RS61387B2 - Gen optimizovanog faktora viii - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Put koagulacije krvi delimično uključuje stvaranje enzimskog kompleksa Faktora VIIIa (FVIIIa) i Faktora IXa (FIXa) (Xaza kompleks) na površini trombocita. FIXa je serinska proteaza sa relativno slabom katalitičkom aktivnošću bez kofaktora FVIIIa. Xaza kompleks razdvaja Faktor X (FX) na Faktor Xa (FXa), koji zauzvrat stupa u interakciju sa Faktorom Va (FVa) kako bi razdvojio protrombin i stvorio trombin. Hemofilija A je poremećaj krvarenja uzrokovan mutacijama i/ili brisanjima FVIII (FVIII) gena što rezultuje nedostatkom FVIII aktivnosti (Peyvandi i dr.2006). U nekim slučajevima pacijenti imaju smanjeni nivo FVIII zbog prisustva inhibitora FVIII, kao što su anti-FVIII antitela.

[0002] Hemofiliju A karakterišu spontana krvarenja i prekomerno krvarenje. Vremenom, ponovljeno krvarenje u mišiće i zglobove, koje često počinje u ranom detinjstvu, rezultuje hemofiličnom artropatijom i nepovratnim oštećenjem zglobova. Ovo oštećenje je progresivno i može dovesti do ozbiljno ograničene pokretljivosti zglobova, atrofije mišića i hroničnog bola (Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003).

[0003] Bolest se može tretirati terapijom zamene usmerenom na obnavljanje aktivnosti FVIII na 1 do 5% normalnog nivoa kako bi se sprečilo spontano krvarenje (pogledati, npr., Mannucci, P.M., i dr., N. Engl. J. Med.344:1773-9 (2001). Postoje dostupni proizvodi izvedeni iz plazme i rekombinantni FVIII proizvodi za tretman na zahtev epizoda krvarenja ili za sprečavanje epizoda krvarenja profilaktičkim tretiranjem. Na osnovu polu-života ovih proizvoda (10-12 sati) (White G.C., i dr.,Thromb. Haemost.77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (suppl 1):94-99;discussion 100 (2003)), režimi tretmana zahtevaju čestu intravensku primenu, obično dva do tri puta nedeljno za profilaksu, i jedan do tri puta dnevno za tretman na zahtev (Manco-Johnson, M.J., i dr.,N. Engl. J. Med.357:535-544 (2007)). Takva česta primena je neudobna i skupa.

[0004] Glavna prepreka u pružanju jeftinog rekombinantnog FVIII proteina pacijentima su visoki troškovi komercijalne proizvodnje. FVIII protein se slabo eksprimira u heterolognim sistemima eksprimiranja, dva do tri reda veličine niže od proteina slične veličine. (Lynch i dr., Hum. Gene. Ther.; 4:259-72 (1993). Loše eksprimiranje FVIII delimično je posledica prisustva cis delujućih elemenata u kodirajućoj sekvenci FVIII koji inhibiraju eksprimiranje FVIII, poput transkripcionih prigušivača (Hoeben i dr., Blood 85:2447-2454 (1995)), sekvenci nalik regionu vezivanja matrica (MAR) (Fallux i dr., Mol. Cell. Biol.16:4264-4272 (1996)) i inhibitornih elemenata transkripcionog produženja (Koeberl i dr., Hum. Gene. Ther.; 6:469-479 (1995)).

[0005] Napredak u našem razumevanju biologije eksprimiranja FVIII doveo je do razvoja snažnijih varijanti FVIII. Na primer, biohemijske studije su pokazale da je FVIII B-domen neophodan za aktivnost FVIII kofaktora. Brisanje B-domena rezultovalo je 17-ostrukim povećanjem nivoa mRNK iznad divljeg tipa FVIII pune dužine, i povećanjem izlučenih proteina za 30%. (Toole i dr., Proc Natl Acad Sci USA 83:5939-42 (1986)). To je dovelo do razvoja koncentrata FVIII proteina sa izbrisanim B domenom (BDD), koji se sada široko koristi u kliničkim uslovima. Skorašnja istraživanja, međutim, ukazuju na to da se hFVIII pune dužine i BDD pogrešno poklapaju u ER lumenu, što rezultuje aktivacijom rasklopljenog proteinskog odgovora (UPR) i apoptozom mišjih hepatocita. WO2011005968 i US2009042283 obelodanjuju Faktor VIII kodonski optimizovan sa brisanjem B-domena.

[0006] Dakle, u struci postoji potreba za FVIII sekvencama koje se efikasno eksprimiraju u heterolognim sistemima.

SAŽETAK PRONALASKA

[0007] Predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1, gde nukleotidna sekvenca kodira polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII. U još jednom otelotvorenju, pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 100% identičnu sa SEQ ID NE: 1. U drugim otelotvorenjima, pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 1.

[0008] Predmetni pronalazak takođe pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 100% identičnu sa SEQ ID NO: 2, gde nukleotidna sekvenca kodira polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII. U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 2.

[0009] U nekim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ima indeks adaptacije ljudskog kodona koji je povećan u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ima indeks adaptacije ljudskog kodona koji iznosi najmanje oko 0,75, najmanje oko 0,76, najmanje oko 0,77, najmanje oko 0,78, najmanje oko 0,79 ili najmanje oko 0,80. U još nekim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ima indeks adaptacije ljudskog kodona koji iznosi najmanje oko 0,80, najmanje oko 0,81, najmanje oko 0,82, najmanje oko 0,83, najmanje oko 0,84, najmanje oko 0,85, najmanje oko 0,86, najmanje oko 0,87 ili najmanje oko 0,88.

[0010] U određenim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži veći procenat G/C nukleotida u poređenju sa procentom G/C nukleotida u SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži procenat G/C nukleotida koji iznosi najmanje oko 45%, najmanje oko 46%, najmanje oko 47%, najmanje oko 48%, najmanje oko 49 %, ili najmanje oko 50%.

[0011] U još nekim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži manje MARS/ARS sekvenci (SEQ ID NO: 5 i 6) u odnosu na SEQ ID NO: 3. U još jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži najviše jednu MARS/ARS sekvencu. U nekim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ne sadrži MARS/ARS sekvencu.

[0012] U nekim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ne sadrži mesto razdvajanja GGTGAT (SEQ ID NO: 7).

[0013] U određenim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži manje destabilizujućih sekvenci (SEQ ID NO: 8 i 9) u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži najviše 4 destabilizujuće sekvence. U još nekim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži najviše 2 destabilizujuće sekvence. U još jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ne sadrži destabilizujuću sekvencu.

[0014] U drugim otelotvorenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ne sadrži poli-T sekvencu (SEQ ID NO: 10). U još jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ne sadrži poli-A sekvencu (SEQ ID NO: 11).

[0015] U jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrži heterolognu nukleotidnu sekvencu. Na primer, heterologna nukleotidna sekvenca može kodirati heterolognu aminokiselinsku sekvencu koja je produživač polu-života. U nekim otelotvorenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, transferin, albumin, albumin-vezujući polipeptid, XTEN sekvenca, Fc, C-terminalni peptid (CTP) od β podjedinice ljudskog horionskog gonadotropina, ili PAS sekvenca. U drugim otelotvorenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je Fc region ili FcRn vezujući partner. U još nekim otelotvorenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca je vezana za N-terminus ili C-terminus aminokiselinske sekvence kodirane nukleotidnom sekvencom ili umetnute između dve aminokiseline u aminokiselinskoj sekvenci kodiranoj nukleotidnom sekvencom.

[0016] U određenom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kodira molekul monomer-dimer hibrida koji sadrži Faktor VIII.

[0017] U još jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku operativno je povezan sa najmanje jednom sekvencom kontrole transkripcije.

[0018] Predmetni pronalazak takođe pruža vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0019] Predmetni pronalazak takođe pruža ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je izabrana iz grupe koju čine: CHO ćelija, HEK293 ćelija, BHK21 ćelija, PER.C6 ćelija, NS0 ćelija i CAP ćelija.

[0020] Predmetni pronalazak takođe pruža postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII, koji obuhvata: kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima u kojima se proizvodi polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII; i obnavljanje polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII. U drugim otelotvorenjima postupka za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII, eksprimiranje polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII povećana je u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 3. U ostalim otelotvorenjima postupka, ćelija domaćin je CHO ćelija. U drugim otelotvorenjima postupka, ćelija domaćin je HEK293 ćelija.

[0021] Predmetni pronalazak takođe pruža postupak za povećanje eksprimiranja polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII kod pacijenta, gde se postupak sastoji od primene izolovanog molekula nukleinske kiseline prema pronalasku ili vektora prema pronalasku pacijentu koji ima potrebu za tim, gde je eksprimiranje polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII povećano u odnosu na referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline.

[0022] Predmetni pronalazak takođe pruža postupak za povećanje eksprimiranja polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII koji uključuje kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima u kojima se polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII eksprimira od strane molekula nukleinske kiseline, gde je eksprimiranje polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII povećano u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrže referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 3.

[0023] Predmetni pronalazak takođe pruža postupak za poboljšanje prinosa polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima u kojima molekul nukleinske kiseline proizvodi polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII, gde je prinos polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII je povećan u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrže referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 3.

[0024] Predmetni pronalazak takođe pruža postupak za tretiranje poremećaja krvarenja koji uključuje: primenu pacijentu koji ima potrebu za tim molekula nukleinske kiseline prema pronalasku, vektora prema pronalasku ili polipeptida prema pronalasku. U nekim otelotvorenjima postupka za tretiranje poremećaja krvarenja, poremećaj krvarenja karakteriše nedostatak Faktora VIII. U nekim otelotvorenjima, poremećaj krvarenja je hemofilija. U nekim otelotvorenjima, poremećaj krvarenja je hemofilija A.

[0025] U nekim otelotvorenjima postupka za tretiranje poremećaja krvarenja, aktivnost Faktora VIII u plazmi tokom 24 sata nakon primene povećana je u odnosu na pacijenta kom se primenjuje referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 3, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0026]

Slika 1 je šematski dijagram koji prikazuje lokaciju različitih mesta u kodirajućoj sekvenci BDD Faktora VIII. Ova mesta su uklonjena tokom procesa optimizacije kodona.

Slika 2 je nukleotidna sekvenca BDD Faktora VIII (SEQ ID NO: 1), kodonski optimizovana prvim postupkom optimizacije kodona, opisanim u Primeru 1.

Slika 3 je nukleotidna sekvenca BDD Faktora VIII (SEQ ID NO: 2), kodonski optimizovana drugim postupkom optimizacije kodona, opisanim u primeru 2.

Slike 4 A-B prikazuju podešavanje sklonosti upotrebe kodona u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci (SEQ ID NO: 1). Slika 4A prikazuje relativnu frekvenciju kodona u BDD FVIII sekvenci pre optimizacije kodona. Indeks adaptacije ljudskog kodona (CAI) početne BDD FVIII sekvence iznosi 0,74. Slika 4B prikazuje relativnu frekvenciju kodona u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci (SEQ ID NO: 1). Ljudski CAI rezultujuće optimizovane sekvence iznosi 0,88. X-osa označava relativni položaj kodona duž dužine nukleotidne BDD FVIII sekvence. Y-osa označava relativnu frekvenciju kodona na svakom položaju u ljudskom genomu.

Slike 5 A-B pokazuju učestalost optimalnih ljudskih kodona u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci (SEQ ID NO: 1). Slika 5A prikazuje učestalost optimalnih kodona u BDD FVIII sekvenci pre optimizacije kodona. Slika 5B prikazuje učestalost optimalnih kodona u BDD FVIII sekvenci nakon optimizacije kodona (SEQ ID NO: 1). X-osa označava frekvenciju kodona u ljudskom genomu. Y-osa označava procenat kodona u BDD FVIII sekvenci koji spadaju u svaku kategoriju naznačenu na X-osi.

Slike 6 A-B pokazuju G/C sadržaj optimizovane BDD FVIII sekvence (SEQ ID NO: 1). Slika 6A prikazuje GC sadržaj BDD FVIII sekvence pre optimizacije kodona. Sadržaj GC u početnoj BDD FVIII sekvenci iznosi 46,16%. Slika 6B prikazuje G/C sadržaj BDD FVIII sekvence nakon optimizacije kodona (SEQ ID NO: 1). Sadržaj G/C u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci iznosi 51,56%. X-osa označava relativni položaj kodona duž dužine nukleotidne BDD FVIII sekvence. Y-osa označava procentualni sadržaj G/C.

Slika 7 je histogram koji prikazuje aktivnost FVIII u plazmi kod HemA miševa 24 sata nakon hidrodinamičke injekcije sa plazmidima koji sadrže ili početnu BDD FVIII sekvencu (krugovi), optimizovanu BDD FVIII sekvencu (SEQ ID NO: 1) (kvadratići) ili optimizovanu BDD FVIII sekvencu (SEQ ID NO: 2) (trouglovi).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0027] Primeri konstrukcija pronalaska su ilustrovani na pratećim slikama i spisku sekvenci. Kako bi se pružilo jasno razumevanje specifikacije i zahteva, naredne definicije su date u nastavku.

I. Definicije

[0028] Treba napomenuti da se oblici jednine entiteta odnose na jedan ili više tih entiteta: na primer, „nukleotidna sekvenca“ podrazumeva da predstavlja jednu ili više nukleotidnih sekvenci. Kao takvi, izrazi „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ ovde se mogu koristiti naizmenično.

[0029] Izraz „oko“ ovde se koristi da znači približno, otprilike, okolo ili u okviru. Kada se izraz „oko“ koristi zajedno sa numeričkim rasponom, on modifikuje taj raspon proširujući granice iznad i ispod utvrđenih numeričkih vrednosti. Generalno, izraz „oko“ se ovde koristi za modifikovanje numeričke vrednosti iznad i ispod navedene vrednosti varijansom od 10 procenata, nagore ili nadole (više ili niže).

[0030] Izraz „izolovan“ za potrebe predmetnog pronalaska označava biološki materijal (ćelija, nukleinska kiselina ili protein) koji je uklonjen iz svog prvobitnog okruženja (okruženja u kome je prirodno prisutan). Na primer, polinukleotid prisutan u prirodnom stanju u biljci ili životinji nije izolovan, međutim isti polinukleotid odvojen od susednih nukleinskih kiselina u kojima je prirodno prisutan smatra se „izolovanim“.

[0031] „Nukleinska kiselina“, „molekul nukleinske kiseline“, „oligonukleotid“ i „polinukleotid“ koriste se naizmenično i odnose se na polimerni oblik fosfatnog estra ribonukleozida (adenozin, gvanozin, uridin ili citidin; „molekuli RNK“) ili dezoksiribonukleozida (dezoksiguanozin, dezoksitimidin ili dezoksicitidin; „molekuli DNK“), ili bilo koji njihov analog fosfoestera, poput fosforotioata i tioestera, u jednolančanom obliku ili u dvolančanoj spirali. Mogući su dvolančani DNK-DNK, DNK-RNK i RNK-RNK. Izraz molekul nukleinske kiseline, a posebno molekul DNK ili RNK, odnosi se samo na primarnu i sekundarnu strukturu molekula, i ne ograničava ga na bilo koji određeni tercijarni oblik. Dakle, ovaj izraz uključuje dvolančanu DNK koja je pronađena, između ostalog, u linearnim ili kružnim molekulima DNK (npr., restrikcioni fragmenti), plazmidi, superuvijenim DNK i hromozomima. U raspravi o strukturi određenih dvolančanih molekula DNK, sekvence se ovde mogu opisati u skladu sa uobičajenom konvencijom pružanja samo sekvence u pravcu 5' do 3' duž netranskribovanog lanca DNK (tj. lanac koji ima sekvencu homolognu mRNK). „Rekombinantni molekul DNK“ je molekul DNK koji je podvrgnut molekularno biološkoj manipulaciji. DNK uključuje, ali nije ograničen na, cDNK, genomsku DNK, plazmidnu DNK, sintetičku DNK i polusintetičku DNK. „Sastav nukleinske kiseline“ pronalaska sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina kako je ovde opisano.

[0032] Kako se ovde koristi, „kodirajući region“ ili „kodirajuća sekvenca“ je deo polinukleotida koji se sastoji od kodona koji se mogu prevesti u aminokiseline. Iako se „zaustavni kodon“ (TAG, TGA ili TAA) obično ne prevodi u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ali bilo koja sekvenca koja ga okružuje, na primer promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Granice kodirajućeg regiona se obično određuju početnim kodonom na 5' terminusu, koji kodira amino terminus rezultujućeg polipeptida, i translacionim zaustavnim kodonom na 3' terminusu, koji kodira karboksilni završetak rezultujućeg polipeptida. Dva ili više kodirajućih regiona mogu biti prisutni u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr., na pojedinačnom vektoru, ili u odvojenim polinukleotidnim konstruktima, npr., na odvojenim (različitim) vektorima. Iz toga zatim sledi da jedan vektor može sadržati samo jedan kodirajući region, ili može da sadrži dva ili više kodirajućih regiona.

[0033] Određeni proteini koje izlučuju ćelije sisara povezani su sa sekretornim signalnim peptidom koji se odvaja od zrelog proteina nakon što je pokrenut izvoz rastućeg lanca proteina preko grubog endoplazmatičnog retikuluma. Stručnjaci su svesni da su signalni peptidi uglavnom fuzionisani sa N-terminusom polipeptida, i razdvojeni su od celog ili polipeptida „pune dužine“ kako bi se dobio izlučeni ili „zreli“ oblik polipeptida. U određenim otelotvorenjima, nativni signalni peptid ili funkcionalni derivat te sekvence je onaj koji zadržava sposobnost usmeravanja lučenja polipeptida koji je operativno povezan sa njim. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara, npr., ljudski tkivni aktivator plazminogena (TPA) ili mišji β-glukuronidazni signalni peptid, ili njegov funkcionalni derivat.

[0034] Izraz „nizvodno“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se nalazi 3' od referentne nukleotidne sekvence. U određenim otelotvorenjima, nizvodne nukleotidne sekvence se odnose na sekvence koje slede početnu tačku transkripcije. Na primer, kodon inicijacije translacije gena nalazi se nizvodno od početnog mesta transkripcije.

[0035] Izraz „uzvodno“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se nalazi 5' od referentne nukleotidne sekvence. U određenim otelotvorenjima, uzvodne nukleotidne sekvence odnose se na sekvence koje se nalaze na 5' strani kodirajućeg regiona ili početne tačke transkripcije. Na primer, većina promotera se nalazi uzvodno od početnog mesta transkripcije.

[0036] Kako se ovde koristi, izraz „regulatorni region“ odnosi se na nukleotidne sekvence smeštene uzvodno (5' nekodirajuće sekvence), unutar, ili nizvodno (3' nekodirajuće sekvence) od kodirajućeg regiona, i koje utiču na transkripciju, RNK obradu, stabilnost ili translaciju povezanog kodirajućeg regiona. Regulatorni regioni mogu da uključuju promotere, liderske sekvence translacije, introne, sekvence prepoznavanja poliadenilacije, mesta za RNK obradu, mesta za vezivanje efektora i strukture matične petlje. Ako je kodirajući region namenjen za eksprimiranje u eukariotskoj ćeliji, signal poliadenilacije i završetak transkripcije sekvence će se obično nalaziti 3' od kodirajuće sekvence.

[0037] Polinukleotid koji kodira genski proizvod, npr., polipeptid, može da sadrži promoter i/ili druge elemente kontrole transkripcije ili translacije koji su operativno povezani sa jednim ili više kodirajućih regiona. Kada je kodirajući region operativno povezan za genski proizvod, npr., polipeptid, povezan je sa jednim ili više regulatornih regiona na takav način da eksprimiranje genskog proizvoda stavi pod uticaj ili kontrolu regulatornih regiona. Na primer, kodirajući region i promoter su „operativno povezani“ ako indukcija funkcije promotera rezultuje transkripcijom mRNK koja kodira genski proizvod kodiran kodirajućim regionom, i ako priroda veze između promotera i kodirajućeg regiona ne ometa sposobnost promotera da usmeri eksprimiranje genskog proizvoda ili ne ometa sposobnost transkripcije DNK šablona. Ostali elementi kontrole transkripcije, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali završetka transkripcije, takođe mogu biti operativno povezani sa kodirajućim regionom kako bi usmerili eksprimiranje genskog proizvoda.

[0038] „Transkripcione sekvence kontrole“ odnose se na regulatorne sekvence DNK, kao što

1

su promoteri, pojačivači, terminatori i slično, koji pružaju eksprimiranje kodirajuće sekvence u ćeliji domaćinu. Stručnjacima je poznat niz različitih regiona za kontrolu transkripcije. To uključuje, bez ograničenja, regione za kontrolu transkripcije koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, ali bez ograničenja, segmenti promotera i pojačivača iz citomegalovirusa (neposredni rani promoter, zajedno sa intronom-A), simian virus 40 (rani promoter)) i retrovirusi (kao što je Rous sarkoma virus). Ostali regioni za kontrolu transkripcije uključuju one izvedene iz gena kičmenjaka kao što su aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i β-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne da kontrolišu eksprimiranje gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni za kontrolu transkripcije uključuju promotere i pojačivače specifične za tkivo, kao i promotere indukovane limfokinima (npr., promoteri indukovani interferonima ili interleukinima).

[0039] Slično tome, stručnjacima su poznati različiti elementi kontrole translacije. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na mesta vezivanja ribozoma, kodone inicijacije i terminacije translacije i elemente izvedene iz pikornavirusa (naročito unutrašnje mesto ulaska ribozoma ili IRES, takođe poznato kao CITE sekvenca).

[0040] Izraz „eksprimiranje“ kako se ovde koristi odnosi se na postupak kojim polinukleotid proizvodi genski proizvod, na primer, RNK ili polipeptid. Uključuje bez ograničenja transkripciju polinukleotida u mesindžer RNK (mRNK), transfernu RNK (tRNK), RNK male ukosnice (shRNK), malu ometajuću RNK (siRNK) ili bilo koji drugi RNK proizvod, i translaciju mRNK u polipeptid. Eksprimiranje pruža „genski proizvod“. Kako se ovde koristi, genski proizvod može biti ili nukleinska kiselina, npr., mesindžer RNK proizvedena transkripcijom gena, ili polipeptid koji je preveden iz transkripta. Ovde opisani genski proizvodi dalje uključuju nukleinske kiseline sa post-transkripcionim modifikacijama, npr., poliadenilacija ili splajsovanje, ili polipeptidi sa post translacionim modifikacijama, npr., metilacija, glikozilacija, dodavanje lipida, udruživanje sa drugim proteinskim podjedinicama ili proteolitičko cepanje. Izraz „prinos“, kako se ovde koristi, odnosi se na količinu polipeptida proizvedenog eksprimiranjem gena.

[0041] „Vektor“ se odnosi na bilo koji nosač za kloniranje i/ili prenos nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Vektor može biti replikon na koji se može vezati drugi segment nukleinske kiseline tako da se postigne replikacija vezanog segmenta. „Replikon“ se odnosi na bilo koji genetski element (npr., plazmid, fag, kozmid, hromozom, virus) koji funkcioniše kao autonomna jedinica replikacije in vivo, tj., sposoban je za replikaciju pod sopstvenom kontrolom. Izraz „vektor“ uključuje i virusne i nevirusne nosače za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju in vitro, ex vivo ili in vivo. Veliki broj vektora je poznat i koristi se u struci, uključujući, na primer, plazmide, modifikovane eukariotske viruse ili modifikovane bakterijske viruse. Umetanje polinukleotida u pogodan vektor može se postići povezivanjem odgovarajućih polinukleotidnih fragmenata u izabrani vektor koji ima komplementarne kohezivne završetke.

[0042] Vektori mogu biti projektovani tako da kodiraju selektivne markere ili reportere koji omogućavaju selekciju ili identifikaciju ćelija koje su ugrađene vektor. Eksprimiranje selekcionih markera ili reportera omogućava identifikaciju i/ili odabir ćelija domaćina koje uključuju i eksprimiraju druge kodirajuće regione sadržane u vektoru. Primeri selekcionih marker gena koji su poznati i koriste se u struci uključuju: gene koji pružaju otpornost na ampicilin, streptomicin, gentamicin, kanamicin, higromicin, bialafos herbicid, sulfonamid i slično; i geni koji se koriste kao fenotipski markeri, tj., geni za regulaciju antocijanina, gen za izopentanil transferazu i slično. Primeri reportera poznatih i korišćenih u struci uključuju: luciferazu (Luc), zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), -galaktozidazu (LacZ), -glukuronidazu (Gus) i slično. Selekcioni markeri takođe se mogu smatrati reporterima.

[0043] Izraz „selekcioni marker“ odnosi se na faktor identifikacije, obično gen za otpornost na antibiotike ili hemijske supstance, koji se može izabrati na osnovu dejstva marker gena, tj, otpornost na antibiotik, otpornost na herbicid, kolorimetrijski markeri, enzimi, fluorescentni markeri i slično, gde se efekat koristi za praćenje nasleđivanja nukleinske kiseline od interesa i/ili za identifikaciju ćelije ili organizma koji su nasledili nukleinsku kiselinu od interesa. Primeri selekcionih markera gena koji su poznati i koriste se u struci uključuju: gene koji pružaju otpornost na ampicilin, streptomicin, gentamicin, kanamicin, higromicin, bialafos herbicid, sulfonamid i slično; i gene koji se koriste kao fenotipski markeri, tj., gene za regulaciju antocijanina, gen za izopentanil transferazu i slično.

[0044] Izraz „reporter gen“ odnosi se na nukleinsku kiselinu koja kodira faktor identifikacije koji je moguće identifikovati na osnovu efekta reporter gena, gde se efekat koristi za praćenje nasleđivanja nukleinske kiseline od interesa, za identifikaciju ćelije ili organizma koji je nasledio nukleinsku kiselinu od interesa i/ili za merenje indukcije ili transkripcije eksprimiranja gena. Primeri reporter gena poznati i korišćeni u struci uključuju: luciferazu (Luc), zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), βgalaktozidazu (LacZ), β-glukuronidazu (Gus) i slično. Selekcioni marker geni se takođe mogu smatrati reporter-genima.

