ES2843269T3 - Diacuerpos unidos covalentemente que tienen inmunorreactividad con pd-1 y lag-3, y métodos de uso de estos - Google Patents

Abstract

Un diacuerpo Fc biespecífico que puede unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de PD-1 y a un epítopo de LAG-3, en donde dicho diacuerpo comprende cuatro cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales tiene un extremo amino terminal y un extremo carboxilo terminal, y en donde: (A) dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí, dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí, y dichas tercera y cuarta cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí; (B) dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo comprenden cada una, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, y un dominio CH2-CH3, en donde dichos dominios variables de cadena ligera y dichos dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3; y (C) dicha segunda y dicha cuarta cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo comprenden cada una, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, en donde dichos dominios variables de cadena ligera y dichos dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3; y en donde: (I) (1) dicho dominio variable de cadena ligera de dicha primera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha segunda cadena polipeptídica se asocian para formar un primer sitio de unión a epítopo y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha primera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena ligera de dicha segunda cadena polipeptídica se asocian para formar un segundo sitio de unión a epítopo; y (2) dicho dominio variable de cadena ligera de dicha tercera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha cuarta cadena polipeptídica se asocian para formar un tercer sitio de unión a epítopo y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha tercera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena ligera de dicha cuarta cadena polipeptídica se asocian para formar un cuarto sitio de unión a epítopo; en donde dos de dichos sitios de unión a epítopo formados pueden unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de PD-1 y dos de dichos sitios de unión a epítopo formados pueden unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de LAG-3; y (II) dichos dominios CH2-CH3 de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas se asocian para formar un dominio Fc.

Description

DESCRIPCIÓN

Diacuerpos unidos covalentemente que tienen inmunorreactividad con PD-1 y LAG-3, y métodos de uso de estos Antecedentes de la invención:

Campo de la invención:

La presente invención se dirige a diacuerpos biespecíficos que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas y que poseen al menos un sitio de unión a epítopo que es inmunoespecífico para un epítopo de PD-1 y al menos un sitio de unión a epítopo que es inmunoespecífico para un epítopo de LAG-3 (es decir, un "diacuerpo biespecífico para PD-1 x LAG-3"). Con mayor preferencia, la presente invención se dirige a diacuerpos biespecíficos que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas y que poseen dos sitios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos para uno (o dos) epítopo(s) de PD-1 y dos sitios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos para uno (o dos) epítopo(s) de LAG-3 (es decir, un "diacuerpo tetravalente biespecífico para PD-1 x LAG-3"). La presente invención se dirige además a tales diacuerpos que comprenden adicionalmente un dominio Fc de inmunoglobulina ("diacuerpos Fc biespecíficos" y "diacuerpos Fc biespecíficos, tetravalentes"). Los diacuerpos de la presente invención pueden unirse simultáneamente a PD-1 y LAG-3, particularmente cuando tales moléculas se disponen en las superficies de células humanas. La invención se dirige a composiciones farmacéuticas que contienen tales diacuerpos y a métodos que implican el uso de tales diacuerpos en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades y afecciones.

Descripción de la técnica relacionada:

I. Respuestas inmunitarias mediadas por células

El sistema inmunitario de los seres humanos y otros mamíferos es responsable de brindar protección contra infecciones y enfermedades. Dicha protección es proporcionada tanto por una respuesta inmunitaria humoral como por una respuesta inmunitaria mediada por células. La respuesta humoral da como resultado la producción de anticuerpos y otras biomoléculas que pueden reconocer y neutralizar dianas extrañas (antígenos). Por el contrario, la respuesta inmunitaria mediada por células implica la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK) y linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno por parte de las células T, y la liberación de varias citocinas en respuesta al reconocimiento de un antígeno (Dong, C. y otros (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1): 39-48).

La capacidad de las células T para mediar óptimamente una respuesta inmunitaria contra un antígeno requiere dos interacciones de señalización distintas (Viglietta, V. y otros (2007) "Modulating Co-Stimulation", Neurotherapeutics 4: 666-675; Korman, A.J. y otros (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy", Adv. Immunol. 90: 297-339). En primer lugar, el antígeno que se ha dispuesto en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC) debe presentarse a una célula T CD4+ virgen específica del antígeno. Tal presentación envía una señal a través del receptor de células T (TCR) que dirige a la célula T para iniciar una respuesta inmunitaria que será específica para el antígeno presentado. En segundo lugar, una serie de señales coestimuladoras e inhibidoras, mediadas a través de interacciones entre la APC y distintas moléculas de superficie de las células T, desencadenan primero la activación y proliferación de las células T y, en última instancia, su inhibición. Por tanto, la primera señal confiere especificidad a la respuesta inmunitaria, mientras que la segunda señal sirve para determinar la naturaleza, magnitud y duración de la respuesta.

El sistema inmunitario está estrictamente controlado por ligandos y receptores coestimuladores y coinhibidores. Estas moléculas proporcionan la segunda señal para la activación de las células T y proporcionan una red equilibrada de señales positivas y negativas para maximizar las respuestas inmunitarias contra la infección al tiempo que limitan la inmunidad propia (Wang, L. y otros (7 de marzo de 2011) "VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses," J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. y otros (2008) "The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections", Endocrine, Metabolic & Immune Disorders -Drug Targets 8:279-288). Es de particular importancia la unión entre los ligandos B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) de la célula presentadora de antígeno y los receptores CD28 y CTLA-4 del linfocito T CD4+ (Sharpe, A.H. y otros (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2: 116-126; Dong, C. y otros (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. y otros (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation", Immunol. Rev.229: 307-321). La unión de B7.1 o B7.2 a CD28 estimula la activación de células T; la unión de B7.1 o B7.2 a CTLA-4 inhibe dicha activación (Dong, C. y otros (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. y otros (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation", Immunol. Rev. 229: 307-321; Greenwald, R.J. y otros (2005) "The B7 Family Revisited", Ann. Rev. Immunol. 23: 515-548). CD28 se expresa constitutivamente en la superficie de las células T (Gross, J., y otros (1992) "Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor ^c D28 In The Mouse," J. Immunol. 149: 380-388), mientras que la expresión de CTLA4 se regula positivamente de manera rápida después de la activación de las células T (Linsley, P. y otros (1996) "Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement", Immunity 4: 535-543). Dado que CTLA4 es el receptor de mayor afinidad (Sharpe, A.H. y otros (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2: 116126), la unión primero inicia la proliferación de células T (a través de CD28) y después la inhibe (a través de la expresión naciente de CTLA4), amortiguando así el efecto cuando la proliferación ya no es necesaria.

Investigaciones adicionales sobre los ligandos del receptor CD28 han llevado a la identificación y caracterización de un conjunto de moléculas B7 relacionadas (la "Superfamilia B7") (Coyle, A.J. y otros (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T-Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. y otros (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. y otros (2005) "The B7 Family Revisited", Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. y otros (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. y otros (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells". Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. y otros (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy", Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. y otros (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity", J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. y otros (2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance", Curr. Opin. Organ Transplant.

13:366-372; Lenschow, D.J. y otros (1996) "CD28/B7 System of T-Cell Costimulation", Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. y otros (2004) "CoSignaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses", Microbes Infect. 6:759-766). Actualmente hay varios miembros conocidos de la familia: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), el ligando coestimulador inducible (ICOS-L), el ligando de muerte programada-1 (PD-L1; B7-H1), el ligando de muerte programada 2 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 y B7-H6 (Collins, M. y otros (2005) "The ^b7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. y otros (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New ^b7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC", Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2). II. PD-1

La muerte programada-1 ("PD-1") es una proteína de membrana de tipo I de aproximadamente 31 kD, miembro de la familia extendida de reguladores de células T CD28/CTLA4 que regula negativamente en general las respuestas inmunitarias (Ishida, Y. y otros (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBo J. 11: 3887-3895; publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos núm. 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; patentes de Estados Unidos núm. 6,808,710; 7,101,550; 7,488,802; 7,635,757; 7,722,868; publicación PCT núm. WO 01/14557). Comparado con CTLA4, PD-1 más.

PD-1 se expresa en células T activadas, células B y monocitos (Agata, Y. y otros (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T and B Lymphocytes", Int. Immunol. 8(5): 765-772; Yamazaki, T. y otros (2002) "Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And a PC," J. Immunol. 169: 5538­ 5545) y en niveles bajos en células T asesinas naturales (NK) (Nishimura, H. y otros (2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice", J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. y otros (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity", Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).

La región extracelular de PD-1 consiste en un único dominio V de inmunoglobulina (Ig) con un 23 % de identidad con el dominio equivalente en CTLA4 (Martin-Orozco, N. y otros (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity", Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). El dominio de IgV extracelular va seguido de una región transmembrana y una cola intracelular. La cola intracelular contiene dos sitios de fosforilación ubicados en un motivo inhibidor del inmunorreceptor basado en tirosina y un motivo conmutador del inmunorreceptor basado en tirosina, lo que sugiere que PD-1 regula negativamente las señales de TCR (Ishida, Y. y otros (1992) "Induced Expression Of Pd-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death", EMBO J. 11: 3887-3895; Blank, C. y otros (Epub 29 de dic de 2006) “Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer," Immunol. Immunother.

56(5): 739-745).

PD-1 media su inhibición del sistema inmunitario al unirse a B7-H1 y B7-DC (Flies, D.B. y otros (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity", J. Immunother. 30(3): 251-260; patentes de Estados Unidos núm.

6,803,192; 7,794,710; publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos núm. 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; publicaciones PCT núm. WO 01/39722; WO 02/086083).

B7-H1 y B7-DC son ligandos de unión que se expresan ampliamente en las superficies de tejidos humanos y murinos, como corazón, placenta, músculo, hígado fetal, bazo, ganglios linfáticos y timo, así como hígado, pulmón y riñón, células de los islotes del páncreas y del intestino delgado murinos (Martin-Orozco, N. y otros (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). En seres humanos, la expresión de la proteína B7-H1 se ha encontrado en células endoteliales humanas (Chen, Y. y otros (2005) "Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells", Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. y otros (2005) "Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1" Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. y otros (2002) "B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis", J. Immunol. 169:3581-3588), miocardio (Brown, J.A. y otros (2003) "Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production", J. Immunol. 170:1257-1266), sincitiotrofoblastos (Petroff, M.G. y otros (2002) "B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface", Placenta 23:S95-S101). Las moléculas también son expresadas por los macrófagos residentes de algunos tejidos, por macrófagos que han sido activados con interferón (IFN)-y o factor de necrosis tumoral (TNF)-a (Latchman, Y. y otros (2001) "^p D-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation," Nat. Immunol 2:261-268), y en tumores (Dong, H. (2003) "B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity", J. Mol. Med. 81:281-287).

Se ha descubierto que la interacción entre B7-H1 y PD-1 proporciona una señal coestimuladora negativa crucial para las células T y B (Martin-Orozco, N. y otros (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity", Semin. Cancer Biol. 17(4): 288-298) y funciona como un inductor de muerte celular (Ishida, Y. y otros (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death", EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. y otros (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition", J. Molec. Med. 83:193-202). Más específicamente, se ha encontrado que la interacción entre concentraciones bajas del receptor PD-1 y el ligando B7-H1 da como resultado la transmisión de una señal inhibidora que inhibe fuertemente la proliferación de células T CD8+ específicas del antígeno; a concentraciones más altas, las interacciones con PD-1 no inhiben la proliferación de células T pero reducen marcadamente la producción de múltiples citocinas (Sharpe, A.H. y otros (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Se ha descubierto que la proliferación de células T y la producción de citocinas por las células T CD4 y CD8 en reposo y previamente activadas, e incluso las células T vírgenes de sangre del cordón umbilical, son inhibidas por proteínas de fusión solubles B7-H1-Fc (Freeman, G.J. y otros (2000) "Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation", J. Exp. Med.

192:1-9; Latchman, Y. y otros (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation", Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. y otros (2002) "PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T-cells and is overcome by IL-2", Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. y otros (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126).

El papel de B7-H1 y PD-1 en la inhibición de la activación y proliferación de células T ha sugerido que estas biomoléculas podrían servir como dianas terapéuticas para tratamientos de inflamación y cáncer. Por lo tanto, se ha propuesto el uso de anticuerpos anti-PD-1 para tratar infecciones y tumores y modular positivamente una respuesta inmunitaria adaptativa (ver, publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos núm. 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401; patentes de Estados Unidos núm. 7,521,051; 7,563,869; 7,595,048; Publicaciones PCT núm. WO 2004/056875; WO 2008/083174). Se ha informado de anticuerpos que pueden unirse inmunoespecíficamente a PD-1, Agata, T. y otros (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes", Int. Immunol. 8(5):765-772 y Berger, R. y otros (2008) "Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies," Clin. Cancer Res. 14 (10): 3044-3051 (véanse también las patentes de Estados Unidos núm. 8,008,449 y 8,552,154; publicaciones de patente de Estados Unidos núm.

2007/0166281; 2012/0114648; 2012/0114649; 2013/0017199; 2013/0230514 y 2014/0044738; y publicaciones de patente PCT WO 2003/099196; WO 2004/004771; WO 2004/056875; WO 2004/072286; WO 2006/121168; WO 2007/005874; WO 2008/083174; WO 2009/014708; WO 2009/073533; WO 2012/135408, WO 2012/145549 y WO 2013/014668).

III. LAG-3

El gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3, CD223) es una proteína receptora de la superficie celular que se expresa en células T CD4+ y CD8+ activadas y células NK, y se expresa de forma constitutiva en células dendríticas plasmocitoides; LAG-3 no se expresa en células B, monocitos o cualquier otro tipo de célula estudiada (Workman, C.J. y otros (2009) "LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis", J. Immunol. 182(4):1885-1891).

Se ha descubierto que LAG-3 está estrechamente relacionado con el correceptor de células T CD4 (Grosso, J.F. y otros (2009) "Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells", J. Immunol. 182(11):6659-6669; Huang, C.T. y otros (2004) "Role Of LAG-3 In Regulatory T-Cells", Immunity 21:503-513; Workman, C.J. y otros (2009) "LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cel1Homeostasis", J. Immunol.

