ES2905479T3 - Acidos grasos y su uso en la conjugación con biomoléculas - Google Patents

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Jun Yuan
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Abstract

Un conjugado que comprende una biomolécula unida a un ácido graso mediante un enlazador, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos del mismo o un dímero del mismo, y en donde el ácido graso tiene la siguiente Fórmula A1: **(Ver fórmula)** R1 es CO2H; R2 y R3 son independientemente entre sí H, OH, CO2H, -CH=CH2 o -C=CH; n y m son independientemente entre sí un número entero entre 6 y 30; o una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos grasos y su uso en la conjugación con biomoléculas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevos conjugados de GDF15 que tienen una semivida y una duración de acción mejoradas, y a un método para prepararlos y usarlos. La invención se refiere además a nuevos ácidos grasos y a su uso para prolongar la semivida de biomoléculas mediante conjugación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los péptidos y las proteínas se utilizan ampliamente en la práctica médica y, dado que pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante, se puede esperar que su importancia aumente también en los años venideros. El número de péptidos y proteínas endógenos conocidos con actividades biológicas interesantes está creciendo rápidamente, también como resultado de la exploración en curso del genoma humano. Debido a sus actividades biológicas, muchos de estos polipéptidos y proteínas podrían utilizarse en principio como agentes terapéuticos. Sin embargo, los péptidos o las proteínas endógenos no siempre son adecuados como posibles fármacos porque suelen tener semividas de algunos minutos debido a la rápida degradación por peptidasas y/o debido a la filtración renal y la excreción en la orina. La semivida de los polipéptidos o las proteínas en el plasma humano varía considerablemente (desde algunos minutos a más de una semana).
Un alto aclaramiento de un agente terapéutico es poco práctico en los casos en los que se desea mantener un alto nivel en sangre del mismo durante un período de tiempo prolongado. Una forma que se ha utilizado actualmente para superar esta desventaja es administrar al paciente grandes dosis de péptidos o proteínas terapéuticos de interés, de modo que aunque parte del péptido o de la proteína terapéutica se degrade, quede una cantidad suficiente para ser terapéuticamente eficaz. Sin embargo, este método resulta incómodo para los pacientes. Dado que la mayoría de los péptidos o proteínas terapéuticos no se pueden administrar por vía oral, los péptidos o las proteínas terapéuticas tendrían que infundirse constantemente, infundirse frecuentemente mediante inyección intravenosa o administrarse frecuentemente mediante la vía poco práctica de inyecciones subcutáneas. La necesidad de una administración frecuente también hace que muchas de las posibles terapias con péptidos o proteínas tengan un coste de tratamiento previsto inaceptablemente alto. La presencia de grandes cantidades de péptidos o proteínas degradados también puede generar efectos secundarios no deseados.
La incomodidad en la administración y los altos costes son dos razones por las que la mayoría de los péptidos o proteínas terapéuticos con perfiles de bioactividad atractivos no pueden desarrollarse como posibles fármacos. Por lo tanto, un enfoque para prolongar la semivida de los péptidos o las proteínas es modificar los péptidos terapéuticos o las proteínas terapéuticas de tal manera que su degradación se ralentice mientras se mantiene la actividad biológica. La seroalbúmina tiene una semivida de más de una semana, y un enfoque para aumentar la semivida plasmática de los péptidos o las proteínas ha sido derivatizarlos con una entidad química que se una a la seroalbúmina o a otras proteínas plasmáticas.
Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevas fracciones que prolonguen la semivida para modificar biomoléculas terapéuticas, tales como péptidos y proteínas, con el fin de proporcionar una duración de acción in vivo más prolongada manteniendo al mismo tiempo una baja toxicidad y ventajas terapéuticas.
Michael J. Hackett et al, "A dicarboxylic fatty acid derivative of paclitaxel for albumin-assisted drug delivery", Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 101, n.° 9, 6 de junio de 2012, páginas 3292 - 3304, describen la conjugación de un ácido graso dicarboxílico con paclitaxel para unirse a la seroalbúmina.
D. Lefort et al, "Free-radical addition of alcohols and acids to 10-undecenoic ester, 10-undecen-1-ol, and 10-undecenyl acetate", Bulletin of the Academy of Sciences of the USSR, Division of Chemical Sciences, vol. 16, n.° 3, 1 de marzo de 1967, páginas 623 - 627, describen la síntesis de un ácido dicarboxílico.
Su Young Chae et al, "The Fatty aicd conjugated exendin-4 analogs for type 2 antidiabetic therapeutics", Journal of Controlled Release, vol. 144, n.° 1, 21 de mayo de 2010, páginas 10 - 16, describen la modificación de la exendina-4 utilizando los dos ácidos grasos, el ácido láurico y el ácido palmítico.
Sung In Lim et al, "Site-specific fatty acid-conjugation to prolong protein half-life in vivo", Journal of Controlled Release, vol. 170, n.° 2, 2 de junio de 2013, páginas 219 - 225, describen la conjugación de ácidos grasos específicos de sitio con un sitio permisivo de una proteína, utilizando cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un conjugado que comprende una biomolécula unida a un ácido graso mediante un enlazador, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15, siglas del inglés Growth Differentiation Factor 15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos del mismo o un dímero del mismo, y en donde el ácido graso tiene la siguiente Fórmula A1:
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R1 es CO2H;
R2 y R3 son independientemente entre sí H, OH, CO2H, -CH=CH2 o —C=CH;
n y m son independientemente entre sí un número entero entre 6 y 30, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Se ha descubierto que cuando el ácido graso de Fórmula A1 se conjuga con una biomolécula de interés a través de un enlazador, aumenta la semivida de dicha biomolécula a un grado mucho mayor que el de los restos de ácidos grasos usados más comúnmente.
En otra realización, la invención se refiere a un conjugado en donde al menos uno de R2 y R3 es CO2H.
En otra realización más, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado de la invención y uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables.
En otra realización más, la invención se refiere a combinaciones que incluyen un conjugado de la invención, y combinaciones farmacéuticas de uno o más agentes terapéuticamente activos.
La presente invención contempla el uso de los conjugados descritos en el presente documento, y su composición, para tratar y/o prevenir diversas enfermedades, trastornos y afecciones, y/o los síntomas de los mismos.
Los conjugados de la invención pueden usarse en un método para el tratamiento de enfermedades o trastornos metabólicos, diabetes, diabetes mellitus tipo 2, obesidad, esteatosis hepática/esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica y otras hepatopatías progresivas, pancreatitis, dislipidemia, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, arteriopatía periférica, accidente cerebrovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía coronaria, complicaciones diabéticas (incluida la hepatopatía crónica), neuropatía, gastroparesia y otros trastornos metabólicos, en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos del mismo.
