ES2903402T3 - Anticuerpos contra alfa-sinuclueína y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a α-sinucleína humana, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: a) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias: (i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 5, (ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 15; y (iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 16, y b) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias: (i) L-CDR1 de SEQ ID NO: 20, (ii) L-CDR2 de SEQ ID NO: 10; y (iii) L-CDR3 de SEQ ID NO: 21.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra alfa-sinuclueína y usos de los mismos
ANTECEDENTES
[0001] La presente divulgación se refiere a anticuerpos contra a -sinuclueína y su uso en la prevención o tratamiento de enfermedades, en particular alfa-sinucleinopatías, y más particularmente la enfermedad de Parkinson (PD).
[0002] Las alfa-sinucleinopatías, también conocidas como enfermedades con cuerpos de Lewy (LBD), son una familia de enfermedades neurodegenerativas que tienen todas en su núcleo alfa-sinucleína como el sello patológico clave (Jellinger, Mov Disord (2003), 18 Suppl 6: S2-12; y Spillantini y Goedert, Ann NY Acad Sci (2000), 920: 16-27). Las alfa-sinucleinopatías incluyen la enfermedad de Parkinson (PD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y la atrofia multisistémica (MSA).
[0003] La PD es un trastorno del movimiento del movimiento relacionado con la edad de progresión lenta que afecta a más del 1% de las personas mayores de 65 años. La PD es la segunda afección neurodegenerativa más común después de la enfermedad de Alzheimer.
[0004] Una patología distintiva definitoria de alfa-sinucleinopatías son cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy, que son inclusiones insolubles de proteínas agregadas que se encuentran dentro de las neuronas del cerebro reveladas tras el examen histopatológico post-mortem.
[0005] La presencia de patología de Lewy y la pérdida neuronal en regiones del cerebro no motoras tales como el cerebro anterior basal, el sistema mesopontino, amígdala, neocórtex, el núcleo motor dorsal del nervio vago, bulbos olfativos, locus coeruleus, y el tronco cerebral, puede provocar déficits cognitivos y demencia, hiposmia, alteraciones del sueño que incluyen trastorno del comportamiento del sueño con movimientos oculares rápidos (RBD), trastornos del estado de ánimo que incluyen depresión y ansiedad, disfunción autonómica que incluye problemas cardiovasculares y gastrointestinales, tales como estreñimiento y fatiga y somnolencia. Algunos de estos síntomas no motores parecen caracterizar la fase premotora o prodrómica de la enfermedad (Kalia et al. Lancet (2015), 386 (9996): 896-912).
[0006] La presencia de patología de Lewy y la pérdida neuronal en las regiones cerebrales motoras, que incluyen de manera destacada la muerte de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra, puede provocar temblor en reposo, rigidez, bradiquinesia e inestabilidad postural (Spillantini y Goedert, Ann NY Acad Sci ( 2000), 920: 16-27).
[0007] La proteína alfa-sinucleína (también llamada "a-sinucleína" o "a-syn") es el principal componente estructural de los cuerpos de Lewy y las neuritas de Lewy. La alfa-sinucleína es una pequeña proteína ácida formada por 140 aminoácidos (14 kDa). La alfa-sinucleína natural humana de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 como se describe en UniProtKB número de acceso P37840. A menos que sea evidente por el contexto, la referencia a alfa-sinucleína o sus fragmentos incluye la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje humana natural indicada anteriormente, y variantes alélicas humanas de la misma, en particular aquellas asociadas con la enfermedad con cuerpos de Lewy (por ejemplo, E46K, A30P, H50Q , G51D y A53T, donde la primera letra indica el aminoácido en SEQ ID NO: 1, el número es la posición del codón en SEQ ID NO: 1 y la segunda letra es el aminoácido en la variante alélica). Opcionalmente, tales variantes pueden presentarse individualmente o en cualquier combinación. Las mutaciones inducidas E83Q, A90V, A76T, que potencian la agregación de alfa-sinucleína, también pueden estar presentes individualmente o en combinación entre sí y/o con variantes alélicas humanas E46K, A30P, H50Q, G51D y A53T. A nivel estructural, la alfa-sinucleína contiene tres regiones distintas: un dominio de hélice alfa N-terminal anfipático que tiene propiedades de unión a lípidos y membranas (residuos 1-60), un dominio de unión a amiloide hidrofóbico central que codifica el componente no beta amiloide (NAC) de las placas (residuos 61-95) y una cola C-terminal rica en prolina ácida (residuos 96-140). Se cree que los residuos 71-82 del dominio NAC son clave para las propiedades de agregación/fibrilación de la alfa-sinucleína al permitir que la proteína cambie de una estructura de espiral aleatoria a una estructura de lámina beta (Bisaglia et al. FASEB J (2009), 23 (2): 329-40). Aunque el dominio C-terminal está libre de una estructura secundaria significativa, contiene un sitio de fosforilación clave en el residuo Ser129 y varios residuos de tirosina que están nitrados en inclusiones de alfa-sinucleína citosólica. También existen formas truncadas N-terminal y C-terminal de alfa-sinucleína. Las modificaciones postraduccionales de la proteína pueden afectar la agregación y la toxicidad de la alfa-sinucleína (Oueslati et al. Prog Brain Res (2010), 183: 115-45.
[0008] La alfa-sinucleína es abundante en el sistema nervioso central (SNC)/cerebro donde se encuentra tanto intracelularmente en neuronas y glía como extracelularmente en líquido cefalorraquídeo (CSF) (Mollenhauer et al. J Neural Transm (2012), 119 (7): 739-46) y el líquido intersticial (ISF) que baña y rodea las células del cerebro (Emmanouilidou et al. PLoS One (2011), 6 (7): e22225). La alfa-sinucleína es una proteína sináptica expresada predominantemente en neuronas del neocórtex, hipocampo, sustancia negra, tálamo y cerebelo (Iwai et al. Neuron (1995), 14: 467-475). En condiciones fisiológicas, se localiza en las terminales sinápticas neuronales y se regula por incremento específicamente en las terminales presinápticas durante el reordenamiento sináptico relacionado con la adquisición (Fortin et al. J Neurosci (2005), 25: 10913-10921).
[0009] Los estudios in vitro han demostrado que los monómeros de alfa-sinucleína pueden formar el punto de partida para el proceso de agregación. El monómero puede agregarse en una variedad de pequeñas especies oligoméricas que a continuación se estabilizan mediante interacciones de lámina beta, pasando a formar protofibrillas que pueden polimerizar en estructuras fibrilares insolubles que recuerdan a las identificadas en los cuerpos de Lewy (Cremades et al. Cell (2012), 149 (5): 1048-59).
[0010] En condiciones patológicas, la agregación aberrante alfa-sinucleína puede ser clave para los cambios patológicos observados en alfa-sinucleinopatías (Lashuel et al Nature (2002), 418: 291; y Tsigelny et al FEBS Journal (2007), 274: 1862-1877). Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que los efectos neurotóxicos de la alfasinucleína parecen ser provocados por pequeños confórmeros oligoméricos solubles o protofibrillas (Winner et al. Proc Natl Acad Sci USA (2011), 108 (10): 4194-9; y Danzer et al., J Neurosci (2007), 27 (34): 9220-32). Aunque los agregados fibrilares de alfa-sinucleína son característicos de la PD, las formas oligoméricas de alfa-sinucleína son las especies tóxicas (Danzer et al. J Neurosci (2007), 27 (34): 9220-32; Lashuel et al. Nature (2002), 418: 291; y Winner et al., Proc Natl Acad Sci USA (2011), 108: 4194-4199).
[0011] Los oligómeros de alfa-sinucleína pueden liberarse al entorno extracelular y ser captados por las células vecinas en un mecanismo de "propagación" (Angot y Brundin, Parkinsonism Relat Disord (2009), 15 Suppl 3: S143-147; Desplats et al. Proc Natl Acad Sci USA (2009), 106: 13010-13015; y Lee et al. J Biol Chem (2010), 285: 9262­ 9272). Los agregados de alfa-sinucleína pueden propagar el plegamiento incorrecto a través de un mecanismo de diseminación similar a un prión (Lee et al. Nat Rev Neurol (2010), 6: 702-706; Luk et al. J Exp Med (2012), 209 (5): 975 -86; y Luk et al. Science (2012), 338 (6109): 949-53). Por lo tanto, la alfa-sinucleína puede inducir la neurodegeneración por toxicidad de oligómeros o por propagación y diseminación similar a priones.
[0012] Actualmente está bien establecido y aceptado que las células, incluyendo neuronas, pueden secretar diversas formas de alfa-sinucleína (monómeros, oligómeros, agregados) en condiciones normales y también bajo condiciones de estrés celular, la secreción de las formas monoméricas y agregadas de alfa-sinucleína se eleva en condiciones de estrés celular y, a través de esta liberación de alfa-sinucleína en el medio extracelular, las formas patológicas transmisibles de alfa-sinucleína pueden propagarse entre neuronas (Recasens y Dehay, Front Neuroanat (2014), 8: 159).
[0013] Los efectos de la alfa-sinucleína en la PD se puede extender más allá de los daños inmediatos a las células neuronales vulnerables. Como la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, también se observa una respuesta celular proinflamatoria (Lee et al. J Biol Chem (2010), 285: 9262-9272). La alfa-sinucleína circulante y/o los astrocitos activados pueden activar la microglía, lo que lleva a una mayor generación de especies reactivas de oxígeno, producción de óxido nítrico y citocinas, y exacerba aún más la neurodegeneración (Lee et al. J Biol Chem (2010), 285: 9262-9272).
[0014] Una variedad de diferentes modelos experimentales han demostrado una transmisión de célula a célula de la alfa-sinucleína en células cultivadas, o la diseminación y propagación in vivo de patologías con alfa-sinucleína. Se ha observado patología con cuerpos de Lewy en injertos neuronales mesencefálicos embrionarios más de 10 años después de que los injertos se trasplantaran terapéuticamente al cuerpo estriado de pacientes con PD. Específicamente, las neuronas injertadas contenían un conjunto de inclusiones similares a cuerpos de Lewy que se tiñeron positivamente para la alfa-sinucleína, lo que indica que se había producido una transmisión de la patología de la alfa-sinucleína de huésped a injerto (Li et al. Nat Med (2008), 14 (5). ): 501-3; y Kordower et al. Nat Med (2008), 14 (5): 504-6).
[0015] Además, las fibrillas de alfa-sinucleína recombinantes preformadas y los oligómeros de alfa-sinucleína pueden internalizarse por células y neuronas cultivadas, y se ha demostrado la transferencia directa de alfa-sinucleína de las células del donante a las receptoras con la formación de inclusiones de alfa-sinucleína similares a la patología de Lewy. (Danzer et al. J Neurosci (2007), 27 (34): 9220-32; Volpicelli-Daley et al. Neuron (2011), 72 (1): 57-71; y Luk et al. Proc Natl Acad Sci USA (2009), 106 (47): 20051-6). La inyección de fibrillas de alfa-sinucleína sintéticas preformadas o de material que contiene alfa-sinucleína similar a cuerpos de Lewy extraído de los cerebros de ratones transgénicos con alfa-sinucleína envejecidos en los cerebros de ratones receptores asintomáticos promueve la formación de patología similar a los cuerpos de Lewy en las neuronas huésped de los animales receptores junto con neurodegeneración y déficits neurológicos (Luk et al. J Exp Med (2012), 209 (5): 975-86; y Luk et al. Science (2012), 338 (6109): 949-53). La alfa-sinucleína que contiene extractos de cuerpos de Lewy aislados de cerebros con PD inoculados en la sustancia negra o el cuerpo estriado de monos macacos y ratones es absorbida rápidamente por las células huésped (dentro de las 24 horas), seguida de una pérdida más lenta de terminales dopaminérgicas estriatales, con pérdida celular evidente después más de un año (Recasens et al. Ann Neurol (2014), 75 (3): 351-62). De manera similar, la inoculación de ratones con homogeneizados cerebrales derivados de pacientes con sinucleinopatías DLB o MSA desencadena una patología similar a la alfa-sinucleína Lewy en los ratones huésped (Watts et al. Proc Natl Acad Sci USA (2013), 110 (48): 19555- 60; y Masuda-Suzukake et al. Brain (2013), 136 (Pt 4): 1128-38). Finalmente, se ha demstrado en ratones la transferencia y transmisión de alfa-sinucleína monomérica y oligomérica desde el bulbo olfativo a la estructuras cerebrales conectadas (Rey et al. Acta Neuropathol (2013), 126(4): 55-73).
[0016] Las estrategias de inmunoterapia pasivacon anticuerpos dirigidos a la alfa-sinucleína se han probado en numerosos modelos de ratón con alfa-sinucleinopatía preclínicos (Lawand Targets et al Expert Opin Ther (2015): 1­ 10). Específicamente, un estudio que utilizó un anticuerpo monoclonal dirigido contra la alfa-sinucleína (9E4) ha demostrado la depuración in vivo de los agregados de alfa-sinucleína y la patología, mejoras motoras del comportamiento y efectos neuroprotectores (WO 2014/058924).
[0017] Otros estudios que utilizan la inmunización pasiva de ratones transgénicos con alfa-sinucleína desarrollados como modelos experimentales de PD/DLB, con el anticuerpo monoclonal 9E4, han demostrado que el anticuerpo elimina la patología con la alfa-sinucleína, reduce los déficits sinápticos y axonales, anula la pérdida de fibras de tirosina hidroxilasa estriatales, y reducen significativamente los déficits de memoria y las alteraciones de la función motora (Games et al. J Neurosci (2014), 34 (28): 9441-54; Bae et al. J Neurosci (2012), 32 (39): 13454-69; y Masliah et al.PLoS One (2011), 6 (4): e19338). Además, se ha demostrado que la administración pasiva de anticuerpos monoclonales anti-alfa-sinucleína en ratones de tipo salvaje que fueron inyectados intraestriatalmente con fibrillas sintéticas preformadas con alfa-sinucleína (pffs) condujo a una fuerte reducción de la patología de Lewy, prevención de la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y una mejora significativa en alteraciones motoras que se manifiestan en el modelo de ratón después del tratamiento con pffs (Tran et al. Cell Rep. (2014), 7(6): 2054­ 65).
[0018] Además, uno de los principales desafíos asociados con el tratamiento de trastornos del SNC con agentes terapéuticos de moléculas grandes, tales como los anticuerpos, es hacer que estos medicamentos lleguen al tejido afectado. El paso de moléculas grandes al cerebro y la médula espinal está restringido en gran medida por la barrera hematoencefálica (BBB). La BBB protege y regula la homeostasis del cerebro e impide el paso libre de moléculas a la mayor parte del cerebro, lo que limita el tratamiento de muchas enfermedades cerebrales. El transporte de moléculas esenciales, tales como nutrientes, factores de crecimiento y hormonas, se logra a través de una serie de transportadores y receptores específicos que regulan el paso a través de las células endoteliales del cerebro. El suministro de agentes biológicos y otros fármacos al cerebro, por lo tanto, representa un desafío importante. Adicionalmente, parecen existir mecanismos de transporte que eliminan rápidamente los anticuerpos del cerebro, presumiblemente para evitar respuestas inflamatorias debido al acoplamiento de Fc con ligandos efectores que promueven una respuesta pro-inflamatoria.
[0019] Durante la última década, los informes de transporte de anticuerpo través de la BBB han surgido donde la unión al dominio extracelular del transportador de moléculas facilita la transcitosis del complejo de anticuerpo receptor a través de la capa de células endoteliales.
[0020] La BBB se compone principalmente de células endoteliales capilares del cerebro, que tienen características especializadas, tales como uniones estrechas, para limitar el transporte de moléculas en el cerebro (Reese et al 1967, J. Cell Biol. 34:. 207-217; Brightman et al. 1969, J. Cell Biol. 40: 648-677; Rubin et al. 1999, Ann. Rev. Neurosci. 22: 11-28), aunque otros tipos de células, tales como pericitos, astrocitos y células neuronales, también juegan un papel importante en la función de BBB. Normalmente, menos del 0,1% de un anticuerpo dosificado periféricamente llega al cerebro (Boado et al. 2010, Mol. Pharm. 7: 237-244; Pepinsky et al. 2011, Nat. Neurosci. 8: 745-751). La BBB funciona como una barrera física, metabólica e inmunológica (Gaillard et al. 2003, Microvasc. Res. 65: 24-31).
[0021] El transporte de anticuerpos a través de la BBB puede potenciarse activando la transcitosis mediada por receptores en las células endoteliales del cerebro. A través de este proceso, el acoplamiento de los antígenos en el lado luminal de la célula endotelial puede inducir la internalización y el transporte del anticuerpo a través de la célula, y a continuación su posterior liberación en el tejido.
[0022] Las terapias con fármacos actuales para la PD se centran principalmente en el tratamiento de los síntomas relacionados con el sistema motor de la enfermedad. Actualmente no existen terapias comercializadas o disponibles que puedan tratar o prevenir la alfa-sinucleinopatía.
