infección de los tractos gastrointestinales del huésped con un patógeno (documentos no de patente 11 a 13). Además, se sabe que los ácidos grasos de cadena corta derivados de varias bacterias comensales suprimen la inflamación intestinal (documento no de patente 14). Además, se presume que la presencia de algunas especies de microbiota intestinal ejerce una gran influencia sobre la diferenciación de células T reguladoras (denominadas a continuación en el presente documento “células Treg”) que mantienen la homeostasis del sistema inmunitario.
Mientras tanto, las células T reguladoras que se han identificado como un subconjunto que suprime la inmunidad son células T CD4+ en las que se expresa un factor de transcripción Foxp3, y se sabe que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmunológica (documentos no de patente 8, 9, 15 y 16). Además, se sabe que las células que expresan Foxp3 están presentes en un gran número, especialmente en el colon, y sólo las células Treg presentes de manera local en el colon expresan de manera constante IL-10, que es una citocina inmunosupresora, a un nivel alto (documento no de patente 17). También se sabe que los animales que tienen células CD4+ Foxp3+, a partir de las cuales se elimina específicamente IL-10, desarrollan enfermedad inflamatoria del intestino (documento no de patente 18).
Por consiguiente, si se esclarece el mecanismo de la inducción de células Treg que producen IL-10 en el colon a un nivel alto, puede potenciarse la inmunosupresión, que a su vez puede aplicarse al tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como enfermedad inflamatoria del intestino, así como a trasplante de órganos.
Sin embargo, los mecanismos de cómo un gran número de células Treg llegan a estar presentes en el colon y cómo las células Treg producen IL-10 en el colon a un nivel alto aún permanecen poco claros. Además, todavía permanece poco claro qué especies de bacterias que constituyen la flora bacteriana comensal intestinal ejercen la influencia sobre la inducción de células T reguladoras.
Lista de referencias
Bibliografía no de patentes
[NPL 1] J. J. Cebra, “Am J Clin Nutr”, mayo de 1999, 69, 1046S
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[NPL 5] K. Atarashiet a l,“Nature”, 9 de octubre de 2008, 455, 808
[NPL 6] Ivanov, IIet al.,“Cell Host Microbe”, 16 de octubre de 2008, 4, 337
[NPL 7] S. L. Sanoset al.,“Nat Immunol”, enero de 2009, 10, 83
[NPL 8] M. A. Curotto de Lafaille, J. J. Lafaille, “ Immunity”, mayo de 2009, 30, 626
[NPL 9] M. J. Barnes, F. Powrie, “ Immunity”, 18 de septiembre de 2009, 31, 401
[NPL 10] W. S. Garrettet al.,“Cell”, 5 de octubre de 2007, 131, 33
[NPL 11] Ivanov, IIetal., “Cell”, 30 de octubre de 2009, 139, 485.
[NPL 12] V. Gaboriau-Routhiauet al.,“ Immunity”, 16 de octubre de 2009, 31,677
[NPL 13] N. H. Salzmanet al.,“Nat Immunol”, 11, 76.
[NPL 14] K. M. Maslowskiet al.,“Nature”, 29 de octubre de 2009, 461, 1282
[NPL 15] L. F. Lu, A. Rudensky, “Genes Dev”, 1 de enero de 2009, 23, 1270
[NPL 16] S. Sakaguchi, T. Yamaguchi, T. Nomura, M. Ono, “Cell”, 30 de mayo de 2008, 133, 775
[NPL 17] C. L. Maynardet al.,“Nat Immunol”, septiembre de 2007, 8, 931
[NPL 18] Y. P. Rubtsovet al.,“ Immunity”, abril de 2008, 28, 546
Sumario de la invención
Problema técnico
La presente invención se ha realizado en vista de los problemas descritos anteriormente de las técnicas convencionales. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es identificar bacterias comensales intestinales que induzcan la proliferación o acumulación de células T reguladoras. Otro objeto de la presente invención es proporcionar composiciones o similares que comprenden las bacterias comensales intestinales identificadas o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las mismas y que, por tanto, induzcan la proliferación o acumulación de células T reguladoras (células Treg).
Solución al problema
Los presentes inventores han realizado serios estudios para resolver los problemas descritos anteriormente. Como resultado, los presentes inventores han descubierto que una fracción tratada con cloroformo y una fracción de formación de esporas de una muestra fecal obtenida de un mamífero induce la acumulación de células T reguladoras (células Treg) en el colon. Además, los presentes inventores han descubierto que bacterias pertenecientes al géneroClostridiuminducen proliferación o acumulación de células T reguladoras en el colon. Los presentes inventores también han descubierto que las células T reguladoras inducidas por estas bacterias suprimen la proliferación de células T efectoras. Además, los presentes inventores también han descubierto que la colonización de bacterias pertenecientes al géneroClostridiumy la proliferación o acumulación resultante de células Treg regulan las respuestas inmunitarias locales y sistémicas.
A partir de estos hallazgos, los presentes inventores han descubierto que el uso de bacterias pertenecientes al géneroClostridium,o esporas de las mismas, permite inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras (células Treg), y además suprimir funciones inmunitarias.
La invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto.
Efectos ventajosos de la invención
Las composiciones de la presente invención sirven como una excelente composición para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras (células Treg). La inmunidad en un organismo vivo puede suprimirse a través de la administración de la composición de la presente invención como producto farmacéutico o de la ingesta de la composición como un alimento o una bebida. Por consiguiente, la composición de la presente invención puede usarse, por ejemplo, para prevenir o tratar enfermedades autoinmunitarias o enfermedades alérgicas. Además, si un alimento o una bebida, tal como un alimento saludable, comprende la composición de la presente invención, los individuos sanos pueden ingerir la composición de manera fácil y rutinaria. Como resultado, es posible inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras y, por tanto, mejorar las funciones inmunitarias.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un método de producción de un ratón ]l10venus. [Figura 2] La figura 2 es un diagrama que muestra los resultados de transferencia de tipo Southern realizada para el análisis en cuanto a si los ratones ]l10venus tienen o no un alelo ]l10venus.
[Figura 3] La figura 3 es un diagrama de gráfico de puntos de FACS que muestra los resultados obtenidos cuando se clasificaron células positivas para Venus y células negativas para Venus de los ratones ]l10venus.
[Figura 4] La figura 4 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se analizaron las cantidades de ARNm de IL-10 expresado en células positivas para Venus y células negativas para Venus de los ratones ]l10venus mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 5] La figura 5 es un gráfico que muestra el cambio en la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ de ratones SPF.
[Figura 6] La figura 6 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF y ratones SPF.
[Figura 7] La figura 7 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF y ratones SPF.
[Figura 8] La figura 8 muestra gráficos que muestran los resultados del análisis de los números de células CD4+ Foxp3+ aisladas del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF y ratones SPF.
[Figura 9] La figura 9 es un diagrama de gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Venus+ en células CD4+ en diversos tejidos de ratones SPF tratados con antibióticos.
[Figura 10] La figura 10 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones GF a los que se les administró una suspensión fecal de ratones SPF.
[Figura 11] La figura 11 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon y la lámina propia del intestino delgado de ratones GF a los que se les administró una suspensión fecal de ratones SPF.
[Figura 12] La figura 12 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia de ratones deficientes en !LF, PP y placas del colon.
[Figura 13] La figura 13 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones GF a los que se les administraron bacterias comensales específicas.
[Figura 14] La figura 14 muestra gráficos que muestran los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones GF a los que se les administraron bacterias comensales específicas.
[Figura 15] La figura 15 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células !FN-y+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 16] La figura 16 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células !L-17+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 17] La figura 17 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados del colon de tipos de ratones SPF siendo cada uno deficiente en un factor asociado al receptor de reconocimiento de patrones moleculares asociado a patógenos.
[Figura 18] La figura 18 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ aislados de la lámina propia del colon de ratones Myd88-/- en los que se colonizóClostridium.
[Figura 19] La figura 19 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de las razones de células Venus+ en linfocitos aislados de diversos tejidos de ratones ]l10venus
[Figura 20] La figura 20 es un diagrama de gráfico de puntos de FACS que muestra los resultados del análisis de la expresión de una cadena p del receptor de células T en superficies celulares de linfocitos aislados de la lámina propia del colon de ratones ]l10venus.
[Figura 21] La figura 21 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de IL-17, IL-4 e IFN-y en linfocitos aislados de la lámina propia del colon de ratones ]l10venus.
[Figura 22] La figura 22 muestra gráficos que muestran los resultados del análisis de las cantidades de ARNm de IL-10, CTLA4, Foxp3 y GITR expresados en células Foxp3- CD4+ del bazo, células CD4+ Foxp3+ del bazo, células Venus+ de la lámina propia del colon y células Venus+ de la lámina propia del intestino delgado.
[Figura 23] La figura 23 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de CD4, Foxp3 y Venus en la lámina propia del intestino delgado y la lámina propia del colon de ratones N10venus GF y ratones Il10venus SPF.
[Figura 24] La figura 24 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de Venus y Foxp3 de células CD4 en diversos tejidos de ratones SPF Il10venus.
[Figura 25] La figura 25 muestra diagramas de gráfico de puntos de FACS que muestran los resultados del análisis de la expresión de Foxp3 y Venus en ratones Il10venus en los que se colonizaron bacterias comensales específicas. [Figura 26] La figura 26 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de la expresión de Foxp3 y/o Venus de células CD4+ en el intestino delgado de ratones Il10venus en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 27] La figura 27 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de la expresión de Foxp3 y/o Venus de células CD4+ en el colon de ratones Il10venus en los que se colonizaron bacterias comensales específicas.
[Figura 28] La figura 28 es un diagrama de gráfico que muestra los resultados del análisis de las razones de células Venus+ en células CD4+ aisladas de diversos tejidos de ratones Il10venus tratados con antibióticos.
[Figura 29] La figura 29 es un gráfico que muestra los resultados del análisis de funciones inmunorreguladoras de células CD4+ Venus+ de la lámina propia del colon de ratones N10venus GF en los que se colonizó el géneroClostridium,células CD4+ Venus+ de la lámina propia del colon de ratones N10venus SPF y células CD4+ GFP+ del bazo de ratones indicadores de Foxp3eGFP.
[Figura 30] La figura 30 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se trataron ratones SPF B6 con polimixina B o vancomicina durante 4 semanas, y luego se analizaron para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+.
[Figura 31] La figura 31 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se administraron por vía oral heces tratadas con cloroformo derivadas de ratones SPF a ratones GF, y luego se analizaron para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+.
[Figura 32] La figura 32 es un gráfico que muestra los resultados generales del análisis por citometría de flujo de la expresión de Helios en linfocitos LP en el timo o el colon de ratones SPF, ratones GF, ratones colonizados conLactobacilluso ratones colonizados conClostridium.
[Figura 33] La figura 33 muestra diagramas de gráficos que muestran resultados representativos del análisis por citometría de flujo de la expresión de CD4, la expresión de Foxp3 y la expresión de Helios en los linfocitos LP en el timo o el colon de los ratones SPF, los ratones GF, los ratones colonizados conLactobacilluso los ratones colonizados conClostridium.
[Figura 34] La figura 34 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se cultivaron los cólones completos derivados de ratones GF, ratones colonizados conLactobacilluso ratones colonizados conClostridium,y se analizaron los sobrenadantes de cultivo de los mismos para determinar la concentración de TGF-pi mediante ELISA.
[Figura 35] La figura 35 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se cultivaron células epiteliales intestinales (IEC) derivadas de ratones GF o ratones colonizados conClostridium,y se analizaron los sobrenadantes de cultivo de las mismas para determinar la concentración de TGF-P1 mediante ELISA.
[Figura 36] La figura 36 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se cultivaron células T CD4+ del bazo junto con un anticuerpo anti-CD3 y con un sobrenadante de cultivo de IEC aisladas de ratones GF o ratones colonizados con 46 cepas bacterianas del géneroClostridium(Clost.) en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TGF-p, y se recogieron las células T en el día 5 del cultivo y se analizaron para determinar la expresión de Foxp3 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 37] La figura 37 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del géneroClostridium(Clost.) o tres cepas bacterianas del géneroLactobacillus(Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de MMP2 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 38] La figura 38 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del géneroClostridium(Clost.) o tres cepas bacterianas del géneroLactobacillus(Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de MMP9 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 39] La figura 39 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del géneroClostridium(Clost.) o tres cepas bacterianas del géneroLactobacillus(Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de MMP13 mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 40] La figura 40 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se inocularon por vía oral ratones C57BL/6 GF con 46 cepas bacterianas del géneroClostridium(Clost.) o tres cepas bacterianas del géneroLactobacillus(Lacto.), y se recogieron las IEC tres semanas después de la inoculación y se analizaron para determinar el nivel de expresión relativo de ARNm del gen de IDO mediante RT-PCR en tiempo real.
[Figura 41] La figura 41 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando ratones de control (SPF) y ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se trataron con DSS al 2%, se observaron y se midieron para determinar la pérdida de peso corporal, la dureza de las deposiciones y sangrado durante seis días, y luego se evaluaron de forma numérica.
[Figura 42] La figura 42 es una fotografía que muestra el estado de los cólones recogidos en el día 6 después de que los ratones de control (SPF) y los ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se trataron con DSS al 2%.
[Figura 43] La figura 43 muestra fotomicrografías que muestran los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se trataron con DSS al 2%, y se recogieron los cólones de los mismos en el día 6 y se analizaron de manera histológica mediante tinción con HE.
[Figura 44] La figura 44 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando ratones de control (SPF) y ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se sensibilizaron con oxazolona, y posteriormente se trató el interior de cada recto con una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50%, y se midió la pérdida de peso corporal.
[Figura 45] La figura 45 muestra fotomicrografías que muestran los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se sensibilizaron con oxazolona, y posteriormente se trató el interior de cada recto con una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50%, y se analizaron de manera histológica los cólones obtenidos por el tratamiento mediante tinción con HE.
