ES2858248T3 - Receptores de linfocitos T con afinidad potenciada y métodos para preparar los mismos - Google Patents

Abstract

Un método para generar un receptor de linfocitos T (TCR) con afinidad potenciada, que comprende: a. poner en contacto una o más células progenitoras hematopoyéticas con una o más células estromales y un antígeno peptídico, en condiciones y durante un tiempo suficientes para inducir la diferenciación de al menos unas células progenitoras hematopoyéticas en timocitos doble negativos (DN) TCRαβ+, en donde la una o más células progenitoras hematopoyéticas comprenden un polinucleótido no endógeno que codifica una cadena TCRα de un TCR precursor específica para el antígeno peptídico, y en donde la una o más células estromales comprenden un polinucleótido no endógeno que codifica Delta-like-1 o Delta-like-4 y un polinucleótido que codifica una molécula MHC; b. introducir polinucleótidos que codifican cadenas TCRβ de los timocitos DN TCRαβ+ generados en la etapa (a) en células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular y que comprenden el polinucleótido no endógeno que codifica la cadena TCRα de la etapa (a); c. identificar TCR con afinidad potenciada expresado por al menos una o más células generadas en la etapa (b), en donde el TCR con afinidad potenciada es opcionalmente un TCR humano.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de linfocitos T con afinidad potenciada y métodos para preparar los mismos

Antecedentes

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a receptores de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) con afinidad potenciada ) y, más particularmente, al uso de selección agonista de células progenitoras hematopoyéticas que expresan un TCRa específico de antígeno para generar TCR con afinidad potenciada y a los usos de los mismos.

Descripción de la técnica relacionada

La terapia génica con TCR es un enfoque de tratamiento emergente que puede superar muchos de los obstáculos asociados con la inmunoterapia adoptiva con linfocitos T convencional, tal como el tiempo y la mano de obra extensos necesarios para aislar, caracterizar y expandir clones de linfocitos T específicos de antígenos tumorales (Schmitt, Ragnarsson, & Greenberg, 2009, Hum. Gene Ther. 20:1240-1248). Otros beneficios de la terapia génica incluyen la capacidad de utilizar poblaciones definidas de linfocitos T capaces de persistir a largo plazo. in vivo (Berger et al., 2008, J. Clin. Invest. 118:294-305; Hinrichs et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:17469-17474). Estos linfocitos T se pueden transducir con genes que codifican TCR bien caracterizados que tienen una alta afinidad por antígenos tumorales, aumentando, de este modo, la probabilidad de mediar un efecto antitumoral. De hecho, un informe reciente de terapia dirigida a leucemia de linfocitos B avanzada con linfocitos T modificados genéticamente que expresan un receptor quimérico de alta afinidad dirigido a un antígeno propio/tumoral ha destacado el potencial de utilizar linfocitos T de alta avidez modificados por ingeniería para el tratamiento de la leucemia (Kalos et al., 2011, Sci. Transl. Med.

3:95ra73). Sin embargo, debido a que la mayoría de los antígenos tumorales a los que se dirige la inmunoterapia con linfocitos T son autoproteínas sobreexpresadas, los linfocitos T de alta afinidad específicos para estos antígenos generalmente están sujetos a selección negativa en el timo. Por lo tanto, una limitación significativa de las inmunoterapias basadas en linfocitos T, en general, es la disponibilidad limitada de linfocitos T que expresan un TCR endógeno con una afinidad suficientemente alta por antígenos tumorales no mutados.

Se han creado varias estrategias para potenciar la afinidad de los TCR destinados a su uso en terapia génica con TCR (Richman & Kranz, 2007, Biomol. Eng. 24:361-373; Udyavar et al., 2009, J. Immunol. 182:4439-4447; Zhao et al., 2007, J. Immunol. 179:5845-5854). Estos enfoques generalmente implican la generación de bibliotecas de mutantes de TCR que se han sometido a rondas de mutagénesis y la posterior selección de mutaciones que confieren una mayor afinidad por el ligando diana péptido/MHC. Las mutaciones se realizan generalmente en las regiones CDR que se sabe que interactúan con el péptido/MHC. Las regiones CDR1 y CDR2 entran en contacto predominantemente con la molécula MHC, mientras que la región CDR3 hipervariable entra en contacto principalmente con el péptido (Wucherpfennig et al., 2010, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2:a005140-a005140). Las estrategias de mutagénesis dirigida generalmente se dirigen a porciones seleccionadas de estas tres regiones, pero, aun así, no siempre tienen éxito en la generación de una variante de mayor afinidad, y las mejoras se limitan solamente a cambios en las regiones específicamente dirigidas. Además, las mutaciones introducidas en los restos de contacto con MHC tienen el riesgo de aumentar potencialmente la afinidad del TCR por MHC al tiempo que disminuyen la especificidad general del receptor por su péptido afín. En el mejor de los casos, la mayoría de las mutaciones introducidas para potenciar la afinidad de un t Cr estarían restringidas a la región CDR3 por esta razón. Sin embargo, las metodologías actuales tienen una capacidad limitada para generar diversidad de CDR3, porque la mutagénesis dirigida está limitada por la longitud original de la región CDR3.

Weber et al., (PNAS (2005) 102(52): 19033-19038) describieron un receptor de linfocitos T restringido de clase II modificado por ingeniería in vitro para obtener una mayor afinidad que conserva la especificidad por el péptido y la función.

Li et al., (Nature Biotech (2005) 23(3): 349-354) describieron la evolución dirigida de los receptores de linfocitos T humanos con afinidades picomolares mediante presentación en fagos.

Dada la dificultad de aislar linfocitos T de alta afinidad que reconocen antígenos asociados a tumores de interés, existe una necesidad continua de métodos alternativos para generar TCR con afinidad potenciada.

Breve sumario

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para generar un TCR con afinidad potenciada que comprende: a) poner en contacto células progenitoras hematopoyéticas con células estromales y un antígeno peptídico, en condiciones y durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas en timocitos DN TCRap+, en donde las células progenitoras hematopoyéticas comprenden una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica una cadena TCRa de un TCR precursor específico para el antígeno peptídico, y en donde las células estromales comprenden una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica Delta-like-1 o Delta-like-4 y una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC; b) aislar secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las diversas cadenas TCRp de los timocitos DN TCRap+ e introducir las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas TCRp en células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular y que comprenden la secuencia del ácido nucleico que codifica la cadena TCRa de la etapa a); e identificar TCR con afinidad potenciada (por ejemplo, detectando o seleccionando un candidato de TCRap de alta afinidad mediante un ensayo de tetrámeros de MHC, y midiendo después, la afinidad de unión en comparación con un TCRap precursor).

En aspectos adicionales, se proporcionan TCR con afinidad potenciada generados por los métodos divulgados en el presente documento, que pueden estar unidos a células o en forma soluble, y pueden tener además codones optimizados para potenciar la expresión en linfocitos T.

En otros aspectos más, los TCR con afinidad potenciada de la presente divulgación pueden usarse para tratar una enfermedad (tal como cáncer, enfermedad infecciosa o enfermedad autoinmunitaria) en un sujeto mediante la administración de una composición que comprende los TCR con afinidad potenciada. En realizaciones adicionales, los TCR con afinidad potenciada de la presente divulgación pueden usarse en métodos de diagnóstico o en métodos de obtención de imágenes, incluyendo estos métodos usados en relación con las indicaciones o condiciones identificadas en el presente documento.

Estos y otros aspectos se harán evidentes al hacer referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos

Breve descripción de los dibujos

FIGURAS 1A-D: Los timocitos de ratones transgénicos OT-1 se clasificaron para obtener células progenitoras DN1 y DN2 TCRP'TCRy8'CD4'CD8'CD117+CD44+ y se cultivaron en células OP9-DL1 que expresan la molécula MHC de clase I H-2Kb durante 20 días en presencia de diversas concentraciones de péptido SIINFEKL de ovoalbúmina (SEQ ID NO: 1) como se indica. (A, B, C) Los cultivos se analizaron mediante citometría de flujo en los puntos temporales indicados. (D) La celularidad total de cada cultivo se determinó en el día 20 de cultivo.

FIGURA 2: Se cultivaron timocitos DP CD69- que aún no han pasado por la selección positiva clasificados a partir de ratones transgénicos B6 u OT-1 en células OP9-DL1 que expresan la molécula MHC de clase 1H-2Kb en presencia de péptido SIINFEKL de ovoalbúmina (SEQ ID n O: 1).

FIGURAS 3A-C: Los timocitos B6 se clasificaron para obtener células progenitoras DN1 y DN2 CD4'CD8‘ CD117+CD44+ y se transdujeron con la cadena TCRa del clon TCR 3D específico de WT1 con afinidad potenciada, y se cultivaron en células OP9-DL1 que expresan la molécula MHC de clase 1H-2Db en presencia o ausencia de péptido WT 1 RMFPNAPYL (SEQ iD NO: 2) 1 |jM. (A) El día 16 de cultivo, se analizaron células transducidas (hCD2+) y no transducidas (hCD2-) mediante citometría de flujo. (B) El día 21 de cultivo de OP9-DL1 en presencia de péptido RMFPNAPYL de WT1 1 j M (SEQ ID NO: 2), las células DN TCRap+ se clasificaron de acuerdo con el esquema indicado. (C) Las células clasificadas se lisaron, se aisló el ADN y se realizó la PCR utilizando un cebador directo específico de Vb 10 y un cebador inverso específico de Cb2. El producto de PCR de Vb10 se clonó después direccionalmente con TOPO en el vector pENTR/D-TOPO, se transfirió al vector retrovírico MigR1-attR usando tecnología Gateway®, y se generó el sobrenadante retrovírico y se usó para transducir células murinas 58'/_ para el varias de la biblioteca como se describe.

FIGURAS 4A-C: La biblioteca de TCRp de retrovirus se utilizó para transducir células 58'/_ CD8+3Da+. (A) Las células transducidas se clasificaron inicialmente solamente en función de la expresión de GFP (por sus siglas en inglés) (datos no mostrados), seguido de dos clasificaciones adicionales en función de la expresión de GFP y alta expresión de tetrámeros MHC-péptido WT1 como se indica. Las células 58'/_ clasificadas también se analizaron para la tinción con el tetrámero de MHC H2Db-péptido no específico pero específico para GP33 como control para determinar la unión no específica del tetrámero. (B) Análisis de secuencia de cadenas TCRp aisladas. (C) Se identificaron cuatro cadenas TCRp candidatas mediante análisis de secuencia y se transfirieron de nuevo al vector retrovírico MigR1-attR. Se generó sobrenadante retrovírico y se usó para transducir células 58'/_ CD8+3Da+. FIGURAS 5A-C: (A) La afinidad relativa de los tres TCR de mayor afinidad se determinó tiñendo cada línea celular transducida con tetrámero de MHC-péptido seguido por citometría de flujo. Las mediciones de Kd se realizaron utilizando seis diluciones dobles de tetrámeros conjugados con PE, y los valores de K d aparente se determinaron a partir de curvas de unión por regresión no lineal, como la concentración de ligando que producía la mitad de la unión máxima. (B) La cadena TCRp de mayor afinidad (clon n.° 1) tenía codones optimizados, y la unión del tetrámero se comparó con la construcción 3Dap con afinidad potenciada original. (C) Las células 58'/_ transducidas con cada una de las cadenas TCRp candidatas emparejadas con 3Da se tiñeron con tetrámero de MHC-péptido WT1 específico, así como con varios tetrámeros MHC H-2Db-péptido no específicos para evaluar la posible reactividad independiente de péptidos hacia MHC.

FIGURAS 6A-B: Análisis de la expresión de CD4 y CD8 de timocitos TCRp+(A) y esplenocitos (B) de ratones retrogénicos 3D-PYYa-IRES-hCD2 y 7431a-IRES-hCD2. Expresión de Vp10 y Vp9 de timocitos de TCRp+(A) de ratones retrogénicos 3D-PYYa-IRES-hCD2 y 7431a-IRES-hCD2.

FIGURA 7: Análisis de esplenocitos de ratones retrogénicos después de 6 días de estimulación con péptido de mesotelina WT1 IL2 in vitro.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona métodos y composiciones para generar TCR potenciados o de alta afinidad, en los que la cadena TCRa de un TCR específico de antígeno se usa para seleccionar de novo cadenas TCRp generadas que se emparejan con una cadena TCRa específica de antígeno durante la producción de linfocitos T in vitro, para formar nuevos receptores con afinidad potenciada que puedan impulsar ventajosamente la maduración de linfocitos T independiente de selección negativa a través de un proceso de selección novedoso para dirigirse a un antígeno de interés.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para generar un receptor de linfocitos T (TCR) con afinidad potenciada cultivando células progenitoras hematopoyéticas (que contienen una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica una cadena TCRa específica de antígeno) con células estromales (que contienen una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica Delta-like-1 o Delta-like-4 y una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC) en presencia de un antígeno peptídico, que inducirá la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas en timocitos DN TCRap+. A continuación, las secuencias del ácido nucleico que codifican diversas cadenas TCRp de los timocitos DN TCRap+ se aíslan y se introducen en células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular y también expresan la cadena TCRa indicada anteriormente. Finalmente, un TCR con afinidad potenciada se identifica comparando la afinidad de unión del TCRap candidato con el TCRap precursor.

