RS62682B1 - Antitela na alfa-sinukleinu i njihova upotreba - Google Patents

Antitela na alfa-sinukleinu i njihova upotreba

Info

Publication number
RS62682B1
RS62682B1 RS20211502A RSP20211502A RS62682B1 RS 62682 B1 RS62682 B1 RS 62682B1 RS 20211502 A RS20211502 A RS 20211502A RS P20211502 A RSP20211502 A RS P20211502A RS 62682 B1 RS62682 B1 RS 62682B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
synuclein
antigen
binding fragment
Prior art date
Application number
RS20211502A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Perkinton
Darren Schofield
Lorraine Irving
George Thom
Original Assignee
Medimmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medimmune Ltd filed Critical Medimmune Ltd
Publication of RS62682B1 publication Critical patent/RS62682B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

STANJE TEHNIKE
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na Į-sinukleinska antitela i njihovu primenu u prevenciji ili lečenju oboljenja, naročito alfa-sinukleinopatija, a prvenstveno Parkinsonove bolesti (PD).
[0002] Alfa-sinukleinopatije, takođe poznate kao bolest Levijevog tela (Lewy body diseases (LBDs)), su porodica neurodegenerativnih bolesti koje svi imaju u njihovoj srži alfa-sinukleina kao ključni patološki znak (Jellinger, Mov Disord (2003), 18 Suppl 6: S2-12; and Spillantini and Goedert, Ann N Y Acad Sci (2000), 920: 16-27). Alfa-sinukleinopatije uključuju Parkinsonovu bolest (PD), demenciju sa Levijevim telom (DLB) i multipla sistemska atrofija (MSA).
[0003] PD je sporo progresivni poremećaj kretanja povezan sa uzrastom koji pogađa više od 1% ljudi starijih od 65 godina. PD je drugo najčešće neurodegenerativno stanje posle Alchajmerove bolesti.
[0004] Definišući znak patologije alfa-sinukleinopatija su Levijeva tela i Levijevi neuriti, koji su nerastvorljive inkluzije agregiranih proteina pronađenih unutar neurona mozga otkrivenih nakon postmortalnog histopatološkog pregleda.
[0005] Prisustvo Levijeve patologije i gubitak neurona u nemotornim regionima mozga kao što su bazalni prednji mozak, mezopontinski sistem, amigdala, neokorteks, dorzalno motorno jezgro vagusnog nerva, olfaktorni bulbus, lokus coeruleus i moždano stablo, može izazvati kognitivne deficite i demenciju, hiposmija, poremećaji spavanja uključujući brze pokrete očiju, poremećaj ponašanja u snu (RBD), poremećaji raspoloženja uključujući depresiju i anksioznost, autonomna disfunkcija uključujući kardiovaskularne i gastrointestinalne probleme kao što je zatvor, i umor i pospanost. Čini se da neki od ovih nemotornih simptoma karakterišu premotornu ili prodromalnu fazu bolesti (Kalia et a/. Lancet (2015), 386(9996): 896-912).
[0006] Prisustvo Levijeve patologije i gubitka neurona u motornim regijama mozga, uključujući pre svega smrt dopaminergičkih neurona u supstanci nigra, može izazvati tremor u mirovanju, rigidnost, bradikineziju i posturalnu nestabilnost (Spillantini and Goedert, Ann N Y Acad Sci (2000), 920: 16-27).
[0007] Alfa-sinuklein (takođe poznat kao "a-sinuklein" ili "a-sin") protein je glavna strukturna komponenta Levijevih tela i Levijevih neurita. Alfa-sinuklein je mali kiselinski protein sasatvljen od 140 amino kiselina (14 kDa). Prirodni humani alfa-sinuklein divljeg tipa ima sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 1 kao što je opisano pod UniProtKB pristupnim brojem P37840. Osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta, upućivanje na alfa-sinuklein ili njegove fragmente uključuje prirodnu humanu sekvencu amino kiselina divljeg tipa navedenu gore, i njene alelne varijante, posebno one povezane sa bolesti Levijevog tela (npr., E46K, A30P, H50Q, G51D i A53T, gde prvo slovo označava amino kiselinu u SEQ ID NO: 1, broj je pozicija kodona u SEQ ID NO: 1, a drugo slovo je amino kiselina u alelnoj varijanti). Takve varijante mogu opciono biti prisutne pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji. Indukovane mutacije E83Q, A90V, A76T, koje pojačavaju alfa-sinukleinsku agregaciju, takođe mogu biti prisutne pojedinačno ili u kombinaciji jedna sa drugom i/ili sa humanim alelnim varijantama E46K, A30P, H50Q, G51D i A53T. Na strukturnom nivou, alfa-sinuklein sadrži tri različita regiona: amfipatski N-terminalni alfa-heliks domen koji ima svojstva vezivanja za lipide i membranu (ostaci 1-60), centralni hidrofobni domen koji se vezuje za amiloid koji kodira ne-amiloidne- beta komponente (NAC) plakova (ostaci 61-95), i kiseli prolinom bogat C-terminalni rep (ostaci 96-140). Veruje se da su ostaci 71-82 NAC domena ključni za svojstva agregacije/fibrilacije alfa-sinukleina tako što omogućavaju proteinu da pređe sa nasumične strukture zavojnice na strukturu beta lista (Bisaglia et al. FASEB J (2009), 23(2): 329-40). Iako C-terminalni domen nema značajnu sekundarnu strukturu, on sadrži ključno mesto fosforilacije na ostatku Ser129 i određeni broj ostataka tirozina koji su nitrirani u inkluzijama citosolnog alfa-sinukleina. Takođe postoje N-terminalni i C-terminalni skraćeni oblici alfa-sinukleina. Posttranslacione modifikacije proteina mogu uticati na agregaciju i toksičnost alfa-sinukleina (Oueslati et al. Prog Brain Res (2010), 183: 115-45).
[0008] Alfa-sinuklein se nalazi u izobilju u centralnom nervnom sistemu (CNS)/mozgu gde se nalazi i intracelularno u neuronima i gliji, a takođe i ekstracelularno u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) (Mollenhauer et al. J Neural Transm (2012), 119(7): 739-46) i intersticijalnoj tečnosti (ISF) koja kupa i okružuje ćelije mozga (Emmanouilidou et al. PLoS One (2011), 6(7): e22225). Alfasinuklein je sinaptički protein pretežno izražen u neuronima neokorteksa, hipokampusa, supstancije nigre, talamusa i malog mozga (Iwai et al. Neuron (1995), 14: 467-475). Pod fiziološkim uslovima, nalazi se u neuronskim sinaptičkim terminalima i posebno se reguliše na presinaptičkim terminalima tokom sinaptičkog preuređivanja vezanog za akviziciju (Fortin et al. J Neurosci (2005), 25: 10913-10921).
[0009] In-vitro studije su pokazale da monomeri alfa-sinukleina mogu biti polazna tačka za proces agregacije. Monomer se može agregirati u različite male oligomerne vrste koje se zatim stabilizuju interakcijama beta-listova, nastavljajući da formiraju protofibrile koji mogu da se polimerizuju u nerastvorljive fibrilarne strukture koje podsećaju na one identifikovane u Levijevim telima (Cremades et al. Cell (2012), 149(5): 1048-59).
[0010] Pod patološkim uslovima, aberantna agregacija alfa-sinukleina može biti ključna za patološke promene koje se vide kod alfa-sinukleinopatija (Lashuel et al. Nature (2002), 418: 291; and Tsigelny et al. FEBS Journal (2007), 274: 1862-1877). In vitro i in vivo studije su pokazale da neurotoksični efekti alfa-sinukleina su izgleda izazvane sa malim rastvorljivim oligomernim konformerima ili protofibrilima (Winner et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2011), 108(10): 4194-9; and Danzer et al. J Neurosci (2007), 27(34): 9220-32). Dok su fibrilarni agregati alfa-sinukleina karakteristični za PD, oligomerni oblici alfa-sinukleina su toksične vrste (Danzer et al. J Neurosci (2007), 27(34): 9220-32; Lashuel et al. Nature (2002), 418: 291; i Winner et al. Proc Natl Acad Sci USA (2011), 108: 4194-4199).
[0011] Alfa-sinukleinski oligomeri se mogu osloboditi u ekstraćelijskom okruženju i preuzeti od susednih ćelija u mehanizmu "propagacije" (Angot and Brundin, Parkinsonism Relat Disord (2009), 15 Suppl 3: S143-147; Desplats et al. Proc Natl Acad Sci USA (2009), 106: 13010-13015; and Lee et al. J Biol Chem (2010), 285: 9262-9272). Agregati alfa-sinukleina mogu da propagiraju pogrešno savijanje kroz mehanizam širenja sličan prionima (Lee et al. Nat Rev Neurol (2010), 6: 702-706; Luk et al. J Exp Med (2012), 209(5): 975-86; and Luk et al. Science (2012), 338(6109): 949-53). Alfasinuklein stoga može izazvati neurodegeneraciju bilo toksičnošću oligomera ili razmnožavanjem i širenjem sličnim prionima.
[0012] Sada je dobro utvrđeno i prihvaćeno da ćelije uključujući neurone mogu lučiti različite oblike alfa-sinukleina (monomeri, oligomeri, agregati) u normalnim uslovima, a takođe i pod uslovima ćelijskog stresa, povećana je sekrecija monomernih i agregiranih oblika alfa-sinukleina u uslovima ćelijskog stresa, i kroz ovo oslobađanje alfa-sinukleina u ekstraćelijski milje, patološki prenosivi oblici alfa-sinukleina se mogu propagirati između neurona (Recasens and Dehay, Front Neuroanat (2014), 8: 159).
[0013] Efekti alfa-sinukleina u PD se mogu proširiti izvan neposrednog oštećenja ranjivih neuronskih ćelija. Kao i većina neurodegenerativnih bolesti, primećen je i proinflamatorni ćelijski odgovor (Lee et al. J Biol Chem (2010), 285: 9262-9272). Cirkulišući alfa-sinuklein i/ili aktivirani astrociti mogu aktivirati mikrogliju, što dovodi do povećanog stvaranja reaktivnih vrsta kiseonika, proizvodnje azotnog oksida i citokina i dodatno pogoršava neurodegeneraciju (Lee et al. J Biol Chem (2010), 285: 9262-9272).
[0014] Višestruki različiti eksperimentalni modeli su demonstrirali prenos alfa-sinukleina od ćelije do ćelije u kultivisanim ćelijama, ili in vivo širenje i propagaciju alfa-sinukleinskih patologija. Patologija Levijevog tela primećena je u embrionalnim mezencefalnim neuronskim transplantacijama više od 10 godina nakon što su transplantacije terapeutski presađene u strijatum pacijenata sa PD. Konkretno, kalemljeni neuroni su sadržali brojne inkluzije nalik Levijevom telu koje su pozitivno obojene na alfa-sinuklein, što ukazuje na to da je došlo do prenošenja alfa-sinukleinske patologije od domaćina do transplantata (Li et al. Nat Med (2008), 14(5): 501-3; i Kordower et al. Nat Med (2008), 14(5): 504-6).
[0015] Dalje, prethodno formirani rekombinantne alfa-sinukleinske fibrilii i alfa-sinukleinski oligomeri mogu biti internalizovani kultivisanim ćelijama i neuronima, a demonstrirano je direktno prenošenje alfa-sinukleina sa ćelija donora na ćelije primaoca sa formiranjem alfasinukleinskih inkluzija sličnih Levijevoj patologiji (Danzer et al. J Neurosci (2007), 27(34): 9220-32; Volpicelli-Daley et al. Neuron (2011), 72(1): 57-71; i Luk et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2009), 106(47): 20051-6). Injekcija prethodno formiranih sintetičkih alfa-sinukleinskih fibrila ili materijala koji sadrži alfa-sinuklein sličan Levijevom telu ekstrahovan iz mozga ostarelih alfasinukleinskih transgenih miševa u mozgove asimptomatskih miševa primaoca promoviše formiranje patologije nalik Levijevom telu u neuronima domaćina životinje primaoca zajedno sa neurodegeneracijom i neurološkim deficitima (Luk et al. J Exp Med (2012), 209(5): 975-86; and Luk et al. Science (2012), 338(6109): 949-53). Alfa-sinuklein koji sadrži esktrakte Levijevog tela izolovan iz PD mozga inokulisan u suštinski nigra ili strijatum makakija majmuna i miševa brzo se preuzimaju od strane ćelija domaćina (u roku od 24 sata), nakon čega sledi sporiji gubitak strijatalnih dopaminergičkih terminala, sa gubitkom ćelija evidentnim nakon više od godinu dana (Recasens et al. Ann Neurol (2014), 75(3): 351-62). Slično tome, inokulacija miševa sa moždanim homogenatima izvedenih iz pacijanta koji boluju od sinukleinopatija DLB ili MSA aktivira alfa-sinuklein patologiju sličnu Leviju u domaćinskim miševima (Watts et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2013), 110(48): 19555-60; i Masuda-Suzukake et al. Brain (2013), 136(Pt 4): 1128-38). Konačno, kod miševa je demonstriran transfer i prenos i monomernog i oligomernog alfa-sinukleina iz olfaktorne bulbe do međusobno povezanih moždanih struktura (Rey et al. Acta Neuropathol (2013), 126(4): 555-73).
[0016] Pristupi pasivne imunoterapije sa antitelima usmerenim na alfa-sinuklein su testirani na brojnim pretkliničkim modelima miševa alfa-sinukleinopatije (Lawand et al. Expert Opin Ther Targets (2015): 1-10). Konkretno, studija koja koristi monoklonsko antitelo usmereno protiv alfasinukleina (9E4) pokazala je in vivo čišćenje alfa-sinuklein agregacija i patologije, poboljšanja u motornom ponašanju i neuroprotektivne efekte (WO 2014/058924).
[0017] Dalje studije koje koriste pasivnu imunizaciju alfa-sinukleinskih transgenih miševa razvijenih kao eksperimentalni modeli PD/DLB, sa 9E4 monoklonskim antitelom su pokazale da antitelo čisti alfa-sinukleinsku patologiju, smanjuje sinaptički i aksonalni deficit, ukida gubitak strijatalnih tirozin hidroksilaznih vlakana i značajno smanjuju deficite pamćenja i oštećenja motoričke funkcije (Games et al. J Neurosci (2014), 34(28): 9441-54; Bae et al. J Neurosci (2012), 32(39): 13454-69; i Masliah et al. PLoS One (2011), 6(4): e19338). Dalje je pokazano da je pasivna primena anti-alfa-sinukleinskih monoklonskih antitela kod miševa divljeg tipa koji su intrastriatalno ubrizgavani sintetičkim alfa-sinukleinskim preformiranim fibrilima (pffs) dovela do snažnog smanjenja Levijeve patologije, sprečavanja gubitka dopaminskih neurona u značajnoj nigri, i značajnog poboljšanja motoričkih oštećenja koja se manifestuju u modelu miša nakon pffs lečenja (Tran et al. Cell Rep (2014), 7(6): 2054-65).
[0018] Pored toga, jedan od glavnih izazova povezanih sa lečenjem poremećaja CNS terapeutskim agensima velikih molekula, kao što su antitela, je unošenje ovih lekova u zahvaćeno tkivo. Prolaz velikih molekula u mozak i kičmenu moždinu u velikoj meri je ograničen krvno-moždanom barijerom (BBB). BBB štiti i reguliše homeostazu mozga i sprečava slobodan prolaz molekula u većinu delova mozga, čime se ograničava lečenje mnogih bolesti mozga. Transport esencijalnih molekula kao što su hranljive materije, faktori rasta i hormoni se postiže nizom specifičnih transportera i receptora koji regulišu prolaz kroz endotelne ćelije mozga. Dostava bioloških i drugih lekova u mozak stoga predstavlja značajan izazov. Pored toga, izgleda da postoje transportni mehanizmi koji brzo uklanjaju antitela iz mozga, verovatno da bi sprečili inflamatorne odgovore usled angažovanja Fc sa efektorskim ligandima koji promovišu proinflamatorni odgovor.
[0019] Tokom poslednje decenije, pojavili su se izveštaji o transportu antitela preko BBB gde vezivanje za ekstraćelijski domen molekula transportera olakšava transcitozu kompleksa receptorskih antitela preko sloja endotelnih ćelija.
[0020] BBB se uglavnom sastoji od endotelnih ćelija kapilara mozga, koje imaju specijalizovane karakteristike, kao što su čvrsti spojevi, da ograniče transport molekula u mozak (Reese et al.
1967, J. Cell Biol.34: 207-217; Brightman et al.1969, J. Cell Biol.40: 648-677; Rubin et al. 1999, Ann. Rev. Neurosci.22: 11-28), iako drugi tipovi ćelija, kao što su periciti, astrociti i neuronske ćelije, takođe igraju važnu ulogu u funkciji BBB. Tipično, manje od 0.1% periferno doziranog antitela stigne do mozga (Boado et al.2010, Mol. Pharm.7: 237-244; Pepinsky et al.
2011, Nat. Neurosci.8: 745-751). BBB funkcioniše kao fizička, metabolička i imunološka barijera (Gaillard et al.2003, Microvasc. Res.65: 24-31).
[0021] Transport antitela kroz BBB se može poboljšati pokretanjem transcitoze posredovane receptorima na endotelnim ćelijama mozga. Kroz ovaj proces, angažovanje antigena na luminalnoj strani endotelne ćelije može izazvati internalizaciju i prebacivanje antitela kroz ćeliju, a zatim njegovo naknadno oslobađanje u tkivo.
[0022] Trenutne terapije lekovima za PD uglavnom su fokusirane na lečenje simptoma bolesti povezanih sa motorikom. Trenutno ne postoje na tržištu ili dostupne terapije koje mogu lečiti ili sprečiti alfa-sinukleinopatiju.
[0023] Shodno tome, postoji potreba u struci za terapijom za lečenje alfa-sinukleinopatija, posebno kod ljudi.
[0024] WO 2014/132210 opisuje antitela ili njegove fragmente koji imaju visoki vezujući afinitet za a-sinukleinske agregacije (npr. amiloidi fibrili, protofibrili ili oligomeri) i niski vezujući afiniteta za Į-sinukleinske monomere.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0025] Predmetni pronalazak je opisan priloženim zahtevima. Zahtev 1 obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se vezuje za humani a-sinuklein, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži:
a) tri teška lanca CDRs koja imaju sekvencu:
(i) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 15; i
(iii) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 16, i
b) tri laka lanca CDRs koja imaju skevence:
(i) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 10; i
(iii) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 21.
[0026] Druge prednosne karakteristike su opisane u preostalim zavisnim zahtevima.
[0027] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovana antitela na humani alfa-sinuklein.
Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela ili njegov antigenski vezujući fragment koji imaju jedno ili više funkcionalnih svojstava aslo0452 ngl-3 antitela. Na primer: Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji specifično vezuje C-terminalni region humanog Į-sinukleina. Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji specifično vezuje region koji sadrži oko 102 amino kiseline do oko130 amino kiseline humanog Į-sinukleina (npr. SEQ ID NO: 1). U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment se specifično vezuje za region koji sadrži oko 120 amino kiseline do oko 130 amino kiseline humanog Į-sinukleina (SEQ ID NO: 1). U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment se vezuje za epitop koji nije isti kao antitelo vezano sa 9E4 antitelom.
[0028] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji vezuju humani Į-sinuklein ali ne i humani ȕ-sinuklein ili humani Ȗ-sinuklein.
[0029] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji se vezuju za humani, pacovski i cinomolgusni Į-sinuklein.
[0030] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji se vezuju za humani Į-sinuklein sa visokim afinitetom. U jednom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, predmetnog pronalaska se vezuje za alfa-sinuklein sa KDmanjim od 500 pikoMolar (pM), manjim od 400 pM, manjim od 300 pM, manjim od 200 pM, manjim od 150 pM, manjim od 120 pM, manjim od 110 pM ili 106 pM ili manje kao što je izmereno na primer korišćenjem Oktet analize. U jednom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, predmetnog pronalaska se vezuje za alfa-sinuklein sa KDmanjim od 400 pikoMolar (pM), manjim od 300 pM, manjim od 250 pM, manjim od 200 pM, manjim od 150 pM, manjim od 120 pM, manjim od 110 pM, manjim od 100 pM, manjim od 80 pM ili 74 pM ili manje kao što je izmereno na primer koristeći KinExA analizu.
[0031] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji se vezuju za prirodni endogeni humani Į-sinuklein.
[0032] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji se vezuju za monomerne oblike humanog Į-sinukleina.
[0033] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji se vezuju za agregate humanog Į-sinukleina.
[0034] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji se vezuju za relevantna za oboljenja, patološke oblike Į-sinukleina.
[0035] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji redukuje Į-sinuklein nivoe u moždanoj intersticijskoj tečnosti. Prvenstveno, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku smanjuju slobodne nevezane Į-sinuklein nivoe u moždanoj intersticijskoj tečnosti.