[0023] Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de una terapia para tratar alfa-sinucleinopatías, particularmente en seres humanos.
[0024] El documento WO 2014/132210 describe anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen una alta afinidad de unión por agregados de a-sinucleína (por ejemplo, fibrillas amiloides, protofibrillas u oligómeros) y baja afinidad de unión por monómeros de a-sinucleína.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0025] La presente invención se describe mediante las reivindicaciones adjuntas. La reivindicación 1 proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a a-sinucleína humana, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:
a) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias:
(i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 15; y
(iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 16,
y
b) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias:
(i) L-CDR1 de SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 de SEQ ID NO: 10; y
(iii) L-CDR3 de SEQ ID NO: 21.
[0026] Otras características ventajosas se describen en las reivindicaciones dependientes restantes.
[0027] La presente divulgación se refiere a anticuerpos aislados contra alfa-sinucleína humana. La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen una o más de las propiedades funcionales del anticuerpo aslo0452 ngl-3. Por ejemplo:
La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la región C-terminal de la a-sinucleína humana. La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la región que comprende aproximadamente el aminoácido 102 a aproximadamente el aminoácido 130 de la a-sinucleína humana (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a una región que comprende de aproximadamente el aminoácido 120 a aproximadamente el aminoácido 130 de la a-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo que no es el mismo que el anticuerpo unido por el anticuerpo 9E4.
[0028] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a asinucleína humana, pero no p-sinucleína humana o Y-sinucleína humana.
[0029] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a asinucleína humana, de rata y cynomolgus.
[0030] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a asinucleína humana con alta afinidad. En una realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente divulgación se une a alfa-sinucleína con una Kd de menos de 500 picoMolar (pM), menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 150 pM, menos de 120 pM, menos de 110 pM o 106 pM o menos medido, por ejemplo, usando análisis de octets. En una realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente divulgación se une a alfa-sinucleína con una Kd de menos de 400 picoMolar (pM), menos de 300 pM, menos de 250 pM, menos de 200 pM, menos de 150 pM, menos de 120 pM, menos de 110 pM, menos de 100 pM, menos de 80 pM o 74 pM o menos medido, por ejemplo, usando análisis KinExA.
[0031] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a asinucleína endógena humana nativa.
[0032] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a las formas monoméricas de a-sinucleína humana.
[0033] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a los agregados de a-sinucleína humana.
[0034] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une formas patológicas de a-sinucleína relevante para la enfermedad.
[0035] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que reduce los niveles de a -sinucleína en el líquido intersticial del cerebro. En particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente divulgación reduce los niveles de a-sinucleína libre no unida en el líquido intersticial del cerebro.
[0036] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que reduce los niveles de a -sinucleína en el líquido cefalorraquídeo. En particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente divulgación reduce los niveles de a-sinucleína libre no unida en el líquido cefalorraquídeo.
[0037] Tal como se usa en este documento, los términos "a-sinucleína no unida libre" se refieren a la a -sinucleína que no está unida al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación. Dicha a-sinucleína libre no unida se puede aplicar a la a-sinucleína en su forma monomérica u oligomérica, o en forma agregada. Estos términos generalmente se aplican a cualquier forma patológica de a-sinucleína.
[0038] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que reduce la propagación de a-sinucleína in vivo.
[0039] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación compite con el anticuerpo aslo0452 ngl-3 para la unión a a-sinucleína humana.
[0040] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación se une al mismo epítopo en a-sinucleína humana que el anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0041] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación deriva del anticuerpo asyn0087 que comprende una región de cadena pesada variable (VH) de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una región de cadena ligera variable (VL) de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, tal como se describe en el presente documento.
[0042] En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación deriva del anticuerpo asyn0087, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una Kd de menos de 500 mM y se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos asyn0087, aslo0452 ngl-3 y aslo0543, descritos a continuación.
[0043] Tal como se usa en el presente documento, "H-CDR" se refiere a una región determinante complementaria (CDR) en la región de la cadena pesada, y "L-CDR" se refiere a una región determinante complementaria (CDR) en la región de la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0044] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende al menos una CDR seleccionada de:
(i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 6,
(iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 7,
(iv) L-CDR1 de SEQ ID NO: 9,
(v) L-CDR2 de SEQ ID NO: 10,
(vi) L-CDR3 de SEQ ID NO: 11.
[0045] En una realización adicional, la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación es CDR3 de SEQ ID NO: 16 de la cadena pesada del anticuerpo aslo0452 ngl-3; y/o la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la presente divulgación es la CDR3 de SEQ ID NO: 21 de la cadena ligera del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0046] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación tiene al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o todas las CDR seleccionadas de las CDR de anticuerpo aslo0452 ngl-3, es decir, al menos una CDR seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21.
[0047] En una realización, la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo aslo0452 ngl-3; y/o la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0048] En una realización, la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0049] En una realización, la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0050] En una realización, la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo aslo0452 ngl-3 y la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0051] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene las seis CDR de anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0052] Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende:
a) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias:
(i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 15; y
(iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 16, y
b) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias:
(i) L-CDR1 de SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 de SEQ ID NO: 10, y
(iii) L-CDR3 de SEQ ID NO: 21.
[0053] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de nucleótidos definida por SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos definida por SEQ ID NO: 18.
[0054] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 19.
[0055] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
[0056] En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 8.
[0057] En una realización adicional particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO : 8, y se une a la a-sinucleína humana con una Kd de menos de 500 pM y se une al mismo epítopo que asyn0087, aslo0452 ngl-3 o aslo0543.
[0058] En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 19.
[0059] En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 19.
[0060] En una realización adicional, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 19 y además comprende:
a) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias:
(i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 15; y
(iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 16, y
b) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias:
(i) L-CDR1 de SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 de SEQ ID NO: 10; y
(iii) L-CDR3 de SEQ ID NO: 21.
[0061] La presente divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 18.
[0062] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 19.
[0063] También se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 17.
[0064] En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 30.
[0065] En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 30.
[0066] En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 30 y además comprende:
c) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias:
(iv) H-CDR1 de SEQ ID NO: 25,
(v) H-CDR2 de SEQ ID NO: 26; y
(vi) H-CDR3 de SEQ ID NO: 27, y
d) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias:
(iv) L-CDR1 de SEQ ID NO: 31,
(v) L-CDR2 de SEQ ID NO: 32; y
(vi) L-CDR3 de SEQ ID NO: 33.
[0067] La presente divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 30.
[0068] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 30.
[0069] También se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 28.
[0070] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación tal como se define en cualquier lugar anteriormente, es un anticuerpo IgA, IgD, IgE, IgM, IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 o fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0071] En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación tiene una región Fc modificada. Las modificaciones adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden incluir, entre otras, modificaciones para aumentar o disminuir la semivida, eliminar, reducir o mejorar la función efectora, proporcionar cisteínas sustituidas con tioles libres para la conjugación. Los ejemplos de tales modificaciones son YTE para aumentar la semivida y/o TM para reducir la función efectora. En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento comprende las mutaciones M252Y/S254T/T256E (YTE) en la región Fc del anticuerpo (Dall'Acqua et al., 2006, J. Biol. Chem, 281: 23514­ 23524). En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento comprende una triple mutación (abreviada en el presente documento como "TM ")) en la región Fc correspondiente a la mutación L234F/L235E/P331S descrita en Oganesyan et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, (2008) 64: 700-704. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo IgG1 con TM o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación puede comprender una región Fc que tiene mutaciones YTE.
[0072] En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente divulgación puede estar acoplado a un resto transportador de la barrera hematoencefálica (BBB), en donde el resto transportador de BBB es capaz de transportar el anticuerpo, o de unión a antígeno fragmento del mismo, a través de la BBB.
[0073] En una realización, el resto transportador de BBB puede ser un anticuerpo. En una realización, el anticuerpo de BBB puede formar una construcción multiespecífica con un anticuerpo anti-a-sincucleína o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El resto transportador de BBB puede comprender una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable de inmunoglobulina-1 (VH-CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable de inmunoglobulina-2 (VH-CDR2), una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable de inmunoglobulina-3 (VH-CDR3), una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable de inmunoglobulina-1 (VL-CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable de inmunoglobulina-2 (VL-CDR2), y una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable de inmunoglobulina región-3 (VL-CDR3); en donde la VH-CDR1 comprende la SEQ ID NO. 40 o 49, VH-CDR2 comprende la SEQ ID NO. 41 o 50, VH-CDR3 comprende la SEQ ID NO. 42 o 51, VL-CDR1 comprende la SEQ ID NO. 36, 44 o 53, VL-CDR2 comprende la SEQ ID NO. 37, 45 o 54 y VLCDR3 comprende la SEQ ID NO. 38, 46 o 55.
[0074] En algunas realizaciones, el resto transportador comprende una región de cadena pesada (VH) variable de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el resto transportador comprende una región de cadena ligera (CL) variable de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 43.
[0075] Además, el resto transportador puede ser seleccionado de un anticuerpo completo, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento unido a disulfuro (dsFv), un fragmento Fv de cadena única (scFV), un fragmento sc(Fv)2, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un minicuerpo y un anticuerpo monocatenario. En una realización particular, el resto transportador comprende un fragmento scFV que comprende un dominio VH y un dominio VL fusionados entre sí mediante un enlazador. En algunos casos, el enlazador puede ser (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 56), donde n es un número entero positivo seleccionado del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.
[0076] En algunas realizaciones, cualquier molécula transportadora de la presente divulgación se puede combinar, tal como se describe en el presente documento, con cualquier molécula de unión a alfa-sinucleína de la presente divulgación para proporcionar una molécula de unión multi-específica de la presente divulgación.
[0077] La presente divulgación proporciona el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar anteriormente, para uso como un medicamento.
[0078] La presente divulgación también proporciona el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar anteriormente, para su uso en la prevención o tratamiento de una a-sinucleinopatía.
[0079] En una realización, la a-sinucleinopatía se selecciona de la enfermedad de Parkinson (PD), demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y atrofia multisistémica (MSA).
[0080] En una realización, la a-sinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson (PD).
[0081] La presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad, en particula una enfermedad asociada con el sistema nervioso central, en un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar anteriormente.
[0082] En una realización, la enfermedad es una a-sinucleinopatía.
[0083] En una realización, la a-sinucleinopatía se selecciona de la enfermedad de Parkinson (PD), demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y atrofia multisistémica (MSA).
[0084] En una realización, la a-sinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson (PD).
[0085] La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar anteriormente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0086] La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionen funciones terapéuticas suplementarias, adicionales o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administración.
[0087] Una composición farmacéutica de la presente divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los expertos en la técnica conocen métodos para realizar la administración. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, subcutánea o transdérmica.
[0088] La presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar anteriormente.
[0089] En una realización particular, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 18.
[0090] En otra realización particular, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEQ ID NO: 23 y/o SEQ ID NO: 29.
[0091] Una vez provisto de esta información, un experto en la técnica podría obtener fácilmente moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos descritos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden comprender ADN o ARN y pueden ser total o parcialmente sintéticos o recombinantes. La referencia a una secuencia de nucleótidos abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera lo contrario.
[0092] Las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación comprenden una secuencia que codifica una CDR, un dominio VH y/o un dominio VL descritos en este documento.
[0093] La presente divulgación también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores, fagémidos, transcripción o casetes de expresión que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar anteriormente, en en particular que codifica una CDR, un dominio VH y/o un dominio VL descritos en el presente documento.
[0094] La divulgación proporciona además una célula huésped que comprende una o más construcciones como anteriormente.
[0095] También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican una o más CDR (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, o L-CDR3), dominio VH o VL descritos en el presente documento, así como métodos de fabricación de los productos codificados. El método comprende expresar el producto codificado a partir del ácido nucleico codificante. La expresión se puede lograr cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, un dominio VH o VL, o un miembro de unión específico puede aislarse y/o purificarse usando cualquier técnica adecuada, y a continuación usarse según sea apropiado.
[0096] Los fragmentos de unión a antígeno, los dominios VH y/o VL y las moléculas de ácido nucleico codificantes y vectores pueden aislarse y/o purificarse de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso de ácido nucleico, libres o sustancialmente libres de ácido nucleico o genes de origen distintos de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida.
[0097] Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos en la técnica. Para las células adecuadas para producir anticuerpos, consulte Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999. Brevemente, las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células vegetales, células de mamíferos y sistemas de levaduras y baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de mieloma de ratón NS0 y muchas otras. Un huésped bacteriano común es E. coli. Puede usarse cualquier sistema de expresión de proteínas compatible con la presente divulgación para producir los anticuerpos divulgados. Los sistemas de expresión adecuados incluyen animales transgénicos descritos en Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999.
[0098] Se pueden elegir o construir vectores adecuados, de modo que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos o virales, por ejemplo, fagos o fagémidos, según sea apropiado. Para más detalles, ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, 2a edición, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992.
[0099] Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico, tal como se describe en el presente documento, en particular, un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar anteriormente.
[0100] Otro aspecto adicional proporciona un procedimiento que comprende introducir dicho ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otro virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación de cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos. La introducción del ácido nucleico en las células puede ir seguida de provocar o permitir la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones para la expresión del gen.
BREVE DIVULGACIÓN DE LAS FIGURAS Y LISTADO DE SECUENCIAS
[0101] La presente divulgación se describirá ahora con más detalle con referencia a las figuras adjuntas y listado de secuencias, en las que se muestran:
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Figuras de la leyenda:
[0102] Tabla 1: Determinación de afinidad de los anticuerpos anti-a-sinucleína clave para a-syn humana realizada en dos plataformas de medición de afinidad.
Figura 1: Representación esquemática de ensayo HTRF®.
Figura 2: Comparación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) (SEQ ID NO: 2, 14 y 24, respectivamente) y región variable de cadena ligera (VL) (SEQ ID NO: 3, 19 y 30, respectivamente) de asyn0087, aslo0452ngl-3 y aslo0543 Los aminoácidos subrayados corresponden a las CDR.
Figuras 3A-3D: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de aslo0452 ngl-3. Las Figuras 3A y 3B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cadena pesada variable y cadena ligera variable, respectivamente, de aslo0452 ngl-3. La Figura 3A describe las SEQ ID Nos: 13 y 14, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 3B describe las SEQ ID Nos: 18 y 19, respectivamente, en orden de aparición. Las Figuras 3C y 3D muestran el alineamiento de estas secuencias con las secuencias de la línea germinal humana más cercanas. La Figura 3C muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable de aslo0452 ngl-3 (SEQ ID NO: 14) con las secuencias de línea germinal IGHV3-23 (SEQ ID NO: 58) y JH6 (SEQ ID NO: 59). La Figura 3D muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos del dominio de cadena ligera variable de aslo0452 ngl-3 (SEQ ID NO: 19) con las secuencias de línea germinal IGLV5-45 (SEQ ID NO: 60) y JL2 (SEQ ID NO: 61), 3. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están subrayadas y etiquetadas. Las diferencias con la línea germinal se resaltan en negrita y se describen. Todos los residuos que no son de Vernier en las regiones estructurales de la cadena ligera son aminoácidos de la línea germinal humana. Los residuos de vernier (*) no se han cambiado para coincidir con los aminoácidos de la línea germinal.
Figuras 4A y 4B: Unión a epítopos de clones aislados cabezas de serie usando un panel de truncados de asyn . Los pocillos de ELISA están recubiertos con una variedad de truncados de a-syn disponibles comercialmente que representan las diversas regiones definidas de la proteína: 1-140: a-syn de longitud completa, 1-60: región N-terminal solamente, 61-140: componente no amiloide de placas (NAC) más región C-terminal, 1-95: regiones N-terminal y NAC, 96-140: región C-terminal solamente, ANAC: región NAC eliminada, NCAP: es una forma de empalme alternativo de a-syn carente de aminoácidos 103-129 (rPeptide). Los anticuerpos primarios usados para la detección fueron (Figura 4A) Asyn087; y (Figura 4B) Aslo0452 ngl-3 (barras negras), aslo0543 (barras de color gris claro) y control emparejado de isotipo NIP228 (barras de color gris oscuro). La unión se detecta con un anticuerpo secundario de IgG anti-humana Eu3+ (Figura 4A) o un anticuerpo secundario IgG anti-humana-HRP (Figura 4B).
