BRPI0616054B1 - Processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor - Google Patents
Processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor Download PDFInfo
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Abstract
clivagem de precursores de insulunas por uma variante de tripsina. a presente invenção refere-se à produção de uma variante de tripsina recombinante com especificidade de substrato aumentada para arginina versus usina, em organismos hospedeiros não-animais. além disso, a presente invenção refere-se a uma variante de tripsina recombinante e sua produção. também proporcionados estão o uso de variantes de tripsina pancreática porcina recombinante para clivagem de precursores de insulinas, e kits contendo a variante de tripsina.
Description
[001] A presente invenção refere-se à produção de uma variante de tripsina recombinante com especificidade de substrato aumentada para arginina versus lisina em organismos hospedeiros não-animais. Além disso, a presente invenção refere-se a uma variante de tripsina recombinante e sua produção. São também proporcionados uso de variantes de tripsina pancreática porcina recombinante para clivagem de precursores de insulinas e kit contendo a variante de tripsina.
[002] Tripsina é uma serina protease que catalisa a clivagem hidrolítica de peptídeos no grupo carboxila dos aminoácidos básicos arginina e lisina (Keil B., (1971), The Enzyme Vol. II, 3a Edição, Editor Boyer, Acad. Press NY, pp. 249-275). Tripsina pancreática porcina recombinante tem um peso molecular de cerca de 23.000 dáltons e uma atividade enzimática ótima no pH 8,0.
[003] Tripsina é usada no processo industrial de produzir insulina e análogos de insulina. A produção dessas biomoléculas está descrita na literatura e várias abordagens foram escolhidas. Do ponto de vista econômico, a síntese química de insulina humana e de análogos de insulina não é exequível. Portanto, principalmente dois processos para a produção de insulina e de análogos de insulina existem correntemente, ou seja, abordagem semi-sintética usando insulina porcina como material de partida, e o uso de microorganismos geneticamente modificados para a expressão de insulina recombinante.
[004] Insulina é um polipeptídeo de 51 aminoácidos, que são divididos em duas cadeias de aminoácidos: a cadeia A tendo 21 aminoácidos e a cadeia B tendo 30 aminoácidos. As cadeias são conectadas
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2/38 uma à outra por meio de 2 pontes de dissulfeto. As preparações de insulina têm sido empregadas para terapia de diabetes por muitos anos. Não somente são usadas aqui proteínas de ocorrência natural, mas, recentemente, também derivados e análogos de insulina.
[005] Análogos de insulina são análogos de insulina de ocorrência natural, ou seja, insulina humana ou insulina animal, que diferem pela substituição de pelo menos um resíduo da aminoácido de ocorrência natural com outros resíduos de aminoácidos e/ou adição/remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido da insulina correspondente, de outro modo, de insulina de ocorrência natural. Os resíduos de aminoácidos adicionados e/ou substituídos podem ser também aqueles que não ocorrem naturalmente.
[006] Derivados de insulina são derivados de insulina de ocorrência natural ou um análogo de insulina, que são obtidos por modificação química. A modificação química pode consistir, por exemplo, na adição de um ou mais grupos químicos específicos a um ou mais aminoácidos.
[007] exemplos de derivados de insulina são insulina humana B29N-N-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N-palmitoil-des(B30), insulina humana B29-N-miristoíla, insulina humana B29-N-palmitoíla, insulina humana B28-N-miristoil LysB28ProB29, insulina humana B28-Npalmitoil-LysB28ProB29, insulina humana B30-N-miristoil-ThrB29LysB30, insulina humana B30-N-palmitoil-ThrB29LysB30, insulina humana B29-N(N-palmitoil-Y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil-Yglutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(w-carboxieptadecanoil)des(B30) e insulina humana B29-N-(w-carboxieptadecanoíla).
[008] Análogos de insulina são descritos em EP 0 214 826, EP 0 375 437 e EP 0 678 522. EP 0 214 826 refere-se, entre outras, às substituições B27 e B28. EP 0 678 522 descreve análogos de insulina que têm vários aminoácidos, preferivelmente, prolina, na posição B29,
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3/38 mas não ácido glutâmico.
[009] Outros análogos de insulina são insulina humana LysB28Prob29, insulina humana B28 Asp, insulina humana, na qual a prolina na posição B28 foi substituída por Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e, onde, na posição B29 Lys pode ser substituída por Pro; insulina humana AlaB26; insulina humana des(B28-B30); insulina humana des(B27) ou insulina humana des(B30).
[0010] EP 0 375 437 inclui análogos de insulina com lisina ou arginina em B28, que podem ser opcional e adicionalmente modificados em B3 e/ou A21.
[0011] Em EP 0 419 504, são descritos análogos de insulina que são protegidos de modificações químicas, onde em B3 e pelo menos um outro aminoácido nas posições A5, A15, A18 ou A21 são modificados. Em WO 92/00321, análogos de insulina são descritos, nos quais pelo menos um aminoácido das posições B1-B6 é substituído por lisina ou arginina.
[0012] Importantes análogos de insulina discutidos aqui são ainda insulina glargina (insulina humana Gly A(21), Arg B (31), Arg B (32)) e insulina glulisina (insulina humana Lys B(3), Glu B(29)).
[0013] Processos de DNA recombinante permitem que precursores de insulina e análogos de insulina, em particular pró-insulina humana ou pró-insulina que tem uma sequência de aminoácidos e/ou um comprimento de cadeia de aminoácido diferindo da insulina humana a ser preparada em microorganismos. As pró-insulinas preparadas de células de Escherichia coli não têm quaisquer pontes de cistina corretamente ligadas. Um processo para obter insulina humana usando E. coli (EP 0 055 945) está baseado nas seguintes etapas processuais: [0014] Fermentação do microorganismo, separação da célula, ruptura da célula, isolamento da insulina ou do precursor de análogo de insulina, re-dobrar para a estrutura tridimensional (nativa) desejada por
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4/38 formação das respectivas ligações de dissulfeto para produzir as prépró-insulina(s) (PPI), clivagem tríptica da pré-pró-insulina (possivelmente em presença de Carboxipeptidase B), purificação básica, primeira etapa cromatográfica, clivagem enzimática eventual para produzir a respectiva insulina humana ou o análogo de insulina, segunda etapa cromatográfica e purificação final por HPLC, cristalização e secagem.
[0015] Clivagem tríptica da pré-pró-insulinas é uma reação enzimática e complexa: a pré-sequência e o peptídeo C são clivados nesta etapa de modo a render os respectivos produtos. Por exemplo, no caso da produção de insulina humana, os valiosos desejados são Arg(B31), Arg(B32)-insulina e Arg(B31)-insulina (DE 19821866).
[0016] Contudo, clivagem tríptica leva à formação de vários subprodutos, como resultado da ocorrência de reações colaterais não desejadas. A tripsina é uma endoprotease (tipo serina) que cliva ligações peptídicas em resíduos de arginina (Arg) ou lisina (Lys) C-terminal. Clivagem tríptica da pré-pró-insulina pode ocorrer em sítios de clivagem diferentes, simultaneamente. Devido aos vários lados da clivagem dentro de uma molécula de pré-pró-insulina específica, vários produtos secundários indesejados podem ser formados durante a reação de clivagem tríptica. Como pode ser visto na Figura 1, vários dos subprodutos gerados durante as reações de clivagem são uma consequência da clivagem da ligação peptídica no lado C-terminal de resíduos Lys em vez de Arg.
[0017] Para todas as pré-pró-insulinas, o sítio de clivagem entre a pré-sequência e a cadeia de insulina B é monobásica. Nessa junção, somente uma reação de clivagem pode ocorrer.
[0018] Nas duas outras junções - cadeia B/peptídeo C e peptídeo C/cadeia A - existem diferentes sítios de clivagem. No caso de sítios de clivagem de insulina humana e de insulina glargina entre cadeia
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B/peptídeo C e petídeo C/cadeia A são ambos dibásicos (Arg-Arg e Lys-Arg, respectivamente). Além disso, clivagem depois de B29-Lys leva à formação de B30-des-Thr (des-Thr).
[0019] Para insulina humana, somente a clivagem tríptica depois dos resíduos B31-Arg e B32-Arg rende produtos valiosos para junção cadeia/B peptídeo C, isto é, B31-Arg insulina (mono-Arg) e B31-Arg, B32-Arg insulina (di-Arg). Esses produtos podem ser sumarizados como Arg-insulinas. A clivagem depois de B32-Arg é crucial no processo de produzir insulina glargina, pois somente Di-Arg-Insulina pode ser usada. Para insulina humana ou insulina glargina, clivagem depois de B29-Lys resulta na formação de des-Thr. Para insulina glulisina, esse sítio de clivagem é monobásico e possíveis produtos são espécies contendo Arg.
[0020] Com respeito ao peptídeo C/cadeia A, a clivagem tríptica depois do Arg e não do resíduo Lys é crucial para produzir produtos valiosos. Clivagem falsa depois de Lys resulta na formação de subprodutos A0.
[0021] De modo a superar as desvantagens do estado da técnica, é desejado usar no processo de clivagem de pré-pró-insulina, um enzima tripsina com especificidade para Arg intensificada para os diferentes sítios de clivagem, como exemplarmente mostrado na Figura 1. Ao se aumentar a especificidade para Arg de uma enzima tripsina - e, consequentemente diminuir a especificidade para Lys - a formação de subprodutos, especialmente os componentes des-Thr e A0 podem ser esperados.