[Figura 46] La figura 46 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando ratones de control (SPF) y ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se inmunizaron mediante la administración de ovoalbúmina (OVA) absorbida con alumbre dos veces en un intervalo de 2 semanas, y se recogieron los sueros de los mismos y se analizaron para determinar la concentración de IgE específica de OVA en estos sueros mediante ELISA.
[Figura 47] La figura 47 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se inmunizaron mediante la administración de OVA absorbida con alumbre dos veces en un intervalo de 2 semanas, y se recogieron las células del bazo y se analizaron para determinar la producción de IL-4 de estas células del bazo mediante reestimulación con OVAin vitro.
[Figura 48] La figura 48 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando los ratones de control (SPF) y los ratones administrados conClostridium(SPF+Clost.) se inmunizaron mediante la administración de OVA absorbida con alumbre dos veces en un intervalo de 2 semanas, y se recogieron las células del bazo y se analizaron para determinar la producción de IL-10 de estas células del bazo mediante reestimulación con OVAin vitro.
[Figura 49] La figura 49 es un árbol filogenético construido mediante el método de unión de vecinos con las secuencias resultantes de las 41 cepas deClostridiumy aquellas de bacterias conocidas obtenidas de la base de datos de Genbank usando el software Mega.
[Figura 50] La figura 50 son histogramas que muestran la expresión de Foxp3 por células CD4 seleccionadas de ratones<g>F (ratón aséptico n.° 1 y n.° 2) o ratones GF colonizados con tres cepas deClostridiumpertenecientes al grupo IV (ratón con 3 cepas de Clost. n.° 1 y n.° 2).
[Figura 51] La figura 51 son histogramas que muestran la expresión de Foxp3 por linfocitos positivos para CD4 de ratones<g>F (GF) o ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.)
[Figura 52] La figura 52 es un gráfico que muestra la expresión de Foxp3 por linfocitos positivos para CD4 de ratones GF (GF) o ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.)
[Figura 53] La figura 53 es un gráfico que muestra las cantidades deClostridiumyBacteroidesen heces de ratones alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo.
Descripción de realizaciones
<Composición que tiene efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras>
La presente invención proporciona una composición para su uso según la reivindicación 1.
En la presente invención, “células T reguladoras” significa células T que tienen una función de supresión de una respuesta inmunitaria anómala o excesiva, y que desempeñan un papel en la tolerancia inmunitaria. Las células T reguladoras son normalmente células T positivas para CD4 positivas para el factor de transcripción Foxp3.
El significado de “ induce la proliferación o acumulación de células T reguladoras” en la presente invención incluye un efecto de inducción de la diferenciación de células T inmaduras en células T reguladoras, cuya diferenciación conduce a la proliferación o la acumulación de células T reguladoras. Además, el significado de “induce la proliferación o acumulación de células T reguladoras” en la presente invención incluye efectosin vivo.El efecto de inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras puede evaluarse, por ejemplo, de la siguiente manera. Específicamente, las bacterias pertenecientes al géneroClostridiumse administran por vía oral a un animal de experimentación tal como un ratón aséptico, luego se aíslan las células positivas para CD4 en el colon y se mide la razón de células T reguladoras contenidas en las células positivas para CD4 mediante citometría de flujo (véase el ejemplo 7).
Las células T reguladoras cuya proliferación o acumulación se induce mediante la composición de la presente invención son células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3.
Las “bacterias pertenecientes al géneroClostridium",que son el principio activo en la composición de la presente invención, no están particularmente limitadas siempre que las bacterias tengan el efecto de inducción de proliferación 0 acumulación de células T reguladoras. Las bacterias pertenecen preferiblemente al grupo XlVa o al grupo IV. Puede usarse una cepa de las bacterias sola para la composición de la presente invención, pero pueden usarse dos o más cepas de las bacterias juntas para la composición de la presente invención. El uso de múltiples cepas de bacterias pertenecientes al grupo XlVa o al grupo IV en combinación puede lograr un excelente efecto sobre las células T reguladoras. Además de las bacterias pertenecientes a estos grupos, también pueden usarse bacterias pertenecientes a otros grupos (por ejemplo, bacterias pertenecientes al grupo III) en combinación. Si se usa más de una cepa de bacterias (por ejemplo, una o más cepas pertenecientes al grupo XIVa, una o más cepas pertenecientes al grupo IV, una o más cepas pertenecientes a un grupo distinto del grupo XIVa o del grupo IV, tal como una o más cepas pertenecientes al grupo III), el tipo y número de cepas usadas puede variar ampliamente. El tipo y número que va a usarse puede determinarse basándose en una variedad de factores (por ejemplo, la enfermedad o el estado que va a tratarse, prevenirse o reducirse en gravedad; la edad o el género del receptor). Las cepas pueden estar presentes en una sola composición, en cuyo caso se consumirán o ingerirán juntas, o pueden estar presentes en más de una composición (por ejemplo, cada una puede estar en una composición separada), en cuyo caso pueden consumirse de manera individual o las composiciones pueden combinarse y la combinación resultante (composiciones combinadas) consumirse o ingerirse. Puede administrarse cualquier número o combinación de cepas que sea eficaz (por ejemplo, cualquier número desde uno hasta 200, tal como de 1 a 100, de 1 a 50, de 1 a 40, de 1 a 30, de 1 a 20, de 1 a 10, de 1 a 5 y cualquier número entre los mismos). En determinadas realizaciones de la presente invención, se usa una combinación de algunas o la totalidad de las 46 cepas descritas en el documento (Itoh, K., y Mitsuoka, T. Characterization of clostridia isolated from faeces of limited flora mice and their effect on caecal size when associated with germ-free mice. Lab. Animals 19: 111-118 (1985)). Por ejemplo, puede usarse al menos una, dos o más, tres, tres o más, cuatro, cuatro o más, cinco, cinco o más, seis, seis o más, o cualquier otro número de las 46 cepas descritas, incluyendo las 46 cepas. Pueden usarse en combinación entre sí y en combinación con cepas no descritas en la referencia citada (por ejemplo, en combinación con una o más cepas pertenecientes al grupo III). Obsérvese que el grupo de “bacterias pertenecientes al géneroClostridium"puede identificarse, por ejemplo, de la siguiente manera. Específicamente, las bacterias pertenecientes al géneroClostridiumse clasifican mediante PCR usando un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID NO: 64 y 65 (paraClostridiumspp. pertenecientes al grupo XIVa) o un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID NO: 66 y 67 (paraClostridiumspp. pertenecientes al grupo IV) (véase el ejemplo 18). Además, las bacterias pertenecientes al géneroClostridiumse clasifican mediante secuenciación del gen de ARNr 16S amplificado usando un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID NO: 19 y 20 (véase el ejemplo 7).
Pueden usarse células viables de las bacterias pertenecientes al géneroClostridiumpara la composición de la presente invención. Además, desde el punto de vista de estabilidad frente al calor, resistencia al tratamiento con antibióticos y similares, y periodo de almacenamiento prolongado, las bacterias pertenecientes al géneroClostridiumestán preferiblemente en forma de espora.
La composición de la presente invención puede estar en forma de una composición farmacéutica, un alimento o una bebida, teniendo la composición farmacéutica, y el alimento o la bebida el efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras. Un ejemplo de la presente invención reveló que las células T reguladoras (células Treg) inducidas por bacterias o similares pertenecientes al géneroClostridiumsuprimieron la proliferación de células T efectoras. Por consiguiente, la composición de la presente invención puede usarse de manera adecuada como una composición que tiene un efecto inmunosupresor. El efecto inmunosupresor puede evaluarse, por ejemplo, de la siguiente manera. Específicamente, se provoca que células T reguladoras aisladas de un animal de experimentación, tal como un ratón, al que se le administra por vía oral la composición de la presente invención actúen en las células T efectoras (células CD4+ CD25-) aisladas del bazo, y luego se mide la capacidad de proliferación de las mismas usando la cantidad de ingesta de [3H]-timidina como índice (véase el ejemplo 14).
La composición de la presente invención puede usarse, por ejemplo, como una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria tal como enfermedad inflamatoria del intestino crónica, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, o enfermedad de Hashimoto, o una enfermedad alérgica tal como polinosis o asma.
Los ejemplos más específicos de enfermedades diana de la composición de la presente invención incluyen enfermedades autoinmunitarias y enfermedades alérgicas, tales como enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, esprúe, artritis autoinmunitaria, artritis reumatoide, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependiente de la insulina, tiroiditis, asma, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, dermatitis atópica, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlejn, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome del choque tóxico, síndrome séptico, caquexia, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, síndrome de deficiencia poliglandular tipo I y síndrome de deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) de adultos, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, clamidia, espondiloartropatía artropatía asociada conYersiniaySalmonella,enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, alergias alimentarias, enfermedad ampollosa autoinmunitaria, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, dermatosis con depósitos lineales de IgA, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica con prueba de Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad del Royal Free, candidosis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmunitaria criptogénica, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia común variable (hipogammaglobulinemia común variable), miocardiopatía dilatada, fibrosis pulmonar, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial posinflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad del tejido conjuntivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad mixta del tejido conjuntivo, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar inducida por fármacos, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial tras infección, artritis gotosa, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria tipo l (hepatitis lupoide o autoinmunitaria clásica), hepatitis autoinmunitaria tipo 2 (hepatitis por anticuerpos anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmunitaria, resistencia a la insulina de tipo B con acantosis pigmentaria, hipoparatiroidismo, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, leucocitopenia idiopática, neutrocitopenia autoinmunitaria, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad del esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), diabetes mellitus dependiente de la insulina, oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conjuntivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmunitario por bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmunitario atrófico, mixoedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitiligo, rinitis alérgica (alergias al polen), anafilaxis, alergias a mascotas, alergias al látex, alergias a fármacos, rinoconjuntivitis alérgica, esofagitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico, gastroenteritis eosinofílica, lupus eritematoso cutáneo, esofagitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico y gastroenteritis eosinofílica.
La composición de la presente invención también puede usarse como una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades infecciosas en un individuo cuya resistencia a las enfermedades infecciosas se ve alterada debido al daño debido a una inflamación excesiva provocada por la inmunidad.
El ejemplo de patógenos infecciosos que alteran el mantenimiento o la recuperación de la homeostasis de un huésped y que provocan de manera eventual tal daño inmunopatológico de los tejidos incluyeSalmonella, Shigella, Clostridium difficile, Mycobacterium(que provoca la enfermedad de la tuberculosis), protozoos (que provocan la enfermedad de la malaria), nematodos filariales (que provocan la enfermedad de la filariasis),Schistosoma(que provoca la enfermedad de la esquistosomiasis),Toxoplasma(que provoca la enfermedad de la toxoplasmosis),Leishmania(que provoca la enfermedad de la leishmaniosis), VHC y VHB (que provocan la enfermedad de la hepatitis C y hepatitis B) y virus del herpes simple (que provoca la enfermedad del herpes).
Las preparaciones farmacéuticas pueden formularse a partir de la composición de la presente invención mediante métodos de formulación de fármacos ya conocidos. Por ejemplo, la composición de la presente invención puede usarse por vía oral en las formas de cápsulas, comprimidos, pastillas, líquidos, polvos, gránulos, gránulos finos, preparaciones recubiertas con película, microgránulos, trociscos, preparaciones sublinguales, chicles, preparaciones bucales, pastas, jarabes, suspensiones, elixires, emulsiones, y similares.
Para formular estas preparaciones, la composición de la presente invención puede usarse en combinación apropiada con portadores aceptables farmacológicamente o aceptables para un alimento o una bebida, específicamente, con agua estéril, solución salina fisiológica, aceite vegetal, disolvente, un material base, un emulsionante, un agente de suspensión, un tensioactivo, un estabilizante, un agente aromatizante, un compuesto aromático, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante, un diluyente, un agente de ajuste de la tonicidad, un calmante, un agente de carga, un agente disgregante, un agente tamponante, un agente de recubrimiento, un lubricante, un colorante, un edulcorante, un agente espesante, un corrector del sabor, un solubilizante, otros aditivos, o similares.
Mientras tanto, para formular una preparación farmacéutica de la misma, y particularmente para formular una preparación farmacéutica para administración oral, es preferible usaren combinación una composición que permita la administración eficaz de la composición de la presente invención al colon, desde el punto de vista de inducir de manera más eficaz la proliferación o acumulación de células T reguladoras en el colon.
Una composición o un método de este tipo que permite la administración al colon no está particularmente limitado, y pueden emplearse composiciones o métodos conocidos según sea apropiado. Los ejemplos de los mismos incluyen composiciones sensibles al pH, más específicamente, polímeros entéricos que liberan su contenido cuando el pH se vuelve alcalino después de que los polímeros entéricos pasen a través del estómago. Cuando se usa una composición sensible al pH para formular la preparación farmacéutica, la composición sensible al pH es preferiblemente un polímero cuyo umbral de pH de la descomposición de la composición es de 6,8 a 7,5. Un intervalo de valores numéricos de este tipo se encuentra en el intervalo en el que el pH se desplaza hacia el lado alcalino en la parte distal del estómago y, por tanto, es un intervalo adecuado para su uso en la administración al colon.
Además, otro ejemplo de la composición que permite la administración al colon es una composición que garantiza la administración al colon retrasando la liberación del contenido en aproximadamente de 3 a 5 horas, que corresponde al tiempo de tránsito del intestino delgado. En un ejemplo de formulación de una preparación farmacéutica usando la composición para retrasar la liberación, se usa un hidrogel como cubierta. El hidrogel se hidrata y se hincha tras el contacto con el fluido gastrointestinal, de modo que se libera eficazmente el contenido. Además, las unidades de dosificación de liberación retardada incluyen composiciones que contienen fármaco que tienen un material que recubre o recubre de manera selectiva un fármaco. Los ejemplos de un material de recubrimiento selectivo de este tipo incluyen polímeros degradablesin vivo,polímeros hidrolizables de manera gradual, polímeros solubles en agua de manera gradual y/o polímeros degradables por enzimas. El material de recubrimiento preferido para retrasar de manera eficaz la liberación no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen polímeros a base de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa, polímeros y copolímeros de ácido acrílico, tales como polímeros y copolímeros de ácido metacrílico, y polímeros y copolímeros de vinilo, tales como polivinilpirrolidona.