[0036] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji redukuje Į-sinuklein nivoe cerebrospinalnoj tečnosti. Prvenstveno, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku smanjuju slobodne nevezane Į-sinuklein nivoe u cerebrospinalnoj tečnosti.
[0037] Kao što je korišćeno ovde, termini "slobodni nevezani Į-sinuklein" odnose se na Į-sinuklein koji nije vezan za antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku. Navedeni slobodni nevezani Į-sinuklein se može primeniti na Į-sinuklein u njegovom monomernom ili oligomernom obliku, ili u agregatnom obliku. Ovi termini se uopšteno odnose na bilo koji patološki oblik Į-sinukleina.
[0038] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji redukuje širenje Į-sinukleina in vivo.
[0039] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska se takmiči sa antitelom aslo0452 ngl-3 u vezivanju za humani Į-sinuklein.
[0040] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska se vezuju za isti epitop na humanom Į-sinukleinu kao antitelo aslo0452 ngl-3.
[0041] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska izvedeni iz antitela asyn0087 sadrže varijabilni region teškog lanca (VH) amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 i varijabilni region lakog lanca (VL) amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 3, kao što je ovde opisano.
[0042] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska izvedeni iz antitela asyn0087, pri čemu navedeno antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment imaju KDmanje od 500 mM i vezuju isti epitop kao bilo koje antitelo t asyn0087, aslo0452 ngl-3 i aslo0543, koja su ovde opisana.
[0043] Kao što je ovde korišćeno, "H-CDR" označava komplementarni određujući region (CDR) na regionu teškog lanca, a "L-CDR" označava komplementarni određujući region (CDR) na regionu lakog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta.
[0044] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan CDR odabran između:
(i) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 6,
(iii) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 7,
(iv) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 9,
(v) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 10,
1
(vi) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 11.
[0045] U drugom rešenju, CDR3 teškog lanca antitela ili njegovog anitgenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 iz SEQ ID NO: 16 teškog lanca antitela aslo0452 ngl-3; i/ili CDR3 lakog lanca antitela ili njegovog anitgenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 iz SEQ ID NO: 21 lakog lanca antitela aslo0452 ngl-3.
[0046] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku ima najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri, anjmanje četiri, najmanje pet ili sve CDRs odabrane između CDRs antitela aslo0452 ngl-3, odn. najmanje jedan CDR odabran između bilo kog od SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21.
[0047] U drugom rešenju, CDR3 teškog lanca antitela ili njegovog anitgenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 teškog lanca antitela aslo0452 ngl-3; i/ili CDR3 lakog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg frgamenta predmetnog pronalaska je CDR3 lakog lanca antitela aslo0452 ngl-3.
[0048] U jednom rešenju, CDR3 teškog lanca antitela ili njegovog anitgenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 teškog lanca antitela aslo0452 ngl-3.
[0049] U jednom rešenju, CDR3 lakog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg frgamenta predmetnog pronalaska je CDR3 lakog lanca antitela aslo0452 ngl-3.
[0050] U jednom rešenju, CDR3 teškog lanca antitela ili njegovog anitgenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 teškog lanca antitela aslo0452 ngl-3 i CDR3 lakog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg frgamenta predmetnog pronalaska je CDR3 lakog lanca antitela aslo0452 ngl-3.
[0051] Predmetni pronalazk obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji ima šest CDRs antitela aslo0452 ngl-3.
[0052] Stoga, u jednom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku obuhvata:
a) tri teška lanca CDRs koja imaju sekvence:
(i) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 15; i
(iii) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 16, i
b) tri laka lanca CDRs koja imaju sekvence:
(i) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 10, i
(iii) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 21.
[0053] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 13 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 18.
[0054] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 19.
[0055] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima amino kiselinsku skvencu iz SEQ ID NO: 19.
[0056] U određenom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrži varijabilni teški lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 4 i varijabilni laki lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 8.
[0057] U daljem poželjnom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrži varijabilni teški lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 4 i varijabilni laki lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 8, i vezuje se za humani Į-sinuklein sa KDmanjim od 500 pM i vezuje isti epitop kao asyn0087, aslo0452 ngl-3 ili aslo0543.
[0058] U drugom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrži varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 19.
[0059] U određenom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrže varijabilni teški lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 19.
[0060] U drugom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrže varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 19 i dalje sadrži:
a) tri teška lanca CDRs koja imaju sekvencu:
(i) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 15; i
(iii) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 16, i
b) tri laka lanca CDRs koja imaju sekvencu:
(i) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 10; i
(iii) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 21.
[0061] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži verijabilni teški lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 13 i varijabilni laki lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 18.
1
[0062] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži verijabilni teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 19.
[0063] Takođe je obezbeđeno antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji sadrže teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 12 i laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 17.
[0064] U drugom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrže varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 24 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 30.
[0065] U određenom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrže varijabilni teški lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 24 i varijabilni laki lanac koji ima sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 30.
[0066] U drugom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrže varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 24 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 30 i dalje sadrži:
c) tri teška lanca CDRs koja maju sekvence:
(iv) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 25,
(v) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 26; i
(vi) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 27, i
d) tri laka lanca CDRs koja imaju sekvence:
(iv) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 31,
(v) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 32; i
(vi) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 33.
[0067] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži verijabilni teški lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 24 i varijabilni laki lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 30.
[0068] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži verijabilni teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 24 i varijabilni laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 30.
[0069] Takođe je obezbeđeno antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji sadrže teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 22 i laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 28.
[0070] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska kao što je definisano bilo gde gore je IgA, IgD, IgE, IgM, IgG such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment.
[0071] U drugom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska ima modifikovani Fc region. Pogodne modifikacije su dobro poznate srtučnom licu u tehnici i mogu uključivati inter alia modifikacije kako bi se povećao ili smanjio poluživot, ablacija, smanjila ili povećala efektorska funkcija, obezbedili supstituisani cisteini sa slobodnim tiolima za konjugaciju. Primeri takvih modifikacija su YTE kako bi se povećao poluživot i/ili TM kakob i se smanjila efektorska funkcija. U nekim rešenjima, bilo koje antitelo ili antigenski vezujući fragment koje je ovde otkriveno obuhvataju mutacije M252Y/S254T/T256E (YTE) u Fc regionu antitela (Dall’Acqua et al., 2006, J. Biol. Chem, 281:23514-23524). U nekimrešenjima, bilo koje antitelo ili antigenski vezujući fragment koji su ovde otkriveni sadrže trostruke mutacije (skraćeno ovde kao "TM") u Fc regionu koji odgovara L234F/L235E/P331S mutaciji koja je opisana u Oganesyan et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, (2008) 64: 700-704. U rešenju antitelo ili antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska može biti IgG1 TM antitelo ili njegov antigenski vezujući frgament. U drugom rešenju antitelo ili njgeov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska može sadržati Fc region koji ima YTE mutacije.
[0072] U drugom rešenju antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, predmetnog pronalaska može biti kuplovano za krvno moždanu barijeru (blood-brain barrier (BBB))
1
transportnog ostatka, pri čemu BBB transportni ostatak je sposoban da transportuje antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, duž BBB.
[0073] U rešenju BBB transportni ostatak može biti antitelo. U rešenju BBB antitelo može obrazovati multispecifičnu konstrukciju sa anti-a-sinkuklein antitelom ili njegovim antigenskim vezujućim frgamentom. BBB transportni ostatak može sadržati imunoglobulinski varijabilni teški lanac komplementarnog određenog regiona -1 (VH-CDR1), imunoglobulinski varijabilni teški lanac komplementarnog određenog regiona -2 (VH-CDR2), imunoglobulinski varijabilni teški lanac komplementarnog određenog regiona -3 (VH-CDR3), imunoglobulinski varijabilni laki lanac komplementarnog određenog regiona -1 (VL-CDR1), imunoglobulinski varijabilni laki lanac komplementarnog određenog regiona -2 (VLCDR2), i imunoglobulinski varijabilni laki lanac komplementarnog određenog regiona -3 (VL-CDR3); pri čemu VHCDR1 sadrži SEQ ID NO.40 ili 49, VH-CDR2 sadrži SEQ ID NO.41 ili 50, VH-CDR3 sadrži SEQ ID NO.42 ili 51, VL-CDR1 sadrži SEQ ID NO.36, 44 ili 53, VL-CDR2 sadrži SEQ ID NO.37, 45 ili 54 i VL-CDR3 sadrži SEQ ID NO.38, 46 ili 55.
[0074] U nekim rešenjima, transportni ostatak sadrži imunoglobulinski varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži SEQ ID NO: 47 iliSEQ ID NO: 39. U nekim rešenjima, transportni ostatak sadrži imunoglobulinski varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži SEQ ID NO: 43.
[0075] Dodatno, transportni ostatak može biti odabran između kompletnog antitela, Fv fragmenta, Fab fragmenta, Fab’ fragmenta, F(ab’)2 fragmenta, disulfidno vezanog (dsFv) fragmenta, pojedinačnog lančanog Fv (scFV) fragmenta, sc(Fv)2 fragmenta, diatela, triatela, tetratela, minitela, i pojedinačnog lančanog antitela. U određenom rešenju, transportni ostatak sadrži scFV fragment koji sadrži VH domen i VL domen spojeni zajedno preko veze. U nekim slučajevima, veza može biti (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 56), pri čemu n je pozitivni ceo broj odabran između grupe koja se sastoji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10..
[0076] U nekim rešenjima, bilo koji transportni molekul predmetnog pronalaska se može kombinovati kao što je ovde opisano sa bilo kojim alfa-sinuklein vezujućim molekulom predmetnog pronalaska da bi se obezbedio multispecifičan vezujući molekul predmetnog pronalaska.
1
[0077] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska kao što je definisano bilo gde gore, za upotrebu kao lek.
[0078] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska kao što je definisano bilo gde gore u prevenciji ili lečenju Į-sinukleinopatije.
[0079] U jednom rešenju, Į-sinukleinopatija je odabrana između Parkinsonove bolesti (PD), demencije sa Levijevim telom (DLB), i višestruka sistemska atrofija (MSA).
[0080] U jednom rešenju, Į-sinukleinopatija je Parkinsonova bolest (PD).
[0081] Predmetni pronalazak obezbeđuje metod lečenja ili prevencije bolesti, posebno bolesti povezane sa centralnim nervnim sistemom, kod pacijenta, postupak koji se sastoji od davanja pacijentu antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska kako je definisano bilo gde gore.
[0082] U jednom rešenju, oboljenje je Į-sinukleinopatija.
[0083] U jednom rešenju, Į-sinukleinopatija je odabrana između Parkinsonove bolesti (PD), demencije sa Levijevim telom (DLB), i višestruka sistemska atrofija (MSA).
[0084] U jednom rešenju, Į-sinukleinopatija je Parkinsonova bolest (PD).
[0085] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska kao što je definisano bilo gde gore, i farmaceutski prihvatljivi ekscipijens.
[0086] Fraza " farmaceutski prihvatljivi ekscipijens " uključuje sve rastvarače, disperzione medije, obloge, antibakterijske agense i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, koji su kompatibilni sa farmaceutskom primenom. Upotreba takvih medija i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Kompozicije mogu takođe da sadrže druga aktivna jedinjenja koja obezbeđuju dopunske, dodatne, ili
1
poboljšane terapeutske funkcije. Farmaceutske kompozicije takođe mogu biti uključene u posudu, pakovanje, ili dozator zajedno sa uputstvima za primenu.
[0087] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska je formulisana tako da bude kompatibilna sa nameravanim načinom primene. Metode za postizanje primene su poznate prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Primena može, na primer, biti intravenska, intraperitonealna, intramuskularna, intrakavitetna, potkožna ili transdermalna.
[0088] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska kao što je definisano bilo gde gore.
[0089] U određenom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 13 i/ili SEQ ID NO: 18.
[0090] U drugom određenom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 23 i/ili SEQ ID NO: 29.
[0091] Jednom kada se dobije ova informacija, stručnjak u ovoj oblasti može lako da dobije molekule nukleinske kiseline koji kodiraju otkrivena antitela ili njihove antigenske vezujuće fragmente. Nukleinske kiseline mogu da sadrže DNK ili RNK i mogu biti u potpunosti ili delimično sintetičke ili rekombinantne. Pozivanje na nukleotidnu sekvencu obuhvata molekul DNK sa navedenom sekvencom i obuhvata molekul RNK sa navedenom sekvencom u kojoj je U zamenjeno za T, osim ako kontekst ne zahteva drugačije.
[0092] Molekuli nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska sadrže kodirajuću sekvencu za CDR, VH domen i/ili VL domen koji je ovde otkriven.
[0093] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje konstrukte u obliku plazmida, vektora, fagemida, transkripcionih ili ekspresionih kaseta koje sadrže najmanje jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska kao što je definisano bilo gde gore, posebno koji kodira CDR, VH domen i/ili VL domena koji je ovde otkriven.
1
[0094] Pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više konstruktora kao što je gore.
[0095] Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju ili više CDR (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, LCDR2, ili L-CDR3), VH ili VL domen koji je otkriven ovde, kao i metode dobijanja kodiranih proizvoda. Metodf obuhvata ekspresovanje kodiranog proizvoda iz kodirane nukleinske kiseline. Ekspresija se može postići kultivisanjem pod određenim uslovima rekombinantnih ćelija domaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu. Prateći proizvodnju sa ekspresijom VH ili VL domena, ili specifično vezivanje člana može biti izolovano i/ili prečišćeno korišćenjem bilo koje pogodne tehnike, a zatim korišćen prema potrebi.
[0096] Antigenski vezujući fragmetni, VH i/ili VL domeni i kodirajući molekuli nukleinske kiseline i vektori mogu biti izolovani i/ili prečišćeni iz svog prirodnog okruženja, u suštinski čistom ili homogenom obliku, ili, u slučaju nukleinske kiseline, slobodne ili u suštini slobodne nukleinske kiseline ili geni porekla koji nisu sekvenca koja kodiraju polipeptid sa traženom funkcijom.
[0097] Sistemi za kloniranje i ekspresiju polipeptida u nizu različitih ćelija domaćina su dobro poznati u tehnici. Za ćelije pogodne za proizvodnju antitela, videti Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999. Ukratko, pogodne ćelije domaćina uključuju bakterije, biljne ćelije, ćelije sisara i sisteme kvasca i bakulovirusa. ûelijske linije sisara dostupne u tehnici za ekspresiju heterolognog polipeptida uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka, HeLa ćelije, ćelije bubrega beba hrčaka, ćelije mijeloma NS0 miša i mnoge druge. Uobičajeni bakterijski domaćin je E. coli. Bilo koji sistem ekspresije proteina kompatibilan sa ovim pronalaskom se može koristiti za proizvodnju otkrivenih antitela. Pogodni sistemi ekspresije uključuju transgene životinje opisane u Gene Expression Systems, Academic Press, eds.
Fernandez et al., 1999.
[0098] Pogodni vektori mogu biti odabrani ili konstruisani tako da sadrže odgovarajuće regulatorne sekvence, uključujući sekvence promotera, sekvence terminatora, sekvence poliadenilacije, sekvence pojačivača, markerske gene i druge sekvence prema potrebi. Vektori mogu biti plazmidi ili virusni, npr., fag ili fagemid, prema potrebi. Za više detalja pogledati, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Mnoge poznate tehnike i protokoli za manipulaciju nukleinskom kiselinom, na primer, u pripremi konstrukta nukleinske kiseline, mutagenezi, sekvenciranju,
1
uvođenju DNK u ćelije i ekspresiji gena, kao i analizi proteina, detaljno su opisani u Current Protocols in Molecular Biology, 2nd Edition, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992.
[0099] Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu kako je ovde otkriveno, posebno vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz ovog pronalaska kako je definisano bilo gde iznad.
[0100] Još dalji aspekt obezbeđuje postupak koji obuhvata uvođenje takve nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Uvođenje može koristiti bilo koju dostupnu tehniku. Za eukariotske ćelije, pogodne tehnike mogu uključiti transfekciju kalcijum fosfatom, DEAE-dekstran, elektroporaciju, transfekciju posredovanu lipozomima i transdukciju korišćenjem retrovirusa ili drugog virusa, npr., vakcina ili, za ćelije insekata, bakulovirusa. Za bakterijske ćelije, pogodne tehnike mogu uključivati transformaciju kalcijum hlorida, elektroporaciju i transfekciju korišćenjem bakteriofaga. Uvođenje nukleinske kiseline u ćelije može biti praćeno izazivanjem ili omogućavanjem ekspresije iz nukleinske kiseline, npr., kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima za ekspresiju gena.
KRATAK OPIS SLIKA I LISTA SEKVENCE
[0101] Predmetni pronalazak će sada biti detaljnije opisano sa pozivanjem na priložene Slike i listu sekvenci, u kojima su prikazane:
Osnova za SEQ ID NOs:
2
Naslovi Slika:
[0102]
Tabela 1: Određivanje afiniteta osnovnih anti-Į-sinuklein antitela za humani Į-sin izveden na dve platforme za merenje afiniteta.
Slika 1: Šema HTRF® analize.
Slika 2: Poređenje amino kiselinskih sekvenci asyn0087, aslo0452ngl-3 i aslo0543 verijabilnog regiona teškog lanca (VH) (SEQ ID NOs: 2, 14 i 24, respektivno) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) (SEQ ID NOs: 3, 19, i 30, respektivno). Podvučene amino kiseline odgovaraju CDRs.
Slike 3A-3D: Nukleotidna i Amino Kiselinska Sekvenca aslo0452 ngl-3. Slike 3A i 3B prikazuju nukleotidne i amino kiselinske sekvence varijabilnog teškog lanca i verijabilnog lakog lanca, respektivno, aslo0452 ngl-3. Slika 3A prikazuje SEQ ID Nos: 13 i 14, respektivno, prema redosledu pojavljivanja. Slika 3B prikazuje SEQ ID Nos: 18 i 19, respektivno, prema redosledu pojavljivanja. Slike 3C i 3D pokazuju poravnanje ovih sekvenci sa najbližim sekvencama humane germlinije. Slika 3C prikazuje poravnjanje aslo0452 ngl-3 amino kiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca (SEQ ID NO: 14) za germliniju IGHV3-23 (SEQ ID NO: 58) i JH6 sekvence (SEQ ID NO: 59). Slika 3D prikazuje poravnanje aslo0452 ngl-3 amino kiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca (SEQ ID NO: 19) za germliniju IGLV5-45 (SEQ ID NO: 60) i JL2 (SEQ ID NO: 61), 3 sekvence. Komplementarno određujući regioni (CDRs) su podvučeni i označeni. Razlike u germlinijama su istaknute bold i podvučene. Svi ne-Vernierni ostaci u okvirnim regionima lakog lanca su amino kiseline humane germlinije. Vernierni ostaci (*) nisu promenjeni da odgovaraju amino kisleinama germlinije.
Slike 4A i 4B: Vezivanje epitopa vodećih klonova izolata korišćenjem panela od Į-sin skraćenih delova. ELISA bunarčLći su prekriveni sa nizom komercijalno dostupnih skraćenih Į-sin koji predstavljaju različite definisane regione proteina: 1-140: puna dužina Į-syn, 1-60: N-terminalni region samo, 61-140: ne-amiloidna komponenta plakova (NAC) plus C-terminalni region, 1-95: N-terminalni i NAC regioni, 96-140: C-terminalni region samo, ǻNAC: NAC region izbrisani, NCAP: je alternativno spojeni oblik Į-sin nedostajećih amino kiselina 103-129 (rPeptid). Primarna antitela korišćena za detekciju su bila (Slika 4A) Asyn087; i (Slika 4B) Aslo0452 ngl-3 (crna šipka), aslo0543 (svetlo siva šipka) i NIP228 izotip usklađena kontroli (tamno siva šipka). Vezivanje se detektuje bilo sa anti-human IgG Eu3+sekundarno antitelo (Slika 4A) ili anti-human IgG-HRP sekundarno antitelo (Slika 4B).
Slika 5: Specifičnost aslo0452 ngl-3 i aslo0543 za Į-sin U odnosu na članove porodice Sinuklein koji koriste DELFIA Epitopnu Kompetitivnu analizu. Koristeći epitopnu kompetitvnu HTRF analizu, specifičnost afiniteta optimizovanih aslo0452 ngl-3 i aslo0543 klonova za Į-sin je određena sa titracijom neoznačenog Į-syn, ȕ-syn i Ȗ-syn. Iz ovoga su određene vrednosti IC50.
Slika 6: Specifičnost aslo0452 ngl-3 i aslo0543 za humano, cinomolgus majmunsko i pacovsko Į-sinusovanje HTRF Epitop Kompetitivna analiza. Koristeći HTRF analizu konkurencije epitopa, profil unakrsne reaktivnosti vrsta klonova optimizovanih afinitetom određen je u sličnoj analizi sa titracijom neoznačenog Į-sin i izvođenje IC50vrednosti za svaku vrstu Į-sin.
