ES2848703T3

ES2848703T3 - Gen del factor VIII optimizado

Info

Publication number: ES2848703T3
Application number: ES14751254T
Authority: ES
Inventors: Siyuan Tan; Robert Peters
Original assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Current assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date: 2013-02-15
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2021-08-11
Anticipated expiration: 2034-02-14
Also published as: LT3889173T; EP3889173B1; SI2956477T1; EP2956477A4; EP2956477B1; SI2956477T2; FI2956477T4; LT2956477T; DK3889173T3; DK2956477T3; PL2956477T5; US20240141019A1; US20150361158A1; EP2956477B2; HUE053136T2; US10370431B2; RS64664B1; HRP20210185T4; SI3889173T1; HRP20210185T1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con actividad de factor VIII.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen del factor VIII optimizado

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La vía de coagulación de la sangre implica, en parte, la formación de un complejo enzimático del factor VIIIa (FVIIIa) y el factor IXa (FIXa) (complejo Xasa) sobre la superficie de las plaquetas. El FIXa es una serina proteasa con actividad catalítica relativamente débil sin su cofactor FVIIIa. El complejo Xasa escinde el factor X (FX) en el factor Xa (FXa), que a su vez interacciona con el factor Va (FVa) para escindir protrombina y generar trombina. La hemofilia A es un trastorno hemorrágico provocado por mutaciones y/o deleciones en el gen FVIII (FVIII) que da como resultado una deficiencia de actividad de FVIII (Peyvandi et al. 2006). En algunos casos, los pacientes tienen niveles de FVIII reducidos debido a la presencia de inhibidores de FVIII, tales como anticuerpos anti-FVIII.

La hemofilia A se caracteriza por hemorragia espontánea y excesivo sangrado. Con el tiempo, el sangrado repetido en músculos y articulaciones, que frecuentemente empieza en la segunda infancia, da como resultado artropatía hemófila y daño articular irreversible. Este daño es progresivo y puede conducir a una movilidad fuertemente limitada de articulaciones, atrofia muscular y dolor crónico (Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003).

La enfermedad se puede tratar por tratamiento sustitutivo que se dirige a la restauración de la actividad de FVIII al 1 a 5 % de los niveles normales para prevenir el sangrado espontáneo (véase, por ejemplo, Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-9 (2001). Están disponibles productos derivados del plasma y de FVIII recombinante para tratar episodios hemorrágicos a demanda o para prevenir que ocurran episodios hemorrágicos tratando profilácticamente. Basándose en la semivida de estos productos (10-12 h) (White G.C., et al., Thromb. Haemost.

77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (supl 1):94-99; discusión 100 (2003)), las pautas de tratamiento requieren una frecuente administración intravenosa, comúnmente dos a tres veces a la semana para la profilaxis y de una a tres veces al día para el tratamiento a demanda (Manco-Johnson, M.J., et al., N. Engl. J. Med. 357:535-544 (2007)). Dicha administración frecuente es poco práctica y cara.

Un impedimento importante en proporcionar una proteína FVIII recombinante de bajo coste a los pacientes es el alto coste de la producción comercial. La proteína FVIII se expresa débilmente en los sistemas de expresión heteróloga, dos a tres órdenes de magnitud menos que las proteínas de tamaño similar (Lynch et al., Hum. Gene. Ther.; 4:259-72 (1993). La mala expresión de FVIII es debida en parte a la presencia de elementos que actúan en cis en la secuencia codificante de FVIII que inhiben la expresión de FVIII, tal como los elementos silenciadores transcripcionales (Hoeben et al., Blood 85:2447-2454 (1995)), secuencias de tipo unión a la matriz (MAR) (Fallux et al., Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996)) y elementos inhibidores de la elongación transcripcional (Koeberl et al., Hum. Gene. Ther.; 6:469-479 (1995)).

Los avances en el entendimiento de los presentes inventores de la biología de la expresión de FVIII han conducido al desarrollo de variantes de FVIII más potentes. Por ejemplo, estudios bioquímicos demostraron que el dominio B de FVIII era dispensable para la actividad del cofactor FVIII. La deleción del dominio B produjo un aumento de 17 veces en los niveles de ARNm a lo largo de FVIII natural de longitud completa y un aumento del 30 % en proteína secretada. (Toole et al., Proc Natl Acad Sci USA 83:5939-42 (1986)). Esto condujo al desarrollo de un concentrado de proteína FVIII de dominio B delecionado (BDD), que ahora se usa ampliamente en la clínica. Estudios recientes, sin embargo, indican que FVIIIh de longitud completa y BDD se plegaron erróneamente en la luz del RE, dando como resultado la activación de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR) y la apoptosis de hepatocitos murinos. Los documentos de patente WO2011005968 y US2009042283 desvelan factor VIII optimizados por codones con deleción del dominio B.

Así, existe una necesidad en la técnica de secuencias de FVIII que se expresen eficientemente en sistemas heterólogos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con actividad de factor VIII. En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 1. En otra realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende SEQ ID NO: 1. La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con actividad de factor VIII. En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene un índice de adaptación de codones humanos que es elevado con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene un índice de adaptación de codones humanos que es al menos aproximadamente 0,75, al menos aproximadamente 0,76, al menos aproximadamente 0,77, al menos aproximadamente 0,78, al menos aproximadamente 0,79, o al menos aproximadamente 0,80. En otras realizaciones más, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene un índice de adaptación de codones humanos que es al menos aproximadamente 0,80, al menos aproximadamente 0,81, al menos aproximadamente 0,82, al menos aproximadamente 0,83, al menos aproximadamente 0,84, al menos aproximadamente 0,85, al menos aproximadamente 0,86, al menos aproximadamente 0,87, o al menos aproximadamente 0,88.

En ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención contiene un mayor porcentaje de nucleótidos G/C en comparación con el porcentaje de nucleótidos G/C en SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención contiene un porcentaje de nucleótidos G/C que es al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 46 %, al menos aproximadamente 47 %, al menos aproximadamente 48 %, al menos aproximadamente 49 %, o al menos aproximadamente 50 %.

En otras realizaciones más, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención contiene menos secuencias MARS/ARS (SEQ ID NO: 5 y 6) con respecto a SEQ ID NO: 3. En aún otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención contiene como máximo una secuencia MARS/ARS. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención no contiene una secuencia MARS/ARS.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención no contiene el sitio de corte y empalme GGTGAT (SEQ ID NO: 7).

En ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención contiene menos secuencias desestabilizantes (SEQ ID NO: 8 y 9) con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención contiene como máximo 4 secuencias desestabilizantes. En otras realizaciones más, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención contiene como máximo 2 secuencias desestabilizantes. En aún otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención no contiene una secuencia desestabilizante.

En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención no contiene una secuencia de poli-T (SEQ ID NO: 10). En aún otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención no contiene una secuencia de poli-A (SEQ ID NO: 11).

En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende además una secuencia heteróloga de nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia heteróloga de nucleótidos puede codificar una secuencia heteróloga de aminoácidos que es un extensor de la semivida. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos es una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, transferrina, albúmina, polipéptido de unión a albúmina, una secuencia XTEN, Fc, el péptido del extremo C (CTP) de la subunidad p de gonadotropina coriónica humana, o una secuencia PAS. En otras realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos es una región Fc o un componente de unión a FcRn. En otras realizaciones más, la secuencia heteróloga de aminoácidos se une al extremo N o el extremo C de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos o se inserta entre dos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos.

En una realización particular, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención codifica una molécula híbrida de monómero-dímero que comprende el factor VIII.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención está operativamente unida a al menos un secuencia de control de la transcripción.

La presente invención también proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención. La presente invención también proporciona una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en: una célula CHO, una célula HEK293, una célula BHK^{2 1}, una célula PER.C6, una célula NS0 y una célula CAP.

La presente invención también proporciona un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención o el vector de la invención o se produce por la célula hospedadora de la invención.

La presente invención también proporciona un método de producción de un polipéptido con actividad de factor VIII, que comprende: cultivar la célula hospedadora de la invención en condiciones por las cuales se produce un polipéptido con actividad de factor VIII; y, recuperar el polipéptido con actividad de factor VIII. En otras realizaciones del método de producción de un polipéptido con actividad de factor VIII, la expresión del polipéptido con actividad de factor VIII es elevada con respecto a una célula hospedadora cultivada en las mismas condiciones que comprende una secuencia de nucleótidos de referencia que comprende SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones del método, la célula hospedadora es una célula CHO. En otras realizaciones del método, la célula hospedadora es una célula HEK293.

La presente invención también proporciona un método de aumento de la expresión de un polipéptido con actividad de factor VIII en un sujeto que comprende administrar la molécula de ácido nucleico aislada de la invención o el vector de la invención a un sujeto en necesidad del mismo, en donde la expresión del polipéptido con actividad de factor VIII es elevada con respecto a una molécula de ácido nucleico de referencia que comprende SEQ ID NO: 3 o el vector que comprende la molécula de ácido nucleico de referencia .

La presente invención también proporciona un método de aumento de la expresión de un polipéptido con actividad de factor VIII que comprende cultivar la célula hospedadora de la invención en condiciones por las cuales un polipéptido con actividad de factor VIII se expresa por la molécula de ácido nucleico, en donde la expresión del polipéptido con actividad de factor VIII es elevada con respecto a una célula hospedadora cultivada en las mismas condiciones que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de referencia que comprende SEQ ID NO: 3.

La presente invención también proporciona un método de mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de factor VIII que comprende cultivar la célula hospedadora de la invención en condiciones por las cuales se produce un polipéptido con actividad de factor VIII por la molécula de ácido nucleico, en donde el rendimiento del polipéptido con actividad de factor VIII es elevada con respecto a una célula hospedadora cultivada en las mismas condiciones que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de referencia que comprende SEQ ID NO: 3.

La presente invención también proporciona un método de tratamiento de un trastorno hemorrágico que comprende: administrar a un sujeto en necesidad del mismo una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de la invención o un polipéptido de la invención. En algunas realizaciones del método de tratamiento de un trastorno hemorrágico, el trastorno hemorrágico se caracteriza por una deficiencia en el factor VIII. En algunas realizaciones, el trastorno hemorrágico es hemofilia. En algunas realizaciones, el trastorno hemorrágico es hemofilia A.

En algunas realizaciones del método de tratamiento de un trastorno hemorrágico, la actividad de factor VIII en plasma 24 horas después de la administración es elevada con respecto a un sujeto administrado con una molécula de ácido nucleico de referencia que comprende SEQ ID NO: 3, un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de referencia, o un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la localización de diversos sitios en la secuencia codificante del factor VIII BDD. Estos sitios se retiraron durante el proceso de optimización por codones.

La Figura 2 es la secuencia de nucleótidos del factor VIII BDD (SEQ ID NO: 1), optimizado por codones por un primer método de optimización por codones, descrito en el Ejemplo 1.

La Figura 3 es la secuencia de nucleótidos del factor VIII BDD (SEQ ID NO: 2), optimizado por codones por un segundo método de optimización por codones, descrito en el Ejemplo 2.

Las Figuras 4 A-B muestran el ajuste del sesgo de uso de codones en la secuencia de FVIII BDD optimizado (SEQ ID NO: 1). La Figura 4A muestra la frecuencia de codones relativa en la secuencia de FVIII BDD antes de la optimización por codones. El índice de adaptación de codones (IAC) humanos de la secuencia FVIII BDD de partida es 0,74. La Figura 4B muestra la frecuencia de codones relativa en la secuencia de FVIII BDD optimizado (SEQ ID NO: 1). La IAC humana de la secuencia optimizada resultante es 0,88. El eje X indica la posición relativa de los codones a lo largo de la longitud de la secuencia de nucleótidos FVIII BDD. El eje Y indica la frecuencia relativa del codón en cada posición dentro del genoma humano.

Las Figuras 5 A-B muestran la frecuencia de codones humanos óptimos en la secuencia de FVIII BDD optimizado (SEQ ID NO: 1). La Figura 5A muestra la frecuencia de codones óptimos en la secuencia de FVIII BDD antes de la optimización por codones. La Figura 5B muestra la frecuencia de codones óptimos en la secuencia de FVIII BDD después de la optimización por codones (SEQ ID NO: 1). El eje X indica la frecuencia de codones en el genoma humano. El eje Y indica el porcentaje de codones en la secuencia de FVIII BDD que se clasifican en cada categoría delineada en el eje X.

Las Figuras 6 A-B muestra el contenido de G/C de la secuencia de FVIII BDD optimizado (SEQ ID NO: 1). La Figura 6A muestra el contenido de G/C de la secuencia de FVIII BDD antes de la optimización por codones. El contenido de G/C de la secuencia de FVIII BDD inicial es 46,16 %. La Figura 6B muestra el contenido de G/C de la secuencia de FVIII BDD después de de la optimización por codones (SEQ ID NO: 1). El contenido de G/C de la secuencia FVIII BDD optimizado es 51,56 %. El eje X indica la posición relativa de los codones a lo largo de la longitud de la secuencia de nucleótidos de FVIII BDD. El eje Y indica el porcentaje de contenido de G/C. La Figura 7 es un histograma que muestra la actividad de FVIII en plasma en ratones HemA 24 horas después de la inyección hidrodinámica con plásmidos que contienen o la secuencia de FVIII BDD inicial (círculos), secuencia de FVIII BDD optimizado (SEQ ID NO: 1) (cuadrados) o secuencia de FVIII BDD optimizado (SEQ ID NO: 2) (triángulos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Las construcciones a modo de ejemplo de la invención se ilustran en las figuras adjuntas y el listado de secuencias. Para proporcionar un claro entendimiento de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a continuación se proporcionan las siguientes definiciones.

I. Definiciones

Se debe observar que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad: por ejemplo, "una secuencia de nucleótidos" se entiende que representa una o más secuencias de nucleótidos. Como tales, los términos "un" (o "una"), "uno o más," y "al menos uno" se pueden usar indistintamente en el presente documento. El término "aproximadamente" se usa en el presente documento para significar aproximadamente, alrededor o en las regiones de. Cuando el término "aproximadamente" se usa junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos expuestos. En general, el término "aproximadamente" se usa en el presente documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor establecido por una varianza del 10 por ciento, arriba o abajo (más alto o más bajo).

El término "aislado" para los fines de la presente invención designa un material biológico (célula, ácido nucleico o proteína) que se ha retirado de su entorno original (el entorno en el que está naturalmente presente). Por ejemplo, un polinucleótido presente en el estado natural en una planta o un animal no está aislado, sin embargo, el mismo polinucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes en los que está naturalmente presente se considera "aislado".

"Ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan indistintamente y se refieren a la forma polimérica de éster de fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN"), o cualquier análogo de fosfoéster de los mismos, tal como fosforotioatos y tioésteres, en cualquier forma monocatenaria, o una hélice bicatenaria. Son posibles hélices de ADN bicatenario-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico, y en particular ADN o molécula de ARN, solo se refiere a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no lo limita a ninguna forma terciaria particular. Así, este término incluye ADN bicatenario encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineal o circular (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos, ADN superenrollado y cromosomas. En la discusión de la estructura de moléculas de ADN bicatenario particulares, las secuencias se pueden describir en el presente documento según la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene un homólogo de secuencia al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación biológica molecular. El ADN incluye, pero no se limita a, ADNc, ADN genómico, ADN de plásmido, ADN sintético y ADN semisintético. Una "composición de ácido nucleico" de la invención comprende uno o más ácidos nucleicos como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, una "región codificante" o "secuencia codificante" es una porción de polinucleótido que consiste en codones traducibles en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce normalmente en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión al ribosoma, terminadores transcripcionales, intrones y similares, no es parte de una región codificante. Los límites de una región codificante normalmente se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5', que codifica el extremo amino del polipéptido resultante, y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3', que codifica el extremo carboxilo del polipéptido resultante. Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes en una única construcción de polinucleótido, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). De esto resulta, entonces, que un único vector puede contener solo una única región codificante, o comprender dos o más regiones codificantes.

Ciertas proteínas secretadas por células de mamífero están asociadas con un péptido señal secretor que se escinde de la proteína madura una vez se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplasmático rugoso. Los expertos habituales en la técnica conocen que los péptidos señal, en general, se fusionan con el extremo N del polipéptido, y se escinden del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas realizaciones, se usa un péptido señal nativo, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido al que está operativamente asociado. Alternativamente, se puede usar un péptido señal de mamífero heterólogo, por ejemplo, un activador de plasminógeno de tejido humano (TPA) o péptido señal de p-glucuronidasa de ratón, o un derivado funcional del mismo.

El término "en la dirección 3'" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se localiza 3' con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleótidos en la dirección 3' se refieren a secuencias que siguen el punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, el codón de iniciación de la traducción de un gen se localiza en la dirección 3' del sitio de inicio de la transcripción.

El término "en la dirección 5'" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se localiza 5' con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleótidos en la dirección 5' se refieren a secuencias que se localizan en el lado 5' de una región codificante o punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores se localizan en la dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción.

Como se usa en el presente documento, el término "región reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas en la dirección 5' (secuencias no codificantes 5'), dentro de, o en la dirección 3' (secuencias no codificantes 3') de una región codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento de ARN, estabilidad, o traducción de la región codificante asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias conductoras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión a efector y estructuras de tallo-bucle. Si está prevista una región codificante para la expresión en una célula eucariota, una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se localizará normalmente 3' con respecto a la secuencia codificante.

Un polinucleótido que codifica un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o de la traducción operativamente asociados a una o más regiones codificantes. En una asociación operativa, una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más regiones reguladoras de tal forma que pongan la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) región (regiones) reguladora(s). Por ejemplo, una región codificante y un promotor están "operativamente asociados" si la inducción de la función de promotor da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico codificado por la región codificante, y si la naturaleza del enlace entre el promotor y la región codificante no interfiere con la capacidad del promotor para dirigir la expresión del producto génico o interferir con la capacidad del molde de ADN a transcribir. También se pueden asociar operativamente otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, a una región codificante para dirigir la expresión del producto génico.

"Secuencias de control de la transcripción" se refiere a secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora. Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero no se limitan a, segmentos de promotores y potenciadores del citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, conjuntamente con el intrón A), virus 40 simio (el promotor temprano) y retrovirus (tales como el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovina y p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).

Similarmente, los expertos habituales en la técnica conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión al ribosoma, codones de inicio y terminación de la traducción, y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio interno de entrada al ribosoma, o IRES, también denominada una secuencia CITE).

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso por el que un polinucleótido produce un producto génico, por ejemplo, un ARN o un polipéptido. Incluye, sin limitación, la transcripción del polinucleótido en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN de horquilla pequeña (ARNhp), ARN interferente pequeño (ARNip), o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de un ARNm en un polipéptido. La expresión produce un "producto génico". Como se usa en el presente documento, un producto génico puede ser o un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce de un transcrito. Los productos génicos descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación o corte y empalme, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteína, o escisión proteolítica. El término "rendimiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un polipéptido producido por la expresión de un gen.

Un "vector" se refiere a cualquier vehículo para la clonación de y/o transferencia de un ácido nucleico en una célula hospedadora. Un vector puede ser un replicón al que se puede unir otro segmento de ácido nucleico de manera que provoque la replicación del segmento unido. Un "replicón" se refiere a cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que actúa como una unidad de replicación autónoma in vivo, es decir, capaz de replicación bajo su propio control. El término "vector" incluye tanto vehículos virales como no virales para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Se conocen un gran número de vectores y se usan en la técnica incluyendo, por ejemplo, plásmidos, virus eucariotas modificados, o virus bacterianos modificados.

La inserción de un polinucleótido en un vector adecuado se puede llevar a cabo uniendo los fragmentos de polinucleótidos apropiados en un vector elegido que tiene extremos cohesivos complementarios.

Los vectores se pueden manipular para codificar marcadores o indicadores de selección que proporcionan la selección o identificación de células que han incorporado el vector. La expresión de marcadores o indicadores de selección permite la identificación y/o selección de células hospedadoras que incorporan y expresan otras regiones codificantes contenidas en el vector. Los ejemplos de genes marcadores de selección conocidos y usados en la técnica incluyen: genes que proporcionan resistencia a ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, el herbicida bialafos, sulfonamida y similares; y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir, genes reguladores de antocianina, gen isopentanil transferasa y similares. Los ejemplos de indicadores conocidos y usados en la técnica incluyen: luciferasa (Luc), proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), -galactosidasa (LacZ), -glucuronidasa (Gus) y similares. También se puede considerar que los marcadores de selección son indicadores.

El término "marcador de selección" se refiere a un factor identificador, normalmente un gen de resistencia a antibióticos o a productos químicos, que es capaz de ser seleccionado para basarse en el efecto del gen marcador, es decir, resistencia a un antibiótico, resistencia a un herbicida, marcadores colorimétricos, enzimas, marcadores fluorescentes y similares, en donde el efecto se usa para hacer el seguimiento de la herencia de un ácido nucleico de interés y/o para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés. Los ejemplos de genes marcadores de selección conocidos y usados en la técnica incluyen: genes que proporcionan resistencia a ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, herbicida bialafos, sulfonamida y similares; y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir, genes reguladores de antocianina, gen isopentanil transferasa y similares.

El término "gen indicador" se refiere a un ácido nucleico que codifica un factor identificador que es capaz de ser identificado basándose en el efecto del gen indicador, en donde el efecto se usa para hacer el seguimiento de la herencia de un ácido nucleico de interés, para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés, y/o para medir la inducción o transcripción de la expresión génica. Los ejemplos de genes indicadores conocidos y usados en la técnica incluyen: luciferasa (Luc), proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), p-galactosidasa (LacZ), p-glucuronidasa (Gus) y similares. Los genes marcadores de selección también se pueden considerar genes indicadores.

"Promotor" y "secuencia promotora" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se localiza 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores se pueden obtener en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de elementos diferentes derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Se entiende por los expertos en la técnica que los diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes estadios de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones medioambientales o fisiológicas. Los promotores que provocan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células en la mayoría de los casos se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Los promotores que provocan que un gen se exprese en un tipo específico de célula se denominan comúnmente "promotores específicos de célula" o "promotores específicos de tejido". Los promotores que provocan que un gen se exprese en un estadio de desarrollo específico o diferenciación celular se denominan comúnmente "promotores específicos del desarrollo" o "promotores específicos de la diferenciación celular". Los promotores que se inducen y provocan que se exprese un gen después de la exposición o tratamiento de la célula con un agente, molécula biológica, producto químico, ligando, luz o similares que inducen el promotor se denominan comúnmente "promotores inducibles" o "promotores regulables". Se reconoce además que puesto que en la mayoría de los casos los límites exactos de secuencias reguladoras no se han definido completamente, fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad de promotor idéntica.

La secuencia promotora normalmente está unida en su extremo 3' por el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende aguas arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, por mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa.

Los términos "endonucleasa de restricción" y "enzima de restricción" se usan indistintamente y se refieren a una enzima que se une y corta dentro de una secuencia de nucleótidos específica dentro de ADN bicatenario.

El término "plásmido" se refiere a un elemento extracromosómico que frecuentemente lleva un gen que no es parte del metabolismo central de la célula, y normalmente en forma de moléculas de ADN bicatenario circular. Dichos elementos pueden ser secuencias que se replican de forma autónoma, secuencias que se integran en el genoma, secuencias de fagos o nucleótidos, lineales, circulares, o superenrolladas, de un ADN o ARN mono o bicatenario, derivados de cualquier fuente, en las que varias secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una única construcción que es capaz de introducir un fragmento de promotor y secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con secuencia no traducida de 3' apropiada dentro de una célula.

Los vectores virales eucariotas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, vectores de adenovirus, vectores de retrovirus, vectores de virus adeno-asociado, poxvirus, por ejemplo, vectores de virus de la variolovacuna, vectores de baculovirus, o vectores de virus del herpes. Los vectores no virales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos eléctricamente cargados (citofectinas), complejos de ADN-proteína y biopolímeros.

Un "vector de clonación" se refiere a un "replicón", que es una unidad de longitud de un ácido nucleico que se replica secuencialmente y que comprende un origen de replicación, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de ácido nucleico de manera que provoque la replicación del segmento unido. Ciertos vectores de clonación son capaces de replicación en un tipo de célula, por ejemplo, bacterias, y expresión en otro, por ejemplo, células eucariotas. Los vectores de clonación normalmente comprenden una o más secuencias que se pueden usar para la selección de células que comprenden el vector y/o uno o más sitios de clonación múltiple para la inserción de secuencias de ácidos nucleicos de interés.

El término "vector de expresión" se refiere a un vehículo diseñado para permitir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos insertada tras la inserción en una célula hospedadora. La secuencia de ácidos nucleicos insertada se pone en asociación operativa con regiones reguladoras, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores se introducen en células hospedadoras por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola de genes, o un transportador de vector de ADN.

"Cultivo", "para cultivar" y "cultivar", como se usan en el presente documento, significa incubar células en condiciones in vitro que permite el crecimiento o división celular, o mantener las células en un estado vivo. "Células cultivadas", como se usa en el presente documento, significa células que son propagadas in vitro.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" pretende englobar un "polipéptido" singular, así como "polipéptidos" plurales, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) linealmente unidos por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica de producto. Así, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos", o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, están incluidos dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o indistintamente, con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, que incluyen, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, o modificación por aminoácidos que no existen de forma natural. Un polipéptido se puede obtener de una fuente biológica natural o se produce por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente de una secuencia de ácidos nucleicos designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química.

El término "aminoácido" incluye alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (Ile o I); leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V). También están dentro del alcance de la invención los aminoácidos no tradicionales e incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina, y otros análogos de restos de aminoácidos tales como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). Para generar dichos restos de aminoácidos que no existen de forma natural, se pueden usar los procedimientos de Noren et al. Science 244:182 (1989) y Ellman et al., arriba. Brevemente, estos procedimientos implican activar químicamente un ARNt supresor con un resto de aminoácido que no existe de forma natural, seguido por transcripción y traducción in vitro del ARN. La introducción del aminoácido no tradicional también se puede lograr usando químicas de péptidos conocidas en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido polar" incluye aminoácidos que tienen carga neta cero, pero tienen cargas parciales distintas de cero en diferentes porciones de sus cadenas laterales (por ejemplo M, F, W, S, Y, N, Q, C). Estos aminoácidos pueden participar en interacciones hidrófobas e interacciones electrostáticas. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido cargado" incluye aminoácidos que pueden tener carga neta distinta de cero en sus cadenas laterales (por ejemplo, R, K, H, E, D). Estos aminoácidos pueden participar en interacciones hidrófobas e interacciones electrostáticas.

Un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado del mismo, se refiere a un polipéptido que no está en su ámbito natural. No se requiere nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar simplemente de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas recombinantemente producidos expresados en células hospedadoras se consideran aislados para el fin de la invención, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido separados, fraccionados, o parcialmente o sustancialmente purificados, por cualquier técnica adecuada.

También se incluyen en la presente invención fragmentos o variantes de polipéptidos, y cualquier combinación de los mismos. El término "fragmento" o "variante", cuando se refiere a dominios de unión a polipéptido o moléculas de unión de la presente invención, incluye cualquier polipéptido que retenga al menos algunas de las propiedades (por ejemplo, afinidad de unión de FcRn por un dominio de unión de FcRn o variante de Fc, actividad de coagulación para una variante de FVIII, o la actividad de unión de FVIII para el fragmento de VWF) del polipéptido de referencia. Los fragmentos de polipéptidos incluyen fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción, además de los fragmentos específicos de anticuerpo tratados en cualquier parte en el presente documento, pero no incluyen el polipéptido de longitud completa que existe de forma natural (o polipéptido maduro). Las variantes de dominios de unión de polipéptido o moléculas de unión de la presente invención incluyen fragmentos como se ha descrito anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones de aminoácidos, deleciones, o inserciones. Las variantes pueden existir de forma natural o no existir de forma natural. Las variantes que no existen de forma natural se pueden producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos de variante pueden comprender sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos, deleciones o adiciones.

Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales betaramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, si un aminoácido en un polipéptido se sustituye por otro aminoácido de la misma familia de cadena lateral, se considera que la sustitución es conservativa. En otra realización, una cadena de aminoácidos se puede sustituir conservativamente con una cadena estructuralmente similar que se diferencia en orden y/o composición de los miembros de familia de la cadena lateral.

El término "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de vinculación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según lo requiera el caso, como se ha determinado por el emparejamiento entre series de dichas secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); y Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar el mejor emparejamiento entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Se pueden realizar alineamientos de secuencias y cálculos del porcentaje de identidad usando software de análisis de secuencias, tal como el programa Megalign del paquete de cálculo bioinformático LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), el paquete de programas GCG (Wisconsin Package versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J Mol. Biol. 215:403 (1990)) y DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 EE. UU.). Dentro del contexto de la presente solicitud se entenderá que donde se usa el software de análisis de secuencias para el análisis, que los resultados del análisis se basarán en los "valores por defecto" del programa referenciado, a menos que se especifique de otro modo. Como se usa en el presente documento, "valores por defecto" significará cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el software cuando se inicia por primera vez. A efectos de determinar el porcentaje de identidad entre una secuencia de FVIII BDD optimizado de la invención y una secuencia de referencia, solo los nucleótidos en la secuencia de referencia correspondientes a los nucleótidos en la secuencia de FVIII BDD optimizado de la invención se usan para calcular el porcentaje de identidad. Por ejemplo, cuando se compara una secuencia de nucleótidos de FVIII de longitud completa que contiene el dominio B con una secuencia de nucleótidos de FVIII delecionado en el dominio B (BDD) optimizado de la invención, la porción del alineamiento que incluye el dominio A1, A2, A3, C1 y C2 se usará para calcular el porcentaje de identidad. Los nucleótidos en la porción de la secuencia de FVIII de longitud completa que codifican el dominio B (que dará como resultado un gran "hueco" en el alineamiento) no se contarán como un desapareamiento.