Estos y otros aspectos de la invención se explicarán en la siguiente descripción detallada de la invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones:
A efectos de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones a menos que se especifique lo contrario y cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "uno", "el" y "la", incluyen referentes en plural, a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "el conjugado" incluye la referencia a uno o más conjugados; la referencia a "el polipéptido" incluye la referencia a uno o más polipéptidos, etcétera.
El término alquilo se refiere a una fracción hidrocarbonada ramificada o no ramificada (o de cadena lineal o no lineal) completamente saturada, que comprende de 1 a 30 átomos de carbono. Preferentemente, el alquilo comprende de 5 a 20 átomos de carbono, y más preferentemente de 10 a 15 átomos de carbono. Alquilo C10-15 se refiere a una cadena de alquilo que comprende de 10 a 15 carbonos. El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente como se define anteriormente.
El término "alquenilo" se refiere a un hidrocarburo ramificado o no ramificado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. El término "alquinilo C2-30" se refiere a un hidrocarburo que tiene de dos a siete átomos de carbono y que comprende al menos un triple enlace carbono-carbono
El término "alquinilo" se refiere a un hidrocarburo ramificado o no ramificado que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. El término "alquinilo C2-30" se refiere a un hidrocarburo que tiene de dos a siete átomos de carbono y que comprende al menos un triple enlace carbono-carbono.
El término arilo se refiere a grupos hidrocarbonados aromáticos, monocíclicos o bicíclicos, que tienen 6-10 átomos de carbono en la parte del anillo. Son ejemplos representativos de arilo, fenilo o naftilo.
El término heteroarilo incluye heteroarilo monocíclico o bicíclico, que contiene de 5-10 miembros del anillo seleccionados de átomos de carbono y de 1 a 5 heteroátomos, y cada heteroátomo se selecciona independientemente de O, N o S en donde S y N pueden oxidarse a varios estados de oxidación. Para el sistema heteroarilo bicíclico, el sistema es completamente aromático (es decir, todos los anillos son aromáticos).
El término cicloalquilo se refiere a grupos hidrocarbonados monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos saturados o insaturados, pero no aromáticos, de 3-12 átomos de carbono, preferentemente de 3-8 o de 3-7 átomos de carbono. Para el sistema cicloalquilo bicíclico y tricíclico, todos los anillos son no aromáticos. Por ejemplo, cicloalquilo incluye cicloalquenilo y cicloalquinilo. El término "cicloalquenilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado bicíclico o tricíclico de 3-12 átomos de carbono, que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. El término "cicloalquinilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado bicíclico o tricíclico de 3-12 átomos de carbono, que tiene al menos un triple enlace carbonocarbono.
El término heterociclilo se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico no aromático (parcialmente insaturado pero no aromático) saturado o insaturado que contiene al menos un heteroátomo seleccionado de O, S y N, en que N y S también pueden ser opcionalmente oxidado a diversos estados de oxidación. En una realización, la fracción heterociclilo representa un anillo monocíclico saturado que contiene de 5-7 átomos de anillo y que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional, seleccionado de O, S o N. El anillo heterocíclico puede estar sustituido con alquilo, halo, oxo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi. En otra realización, el heterociclilo es dicíclico o tricíclico. En el caso del sistema policíclico, algunos anillos pueden ser aromáticos y estar fusionados con un anillo o anillos saturados o parcialmente saturados. El sistema fusionado global no es completamente aromático. Por ejemplo, un sistema de anillo heterocíclico puede ser un anillo de heteroarilo aromático fusionado con un sistema de anillo de cicloalquilo saturado o parcialmente saturado.
Se pretende que el término "conjugado" se refiera a la entidad formada como resultado de una conexión covalente de una biomolécula y una fracción de ácido graso, a través de un enlazador. El término "conjugación" se refiere a la reacción química que da como resultado la conexión covalente de la biomolécula y de la fracción de ácido graso. Biomolécula:
Como se usa en el presente documento, el término biomolécula incluye el polipéptido GDF15, un homólogo, una variante, un mutante y un fragmento del mismo.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea producido de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 restos de aminoácidos se denominan comúnmente "péptidos". El término "péptido" pretende indicar una secuencia de dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en donde dichos aminoácidos pueden ser naturales o no naturales. El término incluye los términos polipéptidos y proteínas, que pueden estar constituidos por dos o más péptidos que se mantienen unidos mediante interacciones covalentes, tales como, por ejemplo, puentes de cisteína, o interacciones no covalentes. Las abreviaturas de una o tres letras reconocidas en la técnica se utilizan para representar restos de aminoácidos que constituyen los péptidos y polipéptidos de la invención. Excepto cuando está precedido por "D", el aminoácido es un L-aminoácido. Cuando la abreviatura de una letra es una letra mayúscula se refiere al D-aminoácido. Cuando la abreviatura de una letra es una letra minúscula, se refiere al L-aminoácido. Se utilizan grupos o cadenas o abreviaturas de aminoácidos para representar péptidos. Los péptidos se indican con el extremo N-terminal a la izquierda y la secuencia se escribe desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal. Como alternativa, se pueden emplear péptidos de la invención que contengan aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que no se encuentren en la naturaleza) y otros análogos de aminoácidos conocidos en la técnica.
Algunos aminoácidos no naturales pueden introducirse mediante la tecnología descrita en Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang y Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 o en la Patente de EE.UU. N.° 7.083.970. Brevemente, algunos de estos sistemas de expresión implican mutagénesis dirigida al sitio para introducir un codón sin sentido, tal como un TAG ámbar, en el marco abierto de lectura que codifica un polipéptido de la invención. A continuación, dichos vectores de expresión se introducen en un hospedador que puede utilizar un ARNt específico para el codón sin sentido introducido y se carga con el aminoácido no natural de elección. Como aminoácidos no naturales particulares que son beneficiosos con el propósito de conjugar fracciones con los polipéptidos de la invención, se incluyen los que tienen cadenas laterales de acetileno y azido.
Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos de carbohidrato. Algunos carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden añadirse a una proteína por la célula en la que la se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. En el presente documento, as proteínas se definen en términos de sus estructuras de la cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes, tales como grupos de carbohidrato, generalmente no se especifican, aunque sin embargo, pueden estar presentes. Una proteína o un polipéptido codificado por una molécula de ADN que no es del hospedador, es una proteína o un polipéptido "heterólogo".