[0045] „Promoter“ i „promoterska sekvenca“ se koriste naizmenično i odnose se na DNK sekvencu sposobnu da kontroliše eksprimiranje kodirajuće sekvence ili funkcionalne RNK. Generalno, kodirajuća sekvenca se nalazi 3' od promoterske sekvence. Promoteri mogu biti izvedeni u celini iz nativnog gena, ili mogu biti sastavljeni od različitih elemenata izvedenih iz različitih promotera koji se nalaze u prirodi, ili čak mogu sadržati sintetičke DNK segmente. Stručnjacima je jasno da različiti promoteri mogu da usmere eksprimiranje gena u različitim tkivima ili tipovima ćelija, ili u različitim fazama razvoja, ili kao odgovor na različite životne sredine ili fiziološke uslove. Promoteri zbog kojih se gen u većini slučajeva eksprimira u većini tipova ćelija obično se nazivaju „konstitutivni promoteri“. Promoteri koji uzrokuju eksprimiranje gena u određenom tipu ćelije obično se nazivaju „promoteri specifični za ćelije“ ili „promoteri specifični za tkivo“. Promoteri koji dovode do eksprimiranja gena u određenoj fazi razvoja ili diferencijacije ćelija obično se nazivaju „promoterima specifičnim za razvoj“ ili „promoterima specifičnim za ćelijsku diferencijaciju“. Promoteri koji su indukovani i koji uzrokuju da se gen eksprimira nakon izlaganja ili tretmana ćelije agensom, biološkim molekulom, hemikalijom, ligandom, svetlošću ili slično koji indukuje promoter, obično se nazivaju „inducibilni promoteri“ ili „regulatorni promoteri“. Dalje se prepoznaje da pošto u većini slučajeva tačne granice regulatornih sekvenci nisu u potpunosti definisane, fragmenti DNK različitih dužina mogu imati identičnu promotersku aktivnost.

[0046] Sekvenca promotera je obično ograničena na svom 3' terminusu mestom inicijacije transkripcije i proteže se uzvodno (5' pravac) kako bi uključila minimalni broj baza ili elemenata neophodnih za pokretanje transkripcije na nivoima koji se mogu prepoznati iznad pozadine. Unutar promoterske sekvence naći će se mesto za inicijaciju transkripcije (pogodno definisano na primer mapiranjem sa nukleazom S1), kao i domeni za vezivanje proteina (konsenzus sekvence) odgovorni za vezivanje RNK polimeraze.

[0047] Izrazi „restrikciona endonukleaza“ i „restrikcioni enzim“ koriste se naizmenično i odnose se na enzim koji se vezuje i preseca u određenoj nukleotidnoj sekvenci unutar

1

dvolančane DNK.

[0048] Izraz „plazmid“ odnosi se na ekstrahromozomski element koji često nosi gen koji nije deo centralnog metabolizma ćelije, i obično u obliku kružnih dvolančanih molekula DNK. Takvi elementi mogu biti autonomno replicirajuće sekvence, sekvence koje integrišu genom, sekvence faga ili nukleotida, linearne, kružne ili superuvijene, jedno- ili dvolančane DNK ili RNK, izvedene iz bilo kog izvora, u kojima je određen broj nukleotidnih sekvenci spojen ili rekombinovan u jedinstvenu konstrukciju koja je sposobna da u ćeliju uvede fragment promotera i DNK sekvencu za izabrani genski proizvod zajedno sa odgovarajućom 3' neprevedenom sekvencom.

[0049] Eukariotski virusni vektori koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, adenovirusne vektore, retrovirusne vektore, adeno-povezane virusne vektore, poksvirus, npr., vektori virusa vakcinije, bakulovirusni vektori ili herpesvirusni vektori. Nevirusni vektori uključuju plazmide, lipozome, električno naelektrisane lipide (citofektini), DNK-proteinske komplekse i biopolimere.

[0050] „Vektor kloniranja“ odnosi se na „replikon“, koji je jedinična dužina nukleinske kiseline koja se replicira sekvencijalno i koji sadrži poreklo replikacije, kao što je plazmid, fag ili kozmid, na koji može da se vezuje drugi segment nukleinske kiseline tako da se postigne replikacija priloženog segmenta. Određeni vektori kloniranja mogu se replicirati u jednom tipu ćelije, npr., bakterije, i eksprimirati u drugom, npr., eukariotske ćelije. Klonski vektori obično sadrže jednu ili više sekvenci koje se mogu koristiti za odabir ćelija koje sadrže vektor i/ili jedno ili više mesta za kloniranje za umetanje sekvenci nukleinske kiseline od interesa.

[0051] Izraz „vektor eksprimiranja“ odnosi se na nosač dizajniran da omogući eksprimiranje umetnute sekvence nukleinske kiseline nakon umetanja u ćeliju domaćina. Umetnuta sekvenca nukleinske kiseline stavlja se u operativnu vezu sa regulatornim regionima kako je opisano iznad.

[0052] Vektori se unose u ćelije domaćina postupcima dobro poznatim u struci, npr., transfekcija, elektroporacija, mikroinjekcija, transdukcija, fuzija ćelija, DEAE dekstran, taloženje kalcijum fosfata, lipofekcija (fuzija lizozoma), upotreba genskog pištolja ili DNK vektor transportera.

[0053] „Kultura“, „kultivisati“ i „kultivisanje“, kako se ovde koristi, znači inkubiranje ćelija pod in vitro uslovima koji omogućavaju rast ili podelu ćelija ili održavanje ćelija u živom stanju. „Kultivisane ćelije“, kako se ovde koristi, označavaju ćelije koje se razmnožavaju in vitro.

[0054] Kako se ovde koristi, izraz „polipeptid“ obuhvata pojedinačni „polipeptid“ kao i mnoštvo „polipeptida“, i odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih amidnim vezama (takođe poznatim kao peptidne veze). Izraz „polipeptid“ odnosi se na bilo koji lanac ili lance dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Dakle, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „aminokiselinski lanac“ ili bilo koji drugi izraz koji se koristi za označavanje lanca ili lanaca dve ili više aminokiselina, uključeni su u definiciju „polipeptida“ i izraz „polipeptid“ može se koristiti umesto ili naizmenično sa bilo kojim od ovih izraza. Izraz „polipeptid“ takođe se odnosi na proizvode post-eksprimirajućih modifikacija polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje ili modifikaciju aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu.

[0055] Izraz „aminokiselina“ uključuje alanin (Ala ili A); arginin (Arg ili R); asparagin (Asn ili N); asparaginsku kiselina (Asp ili D); cistein (Cys ili C); glutamin (Gln ili Q); glutaminsku kiselinu (Glu ili E); glicin (Gly ili G); histidin (His ili H); izoleucin (Ile ili I): leucin (Leu ili L); lizin (Lys ili K); metionin (Met ili M); fenilalanin (Phe ili F); prolin (Pro ili P); serin (Ser ili S); treonin (Thr ili T); triptofan (Trp ili W); tirozin (Tyr ili Y); i valin (Val ili V).

Netradicionalne aminokiseline su takođe obuhvaćene predmetnim pronalaskom i uključuju norlevcin, omitin, norvalin, homoserin i druge analoge ostataka aminokiselina kao što su oni opisani kod Ellman i dr. Meth. Enzym.202:301-336 (1991). Kako bi se generisali takvi aminokiselinski ostaci koji se ne javljaju u prirodi, postupci od Noren i dr. Science 244:182 (1989) i Ellman i dr., supra, mogu se koristiti. Ukratko, ovi postupci uključuju hemijsku aktivaciju supresorske tRNK sa aminokiselinskim ostatkom koji se ne javlja u prirodi, praćeno in vitro transkripcijom i translacijom RNK. Uvođenje netradicionalnih aminokiselina

1

takođe se može postići upotrebom peptidnih hemikalija poznatih u struci. Kako se ovde koristi, izraz „polarna aminokiselina“ uključuje aminokiseline koje imaju neto nula naelektrisanja, ali imaju broj delimičnih naelektrisanja koji nije nula u različitim delovima svojih bočnih lanaca (npr. M, F, W, S, Y, N, Q, C). Ove aminokiseline mogu učestvovati u hidrofobnim i elektrostatičkim interakcijama. Kako se ovde koristi, izraz „naelektrisana aminokiselina“ uključuje aminokiseline koje na svojim bočnim lancima mogu imati neto naelektrisanje koje nije nula (npr. R, K, H, E, D). Ove aminokiseline mogu učestvovati u hidrofobnim i elektrostatičkim interakcijama.

[0056] „Izolovani“ polipeptid ili njegov fragment, varijanta ili derivat odnosi se na polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban poseban nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se jednostavno može ukloniti iz svog prirodnog ili nativnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćinima smatraju se izolovanim za svrhe pronalaska, kao i nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, fragmentisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom pogodnom tehnikom.

[0057] Takođe su u predmetni pronalazak uključeni fragmenti ili varijante polipeptida i bilo koja njihova kombinacija. Izraz „fragment“ ili „varijanta“ kada se odnosi na domene vezivanja polipeptida ili molekule vezivanja predmetnog pronalaska uključuje bilo koji polipeptid koji zadržava barem neka svojstva (npr., FcRn afinitet vezivanja za FcRn vezujući domen ili Fc varijantu, aktivnost koagulacije za FVIII varijantu ili aktivnost vezivanja FVIII za VWF fragment) referentnog polipeptida. Fragmenti polipeptida uključuju proteolitičke fragmente, kao i fragmente brisanja, pored specifičnih fragmenata antitela o kojima je ovde diskutovano na drugom mestu, ali ne uključuju prirodni polipeptid pune dužine (ili zreli polipeptid). Varijante vezujućih domena polipeptida ili vezujući molekuli predmetnog pronalaska uključuju fragmente kako je opisano iznad, i takođe i polipeptide sa izmenjenim sekvencama aminokiselina usled supstitucije, brisanja ili umetanja aminokiselina. Varijante mogu biti one koje se javljaju u prirodne ili koje se ne javljaju u prirodi. Varijante koje se ne javljaju u prirodi mogu se proizvesti upotrebom tehnika mutageneze poznatih u struci.

Različiti polipeptidi mogu da sadrže konzervativne ili nekonzervativne supstitucije, brisanja ili umetanja aminokiselina.

[0058] „Konzervativna supstitucija aminokiselina“ je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih

1

ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci, uključujući bazne bočne lance (npr., lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Dakle, ako se aminokiselina u polipeptidu zameni drugom aminokiselinom iz iste porodice bočnih lanaca, supstitucija se smatra konzervativnom. U još jednom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca može se konzervativno zameniti strukturno sličnom sekvencom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova porodice bočnog lanca.

[0059] Izraz „procenat identičnosti“, kako je poznato u struci, je odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, kako je utvrđeno upoređivanjem sekvenci. U struci, „identičnost“ takođe znači stepen povezanosti sekvenci između polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci, u zavisnosti od slučaja, kako se određuje podudaranjem nizova takvih sekvenci. „Identičnost“ se lako može izračunati poznatim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na one opisane u: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing:

Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); i Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). Poželjni postupci za određivanje identičnosti dizajnirani su tako da daju najbolje podudaranje između testiranih sekvenci. Postupci za utvrđivanje identičnosti kodifikovani su u javno dostupnim računarskim programima.

Poravnanje sekvenci i proračun procenta identičnosti mogu se izvršiti pomoću softvera za analizu sekvenci kao što je Megalign program od LASERGENE bioinformatičkog računarskog paketa (DNASTAR Inc., Madison, WI), GCG paket programa (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul i dr., J Mol. Biol.215:403 (1990)), i DNASTAR (DNASTAR, Inc.1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA). U kontekstu ove prijave podrazumevaće se da će se tamo gde se za analizu koristi softver za analizu sekvenci, rezultati analize zasnivati na „podrazumevanim vrednostima“ navedenog programa, osim ako nije drugačije naznačeno. Kako se ovde koristi, „podrazumevane vrednosti“ podrazumevaće bilo koji skup vrednosti ili

1

parametara koji se prvobitno učitavaju sa softverom kada se on prvi put pokreće. U svrhu određivanja procenta identičnosti između optimizovane BDD FVIII sekvence pronalaska i referentne sekvence, za izračunavanje procenta identičnosti koriste se samo nukleotidi u referentnoj sekvenci koji odgovaraju nukleotidima u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci pronalaska. Na primer, kada se upoređuje FVIII nukleotidna sekvenca pune dužine koja sadrži B domen sa optimizovanom FVIII nukleotidnom sekvencom sa izbrisanim B domenom (BDD) pronalaska, deo poravnanja koji uključuje A1, A2, A3, C1 i C2 domen se koristi za izračunavanje procenta identičnosti. Nukleotidi u delu FVIII sekvence pune dužine koji kodira B domen (što će rezultovati velikom „prazninom“ u poravnanju) neće se računati kao neusklađenost.

[0060] Kako se ovde koristi, „nukleotidi koji odgovaraju nukleotidima u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci pronalaska“ identifikuju se poravnavanjem optimizovane BDD FVIII sekvence pronalaska kako bi se maksimizovala identičnost referentne FVIII sekvence. Broj koji se koristi za identifikaciju ekvivalentne aminokiseline u referentnoj FVIII sekvenci zasnovan je na broju koji se koristi za identifikaciju odgovarajuće aminokiseline u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci pronalaska.

[0061] „Fuzioni“ ili „himerni“ protein sadrži prvu aminokiselinsku sekvencu povezanu sa drugom aminokiselinskom sekvencom sa kojom u prirodi nije prirodno povezan.

Aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u odvojenim proteinima mogu se spojiti u fuzionom polipeptidu ili se aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u istom proteinu mogu postaviti u novi raspored u fuzionom polipeptidu, npr., fuzija domena Faktora VIII prema pronalasku sa Ig Fc domenom. Fuzioni protein se stvara, na primer, hemijskom sintezom ili stvaranjem i translacijom polinukleotida u kom su peptidni regioni kodirani u željenom odnosu. Himerni protein može dalje da sadrži drugu aminokiselinsku sekvencu povezanu sa prvom aminokiselinskom sekvencom kovalentnom, nepeptidnom vezom ili nekovalentnom vezom.

[0062] Kako se ovde koristi, izraz „polu-život“ odnosi se na biološki period polu-života određenog polipeptida in vivo. Polu-život se može predstaviti vremenom potrebnim da se polovina količine koja se primenjuje pacijentu ukloni iz cirkulacije i/ili drugih tkiva životinje. Kada se kriva klirensa datog polipeptida konstruiše u zavisnosti od vremena, kriva je obično dvofazna sa brzom α-fazom i dužom β-fazom. α-faza tipično predstavlja ravnotežu datog Fc

1

polipeptida između intra- i ekstravaskularnog prostora i delom je određena veličinom polipeptida. β-faza tipično predstavlja katabolizam polipeptida u intravaskularnom prostoru. U nekim otelotvorenjima, FVIII i himerni proteini koji sadrže FVIII su monofazni, pa prema tome nemaju alfa fazu, već samo jednu beta fazu. Prema tome, u određenim otelotvorenjima, izraz polu-života kako se ovde koristi odnosi se na polu-život polipeptida u β-fazi.

[0063] Izraz „vezan“, kako se ovde koristi, odnosi se na prvu aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu kovalentno ili nekovalentno spojenu sa drugom aminokiselinskom sekvencom, odnosno nukleotidnom sekvencom. Prva aminokiselinska ili nukleotidna sekvenca može se direktno pridružiti ili postaviti jedna uz drugu sa drugom aminokiselinskom ili nukleotidnom sekvencom ili alternativno intervenišuća sekvenca može kovalentno pridružiti prvu sekvencu drugoj sekvenci. Izraz „vezan“ ne označava samo fuziju prve aminokiselinske sekvence sa drugom aminokiselinskom sekvencom na C-terminusu ili N-terminusu, već takođe uključuje umetanje cele prve aminokiselinske sekvence (ili druge aminokiseline sekvenca) u bilo koje dve aminokiseline u drugoj aminokiselinskoj sekvenci (ili u prvoj aminokiselinskoj sekvenci). U jednom otelotvorenju, prva aminokiselinska sekvenca može biti vezana za drugu aminokiselinsku sekvencu peptidnom vezom ili veznikom. Prva nukleotidna sekvenca može biti vezana za drugu nukleotidnu sekvencu fosfodiesterskom vezom ili veznikom. Veznik može biti peptid ili polipeptid (za polipeptidne lance) ili nukleotid ili nukleotidni lanac (za nukleotidne lance) ili bilo koji hemijski deo (i za polipeptidni i za polinukleotidni lanac). Izraz „vezan“ takođe je označen crticom (-).

[0064] Kako se ovde koristi, izraz „povezan sa“ odnosi se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu formiranu između prvog aminokiselinskog lanca i drugog aminokiselinskog lanca. U jednom aspektu, izraz „povezan sa“ označava kovalentnu, nepeptidnu vezu ili nekovalentnu vezu. Ovo povezivanje može biti naznačeno dvotačkom, tj., (:). U još jednom otelotvorenju, to označava kovalentnu vezu, osim peptidne veze. Na primer, aminokiselina cistein sadrži tiol grupu koja može da formira disulfidnu vezu ili most sa tiol grupom na drugom ostatku cisteina. U većini prirodno prisutnih IgG molekula, CH1 i CL regioni su povezani disulfidnom vezom, i dva teška lanca su povezana sa dve disulfidne veze na položajima koji odgovaraju 239 i 242 pomoću Kabat sistema numeracije (položaj 226 ili 229, EU sistem numeracije). Primeri kovalentnih veza uključuju, ali nisu ograničeni na, peptidnu vezu, metalnu vezu, vodoničnu vezu, disulfidnu vezu, sigma vezu, pi vezu, delta vezu, glikozidnu vezu, agnostičku vezu, savijenu vezu, dipolarnu vezu, Pi zadnju vezu, dvostruku vezu,

1

trostruku vezu, četverostruku vezu, petostruku vezu, šestostruku vezu, konjugaciju, hiperkonjugaciju, aromatičnost, haptičnost ili anti-vezz. Neograničavajući primeri nekovalentne veze uključuju jonsku vezu (npr., katjon-pi veza ili slana veza), metalna veza, vodonična veza (npr., divodonična veza, divodonik kompleks, vodonična veza sa niskom barijerom ili simetrična vodonična veza), van der Valsova sila, londonska sila disperzije, mehanička veza, halogena veza, aurofilnost, interkalacija, slaganje, entropijska sila ili hemijski polaritet.

[0065] Izraz „monomer-dimer hibrid“ kako se ovde koristi odnosi se na himerni protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, koji su međusobno povezani disulfidnom vezom, gde prvi lanac sadrži faktor zgrušavanja, npr., Faktor VIII, i prvi Fc region i drugi lanac obuhvata, značajno se sastoji od, ili ga čini drugi Fc region bez faktora zgrušavanja. Monomer-dimer hibrid konstrukt je prema tome hibrid koji sadrži monomerni aspekt koji ima samo jedan faktor zgrušavanja i dimerni aspekt koji ima dva Fc regiona.

[0066] Hemostaza, kako se ovde koristi, znači zaustavljanje ili usporavanje krvarenja ili hemoragije; ili zaustavljanje ili usporavanje protoka krvi kroz krvni sud ili deo tela.

[0067] Hemostatski poremećaj, kako se ovde koristi, označava genetski nasledno ili stečeno stanje koje se karakteriše tendencijom ka hemoragiji, spontano ili kao rezultat traume, zbog oštećene sposobnosti ili nemogućnosti stvaranja fibrinskog ugruška. Primeri takvih poremećaja uključuju hemofiliju. Tri glavna oblika su hemofilija A (nedostatak Faktora VIII), hemofilija B (nedostatak faktora IX ili „božićna bolest“) i hemofilija C (nedostatak Faktora XI, blaga tendencija krvarenja). Ostali hemostatski poremećaji uključuju, npr., fon Vilebrandovu bolest, nedostatak Faktora XI (nedostatak PTA), nedostatak Faktora XII, nedostatke ili strukturne abnormalnosti u fibrinogenu, protrombinu, Faktoru V, Faktoru VII, Faktoru X ili Faktoru XIII, Bernard-Soulierov sindrom, koji je defekt ili nedostatak GPIb. GPIb, receptor za VWF, može biti neispravan i dovesti do nedostatka primarnog stvaranja ugrušaka (primarna hemostaza) i povećane tendencije krvarenja) i trombastenije Glanzmana i Naegelija (Glanzmanova trombastenija). Kod otkazivanja jetre (akutni i hronični oblici), nedovoljna je proizvodnja faktora koagulacije u jetri; ovo može povećati rizik od krvarenja.

[0068] Izolovani molekuli nukleinske kiseline ili polipeptidi prema pronalasku mogu se koristiti profilaktički. Kako se ovde koristi, izraz „profilaktički tretman“ odnosi se na

2

primenu molekula pre epizode krvarenja. U jednom aspektu, pacijent kom je potreban opšti hemostatski agens prolazi ili će biti podvrgnut operaciji. Himerni protein prema pronalasku može se primenjivati pre ili posle operacije kao profilaktički lek. Himerni protein prema pronalasku može se primenjivati tokom ili posle operacije za kontrolu epizode akutnog krvarenja. Operacija može da uključuje, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre, stomatološke zahvate ili transplantaciju matičnih ćelija.

[0069] Izolovani molekuli nukleinske kiseline i polipeptidi pronalaska se takođe koriste za tertman na zahtev. Izraz „tretman na zahtev“ odnosi se na primenu izolovanog molekula nukleinske kiseline ili polipeptida kao odgovor na simptome epizode krvarenja ili pre aktivnosti koja može izazvati krvarenje. U jednom aspektu, tretman na zahtev može se primeniti pacijentu kada započinje krvarenje, kao što je posle povrede ili kada se očekuje krvarenje, kao pre operacije. U drugom aspektu, tretman na zahtev može se primeniti pre aktivnosti koje povećavaju rizik od krvarenja, kao što su kontaktni sportovi.

[0070] Kako se ovde koristi, izraz „akutno krvarenje“ odnosi se na epizodu krvarenja bez obzira na osnovni uzrok. Na primer, pacijent može imati traumu, uremiju, nasledni poremećaj krvarenja (npr., nedostatak Faktora VII) poremećaj trombocita ili otpornost usled razvoja antitela na faktore zgrušavanja.

[0071] Tretirati, tretman, tretiranje, kako se ovde koristi, odnosi se na, npr., smanjenje ozbiljnosti bolesti ili stanja; smanjenje trajanja toka bolesti; poboljšanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem; pružanje blagotvornih efekata na pacijenta sa bolešću ili stanjem, bez nužnog izlečenja bolesti ili stanja, ili profilaksu jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem. U jednom otelotvorenju, izraz „tretiranje“ ili „tretman“ označava održavanje FVIII na nivou od najmanje oko 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, ili 20 IU/dL kod pacijenta primenom izolovanog molekula nukleinske kiseline ili polipeptida prema pronalasku. U još jednom otelotvorenju, tretiranje ili tretman označava održavanje FVIII na nivou između oko 1 i oko 20 IU/dL, oko 2 i oko 20 IU/dL, oko 3 i oko 20 IU/dL, oko 4 i oko 20 IU/dL oko 5 i oko 20 IU/dL, oko 6 i oko 20 IU/dL, oko 7 i oko 20 IU/dL, oko 8 i oko 20 IU/dL, oko 9 i oko 20 IU/dL, ili oko 10 i oko 20 IU/dL. Tretiranje ili tretman bolesti ili stanja takođe može uključivati održavanje aktivnosti FVIII kod pacijenta na nivou uporedivom sa najmanje oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ili 20% aktivnosti FVIII kod nehemofiličkog pacijenta. Minimalni nivo potreban za tretiranje može se meriti jednim ili više poznatih postupaka i može se prilagoditi (povećati ili smanjiti) za svaku osobu.

[0072] „Primena“, kako se ovde koristi, označava primenu farmaceutski prihvatljivog polipeptida Faktora VIII prema pronalasku pacijentu putem farmaceutski prihvatljivog puta. Načini primene mogu biti intravenski, npr., intravenska injekcija i intravenska infuzija.

Dodatni putevi primene uključuju, npr., subkutanu, intramuskularnu, oralnu, nazalnu i plućnu primenu. Himerni polipeptidi i hibridni proteini mogu se primenjivati kao deo farmaceutskog sastava koji sadrži najmanje jedan pomoćni sastojak.

[0073] Kako se ovde koristi, izraz „pacijent koji ima potrebu za tim“ uključuje pacijente, poput pacijenta sisara, koji bi imali koristi od primene molekula nukleinske kiseline ili polipeptida prema pronalasku, npr., za poboljšanje hemostaze. U jednom aspektu, pacijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, osobe sa hemofilijom. U još jednom otelotvorenju, pacijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, pojedince koji su razvili FVIII inhibitor i zbog toga im je potrebna bajpas terapija. Pacijent može biti odrasla ili maloletna osoba (npr., mlađi od 12 godina).

[0074] Kako se ovde koristi, izraz „faktor zgrušavanja“ odnosi se na molekule ili njihove analoge koji se prirodno javljaju ili proizvode rekombinantno, i koji sprečavaju ili smanjuju trajanje epizode krvarenja kod pacijenta. Drugim rečima, to označava molekule koji imaju prokoagulacionu aktivnost, tj., odgovorni su za pretvaranje fibrinogena u mrežu nerastvorljivog fibrina zbog čega se krv zgrušava ili koagulira. „Faktor zgrušavanja koji se može aktivirati“ je faktor zgrušavanja u neaktivnom obliku (npr., u svom zimogenom obliku) koji je sposoban da se pretvori u aktivni oblik.

[0075] Aktivnost zgrušavanja, kako se ovde koristi, znači sposobnost učešća u kaskadi biohemijskih reakcija koja kulminira stvaranjem fibrinskog ugruška i/ili smanjuje ozbiljnost, trajanje ili učestalost epizode krvarenja ili hemoragije.