182(4):1885-1891). Al igual que Cd4, LAG-3 también se une a moléculas MHC de clase II pero lo hace con una afinidad significativamente mayor (Workman, C.J. y otros (2002) "Phenotypic Analysis Of The Murine CD4-Related Glycoprotein, CD223 (LAG-3)", Eur. J. Immunol. 32:2255-2263; Huard, B. y otros (1995) "CD4/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Analyzed With CD4- And Lymphocyte Activation Gene-3 (LAG-3)-Ig Fusion Proteins", Eur. J. Immunol. 25:2718-2721; Huard, B. y otros (1994) "Cellular Expression And Tissue Distribution Of The Human LAG-3-Encoded Protein, An MHC Class II Ligand", Immunogenetics 39:213-217).

Los estudios han demostrado que LAG-3 desempeña un papel importante en la regulación negativa de la proliferación, función y homeostasis de las células T (Workman, C.J. y otros (2009) "LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis", J. Immunol. 182(4):1885-1891; Workman, C.J. y otros (2002) "Cutting Edge: Molecular Analysis Of The Negative Regulatory Function Of Lymphocyte Activation Gene-3", J. Immunol. 169:5392-5395; Workman, C.J. y otros (2003) "The CD4-Related Molecule, LAG-3 (CD223), Regulates The Expansion Of Activated T-Cells", Eur. J. Immunol. 33:970-979; Workman, C.J. (2005) "Negative Regulation Of T-Cel1Homeostasis By Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223)", J. Immunol. 174:688-695; Hannier, S. y otros (1998) "CD3/TCR Complex-Associated Lymphocyte Activation Gene-3 Molecules Inhibit CD3/TCR Signaling", J. Immunol. 161:4058-4065; Huard, B. y otros (1994) "Lymphocyte-Activation Gene 3/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Modulates The Antigenic Response Of CD4+ T Lymphocytes", Eur. J. Immunol. 24:3216-3221).

Los estudios han sugerido que la inhibición de la función de LAG-3 a través del bloqueo de anticuerpos puede revertir la inhibición del sistema inmunitario mediada por LAG-3 y restaurar parcialmente la función efectora (Grosso, J.F. y otros (2009) "Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells", J. Immunol. 182(11):6659-6669; Grosso, J.F. y otros (2007) "LAG-3 Regulates CD8+ T-Cell Accumulation And Effector Function During Self And Tumor Tolerance", J. Clin. Invest. 117:3383-3392). Se ha descubierto que LAG-3 regula negativamente la expansión de las células T mediante la inhibición de los flujos de calcio inducidos por el receptor de células T (TCR) y controla el tamaño de la reserva de células T de memoria (Matsuzaki, J. y otros (2010) "Tumor-Infiltrating NY-ESO-1-Specific CD8+ T-Cells Are Negatively Regulated By LAG-3 And PD-1 In Human Ovarian Cancer", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107(17):7875-7880; Workman C.J., y otros (2004) "Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223) Regulates The Size Of The Expanding T-Cell Population Following Antigen Activation in vivo", J. Immunol. 172:5450-5455).

A pesar de los avances anteriores, persiste la necesidad de composiciones mejoradas que puedan dirigir más vigorosamente el sistema inmunitario del cuerpo para que ataque las células cancerosas o las células infectadas por patógenos, especialmente a concentraciones terapéuticas más bajas. Aunque el sistema inmunitario adaptativo puede ser un potente mecanismo de defensa contra el cáncer y las enfermedades, a menudo se ve obstaculizado por mecanismos inmunosupresores en el microambiente tumoral, como la expresión de PD-1 y LAG-3. Las moléculas coinhibidoras expresadas por células tumorales, células inmunitarias y células estromales en el medio tumoral pueden atenuar de manera dominante las respuestas de las células T contra las células cancerosas.

Como se describe en detalle a continuación, la presente invención aborda esta necesidad proporcionando diacuerpos tetravalentes biespecíficos para PD-1 x ^lAG-3. Dichos diacuerpos pueden unirse a las moléculas de la superficie celular PD-1 y LAG-3 que están presentes en las superficies de los linfocitos infiltrantes de tumores tolerantes y agotados, y de ese modo alterar la capacidad de dichas moléculas de la superficie celular para unirse a sus ligandos del receptor. Como tales, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención actúan para bloquear la inhibición del sistema inmunitario mediada por PD-1 y LAG-3 y, por lo tanto, promover la activación continuada del sistema inmunitario. Este atributo permite que tales diacuerpos biespecíficos tengan utilidad en el tratamiento del cáncer y enfermedades y afecciones asociadas a patógenos. La invención se dirige a tales diacuerpos y a métodos para su uso.

Breve descripción de las figuras:

La Figura 1 muestra una representación esquemática de los dominios de un DART® básico.

La Figura 2 muestra una representación esquemática de los dominios de un DART® que porta un Fc.

La figura 3 muestra una representación esquemática de los dominios de un Fc-DART®.

La Figura 4 muestra una representación esquemática de los Dominios de un diacuerpo tetravalente biespecífico para PD-1 x LAG-3 preferido de la presente invención. Cuatro cadenas polipeptídicas, dos de las cuales tienen los dominios de las cadenas polipeptídicas 1 y 3, y dos de las cuales tienen los dominios de las cadenas polipeptídicas 2 y 4, forman un complejo para formar el diacuerpo. Los enlaces disulfuro (mostrados como líneas de rayas) unen covalentemente las cadenas polipeptídicas 1 y 2, las cadenas polipeptídicas 1 y 3 y las cadenas polipeptídicas 3 y 4. Los dominios variables de cadena ligera y los dominios variables de cadena pesada de la misma cadena polipeptídica se dirigen a diferentes epítopos (ya sea PD-1 o LAG-3), de modo que el diacuerpo resultante tiene dos dominios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos contra PD-1 y dos dominios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos para LAG-3.

La Figura 5 muestra un diagrama del protocolo para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-PD-1 y anti-LAG-3 para potenciar la proliferación de células T.

La Figura 6 muestra que la adición del mAb 1 contra PD-1 (5C4; BMS-936558), mAb 2 contra PD-1 (MK-3475; Merck, lambrolizumab) y mAb 3 contra PD-1 (EH12.2H7; Dana Farber) en el inicio del ensayo alo-MLR, indujo una fuerte respuesta de proliferación de células T en comparación con el anticuerpo de control de isotipo IgG1. También se muestran las respuestas proliferativas obtenidas con mAb 4 contra PD-1 (CT-011; CureTech, BAT-1), un mAb anti-CTLA y mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS). Las células respondedoras (R) son células pan T; las células estimuladoras (S) son células dendríticas maduras (mDC).

La Figura 7 muestra los resultados de una evaluación de mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS), para el potencial proliferativo de células T, ya sea solo o en combinación con mAb 1 contra PD1 (5C4; BMS-936558)), mAb 2 contra PD-1 (MK-3475; Merck, lambrolizumab). Las células respondedoras (R) son células pan T; las células estimuladoras (S) son células dendríticas maduras (mDC).

La Figura 8 muestra que LAG-3 humano soluble (shLAG-3), que se une a moléculas HLA-clase II humanas expresadas tanto en APC como en células T CD4, indujo una respuesta proliferativa robusta en comparación con los pocillos de control con el isotipo IgG o células respondedoras (R) (células pan T) más estimuladoras (S) (células dendríticas maduras (mDC).

Las Figuras 9A-9B muestran que los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención indujeron potentes respuestas proliferativas de células T cuando se compararon con mAb anti-PD-1 (5C4) o mAb anti-LAG-3 (25F7). La Figura 9a muestra las respuestas proliferativas de células T obtenidas con el uso de los diacuerpos tetravalentes biespecíficos para PD-1 x LAG-3 preferidos de la presente invención (PD-1 x LAG-Fc-DART®-1 y PD-1 x LAG-Fc-DART®-2), mAb 1 contra PD-1 (5C4; BMS-936558)), mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS), LAG-3 humano soluble (ShLAG-3), una IgG de control, células respondedoras estimuladoras (células pan T y células dendríticas maduras; R S) y células estimuladoras (células dendríticas maduras; S). La Figura 9B muestra los mismos datos para PD-1 x LAG-Fc-DART®-1 y PD-1 x LAG-Fc-DART®-2, mAb 1 contra PD-1 (5C4; BMS-936558)), mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS) y mAb 1 contra PD-1 (5C4; BMS-936558)) mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS), con el uso de una escala diferente del eje y.

Resumen de la invención:

La presente invención se dirige a diacuerpos biespecíficos que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas y que poseen al menos un sitio de unión a epítopo que es inmunoespecífico para un epítopo de PD-1 y al menos un sitio de unión a epítopo que es inmunoespecífico para un epítopo de LAG-3 (es decir, un "diacuerpo biespecífico para PD-1 x LAG-3"). Con mayor preferencia, la presente invención se dirige a diacuerpos biespecíficos que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas y que poseen dos sitios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos para uno (o dos) epítopo(s) de PD-1 y dos sitios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos para uno (o dos) epítopo(s) de LAG-3 (es decir, un "diacuerpo tetravalente biespecífico para PD-1 x LAG-3"). La presente invención se dirige además a tales diacuerpos que comprenden adicionalmente un dominio Fc de inmunoglobulina ("diacuerpos Fc biespecíficos" y "diacuerpos Fc biespecíficos, tetravalentes"). Los diacuerpos de la presente invención pueden unirse simultáneamente a PD-1 y LAG-3, particularmente cuando tales moléculas se disponen en las superficies de células humanas. La invención se dirige a composiciones farmacéuticas que contienen tales diacuerpos y a métodos que implican el uso de tales diacuerpos en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades y afecciones.

En detalle, la invención proporciona un diacuerpo Fc biespecífico que puede unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de PD-1 y a un epítopo de LAG-3, en donde el diacuerpo comprende cuatro cadenas polipeptídicas, cada una con un extremo amino terminal y un extremo carboxilo terminal, y en donde:

(A) la primera y segunda cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente entre sí, la primera y tercera cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente entre sí, y la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente entre sí;

(B) cada una de la primera y tercera cadenas polipeptídicas del diacuerpo comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, un dominio promotor de heterodímero y un dominio CH2-CH3, en donde los dominios variables de cadena ligera y los dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3; y

(C) la segunda y la cuarta cadenas polipeptídicas del diacuerpo comprenden cada una, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, y un dominio promotor de heterodímero, en donde los dominios variables de cadena ligera y los dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3;

y en donde:

(I)

(1) el dominio variable de cadena ligera de la primera cadena polipeptídica y el dominio variable de cadena pesada de la segunda cadena polipeptídica se asocian para formar un primer sitio de unión a epítopo y el dominio variable de cadena pesada de la primera cadena polipeptídica y el dominio variable de cadena ligera de la segunda cadena polipeptídica se asocian para formar un segundo sitio de unión a epítopo; y

(2) el dominio variable de cadena ligera de la tercera cadena polipeptídica y el dominio variable de cadena pesada de la cuarta cadena polipeptídica se asocian para formar un tercer sitio de unión a epítopo y el dominio variable de cadena pesada de la tercera cadena polipeptídica y el dominio variable de cadena ligera de la cuarta cadena polipeptídica se asocian para formar un cuarto sitio de unión a epítopo;

en donde dos de los sitios de unión a epítopo formados pueden unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de PD-1 y dos de los sitios de unión a epítopo formados pueden unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de LAG-3;

II. los Dominios Promotores de Heterodímeros de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas difieren y tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17; y

III. los dominios CH2-CH3 de la primera y la tercera cadenas polipeptídicas se asocian para formar un dominio Fc.

La invención se refiere, además, a la modalidad de dicho diacuerpo Fc biespecífico en donde los dominios CH2-CH3 de la primera y la tercera cadenas polipeptídicas tienen cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. La invención se refiere, además, a la modalidad de dichos diacuerpos Fc biespecíficos en donde el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y en donde el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

La invención se refiere, además, a la modalidad de dichos diacuerpos Fc biespecíficos en donde el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y en donde el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

La invención se refiere, además, a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de cualquiera de los diacuerpos Fc indicados anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere, además, a la modalidad de dicha composición farmacéutica en donde la cantidad eficaz del diacuerpo Fc biespecífico es una cantidad eficaz para tratar el cáncer en un individuo receptor que necesita dicho tratamiento.

La invención se refiere, además, a la modalidad de tales composiciones farmacéuticas en donde el cáncer es un cáncer de glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma renal de células cromófobas, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma fibroso cutáneo benigno, un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ósea, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de vías biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un carcinoma de tiroides papilar, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor de la vaina de nervios periféricos, un feocromocitoma, un tumor hipofisario, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico poco común, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomiosarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejido blando, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer metastásico de tiroides o un cáncer de útero.

La invención se refiere, además, a la modalidad de tales composiciones farmacéuticas en donde la cantidad eficaz del diacuerpo Fc biespecífico es una cantidad eficaz para tratar una enfermedad asociada con la presencia de un patógeno en un individuo receptor que necesita dicho tratamiento.

La invención se refiere, además, a la modalidad de dicha composición farmacéutica en donde el patógeno es una bacteria, un hongo o un virus.

Descripción detallada de la invención:

La presente invención se dirige a diacuerpos biespecíficos que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas y que poseen al menos un sitio de unión a epítopo que es inmunoespecífico para un epítopo de PD-1 y al menos un sitio de unión a epítopo que es inmunoespecífico para un epítopo de LAG-3 (es decir, un "diacuerpo biespecífico para PD-1 x LAG-3"). Con mayor preferencia, la presente invención se dirige a diacuerpos biespecíficos que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas y que poseen dos sitios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos para uno (o dos) epítopo(s) de PD-1 y dos sitios de unión a epítopo que son inmunoespecíficos para uno (o dos) epítopo(s) de LAG-3 (es decir, un "diacuerpo tetravalente biespecífico para PD-1 x LAG-3"). La presente invención se dirige además a tales diacuerpos que comprenden adicionalmente un dominio Fc de inmunoglobulina ("diacuerpos Fc biespecíficos" y "diacuerpos Fc biespecíficos, tetravalentes"). Los diacuerpos de la presente invención pueden unirse simultáneamente a PD-1 y LAG-3, particularmente cuando tales moléculas se disponen en las superficies de células humanas. La invención se dirige a composiciones farmacéuticas que contienen tales diacuerpos y a métodos que implican el uso de tales diacuerpos en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades y afecciones.