Un "polipéptido aislado o una proteína aislada" es un polipéptido o una proteína (por ejemplo GDF15) que carece esencialmente de componentes celulares, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteicas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Normalmente, una preparación de polipéptido o proteína aislado contiene el polipéptido o la proteína en una forma sumamente purificada, es decir, con una pureza de al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, una pureza mayor de 95 %, tal como una pureza de 96 %, 97 % o 98 % o mayor o una pureza mayor de 99 %. Una forma de demostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido o proteína aislado es mediante la aparición de una sola banda después de la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS) de la preparación de proteína y la tinción con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido o proteína en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas. Preferentemente, el polipéptido aislado carece sustancialmente de cualquier otro polipéptido contaminante o de otros contaminantes que se encuentren en su entorno natural que interfieran con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de investigación.
Un experto habitual en la técnica apreciará que se pueden realizar diversas sustituciones de aminoácidos, p. ej., sustituciones conservativas de aminoácidos, en la secuencia de cualquiera de los polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, sin disminuir necesariamente su actividad. Como se usa en el presente documento, "aminoácido comúnmente utilizado como un sustituto del mismo" incluye sustituciones conservativas (es decir, sustituciones con aminoácidos de características químicas equiparables). Para los fines de la sustitución conservativa, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, glicina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares (hidrófilos) neutros incluyen serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos incluyen la sustitución de un L-aminoácido por su correspondiente D-aminoácido, la sustitución de cisteína por homocisteína u otros aminoácidos no naturales que tengan una cadena lateral que contenga tiol, la sustitución de una lisina por homolisina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiónico, ornitina u otros aminoácidos no naturales que tengan una cadena lateral que contenga amino, o la sustitución una alanina por norvalina o similares.
El término "aminoácido", como se usa en el presente documento, se refiere a aminoácidos de origen natural, a aminoácidos de origen no natural, a análogos de aminoácidos y a miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a la de los aminoácidos de origen natural, todos en sus estereoisómeros D y L si su estructura permite dichas formas estereoisoméricas. En el presente documento, los aminoácidos se mencionan por su nombre, por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.
La expresión "de origen natural" se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y que no son manipulados por el hombre. De manera similar, expresiones tales como "de origen no natural", "no natural" y similares, como se usan en el presente documento, se refieren a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre. Cuando se utiliza en relación con aminoácidos, la expresión "de origen natural" se refiere a los 20 aminoácidos convencionales (es decir, alanina (A o Ala), cisteína (C o Cys), ácido aspártico (D o Asp), ácido glutámico (E o Glu), fenilalanina (F o Phe), glicina (G o Gly), histidina (H o His), isoleucina (I o Ile), lisina (K o Lys), leucina (L o Leu), metionina (M o Met), asparagina (N o Asn), prolina (P o Pro), glutamina (Q o Gln), arginina (R o Arg), serina (S o Ser), treonina (T o Thr), valina (V o Val ), triptófano (W o Trp) y tirosina (Y o Tyr)).
Las expresiones "aminoácido no natural" y "aminoácido antinatural", como se usan en el presente documento, pretenden representar indistintamente estructuras de aminoácidos que no se pueden generar biosintéticamente en ningún organismo utilizando genes no modificados o modificados de cualquier organismo, ya sea el mismo o diferente. Las expresiones se refieren a un resto de aminoácido que no está presente en la secuencia proteica de origen natural (tipo silvestre) o en las secuencias de la presente invención. Estos incluyen aminoácidos modificados y/o análogos de aminoácidos que no son uno de los 20 aminoácidos de origen natural, selenocisteína, pirrolisina (Pyl) o pirrolinacarboxilisina (Pcl, por ejemplo, como se describe en la publicación de patente PCT WO2010/48582). Dichos residuos de aminoácidos no naturales pueden introducirse mediante sustitución de aminoácidos de origen natural y/o mediante inserción de aminoácidos no naturales en la secuencia proteica de origen natural (tipo silvestre) o en las secuencias de la invención. El resto de aminoácido no natural también puede incorporarse de modo que se imparta una funcionalidad deseada a la molécula, por ejemplo, la capacidad de unir una fracción funcional (por ejemplo, PEG). Cuando se utilice en relación con aminoácidos, el símbolo "U" significará "aminoácido no natural" y "aminoácido antinatural", tal como se usa en el presente documento.
El término "análogo", como se usa en el presente documento para referirse a un polipéptido o a una proteína, significa un péptido o proteína modificado en donde uno o más restos de aminoácidos del péptido/la proteína se han sustituido con otros restos de aminoácidos y/o en donde uno o más restos de aminoácidos se han delecionado del péptido/la proteína y/o en donde se han añadido uno o más restos de aminoácidos al péptido/la proteína. Dicha adición o deleción de restos de aminoácidos puede tener lugar en el extremo N-terminal del péptido y/o en el extremo C-terminal del péptido.
Como se usa en el presente documento, la expresión "éster del conjugado" se refiere a un conjugado que comprende un péptido o polipéptido en donde está presente un derivado éster de un grupo ácido carboxílico (por ejemplo, -CO2H en el extremo C-terminal se ha convertido en una forma -COOR) en donde R del éster se refiere a grupos alquilo C1-6 tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, etc., grupos cicloalquilo C3-8 tales como ciclopentilo, ciclohexilo, etc., grupos arilo C6-10 como fenilo, a-naftilo, etc., grupos arilo C6-10-alquilo C1-6, por ejemplo grupos fenil-alquilo C1-2 como bencilo, fenetilo, benzhidrilo, etc., y grupos a-naftil-alquilo C1-2 tales como a-naftilmetilo y similares. Cuando la fracción de péptido o polipéptido del conjugado posee grupos carboxilo o carboxilato adicionales en posiciones distintas del extremo C-terminal, los polipéptidos en los que dichos grupos están amidados o esterificados también están dentro de la categoría del polipéptido de la invención. En dichos casos, los ésteres pueden ser, por ejemplo, los mismos tipos de ésteres que los ésteres C-terminales mencionados anteriormente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "amida del conjugado" se refiere a un conjugado que comprende un péptido o polipéptido en donde está presente un derivado amida de un grupo ácido carboxílico (por ejemplo, -CO2H se ha convertido en -CO(NR'R') en donde R' es H o R y R es como se ha definido anteriormente. La expresión "amida del conjugado" también se refiere a un conjugado que comprende un péptido o polipéptido en donde está presente un derivado amida de un grupo amino (es decir, distinto del grupo amino conjugado con un ácido graso) (por ejemplo, —NH2 se ha convertido en —NH-C(O)R) en donde R es como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, una "amida del conjugado" es un conjugado que comprende un péptido o polipéptido en donde el grupo carboxílico en el extremo C-terminal ha sido amidado (por ejemplo, —CO2H se ha convertido en -C(O)NH2 , -C(O)NH-alquilo C1-6, -C(O)NH-alquilfenilo C1-2, o -C(O)N(alquilo C1-6)2).