Slike 7A i 7B: Reprezentativni rezultati protočne citometrije koji pokazuju da se klonovi optimizovani za afinitet vezuju za nativni humani Į-sin u ćelijskoj liniji humanog neuroblastoma.
Paneli A, C, E i G na Slikama 7A i 7B pokazuju vezivanje za Į-sin negativnu ćelijsku liniju humanog raka dojke, BT20. Paneli B, D, F i H na Slikama 7A i 7B pokazuju vezivanje za Į-sin pozitivnu ćelijsku liniju humanog neuroblastoma, SHSY5Y. Slika 7A: Primarna humana antitela korišćena u ovoj studiji bila su asin0087 i Hu IgG kontrola. Vezivanje humanih antitela je otkriveno korišćenjem sekundarnog anti-humanog IgG-FITC (Jackson). Slika 7B: Primarna humana antitela korišćena u ovoj studiji bila su aslo0452 ngl-3, aslo0543, i kontrola izotipa NIP228 IgG1 TM. Vezivanje humanih antitela je otkriveno korišćenjem sekundarnog antihumanog IgG-FITC (Jackson). Primarna mišja antitela koja su korišćena su 4D6 (Covance) i negativna kontrola podudarna izotipa (R&D Sistems). Vezivanje mišjeg antitela je otkriveno korišćenjem sekundarnog anti-mišjeg IgG-FITC (Sigma).
Slika 8: Specifičnost optimizovanog anti-Į-sin IgGs za agrerirani humani Į-syn sa DELFIA ELISA. Grafikon pokazuje da su aslo0452 ngl-3 i aslo0543, dva klona specifična za Į-sin visokog afiniteta, i olovno antitelo asin0087 otkrili uhvaćene agregirane oblike Į-sin (crne šipke), ali nisu otkrili uhvaćeni monomer Į-syn.
Slikas 9A-9C: Specifičnost klonova optimizovanih prema afinitetu u tkivima relevantnim za bolest imunohistohemijom. Slike 9A, 9B i 9C pokazuju bojenje sa aslo0452 ngl-3, asin0087 i aslo0543, respektivno. Paneli A, B i C pokazuju aslo0452 ngl-3 bojenje oba Levijeva tela (paneli A i B) i Levijevih neurita (panel C) supstancije nigre u PD moždanom tkivu. Panel D prikazuje aslo0452 ngl-3 pokazuje nizak nivo bojenja Į-sin u ćelijama iz temporalnog korteksa u normalnom delu mozga. Paneli E, F i G pokazuju aslo0452 ngl-3 bojenje Levijevih tela,
2
Levijevih neurita i Levijevih tačaka amigdale u PD moždanom tkivu. Panel H prikazuje kontrolno antitelo usklađeno sa izotipom koje ne pokazuje bojenje u amigdali u moždanom tkivu PD. Paneli I do M pokazuju asin0087 bojenje Locus Coeruleusa u PD moždanom tkivu; identifikovane patološke karakteristike su Levijeva tela (Panel I i L), neuronski agregati (Panel J), Levijevi neuriti (Panel K) i Bleda tela (Panel M). Paneli N i O pokazuju aslo0543 bojenje Levijevih tela i Levijevih neurita u supstanciji nigra u PD moždanom tkivu. Panel P prikazuje aslo0543 nizak nivo bojenja Į-sin u ćelijama iz temporalnog korteksa u normalnom delu mozga.
Slike 10A i 10B: Sistemska primena aslo0452 ngl-3 brzo snižava nivoe slobodnog asina u prefrontalnom korteksu pacova. Srednja vrednost ± SEM apsolutne (Slika 10A) ili relativne (Slika 10B) slobodne Į-sinuklein koncentracije u ISF aslo0452 ngl-3 (30 mg/kg intravenozno; zatvoreni simboli) ili nosač (otvoreni simboli) tretiranih pacova.
Slike 11A i 11B: Aslo0452 ngl-3 u zavisnosti od doze i vremena, snižava nivoe slobodnog asina u CSF pacova nakon sistemske primene. Srednja vrednost ± SEM apsolutne (Slika 11A) ili relativne (Slika 11B) slobodneĮ-sinuklein koncentracije u CSF aslo0452 ngl-3 (3, 10, 30, 100 mg/kg intravenozno; zatvoreni simboli) ili nosač (otvoreni simboli) tretiranih pacova.
Slike 12A-12C: nti-alfa-sinuklein antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0452 ngl-3-D265A blokiraju ip silateralno-kontralateralno širenje alfa-sinukleina. (Slika 12A): ne-tg miševi ubrizgani sa LV-Į-sin u desni hipokampus (crne strelice) pasivno su imunizovani nedeljnim dozama anti-alfasinuklein mišjih IgG1 antitela: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D245A, ili sa 9E Kontrolno antitelo izotipa NIP228, tokom 13 nedelja, nakon čega je usledilo određivanje širenja alfa-sinukleina imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. (Slika 12B): Kvantifikacija podataka o imunoreaktivnosti alfa-sinukleina dobijenih imunocitohemijskom analizom ipsilateralnih hipokampalnih koronalnih preseka predstavljenih u A. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelom (n=10 miševa po grupi tretiranoj antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom. (Slika 12C): Kvantifikacija podataka o imunoreaktivnosti alfa-sinukleina dobijenih imunocitohemijskom analizom kontralateralnih koronalnih preseka hipokampusa predstavljenih na panelu A. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretiranoj antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; Jednosmerna ANOVA sa Dunettovim posttestom.
Slike 13A-13C: Anti-alfa-sinuklein antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0452 ngl-3-D265A smanjuju taloženje i diseminaciju lentivirusno izraženog alfa-sinukleina duž aksona. (Slika 13A): ne-tg miševi ubrizgani sa LV-Į-sin u desni hipokampus su pasivno imunizovani nedeljnim dozama anti-alfasinuklein mišjih IgG1 antitela: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4, ili sa zao tipom antitela NIP2213 nedelja, nakon čega sledi imunocitohemijska analiza depozita alfa-sinukleina duž ipsilateralnih i kontralateralnih trans-hipokampalnih aksona (crne strelice). (Slika 13B): Kvantifikacija ipsilateralnih aksonalnih depozita alfa-sinukleina utvrđenih imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretiranih antitelima). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom. (Slika 13C): Kvantifikacija kontralateralnih aksonalnih depozita alfa-sinukleina utvrđenih imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretmana antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; Jednosmerna ANOVA sa Dunettovim post-testom.
Slike 14A-14C: Anti-alfa-sinuklein antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0452 ngl-3-D265A smanjuju taloženje alfa-sinukleina u CA1 hipokampalnim neuronima i neokortikalnim neuronima sloja 5. (Slika 14A): Netg miševi ubrizgani sa LV-Į-sin u desni hipokampus pasivno su imunizovani nedeljnim dozama antialfa-sinukleinskih mišjih IgG1 antitela: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4, ili sa zao tipom NIP328 kontrolne nedelje , nakon čega je usledila imunocitohemijska analiza depozita alfa-sinukleina u ipsilateralnim CA1 hipokampalnim neuronima i neokortikalnim neuronima ipsilateralnog sloja 5 (crne strelice). (Slika 14B):
Kvantifikacija depozita alfa-sinukleina u neokortikalnim neuronima ipsilateralnog sloja 5 određena imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Prikazani podaci predstavljaju broj alfa-sinuklein pozitivnih ćelija (neurona) na 0.1 sq mm. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretmana antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom. (Slika 14C): Kvantifikacija depozita alfa-sinukleina u ipsilateralnim CA1 hipokampalnim neuronima utvrđena imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Prikazani podaci predstavljaju broj alfa-sinuklein pozitivnih ćelija (neurona) na 0.1 sq mm. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretmana antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; Jednosmerna ANOVA sa Dunettovim post-testom.
2
Slike 15A-15C: aslo0452 ngl-3 i aslo0452 ngl-3-D265A antitela blokiraju širenje alfasinukleina u alfa-sinuklein transgenskim miševima. (Slika 15A): Į-sin tg miševa kojima je ubrizgan LV-Į-sin u desni hipokampus (crne strelice) pasivno su imunizovani nedeljnim dozama anti-alfa-sinuklein mišjih IgG1 antitela: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E28 ili sa kontrolom N9E28 antitela, tokom 13 nedelja, nakon čega je usledilo određivanje širenja alfasinukleina imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. (Slika 15B):
Kvantifikacija podataka o imunoreaktivnosti alfa-sinukleina dobijenih imunocitohemijskom analizom ipsilateralnih hipokampalnih koronalnih preseka predstavljenih na panelu A. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelom (n=10 miševa po grupi tretmana antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom. (Slika 15C): Kvantifikacija podataka o imunoreaktivnosti alfa-sinukleina dobijenih imunocitohemijskom analizom kontralateralnih koronalnih preseka hipokampusa predstavljenih na panelu A. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretiranoj antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; Jednosmerna ANOVA sa Dunettovim post-testom.
Slike 16A-16C: aslo0452 ngl-3 i aslo0452 ngl-3-D265A antitela smanjuju taloženje i diseminaciju lentivirusno eksprimiranog alfa-sinukleina duž aksona kod transgenih miševa. (Slika 16A): Į-syn tg miševi ubrizgani sa LV-Į-sin u desni hipokampus pasivno su imunizovani nedeljnim dozama anti-alfa-sinuklein mišjih IgG1 antitela: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4 ili sa NIP1 kontrolnim antitelom, tokom 13 nedelja, praćeno sa imunocitohemijskom analizom depozita alfa-sinukleina duž ipsilateralnih i kontralateralnih transhipokampalnih aksona (crne strelice). (Slika 16B): Kvantifikacija ipsilateralnih aksonalnih depozita alfa-sinukleina utvrđenih imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretmana antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom. (Slika 16C): Kvantifikacija kontralateralnih aksonalnih depozita alfasinukleina utvrđenih imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretmana antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; Jednosmerna ANOVA sa Dunettovim posttestom.
Slike 17A-17D: aslo0452 ngl-3 i aslo0452 ngl-3-D265A antitela smanjuju taloženje alfasinukleina u neuronima hipokampusa CA1 i neokortikalnim neuronima sloja 5 kod
2
transgenih miševa alfa-sinukleina. (Slika 17A): Į-sin tg miševa ubrizgan sa LV-Į-sin u desni hipokampus su pasivno imunizovani nedeljnim dozama anti-alfa-sinuklein mišjih IgG1 antitela: aslo0452 ngl-3, aslo0452 ngl-3 D265A, 9E4 ili sa NIP228 kontrolnim antitelom izotipa, tokom 13 nedelja, praćeno sa imunohemijskom analizom depozita alfa-sinukleina u ipsilateralnim CA1 hipokampalnim neuronima i neokortikalnim neuronima ipsilateralnog sloja 5 (crne strelice). (Slika 17B): Kvantifikacija depozita alfa-sinukleina u neokortikalnim neuronima ipsilateralnog sloja 5 određena imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Prikazani podaci predstavljaju broj alfa-sinuklein pozitivnih ćelija (neurona) na 0.1 sq mm. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretmana antitelom). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom. (Slika 17C): Kvantifikacija depozita alfa-sinukleina u ipsilateralnim CA1 hipokampalnim neuronima utvrđena imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Prikazani podaci predstavljaju broj alfa-sinuklein pozitivnih ćelija (neurona) na 0.1 sq mm. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretiranih antitelima). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom. (Slika 17D): Kvantifikacija depozita alfa-sinukleina u kontralateralnim CA1 hipokampalnim neuronima određena imunocitohemijom sa SYN-1 i automatizovanom analizom slike. Prikazani podaci predstavljaju broj alfa-sinuklein pozitivnih ćelija (neurona) na 0.1 sq mm. Svaka kolona je srednja vrednost ± SEM za 10 nezavisnih tretmana antitelima (n=10 miševa po grupi tretmana antitelima). *P < 0.05 u odnosu na NIP228; 1-way ANOVA sa Dunettovim post-testom.
Slika 18 Epitopska konkurencija aslo452-ngl3-hlgG1TM sa BBBt0626gl-ScFv-Bs2-also0452-ngl-3-hlgG1TM pokazuje u HTRF testu da inkorporacija BBB dela ne menja specifičnost vezivanja aslo452-ngl3-hlgG1TM. Anti-alfa-sinukleinsko antitelo obeleženo Dylight650, aslo0452hgl3-hlgG1TM se vezuje za biotinilovani alfa sinuklein koji je zauzvrat vezan za streptavidin obeležen cirptatom. Nakon ekscitacije cirptata dolazi do prenosa energije (FRET) i kada je u prisustvu dylight650 označenog kao aslo0452hgl3-hlgG1TM, dylight650 se pobuđuje i rezultira fluorescenom. Ako je prisutan konkurentski IgG, vezivanje dylight650 označenog aslo0452 je blokirano i ekscitacija dylight650 označenog aslo0452 je sprečena, što dovodi do smanjenja fluorescentnog signala. Neoznačeni aslo0452 i Bbbt0626-Bs2-also0452 hlgG1TM, oba mogu da se takmiče na sličan način sa dylight650 označenim aslo0452-ngl3-hlgG1TM.
2
Slika 19 Vezivanje endotelnih ćelija mozga miša BBBt0626gl-BS2-aslo452-ngl-3-hlgG1TM pokazuje efektivno ciljano angažovanje BBB grupe kada je spojeno sa aslo452-ngl3-hlgG1TM. FMAT (Tehnologija fluorescentnog mikrovolumnog testa) ili tehnologije ogleda sa kuglicom su korišćene za određivanje specifičnog vezivanja antitela za endotelne ćelije mozga. Ovaj test meri vezivanje humanih IgG za endotelne ćelije mozga miša (b.End3). B.End3 ćelije na sličan način vezuju Bbbt0626 hlgG1TM, Bbbt0626glscFv-Bs2-aslo0452-hlgG1TM i Bbbt0626glscFv-Bs2-NIP228 hlgG1TM, ali ne i kontrolno antitelo hIg28TM. Ovo vezivanje se detektuje mišjim anti-Fc mAb (specifičnim za ljude) koje se zauzvrat detektuje sa Alekafluor647 označenim kozjim antimišem Fc.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0103] Predmetni pronalazak je zasnivan na iznenađujućem i neočekivanom otkriću antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543. Ovo otkriće je dovelo do nove grupe antitela sa karakteristikama koje dele antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543, kao i podgrupe antitela sa karakteristikama aslo0452 ngl-3 i aslo0543, respektivno.
[0104] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska potiče od antitela asin0087 koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 i varijabilni region lakog lanca (VL) amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 3, kao što je ovde otkriveno.
[0105] U određenom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska potiče od antitela asin0087, gde pomenuto antitelo ili antigenski vezujući fragment ima KDmanji od 500 nM i vezuje isti epitop kao bilo koje od antitela asyn0087, aslo0452ngl-3 i aslo054, ovde opisano.
[0106] Kao i asyn0087, antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 vezuju C-terminalni region (ostaci 96-140) humanog Į-sinukleina. Tačnije, aslo0452 ngl-3 i aslo0543 antitela ili njihov antigenski vezujući fragment vezuju region koji se sastoji između oko amino kiseline 102 i oko amino kiseline 130 humanog Į-sinukleina (npr., SEQ ID NO: 1). U nekim rešenjima, bilo koje od antitela ili antigenskih vezujućih fragmenata koji su ovde otkriveni vezuju region koji se sastoji između oko amino kiselina 120 i oko 130 of humanog Į-sinukleina (npr., SEQ ID NO: 1). U
2
nekim rešenjima, bilo koji od antitela ili antigenskih vezujućih fragmenata koji su ovde otkriveni vezuju epitop koji nije isti epitop kao epitop vezan za 9E4 antitelo.
[0107] Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 su selektivna za Į-sinuklein. Antitelo ili njegov anitgenski vezujući fragment se ne vezuje za druge članove porodice sinukleina kao što su ȕsinuklein ili Ȗ-sinuklein. Tačnije, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen je specifičan za humani Į-sinuklein.
[0108] Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 se vezuju za alfa-sinuklein čoveka, pacova ili cinomolgusa. Sposobnost aslo0452 ngl-3 i aslo0543 da se vežu za alfa-sinuklein čoveka, majmuna cinomolgus i pacova ukazuje na vezivanje za drugačiji epitop na humanom alfasinukleinu u poređenju sa antitelima koja se ne vezuju alfa-sinuklein čoveka, majmuna cinomolgus i pacova. Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 su stoga sposobna da se koriste za in vivo procenu bezbednosti i istraživanje na modelima bolesti kod cinomolgus majmuna i pacova.
[0109] Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 se vezuju za humani Į-sinuklein sa visokim afinitetom. Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 se vezuju za alfa-sinuklein sa KDmanjim od 500 pikomolara (pM), manjim od 400 pM, manjim od 300 pM, manjim od 150 pM, manjim od 120 pM, manjim od 115 pM, manje od 110 pM ili 106 pM ili manje kao što je izmereno na primer korišćenjem oktet analize (videti, npr. Primer 9). Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 se vezuju za alfa-sinuklein sa KDmanjim od 300 pikomolara (pM), manjim od 250 pM, manjim od 200 pM, manjim od 150 pM, manjim od 120 pM, manjim od 110 pM ili 108 pM, manje od 100 pM, manje od 80 pM ili 74 pM ili manje kao što je mereno na primer korišćenjem KinExA analize (za referentni KinExA protokol analize, pogledati, npr., Primer 9).
[0110] Aslo0452 ngl-3 Fab fragment se vezuje za humani Į-sinuklein sa visokim afinitetom. Fragment aslo0452 ngl-3 Fab vezuje se za alfa-sinuklein sa KDmanjim od 300 pikomolara (pM), manjim od 200 pM, manjim od 180 pM, 174 pM ili manje kao što je mereno na primer korišćenjem KinExA analize (videti, npr., Primer 9.3).
[0111] Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 se vezuju za nativni endogeni humani Į-sinuklein. Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 vezuju se za agregate humanog Į-sinukleina. Konkretno, antitela se stoga vezuju za epitop koji nije potreban za agregaciju. Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 su sposobna da sekvestriraju i monomerne i agregirane oblike alfa-sinukleina. Antitelo
2
ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog otkrića su sposobni da vežu monomerne i agregirane oblike alfa-sinukleina.
[0112] Antitela aslo0452 ngl-3 i aslo0543 vezuju za bolest relevantne, patološke oblike Į-sinukleina, npr., Levijeva tela, Levijevi neuriti, Levijeve tačke u moždanim tkivima Parkinsonove bolesti. Minimalno bojenje se primećuje u normalnom (nebolesnom) mozgu.
[0113] Aslo0452 ngl-3 antitelo smanjuje nivoe Į-sinukleina u moždanoj intersticijskoj tečnosti. Konkretno, antitelo aslo0452 ngl-3 smanjuje nivo slobodnog nevezanog Į-sinukleina u intersticijskoj tečnosti mozga.
[0114] Aslo0452 ngl-3 antitelo smanjuje nivoe Į-sinukleina u cerebrospinalnoj tečnosti.
Konkretno, antitelo aslo0452 ngl-3 smanjuje nivoe slobodnog nevezanog Į-sinukleina u cerebrospinalnoj tečnosti. Aslo0452 ngl-3 antitelo smanjuje širenje Į-sinukleina in vivo. Ova nova funkcija inhibicije širenja alfa-sinukleina ukazuje na vezivanje za drugačiji epitop na humanom alfa-sinukleinu u poređenju sa antitelima koja ne inhibiraju širenje.
[0115] U nekim rešenjima, bilo koje od antitela ili njihovih antigenskih vezujućih fragmenata koji su ovde otkriveni imaju bilo koje ili više funkcionalnih svojstava aslo0452 ngl-3, npr., bilo koje od ovde navedenih funkcionalnih osobina aslo0452 ngl-3. U nekim rešenjima, bilo koje od antitela ili njihovih fragmenata koji se vezuju za antigen koji su ovde otkriveni imaju jedno ili više funkcionalnih svojstava aslo0543, npr., bilo koje od ovde navedenih funkcionalnih svojstava aslo0543.
[0116] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska se takmiči sa antitelom aslo0452 ngl-3 i/ili aslo0543 za vezivanje za humani Į-sinuklein. U drugom aspektu, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska vezuje se za isti epitop na humanom Į-sinukleinu kao antitelo aslo0452 ngl-3 i/ili aslo0543.
[0117] Može se lako odrediti da li se antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment vezuje za epitop referentnog antitela ili fragment koji se vezuje za antigen kao što je gore definisano. Takve metode su stvar rutine u tehnici. Na primer, jedno antitelo se može uporediti sa drugim biohemijskim testom konkurencije pri čemu se dva antitela (jedno obeleženo za detekciju a jedno ne) inkubiraju istovremeno sa datim antigenom. Ako se postigne signal vezivanja za obeleženo antitelo, onda se kaže da ta dva antitela prepoznaju različite epitope koji se ne preklapaju na proteinu od interesa. Ako se ne dobije signal vezivanja, onda bi, obrnuto, oni bili okarakterisani kao da imaju preklapajuće epitope na proteinskoj sekvenci jer vezivanje jednog antitela sterički ometa vezivanje drugog antitela. Dalje, amino kiselinska lokacija datog epitopa se takođe može identifikovati korišćenjem modifikovanih proteina kao što su skraćeni proteini, linearne peptidne sekvence izvedene iz primarne amino sekvence antigena, ortolozi vrste i proteolitičkom digestijom i analizom masenih specifikacija antitela vezanog za dato protein. Ove metodologije služe za stvaranje regiona interakcije između antitela i antigena.