Los diacuerpos biespecíficos de la presente invención pueden unirse simultáneamente a PD-1 y LAG-3, particularmente cuando tales moléculas se disponen en las superficies de las células humanas. La invención se dirige a composiciones farmacéuticas que contienen tales diacuerpos y a métodos que implican el uso de tales diacuerpos en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades y afecciones. En particular, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención comprenden cadenas polipeptídicas que forman complejos por unión covalente entre sí.

Como se analizó anteriormente, la activación de las células T requiere dos señales distintas. La primera señal la proporciona el receptor de células T (TCR) expresado en la superficie de una célula T que ha reconocido un antígeno peptídico dentro del contexto de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) expresados en una célula presentadora de antígeno (APC). La segunda señal es proporcionada por la interacción de pares afines de ligandos coestimuladores: B7-1 y B7-2 expresados en APC y sus correspondientes receptores: CD28 y CTLA-4 expresados en células T.

Dentro de este eje receptor-ligando, el acoplamiento de las moléculas coestimuladoras de B7 con el receptor CD28 puede estimular la proliferación de células T y posteriormente inducir la expresión de CTLA-4, un regulador negativo y contrarreceptor de CD28 que compite fuertemente por los ligandos B7-1 y B7-2 para "reducir' la activación de las células T y las respuestas proliferativas. Se ha demostrado que los anticuerpos agonistas que se unen a CD28 inducen la función efectora de las células T y mejoran la generación de inmunidad erradicadora de tumores y son de naturaleza coestimuladora. Por el contrario, los antagonistas que bloquean la participación de CTLA-4 pueden evitar que las células T desactiven su función efectora mientras mantienen una proliferación sostenida que puede conducir a la autoinmunidad.

En paralelo con el eje CTLA-4:B7-1/B7-2, que funciona para activar el sistema inmunitario durante la homeostasis normal y en la fase de sensibilización de una respuesta inmunitaria contra un antígeno, un segundo eje receptorligando funciona para inhibir el sistema inmunitario, y servir así como contrapunto a CTLA-4 durante la fase efectora de una respuesta inmunitaria. Este segundo eje implica la unión del receptor de la proteína de muerte celular programada-1 (PD-1), expresado en la superficie de las células T, a sus ligandos correspondientes: PD-L1 y PD-L2, expresados en células presentadoras de antígeno (APC) y células epiteliales, respectivamente (Chen L. y otros (2013) "Molecular Mechanisms Of T-Cell Co-Stimulation And Co-Inhibition", Nature Reviews Immunology 13(4):227-242). En contraste con los anticuerpos agonistas que se unen a CD28 para estimular las respuestas de las células T, los anticuerpos que se unen a PD-1 o PD-L1 antagonizan o bloquean la participación de PD-1/PD-L1 pueden mantener las respuestas de las células T al prevenir el suministro de una señal negativa hacia la célula T. Esto aumenta o mantiene la proliferación de células T, la citotoxicidad y la secreción de citocinas. Tomados en conjunto, los anticuerpos agonistas, como los anti-CD28, se dirigen a las vías de señales positivas y, por lo tanto, son coestimuladores, mientras que los anticuerpos antagonistas, como los anti-PD-f, se dirigen a las vías de las señales negativas y se denominan inhibidores de puntos de control.

Aunque CTLA-4 y PD-1 representan los inhibidores de puntos de control canónicos, existe una familia creciente de pares de receptor-ligando inmunomoduladores. El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), analizado anteriormente, es otra diana inhibidora de punto de control expresada en las células T que se une a moléculas HLA de clase II expresadas en las APC. LAG-3 se coexpresa con PD-1 en linfocitos infiltrantes de tumores tolerantes y agotados ("TIL") (Matsuzaki, J. y otros (2010) "Tumor-Infiltrating NY-ESO-1-Specific CD8+ T-Cells Are Negatively Regulated by ^lAG-3 and PD-1 in Human Ovarian Cancer", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107 (17): 7875-7880; Okazaki, T. y otros (2011) "PD-1 and LAG-3 inhibitor Coreceptors Act Synergistically To Prevent Autoimmunity In Mice", J. Exp. Med. 208(2):395-407), y se ha informado de la expresión de LAG-3 en células T reguladoras que implican un papel tanto en la inmunología tumoral como en la autoinmunidad. Los modelos animales han demostrado que un anti-LAG-3 induce una potente inmunidad que erradica tumores, suficiente para ralentizar el crecimiento tumoral, y cuando se administra en combinación con mAb anti-PD-1 puede incluso desencadenar una regresión tumoral completa (Woo, S.R. y otros (2012) "Immune Inhibitory Molecules LAG-3 And PD-1 Synergistically Regulate T-Cell Function To Promote Tumoral Immune Escape", Cancer Res. 72(4):917-927). Las terapias de combinación que implican mAb anti-LAG-3 BMS-986016 se encuentran actualmente en investigación clínica en fase temprana, ya sea solo o en combinación con mAb anti-PD-1 (nivolumab/BMS-936558) (ver, Creelan, B.C. (2014) "Update on Immune Checkpoint Inhibitors in Lung Cancer", Cancer Control 21(1):80-89).

Los diacuerpos biespecíficos de la presente invención pueden unirse a las moléculas de la superficie celular PD-1 y LAG-3 que están presentes en las superficies de linfocitos infiltrantes de tumores tolerantes y agotados, y de ese modo deteriorar la capacidad de tales moléculas de la superficie celular para unirse a sus ligandos de receptores.

Como tales, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención pueden atenuar la inhibición del sistema inmunitario mediada por PD-1 y LAG-3 y promover la activación continua del sistema inmunitario.

I. Técnicas generales y definiciones generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tales como MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Tercera Edición (Sambrook y otros, Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, Nueva York, NY; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE (Mather, J.P. y Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, Nueva York, NY; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. y otros, Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) Nueva York, NY; WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. y otros, Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, Nueva York, NY; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. y otros, Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. y otros, Eds., 1987) Greene Pub. Associates, Nueva York, NY; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. y otros, Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, J.E. y otros, eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. y otros 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; a Nt IBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, Nueva York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. y otros, Eds., 2000) Oxford University Press, USA, Nueva York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. y otros, Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; THE ANTIBODIES (Zanetti, M. y otros, Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); y DEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION, DeVita, V. y otros, Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA.

Como se usa en este documento, los "anticuerpos" son moléculas de inmunoglobulina que pueden unirse específicamente a una diana, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en este documento, el término abarca no solo anticuerpos monoclonales o policlonales intactos, sino también mutantes de estos, variantes naturales, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida. Los anticuerpos de origen natural típicamente comprenden dos copias de una cadena polipeptídica "pesada" ("H") y dos copias de una cadena polipeptídica "ligera" ("L"). Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera ("VL") y una región constante de cadena ligera ("CL"). Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada ("VH") y una región constante de cadena pesada, generalmente compuesta por tres dominios (CH1, CH2 y CH3). Los dominios CH2 y CH3 de los polipéptidos de la cadena pesada interactúan entre sí para formar una región Fc que puede unirse a los receptores Fc presentes en las superficies de las células del sistema inmunitario.

La capacidad de un anticuerpo intacto no modificado (por ejemplo, una IgG) para unirse a un epítopo de un antígeno depende de la presencia de dominios variables en las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina (es decir, los dominios VL y VH, respectivamente). La interacción de una cadena ligera de un anticuerpo y una cadena pesada de un anticuerpo y, en particular, la interacción de sus dominios VL y VH forma uno de los sitios de unión al epítopo del anticuerpo. Por el contrario, un fragmento "scFv" de un anticuerpo comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una única cadena polipeptídica en donde los dominios están separados por un enlazador flexible de longitud suficiente para permitir el autoensamblaje de los dos dominios en un sitio de unión a epítopo funcional.

Cuando el autoensamblaje de los dominios VL y VH se vuelve imposible debido a un enlazador de longitud insuficiente (menos de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos), dos de las construcciones scFv interactúan entre sí para formar un "diacuerpo", que es una molécula bivalente en la que el VL de una cadena se asocia con el VH de la otra (revisado en Marvin y otros (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies", Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).

Además de sus usos conocidos en el diagnóstico, se ha demostrado que los anticuerpos son útiles como agentes terapéuticos. Las últimas décadas han visto un resurgimiento del interés en el potencial terapéutico de los anticuerpos, y los anticuerpos se han convertido en una de las clases principales de fármacos derivados de la biotecnología (Chan, C.E. y otros (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases", Singapore Med. J. 50(7):663-666). Cerca de 200 fármacos basados en anticuerpos han sido aprobados para el uso o están en desarrollo.

El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea en donde el anticuerpo monoclonal está compuesto de aminoácidos (de origen natural y no natural) que están implicados en la unión selectiva de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. El término anticuerpo monoclonal abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de estos (como Fab, Fab', F(ab^')2 Fv), monocatenarios (scFv), mutantes de estos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un antígeno. No se pretende que esté limitado con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en que se produce (por ejemplo, por hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). El término incluye inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos, etc. descritos anteriormente bajo la definición de "anticuerpo". En la técnica se conocen métodos para fabricar anticuerpos monoclonales. Un método que puede emplearse es el método de Kohler, G. y otros (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity", Nature 256:495-497 o una modificación de este.

Típicamente, los anticuerpos monoclonales se desarrollan en ratones, ratas o conejos. Los anticuerpos se producen inmunizando a un animal con una cantidad inmunogénica de células, extractos celulares o preparaciones de proteínas que contienen el epítopo deseado. El inmunógeno puede ser, pero no se limita a, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o tejido. Las células utilizadas para la inmunización se pueden cultivar durante un período de tiempo (por ejemplo, al menos 24 horas) antes de su uso como inmunógeno. Las células se pueden usar como inmunógenos por sí mismas o en combinación con un adyuvante no desnaturalizante, como Ribi. En general, las células deben mantenerse intactas y preferentemente viables cuando se usan como inmunógenos. Las células intactas pueden permitir que el animal inmunizado detecte mejor los antígenos que las células rotas. El uso de adyuvantes desnaturalizantes o agresivos, por ejemplo, el adyuvante de Freud, puede romper las células y, por lo tanto, se desaconseja. El inmunógeno se puede administrar múltiples veces a intervalos periódicos tales como dos veces por semana o semanalmente, o se puede administrar de tal manera que se mantenga la viabilidad en el animal (por ejemplo, en un tejido recombinante). Alternativamente, los anticuerpos monoclonales existentes y cualquier otro anticuerpo equivalente que sea inmunoespecífico para un epítopo patogénico deseado se pueden secuenciar y producir de manera recombinante por cualquier medio conocido en la técnica. En una modalidad, dicho anticuerpo se secuencia y la secuencia polinucleotídica se clona después en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede después expandirse y congelarse para uso futuro. La secuencia de polinucleótidos de tales anticuerpos puede usarse para manipulación genética para generar las moléculas biespecíficas de la invención; así como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo caninizado, para mejorar la afinidad u otras características del anticuerpo. El principio general en la humanización de un anticuerpo implica retener la secuencia básica de la porción de unión al epítopo del anticuerpo, mientras se intercambia el resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpos humanas. Hay cuatro pasos generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estos son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida (2) diseñar el anticuerpo humanizado o el anticuerpo caninizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el proceso de humanización o canonización (3) las metodologías/técnicas de humanización o caninización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm.

4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; y 6,331,415.

Los anticuerpos naturales pueden unirse a una sola especie de epítopo (es decir, son monoespecíficos), aunque pueden unirse a múltiples copias de esa especie (es decir, que exhiben bivalencia o multivalencia). Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos biespecíficos recombinantes (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT núm. WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968), la mayoría de los cuales utilizan péptidos enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a otra proteína de unión (por ejemplo, scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv. Por lo general, estos enfoques implican compromisos y compensaciones. Por ejemplo, las publicaciones PCT números WO 2013/174873, WO 2011/133886 y WO 2010/136172 describen que el uso de enlazadores puede causar problemas en entornos terapéuticos y enseña un anticuerpo triespecífico en el que los dominios CL y CH1 se cambian de sus respectivas posiciones naturales y los Dominios VL y Vh se han diversificado (documentos WO 2008/027236; WO 2010/108127) para permitirles unirse a más de un antígeno. Por tanto, las moléculas descritas en estos documentos intercambian especificidad de unión por la capacidad de unirse a especies antigénicas adicionales. Las publicaciones PCT núm. WO 2013/163427 y w O 2013/119903 describen la modificación del dominio CH2 para que contenga un aducto de proteína de fusión que comprende un dominio de unión. El documento señala que el dominio CH2 probablemente solo juega un papel mínimo en la mediación de la función efectora. Las publicaciones PCT números WO 2010/028797, WO2010028796 y WO 2010/028795 describen anticuerpos recombinantes cuyas regiones Fc se han reemplazado con dominios VL y VH adicionales, para formar moléculas de unión trivalentes. Las publicaciones PCT núm. WO 2003/025018 y WO2003012069 describen diacuerpos recombinantes cuyas cadenas individuales contienen dominios scFv. Las publicaciones PCT núm. WO 2013/006544 describen moléculas Fab multivalentes que se sintetizan como una única cadena polipeptídica y después se someten a proteólisis para producir estructuras heterodiméricas. Por tanto, las moléculas descritas en estos documentos intercambian toda o parte de la capacidad de mediar la función efectora por la capacidad de unirse a especies antigénicas adicionales. Las publicaciones PCT núm. WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 y WO 1991/003493 describen la adición de dominios de unión adicionales o grupos funcionales a un anticuerpo o una porción de anticuerpo (por ejemplo, adicionar un diacuerpo a la cadena ligera del anticuerpo, o adicionar dominios VL y VH adicionales a las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, o adicionar una proteína de fusión heteróloga o encadenar múltiples dominios Fab entre sí). Por tanto, las moléculas descritas en estos documentos intercambian la estructura del anticuerpo natural por la capacidad de unirse a especies antigénicas adicionales.

La técnica también ha señalado la capacidad de producir diacuerpos que difieren de los anticuerpos naturales por ser capaces de unirse a dos o más especies de epítopos diferentes (es decir, exhibir biespecificidad o multiespecificidad además de bivalencia o multivalencia) (ver, por ejemplo, Holliger y otros (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; documentos US 2004/0058400 (Hollinger y otros); US 2004/0220388 (Mertens y otros); Alt y otros (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. y otros (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity", J. Biol. Chem.