Las expresiones "péptido GDF15", "polipéptido GDF15" y "proteína GDF15" se usan indistintamente y se refieren a un polipéptido de tipo silvestre de origen natural expresado en un mamífero, tal como un ser humano o un ratón. A efectos de esta divulgación, la expresión "proteína GDF15" se puede utilizar indistintamente para referirse a cualquier polipéptido GDF15 de longitud completa, que consiste en 308 restos de aminoácidos; (NCI Ref. Seq. NP_004855.2) que contiene un péptido señal de 29 aminoácidos (aminoácidos 1-29), un prodominio de 167 aminoácidos (aminoácidos 30-196) y un dominio maduro de 112 aminoácidos (aminoácidos 197-308) que se escinde del prodominio mediante proteasas de tipo furina. Un polipéptido GDF15 de 308 aminoácidos se denomina polipéptido GDF15 de "longitud completa"; un polipéptido GDF15 de 112 aminoácidos (por ejemplo, los aminoácidos 197-308) es un polipéptido GDF15 "maduro". El péptido GDF15 maduro contiene los siete restos de cisteína conservados necesarios para la formación del motivo del nudo de cisteína (que tiene tres enlaces disulfuro intracatenarios) y el enlace disulfuro intercadena único que son característicos de los miembros de la superfamilia TGF~. El péptido GDF15 maduro contiene dos restos de cisteína adicionales que forman un cuarto enlace disulfuro intracatenario. Por lo tanto, GDF15 biológicamente activo es un homodímero del péptido maduro enlazado covalentemente por un enlace disulfuro intercatenario. Por lo tanto, una proteína o un polipéptido GDF15 también incluye un multímero, más particularmente un dímero de la proteína. Cada unidad monomérica que constituye el homodímero GDF15 puede unirse a un ácido graso de Fórmula A1.
Por "GDF15" o "proteína GDF15" como se usa en el presente documento también se entiende GDF15 humano o un homólogo, una variante, un mutante, un fragmento o una forma modificada del mismo, que conserva al menos una actividad del GDF15 humano.
La expresión "polipéptido mutante GDF15" o "variante del polipéptido GDF15" incluye un polipéptido GDF15 en donde se ha modificado una secuencia polipeptídica GDF15 de origen natural. Dichas modificaciones incluyen una o más sustituciones de aminoácidos, incluidas sustituciones con aminoácidos de origen no natural, análogos de aminoácidos de origen no natural y miméticos de aminoácidos.
En un aspecto, la expresión "proteína mutante GDF15" o "variante del polipéptido GDF15" se refiere a una secuencia de proteína GDF15 en la que al menos un resto que se encuentra normalmente en una posición dada de un polipéptido GDF15 natural se deleciona o se reemplaza por un resto que normalmente no se encuentra en esa posición en la secuencia natural de GDF15. En algunos casos, será deseable reemplazar un solo resto que normalmente se encuentra en una posición dada de un polipéptido GDF15 natural con más de un resto que normalmente no se encuentra en la posición; en otros casos más, puede ser deseable mantener la secuencia de polipéptido GDF15 natural e insertar uno o más restos en una posición dada en la proteína; en otros casos, puede ser conveniente delecionar por completo un resto dado; todas estas construcciones están incluidas en la expresión "proteína mutante GDF15" o "variante de la proteína GDF15". En un aspecto de la invención, la proteína mutante GDF15 o la "variante de la proteína GDF15" tiene una secuencia seleccionada de una cualquiera de la SEQ ID NO 1 a la SEQ ID NO 7.
Por un "homólogo", "variante", "fragmento" o "forma modificada" de GDF15 o similar se entiende un polipéptido similar pero no idéntico a un GDF15 humano, pero que conserva al menos una actividad del GDF15 humano.
Por "forma modificada" de GDF15 se entiende un GDF15 que comprende una secuencia similar o idéntica a la de GDF15, pero que tiene una o más modificaciones, y que conserva al menos una actividad del GDF15 humano. Dicha modificación puede incluir, como ejemplos no limitantes, una modificación postraduccional (fosforilación, metilación o adición de un carbohidrato).
Por un "homólogo" de GDF15 se entiende un polipéptido correspondiente al GDF15 humano, pero de una fuente diferente, tal como un mamífero, tal como monos cinomolgos, ratones y ratas, etc., pero que conserva al menos una función del GDF15 humano. En algunos casos, se puede utilizar un homólogo de GDF15 para tratar o mejorar un trastorno metabólico en un sujeto en una forma madura de un polipéptido mutante de GDF15 que se obtiene de la misma especie que la del sujeto.
En diversas realizaciones, un polipéptido, homólogo, variante, mutante, fragmento o forma modificada de GDF15 del mismo comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 85 por ciento idéntica a una proteína GDF15 de origen natural. En otras realizaciones, un polipéptido GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos de un polipéptido GDF15 de origen natural. Dicho polipéptido GDF15, homólogo, variante, mutante, fragmento o forma modificada del mismo posee al menos una actividad de un polipéptido GDF15 mutante de tipo silvestre, tal como la capacidad para reducir los niveles de glucosa, insulina, triglicéridos o colesterol en sangre; la capacidad de reducir el peso corporal; o la capacidad de mejorar la tolerancia a la glucosa, el gasto energético o la sensibilidad a la insulina.
En diversas realizaciones respectivas, un polipéptido GDF15 o un homólogo, una variante, un mutante, un fragmento o una forma modificada del mismo, tiene una actividad biológica que es equivalente a la de la forma de origen natural de la proteína GDF15 madura, o mayor o menor que la de dicha proteína. Como ejemplos de actividades biológicas se incluyen la capacidad de reducir los niveles de glucosa, insulina, triglicéridos o colesterol en sangre; la capacidad de reducir el peso corporal; o la capacidad de mejorar la tolerancia a la glucosa, la tolerancia a los lípidos o la sensibilidad a la insulina; la capacidad de reducir la excreción de glucosa y proteínas en la orina.
Como se usa en el presente documento en el contexto de la estructura de un polipéptido o proteína, el término "N-terminal" (o "amino terminal") y "C-terminal" (o "carboxilo terminal") se refieren a los extremos amino y carboxilo del polipéptido, respectivamente.
La expresión "polipéptido terapéutico" o "proteína terapéutica", como se usa en el presente documento, significa un polipéptido o proteína que se está desarrollando para su uso terapéutico, o que se ha desarrollado para su uso terapéutico.
El enlazador separa la biomolécula y la fracción de ácido graso. Su estructura química no es crítica, ya que sirve principalmente como espaciador.
El enlazador es una fracción química que contiene dos grupos reactivos/grupos funcionales, uno de los cuales puede reaccionar con la biomolécula y el otro con la fracción de ácido graso. Los dos grupos reactivos/funcionales del enlazador están unidos mediante una fracción enlazadora o espaciador, cuya estructura no es crítica siempre que no interfiera con el acoplamiento del enlazador a la biomolécula y la fracción de ácido graso de Fórmula A1.