Los ejemplos de la composición que permite la administración al colon incluyen además composiciones bioadhesivas que se adhieren específicamente a la membrana mucosa del colon (por ejemplo, un polímero descrito en la memoria descriptiva de la patente estadounidense n.° 6.368.586), y composiciones en las que se incorpora un inhibidor de proteasas para proteger particularmente una preparación biofarmacéutica en los tractos gastrointestinales frente a la descomposición debida a la actividad de una proteasa.
Un ejemplo de un sistema que permite la administración al colon es un sistema de administración de una composición al colon mediante un cambio de presión de tal manera que se libera el contenido utilizando el cambio de presión provocado por la generación de gas en la fermentación bacteriana en la parte distal del estómago. Un sistema de este tipo no está particularmente limitado, y un ejemplo más específico del mismo es una cápsula que tiene el contenido disperso en una base de supositorio y que está recubierta con un polímero hidrófobo (por ejemplo, etilcelulosa).
Otro ejemplo del sistema que permite la administración al colon es un sistema de administración de una composición al colon, descomponiéndose específicamente el sistema por una enzima (por ejemplo, una hidrolasa de hidratos de carbono o una reductasa de hidratos de carbono) presente en el colon. Un sistema de este tipo no está particularmente limitado, y los ejemplos más específicos del mismo incluyen sistemas que usan componentes alimenticios tales como polisacáridos no amiláceos, amilosa, goma xantana y polímeros azoicos.
Cuando se usa como composición farmacéutica, la composición de la presente invención puede usarse en combinación con una composición farmacéutica ya conocida para su uso en inmunosupresión. Una composición farmacéutica conocida de este tipo no está particularmente limitada, y puede ser al menos una composición terapéutica seleccionada del grupo que consiste en corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, antihistaminas, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolina sódica, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para la rinitis, descongestivos anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos anti-IgE monoclonales, vacunas (preferiblemente vacunas usadas para la vacunación en las que la cantidad de alérgeno se aumenta de manera gradual), y combinaciones de los mismos. Es preferible usar estas composiciones terapéuticas en combinación con la composición de la presente invención.
Cuando la composición de la presente invención se usa como un alimento o una bebida, el alimento o la bebida puede ser, por ejemplo, un alimento saludable, un alimento funcional, un alimento para uso saludable especificado, un suplemento alimenticio, o un alimento para pacientes. El alimento o la bebida de la presente invención puede ingerirse en las formas de las composiciones tal como se describió anteriormente, y también puede ingerirse en las formas de diversos alimentos y bebidas. Los ejemplos específicos de los alimentos y las bebidas incluyen diversas bebidas tales como zumos, bebidas refrescantes, bebidas de té, preparaciones de bebidas, bebidas de gelatina y bebidas funcionales; bebidas alcohólicas tales como cervezas; alimentos que contienen hidratos de carbono tales como productos alimenticios de arroz, fideos, panes y pastas; productos de pasta tales como jamones de pescado, salchichas, productos de pasta de marisco; productos en bolsa esterilizados tales como curry, alimentos aderezados con salsas amiláceas espesas y sopas chinas; sopas; productos lácteos tales como leche, bebidas lácteas, helados, quesos y yogures; productos fermentados tales como pastas de soja fermentada, yogures, bebidas fermentadas y pepinillos; productos de judías; diversos productos de confitería tales como productos de confitería occidentales incluyendo panecillos, galletas, y similares, productos de confitería japoneses incluyendo bollos de mermelada de judías al vapor, gelatinas blandas de soja roja, y similares, caramelos, chicles, gominolas, postres fríos incluyendo gelatinas, flanes y postres congelados; alimentos instantáneos tales como sopas instantáneas y sopas de soja instantáneas; alimentos para cocinarse en microondas; y similares. Además, los ejemplos también incluyen alimentos y bebidas saludables preparados en las formas de polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, líquidos, pastas y gelatinas.
Sin desear limitarse a la teoría, en la presente invención, los individuos en los que la abundancia relativa de bacterias pertenecientes al grupoFirmicutes(el grupo al que pertenecen los grupos IV y XIVa deClostridium)es mayor, ganan más peso corporal que los individuos en los que la abundancia relativa de bacterias pertenecientes al grupoBacteroideteses mayor. Por consiguiente, la composición de la presente invención es capaz de condicionar la absorción de nutrientes y mejorar la eficacia de alimentación.
Además, la adición de la composición de la presente invención a un pienso libre de antibióticos permite aumentar el peso corporal de un sujeto que ingiere el pienso hasta un nivel igual a o mayor que los logrados por piensos que contienen antibióticos, y también permite reducir las bacterias patógenas en el estómago hasta un nivel igual a los logrados por piensos que contienen antibióticos típicos.
El alimento o la bebida de la presente invención puede fabricarse mediante una técnica de fabricación que se conoce bien en el campo técnico. Al alimento o a la bebida pueden añadírsele uno o más componentes (por ejemplo, un nutriente) que sean eficaces para la mejora de una función inmunitaria mediante un efecto inmunosupresor. Además, el alimento o la bebida puede combinarse con otro componente u otro alimento funcional que presente una función distinta de la función de la mejora de una función inmunitaria para servir de ese modo como alimento o bebida multifuncional.
Además, la composición de la presente invención puede incorporarse preferiblemente en alimentos que requieren una etapa de procesamiento que puede destruir las cepas probióticas ordinarias. Específicamente, la mayoría de cepas probióticas que pueden usarse comercialmente no pueden incorporarse en alimentos que necesiten procesarse mediante uno cualquiera de tratamiento térmico, almacenamiento a largo plazo, tratamiento de congelación, tratamiento de esfuerzo mecánico y tratamiento de alta presión (por ejemplo, extrusión o perfilado). Por otro lado, debido a una naturaleza ventajosa de formación de esporas, la composición de la presente invención puede incorporarse fácilmente en tales alimentos procesados.
Por ejemplo, la composición de la presente invención en forma de esporas puede sobrevivir incluso en un alimento seco, y puede permanecer viva incluso después de ingerirse. Del mismo modo, la composición de la presente invención puede soportar procedimientos de esterilización a baja temperatura, normalmente procedimientos a una temperatura en un intervalo de desde 70°C hasta el punto de ebullición, ambos inclusivos. Por tanto, la composición de la presente invención puede incorporarse en todas las clases de productos lácteos. Además, la composición de la presente invención puede soportar almacenamiento a largo plazo de muchos años; procesamiento a alta temperatura tal como horneado y ebullición; procesamiento a baja temperatura tal como congelación y almacenamiento en frío; y tratamientos de alta presión tales como extrusión y perfilado.
Los alimentos que necesitan procesarse en tales condiciones rigurosas no están particularmente limitados, y los ejemplos de los mismos incluyen alimentos que necesitan procesarse en un horno microondas para ser comestibles (por ejemplo, avena), alimentos que necesitan hornearse para ser comestibles (por ejemplo, magdalenas), alimentos que necesitan someterse a un tratamiento de esterilización a alta temperatura durante un corto periodo de tiempo para ser comestibles (por ejemplo, leche) y alimentos que necesitan calentarse para ser bebibles (por ejemplo, té caliente).
Cuando la composición de la presente invención se administra o ingiere, la cantidad de la misma para la administración o ingestión se selecciona según sea apropiado dependiendo de la edad, el peso corporal, los síntomas, los problemas de salud del sujeto, la clase de composición (un producto farmacéutico, un alimento o una bebida, o similares), y similares. Por ejemplo, la cantidad por administración o ingestión es generalmente de 0,01 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, y preferiblemente de 1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal.
En este caso, la “provisión al producto o al manual del mismo con la nota” significa que la nota se proporciona a un cuerpo principal, un recipiente, un envase, o similares del producto, o la nota se proporciona a un manual, un prospecto del envase, un folleto u otros materiales impresos, que divulgan información sobre el producto.
<Inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras>
Tal como se describió anteriormente, y tal como se mostrará en los ejemplos, la administración de la composición de la presente invención a un individuo permite inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras en el individuo.
El “ individuo” puede estar en un estado sano o un estado enfermo.
Además, tal como se mostrará en el ejemplo 5 que se describirá más adelante, las bacterias comensales Gram positivas desempeñan papeles principales en la proliferación o acumulación de células T reguladoras.
En la presente invención, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen antibióticos de aminoglucósido (amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina y paromomicina), antibióticos de cefalosporina (cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona y cefoxotina), sulfonamidas, ampicilina y estreptomicina. Sin desear estar unido a una teoría, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” según la presente invención es preferiblemente uno que reduce las bacterias Gram negativas y contribuye a la colonización de bacterias Gram positivas.
Además, una composición prebiótica tal como piel de almendra, inulina, oligofructosa, rafinosa, lactulosa, pectina, hemicelulosa (tal como xiloglucano y alfa-glucanos), amilopectina y almidón resistente que no se descomponen en la parte alta del tracto gastrointestinal y fomentan el crecimiento de microbios intestinales en el tracto intestinal, así como factores de crecimiento tales como acetil-CoA, biotina, melazas de remolacha y extractos de lavadura, contribuyen a la proliferación de bacterias pertenecientes al géneroClostridium.
Mientras tanto, en la “ inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras” de la presente invención, la composición de la presente invención, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” descrito anteriormente y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” descrito anteriormente pueden usarse en combinación. Tal uso combinado no está particularmente limitado, y los ejemplos del uso combinado son los siguientes: el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” se administra a un individuo de antemano, y luego se administra la composición de la presente invención; el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la composición de la presente invención se administran simultáneamente a un individuo; la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” se administra a un individuo de antemano, y luego se administra la composición de la presente invención; la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” y la composición de la presente invención se administran simultáneamente a un individuo; la composición de la presente invención, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento” se administran a un individuo simultáneamente o de manera individual en cualquier momento apropiado.
Además, una composición terapéutica puede administrarse a un individuo junto con al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en la composición de la presente invención, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento”.
Una composición terapéutica de este tipo no está particularmente limitada, y puede ser al menos una composición terapéutica seleccionada del grupo que consiste en corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, antihistaminas, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolina sódica, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para la rinitis, descongestivos anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos anti-IgE monoclonales, vacunas (preferiblemente, vacunas usadas para la vacunación en las que la cantidad de alérgeno se aumenta de manera gradual), y combinaciones de los mismos. Es preferible usar estas composiciones terapéuticas en combinación con la sustancia descrita anteriormente.
Además, no hay particular limitación impuesta sobre el uso combinado de la composición terapéutica con al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en la composición de la presente invención, el “antibiótico contra bacterias Gram negativas” y la “composición prebiótica o el factor de crecimiento”. Por ejemplo, la “una sustancia” y la composición terapéutica se administran por vía oral o parenteral a un individuo simultáneamente o de manera individual en cualquier momento apropiado.
Además, puede determinarse si la administración de la composición de la presente invención o similar induce realmente o no la proliferación o acumulación de células T reguladoras, usando como índice, aumento o refuerzo de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en el número de células T reguladoras, la razón de células T reguladoras en el grupo de células T del colon, una función de células T reguladoras y la expresión de un marcador de células T reguladoras. Es preferible usar una medición seleccionada del grupo que consiste en fomento de la expresión de IL-10, fomento de la expresión de CTLA4, fomento de la expresión de IDO y supresión de la expresión de IL-4 expresión, como índice de la inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras.
Obsérvese que los ejemplos de un método para detectar tal expresión incluyen transferencia de tipo Northern, RT-PCR y transferencia por puntos para la detección de la expresión génica a nivel de transcripción; y ELISA, radioinmunoensayo, inmunotransferencia, inmunoprecipitación y citometría de flujo para la detección de la expresión génica a nivel de traducción.
Mientras tanto, una muestra usada para medir un índice de este tipo no está particularmente limitada, y los ejemplos de la misma incluyen sangre muestreada de un individuo y partes de tejido obtenidas en una biopsia.
<Predicción de la respuesta de un individuo a la composición de la presente invención y/o el pronóstico de un individuo>
Puede determinarse la cantidad absoluta o la razón de bacterias pertenecientes al géneroClostridiumen una microbiota de un individuo, y cuando la razón o el valor absoluto de las bacterias pertenecientes al géneroClostridiumse reduce en comparación con un valor de referencia obtenido realizando una determinación similar en un individuo con un estado de salud típico, se determina que posiblemente el individuo es sensible a la composición de la presente invención. La respuesta de un sujeto a una sustancia puede determinarse midiendo el porcentaje o las cantidades absolutas de los grupos IV y XIV deClostridiumen la microbiota del sujeto y compararlos con un valor de referencia de las mismas mediciones en un sujeto sano prototipo, en el que una cantidad absoluta o un nivel de porcentaje disminuido de los grupos IV y/o XIV deClostridiumindica que el sujeto puede responder de manera favorable a las composiciones de la invención. Puede medirse la composición de la microbiota del sujeto después de la administración de la sustancia. Un aumento del porcentaje o número absoluto deClostridiumspp. pertenecientes a los grupos IV, XIV después de la administración de las composiciones de la presente invención con respecto a antes de la administración es un indicador positivo de inmunosupresión (o inmunorregulación) potenciada. La medición de la composición de la microbiota de un sujeto puede realizarse con técnicas conocidas en la técnica, tal como secuenciación de ARNr 16S.
Obsérvese que la sustancia son bacterias pertenecientes al géneroClostridium.