Figura 5: Especificidad de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 para a-syn en relación con miembros de la familia de sinucleína usando un ensayo de competición de epítopos DELFIA. Usando el ensayo HTRF de competición de epítopos, se determinó la especificidad de los clones de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 optimizados por afinidad para asyn mediante titulación de a-syn, p-syn y Y-syn no marcadas. A partir de esto, se determinaron los valores de IC50. Figura 6: Especificidad de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 para a-syn humana, de mono cynomolgus y de rata usando un ensayo de competición de epítopos de HTRF. Usando el ensayo de competición de epítopos HTRF, se determinó el perfil de reactividad cruzada de especies de los clones optimizados por afinidad en un ensayo similar mediante una titulación de a-syn no marcada y la derivación de los valores de IC50 para cada especie de a-syn. Figuras 7A y 7B: Resultados de citometría de flu jo representativos que demuestran que los clones optimizados por afinidad se unen a a-syn humana nativa en una línea celular de neuroblastoma humano.
Los paneles A, C, E y G de las Figuras 7A y 7B muestran la unión a la línea celular de cáncer de mama humano asyn negativa, BT20. Los paneles B, D, F y H de las Figuras 7A y 7B muestran la unión a la línea celular de neuroblastoma humano a-syn positiva, SHSY5Y. Figura 7A: Los anticuerpos humanos primarios usados en este estudio fueron asyn0087 y el control de IgG de Hu. La unión del anticuerpo humano se detectó usando un anti-IgG humana-FITC secundario (Jackson). Figura 7B: Los anticuerpos humanos primarios usados en este estudio fueron aslo0452 ngl-3, aslo0543 y el control IgG1 TM emparejado con el isotipo NIP228. La unión del anticuerpo humano se detectó usando un anti-IgG humano-FITC secundario (Jackson). Los anticuerpos de ratón primarios utilizados fueron 4D6 (Covance) y un control negativo de isotipo coincidente (R&D Systems). La unión del anticuerpo de ratón se detectó usando una IgG anti-ratón-FITC secundaria (Sigma).
Figura 8: Especificidad de IgG anti-a-syn optimizadas para a-syn humana agregada mediante ELISA DELFIA. El gráfico muestra que aslo0452 ngl-3 y aslo0543, dos clones específicos de a-syn de alta afinidad, y el anticuerpo cabeza de serie, asyn0087, detectaron formas agregadas capturadas de a-syn (barras negras), pero no detectaron a-syn monomérica capturada.
Figuras 9A-9C: especificidad de clones optimizados por afinidad en tejidos relevantes para la enfermedad mediante inm unohistoquím ica . Las figuras 9A, 9B y 9c muestran la tinción con aslo0452 ngl-3, asyn0087 y aslo0543, respectivamente. Los paneles A, B y C muestran aslo0452 ngl-3 que tiñe tanto los cuerpos de Lewy (paneles A y B) como las neuritas de Lewy (panel C) de la sustancia negra en el tejido cerebral de la PD. El panel D muestra que aslo0452 ngl-3 muestra una tinción de bajo nivel de a-syn en células de la corteza temporal en una sección normal del cerebro. Los paneles E, F y G muestran que aslo0452 ngl-3 tiñe cuerpos de Lewy, neuritas de Lewy y puntos de Lewy de la amígdala en tejido cerebral de PD. El panel H muestra un anticuerpo de isotipo de control coincidente que no muestra tinción en la amígdala en el tejido cerebral de PD. Los paneles I a M muestran que asyn0087 tiñe el Locus Coeruleus en tejido cerebral de PD; las características patológicas identificadas son cuerpos de Lewy (Panel I y L), agregados neuronales (Panel J), neuritas de Lewy (Panel K) y cuerpos Pale (Panel M). Los paneles N y O muestran que aslo0543 tiñen los cuerpos de Lewy y las neuritas de Lewy en la sustancia negra en el tejido cerebral de PD. El panel P muestra que aslo0543 tiñe a bajo nivel a-syn en células de la corteza temporal en una sección de cerebro normal.
Figuras 10A y 10B: la administración sistémica de aslo0452 ngl-3 reduce rápidamente los niveles de asyn libre en la corteza prefrontal de ratas. Media ± SEM absoluta (Figura 10A) o relativa (Figura 10B) de concentración de asinucleína libre en ISF de aslo0452 ngl-3 (30 mg/kg por vía intravenosa; símbolos rellenos) o ratas tratadas con vehículo (símbolos sin rellenar).
Figuras 11A y 11B: Aslo0452 ngI-3 disminuye de manera dependiente de la dosis y el tiempo los niveles de asyn libre en CSF de ratas tras la administración sistém ica . Media ± SEM absoluta (Figura 11A) o relativa (Figura 11B) de concentración de a-sinucleína libre en CSF de aslo0452 ngl-3 (3, 10, 30, 100 mg/kg por vía intravenosa; símbolos rellenos) o ratas tratadas con vehículo (símbolos sin rellenar).
Figuras 12A-12C: Los anticuerpos anti-alfa-sinucleína aslo0452 ngl-3 y aslo0452 ngl-3-D265A bloquean la propagación de alfa-sinucleína ipsilateral a contralateral. (Figura 12A): los ratones no tg inyectados con LV-a-syn en el hipocampo derecho (flechas negras) se inmunizaron pasivamente con dosis semanales de anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4, o con el anticuerpo de isotipo de control NIP228, durante 13 semanas, seguido de la determinación de la propagación de alfa-sinucleína mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. (Figura 12B): Cuantificación de los datos de inmunorreactividad de alfa-sinucleína obtenidos del análisis inmunocitoquímico de secciones coronales del hipocampo ipsolateral representadas en A. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0. 05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett. (Figura 12C): Cuantificación de los datos de inmunorreactividad de alfa-sinucleína obtenidos del análisis inmunocitoquímico de las secciones coronales del hipocampo contralateral representadas en el panel A. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett.
Figuras 13A-13C: los anticuerpos anti-alfa-sinucleína aslo0452 ngl-3 y aslo0452 ngl-3-D265A reducen la deposición y diseminación de alfa-sinucleína expresada lentiviralmente a lo largo de los axones. (Figura 13A): los ratones no tg inyectados con LV-a-syn en el hipocampo derecho se inmunizaron pasivamente con dosis semanales de anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4 o con anticuerpo de isotipo de control NIP228, durante 13 semanas, seguido de análisis inmunocitoquímico de los depósitos de alfasinucleína a lo largo de los axones transhipocampales ipsilaterales y contralaterales (flechas negras). (Figura 13B): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína axonales ipsilaterales determinada mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett. (Figura 13C): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína axonales contralaterales determinados mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett.
Figuras 14A-14C: Los anticuerpos anti-alfa-sinucleína aslo0452 ngl-3 y aslo0452 ngl-3-D265A reducen el depósito de alfa-sinucleína en las neuronas del hipocampo CA1 y en las neuronas neocorticales de capa 5. (Figura 14A): Los ratones no tg inyectados con LV-a-syn en el hipocampo derecho se inmunizaron pasivamente con dosis semanales de anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4 o con anticuerpo de isotipo de control NIP228, durante 13 semanas, seguido de análisis inmunocitoquímico de depósitos de alfa-sinucleína en neuronas hipocampales CA1 ipsilaterales y neuronas neocorticales de capa 5 ipsilaterales (flechas negras). (Figura 14B): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína en neuronas neocorticales de capa 5 ipsilateral determinada mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Los datos mostrados representan el número de células positivas para alfa-sinucleína (neuronas) por 0,1 mm2. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOv A de 1 vía con post-test de Dunnett. (Figura 14C): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína en neuronas hipocampales CA1 ipsolaterales determinada mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Los datos mostrados representan el número de células positivas para alfa-sinucleína (neuronas) por 0,1 mm2. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett.
Figuras 15A-15C: Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0452 ngl-3-D265A bloquean la diseminación de alfasinucleína en ratones transgénicos de alfa-sinucleína . (Figura 15A): ratones tg a-syn inyectados con LV-a-syn en el hipocampo derecho (flechas negras) se inmunizaron pasivamente con dosis semanales de anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4 o con anticuerpo de isotipo de control NIP228, durante 13 semanas, seguido de la determinación de la propagación de alfa-sinucleína mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. (Figura 15B): Cuantificación de los datos de inmunorreactividad de alfa-sinucleína obtenidos del análisis inmunocitoquímico de secciones coronales del hipocampo ipsolateral representados en el panel A. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett. (Figura 15C): Cuantificación de los datos de inmunorreactividad de alfa-sinucleína obtenidos del análisis inmunocitoquímico de secciones coronales del hipocampo contralateral representados en el panel A. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett. Figuras 16A-16C: Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0452 ngl-3-D265A reducen la deposición y diseminación de alfa-sinucleína expresada lentiviralmente a lo largo de axones en ratones transgénicos . (Figura 16A): ratones tg a-syn inyectados con LV-a-syn en el hipocampo derecho se inmunizaron pasivamente con dosis semanales de anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4, o con el anticuerpo de control del isotipo NIP228, durante 13 semanas, seguido de un análisis inmunocitoquímico de los depósitos de alfa-sinucleína a lo largo de los axones transhipocampales ipsilaterales y contralaterales (flechas negras). (Figura 16B): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína axonales ipsilaterales determinados mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOv A de 1 vía con post-test de Dunnett. (Figura 16C): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína axonal contralateral determinada mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett.
Figuras 17A-17D: Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0452 ngl-3-D265A reducen el depósito de alfasinucleína en las neuronas del hipocampo CA1 y las neuronas neocorticales de capa 5 en ratones transgénicos con alfa-sinucleína . (Figura 17A): ratones tg a-syn inyectados con LV-a-syn en el hipocampo derecho se inmunizaron pasivamente con dosis semanales de anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4, o con anticuerpo de isotipo de control NIP228, durante 13 semanas, seguido de análisis inmunocitoquímico de depósitos de alfa-sinucleína en neuronas hipocampales CA1 ipsilaterales y neuronas neocorticales de capa 5 ipsilaterales (flechas negras). (Figura 17B): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína en neuronas neocorticales de capa 5 ipsilateral determinada mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Los datos mostrados representan el número de células positivas para alfa-sinucleína (neuronas) por 0,1 mm2. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett. (Figura 17C): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína en neuronas hipocampales CA1 ipsolaterales determinadas mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Los datos mostrados representan el número de células positivas para alfa-sinucleína (neuronas) por 0,1 mm2. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOv A de 1 vía con post-test de Dunnett. (Figura 17D): Cuantificación de depósitos de alfa-sinucleína en neuronas hipocampales CA1 contralaterales determinadas mediante inmunocitoquímica con SYN-1 y análisis de imagen automatizado. Los datos mostrados representan el número de células positivas para alfa-sinucleína (neuronas) por 0,1 mm2. Cada columna es el valor medio ± SEM de 10 tratamientos con anticuerpos independientes (n = 10 ratones por grupo de tratamiento con anticuerpos). * P <0,05 frente a NIP228; ANOVA de 1 vía con post-test de Dunnett.
Figura 18 Competición de epítopos de aslo452-ngl3-hlgG1TM con BBBt0626gl-ScFv-Bs2-also0452-ngl-3-hlgG1TM demuestra en un ensayo HTRF que la incorporación de un resto de BBB no altera la especificidad de unión de aslo452-ngl3-hlgG1TM. El anticuerpo anti-alfa-sinucleína marcado con Dylight650, aslo0452hgl3-hlgG1TM se une a la alfa sinucleína biotinilada que a su vez se une a la estreptavidina marcada con criptato. Después de la excitación del criptato, se produce una transferencia de energía (FRET) y cuando en presencia del aslo0452hgl3-hlgG1TM marcado con dylight650, el dylight650 se excita y da como resultado fluorescencia. Si está presente una IgG competidora, entonces se bloquea la unión del aslo0452 marcado con dylight650 y se evita la excitación del aslo0452 marcado con dylight650, lo que da como resultado una disminución de la señal fluorescente. Aslo0452 y Bbbt0626-Bs2-also0452 hlgG1TM son capaces de competir de manera similar con aslo0452-ngl3-hlgG1TM marcado con dylight650.
Figura 19 La unión de las células endoteliales del cerebro de ratón de BBBt0626gl-BS2-aslo452-ngl-3-hlgG1TM demuestra el acoplamiento efectivo de la diana del resto de BBB cuando se acopla a aslo452-ngl3-hlgG1TM. FMAT (Tecnología de ensayo de microvolumen de fluorescencia) o tecnologías de ensayo de bola de espejos se han utilizado para determinar la unión específica de anticuerpos a las células endoteliales del cerebro. Este ensayo mide la unión de las IgG humanas a las células endoteliales del cerebro de ratón (b.End3). Las células B.End3 se unen de forma similar por Bbbt0626 hlgG1TM, Bbbt0626glscFv-Bs2-aslo0452-hlgG1TM y Bbbt0626glscFv-Bs2-NIP228 hlgG1TM, pero no por el anticuerpo de control NIP228 hIgG1TM. Esta unión se detecta con un mAb anti-Fc de ratón (específico para humanos) que a su vez se detecta con un Fc de cabra anti-ratón marcado con Alexafluor647.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0103] La presente divulgación se basa en el descubrimiento sorprendente e inesperado de los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543. Este descubrimiento ha conducido a un nuevo grupo de anticuerpos que tienen características compartidas por los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543, así como subgrupos de anticuerpos que tienen características de aslo0452 ngl-3 y aslo0543, respectivamente.
[0104] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación deriva del anticuerpo asyn0087 que comprende una región de cadena pesada variable (VH) de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una región de cadena ligera variable (VL) de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, tal como se describe en el presente documento.
[0105] En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación deriva del anticuerpo asyn0087, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una Kd de menos de 500 nM y se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos asyn0087, aslo0452ngl-3 y aslo0543, descritos en el presente documento.
[0106] Como asyn0087, los anticuerpos aslo0452 ngI 3-y aslo0543 se unen a la región C-terminal (residuos 96-140) de a-sinucleína humana. Más específicamente, los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la región comprendida entre aproximadamente el aminoácido 102 y aproximadamente el aminoácido 130 de la a-sinucleína humana (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento se une a la región comprendida entre aproximadamente el aminoácido 120 y aproximadamente 130 de la a-sinucleína humana (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento se une a un epítopo que no es el mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo 9E4.
[0107] Los anticuerpos aslo0452 ngI-3 y aslo0543 son selectivos para a-sinucleína. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no se une a otros miembros de la familia de sinucleína, tales como p-sinucleína o ysinucleína. Más específicamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es específico para la asinucleína humana.
[0108] Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 se unen a alfa-sinucleína humana, de rata o cynomolgus. La capacidad de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 para unirse a la alfa-sinucleína humana, de mono cynomolgus y de rata es indicativa de la unión a un epítopo diferente en la alfa-sinucleína humana en comparación con los anticuerpos que no se unen a la alfa-sinucleína humana, de mono cynomolgus y de rata. Por tanto, los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 pueden utilizarse para la evaluación e investigación de la seguridad in vivo en modelos de enfermedad de mono cynomolgus y rata.
[0109] Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 se unen a a-sinucleína humana con alta afinidad. Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 se unen a alfa-sinucleína con una Kd de menos de 500 picomolar (pM), menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 150 pM, menos de 120 pM, menos de 115 pM, menos de 110 pM o 106 pM o menos, medida, por ejemplo, usando análisis de octets (véase, por ejemplo, el Ejemplo 9). Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 se unen a la alfa-sinucleína con una Kd de menos de 300 picoMolar (pM), menos de 250 pM, menos de 200 pM, menos de 150 pM, menos de 120 pM, menos de 110 pM o 108 pM, menos de 100 pM, menos de 80 pM o 74 pM o menos, medida, por ejemplo, usando análisis de KinExA (para un protocolo de análisis de KinExA de referencia, ver, por ejemplo, el Ejemplo 9).
[0110] El fragmento Fab de aslo0452 ngl-3 se une a a-sinucleína humana con alta afinidad. El fragmento Fab de aslo0452 ngl-3 se une a alfa-sinucleína con una Kd de menos de 300 picoMolar (pM), menos de 200 pM, menos de 180 pM, 174 pM o menos, medida, por ejemplo, usando análisis KinExA (ver, por ejemplo, Ejemplo 9.3).
[0111] Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 se unen a a-sinucleína humana endógena nativa. Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 se unen a agregados de a-sinucleína humana. En particular, los anticuerpos, por tanto, se unen a un epítopo que no es necesario para la agregación. Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 son capaces de secuestrar tanto formas monoméricas como agregadas de alfa-sinucleína. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es capaz de unirse a formas monoméricas y agregadas de alfasinucleína.
[0112] Los anticuerpos aslo0452 ngl-3 y aslo0543 se unen a formas de a-sinucleína patológicas relevantes de la enfermedad, por ejemplo, cuerpos de Lewy, neuritas de Lewy, puntos de Lewy en los tejidos cerebrales de la enfermedad de Parkinson. Se observa una tinción mínima en el cerebro normal (no enfermo).
[0113] El anticuerpo aslo0452 ngI-3 reduce los niveles de a -sinucleína en el líquido intersticial cerebral. En particular, el anticuerpo aslo0452 ngl-3 reduce los niveles de a-sinucleína no unida libre en el líquido intersticial del cerebro.