Adicionalmente, esta divulgación proporciona TCR con afinidad potenciada generados utilizando tales métodos, así como composiciones y métodos para usar los TCR con afinidad potenciada de la presente divulgación en diversas aplicaciones terapéuticas, incluyendo el tratamiento de una enfermedad en un sujeto (por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmunitaria).

Antes de exponer la presente divulgación con más detalle, puede ser útil para la comprensión de la misma, proporcionar definiciones de determinados términos que se utilizarán en el presente documento. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la presente divulgación.

En la presente descripción, los términos "aproximadamente" y "que consiste/n esencialmente en' significan ± 20 % del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos "un", "una" y "uno" tal como se usan en el presente documento se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados. El uso de la alternativa (p.ej., "o") debe entenderse que significa bien uno, ambos o cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Como se usa en el presente documento, los términos "incluir", "tener" y "comprender" se utilizan como sinónimos, y estos términos y variantes de los mismos deben interpretarse como no limitantes.

"Receptor de linfocitos T" (TCR) se refiere a una molécula que se encuentra en la superficie de los linfocitos T que, en asociación con CD3, generalmente es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El TCR tiene un heterodímero de las cadenas a y p (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) altamente variables unidas por enlaces disulfuro en la mayoría de los linfocitos T. En un pequeño subconjunto de linfocitos T, el TCR está compuesto por un heterodímero de cadenas y y 6 variables (también conocidas como TCRy y TCR6, respectivamente). Cada cadena del TCR es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y posee un dominio variable de inmunoglobulina aminoterminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en el extremo carboxiterminal (véase Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a ed., Current Biology Publications, págs.

4:33, 1997). El TCR, como se usa en la presente divulgación, puede ser de diversas especies animales, incluyendo ser humano, ratón, rata u otros mamíferos. Un TCR puede estar unido a células o en forma soluble.

Los TCR y los dominios de unión de los mismos de la presente divulgación pueden ser "inmunoespecíficos" o capaces de unirse en un grado deseado, incluyendo la "unión específica o selectiva" a una diana sin unirse de manera significativa a otros componentes presentes en una muestra de prueba, si se unen a una molécula diana con afinidad o con Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor que o igual a aproximadamente 105 M-1, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, o 1013 M-1. Los dominios de unión de "alta afinidad" se refieren a los dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1, o mayor. Como alternativa, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (Kd) de una interacción de unión en particular con unidades de M (p.ej, 10-5 M a 10-13 M). Las afinidades de los TCR y de los polipéptidos del dominio de unión de acuerdo con la presente divulgación se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; y las patentes de EE.UU. N.° 5.283.173; 5468614, Análisis Biacore® o el equivalente). Por lo tanto, "receptor de linfocitos T con afinidad potenciada" (TCR con afinidad potenciada) se refiere a un TCR seleccionado o modificado por ingeniería con una unión más fuerte a un antígeno diana que el TCR de tipo silvestre (o precursor). La afinidad potenciada puede estar indicada por un TCR con una Ka (constante de asociación de equilibrio) por el antígeno diana más alta que la del TCR de tipo silvestre (también llamado precursor u original), un TCR con una Kd (constante de disociación) para el antígeno diana menor que la del TCR de tipo silvestre (también llamado precursor u original), o con una velocidad de disociación (Koff) para el antígeno diana menor que la del TCR de tipo silvestre (o precursor).

Las "moléculas del complejo principal de histocompatibilidad" (moléculas MHC) se refieren a glicoproteínas que suministran antígenos peptídicos a la superficie celular. Las moléculas MHC de clase I son heterodímeros que consisten en una cadena a transmembrana (con tres dominios a) y una microglobulina p2 asociada de manera no covalente. Las moléculas MHC de clase II están compuestas por dos glicoproteínas transmembrana, a y p, que atraviesan la membrana. Cada cadena tiene dos dominios. Las moléculas MHC de clase I suministran péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, donde el complejo péptido:MHC es reconocido por los linfocitos T CD8+. Las moléculas MHC de clase II suministran péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, donde son reconocidos por los linfocitos T c D4+. Una molécula MHC puede ser de diversas especies animales, incluyendo ser humano, ratón, rata u otros mamíferos.

Una "célula progenitora hematopoyética" es una célula derivada de células madre hematopoyéticas o de tejido fetal que es capaz de diferenciarse adicionalmente en tipos celulares maduros (por ejemplo, células del linaje de linfocitos T). En una realización particular, Se utilizan células progenitoras hematopoyéticas CD24lD Lin-CD117+. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden ser de diversas especies animales, incluyendo ser humano, ratón, rata u otros mamíferos.

Una "célula progenitora de timocitos" o "timocito" es una célula progenitora hematopoyética presente en el timo.

Las "células madre hematopoyéticas" se refieren a células hematopoyéticas indiferenciadas que son capaces de propagarse de forma esencialmente ilimitada. in vivo o ex vivo y capaces de diferenciarse a otros tipos celulares, incluyendo las células del linaje de linfocitos T. Las células madre hematopoyéticas pueden aislarse de, por ejemplo, hígado fetal, médula ósea y sangre del cordón.

"Células de linaje de linfocitos T" se refiere a células que muestran al menos una característica fenotípica de un linfocito T o un precursor o progenitor del mismo que distingue las células de otras células linfoides y células de los linajes eritroide o mieloide. Tales características fenotípicas pueden incluir la expresión de una o más proteínas específicas para los linfocitos T (por ejemplo, CD8+), o una característica fisiológica, morfológica, funcional o inmunitaria específica de un linfocito T. Por ejemplo, las células del linaje de linfocitos T pueden ser células progenitoras o precursoras comprometidas con el linaje de linfocitos T; linfocitos T CD25+ inmaduros e inactivados; células que han experimentado compromiso con el linaje CD4 o CD8; células progenitoras de timocitos que son doble positivas CD4+ c D8+; simples positivas CD4+ o CD8+; TCRap o TCR y§; o linfocitos T maduros y funcionales o activados.

Las "células estromales" son células de tejido conectivo de cualquier órgano. En una realización particular, las células estromales son células estromales de la médula ósea. Ejemplos de líneas de células estromales que pueden modificarse por ingeniería para expresar DLL1 o DLL4 incluyen la línea de células estromales de ratón MS5 (Itoh, et al., Exp. Hematol. 1989, 17:145-153) y S17, y las líneas de células estromales humana HGS2.11, HGS2.52, HGS.18, HGS3.30, HGS3.65, HGS.3.66, HGS3.103 y HGS3.114 (disponibles en Human Genome Sciences Inc., MD, véase la solicitud publicada de Estados Unidos 20020001826). En una realización particular, células OP9 (Kodama et al., 1994, Exp. Hematol. 22:979-984; disponibles en el depósito de células RIKEN). Las células OP9 que expresan DLL1 y DLL4 se han descrito previamente (véase, por ejemplo, Schmitt et al., 2002, Immunity: 17:749-756; patente de Estados Unidos n.° 7.575.925)

Los "timocitos doble negativos TCRap " (timocitos DN TCRap) se refieren a una población de timocitos que no expresan los correceptores CD4 y CD8, pero expresan cadenas TCRa y p.

"Antígeno peptídico" se refiere a una secuencia de aminoácidos, que varía desde aproximadamente 7 aminoácidos hasta aproximadamente 25 aminoácidos de longitud que se reconoce específicamente por un TCR, o dominios de unión del mismo, como un antígeno, y que puede derivar de o basarse en un fragmento de una molécula biológica diana más larga (p.ej., polipéptido, proteína) o derivado de la misma. Un antígeno puede expresarse en la superficie de una célula, dentro de una célula, o como una proteína de membrana integral. Un antígeno puede proceder del hospedador (p.ej., antígeno tumoral, antígeno autoinmunitario) o tienen un origen exógeno (p.ej., bacteriano, vírico).

"Secuencia de un ácido nucleico", o polinucleótidos, puede estar en forma de ARN o ADN, que incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. La secuencia de un ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria, y si es monocatenaria, puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido). Una secuencia codificante puede ser idéntica a la secuencia codificante conocida en la técnica o puede ser una secuencia codificante diferente, que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, o mediante corte y empalme, codifica el mismo polipéptido.

"No endógeno/a" se refiere a una molécula (p.ej., secuencia de un ácido nucleico) que no está presente en la o las células hospedadoras/muestra en la que se introduce una molécula, por ejemplo, introducida de forma recombinante. Una molécula no endógena puede ser de la misma especie o de una especie diferente.

Los ligandos de Notch "Delta-like-1" (DL1 o DLL1) y "Delta-like-4" (DL4 o DLL4) son homólogos del ligando de Notch Delta y son miembros de la familia de proteínas delta/serrate/jagged. Desempeñan un papel en la mediación de las decisiones sobre el destino celular durante la hematopoyesis y pueden desempeñar un papel en la comunicación de célula a célula. Secuencias de Delta-like-1 ilustrativas incluyen los números de acceso de Genbank NM_005618.3 (SEQ ID NO: 3) y NP_005609.3 (SEQ ID NO: 4) (secuencia de transcrito y de proteica de Homo sapiens, respectivamente) y números de acceso de Genbank n M_007865.3 (SEQ ID NO: 5) y NP_031891.2 (SEQ ID No : 6) (secuencia de transcrito y de proteína de Mus musculus, respectivamente). Secuencias de Delta-like-4 ilustrativas incluyen los números de acceso de Genbank NM_019074.3 (SEQ ID NO: 7) y NP_061947.1 (SEQ ID NO: 8) (secuencias de transcrito y de proteína de Homo sapiens, respectivamente) y números de acceso de Genbank NM_019454.3 (SEQ ID n O: 9) y NP_062327.2 (SEQ ID NO: 10) (secuencias de transcrito y de proteína de Mus musculus, respectivamente). Los ligandos de Notch están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y purificarse en diversos grados.

"Células madre embrionarias" o "células ES" o "ESC" se refieren a células madre embrionarias indiferenciadas que tienen la capacidad de integrarse y formar parte de la línea germinal de un embrión en formación. Las células madre embrionarias son capaces de diferenciarse en células progenitoras hematopoyéticas.

"WT1" se refiere al tumor de Wilm 1, un factor de transcripción que contiene cuatro motivos de dedos de zinc en el extremo carboxiterminal y un dominio de unión a ADN rico en prolina/glutamina en el extremo aminoterminal. WT1 tiene un papel esencial en el desarrollo normal del sistema urogenital y está mutado en un pequeño subconjunto de pacientes con tumores de Wilms. Se ha observado una alta expresión de WT1 en diversos cánceres, incluyendo, cáncer de mama, cáncer de ovario, leucemias agudas, neoplasias vasculares, melanomas, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, sarcoma de huesos y tejidos blandos y cáncer de esófago. Se ha observado un corte y empalme alternativo para WT1. Secuencias de WT1 ilustrativas incluyen los números de acceso de Genbank: NM_000378.4 (SEQ ID NO: 11) (transcrito humano, NP_000369.3 (SEQ ID NO: 12) (proteína humana); NM_024424.3 (SEQ ID NO: 13) (transcrito humano, NP_077742.2 (SEQ ID NO: 14) (proteína humana); NM_024426.4 (SEQ ID NO: 15) (transcrito humano, NP_077744.3 (SEQ ID NO:16); NM_001198552.1 (SEQ ID NO:17), NP_001185481.1 (SEQ ID NO: 18) (proteína humana); NM_001198551.1 (SEQ ID NO: 19) (transcrito humano, NP_001185480.1 (SEQ ID NO: 20) (proteína humana); NM_144783.2 (SEQ ID NO: 21) (transcrito de ratón) y NP_659032.3 (SEQ ID NO: 22) (proteína de ratón).