[0076] Kako se ovde koristi, izrazi „heterologni“ ili „egzogeni“ odnose se na takve molekule koji se obično ne nalaze u datom kontekstu, npr., u ćeliji ili u polipeptidu. Na primer, egzogeni ili heterologni molekul se može uvesti u ćeliju i prisutan je samo nakon manipulacije ćelijom, npr., transfekcijom ili drugim oblicima genetskog inženjeringa ili heterologna aminokiselinska sekvenca može biti prisutna u proteinu u kome se prirodno ne nalazi.

[0077] Kako se ovde koristi, izraz „heterologna nukleotidna sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se prirodno ne javlja sa datom polinukleotidnom sekvencom. U jednom otelotvorenju, heterologna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid sposoban da produži polu-život od FVIII. U još jednom otelotvorenju, heterologna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji povećava hidrodinamički poluprečnik FVIII. U drugim otelotvorenjima, heterologna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji poboljšava jedno ili više farmakokinetičkih svojstava FVIII bez značajnog uticaja na njegovu biološku aktivnost ili funkciju (npr., njegova prokoagulantna aktivnost). U nekim otelotvorenjima, FVIII je vezan za ili spojen sa polipeptidom kodiranim heterolognom nukleotidnom sekvencom pomoću veznika. Neograničavajući primeri polipeptidnih delova kodiranih heterolognim nukleotidnim sekvencama uključuju konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, albumin ili njegov fragment, ostatak koji vezuje albumin, transferin, PAS polipeptide iz SAD patentne prijave br.20100292130, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment, C-terminalni peptid (CTP) od β podjedinice ljudskog horionskog gonadotropina, mali molekul koji vezuje albumin, XTEN sekvencu, ostatke koji vezuju FcRn (npr., kompletni Fc regioni ili njihovi FcRn vezujući delovi), jednolančane Fc regione (ScFc regioni, npr., kako je opisano u US 2008/0260738, WO 2008/012543, ili WO 2008/1439545), poliglicin veznike, poliserin veznike, peptide i kratke polipeptide od 6-40 aminokiselina dve vrste aminokiselina izabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) sa različitim stepenima sekundarne strukture između manje od 50% do više od 50%, između ostalog, ili dve ili više njihovih kombinacija. U nekim otelotvorenjima, polipeptid kodiran heterolognom nukleotidnom sekvencom povezan je sa nepolipeptidnim delom.

Neograničavajući primeri ne-polipeptidnih delova uključuju polietilen glikol (PEG), male molekule koji vezuju albumin, polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njihov derivat ili bilo koje njihove kombinacije.

[0078] Kako se ovde koristi, izraz „Fc region“ je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu nativnog Ig, tj. kako je nastalo dimernim povezivanjem odgovarajućih Fc domena njegova dva teška lanca. Nativni Fc region obrazuje homodimer sa drugim Fc regionom.

2

Suprotno tome, izraz „genetski fuzionisan Fc region“ ili „jednolančani Fc region“ (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region koji se sastoji od Fc domena genetski povezanih u jednom polipeptidnom lancu (tj. kodirano u jednom susednom genetskom nizu).

[0079] U jednom otelotvorenju, „Fc region“ odnosi se na deo pojedinačni teški lanac Ig koji počinje u zglobnom regionu neposredno uzvodno od mesta razdvajanja papaina (tj. ostatak 216 u IgG, uzimajući prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca kao 114) i završava se na C-terminusu antitela. Shodno tome, kompletni Fc domen sadrži najmanje zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen.

[0080] Fc region Ig konstantnog regiona, u zavisnosti od Ig izotipa, može uključivati CH2, CH3 i CH4 domene, kao i zglobni region. Himerni proteini koji sadrže Fc region od Ig pružaju nekoliko poželjnih svojstava himernom proteinu, uključujući povećanu stabilnost, povećani polu-život u serumu (pogledati Capon i dr., 1989, Nature 337:525), kao i vezivanje za Fc receptore kao što je neonatalni Fc receptor (FcRn) (SAD patent br.6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).

[0081] „Referentna nukleotidna sekvenca“, kada se ovde koristi kao poređenje sa nukleotidnom sekvencom pronalaska, je polinukleotidna sekvenca koja je u suštini identična nukleotidnoj sekvenci pronalaska, s tim što delovi koji odgovaraju FVIII sekvenci nisu optimizovani. Na primer, referentna nukleotidna sekvenca za molekul nukleinske kiseline koja se sastoji od kodonski optimizovanog BDD FVIII iz SEQ ID NO: 1 i heterologne nukleotidne sekvence koja kodira jednolančani Fc region povezan sa SEQ ID NO: 1 na svom 3' terminusu je molekul nukleinske kiseline koji se sastoji od originalnog (ili „matičnog“) BDD FVIII od SEQ ID NO: 3 i identične heterologne nukleotidne sekvence koja kodira jednolančani Fc region povezan sa SEQ ID NO: 3 na svom 3' terminusu.

[0082] „Indeks adaptacije kodona“, kako se ovde koristi, odnosi se na meru sklonosti upotrebe kodona. Indeks adaptacije kodona (CAI) meri odstupanje date sekvence gena koja kodira protein u odnosu na referentni skup gena (Sharp PM i Li WH, Nucleic Acids Res. 15(3):1281-95 (1987)). CAI se izračunava određivanjem geometrijske sredine težine povezane sa svakim kodonom preko dužine sekvence gena (mereno u kodonima):

[0083] Za svaku aminokiselinu, težina svakog od njenih kodona, u CAI, izračunava se kao odnos između posmatrane frekvencije kodona (fi) i frekvencije sinonimnog kodona (fj) za tu aminokiselinu:

Formula 2:

[0084] Kako se ovde koristi, izraz „optimizovan“, u smislu nukleotidnih sekvenci, odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid, gde je polinukleotidna sekvenca mutirana da poboljša svojstvo te polinukleotidne sekvence. U nekim otelotvorenjima, optimizacija se vrši radi povećanja nivoa transkripcije, povećanja nivoa translacije, povećanja nivoa mRNK u stanju ravnoteže, povećanja ili smanjenja vezivanja regulatornih proteina kao što su opšti faktori transkripcije, povećanja ili smanjenja splajsovanja ili povećanja prinosa polipeptida proizvedenih polinukleotidnom sekvencom. Primeri promena koje se mogu napraviti na polinukleotidnoj sekvenci radi njene optimizacije uključuju optimizaciju kodona, optimizaciju sadržaja GC, uklanjanje ponavljajućih sekvenci, uklanjanje AT bogatih elemenata, uklanjanje kriptičnih mesta splajsovanja, uklanjanje cis-delujućih elemenata koji potiskuju transkripciju ili translaciju, dodavanje ili uklanjanje poli-T ili poli-A sekvenci, dodavanje sekvenci oko mesta početka transkripcije koje pojačavaju transkripciju, kao što su Kozak konsenzus sekvence, uklanjanje sekvenci koje bi mogle da formiraju strukture matične petlje, uklanjanje destabilizujućih sekvenci, i dve ili više njihovih kombinacija.

[0085] Predmetni pronalazak je usmeren na optimizovane sekvence Faktora VIII, vektore i ćelije domaćina koji sadrže optimizovane sekvence Faktora VIII, i postupke za proizvodnju polipeptida kodiranih optimizovanim sekvencama Faktora VIII. Predmetni pronalazak je takođe usmeren na postupke tretmana poremećaja krvarenja, kao što je hemofilija, koji uključuju primenu pacijentu optimizovane sekvence nukleinske kiseline Faktora VIII.

Predmetni pronalazak zadovoljava važnu potrebu u struci pružanjem optimizovanih sekvenci Faktora VIII koje pokazuju povećano eksprimiranje u ćelijama domaćina, poboljšan prinos proteina Faktora VIII u postupcima za proizvodnju rekombinantnog Faktora VIII i

2

potencijalno rezultuju većom terapijskom efikasnošću kada se koristi u postupcima genske terapije.

[0086] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII (FVIII), gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca je najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO: 1 i kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću. U još nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca sadrži SEQ ID NO: 1.

[0087] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO: 2 i kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću. U još nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca sadrži SEQ ID NO: 2.

[0088] SEQ ID NO: 1 i 2 su optimizovane verzije SEQ ID NO: 3, početne ili „matične“ FVIII nukleotidne sekvence. SEQ ID NO: 3 kodira ljudski FVIII za izbrisanim B domenom. Iako su SEQ ID NO: 1 i 2 izvedeni iz specifičnog oblika FVIII za izbrisanim B domenom (SEQ ID NO: 3), treba razumeti da je predmetni pronalazak takođe usmeren na optimizovane verzije nukleinskih kiselina koje kodiraju druge verzije FVIII. Na primer, druga verzija FVIII može da sadrži FVIII pune dužine, druge brisanja B domena od FVIII (opisana u nastavku) ili druge fragmente FVIII koji zadržavaju FVIII aktivnost.

[0089] „Polipeptid sa FVIII aktivnošću“, kako se ovde koristi, označava funkcionalni FVIII polipeptid u svojoj normalnoj ulozi u koagulaciji, ukoliko nije drugačije naznačeno. Izraz polipeptid sa FVIII aktivnošću uključuje njegov funkcionalni fragment, varijantu, analog ili derivat koji zadržava funkciju divljeg tipa Faktora VIII pune dužine u putu koagulacije.

„Polipeptid sa FVIII aktivnošću“ koristi se naizmenično sa FVIII proteinom, FVIII polipeptidom ili FVIII. Primeri funkcija FVIII uključuju, ali nisu ograničeni na, sposobnost aktiviranja koagulacije, sposobnost delovanja kao kofaktor za Faktor IX ili sposobnost formiranja kompleksa tenaze sa Faktorom IX u prisustvu Ca2+ i fosfolipida, koji zatim

2

pretvara Faktor X u aktivirani oblik Xa. U jednom otelotvorenju, polipeptid koji ima FVIII aktivnost sadrži dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji ima FVIII teški lanac i drugi lanac koji ima FVIII laki lanac. U još jednom otelotvorenju, polipeptid koji ima FVIII aktivnost je jednolančani FVIII. Jednolančani FVIII može sadržati jednu ili više mutacija ili supstitucija na aminokiselinskom ostatku 1645 i/ili 1648, koji odgovaraju zreloj FVIII sekvenci.

Pogledati Međunarodnu prijavu br. PCT/US201 2/045784. FVIII protein može biti ljudski, svinjski, pseći, pacovski ili mišji FVIII protein. Pored toga, poređenjem FVIII od ljudi i drugih vrsta utvrđeni su očuvani ostaci koji će verovatno biti potrebni za funkcionisanje (Cameron i dr., Thromb. Haemost.79:317-22 (1998); US 6,251,632).

[0090] „B domen“ FVIII, kako se ovde koristi, isti je kao i B domen poznat u struci, koji je definisan unutrašnjom identičnošću aminokiselinske sekvence i mestima proteolitičkog razdvajanja trombinom, npr., ostaci Ser741-Arg1648 od ljudskog FVIII pune dužine. Ostali ljudski FVIII domeni su definisani narednim aminokiselinskim ostacima: A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Ile2032; C1, ostaci Arg2033-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. Sekvenca A3-C1-C2 uključuje ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostala sekvenca, ostaci Glu1649-Arg1689, obično se naziva FVIII peptidom za aktiviranje lakog lanca. Lokacije granica za sve domene, uključujući B domene, za svinjske, mišje i pseće FVIII takođe su poznate u struci. Primer BDD FVIII je REFACTO® rekombinantni BDD FVIII (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.).

[0091] „FVIII sa izbrisanim B domenom“ može imati potpuna ili delimična brisanja obelodanjena u SAD patentima br.6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, i 6,458,563. U nekim otelotvorenjima, sekvenca FVIII sa izbrisanim B domenom predmetnog pronalaska sadrži bilo koje od brisanja obelodanjenih u kol.4, red 4 do kol.5, red 28 i primerima 1-5 od SAD patenta br.6,316,226 (takođe u US 6,346,513). U nekim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom predmetnog pronalaska ima brisanje obelodanjeno u kol.2, redovi 26-51 i primeri 5-8 od SAD patenta br.5,789,203 (takođe US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620). U nekim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom ima brisanje obelodanjeno u kol.1, redovi 25 do kol.2, red 40 od SAD patenta br.

5,972,885; kol.6, redovi 1-22 i primeru 1 od SAD patenta br.6,048,720; kol.2, redovi 17-46 od SAD patenta br.5,543,502; kol.4, red 22 do kol.5, red 36 od SAD patenta br.5,171,844; kol. 2, redovi 55-68, na slici 2, i primeru 1 od SAD patenta br.5,112,950; kol.2, red 2 do kol.

2

19, red 21 i table 2 od SAD patenta br.4,868,112; kol.2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol.7, red 43 do kol.8, red 26, i kol.11, red 5 do kol.13, red 39 od SAD patenta br.7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53, od SAD patenta br.6,458,563. U nekim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom ima brisanje većeg dela B domena, ali i dalje sadrži amino-terminalne sekvence B domena koje su od suštinske važnosti za in vivo proteolitičku obrada primarnog proizvoda translacije u dva polipeptidna lanca, kako je obelodanjeno u WO 91/9122. U nekim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom je konstruisan sa brisanjem aminokiselina 747-1638, tj. praktično potpuno brisanje B domena. Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). FVIII sa izbrisanim B domenom takođe može sadržati brisanje aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 FVIII. Meulien P., i dr. Protein Eng.2(4): 301-6 (1988). Dodatna brisanja domena B koja su deo pronalaska uključuju, npr.,: brisanje aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, i dr.

Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT objavljena prijava br. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, i dr., DNA (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava No.88/00831)), 816 do 1598 ili 741 do 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)). Svako od prethodnih brisanja može se izvršiti u bilo kojoj FVIII sekvenci.

[0092] Brojni funkcionalni molekuli FVIII, uključujući brisanja B-domena, obelodanjeni su u narednim patentima US 6,316,226 i US 6,346,513, oba dodeljena Baxter; US 7,041,635 dodeljen In2Gen; US 5,789,203, US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620 dodeljen Chiron; US 5,972,885 i US 6,048,720 dodeljen Biovitrum, US 5,543,502 i US 5,610,278 dodeljen Novo Nordisk; US 5,171,844 dodeljen Immuno Ag; US 5,112,950 dodeljen Transgene S.A.; US 4,868,112 dodeljen Genetics Institute.

Optimizacija kodona

[0093] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je sekvenca nukleinske kiseline kodonski optimizovana. U još jednom otelotvorenju, početna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je predmet optimizacije kodona je SEQ ID NO: 3. U nekim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću je kodonski optimizovana za ljudsko eksprimiranje. U drugim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću je kodonski

2

optimizovana za eksprimiranje kod miševa. SEQ ID NO: 1 i 2 su kodonski optimizovane verzije SEQ ID NO: 3, optimizovane za ljudsko eksprimiranje.

[0094] Izraz „kodonski optimizovan“, budući da se odnosi na gene ili kodirajuće regione molekula nukleinske kiseline za transformaciju različitih domaćina, odnosi se na promenu kodona u genu ili kodirajućim regionima molekula nukleinske kiseline kako bi odrazila tipična upotrebu kodona u organizmu domaćinu bez promene polipeptida kodiranog od strane DNK. Takva optimizacija uključuje zamenu najmanje jednog, ili više njih, ili značajnog broja kodona sa jednim ili više kodona koji se češće koriste u genima tog organizma.

[0095] Odstupanja u nukleotidnoj sekvenci koja sadrži kodone koji kodiraju aminokiseline bilo kog polipeptidnog lanca omogućavaju varijacije u sekvenci koja kodira gen. Budući da se svaki kodon sastoji od tri nukleotida, i nukleotidi koji sadrže DNK su ograničeni na četiri specifične baze, postoje 64 moguće kombinacije nukleotida, od kojih 61 kodira aminokiseline (preostala tri kodona kodiraju signale koji završavaju translaciju). „Genetski kod“ koji pokazuje koji kodoni kodiraju koje aminokiseline su ovde reprodukovani kao Tabela 1. Kao rezultat toga, mnoge aminokiseline su označene sa više od jednog kodona. Na primer, aminokiseline alanin i prolin kodiraju se sa četiri tripleta, serin i arginin sa šest, dok su triptofan i metionin kodirani sa samo jednim tripletom. Ova degeneracija omogućava da sastav DNK baze varira u širokom rasponu, ne menjajući aminokiselinsku sekvencu proteina kodiranih od strane DNK.

Tabela 1. Standardni genetski kod

2

[0096] Mnogi organizmi pokazuju pristrasnost za upotrebu određenih kodona za kodiranje umetanja određene aminokiseline u rastući peptidni lanac. Preferencije kodona ili pristrasnost kodona, razlike u upotrebi kodona među organizmima, pruženi su degeneracijom genetskog koda i dobro su dokumentovani među mnogim organizmima. Kodonska sklonost često korelira sa efikasnošću translacije mesindžer RNK (mRNK), za koju se, za uzvrat, veruje da zavisi od, između ostalog, svojstva kodona koji se prevodi i dostupnosti određenih molekula prenosne RNK (tRNK). Prevladavanje odabranih tRNK u ćeliji je generalno odraz kodona koji se najčešće koriste u sintezi peptida. Shodno tome, geni se mogu prilagoditi za optimalno eksprimiranje gena u datom organizmu na osnovu optimizacije kodona.

[0097] S obzirom na veliki broj genskih sekvenci dostupnih za širok spektar životinjskih, biljnih i mikrobnih vrsta, izračunate su relativne učestalosti upotrebe kodona. Tabele upotrebe kodona dostupne su, na primer, u „Codon Usage Database“ koja je dostupna na www.kazusa.or.jp/codon/ (posećeno 18. juna 2012). Pogledati Nakamura, Y., i dr. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000).

[0098] Nasumično dodeljivanje kodona na optimizovanoj frekvenciji za kodiranje date polipeptidne sekvence može se izvršiti ručno izračunavanjem frekvencija kodona za svaku aminokiselinu, i zatim nasumičnim dodeljivanjem kodona polipeptidnoj sekvenci. Pored toga, različiti algoritmi i računarski programi mogu se koristiti za izračunavanje optimalne sekvence.

[0099] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde je indeks adaptacije ljudskog kodona povećan u odnosu na SEQ ID NO: 3. Na primer, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 može imati indeks adaptacije ljudskog kodona koji je najmanje oko 0,75, najmanje oko 0,76, najmanje oko 0,77, najmanje oko 0,78, najmanje oko 0,79, najmanje oko 0,80, najmanje oko 0,81, najmanje oko 0,82, najmanje oko 0,83, najmanje oko 0,84, najmanje oko 0,85, najmanje oko 0,86, najmanje oko 0,87, najmanje oko 0,88, najmanje oko 0,89 ili najmanje oko 0,90.

[0100] U još jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII (FVIII), gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde je ljudski indeks adaptacije kodona povećan u odnosu na SEQ ID NO: 3. Na primer, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 2 može imati indeks adaptacije ljudskog kodona koji je najmanje oko 0,75, najmanje oko 0,76, najmanje oko 0,77, najmanje oko 0,78, najmanje oko 0,79, najmanje oko 0,80, najmanje oko 0,81, najmanje oko 0,82, najmanje oko 0,83, najmanje oko 0,84, najmanje oko 0,85, najmanje oko 0,86, najmanje oko 0,87, najmanje oko 0,88, najmanje oko 0,89 ili najmanje oko 0,90.

[0101] U drugim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 i ima jednu ili više narednih karakteristika: (1) nukleotidna sekvenca sadrži veći procenat G/C nukleotida u poređenju sa SEQ ID NO: 3, (2) nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci u poređenju sa SEQ ID NO: 3, (3) nukleotid sekvenca ne sadrži mesto splajsovanja GGTGAT, (4) nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata, (5) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-T sekvencu, (6) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-A sekvencu, (7) nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije kodona koji je povećan u odnosu na SEQ ID NO: 3 ili kombinaciju dve ili više takvih karakteristika. U određenom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca sadrži sve karakteristike (1) do (6).

[0102] U drugim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 i ima jednu ili više

1

narednih karakteristika: (1) nukleotidna sekvenca sadrži veći procenat G/C nukleotida u poređenju sa SEQ ID NO: 3, (2) nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci, (3) nukleotidna sekvenca ne sadrži mesto splajsovanja GGTGAT, (4) nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata, (5) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-T sekvencu, (6) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-A sekvencu, (7) nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije kodona koji je povećan u odnosu na SEQ ID NO: 3 ili kombinacija dve ili više takvih karakteristika. U određenom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca sadrži sve karakteristike (1) do (6).

Optimizacija G/C sadržaja

[0103] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca sadrži viši procenat G/C nukleotida u poređenju sa procentom G/C nukleotida u SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 ima sadržaj G/C koji je najmanje oko 45%, najmanje oko 46%, najmanje oko 47%, najmanje oko 48%, najmanje oko 49%, najmanje oko 50%, najmanje oko 51%, najmanje oko 52%, najmanje oko 53%, najmanje oko 54% ili najmanje oko 55%.

[0104] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca sadrži viši procenat G/C nukleotida u poređenju sa procentom G/C nukleotida u SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 ima sadržaj G/C koji je najmanje oko 45%, najmanje oko 46%, najmanje oko 47%, najmanje oko 48%, najmanje oko 49%, najmanje oko 50%, najmanje oko 51%, najmanje oko 52%, najmanje oko 53%, najmanje oko 54% ili najmanje oko 55%.

[0105] „Sadržaj G/C“ (ili sadržaj gvanin-citozina), ili „procenat G/C nukleotida“, odnosi se na procenat azotnih baza u molekulu DNK koje su ili gvanin ili citozin. Sadržaj GC može se izračunati pomoću naredne formule:

2

[0106] Ljudski geni su visoko heterogeni u svom sadržaju G/C, s tim što neki geni imaju sadržaj G/C i do 20%, i drugi geni imaju sadržaj G/C i do 95%. Generalno, GC bogati geni su snažnije eksprimirani. U stvari, pokazano je da povećanje sadržaja G/C u genu može dovesti do povećanog eksprimiranja gena, uglavnom zbog povećanja transkripcije i viših nivoa mRNK u stanju ravnoteže. Pogledati Kudla i dr., PLoS Biol., 4(6): e180 (2006).

Sekvence nalik regionu vezivanja matrica

[0107] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 sadrži najviše 6, najviše 5, najviše 4, najviše 3 ili najviše 2 MARS/ARS sekvence. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 sadrži najviše 1 MARS/ARS sekvencu. U još jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 ne sadrži MARS/ARS sekvencu.

[0108] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 sadrži najviše 6, najviše 5, najviše 4, najviše 3 ili najviše 2 MARS/ARS sekvence. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 sadrži najviše 1 MARS/ARS sekvencu. U još jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 ne sadrži MARS/ARS sekvencu.

[0109] Elementi bogati sa AT u ljudskoj FVIII nukleotidnoj sekvenci koji dele sličnost sekvence sa Saccharomyces cerevisiae identifikovane su autonomno replicirajuće sekvence (ARS) i regioni vezivanja nuklearne matrice (MAR). (Fallux i dr., Mol. Cell. Biol.16:4264-4272 (1996). Pokazano je da jedan od ovih elemenata vezuje nuklearne faktore in vitro i da potiskuje eksprimiranje reporter gena hloramfenikol acetiltransferaze (CAT). Id.

Pretpostavljeno je da ove sekvence mogu doprineti transkripcionom potiskivanju ljudskog gena FVIII. Prema tome, u jednom otelotvorenju, sve MAR/ARS sekvence su ukinute u FVIII genu predmetnog pronalaska. Postoje četiri MAR/ARS ATATTT sekvence (SEQ ID NO: 5) i tri MAR/ARS AAATAT sekvence (SEQ ID NO: 6) u roditeljskoj FVIII sekvenci (SEQ ID NO: 3). Sva ova mesta su mutirana da unište MAR/ARS sekvence u optimizovanim FVIII sekvencama (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2). Lokacija svakog od ovih elemenata i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u tabeli 2, dole.

Tabela 2: Sažetak promena u represivnim elementima

4

Destabilizujuće sekvence

[0110] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6 ili najviše 5 destabilizujućih elemenata. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 destabilizujući element. U još jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 ne sadrži destabilizujući element.

[0111] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6 ili najviše 5 destabilizujućih elemenata. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 destabilizujući element. U još jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 2 ne sadrži destabilizujući element.

[0112] Postoji deset destabilizujućih elemenata u roditeljskoj FVIII sekvenci (SEQ ID NO: 3); šest ATTTA sekvenci (SEQ ID NO: 8) i četiri TAAAT sekvence (SEQ ID NO: 9). U jednom otelotvorenju, sekvence ovih mesta su mutirane da unište destabilizujuće elemente u optimizovanim FVIII SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Lokacija svakog od ovih elemenata i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u Tabeli 2.

Potencijalna mesta za vezivanje promotera

[0113] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca sadrži manje potencijalnih mesta za vezivanje promotera u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99 % ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1 sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6 ili najviše 5 potencijalnih mesta za vezivanje promotera. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99 % ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1 sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 potencijalno mesto za vezivanje promotera. U još nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja iznosi najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1 ne sadrži potencijalno mesto za vezivanje promotera.

[0114] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca sadrži manje potencijalnih mesta za vezivanje promotera u odnosu na SEQ ID NO: 3. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2 sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6 ili najviše 5 potencijalnih mesta za vezivanje promotera. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2 sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 potencijalna mesta za vezivanje promotera. U još drugih otelotvorenja, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću i koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2 ne sadrži potencijalno mesto za vezivanje promotera.