[0118] Dodatni rutinski eksperimenti (kao što su peptidne mutacije i analize vezivanja) se mogu sprovesti da bi se potvrdilo da li je bilo koji uočeni nedostatak vezivanja u stvari posledica vezivanja epitopa predmetnog pronalaska ili je neki drugi fenomen (kao što je sterična prepreka) odgovoran. Takvi eksperimenti se mogu izvesti pomoću ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili drugih poznatih testova vezivanja antitela.
[0119] Na primer, za fino mapiranje specifičnog epitopa, matematički modeli interfejsa epitop:paratop mogu se izvesti iz podataka generisanih rešavanjem strukture kompleksa antigen:antitelo korišćenjem metode snimanja slike visoke rezolucije kao što je istovremena kristalizacija sa rendgenskim zracima difrakcija. Da bi se potvrdila relevantnost dobijenog matematičkog modela, u smislu identifikacije ključnih kontaktnih ostataka koji definišu epitop, mora se naknadno izvršiti tačkasta mutageneza antigena i utvrditi uticaj na jačinu vezivanja između antigena i antitela izazvanog takvim mutacijama. Korišćenjem ove kombinacije metoda može se uspostaviti tačna mapa ključnih kontaktnih ostataka koji sadrže epitop.
[0120] Antitela ili njihovi antigenski vezujući fragmenti koji se vezuju za epitop antitela ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku se mogu generisati proizvodnjom varijanti antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema predmetnom pronalasku. Takva varijanta antitela ili njihovih antigenskih vezujućih fragmenata mogu imati CDRs koji dele visok nivo identičnosti sa CDRs antitela ili njegovih antigenskih vezujućih fragmenata iz predmetnog pronalaska. Na primer, u nekim rešenjima, bilo koji od CDRs otkrivenih ovde bilo kojih antitela ili antigenskih vezujućih fragmenata koji su ovde otkriveni može se razlikovati za 1 ili 2 amino kiselinska ostatka u poređenju sa bilo kojom ili više specifičnih CDR sekvenci koje se ovde pominju (na primer, bilo koji jedan ili više CDRs koji
1
imaju SEQ ID NOs: 5, 15, 16, 20, 10 i 21). Pored toga, takva antitela mogu imati jednu ili više varijacija (npr., konzervativna supstitucija amino kiselina) u okvirnim regionima.
[0121] U jednom rešenju, antitela ili njihovi antigenski vezujući fragmenti predmetnog pronalaska imaju varijacije u CDR amino kiselinskim sekvencama koji održavaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98 % i do 99% identičnosti sekvence sa CDR antitela aslo0452 ngl-3.
[0122] Konkretno, razmatraju se konzervativne supstitucije amino kiselina. Konzervativne zamene su one koje se odvijaju unutar porodice amino kiselina koje imaju povezane bočne lance. Genetski kodirane amino kiseline se generalno dele na porodice: (1) kisele: aspartat, glutamat; (2) bazične: lizin, arginin, histidin; (3) nepolarni: alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisani polarni: glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Ove porodice se mogu dalje kategorizovati: serin i treonin su alifatičnohidroksi porodica; asparagin i glutamin su porodica koja sadrži amide; alanin, valin, leucin i izoleucin su alifatska porodica; a fenilalanin, triptofan i tirozin su aromatična porodica. Dakle, uopšteno se može očekivati da izolovana zamena leucina sa izoleucinom ili valinom, aspartata sa glutamatom, treonina sa serinom, ili slična zamena amino kiseline strukturno srodnom amino kiselinom, neće imati veliki efekat na funkciju vezivanja ili svojstva rezultujućeg antitela, posebno ako zamena ne uključuje amino kiselinu unutar CDR mesta.
[0123] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment u skladu sa predmetnim pronalaskom sadrži najmanje jedan CDR izabran između:
(i) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 6,
(iii) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 7,
(iv) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 9,
(v) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 10,
(vi) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 11.
[0124] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment u skladu sa predmetnim pronalaskom sadrži najmanje jedan CDR izabran između CDRs antitela aslo0452
2
ngl-3, odn. najmanje jedan CDR izabran iz bilo koje od SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21.
[0125] U drugom rešenju, CDR3 teškog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta iz predmetnog pronalaska je CDR3 teškog lanca antitela aslo0452 ngl-3; i/ili CDR3 lakog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 lakog lanca antitela kao i 0452 ngl-3. Prema tome, u jednom aspektu, CDR3 teškog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 iz SEQ ID NO: 16 teškog lanca antitela aslo0452 ngl-3; i/ili CDR3 lakog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku je CDR3 iz SEQ ID NO: 21 lakog lanca antitela aslo0452 ngl-3.
[0126] U drugom rešenju, CDR3 teškog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska je CDR3 teški lanac antitela aslo0452 ngl-3.
[0127] U jednom rešenju, CDR3 lakog lanca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska je CDR3 lakog lanca antitela aslo0452 ngl-3.
[0128] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska ima šest CDRs antitela aslo0452 ngl-3 odn. tri teška lanca CDRs koja imaju amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16; i tri laka lanca CDRs koja imaju amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 21.
[0129] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 13 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 18.
[0130] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 13 i varijabilni laki lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 18.
[0131] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji ima varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 19.
[0132] U jednom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, sadrži (i) varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 19, i (ii) šest CDRs antitela aslo0452 ngl-3.
[0133] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19.
[0134] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment u skladu sa predmetnim pronalaskom ima šest CDRs antitela aslo0543.
[0135] Stoga, u jednom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrži:
a) tri teška lanca CDRs koja imaju sekvence:
(i) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 25,
(ii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 26; i
(iii) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 27, i
b) tri laka lanca CDRs koja imaju sekvence:
(i) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 31,
(ii) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 32; i
(iii) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 33.
4
[0136] U drugom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrži varijabilni teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 14 i varijabilni laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa sekvencom definisanom sa SEQ ID NO: 19 i dalje sadrži:
a) tri teška lanca CDRs koja imaju sekvence:
(vii) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 25,
(viii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 26; i
(ix) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 27, i
b) tri laka lanca CDRs koja imaju sekvence:
(vii) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 31,
(viii) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 32; i
(ix) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 33.
[0137] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 23 i varijabilni laki lanac koji ima nukleotidnu sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 29.
[0138] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronalaska koji sadrži varijabilni teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i varijabilni laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30.
[0139] U drugom rešenju, antitelo, ili njegov antigenski vezujući frgament, sadrži teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 22 i laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu definisanu sa SEQ ID NO: 28.
[0140] Okvirni region i CDRs ili antitelo mogu biti precizno definisani (videti, Kabat et al.
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services (1991), 91-3242, 1991; i Chothia et al. J. Mol. Biol. (1987), 196:901-917).
[0141] Manje varijacije u amino kiselinskim sekvencama antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta iz predmetnog pronalaska su obuhvaćene ovim pronalaskom, pod uslovom da varijacije u amino kiselinskoj(im) sekvenci(ama) održavaju najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, a najpoželjnije najmanje 99% identičnosti sekvence sa antitelom ili njegovim antigenskim vezujućim fragmentom iz predmetnog pronalaska kao što je ovde definisano. Konkretno, razmatraju se konzervativne zamene amino kiselina.
[0142] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jednolančanu amino kiselinsku sekvencu koja sadrži laki lanac antitela ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska kao što je ovde definisano. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jednolančanu amino kiselinsku sekvencu koja sadrži teški lanac antitela ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska kako je definisano bilo gde ovde.
[0143] Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se izvesti, na primer, algoritmom lokalnog poravnanja homologije Smith i Waterman (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math.2 (1981), 484), algoritmom Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. (1970), 48: 443) pretragom metode sličnosti Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci U S A (1988), 85: 2444), kompjuterskim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA - Softverski paket za analizu sekvenci Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis.53705), ili sa vizualnom inspekcijom (videti Trenutne Protokole u Molekularnoj Biologiji, F.M. Ausbel et al, eds, Current Protocols, zajedničko ulaganje između Greene Publishing Associates, In. i John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubel).
[0144] Primeri algoritama pogodnih za određivanje procenta sličnosti ili identiteta sekvenci su algoritmi BLAST i BLAST 2.0 (videti Altschul et al. J. Mol. Biol. (1990), 215(3): 403-410; i "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" Nacionalnog centra za biotehnološke informacije).
[0145] U jednom rešenju, izolovano je antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska. U drugom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska je prečišćen.
[0146] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska je monoklonalno antitelo. U drugom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska je humanizovano antitelo. U još jednom rešenju, the antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska je humano antitelo.
[0147] U jednom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska je IgA, IgD, IgE, IgM ili IgG, kao što je as IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment.
[0148] U drugom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalaska ima smanjeni afinitet vezivanja za IgG Fc receptore. Stoga antitelo ili antigenski vezujući fragment iz predmetnog pronalasku ima nizak imunogeni efekat. U jednom aspektu, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment je IgG1 TM antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment. IgG1 TM je IgG1 trostruki mutant, koji sadrži mutacije u 3 tačke (L234F/L235E/ P331S) u Fc domenu koje smanjuju afinitet vezivanja antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta za Fc-gama receptore (FcȖRs) (Oganesyan et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, (2008) 64: 700-704). U nekim rešenjima, sprečavanje širenja alfa-sinukleina putem antitela predmetnog pronalaska ne zahteva efektorske funkcije povezane sa Fc kao ključni mehanizam delovanja.
[0149] Antivezujući fragmenti obuhvataju Fab, Fv, scFv, dAb, Fd, Fab’, F(ab’)2 ili izolovani komplementarni određujući region (complementarity determining region (CDR)) koji ima dovoljno okvira za vezivanje. Fab fragment može da bude monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena. F(ab’)2 fragment može biti bivalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana sa disulfidnom vezom na regionu veze. Fc fragment se može sastojati od CH2 i CH3 domena. Fv fragment se može sastojati od VL i VH domena jednog kraka antitela. dAb fragment (Ward et al. Nature (1989), 341: 544-546) se može sastojati od VH domena. Izolovani komplementarni određujući region (CDR) koji ima dovoljan okvir za vezivanje može biti deo varijabilnog regiona koji se vezuje za antigen.
[0150] Deo koji se vezuje za antigen varijabilnog regiona lakog lanca i deo koji se vezuje za antigen varijabilnog regiona teškog lanca, na primer, dva domena Fv fragmenta, VL i VH, mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih metoda, pomoću sintetičkog linkera koji omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. Science (1988), 242(4877): 423-426; i Huston et al. Proc Natl Acad Sci U S A (1988), 85: 5879-5883). Oni se dobijaju korišćenjem uobičajenih tehnika poznati onima koji su vešti u ovoj oblasti, a delovi se testiraju na upotrebljivost na isti način kao i intaktna antitela.
[0151] Antitela ili njihovi antigenski vezujući fragmenti predmetnog pronalaska mogu imati bilo koje ili sve povoljne osobine kao što je gore definisano ili njihove kombinacije. Konkretno, antitela ili njihovi antigenski vezujući fragmenti iz predmetnog pronalaska mogu biti selektivni za alfa-sinuklein i biti u stanju da uspore ili spreče prenos sa ćelije na ćeliju i širenje alfa-sinukleina in vivo.
[0152] Funkcionalnost rezultujućeg antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta koji prema predmetnom pronalasku i posebno (i) njegovu sposobnost da veže epitop alfasinukleina; i (ii) njegova sposobnost da uspori ili spreči prenos sa ćelije na ćeliju i širenje alfasinukleina in vivo može se lako odrediti ispitivanjem njegove specifične aktivnosti korišćenjem tehnika opisanih ovde u Primerima.
[0153] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije za isporuku antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku preko krvno-moždane barijere (BBB) korišćenjem molekula transportera koji može da prođe kroz endotelne ćelije mozga dok je povezan sa navedenim antitelom ili fragmentom, npr. fuzionisan ili konjugovan sa navedenim antitelom ili fragmentom. BBB sekvence su ovde date.
[0154] Kao što je korišćeno ovde, izraz "nosivost" se koristi kao skraćenica za antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment kao što je ovde opisano, čiji transport preko BBB može biti olakšan molekulom transportera kao što je ovde dato. U određenim aspektima, "korisno opterećenje" pokriva varijabilni region teškog lanca antitela prema ovom pronalasku, tačnije varijabilni region teškog lanca also0452 ngl-3 or aslo0543.
[0155] Korisni teret može biti deo molekula transportera, na primer, kao fuzioni polipeptid, ili povezan sa polipeptidom preko disulfidnih veza ili drugih kovalentnih veza. Alternativno, korisni teret može biti povezan sa molekulom transportera na bilo koji način koji će omogućiti molekulu transportera da olakša njegov transport preko BBB, kao što je dalje opisano u nastavku. U određenim aspektima, korisni teret ostaje deo molekula transportera nakon transporta BBB i zadržava aktivnost centralnog nervnog sistema (CNS) u tom obliku. Alternativno, korisni teret može biti povezan sa molekulom transportera tokom BBB transporta, ali na način koji mu omogućava da se odvoji od molekula transportera nakon BBB transporta.
[0156] Otkrivanje dalje pruža metode za lečenje ili dijagnozu bolesti ili poremećaja CNS, posebno a-sinukleinopatije, koje obuhvataju upotrebu takvih transporternih molekula povezanih sa antitelom ili njegovim antigenskim vezujućim fragmentom iz predmetnog pronalaska.
[0157] U određenim aspektima, ovaj pronazak obezbeđuje izolovani transporter molekul koji sadrži polipeptid dobijen iz imunoglobulina. U određenim aspektima, polipeptid je mimetik ili nemimetik antitela kamile FC5, identifikovano i izolovano korišćenjem tehnologije fluorescentnog mikro-volumnog testa (FMAT) da bi se otkrilo vezivanje za mikrovaskularne endotelne ćelije mozga (BMVEC), npr., mišje B.End3 ćelije. U određenim aspektima, polipeptid dobijen iz imunoglobulina je antitelo ili njegov aktivni fragment, pri čemu „aktivan“ znači da se molekul transportera može, na primer, vezati za BMVEC kod jedne ili više vrsta, na primer, BMVEC miša, BMVEC pacova, cinomolgus majmun BMVEC, ili humani BMVEC, internalizuje se u BMVEC jedne ili više vrsta i/ili prelazi krvno-moždanu barijeru ili sam, ili povezan sa teretom.
[0158] U nekim rešenjima, BBB transporter molekul je BBB transporter molekul opisan u US Privremenoj patentnoj prijavi br.62/094,503. U određenim aspektima, molekul transportera sadrži jedan ili više Bbbt0241, Bbbt0626, Bbbt0626gl, Bbbt0632, BBBt0632gl Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0727, Bbbt0732, Bbbt0754, Bbbt0674, Bbbt0755, Bbbt0643, Bbbt0579 ili Bbbt0671 kao što je opisano u US Privremenoj patentnoj prijavi br.62/094,503.
[0159] U određenom rešenju, BBB transporter molekul je Bbbt0626 ili BBBt0632.
[0160] U određenim rešenjima, BBB transporter molekul je germlinijski, npr., Bbbt0626gl je germlinijska verzija Bbbt0626, nazvana "Bbbt0626gl".
[0161] U drugom određenom rešenju, BBB transporter molekul je BBBt0632gl ili Bbbt0626gl.
[0162] U određenim aspetcima, molekul transportera se ne vezuje za BMVEC ali je i dalje spsoban da transportuje preko BBB kao što je naznačeno u in vitro testu transcitoze.
[0163] U odnosu na molekule BBB transportera, opisane VH CDR sekvence odgovaraju klasičnim Kabat lokacijama za numerisanje, naime Kabat H-CDR1 je na pozicijama 31-35, H-CDR2 je na pozicijama 50-65, a H-CDR3 je na pozicijama 95-102. L-CDR2 i L-CDR3 takođe odgovaraju klasičnim Kabat lokacijama za numerisanje, odnosno pozicijama 50-56 i 89-97, respektivno. Kako se ovde koristi, izrazi "L-CDR1" ili "CDR1 lakog lanca" odgovaraju sekvencama koje se nalaze na Kabat pozicijama 23-34 u VL (za razliku od toga, klasična lokacija L-CDR1 prema Kabat šemi numerisanja odgovara pozicijama 24-34).
[0164] U određenim aspektima, polipeptid izveden iz imunoglobulina sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca imunoglobulina (CDR). Na primer, polipeptid dobijen iz imunoglobulina može uključivati region-1 koji određuje komplementarnost teškog lanca imunoglobulina (H-CDR1), region-2 koji određuje komplementarnost teškog lanca imunoglobulina (H-CDR2), region koji određuje komplementarnost teškog lanca imunoglobulina-3 (H-CDR3). U određenim aspektima, polipeptid izveden iz imunoglobulina može dalje da sadrži, ili alternativno, CDRs lakog lanca imunoglobulina. Na primer, polipeptid dobijen iz imunoglobulina može uključivati region-1 koji određuje komplementarnost lakog lanca imunoglobulina (L-CDR1), region-2 koji određuje komplementarnost lakog lanca imunoglobulina (L-CDR2) i komplementarnost lakog lanca imunoglobulina koji određuje komplementarnost region-3 (L-CDR3). L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3 sa sledećim amino kiselinskim sekvencama, respektivno:
(a) SEQ ID NO: 40 kao H-CDR1, SEQ ID NO: 41 kao H-CDR2, SEQ ID NO: 42 kao H-CDR3, SEQ ID NO: 36 kao LCDR1, SEQ ID NO: 37 kao L-CDR2, i SEQ ID NO: 38 kao L-CDR3, pri čemu CDRs su slični onima na Bbbt0626 i Bbbt0626gl;
(b) SEQ ID NO: 40 kao H-CDR1, SEQ ID NO: 41 kao H-CDR2, SEQ ID NO: 42 kao H-CDR3, SEQ ID NO: 44 kao LCDR1, SEQ ID NO: 45 kao L-CDR2, i SEQ ID NO: 46 kao L-CDR3, čemu CDRs su slični onima na Bbbt0626 i Bbbt062gl.
[0166] U određenim apsektima, polipeptid dobijen iz imunoglobulina sadrži H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3 sa sledećim amino kiselinskim sekvencama, respektivno:
4
(a) SEQ ID NO: 49 kao H-CDR1, SEQ ID NO: 50 kao H-CDR2, SEQ ID NO: 51 kao H-CDR3, SEQ ID NO: 53 kao LCDR1, SEQ ID NO: 54 kao L-CDR2, i SEQ ID NO: 55 kao L-CDR3, pri čemu CDRs su slični onima na Bbbt0632gl;
(b) SEQ ID NO: 49 kao H-CDR1, SEQ ID NO: 50 kao H-CDR2, SEQ ID NO: 51 kao H-CDR3, SEQ ID NO: 53 kao LCDR1, SEQ ID NO: 54 kao L-CDR2, i SEQ ID NO: 55 kao L-CDR3, čemu CDRs su slični onima na Bbbt0632gl;
[0167] U određenim alternativnim rešenjima, jedan ili više CDRs kao što su gore opisani su identični navedenim CDRs, osim za, npr., 1, 2, 3, 4, ili 5 pojedinačnih amino kiselinskih brisanja, supstitucija, ili ubacivanja.
[0168] U određenim rešenjima, molekul transportera kao što je gore navedeno može preći krvno-moždanu barijeru.
[0169] U određenim aspektima, H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3 mogu biti locirani u regionima imunoglobulina da bi proizveli antitelo VH i antitelo VL. U određenim aspektima okvirni regioni mogu biti okvirni regioni koje je izveo čovek. U određenim aspektima, antitelo VH i antitelo VL su spojeni zajedno, na primer, preko fleksibilnog peptidnog linkera, da bi se formirao scFv molekul. U određenim aspektima, VH i VL dalje obuhvataju jedan ili više konstantnih domena imunoglobulina, npr., CH1 domen, zglobni region, CH3 domen, CH3 domen, CL-kapa domen i/ili CL lambda domen. U određenim aspektima, jedan ili više konstantnih domena imunoglobulina su izvedeni iz humanog imunoglobulina, npr., humanog IgG1 imunoglobulina. U određenim aspektima, VH, VL i/ili konstantni domeni mogu sadržati mutacije koje olakšavaju, na primer, duži ili kraći poluživot, povećane ili smanjene efektorske funkcije, ili sposobnost vezivanja molekula korisnog opterećenja bilo putem fuzije peptida, disulfidne veze , ili hemijska konjugacija.