[0022] Sichler et al., FEBS Lett. (2002) 530:220-224, examinaram na tripsina humana o impacto de uma troca de aminoácido na posição 190 (numeração do quimiotripsinogênio, de acordo com Huber, R. & Bode, W., Acc. Chem. Res. (1978) 11:114-122). Foi verificado que nessa posição, uma troca de Serina tipo selvagem para Alanina mu
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6/38 tante provocou um aumento da seletividade do sítio de clivagem para Arginina e um decréscimo para Lisina quando substratos artificiais são usados. Ao mesmo tempo, verificou-se que a atividade enzimática do mutante diminuiu de um fator de cerca de 2 quando em comparação com o tipo selvagem. O teste de tripsina tipo selvagem humana recombinante e mutante de tripsina humana (troca de aminoácido na posição 190 de Serina para Alanina) para processamento de pre-próinsulina resultou na formação de grandes quantidades de subprodutos para ambas as enzimas, revelando que um aumento da seletividade para Arg não podia ser atribuído à clivagem de pré-pró-insulina (vide abaixo, exemplo 1).
[0023] Em vista do estado da técnica, o problema a ser resolvido é proporcionar uma variante de tripsina que exibe uma seletividade de sítio de clivagem aumentada para Arginina sem uma perda maior da atividade proteolítica. Um outro problema particular a ser resolvido é proporcionar uma variante de tripsina que tem uma seletividade para resíduos de Arginina dentro dos sítios de clivagem para processamento de pré-pró-insulina como exemplarmente mostrado na Figura 1. [0024] Por conseguinte, o problema é resolvido proporcionando-se uma variante de tripsina porcina com uma troca de aminoácido na posição 172 de Serina para Alanina. Em uma modalidade preferida, a variante Ser172Ala de tripsina porcina é proporciona por meio recombinante. Surpreendentemente, foi verificado que a atividade enzimática da variante Ser172Ala de tripsina porcina é quase igual para as reações de clivagem de pré-pró-insulina quando em comparação com a enzima tipo selvagem.
[0025] A posição 190 do aminoácido Serina examinada na tripsina humana por Sichler et al. (FEBS Lett. (2002) 530:220-224) corresponde à Serina na posição 172 da tripsina porcina conforme dado na SEQ ID NO:1. Ambas as posições são parte do assim chamado sítio S1 das
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7/38 serina proteases similares à tripsina.
[0026] Uma modalidade da invenção é, portanto, o uso da tripsina porcina Ser172Ala em um processo para preparar insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina.
[0027] Uma outra modalidade da invenção é um processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, em que:
(a) uma pré-pró-insulina, um análogo de pré-pró-insulina ou um derivado de pré-pró-insulina é clivada com tripsina porcina Ser 172Ala, (b) os produtos de clivagem resultantes são separados e (aa) se um dos produtos de clivagem resultantes é um análogo de insulina ou derivado de insulina, este análogo de insulina ou derivado de insulina é obtido, ou (bb) aqueles produtos de clivagem que são precursores de insulina, um análogo de insulina ou derivado de insulina são subsequentemente processados e a insulina, análogo de insulina ou derivado de insulina resultante de tal processamento subsequente é separado e obtido;
em que a insulina é preferivelmente insulina humana; e o análogo de insulina é selecionado de um grupo que compreende insulina humana LysB28ProB29, insulina humana B28 Asp, insulina humana, onde a prolina na posição 28 foi substituída por Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e onde, na posição B29 Lys pode ser substituída por Pro; insulina humana AlaB26; insulina humana des(B28-B30); insulina humana des(B27) e insulina humana des(B30), e o derivado de insulina é selecionado do grupo que compreende insulina humana B29-N-miristoildes(B30), insulina humana B29-N-palmitoil-des(B30), insulina humana B29-N-miristoíla, insulina humana B29N-palmitoíla, insulina humana B28-N-miristoil-LysB28ProB29, insulina humana B28-N-palmitoil
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LysB28ProB29, insulina humana B30-N-miristoil-ThrB29LysB30, insulina humana B30-N-palmitoil-ThrB29LysB30, insulina humana B29-N-(Npalmitoil-Y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil-Yglutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(w-carboxieptadecanoil)des(B30) e insulina humana B29-N-(w-carboxieptadecanoíla).
[0028] Em uma modalidade preferida da invenção, o análogo de insulina é insulina glulisina ou insulina glargina.
[0029] Em uma outra modalidade da invenção, o subsequente processamento mencionado desses produtos de clivagem que são precursores de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina compreende clivagem dos ditos produtos com Carboxipeptidase B, exceto para a insulina glargina.
[0030] Em uma outra modalidade da invenção, a clivagem com a tripsina porcina Ser172Ala é realizada em um valor de pH na faixa de 7,5 a 9,5, preferivelmente 8,3; uma temperatura entre 1oC e 30oC, mais preferivelmente entre 8 e 15oC, mais preferivelmente a 8oC; e a reação enzimática é terminada por acidificação da amostra, preferivelmente por adição de solução 1N ou 2N de HCl.
[0031] Uma outra modalidade da invenção é a tripsina porcina Ser172Ala caracterizada pela sequência SEQ ID NO:3; um DNA que codifica a tripsina porcina Ser172Ala, preferivelmente caracterizada pela SEQ ID NO:4.
[0032] Uma outra modalidade da invenção é um DNA que codifica o tripsinogênio porcino Ser196Ala caracterizado pela SEQ ID NO:6. O peptídeo sinalizador desse pré-tripsinogênio deriva do fator alfa da Saccharomyces cerevisiae.
[0033] Uma outra modalidade da invenção é um vetor que compreende um DNA conforme descrito acima.
[0034] Uma outra modalidade da invenção é um método para produzir a tripsina porcina Ser172Ala, que compreende as etapas de
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9/38 (a) proporcionar um vetor conforme definido na reivindicação 16, (b) transformar uma cepa hospedeira microbiana com o vetor;
(c) cultivar a cepa hospedeira microbiana transformada em um meio de crescimento que contém nutrientes, pelo que a cepa hospedeira microbiana expressa a tripsina porcina Ser172Ala ou o tripsinogênio porcino Ser196Ala, (d) no caso do produto de expressão de (c) ser tripsinogênio porcino Ser196Ala, conversão em tripsina porcina Ser172Ala madura, e
e) purificar a tripsina porcina Ser172Ala da cepa hospedeira microbiana e/ou do meio de crescimento, em particular em que a cepa hospedeira microbiana é um cepa de levedura metilotrófica selecionada de um grupo que compreende as espécies Hansenula, Pichia, Candida e Torulopsis; preferivelmente em que a cepa hospedeira microbiana é selecionada de um grupo que compreende Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii e Toruslopsis glabrata.
[0035] No presente relatório descritivo, os termos tripsina porcina variante e variante de tripsina porcina designam uma proteína que é uma variante, isto é uma forma alélica da isoforma I da proteína tripsina pancreática porcina madura, gerada por meio da substituição do aminoácido na posição 172 de acordo com a SEQ ID NO:1.
[0036] Com a finalidade de designação abreviada da variante de tripsina porcina descrita aqui, é mencionado que o número refere-se ao resíduo/posição do aminoácido ao longo da sequência de aminoácidos da tripsina pancreática porcina madura como dada na SEQ ID NO:1. A identificação dos aminoácidos usa a abreviações de as três primeiras letras, bem como o alfabeto de letra simples dos aminoáci
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10/38 dos, isto é Asp D Ácido aspártico, ILE I Isoleucina, Thr T Treonina, Leu L Lecina, Ser S Serina, Tyr Y tirosina, Glu E Ácido glutâmico, Phe F Fenilalanina, Pro P Prolina, His H Histidina, Gly G Glicina, Lys K Lisina, Ala A Alanina, Arg R Arginina, Cys C Cisteína, Trp W Triptofano, Val V Valina, Gln Q Glutamina, Met M Metionina, Asn N Asparagina. Um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de aminoácidos é dado pela sua abreviação de três letras e um número. Por conseguinte, Ser172 denota o resíduo de Serina na posição de aminoácido 172 na SEQ ID NO: 1. Uma substituição por um aminoácido diferente é dada como a abreviação de três letras adicionada depois do número que indica a posição. Por exemplo, Ser172Ala denota a substituição de Ser na posição 172 na SEQ ID NO:3 por Ala.
[0037] O termo seletividade de sítio de clivagem aumentada de uma variante de tripsina significa um deslocamento da especificidade para a clivagem hidrolítica, pelo que para a variante o deslocamento leva a uma clivagem preferida no grupo carboxila de arginina em vez da lisina.
[0038] Quando a atividade tríptica é quantificada, o presente ralatório descritivo refere-se às unidades (U). A atividade proteolítica de tripsina e variantes desta é quantificada usando-se um ensaio fotométrico empregando os substratos Chromozym TRY, Chromozym TH e Chromozym PL (Roche Diagnostics GmBH). A atividade proteolítica específica ou atividade específica de uma dada preparação é definida como o número de unidades por mg de proteína na preparação, determinada pelo método descrito no exemplo 9.
[0039] Uma levedura metilotrófica é definida como uma levedura que é capaz de utilizar metanol como sua fonte de carbonos. O termo também compreende suas cepas de laboratório. No caso de uma cepa de levedura metilotrófica ser auxotrófica e por causa desta necessidade de ser suplementada com uma substância contendo carbono auxili
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11/38 ar, tal como, por exemplo, histidina no caso de uma cepa de levedura metilotrófica incapaz de sintetizar este aminoácido em quantidades suficientes, esta substância auxiliar é considerada como um nutriente, mas não como uma fonte de carbono.
[0040] Um vetor é definido como um DNA que pode compreender isto é transportar, e manter o fragmento de DNA da invenção, incluindo, por exemplo, fagos e plasmídios. Esses termos são entendidos por aqueles versados na técnica de engenharia genética. O termo cassete de expressão significa uma sequência de nucleotídeos que codifica uma pré-proteína, operavelmente ligada a um promotor e um terminador. Quanto aos vetores contendo um cassete de expressão, os termos vetor e vetor de expressão são usados como sinônimos.
[0041] O termo oligonucleotídeo é usado para uma molécula de ácido nucléico, DNA (ou RNA), com menos que 100 nucleotídeos de comprimento.