[0115] TATA kutije su regulatorne sekvence koje se često nalaze u promoterskim regionima eukariota. Oni služe kao mesto vezivanja TATA vezujućeg proteina (TBP), opšteg faktora transkripcije. TATA kutije obično sadrže TATAAA sekvencu (SEQ ID NO: 12) ili blisku varijantu. TATA kutije unutar kodirajuće sekvence, međutim, mogu inhibirati translaciju proteina pune dužine. Postoji deset potencijalnih sekvenci za vezivanje promotera u divljem tipu BDD FVIII sekvence (SEQ ID NO: 3); pet TATAA sekvenci (SEQ ID NO: 12) i pet TTATA sekvenci (SEQ ID NO: 13). U jednom otelotvorenju, sva mesta za vezivanje promotera su ukinuta u genima FVIII predmetnog pronalaska. Lokacija svakog potencijalnog mesta vezivanja promotera i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u Tabeli 2.

Ostali Cis delujući negativni regulatorni elementi

[0116] Pored gore opisanih MAR/ARS sekvenci, destabilizujućih elemenata i potencijalnih promoterskih mesta, nekoliko dodatnih potencijalno inhibitornih sekvenci može se identifikovati u divljem tipu BDD FVIII sekvence (SEQ ID NO: 3). Mogu se identifikovati dva elementa sekvence bogata sa AU (ARE) (SEQ ID NO: 14 i 15), zajedno sa poli-A mestom (SEQ ID NO: 11), poli-T mestom (SEQ ID NO: 10) i mestom splajsovanja (SEQ ID NO: 7) u divljem tipu BDD FVIII sekvence. Jedan ili više ovih elemenata može se ukloniti iz optimizovanih FVIII sekvenci. Lokacija svakog od ovih mesta i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u Tabeli 2.

[0117] U određenim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1, gde nukleotidna sekvenca ne sadrži jedan ili više cis-negativnih regulatornih elemenata, na primer mesto splajsovanja, poli-T sekvencu, poli-A sekvencu, ARE sekvencu ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0118] U određenim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2, gde nukleotidna sekvenca ne sadrži jedan ili više cis delujućih negativnih regulatornih elemenata, na primer, mesto splajsovanja, poli-T sekvencu, poli-A sekvencu, ARE sekvencu ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0119] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži mesto splajsovanja GGTGAT (SEQ ID NO: 7). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-T sekvencu (SEQ ID NO: 10). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-A sekvencu (SEQ ID NO: 11). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži ARE element (SEQ ID NO: 14 ili SEQ ID NO: 15).

[0120] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži mesto splajsovanja GGTGAT (SEQ ID NO: 7). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-T sekvencu (SEQ ID NO: 10). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-A sekvencu (SEQ ID NO: 11). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, gde je nukleotidna sekvenca najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2, i gde nukleotidna sekvenca ne sadrži ARE element (SEQ ID NO: 14 ili SEQ ID NO: 15).

[0121] U drugim otelotvorenjima, optimizovana FVIII sekvenca pronalaska ne sadrži jedan ili više antivirusnih motiva, stabljika-petlja struktura i ponavljajuće sekvence.

[0122] U još nekim otelotvorenjima, nukleotidi koji okružuju početno mesto transkripcije se menjaju u kozak konsenzus sekvencu (GCCGCCACCATGC, gde su podvučeni nukleotidi početni kodon; SEQ ID NO: 16). U drugim otelotvorenjima, restrikciona mesta se mogu dodati ili ukloniti kako bi se olakšao proces kloniranja.

Heterologne nukleotidne sekvence

[0123] U nekim otelotvorenjima, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrže heterolognu nukleotidnu sekvencu. U nekim otelotvorenjima, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrže najmanje jednu heterolognu nukleotidnu sekvencu. Heterologna nukleotidna sekvenca može se povezati sa optimizovanim BDD-FVIII nukleotidnim sekvencama pronalaska na 5' terminusu, na 3' terminusu ili ubaciti u sredinu optimizovane BDD-FVIII nukleotidne sekvence. Dakle, u nekim otelotvorenjima, heterologna aminokiselinska sekvenca kodirana heterolognom nukleotidnom sekvencom povezana je sa N-terminusem ili C-terminusom FVIII aminokiselinske sekvence kodirane nukleotidnom sekvencom ili umetnute između dve aminokiseline u FVIII aminokiselinskoj sekvenci. U drugim otelotvorenjima, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrže dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam heterolognih nukleotidnih sekvenci. U nekim otelotvorenjima, sve heterologne nukleotidne sekvence su identične. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna heterologna nukleotidna sekvenca se razlikuje od ostalih heterolognih nukleotidnih sekvenci. U nekim otelotvorenjima, pronalazak može da sadrži dve, tri, četiri, pet, šest ili više od sedam heterolognih nukleotidnih sekvenci u tandemu.

[0124] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleotidna sekvenca kodira aminokiselinsku sekvencu. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska sekvenca kodirana heterolognom nukleotidnom sekvencom je heterologni deo koji može povećati polu-život („produživač polu-života“) FVIII molekula.

[0125] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo je peptid ili polipeptid ili sa nestrukturiranim ili strukturiranim karakteristikama koje su povezane sa produženjem in vivo polu-života kada je ugrađen u protein prema pronalasku. Neograničavajući primeri uključuju

4

albumin, fragmente albumina, Fc fragmente imunoglobulina, C-terminalni peptid (CTP) od β podjedinice ljudskog horionskog gonadotropina, HAP sekvencu, XTEN sekvencu, transferin ili njegov fragment, PAS polipeptid, poliglicin veznike, poliserinske veznike, delove koji vezuju albumin, ili bilo koje fragmente, derivate, varijante ili kombinacije ovih polipeptida. U nekim aspektima, heterologni deo uključuje fon Vilebrandov faktor ili njegov fragment. U ostalim srodnim aspektima, heterologni deo može da sadrži mesto vezivanja (npr., cistein aminokiselina) za nepolipeptidni deo kao što je polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), polisijalna kiselina ili bilo koji derivati, varijante ili kombinacije ovih elemenata. U nekim aspektima, heterologni deo sadrži cisteinsku aminokiselinu koja funkcioniše kao mesto vezivanja za nepolipeptidni deo kao što je polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), polisijalna kiselina ili bilo koji derivati, varijante ili kombinacije ovih elemenata.

[0126] U jednom specifičnom otelotvorenju, prva heterologna nukleotidna sekvenca kodira prvi heterologni deo koji je molekul koji produžava polu-život poznat u struci, i druga heterologna nukleotidna sekvenca kodira drugi heterologni deo koji takođe može da biti molekul koji produžava polu-život koji je poznat u struci. U određenim otelotvorenjima, prvi heterologni deo (npr., prvi Fc deo) i drugi heterologni deo (npr., drugi Fc deo) su međusobno povezani kako bi formirali dimer. U jednom otelotvorenju, drugi heterologni deo je drugi Fc deo, gde je drugi Fc deo vezan ili povezan sa prvim heterolognim delom, npr., prvim Fc delom. Na primer, drugi heterologni deo (npr., drugi Fc deo) može biti vezan sa prvim heterolognim delom (npr., prvi Fc deo) veznikom ili vezan sa prvim heterolognim delom kovalentnom ili nekovalentnom vezom.

[0127] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo je polipeptid koji sadrži, značajno se sastoji ili se sastoji od najmanje oko 10, najmanje oko 100, najmanje oko 200, najmanje oko 300, najmanje oko 400, najmanje oko 500, najmanje oko 600, najmanje oko 700, najmanje oko 800, najmanje oko 900, najmanje oko 1000, najmanje oko 1100, najmanje oko 1200, najmanje oko 1300, najmanje oko 1400, najmanje oko 1500, najmanje oko 1600, najmanje oko 1700, najmanje oko 1800, najmanje oko 1900, najmanje oko 2000, najmanje oko 2500, najmanje oko 3000, ili najmanje oko 4000 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, heterologni deo je polipeptid koji sadrži, značajno se sastoji ili se sastoji od oko 100 do oko 200 aminokiselina, oko 200 do oko 300 aminokiselina, oko 300 do oko 400 aminokiselina, oko 400 do oko 500 aminokiselina, oko 500 do oko 600 aminokiselina, oko 600 do oko 700 aminokiselina, oko 700 do oko 800 aminokiselina, oko 800 do oko 900 aminokiselina, ili oko 900 do oko 1000 aminokiselina.

[0128] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo poboljšava jedno ili više farmakokinetičkih svojstava FVIII proteina bez značajnog uticaja na njegovu biološku aktivnost ili funkciju.

[0129] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo povećava in vivo i/ili in vitro poluživot FVIII proteina. U drugim otelotvorenjima, heterologni deo olakšava vizualizaciju ili lokalizaciju FVIII proteina ili njegovog fragmenta (npr., fragment koji sadrži heterologni deo posle proteolitičkog razdvajanja FVIII proteina). Vizualizacija i/ili lokacija FVIII proteina ili njegovog fragmenta može biti in vivo, in vitro, ex vivo, ili njihove kombinacije.

[0130] U drugim otelotvorenjima, heterologni deo povećava stabilnost FVIII proteina ili njegovog fragmenta (npr., fragment koji sadrži heterologni deo posle proteolitičkog razdvajanja FVIII proteina). Kako se ovde koristi, izraz „stabilnost“ odnosi se na u struci prihvaćeno merenje održavanja jednog ili više fizičkih svojstava FVIII proteina, kao odgovor na uslove okruženja (npr., povišena ili spuštena temperatura). U određenim aspektima, fizičko svojstvo može biti održavanje kovalentne strukture FVIII proteina (npr., odsustvo proteolitičkog razdvajanja, neželjena oksidacija ili deamidacija). U drugim aspektima, fizičko svojstvo takođe može biti prisustvo FVIII proteina u pravilno savijenom stanju (npr., odsustvo rastvorljivih ili nerastvorljivih agregata ili taloga). U jednom aspektu, stabilnost FVIII proteina meri se ispitivanjem biofizičkih svojstava FVIII proteina, na primer termička stabilnost, profil razvijanja pH, stabilno uklanjanje glikozilacije, rastvorljivost, biohemijska funkcija (npr., sposobnost vezivanja za protein, receptor ili ligand) itd., i/ili njihove kombinacije. U drugom aspektu, biohemijska funkcija se pokazuje afinitetom vezivanja interakcije. U jednom aspektu, mera stabilnosti proteina je termička stabilnost, tj. otpornost na termički izazov. Stabilnost se može meriti korišćenjem postupaka poznatih u struci, kao što su HPLC (tečna hromatografija visokih performansi), SEC (hromatografija koja isključuje veličinu), DLS (dinamičko rasejanje svetlosti) itd. Postupci za merenje toplotne stabilnosti uključuju, ali nisu ograničeni na diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC), diferencijalnu skenirajuću fluorimetriju (DSF), kružni dihroizam (CD) i test termičkog izazivanja.

[0131] U određenim aspektima, FVIII protein sadrži najmanje jedan produživač polu-života, tj. heterologni deo koji povećava in vivo polu-život FVIII proteina u odnosu na in vivo poluživot odgovarajućeg FVIII proteina kom nedostaje takav heterologni deo. In vivo polu-život FVIII proteina može se odrediti bilo kojim postupcima poznatim stručnjacima, npr., testovi aktivnosti (hromogeni test ili jednostepeni aPTT test zgrušavanja), ELISA, ROTEM™, itd.

[0132] U nekim otelotvorenjima, prisustvo jednog ili više produživača polu-života rezultuje time da se polu-život FVIII proteina poveća u poređenju sa vremenom polu-života odgovarajućeg proteina kom nedostaje takav jedan ili više produživača polu-života. Poluživot FVIII proteina koji se sastoji od produživača polu-života je najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta duži od in vivo polu-života odgovarajućeg FVIII proteina kom nedostaje takav produživač polu-života.

[0133] U jednom otelotvorenju, polu-život FVIII proteina koji sadrži produživač polu-života koji je oko 1,5 puta do oko 20 puta, oko 1,5 puta do oko 15 puta, ili oko 1,5 puta do oko 10 puta duži od in vivo polu-života odgovarajućeg proteina kom nedostaje takav produživač polu-života. U još jednom otelotvorenju, polu-život FVIII proteina koji sadrži produživač polu-života porudužuje se oko 2 puta do oko 10 puta, oko 2 puta do oko 9 puta, oko 2 puta do oko 8 puta, oko 2 puta do oko 7 puta, oko 2 puta do oko 6 puta, oko 2 puta do oko 5 puta, oko 2 puta do oko 4 puta, oko 2 puta do oko 3 puta, oko 2,5 puta do oko 10 puta, oko 2,5 puta do oko 9 puta, oko 2,5 puta do oko 8 puta, oko 2,5 puta do oko 7 puta, oko 2,5 puta do oko 6 puta, oko 2,5 puta do oko 5 puta, oko 2,5 puta do oko 4 puta, oko 2,5 puta do oko 3 puta, oko 3 puta do oko 10 puta, oko 3 puta do oko 9 puta, oko 3 puta do oko 8 puta, oko 3 puta do oko 7 puta, oko 3 puta do oko 6 puta, oko 3 puta do oko 5 puta, oko 3 puta do oko 4 puta, oko 4 puta do oko 6 puta, oko 5 puta do oko 7 puta, ili oko 6 puta do oko 8 puta u poređenju sa in vivo polu-životom odgovarajućeg proteina kom nedostaje takav produživač polu-života.

[0134] U drugim otelotvorenjima, polu-život FVIII proteina koji sadrži produživač poluživota iznosi je najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sata, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sata, najmanje oko 32 sata,

4

najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati.

[0135] U još jednom otelotvorenju, polu-život FVIII proteina koji sadrži produživač poluživota iznosi oko 15 sati do oko dve nedelje, oko 16 sati do oko jedne nedelje, oko 17 sati do oko jedne nedelje, oko 18 sati do oko jedne nedelje, oko 19 sati do oko jedne nedelje, oko 20 sati do oko jedne nedelje, oko 21 sata do oko jedne nedelje, oko 22 sata do oko jedne nedelje, oko 23 sata do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko jedne nedelje, oko 36 sati do oko jedne nedelje, oko 48 sati do oko jedne nedelje, oko 60 sati do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko šest dana, oko 24 sata do oko pet dana, oko 24 sata do oko četiri dana, oko 24 sata do oko tri dana, ili oko 24 sata do oko dva dana.

[0136] U nekim otelotvorenjima, prosečni polu-život po pacijentu FVIII proteina koji sadrži produživač polu-života iznosi oko 15 sati, oko 16 sati, oko 17 sati, oko 18 sati, oko 19 sati, oko 20 sati, oko 21 sata, oko 22 sata, oko 23 sata, oko 24 sata (1 dan), oko 25 sati, oko 26 sati, oko 27 sati, oko 28 sati, oko 29 sati, oko 30 sati, oko 31 sata, oko 32 sata, oko 33 sata, oko 34 sata, oko 35 sati, oko 36 sati, oko 40 sati, oko 44 sata, oko 48 sati (2 dana), oko 54 sata, oko 60 sati, oko 72 sata (3 dana), oko 84 sata, oko 96 sati (4 dana), oko 108 sati, oko 120 sati (5 dana), oko šest dana, oko seven dana (jedna nedelja), oko osam dana, oko devet dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, ili oko 14 dana.

1. Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo

[0137] U drugom aspektu, heterologni deo sadrži jedan ili više konstantnih regiona imunoglobulina ili njegove delove (npr., Fc region). U jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrži heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region imunoglobulina ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo je Fc region.

[0138] Konstantni region imunoglobulina sastoji se od domena označenih sa CH (konstantni teški) domeni (CHI, CH2, itd.). U zavisnosti od izotipa, (tj. IgG, IgM, IgA IgD ili IgE), konstantni region može se sastojati od tri ili četiri CH domena. Neki izotipi (npr. konstantni regioni IgG) takođe sadrže zglobni region. Pogledati Janeway i dr.2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

[0139] Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo za proizvodnju FVIII proteina mogu se dobiti iz više različitih izvora. U jednom otelotvorenju, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo potiče od ljudskog imunoglobulina. Podrazumeva se, međutim, da konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može da se izvede iz imunoglobulina druge vrste sisara, uključujući na primer glodara (npr. miša, pacova, zeca, zamorca) ili primata koji nije čovek (npr. šimpanza, makaki). Štaviše, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može se dobiti iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa imunoglobulina, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju se koristi ljudski izotip IgG1.

[0140] Različite sekvence gena konstantnog regiona imunoglobulina (npr. sekvence gena ljudskog konstantnog regiona) dostupne su u obliku javno dostupnih depozita. Sekvenca domena konstantnog regiona može se odabrati sa određenom efektorskom funkcijom (ili joj nedostaje određena efektorska funkcija) ili sa određenom modifikacijom radi smanjenja imunogenosti. Mnoge sekvence antitela i geni koji kodiraju antitela su objavljeni, i pogodne sekvence Ig konstantnog regiona (npr. zglob, CH2 i/ili CH3 sekvence ili njihovi delovi) mogu se dobiti iz ovih sekvenci korišćenjem tehnika priznatih u struci. Genetski materijal dobijen korišćenjem bilo kog od prethodnih postupaka može se zatim izmeniti ili sintetizovati kako bi se dobili polipeptidi kako je ovde otkriveno. Dalje će se ceniti da obim predmetnog pronalaska obuhvata alele, varijante i mutacije sekvenci DNK konstantnog regiona.

[0141] Sekvence konstantnog regiona imunoglobulina ili njegov deo mogu se klonirati, npr., Koristeći lančanu reakciju polimeraze i prajmere koji su izabrani da pojačaju domen od interesa. Kako bi se iz antitela klonirala sekvenca konstantnog regiona imunoglobulina ili njen deo, mRNK se može izolovati iz hibridoma, slezine ili limfnih ćelija, reverzno transkribovati u DNK, i geni antitela se mogu pojačati pomoću PCR. Postupci PCR amplifikacije detaljno su opisani u SAD patentima br.4,683,195; 4,683,202; 4,800,159;

4,965,188; i u, npr., „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications“ Innis i dr. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho i dr.1989. Gene 77:51; Horton i dr.1993.

Methods Enzymol. 217:270). PCR se može inicirati konsenzus konstantnim regionom ili specifičnijim prajmerima na osnovu objavljenih sekvenci DNK teškog i lakog lanca i aminokiselina. PCR se takođe može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju laki i teški lanac antitela. U ovom slučaju biblioteke se mogu pregledati pomoću konsenzus

4

prajmera ili većih homoloških sondi, kao što su sonde konstantnog regiona miša. Brojni setovi prajmera pogodni za amplifikaciju gena antitela poznati su u struci (npr., 5' prajmeri zasnovani na N-terminalnoj sekvenci prečišćenih antitela (Benhar and Pastan.1994. Protein Engineering 7:1509); brza amplifikacija cDNK krajeva (Ruberti, F. i dr.1994. J. Immunol. Methods 173:33); liderske sekvence antitela (Larrick i dr.1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Kloniranje sekvenci antitela je dalje opisano kod Newman i dr., SAD patent br.5,658,570, podneseno 25. januara 1995.

[0142] Ovde korišćeni konstantni region imunoglobulina može obuhvatati sve domene i zglobni region ili njihove delove. U jednom otelotvorenju, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo sadrži CH2 domen, CH3 domen i zglobni region, tj. Fc region ili FcRn vezujući partner.

[0143] Kako se ovde koristi, izraz „Fc region“ je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu nativnog Ig, tj. kao što je nastalo dimernim povezivanjem odgovarajućih Fc domena njegova dva teška lanca. Nativni Fc region obrazuje homodimer sa drugim Fc regionom. Suprotno tome, izraz „genetski fuzionisani Fc region“ ili „jednolančani Fc region“ (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region koji se sastoji od Fc domena genetski povezanih u jednom polipeptidnom lancu (tj. kodirano u jednoj susednoj genetskoj sekvenci). Pogledati Međunarodnu publikacija br. WO 2012/006635.

[0144] U jednom otelotvorenju, „Fc region“ odnosi se na deo pojedinačnog teškog lanca Ig koji počinje u zglobnom regionu neposredno uzvodno od mesta razdvajanja papaina (tj. ostatak 216 u IgG, uzimajući prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca kao 114) i završava se na C-terminusu antitela. Shodno tome, kompletan Fc region sadrži najmanje zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen.

[0145] Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može biti FcRn vezujući partner. FcRn je aktivan u odraslim epitelnim tkivima i eksprimira se u lumenu creva, plućnim disajnim putevima, nosnim površinama, površinama vagine, debelog creva i rektuma (SAD patent br.6,485,726). FcRn vezujući partner je deo imunoglobulina koji se vezuje za FcRn.

[0146] FcRn receptor je izolovan od nekoliko vrsta sisara, uključujući ljude. Poznate su sekvence ljudskog FcRn, FcRn majmuna, FcRn pacova i FcRn miša (Story i dr.1994, J. Exp.

4

Med. 180:2377). FcRn receptor vezuje IgG (ali ne i druge klase imunoglobulina kao što su IgA, IgM, IgD i IgE) pri relativno niskom pH, aktivno transportuje IgG transcelularno u luminalnom ka seroznom smeru, i zatim oslobađa IgG pri relativno višem pH koji se nalazi u intersticijskoj tečnosti. Eksprimira se u epitelnom tkivu odraslih (SAD patenti br.6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) uključujući plućni i crevni epitel (Israel i dr.1997, Immunology 92:69) bubrežni proksimalni tubularni epitel (Kobayashi i dr.2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) kao i nazalni epitel, vaginalne površine i površine žučnih stabala.

[0147] FcRn vezujući partneri, korisni u predmetnom pronalasku, obuhvataju molekule koji se mogu specifično vezati za FcRn receptor, uključujući ceo IgG, Fc fragment za IgG i druge fragmente koji uključuju kompletan region za vezivanje za FcRn receptor. Region Fc dela IgG koji se vezuje za FcRn receptor opisan je na osnovu rentgenske kristalografije (Burmeister i dr.1994, Nature 372:379). Glavno dodirno područje Fc sa FcRn je u blizini spoja CH2 i CH3 domena. Fc-FcRn dodiri su svi unutar jednog teškog lanca Ig. FcRn vezujući partneri uključuju ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente IgG koji uključuju kompletan region vezivanja od FcRn. Glavna mesta dodira uključuju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 od CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 od CH3 domena. Sve reference na numerisanje aminokiselina imunoglobulina ili fragmenata ili regiona imunoglobulina zasnivaju se na abat i dr.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

[0148] Fc regioni ili FcRn vezujući partneri vezani za FcRn mogu se efikasno prebaciti preko epitelnih barijera pomoću FcRn, pružajući tako neinvazivne agensi za sistemsku primenu željenog terapeutskog molekula. Pored toga, fuzioni proteini koji sadrže Fc region ili FcRn vezujući partner endocitiraju se od strane ćelija koje eksprimiraju FcRn. Ali umesto da budu obeleženi za razgradnju, ovi fuzioni proteini se ponovo recikliraju u cirkulaciju, povećavajući tako in vivo polu-život ovih proteina. U određenim otelotvorenjima, delovi konstantnih regiona imunoglobulina su Fc region ili FcRn vezujući partner koji se, preko disulfidnih veza i drugih nespecifičnih interakcija, obično povezuju sa drugim Fc regionom ili drugim FcRn vezujućim partnerom kako bi formirali dimere i multimere višeg reda.

[0149] Dva FcRn receptora mogu vezati jedan Fc molekul. Kristalografski podaci sugerišu da

4

se svaki Fc molekulRn vezuje za jedan polipeptid Fc homodimera. U jednom aspektu, vezivanje FcRn vezujućeg partnera, npr., Fc fragmenta IgG, za biološki aktivan molekul pruža način za isporuku biološki aktivnog molekula oralno, bukalno, sublingvalno, rektalno, vaginalno, kao aerosol koji se primenjuje nazalno ili pulmonalno, ili okularno. U još jednom otelotvorenju, FVIII protein može se primenjivati invazivno, npr., subkutano, intravenozno.

[0150] Region FcRn vezujućeg partnera je molekul ili njegov deo koji se može specifično vezati pomoću FcRn receptora sa posledičnim aktivnim transportom preko FcRn receptora iz Fc regiona. Specifično vezivanje se odnosi na dva molekula koji formiraju kompleks koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje karakteriše visok afinitet i nizak do umeren kapacitet, za razliku od nespecifičnog vezivanja koje obično ima nizak afinitet sa umerenim do velikim kapacitetom. Tipično, vezivanje se smatra specifičnim kada je konstanta afiniteta KA veća od 10<6>M<-1>, ili veća od 10<8>M<-1>. Ako je potrebno, nespecifično vezivanje se može smanjiti bez značajnog uticaja na specifično vezivanje promenom uslova vezivanja. Koristeći rutinske tehnike, stručnjak može optimizovati odgovarajuće uslove vezivanja kao što su koncentracija molekula, jonska snaga rastvora, temperatura, vreme dozvoljeno za vezivanje, koncentracija blokatora (npr., serumski albumin, mlečni kazein) itd.

[0151] U određenim otelotvorenjima, FVIII protein prema pronalasku sadrži jedan ili više krnjih Fc regiona koji su ipak dovoljni da daju svojstva vezivanja Fc receptora (FcR) Fc regionu. Na primer, deo Fc regiona koji se vezuje za FcRn (tj. FcRn vezujući deo) sadrži otprilike aminokiseline 282-438 IgG1, EU numerisanje (gde su primarna mesta dodira aminokiseline 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 od CH2 domena i aminokiselinski ostaci 385-387, 428 i 433-436 od CH3 domena. Dakle, Fc region prema pronalasku može sadržati ili se sastojati od FcRn vezujućeg dela. FcRn vezujući delovi mogu se dobiti iz teških lanaca bilo kog izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju se koristi FcRn vezujući deo iz antitela ljudskog izotipa IgG1. U drugom otelotvorenju se koristi FcRn vezujući deo iz antitela ljudskog izotipa IgG4.