<Composición de vacuna y tratamiento o prevención de una enfermedad infecciosa o una enfermedad autoinmunitaria usando la composición de vacuna>
Tal como se describió anteriormente, y tal como se mostrará en el ejemplo 15 que se describirá más adelante, la inducción de células Treg en el colon porClostridiumtiene un papel importante en respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Por consiguiente, la presente invención también puede proporcionar una “composición de vacuna que comprende, como principio activo, bacterias pertenecientes al géneroClostridiumpara su uso en el tratamiento, la ayuda en el tratamiento, la reducción de la gravedad de, o la prevención de al menos una enfermedad seleccionada de enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias en un individuo”.
Obsérvese que tales “enfermedades autoinmunitarias” no están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen aquellas descritas como los “ejemplos específicos de enfermedades objetivo” en <Composición que tiene efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras>. Las “enfermedades infecciosas” tampoco están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen enfermedades infecciosas asociadas con los “patógenos infecciosos” descritos como los “ejemplos de patógenos infecciosos” en < Composición que tiene efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras>.
<Método para seleccionar un compuesto que tiene actividad para fomentar la proliferación o acumulación de células T reguladoras>
Un compuesto que tiene una actividad para fomentar la proliferación o acumulación de células T reguladoras puede seleccionarse usando un método que comprende:
(1) preparar una sustancia de prueba, es decir, bacterias pertenecientes al géneroClostridium;
(2) preparar mamíferos no humanos en los que va a expresarse un gen indicador bajo el control de la expresión del gen de IL-10;
(3) poner la sustancia de prueba en contacto con el mamífero no humano;
(4) después del contacto con la sustancia de prueba, detectar células que expresan el gen indicador en un grupo de células CD4+ Foxp3+ del mamífero no humano, y determinar el número de células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador o una razón de células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador con respecto a células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que no expresan el gen indicador;
(5) detectar células que expresan el gen indicador en un grupo de células CD4+ Foxp3+ del mamífero no humano que no ha estado en contacto con la sustancia de prueba, y determinar el número de células en el grupo de células<c>D4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador o una razón de células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que expresan el gen indicador con respecto a células en el grupo de células CD4+ Foxp3+ que no expresan el gen indicador; y
(6) comparar los números absolutos o las razones determinadas en las etapas (4) con el número o la razón determinada en (5), y determinar, cuando el número o la razón determinada en (4) es mayor que la determinada en (5), que la sustancia de prueba es un compuesto que fomenta la proliferación o acumulación de células Treg.
El término “mamífero no humano en el que va a expresarse un gen indicador bajo el control de la expresión del gen de IL-10” no está particularmente limitado, siempre que el mamífero no humano sea un mamífero no humano que tiene un gen indicador cuya expresión está controlada por una región de control de la expresión del gen de IL-10 (por ejemplo, un promotor o un potenciador). Los ejemplos de un gen indicador de este tipo incluyen genes que codifican para proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) y genes que codifican para luciferasa. Como “mamífero no humano en el que va a expresarse un gen indicador bajo el control de la expresión del gen de IL-10”, puede usarse preferiblemente un ratón Il10venus que se mostrará más adelante en los ejemplos.
El “contacto” no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen la administración de la sustancia de prueba al mamífero no humano por vía oral.
Puede determinarse la composición de una microbiota en un individuo. Un aumento de la razón o el número absoluto de bacterias pertenecientes al géneroClostridiumdespués de la administración de la composición de la presente invención al individuo con respecto a la razón o el número absoluto antes de la administración puede usarse como índice de inmunosupresión aumentada. El método para determinar la composición de la microbiota no está particularmente limitado, y pueden usarse técnicas conocidas (por ejemplo, secuenciación de ARNr 16S) según sea apropiado.
También puede medirse la diferenciación de células Treg. Un aumento de la diferenciación de células Treg en un individuo después de la administración de la composición de la presente invención al individuo con respecto a aquella antes de la administración puede usarse como índice de inmunosupresión (o inmunorregulación) aumentada.
La composición de la presente invención también puede administrarse a un individuo bajo un tratamiento con antibióticos. La programación temporal de la administración no está particularmente limitada, y la composición de la presente invención puede administrarse, por ejemplo, antes de o simultáneamente con el tratamiento con antibióticos. Mientras tanto, la composición de la presente invención se administra preferiblemente en la forma de esporas desde el punto de vista de resistencia al tratamiento con antibióticos.
Además, en un modo preferido de tal administración, la composición de la presente invención se administra, por ejemplo, después de o simultáneamente con la administración de un antibiótico contra bacterias Gram positivas. Obsérvese que un “antibiótico contra bacterias Gram positivas” de este tipo no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen antibióticos de cefalosporina (cefalexina, cefuroxima, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil y ceftobiprol); antibióticos de fluoroquinolona (Cipro, Levaquin, floxina, tequina, Avelox y Norflox); antibióticos de tetraciclina (tetraciclina, minociclina, oxitetraciclina y doxiciclina); antibióticos de penicilina (amoxicilina, ampicilina, penicilina V, dicloxacilina, carbenicilina, vancomicina y meticilina); y antibióticos de carbapenem (ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina y meropenem).
Mientras tanto, en otro modo preferido de tal administración, la composición de la presente invención se administra, por ejemplo, después de (o simultáneamente con) un tratamiento usando vancomicina, metronidazol, linezolid, ramoplanina o fidaxomicina.
Ejemplos
Obsérvese que los ratones usados en los ejemplos se prepararon o produjeron de la siguiente manera. En la siguiente descripción, puede hacerse referencia a los ratones con “SPF” o “GF” unido detrás de los mismos. Estos “SPF” y “GF” indican que los ratones se mantuvieron en ausencia de bacterias patógenas específicas (libres de patógenos específicos, SPF) y que los ratones se mantuvieron en condiciones asépticas (GF,germ-free),respectivamente.
<Ratones>
Los ratones C57BL/6, Balb/c e IQI mantenidos en condiciones SPF o GF se adquirieron de Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Japón), JAPAN SLC, INC. (Japón), CLEA JAPAN, Inc. (Japón) o Jackson Laboratory (EE.UU.). Los ratones GF y los ratones gnotobióticos se criaron y mantuvieron dentro de la instalación gnotobiótica de la Universidad de Tokio, Instituto Central de Yakult para investigación microbiológica, o Sankyo Labo Service Corporation, Inc. Los ratones Myd88-/-, Rip2-/- y Card9-/- se produjeron tal como se describe en los documentos no de patente 1 a 3, y se sometieron a retrocruzamiento durante 8 generaciones o más, de modo que se logró un acervo genético C57BL/6. Los ratones Foxp3eGFP se adquirieron de Jackson Laboratory.
<Ratones Il10venus>
Para formar un locus bicistrónico que codifique tanto para Il10 como para Venus bajo el control de un promotor de Il10, se creó en primer lugar un constructo de direccionamiento. Específicamente, se insertó un casete (casete de señales IRES-Venus-SV40 poliA, al que se hace referencia en el documento no de patente 4), que se elaboró a partir de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), una proteína fluorescente amarillo (Venus) y una señal SV40 poliA (SV40 poliA) y que se dispuso a continuación del resistente a la neomicina (neo), entre un codón de parada y una señal poliA (exón 5) de un gen Il10. A continuación, se usó el constructo de direccionamiento obtenido para provocar la recombinación homóloga con la región del gen Il10 en el genoma de ratones. Por tanto, se produjeron ratones Il10venus que tenían alelos Il10venus (a los que se hace referencia en la figura 1). Obsérvese que, en la figura 1, “tk” representa un gen que codifica para timidina cinasa, “neo” representa el gen resistente a la neomicina y “BamH1” representa un sitio de escisión por la enzima de restricción BamH1.
Se extrajeron ADN genómicos de los ratones Il10venus, se trataron con BamH1 y se sometieron a transferencia de tipo Southern mediante el uso de una sonda mostrada en la figura 1. La figura 2 muestra los resultados obtenidos. Se detectaron alelos de tipo natural e Il10venus como bandas que tenían tamaños de 19 kb y 5,5 kb, respectivamente. Por tanto, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 2, se encontró que la recombinación homóloga mostrada en la figura 1 se produjo en el genoma de los ratones Il10venus.
Además, se clasificaron células CD4+ Venus- o células CD4+ Venus+ en la lámina propia del colon de los ratones Il10venus mediante el uso de un dispositivo FACSAria. Después se llevó a cabo RT-PCR en tiempo real en un sistema ABI 7300 mediante un método que se describirá más adelante, para determinar la cantidad de ARNm de IL-10 expresado. Las figuras 3 y 4 muestran los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 3 y 4, se encontró que, dado que el desarrollo del ARNm de IL-10 se detectó sólo en las células CD4+ Venus+, la expresión de ARNm de IL-10 en los ratones Il10venus se reflejó de manera correcta en la expresión de Venus. Obsérvese que los estados asépticos de tales ratones Il10venus se establecieron en el Instituto Central para animales de experimentación (Kawasaki, Japón). Los ratones Il10venus en estados asépticos se mantuvieron en aisladores de vinilo en Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Tokio, Japón), y se usaron en los siguientes ejemplos.
Mientras tanto, los experimentos y los análisis en los ejemplos se llevaron a cabo de la siguiente manera.
<Método para la colonización de ratones con bacterias y análisis de los mismos>
Según la descripción en los documentos no de patente 5 y 6, se produjeron ratones en los que se colonizaron SFB oClostridium.Se disolvió el contenido del ciego o las heces de los ratones gnotobióticos obtenidos en agua estéril o una disolución de dilución anaerobia. Se administraron por vía oral el contenido del ciego o las heces disueltos tal como eran o después de un tratamiento con cloroformo a ratones GF. Se cultivaron por separado entre sí tres cepas deLactobacillusy 16 cepas deBacteroidesen un medio de agar EG o BL de manera anaerobia. Se recogieron las bacterias cultivadas, se suspendieron en un caldo TS anaerobio y se administraron por vía oral de manera forzada a ratones GF. Se evaluó el estado de la colonización de las bacterias en los ratones mediante observación por microscopio realizada en una preparación de frotis de microgránulos fecales.
<Separación de células y citometría de flujo>
Con el fin de aislar linfocitos de la lámina propia del colon y de la lámina propia del intestino delgado, se recogieron el intestino delgado y el colon y se abrieron longitudinalmente. Después se lavaron para retirar el contenido fecal y similares del interior de los mismos. Posteriormente, se agitaron el intestino delgado y el colon en HBSS que contenía 5 mM de EDTA a 37°C durante 20 minutos. Después de la retirada del epitelio y del tejido adiposo, se cortaron los tejidos intestinales en trozos pequeños. A los trozos pequeños se les añadió RPMI 1640 (suero bovino fetal (FBS) al 4%, 1 mg/ml de colagenasa D, 0,5 mg/ml de dispasa y 40 |ig/ml de DNasa I (todos ellos se fabricaron por Roche Diagnostics K.K.)), y se agitó la mezcla en un baño de agua mantenido a 37°C durante 1 hora. Se lavaron los tejidos diferidos con HBSS que contenía 5 mM de EDTA, y se resuspendieron en 5 ml de Percoll al 40% (GE Healthcare). Se superpuso la suspensión en 2,5 ml de Percoll al 80% en un tubo Falcon de 15 ml. Después se llevó a cabo la centrifugación a temperatura ambiente y a 2000 rpm durante 20 minutos para llevar a cabo la separación de células mediante centrifugación por gradiente de densidad Percoll. Se recogieron las células en la superficie de contacto y se usaron como linfocitos de la lámina propia. Se suspendieron las células recogidas en un tampón de tinción (PBS, FBS al 2%, EDTA 2 mM y NaN3 al 0,09%) y se tiñeron mediante el uso de un anticuerpo anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) marcado con PE o PE-Cy7. Después de la tinción de CD4, se tiñeron Foxp3 en las células mediante el uso del kit Cytofix/Cytoperm Plus con Golgistop (BD Biosciences) o el conjunto de tampón de tinción de Foxp3 (eBioscience), así como un anticuerpo anti-Foxp3 (FJK-16s, eBioscience) marcado con Alexa647. Se realizó citometría de flujo mediante el uso de un dispositivo FACSCanto II, y los datos se analizaron mediante el software FlowJo (TreeStar Inc.). La clasificación de las células se realizó mediante el uso de un dispositivo FACSAria.
<RT-PCR en tiempo real>
A partir de un ARN preparado usando el kit RNeasy Mini (Qiagen), se sintetizó un ADNc mediante el uso de una transcriptasa inversa<m>M<v>(Promega KK). Se analizó el ADNc obtenido mediante RT-PCR en tiempo real usando la mezcla madre para PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems) y el sistema para PCR en tiempo real ABI 7300 (Applied Biosystems), o RT-PCR en tiempo real usando el reactivo SYBR Premix Ex Taq (TAKARA) y un dispositivo Light Cycler 480. Para cada muestra, se normalizó el valor obtenido con respecto a la cantidad de GAPDH. Se diseñó un conjunto de cebadores usando Primer Express versión 3.0 (Applied Biosystems), y se seleccionaron aquellos que mostraron una identidad de secuencia del 90% o mayor en la evaluación inicial. El conjunto de cebadores usado fue el siguiente:
Foxp3
5'-GGCAATAGTTCCTTCCCAGAGTT-3' (SEQ ID NO: 1)
5'-GGGTCGCATATTGTGGTACTTG-3' (SEQ ID NO: 2)
CTLA4
5'-CCTTTTGTAGCCCTGCTCACTCT-3' (SEQ ID NO: 3)
5'-GGGTCACCTGTATGGCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 4)
GITR
5'-TCAGTGCAAGATCTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 5)
5'-ACACCGGAAGCCAAACACA-3' (SEQ ID NO: 6)
IL-10
5'-GATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGT-3' (SEQ ID NO: 7)
5'-CTTCTATGCAGTTGATGAAGATGTCAA-3' (SEQ ID NO: 8)
GAPDH
5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3' (SEQ ID NO: 9)
5'-TCTCCACTTTGCCACTGCAA-3' (SEQ ID NO: 10)
Mmp2
5'-GGACATTGTCTTTGATGGCA-3' (SEQ ID NO: 11)
5'-CTTGTCACGTGGTGTCACTG-3' (SEQ ID NO: 12)
Mmp9
5'-TCTCTGGACGTCAAATGTGG-3' (SEQ ID NO: 13)
5'-GCTGAACAGCAGAGCCTTC-3' (SEQ ID NO: 14)
Mmp13
5'-AGGTCTGGATCACTCCAAGG-3' (SEQ ID NO: 15)
5'-TCGCCTGGACCATAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 16)
Ido1
5'-AGAGGATGCGTGACTTTGTG-3' (SEQ ID NO: 17)
5'-ATACAGCAGACCTTCTGGCA-3' (SEQ ID NO: 18).