El enlazador puede estar formado por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. En algunas realizaciones de la presente invención, el enlazador está formado por 1 a 20 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos de origen natural. En diversas realizaciones, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de los aminoácidos glicina, serina, alanina, metionina, asparagina, glutamina, cisteína y lisina. En algunas realizaciones, un enlazador está formado por una mayoría de aminoácidos que no tienen impedimentos estéricos, tales como glicina y alanina. En algunas realizaciones, los enlazadores son poliglicinas, polialaninas, combinaciones de glicina y alanina (tal como poli(Gly-Ala)) o combinaciones de glicina y serina (tal como poli(Gly-Ser)). En algunas realizaciones, un enlazador está formado por una mayoría de aminoácidos seleccionados de histidina, alanina, metionina, glutamina, asparagina y glicina. En algunas realizaciones, los enlazadores contienen una fracción de polihistidina.
En algunas realizaciones, el enlazador comprende de 1 a 20 aminoácidos que se seleccionan de aminoácidos no naturales. Aunque se prefiere un enlazador de 1-10 restos de aminoácidos para la conjugación con la fracción de ácido graso, la presente invención contempla enlazadores de cualquier longitud o composición. Un ejemplo de enlazador de aminoácidos no natural es el ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico que tiene la siguiente fórmula:
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o sus unidades de repetición.
Los enlazadores descritos en el presente documento son ilustrativos, y la presente invención contempla enlazadores que son mucho más largos y que incluyen otros restos. En la presente invención también se contemplan enlazadores no peptídicos.
En otras realizaciones, el enlazador comprende uno o más grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos cicloalquilo, grupos arilo, grupos heteroarilo, grupos heterocíclicos, polietilenglicol y/o uno o más aminoácidos naturales o no naturales, o combinaciones de los mismos, en donde cada uno de los alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, polietilenglicol y/o los aminoácidos naturales o no naturales se combinan opcionalmente y se unen entre sí, o se unen a la biomolécula y/o a la fracción de ácido graso, mediante un grupo químico seleccionado de -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- o =NH-N(alquil)-.
Se pueden usar enlazadores que contienen un espaciador de alquilo, por ejemplo, —NH-(CH2)z-C(O)- o —S-(CH2)z-C(O)- o —O-(CH2)z-C(O)-, -NH-(CH2)z-NH-, -O-C(O)-(CH2)z-C(O)-O-, -C(O)-(CH2)z-O-, -NHC(O)-(CH2)z-C(O)-NH- y similares, en donde z es 2-20. Estos enlazadores de alquilo pueden estar sustituidos además por cualquier grupo que no produzca impedimentos estéricos, incluido un alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2 o fenilo.
El enlazador también puede ser de naturaleza polimérica. El enlazador puede incluir cadenas o unidades de polímero que sean bioestables o biodegradables. Los polímeros con enlaces repetidos pueden tener diversos grados de estabilidad en condiciones fisiológicas dependiendo de la labilidad del enlace. Los polímeros pueden contener enlaces tales como policarbonatos (-O-C(O)-O-), poliésteres (-C(O)-O-), poliuretanos (-NH-C(O)-O-), poliamida (-C(O)-NH-). Estos enlaces se proporcionan a modo de ejemplos, y no se pretende que limiten el tipo de enlaces que se pueden emplear en las cadenas o enlazadores poliméricos de la invención. Como polímeros adecuados se incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poliaminoácidos, diviniléter con anhídrido maleico, N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano, polipropilenglicol, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, celulosa y derivados de celulosa, almidón y derivados de almidón, polialquilenglicol y derivados del mismo, copolímeros de polialquilenglicoles y derivados de los mismos, poliviniletiléter y similares y mezclas de los mismos. Un enlazador polimérico es, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). El enlazador PEG puede ser lineal o ramificado. El peso molecular del enlazador PEG en la presente invención no está restringido a ningún tamaño particular, pero en algunas realizaciones tiene un peso molecular entre 100 y 5000 Dalton, por ejemplo, 500 a 1500 Dalton.
El enlazador contiene grupos funcionales reactivos apropiados en ambos terminales que forman un puente entre el grupo amino del péptido o polipéptido/proteína y un grupo funcional/reactivo en la fracción de ácido graso (por ejemplo, la funcionalidad ácido carboxílico de la fracción de ácido graso de fórmula A1).
El enlazador puede comprender varias fracciones enlazadoras (o espaciador) de diferente naturaleza (por ejemplo, una combinación de aminoácidos, una fracción de heterociclilo, PEG y/o fracciones de alquilo). En este caso, cada fracción enlazadora contiene grupos reactivos funcionales apropiados en ambos terminales que forman un puente entre el grupo amino del péptido o polipéptido/proteína y la siguiente fracción enlazadora de diferente naturaleza y/o contiene grupos reactivos funcionales apropiados que forman un puente entre la fracción enlazadora anterior de diferente naturaleza y la fracción de ácido graso.
Los péptidos o polipéptidos modificados y/o la construcción parcial péptido-polipéptido (es decir, péptido/polipéptido unido a un enlazador parcial) incluyen grupos reactivos que pueden reaccionar con funcionalidades reactivas disponibles en la fracción de ácido graso (o fracción de ácido graso modificado: es decir, ya unido a un enlazador parcial) para formar un enlace covalente. Los grupos reactivos son grupos químicos capaces de formar un enlace covalente. Los grupos reactivos están ubicados en un sitio de conjugación y generalmente pueden ser un grupo carboxi, fosforilo, acilo, éster o anhídrido mixto, maleimida, N-hidroxisuccinimida, tetrazina, alquino, imidato, piridin-2-il-disulfanilo, por lo que pueden formar un enlace covalente con funcionalidades como grupo amino, grupo hidroxilo, grupo alqueno, grupo hidrazina, grupo hidroxilamina, un grupo azida o un grupo tiol en el otro sitio de conjugación.
Los grupos reactivos de particular interés para conjugar una biomolécula o una biomolécula modificada con un enlazador y/o un enlazador con la fracción de ácido graso y/o para conjugar entre sí varias fracciones enlazadorasde diferente naturaleza son N-hidroxisuccinimida, alquino (más particularmente ciclooctina).