[0114] El anticuerpo aslo0452 ngl-3 reduce los niveles de a -sinucleína en el líquido cefalorraquídeo. En particular, el anticuerpo aslo0452 ngl-3 reduce los niveles de a-sinucleína no unida libre en el líquido cefalorraquídeo. El anticuerpo aslo0452 ngl-3 reduce la diseminación de a-sinucleína in vivo. Esta nueva función de inhibir la diseminación de la alfasinucleína es indicativa de la unión a un epítopo diferente en la alfa-sinucleína humana en comparación con los anticuerpos que no inhiben la diseminación.
[0115] En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en este documento tiene una o más de las propiedades funcionales de aslo0452 ngl-3, por ejemplo, cualquiera de las propiedades funcionales de aslo0452 ngI-3 citadas en esta memoria. En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en este documento tiene una cualquiera o más de las propiedades funcionales de aslo0543, por ejemplo, cualquiera de las propiedades funcionales de aslo0543 citadas en este documento.
[0116] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación compite con el anticuerpo aslo0452 ngl-3 y/o aslo0543 para la unión a a-sinucleína humana. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación se une al mismo epítopo en a-sinucleína humana que el anticuerpo aslo0452 ngl-3 y/o aslo0543.
[0117] Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al epítopo del anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno, tal como se definió anteriormente. Tales métodos son una cuestión de rutina en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo puede compararse con otro mediante un ensayo de competición bioquímica mediante el cual, dos anticuerpos (uno marcado con el propósito de detección y otro no) se incuban simultáneamente con un antígeno determinado. Si se logra una señal de unión para el anticuerpo marcado, se dice que los dos anticuerpos reconocen epítopos distintos que no se superponen en la proteína de interés. Si no se obtiene una señal de unión, a la inversa, se caracterizarían por tener epítopos superpuestos en la secuencia de la proteína porque la unión de un anticuerpo dificulta estéricamente la unión del segundo anticuerpo. Además, la ubicación de aminoácidos de un epítopo determinado también se puede identificar usando proteínas modificadas, tales como truncados, secuencias de péptidos lineales derivadas de la secuencia de aminoácidos primaria de un antígeno, ortólogos de especies y por digestión proteolítica y análisis de espectrometría de masas de un anticuerpo unido a una proteína determinada. Estas metodologías sirven para generar una región de interacción entre anticuerpo y antígeno.
[0118] La experimentación de rutina adicional (tal como la mutación de péptidos y análisis de unión) se puede llevar a cabo para confirmar si la falta de unión observada es, de hecho, debido a la unión del epítopo de la presente divulgación o si algún otro fenómeno (tal como el impedimento estérico) es responsable. Tales experimentos se pueden llevar a cabo usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo u otros ensayos de unión de anticuerpos conocidos.
[0119] Por ejemplo, para el mapeo fino de un epítopo específico, los modelos matemáticos de la interfaz epítopo:paratopo puede derivarse de los datos generados a través de la resolución de la estructura del complejo antígeno:anticuerpo utilizando un método de formación de imágenes de alta resolución, tales como co-cristalización con difracción de rayos X. Para confirmar la relevancia del modelo matemático derivado, en términos de identificación de residuos de contacto clave que definen el epítopo, se debe realizar posteriormente una mutagénesis puntual del antígeno y establecer un análisis del efecto sobre la fuerza de unión entre el antígeno y el anticuerpo causado por tales mutaciones. Usando esta combinación de métodos, se puede establecer un mapa exacto de residuos de contacto clave que comprenden el epítopo.
[0120] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al epítopo del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación pueden generarse produciendo variantes del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación. Dichos anticuerpos variantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden tener CDRs que comparten un alto nivel de identidad con las CDR del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cualquiera de las CDR descritas en este documento de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento puede diferir en 1 o 2 residuos de aminoácidos en comparación con cualquiera de una o más de las secuencias de CDR específicas referidas en este documento (por ejemplo, una cualquiera o más de las CDR que tienen las SEQ ID NO: 5, 15, 16, 20, 10 y 21). Adicionalmente, dichos anticuerpos pueden tener una o más variaciones (por ejemplo, una sustitución conservadora de aminoácido) en las regiones estructurales.
[0121] En una realización, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación tienen variaciones en las secuencias de aminoácidos de las CDR que mantienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% y hasta el 99% de identidad de secuencia con las CDR del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0122] En particular, se contemplan sustituciones conservadoras de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) ácidos: aspartato, glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Estas familias se pueden clasificar adicionalmente: la serina y la treonina son una familia de hidroxi alifáticos; la asparagina y la glutamina son una familia que contiene amidas; la alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y la fenilalanina, el triptófano y la tirosina son una familia aromática. Por lo tanto, en general, se podría esperar que un reemplazo aislado de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto importante en la función de unión o las propiedades del anticuerpo resultante, especialmente si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro de un sitio c Dr .
[0123] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende al menos una CDR seleccionada de:
(i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 6,
(iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 7,
(iv) L-CDR1 de SEQ ID NO: 9,
(v) L-CDR2 de SEQ ID NO: 10,
(vi) L-CDR3 de SEQ ID NO: 11.
[0124] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación tiene al menos una CDR seleccionada entre las CDR de anticuerpo aslo0452 ngl-3, es decir, al menos una CDR seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21.
[0125] En otra realización, la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo aslo0452 ngl-3; y/o la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo aslo0452 ngl-3. Por tanto, en una realización, la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente divulgación es la CDR3 de la SEQ ID NO: 16 de la cadena pesada del anticuerpo aslo0452 ngl-3; y/o la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación es la CDR3 de SEQ ID NO: 21 de la cadena ligera del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0126] En una realización adicional, la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0127] En una realización, la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0128] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación tiene las seis CDR del anticuerpo aslo0452 ngl-3 es decir, tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácido SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; y tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 21.
[0129] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de nucleótidos definida por SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos definida por SEQ ID NO: 18.
[0130] La presente divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 18.
[0131] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% , o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 19.
[0132] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende (i) una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 19, y (ii) las seis CDR del anticuerpo aslo0452 ngl-3.
[0133] La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación que comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 19.
[0134] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación tiene las seis CDR del anticuerpo aslo0543.
[0135] Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende:
a) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias:
(i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 25,
(ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 26; y
(iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 27, y
b) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias:
(i) L-CDR1 de SEQ ID NO: 31,
(ii) L-CDR2 de SEQ ID NO: 32; y
(iii) L-CDR3 de SEQ ID NO: 33.
[0136] En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación comprende una cadena pesada variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera variable que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad con la secuencia definida por SEQ ID NO: 19 y además comprende:
a) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias:
(vii) H-CDR1 de SEQ ID NO: 25,
(viii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 26; y
(ix) H-CDR3 de SEQ ID NO: 27, y
b) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias:
(vii) L-CDR1 de SEQ ID NO: 31,
(viii) L-CDR2 de SEQ ID NO: 32; y
(ix) L-CDR3 de SEQ ID NO: 33.
[0137] La presente divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de nucleótidos definida por la SEQ ID NO: 29.
[0138] La presente divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30.
[0139] En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 28.
[0140] La región estructural y CDRs de un anticuerpo pueden definirse con precisión (véase, Kabat et al. Sequences or Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos (1991), 91-3242, 1991;. Y Chothia et al. J. Mol. Biol. (1987), 196: 901-917).
[0141] Las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación se contemplan que están abarcados por la presente divulgación, siempre que las variaciones en la(s) secuencia(s) de aminoácidos mantengan al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% y lo más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, como se define en cualquier lugar del presente documento. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos.
[0142] La presente divulgación también proporciona una secuencia de aminoácidos de cadena única que comprende la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar en este documento. La presente divulgación también proporciona una secuencia de aminoácidos de cadena única que comprende la cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, tal como se define en cualquier lugar del presente documento.
[0143] La alineación óptima de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de alineación de homología local de Smith y Waterman (Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981), 484), mediante el algoritmo de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. (1970), 48: 443) mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA (1988), 85: 2444), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA - Paquete de software de análisis de secuencia del Grupo de Informática Genética, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705), o mediante inspección visual (consulte Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausbel et al, eds, Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, In. y John Wiley & Sons,Inc. (Suplemento de 1995) Ausbubel).
[0144] Los ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de similitud o identidad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (ver Altschul et al. J. Mol. Biol. (1990), 215 (3): 403-410; y "http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/' del Centro Nacional de Información Biotecnológica).
[0145] En una realización, se aísla el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación. En otra realización, se purifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación.
[0146] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es un anticuerpo monoclonal. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es un anticuerpo humanizado. En otra realización más, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es un anticuerpo humano.
[0147] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es un anticuerpo IgA, IgD, IgE, IgM o IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4, o fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0148] En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación tiene una afinidad de unión reducida a los receptores Fc de IgG. Por tanto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación tiene un bajo efecto inmunogénico. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo IgG1 TM o fragmento de unión a antígeno del mismo. IgG1 TM es un triple mutante de IgG1, que contiene 3 mutaciones puntuales (L234F/L235E/P331S) en el dominio Fc que reducen la afinidad de unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a los receptores Fc-gamma (FcyRs) (Oganesyan et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, (2008) 64: 700-704). En algunas realizaciones, la prevención mediada por anticuerpo de la diseminación de alfa-sinucleína por los anticuerpos de la presente divulgación no requiere por tanto las funciones efectoras asociadas con Fc como un mecanismo de acción clave.
[0149] Los fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, Fv, scFv, dAb, Fd, Fab', F(ab')2 o una región determinante de complementariedad aislada (CDR) que tiene suficiente estructura para unirse. Un fragmento Fab puede ser un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1. Un fragmento F(ab') 2 puede ser un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. Un fragmento Fc puede consistir en los dominios CH2 y CH3. Un fragmento Fv puede consistir en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo. Un fragmento dAb (Ward et al. Nature (1989), 341: 544-546) puede consistir en un dominio VH. Una región determinante de complementariedad (CDR) aislada que tiene una estructura suficiente para unirse puede ser una porción de unión a antígeno de una región variable.
[0150] Una porción de unión a antígeno de una región variable de cadena ligera y una porción de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se pueden unir usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite su producción como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. Science (1988), 242 (4877) : 423-426; y Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988), 85: 5879-5883). Estas se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y las porciones se criban para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
[0151] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación puede tener cualquiera o todas las propiedades ventajosas como se definió anteriormente o combinaciones de las mismas. En particular, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación pueden ser selectivos para alfa-sinucleína y ser capaces de ralentizar o prevenir la transmisión de célula a célula y la propagación de alfa-sinucleína in vivo.
[0152] La funcionalidad del anticuerpo resultante o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación y, en particular (i) su capacidad para unirse al epítopo de alfa-sinucleína; y (ii) su capacidad para ralentizar o prevenir la transmisión de célula a célula y la propagación de alfa-sinucleína in vivo, puede determinarse fácilmente ensayando su actividad específica usando las técnicas descritas en este documento en los Ejemplos.
[0153] Esta divulgación proporciona composiciones para la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación a través de la barrera hematoencefálica (BBB) usando una molécula transportadora que puede cruzar las células endoteliales del cerebro, mientras que está asociada con dicho anticuerpo o fragmento, por ejemplo, mientras está fusionada o conjugada con dicho anticuerpo o fragmento. Las secuencias de BBB se proporcionan en este documento.
[0154] Tal como se utiliza aquí, el término "carga útil" se usa como abreviatura para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento, cuyo transporte a través de la BBB puede ser facilitado por una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento. En realizaciones particulares, la "carga útil" cubre la región variable de la cadena pesada de los anticuerpos de la presente divulgación, más particularmente la región variable de la cadena pesada de also0452 ngl-3 o aslo0543.
[0155] Una carga útil puede ser parte de la molécula transportadora, por ejemplo, como un polipéptido de fusión, o unida al polipéptido a través de enlaces disulfuro u otros enlaces covalentes. Alternativamente, la carga útil se puede asociar con la molécula transportadora de cualquier manera que permita que la molécula transportadora facilite su transporte a través de la BBB, tal como se describe con más detalle a continuación. En ciertos aspectos, la carga útil sigue siendo parte de la molécula transportadora después del transporte de BBB y retiene la actividad del sistema nervioso central (SNC) en esa forma. Alternativamente, la carga útil se puede asociar con la molécula transportadora durante el transporte a través de BBB, pero de una manera que le permita disociarse con la molécula transportadora después del transporte a través de BBB.
[0156] La divulgación proporciona además métodos para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central, en particular una a-sinucleinopatía, que comprende el uso de tales moléculas transportadoras asociadas con un anticuerpo o antígeno fragmento de unión del mismo de acuerdo con la presente divulgación.
[0157] En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula transportadora aislada que comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, el polipéptido es un mimético o no mimético del anticuerpo de camélido FC5, identificado y aislado utilizando la tecnología de ensayo de microvolumen de fluorescencia (FMAT) para detectar la unión a células endoteliales microvasculares cerebrales (BMVEC), por ejemplo, células B.End3 de ratón. En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina es un anticuerpo o un fragmento activo del mismo, donde "activo" significa que la molécula transportadora puede, por ejemplo, unirse a BMVEC en una o más especies, por ejemplo, BMVEC de ratón, BMVEC de rata, BMVEC de mono cynomolgus, o BMVEC humana, se internaliza en BMVEC de una o más especies, y/o cruzan la barrera hematoencefálica ya sea solo o asociado con una carga útil.
[0158] En algunas realizaciones, la molécula transportadora de BBB es una molécula transportadora de BBB que se describe en la Solicitud de Patente Provisional N° 62/094.503. En ciertos aspectos, la molécula transportadora comprende una o más de Bbbt0241, Bbbt0626, Bbbt0626gl, Bbbt0632, BBBt0632gl Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0727, Bbbt0732, Bbbt0754, Bbbt0674, Bbbt0755, Bbbt0643, Bbbt0579 o Bbbt0671, tal como se describe en la Solicitud de Patente Provisional N° 62/094.503
[0159] En una realización particular, la molécula transportadora de BBB es Bbbt0626 o BBBt0632.
[0160] En determinadas realizaciones, la molécula transportadora de BBB está en línea germinal, por ejemplo, Bbbt0626gl es una versión en línea germinal de Bbbt0626, denominada "Bbbt0626gl".
[0161] En una realización adicional particular, la molécula transportadora de BBB es BBBt0632gl o Bbbt0626gl.
[0162] En ciertos aspectos, la molécula transportadora no se une a BMVEC, pero todavía es capaz de transportar a través de la BBB, tal como se indica en ensayo in vitro de transcitosis.
[0163] Con referencia a las moléculas transportadoras de BBB, las secuencias VH CDR descritas corresponden a las localizaciones clásicas de numeración de Kabat, a saber H-CDR1 de Kabat está en las posiciones 31-35, H-CDR2 está en las posiciones 50-65, y H-CDR3 está en las posiciones 95-102. L-CDR2 y L-CDR3 también corresponden a localizaciones de numeración de Kabat clásicas, a saber, las posiciones 50-56 y 89-97, respectivamente. Tal como se usa en este documento, los términos "L-CDR1" o "CDR1 de cadena ligera" corresponden a secuencias ubicadas en las posiciones de Kabat 23-34 en VL (en cambio, la localicación clásica de L-CDR1 según el esquema de numeración de Kabat corresponde a las posiciones 24 -34).
[0164] En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) de inmunoglobulina. Por ejemplo, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede incluir una región determinante de complementariedad de cadena pesada de inmunoglobulina-1 (H-CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada de inmunoglobulina-2 (H-CDR2), una región determinante de complementariedad de cadena pesada de inmunoglobulina- 3 (H-CDR3). En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede comprender además, o comprender alternativamente, CDRs de cadena ligera de inmunoglobulina. Por ejemplo, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede incluir una región determinante de complementariedad de cadena ligera de inmunoglobulina 1 (L-CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena ligera de inmunoglobulina 2 (L-CDR2) y una región determinante de complementariedad de cadena ligera de inmunoglobulina 3 (L-CDR3).
[0165] En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina contiene una H-CDR1, una H-CDR2, una H-CDR3, una L-CDR1, una L-CDR2 y una L-CDR3 con las siguientes secuencias de aminoácidos, respectivamente: (a) SEQ ID NO: 40 como H-CDR1, SEQ ID NO: 41 como H-CDR2, SEQ ID NO: 42 como H-CDR3, SEQ ID NO: 36 como L-CDR1, SEQ ID NO: 37 como L -CDR2 y SEQ ID NO: 38 como L-CDR3, en donde las CDR son similares a las de Bbbt0626 y Bbbt0626gl;
(b) SEQ ID NO: 40 como H-CDR1, SEQ ID NO: 41 como H-CDR2, SEQ ID NO: 42 como H-CDR3, SEQ ID NO: 44 como L-CDR1, SEQ ID NO: 45 como L -CDR2 y SEQ ID NO: 46 como L-CDR3, en donde las CDR son idénticas a las de Bbbt0626 y Bbbt062gl.