[0152] Fc region se može dobiti iz više različitih izvora. U jednom otelotvorenju, Fc region polipeptida je izveden iz ljudskog imunoglobulina. Podrazumeva se, međutim, da Fc ostatak može da se izvede iz imunoglobulina druge vrste sisara, uključujući na primer glodara (npr. miš, pacov, zec, zamorče) ili primata koji nisu ljudi (npr. šimpanze, makaki). Štaviše, polipeptid Fc domena ili njihovi delovi mogu biti izvedeni iz bilo koje klase imunoglobulina,

4

uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa imunoglobulina, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom otelotvorenju, koristi se ljudski izotip IgG1.

[0153] U određenim otelotvorenjima, Fc varijanta dovodi do promene u najmanje jednoj efektorskoj funkciji koja je omogućena Fc ostatkom koji sadrži pomenuti Fc domen divljeg tipa (npr., poboljšanje ili smanjenje sposobnosti Fc regiona da se vezuje za Fc receptore (npr. FcγRI, FcγRII ili FcγRIII) ili komplemente proteine (npr. C1q), ili da pokrene citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu ili citotoksičnost zavisnu od komplemenata (CDCC). U drugim otelotvorenjima, Fc varijanta pruža sintetički ostatak cisteina.

[0154] Fc region pronalaska može da koristi Fc varijante prepoznate u struci, za koje se zna da dovode do promene (npr., poboljšanje ili smanjenje) efektorske funkcije i/ili vezivanja FcR ili FcRn. Konkretno, Fc region pronalaska može da uključuje, na primer, promenu (npr., supstitucija) na jednom ili više položaja aminokiselina obelodanjenih u Međunarodnim PCT publikacijama WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2; SAD patentnim publikacijama br. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056 ; ili SAD patentima 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022;

6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956, i 7,317,091. U jednom aspektu, specifična promena (npr., specifična supstitucija jedne ili više aminokiselina obelodanjenih u struci) može se izvršiti na jednom ili više opisanih položaja aminokiselina. U drugom otelotvorenju, može se izvršiti drugačija promena na jednom ili više obelodanjenih položaja aminokiselina (npr., različita supstitucija jednog ili više položaja aminokiselina koji su obelodanjeni u struci).

[0155] Fc region ili FcRn vezujući partner od IgG mogu se modifikovati u skladu sa dobro poznatim procedurama kao što su mutageneza usmerena na mesto i slično, pružajući modifikovane IgG ili Fc fragmente ili njihove delove koji će biti vezani za FcRn. Takve modifikacije uključuju modifikacije udaljene od FcRn dodirnih mesta, kao i modifikacije

4

unutar dodirnih mesta koje čuvaju ili čak poboljšavaju vezivanje za FcRn. Na primer, naredni pojedinačni aminokiselinski ostaci u ljudskom IgG1 Fc (Fc γ1) mogu biti supstituisani bez značajnog gubitka Fc afiniteta vezivanja za FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, i K447A, gde na primer P238A predstavlja divlji tip prolina supstituisan alaninom na položaju broj 238. Kao primer, određeno otelotvorenje uključuje N297A mutaciju , uklanjajući visoko konzervirano mesto N-glikozilacije. Pored alanina, druge aminokiseline mogu da zamene aminokiseline divljeg tipa na gore navedenim položajima. Mutacije se mogu pojedinačno uvesti u Fc što dovodi do više od sto Fc regiona koji se razlikuju od nativnog Fc. Pored toga, kombinacije dve, tri ili više ovih pojedinačnih mutacija mogu se uvesti zajedno, što dovodi do još stotina Fc regiona.

[0156] Neke od gore navedenih mutacija mogu dovesti do nove funkcionalnost Fc regiona ili FcRn vezujućeg partnera. Na primer, jedno otelotvorenje uključuje N297A, uklanjajući visoko konzervirano mesto N-glikozilacije. Efekat ove mutacije je da smanji imunogenost, povećavajući time polu-život Fc regiona, i da učini Fc region nesposobnim da se vezuje za FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIIA, bez ugrožavanja afiniteta za FcRn (Routledge i dr. 1995, Transplantation 60:847; Friend i dr.1999, Transplantation 68:1632; Shields i dr.1995, J. Biol. Chem.276:6591). Kao dalji primer nove funkcionalnosti koja proizilazi iz gore opisanih mutacija, afinitet za FcRn u nekim slučajevima može da se poveća iznad divljeg tipa. Ovaj povećani afinitet može odražavati povećanu stopu uključenja, smanjenu stopu isključenja ili istovremeno povećanu stopu uključenja i smanjenu stopu isključenja. Primeri mutacija za koje se veruje da daju povećani afinitet za FcRn uključuju, ali nisu ograničeni na, T256A, T307A, E380A, and N434A (Shields i dr.2001, J. Biol. Chem.276:6591).

[0157] Pored toga, izgleda da najmanje tri ljudska Fc gama receptora prepoznaju mesto vezivanja na IgG unutar donjeg zglobnog regiona, obično aminokiseline 234-237. Prema tome, još jedan primer nove funkcionalnosti i potencijalno smanjene imunogenosti može proizaći iz mutacija ovog regiona, kao na primer zamenom aminokiselina 233-236 ljudskog IgG1 „ELLG“ (SEQ ID NO: 29) za odgovarajuću sekvencu iz IgG2 „PVA“ (sa jednim brisanjem aminokiselina). Pokazano je da se FcyRI, FcyRII i FcyRIII, koji posreduju u različitim efektorskim funkcijama, neće vezati za IgG1 kada su uvedene takve mutacije. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour i dr.1999, Eur. J.

Immunol. 29:2613.

[0158] U još jednom otelotvorenju, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo sadrži aminokiselinsku sekvencu u zglobnom regionu ili njen deo koji formira jednu ili više disulfidnih veza sa drugim konstantnim regionom imunoglobulina ili njihovim delom. Drugi konstantni region imunoglobulina ili njegov deo vezan je za drugi polipeptid, čime spaja FVIII protein i drugi polipeptid. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid je pojačivač. Kako se ovde koristi, izraz „pojačivač“ se odnosi na molekul, njegov fragment ili komponentu polipeptida koji je sposoban da pojača prokoagulantnu aktivnost FVIII.

Pojačivač može biti kofaktor, kao što je rastvorljivi faktor tkiva(sTF), ili prokoagulantni peptid. Dakle, nakon aktivacije FVIII, pojačivač je dostupan za pojačavanje FVIII aktivnosti.

[0159] U određenim otelotvorenjima, FVIII protein prema pronalasku sadrži aminokiselinsku supstituciju u konstantnom regionu imunoglobulina ili njegovom delu (npr., Fc varijante), koja menja antigen-nezavisne efektorske funkcije Ig konstantnog regiona, naročito polu-život proteina u cirkulaciji.

2. scFc regioni

[0160] U drugom aspektu, heterologni deo sadrži scFc (jednolančani Fc) region. U jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrži heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira scFc region. SCFc region sadrži najmanje dva konstantna regiona imunoglobulina ili njihove delove (npr., Fc ostaci ili domeni (npr., 2, 3, 4, 5, 6, ili više Fc ostataka ili domena)) u okviru istog linearnog polipeptidnog lanca koji je sposoban da se savije (npr., intramolekularno ili intermolekularno savijanje) kako bi se formirao jedan funkcionalni scFc region koji je povezan Fc peptidnim veznikom. Na primer, u jednom otelotvorenju, polipeptid kako je ovde otkriveno je sposoban da se vezuje preko svog scFc regiona za najmanje jedan Fc receptor (npr. FcRn, FcγR receptor (npr., FcyRIII) ili protein komplementa (npr. C1q)) u cilju poboljšanja polu-života

1

ili pokretanja funkcije imunog efektora (npr., citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), fagocitoza ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDCC) i/ili za poboljšanje proizvodljivosti).

3. CTP

[0161] U drugom aspektu, heterologni deo sadrži jedan C-terminalni peptid (CTP) od β podjedinice ljudskog horionskog gonadotropina ili njegov fragment, varijantu ili derivat. Poznato je da jedan ili više CTP peptida umetnutih u rekombinantni protein povećavaju in vivo polu-život tog proteina. pogledati, npr., SAD patent br.5,712,1: 22.

[0162] Primeri CTP peptida uključuju DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 17) ili SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ. (SEQ ID NO: 18). pogledati, npr., publikaciju SAD patentne prijave br. US 2009/0087411 A1.

4. XTEN sekvenca

[0163] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo sadrži jednu ili više XTEN sekvenci, fragmenata, varijanti ili njihovih derivata. Kako se ovde koristi, „XTEN sekvenca“ odnosi se na polipeptide produžene dužine sa sekvencama koje se ne javljaju u prirodi, značajno se ne ponavljaju i sastoje se uglavnom od malih hidrofilnih aminokiselina, sa sekvencom koja ima nizak stepen ili nema sekundarnu ili tercijarnu strukturu pod fiziološkim uslovima. Kao heterologni deo, XTEN mogu poslužiti kao deo produženja polu-života. Pored toga, XTEN može da pruži poželjna svojstva uključujući, ali bez ograničavanja na, poboljšane farmakokinetičke parametre i karakteristike rastvorljivosti.

[0164] Ugrađivanje heterolognog dela koji sadrži XTEN sekvencu u protein prema pronalasku može proteinu dati jedno ili više narednih korisnih svojstava: konformaciona fleksibilnost, povećana rastvorljivost u vodi, visok stepen otpornosti na proteaze, mala imunogenost, slabo vezivanje za sisarske receptore, ili povećani hidrodinamički (ili Stoksovi) poluprečnici.

[0165] U određenim aspektima, XTEN sekvenca može povećati farmakokinetička svojstva kao što je duži in vivo polu-život ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da protein prema pronalasku ostaje in vivo i ima prokoagulantnu aktivnost tokom produženog vremenskog perioda u poređenju sa proteinom koji je isti, ali bez XTEN heterolognog dela.

2

[0166] Obelodanjeni su primeri XTEN sekvenci koje se mogu koristiti kao heterologni ostaci u himernim proteinima pronalaska, npr., u SAD patentnim publikacijama br.2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ili 2011/0172146 A1, ili Međunarodnim patentnim publikacijama br. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, ili WO 2011028344 A2.

[0167] Primeri XTEN sekvenci koje se mogu koristiti kao heterologni ostaci u himernom proteinu pronalaska uključuju XTEN AE42-4 (SEQ ID NO:30, kodiran od strane SEQ ID NO:31), XTEN 144-2A (SEQ ID NO:32, kodiran od strane SEQ ID NO:33), XTEN A144-3B (SEQ ID NO:34, kodiran od strane SEQ ID NO:35), XTEN AE144-4A (SEQ ID NO:36, kodiran od strane SEQ ID NO:37), XTEN AE144-5A (SEQ ID NO:38, kodiran od strane SEQ ID NO:39), XTEN AE144-6B (SEQ ID NO:40, kodiran od strane SEQ ID NO:41), XTEN AG144-1 (SEQ ID NO:42, kodiran od strane SEQ ID NO:43), XTEN AG144-A (SEQ ID NO:44, kodiran od strane SEQ ID NO:45), XTEN AG144-B (SEQ ID NO:46, kodiran od strane SEQ ID NO:47), XTEN AG144-C (SEQ ID NO:48, kodiran od strane SEQ ID NO:49), i XTEN AG144-F (SEQ ID NO:50, kodiran od strane SEQ ID NO:51).

5. Albumin ili fragment, derivat ili njegova varijanta

[0168] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo sadrži albumin ili njegov funkcionalni fragment. Ljudski serumski albumin (HSA, ili HA), protein od 609 aminokiselina u svom obliku pune dužine, odgovoran je za značajan udeo osmotskog pritiska seruma, i takođe deluje kao nosilac endogenih i egzogenih liganda. Izraz „albumin“ kako se ovde koristi uključuje albumin pune dužine ili njegov funkcionalni fragment, varijantu, derivat ili analog. Primeri albumina ili njegovih fragmenata ili varijanti obelodanjeni su u SAD patentnim publikacijama br.2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, ili 2008/0153751 A1 ili PCT publikacijama prijava br.2008/033413 A2, 2009/058322 A1, ili 2007/021494 A2.

[0169] U jednom aspektu, FVIII protein prema pronalasku sadrži albumin, fragment ili njegovu varijantu koja je dalje povezana sa drugim heterolognim delom odabranim iz grupe koja se sastoji od konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela (npr., Fc region), PAS sekvence, HES i PEG.

6. Deo koji vezuje albumin

[0170] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je deo koji vezuje albumin, koji sadrži peptid koji vezuje albumin, bakterijski domen koji vezuje albumin, fragment antitela koji vezuje albumin ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0171] Na primer, protein koji vezuje albumin može biti bakterijski protein koji vezuje albumin, antitelo ili fragment antitela, uključujući domenska antitela (pogledati SAD patent br. 6,696,245). Na primer, protein koji vezuje albumin može biti bakterijski domen koji vezuje albumin, poput streptokoknog proteina G (Konig, T. and Skerra, A. (1998) J.

Immunol. Methods 218, 73-83). Drugi primeri peptida koji vezuju albumin, i koji se mogu koristiti kao konjugacioni partner su, na primer, oni koji imaju Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys konsenzus sekvencu, gde Xaa1jeste Asp, Asn, Ser, Thr, ili Trp; Xaa2jeste Asn, Gln, H jeste, Ile, Leu, ili Lys; Xaa3jeste Ala, Asp, Phe, Trp, ili Tyr; i Xaa4jeste Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, ili Thr kako je opisano u SAD patentnoj prijavi 2003/0069395 ili Dennis i dr. (Dennis i dr. (2002) J. Biol. Chem.277, 35035-35043).

[0172] Domen 3 iz streptokoknog proteina G, kako je obelodanjeno kod Kraulis i dr., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) i Linhult i dr., Protein Sci.11:206-213 (2002) je primer bakterijskog domena koji vezuje albumin. Primeri peptida koji vezuju albumin uključuju seriju peptida koji imaju sekvencu jezgra DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 19). Pogledati, npr., Dennis i dr., J. Biol. Chem.2002, 277: 35035-35043 (2002). Primeri fragmenata antitela koja vezuju albumin su obelodanjeni kod Muller i Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther.

9:319-326 (2007); Roover i dr., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), i Holt i dr., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008). Primer takve grupe koja vezuje albumin je 2-(3-maleimidopropanamido)-6-(4-(4-jodofenil)butanamido) heksanoat („Albu“ oznaka) kako je obelodanjeno kod Trusseli dr., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).

[0173] Masne kiseline, naročito masne kiseline dugog lanca (LCFA) i jedinjenja koja vezuju albumin slična masnim kiselinama mogu se koristiti za produženje in vivo polu-života FVIII proteina prema pronalasku. Primer jedinjenja koje vezuje albumin sličnih LCFA je 16-(1-(3-(9-(((2,5-dioksopirolidin-1-iloksi) karboniloksi) -meti)-7-sulfo-9H-fluoren-2-ilamino)-3-oksopropil)-2,5-dioksopirolidin-3-iltio) heksadekanska kiselina (pogledati, npr., WO

2010/140148).

4

7. PAS sekvenca

[0174] U drugim otelotvorenjima, heterologni deo je PAS sekvenca. PAS sekvenca, kako se ovde koristi, označava aminokiselinsku sekvencu koja sadrži uglavnom ostatke alanina i serina ili koja sadrži uglavnom ostatke alanina, serina i prolina, i aminokiselinsku sekvencu koja formira konformaciju nasumičnog namotaja pod fiziološkim uslovima. Shodno tome, PAS sekvenca je gradivni blok, aminokiselinski polimer ili kaseta za sekvence koja sadrži, značajno se sastoji ili se sastoji od alanina, serina i prolina, i koja se može koristiti kao deo heterolognog dela u himernom proteinu. Ipak, stručnjak je svestan da aminokiselinski polimer takođe može da formira konformaciju nasumičnog namotaja kada se ostaci koji nisu alanin, serin i prolin dodaju kao sporedni sastojak u PAS sekvencu. Izraz „sporedni sastojak“, kako se ovde koristi, znači da aminokiseline, osim alanina, serina i prolina, mogu biti dodate u PAS sekvencu do određenog stepena, npr., do oko 12%, tj. oko 12 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 10%, tj. oko 10 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 9%, tj. oko 9 od 100 aminokiselina, do oko 8%, tj. oko 8 od 100 aminokiselina, oko 6%, tj. oko 6 od 100 aminokiselina, oko 5%, tj. oko 5 od 100 aminokiselina, oko 4%, tj. oko 4 od 100 aminokiselina, oko 3%, tj. oko 3 od 100 aminokiselina, oko 2%, tj. oko 2 od 100 aminokiselina, oko 1%, tj. oko 1 od 100 aminokiselina. Aminokiseline različite od alanina, serina i prolina mogu se odabrati iz grupe koju čine Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, i Val.

[0175] U fiziološkim uslovima, rastezanje sekvence PAS formira konformaciju nasumičnog namotaja i time može posredovati povećanu in vivo i/ili in vitro stabilnost za FVIII protein. Pošto domen nasumičnog navoja sam po sebi ne prihvata stabilnu strukturu ili funkciju, biološka aktivnost posredovana proteinom FVIII u osnovi je očuvana. U drugim otelotvorenjima, PAS sekvence koje formiraju domen nasumičnog navoja su biološki inertne, posebno u pogledu proteolize u krvnoj plazmi, imunogenosti, izoelektrične tačke/elektrostatičkog ponašanja, vezivanja za receptore ćelijske površine ili internalizacije, ali su i dalje biorazgradive, što pruža jasne prednosti u odnosu na sintetičke polimere kao što je PEG.

[0176] Neograničavajući primeri PAS sekvenci koje formiraju konformaciju nasumičnog namotaja sadrže aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 20), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 21), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 22), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 23), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 24), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 25) i ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 26) ili bilo koje njihove kombinacije. Dodatni primeri PAS sekvenci poznati su iz, npr., SAD patentne publikacije br.2010/0292130 A1 i PCT publikacije prijava br. WO 2008/155134 A1.

8. HAP sekvenca

[0177] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je homo-aminokiselinski polimer (HAP) bogat glicinom. HAP sekvenca može da sadrži ponavljajuću sekvencu glicina, koja je dugačka najmanje 50 aminokiselina, najmanje 100 aminokiselina, 120 aminokiselina, 140 aminokiselina, 160 aminokiselina, 180 aminokiselina, 200 aminokiselina, 250 aminokiselina, 300 aminokiseline, 350 aminokiselina, 400 aminokiselina, 450 aminokiselina ili 500 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, HAP sekvenca je u stanju da produži polu-život dela fuzionisanog sa ili vezanog za HAP sekvencu. Neograničavajući primeri HAP sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na (Gly)n, (Gly4Ser)nili S(Gly4Ser)n, gde n iznosi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20. U jednom otelotvorenju, n iznosi 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40. U drugom otelotvorenju, n iznosi 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ili 200.

9. Transferin ili njegov fragment

[0178] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je transferin ili njegov fragment. Bilo koji transferin se može koristiti za dobijanje FVIII proteina prema pronalasku. Kao primer, ljudski TF divljeg tipa (TF) je protein od 679 aminokiselina, od približno 75 KDa (ne računajući glikozilaciju), sa dva glavna domena, N (oko 330 aminokiselina) i C (oko 340 aminokiselina), koji izgleda potiču od dupliranja gena. Pogledati GenBank pristupne brojeve NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 i S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Transferrin se sastoji od dva domena, N domena i C domena. N domen sadrži dva poddomena, N1 domen i N2 domen, i C domen sadrži dva poddomena, C1 domen i C2 domen.

[0179] U jednom otelotvorenju, heterologni deo transferina uključuje varijantu splajsovanja transferina. U jednom primeru, varijanta splajsovanja transferina može biti varijanta splajsovanja ljudskog transferina, npr., Genbank pristupni br. AAA61140. U još jednom otelotvorenju, transferin deo himernog proteina uključuje jedan ili više domena sekvence transferina, npr., N domen, C domen, N1 domen, N2 domen, C1 domen, C2 domen ili bilo koje njihove kombinacije.

10. Receptori za klirens

[0180] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je receptor za klirens, njegov fragment, varijanta ili derivat. LRP1 je integralni membranski protein od 600 kDa koji je umešan u klirens posredovan receptorima različitih proteina, kao što je Faktor X. Pogledati npr., Narita i dr., Blood 91:555-560 (1998).

11. Fon Vilebrandov faktor ili njegovi fragmenti

[0181] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je fon Vilebrandov faktor (VWF) ili njegovi fragmenti.

[0182] VWF (poznat i kao F8VWF) je veliki multimerni glikoprotein prisutan u krvnoj plazmi i konstitutivno proizveden u endotelu (u Vajbel-Paladovim telima), megakariocitima (α-granule trombocita) i subendotelnom vezivnom tkivu. Osnovni VWF monomer je protein od 2813 aminokiselina. Svaki monomer sadrži određeni broj domena sa određenom funkcijom, D' i D3 domeni (koji se zajedno vezuju za Faktor VIII), A1 domen (koji se vezuje za GPIb-receptor trombocita, heparin i/ili eventualno kolagen), A3 domen (koji se vezuje za kolagen), C1 domen (u kom se RGD domen vezuje za trombocitni integrin αIIbβ3 kada je on aktiviran) i „cisteinski čvor“ domen na C-terminalnom kraju proteina (koji VWF deli sa faktorom rasta izvedenim iz trombocita (PDGF), transformišućim faktorom rasta-β (TGFβ) i β-ljudskim horionskim gonadotropinom (βHCG)).

[0183] 2813 monomerna aminokiselinska sekvenca za ljudski VWF je prijavljena kao Genbank pristupni broj NP000543.2. Nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski VWF je prijavljena kao Genbank pristupni broj NM000552.3. Nukleotidna sekvenca ljudskog VWF označena je kao SEQ ID NO: 27. SEQ ID NO: 28 je aminokiselinska sekvenca kodirana od strane SEQ ID NO: 27. D' domen uključuje aminokiseline 764 do 866 iz SEQ ID NO: 28. D3 domen uključuje aminokiseline 867 do 1240 iz SEQ ID NO: 28.

[0184] U plazmi 95-98% FVIII cirkuliše u uskom nekovalentnom kompleksu sa VWF pune dužine. Formiranje ovog kompleksa je važno za održavanje odgovarajućeg nivoa FVIIII u plazmi in vivo. Lenting i dr., Blood.92(11): 3983-96 (1998); Lenting i dr., J. Thromb.

Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Kada se FVIII aktivira zbog proteolize na položajima 372 i 740 u teškom lancu, i na položaju 1689 u lakom lancu, VWF vezan za FVIII uklanja se iz aktiviranog FVIII.

[0185] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je fon Vilebrandov Faktor pune dužine. U drugim otelotvorenjima, heterologni deo je fragment fon Vilebrandovog faktora. Kako se ovde koristi, izraz „VWF fragment“ ili „VWF fragmenti“ označava bilo koje VWF fragmente koji stupaju u interakciju sa FVIII i zadržavaju najmanje jedno ili više svojstava koja VWF pune dužine obično pruža FVIII, npr., sprečavanje prevremene aktivacije na FVIIIa, sprečavanje prevremene proteolize, sprečavanje povezivanja sa fosfolipidnim membranama koje bi mogle dovesti do prevremenog klirensa, sprečavanje vezivanja za receptore klirensa FVIII koji mogu vezati goli FVIII, ali ne i za VWF-vezani FVIII, i/ili stabilizacija teškog lanca FVIII i interakcije lakih lanaca. U specifičnom otelotvorenju, heterologni deo je (VWF) fragment koji sadrži D' domen i D3 domen od VWF. VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen može dalje sadržati VWF domen izabran iz grupe koju ćine A1 domen, A2 domen, A3 domen, D1 domen, D2 domen, D4 domen, B1 domen, B2 domen, B3 domen, C1 domen, C2 domen, CK domen, jedan ili više njihovih fragmenata i bilo koje njihove kombinacije. Dodatni primeri polipeptida koji ima FVIII aktivnost fuzionisanog sa VWF fragmentom su obelodanjeni u SAD provizornoj patentnoj prijavi br.61/667,901, podnesenoj 3. jula 2012.

12. Veznički delovi

[0186] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je peptidni veznik.

[0187] Kako se ovde koriste, izrazi „peptidni veznici“ ili „veznički delovi“ odnose se na sekvencu peptida ili polipeptida (npr., sintetički peptid ili polipeptidna sekvenca) koja povezuje dva domena u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci polipeptidnog lanca.

[0188] U nekim otelotvorenjima, heterologne nukleotidne sekvence koje kodiraju peptidne veze mogu se umetnuti između optimizovanih FVIII polinukleotidnih sekvenci pronalaska i heterolognih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, na primer, jedan od gore opisanih heterolognih ostataka, kao što je albumin. Peptidni veznici mogu pružiti fleksibilnost himernom molekulu polipeptida. Veznici se obično ne razdvajaju, ali takvo razdvajanje može biti poželjno. U jednom aspektu, ovi veznici se ne uklanjaju tokom obrade.

[0189] Tip veznika koji može biti prisutan u himernom proteinu pronalaska je veznik razdvojiv proteazom, koji sadrži mesto razdvajanja (tj. supstrat mesta razdvajanja proteazom, npr., Faktor XIa, Xa ili mesto razdvajanja trombinom) i koji može sadržati dodatne veznike na N-terminalu ili na obe strane mesta razdvajanja. Ovi razdvojivi veznici kada su ugrađeni u konstrukt pronalaska rezultuju himernim molekulom koji ima heterologno mesto razdvajanja.

[0190] U jednom otelotvorenju, FVIII polipeptid sadrži dva ili više Fc domena ili delova povezanih preko cscFc veznika kako bi se formirao Fc region koji se sastoji od jednog polipeptidnog lanca. cscFc veznik je okružen najmanje jednim unutarćelijskim mestom za obradu, tj. mesto koje je razdvojio unutarćelijski enzim. Razdvajanje polipeptida na najmanje jednom unutarćelijskom mestu obrade rezultuje polipeptidom koji sadrži najmanje dva polipeptidna lanca.