"Mesotelina" (MSLN) se refiere a un gen que codifica una proteína precursora que se escinde en dos productos, factor potenciador de megacariocitos y mesotelina. El factor de potenciación de megacariocitos funciona como una citocina que puede estimular la formación de colonias en los megacariocitos de la médula ósea. La mesotelina es una proteína de la superficie celular anclada al glicosilfosfatidilinositol que puede funcionar como una proteína de adhesión celular. Esta proteína se sobreexpresa en mesoteliomas epiteliales, cánceres de ovario y en carcinomas de células escamosas específicos. El corte y empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcritos. Secuencias de mesotelina ilustrativas incluyen los números de acceso de Genbank: NM_001177355.1 (SEQ ID NO:23), NP_001170826.1 (SEQ ID NO: 24) (secuencias de transcrito y de preproteína humanos, respectivamente); NM_005823.5 (Se Q ID NO:25), NP_005814.2 (SEQ ID NO: 26) (secuencias de transcrito y de preproteína humanos, respectivamente); NM_013404.4 (SEQ ID NO:27), NP_037536.2 (SEQ ID NO: 28) (secuencias de transcrito y de preproteína humanos, respectivamente); NM_018857.1 (SEQ ID n O:29), NP_061345.1 (SEQ ID NO: 30) (secuencias de transcrito y de proteína precursora de ratón, respectivamente).

"Tinción de tetrámeros MHC-péptido" se refiere a un ensayo utilizado para detectar linfocitos T específicos de antígeno, que presenta un tetrámero de moléculas MHC, comprendiendo cada una un péptido idéntico que tiene una secuencia de aminoácidos que es afín (por ejemplo, idéntica a o relacionada con) a al menos un antígeno, en donde el complejo es capaz de unirse a linfocitos T específicos para el antígeno afín. Cada una de las moléculas de MHC se puede etiquetar con una molécula de biotina. Los MHC/péptidos biotinilados se tetramerizan mediante la adición de estreptavidina, que normalmente está marcada con fluorescencia. El tetrámero puede detectarse mediante citometría de flujo a través del marcador fluorescente. En determinadas realizaciones, se usa un ensayo de tetrámeros de MHC-péptido para detectar o seleccionar TCR de alta afinidad de la presente divulgación.

Métodos para generar TCR con afinidad potenciada

Como antecedente, durante la formación de linfocitos T en el timo, los timocitos progenitores están sujetos a varios puntos de control mediados por TCR. El primero de ellos se denomina selección p y se produce en la etapa 3 doble negativa (DN3) de la formación de los linfocitos T murinos. Las células DN3 que producen un reordenamiento exitoso en el locus del gen Tcrb pueden expresar la proteína TCRp en la superficie celular emparejada con la preproteína Ta invariante. Este receptor se denomina pre-TCR y envía señales de manera independiente del ligando para promover la proliferación, diferenciación de las células del linaje ap a la etapa de doble positivo (DP) CD4/CD8, y el reordenamiento en el locus del gen Tcra (Boehmer et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:135-142). Mientras que el locus TCRa está inactivo y cerrado a los reordenamientos del gen TCR antes de la selección p, tanto los loci Tc Ry como 8 también experimentan reordenamientos en la etapa de formación DN3, y los reordenamientos exitosos en ambos locus dan como resultado la expresión de un y8-TCr maduro que puede proporcionar señales que impulsan la diferenciación hacia el linaje y8 de linfocitos T y8 Los linfocitos T no se diferencian a través de una etapa de DP durante la formación y generalmente permanecen DN o CD8aa+. La decisión del destino de las células ap/Y8 está determinada por la fuerza de la señal de TCR en esta etapa de formación, ya que el linfocito T en formación distingue entre una señal pre-TCR y una señal y§ TCR por la señal más fuerte asociada con el y§ TCR maduro (Pennington, Silva-Santos, & Hayday, 2005, Curr. Opin. Immunol. 17:108-115). Curiosamente, muchos ratones transgénicos con TCR ap tienen una gran población de células CD4/CD8 doble negativas (DN) CD24' TCRap positivas en el timo, que se ha demostrado que representan células "aspirantes a y§" que se forman como resultado de la señal más fuerte del TCR ap transgénico maduro en el punto de control de selección p (Egawa et al., 2000, PLOS One 3:1512).

En el presente documento se divulga un método para generar TCR con afinidad potenciada, en donde la expresión ectópica de una cadena TCRa específica de antígeno antes de la selección p permite la formación de linfocitos T que expresan un TCR de alta afinidad por el mismo antígeno cuando se diferencian en presencia del antígeno afín durante la diferenciación de linfocitos T in vitro. Usando este método, Los linfocitos T que expresan receptores de alta afinidad evitan la selección negativa adoptando un destino de linaje DN TCRap+ en respuesta a señales agonistas en la etapa DN3 de la formación de los linfocitos T.

En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para generar un TCR con afinidad potenciada que comprende: a) poner en contacto células progenitoras hematopoyéticas con células estromales y un antígeno peptídico, en condiciones y durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas en timocitos DN TCRap+, en donde las células progenitoras hematopoyéticas comprenden una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica una cadena TCRa de un TCR precursor específico para el antígeno peptídico, y en donde las células estromales comprenden una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica Delta-like-1 o Delta-like-4 y una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC; b) aislar secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las diversas cadenas TCRp de los timocitos DN TCRap+ e introducir las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas TCRp en células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular y comprenden la secuencia del ácido nucleico que codifica la cadena TCRa de la etapa a); e identificar el TCR con afinidad potenciada (por ejemplo, detectando o seleccionando candidatos de TCRap de alta afinidad mediante un ensayo de tetrámeros de m Hc , y midiendo después, la afinidad de unión en comparación con un TCRap precursor).

En determinadas realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas comprenden células progenitoras de timocitos. En otras realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas derivan de tejido hepático fetal. En otras realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas comprenden células madre hematopoyéticas que derivan o se originan en la médula ósea, sangre del cordón umbilical o sangre periférica. En otras realizaciones más, las células progenitoras hematopoyéticas derivan de seres humanos, ratón, rata u otros mamíferos. En una realización particular, se utilizan células progenitoras de timocitos CD24lD Lin'CD117+.

Las células progenitoras hematopoyéticas se han modificado para comprender una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica una cadena TCRa de un TCR precursor específico para el antígeno peptídico. En una realización específica, la cadena TCRp también se aísla del TCR precursor. La clonación de cadenas TCRa y p se puede realizar usando técnicas de biología molecular convencionales que se conocen en la técnica. Los métodos para clonar cadenas de TCR se conocen en la técnica (véanse, p.ej, Walchli et al., 2011, PLoS ONE 6:e27930; Birkholz et al., 2009, J. Immunol. Methods 346:45-54; Kurokawa et al, 2001, Clin. Exp. Immunol. 123:340-345).

Una "célula estromal" es una célula de tejido conectivo de cualquier órgano. Las células estromales que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen células estromales humanas y de ratón. Ejemplos de líneas de células estromales que pueden modificarse por ingeniería para expresar DL1 o DL4 incluyen la línea de células estromales de ratón MS5 (Itoh, et al., Exp. Hematol. 1989, 17:145-153) y S17, y las líneas de células estromales humana HGS2.11, HGS2.52, HGS.18, HGS3.30, HGS3.65, HGS.3.66, HGS3.103 y HGS3.114 (disponibles en Human Genome Sciences Inc., MD, véase la solicitud publicada de Estados Unidos 20020001826). En determinadas realizaciones, las células estromales son células estromales de la médula ósea. En realizaciones adicionales, se utilizan células OP9.

En determinadas realizaciones, las células estromales comprenden secuencias de los ácidos nucleicos no endógenos que codifican DL1, tal como DL1 humana. Secuencias de Delta-like-1 ilustrativas incluyen los números de acceso de Genbank NM_005618.3 (SEQ ID NO: 3) y NP_005609.3 (SEQ ID NO: 4) (secuencia de transcrito y de proteica de Homo sapiens, respectivamente) y números de acceso de Genbank NM_007865.3 (SEQ ID NO: 5) y n P_031891.2 (SEQ ID NO: 6) (secuencia de transcrito y de proteína de Mus musculus, respectivamente). En determinadas realizaciones, las células estromales comprenden secuencias de los ácidos nucleicos no endógenos que codifican DL4, tal como DL4 humana. Secuencias de Delta-like-4 ilustrativas incluyen los números de acceso de Genbank NM_019074.3 (SEQ ID NO: 7) y NP_061947.1 (SEQ ID NO: 8) (secuencias de transcrito y de proteína de Homo sapiens, respectivamente) y números de acceso de Genbank NM_019454.3 (SEQ ID NO: 9) y NP_062327.2 (SEQ ID NO: 10) (secuencias de transcrito y de proteína de Mus musculus, respectivamente). Los ligandos de Notch están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y purificarse en diversos grados.

En otras realizaciones adicionales, las células estromales son células OP9 o un derivado de las mismas que expresan DL1, tal como DL1 humana. Las células OP9 que expresan DL1 y DL4 se han descrito previamente (Schmitt et al., 2002, Immunity 17:749-756; patente de EE.UU. N.° 7.575.925).

En determinadas realizaciones, las células estromales también comprenden una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC. En realizaciones particulares, las células estromales comprenden una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC de clase I y, opcionalmente, también pueden comprender una secuencia de un ácido nucleico que codifica una p2 microglobulina. Las moléculas MHC de clase I y de p2 microglobulina pueden derivar de moléculas MHC de clase I humanas, de ratón, de rata o de otras especies de mamíferos, cuyos genes y secuencias de proteínas se conocen en la técnica. En otras realizaciones, las células estromales comprenden una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC de clase II. La molécula MHC de clase II pueden derivar de moléculas MHC humanas, de ratón, de rata o de otras especies de mamíferos, cuyos genes y secuencias de proteínas se conocen en la técnica.

Un linfocito T determinado reconocerá un antígeno peptídico solamente cuando esté unido a la molécula MHC de una célula hospedadora (reconocimiento de antígeno restringido por MHC). Se selecciona un TCR precursor con especificidad por un antígeno peptídico conocido para potenciar la afinidad del TCR usando los métodos divulgados. Por lo tanto, también se selecciona una molécula MHC que se une al antígeno peptídico particular y se expresa en las células estromales para permitir el reconocimiento del antígeno restringido por MHC en el sistema in vitro divulgado. Los métodos para identificar una molécula MHC que se une a un antígeno peptídico se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Akatsuka et al., 2002, Tissue Antigens 59:502-511). En determinadas realizaciones, una molécula MHC comprende HLA-A2 y beta-2 microglobulina, preferentemente de origen humano, que se puede unir a, por ejemplo, el péptido RMFPNAPYL de WT1 (SEQ ID NO: 2). En otras realizaciones, una molécula MHC comprende H-2DB de ratón, que se puede unir a, por ejemplo, el péptido RMFPNAPYL de WT1 o a varios péptidos de mesotelina como se divulga en la fig. 3A de Hung et al., 2007, Gene Therapy 14:921-929, o H-2Kb que se puede unir a, por ejemplo, varios péptidos de mesotelina como se divulga en la fig. 3A de Hung et al. Los posibles epítopos de mesotelina restringidos por H-2DB divulgados en Hung et al. incluyen: ISKANVDVL (SEQ ID NO:42), GQKMNAQAI (SEQ ID NO:43), SAFQNVSGL (SEQ ID NO:44) y LLGPNIVDL (SEQ ID NO:45). Los posibles epítopos de mesotelina restringidos por H-2Kb divulgados en Hung et al. incluyen: EIPFTYEQL (SEQ ID NO:46) y GIPNGYLVL (SEQ ID NO:47).