Como se usa en el presente documento, "nucleótidos correspondientes a nucleótidos en la secuencia de FVIII de BDD optimizado de la invención" se identifican por alineamiento de la secuencia de FVIII BDD optimizado de la invención para maximizar la identidad con la secuencia de FVIII de referencia. El número usado para identificar un aminoácido equivalente en una secuencia de FVIII de referencia se basa en el número usado para identificar el aminoácido correspondiente en la secuencia de FVIII BDD optimizado de la invención.

Una proteína de "fusión" o "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos unida a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no se une naturalmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en proteínas separadas se pueden poner juntas en el polipéptido de fusión, o las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en la misma proteína se pueden poner en una nueva disposición en el polipéptido de fusión, por ejemplo, fusión de un dominio de factor VIII de la invención con un dominio Fc de Ig. Una proteína de fusión se crea, por ejemplo, por síntesis química, o por creación y traducción de un polinucleótido en el que las regiones de péptido están codificadas en la relación deseada. Una proteína quimérica puede comprender además una segunda secuencia de aminoácidos asociada a la primera secuencia de aminoácidos por un enlace no peptídico covalente, o un enlace no covalente.

Como se usa en el presente documento, el término "semivida" se refiere a una semivida biológica de un polipéptido particular in vivo. La semivida se puede representar por el tiempo requerido para que la mitad de la cantidad administrada a un sujeto sea eliminada de la circulación y/u otros tejidos en el animal. Cuando se construye una curva de eliminación de un polipéptido dado en función del tiempo, la curva es normalmente bifásica con una fase a rápida y una fase p larga. La fase a normalmente representa un equilibrio del polipéptido de Fc administrado entre el espacio intra- y extra-vascular y se determina, en parte, por el tamaño del polipéptido. La fase p normalmente representa el catabolismo del polipéptido en el espacio intravascular. En algunas realizaciones, FVIII y las proteínas quiméricas que comprenden FVIII son monofásicas, y así no tienen una fase alfa, sino solo la fase beta individual. Por tanto, en ciertas realizaciones, el término semivida, como se usa en el presente documento, se refiere a la semivida del polipéptido en la fase p.

El término "unido", como se usa en el presente documento, se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos covalentemente o no covalentemente unida a una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, respectivamente. La primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos se puede unir directamente o yuxtaponer con la segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, o alternativamente una secuencia intercalada puede unir covalentemente la primera secuencia con la segunda secuencia. El término "unido" significa no solo una fusión de una primera secuencia de aminoácidos con una segunda secuencia de aminoácidos en el extremo C o el extremo N, sino que también incluye la inserción de toda la primera secuencia de aminoácidos (o la segunda secuencia de aminoácidos) en cualesquiera dos aminoácidos en la segunda secuencia de aminoácidos (o la primera secuencia de aminoácidos, respectivamente). En una realización, la primera secuencia de aminoácidos se puede unir a una segunda secuencia de aminoácidos por un enlace peptídico o un conector. La primera secuencia de nucleótidos se puede unir a una segunda secuencia de nucleótidos por un enlace fosfodiéster o un conector. El conector puede ser un péptido o un polipéptido (para cadenas de polipéptidos) o un nucleótido o una cadena de nucleótidos (para cadenas de nucleótidos), o cualquier resto químico (para tanto cadenas de polipéptidos como de polinucleótidos). El término "unido" también se indica por un guión (-).

Como se usa en el presente documento, el término "asociado a" se refiere a un enlace covalente o no covalente formado entre una primera cadena de aminoácidos y una segunda cadena de aminoácidos. En una realización, el término "asociado a" significa un enlace no peptídico covalente, o un enlace no covalente. Esta asociación se puede indicar por dos puntos, es decir, (:). En otra realización, significa un enlace covalente, excepto un enlace peptídico. Por ejemplo, el aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un grupo tiol en un segundo resto de cisteína. En la mayoría de las moléculas de IgG que existen de forma natural, las regiones CH1 y CL están asociadas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están asociadas por dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU). Los ejemplos de enlaces covalentes incluyen, pero no se limitan a, un enlace peptídico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, un enlace disulfuro, un enlace sigma, un enlace pi, un enlace delta, un enlace glucosídico, un enlace agnóstico, un enlace flexionado, un enlace dipolar, un esqueleto pi, un doble enlace, un triple enlace, un cuádruple enlace, un quíntuple enlace, un séxtuple enlace, conjugación, hiperconjugación, aromaticidad, hapticidad o antienlace. Los ejemplos no limitantes de enlace no covalente incluyen un enlace iónico (por ejemplo, enlace catión-pi o enlace de sal), un enlace metálico, un enlace de hidrógeno (por ejemplo, enlace de dihidrógeno, complejo de dihidrógeno, enlace de hidrógeno de baja barrera, o enlace de hidrógeno simétrico), fuerza de van der Walls, fuerza de dispersión de London, un enlace mecánico, un enlace halógeno, aurofilicidad, intercalación, apilamiento, fuerza entrópica o polaridad química.

El término "híbrido monómero-dímero" usado en el presente documento se refiere a una proteína quimérica que comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, que están asociadas entre sí por un enlace disulfuro, en donde la primera cadena comprende un factor de coagulación, por ejemplo, factor VIII, y una primera región Fc y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una segunda región Fc sin el factor de coagulación. La construcción híbrida monómero-dímero es así un híbrido que comprende un aspecto de monómero que tiene solo un factor de coagulación y un aspecto de dímero que tiene dos regiones Fc.

Hemostasia, como se usa en el presente documento, significa la detención o el ralentizamiento del sangrado o la hemorragia; o la detención o el ralentizamiento de la circulación sanguínea a través de un vaso sanguíneo o parte del cuerpo.

Trastorno hemostático, como se usa en el presente documento, significa una afección genéticamente heredada o adquirida caracterizada por una tendencia a hemorragia, o espontáneamente, o como resultado de traumatismo, debido a una capacidad alterada o incapacidad de formar un coágulo de fibrina. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen las hemofilias. Las tres formas principales son hemofilia A (deficiencia de factor VIII), hemofilia B (deficiencia de factor IX o "enfermedad de Christmas") y hemofilia C (deficiencia de factor XI, tendencia a sangrado leve). Otros trastornos hemostáticos incluyen, por ejemplo, enfermedad de von Willebrand, deficiencia de factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia de factor XII, deficiencias o anomalías estructurales en fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X o factor XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que es un defecto o deficiencia en GPIb. GPIb, el receptor para vWF, puede ser defectuoso y conducir a una ausencia de formación de coágulos primarios (hemostasia primaria) y elevada tendencia al sangrado), y trombastenia de Glanzman y Naegeli (trombastenia de Glanzmann). En insuficiencia hepática (formas agudas y crónicas), existe producción insuficiente de factores de coagulación por el hígado; esto puede aumentar el riesgo de sangrado.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas o los polipéptidos de la invención se pueden usar profilácticamente. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento profiláctico" se refiere a la administración de una molécula antes de un episodio de sangrado. En una realización, el sujeto en necesidad de un agente hemostático general se somete a, o está a punto de someterse a, cirugía. La proteína quimérica de la invención se puede administrar antes o después de la cirugía como un profiláctico. La proteína quimérica de la invención se puede administrar durante o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo. La cirugía puede incluir, pero no se limita a, trasplante de hígado, resección hepática, procedimientos dentales, o trasplante de células madre.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas y los polipéptidos de la invención también se usan para tratamiento a demanda. El término "tratamiento a demanda" se refiere a la administración de una molécula de ácido nucleico aislada o polipéptido en respuesta a síntomas de un episodio hemorrágico o antes de una actividad que puede provocar sangrado. En un aspecto, el tratamiento a demanda (episódico) se puede administrar a un sujeto cuando el sangrado empieza, tal como después de una lesión, o cuando se espera sangrado, tal como antes de cirugía. En otro aspecto, el tratamiento a demanda se puede administrar antes de actividades que aumentan el riesgo de sangrado, tales como deportes de contacto.

Como se usa en el presente documento, el término "sangrado agudo" se refiere a un episodio de sangrado independientemente de la causa subyacente. Por ejemplo, un sujeto puede tener traumatismo, uremia, un trastorno de sangrado hereditario (por ejemplo, deficiencia de factor VII), un trastorno plaquetario, o resistencia debido al desarrollo de anticuerpos contra factores de coagulación.

Tratar, tratamiento, tratando, como se usa en el presente documento, se refiere a, por ejemplo, la reducción en la gravedad de una enfermedad o afección; la reducción en la duración de una evolución de la enfermedad; la mejora de uno o más síntomas asociados a una enfermedad o afección; la provisión de efectos beneficiosos a un sujeto con una enfermedad o afección, sin curar necesariamente la enfermedad o afección, o la profilaxis de uno o más síntomas asociados a una enfermedad o afección. En una realización, el término "tratar" o "tratamiento" significa mantener un nivel valle de FVIII de al menos aproximadamente 1 UI/dL, 2 UI/dL, 3 UI/dL, 4 UI/dL, 5 UI/dL, 6 UI/dL, 7 UI/dL, 8 UI/dL, 9 UI/dL, 10 UI/dL, 11 UI/dL, 12 UI/dL, 13 UI/dL, 14 UI/dL, 15 UI/dL, 16 UI/dL, 17 UI/dL, 18 UI/dL, 19 UI/dL o 20 UI/dL en un sujeto administrando una molécula de ácido nucleico aislada o polipéptido de la invención. En otra realización, tratar o tratamiento significa mantener un nivel valle de FVIII entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 2 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 3 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 4 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 5 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 6 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 7 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 8 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 9 y aproximadamente 20 UI/dL, o aproximadamente 10 y aproximadamente 20 UI/dL. Tratamiento o tratar dei una enfermedad o afección también puede incluir mantener la actividad de FVIII en un sujeto a un nivel comparable a al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, o 20 % de la actividad de FVIII en un sujeto no hemofílico. El nivel valle mínimo requerido para el tratamiento se puede medir por uno o más métodos conocidos y se puede ajustar (aumentar o reducir) para cada persona.

"Administrar", como se usa en el presente documento, significa dar un polipéptido de factor VIII farmacéuticamente aceptable de la invención a un sujeto por una vía farmacéuticamente aceptable. Las vías de administración pueden ser intravenosas, por ejemplo, inyección intravenosa e infusión intravenosa. Las vías de administración adicionales incluyen, por ejemplo, administración subcutánea, intramuscular, oral, nasal y pulmonar. Se pueden administrar polipéptidos quiméricos y proteínas híbridas como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sujeto en necesidad del mismo" incluye sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiarían de la administración de una molécula de ácido nucleico o un polipéptido de la invención, por ejemplo, para mejorar la hemostasia. En una realización, los sujetos incluyen, pero no se limitan a, individuos con hemofilia. En otra realización, los sujetos incluyen, pero no se limitan a, los individuos que han desarrollado un inhibidor de FVIII y así están en necesidad de una terapia de derivación. El sujeto puede ser un adulto o un menor de edad (por ejemplo, menos de 12 años).

Como se usa en el presente documento, el término "factor de coagulación" se refiere a moléculas, o análogos de las mismas, que existen de forma natural o se producen recombinantemente que previenen o disminuyen la duración de un episodio hemorrágico en un sujeto. En otras palabras, significa que las moléculas que tienen actividad pro coagulante, es decir, son responsables de la conversión de fibrinógeno en una malla de fibrina insoluble que causa que la sangre coagule. Un "factor de coagulación activable" es un factor de coagulación en una forma inactiva (por ejemplo, en su forma de zimógeno) que es capaz de ser convertido en una forma activa.

La actividad de coagulación, como se usa en el presente documento, significa la capacidad de participar en una cascada de reacciones bioquímicas que culmina en la formación de un coágulo de fibrina y/o reduce la intensidad, duración o frecuencia de la hemorragia o episodio hemorrágico.

Como se usa en el presente documento, los términos "heterólogo" o "exógeno" se refieren a dichas moléculas que no se encuentran normalmente en un contexto dado, por ejemplo, en una célula o en un polipéptido. Por ejemplo, se puede introducir una molécula exógena o heteróloga en una célula y solo están presentes después de la manipulación de la célula, por ejemplo, por transfección u otras formas de ingeniería genética o una secuencia heteróloga de aminoácidos pueden estar presentes en una proteína en la que no se encuentra naturalmente.

Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de nucleótidos heteróloga" se refiere a una secuencia de nucleótidos que no ocurre naturalmente con una secuencia de polinucleótidos dada. En una realización, la secuencia heteróloga de nucleótidos codifica un polipéptido capaz de prolongar la semivida de FVIII. En otra realización, la secuencia heteróloga de nucleótidos codifica un polipéptido que aumenta el radio hidrodinámico de FVIII. En otras realizaciones, la secuencia heteróloga de nucleótidos codifica un polipéptido que mejora una o más propiedades farmacocinéticas de FVIII sin afectar significativamente su actividad o función biológica (por ejemplo, su actividad procoagulante). En algunas realizaciones, FVIII se une o conecta con el polipéptido codificado por la secuencia heteróloga de nucleótidos por un conector. Los ejemplos no limitantes de restos de polipéptido codificados por secuencias de nucleótidos heterólogas incluyen una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una transferrina, los polipéptidos PAS de la solicitud de patente de EE. UU. N° 20100292130, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de la misma, el péptido del extremo C (CTP) de la subunidad p de gonadotropina coriónica humana, molécula pequeña de unión a albúmina, una secuencia XTEN, restos de unión a FcRn (por ejemplo, regiones Fc completas o porciones de la misma que se unen a FcRn), regiones Fc de una sola cadena (regiones scFc, por ejemplo, como se describe en los documentos de patente uS 2008/0260738, WO 2008/012543 o WO 2008/1439545), conectores de poliglicina, conectores de poliserina, péptidos y polipéptidos cortos de 6-40 aminoácidos de dos tipos de aminoácidos seleccionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) con grados variables de estructura secundaria desde menos del 50 % hasta más del 50 %, entre otros, o dos o más combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido codificado por la secuencia heteróloga de nucleótidos se une a un resto no de polipéptido. Los ejemplos no limitantes de los restos no de polipéptido incluyen polietilenglicol (PEG), moléculas pequeñas de unión a albúmina, ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado del mismo, o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, el término "región Fc" se define como la porción de un polipéptido que corresponde a la región Fc de Ig nativa, es decir, como se forma por la asociación dimérica de los dominios Fc respectivos de sus dos cadenas pesadas. Una región Fc nativa forma un homodímero con otra región Fc. A diferencia, el término "región Fc genéticamente fusionada" o "región Fc de una sola cadena" (región scFc), como se usa en el presente documento, se refiere a una región Fc dimérica sintética que comprende los dominios Fc genéticamente unidos dentro de una única cadena de polipéptidos (es decir, codificada en una única secuencia genética contigua).

En una realización, la "región Fc" se refiere a la porción de una única cadena pesada de Ig que empieza en la región bisagra justo en la dirección 5' del sitio de escisión por papaína (es decir, el resto 216 en IgG, considerando que el primer resto de la región constante de la cadena pesada es 114) y que termina en el extremo C del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio Fc completo comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.

La región Fc de una región constante de Ig, dependiendo del isotipo de Ig, puede incluir los dominios CH2, CH3 y CH4, así como la región bisagra. Las proteínas quiméricas que comprenden una región Fc de una Ig conceden varias propiedades deseables a una proteína quimérica que incluyen elevada estabilidad, elevada semivida en suero (véase Capon et al., 1989, Nature 337:525), así como unión a receptores de Fc tales como el receptor de Fc neonatal (FcRn) (patentes de EE. UU. N° 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; documentos de patente WO 03/077834; US2003-0235536A1).

Una "secuencia de nucleótidos de referencia", cuando se usa en el presente documento como una comparación con una secuencia de nucleótidos de la invención, es una secuencia de polinucleótidos esencialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de la invención, excepto que las porciones correspondientes a la secuencia de FVIII no están optimizadas. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de referencia para una molécula de ácido nucleico que consiste en FVIII BDD optimizado por codones de SEQ ID NO: 1 y una secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica una región Fc de una sola cadena unida a SEQ ID NO: 1 en su extremo 3' es una molécula de ácido nucleico que consiste en el FVIII BDD original (o "parental") de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de nucleótidos heteróloga idéntica que codifica una región Fc de una sola cadena unida a SEQ ID NO: 3 en su extremo 3'.

Un "índice de adaptación de codones", como se usa en el presente documento, se refiere a una medida del sesgo de uso de codones. Un índice de adaptación de codones (IAC) mide la desviación de una secuencia de genes codificantes de proteína dada con respecto a un conjunto de referencia de genes (Sharp PM y Li WH, Nucleic Acids Res. 15(3):1281 -95 (1987)). IAC se calcula determinando la media geométrica del peso asociado a cada codón a lo largo de la longitud de la secuencia del gen (medida en codones):

Para cada aminoácido, el peso de cada uno de sus codones, en IAC, se calcula como la relación entre la frecuencia observada del codón (fi) y la frecuencia del codón sinónimo (fj) para ese aminoácido:

Fórmula 2:

€ [codones sinónimos para el aminoácido]

(II)

Como se usa en el presente documento, el término "optimizado", con respecto a secuencias de nucleótidos, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de polinucleótidos se ha mutado para potenciar una propiedad de esa secuencia de polinucleótidos. En algunas realizaciones, la optimización se hace para aumentar los niveles de transcripción, aumentar los niveles de traducción, aumentar los niveles de ARNm en estado estacionario, aumentar o disminuir la unión de proteínas reguladoras, tales como factores de transcripción generales, aumentar o disminuir el corte y empalme, o aumentar el rendimiento del polipéptido producido por la secuencia de polinucleótidos. Los ejemplos de cambios que se pueden hacer a una secuencia de polinucleótidos para optimizarla incluyen la optimización por codones, optimización del contenido de G/C, retirada de secuencias de repetición, retirada de elementos ricos en AT, retirada de espacios crípticos de corte y empalme, retirada de elementos que actúan en cis que reprimen la transcripción o traducción, adición o retirada de secuencias de poli-T o poli-A, adición de secuencias alrededor del sitio de inicio de la transcripción que potencian la transcripción, tal como secuencias consenso de Kozak, retirada de secuencias que podrían formar estructuras de tallo-lazo, retirada de secuencias desestabilizantes, y dos o más combinaciones de los mismos.

La presente invención se refiere a secuencias del factor VIII optimizado, vectores y células hospedadoras que comprenden secuencias de factor VIII optimizado, polipéptidos codificados por secuencias de factor VIII optimizado, y a métodos de producción de dichos polipéptidos. La presente invención también se refiere a métodos de tratamiento de trastornos hemorrágicos tales como hemofilia que comprenden administrar al sujeto una secuencia de ácidos nucleicos de factor VIII optimizado o el polipéptido así codificado. La presente invención cumple una necesidad importante en la técnica proporcionando secuencias de factor VIII optimizado que demuestran un aumento de la expresión en células hospedadoras, rendimiento mejorado de la proteína factor VIII en métodos para producir factor VIII recombinante, y dan posiblemente como resultado mayor eficacia terapéutica cuando se usa en métodos de terapia génica.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de factor VIII (FVIII), en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos es al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a SEQ ID NO: 1 y codifica un polipéptido con actividad de FVIII. En otras realizaciones más, la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos es al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a SEQ ID NO: 2 y codifica un polipéptido con actividad de FVIII. En otras realizaciones más, la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 1 y 2 son versiones optimizadas de SEQ ID NO: 3, la secuencia de nucleótidos de FVIII inicial o "parental". SEQ ID NO: 3 codifica un FVIII humano de dominio B delecionado. Aunque SEQ ID NO: 1 y 2 derivan de una forma específica de dominio B delecionado de FVIII (SEQ ID NO: 3), se debe entender que la presente invención también se refiere a versiones optimizadas de ácidos nucleicos que codifican otras versiones de FVIII. Por ejemplo, otra versión de FVIII puede incluir FVIII de longitud completa, otras deleciones del dominio B de FVIII (descritas a continuación), u otros fragmentos de FVIII que retienen actividad de FVIII.

"Un polipéptido con actividad de FVIII" como se usa en el presente documento significa un polipéptido FVIII funcional en su función normal en la coagulación, a menos que se especifique de otro modo. El término un polipéptido con actividad de FVIII incluye un fragmento funcional, variante, análogo o derivado del mismo que retiene la función de factor VIII natural de longitud completa en la vía de coagulación. "Un polipéptido con actividad de FVIII" se usa indistintamente con proteína FVIII, polipéptido FVIII o FVIII. Los ejemplos de funciones de FVIII incluyen, pero no se limitan a, una capacidad para activar la coagulación, una capacidad para actuar de cofactor para el factor IX, o una capacidad para formar un complejo de tenasa con el factor IX en presencia de Ca2+ y fosfolípidos, que luego convierte el factor X en la forma activada Xa. En una realización, un polipéptido que tiene actividad de FVIII comprende dos cadenas de polipéptidos, la primera cadena que tiene la cadena pesada de FVIII y la segunda cadena que tiene la cadena ligera de FVIII. En otra realización, el polipéptido que tiene actividad de FVIII es FVIII de una sola cadena. FVIII de una sola cadena puede contener una o más mutaciones o sustituciones en el resto de aminoácido 1645 y/o 1648 correspondientes a la secuencia de FVIII maduro. Véase la solicitud internacional N° PCT/US2012/045784. La proteína FVIII puede ser la proteína FVIII humana, porcina, canina, de rata o murina. Además, las comparaciones entre FVIII de seres humanos y otras especies han identificado restos conservados que es probable que se requieran para la función (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); documento de patente US 6.251.632).

El "dominio B" de FVIII, como se usa en el presente documento, es el mismo que el dominio B conocido en la técnica que se define por identidad interna de secuencia de aminoácidos y sitios de escisión proteolítica por trombina, por ejemplo, los restos Ser741-Arg1648 de FVIII humano de longitud completa. Los otros dominios de FVIII humano se definen por los siguientes restos de aminoácidos: A1, restos Ala1-Arg372; A2, restos Ser373-Arg740; A3, restos Ser1690-Ile2032; C1, restos Arg2033-Asn2172; C2, restos Ser2173-Tyr2332. La secuencia de A3-C1-C2 incluye los restos Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, los restos Glu1649-Arg1689, se denomina normalmente el péptido de activación de la cadena ligera de FVIII. También se conocen en la técnica las localizaciones de los límites para todos los dominios, que incluyen los dominios B, para FVIII porcino, de ratón y canino. Un ejemplo de un FVIII BDD es el FVIII BDD recombinante REFACTO® (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.).

Un "FVIII de dominio B delecionado" puede tener las deleciones completas o parciales desveladas en las patentes de EE. UU. N26.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 y 6.458.563. En algunas realizaciones, una secuencia de FVIII de dominio B delecionado de la presente invención comprende una cualquiera de las deleciones desveladas en la col. 4, línea 4 a col. 5, línea 28 y los Ejemplos 1-5 de la patente de E^e. UU. N° 6.316.226 (también en el documento de patente US 6.346.513). En algunas realizaciones, un FVIII de dominio B delecionado de la presente invención tiene una deleción desvelada en la col. 2, líneas 26-51 y Ejemplos 5-8 de la patente de EE. UU. N° 5.789.203 (también los documentos de patente US 6.060.447, U^s5.595.886 y US 6.228.620). En algunas realizaciones, un FVIII de dominio B delecionado tiene una deleción descrita en la col. 1, líneas 25 a col. 2, línea 40 de la patente de EE. UU. N° 5.972.885; col. 6, líneas 1-22 y Ejemplo 1 de la patente de EE. UU. N° 6.048.720; col. 2, líneas 17-46 de la patente de EE. UU. N° 5.543.502; col. 4, línea 22 a col. 5, línea 36 de la patente de EE. UU. N° 5.171.844; col. 2, líneas 55-68, Figura 2, y el Ejemplo 1 de la patente de EE. UU. N° 5.112.950; col. 2, línea 2 a col.

19, línea 21 y Tabla 2 de la patente de EE. UU. N° 4.868.112; col. 2, línea 1 a col. 3, línea 19, col. 3, línea 40 a col.

4, línea 67, col. 7, línea 43 a col. 8, línea 26, y col. 11, línea 5 a col. 13, línea 39 de la patente de EE. UU. N° 7.041.635; o col. 4, líneas 25-53, de la patente de EE. UU. N° 6.458.563. En algunas realizaciones, un FVIII de dominio B delecionado tiene una deleción de la mayor parte del dominio B, pero aún contiene secuencias de extremo amino del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primaria en dos cadenas de polipéptido, como se desvela en documento de patente WO 91/9122. En algunas realizaciones, un FVIII de dominio B delecionado se construye con una deleción de aminoácidos 747-1638, es decir, prácticamente una deleción completa del dominio B. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Un FVIII de dominio B delecionado también puede contener una deleción de aminoácidos 771-1666 o aminoácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Las deleciones del dominio B adicional que son parte de la invención incluyen, por ejemplo: deleción de los aminoácidos 982 a 1562 o 760 a 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 a 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 a 1646 (Kaufman (solicitud PCT publicada N2 WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 a 1648 (Pasek (solicitud PCT N288/00831)), 816 a 1598 o 741 a 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, documento de patente EP 295597)). Cada una de las deleciones anteriores se puede hacer en cualquier secuencia de FVIII.

Se desvelan varias moléculas de FVIII funcionales, que incluyen deleciones del dominio B, en las siguientes patentes US 6.316.226 y US 6.346.513, ambas cedidas a Baxter; US 7.041.635 cedidas a In2Gen; US 5.789.203, US 6.060.447, US 5.595.886 y US 6.228.620 cedidas a Chiron; US 5.972.885 y US 6.048.720 cedidas a Biovitrum, US 5.543.502 y US 5.610.278 cedidas a Novo Nordisk; US 5.171.844 cedidas a Immuno Ag; US 5.112.950 cedidas a Transgene S.A.; US 4.868.112 cedidas a Genetics Institute.

Optimización por codones

En una realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de ácidos nucleicos se ha optimizado por codones. En otra realización, la secuencia de ácidos nucleicos inicial que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que se somete a la optimización por codones es SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la secuencia que codifica un polipéptido con actividad de FVIII se optimiza por codones para la expresión humana. En otras realizaciones, la secuencia que codifica un polipéptido con actividad de FVIII se optimiza por codones para la expresión murina. SEQ ID NO: 1 y 2 son versiones optimizadas por codones de SEQ ID NO: 3, optimizadas para expresión humana.

El término "optimizado por codones", como se refiere a genes o regiones codificantes de moléculas de ácidos nucleicos para la transformación de diversos hospedadores, se refiere a la alteración de codones en el gen o las regiones codificantes de las moléculas de ácidos nucleicos para reflejar el uso típico de codones del organismo hospedador sin alterar el polipéptido codificado por el ADN. Dicha optimización incluye sustituir al menos uno, o más de uno, o un número significativo, de codones con uno o más codones que se usan más frecuentemente en los genes de ese organismo.

Las desviaciones en la secuencia de nucleótidos que comprenden los codones que codifican los aminoácidos de cualquier cadena de polipéptidos permiten variaciones en la secuencia que codifica el gen. Puesto que cada codón consiste en tres nucleótidos, y los nucleótidos que comprenden el ADN están restringidos a cuatro bases específicas, existen 64 combinaciones posibles de nucleótidos, 61 de las cuales codifican aminoácidos (los tres codones restantes codifican señales que terminan la traducción). El "código genético" que muestra qué codones codifican qué aminoácidos se reproduce en el presente documento como la Tabla 1. Como resultado, muchos aminoácidos se designan por más de un codón. Por ejemplo, los aminoácidos alanina y prolina están codificados por cuatro tripletes, serina y arginina por seis, mientras que triptófano y metionina están codificados por solo un triplete. Esta degeneración permite que la composición de bases de ADN varíe en un amplio intervalo sin alterar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el ADN.

Tabla 1. El código genético estándar

Muchos organismos muestran un sesgo para que el uso de codones particulares codifique la inserción de un aminoácido particular en una cadena de péptido en crecimiento. Se proporciona preferencia de codones, o preferencia codónica, diferencia en el uso de codones entre organismos, por la degeneración del código genético, y está bien documentada entre muchos organismos. La preferencia codónica se correlaciona frecuentemente con la eficiencia de traducción de ARN mensajero (ARNm), que se cree a su vez que es dependiente, entre otros, de las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de las moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particular. La predominancia de ARNt seleccionados en una célula es, en general, una reflexión de los codones más frecuentemente usados en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes se pueden adaptar para la expresión génica óptima en un organismo dado basándose en la optimización por codones.