280(20):19665-19672; documento WO 02/02781 (Mertens y otros); Olafsen, T. y otros (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications", Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. y otros (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange", Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano y otros (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain", Resumen 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. y otros (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. y otros (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy", Cancer Res. 69(12):4941-4944).

El diseño de un diacuerpo se basa en los fragmentos de la región variable de cadena única (scFv). Dichas moléculas se preparan mediante la unión de regiones variables de cadena ligera y/o pesada con el uso de un péptido de enlace corto. Bird y otros (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins", Science 242: 423-426) describen un ejemplo de péptidos enlazadores que forman un puente de aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxilo terminal de una región variable y el extremo amino terminal de la otra región variable. Se han diseñado y utilizado enlazadores de otras secuencias (Bird y otros (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins”, Science 242: 423-426). A su vez, los enlazadores pueden modificarse para funciones adicionales, como la fijación de fármacos o la fijación a soportes sólidos. Las variantes monocatenarias pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv, un plásmido adecuado que contenga un polinucleótido que codifique el scFv se puede introducir en una célula huésped adecuada, ya sea eucariota, como células de levadura, plantas, insectos o mamíferos, o procariotas, como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés se pueden preparar mediante manipulaciones rutinarias tales como ligación de polinucleótidos. El scFv resultante se puede aislar con el uso de técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.

La patente de los Estados Unidos núm. 7,585,952 y la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2010­ 0173978 se refieren a moléculas scFv que son inmunoespecíficas para ErbB2. Se han descrito los anticuerpos biespecíficos acopladores de células T ("BiTE"), un tipo de molécula scFv (documento WO 05/061547; Baeuerle, P y otros (2008) "BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T-Cells", Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, y otros 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T-Cell-Engaging Antibody", Science 321: 974-977). Dichas moléculas están compuestas por una única molécula de cadena polipeptídica que tiene dos dominios de unión a antígeno, uno de los cuales se une inmunoespecíficamente a un epítopo de CD3 y el segundo se une inmunoespecíficamente a un antígeno presente en la superficie de una célula diana.

La provisión de diacuerpos no monoespecíficos proporciona una ventaja significativa: la capacidad de coligar y colocalizar diferentes epítopos. Por tanto, los diacuerpos bivalentes tienen una amplia gama de aplicaciones, incluida la terapia y el inmunodiagnóstico. La bivalencia permite una gran flexibilidad en el diseño y la ingeniería del diacuerpo en diversas aplicaciones, lo que proporciona una mayor avidez por los antígenos multiméricos, la reticulación de diferentes antígenos y el direccionamiento dirigido a tipos celulares específicos que dependen de la presencia de ambos antígenos diana. Debido a su mayor valencia, bajas tasas de disociación y rápida eliminación de la circulación (para diacuerpos de tamaño pequeño, de ~ 50 kDa o menos), las moléculas de diacuerpo conocidas en la técnica también han mostrado un uso particular en el campo de la formación de imágenes de tumores (Fitzgerald y otros (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris", Protein Eng. 10:1221).

La bivalencia de los diacuerpos ha llevado a su uso para coligar células diferentes, por ejemplo, para entrecruzar células T citotóxicas con células tumorales (Staerz y otros (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T-Cells", Nature 314:628-631, y Holliger y otros (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody", Protein Eng. 9:299-305). Así, por ejemplo, los dominios de unión a epítopo del diacuerpo pueden dirigirse a un determinante de la superficie de cualquier célula efectora inmunitaria como CD3, CD16, CD32 o CD64, que se expresan en linfocitos T, células asesinas naturales (NK) u otras células mononucleares. En muchos estudios, también se descubrió que la unión de diacuerpos a determinantes de células efectoras, por ejemplo, receptores F^cy (FcyR), activa la célula efectora (Holliger y otros (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody", Protein Eng. 9:299-305; Holliger y otros (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti­ CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins", Cancer Res. 59:2909-2916; documentos WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, la activación de las células efectoras se desencadena por la unión de un anticuerpo unido a un antígeno con una célula efectora a través de la interacción Fc-FcyR; por tanto, a este respecto, las moléculas de diacuerpo pueden exhibir una funcionalidad similar a Ig independientemente de si comprenden un Dominio Fc (por ejemplo, como se analiza en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o ejemplificado aquí (por ejemplo, ensayo de ADCC)). Al reticular las células tumorales y efectoras, el diacuerpo no solo lleva la célula efectora a una proximidad con las células tumorales, sino que conduce a la destrucción efectiva del tumor (véase, por ejemplo, Cao y otros (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics", Adv.Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).

Sin embargo, las ventajas anteriores tienen un costo notable. La formación de tales diacuerpos no monoespecíficos requiere el ensamblaje exitoso de dos o más polipéptidos distintos y diferentes (es decir, tal formación requiere que los diacuerpos se formen mediante la heterodimerización de diferentes especies de cadenas polipeptídicas). Este hecho contrasta con los diacuerpos monoespecíficos, que se forman mediante la homodimerización de cadenas polipeptídicas idénticas. Porque deben proporcionarse al menos dos polipéptidos diferentes (es decir, dos especies de polipéptidos) para formar un diacuerpo no monoespecífico, y porque la homodimerización de dichos polipéptidos conduce a moléculas inactivas (Takemura, S. y otros (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588), la producción de tales polipéptidos debe lograrse de manera que se evite la unión covalente entre polipéptidos de la misma especie (Takemura, S. y otros (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588).

Por lo tanto, la técnica ha enseñado la asociación no covalente de dichos polipéptidos (véase, por ejemplo, Olafsen y otros (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications", Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano y otros (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain", Resumen 3P-683, J. Biochem.

76(8):992; Takemura, S. y otros (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. y otros (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity", J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672). Sin embargo, la técnica ha reconocido que los diacuerpos biespecíficos compuestos de polipéptidos asociados no covalentemente son inestables y se disocian fácilmente en monómeros no funcionales (ver, por ejemplo, Lu, D. y otros (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity", J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).

Frente a este desafío, la técnica ha tenido éxito en el desarrollo de diacuerpos heterodiméricos no monoespecíficos, estables, unidos covalentemente, denominados DART® (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de los Estados Unidos núm. 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; Publicación de patente Europea núm. EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 y Publicaciones PCT núm. WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; y Moore, P.A. y otros (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma", Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. y otros (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold", Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. y otros (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion", J. Mol. Biol. 399(3):436-449). Dichos diacuerpos comprenden dos o más polipéptidos que forman complejos de manera covalente e implican modificar uno o más residuos de cisteína en cada una de las especies polipeptídicas empleadas. Por ejemplo, se ha demostrado que la adición de un residuo de cisteína al extremo c-terminal de tales construcciones permite el enlace disulfuro entre las cadenas polipeptídicas, lo que estabiliza el heterodímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente.

Cada uno de los dos polipéptidos del DART® más simple comprende tres Dominios (Figura 1). El primer polipéptido comprende: (i) un dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1), (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) y (iii) un tercer dominio que sirve para promover la heterodimerización con el segundo polipéptido y para unir covalentemente el primer polipéptido al segundo polipéptido del diacuerpo. El segundo polipéptido contiene un primer dominio complementario (un dominio VL2), un segundo dominio complementario (un dominio VH1) y un tercer dominio que forma complejos con el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica para promover la heterodimerización y la unión covalente con la primera cadena polipeptídica. Estas moléculas son estables, potentes y tienen la capacidad de unirse simultáneamente a dos o más antígenos.

En una modalidad, los terceros dominios del primer y segundo polipéptidos contienen cada uno un residuo de cisteína, que sirve para unir los polipéptidos mediante un enlace disulfuro. El tercer dominio de uno o ambos polipéptidos puede poseer adicionalmente la secuencia de un dominio CH2-CH3, de manera que la formación de complejos de los polipéptidos del diacuerpo forma un dominio Fc que puede unirse al receptor Fc de las células (como los linfocitos B, células dendríticas, células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos) (Figura 2). Se han descrito muchas variaciones de tales moléculas (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de los Estados Unidos núm. 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; publicaciones de patente europea núm. EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 y publicaciones ^pC^t núm. WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538). Estos DART® que portan Fc pueden comprender tres cadenas polipeptídicas. El primer polipéptido de dicho diacuerpo contiene tres dominios: (i) un dominio que contiene VL1, (ii) un dominio que contiene VH2 y (iii) un dominio que contiene una secuencia CH2-CH3. El segundo polipéptido de tal DART® contiene: (i) un dominio que contiene v L2, (ii) un dominio que contiene VH1 y (iii) un dominio que promueve la heterodimerización y la unión covalente con la primera cadena polipeptídica del diacuerpo. El tercer polipéptido de tal DART® comprende una secuencia CH2-CH3. Por tanto, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas de dicho complejo DART® se juntan para formar un sitio de unión VL1/VH1 que puede unirse al epítopo, así como un sitio de unión VL2/VH2 que puede unirse al segundo epítopo. El primer y segundo polipéptidos están unidos entre sí a través de un enlace disulfuro que involucra residuos de cisteína en sus respectivos terceros dominios. En particular, la primera y la tercera cadenas polipeptídicas forman complejos entre sí para formar un dominio Fc que se estabiliza mediante un enlace disulfuro. Dichos diacuerpos tienen una potencia mejorada. Dichos DART® que portan Fc pueden tener dos orientaciones (Tabla 1):

También se ha descrito un DART® aún más complejo, denominado Fc-DART® (Figura 3) (documento WO 2012/018687). Los Fc-DART® tienen cuatro cadenas polipeptídicas. La primera y tercera cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo contienen tres dominios: (i) un dominio que contiene VL1, (ii) un dominio que contiene v H2 y (iii) un dominio que contiene una secuencia CH2-CH3. El segundo y cuarto polipéptido del Fc-DART® contienen: (i) un dominio que contiene VL2, (ii) un dominio que contiene VH1 y (iii) un dominio que promueve la heterodimerización y la unión covalente con la primera cadena polipeptídica del Fc-DART™. Los dominios VL y/o VH de la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas, y los dominios VL y/o VH de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas pueden ser iguales o diferentes para permitir una unión tetravalente que sea monoespecífica, biespecífica o tetraespecífica (Tabla 2).

A lo largo de esta solicitud, la numeración de los residuos de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos está de acuerdo con el índice EU como en Kabat y otros (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Publicación de los Institutos Nacionales de Salud núm. 91-3242.

Los términos "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud, pero especialmente longitudes superiores a 3, 5, 10, 15, 20 o 25 residuos de aminoácidos. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos de esta invención pueden presentarse como cadenas simples o como cadenas en complejos.

Los términos "diacuerpo" y "DART™" se han analizado anteriormente. Un DART® es un tipo de diacuerpo que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas que preferentemente forman complejos entre sí a través de una interacción covalente para formar al menos dos sitios de unión a epítopo, que pueden reconocer el mismo o diferentes epítopos. Dos de las cadenas polipeptídicas de un diacuerpo o DART™ comprenden, cada una, una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, pero estas regiones no interactúan para formar un sitio de unión a epítopo (es decir, no son mutuamente "complementarias"). Más bien, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de una (por ejemplo, la primera) de las cadenas polipeptídicas del diacuerpo o DART™ interactúa con la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica diferente (por ejemplo, la segunda) del diacuerpo o DART™ para formar un sitio de unión a epítopo. De manera similar, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de una (por ejemplo, La primera) de las cadenas polipeptídicas del diacuerpo o DART™ interactúa con la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica diferente (por ejemplo, la segunda) del diacuerpo o DART™ para formar un sitio de unión a epítopo. Las moléculas de DART™ se describen en las publicaciones de patente de Estados Unidos núm. 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; publicaciones de patente europea núm. EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 y publicaciones PCT núm. WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665, WO 2008/157379 y Moore, P.A. y otros (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma", Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. y otros (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold", Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; y Johnson, S. y otros (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion", J. Mol. Biol. 399(3):436-449.

Como se usa en este documento, los términos "asociación" o "asociar" con respecto a polipéptidos (por ejemplo, un polipéptido de un diacuerpo con respecto a otro, una cadena ligera de inmunoglobulina con respecto a una cadena pesada de inmunoglobulina, un dominio CH2-CH3 con respecto a otro dominio CH2-CH3, etc.) debe indicar una combinación no covalente de los polipéptidos. Los términos "complejos" o "formación de complejos" están destinados a indicar una combinación covalente de los polipéptidos.

Como se usa en el presente documento, se dice que los diacuerpos de la presente invención median la "unión coordinada" si sus dominios de unión a epítopo pueden unirse simultáneamente a sus respectivos epítopos reconocidos. Tal unión puede ser simultánea.

Los dominios de unión a epítopos de los diacuerpos de la presente invención se unen a sus epítopos reconocidos de una manera "inmunoespecífica". Como se usa en este documento, se dice que un anticuerpo, diacuerpo u otra molécula de unión a epítopo se une "inmunoespecíficamente" a una región de otra molécula (es decir, un epítopo) si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con ese epítopo en relación con epítopos alternativos. Por ejemplo, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítopo viral es un anticuerpo que se une a este epítopo viral con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une inmunoespecíficamente a otros epítopos virales o epítopos no virales. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une inmunoespecíficamente a una primera diana puede o no unirse específica o preferencialmente a una segunda diana. Como tal, una "unión específica" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión "específica".

Los diversos dominios de inmunoglobulina de tales moléculas pueden derivar de inmunoglobulinas de cualquier isotipo o alotipo, que incluye, pero sin limitarse a, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En modalidades preferidas, como se analiza a continuación, tales inmunoglobulinas se derivan de inmunoglobulinas IgG. En modalidades específicas, el isotipo de IgG usado es IgG1, sin embargo, se puede emplear IgG de otros isotipos (por ejemplo, IgG2, IgG3 o IgG4 o un alotipo de estos).

II. Diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 preferidos de la presente invención

La presente invención se refiere a diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3. Los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 preferidos de la presente invención poseen fragmentos de unión a epítopo de los anticuerpos que les permiten unirse de manera coordinada a dos epítopos diferentes: un epítopo de PD-1 y un epítopo de LAG-3, para atenuar las actividades inhibidoras de tales moléculas. Como se usa en este documento, dicha atenuación se refiere a una disminución de al menos 20 %, una disminución de al menos 50 %, una disminución de al menos 80 % o una disminución de al menos 90 % en la actividad inhibidora detectable de PD-1 y/o LAG-3, o la eliminación completa de la actividad inhibidora detectable de PD-1 y/o LAG-3.

A. Capacidades de unión anti-PD-1

Se conocen anticuerpos que son inmunoespecíficos para PD-1 (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm. 8,008,449; 8,552,154; Publicaciones de patente PCT WO 2012/135408; WO 2012/145549; y WO 2013/014668). Pueden prepararse anticuerpos adicionales deseados mediante el aislamiento de hibridomas secretores de anticuerpos inducidos con el uso de PD-1 o un fragmento peptídico de este. PD-1 humano (que incluye una secuencia señal de 20 residuos de aminoácidos (que se muestra subrayada) y la proteína madura de 268 residuos de aminoácidos) tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1):

MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWEPPTFSPA LLVVTEGDNA

TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL

PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE

VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI

GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT

IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL

Los anticuerpos anti-PD-1 preferidos incluyen: mAb 1 contra PD-1 (5C4; BMS-936558)), mAb 2 contra PD-1 (MK-3475; Merck, lambrolizumab), mAb 3 contra PD-1 (EH12.2H7; Dana Farber) y mAb 4 contra PD-1 (CT-011; CureTech, BAT-1).

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del mAb 1 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) (las CDR se muestran subrayadas):

QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKñSGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV

IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATMD

DYWGQGTLVT VSS

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del mAb 1 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) (las CDR se muestran subrayadas):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ

GTKVEIK

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de mAb 2 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) (las CDR se muestran subrayadas):

QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG

IMPSMGGTMF NEKFKMRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQEDD TAVYYCARRD

YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del mAb 2 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) (las CDR se muestran subrayadas):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL

LIYLASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL

TFGGGTKVEIK

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de mAb 3 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) (las CDR se muestran subrayadas):

QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSW1HWVKQR PGQGLEWIGY

IYPSTGFTEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARWR

DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del mAb 3 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) (las CDR se muestran subrayadas):

DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISCRASQSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL LIKFGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLN1H PVEEEDTATY YCQHSWEIPY TFGGGTKLEI K

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de mAb 4 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) (las CDR se muestran subrayadas):

QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW

INTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG

YDALDYWGQG TLVTVSS

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del mAb 4 contra PD-1 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) (las CDR se muestran subrayadas):

EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT

SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG

TKLEIK

B. Capacidades de unión anti-LAG-3

También se conocen anticuerpos que son inmunoespecíficos para LAG-3 (ver, por ejemplo, documento WO 2014/008218). Pueden prepararse anticuerpos adicionales deseados aislando hibridomas que secretan anticuerpos inducidos con el uso de LAG-3 o un fragmento peptídico de este. LAG-3 humano (que incluye una secuencia señal de 28 residuos de aminoácidos (que se muestra subrayada) y la proteína madura de 497 residuos de aminoácidos) tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10):

MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL

QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT

VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DF3LWLRPAR RADAGEYRAA

VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV

HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN

VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP

PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCH1HLQEQ QLNATVTLAI

ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VT PV3GQERF VW3SLDTPSQ RSFSGPWLEA

QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL

LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE

ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL

Un anticuerpo anti-LAG-3 preferido es mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS). La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del mAb 1 contra LAG-3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) (las CDR se muestran subrayadas):

QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE

INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS

DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del mAb 1 contra LAG-3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) (las CDR se muestran subrayadas):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ

GTNLEIK

Como se usa en este documento, el término "fragmento de unión a epítopo de un anticuerpo" significa un fragmento de un anticuerpo que puede unirse inmunoespecíficamente a un epítopo. Un fragmento de unión a epítopo puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o los 6 dominios CDR de dicho anticuerpo y, aunque puede unirse inmunoespecíficamente a dicho epítopo, puede exhibir una inmunoespecificidad, afinidad o selectividad hacia dicho epítopo que difiere de la de dicho anticuerpo. Sin embargo, preferentemente, un fragmento de unión a epítopo contendrá los 6 dominios CDR de dicho anticuerpo. Un fragmento de unión a epítopo de un anticuerpo puede ser una sola cadena polipeptídica (por ejemplo, Un scFv) o puede comprender dos o más cadenas polipeptídicas, cada una con un extremo amino terminal y un extremo carboxilo terminal (por ejemplo, un diacuerpo, un fragmento Fab, un fragmento Fab², etc.).

C. Diacuerpos DART® preferidos de la presente invención

1. Consideraciones Generales

Los diacuerpos preferidos de la presente invención son diacuerpos Fc-DART® tetravalentes biespecíficos (Figura 3) que están compuestos por cuatro cadenas polipeptídicas en total. Las cuatro cadenas polipeptídicas comprenden dos polipéptidos que contienen CH2-CH3 (es decir, la "primera" y "tercera" cadenas polipeptídicas del diacuerpo) que forman un complejo entre sí para formar un dominio Fc y dos polipéptidos idénticos que no contienen CH3 (es decir, la "segunda" y "cuarta" cadenas polipeptídicas del diacuerpo), cada una de las cuales forma un complejo con un polipéptido del diacuerpo que contiene CH2-CH3 para formar un dominio de unión a epítopo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3. Así, por ejemplo, la primera cadena polipeptídica contendrá un dominio variable de cadena ligera (VL) anti-PD-1 (o anti-LAG-3) y un dominio variable de cadena pesada (VH) anti-LAG-3 (o anti-PD-1) y formará un complejo con una segunda cadena polipeptídica que posee un dominio VH complementario anti-PD-1 (o anti-LAG-3) y un dominio VL complementario anti-LAG-3 (o anti-PD-1), para formar un primer par de dominios de unión a epítopos PD-1 y LAG-3. De manera similar, la tercera cadena polipeptídica contendrá un dominio variable de cadena ligera (VL) anti-PD-1 (o anti-LAG-3) y un dominio variable de cadena pesada (VH) anti-LAG-3 (o anti-PD-1) y formará un complejo con una cuarta cadena polipeptídica que posee un dominio VH complementario anti-PD-1 (o anti-LAG-3) y un dominio VL complementario anti-LAG-3 (o anti-PD-1), para formar un segundo par de dominios de unión a epítopos PD-1 y LAG-3.

Dado que los dominios variable de cadena ligera y variable de cadena pesada del mismo polipéptido se dirigen hacia diferentes epítopos, no pueden formar complejos entre sí para formar un dominio de unión a epítopo que pueda unirse a PD-1 o LAG-3. Los dominios variables de cadena ligera y variables de cadena pesada del primer polipéptido están preferentemente separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que es suficientemente corto como para prevenir sustancialmente la formación de complejos de estos dominios. Un enlazador ilustrativo tiene la secuencia (SEQ ID NO: 13: GGGSGGGG. Alternativamente, pueden emplearse otros enlazadores de longitud similar (para evitar que los dominios VL y VH de la misma cadena polipeptídica interaccionen entre sí).

Como se muestra en la Figura 4, los diacuerpos Fc-DART® tetravalentes biespecíficos de máxima preferencia de la presente invención son diacuerpos Fc-DARt® que se han modificado para contener dominios promotores de heterodímeros. La inclusión de tales dominios promueve la formación de heterodímeros entre las cadenas polipeptídicas del diacuerpo. La inclusión de tales dominios no es esencial y la presente invención incluye diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 que no poseen tales dominios. Los dominios promotores de heterodímeros preferidos incluyen los dominios "espiral E" (SEQ ID NO: 14): EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK, y los dominios "espiral K" (SEQ ID NO: 15): KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE. Más específicamente, "un par de cadenas polipeptídicas que se desea que formen complejos entre sí se diseñan cada una para contener uno (o más) de dichos dominios promotores de heterodímeros, donde el dominio o los dominios empleados de una cadena polipeptídica son complementarios al dominio o dominios empleados de la otra cadena polipeptídica (por ejemplo, una cadena polipeptídica contendrá un dominio en espiral E y la otra contendrá un dominio en espiral K). Cuando las dos cadenas polipeptídicas se diseñan para contener más de uno de dichos dominios promotores de heterodímeros, pueden tener la misma carga, o con mayor preferencia de carga opuesta.

Particularmente preferidos son los Dominios Promotores de Heterodímeros que comprenden modificaciones de las secuencias de espiral E y espiral K descritas anteriormente para incluir uno o más residuos de cisteína. La presencia de tales residuos de cisteína permite que la espiral presente en una cadena polipeptídica se una covalentemente a una espiral complementaria presente en otra cadena polipeptídica, lo que une así covalentemente las cadenas polipeptídicas entre sí y aumenta la estabilidad del diacuerpo. Ejemplos de dominios promotores de heterodímeros particularmente preferidos incluyen una espiral E modificada que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16): EVAACEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK, en donde un residuo de leucina de la SEQ ID NO: 14 se ha reemplazado por un residuo de cisteína (se muestra subrayado), y una espiral K modificada que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17): KVAACKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE, en donde un residuo de leucina de la SEQ ID NO: 15 se ha reemplazado con un residuo de cisteína (se muestra subrayado).

El dominio variable de cadena pesada del primer polipéptido y el dominio promotor de heterodímero de ese polipéptido están preferentemente separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que contiene 1, 2, 3 o más residuos de cisteína. Un péptido espaciador que contiene cisteína preferido tiene la secuencia SEQ ID NO: 18: GGCGGG. Pueden emplearse otros enlazadores de longitud similar (de manera que incluya un residuo de cisteína que puede unirse covalentemente con un residuo de cisteína de otra cadena polipeptídica).

Preferentemente, el dominio promotor de heterodímero empleado y el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica están separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que contiene cisteína que proporciona una estabilización mejorada al dominio promotor de heterodímero. Un péptido enlazador que contiene cisteína adecuado tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19): DKTHTCPPCP, sin embargo, un enlazador de mayor preferencia tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20): LEPKSADKTHTCPPC. Alternativamente, se pueden emplear otros enlazadores de longitud similar (de manera que incluya un residuo de cisteína que pueda unirse covalentemente con un residuo de cisteína de otra cadena polipeptídica).

La secuencia de aminoácidos de un dominio CH2-CH3 natural es la siguiente (el posicionamiento es como en el índice de EU como en Kabat y otros (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Publicación de los Institutos Nacionales de Salud núm. 91-3242) (SEQ ID NO: 21):

| CH2 ->

PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLPIISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT

230 2 40 250 260 270 280

4-CH2 | C H 3^

KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA K GQPREPQVY

290 300 310 320 330 340

TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK

350 360 370 380 390 400

^C H 3 |

LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

410 420 430 440

Para diacuerpos triespecíficos o tetraespecíficos (es decir, para diacuerpos cuya primera y tercera cadenas polipeptídicas no son idénticas), es conveniente reducir o prevenir que ocurra la homodimerización entre los dominios CH2-CH3 de dos primeras cadenas polipeptídicas o entre los dominios CH2-CH3 de dos terceras cadenas polipeptídicas. Para promover la heterodimerización entre la primera y la tercera cadenas polipeptídicas, el dominio CH2-CH3 de estas cadenas se modifica preferentemente para promover dicha heterodimerización. Por ejemplo, se puede introducir una sustitución de aminoácidos (preferentemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un “botón”, por ejemplo, triptófano) en el dominio CH2 o CH3 de la primera cadena polipeptídica de modo que la interferencia estérica evite interacción con un Dominio mutado de manera similar y obligará al Dominio mutado a emparejarse con un Dominio en el que se ha diseñado una mutación complementaria o de acomodación, es decir, "el ojal" (por ejemplo, una sustitución con glicina). Dichos conjuntos de mutaciones pueden modificarse por ingeniería genética en cualquier par de polipéptidos que comprendan la molécula de diacuerpo y, además, modificarse por ingeniería genética en cualquier parte de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los métodos de ingeniería de proteínas para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización se conocen bien en la técnica, en particular con respecto a la ingeniería de moléculas similares a las inmunoglobulinas, y se incluyen en este documento (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm.

7,695,936 y la publicación de patente 2007/0196363, Ridgway y otros (1996) "'Knobs-Into-Holes1 Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization", Protein Engr. 9:617-621, Atwell y otros (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library", J. Mol. Biol.

270: 26-35, y Xie y otros (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis", J. Immunol. Methods 296:95-101; cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad. Un botón preferido se crea mediante la modificación de un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366W. Un ojal preferido se crea mediante la modificación de un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366S, L368A e Y407V. Para ayudar a purificar los diacuerpos de la presente invención, la cadena polipeptídica que contiene las mutaciones de ojal comprende además una sustitución en la posición 435 (H435R) para eliminar el sitio de unión a la proteína A. Por lo tanto, los homodímeros de polipéptidos que contienen las mutaciones de ojal no se unirán a la proteína A, mientras que los diacuerpos que se forman como resultado de los heterodímeros que contienen botones y ojales conservarán su capacidad para unirse a la proteína A mediante el sitio de unión a la proteína A en la cadena polipeptídica que contiene la mutación de botón.