[0191] Ostali peptidni veznici mogu se opciono koristiti u konstruktu pronalaska, npr., za povezivanje FVIII proteina sa Fc regionom. Neki primerni veznici koji se mogu koristiti u vezi sa pronalaskom uključuju, npr., polipeptide koji sadrže GlySer aminokiseline, detaljnije opisane u nastavku.

[0192] U jednom otelotvorenju, peptidni veznik je sintetički, tj. ne javlja se u prirodi. U jednom otelotvorenju, peptidni veznik uključuje peptide (ili polipeptide) (koji mogu ali ne moraju biti prirodni) koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja povezuje ili genetski spaja prvu linearnu aminokiselinsku sekvencu sa drugom linearnom aminokiselinskom sekvencom za koju nije prirodno povezana ili genetski fuzionisana u prirodi. Na primer, u jednom otelotvorenju peptidni veznik može da sadrži polipeptide koji se ne javljaju u prirodi i koji su modifikovani oblici prirodnih polipeptida (npr., koji uključuju mutaciju kao što je dodavanje, supstitucija ili brisanje). U još jednom otelotvorenju, peptidni veznik može sadržati aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi. U još jednom otelotvorenju, peptidni veznik može sadržati aminokiseline koje se javljaju u prirodi i javljaju se u linearnoj sekvenci koji se ne javlja u prirodi. U još jednom otelotvorenju, peptidni veznik može sadržati prirodno prisutnu polipeptidnu sekvencu.

[0193] Na primer, u određenim otelotvorenjima, peptidni veznik se može koristiti za spajanje identičnih Fc ostataka, čime se formira homodimerni scFc region. U drugim otelotvorenjima, peptidni veznik se može koristiti za stapanje različitih Fc ostataka (npr. divlji tip Fc ostatka i varijanta Fc ostatka), čime se formira heterodimerni scFc region.

[0194] U još jednom otelotvorenju, peptidni veznik sadrži ili se sastoji od gly-ser veznika. U jednom otelotvorenju, scFc ili cscFc veznik sadrži najmanje deo imunoglobulinskog zglob i gly-ser veznik. Kako se ovde koristi, izraz „gly-ser veznik“ odnosi se na peptid koji se sastoji od ostataka glicina i serina. U određenim otelotvorenjima, pomenuti gly-ser veznik može se umetnuti između dve druge sekvence peptidnog veznika. U drugim otelotvorenjima, gly-ser veznik je vezan na jednom ili oba kraja druge sekvence peptidnog veznika. U još nekim otelotvorenjima, dva ili više gly-ser veznika ugrađena su u serijama u peptidni veznik. U jednom aspektu, peptidni veznik prema pronalasku sadrži najmanje deo gornjeg regiona zgloba (npr., izveden iz molekula IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4), najmanje deo srednjeg regiona zgloba (npr., izveden iz molekula IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) i serijz gly/ser aminokiselinskih ostataka.

[0195] Peptidni veznici prema pronalasku imaju najmanje jednu aminokiselinu i mogu biti različite dužine. U jednom otelotvorenju, peptidni veznik prema pronalasku je dugačak od oko 1 do oko 50 aminokiselina. Kako se koristi u ovom kontekstu, izraz „oko“ označava /dva aminokiselinska ostatka. S obzirom da dužina veznika mora biti pozitivan ceo broj, dužina od oko 1 do oko 50 aminokiselina, znači dužinu od 1-3 do 48-52 aminokiselina. U još jednom otelotvorenju, peptidni veznik prema pronalasku je dugačak od oko 10 do oko 20 aminokiselina. U narednom otelotvorenju, peptidni veznik prema pronalasku je dugačak od oko 15 do oko 50 aminokiselina. U narednom otelotvorenju, peptidni veznik prema pronalasku je dugačak od oko 20 do oko 45 aminokiselina. U još jednom otelotvorenju, peptidni veznik prema pronalasku je dugačak od oko 15 do oko 35 ili oko 20 do oko 30 aminokiselina. U još jednom otelotvorenju, peptidni veznik pronalaska je dugačak oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000, ili 2000 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, peptidni veznik prema pronalasku je dugačak 20 ili 30 aminokiselina.

[0196] U nekim otelotvorenjima, peptidni veznik može sadržati najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, peptidni veznik može sadržati najmanje 200, najmanje 300, najmanje 400, najmanje 500, najmanje 600, najmanje 700, najmanje 800, najmanje 900 ili najmanje 1000 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, peptidni veznik može sadržati najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ili 2000 aminokiselina. Peptidni veznik može sadržati 1-5 aminokiselina, 1-10 aminokiselina, 1-20 aminokiselina, 10-50 aminokiselina, 50-100 aminokiselina, 100-200 aminokiselina, 200-300 aminokiselina, 300-400 aminokiselina, 400-500 aminokiselina, 500-600 aminokiselina, 600-700 aminokiselina, 700-800 aminokiselina, 800-900 aminokiselina ili 900-1000 aminokiselina.

[0197] Peptidni veznici se mogu uvesti u polipeptidne sekvence upotrebom tehnika poznatih u struci. Modifikacije se mogu potvrditi DNK analizom sekvence. Plazmidna DNK se može koristiti za transformaciju ćelija domaćina za stabilnu proizvodnju proizvedenih polipeptida.

Monomer-dimer hibridi

[0198] U nekim otelotvorenjima, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku koji dalje sadrže heterolognu nukleotidnu sekvencu kodiraju molekul monomer-dimer hibrida koji sadrži FVIII.

[0199] Izraz „monomer-dimer hibrid“ ovde se koristi da označi himerni protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, koji su međusobno povezani disulfidnom vezom, gde prvi lanac sadrži Faktor VIII i prvi Fc region, a drugi lanac sadrži, značajno se sastoji ili se sastoji od drugog Fc regiona bez FVIII. Monomer-dimer hibrid konstrukt je prema tome hibrid koji sadrži monomerni aspekt koji ima samo jedan faktor zgrušavanja i dimerni aspekt koji ima dva Fc regiona.

Sekvence kontrole transkripcije

[0200] U nekim otelotvorenjima, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku operativno su povezani sa najmanje jednom sekvencom kontrole transkripcije. Sekvence kontrole transkripcije, kako se ovde koristi, su bilo koje regulatorne nukleotidne sekvence, kao što su promoterske sekvence ili promoter-pojačivač kombinacija, koje omogućavaju efikasnu transkripciju i translaciju kodirajuće nukleinske kiseline za koju je operativno povezana. Sekvenca kontrole eksprimiranja gena može, na primer, biti promoter sisara ili

1

virusa, kao što je konstitutivni ili inducibilni promoter. Konstitutivni promoteri sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, promotere za naredne gene: hipoksantin fosforibozil transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktinski promoter i druge konstitutivne promotere. Primeri virusnih promotera koji konstitutivno funkcionišu u eukariotskim ćelijama uključuju, na primer, promotere iz citomegalovirusa (CMV), simijanskog virusa (npr. SV40), papiloma virusa, adenovirusa, virusa ljudske imunodeficijencije (HIV), virusa Rous sarkoma, citomegalovirusa, dugačkih terminalnih ponavljanja(LTR) virusa Moloney leukemije i drugih retrovirusa i promoter timidin kinaze herpes simpleks virusa. Ostali konstitutivni promoteri poznati su stručnjacima. Promoteri korisni kao sekvence eksprimiranja gena prema pronalasku takođe uključuju inducibilne promotere. Inducibilni promoteri se eksprimiraju u prisustvu indukcionog agensa. Na primer, promoter metalotioneina se indukuje kako bi se pospešile transkripcija i translacija u prisustvu određenih metalnih jona. Drugi inducibilni promoteri poznati su stručnjacima iz ove oblasti.

[0201] Generalno, sekvence kontrole transkripcije uključuju, po potrebi, 5' ne-transkribujuće sekvence i 5' ne-translacione sekvence, uključene u iniciranje transkripcije i translacije, respektivno, kao što su TATA kutija, sekvenca za ograničavanje, CAAT sekvenca i slično. Naročito će takve 5' sekvence bez transkripcije sadržati promoterski region koji uključuje promotersku sekvencu za kontrolu transkripcije operativno spojene kodirajuće nukleinske kiseline. Sekvence eksprimiranja gena opciono uključuju pojačivačke sekvence ili uzvodne aktivatorske sekvence, po želji.

Vektori

[0202] Pronalazak takođe pruža vektore koji sadrže izolovane molekule nukleinske kiseline prema pronalasku. Pogodni vektori uključuju vektore eksprimiranja, virusne vektore i plazmidne vektore.

[0203] Kako se ovde koristi, vektor eksprimiranja se odnosi na bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži potrebne elemente za transkripciju i translaciju umetnute kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, potrebne elemente za replikaciju i translaciju, kada se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina. Vektori eksprimiranja mogu da uključuju plazmide, fagemide, viruse i njihove derivate.

2

[0204] Vektori eksprimiranja pronalaska će obuhvatiti optimizovane polinukleotide koji kodiraju ovde opisani BDD FVIII protein. U jednom otelotvorenju, optimizovane kodirajuće sekvence za BDD FVIII protein su operativno povezane sa sekvencom kontrole eksprimiranja. Kako se ovde koristi, dve sekvence nukleinske kiseline su operativno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da omogućavaju svakoj komponenti sekvence nukleinske kiseline da zadrži svoju funkcionalnost. Za kodirajuću sekvencu i kontrolnu sekvencu eksprimiranja gena kaže se da su operativno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da stavljaju eksprimiranje ili transkripciju i/ili translaciju kodirajuće sekvence pod uticaj ili kontrolu sekvence kontrole eksprimiranja gena. Za dve DNK sekvence se kaže da su operativno povezane ako indukcija promotera u 5' sekvenci eksprimiranja gena rezultuje transkripcijom kodirajuće sekvence, i ako priroda veze između dve DNK sekvence (1) ne rezultuje uvođenjem mutacije pomeranja okvira, (2) ometa sposobnost područja promotera da usmeri transkripciju kodirajuće sekvence, ili (3) ometa sposobnost odgovarajućeg RNK transkripta da se prevede u protein. Tako bi sekvenca eksprimiranja gena bila operativno povezana sa kodirajućom sekvencom nukleinske kiseline ako bi sekvenca eksprimiranja gena bila sposobna da izvrši transkripciju te kodirajuće sekvence nukleinske kiseline tako da se rezultujući transkript prevede u željeni protein ili polipeptid.

[0205] Virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence nukleinske kiseline iz narednih virusa: retrovirus, kao što je Moloney virus mišje leukemije, Harvey virus mišjeg sarkoma, virus tumora mišje dojke i virus Rous sarkoma; adenovirus, adeno-povezan virus; virusi tipa SV40; poliomavirusi; Epštajn-Barovi virusi; papiloma virusi; virus herpesa; virus vakcinije; polio virus; i RNK virus kao što je retrovirus. Mogu se lako upotrijebiti drugi vektori dobro poznati u struci. Određeni virusni vektori su zasnovani na ne-citopatskim eukariotskim virusima u kojima su ne-esencijalni geni zamenjeni genima od interesa.

Necitopatski virusi uključuju retroviruse, čiji životni ciklus uključuje obrnutu transkripciju genomske virusne RNK u DNK sa naknadnom provirusnom integracijom u ćelijsku DNK domaćina. Retrovirusi su odobreni za ispitivanja genske terapije. Najkorisniji su oni retrovirusi kojima nedostaje replikacija (tj. sposobni su da usmere sintezu željenih proteina, ali nisu sposobni da proizvedu zarazne čestice). Takvi genetski izmenjeni retrovirusni vektori eksprimiranja imaju opštu korisnost za visoko efikasnu transdukciju gena in vivo. Standardni protokoli za proizvodnju retrovirusa sa nedostatkom replikacije (uključujući korake ugradnje egzogenog genetskog materijala u plazmid, transfekciju ćelijske linije pakovanja sa plazmidom, proizvodnju rekombinantnih retrovirusa ćelijskom linijom pakovanja, sakupljanje virusnih čestica iz medijuma za kulturu tkiva, i infekcijom ciljanih ćelija virusnim česticama) pruženi su kod Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) i Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

[0206] U jednom otelotvorenju, virus je adeno-povezan virus, dvolančani DNA virus. Adenopovezan virus može se dizajnirati tako da ima nedostatak replikacije i da bude sposoban da zarazi širok spektar tipova i vrsta ćelija. Dalje ima prednosti kao što su toplota i stabilnost lipidnih rastvarača; visoke frekvencije transdukcije u ćelijama različitih linija, uključujući hematopoetske ćelije; i nedostatak inhibicije superinfekcije, što omogućava višestruke serije transdukcija. Navodi se da se adeno-povezan virus može integrisati u ćelijsku DNK čoveka na način specifičan za određeno mesto, čime se minimizira mogućnost insercione mutageneze i varijabilnosti eksprimiranja umetnutog gena karakteristične za retrovirusnu infekciju. Pored toga, divlje vrste adeno-povezanih virusnih infekcija praćene su u kulturi tkiva više od 100 prolazaka u odsustvu selektivnog pritiska, što implicira da je genomska integracija adenopovezanog virusa relativno stabilan događaj. Adeno-povezan virus takođe može funkcionisati na ekstrahromozomski način.

[0207] Ostali vektori uključuju plazmidne vektore. Plazmidni vektori su opširno opisani u struci i dobro su poznati stručnjacima. Pogledati, npr., Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. U poslednjih nekoliko godina utvrđeno je da su plazmidni vektori posebno korisni za isporuku gena u ćelije in vivo zbog svoje nemogućnosti da se repliciraju unutar i integrišu u genom domaćina. Ovi plazmidi, međutim, imaju promoter kompatibilan sa ćelijom domaćina, mogu da eksprimiraju peptid iz gena koji je operativno kodiran u plazmidu. Neki često korišćeni plazmidi dostupni od komercijalnih dobavljača uključuju pBR322, pUC18, pUC19, različite pcDNK plazmide, pRC/CMV, različite pCMV plazmide, pSV40 i pBlueScript. Dodatni primeri specifičnih plazmida uključuju pcDNK3.1, kataloški broj V79020; pcDNK3.1/higro, kataloški broj V87020; pcDNK4/myc-His, kataloški broj V86320; i pBudCE4.1, kataloški broj V53220, svi od Invitrogen (Carlsbad, CA). Ostali plazmidi su dobro poznati stručnjacima. Pored toga, plazmidi se mogu posebno dizajnirati koristeći standardne tehnike molekularne biologije za uklanjanje i/ili dodavanje određenih fragmenata DNK.

4

Ćelije domaćini

[0208] Pronalazak takođe pruža ćelije domaćine koje sadrže izolovane molekule nukleinske kiseline prema pronalasku. Kako se ovde koristi, izraz „transformacija“ koristiće se u širem smislu kako bi označila uvođenje DNK u ćeliju domaćina primaoca koja menja genotip i posledično rezultuje promenom u ćeliji primaocu.

[0209] „Ćelije domaćini“ se odnosi na ćelije koje su transformisane sa vektorima konstruisanim korišćenjem tehnika rekombinantne DNK i kodiraju najmanje jedan heterologni gen. Ćelije domaćini predmetnog pronalaska su poželjno sisarskog porekla; najpoželjnije ljudskog ili mišjeg porekla. Stručnjacima se pripisuje sposobnost da po želji odrede određene ćelijske linije domaćina koje su najprikladnije za njihovu namenu. Primerne ćelijske linije domaćina uključuju, ali nisu ograničene na, CHO, DG44 i DUXB11 (linije jajnika kineskog hrčka, DHFR minus), HELA (karcinom grlića materice čoveka), CVI (linija bubrega majmuna), COS (derivat CVI sa SV40 T antigenom), R1610 (fibroblast kineskog hrčka) BALBC/3T3 (fibroblast miša), HAK (bubrežna linija hrčka), SP2/O (mijelom miša), P3.times.63-Ag3.653 (mijelom miša), BFA-1c1BPT (endotelne ćelije goveda), RAJI (ljudski limfociti), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21 i HEK 293 (ljudski bubreg). Ćelijske linije domaćini obično su dostupne od komerijalnih dobavljača, od strane American Tissue Culture Collection ili iz objavljene literature.

[0210] Uvođenje izolovanih molekula nukleinske kiseline prema pronalasku u ćeliju domaćina može se postići različitim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima. Tu spadaju, ali bez ograničavanja, transfekcija (uključujući elektroforezu i elektroporaciju), fuzija protoplasta, taloženje kalcijum fosfata, fuzija ćelija sa obmotanom DNK, mikroinjekcija i infekcija netaknutim virusom. Pogledati, Ridgway, A. A. G. „Mammalian Expression Vectors“ Chapter 24.2, pp.470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass.1988). Najpoželjnije je uvođenje plazmida u domaćina elektroporacijom. Transformisane ćelije se gaje pod uslovima pogodnim za proizvodnju lakih lanaca i teških lanaca i ispituju se za sintezu teških i/ili lanaca. Primerne tehnike ispitivanja uključuju enzimski imunološki test (ELISA), radioimunološki test (RIA) ili analizu sortiranja ćelija aktiviranu flourescentom (FACS), imunohistohemiju i slično.

[0211] Ćelije domaćina koje sadrže izolovane molekule nukleinske kiseline prema pronalasku se gaje u odgovarajućem medijumu za rast. Kako se ovde koristi, izraz „odgovarajući medijum za rast“ označava medijum koji sadrži hranljive sastojke potrebne za rast ćelija. Hranljive materije potrebne za rast ćelija mogu da uključuju izvor ugljenika, izvor azota, esencijalne aminokiseline, vitamine, minerale i faktore rasta. Po želji, medijumi mogu sadržati jedan ili više selekcionih faktora. Opciono, medijum može sadržati goveđi teleći serum ili fetalni teleći serum (FCS). U jednom aspektu, medijum ne sadrži značajno IgG. Medijum za rast će generalno biti odabran za ćelije koje sadrže DNK konstrukt, na primer, izborom leka ili nedostatkom esencijalnog hranljivog sastojka, koji je dopunjen selekcionim markerom na DNK konstruktu ili ko-transfektovan sa DNK konstruktom. Kultivisane ćelije sisara uglavnom se gaje u komercijalno dostupnim medijumima koji sadrže serum ili su bez seruma (npr. MEM, DMEM, DMEM/F12). U jednom otelotvorenju, medijum je CDoptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA.). U još jednom otelotvorenju, medijum je CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Izbor medijuma pogodnog za određenu korišćenu ćelijsku liniju je u okviru znanja stručnjaka.

Priprema polipeptida

[0212] Polipeptid može da bude kodiran izolovanim molekulima nukleinske kiseline prema pronalasku. U nekim otelotvorenjima, polipeptid je kodiran vektorom koji sadrži izolovane nukleinske molekule pronalaska. U drugim otelotvorenjima, polipeptid je proizveden od strane ćelije domaćina koja sadrži izolovane nukleinske molekule pronalaska.

[0213] U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža postupak za proizvodnju polipeptida sa FVIII aktivnošću, koji uključuje kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima u kojima se proizvodi polipeptid sa FVIII aktivnošću i izvlačenje polipeptida sa FVIII aktivnošću. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje polipeptida sa FVIII aktivnošću je povećano u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima, ali koja sadrži referentnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 3, matičnu sekvencu FVIII gena.

[0214] U drugim otelotvorenjima, pronalazak pruža postupak za povećanje eksprimiranja polipeptida sa FVIII aktivnošću, koji uključuje kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima u kojima se polipeptid sa FVIII aktivnošću eksprimira od strane molekula nukleinske kiseline, gde je eksprimiranje polipeptida sa FVIII aktivnošću povećana u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koji sadrže referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 3.

[0215] U drugim otelotvorenjima, pronalazak pruža postupak za poboljšanje prinosa polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina pod uslovima u kojima molekul nukleinske kiseline proizvodi polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII, gde je prinos polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII povećan u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima, koja sadrži referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 3.

[0216] Dostupno je mnoštvo postupaka za rekombinantno stvaranje FVIII proteina iz optimizovanog molekula nukleinske kiseline prema pronalasku. Polinukleotid željene sekvence može se dobiti pomoću de novo sinteza DNK u čvrstoj fazi ili PCR mutagenezom ranije pripremljenog polinukleotida. Mutageneza posredovana oligonukleotidom je jedan od postupaka za pripremu supstitucije, umetanja, brisanja ili izmene (npr. izmenjen kodon) u nukleotidnoj sekvenci. Na primer, početna DNK se menja hibridizacijom oligonukleotida koji kodira željenu mutaciju u jednolančani DNK obrazac. Posle hibridizacije, DNK polimeraza se koristi za sintezu čitavog drugog komplementarnog lanca obrasca koji uključuje oligonukleotidni prajmer. U jednom otelotvorenju, genetski inženjering, npr., PCR mutageneza zasnovana na prajmerima, dovoljan je da uključi izmenu, kako je ovde definisano, za proizvodnju polinukleotida prema pronalasku.

[0217] Za proizvodnju rekombinantnih proteina, optimizovana polinukleotidna sekvenca pronalaska koja kodira FVIII protein ubacuje se u odgovarajući nosač eksprimiranja, tj. vektor koji sadrži potrebne elemente za transkripciju i translaciju ubačene kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, potrebne elemente za replikaciju i translaciju.

[0218] Polinukleotidna sekvenca pronalaska je umetnuta u vektor u odgovarajućem okviru za čitanje. Vektor eksprimiranja se zatim transficira u odgovarajuću ciljanu ćeliju koja će eksprimirati polipeptid. Tehnike transfekcije poznate u struci uključuju, ali nisu ograničene na, taloženje kalcijum-fosfata (Wigler i dr.1978, Cell 14 : 725) i elektroporaciju (Neumann i dr. 1982, EMBO, J.1 : 841). Raznovrsni sistemi vektora eksprimiranja domaćina mogu se koristiti za eksprimiranje ovde opisanih FVIII proteina u eukariotskim ćelijama. U jednom aspektu, eukariotska ćelija je životinjska ćelija, uključujući ćelije sisara (npr. HEK293 ćelije, PER.C6®, CHO, BHK, Cos, HeLa ćelije). Polinukleotidna sekvenca pronalaska takođe može da kodira signalnu sekvencu koja će omogućiti lučenje FVIII proteina. Stručnjak će razumeti da ćelija dok se FVIII protein prevodi, signalna sekvenca se razdvaja kako bi formirala zreli protein. U struci su poznate različite signalne sekvence, npr., signalna sekvenca nativnog Faktora VII, signalna sekvenca nativnog Faktora IX i signalna sekvenca mišjeg IgK lakog lanca. Alternativno, tamo gde signalna sekvenca nije uključena, FVIII protein se može oporaviti liziranjem ćelija.

[0219] FVIII protein može se sintetisati u transgenoj životinji koja nije čovek, poput glodara, koze, ovce, svinje ili krave. Izraz „transgene životinje“ odnosi se na životinje koje nisu čovek koje imaju ugrađen strani gen u svoj genom. Budući da je ovaj gen prisutan u germlinijskim tkivima, prenosi se sa roditelja na potomstvo. Egzogeni geni se unose u jednoćelijske embrione (Brinster i dr.1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4438). Postupci proizvodnje transgenih životinja su poznati u struci, uključujući transgene, koji proizvode molekule imunoglobulina (Wagner i dr.1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight i dr. 1983, Cell 34 : 335; Brinster i dr.1983, Nature 306: 332; Ritchie i dr.1984, Nature 312: 517; Baldassarre i dr.2003, Theriogenology 59 : 831 ; Robl i dr.2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne i dr.2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).

[0220] Vektori eksprimiranja mogu kodirati oznake koje omogućavaju lako prečišćavanje ili identifikaciju rekombinantno proizvedenog proteina. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, vektor pUR278 (Ruther i dr.1983, EMBO J.2: 1791) u kom se kodirajuća sekvenca ovde opisanog FVIII proteina može povezati u vektor u okviru sa lac Z kodirajućim regionom tako da se proizvodi hibridni protein; pGEX vektori mogu se koristiti za eksprimiranje proteina sa oznakom glutation S-transferaze (GST). Ovi proteini su obično rastvorljivi i mogu se lako prečistiti iz ćelija adsorpcijom na zrnca glutation-agaroze, nakon čega sledi eluiranje u prisustvu slobodnog glutationa. Vektori uključuju mesta razdvajanja (npr., PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)) za lako uklanjanje oznake nakon prečišćavanja.

[0221] Za potrebe predmetnog pronalaska mogu se koristiti brojni sistemi vektora eksprimiranja. Ovi vektori eksprimiranja se tipično repliciraju u organizmima domaćinima ili kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK domaćina. Vektori eksprimiranja mogu uključivati sekvence za kontrolu eksprimiranja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, promotere (npr., prirodno povezani ili heterologni promoteri), pojačivače, signalne sekvence, signale splajsovanja, elemente pojačivača i sekvence završetka transkripcije. Poželjno, sekvence kontrole eksprimiranja su eukariotski sistemi promotera u vektorima sposobnim da transformišu ili transfektuju eukariotske ćelije domaćina. Vektori eksprimiranja takođe mogu da koriste DNK elemente koji potiču od životinjskih virusa, poput goveđeg papiloma virusa, polioma virusa, adenovirusa, virusa vakcinije, bakulovirusa, retrovirusa (RSV, MMTV ili MOMLV), citomegalovirusa (CMV) ili SV40 virusa. Drugi uključuju upotrebu policistronskih sistema sa unutrašnjim mestima vezivanja ribozoma.

[0222] Uobičajeni vektori eksprimiranja obično sadrže selekcione markere (npr., otpornost na ampicilin, otpornost na higromicin, otpornost na tetracikline ili otpornost na neomicin) kako bi se omogućilo detektovanje onih ćelija koje su transformisane sa željenim DNK sekvencama (pogledati npr., Itakura i dr., US Patent 4,704,362). Ćelije koje su integrisale DNK u svoje hromozome mogu se odabrati uvođenjem jednog ili više markera koji omogućavaju odabir transficiranih ćelija domaćina. Marker može pružiti prototrofiju za auksotrofnog domaćina, otpornost na biocid (npr., antibiotici) ili otpornost na teške metale poput bakra. Selektivni marker gen može biti direktno povezan sa DNK sekvencama koje treba eksprimirati ili uvesti u istu ćeliju kotransformacijom.