Dado el gran número de secuencias de genes disponible para una amplia variedad de especies animales, vegetales y microbianas, se han calculado las frecuencias relativas de uso de codones. Las tablas de uso de codones están disponibles, por ejemplo, en "Codon Usage Database" disponible en www.kazusa.or.jp/codon/ (visitado el 18 de junio de 2012). Véase Nakamura, Y., et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000).

Se puede hacer manualmente la asignación aleatoria de codones a una frecuencia optimizada para codificar una secuencia de polipéptidos dada calculando frecuencias de codones para cada aminoácido, y luego asignando los codones a la secuencia de polipéptidos aleatoriamente. Además, se pueden usar diversos algoritmos y programas informáticos de software para calcular una secuencia óptima.

En una realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde el índice de adaptación de codones humanos es elevado con respecto a SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 puede tener un índice de adaptación de codones humanos que es al menos aproximadamente 0,75, al menos aproximadamente 0,76, al menos aproximadamente 0,77, al menos aproximadamente 0,78, al menos aproximadamente 0,79, al menos aproximadamente 0,80, al menos aproximadamente 0,81, al menos aproximadamente 0,82, al menos aproximadamente 0,83, al menos aproximadamente 0,84, al menos aproximadamente 0,85, al menos aproximadamente 0,86, al menos aproximadamente 0,87, al menos aproximadamente 0,88, al menos aproximadamente 0,89, o al menos aproximadamente 0,90.

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de factor VIII (FVIII), en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde el índice de adaptación de codones humanos es elevado con respecto a SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 2 pueden tener un índice de adaptación de codones humanos que es al menos aproximadamente 0,75, al menos aproximadamente 0,76, al menos aproximadamente 0,77, al menos aproximadamente 0,78, al menos aproximadamente 0,79, al menos aproximadamente 0,80, al menos aproximadamente 0,81, al menos aproximadamente 0,82, al menos aproximadamente 0,83, al menos aproximadamente 0,84, al menos aproximadamente 0,85, al menos aproximadamente 0,86, al menos aproximadamente 0,87, al menos aproximadamente 0,88, al menos aproximadamente 0,89, o al menos aproximadamente 0,90.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de factor VIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 y tiene una o más de las siguientes características: (1) la secuencia de nucleótidos contiene un mayor porcentaje de nucleótidos G/C en comparación con SEQ ID NO: 3, (2) la secuencia de nucleótidos contiene menos secuencias MARS/ARS en comparación con SEQ ID NO: 3, (3) la secuencia de nucleótidos no contiene el sitio de corte y empalme GGTGAT, (4) la secuencia de nucleótidos contiene menos elementos desestabilizantes, (5) la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-T, (6) la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-A, (7) la secuencia de nucleótidos tiene un índice de adaptación de codones que es elevado con respecto a SEQ ID NO: 3, o una combinación de dos o más de dichas características. En una realización particular, la secuencia de nucleótidos contiene todas las características (1) a (6).

En otras realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de factor VIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 y tiene una o más de las siguientes características: (1) la secuencia de nucleótidos contiene un mayor porcentaje de nucleótidos G/C en comparación con SEQ ID NO: 3, (2) la secuencia de nucleótidos contiene menos secuencias MARS/ARS, (3) la secuencia de nucleótidos no contiene el sitio de corte y empalme GGTGAT, (4) la secuencia de nucleótidos contiene menos elementos desestabilizantes, (5) la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-T, (6) la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-A, (7) la secuencia de nucleótidos tiene un índice de adaptación de codones que es elevado con respecto a SEQ ID NO: 3, o una combinación de dos o más de dichas características. En una realización particular, la secuencia de nucleótidos contiene todas las características (1) a (6).

Optimización del contenido de G/C

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene un mayor porcentaje de nucleótidos G/C en comparación con el porcentaje de nucleótidos G/C en SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 tiene un contenido de G/C que es al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 46 %, al menos aproximadamente 47 %, al menos aproximadamente 48 %, al menos aproximadamente 49 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 51 %, al menos aproximadamente 52 %, al menos aproximadamente 53 %, al menos aproximadamente 54 %, o al menos aproximadamente 55 %.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene un mayor porcentaje de nucleótidos G/C en comparación con el porcentaje de nucleótidos G/C en SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 tiene un contenido de G/C que es al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 46 %, al menos aproximadamente 47 %, al menos aproximadamente 48 %, al menos aproximadamente 49 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 51 %, al menos aproximadamente 52 %, al menos aproximadamente 53 %, al menos aproximadamente 54 %, o al menos aproximadamente 55 %.

"Contenido de G/C" (o contenido de guanina-citosina), o "porcentaje de nucleótidos G/C", se refiere al porcentaje de bases nitrogenadas en una molécula de ADN que son o guanina o citosina. El contenido de G/C se puede calcular usando la siguiente fórmula:

Los genes humanos son altamente heterogéneos en su contenido de G/C, teniendo algunos genes un contenido de G/C de tan solo 20 %, y teniendo otros genes un contenido de G/C de hasta 95 %. En general, los genes ricos en G/C se expresan más altamente. En realidad, se ha demostrado que el aumento del contenido de G/C de un gen puede conducir al aumento de la expresión del gen, debido principalmente a un aumento en la transcripción y mayores niveles de ARNm en estado estacionario. Véase Kudla et al., PLoS Biol., 4(6): e180 (2006).

Secuencias de tipo región de unión a matriz

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene menos secuencias MARS/ARS con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 contiene como máximo 6, como máximo 5, como máximo 4, como máximo 3, o como máximo 2 secuencias MARS/ARS. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 contiene como máximo 1 secuencia MARS/ARS. En aún otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 no contiene una secuencia MARS/ARS.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene menos secuencias MARS/ARS con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 contiene como máximo 6, como máximo 5, como máximo 4, como máximo 3, o como máximo 2 secuencias MARS/ARS. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 contiene como máximo 1 secuencia MARS/ARS. En aún otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 no contiene una secuencia MARS/ARS.

Se han identificado elementos ricos den AT en la secuencia de nucleótidos de FVIII humano que comparten similitud de secuencias con secuencias de replicación autónoma (ARS) de Sacaromyces cerevisiae y regiones de unión a la matriz nuclear (MAR). (Fallux et al., Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996). Se ha demostrado que uno de estos elementos se une a factores nucleares in vitro y reprime la expresión de un gen indicador de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Ídem. Se ha supuesto que estas secuencias pueden contribuir a la represión transcripcional del gen FVIII humano. Así, en una realización, todas las secuencias de MAR/ARS se suprimen en el gen FVIII de la presente invención. Existen cuatro secuencias de MAR/ARS ATATTT (SEQ ID NO: 5) y tres secuencias de MAR/ARS AAATAT (SEQ ID NO: 6) en la secuencia de FVIII parental (SEQ ID NO: 3). Todos estos sitios se mutaron para destruir las secuencias de MAR/ARS en las secuencias de FVIII optimizado (S^eQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2).

La localización de cada uno de estos elementos, y la secuencia de los nucleótidos correspondientes en las secuencias optimizadas se muestran en la Tabla 2, a continuación.

Tabla 2: Resumen de cambios a elementos represores

Secuencias desestabilizantes

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene menos elementos desestabilizantes con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 contiene como máximo 9, como máximo 8, como máximo 7, como máximo 6, o como máximo 5 elementos desestabilizantes. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 contiene como máximo 4, como máximo 3, como máximo 2, o como máximo 1 elemento desestabilizante. En aún otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 1 no contiene un elemento desestabilizante.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene menos elementos desestabilizantes con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 contiene como máximo 9, como máximo 8, como máximo 7, como máximo 6, o como máximo 5 elementos desestabilizantes. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 contiene como máximo 4, como máximo 3, como máximo 2, o como máximo 1 elemento desestabilizante. En aún otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 2 no contiene un elemento desestabilizante.

Existen diez elementos desestabilizantes en la secuencia de FVIII parental (SEQ ID NO: 3); seis secuencias ATTTA (SEQ ID NO: 8) y cuatro secuencias TAAAT (SEQ ID NO: 9). En una realización, las secuencias de estos sitios se mutaron para destruir los elementos desestabilizantes en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 de FVIII optimizado. La localización de cada uno de estos elementos, y la secuencia de los nucleótidos correspondientes en las secuencias optimizadas, se muestran en la Tabla 2.

Posibles sitios de unión al promotor

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene menos posibles sitios de unión al promotor con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1 contiene como máximo 9, como máximo 8, como máximo 7, como máximo 6, o como máximo 5 posibles sitios de unión al promotor. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1 contiene como máximo 4, como máximo 3, como máximo 2, o como máximo 1 posible sitio de unión al promotor. En aún otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1 no contiene un posible sitio de unión al promotor.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos contiene menos posibles sitios de unión al promotor con respecto a SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2 contiene como máximo 9, como máximo 8, como máximo 7, como máximo 6, o como máximo 5 posibles sitios de unión al promotor. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2 contiene como máximo 4, como máximo 3, como máximo 2, o como máximo 1 posible sitio de unión al promotor. En aún otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII y que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2 no contiene un posible sitio de unión al promotor.

Las cajas TATA son secuencias reguladoras encontradas frecuentemente en las regiones promotoras de eucariotas. Sirven de sitio de unión de la proteína de unión a TATA (TBP), un factor de transcripción general. Las cajas TATA comprenden normalmente la secuencia TATAAA (SEQ ID NO: 12) o una variante cercana. Las cajas TATA dentro de una secuencia codificante, sin embargo, pueden inhibir la traducción de proteína de longitud completa. Existen diez posibles secuencias de unión al promotor en la secuencia natural de FVIII BDD (SEQ ID NO: 3); cinco secuencias TATAA (SEQ ID NO: 12) y cinco secuencias TTATA (SEQ ID NO: 13). En una realización, todos los sitios de unión al promotor se suprimen en los genes FVIII de la presente invención. La localización de cada posible sitio de unión al promotor y la secuencia de nucleótidos correspondientes en las secuencias optimizadas se muestran en la Tabla 2.

Otros elementos reguladores negativos que actúan en cis

Además de las secuencias de MAR/ARS, elementos desestabilizantes y posibles sitios de promotor descritos anteriormente, se pueden identificar varios secuencias posiblemente inhibidoras adicionales en la secuencia de FVIII BDD natural (SEQ ID NO: 3). Se pueden identificar dos elementos de secuencia ricos en AU (ARE) (SEQ ID NO: 14 y 15), junto con un sitio de poli-A (SEQ ID NO: 11), un sitio de poli-T (SEQ ID NO: 10) y un sitio de corte y empalme (SEQ ID NO: 7) en la secuencia de FVIII BDD natural. Uno o más de estos elementos se pueden retirar de las secuencias de FVIII optimizado. La localización de cada uno de estos sitios y la secuencia de los nucleótidos correspondientes en las secuencias optimizadas se muestran en la Tabla 2.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos no contiene uno o más elementos reguladores negativos que actúan en cis, por ejemplo, un sitio de corte y empalme, una secuencia de poli-T, una secuencia de poli-A, una secuencia ARE, o cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos no contiene uno o más elementos reguladores negativos que actúan en cis, por ejemplo, un sitio de corte y empalme, una secuencia de poli-T, una secuencia de poli-A, una secuencia ARE, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene el sitio de corte y empalme GGTGAT (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-T (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-A (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene un elemento ARE (SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene el sitio de corte y empalme GGTGAT (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-T (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-A (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de FVIII, en donde la secuencia de nucleótidos es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de nucleótidos no contiene un elemento ARE (SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15).

En otras realizaciones, una secuencia de FVIII optimizado de la invención no comprende uno o más de motivos antivirales, estructuras de tallo-lazo y secuencias repetidas.

En otras realizaciones más, los nucleótidos que rodean el sitio de iniciación de la transcripción se cambian a una secuencia consenso de Kozak (GCCGCCACCATGC, en donde los nucleótidos subrayados son el codón de iniciación; SEQ ID NO: 16). En otras realizaciones, se pueden añadir o quitar sitios de restricción para facilitar el proceso de clonación.

Secuencias heterólogas de nucleótidos

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención comprenden además una secuencia heteróloga de nucleótidos. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención comprenden además al menos una secuencia heteróloga de nucleótidos. La secuencia heteróloga de nucleótidos se puede unir con las secuencias de nucleótidos de FVIII BDD optimizado de la invención en el extremo 5', en el extremo 3', o se inserta en el centro de la secuencia de nucleótidos de FVIII BDD optimizado. Así, en algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos codificada por la secuencia heteróloga de nucleótidos se une al extremo N o al extremo C de la secuencia de aminoácidos de FVIII codificada por la secuencia de nucleótidos o se inserta entre dos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de FVIII. En otras realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención comprenden además dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho secuencias heterólogas de nucleótidos. En algunas realizaciones, todas las secuencias heterólogas de nucleótidos son idénticas. En algunas realizaciones, al menos una secuencia heteróloga de nucleótidos es diferente de las otras secuencias heterólogas de nucleótidos. En algunas realizaciones, la invención puede comprender dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de siete secuencias heterólogas de nucleótidos en tándem.

En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia heteróloga de nucleótidos es un resto heterólogo que puede aumentar la semivida (un "extensor de la semivida'') de una molécula de FVIII.

En algunas realizaciones, el resto heterólogo es un péptido o un polipéptido con característias o sin estructurar o estructuradas que están asociadas con la prolongación de la semivida in vivo cuando se incorpora en una proteína de la invención. Los ejemplos no limitantes incluyen albúmina, fragmentos de albúmina, fragmentos Fc de inmunoglobulinas, el péptido del extremo C (CTP) de la subunidad p de gonadotropina coriónica humana, una secuencia HAP, una secuencia XTEN, una transferrina o un fragmento de la misma, un polipéptido PAS, conectores de poliglicina, conectores de poliserina, restos de unión a albúmina, o cualquier fragmento, derivado, variante o combinaciones de estos polipéptidos. En algunos aspectos, un resto heterólogo incluye factor de von Willebrand o un fragmento del mismo. En otros aspectos relacionados, un resto heterólogo puede incluir un sitio de unión (por ejemplo, un aminoácido de cisteína) para un resto no polipeptídico tal como polietilenglicol (PEG), hidroxietilalmidón (HES), ácido polisiálico, o cualquier derivado, variante o combinaciones de estos elementos. En algunos aspectos, un resto heterólogo comprende un aminoácido de cisteína que actúa como un sitio de unión para un resto no polipeptídico tal como polietilenglicol (PEG), hidroxietilalmidón (HES), ácido polisiálico, o cualquier derivado, variante o combinaciones de estos elementos.

En una realización específica, un primera secuencia heteróloga de nucleótidos codifica un primer resto heterólogo que es una molécula extensora de la semivida que se conoce en la técnica, y una segunda secuencia heteróloga de nucleótidos codifica un segundo resto heterólogo que también puede ser una molécula extensora de la semivida que se conoce en la técnica. En ciertas realizaciones, el primer resto heterólogo (por ejemplo, un primer resto Fc) y el segundo resto heterólogo (por ejemplo, un segundo resto Fc) se asocian entre sí para formar un dímero. En una realización, el segundo resto heterólogo es un segundo resto Fc, en donde el segundo resto Fc se une a o se asocia con el primer resto heterólogo, por ejemplo, el primer resto Fc. Por ejemplo, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, el segundo resto Fc) se pueden unir al primer resto heterólogo (por ejemplo, el primer resto Fc) por un conector o se asocia con el primer resto heterólogo por un enlace covalente o no covalente.

En algunas realizaciones, el resto heterólogo es un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 1100, al menos aproximadamente 1200, al menos aproximadamente 1300, al menos aproximadamente 1400, al menos aproximadamente 1500, al menos aproximadamente 1600, al menos aproximadamente 1700, al menos aproximadamente 1800, al menos aproximadamente 1900, al menos aproximadamente 2000, al menos aproximadamente 2500, al menos aproximadamente 3000, o al menos aproximadamente 4000 aminoácidos. En otras realizaciones, el resto heterólogo es un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en aproximadamente 100 a aproximadamente 200 aminoácidos, aproximadamente 200 a aproximadamente 300 aminoácidos, aproximadamente 300 a aproximadamente 400 aminoácidos, aproximadamente 400 a aproximadamente 500 aminoácidos, aproximadamente 500 a aproximadamente 600 aminoácidos, aproximadamente 600 a aproximadamente 700 aminoácidos, aproximadamente 700 a aproximadamente 800 aminoácidos, aproximadamente 800 a aproximadamente 900 aminoácidos, o aproximadamente 900 a aproximadamente 1000 aminoácidos.

En ciertas realizaciones, un resto heterólogo mejora una o más propiedades farmacocinéticas de la proteína FVIII sin afectar significativamente su actividad biológica o función.

En ciertas realizaciones, un resto heterólogo aumenta la semivida in vivo y/o in vitro de la proteína FVIII de la invención. En otras realizaciones, un resto heterólogo facilita la visualización o localización de la proteína FVIII de la invención o un fragmento de la misma (por ejemplo, un fragmento que comprende un resto heterólogo después de la escisión proteolítica de la proteína FVIII). La visualización y/o localización de la proteína FVIII de la invención o un fragmento de la misma puede ser in vivo, in vitro, ex vivo, o combinaciones de los mismos.

En otras realizaciones, un resto heterólogo aumenta la estabilidad de la proteína FVIII de la invención o un fragmento de la misma (por ejemplo, un fragmento que comprende un resto heterólogo después de la escisión proteolítica de la proteína FVIII). Como se usa en el presente documento, el término "estabilidad" se refiere a una medida conocida en la técnica del mantenimiento de una o más propiedades físicas de la proteína FVIII en respuesta a una condición medioambiental (por ejemplo, una temperatura elevada o reducida). En ciertos aspectos, la propiedad física puede ser el mantenimiento de la estructura covalente de la proteína FVIII (por ejemplo, la ausencia de escisión proteolítica, oxidación no deseada o desamidación). En otros aspectos, la propiedad física también puede ser la presencia de la proteína FVIII en un estado apropiadamente plegado (por ejemplo, la ausencia de agregados o precipitados solubles o insolubles). En un aspecto, la estabilidad de la proteína FVIII se mide ensayando un propiedad biofísica de la proteína FVIII, por ejemplo la estabilidad térmica, perfil de desarrollo del pH, retirada estable de la glucosilación, solubilidad, función bioquímica (por ejemplo, capacidad para unirse a una proteína, receptor o ligando), etc., y/o combinaciones de los mismos. En otro aspecto, la función bioquímica se demuestra por la afinidad de unión de la interacción. En un aspecto, una medida de la estabilidad de la proteína es la estabilidad térmica, es decir, la resistencia a la exposición térmica. La estabilidad se puede medir usando métodos conocidos en la técnica, tales como, HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), SEC (cromatografía de exclusión por tamaño), DLS (dispersión dinámica de luz), etc. Los métodos para medir la estabilidad térmica incluyen, pero no se limitan a, calorimetría diferencial de barrido (DSC), fluorimetría diferencial de barrido (DSF), dicroismo circular (CD) y ensayo de exposición térmica.

En ciertos aspectos, una proteína FVIII de la invención comprende al menos un extensor de la semivida, es decir, un resto heterólogo que aumenta la semivida in vivo de la proteína FVIII con respecto a la semivida in vivo de la proteína FVIII correspondiente que carece de dicho resto heterólogo. La semivida in vivo de una proteína FVIII se puede determinar por cualquier método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, ensayos de actividad (ensayo cromogénico o ensayo de aPTT por coagulación de una etapa), ELISA, ROTEM™, etc.

En algunas realizaciones, la presencia de uno o más extensores de la semivida da como resultado que aumente la semivida de la proteína FVIII en comparación con la semivida de la proteína correspondiente que carece de dichos uno o más extensores de la semivida. La semivida de la proteína FVIII que comprende un extensor de la semivida es al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces, o al menos aproximadamente 12 veces más larga que la semivida in vivo de la proteína FVIII correspondiente que carece de dicho extensor de la semivida.

En una realización, la semivida de la proteína FVIII que comprende un extensor de la semivida es aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 20 veces, aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 15 veces, o aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 10 veces más larga que la semivida in vivo de la proteína correspondiente que carece de dicho extensor de la semivida. En otra realización, la semivida de la proteína FVIII que comprende un extensor de la semivida se extiende aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, veces, mente 8 ve mente 6 ve

mente 4 ve

correspondiente que carece de dicho extensor de la semivida.

En otras realizaciones, la semivida de la proteína FVIII que comprende un extensor de la semivida es al menos aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 25 horas, al menos aproximadamente 26 horas, al menos aproximadamente 27 horas, al menos aproximadamente 28 horas, al menos aproximadamente 29 horas, al menos aproximadamente 30 horas, al menos aproximadamente 31 horas, al menos aproximadamente 32 horas, al menos aproximadamente 33 horas, al menos aproximadamente 34 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 48 horas, al menos aproximadamente 60 horas, al menos aproximadamente 72 horas, al menos aproximadamente 84 horas, al menos aproximadamente 96 horas, o al menos aproximadamente 108 horas.

En otras realizaciones más, la semivida de la proteína FVIII que comprende un extensor de la semivida es aproximadamente 15 horas a aproximadamente dos semanas, aproximadamente 16 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 17 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 18 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 19 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 20 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 21 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 22 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 23 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 36 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 48 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 60 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente seis días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cinco días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cuatro días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente tres días, o aproximadamente 24 horas a aproximadamente dos días.

En algunas realizaciones, la semivida promedio por sujeto de la proteína FVIII que comprende un extensor de la semivida es aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente

18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente

22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas (1 día), aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 48 horas (2 días), aproximadamente 54 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas (3 días), aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas (4 días), aproximadamente 108 horas, aproximadamente 120 horas (5 días), aproximadamente seis días, aproximadamente siete días (una semana), aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, o aproximadamente 14 días.

1. Una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma

En otro aspecto, un resto heterólogo comprende una o más regiones constantes de inmunoglobulina o porciones de la misma (por ejemplo, una región Fc). En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende además una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma. En algunas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina o porción de la misma es una región Fc.

Una región constante de inmunoglobulina comprende dominios indicados dominios CH (pesados constantes) (CH1, CH2, etc.). Dependiendo del isotipo (es decir, IgG, IgM, IgA IgD o IgE), la región constante puede comprender tres o cuatro dominios CH. Las regiones constantes de algunos isotipos (por ejemplo, IgG) también contienen una región bisagra. Véase Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

Se puede obtener de varias fuentes diferentes una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma para producir la proteína FVIII de la presente invención. En una realización, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma deriva de una inmunoglobulina humana. Se entiende, sin embargo, que

la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma puede derivar de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, que incluye, por ejemplo, una especie de roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobaya) o primate no humano (por ejemplo, chimpancé, macaco). Además, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma puede derivar de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de inmunoglobulina, que incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, se usa el isotipo humano IgG1.

Están disponibles una variedad de las secuencias de genes de la región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencias de genes de la región constante humana) en forma de depósitos públicamente accesibles. Se puede seleccionar la secuencia de dominios de la región constante que tiene una función efectora particular (o que carece de una función efectora particular) o con una modificación particular para reducir la inmunogenicidad. Se han publicado muchas secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos y se pueden derivar secuencias adecuadas de la región constante de Ig (por ejemplo, secuencias de bisagra, CH2, y/o CH3, o porciones de las mismas) de estas secuencias usando técnicas reconocidas en la técnica. Entonces, el material genético obtenido usando cualquiera de los métodos anteriores se puede alterar o sintetizar para obtener polipéptidos de la presente invención. Se apreciará además que el alcance de la presente invención engloba alelos, variantes y mutaciones de secuencias de ADN de la región constante.

Se pueden clonar las secuencias de la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa y cebadores que se seleccionan para amplificar el dominio de interés. Para clonar una secuencia de la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma de un anticuerpo, se puede aislar ARNm de hibridoma, bazo o células linfáticas, transcribirse de forma inversa en ADN, y amplificarse los genes de anticuerpo por PCR. La amplificación por métodos de PCR se describe en detalle en las patentes de EE. UU. N° 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; y en, por ejemplo, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). Se puede iniciar PCR por cebadores de la región constante consenso o por cebadores más específicos basándose en las secuencias de aminoácidos publicadas de ADN de la cadena pesada y ligera. También se puede usar PCR para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas se pueden cribar por cebadores consenso o sondas homólogas mayores, tales como sondas de región constante de ratón. Se conocen en la técnica numerosos conjuntos de cebadores adecuados para amplificación de genes de anticuerpo (por ejemplo, cebadores de 5' basados en la secuencia del extremo N de anticuerpos purificados (Benhar y Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); amplificación rápida de extremos de ADNc (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); secuencias conductoras de anticuerpos (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). La clonación de secuencias de anticuerpos se describe además en Newman et al., patente de EE. UU. N° 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995.

Una región constante de inmunoglobulina usada en el presente documento puede incluir todos los dominios y la región bisagra o porciones de la misma. En una realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma comprende dominio CH2, dominio CH3, y una región bisagra, es decir, una región Fc o un componente de unión de FcRn.

Como se usa en el presente documento, el término "región Fc" se define como la porción de un polipéptido que corresponde a la región Fc de Ig nativa, es decir, como se forma por la asociación dimérica de los dominios Fc respectivos de sus dos cadenas pesadas. Una región Fc nativa forma un homodímero con otra región Fc. A diferencia, el término "región Fc genéticamente fusionada" o "región Fc de cadena sencilla" (región scFc), como se usa en el presente documento, se refiere a una región Fc dimérica sintética comprendida de dominios Fc genéticamente unidos dentro de una cadena sencilla de polipéptidos (es decir, codificada en una única secuencia genética contigua). Véase la publicación internacional N° WO 201 2/006635.

En una realización, la "región Fc" se refiere a la porción de una única cadena pesada de la Ig que empieza en la región bisagra justo en la dirección 5' del sitio de escisión por papaína (es decir, resto 216 en IgG, que toma el primer resto de la región constante de la cadena pesada para que sea 114) y que termina en el extremo C del anticuerpo. Por consiguiente, una región Fc completa comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.

Una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma puede ser un componente de unión de FcRn. FcRn es activo en tejidos epiteliales adultos y se expresa en la luz de los intestinos, vías respiratorias pulmonares, superficies nasales, superficies vaginales, colon y superficies rectales (patente de EE. UU. N° 6.485.726). Un componente de unión de FcRn es una porción de una inmunoglobulina que se une a FcRn.

Se ha aislado el receptor de FcRn de varias especies de mamífero que incluyen seres humanos. Se conocen las secuencias de FcRn humano, FcRn de mono, FcRn de rata y FcRn de ratón (Story et al. 1994, J. Exp. Med.

180:2377). El receptor FcRn se une a IgG (pero no a otras clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgM, IgD e IgE) a pH relativamente bajo, transporta activamente la IgG transcelularmente en una dirección de luminal a serosal, y entonces libera la IgG al pH relativamente más alto encontrado en los fluidos intersticiales. Se expresa en tejido epitelial adulto (patentes de EE. UU. N° 6.485.726, 6.030.613, 6.086.875; documentos de patente Wo 03/077834; US2003-0235536A1) que incluye epitelio pulmonar e intestinal (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), epitelio tubular proximal renal (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), así como epitelio nasal, superficies vaginales y superficies de los árboles biliares.

Los componentes de unión de FcRn útiles en la presente invención engloban moléculas que se pueden unir específicamente por el receptor FcRn que incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos que incluyen la región de unión completa del receptor FcRn. La región de la porción Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). La principal área de contacto de Fc con el FcRn está cerca del empalme de los dominios CH2 y CH3. Los contacto Fc-FcRn están todos dentro de una cadena pesada sencilla de Ig. Los componentes de unión de FcRn incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión de FcRn completa. Los principales sitios de contacto incluyen los restos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los restos de aminoácidos 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3. Las referencias hechas a la numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas, o regiones, se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

Las regiones Fc o componentes de unión de FcRn unidos a FcRn se pueden llevar eficazmente a través de barreras epiteliales por FcRn, proporcionando así un medio no invasivo para administrar por vía sistémica una molécula terapéutica deseada. Además, las proteínas de fusión que comprenden una región Fc o un componente de unión de FcRn son endocitosadas por células que expresan el FcRn. Pero en lugar de ser marcadas para degradación, estas proteínas de fusión se recirculan fuera en la circulación otra vez, aumentando así la semivida in vivo de estas proteínas. En ciertas realizaciones, las porciones de regiones constantes de inmunoglobulina son una región Fc o un componente de unión de FcRn que normalmente se asocia, mediante enlaces disulfuro y otras interacciones no específicas, con otra región Fc u otro componente de unión de FcRn para formar dímeros y multímeros de orden superior.

Se pueden unir dos receptores de FcRn a una única molécula de Fc. Los datos cristalográficos sugieren que cada molécula de FcRn se une a un único polipéptido del homodímero de Fc. En una realización, la unión del componente de unión de FcRn, por ejemplo, un fragmento Fc de una IgG, a una molécula biológicamente activa proporciona un medio de administración de la molécula biológicamente activa por vía oral, por vía bucal, por vía sublingual, por vía rectal, por vía vaginal, como un aerosol administrado nasalmente o por una vía pulmonar, o por una vía ocular. En otra realización, la proteína FVIII se puede administrar invasivamente, por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intravenosa.