La invención abarca, además, moléculas que comprenden dominios Fc variantes que comprenden una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a un dominio Fc natural comparable. Las moléculas que comprenden dominios Fc variantes normalmente tienen fenotipos alterados con respecto a moléculas que comprenden dominios Fc naturales El fenotipo variante puede expresarse como alteración de la semivida sérica, alteración de la estabilidad, alteración de la susceptibilidad a enzimas celulares o alteración de la función efectora según se analiza en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófagos. Las modificaciones del dominio Fc identificadas como alteración de la función efectora se conocen en la técnica, incluidas las modificaciones que aumentan la unión a los receptores activadores (por ejemplo, FcyRIIA (CD16A) y reducen la unión a receptores inhibidores (por ejemplo, FcyRIIB (CD32B) (ver, por ejemplo, Staven-hagen, J.B. y otros (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors", Cancer Res. 57(18):8882-8890). Las variantes ilustrativas de dominios Fc de IgG1 humana con unión reducida a CD32B y/o unión aumentada a CD16A contienen las sustituciones F243L, R929P, Y300L, V305I o P296L. Estas sustituciones de aminoácidos pueden estar presentes en un dominio Fc de IgG1 humana en cualquier combinación. En una modalidad, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R929P e Y300L. En otra modalidad, la variante del Dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R929P, Y300L, V305I y P296L. En otra modalidad, la variante del Dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución N297Q, sustituciones L234A y L235A o una sustitución D265A, ya que estas mutaciones anulan la unión a FcR. El dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica de tales moléculas tendrá la secuencia "portadora de botón" (SEQ ID NO: 22):

PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV

DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV

EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

EALHNHYTQK SLSLSPGK

o la secuencia "portadora de ojal" con una sustitución H435R para anular la unión a la proteína A (SEQ ID NO: 23):

PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV

DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV

EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

EALHNRYTQK SLSLSPGK

Como se reconocerá, podría emplearse un dominio CH2-CH3 "portador de ojal" (por ejemplo, SEQ ID NO: 22) en la primera cadena polipeptídica, en cuyo caso, un dominio CH2-CH3 "portador de botón" (por ejemplo, SEQ ID NO: 22) se emplearía en la tercera cadena polipeptídica.

Para los diacuerpos tetravalentes biespecíficos de la presente invención cuyas primera y tercera cadenas polipeptídicas no son diferentes, un dominio CH2-CH3 preferido es un dominio CH2-CH3 modificado que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24):

PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV

DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

EALHNHYTQK SLSLSPG

Por tanto, en resumen, la primera y la tercera cadenas polipeptídicas preferidas de un diacuerpo Fc-DART® tetravalente, biespecífico para PD-1 x LAG-3 preferido de la presente invención tienen secuencias idénticas, y la segunda y cuarta cadenas polipeptídicas de tales diacuerpos Fc-DART® tetravalentes, biespecíficos para PD-1 x LAG-3 preferidos tienen secuencias idénticas, como se muestra en la Tabla 3:

2. Primer ejemplo de diacuerpo Fc-DART® biespecífico para PD-1 x LAG-3 (PD-1 x LAG-3 Fc-DART®-1)

Un primer diacuerpo Fc-DART® tetravalente biespecífico para PD-1 x LAG-3 particularmente preferido de la presente invención ("PD-1 x LAG-3 Fc-DART®-1") tiene una primera y tercera cadenas polipeptídicas de secuencia idéntica. Dicha primera/tercera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ

GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH

WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS

LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAACE KEVAALEKEV

AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLY

ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV

VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP

PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG

SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPG

en donde, los residuos de aminoácidos 1-107 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de mAb 1 contra LAG-3 (SEQ ID NO: 12), los residuos de aminoácidos 108-115 son los residuos de aminoácidos del enlazador GGGSGg Gg (SEQ ID NO: 13), los residuos de aminoácidos 116-228 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del mAb 1 contra PD-1 (SEQ ID NO: 2), los residuos de aminoácidos 229-234 son los residuos de aminoácidos del péptido espaciador que contiene cisteína GGCGGG (SEQ ID NO: 18), los residuos de aminoácidos 235-262 son los residuos de aminoácidos de la espiral E modificada (SEQ ID NO: 16), los residuos de aminoácidos 263-277 son los residuos de aminoácidos del péptido enlazador que contiene cisteína LEPKSADKTHTCPPC (SEQ ID NO: 20) y los residuos de aminoácidos 278-494 son los residuos de aminoácidos del dominio CH2-CH3 modificado

(SEQ ID NO: 24).

Una molécula de ácido nucleico que codifica dicha primera/tercera cadena polipeptídica es (SEQ ID NO: 26):

gaaattgtcc tgacacagtc tcccgcaacc ctgagtttga gtcctgggga gcgagcaact ctctcctgcc gagcctccca gagtatctcc tcctacctcg cctggtacca acagaagcca gggcaggctc caaggctgct tatctatgac gcctctaacc gcgcaactgg gattcccgca cgcttctccg gctctggttc cggcacagac tttacactta ctatctctag cctggagcca gaagactttg ccgtgtacta ttgtcagcaa cgttccaatt ggccccttac ctttgggcag ggcactaact tggaaatcaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtc gagagtggtg gcggcgttgt gcaacctggg cgttccctcc gattggactg taaagcttcc ggcattactt tctcaaattc cggcatgcat tgggtgaggc aagcccctgg aaaagggctc gaatgggtgg ctgtgatttg gtacgatggc agcaaacggt actacgccga ttctgttaag ggccgcttta ccatctcccg cgataactca aagaacacac tgtttctgca aatgaatagt cttagagccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccacaa atgacgatta ttgggggcag ggcacattgg tcacagtgtc ttccggagga tgtggcggtg gagaagtggc cgcatgtgag aaagaggttg ctgctttgga gaaggaggtc gctgcacttg aaaaggaggt cgcagccctg gagaaactgg agcccaaatc tgctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccgcgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctctat atcacccggg agcctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata

atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gt

La segunda y cuarta cadena polipeptídica de tal PD-1 x LAG-3 Fc-DART®-1 tienen secuencias idénticas. Tal segunda/cuarta cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 27):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ

GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN

WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV

TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAACKEKV

AALKEKVAAL KEKVAALKE

en donde, los residuos de aminoácidos 1-107 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de mAb 1 contra PD-1 (SEQ ID NO: 3), los residuos de aminoácidos 108-115 son los residuos de aminoácidos del enlazador GGGSGGGG (SEQ ID NO: 13), los residuos de aminoácidos 116-235 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del mAb 1 contra LAG-3 (SEQ ID NO: 11), los residuos de aminoácidos 236-241 son los residuos de aminoácidos del péptido espaciador que contiene cisteína GGCGGG (SEQ ID NO: 18), y los residuos de aminoácidos 242-269 son los residuos de aminoácidos de la espiral K modificada (SEQ ID NO: 17).

Una molécula de ácido nucleico que codifica dicha segunda/cuarta cadena polipeptídica es (SEQ ID NO: 28):

gagatcgtac ttacccagtc tcccgccacc ctttccctga gtcctggtga gcgggccact ctttcctgtc gcgcaagcca atcagtttct agctacctcg catggtatca gcagaagcca gggcaggcac ccaggcttct catctatgac gccagtaacc gcgcaaccgg gatacctgct agattttccg gcagtggatc tgggaccgat ttcacactga caatttcatc cttggaacca gaagatttcg cagtctacta ctgccagcaa tcttccaact ggccaagaac tttcggacag gggaccaaag tggaaattaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctccag caatggggag ccgggctgct gaaaccctct gaaacactga gtctcacatg tgccgtttat ggaggttcct tctccgatta ttactggaac

tggattcgtc agcctcccgg caagggcctg gagtggatcg gtgagattaa ccacaatggc aataccaata gcaatcctag tttgaaatct cgcgtcactc tttccctcga tacaagcaaa aaccagtttt ctttgaaatt gcgatctgta actgctgctg atactgccgt gtattactgc gcattcggct actccgacta tgaatataat tggttcgatc cttggggaca gggaacattg gtaaccgtgt catccggagg atgtggcggt ggaaaagtgg ccgcatgtaa ggagaaagtt gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt aaggaaaagg tcgcagccct gaaagag

3. Segundo ejemplo de diacuerpo Fc-DART® biespecífico para PD-1 x LAG-3 (PD-1 x LAG-3 Fc-DART®-2) Un segundo diacuerpo Fc-DART® tetravalente biespecífico para PD-1 x LAG-3 particularmente preferido de la presente invención (PD-1 x LAG-3 Fc-DART®-2) tiene la primera y tercera cadenas polipeptídicas de secuencia idéntica. Dicha primera/tercera cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 29):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQG SSNWPRTFGQ

GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN

WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV

TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAACEKEV

AALEKEVAAL EKEVAALEKL EPKSADKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP

KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

G

en donde, los residuos de aminoácidos 1-107 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de mAb 1 contra PD-1 (SEQ ID NO: 3), los residuos de aminoácidos 108-115 son los residuos de aminoácidos del enlazador GGGSGGGG (SEQ ID NO: 13), los residuos de aminoácidos 116-235 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del mAb 1 contra LAG-3 (SEQ ID NO: 11), los residuos de aminoácidos 236-241 son los residuos de aminoácidos del péptido espaciador que contiene cisteína GGCGGG (SEQ ID NO: 18), los residuos de aminoácidos 242-269 son los residuos de aminoácidos de la espiral E modificada (SEQ ID NO: 16), los residuos de aminoácidos 270-284 son los residuos de aminoácidos del péptido enlazador que contiene cisteína LEPKSADKTHTCPPC (SEQ ID NO: 20) y los residuos de aminoácidos 285-501 son los residuos de aminoácidos del dominio CH2-CH3 modificado (SEQ ID NO: 24).

Una molécula de ácido nucleico que codifica dicha primera/tercera cadena polipeptídica es (SEQ ID NO: 30):

gagatcgtac ttacccagtc tcccgccacc ctttccctga gtcctggtga gcgggccact ctttcctgtc gcgcaagcca atcagtttct agctacctcg catggtatca gcagaagcca gggcaggcac ccaggcttct catctatgac gccagtaacc gcgcaaccgg gatacctgct agattttccg gcagtggatc tgggaccgat ttcacactga caatttcatc cttggaacca gaagatttcg cagtctacta ctgccagcaa tcttccaact ggccaagaac tttcggacag gggaccaaag tggaaattaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctccag caatggggag ccgggctgct gaaaccctct gaaacactga gtctcacatg tgccgtttat ggaggttcct tctccgatta ttactggaac tggattcgtc agcctcccgg caagggcctg gagtggatcg gtgagattaa ccacaatggc aataccaata gcaatcctag tttgaaatct cgcgtcactc tttccctcga tacaagcaaa aaccagtttt ctttgaaatt gcgatctgta actgctgctg atactgccgt gtattactgc gcattcggct actccgacta tgaatataat tggttcgatc cttggggaca gggaacattg gtaaccgtgt catccggagg atgtggcggt ggagaagtgg ccgcatgtga gaaagaggtt gctgctttgg agaaggaggt cgctgcactt gaaaaggagg tcgcagccct ggagaaactg gagcccaaat ctgctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcta tatcacccgg gagcctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt

La segunda y cuarta cadena polipeptídica de PD-1 x LAG-3 Fc-DART®-2 tienen secuencias idénticas. Dicha segunda/cuarta cadena polipeptídica tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 31):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ

GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH

WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS

LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAACK EKVAALKEKV

AALKEKVAAL KE

en donde, los residuos de aminoácidos 1-107 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de mAb 1 contra LAG-1 (SEQ ID NO: 12), los residuos de aminoácidos 108-115 son los residuos de aminoácidos del enlazador GGGSGg Gg (SEQ ID NO: 13), los residuos de aminoácidos 116-228 son los residuos de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del mAb 1 contra PD-1 (SEQ ID NO: 2), los residuos de aminoácidos 229-234 son los residuos de aminoácidos del péptido espaciador que contiene cisteína GGCGGG (SEQ ID NO: 18), y los residuos de aminoácidos 235-262 son los residuos de aminoácidos de la espiral K modificada (SEQ ID NO: 17).

Una molécula de ácido nucleico que codifica dicha segunda/cuarta cadena polipeptídica es (SEQ ID NO: 32):

gaaattgtcc tgacacagtc tcccgcaacc ctgagtttga gtcctgggga gcgagcaact ctctcctgcc gagcctccca gagtatctcc tcctacctcg cctggtacca acagaagcca gggcaggctc caaggctgct tatctatgac gcctctaacc gcgcaactgg gattcccgca cgcttctccg gctctggttc cggcacagac tttacactta ctatctctag cctggagcca gaagactttg ccgtgtacta ttgtcagcaa cgttccaatt ggccccttac ctttgggcag ggcactaact tggaaatcaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtc gagagtggtg gcggcgttgt gcaacctggg cgttccctcc gattggactg taaagcttcc ggcattactt tctcaaattc cggcatgcat tgggtgaggc aagcccctgg aaaagggctc gaatgggtgg ctgtgatttg gtacgatggc agcaaacggt actacgccga ttctgttaag ggccgcttta ccatctcccg cgataactca aagaacacac tgtttctgca aatgaatagt cttagagccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccacaa atgacgatta ttgggggcag ggcacattgg tcacagtgtc ttccggagga tgtggcggtg gaaaagtggc cgcatgtaag gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg aaagag

III. Composiciones farmacéuticas

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un cáncer o una enfermedad asociada con la presencia de un patógeno. Tales composiciones incluyen composiciones de los principios activos útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para la administración a un sujeto o paciente) que se pueden usar en la preparación de formas de dosificación unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un diacuerpo biespecífico para PD-1 x LAG-3 modificado de la presente invención (y especialmente un diacuerpo Fc-DART® tetravalente, biespecífico para PD-1 x LAG-3 de la presente invención) y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención incluye, además, composiciones farmacéuticas que comprenden tales diacuerpos modificados y un segundo anticuerpo terapéutico que es específico para un antígeno asociado a un patógeno en particular, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en este documento, el término "cáncer" se refiere a una enfermedad caracterizada por la presencia de un tumor maligno. Dichos cánceres incluyen un cáncer de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado con el SIDA, un sarcoma alveolar de partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma renal de células cromófobas, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma fibroso benigno cutáneo, un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ósea, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de vías biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un carcinoma de tiroides papilar, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor de la vaina de nervios periféricos, un feocromocitoma, un tumor hipofisario, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico poco común, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomiosarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer metastásico de tiroides o un cáncer de útero.