[0166] En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina contiene una H-CDR1, una H-CDR2, una H-CDR3, una L-CDR1, una L-CDR2 y una L-CDR3 con las siguientes secuencias de aminoácidos, respectivamente: (a) SEQ ID NO: 49 como H-CDR1, SEQ ID NO: 50 como H-CDR2, SEQ ID NO: 51 como H-CDR3, SEQ ID NO: 53 como L-CDR1, SEQ ID NO: 54 como L -CDR2 y SEQ ID NO: 55 como L-CDR3, en donde las CDR son similares a las de Bbbt0632gl;
(b) SEQ ID NO: 49 como H-CDR1, SEQ ID NO: 50 como H-CDR2, SEQ ID NO: 51 como H-CDR3, SEQ ID NO: 53 como L-CDR1, SEQ ID NO: 54 como L -CDR2 y SEQ ID NO: 55 como L-CDR3, en donde las CDR son idénticas a las de Bbbt0632gl.
[0167] En ciertas realizaciones alternativas, una o más CDR como se describen anteriormente son idénticas a las CDRs citadas, a excepción de, por ejemplo, 1,2, 3, 4, o 5 deleciones, sustituciones, o inserciones de aminoácidos individuales.
[0168] En ciertas realizaciones, la molécula transportadora proporcionada anteriormente puede cruzar la barrera hematoencefálica.
[0169] En ciertos aspectos, la H-CDR1, la H-CDR2, la H-CDR3, la L-CDR1, la L-CDR2 y la L-CDR3 pueden estar situadas en regiones estructurales de la inmunoglobulina para producir un anticuerpo VH y un anticuerpo VL. En ciertos aspectos, las regiones estructurales pueden ser regiones estructurales derivadas de seres humanos. En ciertos aspectos, el anticuerpo VH y el anticuerpo VL se fusionan, por ejemplo, a través de un enlazador de péptido flexible, para formar una molécula scFv. En ciertos aspectos, VH y VL comprenden además uno o más dominios constantes de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH3, un dominio CH3, un dominio CL-kappa y/o un dominio CL lambda. En ciertos aspectos, uno o más dominios constantes de inmunoglobulina se derivan de una inmunoglobulina humana, por ejemplo, una inmunoglobulina IgG1 humana. En ciertos aspectos, los dominios VH, VL y/o constantes pueden comprender mutaciones para facilitar, por ejemplo, una semivida más larga o más corta, funciones efectoras aumentadas o disminuidas, o la capacidad de unirse a una molécula de carga a través de una fusión con péptido, un enlace disulfuro o conjugación química.
[0170] En ciertos aspectos de la presente divulgación se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación asociados con una molécula transportadora que puede cruzar las células endoteliales cerebrales, tal como se describe con el presente documento.
[0171] En aspectos particulares, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación asociado con una molécula transportadora que comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina, en donde el polipéptido comprende una región de la región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina y una región de la región variable de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina comprende las secuencias proporcionadas en el presente documento, que incluyen:
(a) una secuencia de aminoácidos de VH al menos 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a s Eq ID NO: 39 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 43, donde SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 43 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0626gl, (b) una secuencia de aminoácidos de VH al menos 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a s Eq ID NO: 47 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 43, donde SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 43 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0626, (c) una secuencia de aminoácidos de VH al menos 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 48 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 43, donde SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 43 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0632.
[0172] En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación asociado con una molécula transportadora que comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina, en donde el polipéptido derivado de inmunoglobulina comprende una región VH y una región VL, donde:
(a) la región VH comprende la SEQ ID NO: 34 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 35; o
(b) la región VH comprende la SEQ ID NO: 39 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 43; o
(c) la región VH comprende la SEQ ID NO: 39 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 35; o
(d) la región VH comprende la SEQ ID NO: 47 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 43; o
(e) la región VH comprende la SEQ ID NO: 47 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 35; o
(f) la región VH comprende la SEQ ID NO: 48 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 52
[0173] En una realización adicional, las regiones VH y VL de la molécula transportadora como se describió anteriormente están unidas covalentemente para formar un fragmento de cadena única (scFv).
[0174] En ciertos aspectos, la molécula transportadora proporciona con el presente documento tiene la actividad de transportadora, por ejemplo, se puede unir a BMVEC de una o más especies, por ejemplo, ratón, rata, mono cynomolgus, o BMVEC humana, puede internalizar en BMVEC de una o más especies, o puede cruzar la barrera hematoencefálica.
[0175] En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina, donde el polipéptido derivado de inmunoglobulina comprende un anticuerpo o un fragmento que puede penetrar la BBB del mismo.
[0176] Un "fragmento que puede penetrar la BBB" como se describe en este documento es un fragmento de la molécula transportadora que puede unirse específicamente a BMVEC de una o más especies y cruzar a través de BMVEC in vitro o in vivo desde la vasculatura periférica a la vasculatura del SNC. Se puede analizar si un fragmento determinado es un fragmento que puede penetrar la BBB mediante una variedad de ensayos in vitro o in vivo conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la molécula transportadora puede ensayarse en un ensayo de transcitosis in vitro, en un ensayo in vivo, tal como un ensayo de diuresis, tal como se describe en el documento US 62/094.503. Otros ensayos que podrían usarse para medir la administración in vivo de cargas útiles a través de la BBB incluyen, sin limitación, lesión por constricción crónica (CCI); modelo de lesión del nervio libre (SNI) o ligadura del nervio espinal (SNL), todos los cuales se pueden medir con un movimiento rápido de la pata, o el método de Hargreaves (Hargreaves K, et al., Pain; 1988; 32; 77-88). En ciertos aspectos, una molécula transportadora tal como se proporciona en el presente documento puede unirse a BMVEC de una o más especies, por ejemplo, BMVEC humana, de mono cynomolgus, murina, de rata o bovina. La unión se puede demostrar de diversas formas conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, en un ensayo FMAT, tal como se describe en el documento US 62/094.503. En ciertos aspectos, las BMVEC son células endoteliales capilares cerebrales (BCEC). En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede pasar a través de una monocapa de BCEC en un ensayo de transcitosis in vitro. En ciertos aspectos, la actividad de la molécula transportadora puede demostrarse mediante la visualización de la molécula transportadora en el SNC. Por ejemplo, una molécula transportadora marcada con tritio se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, un ratón por vía periférica, por ejemplo, por vía intravenosa, y a continuación se visualiza en el SNC mediante una radiografía cuantitativa de cuerpo entero. En ciertos aspectos, la molécula transportadora se localiza en regiones específicas del SNC, por ejemplo, la corteza del cerebelo, la sustancia gris del cerebro, la sustancia gris de la médula espinal, la pons o una combinación de los mismos.
[0177] En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se describe en el presente documento comprende un anticuerpo o fragmento que puede penetrar la BBB del mismo que comprende o consiste en dos o más subunidades, por ejemplo, una cadena pesada o fragmento de la misma y una cadena ligera o fragmento de la misma, donde la cadena pesada y la cadena ligera están asociadas, por ejemplo, como una única proteína de fusión (por ejemplo, un scFv), o como dos subunidades unidas por uno o más enlaces disulfuro. En ciertos aspectos, la cadena pesada comprende un dominio o región VH y la cadena ligera comprende un dominio o región VL.
[0178] En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación asociado a una molécula transportadora a través de la barrera hematoencefálica como se describe con el presente documento.
[0179] En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación está asociado a una molécula transportadora a través de la barrera hematoencefálica, en el que la molécula transportadora es un fragmento de cadena única (scFv) que comprende:
I. la región variable de cadena pesada (VH) de BBBt0626gl de SEQ ID NO: 39 y la región variable de cadena ligera (VL) de BBBt0626gl de SEQ ID NO: 43, o
ii. la región variable de cadena pesada (VH) de BBBt0626 de SEQ ID NO: 47 y la región variable de cadena ligera (VL) de BBBt0626 de SEQ ID NO: 43,
iii. la región variable de cadena pesada (VH) de BBBt0632gl de SEQ ID NO: 48 y la región variable de cadena ligera (VL) de BBBt0632gl de SEQ ID NO: 52.
[0180] En ciertos aspectos, la cadena pesada comprende además un dominio constante de cadena pesada, por ejemplo, un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y/o un dominio CH3, o un fragmento de los mismos. En ciertos aspectos, el dominio constante de la cadena pesada es un dominio constante de IgG o un fragmento del mismo, por ejemplo, un dominio constante de IgG humana, por ejemplo, un dominio constante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas. En ciertos aspectos, el dominio constante de IgG o fragmento del mismo comprende una glicosilación alterada y/o una o más sustituciones de aminoácidos con respecto a un dominio constante de IgG de tipo salvaje en el que la IgG modificada tiene una propiedad particular, por ejemplo, una semivida aumentada o disminuida en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo salvaje, funciones efectoras aumentadas o disminuidas en relación con un dominio constante de IgG de tipo salvaje, o la capacidad de unir restos heterólogos mediante, por ejemplo, un enlace peptídico, un enlace disulfuro o una conjugación química. En ciertos aspectos, el dominio constante de IgG o fragmento del mismo tiene una glicosilación alterada con respecto a un dominio constante de IgG de tipo salvaje en el que la IgG modificada tiene una propiedad particular, por ejemplo, una semivida aumentada o disminuida en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo salvaje, funciones efectoras aumentadas o disminuidas en relación con un dominio constante de IgG de tipo salvaje.
[0181] En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación se asocia con BBBt0626 o BBBt0626gl, tal como se define en el presente documento, formando moléculas de anticuerpo biespecíficas.
[0182] En otras realizaciones, dichos anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación comprenden el esqueleto de IgG1 TM humana (es decir, las regiones CH1, CH2, CH3 de cadena pesada de una IgG1 TM) asociado con un fragmento de cadena única (scFv) que comprende las regiones VH y VL de BBBt0626 o BBBt0626gl injertadas en el extremo N-terminal ("formato BiS2") o C-terminal ("formato BiS3") de la cadena pesada o N-terminal ("formato BiS1") de VL, de un anticuerpo anti-a-sinucleína según la presente divulgación. Las referencias al formato BiS se describen en DiMasi et al. J Mol Biol. 30 de octubre de 2009; 393 (3): 672-92.
[0183] En algunas realizaciones, dichos anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación comprenden además una cadena ligera que comprende la región CL kappa o lambda asociada con la VL de un anticuerpo anti-asinucleína de acuerdo con la presente divulgación.
[0184] En realizaciones particulares, los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación comprenden el esqueleto IgG1 TM humana asociado con:
(i) un fragmento de cadena única (scFv) de BBBt0626gl que comprende la región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 39 y la región variable de cadena ligera (VL) de Se Q ID NO: 43; o
(ii) un fragmento de cadena única (scFv) de Bbbt0626 que comprende la región variable de cadena pesada (VH) de s Eq ID NO: 47 y la región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 43,
en el que dicho ScFv se injerta en el extremo N-terminal (formato BiS2) o C-terminal (formato BiS3) de la cadena pesada de aslo0452 ngl-3 de SEQ ID NO: 12 o N-terminal ("formato BiS1") de la cadena ligera de SEQ ID NO. 17.
[0185] En todavía otras realizaciones particulares, los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación comprenden el esqueleto de IgG1 TM humana asociado con un fragmento de cadena única (scFv) de BBBt0626gl que comprende (i) la región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 39 y (ii) la región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 43; en el que dicho ScFv se injerta en el extremo N-terminal (formato BiS2) o C-terminal (formato BiS3) de la cadena pesada de aslo0452 ngl-3 de SEQ ID NO: 12 o N-terminal ("formato BiS1") de la cadena ligera de SEQ ID NO. 17.
[0186] En otras realizaciones particulares, los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación comprenden el esqueleto de IgG1 TM humana asociado con:
(i) un fragmento de cadena única (scFv) de BBBt0626gl que comprende la región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 39 y la región variable de cadena ligera (VL) de Se Q ID NO: 43; o
(ii) un fragmento de cadena única (scFv) de Bbbt0626 que comprende la región variable de cadena pesada (VH) de s Eq ID NO: 47 y la región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 43,
en el que dicho ScFv se injerta en el extremo N-terminal (formato BiS2) o C-terminal (formato BiS3) de la cadena pesada de aslo0543 de Se Q ID NO: 22 o N-terminal ("formato BiS1") de la cadena ligera de SEQ ID NO. 28.
[0187] La presente divulgación también proporciona el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación para su uso como un medicamento.
[0188] La presente divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central, en particular una a-sinucleinopatía. En una realización, la a-sinucleinopatía se selecciona de la enfermedad de Parkinson (PD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y la atrofia multisistémica (MSA). En una realización preferida, la asinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson (PD).
[0189] La presente divulgación también proporciona el uso de un anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad del sistema nervioso central, en particular una a-sinucleinopatía. En una realización, la a-sinucleinopatía se selecciona de la enfermedad de Parkinson (PD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y la atrofia multisistémica (MSA). En una realización preferida, la a-sinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson (PD).
[0190] La presente divulgación también proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad en un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación. En una realización, la a-sinucleinopatía se selecciona de la enfermedad de Parkinson (PD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y la atrofia multisistémica (MSA). En una realización preferida, la asinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson (PD).
[0191] En uso, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación es capaz de tratar o prevenir la progresión de la enfermedad mediante la inhibición de la propagación y diseminación de la alfa-sinucleína in vivo. Por tanto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación proporciona una clara ventaja sobre otras terapias. La presente divulgación también proporciona un método para ralentizar o prevenir la progresión de la enfermedad en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación al paciente.
[0192] En una realización, dicho método de tratamiento de la enfermedad comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación. En otra realización, dicho método para prevenir enfermedades o ralentizar o prevenir la progresión de la enfermedad comprende administrar una cantidad profilácticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación.
[0193] Los intervalos de dosificación para la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación son aquellos para producir el efecto terapéutico deseado. Se entenderá que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o composición, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, extensión o gravedad de la enfermedad del paciente, las contraindicaciones, si las hubiera, y el criterio del médico tratante.
[0194] Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas estándar para la optimización.
[0195] Las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 1 a 50 mg por kg de peso corporal. Pueden estar en el intervalo de 5 a 30 mg/kg, 10 a 25 mg/kg o 15 a 20 mg/kg. La dosis unitaria se puede administrar diariamente o con menos frecuencia, por ejemplo, semanalmente o mensualmente.
[0196] La administración puede efectuarse mediante administraciones repetidas del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, durante un período de tiempo prolongado. La administración puede ser simultánea o secuencial y puede realizarse en cualquier orden.
[0197] La prevención o el tratamiento definido en este documento puede aplicarse como una única terapia o puede implicar, además del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación, la administración de otros agentes o terapias establecidos utilizados normalmente en el tratamiento de a-sinucleinopatías (tales como L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), agonistas de dopamina (receptor), inhibidores de la catecol-O-metiltransferasa (COMT) y/o inhibidores de la monoamino oxidasa tipo B (MAO-B)). La administración de otros agentes o terapias establecidos puede ser en combinación con, o como un complemento de, o junto con, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la presente divulgación y puede ser mediante dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento.
[0198] El tratamiento de combinación puede llevarse a cabo de cualquier manera que se considere necesaria o conveniente por la persona experta en la técnica y para el propósito de esta memoria descriptiva, no se contemplan limitaciones con respecto al orden, la cantidad, la repetición o la cantidad relativa de los compuestos a utilizar combinados.
[0199] Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que cuando se administra solo o en combinación a un paciente para tratar una enfermedad, o al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad, es suficiente para afectar a dicho tratamiento de la enfermedad o síntoma. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo, por ejemplo, del anticuerpo y/o los síntomas de la enfermedad, la edad, el peso y/o la salud del paciente a tratar y el criterio del médico que prescribe. Los expertos en la técnica pueden determinar una cantidad terapéuticamente eficaz apropiada en cualquier caso dado o ser capaz de determinarla mediante experimentación de rutina. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la pesan más los efectos beneficiosos que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0200] Una "cantidad profilácticamente eficaz" es cualquier cantidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que, cuando se administra solo o en combinación a un paciente, inhibe o retrasa la aparición o reaparición de la enfermedad, o al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad. En algunas realizaciones, la cantidad profilácticamente eficaz previene la aparición o la reaparición de la enfermedad por completo. "Inhibir" la aparición significa disminuir la probabilidad de aparición de la enfermedad o prevenir la aparición de la enfermedad por completo.
[0201] La presente divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados pueden facilitar el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones adecuadas para la administración farmacéutica.
[0202] Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden formular para, pero sin limitación, la administración parenteral, por ejemplo intramuscular, subcutánea o intravenosa. Las composiciones adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa incluyen soluciones acuosas estériles.