Un componente de unión de la región de FcRn es una molécula o porción de la misma que se puede unir específicamente por el receptor de FcRn con el consecuente transporte activo por el receptor de FcRn de la región Fc. Se une específicamente se refiere a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad de baja a moderada como se distingue de la unión no específica que normalmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Normalmente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad KA es superior a 106 M-1, o superior a 108 M-1. Si fuera necesario, se puede reducir la unión no específica sin afectar sustancialmente la unión específica variando las condiciones de unión. Un experto puede optimizar las condiciones de unión apropiadas, tales como concentración de las moléculas, fuerza iónica de la disolución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración de un agente de bloqueo (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de la leche), etc., usando técnicas rutinarias.

En ciertas realizaciones, una proteína FVIII de la invención comprende una o más regiones Fc truncadas que son, sin embargo, suficientes para conferir propiedades de unión de receptor de Fc (FcR) a la región Fc. Por ejemplo, la porción de una región Fc que se une a FcRn (es decir, la porción de unión de FcRn) comprende desde aproximadamente los aminoácidos 282-438 de IgG 1, numeración EU (siendo los sitios de contacto primarios los aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los restos de aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Así, una región Fc de la invención puede comprender o consistir en una porción de unión de FcRn. Las porciones de unión de FcRn pueden derivar de cadenas pesadas de cualquier isotipo, que incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, se usa una porción de unión de FcRn de un anticuerpo de isotipo humano IgG1. En otra realización, se usa una porción de unión de FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG4.

La región Fc se puede obtener de varias fuentes diferentes. En una realización, una región Fc del polipéptido deriva de una inmunoglobulina humana. Se entiende, sin embargo, que un resto Fc puede derivar de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, que incluye, por ejemplo, una especie de roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobaya) o de primate no humano (por ejemplo, chimpancé, macaco). Además, el polipéptido de los dominios Fc o porciones de los mismos puede derivar de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de inmunoglobulina, que incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, se usa el isotipo humano IgG1.

En ciertas realizaciones, la variante Fc confiere un cambio en al menos una función efectora conferida por un resto Fc que comprende dicho dominio Fc natural (por ejemplo, una mejora o reducción en la capacidad de la región Fc para unirse a receptores de Fc (por ejemplo, FcyRi, FcyRII o FcyRIII) o proteínas del complemento (por ejemplo, C1q), o para desencadenar citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis, o citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC)). En otras realizaciones, la variante de Fc proporciona un resto de cisteína manipulado.

La región Fc de la invención puede emplear variantes de Fc reconocidas en la técnica que se conocen por conferir un cambio (por ejemplo, un potenciamiento o reducción) en la función efectora y/o unión de FcR o FcRn. Específicamente, una región Fc de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una sustitución) en una o más de las posiciones de aminoácidos desveladas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, y WO06/085967A2; las publicaciones de patente de EE. UU. N2 US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; o las patentes de EE. UU. 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784; 7.404.956 y 7.317.091. En una realización, se puede hacer el cambio específico (por ejemplo, la sustitución específica de uno o más aminoácidos desvelados en la materia) en una o más de las posiciones de aminoácidos desveladas. En otra realización, se puede hacer un cambio diferente en una o más de las posiciones de aminoácidos desveladas (por ejemplo, la sustitución diferente de una o más posiciones de aminoácidos desvelada en la técnica).

La región Fc o componente de unión de FcRn de IgG se puede modificar según procedimientos bien reconocidos tales como mutagénesis dirigida al sitio y similares para dar IgG modificada o fragmentos Fc, o porciones de los mismos, que se unirán por FcRn. Dichas modificaciones incluyen modificaciones remotas de los sitios de contacto de FcRn, así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso potencian la unión al FcRn. Por ejemplo, se pueden sustituir los siguientes restos de aminoácidos individuales en Fc de IgG 1 humana (Fcy1) sin pérdida significativa de la afinidad de unión de Fc por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A y K447A, donde, por ejemplo, P238A representa prolina natural sustituida con alanina en la posición número 238. Como un ejemplo, una realización específica incorpora la mutación N297A, retirando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. Además de alanina, se pueden sustituir otros aminoácidos por los aminoácidos naturales en las posiciones especificadas anteriormente. Las mutaciones se pueden introducir individualmente en Fc, dando lugar a más de cien regiones Fc distintas de Fc nativa.

Ciertas de las mutaciones anteriores pueden conferir nueva funcionalidad a la región Fc o componente de unión de FcRn. Por ejemplo, una realización incorpora N297A, retirando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenicidad, potenciando así la semivida en circulación de la región Fc, y convirtiendo la región Fc en incapaz de unirse a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, sin comprometer la afinidad por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al.

1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Como ejemplo adicional de la nueva funcionalidad que surge de las mutaciones descritas anteriormente, la afinidad por FcRn se puede aumentar más allá de la del natural en algunos casos. Esta elevada afinidad puede afectar una elevada velocidad de "asociación", una reducida velocidad de "disociación", o ambas, una elevada velocidad de "asociación" y una reducida velocidad de "disociación". Los ejemplos de mutaciones que se cree que confieren una elevada afinidad por FcRn incluyen, pero no se limitan a, T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

Además, al menos tres receptores gamma de Fc humanos parecen reconocer un sitio de unión sobre IgG dentro de la región bisagra inferior, en general, los aminoácidos 234-237. Por tanto, otro ejemplo de nueva funcionalidad y posible inmunogenicidad reducida puede surgir de mutaciones de esta región, como, por ejemplo, reemplazando los aminoácidos 233-236 de la IgG1 humana "ELLG" (SEQ ID NO: 29) con la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con deleción de un aminoácido). Se ha mostrado que FcyRI, FcyRII y FcyRIII, que median en diversas funciones efectoras, no se unirán a IgG1 cuando se hayan introducido dichas mutaciones. Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.

En otra realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma comprende una secuencia de aminoácidos en la región bisagra o una porción de la misma que forma uno o más enlaces disulfuro con una segunda región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma. La segunda región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma se puede unir a un segundo polipéptido, uniendo la proteína FVIII y el segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un resto potenciador. Como se usa en el presente documento, el término "resto potenciador" se refiere a una molécula, fragmento de la misma o un componente de un polipéptido que es capaz de potenciar la actividad procoagulante de FVIII. El resto potenciador puede ser un cofactor, tal como factor tisular soluble (FTs), o un péptido procoagulante. Así, después de la activación de FVIII, el resto potenciador está disponible para potenciar la actividad de FVIII.

En ciertas realizaciones, una proteína FVIII de la invención comprende una sustitución de aminoácidos en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, variantes Fc), que altera las funciones efectoras independientes de antígeno de la región constante de Ig, en particular la semivida circulante de la proteína.

2. Regiones scFc

En otro aspecto, un resto heterólogo comprende una región scFc (Fc de una sola cadena). En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende además una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica una región scFc. La región scFc comprende al menos dos regiones constantes de inmunoglobulina o porciones de la misma (por ejemplo, restos o dominios Fc (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, o más restos o dominios Fc)) dentro de la misma cadena lineal de polipéptidos que son capaces de plegamiento (por ejemplo, plegamiento intramolecularmente o intermolecularmente) para formar una región scFc funcional que se une por un conector peptídico Fc. Por ejemplo, en una realización, un polipéptido de la invención es capaz de unirse, por su región scFc, a al menos un receptor de Fc (por ejemplo un receptor FcRn, F^cyR (por ejemplo, FcyRIII), o una proteína del complemento (por ejemplo, C1q)) para mejorar la semivida o desencadenar una función efectora inmunitaria (por ejemplo, citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC), fagocitosis o citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC) y/o para mejorar la capacidad de fabricación).

3. CTP

En otro aspecto, un resto heterólogo comprende un péptido del extremo C (CTP) de la subunidad p de gonadotropina coriónica humana o fragmento, variante, o derivado de la misma. Se sabe que uno o más péptidos CTP insertados en una proteína recombinante aumentan la semivida in vivo de esa proteína. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N25.712.1:2.

Los péptidos CTP a modo de ejemplo incluyen DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 17) o SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ. (SEQ ID NO: 18). Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N2 US 2009/0087411 A1.

4. Secuencia XTEN

En algunas realizaciones, un resto heterólogo comprende una o más secuencias XTEN, fragmentos, variantes, o derivados de los mismos. Como se usa aquí, "secuencia XTEN" se refiere a polipéptidos de longitud extendida con secuencias sustancialmente no repetitivas que no existen de forma natural, que están compuestas principalmente de aminoácidos hidrófilos pequeños, teniendo la secuencia un bajo grado o ninguna estructura secundaria o terciaria en condiciones fisiológicas. Como resto heterólogo, las XTEN pueden servir de resto de extensión de la semivida. Además, XTEN puede proporcionar propiedades deseables que incluyen, pero no se limitan a, parámetros farmacocinéticos y características de solubilidad potenciados.

La incorporación de un resto heterólogo que comprende una secuencia XTEN en una proteína de la invención puede conferir a la proteína una o más de las siguientes propiedades ventajosas: flexibilidad conformacional, solubilidad acuosa potenciada, alto grado de resistencia a proteasas, baja inmunogenicidad, baja unión a receptores de mamífero, o elevados radios hidrodinámicos (o de Stokes).

En ciertos aspectos, una secuencia XTEN puede aumentar las propiedades farmacocinéticas, tales como mayor semivida in vivo o elevada área bajo la curva (ABC), de manera que una proteína de la invención permanezca in vivo y tenga actividad procoagulante durante un elevado periodo de tiempo en comparación con una proteína con el mismo resto, pero sin el resto heterólogo XTEN.

Los ejemplos de secuencias XTEN que se pueden usar como restos heterólogos en proteínas quiméricas de la invención se desvelan, por ejemplo, en las publicaciones de patente de EE. UU. N° 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, o 2011/0172146 A1, o las publicaciones de patente internacional N2 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1 o WO 2011028344 A2.

Las secuencias XTEN a modo de ejemplo que se pueden usar como restos heterólogos en la proteína quimérica de la invención incluyen XTEN AE42-4 (SEQ iD NO: 30, codificada por SEQ ID NO: 31), XTEN 144-2A (SeQ ID NO: 32, codificada por SEQ ID NO: 33), XTEN A144-3B (SEQ ID NO: 34, codificada por SEQ ID NO: 35), XTEN AE144-4A (SEQ ID NO: 36, codificada por SEQ ID NO: 37), XTEN AE144-5A (SEQ ID NO: 38, codificada por SEQ ID NO: 39), XTEN AE144-6B (SEQ ID NO: 40, codificada por SEQ ID NO: 41), XTEN AG144-1 (SEQ ID NO: 42, codificada por SEQ ID NO: 43), XTEN AG144-A (SEQ ID NO: 44, codificada por SEQ ID NO: 45), XTEN AG144-B (SEQ ID NO: 46, codificada por SEQ ID NO: 47), XTEN AG144-C (SEQ ID NO: 48, codificada por SEQ ID NO: 49) y XTEN AG144-F (SEQ ID nO: 50, codificada por SEQ ID NO: 51).

5. Albúmina o fragmento, derivado o variante de la misma

En algunas realizaciones, un resto heterólogo comprende albúmina o un fragmento funcional de la misma. La albúmina de suero humano (HSA, o HA), una proteína de 609 aminoácidos en su forma de longitud completa, es responsable de una significativa proporción de la presión osmótica del suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. El término "albúmina", como se usa en el presente documento, incluye albúmina de longitud completa o un fragmento funcional, variante, derivado o análogo de la misma. Los ejemplos de albúmina o los fragmentos o variantes de la misma se desvelan en las publicaciones de patente de EE. UU. N° 2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1 o 2008/0153751 A1, o las publicaciones de solicitud PCT N22008/033413 A2, 2009/058322 A1 o 2007/021494 A2.

En una realización, la proteína FVIII de la invención comprende albúmina, un fragmento o una variante de la misma que se une además a un segundo resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia PAS, HES y PEG.

6. Resto de unión a albúmina

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es un resto de unión a albúmina, que comprende un péptido de unión a albúmina, un dominio de unión a albúmina bacteriana, un fragmento de anticuerpo de unión a albúmina, o cualquier combinación de los mismos.

Por ejemplo, la proteína de unión de albúmina puede ser una proteína de unión de albúmina bacteriana, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye anticuerpos de dominio (véase la patente de EE. UU. N° 6.696.245). Una proteína de unión de albúmina, por ejemplo, puede ser un dominio de unión de albúmina bacteriana, tal como la de la proteína G estafilocócica (Konig, T. y Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Otros ejemplos de péptidos de unión de albúmina que se pueden usar como componente de conjugación son, por ejemplo, los que tienen una secuencia consenso Cys-Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Xaa⁴-Cys, en donde Xaa¹es Asp, Asn, Ser, Thr, o Trp; Xaa²es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa³es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr como se describen en la solicitud de patente de EE. UU. 2003/0069395 o Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem.

277, 35035-35043).

El dominio 3 de la proteína G estreptocócica, como se desvela por Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) y Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002), es un ejemplo de un dominio de unión a albúmina bacteriana. Los ejemplos de péptidos de unión a albúmina incluyen una serie de péptidos que tienen la secuencia central DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 19). Véase, por ejemplo, Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002). Los ejemplos de fragmentos de unión a albúmina de anticuerpos se desvelan en Muller y Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Rooverset al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), y Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008). Un ejemplo de dicho resto de unión a albúmina es 2-(3-maleimidopropanamido)-6-(4-(4-yodofenil)butanamido)hexanoato (marca "Albu") como se desvela por Trusselet al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).

Se pueden usar ácidos grasos, en particular ácidos grasos de cadena larga (LCFA) y compuestos de unión a albúmina de tipo ácido graso de cadena larga para prolongar la semivida in vivo de las proteínas FVIII de la invención. Un ejemplo de un compuesto de unión a albúmina de tipo LCFA es ácido 16-(1 -(3-(9-(((2,5-dioxopirrolidin-1-iloxi)carboniloxi)-metil)-7-sulfo-9H-fluoren-2-ilamino)-3-oxopropil)-2,5-dioxopirrolidin-3-iltio)hexadecanoico (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 2010/140148).

7. Secuencia PAS

En otras realizaciones, el resto heterólogo es una secuencia de PAS. Una secuencia de PAS, como se usa en el presente documento, significa una secuencia de aminoácidos que comprende principalmente restos de alanina y serina, o que comprende principalmente restos de alanina, serina y prolina, formando la secuencia de aminoácidos la conformación de espiral al azar en condiciones fisiológicas. Por consiguiente, la secuencia de PAS es un elemento estructural, un polímero de aminoácido, o un casete de secuencia que comprende, consiste esencialmente en, o que consiste en alanina, serina y prolina que se pueden usar como parte del resto heterólogo en la proteína quimérica. Aún, el experto conoce que un polímero de aminoácido también puede formar la conformación de espiral al azar cuando restos distintos de alanina, serina y prolina se añaden como constituyente minoritario en la secuencia de PAS. El término "constituyente minoritario", como se usa en el presente documento, significa que aminoácidos distintos de alanina, serina y prolina se pueden añadir a la secuencia de PAS hasta un cierto grado, por ejemplo, hasta aproximadamente 12 %, es decir, aproximadamente 12 de 100 aminoácidos de la secuencia de PAS, hasta aproximadamente 10 %, es decir, aproximadamente 10 de 100 aminoácidos de la secuencia de PAS, hasta aproximadamente 9 %, es decir, aproximadamente 9 de 100 aminoácidos, hasta aproximadamente 8 %, es decir, aproximadamente 8 de 100 aminoácidos, aproximadamente 6 %, es decir, aproximadamente 6 de 100 aminoácidos, aproximadamente 5 %, es decir, aproximadamente 5 de 100 aminoácidos, aproximadamente 4 %, es decir, aproximadamente 4 de 100 aminoácidos, aproximadamente 3 %, es decir, aproximadamente 3 de 100 aminoácidos, aproximadamente 2 %, es decir, aproximadamente 2 de 100 aminoácidos, aproximadamente 1 %, es decir, aproximadamente 1 de 100 de los aminoácidos. Los aminoácidos diferentes de alanina, serina y prolina se pueden seleccionar del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr y Val.

En condiciones fisiológicas, la extensión de secuencia de PAS forma una conformación de espirales al azar y así puede mediar en una elevada estabilidad in vivo y/o in vitro para la proteína FVIII. Puesto que el dominio de espiral al azar no adopta una estructura estable o función por sí mismo, se conserva esencialmente la actividad biológica mediada por la proteína FVIII. En otras realizaciones, las secuencias PAS que forman el dominio de espiral al azar son biológicamente inertes, especialmente con respecto a la proteólisis en plasma sanguíneo, inmunogenicidad, punto isoeléctrico/comportamiento electrostático, unión a receptores de la superficie celular, o internalización, pero son todavía biodegradables, que proporciona claras ventajas con respecto a los polímeros sintéticos tales como PEG.

Los ejemplos no limitantes de las secuencias PAS que forman la conformación de espiral al azar comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SeQ ID NO: 20), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 21), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 22), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 23), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 24), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 25) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 26), o cualquier combinación de las mismas. Los ejemplos adicionales de secuencias PAS se conocen de, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. N° 2010/0292130 A1 y la publicación de solicitud PCT N° WO 2008/155134 A1.

8. Secuencia HAP

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es un polímero de aminoácidos rico en glicina (HAP). La secuencia HAP puede comprender una secuencia repetitiva de glicina, que tiene al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoácidos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos, o 500 aminoácidos de longitud. En una realización, la secuencia de HAP es capaz de prolongar la semivida de un resto fusionado con o unido a la secuencia de HAP. Los ejemplos no limitantes de la secuencia HAP incluyen, pero no se limitan a, (Gly)n, (Gly4Ser)n o S(Gly4Ser)n, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En una realización, n es 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40. En otra realización, n es 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200.

9. Transferrina o fragmento de la misma

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es transferrina o un fragmento de la misma. Se puede usar cualquier transferrina para preparar las proteínas FVIII de la invención. Como un ejemplo, la TF humana natural (TF) es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 KDa (que no supone glucosilación), con dos dominios principales, N (aproximadamente 330 aminoácidos) y C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parece que se originan a partir de una duplicación génica. Véanse los números de acceso de GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM039847 y S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov). La transferrina comprende dos dominios, dominio N y dominio C. El dominio N comprende dos subdominios, dominio N1 y dominio N2, y el dominio C comprende dos subdominios, dominio C1 y dominio C2.

En una realización, el resto heterólogo de transferrina incluye una variante de corte y empalme de transferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de transferrina puede ser una variante de corte y empalme de transferrina humana, por ejemplo, acceso de Genbank AAA61140. En otra realización, la porción de transferrina de la proteína quimérica incluye uno o más dominios de la secuencia de transferrina, por ejemplo, dominio N, dominio C, dominio N1, dominio N2, dominio C1, dominio C2, o cualquier combinación de los mismos.

10. Receptores de la eliminación

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es un receptor de la eliminación, fragmento, variante o derivado del mismo. LRP1 es una proteína de la membrana integral de 600 kDa que participa en la eliminación mediada por receptor de una variedad de proteínas, tales como factor X. Véase, por ejemplo, Narita et al., Blood 91:555-560 (1998).

11. Factor de von Willebrand o fragmentos del mismo

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es factor de von Willebrand (VWF) o fragmentos del mismo.

VWF (también conocido como F8VWF) es una gran proteína multimérica presente en el plasma sanguíneo y producida constitutivamente en endotelio (en los cuerpos de Weibel-Palade), megacariocitos (gránulos a de plaquetas) y tejido conjuntivo subendoteliano. El monómero de VWF básico es una proteína de 2813 aminoácidos. Cada monómero contiene varios dominios específicos con una función específica, los dominios D' y D3 (que juntos se unen al factor VIII), el dominio A1 (que se une al receptor GPIb de plaquetas, heparina y/o posiblemente colágeno), el dominio A3 (que se une al colágeno), el dominio C1 (en el que el dominio RGD se une a la integrina de plaquetas aIIbp3 cuando esta se activa) y el dominio de "nudo de cisterna" en el extremo C de la proteína (cuyo VWF comparte con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante p (TGFp) y gonadotropina coriónica humana p (pHCG)).

La secuencia de aminoácidos del monómero 2813 para VWF humano se informa como el número de acceso NP000543.2 en Genbank. La secuencia de nucleótidos que codifica el VWF humano se informa como el número de acceso NM000552.3 en Genbank. La secuencia de nucleótidos de VWF humano se designa SEQ ID NO: 27. SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 27. El dominio D' incluye los aminoácidos 764 a 866 de SEQ ID NO: 28. El dominio D3 incluye los aminoácidos 867 a 1240 de SEQ ID NO: 28. En plasma, el 95-98 % de FVIII circula en un compacto complejo no covalente con VWF de longitud completa. La formación de este complejo es importante para el mantenimiento de niveles en plasma apropiados de FVIIII in vivo. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Cuando FVIII se activa debido a la proteólisis en las posiciones 372 y 740 en la cadena pesada y en la posición 1689 en la cadena ligera, el VWF unido a FVIII se retira de FVIII activado.

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es factor de von Willebrand de longitud completa. En otras realizaciones, el resto heterólogo es un fragmento de factor de von Willebrand Factor. Como se usa en el presente documento, el término "fragmento de VWF" o "fragmentos de VWF" usado en el presente documento significa cualquier fragmento de VWF que interacciona con FVIII y retiene al menos una o más propiedades que normalmente se proporcionan a FVIII por VWF de longitud completa, por ejemplo, prevención de la activación prematura de FVIIIa, prevención de la proteólisis prematura, prevención de la asociación con membranas de fosfolípido que podrían conducir a eliminación prematura, prevención de la unión a receptores de la eliminación de FVIII que se pueden unir a FVIII desnudo, pero no a FVIII unido a VWF, y/o estabilización de las interacciones de la cadena pesada y la cadena ligera de FVIII. En una realización específica, el resto heterólogo es un fragmento (de VWF) que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF. El fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 puede comprender además un dominio VWF seleccionado del grupo que consiste en un dominio A1, un dominio A2, un dominio A3, un dominio D1, un dominio D2, un dominio D4, un dominio B1, un dominio B2, un dominio B3, un dominio C1, un dominio C2, un dominio CK, uno o más fragmentos de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos adicionales del polipéptido que tiene actividad de FVIII fusionado con el fragmento VWF se desvelan en la solicitud de patente provisional de EE. UU. N° 61/667.901, presentada el 3 de julio de 2012.

12. Restos conectores

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es un conector peptídico.

Como se usa en el presente documento, los términos "conectores peptídicos" o "restos conectores" se refieren a un péptido o secuencia de polipéptidos (por ejemplo, un péptido sintético o secuencia de polipéptidos) que conecta dos dominios en una secuencia de aminoácidos lineal de una cadena de polipéptidos.

En algunas realizaciones, secuencias heterólogas de nucleótidos que codifican conectores peptídicos se pueden insertar entre las secuencias de polinucleótidos de FVIII optimizado de la invención y una secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica, por ejemplo, uno de los restos heterólogos descritos anteriormente, tal como albúmina. Los conectores peptídicos pueden proporcionar flexibilidad a la molécula de polipéptido quimérico. Los conectores no se escinden normalmente, sin embargo, dicha escisión puede ser conveniente. En una realización, estos conectores no se retiran durante el procesamiento.

Un tipo de conector que puede estar presentes en una proteína quimérica de la invención es un conector escindible por proteasa que comprende un sitio de escisión (es decir, un sustrato de sitio de escisión por proteasa, por ejemplo, un factor XIa, Xa, o sitio de escisión por trombina) y que puede incluir conectores adicionales en cualquiera del extremo N de o ambos lados del sitio de escisión. Estos conectores escindibles cuando se incorporan en una construcción de la invención dan como resultado una molécula quimérica que tiene un sitio de escisión heterólogo. En una realización, un polipéptido FVIII de la presente invención comprende dos o más dominios Fc o restos unidos por un conector cscFc para formar una región Fc comprendida en una única cadena de polipéptidos. El conector cscFc está flanqueado por al menos un sitio de procesamiento intracelular, es decir, un sitio escindido por una enzima intracelular. La escisión del polipéptido en el al menos un sitio de procesamiento intracelular da como resultado un polipéptido que comprende al menos dos cadenas de polipéptidos.

Otros conectores peptídicos se pueden usar opcionalmente en una construcción de la invención, por ejemplo, para conectar una proteína FVIII con una región Fc. Algunos conectores a modo de ejemplo que se pueden usar a propósito de la invención incluyen, por ejemplo, polipéptidos que comprenden los aminoácidos GlySer descritos más abajo en más detalle.

En una realización, el conector peptídico es sintético, es decir, no existen de forma natural. En una realización, un conector peptídico incluye péptidos (o polipéptidos) (que pueden o pueden no existir de forma natural) que comprenden una secuencia de aminoácidos que conecta o fusiona genéticamente una primera secuencia de aminoácidos lineal con una segunda secuencia de aminoácidos lineal con la que no está naturalmente unida o genéticamente fusionada en la naturaleza. Por ejemplo, en una realización el conector peptídico puede comprender polipéptidos que no existen de forma natural que son formas modificadas de polipéptidos que existen de forma natural (por ejemplo, que comprende una mutación tal como una adición, sustitución o deleción). En otra realización, el conector peptídico puede comprender aminoácidos que no existen de forma natural. En otra realización, el conector peptídico puede comprender aminoácidos que existen de forma natural que ocurren en una secuencia lineal que no ocurre en la naturaleza. En otra realización adicional, el conector peptídico puede comprender una secuencia de polipéptidos que existen de forma natural.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se puede usar un conector peptídico para fusionar restos Fc idénticos, formando así una región scFc homodimérica. En otras realizaciones, se puede usar un conector peptídico para fusionar diferentes restos Fc (por ejemplo, un resto Fc natural y una variante de resto Fc), formando así una región scFc heterodimérica.

En otra realización, un conector peptídico comprende o consiste en un conector de gly-ser. En una realización, un conector de scFc o cscFc comprende al menos una porción de una bisagra de inmunoglobulina y un conector de glyser. Como se usa en el presente documento, el término "conector de gly-ser" se refiere a un péptido que consiste en restos de glicina y serina. En ciertas realizaciones, dicho conector de gly-ser se puede insertar entre otras dos secuencias del conector peptídico. En otras realizaciones, un conector de gly-ser se une en uno o ambos extremos de otra secuencia del conector peptídico. En aún otras realizaciones, dos o más conectores de gly-ser se incorporan en serie en un conector peptídico. En una realización, un conector peptídico de la invención comprende al menos una porción de una región bisagra superior (por ejemplo, derivada de una molécula de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), al menos una porción de una región bisagra central (por ejemplo, derivada de una molécula de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) y una serie de restos de aminoácidos gly/ser.

Los conectores peptídicos de la invención tienen al menos un aminoácido de longitud y pueden ser de longitudes variables. En una realización, un conector peptídico de la invención tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Como se usa en este contexto, el término "aproximadamente" indica /dos restos de aminoácidos. Puesto que la longitud del conector debe ser un entero positivo, la longitud de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud significa una longitud de desde 1-3 hasta 48-52 aminoácidos de longitud. En otra realización, un conector peptídico de la invención tiene desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. En otra realización, un conector peptídico de la invención tiene desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. En otra realización, un conector peptídico de la invención tiene desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 45 aminoácidos de longitud. En otra realización, un conector peptídico de la invención tiene desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 35 o aproximadamente 20 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. En otra realización, un conector peptídico de la invención tiene desde aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000 o 2000 aminoácidos de longitud. En una realización, un conector peptídico de la invención tiene 20 o 30 aminoácidos de longitud.

En algunas realizaciones, el conector peptídico puede comprender al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, o al menos 100 aminoácidos. En otras realizaciones, el conector peptídico puede comprender al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, o al menos 1.000 aminoácidos. En algunas realizaciones, el conector peptídico puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 aminoácidos. El conector peptídico puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100 200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600 700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoácidos o 900-1000 aminoácidos.

Los conectores peptídicos se pueden introducir en las secuencias de polipéptidos usando técnicas conocidas en la técnica. Las modificaciones se pueden confirmar por análisis de secuencias de ADN. Se puede usar ADN de plásmido para transformar células hospedadoras para la producción estable de los polipéptidos producidos.

Híbridos de monómero-dímero

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención que comprenden además una secuencia heteróloga de nucleótidos codifican una molécula híbrida de monómero-dímero que comprende FVIII. El término "híbrido de monómero-dímero" usado en el presente documento se refiere a una proteína quimérica que comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, que están asociadas entre sí por un enlace disulfuro, en donde la primera cadena comprende el factor VIII y una primera región Fc y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una segunda región Fc sin el FVIII. La construcción híbrida de monómero-dímero es así un híbrido que comprende un aspecto de monómero que tiene solo un factor de coagulación y un aspecto de dímero que tiene dos regiones Fc.