Las funcionalidades incluyen: 1. grupos tiol que reaccionan con maleimidas, tosilsulfona o piridin-2-ildisulfanilo; 2. grupos amino (por ejemplo, funcionalidad amino de un aminoácido) que se unen a ácido carboxílico o a ácido carboxílico activado (por ejemplo, formación de enlace amida mediante la química de N-hidroxisuccinamida), grupos fosforilo, grupo acilo o anhídrido mixto; 3. Azida que experimenta una cicloadición de Huisgen con un alquino terminal, y más particularmente ciclooctina (más comúnmente conocida como química de clic); 4. grupo carbonilo que reacciona con hidroxilamina o hidrazina para formar oxima o hidrazina, respectivamente; 5. Alqueno, y más particularmente alqueno tensionado, que reacciona con tetrazina en una adición de aza [4+2]. Aunque en el presente documento se describen varios ejemplos de enlazadores y funcionalidades/grupo reactivo, la invención contempla enlazadores de cualquier longitud y composición.
Realizaciones
En el presente documento se describen diversas realizaciones de la invención. Se reconocerá que las características especificadas en cada una de las realizaciones se pueden combinar con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales.
En la realización 1, la invención se refiere a un conjugado que comprende una biomolécula unida a una fracción de ácido graso mediante un enlazador, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos del mismo o un dímero del mismo, en donde la fracción de ácido graso tiene la siguiente Fórmula A1:
Figure imgf000009_0001
R1 es CO2H;
R2 y R3 son independientemente entre sí H, OH, CO2H, -CH=CH2 o —C=CH;
n y m son independientemente entre sí un número entero entre 6 y 30; o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto adicional de la realización 1, el conjugado según la realización 1 puede comprender además un ácido graso de Fórmula A1 como se describe anteriormente. En vista de las dificultades para lograr la conjugación selectiva y/o lograr la monoconjugación de un ácido graso con una biomolécula, los conjugados de la invención pueden comprender una biomolécula que está unida a una o más fracciones de ácido graso de Fórmula A1. Además, en vista de la naturaleza multimérica de algunas proteínas, cada unidad monomérica que constituye una proteína multimérica, puede estar unida a una fracción de ácido graso, pero no todas las unidades monoméricas tienen que estar necesariamente unidas a una fracción de ácido graso siempre que al menos una de las unidades monoméricas esté unida a una fracción de ácido graso. En otro aspecto, la invención se refiere a mezclas de los conjugados de la invención. Por ejemplo, la mezcla puede comprender una biomolécula, por ejemplo una biomolécula multimérica, por ejemplo una biomolécula dimérica, que esté unida a una fracción de ácido graso de Fórmula A1, y una biomolécula, por ejemplo una biomolécula multimérica, por ejemplo una biomolécula dimérica, que esté unida a más de una fracción de ácido graso de Fórmula A1. Los ejemplos de la invención mostrados continuación resaltan adicionalmente este aspecto de multiconjugación selectiva o no selectiva de los ácidos grasos con una proteína o un polipéptido.
En un aspecto particular de la invención, el conjugado comprende una fracción de ácido graso de Fórmula A1 en donde n y m son independientemente de 8 a 20, preferentemente de 10 a 16. En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado según la realización 1 en donde la fracción de ácido graso es de Fórmula A1 y en donde al menos uno de R2 y R3 es CO2H.
En la realización 2, la invención se refiere a un conjugado según la realización 1, en donde la fracción de ácido graso se selecciona de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000010_0001
en donde Ak3, Ak4 , Ak5 , Ak6 y Ak7 son independientemente un alquileno (C8-20) lineal, R5 y R6 son independientemente alquilo (C8-20) lineal.
En la realización 3, la invención se refiere a un conjugado según la realización 1 o 2 en donde la fracción de ácido graso se selecciona de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000010_0002
En la realización 3A, la invención se refiere a un conjugado según la realización 1 o 2 en donde la fracción de ácido graso se selecciona de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000011_0001
En la realización 4, la invención se refiere a un conjugado según cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el enlazador comprende uno o más grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos cicloalquilo, grupos arilo, grupos heteroarilo, grupos heterocíclicos, polietilenglicol, uno o más grupos de aminoácidos naturales o no naturales, o una combinación de los mismos, en donde cada uno de los alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, polietilenglicol y/o los aminoácidos naturales o no naturales se combinan opcionalmente y se unen entre sí o se unen a la biomolécula y/o a la fracción de ácido graso a través de un grupo químico seleccionado de —C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- o =NH-N(alquilo)-.
En la realización 5, la invención se refiere a un conjugado según cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el enlazador comprende una fracción de oligoetilenglicol no ramificado de Fórmula:
Figure imgf000011_0002
en donde y es de 0 a 34.
En la realización 6, la invención se refiere a un conjugado según cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el enlazador comprende (o comprende además) una fracción heterocíclica seleccionada de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000012_0001
Huisgen, que se conoce más comúnmente como química de clic. Más concretamente, algunos de los heterociclilos representados anteriormente son el resultado de la reacción de un cicloalquino con una fracción que contiene azida.
Los cicloalquinos están fácilmente disponibles en fuentes comerciales y, por lo tanto, pueden funcionalizarse mediante cicloadición con una fracción que contiene una funcionalidad azida (por ejemplo, un enlazador que contiene una funcionalidad azida terminal). En el documento US 2009/0068738 se han descrito ejemplos del uso de la química de clic de alquinos cíclicos en el marcaje de proteínas.
Son ejemplos no limitantes de agentes cicloalquinos que pueden usarse en la cicloadición de Huisgen:
Figure imgf000013_0001
En la realización 6A, la invención se refiere a un conjugado según una cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en donde el enlazador comprende (o comprende además) un heterociclilo seleccionado de la siguiente fórmula:
en donde r es un número entero de 0 a 2 y s es un número entero de 0 a 3.
Dichos enlazadores heterocíclicos pueden obtenerse mediante una cicloadición de aza [4+2] de un alqueno, o preferentemente un alqueno tensionado, tal como cicloalcano, con la siguiente fracción:
Figure imgf000014_0001
en donde Rf es, por ejemplo, -CH2NH2, -OH, -CH2-CO2H, -S-CH2-CO2H, -(O-CH2)4-6-C(O)-OH -o
Figure imgf000014_0002
Dichas fracciones de tetrazina están fácilmente disponibles en fuentes comerciales y pueden reaccionar con una fracción que contenga alqueno, por ejemplo, un enlazador que contenga una funcionalidad alqueno terminal.
En la realización 6B, la invención se refiere a un conjugado según una cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en donde el enlazador comprende (o comprende además) un heterociclilo de la fórmula:
Figure imgf000014_0003
Dicha fracción heterocíclica puede obtenerse haciendo reaccionar una maleimida con una fracción que contenga tiol, tal como, por ejemplo, un enlazador que contenga una funcionalidad tiol terminal.