[0203] La composición farmacéutica puede tomar la forma de una solución acuosa y puede incluir tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológicamente tamponada. La composición farmacéutica puede contener adicional o alternativamente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. La composición farmacéutica se puede preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Opcionalmente, la composición farmacéutica puede contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
[0204] La presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente divulgación. La presente divulgación también proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la presente divulgación. La presente divulgación proporciona además una célula huésped que comprende el vector de la presente divulgación.
[0205] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención no están limitados a un método particular de generación o producción. Por tanto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se han fabricado a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo, así como anticuerpos producidos a partir de una célula producida de forma recombinante que ha sido transformada o transfectada con un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo. Dichos hibridomas, células producidas de forma recombinante y ácidos nucleicos forman parte de la presente divulgación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Producción de anticuerpos
[0206] Los anticuerpos específicos anti-a -syn se aislaron de bibliotecas de presentación en fagos usando una serie de ciclos de selección en a-syn humana recombinante ("hu a-syn"), tanto de forma pasiva inmovilizada en pocillos de microtitulación como libre en solución. Para las selecciones se utilizaron bibliotecas de presentación en fagos de Fv de cadena única humana (scFv) sin tratamiento previo clonadas en un vector fagémido basado en el fago filamentoso M13 (Lloyd et al., Protein Eng Des Sel. (2009), 22 (3): 159-68; y Vaughan et al., Nat Biotechnol. (1996), 14 (3); 309­ 14).
[0207] Se cribó inicialmente un número representativo de clones individuales a partir de las salidas de selección después de dos o tres rondas de selección descritas anteriormente como fragmentos solubles de scFv en extractos de E. coli periplásmicos (Kipriyanov et al J Immunol Methods (1997) 200:. 69- 77) en un ensayo FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) homogéneo HTRF ® (Fluroescencia resuelta en tiempo homogénea, Cisbio International) para la unión a a-sinucleína humana soluble.
[0208] Un ensayo HTRF® (Figura 1) es una tecnología de ensayo homogénea que utiliza la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia entre un fluoróforo donante y aceptor que están muy próximos (Mathis G Clin Chem (1995) 41: 1391-1397). Este ensayo se utilizó para medir interacciones macromoleculares acoplando directa o indirectamente una de las moléculas de interés a un fluoróforo donante, por ejemplo, criptato de europio (Eu3+), y acoplando la otra molécula de interés a un fluoróforo aceptor XL665, (una aloficocianina reticulada estable). La excitación de la molécula de criptato (a 337 nm) dio como resultado una emisión de fluorescencia a 620 nm. La energía de esta emisión se transfirió a XL665 muy cerca del criptato, lo que resultó en la emisión de una fluorescencia específica de larga duración (a 665 nm) del XL665. Se midieron las señales específicas del donante (a 620 nm) y el aceptor (a 665 nm), permitiendo el cálculo de la relación a 665/620 nm que compensa la presencia de compuestos coloreados en el ensayo.
[0209] Se ensayaron muestras de scFv anti-a-syn sin purificar para determinar la unión a a-syn biotinilada. Se añadieron 5 microlitros de una solución que contenía a -syn humana biotinilada 40 nM combinada con estreptavidina terbio 0,8 nM (Cisbio International, 610SATLB) a una placa de ensayo de bajo volumen de 384 pocillos (Costar, 3676). A continuación, se añadieron a la placa 10 microlitros de cada dilución de muestra de prueba de anticuerpos. Finalmente, se añadieron 5 microlitros de una solución que contenía DC anti-myc (Cisbio International, 661MYCDAB) a la placa de ensayo. Todas las diluciones se realizaron en tampón de ensayo que contenía fluoruro de potasio 0,8 M (BDH 103444T) y albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA, Sigma A9576) en PBS de Dulbecco (Invitrogen, 14190185). Las placas de ensayo se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente, seguido de 16 horas a 4°C antes de la lectura de la fluorescencia resuelta en tiempo a las longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm utilizando un lector de placas EnVisio (Perkin Elmer).
[0210] Los datos se analizaron calculando la relación 665/620 nm seguida de los valores de % Delta F para cada muestra. Se usó la relación 665/620 nm para corregir la interferencia de la muestra usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000026_0001
[0211] A continuación, se calculó % Delta F para cada muestra usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000026_0002
[0212] El control negativo (unión no específica) se definió mediante la sustitución de la muestra de ensayo por la asyn no etiquetada de humano o de rata.
[0213] Los valores de %Delta F se utilizaron posteriormente para calcular el % de unión específica, tal como se describe en la si uiente ecuación es ecífica:
Figure imgf000026_0003
[0214] Los valores de IC50 se determinaron utilizando software GraphPad Prism mediante el ajuste de curva utilizando una ecuación logística de cuatro parámetros:
Y= lnferior (Superior-Inferior )/(1 10A((LogEC50-X)*HÍIISIOpe))
X es el logaritmo de concentración.
Y es la unión específica
Y comienza en la parte inferior y va hacia la parte superior con una forma sigmoidea.
[0215] Los clones de Fv de cadena única que se unían a a-syn humana como extractos periplásmicos no purificados se sometieron a secuenciación de ADN (Osbourn et al, Immunotechnology (1996), 2: 181-196; y Vaughan et al, Nat Biotechnol (1996 ), 14 (3); 309-14). Los scFv únicos se expresaron de nuevo en bacterias y se purificaron mediante cromatografía de afinidad (como se describe en el documento WO 01/66754). Las potencias de estas muestras se determinaron mediante una titulación de la preparación purificada para la unión a a-syn humana biotinilada en el ensayo de HTRF, tal como se describió anteriormente. Se seleccionaron preparaciones de scFv purificado que exhibían la interacción de a-syn más fuerte para la conversión al formato de IgG.
[0216] Titulando el anticuerpo en el ensayo HTRF, los clones se clasificaron según la fuerza de unión a a-syn. Los mejores elementos de unión a a-syn se analizaron adicionalmente tanto para la cinética de unión a a-syn (koff) como para IgG en un biosensor de Octet Red (ver método como se describe en el Ejemplo 9), así como para la selectividad de miembros de la familia de sinucleína (a-syn, p-syn, Y-syn humana) (ver método como se describe en el Ejemplo 4) y para reactividad cruzada con a-syn murina (ver método como se describe en el Ejemplo 5).
Ejemplo 2: Derivación de aslo0452 ngl-3
[0217] Se identificó un clon específico de a-syn reactivo en C-terminal, asyn0087, mediante el cribado para la unión a a-syn humana en un ensayo de DELFIA (véase el método como se describe en el Ejemplo 4). Asyn0087 se une específicamente a a-syn humana, de mono cynomolgus y roedor (véase el método descrito en el Ejemplo 5). Asyn0087 se revirtió a la secuencia de línea germinal humana más cercana posible (Tomlinson VBASE. m Rc Center of Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido, 1997) que no afectó a la potencia mediante técnicas de mutagénesis estándar antes de la optimización. Después de la germinación, se volvió a evaluar la unión del clon a a-syn. No se observaron efectos perjudiciales.
[0218] Se crearon bibliotecas de fagos-scFv grandes derivadas del clon cabeza de serie mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) pesadas variables (VH) 2 y 3 y las CDR 1 y 3 de cadena ligera (VL) usando técnicas estándar de biología molecular, como se ha descrito en Clarkson y Lowman (2004) (Phage display: A practical approach. Oxford: Oxford University Press). Las bibliotecas se sometieron a selecciones de presentación en fagos basadas en afinidad realizadas sobre a-syn humana biotinilada soluble con el fin de seleccionar variantes con mayor afinidad por a-syn humana. Las selecciones se realizaron esencialmente como se describió anteriormente con la excepción de reducir la concentración de a-syn humana biotinilada soluble para cada ronda de selección realizada.
[0219] Los clones representativos de cada salida de selección se cribaron inicialmente como fragmentos de scFv solubles en extractos periplásmicos de E. coli en un ensayo de HTRF para determinar su capacidad para competir por la unión a a-syn soluble contra el clon de unión a a-syn parental, asyn0087. El rendimiento de cada biblioteca en estos cribados de población se utilizó para informar qué bibliotecas de mutagénesis de CDR se agregaron genéticamente o se 'recombinaron' para crear nuevas bibliotecas, y estas bibliotecas recombinadas se sometieron a rondas adicionales de selecciones impulsadas por afinidad realizadas sobre a-syn humana biotinilada soluble.
[0220] Para clones derivados de biblioteca de mutagénesis individuales y recombinados, después de análisis de la secuencia de ligantes positivos, los clones se expresaron y se purificaron como fragmentos de scFv e IgG y la unión a a-syn soluble se reconfirmó mediante los ensayos de HTRF de competición de epítopo. Mediante la titulación de anticuerpos en un ensayo de competición de epítopo HTRF, los clones fueron calificados por sus valores IC50 para la mejora relativa de la unión a a-syn respecto a la IgG parental, asyn0087. Los mejores ligantes de a-syn se analizaron adicionalmente para la selectividad de los miembros de la familia de sinucleína (a-syn, p-syn, y-syn humana) y para la reactividad cruzada con a-syn de cynomolgus y de rata mediante el ensayo de HTRF de unión directa o el ensayo HTRF de competición de epítopos.
[0221] A partir de estas rondas iterativas de recombinación y cribado de bibliotecas, se identificaron dos clones de reacción cruzada potentes de a-syn de cynomolgus y de rata, aslo0452 ngl-1 y aslo0467.
[0222] Se realizó una mutagénesis puntual individual en aslo0452 ngl-1 para cada una de las CDR donde se habían observado mejoras positivas en la potencia de IC50. Cada posición en la CDR elegida fue mutada individualmente a lo largo de los 20 residuos de aminoácidos posibles, y de nuevo se cribó mediante un ensayo de competición de epítopo HTRF para la IC50 mejorada en comparación con la IgG aslo0452 ngl-1. Se identificaron múltiples residuos a través de cuatro CDR (H2, H3, L1 y L3) y se combinaron en tanto aslo0452 ngl-1 como aslo0467, y de nuevo se evaluaron mediante ensayo de competición de epítopo para la IC50 mejorada en comparación con aslo0452 ngl-1. A partir de estos experimentos, se identificaron los dos ligantes más mejorados como aslo0452 ngl-3 y aslo0543.
[0223] La Figura 2 compara las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de asyn0087, aslo0452 ngl-3 y aslo0543.
Ejemplo 2.1: Reformateo de scFv a IgG1 TM
[0224] Los clones de Fv de cadena única con propiedades deseables de unión a a-syn se convirtieron en formato de anticuerpo de inmunoglobulina completa G1 TM (IgG1 TM) nula con función efectora (Oganesyan et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. (2008), 64 (Pt 6): 700-4) esencialmente como se describe por Persic et al. (Persic et al, Gene (1997) 187: 9-18) con las siguientes modificaciones. Se incluyó un fragmento de OriP en los vectores de expresión para facilitar su uso con células transitorias de CHO y para permitir la replicación episomal. El dominio pesado variable (VH) se clonó en un vector (pEU1.4) que contenía los dominios constantes de la cadena pesada humana y los elementos reguladores para expresar la cadena pesada de IgG1 TM completa en células de mamífero. De manera similar, el dominio ligero variable (VL) se clonó en un vector (pEU4. 4) para la expresión de los dominios constantes de la cadena ligera humana (lambda) y los elementos reguladores para expresar la cadena ligera de IgG completa en células de mamífero. Para obtener IgG, los vectores que expresaban IgG de cadena pesada y ligera se transfectaron en células de mamífero transitorias de CHO (Daramola et al, Biotechnol Prog (2014) 30: 132-141). Las IgG se expresaron y secretaron al medio. Las recolecciones se filtraron antes de la purificación, a continuación se purificó la IgG usando cromatografía de Proteína A. Los sobrenadantes del cultivo se cargaron en una columna de tamaño apropiado de proteína A cerámica (BioSepra) y se lavaron con Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 250 mM. La IgG unida se eluyó de la columna usando citrato de sodio 0,1 M (pH 3,0) y se neutralizó mediante la adición de Tris-HCl (pH 9,0). El material eluido se intercambió con tampón en PBS usando columnas Nap10 (Amersham, # 17-0854-02) y la concentración de IgG se determinó espectrofotométricamente usando un coeficiente de extinción basado en la secuencia de aminoácidos de la IgG (Mach et al, Anal Biochem (1992) 200: 74-80). Las IgG purificadas se analizaron para determinar la agregación y pureza de degradación usando SEC-HPLC y mediante SDS-PAGE.
[0225] El fundamento para el uso de IgG1 TM como el formato de fármaco candidato es minimizar la eliminación de no implicados debido a las células inmunes y la activación del complemento (es decir, la producción excesiva de C3a que puede causar inflamación). La muerte de las células no implicadas puede desencadenarse por la acumulación potencial de complejos inmunes formados por el fármaco candidato y la a-sinucleína extracelular que se ha demostrado que interactúa con las membranas lipídicas (Bartels et al., Biophys. J. (2010), 99: 2116- 2124). Se eligió el formato IgG1 TM porque se ha demostrado que tiene una unión insignificante a los receptores Fcy (FcyR) y una activación del complemento mediada por C1q reducida por complejos inmunes (Oganesyan et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. (2008), 64 (Parte 6): 700-4).
[0226] Para minimizar cualquier riesgo potencial de inmunogenicidad, las estructuras de aslo0452 ngl-3 están tan cerca de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana como sea posible sin afectar a la potencia. Esto significa que algunos aminoácidos en aslo0452 ngl-3, incluidos los residuos de Vernier (Foote y Winter, J Mol Biol. (1992), 224 (2): 487-99), no están mutados a la secuencia de la línea germinal humana más cercana. Para el dominio Vh de aslo0452 ngl-3 hay un residuo Vernier en la región V que no está mutado a la secuencia de IGVH3-23 e IGJH6 de la línea germinal humana (Figura 3C). Para el dominio Vl de aslo0452 ngl-3, todos los residuos de estructura coinciden con la secuencia de IGLV5-45 e IGJL2 o IGJL3 de la línea germinal humana (Figura 3D).
Ejemplo 3: Confirmación del epítopo de IgG anti-a-syn optim izado por afinidad
[0227] La sinucleína alfa, beta y gamma recombinante humana, versiones truncadas recombinantes de alfa-sinucleína humana (aa1-60, aa1-95, aa61-140, 96-140, ANAC y NCAP) y alfa-sinucleína de ratón se obtuvieron de rPeptide LLC. Se realizó un mapeo de epítopos en bruto usando los truncados de a-syn disponibles comercialmente.
[0228] De manera resumida, se recubrió con un microgramo por mililitro de cada truncado un pocillo de microtitulación durante la noche a 4° C. Después de enjuagar los pocillos en PBS, se añadió una dilución de 1 pg/ml de cada anticuerpo anti-a-syn. Después de 1 h de incubación y lavado, el anticuerpo unido se detectó mediante la adición de una IgG antihumana conjugada con HRP o Eu3+. Después de la incubación y el lavado, se añadió el sustrato de detección apropiado (solución TMB o DELFIA Enhancer respectivamente) y se leyó la placa en un lector de placas de microtitulación.
[0229] Estos estudios de unión a epítopo revelaron que el aislado cabeza de serie, asyn0087, reconoce un epítopo localizado en la región C-terminal de la proteína a-syn entre los aminoácidos 102 y 130 (Figura 4A). Tanto aslo0452 ngl-3 como aslo0543 mantienen su reconocimiento del mismo epítopo ubicado en la región C-terminal de la proteína a-syn entre los aminoácidos 102 y 130 como su aislado cabeza de serie parental asyn0087 (Figura 4B).
Ejemplo 4: Especificidad de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 para a-syn en relación con miembros de la familia de sinucleína usando un ensayo HTRF de competición de epítopos
[0230] Es importante para un anticuerpo destinado a ser utilizado en aplicaciones terapéuticas que sea específico para a-syn humana, con el fin de minimizar cualquier potencial riesgo de seguridad en relación con la interacción fuera de diana con las otras sinucleínas (p-sinucleína y y-sinucleína).
[0231] La especificidad de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 por a-syn sobre los otros miembros de la familia de sinucleína, p-syn y y-syn, se determinó utilizando el ensayo de competición de epítopos HTRF que mide la unión de a-syn humana biotinilada al anticuerpo en solución.
[0232] Se valoraron a-syn, p-syn y y-syn en el ensayo, y la selectividad de IgG aslo0452 ngl-3 e IgG aslo0543 se evaluó midiendo el grado de inhibición de la unión de a-syn humana biotinilada a aslo0452 ngl-3/aslo0543. Se determinaron los valores de IC50 mediante ajuste de curva de los datos a una ecuación logística de cuatro parámetros usando software PRISM 6® (GraphPad). También se utilizaron ensayos HTRF más sensibles que miden la unión directa de IgG a a-syn, p-syn e y-syn humanas para confirmar la especificidad de a-syn (datos no mostrados). Para el control negativo, la muestra de prueba de anticuerpos se reemplazó por un anticuerpo de isotipo de control o tampón solo.