[0170] U određenim aspektima predmetnog pronalaska daju se antitela ili njihovi antigenski vezujući fragmenti prema predmetnom pronalasku povezanim sa molekulom transportera koji može da prođe kroz endotelne ćelije mozga kao što je ovde opisano.
[0171] U posebnim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku koji je povezan sa molekulom transportera koji sadrži polipeptid izveden iz imunoglobulina, gde polipeptid sadrži region varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina (VH) i region varijabilnog regiona lankog lanca imunoglobulina (VL). U određenim aspektima, polipeptid izveden iz imunoglobulina sadrži sekvence koje su ovde date, koji uključuje:
(a) VH amino kiselinsku sekevncu najmanje 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 39 i VL amino kiselinsku sekevncu najmanje 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% idenstičnosti sa SEQ ID NO: 43, gde SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 43 kodiraju VH i VL regione Bbbt0626gl,
(b) VH amino kiselinsku sekevncu najmanje 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 47 i VL amino kiselinsku sekevncu najmanje 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 43, gde SEQ ID NO: 47 i SEQ ID NO: 43 kodiraju VH i VL regione Bbbt0626,
(c) VH amino kiselinsku sekevncu najmanje 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 48 i VL amino kiselinsku sekevncu najmanje 80%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 43, gde SEQ ID NO: 48 iSEQ ID NO: 43 kodiraju VH i VL regione Bbbt0632
[0172] U određenim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku koji je povezan sa molekulom transportera koji sadrži polipeptid izveden iz imunoglobulina, gde polipeptid dobijen iz imunoglobulina sadrži VH region i VL region, gde:
(a) VH region sadrži SEQ ID NO: 34 i VL region sadrži SEQ ID NO: 35; ili
(b) VH region sadrži SEQ ID NO: 39 i VL region sadrži SEQ ID NO: 43; ili
(c) VH region sadrži SEQ ID NO: 39 i VL region sadrži SEQ ID NO: 35; ili
(d) VH region sadrži SEQ ID NO: 47 i VL region sadrži SEQ ID NO: 43; ili
(e) VH region sadrži SEQ ID NO: 47 i VL region sadrži SEQ ID NO: 35; ili
(f) VH region sadrži SEQ ID NO: 48 i VL region sadrži SEQ ID NO: 52
[0173] U drugom rešenju, VH i VL regioni molekula transportera kao što je gore opisano su kovalentno povezani da formiraju fragment jednog lanca (ScFv).
[0174] U odrđenim aspektima, molekul transportera koji je ovde dat ima aktivnost transportera, npr., može da se veže za BMVEC iz jedne ili više vrsta, npr., miš, pacov, cinomolgus majmun ili humani BMVEC, može se internalizovati u BMVEC jedne ili više vrsta, ili može preći krvnomoždanu barijeru.
[0175] U određenim aspektima, molekul transportera kao što je ovde dato sadrži polipeptid dobijen iz imunoglobulina, pri čemu polipeptid dobijen iz imunoglobulina sadrži antitelo ili njegov fragment koji može prodirati u BBB.
[0176] "Fragment koji propušta BBB" kako je ovde opisan je fragment molekula transportera koji se može specifično vezati za BMVEC jedne ili više vrsta i proći kroz BMVEC in vitro ili in vivo iz periferne vaskulature u vaskulaturu CNS. Da li je dati fragment fragment koji propušta BBB, može se testirati različitim in vitro ili in vivo testovima poznatim osobama sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti. Na primer, molekul transportera se može testirati u in vitro testu transcitoze, u in vivo testu kao što je test diureze, kao što je opisano u US 62/094,503. Drugi testovi koji bi mogli da se koriste za merenje in vivo isporuke tereta preko BBB uključuju, bez ograničenja, hroničnu povredu stezanja (CCI); model pošteđenog nerva (SNI) ili ligaciju kičmenog nerva (SNL), što se sve može meriti pomeranjem šape, ili Hargreaves metodom (Hargreaves K, et al., Pain; 1988; 32; 77-88). U određenim aspektima, molekul transportera kao što je ovde dat može da se veže za BMVEC iz jedne ili više vrsta, npr., BMVEC čoveka, cinomolgus majmuna, miša, pacova ili goveda. Vezivanje se može demonstrirati na različite načine poznate osobama sa uobičajenim iskustvom u tehnici, na primer, u FMAT testu kao što je opisano u US 62/094,503. U određenim aspektima, BMVEC su moždane kapilarne endotelne ćelije (BCEC). U određenim aspektima, molekul transportera kao što je ovde dato može proći kroz monosloj BCEC u in vitro testu transcitoze. U određenim aspektima, aktivnost molekula transportera može se demonstrirati vizuelizacijom molekula transportera u CNS. Na primer, molekul transportera obeležen tricijumom može biti dostavljen subjektu, npr., mišu periferno, npr., intravenozno, a zatim se vizuelizovati u CNS putem kvantitativne radiografije celog tela. U
4
određenim aspektima, molekul transportera se lokalizuje u određenim regionima CNS, npr., korteks malog mozga, siva materija velikog mozga, siva materija kičmene moždine, most ili njihova kombinacija.
[0177] U određenim aspektima, molekul transportera kao što je ovde opisan sadrži antitelo ili njegov fragment koji može da prodre kroz BBB i koji sadrži ili se sastoji od dve ili više podjedinica, npr., teški lanac ili njegov fragment i laki lanac ili njegov fragment, gde teški lanac i laki lanci su povezani, npr., kao jedan fuzioni protein (npr. scFv), ili kao dve podjedinice koje se drže zajedno pomoću jedne ili više disulfidnih veza. U određenim aspektima teški lanac sadrži VH domen ili region, a laki lanac sadrži VL domen ili region.
[0178] U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku koji je povezan sa molekulom transportera krvno-moždane barijere kao što je ovde opisano.
[0179] U određenom rešenju, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku je povezan sa molekulom transportera krvno-moždane barijere, pri čemu je molekul transportera jednolančani fragment (scFv) koji sadrži:
i. varijabilni region teškog lanca (VH) BBBt0626gl SEQ ID NO: 39 i varijabilni region lakog lanca (VL) BBBt0626gl SEQ ID NO: 43, ili
ii. varijabilni region teškog lanca (VH) BBBt0626 SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca (VL) BBBt0626 SEQ ID NO: 43,
iii. varijabilni region teškog lanca (VH) BBBt0632gl SEQ ID NO: 48 i varijabilni region lakog lanca (VL) BBBt0632gl SEQ ID NO: 52
[0180] U određenim aspektima teški lanac dalje obuhvata konstantni domen teškog lanca, npr., CH1 domen, šarku, CH2 domen i/ili CH3 domen, ili njihov fragment. U određenim aspektima, konstantni domen teškog lanca je IgG konstantni domen ili njegov fragment, npr., humani IgG konstantni domen, npr., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 konstantni domen. U određenim aspektima, IgG konstantni domen ili njegov fragment obuhvata izmenjenu glikozilaciju i/ili jednu ili više amino kiselinskih supstitucija u odnosu na IgG konstantni domen divljeg tipa gde modifikovani IgG ima posebno svojstvo, npr., život u poređenju sa poluživotom IgG koji ima konstantni domen divljeg tipa IgG, bilo povećane ili smanjene efektorske funkcije u odnosu na konstantni domen divljeg tipa IgG, ili sposobnost vezivanja heterolognih delova preko, npr., peptidne veze, disulfidna veza, ili hemijska konjugacija. U određenim aspektima, IgG konstantni domen ili njegov fragment ima izmenjenu glikozilaciju u odnosu na IgG konstantni domen divljeg tipa pri čemu modifikovani IgG ima određenu osobinu, npr., produženi ili smanjeni poluživot u poređenju sa poluživotom IgG koji ima konstantni domen divljeg tipa IgG, ili povećane ili smanjene efektorske funkcije u odnosu na konstantni domen divljeg tipa IgG.
[0181] U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku je povezan sa BBBt0626 ili BBBt0626gl, kako je ovde definisano, formirajući molekule bispecifičnog antitela.
[0182] U drugim rešenjima, navedena bispecifična antitela u skladu sa ovim pronalaskom obuhvataju humani IgG1 TM kičmu (odn., CH1, CH2, CH3 regione teškog lanca IgG1 TM) povezane sa fragmentom jednog lanca (scFv) koji sadrži VH i VL regione BBBt0626 ili BBBt0626gl transplantiranog na N-terminusu ("BiS2 format") ili C-terminusu ("BiS3 format") teškog lanca ili N-terminusu ("BiS1 format") VL, anti-Į-sinukleinskog antitela prema predmetnom pronalasku. Reference formata BiS su kao što je otkriveno u DiMasi et al. J Mol Biol.2009 Oct 30;393(3):672-92.
[0183] U nekim rešenjima, navedena bispecifična antitela prema predmetnom pronalasku dalje sadrže laki lanac koji sadrži kapa ili lambda CL region povezan sa VL anti-Į-sinukleinskog antitela prema predmetnom pronalasku.
[0184] U određenim rešenjima, bispecifična antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju humani IgG1 TM kičme povezan sa:
(i) fragmentom pojedinačnog lanca (scFv) BBBt0626gl koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 39 i varijabilni region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 43; ili
(ii) fragmentom pojedinačnog lanca (scFv) Bbbt0626 koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 43,
4
pri čemu navedeni ScFv je kalemljen na N-terminus (BiS2 format) ili C-terminus (BiS3 format) teškog lanca aslo0452 ngl-3 SEQ ID NO: 12 ili N-terminus ("BiS1 format") lakog lanca SEQ ID NO.17.
[0185] U još daljim konkretnim rešenjima, bispecifična antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju humani IgG1 TM kičme povezan sa fragmentom pojedinačnog lanca (scFv) BBBt0626gl koji sadrži (i) varijabilni region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 39 i (ii) varijabilni region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 43; pri čemu je pomenuti ScFv kalemljen na N-terminus (BiS2 format) ili C-terminus (BiS3 format) teškog lanca aslo0452 ngl-3 SEQ ID NO: 12 ili N-kraja („BiS1 format“) lakog lanca SEQ ID NO.17.
[0186] U drugim određenim rešenjima, bispecifična antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju humani IgG1 TM kičme povezan sa:
(i) fragmentom pojedinačnog lanca (scFv) BBBt0626gl koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 39 i varijabilni region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 43; ili
(ii) fragmentom pojedinačnog lanca (scFv) Bbbt0626 koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 43,
pri čemu navedeni ScFv je kalemljen na N-terminus (BiS2 format) ili C-terminus (BiS3 format) teškog lanca aslo0543 SEQ ID NO: 22 ili N-terminus ("BiS1 format") lakog lanca SEQ ID NO.
28.
[0187] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku za upotrebu kao lek.
[0188] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predemtnom pronaalsku za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti centralnog nervnog sistema, posebno Į-sinukleinopatije. U jednom rešenju, Į-sinukleinopatija se bira između Parkinsonova bolest (PD), demencija sa Levijevim telima (DLB) i multipla sistemska atrofija (MSA). U poželjnom rešenju, Į-sinukleinopatija je Parkinsonova bolest (PD).
4
[0189] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku za proizvodnju leka za prevenciju ili lečenje bolesti centralnog nervnog sistema, posebno Į-sinukleinopatije. U jednom rešenju, Į-sinukleinopatija je odabrana između Parkinsonove bolesti (PD), demencije sa Levijevim telima (DLB) i višestruke sistemske atrofije (MSA). U poželjnom rešenju, Į-sinukleinopatija je Parkinsonova bolest (PD).
[0190] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod lečenja ili prevencije bolesti kod pacijenta, postupak koji obuhvata davanje pacijentu antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku. U jednom rešenju, Į-sinukleinopatija je izabrana između Parkinsonove bolesti (PD), demencije sa Levijevim telima (DLB) i višestruke sistemske atrofije (MSA). U poželjnom rešenju, Į-sinukleinopatija je Parkinsonova bolest (PD).
[0191] U upotrebi, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku je u stanju da leči ili spreči progresiju bolesti inhibiranjem razmnožavanja i širenja alfa-sinukleina in vivo. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku tako daje jasnu prednost u odnosu na druge terapeutike. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod usporavanja ili sprečavanja progresije bolesti kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje pacijentu antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku.
[0192] U jednom rešenju, pomenuti postupak lečenja bolesti obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku. U drugom rešenju, pomenuti metod prevencije bolesti ili usporavanja ili sprečavanja progresije bolesti obuhvata davanje profilaktički efikasne količine antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku.
[0193] Opsezi doza za primenu antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku su oni koji proizvode željeni terapeutski efekat. Razumljivo je da opseg potrebnih doza zavisi od precizne prirode antitela ili njegovog fragmenta ili kompozicije koji se vezuje za antigen, načina primene, prirode formulacije, starosti pacijenta, prirode, obima ili težine stanje pacijenta, kontraindikacije, ako ih ima, i procena lekara koji prisustvuje.
4
[0194] Varijacije u ovim nivoima doze se mogu podesiti korišćenjem standardnih empirijskih rutina za optimizaciju.
[0195] Pogodne doze su u opsegu od 1 do 50 mg po kg telesne težine. Mogu biti u opsegu od 5 do 30 mg/kg, 10 do 25 mg/kg ili 15 do 20 mg/kg. Jedinična doza se može davati dnevno ili ređe, na primer, nedeljno ili mesečno.
[0196] Davanje se može izvršiti ponovljenim davanjima antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku, tokom produženog vremenskog perioda. Davanje može biti istovremena ili uzastopna, i može se vršiti bilo kojim redosledom.
[0197] Prevencija ili lečenje ovde definisano se može primeniti kao jedina terapija ili može uključivati, pored antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku, davanje drugih agenasa ili utvrđenih terapija koje se normalno koriste u lečenju Į-sinukleinopatija (kao što je kao L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), agonisti dopamina (receptora), inhibitori katehol-O-metiltransferaze (COMT) i/ili inhibitori monoamin oksidaze tipa B (MAO-B). Primena drugih agenasa ili utvrđenih terapija može biti u kombinaciji sa, ili kao dodatak, ili u vezi sa antitelom ili antigenskim vezujućim fragmentom prema predmetnom pronalasku i može biti putem istovremenog, uzastopnog ili odvojenog doziranja pojedinačne komponente tretmana.
[0198] Kombinovano lečenje može da se izvede na bilo koji način koji stručnjak za ovu oblast smatra neophodnim ili pogodnim i za potrebe ove specifikacije, nema ograničenja u pogledu redosleda, količine, ponavljanja ili relativne količine jedinjenja koja će se koristiti u kombinaciji se razmatra.
[0199] Terapeutski efikasna količina se odnosi na količinu ili antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment, koji kada se daje sam ili u kombinaciji kod pacijenta za lečenje bolesti, ili bar jednog od kliničkih simptoma bolesti, dovoljan je da utiče na takav tretman bolest, ili simptom. Terapeutski efikasna količina može da varira u zavisnosti, na primer, od antitela i/ili simptoma bolesti, starosti, težine i/ili zdravlja pacijenta koji se leči, i od procene lekara koji je propisao lek. Odgovarajuću terapeutski efikasnu količinu u bilo kom datom slučaju mogu utvrditi oni koji su verzirani u ovoj oblasti ili oni koji su sposobni da ih odrede rutinskim eksperimentisanjem.
4
Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj su svi toksični ili štetni efekti antitela ili antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta nadjačavaju korisni efekti.
[0200] "Profilaktički efikasna količina" je bilo koja količina antitela ili antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta koja, kada se daje sama ili u kombinaciji sa pacijentom, inhibira ili odlaže početak ili ponovnu pojavu bolesti, ili bar jednog od kliničkih simptomi bolesti. U nekim rešenjima, profilaktički efikasna količina u potpunosti sprečava početak ili ponovnu pojavu bolesti. „Sprečavanje“ početka znači ili smanjenje verovatnoće pojave bolesti ili potpuno sprečavanje pojave bolesti.
[0201] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti mogu olakšati preradu aktivnih jedinjenja u preparate pogodne za farmaceutsku primenu.
[0202] Farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu biti formulisane za, ali bez ograničenja na parenteralnu isporuku, na primer intramuskularnu, subkutanu ili intravensku. Kompozicije pogodne za intramuskularnu, subkutanu ili intravensku injekciju uključuju sterilne vodene rastvore.
[0203] Farmaceutska kompozicija može imati oblik vodenog rastvora i može uključivati fiziološki kompatibilne pufere kao što su Hankov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki puferovani slani rastvor. Farmaceutska kompozicija može dodatno ili alternativno da sadrži supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Farmaceutska kompozicija se može dobiti kao odgovarajuće uljane suspenzije za injekcije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja kao što je susamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleat ili trigliceridi, ili lipozomi. Opciono, farmaceutska kompozicija može sadržati odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja kako bi se omogućilo pripremanje visoko koncentrovanih rastvora.
[0204] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku. Predmetni
4
pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži vektor predmetnog pronalaska.
[0205] Antitela ili antigenski vezujući fragmenti pronalaska nisu ograničeni na određeni metod dobijanja ili proizvodnje. Dakle, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja su proizvedena od hibridoma koji luči antitelo, kao i antitela proizvedena iz rekombinantno proizvedene ćelije koja je transformisana ili transfektovana nukleinskom kiselinom ili nukleinskim kiselinama koje kodiraju antitelo. Takvi hibridomi, rekombinantno proizvedene ćelije i nukleinske kiseline čine deo ovog otkrića.
PRIMERI
Primer 1: Proizvodnja antitela
[0206] Anti-Į-sin specifična antitela su izolovana iz fagne prikazane biblioteke koristeći seriju selekcionih ciklusa na rekombinantnom humanom Į-sin ("hu Į-sin"), oba pasivno imobilizovana na mikrotitarskim bunarčLćima i slobodna u rastvoru. Za selekciju su korišćene naivne humane jednolančane Fv (scFv) fage displej biblioteke klonirane u fagemid vektor zasnovan na filamentoznom fagu M13 (Lloyd et al., Protein Eng Des Sel. (2009), 22(3):159-68; i Vaughan et al., Nat Biotechnol. (1996), 14(3); 309-14).
[0207] Reprezentativni broj pojedinačnih klonova iz izlaznih rezultata selekcije nakon dva ili tri kruga selekcije opisanih iznad, u početku je pregledan kao rastvorljivi scFv fragmenti u periplazmatskim ekstraktima E.coli (Kipriyanov et al. J Immunol Methods (1997) 200: 69-77) u homogenom FRET (prenos energije fluorescentne rezonance) HTRF® (Homogena vremenski razrešena fluorescencija, Cisbio International) analiza vezivanja za rastvorljiv humani Į-sinuklein.
[0208] HTRF® analiza (Slika 1) je homogena tehnologija analize koja koristi prenos energije fluorescentne rezonance između donora i akceptora fluorofora koji su u neposrednoj blizini (Mathis G Clin Chem (1995) 41: 1391-1397). Ova analiza je korišćena za merenje makromolekularnih interakcija direktnim ili indirektnim spajanjem jednog od molekula od interesa sa donorskim fluoroforom, npr. evropijum (Eu3+) kriptat, i spajanje drugog molekula od interesa za akceptor fluorofora KSL665, (stabilan unakrsno povezan alofikocijanin). Ekscitacija molekula kriptata (na 337 nm) rezultirala je emisijom fluorescencije na 620 nm. Energija iz ove emisije je preneta na XL665 u neposrednoj blizini kriptata, što je rezultiralo emisijom specifične dugovečne fluorescencije (na 665 nm) iz XL665. Izmereni su specifični signali i donora (na 620 nm) i akceptora (na 665 nm), što je omogućilo izračunavanje odnosa 665/620 nm koji kompenzuje prisustvo obojenih jedinjenja u testu.
[0209] Neprečišćeni anti-Į-syn scFv uzorci su testirani na vezivanje za biotinilovani Į-sin.5 mikrolitara rastvora koji sadrži 40 nM biotinilovanog humanog Į-sina kombinovanog sa 0.8 nM streptavidin terbijuma (Cisbio International, 610SATLB) dodato je na ploču za ispitivanje male zapremine sa 384 bunarčLća (Costar, 3676). Zatim je na ploču dodato 10 mikrolitara svakog razblaženja test uzorka antitela. Na kraju je 5 mikrolitara rastvora koji sadrži DC anti-mic (Cisbio International, 661MICDAB) dodato na ploču za ispitivanje. Sva razblaženja su izvedena u puferu za ispitivanje koji sadrži 0.8 M kalijum fluorida (BDH 103444T) i 0.1% goveđeg serumskog albumina (BSA, Sigma A9576) u Dulbeccos PBS (Invitrogen, 14190185). Ploče za analizu su inkubirane 3 sata na sobnoj temperaturi, a zatim 16 sati na 4°C pre nego što je vreme očitavanja razrešilo fluorescenciju na talasnim dužinama emisije od 620 nm i 665 nm korišćenjem EnVision čitača ploča (Perkin Elmer).