Estos reactivos que están fácilmente disponibles y/o disponibles comercialmente se unen directamente o mediante un enlazador como se describe anteriormente con el péptido o polipéptido de interés. Los grupos reactivos de alquino, maleimida o tetrazina se hacen reaccionar con un grupo funcional (azida, tiol y alqueno respectivamente) que está presente en la fracción de ácido graso o en una construcción enlazador-ácido graso (tal como, por ejemplo, una construcción PEG-ácido graso).
En la realización 7, la invención se refiere a un conjugado según cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el enlazador comprende o comprende adicionalmente uno o más aminoácidos seleccionados independientemente de histidina, metionina, alanina, glutamina, asparagina y glicina. En un aspecto particular de esta realización, el enlazador comprende de 1 a 6 aminoácidos seleccionados de histidina, alanina y metionina.
En la realización 8, la biomolécula es un mutante o una variante del factor de diferenciación del crecimiento 15 (GDF15) humano. En una realización preferida 8A, la biomolécula es un dímero de GDF15 o una variante o un mutante del mismo. En vista de la naturaleza homodímera del polipéptido GDF15 o mutante o variante del mismo, cada una de las dos cadenas polipeptídicas (es decir, cada unidad monomérica) que constituye el homodímero, puede unirse a una molécula de ácido graso de Fórmula A1 mediante un enlazador.
Por tanto, el homodímero de GDF15 se puede unir a uno o dos ácidos grasos mediante un enlazador. La estructura del GDF15 unido a una fracción de ácido graso mediante un enlazador se puede representar de la siguiente manera:
Figure imgf000015_0001
Estructura A
; en donde AG representa la fracción de ácido graso y E el enlazador, y tanto la unidad monomérica 1 como la unidad monomérica 2 de GDF15 están unidas a una fracción de ácido graso mediante un enlazador; o
Figure imgf000015_0002
en donde AG es el residuo de ácido graso y E el enlazador y solo una de las unidades monoméricas está unida a una fracción de ácido graso mediante el enlazador y en donde la línea entre las 2 unidades monoméricas representa un enlace disulfuro. Además, la invención también se refiere a una mezcla que comprende un conjugado de estructura A y un conjugado de estructura B.
En la realización 8B, la invención contempla un conjugado según la realización 8 u 8A, en donde el mutante de GDF15 humano se obtiene reemplazando uno o más restos de aminoácidos del polipéptido maduro con otro resto. En un aspecto particular de esta realización, los dos últimos restos de aminoácidos en el N-terminal del GDF15 humano (es decir, Arginina 198 y Alanina 197) se han reemplazado con una secuencia de aminoácidos XH- en donde H es histidina y X es un aminoácido seleccionado de metionina, alanina, glutamina, asparagina y glicina. En un aspecto preferido de la presente realización, el mutante de hGDF15 es MH(199-308)hGDF15 o AH(199-308)hGDF15.
En la realización 8C, los tres últimos restos de aminoácidos en el N-terminal del GDF15 humano (es decir, Asparagina 199, Arginina 198 y Alanina 197) se han reemplazado con una secuencia de aminoácidos XHX'- en donde H es histidina y X' y X son aminoácidos seleccionados independientemente de metionina, alanina, glutamina, asparagina y glicina. En otro aspecto de esta realización, los tres últimos restos de aminoácidos en el N-terminal del GDF15 humano (es decir, Asparagina 199, Arginina 198 y Alanina 197) se han reemplazado con una secuencia de aminoácidos AHX'-en donde H es histidina y X' es un aminoácido seleccionado independientemente de metionina, alanina, glutamina, asparagina y glicina. En un aspecto preferido de esta realización, la proteína GDF15 modificada es MHA(200-308)hGDF15 o AHA(200-308)hGDF15.
En comparación con la proteína GDF15 natural, el mutante GDF15 permite el marcaje selectivo de la proteína en el extremo N-terminal (es decir, la conjugación del ácido graso en el extremo N-terminal preferido del GDF15). El marcaje selectivo de péptidos y proteínas se describe con más detalle en la solicitud de Estados Unidos presentada conjuntamente con los números de solicitud 62/015.858 (expediente de abogado PAT056275-US-PSP) y 62/082.337 (expediente de abogado número PAT056275-US-PSP02).
En la realización 8D, la invención se refiere a un conjugado según una cualquiera de las realizaciones anteriores, que comprende además una segunda fracción de ácido graso unida a la biomolécula mediante un enlazador. Preferentemente, las dos fracciones de ácido graso-enlazador tienen la misma estructura.
En la realización 9, la invención se refiere a un conjugado según la realización 1, 2, 8, 8A, 8B u 8C que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000016_0001
en donde hGDF15* es hGDF15 en donde los 2 o 3 aminoácidos en el extremo N-terminal se han reemplazado con una secuencia de aminoácidos XH- o XHX'- respectivamente,
en donde H es histidina y X y X' se seleccionan independientemente de M y A; o un dímero del mismo; y
en donde his-hGDF15 es hGDF15 en donde se ha añadido un marcador, que comprende de 1 a 6 aminoácidos de histidina y opcionalmente 1 o 2 aminoácidos de metionina, al extremo N-terminal de hGDF15; o un dímero del mismo; y
s es un número entero entre 20-30
En un aspecto de esta realización, la etiqueta comprende aminoácidos de histidina y 1 o 2 aminoácidos de metionina no adyacentes. En otro aspecto de esta realización, la disposición de los aminoácidos histidina y metionina es tal que el aminoácido en la posición adyacente al aminoácido N-terminal es una histidina. En un aspecto adicional de esta realización, la etiqueta se selecciona de MHHHHHHM-(SEQ ID NO: 16) y MHHHHHH-(SEQ ID NO: 17).
En un aspecto particular de la realización 9, en vista de la naturaleza homodímera de hGDF15* e his-hGDF15, una o dos cadenas polipeptídicas (unidad monomérica) que constituyen el homodímero pueden unirse a la molécula de ácido graso mediante un enlazador. Como resultado, el homodímero se puede unir a una o se puede unir a dos moléculas de ácido graso mediante un enlazador en el extremo N-terminal. Dicha realización puede estar representada por la biomolécula GDF15 unida al ácido graso mediante un enlazador que tiene las fórmulas siguientes:
Figure imgf000017_0001
FORMULA D;
en donde ambas unidades monoméricas de his-hGDF15 o de hGDF15* (como se definió anteriormente) están unidas a la fracción de ácido graso mediante el enlazador en ambos extremos N-terminal; o
Figure imgf000018_0001
en donde solo una de las unidades monoméricas de his-hGDF15 o de hGDF15* (como se definió anteriormente) está unida a la fracción de ácido graso a través del enlazador en el extremo N-terminal. Además, la invención también contempla mezclas de conjugados de la invención; por ejemplo, una mezcla que comprende un conjugado de Fórmula C y un conjugado de Fórmula E, o una mezcla que comprende un conjugado de fórmula D y un conjugado de Fórmula F.