<Preparación y cultivo de células epiteliales del intestino grueso (IEC)>
En primer lugar, se recogió el colon, se abrió longitudinalmente y se enjuagó con PBS. Posteriormente, se trató el colon con ditiotreitol (DTT) 1 mM a 37°C durante 30 minutos en un agitador, y luego se agitó con vórtex durante un minuto para alterar la integridad epitelial. Se recogieron las IEC liberadas y se suspendieron en 5 ml de Percoll al 20%. Se superpuso la suspensión en 2,5 ml de Percoll al 80% en un tubo Falcon de 15 ml. Después se centrifugó el tubo a 25°C y 780 g durante 20 minutos para llevar a cabo la separación de células mediante centrifugación por gradiente de densidad Percoll. Se recogieron las células en la superficie de contacto y se usaron como IEC del colon (pureza: 90% o mayor, viabilidad: 95%). Se suspendieron las IEC obtenidas recogidas de ese modo en RPMI que contenía FBS al 10%, y se cultivaron 1x105 células de las IEC en una placa de 24 pocillos durante 24 horas. Después de eso, se recogió el sobrenadante de cultivo y se midió para determinar el nivel de TGF-P1 activo mediante ELISA (Promega). Mientras tanto, para cultivar las células Tin vitro,se cultivaron 1,5x105 células T CD4+ del bazo purificadas mediante MACS en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo, junto con un medio acondicionado al 50% en el que se cultivaron IEC aisladas de ratones GF o ratones colonizados conClostridium,y con 25 ng/ml de hIL-2 (Peprotech), en presencia o ausencia de 25 |ig/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (R&D). Obsérvese que se unieron 10 |ig/ml de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (BD Bioscience) a la placa de fondo redondo. Después de un cultivo de 5 días, se recogieron las células T CD4+ y se sometieron a PCR en tiempo real.
<Modelo experimental de colitis>
Se administró por vía oral una suspensión fecal de ratones colonizados conClostridiuma ratones C57BL/6 (2 semanas de edad) y se hicieron crecer en un entorno convencional durante seis semanas.
Para preparar un modelo de colitis inducida por DSS, se administró DSS al 2% (p/v) (calidad para reactivo, sal de DSS, peso molecular = de 36 a 50 kD, fabricado por MP Biomedicals), junto con agua potable, a los ratones durante seis días.
Mientras tanto, para preparar un modelo de colitis inducida por oxazolona, se sensibilizaron previamente los ratones mediante la aplicación transdérmica sobre los ratones de 150 |il de una disolución de oxazolona al 3% (4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona, Sigma-Aldrich)/etanol al 100%. Cinco días después de eso, se inyectó por vía intrarrectal 150 |il de una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50% de nuevo a los ratones sensibilizados previamente con una ligera anestesia. Obsérvese que la administración intrarrectal se llevó a cabo usando un catéter de 3,5 F.
Se analizó cada ratón diariamente para determinar el peso corporal, la sangre oculta, el sangrado visible con a simple vista (sangre macroscópica) y la dureza de las deposiciones. Además, se evaluaron numéricamente el porcentaje de pérdida de peso corporal, el sangrado intestinal (no sangrado, sangre oculta (hemoccult+) o sangrado visible a simple vista) y la dureza de las deposiciones (deposición normal, deposición semilíquidas o diarrea) y se calculó el índice de actividad de la enfermedad (DAI, por sus siglas en inglés) según la descripción en “S. Wirtz, C. Neufert, B. Weigmann, M. F. Neurath, Nat Protoc 2, 541 (2007)”.
<Reacción de IgE específica de OVA>
Se inocularon ratones BALB/c SPF con una suspensión fecal de ratones colonizados conClostridium(2 semanas de edad) y se hicieron crecer en un entorno convencional. Después se inyectó por vía intraperitoneal 1 |ig de OVA (grado V, Sigma) y 2 mg de alumbre (Thermo Scientific), 0,2 ml en total, a los ratones (a sus edades de 4 semanas y 6 semanas). Se recogieron sueros cada semana de los ratones de la raíz de su cola y se midió la IgE específica de OVA mediante ELISA (Chondrex). Después, a sus edades de 8 semanas, se recogieron células del bazo, se inocularon en una placa de 96 pocillos a 1x106 células por pocillo y se estimularon con OVA (100 |ig/ml) durante tres días. Después de eso, se recogió el sobrenadante de cultivo y se midió para determinar los niveles de IL-4 e IL-10 mediante ELISA (R&D).
<Análisis estadístico>
La diferencia entre los grupos de control y experimental se evaluó mediante la prueba de la t de Student.
(Ejemplo 1)
En primer lugar, se investigó si la acumulación de células T reguladoras (células Treg) en la lámina propia del colon era dependiente o no de las bacterias comensales. Específicamente, se aislaron linfocitos de los ganglios linfáticos periféricos (pLN) de ratones Balb/c criados en ausencia de bacterias patógenas específicas (SPF) o de la lámina propia del colon o del intestino delgado (SI) de los ratones. Se tiñeron CD4 y Foxp3 mediante anticuerpos. Después se analizó la razón de células Foxp3+ en linfocitos CD4+ mediante citometría de flujo. La figura 5 muestra los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 5, se encontró que las células Treg Foxp3+ estaban presentes a una alta frecuencia en la lámina propia de los tractos gastrointestinales, especialmente en la lámina propia del colon, de ratones mantenidos en un entorno libre de microorganismos patógenos específicos (SPF). Además, también se encontró que el número de células Treg Foxp3+ en la lámina propia del colon aumentó de manera gradual hasta tres meses después de su nacimiento, mientras que el número de células Treg Foxp3+ en los ganglios linfáticos periféricos fue básicamente constante desde el momento de dos semanas después de su nacimiento.
(Ejemplo 2)
A continuación, se investigó si la acumulación temporal de células Treg en el colon tal como se encontró en el ejemplo 1 tenía o no una relación con la colonización de la microbiota comensal intestinal. Específicamente, se analizaron la expresión de CD4 y la expresión de Foxp3 en linfocitos aislados del intestino delgado, el colon y los ganglios linfáticos periféricos de ratones criados en un entorno aséptico (GF) o SPF (8 semanas de edad: ratones Balb/c, ratones IQI y ratones C57BL/6). Se obtuvieron resultados similares en tres o más experimentos independientes. Las figuras 6 y 7 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 7, cada círculo blanco representa el número absoluto de células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, y las barras de error representan las desviaciones estándar (DE).
Además, se recogieron linfocitos de la lámina propia de ratones SPF y ratones GF (ratones Balb/c o ratones C57BL/6). Se tiñeron CD4 y Foxp3 con anticuerpos. Después se analizaron los linfocitos de la lámina propia mediante FACS. La figura 8 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 8, cada círculo blanco representa el número absoluto de células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, ** indica que “P < 0,001” y * indica que “P < 0,01”.
Además, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon, de la lámina propia del intestino delgado (SI), de las placas de Peyer (PP) y de los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) de ratones (ratones C57BL/6 SPF) a los que se les administraron por vía oral antibióticos con agua durante ocho semanas. Se tiñeron CD4 y Foxp3 con anticuerpos. Después se analizaron los linfocitos mediante FACS. Se obtuvieron resultados similares en dos o más experimentos independientes. La figura 9 muestra los resultados obtenidos (la razón de células Foxp3+ en células CD4+ de un ratón individual). Obsérvese que se usaron los siguientes antibióticos en combinación según la descripción en el siguiente documento:
ampicilina (A; 500 mg/l, Sigma)
vancomicina (V; 500 mg/l, NACALAI TESQUE, INC.)
metronidazol (M; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
neomicina (N; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
Rakoff-Nahoum, J. Paglino, F. Eslami-Varzaneh, S. Edberg, R. Medzhitov, Cell 118, 229 (23 de julio de 2004)
Fagarasanet al.,Science 298, 1424 (15 de noviembre de 2002).
En la figura 9, cada círculo blanco representa el número absoluto de Células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, cada barra horizontal representa el valor promedio de los números absolutos, * indica que “P < 0,01” y “AVMN” representa las clases de antibióticos administrados usando las primeras letras de los antibióticos.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 6 a 9, las frecuencias y los números absolutos de células CD4+ Foxp3+ en el intestino delgado y los ganglios linfáticos periféricos de ratones GF fueron iguales a o mayores que los de ratones SPF (véanse las figuras 6 a 8). Además, los números de células Treg en la del lámina propia del intestino delgado, las placas de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos de ratones SPF a los que se les administraron por vía oral los antibióticos durante ocho semanas fueron iguales a o mayores que los de ratones SPF (véase la figura 9). Mientras tanto, el número de células CD4+ Foxp3+ en la lámina propia del colon de ratones GF disminuyó significativamente en comparación con el de ratones SPF (véanse las figuras 6 y 7). Esta disminución se observó comúnmente entre ratones de diferentes acervos génicos (Balb/c, IQI y C57BL/6), así como entre ratones criados en diferentes instalaciones para animales (véase la figura 7 para los datos en cuanto a los diferentes acervos génicos, los datos en cuanto a los ratones criados en las diferentes instalaciones para animales no se muestran en los dibujos). Además, también se mostró que el número de células Treg en la lámina propia del colon de los ratones C57BL/6 SPF a los que se les administraron los antibióticos disminuyó significativamente (véase la figura 9).
(Ejemplo 3)
A continuación, se comprobó directamente si la disminución en el número de células Treg en la lámina propia del colon de los ratones GF mostrada en el ejemplo 2 se atribuía o no a la ausencia de microbiota. Específicamente, se administró por vía oral una suspensión fecal de ratones B6 SPF adquiridos de Jackson Laboratory a ratones IQI GF (convencionalización). Tres semanas después de la administración, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon y se analizó la expresión de Foxp3 en linfocitos CD4+. Las figuras 10 y 11 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que cada círculo blanco en la figura 11 representa el número absoluto de células CD4+ Foxp3+ en un ratón individual, las barras de error representan las desviaciones estándar (DE), * indica que “P < 0,01” en la prueba de la t de Student y ** indica que “P < 0,001”. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 10 y 11, el número de células Treg en la lámina propia del intestino delgado no cambió. Sin embargo, el número de células Treg en la lámina propia del colon aumentó significativamente. Por tanto, se mostró que la interacción entre el huésped y los microbios desempeñaba un papel importante en la acumulación de células Treg Foxp3+ en la lámina propia del colon, mientras que la acumulación de células Treg en la lámina propia del intestino delgado tenía un mecanismo diferente.
(Ejemplo 4)
A continuación, se investigó la relación entre los tejidos linfáticos asociados al intestino de ratones y el número de células Foxp3+ en la lámina propia del colon de los ratones según el método descrito en M. N. Kweonet al.,J Immunol 174, 4365 (1 de abril de 2005). Específicamente, se inyectaron por vía intraperitoneal 100 |ig de una proteína recombinante del dominio extracelular (una proteína de fusión (LTpR-Ig) entre un receptor de linfotoxina p (LTpR) y una región Fc de IgG1 humana, véase Hondaet al.,J Exp Med 193, 621 (5 de marzo de 2001)) en ratones C57BL/6 gestantes 14 días después de la concepción. Se inyectó de nuevo por vía intraperitoneal LTpR-Ig en los fetos obtenidos de tales ratones, de modo que se produjeron ratones de los que se retiraron por completo folículos linfáticos aislados (ILF), placas de Peyer (PP) y placas del colon (CP). Después se analizaron las razones de células Foxp3+ en células CD4+ en la lámina propia del colon de ratones tratados con LTpR-Ig y de ratones tratados con IgG de rata (control) mediante FACS. La figura 12 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 12, cada círculo blanco representa la razón de células Foxp3+ en un ratón individual y las barras de error representan las desviaciones estándar. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 12, se encontró que la razón de células Foxp3+ en la lámina propia del colon de ratones deficientes en folículos linfáticos aislados, placas de Peyer y placas del colon (ratones tratados con LTpR-Ig) aumentó bastante. Por consiguiente, se sugirió que la disminución en el número de células Treg en la lámina propia del colon de ratones GF y ratones tratados con los antibióticos era debida a la transmisión de señales específicas que fomenta la acumulación de células Treg en la lámina propia del colon y la que está provocada por los microbios intestinales no se produjo, en lugar de simplemente debido a un efecto secundario de tejidos linfáticos asociados al intestino desordenados.