[0223] Primer vektora korisnog za eksprimiranje optimizovane FVIII sekvence je NEOSPLA (SAD patent br.6,159,730). Ovaj vektor sadrži promoter/pojačivač citomegalovirusa, glavni promoter beta globina kod miša, SV40 poreklo replikacije, sekvencu poliadenilacije goveđeg hormona rasta, ekson 1 i ekson 2 neomicin fosfotransferaze, gen dihidrofolat reduktaze i lidersku sekvencu. Utvrđeno je da ovaj vektor rezultuje vrlo visokim nivoom eksprimiranja antitela nakon ugradnje gena varijabilnog i konstantnog regiona, transfekcije u ćelijama, praćeno selekcijom u G418 koji sadrži medijum i amplifikaciju metotreksata. Sistemi vektora su takođe izloženi u SAD patent br.5,736,137 i 5,658,570. Ovaj sistem pruža visoke nivoe eksprimiranja, npr. > 30 pg/ćelija/dan. Obelodanjeni su drugi primerni vektorski sistemi npr., u SAD patentu br.6,413,777.

[0224] U drugim otelotvorenjima, polipeptidi mogu se eksprimirati upotrebom policistronskih konstrukata. U ovim sistemima eksprimiranja, višestruki genski proizvodi od interesa kao što su višestruki polipeptidi multimer-vezujućeg proteina mogu se proizvesti iz jednog policistronskog konstrukta. Ovi sistemi korisno koriste unutrašnje mesto za ulazak u ribozom (IRES) kako bi pružili relativno visok nivo polipeptida u eukariotskim ćelijama domaćinima. Kompatibilne IRES sekvence su obelodanjene u SAD patentu br.6,193,980, koji je takođe ovde obuhvaćen.

[0225] Uopštenije, kada se pripreme vektor ili DNK sekvenca koja kodira polipeptid, vektor eksprimiranja se može uvesti u odgovarajuću ćeliju domaćina. Odnosno, ćelije domaćina se mogu transformisati. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može se postići različitim tehnikama dobro poznatim stručnjacima, kao što je prethodno razmatrano. Transformisane ćelije se gaje pod uslovima pogodnim za proizvodnju FVIII polipeptida i ispituju se za sintezu FVIII polipeptida. Primerne tehnike ispitivanja uključuju enzimski imunološki test (ELISA), radioimunološki test (RIA) ili analizu sortiranja ćelija aktiviranu flourescencijom (FACS), imunohistohemiju i slično.

[0226] U opisima procesa za izolaciju polipeptida od rekombinantnih domaćina, izrazi „ćelija“ i „ćelijska kultura“ se koriste naizmenično da označe izvor polipeptida, osim ako nije jasno naznačeno drugačije. Drugim rečima, izvlačenje polipeptida iz „ćelija“ može značiti ili iz celih ćelija, ili iz ćelijske kulture koja sadrži i medijum i suspendovane ćelije.

[0227] Ćelijska linija domaćina koja se koristi za eksprimiranje proteina je poželjno sisarskog porekla; najpoželjnije ljudskog ili mišjeg porekla, pošto su izolovane nukleinske kiseline pronalaska optimizovane za eksprimiranje u ljudskim ćelijama. Primerne ćelijske linije domaćina su opisane iznad. U jednom otelotvorenju postupka za proizvodnju polipeptida sa FVIII aktivnošću, ćelija domaćin je HEK293 ćelija. U još jednom otelotvorenju postupka za proizvodnju polipeptida sa FVIII aktivnošću, ćelija domaćin je CHO ćelija.

[0228] Geni koji kodiraju polipeptide mogu se takođe eksprimirati u ćelijama koje nisu sisarske, kao što su bakterije ili ćelije kvasca ili biljke. S tim u vezi, treba imati na umu da se različiti jednoćelijski ne-sisarski mikroorganizmi, kao što su bakterije, takođe mogu transformisati; tj. one sposobne za kultivaciju u kulturama ili za fermentaciju. Bakterije koje su podložne transformaciji uključuju članove enterobakterija, kao što su sojevi Escherichia coli ili Salmonella; Bacillaceae, kao što je Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus i Haemophilus influenzae. Dalje će se uvažiti da, kada se eksprimiraju u bakterijama, polipeptidi tipično postaju deo inkluzijskih tela. Polipeptidi moraju biti izolovani, prečišćeni i zatim sastavljeni u funkcionalne molekule.

[0229] Alternativno, optimizovane nukleotidne sekvence pronalaska mogu se ugraditi u transgene za uvođenje u genom transgene životinje koja nije čovek, i naknadno eksprimiranje u mleku transgene životinje (pogledati, npr., Deboer i dr., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489, and Meade i dr., US 5,849,992). Pogodni transgeni uključuju kodirajuće sekvence polipeptida u operabilnoj vezi sa promoterom i pojačivačem iz gena specifičnog za mlečne žlezde, kao što su kazein ili beta laktoglobulin.

[0230] In vitro proizvodnja omogućava povećanje razbere kako bi se dobile velike količine željenih polipeptida. Tehnike za kultivaciju ćelija sisara u uslovima kulture tkiva poznate su u struci i uključuju homogenu suspenzionu kulturu, npr. u pneumatskom rekatoru ili u reaktoru sa neprekidnim mešanjem, ili imobilisanu ili zarobljenu ćelijsku kulturu, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na agaroznim mikrokuglicama ili keramičkim kertridžima. Ako je potrebno i/ili poželjeno, rastvori polipeptida mogu se prečistiti uobičajenim hromatografskim postupcima, na primer filtracijom gela, jonoizmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom preko DEAE-celuloze ili (imuno)afinitetnom hromatografijom npr., nakon preferencijalne biosinteze polipeptida sintetičkog zglobnog regiona ili pre ili posle ovde opisanog koraka HIC hromatografije. Sekvenca oznake afiniteta (npr. His(6) oznaka) može opciono biti pričvršćena ili uključena u polipeptidnu sekvencu kako bi se olakšalo nizvodno prečišćavanje.

[0231] Jednom eksprimiran, FVIII protein se može prečistiti u skladu sa standardnim procedurama u struci, uključujući taloženje amonijum sulfata, afinitetnu hromatografiju na koloni, HPLC prečišćavanje, elektroforezu gela i slično (pogledati uopšteno Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Za farmaceutsku upotrebu poželjni su suštinski čisti proteini sa najmanje oko 90 do 95% homogenosti, i najpoželjniji su od 98 do 99% ili više homogenosti.

Farmaceutski sastav

[0232] Sastavi koji sadrže izolovane nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu sadržati pogodan farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, mogu sadržati ekscipijense i/ili pomoćna sredstva koji olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate dizajnirane za isporuku na mesto dejstva.

[0233] Farmaceutski sastav se može formulisati za parenteralnu primenu (tj. intravenozno, subkutano ili intramuskularno) bolus injekcijom. Formulacije za injekcije mogu se predstaviti u obliku jedinične doze, npr., u ampulama, ili u višedoznim kontejnerima sa dodatkom konzervansa. Sastavi mogu da imaju takve oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u

1

uljanim ili vodenim nosačima, i sadrže formulacione agense kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili raspršivanje. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za konstituciju sa odgovarajućim nosačem, npr., vodom bez pirogena.

[0234] Pogodne formulacije za parenteralnu primenu takođe uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivom u vodi, na primer, soli rastvorljive u vodi. Pored toga, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja kao odgovarajuće masne suspenzije za injekcije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja, na primer, susamovo ulje, ili estre sintetičkih masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride. Vodene suspenzije za injekcije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i dekstran. Opciono, suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore. Lipozomi se takođe mogu koristiti za inkapsuliranje molekula pronalaska za isporuku u ćelije ili međućelijski prostor. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača su fiziološki kompatibilni rastvarači, disperzioni medijumi, obloge, antibakterijski i antifungalni agensi, izotonični agensi i agensi za usporavanje apsorpcije, voda, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, dekstroza, glicerol, etanol i slično. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. U drugim otelotvorenjima, sastavi sadrže farmaceutski prihvatljive supstance kao što su agensi za vlaženje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, konzervansi ili puferi, koji povećavaju rok trajanja ili efikasnost aktivnih sastojaka.

[0235] Sastavi pronalaska mogu biti u različitim oblicima, uključujući, na primer, tečni (npr., rastvori za injekcije i infuzije), disperzije, suspenzije, počučvrsti i čvrsti oblici doziranja. Poželjni oblik zavisi od načina primene i terapeutske primene.

[0236] Sastav se može formulisati kao rastvor, mikro emulzija, disperzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti uključivanjem aktivnog sastojka u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom gore navedenih sastojaka, prema potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem aktivnog sastojka u sterilni nosač koji sadrži osnovni medijum za disperziju i potrebne ostale sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje smrzavanjem koji daje prašak aktivnog

2

sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.

Odgovarajuća fluidnost rastvora može se održati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom tenzida.

Produžena apsorpcija sastava za injekcije može se postići uključivanjem u sastav agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.

[0237] Aktivni sastojak se može formulisati pomoću formulacije ili uređaja sa kontrolisanim oslobađanjem. Primeri takvih formulacija i uređaja uključuju implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, na primer, etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoesteri i polisirćetna kiselina. Postupci za pripremu takvih formulacija i uređaja poznati su u struci. Pogledati npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0238] Formulacije depoa za injekcije mogu se napraviti formiranjem mikrokapsuliranih matrica leka u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru i prirode polimera koji se koristi, brzina oslobađanja leka se može kontrolisati. Drugi primerni biorazgradivi polimeri su poliorthoesteri i polianhidridi. Depo formulacije za injekcije takođe se mogu pripremiti uvlačenjem leka u lipozome ili mikroemulzije.

[0239] Dodatna aktivna jedinjenja se mogu ugraditi u smeše. U jednom aspektu, himerni protein je formulisan sa drugim faktorom zgrušavanja, ili njegovom varijantom, fragmentom, analogom ili derivatom. Na primer, faktor zgrušavanja uključuje, ali nije ograničen na, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Faktor XII, Faktor XIII, protrombin, fibrinogen, fon Vilebrandov faktor ili rekombinantni rastvorljivi faktor tkiva (rsTF) ili aktivirani oblici bilo kog od gore navedenih. Faktor zgrušavanja hemostatskog agensa takođe može uključivati anti-fibrinolitičke lekove, npr., epsilon-amino-kapronska kiselina, traneksaminska kiselina.

[0240] Režimi doziranja se mogu prilagoditi kako bi se pružio optimalni željeni odgovor. Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena, ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati, kao što pokazuju potrebe terapijske situacije. Povoljno je formulisati parenteralne sastave u jediničnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Pogledati, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa.1980).

[0241] Pored aktivnog jedinjenja, tečni dozni oblik može sadržati inertne sastojke kao što su voda, etil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja, glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i esteri masnih kiselina sorbitana.

[0242] Neograničavajući primeri pogodnih farmaceutskih nosača su takođe opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences od E. W. Martin. Neki primeri ekscipijenasa uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol, i slično. Sastav takođe može sadržati pH puferske reagense i agense za vlaženje ili emulgovanje.

[0243] Za oralnu primenu, farmaceutski sastav može biti u obliku tableta ili kapsula pripremljenih na uobičajeni način. Sastav se takođe može pripremiti kao tečnost, na primer sirup ili suspenzija. Tečnost može sadržati suspenzione agense (npr., sorbitol sirup, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulgatore (lecitin ili bagrem), nevodene nosače (npr., bademovo ulje, masne estre, etil alkohol ili fragmentisano biljno ulje) i konzervanse (npr., metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati takođe mogu sadržati agense za aromatizaciju, bojenje i zaslađivanje. Alternativno, sastav može biti predstavljena kao suv proizvod za pripremu u vodi ili nekom drugom pogodnom nosaču.

[0244] Za bukalnu primenu, sastav može imati oblik tableta ili pastila prema konvencionalnim protokolima.

[0245] Za inhalaciju, jedinjenja za upotrebu prema predmetnom pronalasku se pogodno isporučuju u obliku nebulizovanog aerosola sa ili bez ekscipijenasa ili u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, sa opciono potisnim gasom, npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluorometan, ugljen-dioksid ili drugi odgovarajući gas. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica se može odrediti pružanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži od, npr., želatin za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru može se formulisati tako da sadrži mešavinu praška

4

jedinjenja i pogodnu bazu u obliku praška, poput laktoze ili skroba.

[0246] Farmaceutski sastav se takođe može formulisati za rektalnu primenu kao supozitorijum ili retencijski klistir, npr., koji sadrži konvencionalne baze supozitorijuma kao što su kakao puter ili drugi gliceridi.

[0247] U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav sadrži FVIII protein, optimizovani polinukleotid koji kodira FVIII protein, vektor koji sadrži polinukleotid ili ćeliju domaćina koja sadrži vektor i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, sastav se primenjuje putem odabranim iz grupe koja se sastoji od topikalne primene, intraokularne primene, parenteralne primene, intratekalne primene, subduralne primene i oralne primene. Parenteralna primena može biti intravenska ili subkutana primena,

[0248] U drugim otelotvorenjima, sastav se koristi za tretiranje bolesti ili stanja krvarenja kod pacijenta koji ima potrebu za tim. Bolest ili stanje krvarenja odabrano je iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja iz mišića, oralnog krvarenja, hemoragije, hemoragije u mišiće, oralne hemoragije, traume, traumatskog kapitisa, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intraabdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, frakture kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u omotaču iliopsoasa, i bilo koje njihove kombinacije. U još nekim otelotvorenjima, za pacijenta je predviđena operacija. U još jednom otelotvorenju, tretman je profilaktički ili na zahtev.

Postupci tretmana

[0249] Pronalazak pruža postupak za tretiranje poremećaja krvarenja koji uključuje primenu pacijentu koji ima potrebu za tim molekula nukleinske kiseline, ili vektora prema pronalasku. U nekim otelotvorenjima, poremećaj krvarenja karakteriše nedostatak Faktora VIII. U nekim otelotvorenjima, poremećaj krvarenja je hemofilija. U nekim otelotvorenjima, poremećaj krvarenja je hemofilija A. U nekim otelotvorenjima postupka za tretiranje poremećaja krvarenja, aktivnost Faktora VIII u plazmi tokom 24 sata nakon primene povećana je u odnosu na pacijenta kom se primenjuje referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 3, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid kodiran od strane referentnog molekula nukleinske kiseline.

[0250] Pronalazak se takođe odnosi na postupak tretmana, ublažavanja ili sprečavanja hemostatskog poremećaja kod pacijenta, koji se sastoji od primene terapeutski efikasne količine izolovanog molekula nukleinske kiseline prema pronalasku. Tretiranje, poboljšanje i prevencija izolovanog molekula nukleinske kiseline može biti bajpas terapija. Pacijent koji prima bajpas terapiju već je razvio inhibitor za faktor zgrušavanja, npr., Faktor VIII, ili je podložan razvoju inhibitora za faktor zgrušavanja.

[0251] Molekuli nukleinske kiseline, ili vektori prema pronalasku tretiraju ili sprečavaju hemostatski poremećaj promovišući stvaranje fibrinskog ugruška. FVIII protein može da aktivira člana koagulacione kaskade. Faktor zgrušavanja može biti učesnik u spoljašnjem, unutrašnjem putu ili oboje.

[0252] Molekuli nukleinske kiseline, ili vektori prema pronalasku mogu se koristiti za tretiranje hemostatskih poremećaja za koje se zna da se tretiraju sa FVIII. Hemostatski poremećaji koji se mogu tretirati postupcima pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, članove grupe koju čine hemofilija A, hemofilija B, fon Vilebrandova bolest, nedostatak Faktora XI (nedostatak PTA), nedostatak Faktora XII, kao i nedostatke ili strukturne abnormalnosti kod fibrinogena, protrombina, Faktora V, Faktora VII, Faktora X ili Faktora XIII, hemartroza, krvarenje iz mišića, oralno krvarenje, hemoragija, hemoragija u mišiće, oralna hemoragija, trauma, traumatični kapitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalna hemoragija, intraabdominalna hemoragija, intratorakalna hemoragija, fraktura kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču iliopsoasa. Sastavi za primenu pacijentu uključuju molekule nukleinske kiseline koji sadrže optimizovanu nukleotidnu sekvencu pronalaska koja kodira faktor zgrušavanja FVIII (za primene genske terapije), kao i molekule FVIII polipeptida.

[0253] U nekim otelotvorenjima, hemostatski poremećaj je nasledni poremećaj. U jednom otelotvorenju, pacijent ima hemofiliju A. U drugim otelotvorenjima, hemostatski poremećaj je rezultat nedostatka Faktora VIII. U drugim otelotvorenjima, hemostatski poremećaj može biti rezultat defektivnog FVIII faktora zgrušavanja.

[0254] U još jednom otelotvorenju, hemostatski poremećaj može biti stečeni poremećaj.

Stečeni poremećaj može biti posledica osnovne sekundarne bolesti ili stanja. Nepovezano stanje može biti, na primer, ali nije ograničeno na, rak, autoimunu bolest ili trudnoću. Stečeni poremećaj može biti posledica starosti ili lekova za tretiranje osnovnog sekundarnog poremećaja (npr. hemoterapija raka).

[0255] Pronalazak se takođe odnosi na postupke tretmana pacijenta koji nema hemostatski poremećaj ili sekundarnu bolest ili stanje koje rezultuje sticanjem hemostatskog poremećaja. Pronalazak se, prema tome, odnosi na postupak tretmana pacijenta kom je potreban opšti hemostatski agens, koji se sastoji od primene terapeutski efikasne količine izolovanog molekula nukleinske kiseline prema pronalasku. Na primer, u jednom otelotvorenju, pacijent kom je potreban opšti hemostatski agens je podvrgnut ili će uskoro biti podvrgnut operaciji. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku može se primeniti pre ili posle operacije kao profilaktički lek. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku može se primenjivati tokom ili posle operacije za kontrolu epizode akutnog krvarenja. Operacija može da uključuje, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre ili transplantaciju matičnih ćelija.

[0256] U još jednom otelotvorenju, izolovani molekul nukleinske kiseline pronalaska mogu se koristiti za tretiranje pacijenta koji ima epizodu akutnog krvarenja i koji nema hemostatski poremećaj. Epizoda akutnog krvarenja može biti posledica teške traume, npr., operacija, automobilska nesreća, rana, prostrelna rana ili bilo koji drugi traumatični događaj koji rezultuje nekontrolisanim krvarenjem.

[0257] Izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se koristiti za profilaktičko tretiranje pacijenta sa hemostatskim poremećajem. Izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se koristiti za tretiranje epizode akutnog krvarenja kod pacijenta sa hemostatskim poremećajem.

[0258] Proteinski sastav FVIII može da se primenjuje se u kombinaciji sa bar jednim drugim agensom koje promoviše hemostazu. Navedeni drugi agens koji promoviše hemostazu u terapiji sa pokazanom aktivnošću zgrušavanja. Kao primer, ali ne kao ograničenje, hemostatski agens može da sadrži Faktor V, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Faktor XII, Faktor XIII, protrombin ili fibrinogen ili aktivirane oblike bilo kog od navedenih. Faktor zgrušavanja ili hemostatski agens takođe mogu da uključuju antifibrinolitičke lekove, npr., epsilon-amino-kapronska kiselina, traneksaminska kiselina.

[0259] U jednom otelotvorenju pronalaska, sastav (npr., optimizovani molekul nukleinske kiseline koji kodira FVIII polipeptid) je onaj u kom je FVIII prisutan u aktivnom obliku kada se primenjuje pacijentu. Takav aktivirajući molekul se može aktivirati in vivo na mestu zgrušavanja nakon primene kod pacijenta.

[0260] Optimizovani molekul nukleinske kiseline koji kodira FVIII polipeptid može se primenjivati intravenozno, subkutano, intramuskularno ili preko bilo koje površine sluzokože, npr., oralno, sublingvalno, bukalno, sublingvalno, nazalno, rektalno, vaginalno ili pulmonalno.

[0261] Za oralnu primenu, farmaceutski sastav može biti u obliku tableta ili kapsula pripremljenih na uobičajeni način. Sastav se takođe može pripremiti kao tečnost, na primer sirup ili suspenzija. Tečnost može da sadrži agense za suspendovanje (npr. sorbitol sirup, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulgatore (lecitin ili bagrem), nevodene nosače (npr. bademovo ulje, masne estre, etiln alkohol ili fragmentisano biljno ulje) i konzervanse (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati takođe mogu sadržati agense za aromatizaciju, bojenje i zaslađivanje. Alternativno, sastav može biti predstavljen kao suv proizvod za pripremu u vodi ili nekom drugom pogodnom nosaču.

[0262] Za bukalnu i sublingvalnu primenu, sastav može imati oblik tableta, pastila ili filmova koji se brzo rastvaraju, prema konvencionalnim protokolima.

[0263] Za primenu inhalacijom, polipeptid koji ima FVIII aktivnost pogodno se isporučuje u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora (npr. i PBS), sa pogodnim potisnim gasom, npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluorometan, ugljen-dioksid ili drugi odgovarajući gas. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica se može odrediti pružanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži od, npr., želatin za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru može se formulisati tako da sadrži mešavinu praška jedinjenja i pogodnu bazu u obliku praška, poput laktoze ili skroba.

[0264] U jednom otelotvorenju, način primene optimizovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira FVIII polipeptid je parenteralni. Izraz parenteralno kako se ovde koristi uključuje intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu, subkutanu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Poželjan je intravenski oblik parenteralne primene. Iako se jasno podrazumeva da su svi ovi oblici primene u opsegu pronalaska, oblik za primenu bi bio rastvor za injekcije, posebno za intravensku ili intraarterijsku injekciju ili kapanje. Obično pogodan farmaceutski sastav za injekcije može sadržati pufer (npr. acetatni, fosfatni ili citratni pufer), surfaktant (npr. polisorbat), opciono agens za stabilizaciju (npr. ljudski albumin) itd. Međutim, u drugim postupcima kompatibilnim sa navodima ovde, optimizovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju FVIII polipeptide mogu se isporučiti direktno na mesto nepovoljne ćelijske populacije, povećavajući tako izloženost obolelog tkiva terapijskom agensu.

[0265] Pripreme za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i organski estri za injekcije kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferisane medije. U predmetnom pronalasku, farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, 0,01-0,1M i poželjno 0,05M fosfatni pufer ili 0,8% fiziološki rastvor. Ostali uobičajeni parenteralni nosači uključuju rastvore natrijum-fosfata, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, laktirani Ringerov rastvor ili fiksna ulja. Intravenski nosači uključuju agense za dopunjavanje tečnosti i hranljivih sastojaka, agensi za dopunjavanje elektrolita, poput onih na bazi Ringerove dekstroze, i slično. Takođe mogu biti prisutni konzervansi i drugi aditivi, kao što su, na primer, antimikrobni agensi, antioksidansi, helatni agensi, inertni gasovi i slično.

[0266] Preciznije, farmaceutske smeše pogodne za injekcije uključuju sterilne vodene rastvore (tamo gde su rastvorljivi u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za privremenu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. U takvim slučajevima, sastav mora biti sterilan i tečna do te mere da postoji laka mogućnost korišćenja u špricu. Trebalo bi da bude stabilno u uslovima proizvodnje i skladištenja, i po mogućstvu će biti sačuvano od zagađujućeg delovanja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata.

[0267] Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antimikotičnim agensima, na primer parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima bi bilo poželjno da se u sastav uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija sastav za injekcije može se postići uključivanjem u sastav agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijumskog monostearata i želatina.

[0268] U svakom slučaju, sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti uključivanjem aktivnog jedinjenja (npr., polipeptid sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensima) u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom ovde nabrojanih sastojaka, prema potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač, koji sadrži bazni medijum za disperziju i potrebne ostale sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje smrzavanjem, čime se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilnog filtriranog rastvora. Preparati za injekcije se obrađuju, pune u kontejnere kao što su ampule, kesice, bočice, špricevi ili epruvete i zapečaćuju pod aseptičnim uslovima prema postupcima poznatim u struci. Dalje, preparati mogu da se pakuju i prodaju u obliku kompleta. Takvi predmeti proizvodnje poželjno će imati nalepnice ili umetke pakovanja koji ukazuju da su pridruženi sastavi korisni za tretiranje pacijenta koji pati od poremećaja zgrušavanja, ili je predisponiran na njega.

[0269] Farmaceutski sastav se takođe može formulisati za rektalnu primenu kao supozitorijum ili retencijski klistir, npr., koji sadrži konvencionalne baze supozitorijuma kao što su kakao puter ili drugi gliceridi.

[0270] Efikasne doze sastava predmetnog pronalaska za tretiranje stanja variraju u zavisnosti od mnogih različitih faktora, uključujući način primene, ciljano mesto, fiziološko stanje pacijenta, bilo da je pacijent čovek ili životinja, drugih lekova koji se primenjuju, kao i da li je tretiranje profilaktičko ili terapijsko. Obično je pacijent čovek, ali sisari koji nisu ljudi, uključujući transgene sisare, takođe mogu da se tretiraju. Doziranja za tretiranje mogu se titrirati rutinskim postupcima poznatim stručnjacima kako bi se optimizovale sigurnost i efikasnost.

[0271] Doziranja se mogu kretati od 1000 ug/kg do 0,1 ng/kg telesne težine. U jednom otelotvorenju, raspon doziranja je od 1 ug/kg do 100 ug/kg. FVIII polipeptid ili optimizovani molekul nukleinske kiseline koji kodira FVIII polipeptid mogu se primenjivati kontinuirano ili u određenim vremenskim intervalima. In vitro testovi se mogu koristiti za određivanje optimalnih raspona doza i/ili rasporeda primene. U struci su poznati in vitro testovi koji mere aktivnost faktora zgrušavanja. Pored toga, efikasne doze se mogu ekstrapolirati iz krivih doza-odgovor dobijenih na životinjskim modelima, npr., pas sa hemofilijom (Mount i dr. 2002, Blood 99 (8); 2670).