[0233] Los valores de IC50 representativos obtenidos con proteínas a-syn, p-syn y y-syn en los ensayos de competición de epítopos HTRF de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 HTRF se muestran en la Figura 5. No se observó unión a 13-syn y ysyn a las concentraciones ensayadas (hasta 5 pM), lo que demuestra que aslo0452 ngl-3 y aslo0543 son selectivos para a-syn.
Ejemplo 5: Especificidad de aslo0452 ngl-3 para a-syn humana, mono cynom olgus y rata usando un ensayo de competencia de epítopo de HTRF
[0234] En vista de las aplicaciones terapéuticas, es importante que el anticuerpo reaccione de forma cruzada con asinucleína de cynomolgus y se desea que reaccione de forma cruzada con a-sinucleína de rata, dentro de 10 veces de la observada frente a a-syn humana. Esto es para permitir que se lleven a cabo estudios de seguridad tanto en especies de ratas como de monos cynomolgus.
[0235] La especificidad de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 para a-syn humana, mono cynomolgus y de rata se determinó usando el ensayo de competición de epítopo de HTRF que medía la unión de a-syn humana biotinilada con aslo0452 ngl-3 en solución.
[0236] Se titularon a-syn humana, de mono cynomolgus y de rata en el ensayo, y la selectividad del anticuerpo se evaluó midiendo el grado de inhibición de la unión al anticuerpo de a-syn humana biotinilada. Los valores de IC50 se determinaron mediante ajuste de curva de los datos a una ecuación logística de cuatro parámetros usando software PRISM 6® (GraphPad). La reactividad cruzada de especies de aslo0452 ngl-3 y aslo0543 también se confirmó usando un formato de ensayo de unión directa HTRF (no mostrado). Aslo0452 ngl-3 (o aslo0543) se tituló en el ensayo para competir por la unión de a-syn humana o de mono cynomolgus o de rata a aslo0452 ngl-3 (o aslo0543) mediante el ensayo de HTRF. Para los controles negativos, la muestra de prueba de anticuerpos se reemplazó por un anticuerpo de isotipo de control o tampón solo.
[0237] Los valores de IC50 representativos obtenidos con las proteínas alfa-syn humana, de mono cynomolgus y de rata en el ensayo de competición epítopo HTRF se muestran en la Figura 6. Aslo0452 ngl-3 se une a a-syn humana y de cynomolgus con valores IC50 de 5,7 nM y 6,8 nM respectivamente, y se une a a-syn de rata con un valor de IC50 de 19,6 nM, dentro de 4 veces. Aslo0543 se une a a-syn humana y de cynomolgus con valores de IC50 de 2,0 nM y 2,1 nM, respectivamente, y se une a a-syn de rata con un valor de IC50 de 3,8 nM, dentro de 2 veces.
[0238] La capacidad de aslo0452 ngl-3 para unirse a a-syn humana, mono cynomolgus y de rata es indicativa de la unión a un epítopo diferente en alfa-sinucleína humana en comparación con anticuerpos que se unen a a-syn humana y de mono cynomolgus y de rata
Ejemplo 6: Especificidad de clones optim izados por afinidad para a-syn nativa medida por citometría de flu jo
[0239] La especificidad de las IgG anti-alfa-syn optimizadas por afinidad, aslo0452 ngl-3 y aslo0543, para la unión a a-syn nativa, endógena humana, se determinó por citometría de flujo utilizando líneas celulares positivas y negativas de a -syn.
[0240] Brevemente, las células de neuroblastoma SHSY5Y (positivos de a-syn) y células de cáncer de mama BT-20 (negativas de a-syn) se fijaron en 0,01% de formaldehído y a continuación se permeabilizaron con 0,5% (v/v) de Tween 20 antes de la incubación con anticuerpos anti-a-syn, anticuerpos de control positivo o de isotipo de control. Después de lavados extensos, el anticuerpo unido se detectó mediante incubación con un anticuerpo secundario IgG-FITC anti­ humano o anti-ratón. Después de lavados adicionales, las células se analizaron con un aparato FACS Canto II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y el análisis de datos se realizó usando el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
[0241] Los datos se representan como histogramas que muestran la diferencia entre las células teñidas solas frente a las células teñidas con anticuerpos primarios. Los resultados de la Figura 7A muestran un desplazamiento en la señal fluorescente en presencia de asyn0087 (panel D) en células SH-SY5Y a-syn positivas, en comparación con el isotipo de control y el anticuerpo secundario solo (panel B), lo que indica el reconocimiento de a-syn expresada endógenamente. Asyn0087 no se une a la línea celular de cáncer de mama humano a-syn negativo, BT-20 (panel C). Los resultados de la Figura 7B muestran un fuerte desplazamiento en la señal fluorescente en presencia de aslo0452 ngl-3 o aslo0543 (panel H) comparable al anticuerpo de control positivo, 4D6 en células SH-SY5Y a-syn positivas (panel F) y no hay desplazamiento en células BT-20 a-syn negativas (panel G). Esto demuestra que tanto aslo0452 ngl-3 como aslo0543 se unen a a-syn nativa humana intracelular expresada endógenamente.
Ejemplo 7: Especificidad de IgG anti-a-syn optimizadas para a-syn humana agregada mediante ELISA DELFIA
[0242] Se generaron preparaciones o agregados fibrilares de a-syn humana como se describe por Emadi et al. (Emadi et al., Biochemistry (2004), 43: 2871-2878). Brevemente, se tomaron alícuotas de 200 j l de a-syn recombinante 50 |jM en un tubo Sarstedt de 1,8 ml y se colocaron en una incubadora con agitación a 37° C durante 3 días a 280 rpm. La presencia de a-syn agregada se determinó mediante la incorporación de tioflavina T añadida a una concentración final de 10 jM , se incubó en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente y se leyó la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 450 nm y una longitud de onda de emisión de 485 nm en un lector de microplacas Envision.
[0243] La especificidad de las IgG anti-a-syn optimizadas por afinidad, aslo0452 ngl-3 y aslo0543, y el anticuerpo cabeza de serie, asyn0087, para a-syn humana agregada se determinó usando un ensayo de captura de anticuerpos DELFIA®. Este ensayo midió la captura de a-syn humana agregada por aslo0452 ngl-3, aslo0543 o asyn0087 en un ELISA por pares. De manera breve, se inmovilizó una versión de IgG1 de ratón del anticuerpo anti-a-syn sobre el pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Nunc). Después del bloqueo, se incubó la a-syn humana agregada o monomérica en los pocillos. Después del lavado, se detectó a-syn humana capturada mediante la adición de la versión de IgG1 TM humana del mismo anticuerpo anti-a-syn y posteriormente un conjugado IgG anti-humanaeuropio (Perkin Elmer) o un conjugado IgG anti-humana-HRP. Posteriormente a la incubación y el lavado, se añadió el sustrato de detección apropiado (solución TMB o DELFIA Enhancer respectivamente) y se leyó la placa en un lector de placas de microtitulación.
[0244] En este ensayo, sólo la a-syn humana agregada se capturará y detectará ya que presenta múltiples copias del mismo epítopo en un único agregado. Para a-syn monomérica, solo está presente una copia de epítopo, por lo tanto, el segundo anticuerpo de detección no puede unirse en presencia del anticuerpo de captura. Los datos se resumen en la Figura 8. El aislado cabeza de serie, asyn0087, es capaz de unirse a a-syn humana recombinante agregada. Por tanto, el epítopo al que se une asyn0087 no participa en sí mismo en la agregación de a-syn. Tanto aslo0452 ngl-3 como aslo0543 conservaron su capacidad para unirse a a-syn humana recombinante agregada.
Ejemplo 8: Especificidad de IgG anti-a-syn optimizadas en tejidos relevantes para la enfermedad mediante inm unohistoquím ica
[0245] La especificidad de las IgG anti-alfa-syn optimizadas por afinidad, aslo0452 ngl-3 y aslo0543, y el anticuerpo asyn0087 cabeza de serie, para las formas relevantes de a-syn humano de la enfermedad, se determinó mediante la tinción inmunohistoquímica de tejido cerebral de la enfermedad de Parkinson. Los resultados se muestran en la Figura 9 y demuestran que, al igual que asyn0087, tanto aslo0452 ngl-3 como aslo0543 pueden reconocer formas patológicas de a-syn humano relevantes para la enfermedad en secciones de tejido cerebral de la enfermedad de Parkinson, incluidos cuerpos de Lewy, neuritas de Lewy, agregados neuronales, puntos de Lewy y tejido cerebral de base. No se observó tinción inespecífica en tejido cerebral normal o sano.
Ejemplo 9: Determinación de la afinidad del anticuerpo anti-a-syn
[0246] Se determinaron las constantes de equilibrio de disociación (Kd) para las IgG anti-alfa-syn para a-syn humana utilizando dos tecnologías de plataforma: Octet Red (Forte Bio) y KinExA (Sapidyne Instruments).
[0247] Ambos sistemas de ensayo mostraron una buena concordancia, lo que indica que la afinidad de aslo0452 ngl-3 estaba en el intervalo sub-nanomolar. La Tabla 1 muestra las medidas de afinidad derivadas de los clones clave anti-a-syn generados a lo largo del proceso de aislamiento y optimización del cabeza de serie.
Ejemplo 9.1: Afinidad de aslo0452 ngl-3 mediante Octet
[0248] La afinidad de IgG aslo0452 ngl-3 para a-syn-Flag-His con etiqueta avi humana monomérica expresada en bacterias se estimó usando un instrumento Octet Red. Se premezcló aslo0452 ngl-3 con concentraciones variables de cada ligando hasta que se alcanzó el equilibrio. A continuación, se midió la cantidad de anticuerpo libre usando el Octet capturando aslo0452 ngl-3 libre usando a-syn biotinilada inmovilizada sobre sensores recubiertos con estreptavidina. La cantidad de anticuerpo libre detectado en cada concentración de a-syn se representó gráficamente frente a la concentración de ligando y se utilizó el software KinExA para calcular la constante de disociación en equilibrio (Kd). Los resultados mostrados en la Tabla 1 demuestran que IgG aslo0452 ngl-3 se une a a-syn humana con una afinidad de 106 pM.
Ejemplo 9.2: Afinidad de aslo0452 ngl-3 mediante KinExA
[0249] Además, se determinó la afinidad en fase en solución (Kd) de IgG aslo0452 ngl-3 para a-syn humana recombinante biotinilada monomérica expresada en bacterias usando un instrumento KinExA (Sapidyne Instruments). Se premezcló Aslo0452 ngl-3 con concentraciones variables de cada ligando hasta que se alcanzó el equilibrio. A continuación, se midió la cantidad de anticuerpo libre usando KinExA capturando aslo0452 ngl-3 libre usando partículas recubiertas de a-syn, lavando el material no unido y detectando el anticuerpo unido usando un anticuerpo específico de especie marcado con fluorescencia. La cantidad de anticuerpo libre detectado en cada concentración de a-syn se representó frente a la concentración de ligando y se utilizó el software KinExA para calcular la constante de disociación en equilibrio (Kd). Los resultados mostrados en la Tabla 1 demuestran que IgG aslo0452 ngl-3 se une a a-syn con una afinidad de 74 pM, mostrando una buena concordancia con el ensayo de afinidad en fase de solución de Octet anterior.
Ejemplo 9.3: Afinidad del fragmento Fab de aslo0452 ngl-3 mediante KinExA
[0250] El fragmento Fab aslo0452 ngl-3 se une a-sinucleína con alta afinidad. El valor de Kd del fragmento Fab de aslo0452 ngl-3 para a-sinucleína, medido mediante análisis KinExA (como se describe en el ejemplo anterior para el anticuerpo completo), es de 174 pM (95% lC: 15 a 177 pM).
Ejemplo 10: Efectos de aslo0452 ngl-3 sobre los niveles de a-sinucleína no unida libre en el líquido intersticial de la corteza prefrontal (ISF) de ratas macho Sprague Dawley
[0251] Se anestesiaron ratas Sprague Dawley macho adultas (293-417 g; Harlan, Países Bajos) y se implantaron guías en la corteza prefrontal.
[0252] Un día antes del experimento, se implantaron sondas “push-pull” (membrana de polietileno de 4 mm 1-3 MDa) en la corteza prefrontal utilizando un marco estereotáxico (coordenadas para las sondas: AP = -3,4 mm (a bregma), lateral 0,8 mm (hasta la línea media), ventral -5,0 mm (hasta la duramadre), la barra incisiva se fijó a -3,3 mm (todas las coordenadas de acuerdo con Paxinos y Watson, The rat brain in stereotaxic coordinates, Academic Press, Nueva York, sexta edición 2008) Las sondas se fijaron al cráneo con un tornillo de acero inoxidable y cemento dental.
[0253] En el día del experimento las sondas de microdiálisis “pussh pull” se conectaron con un tubo de PEEK flexible (Western Analytical Products Inc. USA; PK005-020) a una bomba de microperfusión (Harvard) y se perfundieron con CSF artificial (perfundido), que contenía NaCl 147 mM, KCl 3,0 mM, CaCl2 1,2 mM y MgCl2 1,2 mM BSA al 0,2% a un caudal de 0,5 pl/min. Las salidas de las sondas se conectaron a un tubo de FEP flexible. Después de un mínimo de dos horas de estabilización previa, se dosificó aslo0452 ngl-3 formulado en PBS o PBS solo (vehículo) a 30 o 0 mg/kg, respectivamente. El compuesto se administró a 2 ml/kg por vía intravenosa. Se recogieron muestras de microdiálisis a intervalos de 120 minutos. Las muestras se recogieron en miniviales (Microbiotech/se AB, Suecia; 4001029). Todas las muestras se almacenaron a -80° C.
[0254] Para determinar la concentración de a-sinucleína libre en ISF de rata, las muestras de microdiálisis se sometieron primero a inmunoprecipitación para extraer aslo0452 ngl-3. La inmunoprecipitación coprecipita la asinucleína unida a anticuerpos terapéuticos, mientras que la a-sinucleína "libre" no unida permanece en el sobrenadante. Se añadió una solución de perlas de proteína A (Dynabeads® Protein A) a una placa sin apoyo de 96 pocilios (polipropileno 0,2 ml) y se lavó dos veces con TBST (TBS 50 mM más Tween 20 al 0,1%) usando un imán (DynaMag ™ 96 side) para separar las perlas de la solución. Se añadieron muestras de microdiálisis de ISF de rata descongeladas (10 o 20 |jl) a cada pocillo, se mezclaron con perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo y se incubaron a 4°C con rotación inclinada durante 10 minutos. A continuación, las perlas se peletizaron usando el imán dos veces para asegurar la eliminación completa de las perlas. Las muestras de ISF inmunoprecipitadas se transfirieron a una placa de 96 pocillos de un kit ELISA anti-a-sinucleína (kit ELISA cuantitativo Sensolyte™, humano/ratón/rata, AnaSpec, EE. UU., AS-55550) con tampón diluyente de muestra ya añadido a un total volumen de 100 jL . Se agregaron muestras de calibración, 100 j l por pocillo, a la placa por duplicado y se agregaron 50 j l de solución de trabajo de anticuerpo de detección a cada pocillo. La placa se incubó a 4-8°C durante la noche mientras se agitaba y se protegió de la luz y a continuación se lavó seis veces con 350 j l de tampón de lavado. Finalmente, se añadieron 100 j l de sustrato de color TMB a cada pocillo y la placa se incubó en 10-15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para detener la reacción, se añadieron 50 j l de solución de parada a cada pocillo y se leyó la placa en 2 horas a una absorbancia de 450 nm. La cuantificación se realizó trazando la respuesta de la curva estándar como unidades de absorbancia en la escala lineal frente a la concentración en la escala logarítmica. Se utilizó una función de cuatro parámetros para el ajuste de curvas.
[0255] Se demostró una disminución dependiente del tiempo de a-sinucleína libre en ISF (Figura 10) después de una única administración intravenosa de aslo0452 ngl-3 de 30 mg/kg.
Ejemplo 11: Efectos de aslo0452 ngl-3 sobre los niveles de a-sinucleína libre no unida en el CSF de ratas macho Sprague Dawley
[0256] Se anestesiaron ratas macho adultas Sprague Dawley y se colocaron catéteres en la cisterna magna para acomodar el muestreo de CSF. Se insertó una cánula permanente de 0,8 cm en la cisterna magna y se exteriorizó a través de una incisión en la parte superior del cráneo. El extremo del catéter de CSF se fijó en posición con cemento acrílico dental y se fijó al cráneo con tres tornillos de acero inoxidable. Se permitió a los animales un mínimo de 2 días de recuperación antes de administrar el compuesto.