[0042] Transformação significa introduzir DNA em um organismo, isto é um organismo hospedeiro, de modo que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossômico como por integração cromossômica.
[0043] O termo expressão e o verbo expressar significam transcrição de sequências de DNA e/ou a tradução do mRNA transcrito em um organismo hospedeiro resultando em uma proteína, isto é não incluindo processos pós-traducionais.
[0044] Uma sequência de nucleotídeos codifica um peptídeo ou proteína quando pelo menos uma porção do ácido nucléico, ou seu complemente pode ser diretamente traduzida para proporcionar a sequência de aminoácidos do peptídeo ou proteína, ou quando o ácido nucléico isolado pode ser usado, sozinho ou como parte de um vetor de expressão, para expressar o peptídeo ou proteína in vitro, em uma célula hospedeira procariótica, ou em uma célula hospedeira eucariótiPetição 870170103388, de 29/12/2017, pág. 15/50
12/38 ca.
[0045] Um promotor é uma sequência de nucleotídeos reguladora que estimula a transcrição. Esses termos são entendidos por aqueles versados na técnica de engenharia genética. Como um promotor, um elemento promotor estimula a transcrição, mas constitui um subfragmento de uma sequência de promotores maior.
[0046] O termo operavelmente ligado refere-se à associação de dois ou mais fragmentos de ácidos nucléicos em um vetor simples de modo que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado com uma sequência de codificação, isto é uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou uma pré-proteína, quando ela é capaz de afetar a expressão dessa sequência de codificação, isto é, que a sequência de codificação está sob controle transcricional do promotor.
[0047] O termo polipeptídeo ou proteína significa um polímero composto de mais que 90 monômeros de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. O termo peptídeo denota um oligômero composto de 90 ou menos monômeros de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma ligação peptídica é uma ligação covalente entre dois aminoácidos na qual o grupo a-aminoácido está ligado ao grupo acarboxila do outro aminoácido.
[0048] O termo pró-proteína, forma de pró-proteína, Zimogênio, tripsinogênio, pré-proteína ou pré-pró-proteína denota uma produto de tradução primária que é um precursor de uma proteína madura, isto é neste caso, uma proteína resulta do processamento póstrasducional de uma pré-proteína.
[0049] O termo processamento pós-traducional denota as etapas de modificação que uma pré-proteína ou uma pré-pró-proteína é submetida, de nodo a resultar em uma proteína madura em um compartimento celular ou extracelular.
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13/38 [0050] Um peptídeo sinalizador é uma sequência de sinal clivável de aminoácidos presente na pré-proteína ou em uma forma de prépró-proteína de uma proteína secretável. Proteínas transportadas através da membrana celular, isto é secretadas, têm tipicamente uma sequência N-terminal rica em aminoácidos hidrofóbicos, tipicamente cerca de 15 a 30 aminoácidos de comprimento. Em algum momento durante o processo de passar através da membrana, a sequência de sinal é clivada por uma peptidase sinalizadora (Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (eds), Molecular Biology of the Cell, 4a Edição, 2002, Garland Science Publishing). Muitas fontes de peptídeos sinalizadores são bem conhecidas daqueles versados na técnica e podem incluir, por exemplo, a sequência de aminoácidos do peptídeo sinalizador fator-a da Saccharomyces cerevisiae e similares. Um outro exemplo é o peptídeo sinalizador porcino da préproteína tripsinogênio pancreático porcino nativo de acordo com a SEQ ID NO:5, posição 1-16. Em geral, a terminação N da pré-proteína de qualquer proteína essencialmente secretada é uma fonte potencial de um peptídeo sinalizador adequado para uso na presente invenção. Um peptídeo sinalizador pode ser também bipartite compreendendo dois peptídeos sinalizadores direcionando a pré-proteína para um primeiro e um segundo compartimento celular. Peptídeos de sinal bipartite são clivados, em etapas, no curso da via secretora. Um exemplo específico para eles é a pré-pró-peptídeo do fator-a da Saccharomyces cerevisiae (Waters et al., J. Bio. Chem. 263 (1988) 6209-14).
[0051] Pré-proteínas, com um peptídeo sinalizador N-terminal, são direcionadas para entrar na via secretora. A via secretora compreende os processos do processamento pós-traducional e finalmente resulta na secreção de uma proteína. Glicosilação e a formação de ligações de dissulfeto são processos que fazem parte da via secretora antes da secreção. No presente relatório descritivo, é entendido que proteínas
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14/38 secretadas por cepas de levedura metilotrófica passaram através da via secretora.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0052] Todas as serina proteases similares à tripsina compartilham uma preferência por substrato para um resíduo básico, Lisina ou Arginina. Enquanto a mutação de troca de aminoácido em uma serina correspondente à posição 190 de tripsina pancreática humana levada ao deslocamento desejado de especificidade com respeito aos substratos artificiais, um decréscimo da atividade proteolítica é a consequência.
[0053] Além disso, a avaliação do mutante de tripsina humana revelou que o deslocamento observado na especificidade aos resíduos de Arginina usando substratos artificiais não poderia ser designada ao processamento de pré-pró-insulina. O exemplo 1 ilustra a conversão de uma pré-pró-insulina com mutante da tripsina humana Serina190Alanina. Altas quantidades de subprodutos, principalmente os componentes B30-des-Thr e A0, são formadas durante a reação.
[0054] Não foi mostrado até onde esse efeito se aplica igualmente a todas as serinas proteases similares à tripsina. Um modo de elucidar essa questão é introduzir a mutação de troca de Ser-Ala nas sequências de aminoácidos de outras espécies de tripsina mamífera em um sítio dentro de cada sequência de polipeptídeos respectiva correspondente à posição 190 do isótipo I da tripsina pancreática humana. Ao fazerem isso, os inventores constataram, de forma surpreendente, que tal mutação de troca em tripsina pancreática porcina aumenta a seletividade do sítio de clivagem para Arginina no processamento da prépró-insulina e ao mesmo tempo mantém o nível maior de atividade proteolítica.
[0055] Aquele versado na técnica está bem a par dos métodos para substituir um ou mais resíduos de aminoácidos em uma proteína. O exemplo 2 ilustra como um mutante de troca de aminoácido pode ser
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15/38 engenheirado no nível da sequência de DNA de codificação. Contudo, outros métodos são possíveis. Na presente invenção, a sequência de nucleotídeos sintéticos que codifica o mutante Ser172Ala da tripsina pancreática porcina conforme dada na SEQ ID NO:4 foi expressa em organismos hospedeiros microbianos.
[0056] A variante de tripsina é preferivelmente produzida como proteínas heterólogas em organismos hospedeiros microbianos tais como bactérias e fungos. Aquele versado na técnica está bem familiarizado com sistemas de expressão de bactérias que existem para uma variedade de hospedeiros procarióticos, tais como espécies de E. coli, Bacilos e Estafilococos, entre outras. Microorganismos hospedeiros ainda mais preferidos são fungos. Um exemplo de um gênero de fungo preferido é Aspergillus. Ainda mesmo mais preferidas são espécies de levedura tais como espécies dos gêneros Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Ainda mesmo mais preferidas são cepas de espécies de levedura metilotrófica.
[0057] Leveduras metilotróficas têm vias bioquímicas necessárias para utilização de metanol e são classificadas em quatro gêneros, como base na morfologia da célula e características de crescimento: Hansenula, Pichia, Candida, e Torulopsis. Os sistemas de hospedeiros metilotróficos mais altamente desenvolvidos utilizam Pichia pastoris (Komagataella pastoris) e Hansenula polymorpha (Pichia angusta).
[0058] A expressão de proteínas heterólogas em levedura está descrita nas Patentes US 5.618.676, US 5.854.018, US 5.856.123, e US 5.919.651.
[0059] Organismos de levedura produzem várias proteínas que são sintetizadas intracelularmente, mas têm uma função fora da célula. Essas proteínas extracelulares são referidas como proteínas secretadas. Inicialmente, as proteínas secretadas são expressas dentro da célula na forma de um precursor, uma pré-proteína ou uma pré-pró
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16/38 proteína contendo um peptideo sinalizador N-terminal assegurando a direção eficaz do produto expresso na via secretora da célula, através da membrana do retículo endoplasmático. O peptídeo sinalizador é geralmente clivado do produto desejado durante translocação. A clivagem é efetuada proteoliticamente por uma peptidase sinalizadora. Uma particular subsequência de aminoácidos do peptídeo sinalizador é reconhecida e clivada pela peptidase sinalizadora. Essa subsequência é referida como um sítio de clivagem de peptidase sinalizadora. Uma vez tendo entrado na via secretora, a proteína é transportada ao aparelho de Golgi. Do aparelho de Golgi, as proteínas são distribuídas para a membrana plasmática, lisossomos e vesículas secretoras.
[0060] As proteínas secretadas são confrontadas com diferentes condições ambientais conforme opostas às proteínas intracelulares. Parte dos processos da via secretora é estabilizar as proteínas extracelulares em amadurecimento. Portanto, as pré-proteínas que são passadas através da via secretora de levedura sofrem o processo póstrasducional. Por exemplo, o processamento pode compreender a geração de ligações de dissulfeto para formar reticulações intramoleculares. Além disso, certos aminoácidos da proteína podem ser glicolisados.
[0061] Várias abordagens foram sugeridas para a expressão e secreção em levedura de proteínas heterólogas para levedura. EP 0 116 201 descreve um processo, por meio do qual proteínas heterólogas para levedura são transformadas por um vetor de expressão contendo DNA que codifica a proteína desejada, um peptídeo sinalizador e um peptídeo agindo como um sítio de clivagem de peptidase sinalizadora. Uma cultura do organismo transformado é preparada e crescida, e a proteína é recuperada do meio de cultura. Foi verificado que para uso em células de levedura, um peptídeo sinalizador adequado é um peptídeo sinalizador fator-a da Saccharomyces cerevisiae (Patente US
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4.870.008).