Un antígeno peptídico utilizado en los métodos divulgados se refiere a una secuencia peptídica de un antígeno o molécula biológica diana (por ejemplo, un polipéptido, proteína), al que el TCR precursor se une de manera específica. Una secuencia peptídica puede derivar de un antígeno que se expresa en la superficie celular, dentro de una célula, o que es una proteína de membrana integral. El antígeno puede ser un antígeno derivado del hospedador (p.ej., un antígeno tumoral/canceroso y un antígeno autoinmunitario), o un antígeno exógeno (p.ej., antígeno vírico, bacteriano, protozoario). Un antígeno tumoral o canceroso puede derivar de diversos cánceres, como los que se indican en el presente documento. En algunas realizaciones, un antígeno canceroso comprende un antígeno de leucemia. En determinadas realizaciones, un antígeno peptídico deriva del tumor de Wilms 1 (WT1), tal como un péptido de WT1 que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2). En otras realizaciones, un antígeno peptídico deriva de la mesotelina, tales como los péptidos de mesotelina descritos en la fig. 3A de Hung et al., 2007, Gene Therapy 14:921-929. En algunas realizaciones, el péptido de mesotelina comprende la secuencia de aminoácidos GQKMNAQAI (SEQ ID NO: 31). En otras realizaciones, el péptido de mesotelina comprende una secuencia de aminoácidos que comprende ISKANVDVL (SEQ ID NO: 42), GQKMNAQAI (SEQ ID NO:43), SAFQNVSGL (SEQ ID NO:44) y LLGPNIVDL (SEQ ID NO:45), EIPFTYEQL (SEQ ID NO:46) o GIPNGYLVL (SEQ ID NO:47). Los antígenos autoinmunitarios son antígenos que son reconocidos por TCR autorreactivos específicos para autoantígenos, con las consiguientes funciones efectoras inmunitarias que causan enfermedades autoinmunitarias, agravando la enfermedad autoinmunitaria, contribuyendo a la progresión de la enfermedad autoinmunitaria, causando o empeorando los síntomas asociados con la enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, los TCR autorreactivos específicos para un péptido de colágeno pueden ser útiles para la terapia génica supresora de Treg en artritis reumatoide. Los antígenos autoinmunitarios también pueden ser antígenos localizados en otras células inmunitarias que causan enfermedades autoinmunitarias o median los síntomas de enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, linfocitos B que producen autoanticuerpos). Por ejemplo, los antígenos del péptido CD20 pueden ser útiles para generar TCR con afinidad potenciada que se dirigen a linfocitos B implicados o asociados con artritis reumatoide. Puede añadirse un antígeno peptídico a un sistema de cultivo de células progenitoras hematopoyéticas y células estromales como se describe en el presente documento. Como alternativa, se pueden usar células estromales que comprenden una secuencia de un ácido nucleico que codifica un antígeno peptídico de interés para expresar dicho antígeno en el cultivo celular. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, un antígeno peptídico, ya sea añadido como un antígeno peptídico exógeno al sistema de cultivo o expresado por células estromales, forma un complejo con una molécula MHC expresada por las células estromales para formar un complejo MHC-antígeno peptídico. El complejo MHC-antígeno peptídico permite el reconocimiento del antígeno peptídico restringido por m Hc por los TCR en el sistema de cultivo. En determinadas realizaciones, las células OP9 se transducen con una secuencia de un ácido nucleico para expresar el péptido antigénico de WT1 RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2). En otras realizaciones, las células OP9 se transducen con una secuencia de un ácido nucleico para expresar el péptido antigénico de mesotelina GQK­ MNAQAI (SEQ ID NO: 31).

Los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I tienen generalmente de aproximadamente 7 a aproximadamente 10 aminoácidos de longitud. Los péptidos que se unen a las moléculas del MHC de clase II son de longitud variable, por lo general de aproximadamente 10-25 aminoácidos de largo. En determinadas realizaciones, se conoce la especificidad del antígeno peptídico del TCR precursor. En otras realizaciones, la especificidad del antígeno peptídico del TCR precursor necesita determinarse utilizando métodos conocidos en la técnica (Borras et al., 2002, J. Immunol. Methods 267:79-97; Hiemstra et al., 2000, Cur. Opin. Immunol. 12:80-4). Por ejemplo, si se conoce el antígeno diana de un TCR precursor, aunque no la secuencia peptídica específica, las bibliotecas de péptidos derivadas de la secuencia polipeptídica del antígeno diana pueden usarse para cribar e identificar el antígeno peptídico específico para el TCR precursor.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus o fagos. Un "vector de expresión" es un vector que es capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por uno o más genes portados por el vector cuando está presente en el entorno apropiado.

Los "retrovirus" son virus que tienen un genoma de ARN. "Gammarretrovirus" se refiere a un género de la familia retroviridae. Gammaretrovirus ilustrativos incluyen, pero sin limitación, virus de células madre de ratón, virus de leucemia murina, virus de leucemia felina, virus de sarcoma felino y virus de reticuloendoteliosis aviar.

"Lentivirus" se refiere a un género de retrovirus que son capaces de infectar células en división y no en división. Varios ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de inmunodeficiencia humana: incluyendo VIH de tipo 1 y VIH de tipo 2); virus de anemia infecciosa equina; virus de inmunodeficiencia felina (VIF); virus de inmunodeficiencia bovina (VIB); y virus de inmunodeficiencia de simios (VIS).

Un vector que codifica un virus central también se conoce como "vector vírico". Hay una gran cantidad de vectores víricos disponibles que son adecuados para su uso con la invención, incluyendo los identificados para aplicaciones de terapia génica en seres humanos, como los descritos por Pfeifer y Verma (Pfeifer, A. and I. M. Verma. 2001. Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211). Los vectores víricos adecuados incluyen vectores basados en virus de ARN, tal como los vectores derivados de retrovirus, por ejemplo, vectores derivados del virus de leucemia murina (VLM) de Moloney, e incluyen vectores derivados de retrovirus más complejos, por ejemplo, vectores derivados de lentivirus. Los vectores derivados del VIH-1 pertenecen a esta categoría. Otros ejemplos incluyen vectores de lentivirus derivados del VIH-2, VIF, virus de anemia infecciosa equina, VIS y virus maedi/visna. Los métodos para usar vectores víricos retrovíricos y lentivíricos y células de empaquetamiento para transducir células diana de mamíferos con partículas víricas que contienen transgenes de TCR son bien conocidos en la técnica y se han descrito previamente, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 8.119.772; Walchli et al., 2011, PLoS One 6:327930; Zhao et al., J. Immunol., 2005, 174:4415-4423; Engels et al., 2003, Hum. Gene Ther. 14:1155-68; Frecha et al., 2010, Mol. Ther. 18:1748-57; Verhoeyen et al., 2009, Methods Mol. Biol. 506:97-114. Las construcciones y los sistemas de expresión de vectores retrovíricos y lentivíricos también están disponibles comercialmente.

En una realización específica, se usa un vector vírico para introducir la secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica la cadena TCRa específica para el antígeno peptídico en las células progenitoras hematopoyéticas. En otra realización, se usa un vector vírico para introducir una secuencia de un ácido nucleico no endógeno que codifica DL1 o DL4 y una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC en células estromales. El vector vírico puede ser un vector retrovírico o un vector lentivírico. El vector vírico también puede incluir una secuencia de un ácido nucleico que codifica un marcador para la transducción. Los marcadores de transducción para vectores víricos son conocidos en la técnica e incluyen marcadores de selección, que pueden conferir resistencia a fármacos o marcadores detectables, tales como proteínas de la superficie celular o marcadores fluorescentes que pueden detectarse mediante métodos como citometría de flujo. En una realización particular, el vector vírico comprende además un marcador génico para transducción que comprende proteína verde fluorescente o el dominio extracelular de CD2 humana. Cuando el genoma del vector vírico comprende más de una secuencia de un ácido nucleico para expresarse en la célula hospedadora como transcritos separados, el vector vírico también puede comprender una secuencia adicional entre los dos (o más) transcritos que permitan la expresión bicistrónica o multicistrónica. Ejemplos de dichas secuencias utilizadas en vectores víricos incluyen sitios internos de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés), sitios de escisión de furina, péptido 2A vírico.

También se pueden usar otros vectores para el suministro de polinucleótidos, incluyendo los vectores víricos de ADN, incluyendo, por ejemplo, vectores basados en adenovirus y vectores basados en virus adenoasociados (AAV, por sus siglas en inglés); vectores derivados de virus del herpes simple (VHS), incluyendo los vectores con amplicones, VHS con replicación defectuosa y VHS atenuado (Krisky et al., 1998, Gene Ther. 5: 1517-30).

Otros vectores que se han producido recientemente para usos de terapia génica también pueden usarse con los métodos de esta divulgación. Dichos vectores incluyen los derivados de baculovirus y alfavirus. (Jolly D J. 1999. Emerging viral vectors. págs 209-40 en Friedmann T. ed. 1999. The development of human gene therapy. Nueva York: Cold Spring Harbor Lab).

Las células progenitoras hematopoyéticas se cultivan con células estromales que comprenden una secuencia de un ácido nucleico que codifica un Dl 1 o DL4 no endógenos y una secuencia de un ácido nucleico que codifica una molécula MHC en condiciones y durante un tiempo suficientes para inducir la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas en timocitos DN TCRap+. En determinadas realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas se cultivan en una placa tratada con cultivo de tejidos de 6 cm o 10 cm. La concentración de células progenitoras hematopoyéticas en el cultivo puede estar entre 1-109o 1x102 hasta 1x106o 1x103 a 1x 104. En algunas realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas (aproximadamente de 1-5 x 104 células) se cultivan en una monocapa de células OP9 que expresan DL1.

También se pueden añadir al cultivo una o más citocinas que promueven el compromiso y la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas. Las citocinas pueden derivar de seres humanos o de otras especies. La concentración de una citocina en cultivo puede oscilar entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml. Ejemplos representativos de citocinas que pueden usarse incluyen: todos los miembros de la familia FGF, incluyendo FGF-4 y FGF-2; ligando Flt-3, factor citoblástico (SCF, por sus siglas en inglés, trombopoyetina (TPO) e IL-7. Las citocinas se pueden usar en combinación con un glucosaminoglucano, tal como sulfato de heparina. Las citocinas están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante y purificarse en diversos grados. Algunas citocinas pueden purificarse a partir de medios de cultivo de líneas celulares mediante técnicas bioquímicas convencionales.

Las células progenitoras hematopoyéticas se pueden cultivar en medio de cultivo que comprende medio acondicionado, medio no acondicionado o medio de células madre embrionarias. Ejemplos de medio acondicionado adecuado incluyen IMDM, DMEM o aMEM, condicionado con fibroblastos embrionarios (por ejemplo, fibroblastos embrionarios humanos), o medio equivalente. Ejemplos de medio no acondicionado adecuado incluyen medio de Dulbecco modificado de Iscove (IDMD, por sus siglas en inglés), DMEM, o aMEM, o medio equivalente. El medio de cultivo puede comprender suero (p.ej., suero bovino, suero bovino fetal, suero bovino de ternera, suero equino, suero humano o un sustituto de suero artificial) o puede ser sin suero.

Las condiciones de cultivo implican cultivar las células progenitoras hematopoyéticas durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas en timocitos DN TCRap+. Las células se mantienen en cultivo generalmente durante aproximadamente 4-5 días, preferentemente aproximadamente de 5 a 20 días. Se apreciará que las células se pueden mantener durante el tiempo necesario para lograr el resultado deseado, es decir, la composición celular deseada. Por ejemplo, para generar una composición celular que comprenda principalmente linfocitos T inmaduros e inactivados, las células se pueden mantener en cultivo durante aproximadamente 5 a 20 días. Las células se pueden mantener en cultivo durante 20 a 30 días para generar una composición celular que comprenda principalmente linfocitos T maduros. Las células no adherentes también se pueden recoger del cultivo en varios puntos temporales, tal como desde aproximadamente varios días hasta aproximadamente 25 días. Se han descrito previamente métodos de cultivo para células madre hematopoyéticas en líneas de células estromales (patente de EE.UU. n° 7.575.925; Schmitt et al., 2004, Nat. Immunol. 5:410-417; Schmitt et al., 2002, Immunity 17:749-756).

Puede detectarse la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas en timocitos DN TCRap+ y aislarse estas células usando métodos de citometría de flujo convencionales. Se pueden emplear una o más clasificaciones de células para aislar los timocitos DN TCRap+. Por ejemplo, una primera clasificación celular puede identificar células progenitoras hematopoyéticas que expresan el marcador de transducción (es decir, marcador para la expresión de TCRa). En determinadas realizaciones, un marcador de transducción es el dominio extracelular de CD2 humana. En realizaciones adicionales, las células positivas para el marcador de transducción pueden someterse a una segunda clasificación celular para cribar células que son CD4.' y CD8'. Una tercera clasificación de células en las células DN puede cribar células que expresen TCRp. Será evidente para un experto en la materia que se puede diseñar un subconjunto de estas clasificaciones, o clasificaciones de células sencillas o múltiples utilizando diferentes combinaciones de marcadores de transducción o superficie celular, para identificar la subpoblación deseada de timocitos DN TCRap+. Los métodos para clasificar células DN TCRap+ se conocen en la técnica (documento US 7.575.925 y Schmitt et al., 2002, Immunity: 17:749-756).