(Ejemplo 5)
Para investigar si la flora intestinal específica inducía o no la acumulación de células Treg del colon, se administró vancomicina como antibiótico contra bacterias Gram positivas o polimixina B como antibiótico contra bacterias Gram negativas a ratones SPF (de 4 semanas de edad) durante cuatro semanas y se analizó para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+ ([%] de Foxp3+ en CD4). La figura 30 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 30, “SPF” indica el resultado de ratones SPF (control), “poli B” indica el resultado de ratones SPF a los que se les administró polimixina B y “Vanco.” indica el resultado de ratones SPF a los que se les administró vancomicina. Mientras tanto, * indica que “P < 0,01”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 30, el número de células Treg en el colon de ratones a los que se les administró vancomicina disminuyó de manera notable en comparación con el del control. Por el contrario, no se observó ninguna influencia en el número de células Treg de ratones a los que se les administró polimixina B. Esos hechos sugirieron que las bacterias comensales Gram positivas desempeñaban un papel principal en la acumulación de células Treg.
(Ejemplo 6)
Un informe reciente ha sugerido que las bacterias que forman esporas desempeñan un papel importante en la respuesta de células T del intestino (véase V. Gaboriau-Routhiauet al.,Immunity 31,677 (16 de octubre de 2009)). A este respecto, se administraron por vía oral microorganismos fecales (fracción de formación de esporas) resistentes al tratamiento con cloroformo al 3% a ratones GF, que luego se analizaron para determinar la razón de células Foxp3+ en el grupo de células CD4+ ([%] de Foxp3+ en CD4). La figura 31 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 31, “GF” indica el resultado de ratones GF y “+cloro” indica el resultado de ratones GF a los que se les administraron heces tratadas con cloroformo. Mientras tanto, ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 31, tres semanas después de la administración de las heces tratadas con cloroformo, el número de células Treg en los ratones administrados aumentó de manera notable hasta el mismo nivel que el de ratones SPF y ratones GF a los que se les administró de manera forzada heces sin tratar (véanse las figuras 7 y 11).
Por consiguiente, teniendo en cuenta los resultados mostrados en el ejemplo 5 en combinación, se reveló que los componentes específicos de la microbiota endógena tenían una alta probabilidad de pertenecer al grupo de Gram positivas y que la fracción de formación de esporas desempeñaba un papel importante en la inducción de células Treg.
(Ejemplo 7)
A continuación, se identificaron las especies de la microbiota intestinal que inducían la acumulación de células Treg en el colon tal como se sugirió en los ejemplos 4 a 6. Específicamente, se administraron por vía oral bacterias filamentosas segmentadas (SFB), 16 cepas deBacteroidesspp. (Bactero. (6 cepas deB. vulgatus,7 del grupo 1 deB. acidifaciensy 3 del grupo 2 deB. acidifaciens)),3 cepas deLactobacillus(Lacto.(L. acidophilus, L. fermentumyL. murinum))y 46 cepas deClostridiumspp. (Clost., véase “ Itoh, K., y Mitsuoka, T. Characterization of clostridia isolated from faeces of limited flora mice and their effect on caecal size when associated with germ-free mice. Lab. Animals 19: 111-118 (1985))”), o microbiota recogida de ratones (SPF) criados en un entorno convencional a ratones Balb/c GF o ratones IQI GF. Los ratones se mantuvieron en aisladores de vinilo durante tres semanas. Después se aislaron células CD4 del colon y del intestino delgado de estos ratones. Se analizaron los números de células Treg en el colon y el intestino delgado mediante citometría de flujo.
La figura 13 muestra gráficos de puntos de FACS obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en células CD4+ de ratones Balb/c. La figura 14 muestra la razón de células Foxp3+ en células CD4+ de cada ratón.
Obsérvese que, las bacterias pertenecientes al géneroClostridiumse clasifican mediante secuenciación del gen de ARNr 16S de la siguiente manera. Específicamente, se amplificaron los genes de ARNr 16S de las bacterias mediante PCR usando pares de cebadores específicos de genes de ARNr 16S: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 19) y 5'-ATTACCGCGGCKGCTG-3' (SEQ ID NO: 20) (véase T. Aebischeret al.,Vaccination prevents Helicobacter pilori-induced alterations of the gastric flora in mice. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 46,221-229(2006)). Después se introdujo el producto de PCR de 1,5 kb en el vector pCR-Blunt. Se secuenciaron los insertos y se alinearon usando el programa de software ClustalW. Las secuencias resultantes de los genes de ARNr 16S derivados de la cepa 1-41 de 46 cepas deClostridiumspp. se mostraron en SEQ ID NO: 21-61. El árbol filogenético que se construyó mediante el método de unión de vecinos con las secuencias resultantes de las 41 cepas deClostridiumy las de bacterias conocidas obtenidas de la base de datos Genbank usando el software Mega se mostró en la figura 49.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 13 y 14, no se observó ningún efecto sobre el número de las células Treg en el colon en ratones GF en los que se colonizaron bacterias filamentosas segmentadas (SFB) (véase la figura 14). Además, ratones en los que se colonizó el cóctel de tres cepas deLactobacillusdieron resultados similares (véase la figura 14). Por otro lado, se mostró que la acumulación de células Foxp3+ en la lámina propia del colon se indujo fuertemente en ratones en los que se colonizaron 46 cepas deClostridiumspp. De manera importante, tal acumulación se fomentó independientemente de los acervos génicos de los ratones, y condujo a un aumento en número similar al de ratones SPF a pesar de que sólo se colonizó microbiota intestinal de un solo género. También se mostró que la colonización deClostridiumno cambió el número de células Treg en la lámina propia del intestino delgado (véase la figura 14). Obsérvese que, cuando se colonizaron las 16 cepas deBactericidesspp., el número de células Treg en el colon aumentó significativamente. Sin embargo, el grado del aumento varió en función del acervo génico de los ratones en los que se colonizaron las bacterias (véanse las figuras 13 y 14).
(Ejemplo 8)
A continuación, se analizaron la expresión de CD4, la expresión de Foxp3 y la expresión de Helios en linfocitos LP del timo y del colon de ratones SPF, ratones GF, ratones colonizados conLactobacillusy ratones colonizados conClostridiummediante citometría de flujo.
Las figuras 32 y 33 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 32 y 33, “GF” o “aséptico” indica los resultados de los ratones GF, “SPF” indica los resultados de los ratones SPF, “Lacto.” indica los resultados de los ratones colonizados conLactobacillusy “Clost.” indica los resultados de los ratones colonizados conClostridium.En la figura 32, el eje vertical representa la razón de células Helios- en el grupo de células Foxp3+ ([%] de Helios- en Foxp3+) y ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 32 y 33, la mayoría de células Foxp3+ encontradas en ratones SPF o ratones colonizados conClostridiumno expresaron Helios. Obsérvese que Helios es un factor de transcripción que se sabe que se expresa en células Treg naturales derivadas del tiempo (véase A. M. Thorntonet al.,J Immunol 184, 3433 (1 de abril de 2010)). Por consiguiente, se sugirió que la mayoría de células Treg en ratones SPF y ratones colonizados conClostridiumeran células Treg inducidas en porciones periféricas, es decir, las denominadas células iTreg.
(Ejemplo 9)
A continuación, se investigó si la colonización deClostridiumo similar influía o no en otras células T. Específicamente, se colonizaron SFB, 16 cepas deBacteroidesspp. (Bactero.), 46 cepas deClostridiumspp. (Clost.) o microbiota recogida de ratones criados en un entorno convencional (SPF) en ratones IQI GF. Tres semanas después, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon de estos ratones, y se estimularon con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 |ig/ml) durante cuatro horas en presencia de Golgistop (BD Bioscience). Después de proporcionar estimulación, se tiñeron las citocinas intracelulares usando un anticuerpo anti-IL-17 de PE (TC11-18H10) y un anticuerpo anti-IFN-g de FITC (BD Bioscience) según el manual de un kit Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). Después se analizó la razón de células IFN-y+ o células IL-17+ en leucocitos CD4+ mediante citometría de flujo. Las figuras 15 y 16 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 15 y 16, cada círculo blanco representa el número absoluto de células CD4+ IFN-y+ o el número absoluto de células CD4+ IL-17+ en cada ratón individual y las barras de error representan las desviaciones estándar (DE). Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 15 y 16, la colonización deClostridiumno influyó en células Th1 (células CD4+ IFN-y+) en el colon y sólo provocó un ligero aumento de células Th17 (células c D4+ IL-17+). Por consiguiente, se sugirió que el géneroClostridiumera un género de bacterias que inducía específicamente células Treg.
(Ejemplo 10)
Se ha informado que 46 cepas deClostridiumspp. influyen en la acumulación de linfocitos intraepiteliales (IEL) CD8+ del tracto intestinal en el colon. Por consiguiente, es concebible queClostridiumregule el sistema inmunitario en diversos aspectos, y queClostridiumpresente una capacidad notable para inducir y mantener células Treg especialmente en el colon, tal como se describió anteriormente. Además, se sabe que una clase de citocinas, el factor de crecimiento transformante p (TGF-P), desempeña un papel importante en la regulación de la generación de células Treg.
A este respecto, se examinó si la colonización deClostridiumproporcionaba o no un entorno en el colon rico en TGF-p. Específicamente, en primer lugar, se cultivó el colon completo de ratones GF, ratones colonizados conClostridiumy ratones colonizados conLactobacillusdurante 24 horas, y se midieron los sobrenadantes de cultivo de los mismos para determinar la concentración de TGF-p activo (TGF-p1) mediante ELISA (el número de ratones analizados fue de cuatro por grupo). La figura 34 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 34, “GF” indica el resultado de ratones GF, “Clost.” indica el resultado de ratones colonizados conClostridiumy “Lacto.” indica el resultado de ratones colonizados conLactobacillus.Mientras tanto, * indica que “P < 0,02”, y ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 34, la cantidad de TGF-p producido en el colon de ratones colonizados conClostridiumera significativamente mayor que las de ratones GF y ratones colonizados conLactobacillus.
A continuación, se cultivaron células epiteliales intestinales (IEC) de ratones GF y ratones colonizados conClostridiumdurante 24 horas, y se midieron los sobrenadantes de cultivo de las mismas para determinar la concentración de TGF-p activo (TGF-p1) mediante ELISA (el número de ratones analizados fue de cuatro por grupo). La figura 35 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 35, “GF” indica el resultado de ratones GF y “Clost.” indica el resultado de ratones colonizados conClostridium.Mientras tanto, ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 35, se detectó GF-p en el sobrenadante de cultivo de las IEC aisladas de ratones colonizados conClostridium,mientras que no se detectó TGF-p en el sobrenadante de cultivo de las IEC aisladas de ratones GF.
A continuación, tal como se describió anteriormente, se cultivaron células T CD4+ del bazo durante cinco días junto con un medio acondicionado al 50% en el que se cultivaron IEC aisladas de ratones GF o ratones colonizados conClostridium,y con el anticuerpo anti-CD3, en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TGF-p. Después se recogieron las células T y se analizaron para determinar la expresión de Foxp3 mediante RT-PCR en tiempo real. La figura 36 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 36, “Medio” indica el resultado de un medio en el que no se cultivaron células, “GF” indica el resultado del medio acondicionado en el que se cultivaron IEC de ratones GF, “Clost.” indica el resultado del medio acondicionado en el que se cultivaron IEC de ratones colonizados conClostridiumy “Clost. aTGFp” indica el resultado del medio acondicionado al que se le añadió el anticuerpo anti-TGF-p y en el que se cultivaron IEC de ratones colonizados conClostridium.Mientras tanto, ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 36, cuando se añadió el sobrenadante de cultivo de las IEC derivadas de ratones colonizados conClostridiuma células T CD4+ del bazo, se aceleró la diferenciación en células que expresan Foxp3. Mientras tanto, la diferenciación en las células Treg se inhibió mediante el anticuerpo anti-TGF-p.
Además, se investigó la expresión de MMP2, MMP9 y MMP13, que se piensa que contribuyen a la activación de TGF-p latente. También se investigó la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), que se piensa que está implicada en la inducción de células Treg. Específicamente, se administraron por vía oral 46 cepas bacterianas del géneroClostridium(Clost.) o tres cepas bacterianas del géneroLactobacillus(Lacto.) a ratones C57BL/6 asépticos. Tres semanas después de la administración, se recogieron las IEC y se analizaron para determinar los niveles de expresión relativos de ARNm de los genes de MMP2, MMP9, MMP13 e IDO mediante RT-PCR en tiempo real (el número de ratones analizados fue de tres por grupo). Las figuras 37 a 40 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 37 a 40, “GF n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones GF, “Clost. n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones colonizados conClostridiumy “Lacto. n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones colonizados conLactobacillus.
Para la relación entre la activación de TGF-p latente y las MMP descritas anteriormente, véanse D'Angeloet al.,J. Biol. Chem. 276, 11347-11353, 2001; Heidingeret al.,Biol. Chem. 387, 69-78, 2006; Yuet al.,Genes Dev. i4, 163 176, 2000. Para la relación entre IDO y la inducción de células Treg, véase G. Matteoliet al.,Gut 59, 595 (mayo de 2010).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 37 a 39, de acuerdo con la producción de TGF-p descrita anteriormente, se expresaron los productos de transcripción de los genes que codifican para MMP2, MMP9 y MMP13 a niveles más altos en las IEC derivadas de ratones colonizados conClostridiumque los de ratones GF y ratones colonizados conLactobacillus.
Además, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 40, IDO se expresó sólo en ratones colonizados conClostridium.
Por consiguiente, se reveló queClostridiumactivó las IEC y condujo a la producción de TGF-p y otras moléculas que inducen células Treg en el colon.