Secuencias de control de la transcripción

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se unen operativamente a al menos una secuencia de control de la transcripción. Una secuencia de control de la transcripción como se usa en el presente documento es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación de promotor-potenciador, que facilita la eficiente transcripción y traducción del ácido nucleico codificante al que se une operativamente. La secuencia de control de la expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero o viral, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos de mamífero incluyen, pero no se limitan a, los promotores para los siguientes genes: promotor de hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, beta-actina, y otros promotores constitutivos. Los promotores virales a modo de ejemplo que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores del citomegalovirus (CMV), virus simio (por ejemplo, SV40), virus del papiloma, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarcoma de Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney, y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Los expertos habituales en la técnica conocen otros promotores constitutivos. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, se induce el promotor de metalotioneína para promover la transcripción y traducción en presencia de ciertos iones metálicos. Los expertos habituales en la técnica conocen otros promotores inducibles.

En general, las secuencias de control de la transcripción deben incluir, según sea necesario, secuencias no transcriptoras de 5' y no traductoras de 5' implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tal como una caja TATA, secuencia de terminación, secuencia CAAT, y similares. Especialmente, dichas secuencias no transcriptoras de 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control de la transcripción del ácido nucleico codificante operativamente unido. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en la dirección 5', según se desee.

Vectores

La invención también proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención. Los vectores adecuados incluyen vectores de expresión, vectores virales y vectores plasmídicos.

Como se usa en el presente documento, un vector de expresión se refiere a cualquier construcción de ácidos nucleicos que contenga los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de una secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la replicación y la traducción, cuando se introducen en una célula hospedadora apropiada. Los vectores de expresión pueden incluir plásmidos, fagémidos, virus y derivados de los mismos.

Los vectores de expresión de la invención incluirán polinucleótidos optimizados que codifican la proteína FVIII BDD descrita en el presente documento. En una realización, las secuencias codificantes optimizadas para la proteína FVIII BDD están operativamente unidas a una secuencia de control de la expresión. Como se usa en el presente documento, dos secuencias de ácidos nucleicos se unen operativamente cuando se unen covalentemente de tal forma que se permita que cada secuencia de ácidos nucleicos componente retenga su funcionalidad. Se dice que una secuencia codificante y una secuencia de control de la expresión génica se unen operativamente cuando se unen covalentemente de tal forma que se ponga la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de la secuencia de control de la expresión génica. Se dice que dos secuencias de ADN se unen operativamente si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión del gen 5' da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación con desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia codificante, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente que se va a traducir en una proteína. Así, una secuencia de expresión génica se uniría operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos codificante si la secuencia de expresión génica fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácidos nucleicos codificante de forma que el transcrito resultante se tradujera en la proteína deseada o polipéptido.

Los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácidos nucleicos de los siguientes virus: retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina de Moloney, virus del sarcoma murino de Harvey, virus del tumor mamario murino y virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adeno-asociado; virus tipo SV40; virus del polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de la variolovacuna; virus de la poliomielitis; y virus de ARN tales como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores muy conocidos en la técnica. Ciertos vectores virales se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que genes no esenciales se han sustituido con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo vital implica transcripción inversa de ARN viral genómico en ADN con posterior integración proviral en ADN de la célula hospedadora. Los retrovirus han sido autorizados para ensayos de terapia de genes humanos. Los más útiles son los retrovirus que son deficientes en la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retroviral genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficiencia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno dentro de un plásmido, transfección de una línea celular de encapsidación con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea celular de encapsidación, recogida de partículas virales de medios de cultivo de tejido, e infección de las células diana con partículas virales) en Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) y Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

En una realización, el virus es un virus adeno-asociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adeno-asociado se puede manipular para ser deficiente en la replicación y es capaz de infectar una amplia variedad de tipos de células y especies. Tiene además ventajas tales como estabilidad al calor y disolventes lipídicos; altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, que incluyen células hematopoyéticas; y carecen de inhibición de la superinfección, permitiendo así múltiples series de transducciones. Supuestamente, el virus adeno-asociado se puede integrar dentro del ADN celular humano de un modo específico de sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis insercional y variabilidad de la expresión génica insertada característica de la infección retroviral. Además, se han seguido las infecciones por virus adeno-asociados naturales en cultivo de tejido durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, que implica que la integración genómica del virus adeno-asociado es un acontecimiento relativamente estable. El virus adeno-asociado también puede funcionar de un modo extracromosómico.

Otros vectores incluyen vectores plasmídicos. Los vectores plasmídicos se han descrito ampliamente en la técnica y son bien conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, se ha encontrado que los vectores plasmídicos son particularmente ventajosos para administrar genes a células in vivo debido a su incapacidad para replicarse dentro de e integrarse en un genoma hospedador. Estos plásmidos, sin embargo, que tienen un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido de un gen operativamente codificado dentro del plásmido. Algunos plásmidos comúnmente usados disponibles de proveedores comerciales incluyen pBR322, pUC18, pUC19, diversos plásmidos de pcDNA, pRC/CMV, diversos plásmidos de pCMV, pSV40 y pBlueScript. Los ejemplos adicionales de plásmidos específicos incluyen pcDNA3.1, número de catálogo V79020; pcDNA3.1/hygro, número de catálogo V87020; pcDNA4/myc-His, número de catálogo V86320; y pBudCE4.1, número de catálogo V53220, todos de Invitrogen (Carlsbad, CA.). Otros plásmidos son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica. Además, los plásmidos pueden ser diseñados a medida usando técnicas convencionales de biología molecular para retirar y/o añadir fragmentos específicos de ADN.

Células hospedadoras

La invención también proporciona células hospedadoras que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "transformación" se debe usar en un amplio sentido para referirse a la introducción de ADN en una célula hospedadora receptora que cambia el genotipo y, por consiguiente, da como resultado un cambio en la célula receptora.

"Células hospedadoras" se refiere a células que han sido transformadas con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. Las células hospedadoras de la presente invención son preferentemente de origen mamífero; lo más preferentemente de origen humano o de ratón. A los expertos en la técnica se les atribuye la capacidad de determinar preferentemente líneas de células hospedadoras particulares que son las más aptadas para su fin. Las líneas de células hospedadoras a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, CHO, DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (línea de riñón de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T del SV40), R1610 (fibroblasto de hámster chino), BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), P3.times.63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21 y HEK 293 (riñón humano). Las líneas de células hospedadoras normalmente están disponibles de servicios comerciales, la Colección Americana de Cultivos de tejido, o de la bibliografía publicada.

La introducción de las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención en la célula hospedadora se puede llevar a cabo por diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, pero no se limitan a, transfección (incluyendo electroforesis y electroporación), fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, fusión de células con ADN envuelto, microinyección e infección con virus intacto. Véase Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Capítulo 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Lo más preferentemente, la introducción de plásmidos en el hospedador es por electroporación. Las células transformadas se cultivan en condiciones apropiadas para la producción de las cadenas ligeras y cadenas pesadas, y se ensayan para la síntesis de proteínas de la cadena pesada y/o ligera. Las técnicas de ensayo a modo de ejemplo incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.

Las células hospedadoras que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se cultivan en un medio de crecimiento apropiado. Como se usa en el presente documento, el término "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene los nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento celular pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. Opcionalmente, los medios pueden contener uno o más factores de selección. Opcionalmente, los medios pueden contener suero de ternero bovino o suero de ternero fetal (FCS). En una realización, los medios no contienen sustancialmente IgG. El medio de crecimiento se seleccionará, en general, para células que contienen la construcción de ADN por, por ejemplo, selección de fármacos o deficiencia en un nutriente esencial que se complementa por el marcador de selección sobre la construcción de ADN o se co-transfecta con la construcción de ADN. Las células de mamífero cultivadas, en general, se cultivan en medio que contiene suero o sin suero comercialmente disponible (por ejemplo, MEM, DMEM, DMEM/F12). En una realización, el medio es CDoptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA.). En otra realización, el medio es CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). La selección de un medio apropiado para la línea celular particular usada está dentro del nivel de los expertos habituales en la técnica.

Preparación de polipéptidos

La invención también proporciona un polipéptido codificado por las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención. En otras realizaciones, el polipéptido de la invención está codificado por un vector que comprende las moléculas nucleicas aisladas de la invención. En aún otras realizaciones, el polipéptido de la invención se produce por una célula hospedadora que comprende las moléculas nucleicas aisladas de la invención.

En otras realizaciones, la invención también proporciona un método de producción de un polipéptido con actividad de FVIII, que comprende cultivar una célula hospedadora de la invención en condiciones por las cuales se produce un polipéptido con actividad de FVIII, y recuperar el polipéptido con actividad de FVIII. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido con actividad de FVIII es elevada con respecto a una célula hospedadora cultivada en las mismas condiciones, pero que contiene una secuencia de nucleótidos de referencia que comprende SEQ ID NO: 3, la secuencia del gen FVIII parental.

En otras realizaciones, la invención proporciona un método de aumento de la expresión de un polipéptido con actividad de FVIII que comprende cultivar una célula hospedadora de la invención en condiciones por las cuales un polipéptido con actividad de FVIII se expresa por la molécula de ácido nucleico, en donde la expresión del polipéptido con actividad de FVIII es elevada con respecto a una célula hospedadora cultivada en las mismas condiciones que comprende una molécula de ácido nucleico de referencia que comprende SEQ ID NO: 3.

En otras realizaciones, la invención proporciona un método de mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de factor VIII que comprende cultivar una célula hospedadora en condiciones por las cuales se produce un polipéptido con actividad de factor VIII por la molécula de ácido nucleico, en donde el rendimiento del polipéptido con actividad de factor VIII es elevado con respecto a una célula hospedadora cultivada en las mismas condiciones que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de referencia que comprende SEQ ID NO: 3.

Está disponible una variedad de métodos para producir recombinantemente una proteína FVIII a partir de la molécula de ácido nucleico optimizada de la invención. Se puede producir un polinucleótido de la secuencia deseada por síntesis de ADN en fase sólida de novo o por mutagénesis por PCR de un polinucleótido preparado antes. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método de preparación de una sustitución, inserción, deleción o alteración (por ejemplo, codón alterado) en una secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, el ADN inicial se altera hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con un molde de ADN monocatenario. Después de la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria completa del molde que incorpora el cebador de oligonucleótidos. En una realización, es suficiente ingeniería genética, por ejemplo, mutagénesis por PCR basada en cebadores, para incorporar una alteración, como se define en el presente documento, para producir un polinucleótido de la invención.

Para la producción de proteínas recombinantes, se inserta una secuencia de polinucleótidos optimizada de la invención que codifica la proteína FVIII en un vehículo de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la replicación y la traducción.

La secuencia de polinucleótidos de la invención se inserta en el vector en el marco de lectura apropiado. El vector de expresión se transfecta entonces en una célula diana adecuada que expresará el polipéptido. Las técnicas de transfección conocidas en la técnica incluyen, pero no se limitan a, precipitación con fosfato de calcio (Wigler et al.

1978, Cell 14:725) y electroporación (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1:841). Se puede utilizar una variedad de sistemas de hospedador-vector de expresión para expresar las proteínas FVIII descritas en el presente documento en células eucariotas. En una realización, la célula eucariota es una célula de animal, que incluye células de mamífero (por ejemplo, células HEK293, PER.C6®, células CHO, BHK, Cos, HeLa). Una secuencia de polinucleótidos de la invención también puede codificar una secuencia señal que permitirá secretar la proteína FVIII. Un experto en la técnica entenderá que mientras se traduce la proteína FVIII, la secuencia señal se escinde por la célula para formar la proteína madura. Se conocen en la técnica diversas secuencias señal, por ejemplo, secuencia señal del factor Vll nativo, secuencia señal del factor IX nativo y la secuencia señal de la cadena ligera de IgK de ratón. Alternativamente, donde una secuencia señal no está incluida en la proteína FVIII, se puede recuperar lisando las células.

La proteína FVIII de la invención se puede sintetizar en un animal transgénico no humano, tal como un roedor, cabra, oveja, cerdo o vaca. El término "animales transgénicos" se refiere a animales no humanos que han incorporado un gen extraño en su genoma. Debido a que este gen está presente en tejidos de la línea germinal, se pasa de los padres a la descendencia. Se introducen genes exógenos en embriones unicelulares (Brinster et al.

1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438). Se conocen en la técnica los métodos de producción animales transgénicos que incluyen transgénica que produce moléculas de inmunoglobulina (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al. 1983, Cell 34 : 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al.

1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59 : 831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).

Los vectores de expresión pueden codificar marcas que permiten la fácil purificación o identificación de la proteína recombinantemente producida. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el vector pUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791) en el que la secuencia codificante descrita en el presente documento de la proteína FVIII se puede unir en el vector en marco con la región codificante Z de lac de manera que se produzca una proteína híbrida; se pueden usar vectores pGEX para expresar proteínas con una marca de glutatión S-transferasa (GST). Estas proteínas son normalmente solubles y se pueden purificar fácilmente de las células por adsorción a perlas de glutatión-agarosa, seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (por ejemplo, PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)) para la fácil retirada de la marca después de la purificación.

Para los fines de la presente invención, se pueden emplear numerosos sistemas de vector de expresión. Estos vectores de expresión normalmente son replicables en los organismos hospedadores ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del hospedador. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias de control de la expresión que incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores naturalmente asociados o heterólogos), potenciadores, secuencias señal, señales de corte y empalme, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas de promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar las células hospedadoras eucariotas. Los vectores de expresión también pueden utilizar elementos de ADN que derivan de virus animales, tales como virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus de la variolovacuna, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV), citomegalovirus (CMV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de unión al ribosoma.

Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina o resistencia a neomicina) para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, Itakura et al., patente de EE. UU.

4.704.362). Se pueden seleccionar las células que han integrado el ^aDⁿen sus cromosomas introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de las células hospedadoras transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofia a un hospedador auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como el cobre. El gen marcador de selección se puede unir o directamente a las secuencias de ADN a expresar, o introducir en la misma célula por cotransformación.

Un ejemplo de un vector útil para expresar una secuencia de FVIII optimizado es NEOSPLA (patente de EE. UU. N° 6.159.730). Este vector contiene el promotor/potenciador del citomegalovirus, el promotor principal de beta-globina de ratón, el origen de replicación SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, el exón 1 y el exón 2 de neomicina fosfotransferasa, el gen dihidrofolato reductasa y la secuencia conductora. Se ha encontrado que este vector da como resultado una expresión de muy alto nivel de anticuerpos después de la incorporación de genes de las regiones variables y constantes, transfección en células, seguido por selección en medio que contiene G418 y amplificación con metotrexato. También se enseñan sistemas de vector en las patentes de EE. UU. N° 5.736.137 y 5.658.570. Este sistema proporciona altos niveles de expresión, por ejemplo, > 30 pg/célula/día. Otros sistemas de vector a modo de ejemplo se desvelan, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 6.413.777.

En otras realizaciones, los polipéptidos de la invención de la presente invención se pueden expresar usando construcciones policistrónicas. En estos sistemas de expresión, se pueden producir múltiples productos génicos de interés tales como múltiples polipéptidos de proteína de unión a multímero a partir de una única construcción policistrónica. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de polipéptidos en células hospedadoras eucariotas. Las secuencias de IRES compatibles se desvelan en la patente de EE. UU. N° 6.193.980, que también se incorpora en el presente documento.

Más en general, una vez se ha preparado el vector o la secuencia de ADN que codifica un polipéptido, el vector de expresión se puede introducir en una célula hospedadora apropiada. Es decir, las células hospedadoras se pueden transformar. La introducción del plásmido en la célula hospedadora se puede llevar a cabo por diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, como se trata anteriormente. Las células transformadas se cultivan en condiciones apropiadas para la producción del polipéptido FVIII, y se ensayan para la síntesis de polipéptidos FVIII. Las técnicas de ensayo a modo de ejemplo incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o citometría de flujo activada por flourescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares. En descripciones de procesos para el aislamiento de polipéptidos a partir de hospedadores recombinantes, los términos "célula" y "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente de polipéptido, a menos que se especifique evidentemente de otro modo. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las "células" puede significar cualquier de centrifugación de células completas, o del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

La línea de células hospedadoras usada para la expresión de proteínas es preferentemente de origen mamífero; lo más preferentemente de origen humano o de ratón, ya que los ácidos nucleicos aislados de la invención se han optimizado para la expresión en células humanas. Se han descrito anteriormente líneas de células hospedadoras a modo de ejemplo. En una realización del método para producir un polipéptido con actividad de FVIII, la célula hospedadora es una célula HEK293. En otra realización del método para producir un polipéptido con actividad de FVIII, la célula hospedadora es una célula CHO.

Los genes que codifican los polipéptidos de la invención también se pueden expresar en células no de mamífero, tales como células de bacteria o de levadura o vegetales. A este respecto se apreciará que también se pueden transformar diversos microorganismos unicelulares no de mamífero tales como bacterias; es decir, los capaces de ser cultivados en cultivos o fermentación. Las bacterias, que son susceptibles a la transformación, incluyen miembros de las enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Se apreciará además que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos normalmente llegan a ser parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos se deben aislar, purificar y luego ensamblar en moléculas funcionales.

Alternativamente, se pueden incorporar secuencias de nucleótidos optimizadas de la invención en transgenes para la introducción en el genoma de un animal transgénico no humano y la posterior expresión en la leche del animal transgénico (véase, por ejemplo, Deboer et al., documento de patente US 5.741.957, Rosen, documento de patente US 5.304.489 y Meade et al., documento de patente US 5.849.992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para polipéptidos en enlace operable con un promotor y potenciador de un gen específico de glándulas mamarias, tal como caseína o beta-lactoglobulina.

La producción in vitro permite el aumento de escala para dar grandes cantidades de los polipéptidos alterados deseados de la invención. Se conocen en la técnica técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo de tejido e incluyen cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo en un reactor de columna aireada o en un reactor continuo con agitador, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo en fibras huecas, microcápsulas, sobre microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si fuera necesario y/o se deseara, las disoluciones de polipéptidos se pueden purificar por los métodos habituales de cromatografía, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de (inmuno)afinidad, por ejemplo, después de la biosíntesis preferente de un polipéptido sintético de la región bisagra o antes de o después de la etapa de cromatografía HIC descrita en el presente documento. Se puede unir o incluir opcionalmente una secuencia de marca de afinidad (por ejemplo, una marca de His(6)) dentro de la secuencia de polipéptidos para facilitar la purificación en la dirección 3’.

Una vez expresada, la proteína FVIII se puede purificar según procedimientos convencionales de la técnica, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de afinidad, purificación por HPLC, electroforesis en gel y similares (véase, en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., ( i 982)). Se prefieren proteínas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95 % de homogeneidad, y lo más preferido 98 a 99 % o más de homogeneidad, para fines farmacéuticos.

Composición farmacéutica

Las composiciones que contienen la proteína FVIII de la presente invención, o los ácidos nucleicos aislados de la presente invención, pueden contener un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones diseñadas para administración al sitio de acción.

La composición farmacéutica se puede formular para administración parenteral (es decir, intravenosa, subcutánea, o intramuscular) por inyección en bolo. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua sin pirógenos.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral también incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones aceitosas apropiadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias, que aumentan la viscosidad de la suspensión, que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores. También se pueden usar liposomas para encapsular las moléculas de la invención para la administración en células o espacios intersticiales. Los vehículos farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo son disolventes fisiológicamente compatibles, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares. En algunas realizaciones, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico. En otras realizaciones, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la estabilidad en almacén o la eficacia de los principios activos.

Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, líquidos (por ejemplo, disoluciones inyectables e infusibles), dispersiones, suspensiones, formas farmacéuticas semisólidas y sólidas. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica.

La composición se puede formular como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles incorporando el principio activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización, que dan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración. La fluidez apropiada de una disolución se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

El principio activo se puede formular con una formulación o dispositivo de liberación controlada. Los ejemplos de dichas formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, por ejemplo, etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Se conocen en la técnica los métodos para la preparación de dichas formulaciones y dispositivos. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Se pueden preparar formulaciones de liberación prolongada inyectables formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación entre el fármaco y el polímero, y la naturaleza del polímero empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Otros polímeros biodegradables a modo de ejemplo son poliortoésteres y polianhídridos. También se pueden preparar las formulaciones inyectables de liberación prolongada atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones.

Se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. En una realización, la proteína quimérica de la invención se formula con otro factor de coagulación, o una variante, fragmento, análogo, o derivado del mismo. Por ejemplo, el factor de coagulación incluye, pero no se limita a, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, protrombina, fibrinógeno, factor de von Willebrand o factor tisular soluble recombinante (rsTF), o formas activadas de cualquiera de los precedentes. El factor de coagulación de agente hemostático también puede incluir fármacos antifibrinolíticos, por ejemplo, ácido épsilon-amino-caproico, ácido tranexámico.

Se pueden ajustar las pautas posológicas para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo, o se puede reducir o incrementar proporcionalmente la dosis como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular las composiciones parentales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).

Además del compuesto activo, la forma farmacéutica líquida puede contener componentes inertes tales como agua, alcohol etílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles, y ésteres de ácidos grasos de sorbitano.

También se describen ejemplos no limitantes de vehículos farmacéuticos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Algunos ejemplos de excipientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol, y similares. La composición también puede contener reactivos de tamponamiento del pH, y agentes humectantes o emulsionantes.

Para administración por vía oral, la composición farmacéutica puede tomar la forma de comprimidos o cápsulas preparadas mediante medios convencionales. La composición también se puede preparar como un líquido, por ejemplo, un jarabe o una suspensión. El líquido puede incluir agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (lecitina o goma arábiga), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden incluir aromatizantes, colorantes y edulcorantes. Alternativamente, la composición se puede presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado.

Para administración por vía oral, la composición puede tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar según protocolos convencionales.

Para administración por inhalación, los compuestos para su uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de un aerosol nebulizado con o sin excipientes, o en forma de un espray de aerosol de un envase presurizado o nebulizador, con opcionalmente un propulsor, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica también se puede formular para administración rectal como un supositorio o enema de retención, por ejemplo, que contiene bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

En una realización, una composición farmacéutica comprende una proteína FVIII, el polinucleótido optimizado que codifica la proteína FVIII, el vector que comprende el polinucleótido, o la célula hospedadora que comprende el vector, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición se administra por una vía seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración por vía oral. La administración parenteral puede ser intravenosa o administración subcutánea,

En otras realizaciones, la composición se usa para tratar una enfermedad o afección hemorrágica en un sujeto en necesidad del mismo. La enfermedad o afección hemorrágica se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de la coagulación hemorrágico, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo de la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intrabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del iliopsoas y cualquier combinación de los mismos. En otras realizaciones más, el sujeto es citado para realizarle una cirugía. En aún otras realizaciones, el tratamiento es profiláctico o a demanda.

Métodos de tratamiento

La invención proporciona un método de tratamiento de un trastorno hemorrágico que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una molécula de ácido nucleico, vector o polipéptido de la invención. En algunas realizaciones, el trastorno hemorrágico se caracteriza por una deficiencia en el factor VIII. En algunas realizaciones, el trastorno hemorrágico es hemofilia. En algunas realizaciones, el trastorno hemorrágico es hemofilia A. En algunas realizaciones del método de tratamiento de un trastorno hemorrágico, la actividad de factor VIII en plasma 24 horas después de la administración es elevada con respecto a un sujeto administrado con una molécula de ácido nucleico de referencia que comprende SEQ ID NO: 3, un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de referencia o un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

La invención también se refiere a un método de tratamiento, mejora o prevención de un trastorno hemostático en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína FVIII de la invención o una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. El tratamiento, la mejora y la prevención por la proteína FVIII o molécula de ácido nucleico aislada puede ser una terapia de derivación. El sujeto que recibe la terapia de derivación puede ya haber desarrollado un inhibidor a un factor de coagulación, por ejemplo, factor VIII, o se somete a desarrollo de un inhibidor del factor de coagulación.

Las moléculas de ácidos nucleicos, vectores o polipéptidos FVIII de la invención tratan o previenen un trastorno hemostático promoviendo la formación de un coágulo de fibrina. La proteína FVIII de la invención puede activar un miembro de una cascada de coagulación. El factor de coagulación puede ser un participante en la vía extrínseca, la vía intrínseca, o ambas.

Las moléculas de ácidos nucleicos, vectores o polipéptidos FVIII de la invención se pueden usar para tratar trastornos hemostáticos que se sabe que son tratables con FVIII. Los trastornos hemostáticos que se pueden tratar usando los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, hemofilia A, hemofilia B, enfermedad de von Willebrand, deficiencia de factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia de factor XII, así como deficiencias o anomalías estructurales en el fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X o factor XIII, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo de la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intrabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas. Las composiciones para administración a un sujeto incluyen moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos optimizada de la invención que codifica un factor de coagulación de FVIII (para aplicaciones de terapia génica), así como moléculas de polipéptido FVIII.

En algunas realizaciones, el trastorno hemostático es un trastorno heredado. En una realización, el sujeto tiene hemofilia A. En otras realizaciones, el trastorno hemostático es el resultado de una deficiencia en el factor VIII. En otras realizaciones, el trastorno hemostático puede ser el resultado de un factor de coagulación de FVIII defectuoso. En otra realización, el trastorno hemostático puede ser un trastorno adquirido. El trastorno adquirido puede resultar de una enfermedad o afección secundaria subyacente. La afección sin relacionar puede ser, como un ejemplo, pero no como una limitación, cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o embarazo. El trastorno adquirido puede resultar de vejez o de medicación para tratar un trastorno secundario subyacente (por ejemplo, quimioterapia contra el cáncer).

La invención también se refiere a métodos de tratamiento de un sujeto que no tiene un trastorno hemostático o una enfermedad o afección secundaria que da como resultado la adquisición de un trastorno hemostático. Así, la invención se refiere a un método de tratamiento de un sujeto en necesidad de un agente hemostático general que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido FVIII de la invención o una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Por ejemplo, en una realización, el sujeto en necesidad de un agente hemostático general se va a someter a, o está a punto de someterse, a cirugía. El polipéptido FVIII de la invención o una molécula de ácido nucleico aislada de la invención se puede administrar antes o después de la cirugía como un profiláctico. El polipéptido FVIII de la invención o una molécula de ácido nucleico aislada de la invención se puede administrar durante o después de la cirugía para controlar un episodio hemorrágico agudo. La cirugía puede incluir, pero no se limita a, trasplante de hígado, resección de hígado o trasplante de células madre.

En otra realización, el polipéptido FVIII de la invención o una molécula de ácido nucleico aislada de la invención se puede usar para tratar un sujeto que tiene un episodio hemorrágico agudo que no tiene un trastorno hemostático. El episodio hemorrágico agudo puede resultar de un traumatismo intenso, por ejemplo, cirugía, un accidente de coche, herida, laceración, arma de fuego o cualquier otro acontecimiento traumático que da como resultado una hemorragia incontrolada.

La proteína FVIII o las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se pueden usar para tratar profilácticamente un sujeto con un trastorno hemostático. La proteína FVIII o las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se pueden usar para tratar un episodio hemorrágico agudo en un sujeto con un trastorno hemostático.

En algunas realizaciones, una composición de proteína FVIII de la invención se administra en combinación con al menos otro agente que promueve la hemostasia. Dicho otro agente que promueve la hemostasia es un terapéutico con actividad coagulante demostrada. Como un ejemplo, pero no como una limitación, el agente hemostático puede incluir factor V, factor VII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, protrombina o fibrinógeno o formas activadas de cualquiera de los precedentes. El factor coagulante o agente hemostático también puede incluir fármacos antifibrinolíticos, por ejemplo, ácido épsilon-amino-caproico, ácido tranexámico.

En una realización de la invención, la composición (por ejemplo, el polipéptido FVIII o la molécula de ácido nucleico optimizada que codifica el polipéptido FVIII) es una en la que el FVIII está presente en forma activable cuando se administra a un sujeto. Dicha molécula activable se puede activar in vivo en el sitio de la coagulación después de la administración a un sujeto.

El polipéptido FVIII o la molécula de ácido nucleico optimizada que codifica el polipéptido FVIII se puede administrar por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intramuscular o por cualquier superficie mucosa, por ejemplo, por vía oral, por vía sublingual, por vía bucal, por vía sublingual, por vía nasal, por vía rectal, por vía vaginal o por vía pulmonar. La proteína FVIII se puede implantar dentro de o asociada a un soporte sólido de biopolímero que permite la lenta liberación de la proteína quimérica al sitio deseado.

Para administración por vía oral, la composición farmacéutica puede tomar la forma de comprimidos o cápsulas preparadas mediante medios convencionales. La composición también se puede preparar como un líquido, por ejemplo, un jarabe o una suspensión. El líquido puede incluir agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (lecitina o goma arábiga), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden incluir aromatizantes, colorantes y edulcorantes. Alternativamente, la composición se puede presentar como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo adecuado.

Para administración bucal y sublingual, la composición puede tomar la forma de comprimidos, pastillas para chupar o películas de rápida disolución según protocolos convencionales.