Las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las diversas cadenas TCRp de los timocitos DN TCRap+ se aíslan y se introducen en linfocitos T que comprenden la secuencia de un ácido nucleico que codifica la cadena TCRa del TCR precursor. Como se analiza en el presente documento, los métodos de clonación de cadenas TCRp a partir de células son bien conocidos en la técnica y se han descrito previamente. En determinadas realizaciones, una vez que las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas TCRp candidatas se han aislado de los timocitos Dn TCRap+, las secuencias de los ácidos nucleicos pueden someterse a un proceso de selección adicional mediante el cual las cadenas TCRp con el mismo gen Vp usado por la cadena TCRp precursor ase seleccionan para su introducción en linfocitos T. El gen Vp precursor que contiene la cadena TCRp puede identificarse dentro de la población de células clasificadas usando cebadores específicos del gen Vp para PCR. Una preocupación asociada con la potenciación de la afinidad de los TCR específicos de antígeno in vitro es que algunas modificaciones podrían aumentar la afinidad del receptor solamente por MHC, en lugar de por péptido/MHC, aumentando así la probabilidad de que el TCR sea autorreactivo. Restringir las cadenas TCRp candidatas a las que contienen el gen Vp precursor aumenta la probabilidad de conservar los dominios CDR1 y CDR2 de TCR que entran en contacto con el MHC, y limitar la variabilidad a CDR3. Como se analiza anteriormente, los vectores víricos, tal como vectores retrovíricos y lentivíricos, son adecuados para introducir las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las diversas cadenas TCRp y/o el TCRa precursor en los linfocitos T. En algunas realizaciones, el vector vírico comprende además un marcador génico para la transducción (por ejemplo, proteína verde fluorescente).

Las células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular se utilizan para la transformación o transducción con las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las diversas cadenas TCRp de los timocitos DN TCRap.+. Las células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular expresan una molécula CD3. "CD3" es un complejo de múltiples proteínas de seis cadenas que están asociadas de forma estable con un TCR en la superficie celular. En mamíferos, el complejo comprende una cadena CD3y, una cadena CD8, dos CD3e y un homodímero de cadenas CD3Z. La CD3y, CD38 y c D3e son proteínas de la superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un solo dominio de inmunoglobulina. Las regiones transmembrana de CD3y, CD38 y CD3e están cargadas negativamente, que es una característica que permite que estas cadenas se asocien con las cadenas de TCR cargadas positivamente. Los dominios citoplasmáticos de las cadenas CD3y, CD38 y CD3e contienen motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés) que les permiten asociarse con proteínas tirosina cinasas citosólicas después de la estimulación de los receptores y, por lo tanto, enviar señales al interior de la célula. Las proteínas CD3 son necesarias para la expresión del TCR en la superficie celular (véase Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a ed., Current Biology Publications, págs. 4:39, 1997).

En algunas realizaciones, Las células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular son los linfocitos T, incluyendo células o líneas celulares primarias derivadas de seres humanos, ratón, rata u otros mamíferos. Si se obtiene de un mamífero, un linfocito T puede obtenerse de numerosas fuentes, incluyendo sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos o fluidos. Un linfocito T puede enriquecerse o purificarse. Las líneas de linfocitos T son bien conocidas en la técnica, algunos de los cuales se describen en Sandberg et al., 2000, Leukemia 21:230-237. En determinadas realizaciones, se utilizan linfocitos T que carecen de expresión endógena de cadenas TCRa y p. Tales linfocitos T pueden carecer de forma natural de la expresión endógena de las cadenas TCRa y p o pueden haberse modificado para bloquear la expresión (p.ej., linfocitos T de un ratón transgénico que no expresa cadenas a y p de TCR o una línea celular que se ha manipulado para inhibir la expresión de las cadenas a y p de TCR). En determinadas realizaciones, se utilizan células 58 a'p', una línea de linfocitos T murinas que carece de cadenas TCRa y TCRp endógenas, se utiliza (Letourneur y Malissen, 1989, Eur. J. Immunol. 19:2269-74). En otras realizaciones, se utiliza la línea de linfocitos T H9 (número de catálogo HTB-176, ATCC, Manassas, VA). En determinadas realizaciones, las células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular no son linfocitos T o células de un linaje de linfocitos T, sino células que se han modificado para expresar CD3, que permite la expresión de un TCR en la superficie celular (por ejemplo, células 293 o células 3T3). La expresión en la superficie celular de los TCR en células que no son de un linaje de linfocitos T se ha descrito previamente (Szymczak et al., 2004, Nat. Biotechnol. 22:589-594).

Para identificar un posible TCR con afinidad potenciada, una vez que las células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular que también expresan la cadena TCRa precursora se han transformado o transducido con una biblioteca de cadenas TCRp candidatas, las células específicas de antígeno se clasifican o identifican usando tinción de tetrámeros de MHC-péptido. La tinción con tetrámeros de MHC-péptido presenta un tetrámero de moléculas MHC, comprendiendo cada una un péptido idéntico que tiene una secuencia de aminoácidos que es afín (p.ej., idéntica o relacionada con) al menos a un antígeno, en donde el complejo es capaz de unirse a linfocitos T específicos para el antígeno afín. Cada una de las moléculas de MHC se puede etiquetar con una molécula de biotina. Los MHC/péptidos biotinilados se tetramerizan mediante la adición de estreptavidina, que normalmente está marcada con fluorescencia. El tetrámero puede detectarse mediante citometría de flujo a través del marcador fluorescente. Los métodos de tinción de tetrámeros de MHC-péptido para detectar linfocitos T específicos de antígeno son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Altman et al, 1996, Science 274:94-96; Kalergis et al., 2000, J. Immunol. Methods 234:61-70; Xu y Screaton, 2002, J. Immunol. Methods 268:21-8; James et al., J. Vis. Exp.25:1167). En determinadas realizaciones, el tetrámero de MHC-péptido comprende moléculas MHC de clase I. En otras realizaciones, el tetrámero de MHC-péptido comprende moléculas MHC de clase II. En realizaciones adicionales, el mismo antígeno peptídico utilizado en la etapa de cultivo del método divulgado es el mismo que el péptido incorporado en el tetrámero de MHC-péptido. En otras realizaciones, la molécula MHC expresada por las células estromales en la etapa de cultivo del método divulgado es la misma que una molécula MHC en el tetrámero de MHC-péptido. Las células teñidas con tetrámeros de MHC-péptido pueden clasificarse mediante citometría de flujo una o más veces. Una primera clasificación puede seleccionar células transducidas que expresan un marcador de transducción detectable (por ejemplo, proteína verde fluorescente). Las células positivas a la transducción también pueden clasificarse una o más veces para determinar las células que expresan la misma cadena Vp que el TCR precursor. Será evidente para un experto en la materia que se puede diseñar un subconjunto de estas clasificaciones, o clasificaciones de células sencillas o múltiples utilizando diferentes combinaciones de marcadores de transducción o superficie celular, para identificar la subpoblación deseada de células.

Un TCR con afinidad potenciada se identifica comparando la afinidad de unión del TCRap candidato con el TCRap precursor. Los linfocitos T específicos de antígeno pueden clonarse y secuenciarse después usando técnicas convencionales de biología molecular. Los clones de TCRp candidatas se pueden usar para transducir linfocitos T que comprenden la cadena TCRa precursora y puede utilizarse la tinción de tetrámeros de MHC-péptido para comparar los niveles de tinción con el TCRap precursor, como se describe anteriormente. El aumento de tinción observado con una TCRp candidata puede ser indicativo de una afinidad potenciada en comparación con el TCRap precursor. Sin embargo, si el TCRap precursor tenía codones optimizados para aumentar la expresión en el linfocito T, puede que no sea posible la comparación directa de los niveles de tinción de los tetrámeros con la TCRp candidata. Las cadenas TCRp candidatas también pueden tener codones optimizados para la comparación directa con la TCRp precursora Un TCRap candidato tiene una afinidad potenciada en comparación con un TCRap precursor si tiene una unión más fuerte al antígeno peptídico que el TCRap precursor. La afinidad potenciada puede indicarse mediante un TCR con una Ka (constante de asociación en equilibrio) para el antígeno diana mayor que la del TCR precursor, un TCR con una Kd (constante de disociación) para el antígeno diana menor que la del t Cr precursor, o con una velocidad de disociación(Koff) para el antígeno diana menor que la del TCR de tipo silvestre (o precursor). Se han descrito previamente métodos para medir la afinidad de unión de TCR (por ejemplo, Laugel et al., 2007, J. Biol. Chem.

282:23799-23810; Garcia et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6818-6823).

TCR con afinidad potenciada y composiciones

En otro aspecto, se proporcionan TCR con afinidad potenciada generados por los métodos divulgados en el presente documento. Un TCR con afinidad potenciada puede estar unido a células (p.ej., expresado en la superficie de un linfocito T maduro) o en forma soluble. En determinadas realizaciones, los TCR con afinidad potenciada pueden tener codones optimizados para potenciar la expresión en los linfocitos T (Scholten et al., 2006, Clin. Immunol. 119:135-145).

En otras realizaciones, los TCR con afinidad potenciada también pueden ser un componente de una proteína de fusión, que puede comprender además un componente citotóxico (por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos tal como vindesina, antifolatos; toxinas bacterianas, ricina, antivíricos), que es útil para destruir o inhabilitar de manera específica una célula cancerosa o una célula infectada o un componente detectable (por ejemplo, biotina, resto fluorescente, radionúclido), que es útil para obtener imágenes de células cancerosas, células infectadas o tejidos con crisis autoinmunitaria.

La presente divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un TCR con afinidad potenciada generado por los métodos divulgados en el presente documento y un transportador, diluyentes o excipiente farmacéuticamente aceptables. Excipientes adecuados incluyen agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos.

Aplicaciones

Los TCR con afinidad potenciada generados por los métodos de la presente divulgación pueden usarse para tratar una enfermedad (tal como cáncer, enfermedad infecciosa o enfermedad autoinmunitaria) en un sujeto mediante la administración de una composición que comprende los TCR con afinidad potenciada.

Las enfermedades que pueden tratarse con terapia con TCR de afinidad potenciada incluyen cáncer, enfermedades infecciosas (infecciones víricas, bacterianas, protozoarias) y enfermedades autoinmunitarias. La terapia génica con TCR es un tratamiento prometedor para diversos tipos de cáncer (Morgan et al., 2006, Science 314:126-129; revisado en Schmitt et al, 2009, Human Gene Therapy; revisado en junio de 2007, J. Clin. Invest. 117:1466-1476) y enfermedades infecciosas (Kitchen et al., 2009, PLoS One 4:38208; Rossi et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:1444-54; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018; Luo et al., 2011, J. Mol. Med. 89:903-913). La terapia génica inmunosupresora para enfermedades autoinmunitarias utilizando linfocitos T reguladores que comprenden TCR autorreactivos también es un tratamiento emergente (Fujio et al., 2006, J. Immunol. 177:8140-8147; Brusko et al., 2008, Immunol. Rev.

223:371-390).

Una amplia variedad de cánceres, incluyendo los tumores sólidos y las leucemias, son susceptibles a las composiciones y métodos divulgados en el presente documento. Tipos de cáncer que se pueden tratar incluyen: adenocarcinoma de mama, próstata y colon; todas las formas de carcinoma broncogénico de pulmón; mieloide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinoide maligno; enfermedad cardíaca carcinoide; y carcinoma (p.ej., de Walker, de células basales, basoescamoso, de Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, de células de merkel, mucinoso, de pulmón no microcítico, de células en avena, papilar, escirroso, bronquiolar, broncogénico, de células escamosas y de células transicionales). Tipos adicionales de cánceres que pueden tratarse incluyen: trastornos histiocíticos; leucemia; histiocitosis maligna; enfermedad de Hodgkin; inmunoproliferativo pequeño; linfoma no de Hodgkin; plasmacitoma; reticuloendoteliosis; melanoma; condroblastoma; condroma; condrosarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumor de células gigantes; histiocitoma; lipoma; liposarcoma; mesotelioma; mixoma; mixosarcoma; osteoma; osteosarcoma; cordoma; craneofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miosarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblástico. Adicionalmente, los siguientes tipos de cánceres también se contemplan como susceptibles al tratamiento: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistadenocarcinoma; cistoadenoma; tumor de células de la granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumores de células de los islotes; tumor de células de leydig; papiloma; tumor de células de sertoli; tumor de células de teca; leimioma; liomiosarcoma; mioblastoma; mioma; miosarcoma; rabdomioma; rabdomiosarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma no cromafín. Los tipos de cánceres que pueden tratarse también incluyen: angioqueratoma; hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatosis; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiosarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiosarcoma; pinealoma; carcinosarcoma; condrosarcoma; cistosarcoma filodes; fibrosarcoma; hemangiosarcoma; liomiosarcoma; leucosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; miosarcoma; mixosarcoma; carcinoma de ovarios; rabdomiosarcoma; sarcoma; neoplasias; neurofibromatosis; y displasia cervical.