[0210] Podaci su analizirani izračunavanjem odnosa 665/620 nm praćeno % Delta F vrednosti za svaki uzorak. Odnos 665/620 nm je korišćen za korekciju interferencije uzorka korišćenjem jednačine ispod:
[0212] Negativna kontrola (nespecifično vezivanje) je definisana zamenom analiziranog uzorka neoznačenim humanim ili pacovskim Į-syn.
1
[0213] Vrednosti % Delta F su kasnije korišćene za izračunavanje % specifičnog vezivanja kao što je opisano u jednačini ispod:
[0214] IC50vrednosti su određene korišćenjem softvera GraphPad Prism podešavanjem krive korišćenjem četvoroparametarske logističke jednačine:
X je logaritam koncentracije.
Y je specifično vezivanje
Y počinje od Dna i ide ka Vrhu sa sigmoidnim oblikom.
[0215] Jednolančani Fv klonovi koji su se vezali za humani Į-sin kao neprečišćeni periplazmatski ekstrakti podvrgnuti su sekvenciranju DNK (Osbourn et al, Immunotechnologi (1996), 2: 181-196; i Vaughan et al., Nat Biotechnol. (1996), 14 (3), 309-14. Jedinstveni scFv su ponovo eksprimirani u bakterijama i prečišćeni afinitetnom hromatografijom (kao što je opisano u WO 01/66754). Jačina ovih uzoraka su određene titracijom prečišćenog preparata za vezivanje za biotinilovani humani Į-sin u HTRF testu kao što je gore opisano. Prečišćeni scFv preparati koji su pokazali najjaču Į-sin interakciju odabrani su za konverziju u IgG format.
[0216] Titriranjem antitela u HTRF testu, klonovi su rangirani po jačini vezivanja za Į-sin.
Najbolji Į-sin vezivi su dalje analizirani za obe kinetike vezivanja za Į-sin (koff) kao IgG na oktet crvenom biosenzoru (videti metodu opisanu u Primeru 9), kao i za selektivnost članova porodice sinukleina (humani Į- sin, ȕ-sin, Ȗ-sin) (videti metodu opisanu u Primeru 4) i za unakrsnu reaktivnost sa mišjim Į-sin (videti metodu opisanu u Primeru 5).
Primer 2: Derivacija aslo0452 ngl-3
[0217] C-terminalno reaktivni Į-sin specifičan klon, asin0087, identifikovan je skriningom za vezivanje za humani Į-sin u DELFIA testu (videti metodu opisanu u Primeru 4). Asin0087 se specifično vezuje za Į-sin čoveka, cinomolgus majmuna i pacova (videti metod opisan u Primeru 5). Asin0087 je vraćen na najbližu moguću sekvencu humane germ linije (Tomlinson
2
VBASE. MRC Centre of Protein Engineering, Cambridge, UK.1997) koji nisu uticali na jačinu standardnim tehnikama mutageneze pre optimizacije. Nakon stvaranja germlinija, klon je ponovo procenjen na vezivanje za Į-sin. Nisu primećeni štetni efekti.
[0218] Velike biblioteke scFv-faga izvedene iz vodećeg klona stvorene su oligonukleotidom usmerenom mutagenezom promenljivih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) 2 i 3 i lakog (VL) lanca CDR 1 i 3 korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije kao što je opisano u Clarkson-u i Lowman (2004) (Phage display: A practice approach. Oxford: Oxford Universiti Press). Biblioteke su bile podvrgnute selekciji faga zasnovanom na afinitetu koja je izvedena na rastvorljivom biotinilovanom humanom Į-sin u cilju odabira varijanti sa većim afinitetom za humani Į-sin. Selekcije su izvršene u suštini kao što je prethodno opisano u gornjem tekstu sa izuzetkom snižavanja koncentracije rastvorljivog biotinilovanog humanog Į-sin za svaki krug selekcije koji je obavljen.
[0219] Reprezentativni klonovi iz svakog selekcionog izlaza su inicijalno pregledani kao rastvorljivi scFv fragmenti u periplazmatskim ekstraktima E.coli u HTRF testu za njihovu sposobnost da se takmiče za vezivanje za rastvorljivi Į-sin protiv roditeljskog Į-sin vezujućeg klona asin0087. Performanse svake biblioteke u ovim populacionim ekranima su korišćene da se informiše koje su biblioteke CDR mutageneze genetski sabrane ili „rekombinovane“ da bi se stvorile nove biblioteke, a ove rekombinovane biblioteke su podvrgnute daljim krugovima selekcija zasnovanih na afinitetima koji su izvedeni na rastvorljivom biotinilovanom čoveku Į-syn.
[0220] I za pojedinačne i za klonove izvedene iz biblioteke rekombinovane mutageneze, nakon analize sekvence pozitivnih veziva, klonovi su eksprimirani i prečišćeni kao scFv fragmenti i IgG i vezivanje za rastvorljivi Į-sin što je ponovo potvrđeno HTRF testovima konkurencije epitopa. Titriranjem antitela u testu konkurencije epitopa HTRF klonovi su rangirani prema njihovim vrednostima IC50za relativno poboljšanje vezivanja za Į-sin u poređenju sa roditeljskim IgG asin0087. Najbolji Į-sin vezivi su dalje analizirani za selektivnost članova porodice sinukleina (humani Į-sin, ȕ-sin, Ȗ-sin) i za unakrsnu reaktivnost sa cinomolgusom i Į-sin pacova, bilo putem HTRF testa direktnog vezivanja ili konkurencije epitopa HTRF test.
[0221] Iz ovih iterativnih krugova rekombinacije biblioteke i skrininga identifikovana su dva moćna Į-sin specifična, cinomolgus i Į-sin pacova unakrsno reaktivna klona, aslo0452 ngl-1 i aslo0467.
[0222] Mutageneza u jednoj tački je izvedena na aslo0452 ngl-1 za svaki od CDR gde su primećena pozitivna poboljšanja u IC50potenciji. Svaka pozicija u izabranom CDR je mutirana pojedinačno kroz svih 20 mogućih amino kiselinskih ostataka, i ponovo pregledana HTRF testom konkurencije epitopa za poboljšanje IC50u poređenju sa aslo0452 ngl-1 IgG. Višestruki ostaci u četiri CDR (H2, H3, L1 i L3) su identifikovani i kombinovani na aslo0452 ngl-1 i aslo0467, i ponovo procenjeni HTRF testom konkurencije epitopa za poboljšani IC50u poređenju sa aslo0452 ngl-1. Iz ovih eksperimenata identifikovana su dve najviše poboljšane vezivne supstance aslo0452 ngl-3 i aslo0543.
[0223] Slika 2 upoređuje amino kiselinske sekvence VH i VL regiona asin0087, aslo0452 ngl-3 i aslo0543.
Primer 2.1: Reformatiranje scFv to IgG1 TM
[0224] Jednolančani Fv klonovi sa poželjnim svojstvima vezivanja Į-sin konvertovani su u efektorske funkcije nulte celine imunoglobulina G1 TM (IgG1 TM) (Oganesian et al. Acta Cristallogr D Biol Cristallogr. (2008), 64 (Pt 6):700-4) format antitela u suštini kako su opisali Persic et al. (Persic et al, Gene (1997) 187: 9-18) sa sledećim modifikacijama. OriP fragment je uključen u ekspresione vektore da bi se olakšala upotreba sa CHO-prolaznim ćelijama i da bi se omogućila epizomalna replikacija. Varijabilni teški (VH) domen je kloniran u vektor (pEU1.4) koji sadrži konstantne domene humanog teškog lanca i regulatorne elemente za ekspresiju celog teškog lanca IgG1 TM u ćelijama sisara. Slično, varijabilni laki (VL) domen je kloniran u vektor (pEU4.4) za ekspresiju konstantnih domena humanog lakog lanca (lambda) i regulatornih elemenata za ekspresiju celog IgG lakog lanca u ćelijama sisara. Da bi se dobili IgG, vektori koji eksprimiraju IgG teškog i lakog lanca su transfektovani u CHO-prolazne ćelije sisara (Daramola et al, Biotechnol Prog (2014) 30: 132-141). IgG su eksprimirani i izlučeni u medijum. Prikupljeni materijali su filtrirani pre prečišćavanja, zatim je IgG prečišćen korišćenjem hromatografije na proteinu A. Supernatanti kulture su stavljeni na kolonu odgovarajuće veličine Ceramic Protein A (BioSepra) i isprani sa 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 250 mM NaCl. Vezani IgG je eluiran iz kolone korišćenjem 0.1 M natrijum citrata (pH 3,0) i neutralizovan dodatkom Tris-HCl (pH 9.0). Eluirani
4
materijal je zamenjen puferom u PBS korišćenjem Nap10 kolona (Amersham, #17-0854-02) i koncentracija IgG je određena spektrofotometrijski korišćenjem koeficijenta ekstinkcije zasnovanog na sekvenci amino kiselina IgG (Mach et al, Anal Biochem ( 1992) 200: 74-80). Prečišćeni IgG su analizirani na čistoću agregacije i degradacije korišćenjem SEC-HPLC i sa SDS-PAGE.
[0225] Obrazloženje za korišćenje IgG1 TM kao formata kandidata za lek je da se minimizira ubijanje posmatrača usled aktivacije imunih ćelija i komplementa (odn. prekomerna proizvodnja C3a koja može izazvati upalu). Ubijanje ćelija posmatrača može biti pokrenuto potencijalnom akumulacijom imunih kompleksa formiranih od leka kandidata i ekstracelularnog Į-sinukleina za koji je pokazano da interaguje sa lipidnim membranama (Bartels et al., Biophis. J. (2010), 99: 2116- 2124). Format IgG1 TM je izabran jer je pokazano da ima zanemarljivo vezivanje za FcYreceptore (FcYR) i smanjenu C1q-posredovanu aktivaciju komplementa od strane imunih kompleksa (Oganesyan et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. (2008), 64(Pt 6):700-4).
[0226] Da bi se minimizirao svaki potencijalni rizik od imunogenosti, okviri aslo0452 ngl-3 su što je moguće bliži sekvenci amino kiselina humane germlinije bez uticaja na jačinu. To znači da neke amino kiseline u aslo0452 ngl-3, uključujući Vernijeove ostatke (Foote i Vinter, J Mol Biol. (1992), 224(2): 487-99), nisu mutirane na najbližu sekvencu humane germ linije. Za VHdomen aslo0452 ngl-3 postoji jedan Vernijeov ostatak u V regionu koji nije mutiran u sekvencu humane germ linije IGVH3-23 i IGJH6 (Slika 3C). Za VLdomen aslo0452 ngl-3 svi ostaci okvira odgovaraju sekvenci humane germ linije IGLV5-45 i IGJL2 ili IGJL3 (Slika 3D).
Primer 3: Afinitet optimizovanog anti-Į-sin IgG epitopske konfirmacije
[0227] Rekombinantni humani alfa-, beta-, i gama-sinuklein, rekombinantne skraćene verzije humanog alfasinukleina (aa1-60, aa1-95, aa61-140, 96-140, ǻNAC, i NCAP), i mišji alfasinuklein su dobijeni iz rPeptide LLC. Grubo mapiranje epitopa je izvedeno korišćenjem komercijalno dostupnih skraćenih Į-sin.
[0228] Ukratko, jedan mikrogram po mililitru svakog preseka je obložen u mikrotitarski bunarčLć preko noći na 4°C. Posle ispiranja bunarčLća u PBS, dodato je 1 mg/ml razblaženja svakog anti-Į-sin antitela. Posle 1 h inkubacije i ispiranja vezano antitelo je detektovano dodavanjem antihumanog IgG konjugovanog sa HRP ili Eu3+. Nakon inkubacije i ispiranja, dodat je odgovarajući supstrat za detekciju (TMB ili DELFIA Enhancer rastvor respektivno) i ploča je Rčitana na čitaču mikrotitarske ploče.
[0229] Ove studije vezivanja epitopa otkrile su da vodeći izolat, asin0087, prepoznaje epitop koji se nalazi u C-terminalnom regionu Į-sin proteina između amino kiselina 102 i 130 (Slika 4A). I aslo0452 ngl-3 i aslo0543 održavaju svoje prepoznavanje istog epitopa koji se nalazi u C-terminalnom regionu Į-sin proteina između amino kiselina 102 i 130 kao njihov roditeljski vodeći izolat asin0087 (Slika 4B).
Primer 4: Specifićnost aslo0452 ngl-3 i aslo0543 za Į-sin u odnosu na članove familije korišćenjem epitopske konkurentne HTRF analize
[0230] Važno je da antitelo namenjeno za upotrebu u terapijskim primenama bude specifično za humani Į-sin, kako bi se minimizirali svi potencijalni bezbednosni rizici koji se odnose na interakciju van cilja sa drugim sinukleinima (ȕ-sinuklein i Y-sinuklein).
[0231] Specifičnost aslo0452 ngl-3 i aslo0543 za Į-sin u odnosu na druge članove porodice sinukleina, ȕ-sin i Ȗ-sin, određena je korišćenjem HTRF epitopske konkurentske analize koja je merila vezivanje biotinilovanog humanog Į-sin za antitelo u rastvoru.
[0232] Į-sin, ȕ-sin i Y-sin su titrirani u analizi, a selektivnost aslo0452 ngl-3 IgG i aslo0543 IgG je procenjena merenjem stepena inhibicije vezivanja biotinilovanog humanog Į-sin za aslo0452 ngl-3/aslo0543. IC50vrednosti su određene pomoću krive prilagođavanjem podataka logističkoj jednačini sa četiri parametra korišćenjem PRISM 6® softvera (Graphpad). Osetljivije HTRF analize koje mere direktno vezivanje IgG za humani Į-sin, ȕ-sin i Ȗ-sin su takođe korišćeni da se potvrdi specifičnost Į-sin (podaci nisu prikazani). Za negativnu kontrolu, uzorak za testiranje antitela je zamenjen samo kontrolnim antitelom izotipa ili puferom.
[0233] Reprezentativne vrednosti IC50dobijene sa Į-sin, ȕ-sin i Ȗ-sin proteinima u testovima konkurencije epitopa aslo0452 ngl-3 i aslo0543 HTRF prikazane su na slici 5. Nije primećeno vezivanje za ȕ-sin i Ȗ-sin pri testiranim koncentracijama (do 5 mM), pokazujući da su aslo0452 ngl-3 i aslo0543 selektivni za Į-syn.
Primer 5: Specifičnost aslo0452 ngl-3 za humani, cinomolgus majmunski i pacovski Į-sin korišćenjem HTRF epitopske konkurentne analize
[0234] U pogledu terapijskih primena, važno je da je antitelo unakrsno reaktivno na Į-sinuklein cinomolgusa i poželjno je da bude unakrsno reaktivno na Į-sinuklein pacova, u okviru 10 puta od onog uočenog protiv humanog Į-sin. Ovo je da bi se omogućilo da se sprovode bezbednosne studije i na vrstama cinomolgus majmuna i pacova.
[0235] Specifičnost aslo0452 ngl-3 i aslo0543 za Į-sin čoveka, cinomolgus majmuna i pacova određena je korišćenjem HTRF epitopske konkurentne analize koja je merila vezivanje biotinilovanog humanog Į-sin za aslo0452 ngl-3 u rastvoru.
[0236] Į-sin čoveka, cinomolgus majmuna i pacova su titrirani u analizi, a selektivnost antitela je procenjena merenjem stepena inhibicije biotinilovanog humanog Į-sin vezivanja za antitelo. IC50vrednosti su određene pomoću krive prilagođavanjem podataka logističkoj jednačini sa četiri parametra korišćenjem PRISM 6® softvera (Graphpad). Unakrsna reaktivnost vrsta aslo0452 ngl-3 i aslo0543 je takođe potvrđena korišćenjem formata analize direktnog vezivanja HTRF (nije prikazano). Aslo0452 ngl-3 (ili aslo0543) je titriran u analizi da se takmiči za vezivanje Į-sin kod čoveka ili cinomolgus majmuna ili pacova za aslo0452 ngl-3 (ili aslo0543) pomoću HTRF analize. Za negativne kontrole, uzorak za testiranje antitela je zamenjen samo kontrolnim antitelom izotipa ili puferom.
[0237] Reprezentativne vrednosti IC50dobijene sa humanim, cinomolgus majmunskim i pacovskim Į-sin proteinima u HTRF epitopskoj kompeticijskoj analizi su prikazane na Slici 6. Aslo0452 ngl-3 se vezuje za humani i cinomolgus Į-sin sa IC50vrednostima od 5.7 nM i 6.8 nM, respektivno, i vezuje se za pacovski Į-sin sa IC50vrednošću od 19.6 nM, unutar 4 puta.
Aslo0543 se vezuje za humani i cinomolgus Į-sin sa IC50vrednostima od 2.0 nM i 2.1 nM respektivno, i vezuje se za pacovski Į-sin sa IC50vrednošću od 3.8 nM, u okviru 2 puta.
[0238] Sposobnost aslo0452 ngl-3 da se veže za Į-sin čoveka, cinomolgus majmuna i pacova indikativna je za vezivanje za drugačiji epitop na humanom alfa-sinukleinu u poređenju sa antitelima koja se ne vezuju za Į-sin čoveka, i cinomolgus majmuna i pacova.
Primer 6: Specifičnost afiniteta optimizovanih klonova za nativni Į-sin izmeren sa protočnom citometrijom
[0239] Specifičnost afiniteta optimizovanih anti-Į-sin IgG, aslo0452 ngl-3 i aslo0543, za vezivanje za nativni, endogeni humani Į-sin je određena sa protočnom citometrijom korišćenjem Į-sin pozitivnih i negativnih ćelijskih linija.
[0240] Ukratko, SHSY5Y ćelije neuroblastoma (Į-sin pozitivne) i BT-20 ćelije raka dojke (Į-sin negativne) su fiksirane u 0.01% formaldehida i zatim permeabilizovane sa 0.5% (v/v) Tween 20 pre inkubacije sa anti-Į-sin antitelima, pozitivna kontrola ili antitela za kontrolu izotipa. Posle opsežnog ispiranja, vezano antitelo je detektovano inkubacijom sa anti-humanim ili anti-mišjim IgG-FITC sekundarnim antitelom. Nakon daljeg ispiranja ćelije su analizirane sa FACS Canto II aparatom (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) i analiza podataka je izvršena korišćenjem FlowJo softvera (Tree Star, Ashland, OR).
[0241] Podaci su ucrtani kao histogrami koji pokazuju razliku između ćelija obojenih samih u odnosu na ćelije obojene primarnim antitelom. Rezultati na Slici 7A pokazuju promenu fluorescentnog signala u prisustvu asin0087 (panel D) u Į-sin pozitivnim SH-SY5Y ćelijama, u poređenju sa kontrolnim izotipom i sekundarnim antitelom sam (panel B), što ukazuje na prepoznavanje endogeno eksprimiranih Į-sin. Asin0087 se ne vezuje za Į-sin negativnu ćelijsku liniju humanog raka dojke, BT-20 (panel C). Rezultati na Slici 7B pokazuju snažan pomak u fluorescentnom signalu u prisustvu aslo0452 ngl-3 ili aslo0543 (panel H) uporediv sa antitelom pozitivne kontrole, 4D6 na Į-sin pozitivnim SH-SY5Y ćelijama (panel F) i bez pomeranje na Į-sin negativne BT-20 ćelije (panel G). Ovo pokazuje da se i aslo0452 ngl-3 i aslo0543 vezuju za nativni, endogeno eksprimirani intracelularni humani Į-syn.
Primer 7: Specifičnost optimizovanog anti-Į-sin IgGs za agregirani humani Į-sin sa DELFIA ELISA
[0242] Fibrilarni preparati ili agregati humanog Į-sin su generisani kako su opisali Emadi et al. (Emadi et al, Biochemistri (2004), 43: 2871-2878). Ukratko, 200 µl 50 µM rekombinantnog Į-sin je alikvotno raspoređeno u Sarstedt epruvetu od 1.8 ml i stavljeno u inkubator za mućkanje na 37°C tokom 3 dana na 280 rpm. Prisustvo agregiranog Į-sin je određeno ugradnjom tioflavina T koji je dodat u konačnu koncentraciju od 10 µM, inkubiran u mraku 1 h na sobnoj temperaturi i Rčitavanjem fluorescencije na talasnoj dužini ekscitacije od 450 nm i talasnoj dužini emisije od 485 nm na Envision čitač mikroploča.
[0243] Specifičnost afiniteta optimizovanih anti-Į-sin IgG, aslo0452 ngl-3 i aslo0543, i vodećeg antitela asin0087, za agregirani humani Į-sin je određena korišćenjem DELFIA® analize hvatanja antitela. Ova analiza je merila hvatanje agregiranog humanog Į-sin pomoću aslo0452 ngl-3, aslo0543 ili asin0087 u ELISA analizi u paru. Ukratko, mišja IgG1 verzija anti-Į-sin antitela je imobilizovana na otvor mikrotitarske ploče sa 96 bunarčLća (Nunc). Nakon blokiranja, agregirani ili monomerni humani Į-sin je inkubiran u bunarčLćima. Nakon ispiranja, uhvaćeni humani Į-sin je detektovan dodavanjem humanog IgG1 TM verzije istog anti-Į-sin antitela i zatim anti-humanog IgG-Europium konjugata (Perkin Elmer) ili anti-humanog IgG-HRP konjugata. Nakon inkubacije i ispiranja, dodat je odgovarajući supstrat za detekciju (TMB ili DELFIA Enhancer rastvor respektivno) i ploča je očitana na čitaču mikrotitarske ploče.