Para administración por inhalación, el polipéptido que tiene actividad de FVIII para su uso según la presente invención se administra convenientemente en forma de un espray de aerosol de un envase presurizado o nebulizador (por ejemplo, en PBS), con un propulsor apropiado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

En una realización, la vía de administración del polipéptido FVIII o la molécula de ácido nucleico optimizada que codifica el polipéptido FVIII es parenteral. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Se prefiere la forma intravenosa de administración parenteral. Mientras que todas estas formas de administración son claramente contempladas por estar dentro del alcance de la invención, una forma para administración sería una disolución para inyección, en particular para inyección intravenosa o intrarterial o goteo. Normalmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (por ejemplo, tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros métodos compatibles con las enseñanzas en el presente documento, los polipéptidos FVIII o las moléculas de ácidos nucleicos optimizadas que codifican los polipéptidos FVIII se pueden administrar directamente al sitio de la población celular adversa, aumentando así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen solución salina y medios tamponados. En el objeto de la invención, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, 0,01-0,1 M y preferentemente tampón fosfato 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Otros vehículos parenterales comunes incluyen disoluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato, o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen reforzadores de fluidos y de nutrientes, reforzadores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En tales casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y preferentemente se conservará contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos.

La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por diversos antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Se puede provocar la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, las disoluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un compuesto activo (por ejemplo, un polipéptido por sí mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización, que da un polvo de un principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración de la misma. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se envasan en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan en condiciones asépticas según métodos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones se pueden envasar y comercializar en forma de un kit. Dichos artículos de fabricación tendrán preferentemente etiquetas o prospectos que indican que las composiciones asociadas son útiles para tratar un sujeto que padece, o predispuesto a trastornos de la coagulación.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de afecciones, varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si tratamiento es profiláctico 0 terapéutico. Normalmente, el paciente es un humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento se pueden valorar usando métodos rutinarios conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y la eficacia.

Las dosis pueden variar de 1000 ug/kg a 0,1 ng/kg de peso corporal. En una realización, el intervalo de dosis es 1 ug/kg a 100 ug/kg. El polipéptido FVIII o la molécula de ácido nucleico optimizada que codifica el polipéptido FVIII se puede administrar continuamente o en intervalos programados específicos. Se pueden emplear ensayos in vitro para determinar intervalos de dosis óptima y/o programas para administración. Se conocen en la técnica ensayos in vitro que miden actividad del factor de coagulación. Además, se pueden extrapolar dosis eficaces de las curvas de dosis-respuesta obtenidas de los modelos animales, por ejemplo, un perro hemofílico (Mount et al. 2002, Blood 99 (8); 2670).

Las dosis intermedias en los intervalos anteriores también pretenden estar dentro del alcance de la invención. A los sujetos se pueden administrar dichas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o según cualquiera otro programa determinado por análisis empírico. Un tratamiento a un modo de ejemplo implica la administración en múltiples dosis durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. En algunos métodos, se pueden administrar simultáneamente dos o más polipéptidos, en cuyo caso la dosis de cada polipéptido administrado entra dentro de los intervalos indicados.

Se pueden administrar los polipéptidos FVIII o las moléculas de ácidos nucleicos optimizadas que codifican los polipéptidos FVIII de la invención en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo niveles en sangre de polipéptido modificado o antígeno en el paciente. Alternativamente, los polipéptidos se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosis y frecuencia varían dependiendo de la semivida del polipéptido o polinucleótido en el paciente.

La dosis y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen el polipéptido FVIII o la molécula de ácido nucleico optimizada que codifica el polipéptido FVIII o una mezcla de los mismos se administran a un paciente que no está todavía en el estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente o minimizar los efectos de la enfermedad. Se define que dicha cantidad es una "dosis eficaz profiláctica". Se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento para el resto de su vida.

Los polipéptidos FVIII o las moléculas de ácidos nucleicos optimizadas que codifican los polipéptidos FVIII de la invención se pueden administrar opcionalmente en combinación con otros agentes que son eficaces en el tratamiento del trastorno o afección en necesidad de tratamiento (por ejemplo, profiláctico o terapéutico).

Como se usa en el presente documento, la administración de polipéptidos FVIII o las moléculas de ácidos nucleicos optimizadas que codifican los polipéptidos FVIII de la invención conjuntamente o en combinación con una terapia complementaria significa la administración o aplicación secuencial, simultánea, coextensiva, simultánea, concomitante o contemporánea de la terapia y los polipéptidos desvelados. Los expertos en la técnica apreciarán que la administración o la aplicación de los diversos componentes de la pauta terapéutica combinada puede ser programada para potenciar la eficacia global del tratamiento. Un experto (por ejemplo, un médico) sería fácilmente capaz de discernir pautas terapéuticas combinadas eficaces sin excesiva experimentación basándose en la terapia complementaria seleccionada las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.

Se apreciará adicionalmente que el polipéptido FVIII o la molécula de ácido nucleico optimizada que codifica el polipéptido FVIII de la presente invención se puede usar conjuntamente o en combinación con un agente o agentes (por ejemplo, para proporcionar una pauta terapéutica combinada). Los agentes a modo de ejemplo con los que se puede combinar un polipéptido o polinucleótido de la invención incluyen agentes que representan el actual tratamiento de referencia para un trastorno particular que está tratándose. Dichos agentes pueden ser de naturaleza química o biológica. El término "biológico" o "agente biológico" se refiere a cualquier agente farmacéuticamente activo hecho de organismos vivos y/o sus productos que está previsto para su uso como un terapéutico.

La cantidad de agente que se va a usar en combinación con los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención puede variar por sujeto o se pueden administrar según lo que se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, en GOODMAN & GILMAN’S THE PHARMACOLOGIcAl Ba SiS OF THERAPEUTICS 1233-1287 (Joel G. Hardman et al., eds., 9a ed. 1996). En otra realización, se administra una cantidad de dicho agente de acuerdo con el tratamiento de referencia.

Como se ha tratado previamente, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención se pueden administrar en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de trastornos de la coagulación. A este respecto, se apreciará que los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden formular para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas según la presente invención comprenden un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable, no tóxico, tal como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Por supuesto, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en dosis únicas o dosis múltiples para proporcionar una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido.

Están disponibles varias pruebas para evaluar la función del sistema de coagulación: prueba del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa), ensayo cromogénico, ensayo ROTEM®, prueba del tiempo de protrombina (TP) (también usado para determinar INR), prueba de fibrinógeno (frecuentemente por el método de Clauss), número de plaquetas, prueba de la función plaquetaria (frecuentemente por PFA-100), TCT, tiempo de sangrado, prueba de mezcla (si una anomalía corrige si el plasma del paciente se mezcla con plasma normal), ensayos de factor de coagulación, anticuerpos antifosfolípidos, dímero D, pruebas genéticas (por ejemplo, factor V Leiden, mutación de protrombina G20210A), tiempo del veneno de la víbora de Russell diluido (dRVVT), diversas pruebas de la función plaquetaria, tromboelastografía (TEG o Sonoclot), tromboelastometría (TEM®, por ejemplo, ROTEM®) o tiempo de lisis de euglobulinas (ELT).

La prueba de TTPa es un indicador del rendimiento que mide la eficacia de tanto las vías de coagulación "intrínsecas" (también denominadas la vía de activación por contacto) como las vías de coagulación comunes. Esta prueba se usa comúnmente para medir la actividad de coagulación de factores de coagulación recombinantes comercialmente disponibles, por ejemplo, FVIII o FIX. Se usa junto con el tiempo de protrombina (TP), que mide la vía extrínseca.

El análisis ROTEM® proporciona información sobre la cinética completa de la hemostasia: tiempo de coagulación, formación de coágulos, estabilidad y lisis del coágulo. Los diferentes parámetros en la tromboelastometría dependen de la actividad del sistema de coagulación plasmático, la función plaquetaria, la fibrinólisis, o muchos factores que influyen en estas interacciones. Este ensayo puede proporcionar una visión completa de la hemostasia secundaria. Terapia génica

La invención proporciona un método de aumento de la expresión de un polipéptido con actividad de factor VIII en un sujeto que comprende administrar la molécula de ácido nucleico aislada de la invención a un sujeto en necesidad del mismo, en donde la expresión del polipéptido es elevada con respecto a una molécula de ácido nucleico de referencia que comprende SEQ ID NO: 3. La invención también proporciona un método de aumento de la expresión de un polipéptido con actividad de factor VIII en un sujeto que comprende administrar un vector de la invención a un sujeto en necesidad del mismo, en donde la expresión del polipéptido es elevada con respecto a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de referencia.

Se ha explorado la terapia génica somática como un posible tratamiento para la hemofilia A. La terapia génica es un tratamiento particularmente atractivo para la hemofilia debido a su posibilidad para curar la enfermedad mediante la producción endógena continua de FVIII tras una administración única de vector. La hemofilia A es muy apta para un enfoque de sustitución génica debido a que sus manifestaciones clínicas son completamente atribuibles a la falta de un único producto génico (FVIII) que circula en cantidades mínimas (200 ng/ml) en el plasma.

Sería terapéuticamente beneficiosa una proteína FVIII de la invención que se puede producir in vivo en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, usando un enfoque de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad hemorrágica o trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo de la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intrabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas. En una realización, la enfermedad o trastorno hemorrágico es hemofilia. En otra realización, la enfermedad o trastorno hemorrágico es hemofilia A. Esto implica la administración de un ácido nucleico que codifica FVIII optimizado operativamente unido a secuencias de control de la expresión adecuadas. En ciertas realización, estas secuencias se incorporan en un vector viral. Los vectores virales adecuados para dicha terapia génica incluyen vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores baculovirales, vectores virales de Epstein Barr, vectores papovavirales, vectores virales de la variolovacuna, vectores virales del herpes simple y vectores de virus adeno-asociados (AAV). El vector viral puede ser un vector viral defectuoso en la replicación. En otras realizaciones, un vector adenoviral tiene una deleción en su gen E1 o gen E3. Cuando se usa un vector adenoviral, el mamífero puede no exponerse a un ácido nucleico que codifica un gen marcador de selección. En otras realizaciones, las secuencias se incorporan en un vector no viral conocido por los expertos en la técnica.

Todos los diversos aspectos, realizaciones y opciones descritos en el presente documento se pueden combinar en todas y cada una de las variaciones.

Habiendo descrito, en general, la presente invención, se pueden obtener un entendimiento adicional como referencia a los ejemplos proporcionados en el presente documento. Estos ejemplos son para los fines de ilustración solo y no pretenden ser limitantes.

EJEMPLOS

Se diseñaron secuencias de FVIII BDD optimizado por dos codones con los siguientes objetivos:

1. Retirar todas las secuencias de la región de tipo unión a matriz (MAR) (ATATTT y AAATAT; SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente);

2. Retirar todas las secuencias desestabilizantes (ATTTA, SEQ ID NO: 8 y TAAAT, SEQ ID NO: 9);

3. Retirar las secuencias de unión a promotor (TATAA, SEQ ID NO: 12 y TTATA, SEQ ID NO: 13);

4. Retirar los elementos de secuencias ricos en AU (ARE): ATTTTATT (nucleótido 2468) y ATTTTTAA (nucleótido 3790) (SEQ ID NOs: 14 y 15, respectivamente);

5. Añadir secuencia de Kozak (GCCGCCACCATGC, lo subrayado indica el codón de iniciación de la traducción; SEQ ID NO: 16) para aumentar el inicio traduccional;

6. Ajustar los sitios de restricción para facilitar la clonación;

7. Adaptar el uso de codones a la preferencia codónica de genes de Homo sapiens;

8. Ajustar para evitar regiones de contenido de GC muy alto (>70 %) o bajo (<30 %), que pueden aumentar la estabilidad de ARN o prolongar la semivida de ARN.

Ejemplo 1: Optimización por codones por GENSCRIPT OPTIMUMGENE™

Se optimizó la secuencia de nucleótidos de FVIII BDD por codones usando la tecnología de optimización por codones GENSCRIPT OPTIMUMGENE™ (GenScript Corp., New Jersey, EE. UU.). La tecnología de optimización por codones GENSCRIPT OPTIMUMGENE™ se describe en Burgess-Brown et al., Protein Expr Purif. 59(1 ):94-102 (2008).

Se usaron los siguientes datos de uso de codones humanos para la optimización:

CODÓN AMINOÁCIDO FRACCIÓN FRECUENCIA/MIL

TTT F 0,45 16,9

TCT S 0,18 14,6

TAT Y 0,43 12,0

TGT C 0,45 9,9

TTC F 0,55 20,4

TCC S 0,22 17,4

TAC Y 0,57 15,6

TGC C 0,55 12,2

TTA L 0,07 7,2

TCA S 0,15 11,7

TAA ^*0,28 0,7

CODÓN AMINOÁCIDO FRACCIÓN FRECUENCIA/MIL TGA ^*0,52 1,3

TTG L 0,13 12,6

TCG S 0,06 4,5

TAG ^*0,20 0,5

TGG W 1,00 12,8

CTT L 0,13 12,8

CCT P 0,28 17,3

CAT H 0,41 10,4

CGT R 0,08 4,7

CTC L 0,20 19,4

CCC P 0,33 20,0

CAC H 0,59 14,9

CGC R 0,19 10,9

CTA L 0,07 6,9

CCA P 0,27 16,7

CAA C 0,25 11,8

CGA R 0,11 6,3

CTG L 0,41 40,3

CCG P 0,11 7,0

CAG C 0,75 34,6

CGG R 0,21 11,9

ATT I 0,36 15,7

ACT T 0,24 12,8

AAT N 0,46 16,7

AGT S 0,15 11,9

ATC I 0,48 21,4

ACC T 0,36 19,2

AAC N 0,54 19,5

AGC S 0,24 19,4

ATA I 0,16 7,1

ACA T 0,28 14,8

AAA K 0,42 24,0

AGA R 0,20 11,5

ATG M 1,00 22,3

ACG T 0,12 6,2

CODÓN AMINOÁCIDO FRACCIÓN FRECUENCIA/MIL

AAG K 0,58 32,9

AGG R 0,20 11,4

GTT V 0,18 10,9

GCT A 0,26 18,6

GAT D 0,46 22,3

GGT G 0,16 10,8

GTC V 0,24 14,6

GCC A 0,40 28,5

GAC D 0,54 26,0

GGC G 0,34 22,8

GTA V 0,11 7,0

GCA A 0,23 16,0

GAA E 0,42 29,0

GGA G 0,25 16,3

GTG V 0,47 28,9

GCG A 0,11 7,6

GAG E 0,58 40,8

GGG G 0,25 16,4

Se ajustó el uso de codones al sesgo humano con el índice de adaptación de codones (IAC) humanos cambiando desde 0,75 (FVIII BDD natural) hasta 0,88 (FVIII BDD optimizado por GenScript). El contenido de G/C aumentó desde 46,16 % hasta 51,56 %. Se retiraron los picos de contenido de G/C en una ventana de 60 pb. La secuencia resultante de FVIII BDD optimizado por GenScript se desvela en el presente documento como SEQ ID NO: 1 y se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 2: Optimización por codones por GENEART® GENEOPTIMIZER®

La secuencia de nucleótidos de FVIII BDD se optimizó por codones usando el software GENEART® GENEOPTIMIZER® (Invitrogen LIFE TECHNOLOGIES™ Corp., Grand Island, NY). La tecnología de optimización por codones GENE^aR^t® GENEOPTIMIZER® se describe en Graf et al., J. Virol. 74(22):10822-10826 (2000).

Se ajustó el uso de codones al sesgo humano con el índice de adaptación de codones (IAC) humanos cambiando desde 0,75 (FVIII BDD natural) hasta 0,96 (FVIII BDD optimizado por GeneArt). El contenido de G/C aumentó desde 46,16 % hasta 59 %. La secuencia resultante de FVIII BDD optimizado por GeneArt se desvela en el presente documento como SEQ ID NO: 2 y se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 3: Construcciones de expresión

Todas las construcciones se hicieron en el esqueleto del vector Invitrogen pcDNA™4, que contiene un promotor inmediato-temprano del citomegalovirus humano (CMV), un potenciador de la traducción QBI SP163 y un gen ZEOCIN™ de resistencia para la selección.

pSYN-FVIII-066 conduce la expresión de FVIII BDD natural (SEQ ID NO: 3) en el esqueleto de pcDNA4 (Invitrogen). pSYN-FVIII-116 conduce la expresión de FVIII BDD optimizado por codones (SEQ ID NO: 1) en el esqueleto de pcDNA4. La construcción deriva de pSYN-FVIII-066 reemplazando FVIII BDD natural con FVIII BDD optimizado por codones (SEQ ID NO: 1) usando sitios BsiWI y XhoI.

pSYN-FVIII-115 conduce la expresión de FVIII BDD optimizado por codones (SEQ ID NO: 2) en el esqueleto de pcDNA4. La construcción deriva de pSYN-FVIII-066 reemplazando FVIII BDD natural con FVIII BDD optimizado por codones (SEQ ID NO: 2) usando sitios BsiWI y XhoI.

Todas las construcciones se confirmaron por secuenciación de ADN.

Ejemplo 4: La optimización por codones mejora la expresión de FVIII en un ratón HemA

Para preguntar si cualquiera de las construcciones de FVIII BDD optimizado por codones da como resultado la elevada expresión de proteínas FVIII, se introdujeron plásmidos de expresión pSYN-FVIII116, pSYN-FVIII115 y el control natural pSYN-FVIII-066 en ratones HemA por inyección hidrodinámica. Posteriormente, se monitorizaron los niveles de expresión de FVIII en cada ratón inyectado por ensayos cromogénicos de FVIII de plasma.

La inyección hidrodinámica es un método no viral eficiente y seguro de administración de genes al hígado en animales pequeños, tales como ratones y ratas. La proteína de interés se produce en el hígado y se puede detectar en el plazo de 24 horas después de la inyección.

Se inyectaron por inyección intravenosa ratones HemA que pesaban 20-35 gramos en la vena de la cola con cualquiera de pSYN-FVIII116, pSYN-FVIII115 o el control natural pSYN-FVIII-066. Las inyecciones se constituyeron con 10 ug de ADN de plásmido desnudo libre de endotoxina en disolución al 0,9 % de solución salina estéril, dando un volumen total de 2 mL. Las inyecciones se realizaron rápidamente, necesitándose no más de 4-7 segundos para inyectar la disolución completa de 2 mL de ADN. Los ratones se monitorizaron estrechamente durante dos horas después de la inyección, o hasta que se reanudó la actividad normal. 24 horas después de la inyección, las muestras se recogieron por extracción de sangre retrorbital, se preparó el plasma y se conservó a -80 °C para análisis adicionales.

La actividad de FVIII se midió usando el kit de FVIII COATEST SP de DiaPharma (lote N° N089019) y todas las incubaciones se realizaron en un calentador de placas a 37 °C con agitación. Los patrones de FVIIIr variaron desde 100 mUI/mL hasta 0,78 mUI/mL. Se añadieron un control de ensayo de mezclas de plasmas humanos normales y muestras de plasma (diluidas con tampón IX Coatest) en placas Immulon 2HB de 96 pocillos por duplicado (25 pL/pocillo). Se añadieron mezcla de IXa/FX/fosfolípido recién preparada (50 pL), 25 pL de CaCl²25 mM y 50 pL de sustrato de FXa uno detrás de otro a cada pocillo con una incubación de 5 minutos entre cada adición. Después de la incubación con el sustrato, se añadieron 25 pL de ácido acético al 20 % para terminar la reacción de color y se midió la absorbancia a DO405 con un instrumento SpectraMAX plus (Molecular Devices). Los datos se analizaron con el software SoftMax Pro (versión 5.2). El nivel más bajo de cuantificación (LLOQ) es 7,8 mUI/mL. Los resultados se muestran en la Figura 7.

Se detectan bajos niveles de actividad de FVIII BDD tras la administración del plásmido de expresión de FVIII pSYN-FVIII-066 (control de FVIII BDD natural). La actividad de FVIII BDD promedio en ratones de control es aproximadamente 4-5 UI/mL (Figura 7, círculos). A diferencia, en promedio, se observa un aumento de aproximadamente tres veces en la actividad de FVIII BDD en el plasma de ratones administrados con pSYN-FVIII115 o pSYN-FVIII116 optimizado por codones (Figura 7, cuadrados y triángulos). Por tanto, la optimización por codones de FVIII BDD por los enfoques descritos anteriormente mejora la expresión de FVIII en un modelo de ratón HemA.

SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 - FVIII BDD optimizado

CGTACGGCCGCCACCATGCAGATTGAGCTGTCTACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGGTTTTGCTTTTCCGCTACACG AAGGTATTATCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCAAGGT TTCCCCCTAGAGTCCCTAAGTCATTCCCCTTCAACACTAGCGTGGTCTACAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGAT CACCTGTTCAACATCGCAAAGCCTAGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGGCCAACAATCCAGGCCGAGGTGTACGACAC CGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCG AAGGAGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGATCTCATACCTAC GTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCTATGGCCTCCGACCCTCTGTGCCTGACC'i'ACTCTTATCTGAGTCACGTGGA CCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGCCTGATCGGAGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAAGGAAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCC AGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGGAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTG ATGCAGGACAGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCC TGGGCTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGGATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTT TCCTGGAGGGACATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCTTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCA CAGACTCTGCTGATGGACCTGGGGCAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCTTA CGTGAAAGTGGACTCTTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCAGAAGACTATGACGATGACC TGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAG AAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGA CGATCGCTCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGGCCACAGAGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGCGGTTCATGG CATATACCGATGAGACCTTCAAGACTCGCGAAGCCATCCAGCACGAGAGCGGCATCCTGGGACCACTGC'ÍGTACGGAGAA GTGGGAGACACCCTGCTGATCATTTTCAAGAACCAGGCCAGCCGGCCTTACAATATCTATCCACATGGGATTACAGATGT GCGCCCTCTGTACAGCAGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGAGAAATCTTCA AGTACAAGTGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTCGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTC GTGAATATGGAAAGAGATCTGGCAAGCGGACTGATGGGACCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGG CAACCAGATCATGTCCGACAAGCGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACAGGTCATGGTACCTGACCGAGA ACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCTGGGGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCATCTAACATCATGCATAGT ATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTTTGCAGCTGAGCGTGTGCCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGG GGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTT’iVCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTCTATGAGGACACACTGACTC

TGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGAGCATGGAGAATCCCGGACTGTGGATTCTGGGGTGCCACAACAGCGAT

TTCAGAAATCGCGGAATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGGGACTACTATGAAGATTCATA

CGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCGGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGA

AGCGGCACCAGCGCGAGATGACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTG

GAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCAGGCA

TTACTTTATTGCCGCAGTGGAGCGGCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATAGGGCCCAGT

CAGGAAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGGTCCTTTACTCAGCCACTGTACAGGGGC

c a i r 't r a a r ’n a c r a r r i 'c n n j r T 'r r T r r R f i n r r T a T a T r n r a n r a ^ a a C T c n i c r a T a a r i n ’T a T 'íz n T r 'a r r T T r a c a a a

TCAGGCCTCTCGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGCGACAGGGAGCTGAACCACGAA

AAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAGTTC

GATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTGCACAGTGGCCTGATTGGCCCACTGCTGGT

GTGCCATACTAACACCCTGAATCCAGCCCACGGCCGGCAGGTCACTGTCCAGGAGTTCGCTCTGTTCTTTACCATCTTTG

ATGAGACAAAGAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCAGGGCTCCATGTAACATTCAGA'ÍGGAAGACCCC

ACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCTATCAATGGATACATCATGGATACTCTGCCCGGGCTGGTCATGGCACAGGA

CCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTGAGCATGGGCAGCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGGCACGTGTTTA

CTGÍ:CAGGAAGAAAGAAGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCT

AGCAAGGCCGGAATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGAGAGCACCTGCATGCTGGGATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTA

CAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGAATGGCATCCGGGCATATCAGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACG

GACAGTGGGCACCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGATCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGG

ATTAAGGTGGACC-TGCTGGCCCCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGAGCTCGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTA

CATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGAACTCTGA

TGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGCAGCGGAATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCCGG

CTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGAGGATGGAACTGÁTGGGATGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCC

CCTGGGGATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGA

GCCCTTCCAAAGCAAGACTGCACCTGCAAGGCCGCAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGTTG

CAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGGGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGT

GAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGACATCAGTGGACACTGTTCTTTCÁGAACGGGAAGGTGAAAGTCTTCC

AGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACAGTCTAGACCCTCCACTGCTGACCAGATACCTGAGAATCCACCCT

CAGTCCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGAATGGAAGTGCTGGGATGCGAGGCCCAGGATCTGTACTGATAACTCGAGTC

GACC

SEQ ID NO: 2 - FVIII BDD optimizado

GGCGCGCCCGTACGGCCGCCñCCATGCAGATCGAGCTGTCTACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGCGGTTCTGCTTCAGC

GCCACCCGGCGGTACTACCTGGGCGCCGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGGGAGCTGCCCGTGGA

CGCCAGATTCCCCCCAAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTGTTCGTCGAGT

TCACCGACCACCTGTTCAATATCGCCAAGCCCAGACCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCTACAATCCAGGCCGAGGTG

TACGACACCGTGGTCATCACCCTTAAGAACATGGCCAGCCACCCCGTGTCCCTGCAGGCCGTGGGCGTGTCCTACTGGAA

GGCCTCTGAGGGCGCTGAGTACGACGACCAGACCAGCCAGCGCGA.GAAAGAGGACGÁCAAAGTCTTTCCTGGCGGCAGCC

ATACCTACGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAAAACGGCCCTATGGCCTCCGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGC

CACGTGGACCTGGTCAAGGACCTGAACAGCGGCCTGATTGGCGCCCTGCTCGTGTGTAGAGAGGGCAGCCTCGCCAAAGA

GAAAACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTCGCCGTGTTCGACGAGGGCAAGAGCTGGCACAGCGAGACAAAGA

ACAGCCTGATGCAGGACCGGGACGCCGCCTCTGCCAGAGCCTGGCCTAAGATGCACACCGTGAACGGCTACGTGAACAGA

AGCCTGCCCGGACTGATCGGCTGCCACCGGAAGfCCGTGTACTGGCACGTGATCGGCATGGGCACCACCCCCGAGGTGCA

CAGCATCTTTCTGGAAGGCCACACCTTCCTCGTGCGGAACCACAGACAGGCCAGCCTGGAAATCAGCCCTATCACCTTCC

TGACCGCCCAGACACTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCAGCCACCAGCACGACGGCATG

GAAGCCTACGTGAAGGTGGACAGCTGCCCCGAGGAACCCCAGCTGCGGATGAAGAACAACGAGGAAGCCGAGGACTACGA

CGACGACCTGACCGACAGCGAGATGGACGTCGTGCGCTTCGACGACGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGAAGCG

TGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTATATCGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCCCCTCTGGTGCTG

GCCCCCGACGACAGAAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGCGGATCGGCCGGAAGTACAAGAAAGTGCG

GTTCATGGCCTACACCGACGAGACATTCAAGACCAGAGAGGCCATCCAGCACGAGAGCGGCATCCTGGGCCCCCTGCTC-T

ATGGCGAAGTGGGCGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCCGGCCCTACAACATCTACCCCCACGGCATC

ACCGACGTGCGGCCCCTGTACAGCAGACGGCTGCCCAAGGGCGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCCGGCGA

GATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACCGTGGAAGATGGCCCCACCAAGAGCGACCCCAGATGCCTGACCCGGTACTACA

GCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCCTCCGGGCTGATCGGCCCTCTGCTGATCTGCTACAAAGAAAGCGTGGAC

CAGCGGGGCAACCAGATCATGAGCGACAAGCGGAACGTGATCCTGTTCAGCGTGTTCGATGAGAATCGGTCCTGGTACCT

GACCGAGAATATCCAGCGG'ÍTCCTGCCCAACCCTGCCGGCGTGCAGCTGGAAGATCCCGAGTTCCAGGCCAGCAACATCA

TGCACTCCATCAATGGCTACGTGTTCGACAGGCTCCAGCTGAGCGTGTGCCTGCACGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTG

AGCATCGGCGCCCAGACCGACTTCCTGAGCGTGTTCTTCAGCGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTACGAGGATAC

CCTGACCCTGTTCCCCTTCTCCGGCGAAACCGTGTTCATGAGCATGGAAAACCCCGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACA

ACAGCGACTTCAGAAACCGGGGCATGACCGCCCTGCTGAAGGTGTCCAGCTGCGACAAGAACACCGGCGACTACTACGAG

GACAGCTATGAGGACATCAGCGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAACGCCATCGAGCCCAGATCCTTCAGCCAGAACCCCCC

CGTGCTGAAGCGGCACCAGAGAGAGATCACCCGGACCACCCTGCAGTCCGACCAGGAAGAGATTGATTACGACGACACCA

TCAGCGTCGAGATGAAGAAAGAGGAT'íTCGACATCTACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCCGGTCCTTCCAGAAGAAA

ACCCGGCACTACT'iCATTGCCGCCGTGGAAAGACTGTGGGACTACGGCATGAGCAGCAGCCCCCACGTGCTGCGGAACAG AGCCCAGAGCGGCAGCGTGCCCCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAGTTCACCGACGGCAGCTTCACCCAGCCCC'i’GT