[0062] Durante a secreção, a enzima de levedura KEX-2 é a peptidase sinalizadora que reconhece uma sequência de Lisina-Arginina como seu sítio de clivagem na pré-proteína. KEX-2 cliva na junção para a sequência da proteína desejada. Como resultado, o produto gênico desejado é liberado e isento das porções líder, isto é o peptídeo sinalizador da pré-proteína. A endoprotease KEX-2 foi originalmente caracterizada na levedura Saccharomyces, onde ela processa especificamente o precursor do fator-alfa tipo correspondente e um fator assassino (Julius, D. et al., Cell 37 (1984) 1075-1089). Espécies de levedura metilotrófica, tal como Pichia pastoris, compartilham a protease tipo KEX-2 (papel e função similares) com Saccharomyces cerevisiae (Werten, M.W., et al., Yeast 15 (1999) 1087-1096).
[0063] Uma espécie de levedura metilotrófica bem estabelecida exemplarmente descrita como hospedeiro para expressão de proteína recombinante de alto nível é a Pichia pastoris (Patentes 4.683.293, US 4.808.537, US 4.812.405, US 4.818.700, US 4.837.148, US 4.855.231, US 4.857.467, US 4.879.231, US 4.882.279, US 4.885.242, US 4.895.800, US 4.929.555, US 5.002.876, US 5.004.688, US 5.032.516, US 5.122.465, US 5.135.868, US 5.166.329, WO 00/56903). Em ausência de glicose, Pichia pastoris usa metanol como fonte de carbono, que ao mesmo tempo é uma indicação de um organismo metilotrófico. O promotor de álcool oxidase (AOX1) dado na SEQ ID NO:7 controla a expressão da álcool oxidase, que catalisa a primeira etapa no metabolismo do metanol. Tipicamente, 30% da proteína total solúvel em células induzidas por metanol compreendem álcool oxidase. Vários vetores de expressão de Pichia transportam o promotor AOX1 e usam metanol para induzir expressão de alto nível das proteínas heterólogas desejadas. As construções de expressão também estão integradas ao genoma da Pichia pastoris, criando um
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18/38 hospedeiro geneticamente transformado e estável.
[0064] Usando um vetor de expressão que codifica uma préproteína heteróloga compreendendo um peptídeo sinalizador ou um peptídeo sinalizador com um sítio de clivagem de peptidase sinalizadora, e uma proteína desejada, cepas de levedura metilotrófica, tais como cepas de Pichia pastoris, podem ser manipuladas de modo a secretar o produto desejado no meio de crescimento, do qual a proteína secretada pode ser purificada.
[0065] Pode ser vantajoso produzir sequências de nucleotídeos que codificam a pré-proteína possuindo um uso de códon substancialmente diferente. Os códons podem ser selecionados para aumentar a taxa na qual a expressão da pré-proteína ocorre em um hospedeiro de expressão de levedura particular de acordo com a frequência com a qual os códons particulares são utilizados pelo uso de hospedeiro. Outras razões para alterar substancialmente a sequência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína, sem alterar as sequências de aminoácidos codificadas, incluem a produção de transcritos de RNA tendo mais proteínas desejáveis, tal como meia-vida mais longa, que os transcritos produzidos da sequência que ocorre naturalmente.
[0066] O exemplo 3 ilustra as etapas de clonagem para proporcionar um vetor de expressão que codifica a variante de tripsina. O uso de um vetor que compreende a sequências de nucleotídeos que codifica a pré-proteína que é competente para expressão, por exemplo, operavelmente ligada a um promotor ou elemento de promotor e a um terminador ou elemento de terminador, bem como as sequências requeridas para tradução eficaz, o organismo hospedeiro é transformado com o vetor, e os transformantes são selecionados.
[0067] Por outro lado, o rendimento de expressão é dependente de alvejar apropriadamente o produto desejado, por exemplo, à via secretora por meio de um peptídeo sinalizador tal como o peptídeo siPetição 870170103388, de 29/12/2017, pág. 22/50
19/38 nalizador fator-a da Saccharomyces cerevisiae ou o peptídeo sinalizador porcino do tripsinogênio pancreático porcino nativo. O exemplo 4 proporciona um hospedeiro microbiano transformado e o exemplo 5 mostra como a expressão da variante de tripsina pode ser obtida. Por conseguinte, o produto traducional primário compreende um peptídeo sinalizador que direciona o peptídeo para a via secretora. O exemplo 6 ilustra a medição da atividade típica no sobrenadante da levedura metilotrófica transformada.
[0068] Por outro lado, o rendimento de expressão pode ser elevado aumentando-se a dosagem do gene que codifica o produto desejado. Assim, o número de cópias da construção de expressão, que é o vetor de expressão ou o cassete de expressão, no organismo hospedeiro é ampliado. Um modo de se conseguir isso é por transformação múltipla de um vetor de expressão que codifica o produto desejado. Um outro modo é introduzir o gene que codifica o produto desejado para o organismo hospedeiro usando um primeiro e um segundo vetor de expressão, pelo que o segundo vetor de expressão é baseado em um marcador selecionável que difere do marcador selecionável usado no primeiro vetor de expressão. O segundo vetor de expressão que codifica o mesmo produto desejado pode ser ainda introduzido quando o organismo hospedeiro já transporta múltiplas cópias de um primeiro vetor de expressão (Patente US 5.324.639; Thill, G.P., et al., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia Pastoris, International Symposium on the Genetics of Microorganims 2 (1990), pp. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197201; Werten, M.W., et al., Yeast 15 (1999) 1087-1096. O exemplo 7 descreve como o rendimento de expressão da variante de tripsina pode ser aumentada de modo a proporcionar um clone de levedura para a produção em escala industrial.
[0069] Os transformantes são repetidamente analisados com resPetição 870170103388, de 29/12/2017, pág. 23/50
20/38 peito ao rendimento da proteína secretada no meio de crescimento. Os transformantes que secretam as quantidades mais altas da proteína recombinante enzimaticamente ativa são selecionados.
[0070] A secreção da variante da tripsina porcina no meio de crescimento direciona a proteína recombinante para o espaço extracitoplasmático de onde ela se difunde no meio de crescimento. A levedura metilotrófica transformada em cultura líquida secreta a variante de tripsina pancreática porcina recombinante no meio de crescimento líquido, isto é o meio de cultura líquido. Isso permite uma separação bastante eficaz da biomassa de levedura da proteína recombinante usando, por exemplo, técnicas de filtração. Como resultado, a variante de tripsina porcina recombinante purificada desta fonte é separada muito eficazmente de outras atividades de enzimas, tal como da ribonuclease ou outras atividades de proteases (não trípticas).
[0071] Portanto, uma primeira modalidade da invenção é uma variante, por meio de substituição de aminoácido, do isótipo I de tripsina pancreática porcina, em que o aminoácido Serina na posição 172 substitui o resíduo de aminoácido Alanina, numerado a partir da terminação N do isótipo I de tripsina pancreática porcina de acordo com a SEQ ID NO:1, para formar uma variante de tripsina pancreática com atividade de tripsina.
[0072] Preferivelmente, a variante de tripsina pancreática porcina tem uma seletividade de sítio de clivagem aumentada para clivagem hidrolítica no grupo carboxila do aminoácido arginina, ao invés de clivagem hidrolítica no grupo carboxila do aminoácido lisina.
[0073] Mais preferida, a variante isolada exibe a seletividade aumentada quando um polipeptídeo precursor de insulina ou um análogo deste é usado como substrato.
[0074] Em ainda uma outra modalidade preferida da invenção, a atividade proteolítica específica da variante de tripsina porcina é 100%
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21/38 em comparação com a tripsina pancreática porcina tipo selvagem. Assim, quando produzida e purificada sob condições equivalentes, a atividade de tripsina específica da variante da tripsina pancreática porcina recombinante é 100% quando em comparação com a tripsina pancreática porcina inalterada, ou seja, a forma tipo selvagem.
[0075] Uma outra modalidade preferida da invenção é um método para produzir uma variante de tripsina pancreática porcina compreende as etapas de (a) proporcionar um vetor que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a variante de tripsina pancreática, (b) transformar uma cepa hospedeira microbiana com o vetor, (c) cultivar a cepa hospedeira microbiana em um meio de crescimento que contém nutrientes, pelo que a cepa hospedeira microbiana expressa a variante de tripsina pancreática porcina recombinante, e (d) purificar a variante da tripsina pancreática porcina recombinante da cepa hospedeira microbiana e/ou o meio de crescimento.
[0076] Eficácia de tradução de uma proteína heteróloga pode ser aperfeiçoada por adaptação dos códons da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína heteróloga de acordo com os códons preferidos no organismo hospedeiro. Assim, em uma modalidade preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica a variante de tripsina pancreática porcina recombinante é SEQ ID NO:4.
[0077] Em uma ainda mais preferida modalidade da invenção, (a) o vetor compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma pré-proteína do tripsinogênio pancreático porcino recombinante e um peptídeo sinalizador conforme dado na SEQ ID NO:6, (b) a cepa hospedeira microbiana é uma cepa de levedura metilotrófica, (c) o meio de crescimento contém metanol como fonte de carbono, (d) a cepa de levedura metilotrófica expressa e secreta a variante de tripsina pancreática porcina recombinante, e (e) a variante de tripsina pancreática porcina é purificada do meio de crescimento.