Los cánceres de linfocitos B ilustran la variedad de trastornos hiperproliferativos susceptibles de una terapia con TCR potenciados, incluyendo los linfomas de linfocitos B (como diversas formas de la enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (LNH) o linfomas del sistema nervioso central), leucemias (tal como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas y leucemia mioblástica crónica) y mielomas (tal como mieloma múltiple). Cánceres de linfocitos B adicionales incluyen linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma esplénico de la zona marginal, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma solitario de hueso, plasmacitoma extraóseo, linfoma extraganglionar de la zona marginal de linfocitos B de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT, por sus siglas en inglés), linfoma nodal de zona marginal de linfocitos B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de mediastino (tímico) de linfocitos B grandes, linfoma intravascular de linfocitos B grandes, linfoma de efusión primario, linfoma/leucemia de Burkitt, proliferaciones de linfocitos B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide y trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante.

Enfermedades autoinmunitarias incluyen: artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, policondritis, artritis psoriásica, psoriasis, dermatitis, polimiositis/dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, miositis inflamatoria, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma y esclerosis sistémicas, síndrome de CREST, respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto (SDRA), meningitis, encefalitis, uveítis, colitis, glomerulonefritis, afecciones alérgicas, eccema, asma, afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas, ateroesclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus discoide, mielitis lúpica, cerebritis lúpica, diabetes de inicio juvenil, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, neuromielitis óptica, fiebre reumática, corea de Sydenham, respuestas inmunitarias asociadas con una hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis que incluye granulomatosis de Wegener y enfermedad de Churg-Strauss, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis/angiítis por hipersensibilidad, ANCA y vasculitis reumatoide), anemia aplásica, anemia de Blackfan-Diamond, anemia hemolítica inmunitaria que incluye la anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA, por sus siglas en inglés), deficiencia en factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican la diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central (SNC), síndrome de lesión multiorgánica, miastenia grave, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo al trasplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), penfigoide ampolloso, pénfigo, poliendocrinopatías autoinmunitarias, espondiloartropatías seronegativas, enfermedad de Reiter, síndrome del hombre rígido, arteritis de células gigantes, nefritis del complejo inmunitario, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM o polineuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del testículo y ovario incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitaria, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Graves, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes poliglandulares endocrinopáticos), diabetes de tipo I también denominada diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (VIH), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barré, vasculitis de vasos grandes (incluyendo la polimialgia reumática y la arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos intermedios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa), espondilitis anquilosante con poliarteritis nodosa (PAN), enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), glomerulonefritis de progresión rápida, cirrosis biliar primaria, celiaquía (enteropatía por gluten), crioglobulinemia, crioglobulinemia asociada con hepatitis, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), arteriopatía coronaria, fiebre mediterránea familiar, poliangeítis microscópica, síndrome de Cogan, síndrome de Whiskott-Aldrich y tromboangitis obliterante.

En realizaciones particulares, un método para tratar a un sujeto con los TCR con afinidad potenciada generados por los métodos divulgados en el presente documento incluye un sujeto con leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica aguda o leucemia mielocítica crónica.

Las enfermedades infecciosas incluyen las asociadas con agentes infecciosos e incluyen cualquiera de varias bacterias (p.ej, E. coli patógena, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. anthracis, C. botulinum, C. diffidle, C. perfringens, H. pylori, V. cholerae, Listeria spp., Rickettsia spp., Chlamydia spp., y similares), micobacterias y parásitos (incluyendo cualquier miembro parásito conocido de los protozoos). Los virus infecciosos incluyen virus eucariotas (p.ej., adenovirus, buniavirus, herpesvirus, papovavirus, paramixovirus, picornavirus, rabdovirus (p.ej., rabia), ortomixovirus (p.ej., gripe), poxvirus (p.ej., vaccinia), reovirus, retrovirus, lentivirus (por ejemplo, VIH), flavivirus (p.ej., HCV) y similares). En determinadas realizaciones, la infección con patógenos citosólicos cuyos antígenos se procesan y muestran con moléculas MHC de clase I, se tratan con los TCR con afinidad potenciada de la invención.

Los TCR con afinidad potenciada se pueden administrar a un sujeto unidos células (es decir, terapia génica de la población de células diana (linfocitos T maduros (por ejemplo, linfocitos T CD8+) u otras células del linaje de linfocitos T)). En una realización particular, las células del linaje de linfocitos T que comprenden TCR con afinidad potenciada administradas al sujeto son células autólogas. En otra realización, los TCR con afinidad potenciada se pueden administrar a un sujeto en forma soluble. Los TCR solubles son conocidos en la técnica. (véase, por ejemplo, Molloy et al., 2005, Curr. Opin. Pharmacol. 5:438-443; patente de Estados Unidos 6.759.243).

"Tratar" y "tratamiento" se refieren al manejo médico de una enfermedad, trastorno o afección de un sujeto (es decir, individuo que puede ser un mamífero humano o no humano (por ejemplo, primate, rata, ratón)). En general, una dosis y un régimen de tratamiento apropiados proporcionan los TCR con afinidad potenciada descritos en el presente documento y, opcionalmente, un adyuvante, en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico o profiláctico. Los beneficios terapéuticos y profilácticos incluyen un mejor resultado clínico; reducción o alivio de los síntomas asociados con la enfermedad; disminución de la aparición de síntomas; mejora de la calidad de vida; estado sin enfermedad más prolongado; disminución del grado de enfermedad, estabilización del estado de enfermedad; retraso de la progresión de la enfermedad; remisión; supervivencia; o prolongar la supervivencia.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen los receptores con afinidad potenciada se pueden administrar de una manera apropiada a la enfermedad o afección que se va a tratar (o prevenir) según lo determinen los expertos en la materia médica. Una dosis apropiada, duración adecuada y frecuencia de administración de las composiciones ser determinarán por factores tales como el estado del paciente, tamaño, tipo y gravedad de la enfermedad, forma particular del principio activo y método de administración.

En realizaciones adicionales, los TCR con afinidad potenciada de la presente divulgación pueden usarse en métodos de diagnóstico o en métodos de obtención de imágenes, incluyendo estos métodos usados en relación con las indicaciones o condiciones identificadas en el presente documento.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos demuestran que, según lo dispuesto por la presente divulgación, por ejemplo, los timocitos con TCR transgénicos se diferencian de manera eficaz en un linaje CD4'CD8'CD24'TCRp+ "similar a y§" cuando se exponen a su antígeno afín en cultivos OP9-DL1. Asimismo, los timocitos progenitores que expresan solamente la cadena TCRa de un clon de linfocitos T específico para el antígeno tumoral WT1 también pueden diferenciarse en este linaje TCRap+ maduro en cultivo OP9-DL1. Se generó una biblioteca de cadenas TCRp a partir de una población de células DN TCRap+ clasificadas a partir de estos cultivos, y se cribó para determinar la reactividad de los tetrámeros de MHC con WT1 cuando se emparejaban con la cadena TCRa específica de antígeno. Usando este enfoque, se identificaron diversas cadenas TCRp que pueden emparejarse con una cadena TCRa específica de antígeno para generar TCR con una afinidad hasta 10 veces mayor por el péptido WT1 en comparación con el TCR original.

Ejemplo 1: La participación del agonista peptídico durante la diferenciación en células OP9-DL1 puede impulsar la diferenciación de células DN TCRaB+ maduras a partir de los progenitores de linfocitos T purificados de ratones con TCR transgénicos.

Las señales agonistas a través de un TCR ap antes de la selección p dan como resultado la diferenciación de células doble negativas (DN) TCRap+ "similares a y§" durante la formación de los linfocitos T in vivo, y la reticulación de TCR en la etapa DN3 conduce a la diferenciación de un linaje similar durante la diferenciación de linfocitos T en células OP9-DL1 in vitro. Para determinar si los linfocitos T progenitores de ratones con TCR transgénicos también podrían diferenciarse en un linaje DN TCRap+ en respuesta al antígeno peptídico afín en la etapa DN3, se clasificaron timocitos progenitores DN1 y d N2 TCRap'CD4'CD8'CD117+CD44+ de ratones OT-1 transgénicos (expresan TCR específico para la secuencia del péptido SlINFEKL de ovoalbúmina (SEQ ID NO: 1) presentada en la MHC de clase 1H-2KB; reserva n.° 003831, Jackson Laboratory, ME; véase también Hogquist et al., 1994, Cell 76:17-27) y se cultivaron con células OP9-DL1 (Schmitt et al., 2002, Immunity 17:749-756; patente de Estados Unidos N.° 7.575.925) transducidas para expresar la molécula MHC de clase I H-2k b de ratón, ya sea en ausencia de péptido o con concentraciones crecientes de péptido específico de ovoalbúmina (SEQ ID NO: 1) durante 20 días y se analizaron en diversos puntos temporales mediante citometría de flujo. En ausencia de péptido, los linfocitos T doble positivos (DP) pudieron detectarse el día 16 y constituyeron una fracción importante del cultivo el día 20 (fig. 1A). Sin embargo, la formación o la supervivencia de los linfocitos T DP disminuyó incluso con concentraciones muy bajas de péptido (0,0001 pM), y los DP estaban completamente ausentes en los cultivos que contenían 0,01 pM o más de péptido (fig. 1A), lo que demuestra que las células DP se seleccionan de manera negativa por señalización agonista fuerte en cultivos OP9-DL1.

Para determinar si las señales agonistas cada vez más fuertes impulsan la formación de células DN TCRap+, la población DN se analizó para determinar la expresión de CD24, un marcador de maduración que se expresa a niveles elevados en todas las poblaciones de linfocitos T progenitores inmaduros y de TCRp. Se encontró que la mayoría de las células expresaban niveles altos de CD24 y carecían de expresión de TCRp en el día 5 (fig. 1B), pero el día 16, la mayoría de las células DN de todas las condiciones de cultivo expresaron TCRp, aunque se observó un número sustancialmente mayor de células CD24- a partir de cultivos que contenían 0,01 pM o más de péptido (38,2 % y 31,4 % de células TCR+CD24-en cultivos que contenían 0,01 y 1,0 pM de péptido, respectivamente, en comparación con el 6,9 % de TCR+CD24- en el cultivo sin péptidos) (fig. 1B). El día 20, ~ 60 % de todas las células DN eran TCRp+CD24‘ a partir de cultivos que contenían péptido 0,01 pM o 1,0 pM, mientras que en cultivos que no recibieron péptido o recibieron una concentración baja (0,0001 pM) de péptido, solamente el -20 % de los DN eran TCRp+CD24‘, y cerca del 50 % eran TCRp-(fig. 1B, 1C). Asimismo, cuando se compara el nivel de expresión en la superficie de TCR entre las diferentes condiciones de cultivo, las células TCRp+ que se formaron en respuesta a altos niveles de péptido expresaron niveles más altos de TCRp en la superficie celular (fig. 1C). Sin desear quedar ligados a teoría alguna, es posible que la formación de algunas células DN TCRap+ en cultivos sin péptido añadido se deba a la reactividad cruzada con otros ligandos de péptido-MHC en el sistema de cultivo OP9-DL1. Para confirmar que las células DN TCRap+ observadas en estos cultivos no se formaron a través de una etapa de DP, las células DP CD69- que aún no se han seleccionado positivamente se clasificaron a partir de timo B6 u OT-1 y se cultivaron en presencia o ausencia del péptido SIINFEKL de ovoalbúmina (SEQ ID NO: 1). Las células B6 DP no se vieron afectadas por la presencia del péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 1), pero cuando los timocitos OT-1 DP se cultivaron en células OP9-DL1 en presencia de SIINFEKL (SEQ ID NO: 1), se observaron todas las evidencias de selección negativa, incluyendo una pérdida masiva de celularidad y modulación negativa del correceptor (fig. 2). De manera importante, las células DN observadas en estos cultivos fueron de manera uniforme TCR negativas (fig. 2).

Estos datos indican que la participación de un agonista peptídico durante la diferenciación en células OP9-DL1 puede impulsar la diferenciación de células DN TCRap+ maduras de progenitores de linfocitos T purificados de ratones con TCR transgénicos.