[0257] Se formuló Aslo0452 ngl-3 en tampón para dosificar a 3, 10, 30 o 100 mg/kg. El compuesto o vehículo solo se administró a 2 ml/kg por vía intravenosa.
[0258] Después de la recogida de al menos cuatro muestras de CSF limpias tomadas durante un mínimo de dos días, se administró el compuesto. A todos los animales se les administró aslo0452 ngl-3 o vehículo el día "0". Se recolectaron muestras de CSF en cada punto de tiempo indicado. Todas las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta su envío.
[0259] Para determinar la a-sinucleína libre en CSF, se extrajo la a-sinucleína unida a aslo0452 ngl-3 mediante inmunoprecipitación (IP) antes del análisis. La IP coprecipitará la a-sinucleína unida a los anticuerpos terapéuticos, mientras que la a-sinucleína "libre" no unida permanece en el sobrenadante. La determinación de los niveles libres de a-sinucleína en el sobrenadante se realiza usando un kit ELISA comercial obtenido de Anaspec. El análisis se realizó como se describe para los resultados de ISF (como se describe en el Ejemplo 10).
[0260] Se desmostró una disminución dependiente de la dosis y el tiempo de la a-sinucleína libre en CSF (Figura 11) después de una única administración intravenosa de aslo0452 ngl-3 en el intervalo de dosis de 3-100 mg/kg.
Ejemplo 12: Caracterización funcional de aslo0452 ngl-3 por reducción de la diseminación de alfa-sinucleína en un modelo lentiviral in vivo de alfa-sinucleinopatía
[0261] La capacidad de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína de alta afinidad, aslo0452 ngl-3, para bloquear la diseminación de alfa-sinucleína se investigó utilizando un modelo de ratón lentiviral in vivo de alfa-sinucleinopatía. Para este propósito, tanto los ratones de tipo salvaje no transgénicos (no tg) como los ratones transgénicos que sobreexpresan alfa-sinucleína (tg a-syn) fueron inyectados con un vector lentiviral que expresa alfa-sinucleína (LV-asyn) en el hipocampo derecho, y a continuación se inmunizaron pasivamente semanalmente durante 13 semanas con anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa sinucleína que incluyen aslo0452 ngl-3, y una IgG1 de ratón con isotipo de control NIP228. Al final del período de inmunización, los ratones fueron sacrificados y sus cerebros se fijaron en PFA al 4%, a continuación, se seccionaron coronalmente y se analizaron mediante inmunocitoquímica con análisis de imágenes automatizado de los niveles de inmunoreactividad de alfa-sinucleína ipsilateral y contralateral al sitio de inyección de LV-a -syn.
Cirugía e inmunización pasiva
[0262] Los ratones de tipo salvaje no transgénicos de tres a cuatro meses (no tg; n = 40) y los ratones transgénicos con alfa-sinucleína (a-syn tg; n = 40) recibieron una única inyección unilateral en el hipocampo derecho (-2,0, 1,5, -1,3 de Bregma) de un vector lentiviral que expresa alfa-sinucleína (LV-a-syn). Dos semanas después de la cirugía con inyección de LV-a-syn, los ratones recibieron dosis semanales de anticuerpos IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína: aslo0452 ngl-3 (no tg n = 10; a-syn tg n = 10), aslo0452 ngl-3 D265A (no tg n = 10; a-syn tg n = 10), 9E4 (no tg n = 10; a-syn tg n = 10), o fueron dosificados con IgG1 de ratón con isotipo de control NIP228 (no tg tg n = 10; a-syn tg n = 10).
[0263] Todas las IgG de ratón se dosificaron a 20 mg/kg por vía intraperitoneal (IP) durante 13 semanas. Los animales se alojaron en grupos con un máximo de 4 por jaula. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad 12/12 con acceso a comida y agua ad libitum. Las jaulas se cambiaron una vez a la semana y se controlaron diariamente. Se informó de cualquier evento adverso. Todos los animales toleraron los procedimientos quirúrgicos, así como las inmunizaciones. Al final del período de tratamiento con anticuerpos, los ratones se sacrificaron siguiendo las pautas para el tratamiento humanitario de los animales y sus cerebros se seccionaron en serie en los ejes coronales y se evaluaron para el análisis neuropatológico de la diseminación de alfa-sinucleína mediante métodos inmunocitoquímicos.
Inmunocitoquím ica de alfa-sinucleína
[0264] Se extrajeron los cerebros, se fijaron en paraformaldehído al 4% y se cortaron secciones a intervalos de 40 |jm en los ejes coronales utilizando un vibratomo y se almacenaron a -30° C en medio crioprotector (30% de glicerina, 30% de etilenglicol, 40% de PBS). Después de los lavados con PBS y las etapas de tampón de bloqueo, las secciones se incubaron durante la noche a 4° C con anticuerpo primario (mAb anti-alfa-sinucleína SYN-1 de BD a una dilución de 1:500), se lavaron en PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario (IgG anti-ratón biotinilado de Vector Laboratories a una dilución de 1: 100). Después de las etapas finales de lavado con PBS, se localizó la tinción con alfa-sinucleína utilizando el sistema de detección del complejo avidina/biotinaperoxidasa (Elite ABC, Vector Laboratories). A continuación, se analizaron las secciones con análisis de imágenes automatizado para determinar los niveles de alfa-sinucleína ipsilateral y contralateral al sitio de la inyección del vector lentiviral (LV-a -syn).
Estadísticas
[0265] Los datos generados a partir de la adquisición de imágenes automatizada de los niveles de alfa-sinucleína a través de grupos de tratamiento notg y tg a-syn se analizaron usando GraphPad Prism Software, San Diego California, EE. UU. Se realizó un ANOVA de una vía con el post-test de comparación múltiple de Dunnett. Los datos que se muestran en las figuras se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias entre los grupos se consideraron de significación estadística cuando p <0,05. Todos los análisis se realizaron de forma ciega para el evaluador. Los grupos de tratamiento con anticuerpos también fueron ciegos para el evaluador.
Resultados
[0266] Tanto en ratones no tg como en ratones tg a-syn, la inmunorreactividad de alfa-sinucleína en el lado ipsilateral inyectado con LV-a fue intensa en el neuropilo y cubrió la mayor parte de la superficie del hipocampo (Figura 12 A, Figura 15 A; NIP228 - Ipsilateral). El hipocampo contralateral no inyectado de ratones no tg y ratones tg a-syn también mostró niveles altos de inmunorreactividad de alfa-sinucleína, lo que indica que la alfa-sinucleína expresada lentiviralmente se había extendido desde el hipocampo derecho inyectado al hipocampo izquierdo (Figura 12A, Figura 15 A; NIP228 - Contralateral). En este modelo de ratón con inyección de alfa-sinucleína lentiviral, los experimentos anteriores han demostrado que solo la proteína alfa-sinucleína expresada se disemina hacia el lado contralateral sin evidencia de transferencia del lentivirus en sí, según lo determinado por análisis de PCR (datos no mostrados).
[0267] Los niveles en hipocampo ipsilateral y contralateral de alfa-sinucleína expresada de forma lentiviral en ratones no tg que fueron inmunizados pasivamente con el anticuerpo 9E4 (9E4 - versión de ratón de la PRX002 (Prothena)) fueron casi idénticos a los niveles hipocampo ipsilateral y contralateral de alfa-sinucleína expresada lentiviralmente en ratones no tg que fueron inmunizados pasivamente con IgG1 de ratón con isotipo de control NIP228 (Figura 12 A, B, C; 9E4 en comparación con NIP228), lo que indica que 9E4 cuando se dosifica a 20 mg/kg semanalmente durante 13 semanas a través de la ruta IP no bloquea la diseminación de alfa-sinucleína en este modelo de diseminación de alfasinucleína.
[0268] Por el contrario, los niveles en hipocampo tanto ipsilateral como contralateral de alfa-sinucleína expresada de forma lentiviral en ratones no tg que fueron inmunizados pasivamente con cualquiera de anticuerpo aslo0452 ngl-3 o una versión mutante efectora nula de aslo0452 ngl-3 (aslo0452-ngl-3-D265A), donde el reemplazo de ácido aspártico por alanina en la posición 265 (D265A) en la IgG1 de ratón da como resultado la pérdida de interacción entre este isotipo y los receptores Fc de IgG de baja afinidad (FcyRIIB y FcyRIII) encontrados en la microglía, fueron significativamente más bajos que los niveles hipocampales ipsilaterales y contralaterales de alfa-sinucleína expresada lentiviralmente en ratones no tg que fueron inmunizados pasivamente con IgG1 de ratón con isotipo de control NIP228 (Figura 12 A, B, C; aslo0452-ngl-3 y aslo0452-ngl-3-D265A en comparación con NIP228). Esto indica que la inmunización pasiva de ratones con aslo0452-ngl-3 o la versión mutante efectora nula D265A de aslo0452-ngl-3 bloquea de manera robusta la diseminación de alfa-sinucleína en este modelo de ratón de alfa-sinucleinopatía. Se obtuvieron resultados similares cuando se inyectó el vector LV-a-syn en el hipocampo derecho de ratones tg a-syn; la inmunización pasiva con aslo0452-ngl-3 o aslo0452-ngl-3-D265A, pero no 9E4, condujo a una reducción robusta y estadísticamente significativa en los niveles tanto ipsilateral como contralateral de inmunorreactividad de alfasinucleína en el hipocampo en comparación con ratones tg a-syn tratados con NIP228 (Figura 15 A,B,C).
[0269] A mayor aumento, se observaron depósitos inmunorreactivos de alfa-sinucleína expresada lentiviralmente a lo largo de los axones ipsolaterales del lado inyectado y los axones contralaterales del lado no inyectado de ratones no tg (Figura 13 A; flechas negras que muestran axones transhipocampales), lo que sugiere que la diseminación de alfasinucleína hacia el hipocampo contralateral puede ocurrir principalmente a lo largo de los axones (diseminación transaxonal). Los niveles ipsilaterales y contralaterales de depósitos axonales de alfa-sinucleína en ratones no tg inmunizados pasivamente con anticuerpo 9E4 o IgG1 de ratón con isotipo de control NIP228 no fueron significativamente diferentes (Figura 13 A, B, C; 9E4 en comparación con NIP228), lo que indica que bajo nuestras condiciones experimentales, 9E4 no impacta en los niveles de depósitos axonales de alfa-sinucleína ni reduce la diseminación de alfa-sinucleína a lo largo de axones en este modelo de diseminación de alfa-sinucleinopatía lentiviral.
[0270] Por el contrario, tanto los niveles ipsilateral como contralateral de depósitos axonales de alfa-sinucleína en ratones no tg inmunizados pasivamente con cualquiera de anticuerpo aslo0452 ngl-3 o la versión mutante efectora nula de aslo0452-ngl-3 (aslo0452-ngI-3-D265A), fueron significativamente más bajos que los niveles de depósitos axonales de alfa-sinucleína en ratones no tg tratados con IgG1 de ratón con isotipo de control NIP228 (Figura 13 A, B, C; aslo0452-ngl-3 & aslo0452-ngl-3-D265A en comparación con NIP228), lo que indica que la inmunización pasiva de ratones con aslo0452-ngl-3 o la versión mutante efectora nula D265A de aslo0452-ngl-3 elimina los depósitos axonales de alfa-sinucleína y bloquea de manera robusta la transferencia ipsilateral a contralateral de alfa-sinucleína a lo largo de los axones en este modelo de ratón de alfa-sinucleinopatía lentiviral.
[0271] Se obtuvieron resultados muy similares cuando se inyectó el vector LV-a-syn en el hipocampo derecho de ratones tg a-syn; la inmunización pasiva con aslo0452-ngl-3 o aslo0452-ngl-3-D265A, pero no 9E4, condujo a una reducción robusta y estadísticamente significativa en los niveles ipsilaterales y contralaterales de inmunorreactividad de alfa-sinucleína a lo largo de los axones en comparación con ratones tg a-syn tratados con NIP228 (Figura 16 A, B, C).
[0272] En ratones no tg inyectados con LV-a-syn, a mayor aumento se detectó una intensa inmunorreactividad de alfa-sinucleína en el neuropilo del hipocampo ipsolateral y, en menor grado, en el neuropilo de la neocorteza ipsolateral (Figura 14 A). Además, se detectaron depósitos intensos de alfa-sinucleína en varios cuerpos de células neuronales identificables (soma) en la región CA1 del hipocampo ipsilateral y se detectó una inmunorreactividad de alfa-sinucleína más débil en las neuronas de capa 5 de la neocorteza ipsilateral (Figura 14; flechas negras). Aunque el tratamiento con el anticuerpo 9E4 no alteró significativamente el número de neuronas hipocampales CA1 ipsolaterales o neuronas neocorticales de capa 5 ipsolaterales que contenían depósitos de alfa-sinucleína en comparación con ratones no tg inmunizados con IgG de ratón con isotipo de control NIP228 (Figura 14 A, B, C; 9E4 en comparación con NIP228), los ratones no tg tratados con el anticuerpo aslo0452 ngl-3 o una versión mutante efectora nula de aslo0452-ngl-3 (aslo0452-ngl-3-D265A) tenía un número significativamente reducido de neuronas CA1 ipsilaterales y neuronas de la capa 5 ipsolaterales que contenían depósitos de alfa-sinucleína en comparación con ratones no tg tratados con IgG de ratón con isotipo de control NIP228 (Figura 14 A, B, C; aslo0452-ngl-3 y aslo0452-ngl-3-D265A en comparación con NIP228).
[0273] Además, la intensidad de la inmunorreactividad de la alfa-sinucleína en el neuropilo y las neuronas de la región CA1 ipsilateral del hipocampo y la región de la capa 5 ipsilateral de la neocorteza fue inferior notablemente en ratones no tg tratados con aslo0452-ngl-3 y aslo0452-ngI-3-D265A en comparación con ratones no tg tratados con IgG de ratón con isotipo de control NIP228 (Figura 14 A; aslo0452-ngl-3 y aslo0452-ngl-3-D265A en comparación con NIP228).
[0274] Se obtuvieron resultados similares cuando se inyectó el vector LV-a-syn en el hipocampo derecho de ratones tg a-syn; el tratamiento con aslo0452-ngl-3 o aslo0452-ngl-3-D265A pero no 9E4 condujo a una disminución estadísticamente significativa en el número de neuronas que contienen una fuerte inmunorreactividad de alfasinucleína en las regiones del hipocampo CA1 ipsolateral y en las regiones neocorticales de capa 5, así como en la región hipocampal CA1 contralateral, en comparación con los ratones tg a-syn tratados con NIP228 (Figura 17 A, B, C, D).
[0275] Se ha demostrado que la inmunización pasiva de ratones de tipo salvaje no-tg o ratones tg a-syn que han sido ambos estereotácticamente inyectados con un vector lentiviral que impulsa la expresión de alfa-sinucleína humana en un lado del hipocampo, con un anticuerpo IgG1 de ratón anti-alfa-sinucleína de alta afinidad aslo0452-ngl-3 reduce de manera robusta la propagación trans-axonal ipsilateral a contralateral de alfa-sinucleína expresada lentiviralmente que se observa en este modelo de ratón de propagación de alfa-sinucleína. Esta propiedad de anticuerpo anti-alfasinucleína recientemente descrita de inhibir la propagación de la alfa-sinucleína in vivo es indicativa de la unión a un epítopo diferente de la alfa-sinucleína humana en comparación con los anticuerpos que no inhiben la propagación en el modelo probado, por ejemplo, el anticuerpo 9E4.
[0276] Además, los datos que muestran que una versión mutante efectora nula D265A de aslo0452-ngl-3 es igualmente eficaz que aslo0452-ngl-3 en la reducción de diseminación de alfa-sinucleína en el modelo indica que la

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a a-sinucleína humana, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:
a) tres CDR de cadena pesada que tienen las secuencias:
(i) H-CDR1 de SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 de SEQ ID NO: 15; y
(iii) H-CDR3 de SEQ ID NO: 16, y
b) tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias:
(i) L-CDR1 de SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 de SEQ ID NO: 10; y
(iii) L-CDR3 de SEQ ID NO: 21.
2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a a-sinucleína humana con una Kd de menos de 500 pM.
3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. NO: 14.
4. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
5. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos. de SEQ ID NO: 19.
6. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
7. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo.
8. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una triple mutación en la región Fc correspondiente a L234F/L235E/P331S numerada según la numeración de Kabat.
9. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en la prevención o el tratamiento de una a-sinucleinopatía.
10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la reivindicación 9, en el que la asinucleinopatía se selecciona entre enfermedad de Parkinson (PD), demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y atrofia multisistémica (MSA).
11. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la reivindicación 10, en el que la asinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson (PD).
12. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la reivindicación 10, en el que la asinucleinopatía es la atrofia multisistémica (MSA).
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