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22/38 [0078] Peptídeos sinalizadores eucarióticos derivados de levedura, bem como derivados de não-levedura em vez daqueles particularmente mencionados podem ser usados para o mesmo propósito. Embora os peptídeos sinalizadores não possam ser cliváveis pela peptidase sinalizadora, um peptídeo de clivagem de peptidase sinalizadora pode ser inserido na sequência de aminoácidos de pré-proteína, que está entre a sequência de aminoácidos do peptídeo sinalizador e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de tripsina pancreática porcina, recombinante, variante. Portanto, em ainda uma outra modalidade muita preferida da invenção, o peptídeo sinalizador contém uma sítio de clivagem de peptidase sinalizadora, que está localizado adjacente ao primeiro aminoácido (N-terminal) do tripsinogênio pancreático porcino recombinante.
[0079] Em uma outra modalidade preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína é operavelmente ligada a um promotor ou elemento de promotor. É preferido que o vetor seja um plasmídio capaz de ser replicado como um epissoma na cepa de levedura metilotrófica. Portanto, é preferido que um cromossomo artificial capaz de ser replicado na cepa de levedura metilotrófica contenha o vetor. Ainda, é mais preferido que um cromossomo da cepa de levedura metilotrófica contenha o vetor como um integrado.
[0080] Assim, no método preferido usando as cepas de levedura metilotrófica e particularmente cepas de Pichia pastoris, o vetor que codifica uma sequência de aminoácidos para uma variante de préproteína tripsinogênio pancreático porcino que entra na via secretora.
[0081] Em uma modalidade preferida da invenção, a cepa de levedura metilotrófica é uma espécie de Hansenula, Pichia, Candida ou Torulopsis. É altamente preferido que a cepa de levedura metilotrófica seja selecionada do grupo que consiste em Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii e Torulopsis glabrata. É ainda mais prePetição 870170103388, de 29/12/2017, pág. 26/50
23/38 ferido que a cepa de levedura metilotrófica seja a cepa de Pichia pastoris com o Número de Acesso 76273 no American Type Culture Collection, ou um derivado desta.
[0082] Uma outra modalidade preferida da invenção é uma cepa de Pichia pastoris com um cromossomo que contém um vetor que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma préproteína que consiste na variante de tripsina pancreática porcina recombinante e um peptídeo sinalizador operavelmente ligados com o promotor AOX1 de Pichia pastoris de acordo a SEQ ID NO:7 ou um elemento de promotor deste.
[0083] Aquele versado na técnica tem conhecimento do fato de que o rendimento de proteína heteróloga secretada, tal como uma variante de tripsina pancreática porcina, obtenível do meio de crescimento, tal como um meio de crescimento líquido, pode ser aumentado quando o número de cópias da sequência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína da qual a proteína heteróloga é expressa e secretada, é aumentado. Assim, o rendimento de proteína heteróloga secretada obtenível do meio de crescimento pode ser aumentado quando o número de cópias do vetor no genoma da cepa de levedura metilotrófica é aumentado. Por exemplo, o número de cópias do vetor que pode ser aumentado por submissão da cepa de levedura metilotrófica a repetidas transformações do vetor e os ciclos de seleção repetidos usando concentrações crescentes do agente seletivo contra o qual o marcador seletivo compreendido no vetor confere resistência (Patente US 5.324.639; Thill, G.P., et al., Positive and Negative Effects of MultiCopy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 (1990), pp. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-201).
[0084] Um exemplo para um marcador seletivo é o gene Sh ble, que é o gene de resistência a ZeocinTM (Drocourt, D., et al., Nucleic
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Acids Res. 18 (1990) 4009; Carmels, T., et al., Curr. Genet. 20 (1991) 309-314). A proteína codificada pelo gene Sh ble se liga à ZeocinTM estequiometricamente e com forte afinidade. A ligação de ZeocinTM inibe sua atividade tóxica, selecionando assim transformantes contendo o gene Sh ble. É sabido por aquele versado na técnica que o aumento da concentração de ZeocinTM como o agente seletivo no meio seleciona um aumento do número de cópias do vetor que expressa o gene Sh ble. Portanto, é vantajoso usar um vetor com o gene Sh ble como um marcador selecionável para gerar por transformação repetida transformantes múltiplos da cepa de levedura metilotrófica contendo múltiplas cópias do vetor. Portanto, é vantajoso que transformações sejam repetidas e a seleção para ainda mais transformantes resistentes seja repetida até que para a cepa de levedura metilotrófica transformada, mais nenhum outro aumento do nível de resistência a ZeocinTM seja obtido ou mais nenhum outro aumento da concentração de ZeocinTM no meio de seleção seja ainda possível.
[0085] Aquele versado na técnica está familiarizado com a purificação da tripsina pancreática porcina recombinantemente expressa e secretada por meio de cromatografia (Funakoshi, A., et al., J. Biochem. (Tóquio) 88 (1980) 1113-1138; Paudel, H.K., e Liao, T.H., J. Biol Chem. 261 (1986) 16006-16011; Nefsky, B., e Bretscher, A., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 215-219). É preferido que uma variante de tripsinogênio pancreático porcino no meio de crescimento seja purificado usando cromatografia de troca iônica. Etapas de processamento a jusante levando ao produto purificado são descritas no exemplo 8. A produção da isoforma I de tripsina pancreática porcina do tipo selvagem foi feita similarmente exceto que a sequência de codificação do tipo selvagem foi usada para construir o vetor de expressão.
[0086] Ainda, uma outra modalidade preferida da invenção é uma variante do isótipo I da tripsina pancreática porcina, por um dos métoPetição 870170103388, de 29/12/2017, pág. 28/50
25/38 dos descritos acima. Uma outra modalidade da invenção é o uso da variante de tripsina pancreática porcina para o processamento da prépró-insulina. Os benefícios do uso da variante Ser172Ala de tripsina porcina para clivagem enzimática de diferentes pré-pró-insulinas são descritos nos exemplos 10-12. Os seguintes exemplos, referências, listagem de sequências e figuras são proporcionados para auxiliar o entendimento da presente invenção, o verdadeiro escopo da qual está estabelecido nas reivindicações apensas. É entendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se desviar do espírito da invenção.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Esquema dos principais sítios de clivagem tríptica para as pré-pró-insulinas de insulina humana, Insulina glargina e Insulina glulisina. Os triângulos cheios representam sítios de clivagem rendendo produto(s), triângulos abertos denotam sítios de clivagem rendendo subprodutos. As ligações de dissulfeto das pré-pré-insulinas não são mostradas.
Figura 2: Clivagem de pré-pró-insulina glargina com tripsina humana do tipo selvagem, recombinante (exemplo 1).
Figura 3: Clivagem de pré-pró-insulina glargina com a variante de tripsina humana Serina190Alanina, recombinante (exemplo 1).
Figura 4: Mapa do plasmídio pTyr-Ser172Ala que é um derivado do plasmídio pPICZaA comercialmente disponível (Invitrogen) que confere resistência à ZeocinTM. A inserção designada TrySer172Ala é a sequência de DNA sintético que codifica a variante de tripsinogênio secretado porcino recombinante que transporta a substituição de aminoácido Ser172Ala, e que é fundida à sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinalizador de fator-a de Saccharomyces cerevisiae. AOX1-Prom representa o promotor AOX1 da Pichia pastoris, Term denota o terminador AOX1 de Pichia pastoris.
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Figura 5: É mostrada a clivagem de pré-pró-insulina (insulina humana) com tripsina porcina recombinante, nativa (exemplo 10, Tabela 1).
Figura 6: É mostrada a clivagem de pré-pró-insulina (insulina humana) com tripsina porcina variante S172A (exemplo 10, Tabela 1).
[0087] Geralmente, nos seguintes exemplos, os métodos sugeridos e descritos nos manuais da Invitrogen Kit de Expressão de Pichia pastoris Versão M 011102 25-0043, pPICZ A, B, e C Versão D 110801 25-0148, pPICZa A, B, e C Versão E 010302 25-0150, e pPIC9K Versão E 030402 25-0106, foram aplicados. É também feita referência a outros vetores, cepas de levedura e meios aí mencionados. Métodos básicos de biologia molecular foram aplicados conforme descritos por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edição, CSHL Press, 2001
MÉTODO HPCL:
[0088] Fase estacionária: Nucleosil 1205 C18, Macherey & Nagel, 250 x 4 mm; Fase móvel A: tampão de fosfato de sódio 45 mM (pH 2,5), NaCl 315mM, acetonitrila a 25% (v/v); Fase Móvel B: tampão de fosfato de sódio 45mM (pH 2,5), NaCl 55mM, acetonitrila a 65% (v/v); Gradiente: linear, de 6% da fase B para 10% da fase B, dentro de 30 minutos.
[0089] Os seguintes exemplos têm por objetivo ilustrar a invenção sem limitá-la.
exemplo 1: Clivagem de pré-pró-insulina glargina usando tripsina do tipo selvagem humana, recombinante e variante de tripsina humana Serina190Alanina.
[0090] Esses experimentos foram conduzidos a 8oC e em um valor de pH de 8,3 (solução tamponada) e foram realizados até a escala de 50 mL.
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27/38 [0091] A solução de PPI foi preenchida em um vaso de reação com termostato, apropriado, e a reação foi iniciada por adição da preparação de enzima. Amostras foram tiradas depois de intervalos de tempo definidos; a reação enzimática foi imediatamente interrompida por acidificação da solução de amostra com uma solução de 1N ou 2N de HCl. A concentração dos respectivos produtos foi determinada por HPLC.
exemplo 2: Mutagênese da sequência de nucleotídeos sintética que codifica tripsinogênio pancreático porcino.
[0092] Geralmente, métodos padrão de biologia molecular foram aplicados conforme descritos por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ediçao, CSHL Press, 2001. O método explicado abaixo é uma aplicação específica de um método bastante genérico que é também conhecido como mutagênese sítiodirecionada.