ATCGGGGCGAGCTGAACGAGGACCTGGGACTGCTGGGACCTTACATTAGAGCCGAGGTGGAAGATAACATCATGGTCACC

TTCAGAAACCAGGCCTCCAGACCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTACGAAGAGGACCAGCGGCAGGGCGCCGA

ACCCCGGAAGAACTTCGTGAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACAAAGG

AGGAGTTCGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGi'GGACCTGGAAAAGGACGTGCACTCTGGCCTGATTGGACCT

CTGCTCGTCTGCCACACCAACACCCTGAACCCCGCCCACGGCCGGCAGGTCACAGTGCAGGAATTTGCCCTGTTCTTCAC

CATCTTCGATGAGACAAAGAGCTGGTACTTCACCGAGAACATGGAAAGAAACTGTAGAGCCCCCTGCAACATCCAGATGG

AAGATCCTACCTTCÁAAGAGAACTATCGGTTCCACGCCATCAACGGCTACATCATGGACACCCTGCCCGGCCTGGTCATG

GCCCAGGATCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTGAGCATGGGCAGCAACGAGAACATCCACAGCATCCACTTCAGCGGCCA

CGTGTTCACAGTGCGGAAGAAAGAAGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCCGGCGTGTTCGAGACAGTGGAAA

TGCTGCCCAGCAAGGCCGGCATCTGGCGGGTGGAATGTCTGATCGGCGAGCATCTGCACGCCGGAATGAGCACCCTGTTT

CTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCTCTGGGCATGGCCAGCGGCCACATCCGGGACTTCCAGATCACCGCCTCCGG

CCAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCCCGGCTCCACTACTCCGGATCTATCAACGCCTGGTCCACCAAAGAGCCCT

TCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCTATGAÍCATCCACGGAATCAAGACCCAGGGCGCCAGACAGAAGTTCAGC

AGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGCAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGCAACAGCACCGG

CACCCTGATGGTGTTCTTCGGCAACGTGGACAGCAGCGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCCGGT

ACATCCGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGCTGCGACCTGAACTCTTGC

AGCATGCCCCTGGGGATGGAAAGCAAGGCCATCAGCGACGCCCAGATCACAGCGAGCAGCTACTTCACCAACATGTTCGC

CACCTGGTCCCCAAGCAAAGCCCGCCTGCATCTCCAAGGCAGAAGCAATGCCTGGCGGCCTCAGGTCAACAACCCCAAAG

AATGGCTCCAGGTGGACTTTCAGAAAACCATGAAGGTCACAGGCGTGACCACCCAGGGCGTGAAAAGCCTGCTGACCTCT

ATGTACGTGAAAGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAACGGCAAAGTGAA

AGTGTTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTTACCCCCGTGGTCAACTCTCTAGACCCTCCACTGCTGACCAGATACCTGAGAA

TCCACCCTCAGTCCTGGGTGCACCAGAT^'GCCCTGAGAATGGAAGTGCTGGGATGCGAGGCCCAGGATCTGTACTGATAA

GTCGAGTCGACTTAATTAA

SEQ ID NO: 3 - Secuencia de nucleótidos que codifica FVIII BDD "parental" ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGfiAGATACTACCTGGG TGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGC CAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATC GCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACT TAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGG^tGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGÁGCTGAATATG ATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTG AAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCÁ^tGTGGACCTGGTAAAAGACTT GAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAAT TTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGGACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGAT GCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATG CCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACA CATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATG GACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAG CTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAA TGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACT TGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAA AAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAA

^{c c t t t a a g a c t c g t g a a g c t a t t c a g c a t g a a t c a g g a a t c t t g g g a c c t t t a c t t t a t g g g g a a g t t g g a g a c}A^{cac tg}TTGATTATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTC AAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAG TGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGA GATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTC AGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTC TCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTT TTTGATAGTTTGGAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTT CCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAG GAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGC ATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGÁAGATATTTCAGC ATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGG AAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAA GATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAMACACGACACTATTTTATTGCTGC AGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGGTCCGCACATGTTeTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGGAGTGTGGCTG AGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACAT TTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTGGTCC CTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGC CTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAÁCATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGG GCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACAC ACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTAeAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCT ^{g g t a c t t c a c t g a a a a t a t g g a a a g a a a c t g c a g g g c t c c c t g c a a t a t c c a g a t g g a a g a t c c c a c t t t t a a a g a g}A^at

TATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATG

GTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAG

AGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATT

TGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTtCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCA GACTCeCCTGGGAÁTGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAA

AGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTG

TTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTAT

CATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCA

atgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcat

TATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAG

TAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTC

GACTTCACCTCGAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAG

AAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCAT

CTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACT

CCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCAC

CAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTAC

SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácidos de FVIII BDD

atrryylgavelswdymqsdlgelpvdarfpprvpksfpfntswykktlfveftdhlfniakprppwmgllgptiqAw

YDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLS

HVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNR

SLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTL_jMDLGQFLLFCHISSHQHDGM

EAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVL

APDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTRSAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGI

TDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVE'DGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVD

QRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYIL

SIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYE

DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKK

TRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVT

FRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGP

LLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVM

AQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLF

LVYSNRCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPF^WIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFS

SLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSC

SMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTS

MYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

SEQ ID NO: 5 - Secuencia de nucleótidos MAR/ARS

ATATTT

SEQ ID NO: 6 - Secuencia de nucleótidos MAR/ARS

AAATAT

SEQ ID NO: 7 - Posible sitio de corte y empalme

GGTGAT

SEQ ID NO: 8 - Secuencia desestabilizante

ATTTA

SEQ ID NO: 9 - Secuencia desestabilizante

TAAAT

SEQ ID NO: 10 - Secuencia de poli-T

TTTTTT

SEQ ID NO: 11 - Secuencia de poli-A

AAAAAAA SEQ ID NO: 12 - Sitio de unión al promotor

TATAA SEQ ID NO: 13 - Sitio de unión al promotor

TTATA SEQ ID NO: 14 - Elementos de secuencia rica en AU (ARE)

ATTTTATT SEQ ID NO: 15 - Elementos de secuencia rica en AU (ARE)

ATTTTTAA SEQ ID NO: 16 - Secuencia consenso de Kozak

GCCGCCACCATGC SEQ ID NO: 17 - Péptido CTP

DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL SEQ ID NO: 18 - Péptido CTP

SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ SEQ ID NO: 19 - Secuencia central de péptidos de unión a albúmina

DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 20 - Secuencia PAS

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA SEQ ID NO: 21 - Secuencia PAS

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS SEQ ID NO: 22 - Secuencia PAS

APSSPSPSAPSSPSPASPSS SEQ ID NO: 23 - Secuencia PAS

APSSPSPSAPSSPSPASPS SEQ ID NO: 24 - Secuencia PAS

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA SEQ ID NO: 25 - Secuencia PAS

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA SEQ ID NO: 26 - Secuencia PAS

ASAAAPAAASAAASAPSAAA SEQ ID NO: 27 - Longitud completa de la secuencia de nucleótidos del factor de von Willebrand ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTTGCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAG GTCATCCACGGCCCTACTAAGGACGGTCTAAACGGCCCCACGACGAACGAGACCGGGAGTAAAACGGTCCCTGGGAAACACGTCTT CCTTGAGCGCCGTCCAGTAGGTGCCGGGGATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATGTACAGCTT TGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAACTACGTCGGAAAAGCCTTCACTGAAGCAGTTGTGGAAACTACCC TCGTACATGTCGAAACGCCCTATGACGTCAATGGAGGACCGTCCCCCGACGGTCTTACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCA GAATGGCAAGAGAGTGAGCCTCTCCGTGTñTCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGTTGCGAGGAÁGAGCTAA TAACCCCTGAAGGTCTTACCGTTCTCTCACTCGGAGAGGCACATAGAACCCCTTAAAAAACTGTAGGTAAACAAACAGTTACCÁAC CGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGGGCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGT CCGGTGAGGCCTTGGCACTGTGTCCCCCTGGTTTCTCAGAGGTACGGGATACGGAGGTTTCCCGACATAGATCTTTGACTCCGACC CATGATGTTCGACAGGCCACTCCGGAATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTGTCAGACAGAT ACTTCAACAAGACCTGCGGGCTGTGTGGCAACTTTAACATTACCGAAACACCGGTCCTAGCTACCGTCGCCGTTGAAAGTTCAGGA CGACAGTCTGTCTATGAAGTTGTTCTGGACGCCCGACACACCGTTGAAATTGTACTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAG GGACCTTGACCTCGGACCCTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGTGAAACGACTTCTACTGAA ATACTGGGTTCTTCCCTGGAACTGGAGCCTGGGAATACTGAAACGGTTGAGTACCCGAGACTCGTCACCTCTTGTCACCACAGAAC GGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGSAAATGCAGAAGGGCCSGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGC ACCTCGGTGTCTTGCCCGTAGAGGAGGGTCGTCGAGTACGTTGTAGAGGAGACCCCTTTACGTCTTCCCGGACACCCTCGTCACGG TCGAAGACTTCTCGTGGAGCCACATTGCCCGCTGCCACCCTGTGGTGGACCCCGfiGCCTTTTGTGGCCCTGTGTGAGAAGACTTTG TGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGCAAC3GGCGACGGTGGGAGACCACC?GGGGCTCGGAAAACACCGGGACA CAC’rCTTCTGAAACACACTCACACGACCCCCCGACCTCACGCGGACGGGACGCCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAG GGAATGGTGCTGTACGGCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAGGGAGGACCTCATGCGGGCCT GGACACGGGTCCTCCCTTACCACGACATGCCGACCTGGCTGGTGTCGCGCACGTCGGGTCACACGGGACGACCATACCTCTATAGG CAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACATCAATGAAATGTGTCAGGAGCGAiGCGTGGATGGCTGCAGCTG CCCTGAGGATATCCGTCACACACAGGGGAACGCGGTCCTGGACGGTCTCGGACGTGTAGTTACTTTACACAGTCCTCGCTACGCAC CTACCGACGTCGACGGGACTCCGACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGCGTGCATTCCGGAAA GCGGTÁCCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTGCTGTCGAGGACCTACTTCCGGAGACGCACCTCTCGTGGCTCACAGGGACG CACGTñAGGCCTTTCGCGATGGGAGGGCCGTGGAGGGAGAGAGCTCTGACCAACACCTGCMTTGCCGAAACAGCCAGTGGATCTG CAGCAATGAAGAATGTCCAGGGGAGTGCCTTGTCÁCTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGACGTTGTGGACGTAAACGGCTTTG TCGGTCACCTAGACGTCGTTACTTCTTACAGGTCCCCTCACGGAACAGTGACCAGTTAGGGTGAAGTTCTCGAAACTGAACAGATA CTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGATTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGT GTGCTGTTGTCTÁTGAAG^GGAAGTCñCCCTAGACGGTCATGGACGACCGGGCCCTAACGGTCCTGGTGAGGAAGAGGTAACAGTA ACTCTGACAGGTCACACGACATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGCCTGCACAACAGCCTTG

tgaaactgaagcatggggcaggagttgccatggatactggcgctgcgacacacgtgggcgaggcagtggcaggccgacggaccgga CGTGTTGTCGGAACACTTTGACTTCGTACCCCGTCCTCAACGGTACCTTGGCCAGGñCATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACC TCCGCATCCAGCATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATGACCGGTCCTGTAGGTCGAGGGGGA GGACTTTCCACTGGAGGCGTAGGTCGTATGTCACTGCCGGAGGCACGCGGAGTCGATGCCCCTCCTGGACGTCTACGACTGGGATG GCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAñGCTGTCCCCCGTCTATGCCGGGAAGAGCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGC GACGCTGACCCTACCGGCGCCCTCCGACGACCACTTCGACAGGGGGCAGATñCGGCCCTTCTGGACGCCGGñCACACCCTTAATGT TACCGTTGGTCCCGCTGCACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCRGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGGAACGCCTGGAAGCTGCAC GGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAGTGAAGGAATGGGGGAGACCCGACCGYCTCGGGGCCCACCTCCTGAAGCCCTTGC GGACCTTCGACGTGCCCCTGACGGTCCTGGACGTCTTCGTCGTGTCCGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCC GAGGAGGCGTGCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGCGCTAGGGACGCGGGAGTTGGGCGCGT ACTGGTCCAAGAGGCTCCTCCGCACGCGCCAGGACTGCAGGGGGTGTAAGCTCCGGACGGTAGCACGGCAGTCGCCGCTGCCCTAC CTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGACGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTG CGGGCGACGGGATGGACGCCTTGACGGCGATGCTGCACACGAGGACGAGCCTGCCGGCGCTCACGGACACGCCGCGGGACCGGTCG ATACGGCGCCGGACGCCGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTGAACTGCCCGAAAGGCCAGGT GTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCTGCCCCTCTCCGCACGCGCAGCGCACCGCGCTCGGTCCGGCGACACTCGACTTGACG GGCTTTCCGGTCCACATGGACGTCACGCCCTGGGGGACGTTGGAGACCTGCCGCTCTCTCTCTTfiCCCGGATGAGGAATGCñATGA GGCCTGCCTGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGñTGAGAGGGGGGACCTGGACGGCGAGAGAGAGAATGGGCCTA CTCCTTACGTTACTCCGGACGGACCTCCCGACGAAGACGGGGGGTCCCGAGATGTACCTACTCTCCCCCCTGTGCGTGCCCAAGGC CCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCAGCCAGAAGACATCTTCTCAGACCATCACACCATGTGCTACTGTGAGGATG ACGCACGGGTTCCGGGTCACGGGGACAATGATACTGCCACTCTAGAAGGTCGGTCTTCTGTAGAAGAGTCTGGTAGTGTGGTACAC GATGACACTCCTACGCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGACGCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGT CTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTGCGAAGTACGTGACATGGTACTCACCTCAGGGGCCTTCGAACGACGGACTGCGACAGGA GTCGTCAGGGGACAGAGTAGCGTCGTTTTCCTCGGATAGGACTCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGC GGGCTGAAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATGAGCCGGGGGGTACCAGTTCGACCACACAGG GCGACTGTTGGACGCCCGACTTCCCGAGCTCACATGGTTTTGCACGGTCTTGATACTGGACCTCACGTACAGCATGGGCTGTGTCT CTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCATC GTACCCGACACAGAGACCGACGGAGACGGGGGGCCCGTACCAGGCCGTACTCTTGTCTACACACCGGGACCTTTCCACAGGGACGA AGGTAGTCCCGTAGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACñCTTGTGTCTGTCGGGACCGGAAGTGGAñCTGC ACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTGTCCTCATACGGGGACCTCTTTGTCACTTCTAACCGACGTTGTGAACACAGACAGCCCTGG CCTTCACCTTGAGGTGTCTGGTACACACACTACGGTGCACCTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAA TACCTGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGTGÁGGTGCTAGGCGTACCGGGTGATGGAGTGGA ñGCTGCCCGAGTTTATGGACAAGGGGCCCCTCACGGTCATGCAAGACCACGTCCTAATGACGCCGTCAAACCCTGGGACCTTTCGG ATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAAACGGGTCACCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGATTGG GACCCTGGAAAGCCTAGGATCACCCCTTATTCCCTACGTCGGTGGGGAGTCACTTTACGTTCTTTGCCCAGTGGTAGGACCACCTC CCTCCTCTCTTTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAGACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGG CCGGTACATCATTCTGCTGCTGGGAACTCGACAAACTGCCCCTCCÁCTTACACTTCTCCGGGTACTTCCTACTCTGAGTGAAACTC CACCACCTCAGACCGGCCATGTAGTAAGACGACGACCCCAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGT CCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGATGTTTCGGGAGAGGCACCAGACCCTGGCGGTGGAC TCGTAGAGGCACCAGGACTTCGTCTGTATGGTCCTCTTTCACACACCGGACACACCCTTAAAACTAGGCATCCAGAACAATGACCT CACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCGTAG GTCTTGTTACTGGAGTGGTCGTCGTTGGAGGTTCACCTCCTTCTGGGACACCTGAAACCCTTGAGGACCTTTCACTCGAGCGTCAC ACGACTGTCCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCT GTAGAATCCTTACCAGTGACGTGGTCTTTTCACGGAGACCTGAGTAGGGGACGGIGGACGGTATTGTTGTAGSACTTCGTCTGCTA CCACCTAAGGAGGACATCTTAGGAATGGTCACTGCACTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCT GCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCTGCTTCGAAGGTCCTGACGTTGTTCGAGCACCTGGGGCTCGG TATAGACCTACAGACGTAAATGCTGÍGGACGAGGACACTCAGGTAACCCCTGACGCGGACGAAGTGCGACACCATTGCTGCCTATG CCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAACGCTGTG GTAACGACGGATACGGGTGCACACACGGGTCGTACCGTTCCACCACTGGACCTCCTGCCGGTGTAACACGGGGGTCTCGACGCTCC TCTCCTATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCT GAGCCACTGGCCTGCCCTGTTAGAGGCCCTCTTGCCCATACTCACACTCACCGCGATATTGTCGACACGTGGACGGACAGTTCAGT GCACAGTCGTGGGACTCGGTGACCGGACGGGACAGCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGAT GAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGCGTCACACACCTCCCGACGGTACGGGTGACGGGAGGTC CCTTTTAGGACCTACTCGAAAACGTCTGGACGCAACTGGGACTTCTGACAGGTCACACACTCGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCA GGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGÁTGTTGTCAACCTCACCTCACCGACCGG CCGCAAAACGGAGTCCTTTCTTTCAGTGGAACTTAGGGTCACTGGGACTCGTGACGGTCTAAACGGTGACACTACAACAGTTGGAG TGGAGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGÁGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGAGGA CATCTCGGAACCGCCGTTCACTTCGGACGGTCCTCGGCCCTCCGGACCACCACGGAGGGTGTCTACGGGGCCACTCGGGGTGGTGA GACATACACCTCCTGTAGAGCCTTGGCGGCAAGCACGATTTCTACTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTCTTCCTGCTGGATGGCTC CTCCAGGCTGTCCGAGGCTGAGTTTGAAGTGCTGAAGGCCTTTGTGCGTGCTAAAGATGACGTCGTCCGATGACCTGGACCAGAAG GACGACCTACCGAGGAGGTCCGACAGGCTCCGACTCAAACTTCACGACTTCCGGAAACACGTGGACATGATGGAGCGGCTGCGCAT CTCCCAGAAGTGGGTCCGCGTGGCCGTGGTGGAGTACCACGAGGGCTCCGACGCCTACATCGGGCTCAAGGACCCACCTGTACTAC CTCGCCGACGCGTAGAGGGTCTTCACCCAGGCGCACCGGCACCACCTCATGGTGCTGCCGAGGGTGCGGATGTAGCCCGAGTTCCT GGGGAAGCGACCGTCAGAGCTGCGGCGCATTGCCAGCCAGGTGAAGTATGCGGGCAGCCAGGTGGCCTCCACCAGCGAGGTCTTGA AATACACACTGTTCCACCTTCGCTGGCAGTCTCGACGCCGCGTAACGGTCGGTCCACTTCATACGCCCGTCGGTCCACCGGAGGTG GTCGCTCCAGAACTTTATGTGTGACAAGGTAATCTTCAGCAAGATCGACCGCCCTGÁAGCCTCCCGCATCGCCCTGCTCCTGATGG CCAGCCAGGAGCCCCAACGGATGTCCCGGAACTTTGTCCGCTACTTAGÁAGTCGTTCTAGCTGGCGGGACTTCGGAGGGCGTAGCG GGACGAGGACTACCGGTCGGTCCTCGGGGTTGCCTACAGGGCCTTGAAACAGGCGATGGTCCAGGGCCTGAAGAAGAAGAAGGTCA TTGTGATCCCGGTGGGCATTGGGCCCCATGCCAACCTCAAGCAGATCCGCCTCfiTCGAGAAGCAGGCCCCTGCAGGTCCCGGACTT CTTCTTCTTCCAGTAACACrAGGGCCACCCGTAACCCGGGGTACGGTTGGAGTTCGTCTAGGCGGAGTAGCTCTTCGTCCGGGGAC AGAACAAGGCCTTGGTGCTGAGCAGTGTGGATGAGCTGGAGCAGCAAAGGGACGAGATCGTTAGCTACCTCTGTGACCTTGCCCCT GAAGCCCCTCCTCCTCTTGTTCCGGAAGCACGACTCGTCACACCTACTCGACCTCGTCGTTTCCCTGCTCTAGCAATCGATGGAGA CACTGGAACGGGGACTTCGGGGAGGAGGTACTCTGCCCCCCGACATGGCACAAGTCACTGTGGGCCCGGGGCTCTTGGGGGTTí'CG ACCCTGGGGCCCAAGAGGAACTCCATGGTTCTGGATGTGGCGATGAGAGGGGGGGCTGTACCGTGTTCAGTGACACCCGGGCCCCG AGAACCCCeAAAGCTGGGACCCCGGGTTCTCCTTGAGGTACCAAGAGCTAGACCGCTTCGTCCTGGAAGGATCGGACAAAATTGGT GAAGCCGACTTCAACAGGAGCAAGGAGTTCATGGAGGAGGTGATTCAGCGGATGGATGTGGGCCAGGACAAAGCAGGACCTTCCTA GCCTGTTTTAACCACTTCGGCTGAAGTTGTCCTCGTTCCTCAAGTACCTCCTCCACTAAGTCGCCTACCTACACCCGGTCCTGTGC ATCCACGTCACGGTGCTGCAGTACTCCTACATGGTGACCGTGGAGTACCCCTTCAGCGAGGCACAGTCCAAAGGGGACATCCTGCA GCGGGTGCGAGACGTAGGTGCAGTGCCACGACGTCATGAGGATGTACCACTGGCACCTCATGGGGAAGTCGCTCCGTGTCAGGTTT CCCCTGTAGGACGTCGCCCACGCTCTGATCCGCTACCAGGGCGGCAACAGGACCAACACTGGGCTGGCCCTGCGGTACCTCTCTGA CCACAGCTTCTTGGTCAGCCAGGGTGACCGGGAGCAGGCGCTAGGCGATGGTCCCGCCGTTGTCCTGGTTGTGACCCGACCGGGAC GCCÁTGGAGAGACTGGTGTCGAAGAACCAGTCGGTCCCACTGGCCCTCGTCCGCCCCAACCTGGTCTACATGGTCACCGGAAATCC TGCCTCTGATGAGATCAAGAGGCTGCCfGGAGACATCCAGGTGGTGCCCATTGGAGTGGGCCCTAATGGGGTTGGACCAGATGTAC CAGTGGCCTTTAGGACGGAGACTACTCTAGTTCTCCGACGGACCTCTGTAGGTCCACCACGGGTAACCTCACCCGGGATTACCCAA CGTGCAGGAGCTGGAGAGGATTGGCTGGCCCAATGCCCCTATCCTCATCCAGGACTTTGAGACGCTCCCCCGAGAGGCTCCTGACC TGGTGCTGCAGGTTGCACGTCCTCGACCTCTCCTAACCGACCGGGTTACGGGGATAGGAGTAGGTCCTGAAACTCTGCGAGGGGGC TCTCCGAGGACTGGACCACGACGTGAGGTGCTGCTCCGGAGAGGGGCTGCAGATCCCCACCCTCTCCCCTGCACCTGACTGCAGCC AGCCCCTGGACGTGATCCTTCTCCTGGATGGCTCCTCCCTCCACGACGAGGCCTCTCCCCGACGTCTAGGGGTGGGAGAGGGGACG TGGACTGACGTCGGTCGGGGACCTGCACTAGGAAGAGGACCTACCGAGGAGGAGTTTCCCAGCTTCTTATTTTGATGAAATGAAGA GTTTCGCCAAGGCTT'iCATTTCAAAAGCCAATATAGGGCCTCGTCTCACTCAGGTGTCAGTGCTGCTCAAAGGGTCGAAGAATAAA ACTACTTTACTTCTCAAAGCGGTTCCGAAAGTAAAGTTTTCGGTTATATCCCGGAGCAGAGTGAGTCCACAGTCACGACGAGTATG GAAGCATCACCACCATTGACGTGCCATGGAACGTGGTCCCGGAGAAAGCCCATTTGCTGAGCCTTGTGGACGTCATGCAGCGGGAG GGAGGCCCTCATACCTTCGTAGTGGTGGTAACTGCACGGTACCTTGCACCAGGGCCTCTTTCGGGTAAACGACTCGGAACACCTGC AGTACGTCGCCCTCCCTCCGGGCAGCCAAATCGGGGATGCCTTGGGCTTTGCTGTGCGATACTTGACTTCAGAAATGCATGGTGCC AGGCCGGGAGCCTCAAÁGGCGGTGGTCATCCTGGTCGTCGGTTTAGCCCCTACGGAACCCGSAACGACACGCTATGAACTGAAGTC TTTACGTACCACGGTCCGGCCCTCGGAGTTTCCGCCACCAGTAGGACCAGACGGACGTCTCTGTGGATTCAGTGGATGCAGCAGCT GATGCCGCCAGGTCCAACAGAGTGACAGTGTTGCCTATTGGAATTGGAGATCGCTACGATGCAGTGCCTGCAGAGACACCTAAGTC ACCTACGTCGTCGACTACGGCGGTCCAGGTTGTCTCACTGTCACAAGGGATAACCTTAACCTCTAGCGATGCTACGTCCCCAGCTA CGGATCTTGGCAGGCCCAGCAGGCGACTCCAACGTGGTGAfiGCTCCAGCGAATCGAAGACCTCCCTACCATGGTCACCTTGGGCAA TTCCTTGGGTCGATGCCTAGAACCGTCCGGGTCGTCCGCTGAGGTTGCACCACTTCGAGGTCGCTTAGCTTCTGGAGGGATGGTAC CAGTGGAACCCGTTAAGGAACCTCCACAAACTGTGCTCTGGATTTGTTAGGATTTGCATGGATGAGGATGGGAATGAGAAGAGGCC CGGGGACGTCTGGACCTTGCCAGACCAGTGCCACGGAGGTGTTTGACACGAGACCTAAACAATCCTAAACGTACCTACTCCTACCC TTACTCTTCTCCGGGCCCCTGCAGACCTGGAACGGTCTGGTCACGGTGACCGTGACTTGCCAGCCAGATGGCCAGACCTTGGTGAA GAGTCATCGGGTCAACTGTGACCGGGGGCTGAGGCCTTCGTGCCCTAACAGCCAGTCCCCTGTGGCACTGAACGGTCGGTCTACCG GTCTGGAACGACSTCTCAGTAGCCCAGTTGACACTGGCCCCCGACTCCGGAAGCACGGGATTGTCGGTCAGGGGACTTAAAGTGGA AGAGACCTGTGGCTGCCGCTGGACCTGCCCCTGYGTGTGCACAGGCAGCTCCACTCGGCACATCGTGACCTTTGATGGGCAGAATT TCfiAAATTTCACCTTCTCTGGACACCGACGGCGACCTGGACGGGGACRCACACGTGTCCGTCGAGGTGAGCCGTGTAGCACTGGAA ACTACCCGTCTTAAAGTTGCTGACTGGCAGCTGTTCTTATGTCCTATTTCAAAACAAGGAGCAGGACCTGGAGGTGATTCTCCATA ATGGTGCCTGCAGCCCTGGAGCAAGGCAGGGCCGACTGACCGTCGACAAGAATACAGGATAAAGTTTTGTTCCTCGTCCTGGACCT CCACTAAGAGGTATTACCACGGACGTCGGGACCTCGTTCCGTCCCGTGCATGAAATCCATCGAGGTGAAGCACAGTGCCCTCTCCG TCGAGSTGCACAGTGACATGGAGGTGACGGTGAATGGGAGACTGGTCTCTGTTCCTTACGACGTACTTTAGGTAGCTCCACTTCGT GTCACGGGAGAGGCAGCTCSACGTGTCACTGTACCTCCACTGCCACTTACCCTCTGACCAGAGACAAGGAATGCTGGGTGGGAACA TGGAAGTCAACGTTTATGGTGCCATCATGCATGAGGTCAGATTCAATCACCTTGGTCACATCTTCACATTCACTCCACAAAACAAT GAACCCACCCTTGTACCTTCAGTTGCAAATACCACGGTAGTACGTACTCCAGTCTAAGTTAGTGGAACCAGTGTAGAAGTGTAAGT GAGGTGTTTTGTTACTGTTCCAACTGCAGCTCAGCCCCAAGACTTTTGCTTCAAAGACGTATGGTCTGTGTGGGATCTGTGATGAG AACGGAGCCAATGACTTCATGCTGAGGGATCAAGGTTGACGTCGAGTCGGGGTTCTGAAAACGAAGTTTCTGCATACCAGACACAC CCTAGÁCACTACTCTTGCCTCGGTTACTGAAGTACGACTCCCTAGGCACAGTCACCACAGACTGGAAAACACTTGTTCAGGAATGG ACTGTGCAGCGGCCAGGGCAGACGTGCCAGCCCATCCTGGAGGAGCAGTGTCTTGTCCCCGTGTCAGTGGTGTCTGACCTTTTGTG AACAAGTCCTTACCTGACACGTCGCCGGTCCCGTCTGCACGGTCGGGTAGGACCTCCTCGTCACAGAACAGGCCGACAGCTCCCAC TGCCAGGTCCTCCTCTTACCACTGTTTGCTGAATGCCACAAGGTCCTGGCTCCAGCCACATTCTATGCCATCTGCCAGCAGGACAG