Ejemplo 2: Una cadena TCRa transgénica se empareja con cadenas TCRB endógenas para impulsar la formación de células DN CD24.~TCRaB+ "aspirantes a v5" en el sistema de cultivo OP9-DL1

Para determinar si la expresión solamente de una cadena TCRa antes de la selección p también debería dar como resultado la desviación del linaje de los progenitores de linfocitos T DN3 que expresan una cadena TCRp endógena que se empareja con la cadena TCRa introducida capaz de acoplarse a un ligando de péptido-MHC en el sistema de cultivo OP9-DL1 por encima de un determinado umbral de afinidad, se clasificaron timocitos progenitores DN1 y DN2 CD4"CD8" CD117+CD44+ de ratones B6 y se transdujeron con una cadena TCRa del clon 3D de linfocitos T específicos del antígeno tumoral de Wilm (WT1) que se había identificado previamente como una variante con afinidad potenciada aislada de una biblioteca de mutagénesis por saturación de la región CDR3 de la 3Da. La construcción de expresión de 3Da contiene un motivo de secuencia de entrada intrarribosómico, seguido del dominio extracelular de CD2 humano (números de acceso de Genbank NM_001767.3 (SEQ ID NO: 48) y NP_001758.2 (SEQ ID NO: 49) (secuencias de transcrito y proteína para CD2 de longitud completa, respectivamente)) (IRES- hCD2) como una transducción de marcador. Se cultivaron timocitos progenitores transducidos en presencia o ausencia de 1,0 pM del péptido RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) de WT1 restringido por la MHC de clase I H-2DB durante 14 días, y después se analizó mediante citometría de flujo. Las células DN dentro de la fracción negativa de hCD2 contenían pocas células TCRap+, independientemente de la presencia de péptido en las condiciones de cultivo. Por el contrario, la fracción positiva de hCD2 (que expresó el gen 3Da) de cultivos que no recibieron péptido contenía 6,8 % células TCRp+ y el número de células TCRap+ aumentó a 16,6 % cuando se añadió péptido WT1 1,0 pM (fig. 3A). Estos datos indican que una población significativa de células DN TCRap+ puede formarse a partir de timocitos progenitores tempranos que expresan ectópicamente una cadena TCRa antes de la selección p. Asimismo, el hecho de que esta población de células DN TCRap+ aumente cuando está presente el péptido afín (para la cadena TCRa introducida) sugiere que una fracción sustancial de estas células se formó en respuesta a señales específicas del antígeno WT1.

Tomados en conjunto, estos datos indican que la población de DN TCRap+ podría contener potencialmente células que expresan una cadena TCRp que puede emparejarse con la 3Da introducida para formar un TCR con una mayor afinidad por el tetrámero de MHC-péptido-WT1 que el receptor de afinidad potenciado original, y significativamente mayor que podría aislarse del repertorio de linfocitos T normales.

Por lo tanto, los timocitos progenitores DN1 y DN2 CD4'CD8'CD117+CD44+ transducidos con 3Da se diferenciaron en células OP9-DL1 que expresaban la MHC de Clase 1 H-2DB de ratón y también se transdujeron para expresar WT1. Las células no adherentes se recogieron durante varios días hasta el día 21 y se clasificaron para determinar células hCD2+CD4'CD8'TCRp+ en reactivo TRIzol (Invitrogen) (fig. 3B). Se agruparon los tipos de células clasificados de días individuales; se purificó ARN y se generó ADNc. El TCR 3D precursor utiliza la región variable Vb10. Para conservar los dominios CDR1 y CDR2 de TCR que entran en contacto con MHC, las cadenas TCRp candidatas se restringieron a las que contenían esta región variable. Por lo tanto, las cadenas TCRp que contienen Vp10 dentro de la población de células clasificadas se aislaron mediante PCR usando un cebador directo específico de Vp10 y un cebador inverso específico de Cp2 (fig. 3C). El cebador directo específico de Vb10 se diseñó para contener una secuencia CACC que permite la clonación TOPO direccional en el vector pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen), seguida de la transferencia utilizando la tecnología Gateway® para la recombinación (Invitrogen) en el vector retrovírico MigR1-attR (una versión del vector MigR1 (Pear et al., 1998, Blood 92:3780-3792) que se ha modificado para contener sitios attR y el gen ccdB para la clonación Gateway®). La biblioteca MigR1-TCRp se utilizó para transducir células de empaquetamiento retrovírico PlatE (Morita et al., 2000, Gene Therapy 7:1063-1066; Cell Biolabs, Inc.) para generar sobrenadante retrovírico, que se utilizó después para transducir de manera retrovírica células 58 a'p', una línea de linfocitos T murinos que carece de cadenas TCRa y TCRp endógenas, (58-/-) (Letourneur y Malissen, 1989, Eur. J. Immunol.

19:2269-74).

Se tituló el sobrenadante de la biblioteca de TCRp retrovírico, y se usó una dilución que dio como resultado menos del 20 % de células transducidas después de la transducción para asegurar que la mayoría de las células contuvieran solamente una integración retrovírica. Las células transducidas se clasificaron primero en células GFP positivas, y después se volvieron a clasificar dos veces más en las células Vp10+ que también tenían altos niveles de tinción con tetrámeros de MHC-péptido WT1 (fig. 4A). Después de la segunda clasificación, las células se analizaron para determinar la tinción con un tetrámero de MHC H-2DB-péptido específico para GP33, con el fin de evaluar si las células positivas al tetrámero de MHC-péptido WT1 se unían de una manera independiente del péptido a los restos de MHC (fig. 4A).

Después de la tercera clasificación de células 58-/- transducidas con la biblioteca con alto contenido de tetrámeros de MHC-péptido WT1, las células clasificadas se expandieron, se lisaron y se aisló el ADN. Los insertos retrovíricos se recuperaron mediante PCR utilizando cebadores específicos del vector MigR1-attR, diseñado para incluir sitios de clonación AttB Gateway® del vector. Usando un enfoque de dos etapas, los insertos se clonaron primero en el vector pDONR™ (Invitrogen) usando la tecnología de clonación por recombinación Gateway®, y después, de nuevo en MigR1-attR. Se recogieron colonias bacterianas individuales de la reacción de clonación por recombinación y se secuenciaron. Después del análisis de secuencia de> 30 clones, se identificaron las cuatro cadenas TCRp más predominantes para realizar un análisis adicional. Curiosamente, varios de los clones tenían secuencias de CDR3p que compartían múltiples restos conservados con la cadena 3Dp original (fig. 4B). Se encontró que uno de los clones (Clon n.° 1) era casi idéntico al 3Dp original, excepto por una sustitución P108Q y una sustitución G112S (fig. 4B). Las cuatro cadenas TCRp candidatas se transdujeron de manera retrovírica en células 58_/'3Da+ y se analizaron por citometría de flujo (fig. 4C). Los cuatro clones candidatos se unieron al tetrámero de MHC-péptido WT1 cuando se transdujeron en células 58-/'3Da+, aunque el clon n.° 4 se unió al tetrámero de MHC-péptido WT1 a niveles significativamente más bajos que los otros y no se analizó adicionalmente. La cadena 3Dp precursora se había optimizado con codones previamente y, por lo tanto, expresaba niveles más altos de TCR en la superficie celular, excluyendo la comparación directa de los niveles de tinción de tetrámeros entre 3Dp y los clones aislados.

Para evaluar de manera más directa la afinidad relativa de cada una de las cadenas TCRp por el tetrámero de MHC-péptido WT1, las células 58_/'3Da+ transducidas con 3Da, y cada una de las cadenas TCRp candidatas se tiñeron con seis diluciones dobles en serie de tetrámeros de MHC-péptido WT1 y los valores de MFI se ajustaron a una curva de unión de saturación mediante regresión no lineal, como la concentración de ligando que produjo la mitad de la unión máxima (fig. 5A). Se encontró que las afinidades aparentes de las tres cadenas TCRp candidatas, cuando se emparejan con 3Da, eran mayores que la 3Dp precursora, y el Clon n.° 1 tenía una afinidad ~ 10 veces mayor (fig.

5A). Por lo tanto, para comparar directamente la tinción de tetrámeros de 3Da emparejada con el Clon n.° 1 frente a la 3Dp precursora, El clon n.° 1 tenía codones optimizados de modo que las únicas diferencias de secuencia entre la 3Dp original y el clon n.° 1 estaban en la región CDR3. Ambas construcciones se transdujeron en células 58'/_ y se evaluaron por citometría de flujo para determinar la tinción de tetrámeros de MHC-péptido WT1. Cuando el clon n.° 1 tenía codones optimizados, se encontró que se unía al tetrámero a un nivel más alto que la 3Dp original como se esperaba (fig. 5B).

Una preocupación asociada con la potenciación de la afinidad de los TCR específicos de antígeno in vitro es que algunas modificaciones podrían aumentar la afinidad del receptor solamente por MHC, en lugar de por péptido/MHC, aumentando así la probabilidad de que el TCR sea autorreactivo. Este riesgo se minimizó restringiendo la biblioteca de TCRp a las cadenas TCRp que comparten el mismo dominio variable (Vb10) para restringir la variabilidad a CDR3. Para determinar si alguna de las cadenas TCRp candidatas confería una mayor propensión a unirse a la molécula MHC H-2DB de forma independiente del péptido, las células 58'/_ transducidas se tiñeron con un grupo de tetrámeros de MHC H-2DB tetrámeros (péptidos: WT1, GP33, E4, MESN, SQV). Las tres cadenas TCRp candidatas se tiñeron con el tetrámero de MHC-péptido WT1 a niveles altos cuando se emparejaron con 3Da, similar a la 3Dp original (fig.

5C). Cuando se tiñe con otros cuatro tetrámeros de MHC H-2DB-péptido, las tres cadenas TCRp fueron uniformemente negativas para la tinción de los tetrámeros, lo que sugiere que el aumento de afinidad observado por estos receptores no es el resultado de una mayor afinidad por MHC solo (fig. 5C).

Ejemplo 3: Generación de linfocitos T específicos de WT1 de alta afinidad mediante expresión ectópica de una cadena TCRa específica de antígeno durante la formación temprana de los linfocitos T humanos in vitro.

El antígeno del tumor de Wilm (WT1) se expresa en niveles anormalmente altos en la superficie de las células leucémicas. Los clones de linfocitos T específicos de HLA A2/WT1 se han cribado en busca de clones con alta actividad específica. Se aislaron las cadenas TCRa y TCRp del clon C4, que se determinó que tenían la mayor afinidad por WT1. Un vector lentivírico que comprende el TCR de C4 y que confiere un alto nivel de expresión es objeto de un ensayo clínico de terapia génica con t Cr programado para 2o12. Para potenciar adicionalmente la afinidad del TCR de C4 por el antígeno WT1, se utiliza l sistema de diferenciación in vitro descrito en los ejemplos anteriores con células progenitoras de sangre de cordón humano que expresan la cadena TCRa de C4.

Generación de linfocitos T específicos de WT1:

Se generó una variante de la línea celular OP9-DL1 descrita en el ejemplo 1, que expresaba la molécula MHC de clase I humana HLA-A2 (números de acceso de Genbank U18930.1 (SEQ ID NO: 50) y AAA87076.1 (SEQ ID NO: 51), secuencias de transcrito y proteína, respectivamente) y la molécula MHC de clase I humana p2 microglobulina (p2M) (números de acceso de Genbank NM_004048.2 (Se Q ID NO: 52) y NP_004039.1 (SEQ ID NO: 53), secuencias de transcrito y proteína, respectivamente). La cadena TCRa del clon C4 de TCR se transduce de manera estable en células progenitoras hematopoyéticas derivadas de la sangre del cordón umbilical mediante transducción retrovírica, utilizando un vector retrovírico que también codifica la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador de transducción. Las células progenitoras que expresan GFP se clasifican mediante citometría de flujo y se cultivan en células de estroma OP9-DL1-A2/p2M en presencia o ausencia del péptido RMFPNAPYL de WT1 (Se Q ID NO: 2). Las células progenitoras hematopoyéticas humanas proliferan y se diferencian fácilmente en el cultivo con OP9-DL1 a una etapa de formación de linfocitos T humanos caracterizada por el fenotipo CD34+CD1a+CD4+ (La Motte-Mohs et al., 2005, Blood 105:1431-1439), momento en el que experimentan reordenamientos del gen TCR en los locus p, y y 6 (Spits, 2002, Nat. Rev. Immunol. 2:760-772). Se formula la hipótesis de que, como sus homólogos murinos, los progenitores de linfocitos T humanos que expresan TCRa que producen un reordenamiento en marco en el locus de TCRp adaptarán uno de dos destinos celulares: aquellos que expresan una cadena TCRp que no se empareja bien con la TCRa transgénica, o que se empareja con la TCRa transgénica pero no recibe una señal fuerte a través de este apTCR, se diferenciará a la etapa DP en respuesta a la señalización a través del pre-TCR; por otro lado, aquellos que generan una cadena TCRp que puede emparejarse con la TCRa transgénica y reciben una señal suficientemente fuerte a través de este apTCR maduro se señalarán para diferenciarse hacia un linaje DN TCRap+ similar a y6. Debido a que las células DP soloamente sobreviven durante ~ 3-4 días sin una señal de selección positiva, y debido a que no se produce una selección positiva eficaz en cultivos OP9-DL1, la gran mayoría de las células que no reciben una señal agonista a través del TCR ap se eliminarán del cultivo, permitiendo que las células similares a y6 que se forman debido a la señalización temprana de TCR ap se acumulen.