Como se usa en este documento, el término "enfermedad asociada con la presencia de un patógeno" se refiere a una enfermedad asociada con una infección por una bacteria (por ejemplo, E. coli, C. difficile, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis y Streptococcus pneumonia, etc.), un hongo (por ejemplo, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Coccidioides, Histoplasma, Pneumocystis, Stachybotrys, etc.), un protozoo (Amoebozoa, Excavata, Chromalveolata, Entamoeba, Plasmodium, Giardia, Trypanosoma, Coccidia, Besnoitia, Dicrocoelium, Leishmania, etc.) o un virus (y especialmente un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus B (herpesvirus macacino I), un virus BK, un bunyavirus, un virus chikungunya, un virus cocksackie, un coronavirus, un citomegalovirus, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus del ébola, un enterovirus, un virus de Epstein-Barr, un hantavirus, un virus de la hepatitis A, un virus de la hepatitis B, un virus de la hepatitis C, un virus de la hepatitis D, un virus de la hepatitis E, un virus 1 del herpes simple, un virus 2 del herpes simple, un virus espumoso humano, un virus 3 del herpes humano, un virus 5 del herpes humano, un virus 6 del herpes humano, un virus 7 del herpes humano, un virus de inmunodeficiencia humana, un virus del papiloma humano, un virus p-linfotrópico humano, un virus I de leucemia de células T humanas, un virus II de leucemia de células T humanas, un virus de influenza, un virus JC, un JEV, un virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, un virus de Lassa, un virus de la coriomenengitis linfocítica, un virus de Marburg, un virus del sarampión, un virus de las paperas, un virus de Nipah, un norovirus, un virus de Norwalk, un ortoreovirus, un virus de la parainfluenza, un parvovirus, un poliovirus, un virus de la rabia, un reovirus, un virus sincitial respiratorio, un rinovirus, un virus de la fiebre del Valle del Rift, un rotavirus, virus de la rubéola, un virus de la viruela, un virus de la encefalitis de San Luis, un virus de viruela mayor, un virus de viruela menor, un virus de la varicela y el herpes zóster, un virus del Nilo Occidental, un virus de encefalitis equina occidental o un virus de la fiebre amarilla).

Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" denotan un enfoque para obtener un resultado beneficioso o deseado que incluye y preferentemente un resultado clínico beneficioso o deseado. Dichos resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) células infectadas u otras células enfermas, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de las personas que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los receptores de animales de compañía.

En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener, además, cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención se suministran por separado o mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

Las composiciones de la invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, aquellas formadas con aniones como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio., hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

La invención proporciona, además, un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen un diacuerpo biespecífico para PD-1 x LAG-3 de la presente invención, solo o con dicho portador farmacéuticamente aceptable. Además, en el paquete o kit farmacéutico se pueden incluir, además, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad. La invención proporciona, además, un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado con dicho(s) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicho aviso refleja la aprobación de la agencia para la fabricación, el uso o la venta para administración en humanos.

La presente invención proporciona kits que se pueden usar en los métodos anteriores. En una modalidad, un kit comprende una o más moléculas de la invención. En otra modalidad, un kit comprende además uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer o una enfermedad caracterizada por la presencia de un antígeno asociado a patógenos, en uno o más recipientes. En otra modalidad, un kit comprende además uno o más anticuerpos o diacuerpos que se unen a uno o más antígenos asociados a patógenos. En determinadas modalidades, el otro agente profiláctico o terapéutico es un quimioterapéutico. En otras modalidades, el agente profiláctico o terapéutico es un agente terapéutico biológico u hormonal.

IV. Métodos para producir los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención

Los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención se producen con la máxima preferencia mediante la expresión recombinante de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos, como se conoce bien en la técnica.

Los polipéptidos de la invención se pueden preparar convenientemente con el uso de síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis", Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century", Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

Como alternativa, los anticuerpos se pueden preparar de forma recombinante y expresar con el uso de cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos se pueden preparar de forma recombinante primero mediante aislamiento de los anticuerpos producidos en animales huésped, obtención de la secuencia génica y uso de la secuencia génica para expresar el anticuerpo de manera recombinante en células huésped (por ejemplo, células CHO). Otro método que puede emplearse es expresar la secuencia del anticuerpo en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han descrito métodos adecuados para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche (véase, por ejemplo, Peeters y otros (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants", Vaccine 19:2756; Lonberg, N. y otros (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice", Int. Rev. Immunol 13:65-93; y Pollock y otros(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies", J. Immunol Methods 231:147-157). En la técnica se conocen métodos adecuados para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, quiméricos, humanizados, monocatenarios, etc. En otra alternativa, los anticuerpos pueden obtenerse de forma recombinante mediante tecnología de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núm. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; y Winter, G. y otros (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology", Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).

Los anticuerpos o la proteína de interés pueden someterse a secuenciación mediante degradación de Edman, que es bien conocida por los expertos en la técnica. La información de péptidos que se genera a partir de espectrometría de masas o degradación de Edman se puede usar para diseñar sondas o cebadores que se usan para clonar la proteína de interés.

Un método alternativo de clonación de la proteína de interés es mediante "cribado" con el uso de proteínas purificadas o porciones de estas para obtener las células que expresan el anticuerpo o la proteína de interés. El procedimiento de "cribado" se puede realizar al obtener una biblioteca de ADNc de tejidos o células que expresan o sobreexpresan los ADNc deseados en un segundo tipo de célula y seleccionar las células transfectadas del segundo tipo de célula sobre la base de una unión específica a la proteína deseada. En la técnica se pueden encontrar descripciones detalladas de los métodos utilizados en la clonación de genes de mamíferos que codifican proteínas de la superficie celular mediante "cribado" (véase, por ejemplo, Aruffo, A. y otros (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. y otros (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation", Endocrinol. 140:5841-5854).

Los ADNc que codifican anticuerpos y otros agonistas, antagonistas y moduladores peptídicos pueden obtenerse mediante transcripción inversa de los ARNm de un tipo celular particular de acuerdo con métodos estándar en la técnica. Específicamente, el ARNm se puede aislar con el uso de varias enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con los procedimientos establecidos en Sambrook y otros supra o se puede extraer con resinas de unión a ácidos nucleicos disponibles comercialmente siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes (por ejemplo, Qiagen, Invitrogen, Promega). Los ADNc sintetizados se introducen después en un vector de expresión para producir el anticuerpo o proteína de interés en células de un segundo tipo. Se entiende que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped como episomas o como parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, incluidos adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus y cósmidos.

Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquiera de varios medios apropiados, que incluyen electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.

Cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogos se puede usar con el fin de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o proteína de interés. Los ejemplos no limitantes de células huésped de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células COS, HeLa y CHO. Preferentemente, las células huésped expresan los ADNc a un nivel de aproximadamente 5 veces más alto, con mayor preferencia 10 veces más alto, con mayor preferencia 20 veces más alto, con mayor preferencia 50 veces más alto, con mayor preferencia 100 veces más alto que el del correspondiente anticuerpo endógeno o proteína de interés, si está presente, en las células huésped. La selección de las células huésped según una unión específica a una proteína deseada se efectúa preferentemente mediante un inmunoensayo o FACS. De esta forma se puede identificar una célula que sobreexpresa el anticuerpo o la proteína de interés.

También están disponibles varias técnicas que pueden emplearse ahora para producir agonistas, antagonistas y moduladores peptídicos mutantes que codifiquen adiciones, deleciones o cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante en relación con la molécula agonista, antagonista o moduladora peptídica original.

La invención incluye modificaciones al diacuerpo biespecífico para PD-1 x LAG-3 de la invención que no afectan significativamente sus propiedades y variantes que tienen actividad mejorada o disminuida. La modificación de polipéptidos es una práctica habitual en la técnica. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de forma perjudicial la actividad funcional, o el uso de análogos químicos. Los residuos de aminoácidos que pueden sustituirse de forma conservadora entre sí incluyen, pero no se limitan a: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina. Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos serían conservadoras, es decir, el aminoácido sustituido poseería propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Tales sustituciones conservadoras son conocidas en la técnica y se han proporcionado ejemplos anteriormente. Las modificaciones de aminoácidos pueden variar desde cambiar o modificar uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad y/o especificidad de unión. Otros métodos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Se pueden usar modificaciones, por ejemplo, para la unión de etiquetas para inmunoensayo, tales como la unión de restos radiactivos para radioinmunoensayo. Los polipéptidos modificados se preparan con el uso de procedimientos establecidos en la técnica y se pueden seleccionar con el uso de ensayos estándar conocidos en la técnica.

La invención abarca, además, proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los polipéptidos y anticuerpos de esta invención. En una modalidad, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de una región variable de cadena ligera y al menos 10 aminoácidos de una región variable de cadena pesada. En otra modalidad, el polipéptido de fusión contiene una región constante de inmunoglobulina heteróloga. En otra modalidad, el polipéptido de fusión contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de un anticuerpo producido a partir de un hibridoma depositado públicamente. Para los fines de esta invención, una proteína de fusión de anticuerpo contiene uno o más dominios polipeptídicos que se unen específicamente a un epítopo viral deseado o un receptor activador deseado de una célula efectora inmunitaria o una proteína presente en la superficie de una célula efectora inmunitaria que expresa tal receptor activador y otra secuencia de aminoácidos a la que no se une en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región.

La invención incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de esta invención. Los polipéptidos de esta invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos se pueden producir mediante degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, mediante métodos recombinantes (es decir, polipéptidos únicos o de fusión) como se describió anteriormente o mediante síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se preparan convenientemente mediante síntesis química. Los métodos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, tal polipéptido podría producirse mediante un sintetizador de polipéptidos automatizado con el empleo del método de fase sólida.

V. Usos de las composiciones de la invención

La presente invención abarca composiciones, incluidas composiciones farmacéuticas, que comprenden los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención, polipéptidos derivados de tales moléculas, polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican tales moléculas o polipéptidos y otros agentes como se describe en el presente documento.

Dado que los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención tienen la capacidad de atenuar la inhibición del sistema inmunitario mediada por PD-1 y LAG-3, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención pueden usarse para tratar cualquier enfermedad o afección asociada con un sistema inmunitario indeseablemente deprimido, que incluye cáncer y enfermedades que se asocian con la presencia de un patógeno (por ejemplo, una infección bacteriana, fúngica, viral o protozoaria).

VI. Métodos de administración

Las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar para el tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la invención. En un aspecto preferido, tales composiciones están sustancialmente purificadas (es decir, sustancialmente libres de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). En una modalidad específica, el sujeto es un animal, preferentemente un mamífero como un no primate (por ejemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor, etc.) o un primate (por ejemplo, monos como, un mono cangrejero, ser humano, etc.). En una modalidad preferida, el sujeto es un ser humano. Se conocen varios sistemas de administración y se pueden usar para administrar las composiciones de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o proteína de fusión, endocitosis mediada por receptores (véase, por ejemplo, Wu y otros (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System", J. Biol. Chem.

262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc.

Los métodos para administrar los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosal (por ejemplo, vía intranasal y oral). En una modalidad específica, las moléculas de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, también se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm.

6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones PCT núm. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903, cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.

La invención proporciona, además, que los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención se pueden envasar en un recipiente herméticamente sellado, tal como una ampolla o bolsita que indique la cantidad de tales moléculas. En una modalidad, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado y se pueden reconstituir, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. Preferentemente, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente sellado herméticamente en una dosis unitaria de al menos 5 mg, con mayor preferencia al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 50 mg, al menos 100 mg o al menos 200 mg.

Los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 liofilizados de la presente invención deben almacenarse entre 2 y 8 °C en su recipiente original y las moléculas deben administrarse dentro de las 12 horas, preferentemente dentro de las 6 horas, dentro de las 5 horas, dentro de las 3 horas o dentro de 1 hora después de ser reconstituidos. En una modalidad alternativa, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión o molécula conjugada. Preferentemente, la forma líquida de los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención se suministra en un recipiente herméticamente cerrado en el que las moléculas están presentes en una concentración de al menos 1 mg/ml, con mayor preferencia al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 50 mg/ml o al menos 100 mg/ml.

Como se usa en este documento, una "cantidad eficaz" de una composición farmacéutica, en una modalidad, es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados que incluyen, sin limitación, resultados clínicos tales como disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad atenuar un síntoma de infección (por ejemplo, carga viral, fiebre, dolor, sepsis, etc.) o un síntoma de cáncer (por ejemplo, la proliferación, de células cancerosas, presencia de tumores, metástasis tumorales, etc.), aumentando así la calidad de vida de quienes padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, mejorar el efecto de otro medicamento, por ejemplo, mediante el direccionamiento y/o internalización, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos.

Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para reducir la proliferación (o el efecto) de la presencia viral y para reducir y/o retrasar el desarrollo de la enfermedad viral, ya sea directa o indirectamente. En algunas modalidades, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica se puede lograr o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, se puede considerar una "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos, y se puede considerar que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, se puede lograr o se logra un resultado deseable. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades efectivas de cada componente está dentro del conocimiento de la técnica. Las dosis típicas para la administración de anticuerpos comprenden una o más dosis unitarias entre 0,1 y 100 mg/kg/peso corporal.

La cantidad de diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención que será eficaz en el tratamiento, prevención o mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. La dosis precisa para emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba en modelos animales o in vitro. Para los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención, la dosis administrada a un paciente es típicamente de al menos aproximadamente 0,01 mg/kg, al menos aproximadamente 0,05 mg/kg, al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, al menos aproximadamente 0,2 mg/kg, al menos aproximadamente 0,5 mg/kg, al menos aproximadamente 1 mg/kg, al menos aproximadamente 2 mg/kg, al menos aproximadamente 5 mg/kg, al menos aproximadamente 10 mg/kg, al menos aproximadamente 20 mg/kg, al menos aproximadamente 50 mg/kg, al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, al menos aproximadamente 1 mg/kg, al menos aproximadamente 5 mg/kg, al menos aproximadamente 10 mg/kg, al menos aproximadamente 30 mg/kg, al menos aproximadamente 50 mg/kg, al menos aproximadamente 75 mg/kg, al menos aproximadamente 100 mg/kg, al menos aproximadamente 125 mg/kg, al menos aproximadamente 150 mg/kg o más del peso corporal del sujeto.

En otra modalidad, se administra al paciente un régimen de tratamiento que comprende una o más dosis de dicha cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención, en donde el régimen de tratamiento se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días. En determinadas modalidades, el régimen de tratamiento comprende la administración intermitente de dosis de la cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención (por ejemplo, administrar una dosis el día 1, el día 2, el día 3 y el día 4 de una semana determinada y no administrar dosis de la cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención el día 5, el día 6 y el día 7 de la misma semana). Típicamente, existen 1, 2, 3, 4, 5 o más cursos de tratamiento. Cada curso puede ser el mismo régimen o un régimen diferente.