[0093] Mutações foram geradas em um modo sítio-direcionado usando a reação em cadeia de polimerase (PCR). De modo a mutar uma códon desejado, isto é uma tripleto base, um par de oligonucleotídeos de DNA de fita simples complementares representando uma porção variante da sequência de nucleotídeos sintética que codifica um tripsinogênio pancreático porcino foi desenhado e sintetizado. Os oligonucleotídeos de DNA de fita simples eram idênticos ou complementares à sequência dada na SEQ ID NO:2, exceto quanto à sequência de tripletos a ser mutada. Tipicamente, os oligonucleotídeos de DNA tinham um comprimento de cerca de 20 a 45 nucleotídeos; a sequência de tripletos a ser mutada ou seu complemento estava localizada na porção central do oligonucleotídeo de DNA compreendendo o mesmo, e era flanqueada em ambos os lados por cerca de 10 a 12 nucleotídeos. Os oligonucleotídeos de DNA foram desenhados de modo que a hibridização dos oligonucleotídeos de DNA para o DNA de
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28/38 tripsinogênio pancreático, recombinante, do ‘tipo selvagem' (de acordo com a SEQ ID NO:2) resultou em híbridos com um desemparelhamento central, mas com pareamento de bases intacto nos flancos do desemparelhamento, incluindo as extremidades 5' e 3'de cada oligonucleotídeo de DNA.
[0094] Adicionalmente, dois iniciadores de oligonucleotídeo de DNA de fita simples foram fornecidos, dos quais o primeiro, designado 5' tripsina (SEQ ID NO:8) compreendia os 9 nucleotídeos de 5'terminal da SEQ ID NO:2 e o segundo, designado 3' tripsina (SEQ ID NO:9) compreendia a sequência complementar para os 12 nucleotídeos 3'-terminal da SEQ ID NO:2. Os dois iniciadores foram desenhados para compreender sítios de clivagem de endonuclease de restrição. Portanto, o primeiro e o segundo iniciadores foram estendidos e sequências adjacentes incluídas que estavam flanqueando a sequência de nucleotídeos sintética da SEQ ID NO2. 5' tripsina continham um sítio EcoRI e um 3' Xba I.
[0095] Uma sequência de nucleotídeos que codificou uma variante, por meio de substituição de um aminoácido, da proteína tripsina pancreática porcina, madura, do tipo selvagem, foi sintetizada por meio de várias etapas com base em PCR.
[0096] Uma primeira e uma segunda PCR foram efetuadas usando como DNA de dupla fita de modelo compreendendo a sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:2 que estava presente como uma inserção no vetor. As sequências de vetor flanqueando a inserção eram tais que durante a PCR os iniciadores 5' tripsina e 3' tripsina se corresponderam perfeitamente quando anelados. A primeira PCR foi feita usando um par de iniciadores do iniciador de 5'tripsina e um primeiro oligonucleotídeo de DNA de fita simples compreendendo a sequência mutada, isto é variante de tripletos, pelo que os dois iniciadores anelados às fitas de DNA de modelo em oposiPetição 870170103388, de 29/12/2017, pág. 32/50
29/38 ção. A segunda PCR foi realizada de acordo, usando o iniciador 3' tripsina e um segundo oligonucleotídeo de DNA de fita simples, que era complementar ao primeiro. Como resultado a primeira e a segunda PCR geraram dois produtos intermediários: Uma porção 5' e uma porção 3' de uma sequência de nucleotídeos codificando uma variante de tripsina pancreática porcina recombinante, por meio de que a porção 5' transportou a sequência mutada em sua extremidade 3' vice versa, a porção 3' transportou a sequêcia mutada em sua extremidade 5'.
[0097] Os dois produtos de ampliação, intermediários, resultantes, foram analisados por eletroforese em gel de agarose, os fragmentos desejados foram excisados e DNA foi isolado dos blocos de agarose usando o Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen, catálogo No 28704).
[0098] Uma terceira PCT foi efetuada subsequentemente de modo a fundir a duas porções. Com essa finalidade, as duas porções foram unidas em uma PCR simples e cinco ciclos de PCR foram efetuados sem quaisquer adicionais iniciadores a montante e a jusante. Durante esses ciclos pouco produtos inteiros se formaram, pelo que a temperatura de anelamento que foi usada foi calculada para a sequência de sobreposição da porção 5' e porção 3'. Subsequentemente, os iniciadores 5' tripsina e 3' tripsina foram adicionados e mais 25 ciclos de PCT foram efetuados, por meio de que a temperatura de anelamento usada aqui correspondeu ao iniciador adicionado com a temperatura de fusão mais baixa.
[0099] Um fragmento de DNA inteiro mutado foi, subsequentemente, inserido em um vetor de clonagem usando o Kit de Clonagem por PCR - extremidade cega (Roche Diagnostics GmbF, Mannheim; Catálogo No 1 939 645). O fragmento de DNA foi verificado por meio de análise com enzima de restrição e sequenciamento. O fragmento de DNA verificado foi então excisado por meio de clivagem com Xho I e
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Not I e inserido em vetores de expressão de Pichia pastoris que foram clivados com as mesmas enzimas de restrição (vide exemplo 3 e exemplo 5).
[00100] Ser172Ala: O tripleto base TCT encontrado na EQ ID NO:2 na posição 528-531 foi substituído por GCT. Com esta finalidade, em uma primeira PCR o oligonucleotídeo de DNA 5'-TrySer172Ala (SEQ ID NO:10) foi usado como um iniciador em combinação com 3'-tripsina e em uma segunda PCR 3'-Try-Ser172Ala (SEQ ID NO:11) foi usado como um iniciador em combinação com 5'tripsina. Os fragmentos intermediários isolados foram subsequentemente usados para a terceira PCT, de modo a gerar o produto inteiro. exemplo 3: Clonagem do DNA artificial que codifica um tripsinogênio pancreático porcino, recombinante, variante, em vetores de expressão derivados de pPICZaA.
[00101] O fragmento de DNA que codifica o tripsinogênio pancreático porcino, recombinante, variante, que foi gerado a partir de fragmentos de PCR (vide exemplo 2) foi excisado com EcoRI e XbaII (Roche Diagnostics GmbH). O fragmento foi isolado usando o Kit de Extração de Gel QIAquick, de acordo com as instruções do fabricante.
[00102] O fragmento foi ligado ao vetor de pPICSaA, fundindo assim a sequência de nucleotídeos que codifica o tripsinogênio pancreático porcino, recombinante, variante, à sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinalizador fator-a da Saccharomyces cerevisiae. Antes da reação de ligação, o vetor foi similarmente clivado com EcoRI e XbaI, e isolado.
[00103] O procedimento de clonagem seguido inseriu a sequência de nucleotídeos que codifica o tripsinogênio pancreático porcino, recombinante, variante, diretamente e em alinhamento, depois de a sequência de nucleotídeos codificar o peptídeo sinalizador fator-a da Saccharomyces cerevisiae.
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31/38 [00104] A sequência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína recombinante como dada na SEQ ID NO:6 estava sob o controle do promotor AOX-1 de P. pastoris (SEQ ID NO:7), que, por exemplo na Pichia pastoris, é induzível por metanol.
[00105] A construção foi obtida por unir em um volume total de 10 mL 20 ng de fragmento de vetor linearizado (em um volume de 1 mL), 100 ng de fragmento de PCR ligado (em 3 mL), e incubação durante a noite a 16oC, em presença de T4DNA ligase (Roche Diagnostics GmbH), de acordo com as instruções do fabricante. 5 mL da preparação de ligação foram usados, subsequentemente, para transformar células XL1 Blue de E. coli competentes (Stratagene), em um volume total de 205 mL. Seguinte à incubação em gelo por 30 minutos, as células foram submetidas a choque térmico a 42oC, por 90 segundos. Subsequentemente, as células foram transferidas em 10 mL de meio LB e incubadas, por 1 hora, a 37oC, para permitir a expressão dos marcadores de seleção. Alíquotas foram plaqueadas, depois disso, em placas LB contendo 10 mg/mL de Zeocin e incubadas por 15 horas, a 37oC. Clones resistentes foram retirados, os plasmídios isolados (Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edição, CSHL Press, 2001) e testados por meio de análise de restrição, bem como por análise de sequência. Verificou-se que os clones de construção estavam isentos de erros e os produtos da clonagem foram selecionados. O vetor de expressão contendo uma tripsina pancreática porcina, recombinante, variante com o peptídeo sinalizador fator-a da Saccharomyces cerevisiae foi designado pTry-Ser172Ala.
exemplo 4: Transformação de Pichia pastoris com vetores de expressão pTry-Ser172Ala derivado de pPICZaA.
[00106] As cepas hospedeiras usadas eram Pichia pastoris X-33, GS115, KM71H e SMD1168 (Invitrogen). Cepas preferidas foram X-33 e KM71H. A transformação almejou integrar estavelmente construções
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32/38 de expressão no genoma do organismo hospedeiro. Inicialmente, 5 mL de meio YPD (YPD = levedura peptona dextrose; Invitrogen) foram inoculados com colônia de P. pastoris e pré-cultivados em um agitador durante a noite, a 30oC. Para preparar as células competentes para transformação, 100 mL da pré-cultura foram adicionados como inóculo a 200 mL de meio YPD fresco e crescidas até que uma OD600nm de entre 1,3 e 1,5 fosse alcançado. As células foram centrifugadas em 1.500 x g, por 5 minutos e re-suspensas em 200 mL de água estéril gelada (oC). As células foram centrifugadas novamente a 1.500 x g for 5 minutos e re-suspensas em 100 mL de água estéril gelada. As células foram centrifugadas mais uma vez a 1.500 x g por 5 minutos e resuspensas em 10 mL de sorbitol 1M (ICN) gelado. As células preparadas desse modo foram mantidas em gelo e usadas para transformação imediatamente.