GGCTGTCGAGGGTGACGGTCCAGGAGGAGAATGGTGACAAACGACTTACGGTGTTCCAGGACCGAGGTCGGTGTAAGATACGGTAG

ACGGTCGTCCTGTCTTGCCACCAGGAGCAAGTGTGTGAGGTGATCGCCTCTTATGCCCACCTCTGTCGGACCAACGGGGTCTGCGT

TGACTGGAGGACACCTGATTTCTGTGCTAACGGTGGTCCTCGTTCACACACT'CCACTAGCGGAGAATACGGGTGGAGACAGCCTGG'

TTGCCCCAGACGCAACTGACCTCCTGTGGACTAAAGACACGAATGTCATGCCCACCATCTCTGGTCTACAACCACTGTGAGCATGG

CTGTCCCCGGCACTGTGATGGCAACGTGAGCTCCTGTGGGGACCATCCCTCCGAAGTACAGTACGGGTGGTAGñGACCAGATGTTG

GTGACACTCGTACCGACAGGGGCCGTGACACTACCGTTGCACTCGAGGACACCCCTGGTAGGGAGGCTTCGCTGTTTCTGCCCTCC

AGATAAAGTCATGTTGGAAGGCAGCTGTGTCCCTGAAGAGGCCTGCACTCAGTGCATTGGTGAGGATGGAGTCGAGCACCAGTTCG

ACAAAGACGGGAGGTCTATTTCAGTACAACCTTCCGTCGACACAGGGACTTCTCCGGACGTGAGTCACGTAACCACTCCTACCTCA

GGTCGTGGTCAACCTGGAAGCCTGGGTCCCGGACCACCAGCCCTGTCAGATCTGCACATGCCTCAGCGGGCGGAAGGTCAACTGCA

CAACGCAGCCCTGCCCCACGGCCAAAGGACCTTCGGACCCAGGGCCTGGTGGTCGGGACAGTCTAGACGTGTACGGAGTCGCCCGC

CTTCCAGTTGACGTGTTGCGTCGGGACGGGGTGCCGGTTTGCTCCCACGTGTGGCCTGTGTGAAGTAGCCCGCCTCCGCCAGAATG

CAGACCAGTGCTGCCCCGAGTATGAGTGTGTGTGTGACCCAGTGAGCTGTGACCCGAGGGTGCACACCGGACACACTTCATCGGGC

GGAGGCGGTCTTACGTCTGGTCACGACGGGGCTCATACTCACACACACACTGGGTCACTCGACACTGGTGCCCCCAGTGCCTCACT

GTGAACGTGGCCTCCAGCCCACACTGACCAACCCTGGCGAGTGCAGACCCAACTTCACCTGCGCCTGCAGGAAGGAGGAGTGACGG

GGGTCACGGAGTGACACTTGCACCGGAGGTCGGGTGTGACTGGTTGGGACCGCTCACGTCTGGGTTGAAGTGGACGCGGACGTCCr TCCTCCTCACCAAAAGAGTGTCCCCACCCTCCTGCCCCCCGCACCGTTTGCCCACCCTTCGGAAGACCCAGTGCTGTGfiTGAGTAT

GAGTGTGCCTGCAACTGTGTCAACGTTTTCTCACAGGGGTGGGAGGACGGGGGGCGTGGCAAACGGGTGGGAAGCCTTCTGGGTCA

CGACACTACTCATACTCACACGGACGTTGACACAGTTGTCCACAGTGAGCTGTCCCCTTGGGTACTTGGCCTCAACCGCCACCAAT

GACTGTGGCTGTACCACAACCACCTGCCTTCCCGACAAGGTGTGTGTCCACCAGGTGTCACTCGACAGGGGAACCCATGAACCGGA

GTTGGCGGTGGTTACTGACACCGACATGGTGTTGGTGGACGGAAGGGCTGTTCCACACACAGGTGGGAAGCACCATCTACCCTGTG

GGCCAGTTCTGGGAGGAGGGCTGCGATGTGTGCACCTGCACCGACATGGAGGfiTGCCGTGATGGGCCTCCGCGTGGCCCACTTCGT

GGTAGATGGGAGACCCGGTCAAGACCCTCCTCCCGACGCTACACACGTGGACGTGGCTGTACCTCCTACGGCACTACCCGGAGGCG

CACCGGGTGTGCTCCCAGAAGCCCTGTGAGGACAGCTGTCGGTCGGGCTTCACTTACGTTCTGCATGAAGGCGAGTGCTGTGGAAG

GTGCCTGCCATCTGCCTGTGAGCACGAGGGTCTTCGGGACACTCCTGTCGACAGCCAGCCCGAAGTGAATGCAAGACGTACTTCCG

CTCACGACACCTTCCACGGACGGTAGACGGACACTCGTGGTGACTGGCTCACCGCGGGGGGACTCCCAGTCTTCCTGGAAGAGTGT

CGGCTCCCAGTGGGCCTCCCCGGAGAACCCCTGCCTCATCAATGAGTGTGCACCACTGACCGAGTGGCGCCCCCCTGAGGGTCAGA

AGGACCTTCTCACAGCCGAGGGTCACCCGGAGGGGCCTCTTGGGGACGGAGTAGTTACTCACACTCCGAGTGAAGGAGGAGGTCTT

TATACAACAAAGGAACGTCTCCTGCCCCCAGCTGGAGGTCCCTGTCTGCCCCTCGGGCTTTCAGCTGAGCTGTAAGACAGGCTCAC

TTCCTCCTCCAGAAATATGTTGTTTCCTTGCAGAGGACGGGGGTCGACCTCCAGGGACAGACGGGGAGCCCGAAAGTCGACTCGAC

ATTCTGCTCAGCGTGCTGCCCAAGCTGTCGCTGTGAGCGCATGGAGGCCTGCATGCTCAATGGCACTGTCATTGGGCCCGGGAAGA

CTGTGATGATCGATGTGTGCGAGTCGCACGACGGGTTCGACAGCGACACTCGCGTACCTCCGGACGTACGAGTTACCGTGACAGTA

ACCCGGGCCCTTCTGACACTACTAGCTACACACGACGACCTGCCGCTGCATGGTGCAGGTGGGGGTCATCTCTGGATTCAAGCTGG

AGTGCAGGAAGACCACCTGCAACCCCTGCCCCCTGGGTTACAAGGAAGTGCTGGACGGCGACGTACCACGTCCACCCCCAGTAGAG

ACCTAAGTTCGACCTCACGTCCTTCTGGTGGACGTTGGGGACGGGGGACCCAATGTTCCTTCAAAATAACACAGGTGAATGTTGTG

GGAGATGTTTGCCTACGGCTTGCACCATTCAGCTAAGAGGAGGACAGATCATGACACTGAAGCGTGATGAGACGCTTTTTATTGTG

TCCACTTACAACACCC_1-CTACAAACGGATGCCGAACGTGGTAAGTCGÁTTCTCCTCCTGTCTAGTACTGTGACTTCGCACTACTCT

GCGACCAGGATGGCTG'rGATACTCACTTCTGCAAGGTCAATGAGAGAGGAGAGTACTTCTGGGAGAAGAGGGTCACAGGCTGCCCA

CCCTTTGATGAACACAAGGGTCCTACCGACACTATGAGTGAAGACGTTCCAGTTACTCTCTCCTCTCATGAAGACCCTCTTCTCCC

AGTGTCCGACGGGTGGGAAACTACTTGTGTTCTGTCTTGCTGAGGGAGGTAAAATTATGAAAATTCCAGGCACCTGCTGTGACACA

TGi'GAGGAGCCTGAGTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATGACAGAACGACTCCCTCCATTTTAATACTTTTAAGGTCCGT

GGACGACACTGTGTACACTCCTCGGACTCACGTTGCTGTAGTGACGGTCCGACGTCATACTCAAGGTGGGAAGCTGTAAGTCTGAA

GTAGAGGTGGATATCCACTACTGCCAGGGCAAATGTGCCAGCAAAGCCATGTACTCeATTGACATCAACGATGTAGTTCCACCCTT

CGACATTCAGACTTCATCTCCACCTATAGGTGATGACGGTCCCGTTTACACGGTCGTTTCGGTACATGAGGTAACTGTAGTTGCTA

CAGCAGGACCAGTGCTCCTGCTGCTCTCCGACACGGACGGAGCCCATGCAGGTGGCCCTGCACTGCACCAATGGCTCTGTTGTGTA

CCATGAGGTTCTC/tóTCGTCCTGGTCACGAGGACGACGAGAGGCTGTGCCTGCCTCGGGTACGTCCACCGGGACGTGACGTGGTTA CCGAGACAACACATGGTACTCCA&GAGTTAGCCATGGAGTGCAA&TGCTCCCCCAGGAAGTGCAGCAAGTGA

SEQ ID NO: 28 - Longitud completa de la secuencia de péptidos del factor de von Willebrand (X es cualquier aminoácido natural)

MIPARFAGVLLALALILPGT LCAEGTRGRSSTARCSLFGS DFVNTFDGSMYSFAGYCSYL LAGGCQKRS FS11GDFQNGK RVSLSVYLGE FFD1HLFVNG TVTQGDQRVSMPYASKGLYL ETEAGYYKLSGEAYGFVARI DGSGNFQVLLSDRYFNKTCG LCGNFNIFAEDDFMTQEGTL TSD PYDFAN 3WALSSGEQWC ERASPPSSSCNISSGEMQKG LWEQCQLLKST SVFARCHPL VDPEPFVALCEKTLCECAGG LEC ACPALLEY ARTCAQEGM VLYGWIDH SAOS PVCPAGME YRQCVSPCARTCQSLHINEM CQERCVDGCSCPEGQLLDEG LCVE STECPCVHS GKRYPPG TSLSRDCMTCIC RNSQWIC S NESCPGECLVTGQSHFKSFD NRYFT FSGICQYLLARDCQD HSFSIVIETVQCADDRDAVC TRSVTVRLPGLHNSLVKLKH GAGVAMDGQDIQLPLLKGDL RIQH TVTASV RLSYGEDLQM DWDGRGRLLVKLS PVYAGKT CGLCGNYNGNQGDDFLTPSG LAEPRVEDFGNAWKLHGDCQ DLQKQH SDPCALN PRMTRF S ESACAVLTS P!FEACHRAVS PLPYLRNCRYDVCSCSDGRE CLCGALASYAAACAGRGVRV AWRE PGRCELMCPKGQVYLQ CGTPCNLTCRSLSYPDEECN SACLEGC FCPPGLYMDERGD CVPKAQC PCYYDGEIFQ PED IFSDHHTMCYCEDGFMHCTM SGVPGSLLPDAVLSSPLSHR SKRSLSCRP PMVKLVCPADN LRAEGLECTKTCQNYDLECM 8MGCVS GCLCP PGMVRHEM R CVALERCPCFHQGKEYAPGE TVKIGCNTCVCRDRKWNCT D HVCDATOSTIGMAHYLT FDG LKYLFPGECQYVI,VQDYCGS NPGT FRILVGMKGC SHPSVK CKKRVTILVEGGEIELFDGE VNVKR PMKDEIIIFEW E SGR YIILLLGKALSVVWDRHLSI SVVLKQTYQEKVCGLCGNFD GIQNNDLTSSNLQVEEDPVD FGNSWKVSS QCADTRKVPLD SSPATCHNNIMKQTMVDS SC RILTS DVFQDCNKLVDPEPY LDVCIY DTCS CESIGDCAC F COTIAAYAHVCAQHGKWT W RTATLCPQSCEERNLRENGY ECEWRYN SCAPACQVT CQHP EPLACPVQCVEGCHAHC P PG KILDELLQTCVDPEDCPVCE VAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDWKLTCEACQEP GGLVVPPTDAPVS PTTLYVS DISEPPLHDFYCSRLLDLVF LLDGS SRLSEAE FEVLKAFV VDMME RLRISQKW VRVA W E YHDGSHAYIGLKDRKRPSEL RRIASQVKYAGSQVASTSEV LKYTLFQIFSKIDRPEASRI ALLLMASQEPQRMSRNFVRY VQGLKKKKVIVIPVGIGPHA NLKQIRLIEKQAPENKAFVL SSVDELEQQRDSIVS YLC DL APEAPPPTLPP DMAQVTVGP GLLGVSTLGPKRNSMVLDVA FVLEGSDKIGEADFNRSKEF MEEVIQRMDVGQDS1HVTVL QY3YMVTVEY PFSEAQSKGD ILQRVREIRYQGGN RTNTGL ALRYL SDHSFLVSQGDREQA pnlvy mVtgkpas deikrlp GDIQVVPIGVGPNANVQELE RIGWPNAPILIQDFETLPRE APDLVLQRCCS GE GLQIPTL

SPAPDCSQPLDVILLLDGSS SFPASYFDEMKSFAKAFISK ANIGPRLTQVSVLQYGSITT

IDVPWNWPEKAHLLSLVDV MQREGGPSQIGDALGFAVRY LTSEMHGARPGASKAVVILV

TDVS'VDSVDAAADAARSNRV TVFPIGIGDRYDAAQLRILA GPAGDSNWKLQRISDLPTM

VTLGNSFLHKLC3GFVRICM DEDGNEKRPGDVWTLPDQCH TVTCQPDGQTLLKSHRVNCD

RGLRPSCPMSQSPVKVEETC GCRWTCPCVCTGSSTRHIVT FDGQNFKLTGSCSYVLFQNK

EQDI:EVI.LHNGACS PGARQG CMKSIEVKH.3ALSVEXHSDM EVTYNGRLVSVPYVGGNMEV

NVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKT FASKTYGLCGIC.DENGANDF

MLRDGTVTTDWKTLVQEWTV QRPGQTCQPILEEQCLVPDS SHCQVLLLPLFAECHKVLAP

ATFYAICQQDSCHQEQVCEV IASYAHLCRTNGVCVDWRTP DFCAMSCPPSLVYNHCEHGC

PRHCDGNVSSGGDHPSEGCF CPPDKVMLEGSCVPEEACTQ CIGEDGVQHQFLEAWVPDHQ

PCQICTCLSGRKVNCTTQPC PTAKAPTCGLCEVARLRQNA DQCCPEYECVCDPVSCDLPP

VPHCERGLQPTLTNPGECR? NFTCACRKEECKRVSPPSCP PHRLPTLRKTQCCDEYECAC

NCVNSTVSCPLGYLASTATN DCGCTTTTCLPDKVCVHRST IYFVGQFWEEGCDVCTCTDM

EDAVMGLRVAQCSQKPCEDS CRSGFTYVLHEGECCGRCLP SACEVVTGSPRGDSQ3S WKS

YGSQWASPENPCLINECVRV KEEVFIQQRNVSCPQLEVPV CPSGFQLSCKTSACCPSCRC

ERMEACMLNGTVIGPGKTVM IDVCTTCRCMVQVGVISGFK LECRKTTCNPCPLGYKEENN

TGECCGRCLPTACTIQLRGG QIMTLKRDETLQDGCDTHFC KVNERGEYFWEKRVTGCPPF

DEHKCLAEGGKIMKIPGTCC DTCEEPECNDITARLQYVKV GSCKSEVEVDIKYCQGKCAS

KAMYSIDIMDVQDQC3CCSP TRTEPMQVALHCTNGSVVYH EVLKAMECKC3PRKC3K

SEQ ID NO: 29 - Aminoácidos 233-236 de IgG1 humana

ELLG SEQ ID NO: 30 - XTEN AE42-4, secuencia de proteínas GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASS SEQ ID NO: 31 - XTEN AE42-4, secuencia de ADN

GGCGCGCCAGGTTCTCCTGCTGGCTCCCCCACCTCAACAGAAGAGGGGACAAGCGAAAGC.

GCTACGCCTGAGAGTGGCCCTGGCTCTGAGCCAGCCACGTCCGGCTCTGAAACCCCTGCC

TCGAGC SEQ ID NO: 32 - XTEN AE144-2A, secuencia de proteínas

TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGÍSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG

TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG

TSESATPESGPGTSESAT PESGPG SEQ ID NO: 33 - XTEN AE144-2A, secuencia de ADN

GGCGCGGCAACCAGTACGGAGCCGTCCGAGGGGAGCGCACCAGGAAGCCCGGCTGGGAGC

CCGACTTCTACCGAAGAGGGTACATCTACCGAACCAAGTGAAGGTTCAGCACCAGGCACC

TCAACAGAACCCTCTGAGGGCTCGGCGCCTGGTACAAGTGAGTCCGCGACCCCAGAATCC

GGGCCTGGGACAAGCACAGAACCTTCGGAAGGGAGTGCCCCTGGAACATCCGAATCGGCA

ACCCCAGAATCAGGGCCAGGATCTGAGCCCGCGACTTCGGGCTCCGAGACGCCTGGGACA

TCCACCGAGCCCTCCGAAGGATCAGCCCCAGGCACCAGCACGGAGCCCTCTGAGGGAAGC

GCACCTGGTACCAGCGAAAGCGCAACTCCCGAATCAGGTCCCGGTACGAGCGAGTCGGCG

ACCCCGGAGAGCGGGCCAGGTGCCTCGAGC SEQ ID NO: 34 - XTEN AE144-3B, secuencia de proteínas

SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG

TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG

SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG

SEQ ID NO: 35 - XTEN AE144-3B, secuencia de ADN

GGCGCGCCAAGTCCCGCTGGAAGCCCAACTAGCACCGAAGAGGGGACCTCAGAGTCCGCC

ACCCCCGAGTCCGGCCCTGGCTCTGAGCCTGCCACTAGCGGCTCCGAGACTCCTGGCAGA

TCCGAAAGCGCTACACCCGAGAGTGGACCCGGCACCTCTACCGAGeCCAGTGAGGGCTCC

GCCCCTGGAACAAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGGCCCAGGGACCTCCACAGAGCCC

AGTGAAGGCAGTGCTCCTGGGACCAGCACCGAACCAAGCGAGGGCTCTGCACCCGGGACC

TCCACCGAGCCAAGCGAAGGCTCTGCCCCTGGCACTTCCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGC

GCCCCTGGGAGCCCCGCTGGCTCTCCCACCAGCACTGAGGAGGGCACATCTACCGAACCA

AGTGAAGGCTCTGCACCAGGTGCCTCGAGC

SEQ ID NO: 36 - XTEN AE144-4A, secuencia de proteínas

TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG

TSTE PSEGSAPG^TSESAT PESGPGS PAGS PTS^TEEG SPAGS P^TS?EEGS PAGS PTSTEEG

TSESATPESGPGTS TE PSEGSAPG

SEQ ID NO: 37 - XTEN AE144-4A, secuencia de ADN

GGCGCGCCAACGTCCGAAAGTGCTACCCCTGAGTCAGGCCCTGGTAGTGAGCCTGCCACA

AGCGGAAGCGAAACTCCGGGGACCTCAGAGTCTGCCACTCCCGAATCGGGGCCAGGCTCT

GAACCGGCCACTTCAGGGAGCGAAACACCAGGAACATCGGAGAGCGCTACCCCGGAGAGC

GGGCCAGGAACTAGTACTGAGCCTAGCGAGGGAAGTGCACCTGGTACAAGCGAGTCCGCC

ACACCCGAGTCTGGCCCTGGCTCTCCAGCGGGCTCACCCACGAGCACTGAAGAGGGCTCT

CCCGCTGGCAGCCCAACGTCGACAGAAGAAGGATCACCAGCAGGCTCCCCCACATCAACA

GAGGAGGGTACATCAGAATCTGCTACTCCGGAGAGTGGACCCGGTACCTCCACTGAGCCC

AGCGAGGGGAGTGCACCAGGTGCCTCGAGC

SEQ ID NO: 38 - XTEN AE144-5A, secuencia de proteínas

TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG

TSTEPSEGSAPGSPAGS'PTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG

SPAGS PTSTEEGS PAGSPTSTEEG

SEQ ID NO: 39 - XTEN AE144-5A, secuencia de ADN

GGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACA

TCTGGGTCGGAAACGCCAGGCACAAGTGAGTCTGCAACTCCCGAGTCCGGACCTGGCTCC

GAGCCTGCCACTAGCGGCTCCGAGACTCCGGGAACTTCCGAGAGCGGTACACCAGAAAGC

GGACCCGGAACCAGTACCGAACCTAGGGAGGGGTCTGCTCCGGGCAGCCCAGCCGGCTCT

CCTACATCCACGGAGGAGGGCACTTCCGAATCCGCCACCCCGGAGTCAGGGCCAGGATCT

GAACCCGCTACCTCAGGCAGTGAGACGCCAGGAACGAGCGAGTCCGCTACACCGGAGAGT

GGGCCAGGGAGCCCTGCTGGATCTCCTACGTCCACTGAGGAAGGGTCACCAGCGGGCTCG

CCCACCAGCACTGAAGAAGGTGCCTCGAGC

SEQ ID NO: 40 - XTEN AE144-6B, secuencia de proteínas

TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPG

TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG

SEQ ID NO: 41 - XTEN AE144-6B, secuencia de ADN

GGCGCGCCAACATCTACCGAGCCTTCCCAAGGCTCTGCCCCTGGGACCTCAGAATCTGCA

ACCCCTGAAAGCGGCCCTGGAACCTCCGAAAGTGCCACTCCCGAGAGCGGCCCAGGGACA

AGCGAGTCAGCAACCCCTGAGTCTGGACCCGCCAGCGAGCCTGCAACCTCTGGCTCAGAG

ACTCCCGGCTCAGAACCCGCTACCTCAGGCTCCGAGACACCCGGCTCTCCTGCTGGGAGT

CCCACTTCCACCGAGGAAGGAACATCCACTGAGCCTAGTGAGGGCTCTGCCCCTGGAACC

AGCACAGAGCCAAGTGAGGGCAGTGCACCAGGATCCGAGCCAGCAACCAGCGGGTCCGAG

ACTCCCGGGACCTCTGAGTCTGCCACCCCAGAGAGCGGACCCGGCACTTCAACCGAGCCC

TCCGAAGGATCAGCACCAGGTGCCTCGAGC

SEQ ID NO: 42 - XTEN AG144-1, secuencia de proteínas

^\•u^r<b^rib^{C r}r^'ü^GA^7'i^C'S⁵TGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTG

PGASPGTSSTGSPGT PGS AS SSPGSSTPSGATGS PGT PGS.GTASSSPGASPGT SSTGS

PGASPGT SSTG SPGTPG3GTAS SS

SEQ ID NO: 43 - XTEN AG144-1, secuencia de ADN

GGCGCCCCACCCGGGTCGTCCCCGTCGGCGTCCACCGGAACAGGGCCAGGGTCATCCCCG

TCAGCGTCGACTGGGACGGGACCCGGGACACCCGGTTCGGGGACTGCATCCTCCTCGCCT

GGTTCGTCCAGCCCGTCAGGAGCCACGGGTTCGCCGGGAAGCAGCCCAAGCGCATCCACT

GGTACAGGGCCTGGGGCTTCACCGGGTACTTCATCCACGGGGTCACCGGGAACGCeCGGA

TCGGGGACGGCTTCCTCATCACCAGGATCGTCAACACCCTCGGGCGCAACGGGCAGCCCC

GGAACCCCTGGTTCGGGTACGGCGTCGTCGAGCCCCGGTGCGAGCCCGGGAACAAGCTCG

ACAGGATCGCCTGGGGCGTCACCCGGCACGTCGAGCACAGGCAGCCCCGGAACCCCTGGA

TCGGGAACCGCGTCGTCAAGCGCCTCGAGC

SEQ ID NO: 44 - XTEN AG144-A, secuencia de proteínas

GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPG85PSASTGTGPGTPG3GTASSSPGSSTPSGATGSP

GSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSP

GASPGT SSTGS PGAS PGTSSTGS P

SEQ ID NO: 45 - XTEN AG144-A, secuencia de ADN

GGCGCGCCAGGTGCCTCGCOGGGAACATGATCAAGTGGTTCACCCGGGTCATCCCCCTCG

GCCTCAACCGGGACGGGTCCCGGCTCATGCCCCAGCGCCAGCACTGGAACAGGTCCTGGC

ACTCCTGGTTCCGGTACGGCATCGTCATCCCCGGGAAGCTCAACACCGTCCGGAGCGACA

GGATCACCTGGCTCGTCACCTTCGGCGTCAACTGGAACGGGGCCAGGGGCCTCACCCGGA

ACGTCCTCGACTGGGTCGCCTGGTACGCCGGGATCAGGAACGGCCTCATCCTCGCCTGGG

TCCTCAACGCCCTCGGGTGCGACTGGTTCGCCGGGAACTCCTGGCTCGGGGACGGCCTCG

TCGTGGCCTGGGGCATCACCGGGGACGAGCTCCACGGGGTCCCCTGGAGCGTCACCGGGG

ACCTCCTCGACAGGTAGCCCGGCCTCGAGC

SEQ ID NO: 46 - XTEN AG144-B, secuencia de proteínas

GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP

GSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP

GASPGT SSTGS PGASPGT SSTGSP

SEQ ID NO: 47 - XTEN AG144-B, secuencia de ADN

GGCGCGCCAGGTACACCGGGCAGCGGCACGGCTTCGTCGTCACCCGGCTCGTCCACACCG

TCGGGAGCTACGGGAAGCCCAGGAGCGTCACCGGGAACGTCGTCAACGGGGTCACCGGGT

ACGCCAGGTAGCGGCACGGCCAGCAGCTCGCCAGGTTCATCGACCCCGTCGGGAGCGACT

GGGTCGCCCGGATCAAGCCCGTCAGCTTCCACTGGAACAGGACCCGGGTCGTCGCCGTCA

GCCTCAACGGGGACAGGACCTGGTTCATCGACGCCGTCAGGGGCGACAGGCTCGCCCGGA

TCGTCAACACCCTGGGGGGCAACGGGGAGCCCTGGTGCGTCGCCTGGAACCTCATCCACC

GGAAGCCCGGGGGCCTCGCCGGGTACGAGCTCCACGGGATCGCCCGGAGCGTCCCCCGGA

ACTTCAAGC ACAGGGAGCCCTGC CTCGAGC

SEQ ID NO: 48 - XTEN AG144-C, secuencia de proteínas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con actividad de factor VIII.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos codifica FVIII de dominio B delecionado.

3. La molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de nucleótidos tiene una o más de las siguientes características:

(a) la secuencia de nucleótidos contiene un mayor porcentaje de nucleótidos G/C en comparación con SEQ ID NO: 3;

(b) la secuencia de nucleótidos contiene menos secuencias MARS/ARS en comparación con SEQ ID NO: 3; (c) la secuencia de nucleótidos no contiene el sitio de corte y empalme GGTGAT (SEQ ID NO: 7);

(d) la secuencia de nucleótidos contiene menos elementos desestabilizantes (SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9) con respecto a SEQ ID NO: 3;

(e) la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-T (SEQ ID NO: 10);

(f) la secuencia de nucleótidos no contiene una secuencia de poli-A (SEQ ID NO: 11); o

(g) el índice de adaptación de codones humanos es elevado con respecto a SEQ ID NO: 3.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde

(a) el índice de adaptación de codones humanos es al menos aproximadamente 0,75, al menos aproximadamente 0,76, al menos aproximadamente 0,77, al menos aproximadamente 0,78, al menos aproximadamente 0,79, al menos aproximadamente 0,80, al menos aproximadamente 0,81, al menos aproximadamente 0,82, al menos aproximadamente 0,83, al menos aproximadamente 0,84, al menos aproximadamente 0,85, al menos aproximadamente 0,86, al menos aproximadamente 0,87, o al menos aproximadamente 0,88;

(b) el porcentaje de nucleótidos G/C es al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 46 %, al menos aproximadamente 47 %, al menos aproximadamente 48 %, al menos aproximadamente 49 % o al menos aproximadamente 50 %;

(c) la secuencia de nucleótidos contiene como máximo una secuencia MARS/ARS; o

(d) la secuencia de nucleótidos contiene como máximo 4 elementos desestabilizantes.

5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una secuencia heteróloga de nucleótidos.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde la secuencia heteróloga de nucleótidos codifica una secuencia heteróloga de aminoácidos que es un extensor de la semivida.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, en donde la secuencia heteróloga de aminoácidos es una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, transferrina, albúmina o una secuencia PAS.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, en donde la secuencia heteróloga de aminoácidos es una región Fc.

9. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 1.

10. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. El vector de la reivindicación 10, en donde el vector se selecciona de un vector adenoviral, un vector lentiviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector de virus variolovacunal, un vector del virus del herpes simple y un vector de virus adenoasociado (AAV).

12. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el vector de la reivindicación 10 u 11.

13. Un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el vector de la reivindicación 10 u 11 o producido por la célula hospedadora de la reivindicación 12.

14. Un método de producción de un polipéptido con actividad de factor VIII, que comprende: cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 en condiciones por las cuales se produce un polipéptido con actividad de factor VIII; y, recuperar el polipéptido con actividad de factor VIII.

15. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el vector de la reivindicación 10 u 11, o el polipéptido de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico en un sujeto en necesidad del mismo.