(Ejemplo 11)
A continuación, se investigó si la acumulación de células Treg inducidas por la colonización deClostridiumera dependiente o no de la transmisión de señales mediante receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos. Específicamente, se examinaron los números de células Treg en la lámina propia del colon de cada uno de ratones SPF de Mvd88-/' (deficiente en Myd88 (adaptador de señalización para el receptor tipo Toll)), R¡p2-/' (deficiente en Rip2 (adaptador del receptor NOD)) y Card9'/_ (deficiente en Card9 (factor de transmisión de señales esencial para la transmisión de señales Dectina-1)). Además, se provocó que la colonización deClostridiumspp. en ratones Myd88-/' GF, y se investigó el cambio en el número de células Treg. Las figuras 17 y 18 muestran los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 17 y 18, el número de células Treg de cada clase de ratones SPF deficientes en los factores asociados de los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos no cambió con respecto al de ratones de tipo natural de la misma camada, que sirvió como control. Además, también se encontró que cuando se colonizaronClostridiumspp. en ratones GF deficientes en Myd88, se inducía la acumulación de células Treg en la lámina propia del colon. Por consiguiente, se ha sugerido que el mecanismo de inducción de la acumulación de células Treg en la lámina propia del colon no se basa en la activación de la ruta de reconocimiento para patrones moleculares asociados a patógenos principales, tal como se provoca por la mayoría de bacterias, sino en especies de bacterias comensales específicas.
(Ejemplo 12)
Se sabe que las células Treg Foxp3+ del tracto intestinal ejercen algunas funciones inmunosupresoras a través de la producción de IL-10 (véase el documento no de patente 9). Mientras tanto, se sabe que animales que tienen células CD4+ Foxp3+ de las que se elimina específicamente IL-10 desarrollan enfermedad inflamatoria del intestino (véase el documento no de patente 18). A este respecto, en primer lugar, se examinó la expresión de IL-10 en linfocitos de diversos tejidos. Específicamente, se aislaron linfocitos de diversos tejidos de ratones SPF Il10venus, y se analizaron la expresión de CD4 y la expresión de Venus mediante citometría de flujo. La figura 19 muestra los resultados obtenidos.
Obsérvese que cada valor numérico en la figura 19 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon de ratones ]l10venus, y se detectó la expresión de cadena P del receptor de células T (TCRp) en las superficies de las células mediante FACS. La figura 20 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos de FACS obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+). Obsérvese que cada valor numérico en la figura 20 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon de ratones ]l10venus Se estimularon los linfocitos con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 |ig/ml) durante cuatro horas en presencia de Golgistop (BD Bioscience). Luego, después de proporcionar estimulación, se tiñeron las citocinas intracelulares usando un anticuerpo anti-IL-17 de PE, un anticuerpo anti-IL-4 de APC (11B11) y un anticuerpo anti-IFN-g de FITC (BD Bioscience) según el manual de un kit Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). La figura 21 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos de FACS obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+).
Obsérvese que cada valor numérico en la figura 21 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, se aislaron células CD4+ Foxp3+ y células CD4+ Foxp3- del bazo (Spl) de ratones indicadores de Foxp3eGFP, y se aislaron células Venus+ de la lámina propia del colon y de la lámina propia del intestino delgado (SI) de ratones ¡l10venus. Después se analizaron las células obtenidas en cuanto a la expresión de genes predeterminados. La expresión génica se analizó mediante RT-PCR en tiempo real usando una mezcla madre para PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems) y un sistema de PCR en tiempo real ABI 7300 (Applied Biosystems). En este caso, se normalizó el valor para cada célula con respecto a la cantidad de GAPDH. La figura 22 muestra los resultados obtenidos. Obsérvese que, en la figura 22, las barras de error representan las desviaciones estándar.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 19 a 22, apenas se detectaron células Venus+ (células productoras de IL-10) en los ganglios linfáticos del cuello uterino (ganglios linfáticos periféricos), el timo, la sangre periférica, el pulmón y el hígado de ratones mantenidos en condiciones SPF. Mientras tanto, en el bazo, las placas de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos de los mismos, se detectaron ligeramente células Venus+ (véase la figura 19). Por otro lado, se encontraron muchas células Venus+ en los linfocitos de la lámina propia del intestino delgado y la lámina propia del colon. Además, la mayoría de las células Venus+ en los intestinos eran positivas para CD4, y también positivas para la cadena P del receptor de células T (TCRP) (véanse las figuras 19 y 20). Además, se encontró que las células T CD4+ Venus+ expresaron Foxp3 y otros factores asociados a células Treg, tales como un antígeno de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y una proteína asociada a TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), aunque las células T CD4+ Venus+ no mostraron ninguno de los fenotipos de Th2 (productores de IL-4) y Th17 (productores de IL-17) (véanse las figuras 21 y 22). Además, se mostró que el nivel de expresión de CTLA-4 en células Venus+ del intestino fue mayor que el de células Treg GFP+ del bazo aisladas de ratones indicadores de Foxp3eGFP (véase la figura 22).
(Ejemplo 13)
Las células Venus+ pueden clasificarse en al menos dos subconjuntos, concretamente, células Treg doblemente positivas (DP) Venus+ Foxp3+ y células Treg Venus+ Foxp3- basándose en la expresión de Foxp3 intracelular. Las células del último subconjunto corresponden a células T reguladoras de tipo 1 (Tr1) (véanse los documentos no de patente 8 y 9). A este respecto, se investigaron las células Venus+ (células productoras de IL-10) observadas en el ejemplo 8 en cuanto a la expresión de Foxp3. Específicamente, se analizó la expresión de CD4, Foxp3 y Venus en la lámina propia del colon y la lámina propia del intestino delgado de ratones ]l10venus mantenidos en condiciones GF o SPF mediante FACS, y se compararon los números de células Venus+ en la lámina propia del tracto intestinal entre ratones ]l10venus SPF y GF. La figura 23 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+).
Además, se analizó la expresión intracelular de Venus y Foxp3 en células CD4 en diversos tejidos de ratones ]l10venus SPF mediante citometría de flujo. La figura 24 muestra los resultados obtenidos (gráficos de puntos obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+). Obsérvese que cada valor numérico en la figura 24 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro.
Además, con el fin de investigar si la presencia de bacterias comensales influía o no en la expresión de !L-10 en células reguladoras en los tractos gastrointestinales, se prepararon ratones ]l10venus asépticos (GF). Después se provocó la colonización de especies predeterminadas de bacterias en los ratones ]l10venusGF obtenidos. Tres semanas después de que se colonizaran las especies de bacterias, se analizó un grupo de células CD4+ (V+F-, células Venus+ Foxp3-; V+F+, células Venus+ Foxp3+; y V-F+, células Venus- Foxp3+) en el que se expresaron Foxp3 y/o Venus en el colon y el intestino delgado mediante citometría de flujo. La figura 25 muestra gráficos de puntos obtenidos cuando se estableció una ventana de adquisición en las células CD4+ de colon, y las figuras 26 y 27 muestran las razones en el grupo de células CD4+ de cada ratón. Obsérvese que cada valor numérico en la figura 25 representa la razón de células dentro de una de las regiones correspondientes divididas en cuatro. Mientras tanto, las barras de error en las figuras 26 y 27 representan las desviaciones estándar, * indica que “P < 0,02” y ** indica que “P < 0,001”.
Además, con el fin de comprobar si la presencia de bacterias comensales influía o no en la expresión de IL-10 en células reguladoras en los tractos gastrointestinales, se proporcionaron por vía oral antibióticos con agua a cinco o seis ratones Il10venus por grupo durante 10 semanas. Se usaron los siguientes antibióticos en combinación:
ampicilina (A; 500 mg/l, Sigma)
vancomicina (V; 500 mg/l, NACALAI TESQUE, INC.)
metronidazol (M; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
neomicina (N; 1 g/l, NACALAI TESQUE, INC.)
Después se tiñeron CD4 y Foxp3 de linfocitos de la lámina propia del colon, la lámina propia del intestino delgado (SI), los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y las placas de Peyer (PP) con anticuerpos, y se analizaron mediante FACS. Los resultados se obtuvieron a partir de dos o más experimentos independientes que proporcionaron resultados similares. La figura 28 muestra los resultados obtenidos (la razón de células Venus+ en células CD4+ en cada muestra). Obsérvese que cada círculo blanco en la figura 28 representa una muestra individual, cada barra horizontal representa un valor promedio, * indica que “P < 0,02” y “AVMN” representa las clases de los antibióticos administrados usando la primera letra de los antibióticos.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 23 y 24, se mostró que la lámina propia del intestino delgado era rica en células Venus+ Foxp3-, concretamente, células de tipo Tr1, y que las células Treg DP Venus+ Foxp3+ estaban presentes a una alta frecuencia en el colon de ratones SPF (véanse las figuras 23 y 24). Por el contrario, aunque también se observaron números suficientes de células Foxp3+ en otros tejidos, no se observó la expresión de Venus en casi ninguna de las células (véase la figura 24).
Además, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 23 y 25 a 28, se mostró que todas las fracciones de células T reguladoras de Venus+ Foxp3-, Venus+ Foxp3+ y Venus- Foxp3+ en el colon disminuyeron significativamente en condiciones GF (figuras 23 y 26 a 27). Además, también se observó una disminución similar en células Venus+ en ratones Il10venus SPF tratados con los antibióticos (véase la figura 28).
Además, tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 25 a 27, la colonización deClostridiumspp. indujo fuertemente todas las fracciones de células T reguladoras de Venus+ Foxp3-, Venus+ Foxp3+ y Venus- Foxp3+ en el colon, y los grados de la inducción de los mismos eran iguales a los de ratones SPF (véanse las figuras 25 y 27). Además, se encontró que la colonización de las tres cepas deLactobacilluso la colonización de SFB influía extremadamente poco en el número de células Venus+ y/o Foxp3+ en el colon (véanse las figuras 25 y 27). Además, la colonización de 16 cepas deBacteroidesspp. también indujo células Venus+, pero la influencia de la colonización era específica de células similares a Tr1 Venus+ Foxp3- (véanse las figuras 25 y 27). Por otro lado, se encontró que ninguna de las especies bacterianas sometidas aprueba influyó significativamente en el número de células productoras de IL-10 en la lámina propia del intestino delgado (véase la figura 26).
Por tanto, se mostró que el géneroClostridiumcolonizado en el colon o una sustancia fisiológicamente activa derivada de las bacterias proporcionó una señal para inducir la acumulación de células T reguladoras IL-10+ en la lámina propia del colon o la expresión de IL-10 en células T. Mientras tanto, se mostró que el número de células Venus+ en el intestino delgado no se veía influido significativamente por la situación en la que no estaban presentes bacterias comensales o se redujeron las bacterias comensales (véanse las figuras 23 y 26 a 28) y que se acumularon células reguladoras IL-10+ (células de tipo Tr1) en la lámina propia del intestino delgado independientemente de las bacterias comensales.
(Ejemplo 14)
Se investigó si las células Venus+ inducidas por el géneroClostridiumtenían o no una función inmunosupresora similar a la de las células Venus+ en el colon de ratones SPF. Específicamente, se sembraron células CD4+<c>D25- (células T efectoras, células Teff) aisladas del bazo en una placa de 96 pocillos de fondo plano a 2 x 104/pocillo, y se cultivaron durante tres días junto con 2 x 104 células CD11c+ del bazo (células representadoras de antígeno) sometidas a tratamiento de irradiación con una radiación de 30 Gy, 0,5 |ig/ml de un anticuerpo anti-CD3 y muchas células Treg. Además, durante las últimas seis horas, se cultivaron las células CD4+ CD25-, a las que se le añadió [3H]-timidina (1 |iCi/pocillo). Obsérvese que, las células Treg usadas en el ejemplo 14 fueron células T CD4+ GFP+ aisladas del bazo de ratones indicadores de Foxp3eGFP, o células T CD4+ Venus+ de la lámina propia del colon de ratones Il10venus GF en los que se colonizaronClostridiumspp. o ratones Il10venus SPF. Después se determinó la proliferación de las células basándose en la cantidad de [3H]-timidina captada, y representada mediante un valor de cuentas por minuto (cpm).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 29, las células Venus+ CD4+ de los ratones en los que se colonizó el géneroClostridiumsuprimieron la proliferaciónin vitrode células T activadas CD25- CD4+. La actividad de supresión era ligeramente inferior a la de células GFP+ aisladas de ratones indicadores de Foxp3eGFP, pero igual a la de células Venus+ aisladas de ratones Il10venus SPF. Por consiguiente, se ha mostrado que el géneroClostridiuminduce células T que expresan IL-10 que tienen actividades inmunosupresoras suficientes y, por tanto, desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis inmunitaria en el colon.
(Ejemplo 15)
A continuación, se investigó la influencia, en la respuesta inmunitaria local, de la colonización de un gran número deClostridiumy la proliferación resultante de células Treg.
<Modelo de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS)>
En primer lugar, se preparó el modelo de colitis inducida por DSS tal como se describió anteriormente, y se investigó la influencia, en los ratones del modelo, de la inoculación deClostridiumy la proliferación de células Treg. Específicamente, se trataron ratones de control y ratones inoculados conClostridiumcon DSS al 2%, luego se observaron y se midieron durante seis días para determinar la pérdida de peso corporal, la dureza de las deposiciones y el sangrado, y luego se evaluaron numéricamente. Además, en el día 6, se recogió, diseccionó y analizó de manera histológica el colon mediante tinción con HE. Las figuras 41 a 43 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 41 a 43, “SPF+Clost.” o “SPF+Clost. n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones C57BL/6 inoculados con una suspensión fecal de ratones colonizados conClostridiumy hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas, y “SPF” o “SPF n.° 1 a 3” indican los resultados de ratones C57BL/6 (ratones de control) hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas sin inocularse con la suspensión fecal. Además, en la figura 41, el eje vertical “Puntuación de la enfermedad” representa el índice de actividad de la enfermedad (DAI) descrito anteriormente, y el eje horizontal “después de DSS al 2% (d)” representa los días transcurridos después de la administración inicial de DSS al 2% a los ratones. Además, en la figura 41, * indica que “P < 0,02” y ** indica que “P < 0,001”. Mientras tanto, se sabe que las células Treg inducidas por células dendríticas reguladoras desempeñan un papel preventivo en un modelo de colitis inducida por DSS (véase S. Manicassamyet al.,Science 329, 849 (13 de agosto de 2010)).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 41 a 43, se suprimieron significativamente los síntomas de la colitis tales como pérdida de peso corporal y sangrado rectal en los ratones que tenían un gran número deClostridium(también denominados a continuación en el presente documento “ratones conClostridiumen abundancia”) en comparación con los ratones de control (véase la figura 41). Se observaron de manera notable todas las características típicas de inflamación del colon, tales como acortamiento del colon, edema y hemorragia, en los ratones de control en comparación con los ratones conClostridiumen abundancia (véase la figura 42). Además, las características histológicas, tales como erosión de la mucosa, edema, infiltración celular y perdida de la cripta, fueron menos graves en los ratones conClostridiumen abundancia tratados con DSS que en los ratones de control (véase la figura 43).