[00107] Os vetores de expressão pTry-Ser172Ala derivado de pPICZaA a serem usados para transformação foram linearizados usando a endonuclease de restrição Sac I (Roche Diagnostics GmbH), precipitados e re-suspensos em água. A transformação foi obtida por eletroporação usando um Gene Pulser IIT'' (BioRad). Para preparação da transformação, 80 mL de células de P. pastoris em solução 1M de sorbitol foram misturados com 1 mg de DNA de vetor de expressão linearizado e transferidos para uma cubeta de gelo, que foi então mantida em gelo por 5 minutos. Subsequentemente, a cubeta foi transferida para o Gene Pulser. Os parâmetros de eletroporação foram 1 kV, 1 kW e 25 mF. Seguinte à eletroporação, 1 mL de solução 1M de sorbitol foi adicionado à suspensão de células, que foi subsequentemente plaqueada em placas YPDA (YPDS = levedura peptona dextrose sorbitol; Invitrogen) contendo 100 mg/mL de ZeocinTM (Invitrogen), com 100-150 mL de suspensão de células sendo espalhados em uma placa simples. As placas YPDS foram incubadas a 30oC, por 2-4 dias.
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Clones de levedura foram transferidos para placas quadriculadas com dextrose mínima. As colônias dessas placas foram retiradas e resuspensas separadamente em água estéril. As células foram digeridas com 17,5 unidades de liticase (Roche Diagnostics GmbH) por 1 hora, a 30oC e depois disso congeladas por 10 minutos a -80oC. Por meio de PCR, a presença dos cassetes de expressão de pTrySer172Ala derivado de pICZaA, respectivo, foi verificada. O termo cassete de expressão denota uma sequência de nucleotídeos que codifica a préproteína de tripsina pancreática porcina, recombinante, variante, operavelmente ligada ao promotor AOX1 e ao terminador AOX1, por meio de que o cassete de expressão é derivado do respectivo vetor de pPICZaA usado para transformação. Quanto aos vetores contendo um cassete de expressão, os termos vetor e vetor de expressão são sinônimos.
[00108] Clones positivos, isto é clones que foram testados positivamente para a presença de cassetes de expressão completos estavelmente integrados ao genoma foram usados para posterior caracterização da expressão de tripsina pancreática porcina, recombinante, variante.
[00109] Adicionalmente, as transformações de controle foram feitas com cepa Pichia pastoris KM71H usando o vetor pPICZaA original. Clones positivos foram obtidos e verificados em um modo similar. exemplo 5: Expressão e secreção de tripsinogênio pancreático porcino, recombinante, variante.
[00110] Um conjunto de clones positivos (20-30) transformados com um vetor de expressão pPICZaA-pTrySer172Ala, cada um em 3 mL de meio BMGY (BMGY = meio complexo de glicerol tamponado; Invitrogen). Depois disso, os valores de OD600nm das culturas foram determinados antes de serem passadas para frascos com agitação, cada contendo 10 mL de meio BMMY (Invitrogen), em pH 3. Pré-culturas foram
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34/38 usadas como inóculo para resultar, cada uma, em OD60onm de 1. As culturas foram mantidas em um agitador, a 30oC. Em paralelo, clones de controle positivos foram cultivados sob as mesmas condições.
[00111] O meio BMMY (BMMY = meio complexo de metanol tamponado) compreende metanol (Mallinckrodt Baker B.V.), que é um indutor do promotor AOX-1 que controla a transcrição da sequência de nucleotídeos que codifica o tripsinogênio pancreático porcino, recombinante, variante.
[00112] Amostras de 500 mL foram retiradas do frasco com agitação em intervalos de 24 horas, por um tempo total de 72 horas. Quando uma alíquota de amostra foi removida, a cultura foi também alimentada com metanol a 0,5%. As amostras do meio de crescimento de sobrenadante foram testadas quanto à atividade enzimática da tripsina. exemplo 6: Análise de expressão de tripsina pancreática porcina variante [00113] Das alíquotas de amostras obtidas conforme descrição no exemplo 5, inicialmente o OD600 nm foi determinado. Subsequentemente, as células foram peletizadas por centrifugação e o sobrenadante foi guardado. A atividade da tripsina foi medida no sobrenadante não diluído, bem como em uma diluição de 1:10.
[00114] Enquanto os clones de controle transformados com o vetor pPICZaA não levaram a nenhuma atividade de tripsina mensurável no meio, as cepas de Pichia transformadas com vetores de expressão pPICZaA-pTrySer172Ala mostraram atividade de tripsina devido à variante respectiva de tripsina pancreática porcina, recombinante, secretada no meio de crescimento, isto é no meio de cultura. Portanto, poderia ser concluído que a expressão de uma pré-proteína recombinante, que, nesse caso, compreende o peptídeo sinalizador fator-a de Saccharomyces cerevisiae permite a secreção de uma enzima ativa com atividade proteolítica.
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35/38 exemplo 7: Aumento do rendimento de expressão por transformação múltipla e concentração de Zeocin™ aumentada.
[00115] Os clones de levedura transformados com os vetores de expressão pDNM derivados de pPICZaA e de pPICZA que mostraram que produzem as mais altas atividades de tripsina em meios de sobrenadante foram submetidos à eletroporação repetida usando o mesmo vetor de expressão como previamente. As condições para eletroporação foram como descritas no exemplo 4 com exceção de que as placas YPDS continham ZeocinTM, em concentrações aumentadas, ou seja, entre 1.000 e 2.000 mg/mL. A concentração do antibiótico foi aumentada de modo a selecionar transformantes tendo incorporados em seu genoma cópias múltiplas do respectivo vetor de expressão. Clones de levedura com resistência aumentada ao antibiótico foram transferidos para placas com dextrose mínima, quadriculadas. Como já descritas no exemplo 5, as pré-culturas foram feitas de clones de levedura individuais e a expressão foi medida por determinação da atividade enzimática de tripsina secretada no meio de crescimento conforme descrição no exemplo 6. Clones individuais foram encontrados, os quais produziram uma quantidade aumentada da atividade da tripsina. Na média, a atividade de tripsina medida no sobrenadante de cepas de Pichia transformadas repetidamente com o respectivo vetor de expressão pPICZaA-pTry-Ser172Ala estava entre duas vezes e três vezes tão alta como em comparação com as respectivas cepas de precursor que haviam passado por uma única transformação.
exemplo 8: Purificação da variante de tripsinogênio pancreático porcino de sobrenadante de cultura líquida e ativação para formar a variante de tripsina.
[00116] O caldo de fermentação, inteiro, foi diluído em uma razão de cerca de 1:2 a 1:4 com tampão de acetato de amônio (5-20mM) contendo cloreto de cálcio 5-30mM, pH 3,5. A variante de tripsinogênio
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36/38 foi purificada por meio de cromatografia em leito expandido (McCornick (1993); EP 0 699 687) usando um trocador de cátion (por exemplo, Streamline®SP, XL). A cromatografia foi efetuada sem separação prévia das células de levedura. Posterior purificação foi efetuada usando uma coluna de leito empacotada (por exemplo, SPSepharose® XL). Ativação autocatalítica foi iniciada por retamponamento do pH para 7-8 em presença de CaCl2 20mM. A ativação foi terminada trocando o pH de volta para a faixa de 2 a 4. A tripsina purificada foi armazenada em pH 1,5-3, de modo a evitar autoproteólise.
exemplo 9: Ensaio para determinar a atividade da tripsina específica da tripsina pancreática porcina, recombinante, variante.
[00117] A atividade da tripsina foi determinada usando Chromozym TRY (Roche Diagnostics GmbH) em Tris 100mM pH 8,0, CaCl2 20mM, a 25oC. Medição fotométrica foi efetuada em 405 nm. Para discriminar entre a especificidade de substrato arginina versus lisina, Chromozym TH (contém arginina/Roche Diagnostics GmbH) e Chromozym PL (contém lisina/Roche Diagnostics GmbH) foram usadas.
exemplo 10: Clivagem da pré-pró-insulina humana [00118] Todos os experimentos foram conduzidos a 8oC e um valor de pH de 8,3 (solução tamponada ou controlada por dosagem de NaOH) e foram realizados nos 20 ml para a escala de 3,5 L. Em alguns experimentos, a pré-pró-insulina foi também clivada usando tripsina porcina, recombinante, nativa, de modo a comparar, diretamente, ambas as enzimas.
[00119] A solução de PPI foi preenchida em um vaso de reação com termostato apropriado e a reação foi iniciada pela adição da preparação de enzima. Amostras foram retiradas depois de intervalos de tempo definidos; a reação enzimática foi imediatamente interrompida por acidificação da solução de amostra com uma solução 1N ou 2N de
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HCl. A concentração dos respectivos produtos foi determinada por HPLC.
A TABELA 1 MOSTRA RESULTADOS EXEMPLARES DE UM EXPERIMENTO
| escala | Tripsina | S préArg-Ins [área %] | S Arg-Ins [área%] | des-Thr [área % ] | Compostos S A0 [area %] | Rendimento (padrão externo) [%] |
| 3,5 L | nativa | 1,4 | 68,8 | 7,2 | 10,7 | 84,2 |
| S172A | 0,9 | 82,5 | 3,3 | 4,1 | 96,5 |
Tabela 1: Resultado da reação de clivagem de pré-pré-insulina (insulina humana) usando tripsina porcina recombinante ativa e a variante de tripsina S172A (iguais U/g de PPI usados).
[00120] Como pode ser visto da Tabela 1, o uso da variante de Tripsina S172A diminui a formação dos subprodutos indesejados, compostos des-Thr e A0, e, consequentemente, aumenta a quantidade de Arg-insulinas (Arg-Ins) valiosas e o respectivo rendimento de clivagem.
[00121] A figura 5 mostra a conversão da pré-pró-insulina com tripsina porcina recombinante nativa, a Figura 6 mostra a conversão de PPI com a tripsina variante S172A.
exemplo 11: Clivagem da pré-pró-insulina glargina [00122] As condições experimentais do exemplo 10 foram usadas. A pré-pró-insulina foi também clivada usando tripsina porcina, recombinante, nativa, de modo a comparar diretamente ambas as enzimas. MÉTODO HPLC: COMO DESCRITO [00123] A Tabela 2 mostras resultados exemplares dos experimentos realizados. Os valores apresentados marcam o ponto de formação máxima do produto.