[0244] U ovoj analizi, samo agregirani humani Į-sin će biti uhvaćen i otkriven pošto predstavlja više kopija istog epitopa na jednom agregatu. Za monomerni Į-sin prisutna je samo jedna kopija epitopa, stoga detektivno drugo antitelo ne može da se veže u prisustvu antitela za hvatanje. Podaci su sažeti na Slici 8. Vodeći izolat, asin0087, je u stanju da se veže za agregirani rekombinantni humani Į-sin. Dakle, epitop za koji se asin0087 vezuje nije sam po sebi uključen u agregaciju Į-sin. I aslo0452 ngl-3 i aslo0543 su zadržali svoju sposobnost da se vežu za agregirani rekombinantni humani Į-sin.
Primer 8: Specifičnost optimizovanog anti-Į-sin IgGs u tkivima relevantnim za bolest imunohistohemijom
[0245] Specifičnost afiniteta optimizovanih anti-Į-sin IgG, aslo0452 ngl-3 i aslo0543, i vodećeg antitela asin0087, za oblike humanog Į-sin relevantne za bolest određena je imunohistohemijskim bojenjem moždanog tkiva Parkinsonove bolesti. Rezultati su prikazani na Slici 9 i pokazuju da kao asin0087, i aslo0452 ngl-3 i aslo0543 mogu prepoznati patološke oblike humanog Į-sin relevantne za bolest u delovima moždanog tkiva za Parkinsonovu bolest, uključujući Levijeva tela, Levijeve neurite, neuronske agregate, Levijeve tačke, i pozadinsko moždano tkivo. Nije primećeno nespecifično bojenje u normalnom ili zdravom moždanom tkivu.
Primer 9: Određivanje afiniteta anti-Į-sin antitela
[0246] Konstante ravnoteže disocijacije (KD) za anti-Į-sin IgG za humani Į-sin su određene korišćenjem dve platformske tehnologije: Octet Red (Forte Bio) i KinExA (Sapidyne Instruments).
[0247] Oba sistema ispitivanja su pokazala dobro slaganje, što ukazuje da je afinitet aslo0452 ngl-3 bio u sub-nanomolarnom opsegu. Tabela 1 pokazuje merenja afiniteta izvedena za ključne anti-Į-sin klonove generisane tokom procesa izolacije i optimizacije elektroda.
Primer 9.1:Afinitet aslo0452 ngl-3 sa Octet
[0248] Afinitet aslo0452 ngl-3 IgG za rekombinantni bakterijski eksprimirani monomerni humani avi-tag Į-sin-Flag-His procenjen je korišćenjem Octet Red instrumenta. Aslo0452 ngl-3 je prethodno pomešan sa različitim koncentracijama svakog liganda dok se ne postigne ravnoteža. Količina slobodnog antitela je zatim merena korišćenjem Octet-a sa hvatanjem slobodnog aslo0452 ngl-3 korišćenjem biotinilovanog Į-sin imobilizovanog na senzorima obloženim streptavidinom. Količina slobodnog antitela otkrivena pri svakoj koncentraciji Į-sin je ucrtana u odnosu na koncentraciju liganda i KinExA softver je korišćen za izračunavanje konstante ravnoteže disocijacije (KD). Rezultati prikazani u Tabeli 1 pokazuju da se aslo0452 ngl-3 IgG vezuje za humani Į-sin sa afinitetom 106 pM.
Primer 9.2: Afinitet aslo0452 ngl-3 sa KinExA
[0249] Pored toga, afinitet faze rastvora (KD) aslo0452 ngl-3 IgG za rekombinantni bakterijski eksprimirani monomerni humani biotinilovani Į-sin određen je korišćenjem KinExA instrumenta (Sapidine Instruments). Aslo0452 ngl-3 je prethodno pomešan sa različitim koncentracijama svakog liganda dok se ne postigne ravnoteža. Količina slobodnog antitela je zatim izmerena korišćenjem KinExA hvatanjem slobodnog aslo0452 ngl-3 korišćenjem perli obloženih sa Į-sin, ispiranjem nevezanog materijala i detekcijom vezanog antitela korišćenjem fluorescentno obeleženog antitela specifičnog za vrstu. Količina slobodnog antitela otkrivena pri svakoj koncentraciji Į-sin je ucrtana u odnosu na koncentraciju liganda i KinExA softver je korišćen za izračunavanje konstante ravnoteže disocijacije (KD). Rezultati prikazani u Tabeli 1 pokazuju da se aslo0452 ngl-3 IgG vezuje za Į-sin sa afinitetom od 74 pM, pokazujući dobro slaganje sa prethodno navedenom analizom afiniteta faze rastvora Octet.
Primer 9.3: Afinitet aslo0452 ngl-3 Fab fragmenta sa KinExA
[0250] Aslo0452 ngl-3 Fab fragment vezuje Į-sinuklein sa visokim afinitetom. KDvrednost aslo0452 ngl-3 Fab fragmenta za Į-sinuklein, merena KinExA analizom (kao što je opisano u gornjem primeru za celo antitelo), je 174 pM (95% Cl: 15-177 pM).
Primer 10: Efekti aslo0452 ngl-3 na nivoe slobodnog nevezanog Į-sinukleina u intersticijskoj tečnosti prefrontalnog korteksa (ISF) mužjaka Sprague Davlei pacova
[0251] Odrasli mužjaci Sprague Davlei pacova (293-417 g; Harlan, the Netherlands) su anestezirani i vodiči su implantirani u prefrontalni korteks.
[0252] Jedan dan pre eksperimenta push pull sonde (1-3 MDa polietilenska membrana 4 mm) su implantirane u prefrontalni korteks korišćenjem stereotaksijskog okvira (koordinate za sonde: AP = -3.4 mm (do bregma), bočno 0.8 mm (do srednje linije), ventralna -5.0 mm (do dura), šipka sekutića je postavljena na -3.3 mm (sve koordinate prema Paxinos i Watson, Mozak pacova u stereotaksičkim koordinatama, Academic Press, Njujork, 6. izdanje 2008). Sonde su pričvršćene za lobanju vijkom od nerđajućeg čelika i zubnim cementom.
[0253] Na dan eksperimenta sonde za mikrodijalizu su povezane sa fleksibilnim PEEK cevčicom (Western Analitical Products Inc. USA; PK005-020) sa mikroperfuzionom pumpom (Harvard) i perfuziran sa veštačkim CSF (perfuzat), koji sadrži 147 mM NaCl, 3.0 mM KCI, 1.2 mM CaCl2 i 1.2 mM MgCl2 0.2% BSA pri brzini protoka od 0.5 mL/min. Izlazi sondi su bili povezani na fleksibilne FEP cevi. Posle najmanje dva sata pre stabilizacije, aslo0452 ngl-3 formulisan samo u PBS ili PBS (vehikulum) je doziran u dozi od 30 ili 0 mg/kg, respektivno. Jedinjenje je dato intravenozno u količini od 2 mL/kg. Uzorci mikrodijalize su sakupljeni u intervalima od 120 minuta. Uzorci su sakupljeni u mini-bočice (Microbiotech/se AB, Švedska; 4001029). Svi uzorci su čuvani na -80 °C.
[0254] Da bi se odredila koncentracija slobodnog Į-sinukleina u ISF pacova, uzorci mikrodijalize su prvo podvrgnuti imunoprecipitaciji da bi se uklonio aslo0452 ngl-3. Imunoprecipitacija
1
koprecipitira Į-sinuklein vezan za terapeutska antitela, dok nevezani "slobodni" Į-sinuklein ostaje u supernatantu. Rastvor zrna proteina A (Dinabeads® Protein A) je dodat u ploču sa 96 bunarčLća bez obruba (polipropilen 0,2 mL) i ispran je dva puta sa TBST (50 mM TBS plus 0.1% Tween 20) koristeći magnet (DinaMag™ 96 strana ) da se perle odvoje od rastvora. Odmrznuti uzorci ISF mikrodijalize za pacove (10 ili 20 µL) su dodati u svaki bunar, pomešani sa perlicama pipetiranjem gore-dole i inkubirani na 4°C uz nagibnu rotaciju 10 minuta. Perle su zatim peletirane pomoću magneta dva puta da bi se osiguralo potpuno uklanjanje perli.
Imunoprecipitirani ISF uzorci su prebačeni na ploču sa 96 bunarčLća iz anti-Į-sinukleinskog ELISA kompleta (Sensolite™ kvantitativni ELISA komplet, čovek/miš/pacov, AnaSpec,US, AS-55550) sa puferom za razblaživanje uzorka koji je već dodat u ukupnu količinu zapremina od 100 µL. Uzorci kalibracije, 100 µL po bunarčLću, dodani su na ploču u duplikatu i 50 µL radnog rastvora detekcionog antitela je dodato u svaki bunar. Ploča je inkubirana na 4-8°C preko noći uz mućkanje i zaštićena od svetlosti, a zatim isprana šest puta sa 350 mL pufera za ispiranje. Na kraju, 100 µl TMB supstrata u boji je dodato u svaki bunar i ploča je inkubirana 10-15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Da bi se reakcija zaustavila, 50 µL Stop rastvora je dodato u svaki bunarčLć i ploča je očitana u roku od 2 sata pri apsorbanciji od 450 nm. Kvantifikacija je izvršena crtanjem odgovora standardne krive kao jedinica apsorpcije na linearnoj skali u odnosu na koncentraciju na logaritamskoj skali. Za prilagođavanje krive korišćena je funkcija sa četiri parametra.
[0255] Vremenski zavisno smanjenje slobodnog Į-sinukleina je pokazano u ISF (Slika 10) nakon jedne intravenske primene aslo0452 ngl-3 od 30 mg/kg.
Primer 11: Efekti aslo0452 ngl-3 na slobodnim ne vezanim Į-sinuklein nivoima u CSF mužjaka Sprague Davlei pacova
[0256] Odrasli mužjaci Sprague Davlei pacova su anestezirani i kateteri su stavljeni u cisterna magna da bi se omogućilo uzorkovanje CSF. Unutrašnja kanila od 0.8 cm je umetnuta u cisternu magna i eksteriorizovana kroz rez na vrhu lobanje. Kraj CSF katetera je fiksiran u svom položaju pomoću dentalnog akrilnog cementa i pričvršćen za lobanju pomoću tri zavrtnja od nerđajućeg čelika. Životinjama je dozvoljeno najmanje 2 dana oporavka pre nego što je jedinjenje primenjeno.
2
[0257] Aslo0452 ngl-3 je formulisan u puferu za doziranje od 3, 10, 30 ili 100 mg/kg. Samo jedinjenje ili nosač je davan u dozi od 2 mL/kg intravenozno.
[0258] Nakon prikupljanja najmanje četiri čista uzorka CSF uzetih tokom najmanje dva dana, jedinjenje je primenjeno. Svim životinjama je dozirano ili aslo0452 ngl-3 ili nosač na dan "0". Uzorci CSF su sakupljeni u svakoj naznačenoj vremenskoj tački. Svi uzorci su čuvani na -80 °C do otpreme.
[0259] Da bi se odredio slobodni Į-sinuklein u CSF, Į-sinuklein vezan za aslo0452 ngl-3, uklanja se imunoprecipitacijom (IP) pre analize. IP će koprecipitirati Į-sinuklein vezan za terapeutska antitela, dok nevezani „slobodni“ Į-sinuklein ostaje u supernatantu. Određivanje slobodnih nivoa Į-sinukleina u supernatantu je izvedeno korišćenjem komercijalnog ELISA kompleta dobijenog od Anaspec. Analiza je obavljena kako je opisano za ISF rezultate (kao što je opisano u Primeru 10).
[0260] Smanjenje slobodnog Į-sinukleina zavisno od doze i vremena je demonstrirano u CSF (Slika 11) nakon jedne intravenske primene aslo0452 ngl-3 u opsegu doza od 3-100 mg/kg.
Primer 12: Funkcionalna karakterizacija aslo0452 ngl-3 smanjenjem širenja alfasinukleina u lentivirusnom in vivo modelu alfa-sinukleinopatije
[0261] Sposobnost anti-alfa-sinukleinskog antitela visokog afiniteta, aslo0452 ngl-3, da blokira širenje alfasinukleina je ispitana korišćenjem lentivirusnog in vivo mišjeg modela alfasinukleinopatije. U tu svrhu, i netransgeni miševi divljeg tipa (ne-tg) i transgeni miševi sa prekomernom ekspresijom alfa-sinukleina (Į-sin tg) su ubrizgani lentivirusnim vektorom koji eksprimira alfa-sinuklein (LV-Į-sin) u desni hipokampus, a zatim su pasivno imunizovani nedeljno tokom 13 nedelja sa anti-alfa sinukleinskim mišjim IgG1 antitelima uključujući aslo0452 ngl-3 i izotip kontrolnim mišjim IgG1 NIP228. Na kraju perioda imunizacije, miševi su eutanazirani i njihovi mozgovi su fiksirani u 4% PFA, zatim koronalno isečeni i analizirani imunocitohemijom uz automatsku analizu slike za nivoe imunoreaktivnosti alfa-sinukleina ipsilateralno i kontralateralno u odnosu na mesto LV-Į -sin injekcija.
Hirurgija i Pasivna Imunizacija
[0262] Tri do četiri meseca stari netransgeni divlji miševi (ne-tg; n=40) i alfa-sinuklein transgeni miševi (asin tg; n=40) primili su jednu jednostranu injekciju u desni hipokampus (-2.0, 1.5 , -1.3 iz Bregma) lentivirusnog vektora koji eksprimira alfa-sinuklein (LV-Į-sin). Dve nedelje nakon operacije injekcije LV-Į-sin, miševi su primali nedeljne doze anti-alfa-sinuklein mišjih IgG1 antitela: aslo0452 ngl-3 (non-tg n=10; Į-sin tg n=10), aslo0452 ngl- 3 D265A (non-tg n=10; Į-sin tg n=10), 9E4 (non-tg n=10; a-sin tg n=10), ili su im dozirani NIP228 izotip kontrolnog miša IgG1 (non-tg n=10; Į-sin tg n=10).
[0263] Svi mišji IgG su dozirani u dozi od 20 mg/kg intraperitonealnim (IP) putem tokom 13 nedelja. Životinje su grupisane sa maksimalno ili 4 po kavezu. Životinje su držane na ciklusu svetlo/mrak 12/12 sa pristupom hrani i vodi ad libitum. Kavezi su menjani jednom nedeljno i nadgledani svakodnevno. Prijavljeni su bilo kakvi neželjeni događaji. Sve životinje su tolerisale hirurške zahvate kao i imunizacije. Na kraju perioda tretmana antitelima, miševi su eutanazirani u skladu sa smernicama za humani tretman životinja, a njihovi mozgovi su serijski presečeni u koronalne ose i procenjeni za neuropatološke analize širenja alfa-sinukleina imunocitohemijskim metodama.
Alfa-sinuklein Imunocitohemija
[0264] Mozgovi su uklonjeni, fiksirani u 4% paraformaldehidu, a preseci su isečeni u intervalima od 40 mm u koronalnim osovinama pomoću vibratoma i čuvani na -30°C u krioprotektivnom medijumu (30% glicerin, 30% etilen glikol, 40% PBS). Nakon ispiranja PBS i koraka pufera za blokiranje, sekcije su inkubirane preko noći na 4°C sa primarnim antitelom (anti-alfasinukleinsko mAb SYN-1 iz BD u razblaženju od 1:500), isprane u PBS i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi sa sekundarnim antitelom (biotinilovani anti-mišji IgG iz Vector Laboratories u razblaženju 1:100). Nakon završnih koraka pranja PBS-om, bojenje alfa-sinukleinom je lokalizovano korišćenjem sistema za detekciju kompleksa avidin/biotin-peroksidaza (Elite ABC, Vector Laboratories). Sekcije su zatim analizirane automatizovanom analizom slike za nivoe alfasinukleina ipsilateralno i kontralateralno u odnosu na mesto injekcije lentivirusnog vektora (LV-Į-sin).
4
Statistike
[0265] Podaci generisani iz automatizovane akvizicije nivoa alfa-sinukleina u grupama za tretman koji nisu tg i α-sin tg analizirani su korišćenjem GraphPad Prism softvera, San Dijego, Kalifornija, SAD. Jednosmerni ANOVA je izveden sa Dunnettovim višestrukim poređenjem nakon testa. Podaci prikazani na slikama su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM). Smatralo se da su razlike između grupa statistički značajne kada je p < 0.05. Sve analize su obavljene slepe za ocenjivača. Grupe koje su tretirale antitela su takođe bile slepe za ocenjivača.
Rezultati
[0266] I kod ne-tg miševa i kod Į-sin tg miševa, imunoreaktivnost alfa-sinukleina na ipsilateralnoj strani koja je injektirana LV-Į bila je intenzivna u neuropilu i pokrivala je većinu površine hipokampusa (Slika 12 A, Slika 15 A; NIP228 - Ipsilateralno). Kontralateralni neinjektirani hipokampus ne-tg miševa i α-sin tg miševa takođe je pokazao visoke nivoe imunoreaktivnosti alfa-sinukleina, što ukazuje da se alfa-sinuklein eksprimiran lentivirusom proširio iz ubrizganog desnog hipokampusa na levi hipokampus (Slika 12 A, Slika 15 A; NIP228 – Kontralateralno). U ovom modelu miša sa injekcijom alfa-sinukleina, prethodni eksperimenti su pokazali da se samo eksprimirani protein alfa-sinukleina širi na kontralateralnu stranu bez dokaza o prenosu samog lentivirusa, kako je utvrđeno PCR analizom (podaci nisu prikazani).
[0267] Ipsilateralni i kontralateralni nivoi hipokampusa lentivirusno eksprimiranog alfa-sinukleina kod ne-tg miševa koji su pasivno imunizovani 9E4 antitelom (9E4 - mišja verzija PRX002 (Prothena)) bili su skoro identični nivoima ipsilateralnog i kontralateralnog ekspresnog hipokampa alfa-sinuklein kod ne-tg miševa koji su bili pasivno imunizirani sa NIP228 izotipom kontrolnog mišjeg IgG1 (Slika 12 A, B, C; 9E4 u poređenju sa NIP228), što ukazuje da je 9E4 kada se dozirao u dozi od 20 mg/kg nedeljno tokom 13 nedelja preko IP put ne blokira širenje alfasinukleina u ovom modelu širenja alfa-sinukleina.
[0268] Nasuprot tome, ipsilateralni i kontralateralni nivoi hipokampusa alfa-sinukleina eksprimiranog lentivirusom kod ne-tg miševa koji su pasivno imunizovani bilo aslo0452 ngl-3 antitelom ili efektor null mutantnom verzijom aslo0452 ngl-3 (aslo0452-ngl -D265A), gde zamena asparaginske kiseline alaninom na poziciji 265 (D265A) u mišjem IgG1 dovodi do gubitka interakcije između ovog izotipa i IgG Fc receptora niskog afiniteta (FcIRIIB i FcIRIII) pronađenih na mikrogliji, bili su veoma značajno niži od ipsilateralni i kontralateralni hipokampalni nivoi alfa-sinukleina eksprimiranog lentivirusno kod ne-tg miševa koji su pasivno imunizovani sa NIP228 izotip kontrolnog mišjeg IgG1 (Slika 12 A, B, C; aslo0452-ngl-3 & aslo0452-D265-3 u poređenju sa NIP228). Ovo ukazuje da pasivna imunizacija miševa sa aslo0452-ngl-3 ili efektornom nultom D265A mutantnom verzijom aslo0452-ngl-3 snažno blokira širenje alfa-sinukleina u ovom mišjem modelu alfa-sinukleinopatije. Slični rezultati su dobijeni kada je LV-Į-sin vektor ubrizgan u desni hipokampus Į-sin tg miševa; pasivna imunizacija aslo0452-ngl-3 ili aslo0452-ngl-3-D265A, ali ne i 9E4, dovela je do snažnog i statistički značajnog smanjenja ipsilateralnog i kontralateralnog nivoa imunoreaktivnosti alfa-sinukleina u hipokampusu u poređenju sa NIP228-tretiranim Į-sin tg miša (Slika 15 A,B,C).