<Modelo de colitis inducida por oxazolona>
A continuación, se preparó el modelo de colitis inducida por oxazolona tal como se describió anteriormente, y se investigó la influencia, en los ratones del modelo, de la inoculación deClostridiumy la proliferación de células Treg. Específicamente, se sensibilizaron ratones de control y ratones inoculados conClostridiumcon oxazolona, y posteriormente se trató el interior del recto de los mismos con una disolución de oxazolona al 1%/etanol al 50%. Después se observó y midió la pérdida de peso corporal. Además, se diseccionó y analizó de manera histológica el colon mediante tinción con HE. Las figuras 44 y 45 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 44 y 45, “SPF+Clost.” indica los resultados de ratones C57BL/6 (ratones conClostridiumen abundancia) inoculados con una suspensión fecal de ratones colonizados conClostridiumy hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas, y “SPF” indica los resultados de ratones C57BL/6 (ratones de control) hechos crecer en un entorno convencional durante seis semanas sin inocularse con la suspensión fecal. Además, en la figura 44, el eje vertical “Peso (% del inicial)” representa el peso corporal después de la administración de oxazolona al 1% cuando el peso corporal antes de la administración se tomó como el 100%, y el eje horizontal “después de oxazolona al 1% (d)” representa los días transcurridos después de la administración de oxazolona al 1% a los ratones. Mientras tanto, se sabe que las células T de tipo Th2 están implicadas en colitis inducida por oxazolona (véase M. Boirivant, I. J. Fuss, A. Chu, W. Strober, J Exp Med 188, 1929 (16 de noviembre de 1998)).
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 44 y 45, la colitis continuó junto con la persistente pérdida de peso corporal en los ratones de control. Mientras tanto, se redujo la pérdida de peso corporal de los ratones conClostridiumen abundancia (véase la figura 44). Además, también se reveló que se redujeron porciones que tenían enfermedades histológicas, tales como erosión de la mucosa, edema infiltración celular y hemorragia, en el colon de los ratones conClostridiumen abundancia (véase la figura 45).
(Ejemplo 16)
A continuación, se investigó la influencia, en la respuesta inmunitaria sistémica (producción sistémica de IgE), de la colonización de un gran número deClostridiumy la proliferación resultante de células Treg. Específicamente, tal como se describió anteriormente, se inmunizaron ratones de control y ratones inoculados conClostridiummediante la administración de ovoalbúmina absorbida con alumbre (OVA) dos veces en un intervalo de 2 semanas. Después se recogieron sueros de estos ratones y se investigó el nivel de IgE específica de OVA de los mismos mediante ELISA. Además, se recogieron células del bazo de los ratones de cada grupo, y se investigó la producción de IL-4 e IL-10 mediante reestimulación con OVAin vitro.Las figuras 46 a 48 muestran los resultados obtenidos. Obsérvese que, en las figuras 46 a 48, “SPF+Clost.” indica los resultados de ratones BALB/c SPF (ratones conClostridiumen abundancia) inoculados con una suspensión fecal de ratones colonizados conClostridiumy hechos crecer en un entorno convencional, “SPF” indica los resultados de ratones BALB/c SPF (ratones de control) hechos crecer en un entorno convencional sin inocularse con la suspensión fecal, y ** indica que “P < 0,001”. Mientras tanto, en la figura 46, el eje vertical “ IgE específica de OVA(ng/ml)” representa la concentración de IgE específica de OVA en los sueros. Además, en la figura 46, el eje horizontal representa los días transcurridos después de la administración inicial de la ovoalbúmina absorbida con alumbre a los ratones conClostridiumen abundancia o los ratones de control (4 semanas de edad), y “OVA+Alum” indica la programación temporal de la administración de la ovoalbúmina absorbida con alumbre. Además, en las figuras 47 y 48, “OVA” en el eje horizontal indica los resultados en el caso en el que se realizó reestimulación con OVAin vitro,y “-” indica los resultados en el caso en el que no se realizó reestimulación con OVAin vitro.Además, en las figuras 47 y 48, los ejes verticales “ IL-4 (pg/ml)” e “ IL-10 (pg/ml)” muestran la concentración de IL-4 y la concentración de IL-10 en sobrenadantes de cultivo de células del bazo, respectivamente.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 46 a 48, el nivel de IgE era significativamente menor en los ratones conClostridiumen abundancia que en los ratones de control (véase la figura 46). Además, se redujo la producción de IL-4 por la reestimulación con OVA (véase la figura 47) y, por tanto, aumentó la producción de IL-10 (véase la figura 48) en las células del bazo de los ratones conClostridiumen abundancia sensibilizados con OVA y alumbre, en comparación con las de los ratones de control.
Por consiguiente, teniendo en cuenta los resultados mostrados en el ejemplo 15 en combinación, se ha revelado que la inducción de células Treg medianteClostridiumen el colon desempeña un papel importante en respuestas inmunitarias locales y sistémicas.
(Ejemplo 17)
A continuación, se colonizaron Balb/c GF con tres cepas deClostridiumpertenecientes al grupo IV (cepas 22, 23 y 32 enumeradas en la figura 49). Tres semanas después, se analizaron las células Treg Foxp3+ del colon mediante FACS. La figura 50 muestra los resultados obtenidos. Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 50, los ratones gnotobióticos colonizados con tres cepas deClostridiummostraron un patrón intermedio de inducción de Treg entre ratones GF y ratones inoculados con las 46 cepas.
(Ejemplo 18)
A continuación, se investigó si una fracción de formación de esporas (por ejemplo, una resistente al tratamiento con cloroformo) de una muestra fecal obtenida de humanos tenía o no un efecto de inducción de la proliferación o acumulación de células T reguladoras similar a la fracción de formación de esporas de la muestra fecal obtenida de ratones.
Específicamente, se suspendieron las deposiciones humanas de un voluntario sano (japonés, hombre, 29 años de edad) con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se mezclaron con cloroformo (concentración final del 3%) y luego se incubaron en un baño de agua con agitación durante 60 min. Después de la evaporación del cloroformo mediante burbujeo con gas de N2, se inocularon por vía oral alícuotas que contenían fracción (por ejemplo, de formación de esporas) resistente al tratamiento con cloroformo de bacterias intestinales humanas en ratones asépticos (GF) (IQI, 8 semanas de edad). Se mantuvieron los ratones tratados en un aislador de vinilo durante 3 semanas. Se recogió el colon y se abrió longitudinalmente, se lavó para retirar el contenido fecal y se agitó en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) que contenía EDTA 5 mM durante 20 min a 37°C. Después de retirar las células epiteliales y el tejido adiposo, se cortó el colon en trozos pequeños y se incubaron con RPMi 1640 que contenía suero bovino fetal al 4%, colagenasa D 1 mg/ml, dispasa 0,5 mg/ml y DNasa I 40 |ig/ml (todos fabricados por Roche Diagnostics) durante 1 hora a 37°C en un baño de agua con agitación. Se lavó el tejido digerido con HBSS que contenía EDTA 5 mM, se resuspendió en 5 ml de Percoll al 40% (fabricado por GE Healthcare) y se superpuso en 2,5 ml de Percoll al 80% en un tubo Falcon de 15 ml. Se realizó separación por gradiente Percoll mediante centrifugación a 780 g durante 20 min a 25°C. Se recogieron las células de la superficie de contacto y se suspendieron en tampón de tinción que contenía PBS, FBS al 2%, EDTA 2 mM y NaN3 al 0,09% y teñido para CD4 de superficie con Ac anti-CD4 marcado con ficoeritrina (RM4-5, fabricado por BD Biosciences). Se realizó tinción intracelular de Foxp3 usando el Ac anti-Foxp3 marcado con Alexa647 (FJK-16s, fabricado por eBioscience) y conjunto de tampón de tinción de Foxp3 (fabricado por eBioscience). Se analizó el porcentaje de células positivas para Foxp3 dentro de la población de linfocitos positivos para CD4 mediante citometría de flujo. Las figuras 51 y 52 muestran los resultados obtenidos.
En las figuras, se muestran histogramas representativos (figura 51) y datos combinados (figura 52) para la expresión de Foxp3 mediante linfocitos positivos para CD4 de ratones asépticos (GF) o ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.). Además, los números en la figura 51 indican los porcentajes de células en la ventana de adquisición. Cada círculo en la figura 52 representa un animal independiente, las barras de error indican la DE y ** indica que “P < 0,001”.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en las figuras 51 y 52, también se encontró que cuando se colonizó la fracción de formación de esporas (por ejemplo, la resistente al tratamiento con cloroformo) de bacterias intestinales humanas en ratones GF, se indujo la acumulación de células reguladoras (Treg) Foxp3+ en la lámina propia del colon de los ratones.
A continuación, se investigó qué especies de bacterias crecían mediante alimentación por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo.
Específicamente, usando un mini-kit QIAamp DNA Stool (fabricado por QIAGEN), se aisló ADN genómico bacteriano de las deposiciones humanas de un voluntario sano tal como se describió anteriormente (deposiciones humanas) o microgránulos fecales de ratones GF alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo (GF+cloro.). Se llevó a cabo análisis mediante PCR cuantitativa usando un dispositivo Light-Cycler 480 (fabricado por Roche). Se calculó la cantidad relativa mediante el método ACt y se normalizó con respecto a la cantidad de bacterias totales, la dilución y el peso de la muestra. Se usaron los siguientes conjuntos de cebadores:
Bacterias totales
5'-GGTGAATACGTTCCCGG-3' (SEQ ID NO: 62) y 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID NO: 63) Grupo XIVa deClostridium(subgrupoClostridium coccoides)
5'-AAATGACGGTACCTGACTAA-3' (SEQ ID NO: 64) y 5'-CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA-3' (SEQ ID NO: 65) Grupo IV deClostridium (Clostridium leptum)
5'-GCACAAGCAGTGGAGT-3' (SEQ ID NO: 66) y 5-CTTCCTCCGTTTTGTCAA-3' (SEQ ID NO: 24)Bacteroides
5'-GAGAGGAAGGTCCCCCAC-3' (SEQ ID NO: 67) y 5'-CGCTACTTGGCTGGTTCAG-3' (SEQ ID NO: 68).
La figura 53 muestra los resultados obtenidos.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la figura 53, los ratones alimentados por sonda con deposiciones humanas tratadas con cloroformo presentaron altas cantidades de bacterias formadoras de esporas, tales como los grupos XIVa y IV deClostridium,y una gran disminución de bacterias no formadoras de esporas, tales comoBacteroides,en comparación con las deposiciones humanas antes del tratamiento con cloroformo.
Aplicabilidad industrial
Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invención permite proporcionar una excelente composición para inducir la proliferación o acumulación de células T reguladoras (células Treg) utilizando bacterias pertenecientes al géneroClostridium.Dado que la composición de la presente invención tiene efectos inmunosupresores, la composición puede usarse, por ejemplo, para prevenir o tratar enfermedades autoinmunitarias o enfermedades alérgicas. Además, los individuos sanos pueden ingerir de manera fácil y rutinaria la composición como un alimento o una bebida, tal como un alimento saludable, para mejorar sus funciones inmunitarias.
Lista de secuencias
SEQ ID NO: 1 a 20, 62 a 69
<223> Secuencia de cebador sintetizado artificialmente
SEQ ID NO: 21 a 61
<223> Secuencia del gen que codifica para ARNr 16S de cada cepa deClostridium

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Composición que comprende, como principio activo, bacterias pertenecientes al géneroClostridiumpara su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad alérgica o enfermedad infecciosa en un sujeto humano mediante la inducción de proliferación o acumulación de células T reguladoras positivas para el factor de transcripción Foxp3, en la que la composición se usa por vía oral.
2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la cantidad de la composición por administración es de 1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal.
3. Composición para su uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que la composición se formula con un agente de recubrimiento.
4. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición es para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad alérgica o una enfermedad infecciosa.
5. Composición para su uso según la reivindicación 4, en la que la composición se formula como preparación farmacéutica usando una composición que permite la administración al colon.
6. Composición para su uso según la reivindicación 5, en la que la composición se formula como unidad de dosificación de liberación retardada que tiene un material de recubrimiento adecuado para retrasar la liberación en 3-5 horas.
7. Composición para su uso según la reivindicación 5, en la que la composición se formula como preparación farmacéutica que emplea una composición sensible al pH.
8. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que las bacterias están en forma de esporas.
9. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en la que la composición comprende, como principio activo, múltiples cepas de bacterias pertenecientes al grupo XIVa o al grupo IV en combinación, opcionalmente en la que la composición comprende además bacterias pertenecientes a un grupo deClostridiumdistinto del grupo XIVa deClostridiumy/o del grupo IV deClostridium.
10. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la enfermedad infecciosa es una infección porClostridium difficile,una infección porSalmonella,una infección porShigella,tuberculosis, malaria, filariasis, esquistosomiasis, toxoplasmosis, leishmaniosis, hepatitis C, hepatitis B o herpes.
11. Composición para su uso según la reivindicación 10, en la que la enfermedad infecciosa es una infección porClostridium difficile.
12. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la enfermedad alérgica es polinosis, asma o alergia alimentaria.
13. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la enfermedad autoinmunitaria es enfermedad inflamatoria del intestino crónica.
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