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| escala | Tripsina | préInsulina glarginae [área %] | Insulina glargina [area %] | des-Thr [area %] | Compos-tos S A0 [area %] | Rendimento (padrão externo) [%] |
| 1 L | nativa | 0,5 | 51,1 | 5,6 | 10,9 | 58,1 |
| S172A | 0,4 | 55,5 | 2,6 | 5,1 | 62,9 | |
| Tabela 2: Resull | tados da | reação de clivagem de pré-pré- |
insulina (Insulina glargina) usando a tripsina recombinante, nativa, e a variante S172A (200 U/g de PPI usados).
[00124] Como pode ser visto da Tabela 2, o uso da variante de Tripsina S172A diminui a formação dos subprodutos indesejados, compostos des-Thr e A0, e, consequentemente, aumenta a quantidade de insulina glargina.
exemplo 2: Clivagem de pré-pró-insulina glulisina [00125] As condições experimentais do exemplo 10 foram usadas. A pré-pró-insulina foi também clivada usando tripsina porcina, recombinante, nativa de modo a comparar diretamente ambas as enzimas. A tabela 3 mostra resultados exemplares dos experimentos. Os valores apresentados marcam o ponto de formação máxima de produtos.
| escala | Tripsina | Quantidade de Tripsina [U/g de PPI] | Arg-insulinaglulisina [área %] | A0-Arginsulina glulisina [área %] | Rendimento (padrão externo) [%] |
| 1 L | nativa | 250 | 35,8 | 4,7 | 91,6 |
| S172A | 250 | 39,2 | 1,2 | 100,0 |
Tabela 3: Resultados da reação de clivagem da pré-préinsulina (insulina glulisina) usando tripsina recombinante nativa e a variante de Tripsina S172A.
[00126] Como pode ser visto da Tabela 3, o uso da variante Tripsina S172A diminui a formação do composto A0 indesejado e, consequentemente, aumenta a quantidade de insulina glulisina.
Claims (16)
1. Processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, caracterizado pelo fato de que (a) uma pré-pró-insulina, um análogo de pré-pró-insulina ou um derivado de pré-pró-insulina é clivado com tripsina porcina Ser172Ala tendo a sequência SEQ ID NO: 3, (b) os produtos de clivagem resultantes são separados e (aa) se um dos produtos de clivagem resultantes é um análogo de insulina ou um derivado de insulina, esse análogo de insulina ou derivado de insulina é obtido, ou (cc) aqueles produtos de clivagem sendo precursores de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina são ainda processados e a insulina, análogo de insulina ou derivado de insulina resultante de tal posterior processamento é separado e obtido.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a insulina é insulina humana.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina é selecionado de um grupo que compreende insulina humana LysB28ProB29, insulina humana B28 Asp, insulina humana, na qual a prolina na posição B28 foi substituída por Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e onde na posição B29 Lys pode ser substituída por Pro; insulina humana AlaB26; insulina humana des(B28-B30); insulina humana des(B27) e insulina humana des(B30).
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina é insulina glulisina.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina é insulina glargina.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o derivado de insulina é selecionado de um grupo que
Petição 870180167875, de 27/12/2018, pág. 4/10
2/3 compreende insulina humana B29-N-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N-palmitoil-des(B30), insulina humana B29-N-miristoíla, insulina humana B29-N-palmitoíla, insulina humana B28-N-miristoil LysB28ProB29, insulina humana B28-N-palmitoil-LysB28ProB29, insulina humana B30-N-miristoil-ThrB29LysB30, insulina humana B30-N-palmitoilThrB29LysB30, insulina humana B29-N-(N-palmitoil-y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil-y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-^-carboxieptadecanoil)-des(B30) e insulina humana B29N-^-carboxieptadecanoíla).
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, caracterizado pelo fato de que o posterior processamento daqueles produtos de clivagem sendo precursores de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina compreende uma clivagem dos ditos produtos com Carboxipeptidase B.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a clivagem com tripsina porcina Ser172Ala é realizada em um valor de pH na faixa de 7,5 a 9,5; uma temperatura entre 1oC e 30oC; e a reação enzimática é interrompida por acidificação da amostra.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a clivagem é realizada em um valor de pH de 8,3; uma temperatura entre 8 e 12oC e a acidificação é ajustada por adição de solução 1N ou 2N de HCl.
10. Tripsina porcina Ser172Ala, caracterizada pela sequência SEQ ID NO:3.
11. DNA, caracterizado pela sequência SEQ ID NO:4.
12. DNA, caracterizado pela sequência SEQ ID NO:6.
13. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um DNA como definido na reivindicação 11 ou 12.
14. Método para produzir tripsina porcina Ser172Ala como
Petição 870180167875, de 27/12/2018, pág. 5/10
3/3 definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(a) proporcionar um vetor como definido na reivindicação 14, (b) transformar uma cepa hospedeira microbiana com o vetor;
(c) cultivar a cepa hospedeira microbiana transformada em um meio de crescimento que contém nutrientes, pelo que a cepa hospedeira microbiana expressa a tripsina porcina Ser172Ala ou o tripsinogênio porcino Ser196Ala, (d) no caso de o produto de expressão de (c) ser tripsinogênio porcino Ser196Ala, conversão em tripsina porcina Ser172Ala madura, e (e) purificar a tripsina porcina Ser172Ala da cepa hospedeira microbiana e/ou do meio de crescimento.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a cepa hospedeira microbiana é uma cepa de levedura metilotrófica selecionada do grupo que compreende espécies de Hansenula, Pichia, Candida e Torulopsis.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a cepa hospedeira microbiana é selecionada de um grupo que compreende Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii e Torulopsis glabrata.
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| US8802816B2 (en) * | 2008-02-19 | 2014-08-12 | Biocon Limited | Method of obtaining a purified, biologically active heterologous protein |
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| DK2498802T3 (en) | 2009-11-13 | 2015-04-13 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist, insulin and a methionine |
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| ES2606554T3 (es) | 2010-08-30 | 2017-03-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Uso de AVE0010 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 2 |
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| PL2750699T3 (pl) | 2011-08-29 | 2015-12-31 | Sanofi Aventis Deutschland | Kombinacja farmaceutyczna do stosowania w kontroli glikemii u pacjentów z cukrzycą typu 2 |
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| ES2665853T3 (es) * | 2012-03-29 | 2018-04-27 | Biocon Limited | Secreción de insulina glargina funcional directamente en el medio de cultivo mediante la sobreexpresión intracelularmente de Kex2p |
| CN102816785B (zh) * | 2012-05-24 | 2016-03-09 | 上海仁会生物制药股份有限公司 | 一种甘精胰岛素及其类似物的制备方法 |
| CN102994600A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-03-27 | 鲁南新时代生物技术有限公司 | 甘精胰岛素前体的酶切转化方法 |
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| KR20190036956A (ko) | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 한미약품 주식회사 | 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체 |
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| EP3650541A1 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-13 | BioPharma Translationsinstitut Dessau Forschungs GmbH | Trypsin mutant for c- and n-terminal modification of polypeptides |
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| CN113773391B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-10-20 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素的制备方法 |
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Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3886043A (en) * | 1972-08-24 | 1975-05-27 | Choay Sa | Process for preparing pure porcine beta-trypsin |
| NZ199391A (en) | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| DE3382547D1 (de) | 1983-01-12 | 1992-05-27 | Chiron Corp | Sekretorische expression in eukaryoten. |
| US4870008A (en) * | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
| US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
| US4885242A (en) * | 1984-10-30 | 1989-12-05 | Phillips Petroleum Company | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4808537A (en) * | 1984-10-30 | 1989-02-28 | Phillips Petroleum Company | Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use |
| US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| PH25772A (en) | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| US4818700A (en) * | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
| US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
| US5166329A (en) * | 1985-10-25 | 1992-11-24 | Phillips Petroleum Company | DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US5135868A (en) * | 1985-10-25 | 1992-08-04 | Phillips Petroleum Company | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| US4812405A (en) * | 1986-02-18 | 1989-03-14 | Phillips Petroleum Company | Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation |
| US4857467A (en) * | 1986-07-23 | 1989-08-15 | Phillips Petroleum Company | Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia |
| US5002876A (en) * | 1986-09-22 | 1991-03-26 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of human tumor necrosis factor |
| US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
| US4929555A (en) * | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
| US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
| DK257988D0 (da) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | Novo Industri As | Nye peptider |
| AU641631B2 (en) | 1988-12-23 | 1993-09-30 | Novo Nordisk A/S | Human insulin analogues |
| PT93057B (pt) | 1989-02-09 | 1995-12-29 | Lilly Co Eli | Processo para a preparacao de analogos da insulina |
| US5122465A (en) * | 1989-06-12 | 1992-06-16 | Phillips Petroleum Company | Strains of pichia pastoris created by interlocus recombination |
| CA2090969C (en) * | 1990-09-04 | 2001-08-21 | Russell Arthur Brierley | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| DE19821866A1 (de) | 1998-05-15 | 1999-11-18 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur Katalyse von komplexen Reaktionen großer Moleküle mittels an einem polymeren Träger gebundener Enzyme |
| AU3910000A (en) | 1999-03-22 | 2000-10-09 | Zymogenetics Inc. | Improved methods for producing proteins in transformed (pichia) |
| WO2002061064A2 (de) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur herstellung von rekombinantem trypsin |
| JP4629439B2 (ja) * | 2002-09-24 | 2011-02-09 | ノボザイムス，インコーポレイティド | キモトリプシン活性を有する微生物トリプシン変異体及びそれをコードする核酸 |
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