En otra modalidad, la dosis administrada aumenta durante el primer cuarto, la primera mitad o los primeros dos tercios o tres cuartos del régimen o los regímenes (por ejemplo, durante el primer, segundo o tercer régimen de un tratamiento de 4 ciclos) hasta que se logra la cantidad diaria profiláctica o terapéuticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 abarcados por la invención.

En una modalidad, la dosificación de los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención administrados a un paciente puede calcularse para el uso como tratamiento de agente único. En otra modalidad, los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención se usan en combinación con otras composiciones terapéuticas y la dosis administrada a un paciente es menor que cuando tales diacuerpos se usan como tratamiento de agente único.

En una modalidad específica, puede ser conveniente administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesita tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local, por inyección, o por medio de un implante, donde dicho implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas silastic o fibras. Preferentemente, cuando se administra una molécula de la invención, se debe tener cuidado de utilizar materiales que no absorban la molécula. En otra modalidad, las composiciones pueden administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery", Science 249:1527-1533); Treat y otros, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; véase en general ibid.).

En otra modalidad adicional, las composiciones pueden administrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden una o más moléculas de la invención. Véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 4,526,938; publicación PCT WO 91/05548; publicación PCT WO 96/20698; Ning y otros (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft ilsing A Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song y otros (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek y otros (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application", Pro. Int'1. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam y otros (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery", Proc. Int'1. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad. En una modalidad, se puede usar una bomba en un sistema de liberación controlada (véase Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps", CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14: 201-240; Buchwald y otros (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis", Surgery 88:507-516; y Saudek y otros (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery", N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra modalidad, se pueden usar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada de anticuerpos (ver, por ejemplo, MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Levy y otros (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate", Science 228:190-192; During y otros (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization", Ann. Neurol. 25:351-356; Howard y otros (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits", J. Neurosurg. 7(1):105-112); patente de Estados Unidos núm.

5,679,377; patente de Estados Unidos núm. 5,916,597; patente de Estados Unidos núm. 5,912,015; patente de Estados Unidos núm. 5,989,463; patente de Estados Unidos núm. 5,128,326; publicación PCT núm. WO 99/15154; y publicación PCT núm. WO 99/20253). Los ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. En otra modalidad adicional, se puede colocar un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana terapéutica (por ejemplo, los pulmones), requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en ^m E^{d i}C^a L APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). En otra modalidad, las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada se usan según Dunn y otros (Ver el documento US 5,945,155). Este método particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo del sistema polimérico. La implantación generalmente puede realizarse en cualquier parte del cuerpo del paciente que necesite tratamiento terapéutico. En otra modalidad, se usa un sistema de administración sostenida no polimérico, mediante el cual se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto como sistema de administración de fármacos. Tras la implantación en el cuerpo, el disolvente orgánico del implante se disipará, dispersará o lixiviará de la composición al fluido tisular circundante, y el material no polimérico se coagulará o precipitará gradualmente para formar una matriz microporosa sólida (véase el documento US 5,888,533).

Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery", Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 4,526,938; publicaciones internacionales núm. WO 91/05548 y W^o 96/20698; Ning y otros (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft ilsing A Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song y otros (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek y otros (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application", Pro. Int'1. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam y otros (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery", Proc. Int'1. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.

En una modalidad específica donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica una o más de las cadenas polipeptídicas de un diacuerpo biespecífico para PD-1 x LAG-3 de la presente invención, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión del diacuerpo que codifica, mediante su construcción como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y su administración de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase la patente de los Estados Unidos núm. 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o mediante recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes transfectantes, o mediante administración en unión a un péptido similar a una caja homeótica que se sabe que ingresa al núcleo (Véase, por ejemplo, Joliot y otros (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión mediante recombinación homóloga.

El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de los diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3 de la presente invención puede incluir un único tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto es tratado con moléculas de la invención una vez por semana durante aproximadamente 1 a 10 semanas, preferentemente entre 2 a 8 semanas, con mayor preferencia entre aproximadamente 3 a 7 semanas, e incluso con mayor preferencia durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas se administran una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosis eficaz de las moléculas utilizadas para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento en particular.

Después de describir en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante referencia a los siguientes Ejemplos. Dichos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no deben limitar la presente invención a menos que se especifique.

Ejemplo 1

Producción y propiedades de diacuerpos biespecíficos para PD-1 x LAG-3

En el contexto del ensayo alo-MLR, se induce la proliferación de las células T en respuesta a un desajuste de HLA (Latchman, Y.E. y otros (2004) "PD-L1-Deficient Mice Show That PD-L1 On T-Cells, Antigen-Presenting Cells, And Host Tissues Negatively Regulates T-Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(29):10691-10696; Wang, W. y otros (2008) "PD-L1/PD-1 Signal Deficiency Promotes Allogeneic Immune Responses And Accelerates Heart Allograft Rejection", Transplantation 86(6):836-44) o estimulación mitogénica/farmacológica. Se sabe que los anticuerpos agonistas que se dirigen a moléculas coestimuladoras inducen respuestas proliferativas al reforzar la señalización de las células T y estabilizar los factores de transcripción que promueven o impulsan la función efectora de las células T (Melero, I. y otros (2013) "Agonist Antibodies to TNf R Molecules That Costimulate T and NK Cells", Clin. Cancer Res. 19(5):1044-1053). De manera similar, los anticuerpos antagonistas que se dirigen a moléculas de puntos de control clave que regulan negativamente las respuestas de las células T pueden inducir respuestas proliferativas al mantener la señalización de las células T y la función efectora y, por lo tanto, mejoran la inmunidad antitumoral (Capece, D. y otros (2012) "Targeting Costimulatory Molecules to Improve Antitumor Immunity", J. Biomed. Biotech.

2012:926321). El efecto de los anticuerpos monoclonales contra dianas coestimuladoras o de puntos de control sobre la proliferación en respuesta a un aloantígeno puede medirse fácilmente en reacciones mixtas linfocitarias (alo-MLR) a corto plazo mediante el seguimiento de la incorporación de 3H-timidina. Para abordar la capacidad de los anticuerpos contra los inhibidores de puntos de control para mejorar la proliferación, se generaron, purificaron y agregaron de manera exógena mAb anti-PD-1 o anti-LAG-3 de referencia al inicio del ensayo alo-MLR a 20, 10, 5, 2,5, y 1,25 mg/ml (Figura 5). Al final de los 5-6 días, las placas de 96 pocillos se sometieron a pulsos con 3H-timidina y se cultivaron durante 18 horas para medir la proliferación. Se evaluaron varios anticuerpos de referencia contra PD-1, LAG-3 y CTLA-4 humanos en cuanto a su capacidad para potenciar la proliferación de células T en respuesta a la estimulación con aloantígeno. Como se muestra en la Figura 6, la adición de mAb 1 contra PD-1 (5C4 (BMS-936558), mAb 2 contra PD-1 (MK-3475; Merck, lambrolizumab) o mAb 3 contra PD-1 (EH12.2H7; Dana Farber) al comienzo del ensayo alo-MLR, indujo una fuerte proliferación de células T en comparación con el anticuerpo de control de isotipo IgG1 o los pocillos de control que contenían respondedores y estimuladores. Los pocillos que contenían células estimuladoras irradiadas solas no demostraron proliferación. Aunque se observó una respuesta proliferativa dependiente de la dosis, mAb 4 contra PD-1 (CT-011; CureTech, BAT-1) mostró una proliferación mínima en comparación con mAb 1 contra PD-1 (5C4 (BMS-936558), mAb 2 contra PD-1 (MK-3475; Merck, lambrolizumab) o mAb 3 contra PD-1 (EH12.2H7; Dana Farber). También se observó una ligera respuesta proliferativa dependiente de la dosis con mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS), que se comparó de manera similar con ipilimumab Yervoy®, un mAb anti-CTLA-4 (Bristol Myers-Squib).

La sorprendente efectividad del mAb 1 contra PD-1 (5C4 (BMS-936558), administrado simultáneamente con mAb 1 contra LAG-3 (25F7; BMS-986016, Medarex/BMS) para provocar una potente inmunidad antitumoral en modelos animales en comparación con cualquiera de los anticuerpos administrados solos (Woo, S.R. y otros (2012) "Immune Inhibitory Molecules LAG-3 And PD-1 Synergistically Regulate T-Cell Function To Promote Tumoral Immune Escape", Cancer Res. 72(4):917-927), sugirió que los mAb de referencia administrados en combinación pueden potenciar la proliferación de células T aloinducida más que cualquier anticuerpo solo. Como se muestra en la Figura 7, se evaluó el potencial proliferativo del mAb anti-LAG-3 (25F7) ya sea solo o en combinación con los mAb anti-PD-1 (mAb 1 contra PD-1 (5C4 (BMS-936558) o mAb 2 contra P^d-1 (MK-3475; Merck, lambrolizumab)). Como se observó anteriormente, ambos mAb anti-PD-1 indujeron una potente proliferación de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, la provisión de mAb anti-LAG-3 con cualquier mAb anti-PD-1 no indujo una proliferación mejorada más allá de la observada con los mAb anti-PD-1 solos. El mAb anti-LAG-3 solo exhibió solo una ligera proliferación de células T en comparación con los pocillos de control de isotipo IgG1 o de control de respondedor más estimulador.

La incapacidad de los mAb anti-LAG-3 para inducir la proliferación solos o en combinación más allá de lo observado con los mAb anti-PD-1 sugirió que la expresión de LAG-3 está ausente en las células T durante el ensayo alo-MLR o

Claims (15)

REIVINDICACIONESUn diacuerpo Fc biespecífico que puede unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de PD-1 y a un epítopo de LAG-3, en donde dicho diacuerpo comprende cuatro cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales tiene un extremo amino terminal y un extremo carboxilo terminal, y en donde:(A) dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí, dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí, y dichas tercera y cuarta cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí;(B) dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo comprenden cada una, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, y un dominio CH2-CH3, en donde dichos dominios variables de cadena ligera y dichos dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3; y(C) dicha segunda y dicha cuarta cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo comprenden cada una, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, en donde dichos dominios variables de cadena ligera y dichos dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3;y en donde:(I)(1) dicho dominio variable de cadena ligera de dicha primera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha segunda cadena polipeptídica se asocian para formar un primer sitio de unión a epítopo y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha primera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena ligera de dicha segunda cadena polipeptídica se asocian para formar un segundo sitio de unión a epítopo; y(2) dicho dominio variable de cadena ligera de dicha tercera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha cuarta cadena polipeptídica se asocian para formar un tercer sitio de unión a epítopo y dicho dominio variable de cadena pesada de dicha tercera cadena polipeptídica y dicho dominio variable de cadena ligera de dicha cuarta cadena polipeptídica se asocian para formar un cuarto sitio de unión a epítopo;en donde dos de dichos sitios de unión a epítopo formados pueden unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de PD-1 y dos de dichos sitios de unión a epítopo formados pueden unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de LAG-3; y(II) dichos dominios CH2-CH3 de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas se asocian para formar un dominio Fc.El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, en donde:(A) cada una de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo comprende, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, un dominio promotor de heterodímero y un dominio CH2-CH3, en donde dichos dominios variables de cadena ligera y dichos dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3; y(B) dicha segunda y dicha cuarta cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo comprenden cada una, en la dirección del extremo N-terminal al C-terminal, un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 o LAG-3, un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 o PD-1, y un dominio promotor de heterodímero, en donde dichos dominios variables de cadena ligera y dichos dominios variables de cadena pesada no pueden asociarse para formar un sitio de unión a epítopo que pueda unirse a un epítopo de PD-1 o un epítopo de LAG-3; en donde dicho dominio promotor de heterodímero de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas difiere de dicho dominio promotor de heterodímero de dichas segunda y cuarta cadenas polipeptídicas.El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con la reivindicación 2, en donde:
1. (1) dicho dominio promotor de heterodímero de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y dicho dominio promotor de heterodímero de dichas segunda y cuarta cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; o
2. (2) dicho dominio promotor de heterodímero de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y dicho dominio promotor de heterodímero de dichas segunda y cuarta cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o
3. (3) dicho dominio promotor de heterodímero de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y dicho dominio promotor de heterodímero de dichas segunda y cuarta cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; o

   (4) dicho dominio promotor de heterodímero de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y dicho dominio promotor de heterodímero de dichas segunda y cuarta cadenas polipeptídicas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
4. 4. El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en donde dicho dominio promotor de heterodímero de dicha primera cadena polipeptídica comprende la SEQ ID NO: 14 y dicho dominio promotor de heterodímero de dicha segunda cadena polipeptídica comprende la SEQ ID NO: 15.
5. 5. El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en donde dicho dominio promotor de heterodímero de dicha primera cadena polipeptídica comprende la SEQ ID NO: 16 y dicho dominio promotor de heterodímero de dicha segunda cadena polipeptídica comprende la SEQ ID NO: 17.
6. 6. El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dichos dominios CH2-CH3 de dichas primera y tercera cadenas polipeptídicas comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
7. 7. El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y en donde dicho dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para LAG-3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
8. 8. El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y en donde dicho dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo que es inmunoespecífico para PD-1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
9. 9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y un portador farmacéuticamente aceptable.
10. 10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicha cantidad eficaz de dicho diacuerpo Fc biespecífico es una cantidad eficaz para tratar el cáncer en un individuo receptor que necesita dicho tratamiento.
11. 11. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicho cáncer es un cáncer de glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma renal de células cromófobas, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma fibroso benigno cutáneo, un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis imperfecta ósea, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de vías biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un carcinoma de tiroides papilar, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor de la vaina de nervios periféricos, un feocromocitoma, un tumor pituitario, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomiosarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer metastásico de tiroides o un cáncer de útero.
12. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicha cantidad eficaz de dicho diacuerpo Fc biespecífico es una cantidad eficaz para tratar una enfermedad asociada con la presencia de un patógeno en un individuo receptor que necesita dicho tratamiento.
13. 13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12, en donde dicho patógeno es una bacteria, un hongo o un virus.
14. 14. El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o de la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-11, para el uso en el tratamiento del cáncer.
15. 15. El diacuerpo Fc biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o de la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-13, para el uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la presencia de un patógeno.