[0269] Pri većem uvećanju lentivirusno eksprimirani imunoreaktivni depoziti alfa-sinukleina bili su uočljivi duž oba ipsilateralna aksona ubrizgane strane i kontralateralnih aksona neinjektirane strane ne-tg miševa (Slika 13 A; crne strelice koje pokazuju trans-hipokampalne aksone), što sugeriše da se širenje alfa-sinukleina do kontralateralnog hipokampusa uglavnom može desiti duž aksona (trans-aksonsko širenje). Ipsilateralni i kontralateralni nivoi aksonalnih depozita alfasinukleina kod ne-tg miševa pasivno imunizovanih bilo 9E4 antitelom ili NIP228 izotipom kontrolnog miša IgG1 nisu se značajno razlikovali (Slika 13 A, B, C; 9E4 u poređenju sa NIP228), što ukazuje da pod u našim eksperimentalnim uslovima, 9E4 ne utiče na nivoe aksonalnih depozita alfa-sinukleina niti smanjuje diseminaciju alfa-sinukleina duž aksona u ovom modelu širenja lentivirusne-alfa-sinukleinopatije.
[0270] Nasuprot tome, ipsilateralni i kontralateralni nivoi aksonalnih depozita alfa-sinukleina kod ne-tg miševa pasivno imuniziranih bilo aslo0452 ngl-3 antitelom ili efektor nul mutantnom verzijom aslo0452-ngl-3 (aslo0452-ngl-3-D265A), bili su značajno niži od nivoa aksonalnih depozita alfa-sinukleina kod ne-tg miševa tretiranih sa NIP228 izotipom kontrolnog mišjeg IgG1 (Slika 13 A,B,C; aslo0452-ngl-3 & aslo0452-ngl-3-D265A u poređenju sa NIP228 ), što ukazuje na to da pasivna imunizacija miševa sa aslo0452-ngl-3 ili efektor null D265A mutantnom verzijom aslo0452-ngl-3 čisti aksonalne depozite alfa-sinukleina i snažno blokira ipsilateralni na kontralateralni transfer alfa-sinukleina duž aksona u ovom mišjem modelu lentivirusne-alfasinukleinopatije.
[0271] Veoma slični rezultati su dobijeni kada je LV-Į-sin vektor ubrizgan u desni hipokampus Į-sin tg miševa; pasivna imunizacija sa aslo0452-ngl-3 ili aslo0452-ngl-3-D265A, ali ne i sa 9E4, dovela je do snažnog i statistički značajnog smanjenja ipsilateralnog i kontralateralnog nivoa imunoreaktivnosti alfa-sinukleina duž aksona u poređenju sa Į-sin tretiranim NIP228 tg miševa (Slika 16 A,B,C).
[0272] Kod LV-Į-sin injektiranih ne-tg miševa, pri većem uvećanju intenzivna alfa-sinukleinska imunoreaktivnost je otkrivena u neuropilu ipsilateralnog hipokampusa i u manjoj meri u neuropilu ipsilateralnog neokorteksa (Slika 14 A). Pored toga, intenzivne naslage alfa-sinukleina su otkrivene u nizu identifikovanih tela neuronskih ćelija (soma) u CA1 regionu ipsilateralnog hipokampusa, a slabija imunoreaktivnost alfa-sinukleina je otkrivena u neuronima sloja 5 ipsilateralnog neokorteksa (Slika 14; crne strelice). Dok tretman sa 9E4 antitelom nije značajno promenio broj ipsilateralnih CA1 hipokampalnih neurona ili neokortikalnih neurona ipsilateralnog sloja 5 koji sadrže depozite alfa-sinukleina u poređenju sa ne-tg miševima imunizovanim sa NIP228 izotipom kontrolnog mišjeg IgG (Slika 14 A, B, C; 9E4 u poređenju sa NIP228), ne-tg miševi tretirani ili sa aslo0452 ngl-3 antitelom ili efektor null mutantnom verzijom aslo0452-ngl-3 (aslo0452-ngl-3-D265A) imali su značajno smanjen broj ipsilateralnih CA1 neurona i ipsilateralnog sloja 5 neurona koji sadrže depozite alfa-sinukleina u poređenju sa NIP228 izotipom kontrolnih miševa tretiranih IgG ne-tg miševa (Slika 14 A,B,C; aslo0452-ngl-3 & aslo0452-ngl-3-D265A u poređenju sa NIP228).
[0273] Takođe, intenzitet alfa-sinukleinske imunoreaktivnosti u neuropilu i neuronima ipsilateralnog CA1 regiona hipokampusa i ipsilateralnog sloja 5 regiona neokorteksa bio je primetno niži kod aslo0452-ngl-3-tretiranih i aslo0452-ngl-3-D265A- tretirani ne-tg miševi u poređenju sa NIP228 kontrolnim mišem izotipa IgG tretiranim ne-tg miševima (Slika 14 A; aslo0452-ngl-3 & aslo0452-ngl-3-D265A u poređenju sa NIP228).
[0274] Slični rezultati su dobijeni kada je LV-Į-sin vektor ubrizgan u desni hipokampus Į-sin tg miševa; tretman sa aslo0452-ngl-3 ili aslo0452-ngl-3-D265A, ali ne i 9E4, doveo je do statistički značajnog smanjenja broja neurona koji sadrže jaku alfa-sinukleinsku imunoreaktivnost u ipsilateralnom CA1 hipokampu i neokortikalnim regionima sloja 5, kao i u kontralateralni CA1 hipokampalni region, u poređenju sa NIP228 tretiranim Į-sin tg miševima (Slika 17 A, B, C, D).
[0275] Pokazalo se da je pasivna imunizacija bilo ne-tg divljeg tipa miševa ili Į-sin tg miševa koji su oboje stereotaksički ubrizgani lentivirusnim vektorom koji pokreće ekspresiju humanog alfasinukleina na jednoj strani hipokampusa, sa visokim afinitetom anti-alfa-sinuklein mišje IgG1 antitelo aslo0452-ngl-3 snažno smanjuje ipsilateralno-kontralateralno trans-aksonsko širenje lentivirusno eksprimiranog alfa-sinukleina koje je primećeno u ovom mišjem modelu razmnožavanja alfa-sinukleina. Ovo novo otkriveno svojstvo anti-alfa-sinukleinskog antitela da inhibira širenje alfasinukleina in vivo ukazuje na vezivanje za drugačiji epitop humanog alfasinukleina u poređenju sa antitelima koja ne inhibiraju širenje u testiranom modelu, npr.9E4 antitelo.
[0276] Štaviše, podaci koji pokazuju da je efektorska null D265A mutantna verzija aslo0452-ngl-3 podjednako efikasna kao aslo0452-ngl-3 u smanjenju širenja alfa-sinukleina u modelu ukazuju na to da prevencija širenja alfa-sinukleina posredovana antitelom ne zahteva Efektor povezan sa Fc funkcioniše kao ključni mehanizam delovanja, a posebno ukazuje na to da izgleda da nema potrebe ili uloge za Fc receptore (FcYRIIB i FcYRIII) prisutnih na mikrogliji u blokadi širenja alfa-sinukleina posredovanom antitelima.
[0277] Ukratko, antitela predmetnog pronalaska koja ciljaju alfa-sinuklein, kao i njegov fragment koji se vezuje za antigen, imaju potencijal da modifikuju bolest kod PD ili DLB ili MSA blokiranjem ili usporavanjem patološkog preuzimanja alfa-sinukleina u ćelije primaoca i sprečavaju sejanje i prenošenje alfa-sinukleinske patologije između anatomski povezanih regiona mozga. Na ovaj način, antitela koja ciljaju alfa-sinuklein mogu lečiti ili sprečiti progresiju bolesti i biti od terapeutske koristi za pacijente sa sinukleinopatijama kao što su PD, DLB ili MSA.
Primer 13: Generisanje 0452 ngl-3-BBBt0626gl bispecifičnih antitela
[0278] Primeri bispecifičnih antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom koji sadrže humani IgG1 TM kičme povezan sa jednim lančanim fragmentom (scFv) BBBt0626gl, kalemljenim na N-terminus (Bis2 format) ili C-terminus (Bis3 format) teškog lanca aslo0452 ngl-3 su generisani kao što je opisano u nastavku.
[0279] Bispecifično antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom, u Bis2 formatu, generisano je sintetičkim stvaranjem DNK fragmenta koji kodira Bbbt0626glscFv-(G4S)x2-aslo0452 ngl-3 VH ili Bbbt0626wt-(G4S)x2-aslo-352 koji sadrži BssHII i BstEII bočna restrikciona mesta endonukleaze, uzvodno od Bbbt0626glscFv ili Bbbt0626vt i nizvodno od aslo0452 ngl-3 VH, respektivno. Digestivni fragmenti DNK su zatim usmereno klonirani u kičmu vektora hIgG1TM.
[0280] Bispecifično antitelo prema predmetnom pronalasku, u Bis3 formatu, generisano je PCR amplifikacijom praćeno usmerenim kloniranjem korišćenjem restrikcionih endonukleaznih mesta (Sfil i Xbal). Generisana su dva PCR fragmenta: (1) amplifikacija hIgG1TM -CH3 domena sa Sfil restrikcionog mesta do C-terminalnog kraja CH3 domena i (2) preklapajući PCR fragment sa prednjim PCR oligom koji uključuje C-terminalni kraj CH3-(G4S)x3 linkera (SEQ ID NO: 57) i N-terminalnog kraja Bbbt0626gl scFv zajedno sa oligo koji pojačava C-terminalni kraj Bbbt0626gl scFv i neposredne nizvodne vektorske sekvence iza Xbal restrikcionog mesta. Oba PCR fragmenta su spojena zajedno u PCR reakciji povlačenja i potom usmereno klonirana u pEU1_4 (humani IgG1TM vektor) preko Sfil i Xbal restrikcionih endonukleaza mesta.
[0281] Ova bispecifična antitela su eksprimirana u sistemu ekspresije zasnovanom na CHO i rezultujuća antitela su prečišćena prečišćavanjem kolone proteina A. Sva bispecifična antitela izvedena iz Bbbt0626 su testirana na in vitro vezivanje za endotelnu ćelijsku liniju mozga miša (b.end3) da bi se potvrdila aktivnost vezivanja BBB transportera i takođe testirana na konkurenciju vezivanja takođe0452 ngl-3 u takmičenju epitopa zasnovanog na HTRF test za potvrdu vezivanja za aslo0452 ngl-3 epitop.
1
2
4
1
2
�
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment koji se vezuje za humani Į-sinuklein, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrži:
a) tri teška lanca CDRs koja imaju sekvence:
(i) H-CDR1 iz SEQ ID NO: 5,
(ii) H-CDR2 iz SEQ ID NO: 15; i
(iii) H-CDR3 iz SEQ ID NO: 16, i
b) tri laka lanca CDRs koja imaju sekvence:
(i) L-CDR1 iz SEQ ID NO: 20,
(ii) L-CDR2 iz SEQ ID NO: 10; i
(iii) L-CDR3 iz SEQ ID NO: 21.
2. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment se vezuju za humani Į-sinuklein sa KDmanjim od 500 pM.
3. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrže varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu amino kiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci amino kiseline SEQ ID NO: 14.
4. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrže varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 14.
5. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrže varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu amino kiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci amino kiseline SEQ ID NO: 19.
6. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrže varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 19.
7. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment je antitelo.
8. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrže trostruku mutaciju na Fc regionu koji odgovara L234F/L235E/P331S numerisan na osnovu Kabat numeracije.
9. Antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 8, za upotrebu u prevenciji ili lečenju Į-sinukleinopatije.
10. Antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu Į-sinukleinopatija je odabrana između Parkinsonove bolesti (PD), demencije sa Lewy-jevim telom (DLB), i višestruke sistemske atrofije (multiple system atrophy (MSA)).
11. Antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu Į-sinukleinopatija je Parkinsonova bolest (PD).
12. Antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu Į-sinukleinopatija je višestruka sistemska atrofija (multiple system atrophy (MSA)).
RS20211502A 2016-06-02 2017-06-01 Antitela na alfa-sinukleinu i njihova upotreba RS62682B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662344746P 2016-06-02 2016-06-02
EP17728525.1A EP3463435B1 (en) 2016-06-02 2017-06-01 Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
PCT/EP2017/063406 WO2017207739A1 (en) 2016-06-02 2017-06-01 Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62682B1 true RS62682B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=59021492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211502A RS62682B1 (sr) 2016-06-02 2017-06-01 Antitela na alfa-sinukleinu i njihova upotreba

Country Status (37)

Country Link
US (5) US10160800B2 (sr)
EP (2) EP3463435B1 (sr)
JP (3) JP7078552B2 (sr)
KR (1) KR102499438B1 (sr)
CN (2) CN109475616B (sr)
AR (1) AR108663A1 (sr)
AU (2) AU2017272804B2 (sr)
BR (1) BR112018074978A2 (sr)
CA (1) CA3025987A1 (sr)
CL (1) CL2018003438A1 (sr)
CO (1) CO2018014010A2 (sr)
CY (1) CY1124896T1 (sr)
DK (1) DK3463435T3 (sr)
EA (2) EA038358B1 (sr)
EC (1) ECSP18096095A (sr)
ES (1) ES2903402T3 (sr)
GE (2) GEAP202114964A (sr)
HR (1) HRP20211935T1 (sr)
HU (1) HUE057214T2 (sr)
IL (1) IL263243A (sr)
LT (1) LT3463435T (sr)
MA (1) MA45125B1 (sr)
MD (1) MD3463435T2 (sr)
MX (1) MX393740B (sr)
MY (1) MY188183A (sr)
PE (2) PE20190440A1 (sr)
PH (1) PH12018502538A1 (sr)
PL (1) PL3463435T3 (sr)
PT (1) PT3463435T (sr)
RS (1) RS62682B1 (sr)
SG (1) SG11201810420YA (sr)
SI (1) SI3463435T1 (sr)
SM (1) SMT202200008T1 (sr)
TW (2) TWI765890B (sr)
UA (1) UA124733C2 (sr)
WO (1) WO2017207739A1 (sr)
ZA (1) ZA201808582B (sr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
AR110074A1 (es) 2016-11-15 2019-02-20 H Lundbeck As Agentes, usos y métodos para el tratamiento de la sinucleinopatía
CN110072888B (zh) 2016-12-16 2023-07-18 H.隆德贝克有限公司 药剂、用途和方法
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
CN110506057B (zh) 2017-02-17 2023-09-29 百时美施贵宝公司 Alpha突触核蛋白抗体及其应用
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
WO2020079113A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Anti-synuclein antibodies
TWI734279B (zh) * 2018-12-14 2021-07-21 美商美國禮來大藥廠 抗α-突觸核蛋白抗體及其用途
KR20210154179A (ko) 2019-04-18 2021-12-20 에이씨 이뮨 에스.에이. 치료 및 진단용 신규한 분자
CN110172098B (zh) * 2019-05-27 2023-03-10 长春工业大学 抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用
US20230074436A1 (en) 2019-09-20 2023-03-09 Denali Therapeutics Inc. Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use thereof
KR102239512B1 (ko) * 2020-09-10 2021-04-12 서울대학교산학협력단 다중기능성 마이크로캡슐 조성물 및 그 제조방법
EP4229082A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 AC Immune SA Antibodies binding to alpha-synuclein for therapy and diagnosis
CN112920274A (zh) * 2021-03-17 2021-06-08 江苏贝格尔生物医药有限公司 一种检测alpha-synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用
CN113912716B (zh) * 2021-12-15 2022-03-01 北京凯祥弘康生物科技有限公司 针对α-突触核蛋白抗原的抗体及其应用
KR20250148576A (ko) 2022-12-29 2025-10-14 아스트라제네카 아베 알파-시누클레인병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0108923B8 (pt) 2000-03-03 2021-05-25 Cambridge Antibody Tech Limited elemento de ligação específico, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos para produzir um elemento de ligação específico ou domínio vh ou vl de anticorpo, e, para obter um elemento de ligação específico que liga eotaxina
US7943129B2 (en) 2000-05-26 2011-05-17 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
EP1309341A2 (en) 2000-07-07 2003-05-14 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
US9034337B2 (en) 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
SI1633189T1 (sl) 2003-05-19 2017-12-29 Prothena Biosciences Limited Skrajšani fragmenti alfa-sinukleina pri bolezni Lewyjevih telesc
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
MX2007001679A (es) 2004-08-09 2007-05-23 Elan Pharm Inc Prevencion y tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica y amiloidogenica.
US20090047300A1 (en) 2005-09-27 2009-02-19 Abedelnasser Abulrob Blood-brain barrier epitopes and uses thereof
PL2118300T3 (pl) 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
JP4934074B2 (ja) 2007-03-07 2012-05-16 株式会社アルファ スイッチ固定構造
PT2282758T (pt) 2008-04-29 2019-02-12 Bioarctic Ab Anticorpos e vacinas para uso em métodos terapêuticos e diagnósticos para perturbações relacionadas com a alfa-sinucleína
AU2009328505B2 (en) 2008-12-19 2014-11-27 Panima Pharmaceuticals Ag Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
JP4654348B1 (ja) 2010-02-23 2011-03-16 多摩川精機株式会社 検出装置用巻線の正弦波巻線方法
CA2789963C (en) 2010-02-26 2019-09-03 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies
HUE041391T2 (hu) 2011-06-23 2019-05-28 Biogen Int Neuroscience Gmbh Anti-alfa-szinukleinkötõ molekulák
US8609820B2 (en) 2011-10-28 2013-12-17 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US9534044B2 (en) * 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
CA2924268C (en) * 2013-11-21 2021-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
DK3218406T4 (da) 2014-11-10 2024-12-09 Medimmune Ltd Bindingsmolekyler, der er specifikke for cd73, og anvendelser deraf

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20211935T1 (hr) 2022-03-18
EA202191380A1 (ru) 2021-08-26
KR102499438B1 (ko) 2023-02-14
DK3463435T3 (da) 2021-11-22
CA3025987A1 (en) 2017-12-07
PE20250392A1 (es) 2025-02-11
US10160800B2 (en) 2018-12-25
TW202309093A (zh) 2023-03-01
PH12018502538A1 (en) 2019-04-08
SG11201810420YA (en) 2018-12-28
CN116120445A (zh) 2023-05-16
MD3463435T2 (ro) 2022-03-31
EA038358B1 (ru) 2021-08-13
CL2018003438A1 (es) 2019-03-22
US11560424B2 (en) 2023-01-24
MX2018014456A (es) 2019-08-12
SI3463435T1 (sl) 2022-02-28
JP7823118B2 (ja) 2026-03-03
SMT202200008T1 (it) 2022-03-21
BR112018074978A2 (pt) 2019-03-12
PT3463435T (pt) 2021-11-22
PL3463435T3 (pl) 2022-02-14
US20190276522A1 (en) 2019-09-12
ECSP18096095A (es) 2019-01-31
US20250263477A1 (en) 2025-08-21
AU2024200601A1 (en) 2024-04-18
MA45125B1 (fr) 2021-11-30
US20180002411A1 (en) 2018-01-04
JP7078552B2 (ja) 2022-05-31
EA201892548A1 (ru) 2019-06-28
AR108663A1 (es) 2018-09-12
EP3463435B1 (en) 2021-10-13
CN109475616A (zh) 2019-03-15
CY1124896T1 (el) 2023-01-05
JP2024123247A (ja) 2024-09-10
GEAP202114964A (en) 2021-01-25
EP4000632A1 (en) 2022-05-25
LT3463435T (lt) 2021-12-27
AU2017272804B2 (en) 2023-11-23
JP2019527194A (ja) 2019-09-26
EP3463435A1 (en) 2019-04-10
KR20190013923A (ko) 2019-02-11
CO2018014010A2 (es) 2019-01-18
WO2017207739A1 (en) 2017-12-07
IL263243A (en) 2018-12-31
TW201802119A (zh) 2018-01-16
GEP20217253B (en) 2021-05-13
ES2903402T3 (es) 2022-04-01
TWI765890B (zh) 2022-06-01
MX393740B (es) 2025-03-24
US20230331830A1 (en) 2023-10-19
US10889639B2 (en) 2021-01-12
CN109475616B (zh) 2022-10-18
NZ748616A (en) 2025-08-29
PE20190440A1 (es) 2019-03-27
UA124733C2 (uk) 2021-11-10
MY188183A (en) 2021-11-24
US20210179698A1 (en) 2021-06-17
AU2017272804A1 (en) 2018-12-13
JP2022110117A (ja) 2022-07-28
HUE057214T2 (hu) 2022-04-28
MA45125A (fr) 2021-06-02
ZA201808582B (en) 2021-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7823118B2 (ja) α－シヌクレインに対する抗体およびその使用
JP7138322B2 (ja) シヌクレイノパチーの治療のための薬剤、使用および方法
JP6952827B2 (ja) 血液脳関門輸送分子およびそれらの使用
CA2713786A1 (en) Anti-trka antibodies and antigen-binding derivatives thereof
US20230110188A1 (en) MuSK AGONIST ANTIBODY
HK40072606A (en) Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
HK40093237A (zh) 针对α-突触核蛋白的抗体及其用途
HK40007492B (en) Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
JP7796049B2 (ja) 抗ＥｐｈＡ４抗体
HK40005896B (zh) 针对α-突触核蛋白的抗体及其用途
HK40005896A (en) Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
EA048795B1 (ru) Антитело к epha4
HK40092741A (zh) 抗epha4抗体