[0272] Intermedijarne doze u gore navedenim rasponima takođe treba da budu u opsegu pronalaska. Pacijentima mogu da se primenjuju doze svakodnevno, naizmeničnim danima, nedeljno ili prema bilo kom drugom rasporedu utvrđenim empirijskom analizom. Primer za tretiranje podrazumeva primenu iz više doza tokom dužeg perioda, na primer, od najmanje šest meseci. U nekim postupcima, dva ili više polipeptida mogu se primeniti istovremeno, u kom slučaju doza svakog primenjenog polipeptida spada u naznačene raspone.

[0273] FVIII polipeptidi ili optimizovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju FVIII polipeptide mogu se primenjivati u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti dnevni, nedeljni, mesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu biti neredovni, što se pokazuje merenjem nivoa modifikovanog polipeptida ili antigena u krvi kod pacijenta.

Alternativno, polipeptidi se mogu primenjivati kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna ređa primenu. Doziranje i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota polipeptida ili polinukleotida kod pacijenta.

[0274] Doziranje i učestalost primene mogu varirati u zavisnosti od toga da li je tretiranje profilaktičko ili terapijsko. U profilaktičkim primenama, sastavi koje sadrže FVIII polipeptid ili optimizovani molekul nukleinske kiseline koji kodiraju FVIII polipeptid ili njegov koktel primenjuju se pacijentu koji još uvek nije u bolesnom stanju, kako bi se poboljšala otpornost pacijenta ili minimizovali efekti bolesti. Takva količina je definisana kao „profilaktički efikasna doza“. Relativno niska doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da dobijaju tretman do kraja svog života.

1

[0275] FVIII polipeptidi ili optimizovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju FVIII polipeptide mogu se opciono primenjivati u kombinaciji sa drugim agensima koji su efikasni u tretmanu poremećaja ili stanja kojima je potrebno tretiranje (npr., profilaktički ili terapijski).

[0276] Kako se ovde koristi, primena FVIII polipeptida ili optimizovanih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju FVIII polipeptide u sprezi ili u kombinaciji sa dodatnom terapijom znači sekvencijalnu ili istovremenu primenu terapije i obelodanjenih polipeptida. Stručnjaci će shvatiti da primena različitih komponenti kombinovanog terapijskog režima može da se odredi kako bi se poboljšala ukupna efikasnost tretmana. Kvalifikovani stručnjak (npr. lekar) bio bi lako u stanju da razazna efikasne kombinovane terapijske režime bez nepotrebnog eksperimentisanja na osnovu odabrane pomoćne terapije i navoda predmetne specifikacije.

[0277] Dalje će se razumeti da se FVIII polipeptid ili optimizovani molekul nukleinske kiseline koji kodiraju FVIII polipeptid mogu koristiti u sprezi ili u kombinaciji sa agensom ili agensima (npr. za pružanje kombinovanog terapijskog režima). Primeri agenasa sa kojima se polipeptid ili polinukleotid mogu kombinovati uključuju agense koja predstavljaju trenutni standard nege za određeni poremećaj koji se tretira. Takvi agensi mogu biti hemijske ili biološke prirode. Izraz „biološki“ ili „biološki agens“ odnosi se na bilo koji farmaceutski aktivan agens napravljen od živih organizama i/ili njihovih proizvoda koje je namenjeno za upotrebu kao terapeutski agens.

[0278] Količina agensa koji se koristi u kombinaciji sa polinukleotidima ili polipeptidima može da varira u zavisnosti od pacijenta ili se može primenjivati u skladu sa onim što je poznato u struci. Pogledati na primer, Bruce A Chabner i dr., Antineoplastic Agents, u GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman i dr., eds., 9th ed.1996). U još jednom otelotvorenju, primenjuje se količina takvog agensa koja je u skladu sa standardom nege.

[0279] Kao što je prethodno razmatrano, polinukleotidi i polipeptidi mogu se primenjivati u farmaceutski efikasnoj količini za in vivo tretiranje poremećaja zgrušavanja. S tim u vezi, treba imati na umu da polipeptidi ili polinukleotidi mogu biti formulisani tako da olakšaju

2

primenu i unaprede stabilnost aktivnog agensa. Poželjno je da farmaceutske smeše u skladu sa predmetnim pronalaskom sadrže farmaceutski prihvatljiv, netoksičan, sterilni nosač kao što je fiziološki rastvor, netoksični puferi, konzervansi i slično. Naravno, farmaceutske smeše predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u jednoj ili više doza, kako bi se pružila farmaceutski efikasna količina polipeptida.

[0280] Dostupni su brojni testovi za procenu funkcije sistema koagulacije: test vremena aktiviranog delimičnog tromboplastina (aPTT), hromogeni test, ROTEM® test, test vremena protrombina (PT) (takođe se koristi za određivanje INR), ispitivanje fibrinogena (često putem Clauss postupka), broj trombocita, ispitivanje funkcije trombocita (često PFA-100), TCT, vreme krvarenja, test mešanja (da li se abnormalnost ispravlja ako se pacijentova plazma meša sa normalnom plazmom), testovi faktora koagulacije, antifosfolipidna antitela, D-dimer, genetski testovi (npr., Faktor V Leiden, mutacija protrombina G20210A), vreme razblaženog otrova Daboia russelii (dRVVT), testovi različitih funkcija trombocita, tromboelastografija (TEG ili Sonoclot), tromboelastometrija (TEM®, npr. ROTEM®) ili vreme lize euglobulina (ELT).

[0281] aPTT test je pokazatelj performansi koji meri efikasnost i „unutrašnjeg“ (takođe se navodi kao puta dodirne aktivacije) i uobičajenih puteva koagulacije. Ovaj test se obično koristi za merenje aktivnosti zgrušavanja komercijalno dostupnih rekombinantnih faktora zgrušavanja, npr., FVIII ili FIX. Koristi se zajedno sa protrombinskim vremenom (PT), koje meri spoljni put.

[0282] ROTEM® analiza pruža informacije o celokupnoj kinetici hemostaze: vremenu zgrušavanja, stvaranju ugrušaka, stabilnosti ugrušaka i lizi. Različiti parametri u tromboelastometriji zavise od aktivnosti sistema plazmatične koagulacije, funkcije trombocita, fibrinolize ili mnogih faktora koji utiču na ove interakcije. Ovaj test može pružiti potpun prikaz sekundarne hemostaze.

Genska terapija

[0283] Pronalazak pruža postupak za povećanje eksprimiranja polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII kod pacijenta koji se sastoji od primene izolovanog molekula nukleinske kiseline prema pronalasku pacijentu koji ima potrebu za tim, gde je eksprimiranje polipeptida povećano u odnosu na referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 3.

Pronalazak takođe pruža postupak za povećanje eksprimiranja polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII kod pacijenta koji se sastoji od primene vektora prema pronalasku pacijentu koji ima potrebu za tim, gde je eksprimiranje polipeptida povećano u odnosu na vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline.

[0284] Somatska genska terapija je istražena kao mogući način tretmana hemofilije A.

Genska terapija je posebno privlačan tretman hemofilije zbog svog potencijala da izleči bolest kontinuiranom endogenom proizvodnjom FVIII nakon pojedinačne primene vektora. Hemofilija A je vrlo pogodna za pristup zamene gena, jer se njene kliničke manifestacije u potpunosti mogu pripisati nedostatku jednog genskog proizvoda (FVIII) koji cirkuliše u malim količinama (200ng/ml) u plazmi.

[0285] Može se proizvesti FVIII protein in vivo kod sisara, npr., ljudski pacijent, koristeći pristup genske terapije za tretiranje bolesti ili poremećaja krvarenja odabranih iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja mišića, oralnog krvarenja, hemoragije, hemoragije u mišiće, oralne hemoragije, traume, traume capitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intraabdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, frakture kostije, krvarenja centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru i krvarenja u omotaču iliopsoasa, imao bi terapeutske benefite. U jednom otelotvorenju, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija. U još jednom otelotvorenju, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija A. To uključuje primenu optimizovanog FVIII koji kodira nukleinsku kiselinu operativno povezanu sa pogodnim sekvencama kontrole eksprimiranja. U određenom otelotvorenju, ove sekvence su ugrađene u virusni vektor. Pogodni virusni vektori za takvu gensku terapiju uključuju adenovirusne vektore, lentivirusne vektore, bakulovirusne vektore, Epštajn-Bar virusne vektore, papovavirusne vektore, vektore virusa vakcinije , herpes simpleks virusne vektore i vektore adeno-povezanih virusa (AAV). Virusni vektor može biti virusni vektor oštećen replikacijom. U drugim otelotvorenjima, adenovirusni vektor ima brisanje u svom E1 genu ili E3 genu. Kada se koristi adenovirusni vektor, sisar ne može biti izložen nukleinskoj kiselini koja kodira selektivni marker gen. U drugim otelotvorenjima, sekvence su ugrađene u nevirusni vektor poznat stručnjacima.

[0286] Svi ovde opisani različiti aspekti, otelotvorenja i opcije mogu se kombinovati u bilo kojoj varijanti.

4

[0287] Nakon generalnog opisivanja predmetnog pronalaska, dalje razumevanje se može dobiti pozivanjem na ovde date primere. Ovi primeri su samo za ilustraciju i nisu ograničeni.

PRIMERI

[0288] Dve kodonski optimizovane BDD FVIII sekvence dizajnirane su sa narednim ciljevima:

1. Ukloniti sve sekvence nalik regionu vezivanja matrica (MAR) (ATATTT i AAATAT; SEQ ID NO: 5 i 6, respektivno);

2. Ukloniti sve destabilizujuće sekvence (ATTTA, SEQ ID NO: 8 i TAAAT, SEQ ID NO: 9); 3. Ukloniti sekvence vezivanja promotera (TATAA, SEQ ID NO: 12 i TTATA, SEQ ID NO: 13);

4. Ukloniti elemente sekvence bogate sa AU (ARE): ATTTTATT (nukleotid 2468) i ATTTTTAA (nukleotid 3790) (SEQ ID NO: 14 i 15, respektivno);

5. Dodajti kozak sekvencu (GCCGCCACCATGC, podvučeno označava kodon početka translacije; SEQ ID NO: 16) za povećanje translacione inicijacije;

6. Prilagoditi restrikciona mesta kako bi se olakšalo kloniranje;

7. Prilagoditi upotrebu kodona kodonskoj sklonosti homo sapiens gena;

8. Prilagoditi kako bi se izbegli regione sa vrlo visokim (> 70%) ili niskim (<30%) sadržajem GC, što može povećati stabilnost RNK ili produžiti polu-život RNK.

Primer 1: Optimizacija kodona pomoću GENSCRIPT OPTIMUMGENE™

[0289] Nukleotidna sekvenca BDD FVIII kodonski je optimizovana korišćenjem tehnologije optimizacije kodona GENSCRIPT OPTIMUMGENE™. (GenScript Corp., New Jersey, USA). Tehnologija optimizacije kodona GENSCRIPT OPTIMUMGENE™ opisana je kod Burgess-Brown i dr., Protein Expr Purif.59(1):94-102 (2008).

[0290] Za optimizaciju su korišćeni naredni podaci o upotrebi ljudskog kodona:

[0291] Upotreba kodona prilagođena je ljudskoj sklonosti sa indeksom adaptacije ljudskog kodona (CAI) koji se promenio od 0,75 (divlji tip BDD FVIII) na 0,88 (GenScript optimizovan BDD FVIII). G/C sadržaj povećan je sa 46,16% na 51,56%. Uklonjeni su vrhovi G/C sadržaja u prozoru od 60 bp. Dobijena sekvenca od GenScript optimizovanog BDD FVIII je ovde obelodanjena kao SEQ ID NO: 1, i prikazana je na Slici 2.

Primer 2: Optimizacija kodona pomoću GENEART® GENEOPTIMIZER®

[0292] Nukleotidna sekvenca BDD FVIII je kodonski optimizovana korišćenjem GENEART® GENEOPTIMIZER® softvera. (Invitrogen LIFE TECHNOLOGIES™ Corp., Grand Island, NY). GENEART® GENEOPTIMIZER® tehnologija optimizacije kodona opisana je kod Graf i dr., J. Virol.74(22):10822-10826 (2000).

[0293] Upotreba kodona prilagođena je ljudskoj sklonosti sa promenom indeksa adaptacije ljudskog kodona (CAI) sa 0,75 (divlji tip BDD FVIII) na 0,96 (GeneArt optimizovan BDD FVIII). G/C sadržaj povećan je sa 46,16% na 59%. Dobijena sekvenca od GenScript optimizovanog BDD FVIII je ovde obelodanjena kao SEQ ID NO: 2 i prikazana je na Slici 3.

Primer 3: Ekspresioni konstrukti

[0294] Svi konstrukti su napravljeni u Invitrogen pcDNK™4 vektorskoj kičmi, koja sadrži promoter ljudskog citomegalovirusa (CMV), QBI SP163 pojačivač translacije i ZEOCIN™ rezistentni gen za selekciju.

[0295] pSYN-FVIII-066 pokreće eksprimiranje divljeg tipa BDD FVIII (SEQ ID NO: 3) u pcDNK4 kičmi (Invitrogen).

[0296] pSYN-FVIII-116 pokreće eksprimiranje kodonski optimizovanog BDD FVIII (SEQ ID NO: 1) u pcDNK4 kičmi. Konstrukt je izveden iz pSYN-FVIII-066 zamenom divljeg tipa BDD FVIII sa kodonski optimizovanim BDD FVIII (SEQ ID NO: 1) koristeći BsiWI i XhoI mesta.

[0297] pSYN-FVIII-115 pokreće eksprimiranje kodonski optimizovanog BDD FVIII (SEQ ID NO: 2) u pcDNK4 kičmi. Konstrukt je izveden iz pSYN-FVIII-066 zamenom divljeg tipa BDD FVIII sa kodonski optimizovanim BDD FVIII (SEQ ID NO: 2) koristeći BsiWI i XhoI mesta.

[0298] Svi konstrukti su potvrđeni DNK sekvenciranjem.

Primer 4: Optimizacija kodona poboljšava eksprimiranje FVIII kod HemA miša [0299] Kako bi se postavilo pitanje da li neki od kodonski optimizovanih BDD FVIII konstrukata rezultuje povećanim eksprimiranjem FVIII proteina, ekspresioni plazmidi pSYN-FVIII116, pSYN-FVIII115 i kontrola divljeg tipa pSYN-FVIII-066 uvedeni su u HemA miševe hidrodinamičkom injekcijom. Posle toga, nivoi eksprimiranja FVIII praćeni su kod svakog injektiranog miša hromogenim testovima u plazmi.

[0300] Hidrodinamička injekcija je efikasan i siguran nevirusni postupak za isporuku gena u jetru malim životinjama, kao što su miševi i pacovi. Protein od interesa se proizvodi u jetri, i može se otkriti u roku od 24 sata nakon injekcije.

[0301] HemA miševi težine 20-35 grama injektirani su putem intravenske injekcije repne vene sa pSYN-FVIII116, pSYN-FVIII115 ili sa kontrolom divljeg tipa pSYN-FVIII-066. Injekcije su napravljene sa 10ug gole plazmidne DNK bez endotoksina u 0,9% sterilnom fiziološkom rastvoru, do ukupne zapremine 2 ml. Injekcije su izvedene brzo, ne treba više od 4-7 sekundi da se ubrizga puni rastvor DNK od 2 ml. Miševi su bili pažljivo nadgledani dva sata nakon injekcije, ili dok nije nastavljena normalna aktivnost.24 sata nakon injekcije, uzorci su sakupljeni retro orbitalnim uzimanjem krvi, pripremljena je plazma i čuvana na -80°c za dalju analizu.

[0302] FVIII aktivnost je merena pomoću COATEST SP FVIII kompleta od DiaPharma (lot# N089019) i sve inkubacije su izvedene na grejaču ploče sa 37°C uz mućkanje. rFVIII standardi su se kretali od 100 mIU/ml do 0,78 mIU/ml. Objedinjena kontrola normalnog ispitivanja ljudske plazme i uzorci plazme (razblaženi sa IX Coatest puferom) dodati su u Immulon 2HB ploče sa 96 komorica u duplikatu (25 µL/komorica). Sveže pripremljena mešavina IXa/FX/fosfolipida (50 µL), 25 µL 25mM CaCl2, i 50 µL FXa supstrata je dodato sekvencijalno u svaku komorica sa 5 minuta inkubacije između svakog dodavanja. Nakon inkubacije sa supstratom, dodato je 25 µL 20% sirćetne kiseline kako bi se prekinula reakcija bojenja, i apsorbancija na OD405 je izmerena SpectraMAX plus (Molecular Devices) instrumentom. Podaci su analizirani SoftMax Pro (verzija 5.2) softverom. Najniži nivo kvantifikacije (LLOQ) je 7,8 mIU/mL. Rezultati su prikazani na Slici 7.

[0303] Niski nivoi aktivnosti BDD FVIII obelodanjeni su nakon primene FVIII ekspresionog plazmida pSYN-FVIII-066 (kontrola divljeg tipa BDD FVIII). Prosečna aktivnost BDD FVIII kod kontrolnih miševa je oko 4-5 IU/mL (Slika 7, krugovi). Suprotno tome, u plazmi miševa kojima je primenjen kodonski optimizovani pSYN-FVIII115 ili pSYN-FVIII116 (Slika 7, kvadrati i trouglovi), u proseku se primećuje približno trostruko povećanje aktivnosti BDD FVIII. Stoga, kodonska optimizacija BDD FVIII prema gore opisanim pristupima poboljšava eksprimiranje FVIII u modelu HemA miša.

SEKVENCE

1

�

�

SEQ ID NO:5 - MAR/ARS nukleotidna sekvenca ATATTT SEQ ID NO:6 - MAR/ARS nukleotidna sekvenca AAATAT SEQ ID NO:7 - Potencijalno mesto splajsovanja GGTGAT SEQ ID NO:8 - Destabilizujuća sekvenca ATTTA SEQ ID NO:9 - Destabilizujuća sekvenca

TAAAT

SEQ ID NO:10 - poli-T sekvenca

TTTTTT SEQ ID NO:11 - poli-A sekvenca

AAAAAAA SEQ ID NO:12 - Mesto vezivanja promotera

TATAA SEQ ID NO:13 - Mesto vezivanja promotera

TTATA SEQ ID NO:14 - Elementi sekvence bogati sa AU (ARE) ATTTTATT SEQ ID NO:15 - Elementi sekvence bogati sa AU (ARE) ATTTTTAA SEQ ID NO:16 - Kozak konsenzus sekvenca GCCGCCACCATGC SEQ ID NO:17 - CTP peptid DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL SEQ ID NO:18 - CTP peptid SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ SEQ ID NO:19 - sekvenca jezgra albumin-vezujućih peptida DICLPRWGCLW SEQ ID NO:20 - PAS sekvenca ASPAAPAPASPAAPAPSAPA SEQ ID NO:21 - PAS sekvenca AAPASPAPAAPSAPAPAAPS SEQ ID NO:22 - PAS sekvenca APSSPSPSAPSSPSPASPSS SEQ ID NO:23 - PAS sekvenca APSSPSPSAPSSPSPASPS SEQ ID NO:24 - PAS sekvenca SSPSAPSPSSPASPSPSSPA SEQ ID NO:25 - PAS sekvenca AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA SEQ ID NO:26 - PAS sekvenca

ASAAAPAAASAAASAPSAAA

�

11

��

1

��

�

�

SPISAK SEKVENCI

[0305]

<110> Biogen Idec MA Inc.

<120> Gen optimizovanog Faktora VIII <130> 2159,378PC01

<140> treba da bude dodeljeno <141> 2014-02-14

<150> 61/765,626

<151> 2013-02-15

<160> 51

<170> PatentIn verzija 3.5

<210> 1

<211> 4404

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> optimizovan BDD FVIII <400> 1

1

�

�

<211> 4419

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> optimizovan BDD FVIII <400> 2

11

<211> 4371

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Matični BDD FVIII <400> 3

11

<211> 1438

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> BDD FVIII <400> 4

11

11

11

11

11

��

<211> 6

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> MAR/ARS <400> 5

atattt 6

<210> 6

<211> 6

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<223> MAR/ARS

<400> 6

aaatat 6

<210> 7

<211> 6

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Potencijalno mesto splajsovanja <400> 7

ggtgat 6

<210> 8

<211> 5

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Destabilizujuća sekvenca <400> 8

attta 5

<210> 9

<211> 5

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Destabilizujuća sekvenca <400> 9

taaat 5

<210> 10

<211> 6

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> poli-T sekvenca

tttttt 6

<210> 11

<211> 7

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> poli-A sekvenca

<400> 11

aaaaaaa 7

<210> 12

<211> 5

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Mesto vezivanja promotera

<400> 12

tataa 5

<210> 13

<211> 5

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sekvenca vezivanja promotera <400> 13

ttata 5

<210> 14

<211> 8

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Elementi sekvence bogati sa AU (ARE) <400> 14

attttatt 8

12 <211> 8

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Elementi sekvence bogati sa AU (ARE) <400> 15

atttttaa 8

<210> 16

<211> 13

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Kozak konsenzus sekvenca

<400> 16

gccgccacca tgc 13

<210> 17

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CTP peptid

<400> 17

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CTP peptid

<400> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> sekvenca jezgra albumin-vezujućih peptida <400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> PAS sekvenca

<400> 20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> PAS sekvenca

<400> 21

<210> 22

<211> 20

12

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> PAS sekvenca <400> 22

<210> 23

<211> 19

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> PAS sekvenca <400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> PAS sekvenca <400> 24

<210> 25

<211> 24

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> PAS sekvenca

12

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> PAS sekvenca <400> 26

<210> 27

<211> 16842

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 27

12

��

��

�

11

��

�

��

�

<211> 2813

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (2016)..(2016)

<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina koja se javlja u prirodi <400> 28

1

�

�

�

��

��

��

��

��

<211> 4

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Ljudski IgG1 <400> 29

<210> 30

<211> 42

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

14

<223> XTEN AE42-4 <400> 30

<210> 31

<211> 126

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE42-4 <400> 31

<210> 32

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-2A <400> 32

14

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-2A <400> 33

<210> 34

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-3B <400> 34

1

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-3B <400> 35

<210> 36

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-4A <400> 36

1 1

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-4A <400> 37

<210> 38

<211> 144

<212> PRT

1 2

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-5A <400> 38

<210> 39

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-5A <400> 39

1

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-6B <400> 40

<210> 41

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AE144-6B

1 4

<210> 42

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-1 <400> 42

<210> 43

1

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-1 <400> 43

<210> 44

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-A <400> 44

1

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-A <400> 45

<210> 46

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-B <400> 46

1

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-B <400> 47

<210> 48

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-C <400> 48

1

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-C <400> 49

<210> 50

<211> 144

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-F <400> 50

1

<211> 450

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> XTEN AG144-F <400> 51

1

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 1, gde nukleotidna sekvenca kodira polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII.

2. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, gde nukleotidna sekvenca kodira FVIII sa obrisanim B domenom.

3. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde nukleotidna sekvenca ima jednu ili više narednih karakteristika:

(a) nukleotidna sekvenca sadrži veći procenat G/C nukleotida u odnosu na SEQ ID NO: 3; (b) nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci u odnosu na SEQ ID NO: 3; (c) nukleotidna sekvenca ne sadrži mesto splajsovanja GGTGAT (SEQ ID NO: 7);

(d) nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata (SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 9) u odnosu na SEQ ID NO: 3;

(e) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-T sekvencu (SEQ ID NO: 10);

(f) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-A sekvencu (SEQ ID NO: 11); ili

(g) indeks adaptacije ljudskog kodona je povećan u odnosu na SEQ ID NO: 3.

4. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3, gde

(a) indeks adaptacije ljudskog kodona iznosi najmanje oko 0,75, najmanje oko 0,76, najmanje oko 0,77, najmanje oko 0,78, najmanje oko 0,79, najmanje oko 0,80, najmanje oko 0,81, najmanje oko 0,82, najmanje oko 0,83, najmanje oko 0,84, najmanje oko 0,85, najmanje oko 0,86, najmanje oko 0,87, ili najmanje oko 0,88;

(b) procenat G/C nukleotida iznosi najmanje oko 45%, najmanje oko 46%, najmanje oko 47%, najmanje oko 48%, najmanje oko 49%, ili najmanje oko 50%;

(c) nukleotidna sekvenca sadrži najviše jednu MARS/ARS sekvencu; ili

(d) nukleotidna sekvenca sadrži najviše 4 destabilizujuća elementa.

5. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, koji dalje sadrži heterolognu nukleotidnu sekvencu.

6. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5, gde heterologna nukleotidna sekvenca kodira heterolognu aminokiselinsku sekvencu koja je produživač polu-života.

7. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6, gde heterologna aminokiselinska sekvenca jeste konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, transferin, albumin ili PAS sekvenca.

8. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 7, gde heterologna aminokiselinska sekvenca jeste Fc region.

9. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, gde nukleotidna sekvenca sadrži SEQ ID NO: 1.

10. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 9.

11. Vektor prema patentnom zahtevu 10, gde je vektor odabran između adenovirusnog vektora, lentivirusnog vektora, bakulovirusnog vektora, vektora Epštajn-Barovog virusa, papovavirusnog vektora, vektora virusa vakcinije, vektora herpes simpleks virusa i vektora adeno-povezanog virusa (AAV).

12. Ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 9 ili vektor prema patentnom zahtevu 10 ili 11.

13. Postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII, koji obuhvata: kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 12 pod uslovima u kojima se proizvodi polipeptid sa aktivnošću Faktora VIII; i izvlačenje polipeptida sa aktivnošću Faktora VIII.

14. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 9, ili vektor iz patentnog zahteva 10 ili 11, za upotrebu u tretmanu poremećaja krvarenja kod pacijenta koji ima potrebu za tim.