Aislamiento de cadenas TCRp candidatas:

En diversos momentos del cultivo, las células no adherentes que tienen un fenotipo DN TCRap+ similar a y6 y son positivas para los tetrámeros de MHC A2/péptido WT1 se recogen mediante clasificación celular. Puede que no sea posible detectar células positivas para tetrámeros de WT1, ya que la presencia continua de antígeno en los cultivos puede dar como resultado una modulación negativa de TCR que podría disminuir la tinción de tetrámeros por debajo de la detección. Asimismo, debido a que es probable que estas células no expresen CD8ap, los receptores de alta afinidad que no son independientes de CD8 son indetectables mediante tinción de tetrámeros. Por lo tanto, puede ser necesario cribar las cadenas TCRp de todas las células DN TCRap+ que emergen en el cultivo (véase a continuación). También puede ser deseable restringir los linfocitos T candidatos a aquellos que usan el mismo segmento Vp utilizado por la cadena TCRp de C4 original (Vp17), para conservar los contactos de MHC con CDR1 y CDR2 del TCR de C4 precursor.

Después de la clasificación de células, las cadenas TCRp endógenas se clonan purificando el ARN total, realizando RT-PCR RACE de longitud completa con cebadores C-p1 o C-p2 y clonando los productos de PCR en el vector pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen), que permite la clonación TOPO direccional e incorpora sitios attL que permiten una transferencia rápida y eficaz al vector retrovírico Mig-attR (una variante de MigR1 (Pear et al., 1998, Blood 92:3780-3792) que contiene sitios attR para la inserción del gen de interés) utilizando el sistema de recombinación de tecnología Gateway® de Invitrogen. Los productos de la reacción de recombinación se someten a electroporación en bacterias de alta eficacia, y las colonias se recogen con un asa de cultivo juntas y se maximizan para generar una biblioteca retrovírica de cadenas TCRp potencialmente reactivas con WT1.

Varias de TCR específicos de WT1 de alta afinidad:

Las cadenas TCRp que pueden emparejarse con la cadena TCRa de C4 para formar un TCR específico de WT1 de alta afinidad se identifican mediante la transducción de la biblioteca de TCRp en la línea de linfocitos T humanos H9 (número de catálogo HTB-176, ATCC, Manassas, VA) que se ha transducido para expresar la cadena TCRa de C4 (H9-C4a). Las células transducidas se clasifican mediante citometría de flujo para determinar niveles altos de tinción con tetrámeros de MHC-péptido WT1 y los insertos retrovíricos se amplificarán mediante PCR a partir de la población clasificada. Las cadenas TCRp candidatas se identifican mediante clonación TOPO del producto de PCR seguido de análisis de secuencia. Las cadenas TCRp seleccionadas y la C4a precursora se transducen en células H9-C4a y las afinidades relativas por el tetrámero de MHC-péptido WT1 se calcularán mediante tinción de células transducidas con diluciones dobles en serie de tetrámeros conjugados con PE (como se describe en el ejemplo 2). Los valores de afinidad se determinan ajustando la MFI para cada dilución a una curva de unión mediante regresión no lineal y la KD definida como concentración de tetrámeros que produce la mitad de la unión máxima. Las cadenas TCRp que pueden emparejarse con TCRa de C4 para generar un TCR con mayor afinidad mediante tinción con tetrámeros de MHC-péptido que el receptor C4 de tipo silvestre se caracterizan además por su seguridad y eficacia.

Ejemplo 4: Caracterización de la eficacia y seguridad de los candidatos a TCR de alta afinidad utilizando un modelo de terapia génica con TCR dirigido a WT1 en ratones in vivo.

Los TCR específicos de WT1 humano con afinidad potenciada que se identifican como en el ejemplo 3 se prueban para determinar su seguridad y eficacia en un modelo de terapia génica dirigida a WT1 en ratones transgénicos HLA-A2.

Evaluación de TCR potenciados para determinar actividad inespecífica:

La activación fugaz de TCR de alta afinidad se evalúa midiendo la producción de citocinas por linfocitos T transducidos con TCR en respuesta a un grupo de células diana que expresan A2 en presencia o ausencia del péptido WT1. Los TCR que muestran un reconocimiento inespecífico de células diana WT1 negativas en comparación con el TCR de C4 precursor no están especializados para estudios adicionales.

Actividad de TCR con afinidad potenciada en tejido normal in vivo:

La expresión de WT1 en tejido normal es similar tanto en el ratón como en el hombre, y el péptido WT1 reconocido por el TCR de C4 es idéntico en ratones y se sabe que se procesa y presenta mediante las células de ratón (Gaiger et al., 2000, Blood 96:1480-9). Se han utilizado ratones transgénicos HLA-A2 para probar el reconocimiento de tejidos normales por linfocitos T que expresan TCR humanos específicos de WT1 de alta afinidad (Kuball et al., 2009, J. Exp. Med. 206:463-475).

Para evaluar la seguridad de los TCR con afinidad potenciada generados in vitro como se divulga en el ejemplo anterior, los linfocitos T CD8+ de ratones B6.A2/Db, que expresan un transgén que codifica los dominios a l y a2 de A2 fusionados con a3 de Db (para la unión de CD8 de ratón) (Newberg et al., 1996, J. Immunol. 156:2473-2480), se transducen a TCR con afinidad potenciada candidatos expresados. Los TCR se modifican antes de la transducción para contener dominios Ca y Cp de ratón en lugar de humanos, que aumenta la expresión en los linfocitos T de ratón (Pouw et al., 2007, J. Gene Med. 9:561-570). Aproximadamente 4-6 semanas después de la transferencia de linfocitos T transducidos con TCR a ratones, los tejidos que se sabe que expresan WT1 de forma natural (por ejemplo, pulmones y riñón) se analizan mediante histología en busca de evidencia de infiltración de linfocitos T y daño tisular, y la médula ósea se evalúa mediante citometría de flujo para determinar el agotamiento de las células progenitoras hematopoyéticas de expresión de WT1.

Correlación de afinidad potenciada con función y reconocimiento de dianas mejorados:

Existe evidencia de que puede existir un umbral de afinidad para los TCR, por encima del cual las potenciaciones adicionales no aumentarán la función de los linfocitos T y, de hecho, pueden disminuir la sensibilidad al antígeno (Schmid et al., 2010, J. Immunol. 184:4936-46). Por lo tanto, la respuesta de los linfocitos T CD8+ transducidos con TCR de alta afinidad a las células diana pulsadas con concentraciones de péptidos limitantes se compara con los linfocitos T que expresan el TCR de C4 precursor. Se analizan la producción y proliferación de citocinas (IFNy/IL-2), así como la actividad lítica. Los TCR que muestran una mayor afinidad y una función potenciada están especializados para su estudio adicional y para su posible uso en ensayos de terapia génica con TCR.

Ejemplo 5: Generación de linfocitos T específicos de WT1 de alta afinidad in vivo.

Se utilizó un modelo en ratones (ratones retrogénicos TCRa) in vivo para determinar si las células doble negativas (DN) TCRp+ pueden formarse en el timo. Los ratones retrogénicos (transducidos de manera retrovírica) permiten una generación rápida, en comparación con los métodos transgénicos, de ratones que expresan un transgén de TCR específico. Se conocen en la técnica métodos para producir ratones retrogénicos (véanse, p.ej, Holst et al., 2006, Nat. Protoc. 1:406-417; Holst et al., 2006, Nat. Methods 3:191-197; Bettini et al., 2012, Immunology 136:265-272). Brevemente, se purificaron células madre/progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea de ratones B6 y se transdujeron para expresar la cadena TCRa del TCR 3D-PYY específico de WT1 de alta afinidad o del TCR 7431 específico de mesotelina de baja afinidad. El TCR 3D-PYY es un TCR de mayor afinidad modificado por ingeniería a partir del TCR 3D, identificado utilizando un sistema de presentación de linfocitos T y selección con Dímero X WT1/Ig Db (BD Biosciences) (Stone et al., 2011, J. Immunol. 186:5193-5200; Chervin et al., 2008, J. Immunol. Methods 339:175-184). Las construcciones retrovíricas que comprenden los transgenes de TCRa 3D-PYY o 7431 a también incluyen el dominio extracelular de CD2 humano como marcador de transducción, con un IRES entre los dos transgenes. Los progenitores derivados de médula ósea transducidos se transfirieron a ratones hospedadores B6 irradiados de forma letal para generar quimeras de médula ósea que expresaban las cadenas TCRa introducidas. Seis semanas después de la transferencia in vivo de las células de la médula ósea transducidas con TCRa, se sacrificó a los ratones. Las células del timo y el bazo se analizaron para determinar la expresión de CD4 y CD8 mediante citometría de flujo (figuras 6A, 6B). El análisis de la expresión de CD4 y CD8 por células TCRp+ en el timo (figura 6A) muestra que se puede detectar una gran población de células doble negativas TCRp+ in vivo en los timocitos transducidos que expresan ectópicamente una cadena TCRa temprano en la formación, y que esta población es más acentuada en ratones que expresan una TCRa de un TCR de alta afinidad (por ejemplo, 3D-PYYa). Los timocitos DN TCRp+ de ratones retrogénicos 3D-PYYa y 7431 a también se analizaron para determinar la expresión de Vp10 y Vp9, respectivamente (figura 6A). Estos datos muestran que la población de DN TCRp+ está enriquecida por células que utilizan el mismo segmento génico Vp que el TCR específico de antígeno original. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que las células DN TCRp+ se forman en respuesta a una señalización de TCR

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para generar un receptor de linfocitos T (TCR) con afinidad potenciada, que comprende:

a. poner en contacto una o más células progenitoras hematopoyéticas con una o más células estromales y un antígeno peptídico, en condiciones y durante un tiempo suficientes para inducir la diferenciación de al menos unas células progenitoras hematopoyéticas en timocitos doble negativos (DN) TCRap+,

en donde la una o más células progenitoras hematopoyéticas comprenden un polinucleótido no endógeno que codifica una cadena TCRa de un TCR precursor específica para el antígeno peptídico, y

en donde la una o más células estromales comprenden un polinucleótido no endógeno que codifica Delta-like-1 o Delta-like-4 y un polinucleótido que codifica una molécula MHC;

b. introducir polinucleótidos que codifican cadenas TCRp de los timocitos DN TCRap+ generados en la etapa (a) en células que son capaces de expresar un TCR en la superficie celular y que comprenden el polinucleótido no endógeno que codifica la cadena TCRa de la etapa (a);

c. identificar TCR con afinidad potenciada expresado por al menos una o más células generadas en la etapa (b), en donde el TCR con afinidad potenciada es opcionalmente un TCR humano.

2. El método de la reivindicación 1, en donde identificar TCR con afinidad potenciada comprende comparar la afinidad de unión de un TCRap candidato con el TCRap precursor.

3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde las células progenitoras hematopoyéticas comprenden células progenitoras de timocitos, o las células progenitoras hematopoyéticas derivan de células madre hematopoyéticas.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se usa un vector vírico para introducir en las células progenitoras hematopoyéticas el polinucleótido no endógeno que codifica la cadena TCRa específica para el antígeno peptídico.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células estromales expresan Deltalike-1 o derivan de OP9 o comprenden un polinucleótido que codifica el antígeno peptídico.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además seleccionar las células que son capaces de expresar un TCR en la superficie de las células resultantes de la etapa (b) con tinción de tetrámeros de MHC-péptido, en donde dichas células se seleccionan opcionalmente con tinción de tetrámeros de MHC-péptido varias veces.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se usa un vector vírico para introducir los polinucleótidos que codifican las cadenas TCRp de la etapa (b) en las células que son capaces de expresar TCR en la superficie celular.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el vector vírico es un vector retrovírico o un vector lentivírico, comprendiendo opcionalmente el vector vírico un marcador génico para la transducción, comprendiendo opcionalmente el marcador génico para la transducción una proteína verde fluorescente o un dominio extracelular de CD2 humano.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno peptídico se selecciona de un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno canceroso o un antígeno autoinmunitario.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el antígeno peptídico es un antígeno peptídico de WT1 o un antígeno peptídico de mesotelina, comprendiendo opcionalmente el antígeno peptídico de WT1 una secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) y comprendiendo opcionalmente, el antígeno peptídico de mesotelina una secuencia de aminoácidos GQKMNAQAI (SEQ ID NO: 31).

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno peptídico se añade a las células progenitoras hematopoyéticas y a las células estromales en cultivo.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente, antes de la introducción de la etapa (b), aislar uno o más polinucleótidos que codifican una o más cadenas TCRp a partir de timocitos DN TCRpa+, en donde el aislamiento comprende seleccionar una o más cadenas TCRp que comprenden el mismo gen Vp que la cadena p del TCR precursor y en donde la introducción comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican las cadenas TCRp seleccionadas en las células.