En la realización 10, la invención se refiere a una composición que comprende una mezcla de un conjugado de Fórmula C y un conjugado de Fórmula E. En la realización 10A, la invención se refiere a una composición que comprende una mezcla de un conjugado de Fórmula D y un conjugado de Fórmula F.
Por tanto, en la realización 10B, la invención se refiere a un conjugado según la reivindicación 1, 2, 9 o 10, que comprende:
1. una variante del homodímero hGDF15 en donde los 2 o 3 aminoácidos en el extremo N-terminal se han reemplazado con una secuencia de aminoácidos XH- o XHX'- respectivamente, en donde H es histidina y X y X' se seleccionan independientemente de M y A; o
un homodímero hGDF15 en donde se ha añadido un marcador, que comprende de 1 a 6 aminoácidos de histidina y opcionalmente 1 o 2 aminoácidos de metionina, en el extremo N-terminal de hGDF15; y 2
2. uno o dos ácidos grasos de fórmula:
Figure imgf000019_0001
en donde el ácido graso está unido al extremo N-terminal de la cadena polipeptídica mediante el enlazador; o una mezcla de conjugados.
En la realización 10C, la invención se refiere a un conjugado de la realización 9, 10, 10A o 10B, en donde hGDF15* es hGDF15 en donde los 2 o 3 aminoácidos en el extremo N-terminal se han reemplazado con una secuencia de aminoácidos XH- o XHX'- respectivamente,
en donde H es histidina y X y X' se seleccionan independientemente de M y A; o un dímero del mismo; y en donde his-hGDF15 es hGDF15 en donde se ha añadido un marcador, que comprende de 4 a 6 aminoácidos de histidina y 1 o 2 aminoácidos de metionina, al extremo N-terminal de hGDF15; o un dímero del mismo;
y s es un número entero entre 22 y 28. En un aspecto de esta realización, la etiqueta comprende aminoácidos de histidina y 1 o 2 aminoácidos de metionina no adyacentes. En otro aspecto de esta realización, la disposición de los aminoácidos histidina y metionina es tal que el aminoácido en la posición adyacente al aminoácido N-terminal es una histidina. En un aspecto adicional de esta realización, la etiqueta se selecciona de MHHHHHHM-(SEQ ID NO: 16) y MHHHHHH-(SEQ ID NO: 17).
En la realización 11, la invención se refiere a un conjugado según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la biomolécula se selecciona de M-(His)6-hGDF15 (SEQ ID NO 1), M-(his)6-M-hGDF15 (SEQ ID NO: 2), MH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 4), MHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 6), AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7) y AH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 5); o un dímero del mismo.
En la realización 11A, la invención se refiere a un conjugado según la realización 11, en donde la biomolécula se selecciona de MH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 4), MHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 6), AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7) y AH(199-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 5); o un dímero del mismo.
En la realización 11B, la invención se refiere a un conjugado según la realización 11, en donde la biomolécula es AHA(200-308)hGDF15 (SEQ ID NO: 7); o un dímero del mismo.
En la realización 12, la invención se refiere a un conjugado de acuerdo con la realización 11B, en donde la biomolécula unida al ácido graso mediante un enlazador es de Fórmula G o de Fórmula H:
Figure imgf000020_0001
FORMULA H,
en donde AHA-hGDF15 es SEQ ID NO: 7 y el ácido graso está enlazado mediante el enlazador en el extremo N-terminal de una o de las 2 unidades monoméricas. Además, la invención contempla una mezcla que comprende el conjugado de Fórmula G y el conjugado de Fórmula H.
En la realización 13, la invención se refiere a una composición que comprende una mezcla de un conjugado según la realización 12 que tiene la Fórmula G y un conjugado según la realización 12 que tiene la Fórmula H. En un aspecto particular de esta realización, la mezcla está en una proporción molar de 1:1 de un conjugado de Fórmula G y un conjugado de Fórmula H.
AHA-(200-308)-hGDF15 (SEQ ID NO: 7) se diseñó para eliminar el sitio de recorte observado dentro de la proteína natural, así como para eliminar el posible sitio de formilación de metionina (M1) y el sitio de desamidación de N-199. La calidad superior y homogeneidad del AHA se confirmó mediante un control de calidad del material que no mostró recorte, desamidación u oxidación de metionina que se observó con la secuencia natural de hGDF15.
Figure imgf000021_0002
En la realización 14, la invención se refiere a un conjugado según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el resto de ácido graso está unido al extremo N-terminal del péptido o la proteína mediante un enlazador. En la realización 15, la invención se refiere a un conjugado según una cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el conjugado tiene una semivida de estabilidad en plasma de más de 5 h. En un aspecto de esta realización, el conjugado tiene una semivida de estabilidad en plasma de más de 10 h. En otro aspecto de esta realización, el conjugado tiene una semivida de estabilidad en plasma de más de 20 h o de más de 30 h. En otro aspecto más de esta realización, el conjugado tiene una semivida de estabilidad en plasma de más de 40 h o de más de 50 h.
En la realización 16, la invención se refiere a un conjugado según una cualquiera de las realizaciones anteriores, donde la mejora de la semivida de estabilidad en plasma, en comparación con la biomolécula no conjugada, es de 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 75 veces.
En otra realización, la biomolécula, el enlazador y la fracción de ácido graso son los definidos más adelante en el apartado de Ejemplos.
En una realización, la invención se refiere a un compuesto de fórmula:
Figure imgf000021_0001
R1 es CO2H;
R2 y R3 son independientemente entre sí H, OH, CO2H, -CH=CH2 o —C=CH; con la condición de que R2 y R3 no sean idénticos;
n y m son independientemente entre sí un número entero entre 6 y 30; o una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otro aspecto de esta realización, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula A1 en donde al menos uno de R2 y R3 es CO2H. En otro aspecto adicional de esta realización, la invención se refiere a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000022_0001
Síntesis de péptido/polipéptido y/o forma modificada del mismo
Los péptidos o polipéptidos de la invención pueden producirse mediante procesos químicos sintéticos o mediante métodos recombinantes o mediante una combinación de ambos métodos. Las construcciones de péptidos o polipéptidos/proteínas pueden prepararse como fragmentos de longitud completa o pueden sintetizarse como fragmentos de longitud no completa y unirse. Los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden producirse mediante los procedimientos de por sí conocidos para la síntesis de péptidos. Los métodos para la síntesis de péptidos pueden ser cualquiera de una síntesis en fase sólida y una síntesis en fase líquida. Por lo tanto, el péptido y polipéptido de interés se pueden producir condensando un péptido o aminoácido parcial capaz de constituir la proteína con la parte residual de la misma y, cuando el producto tiene un grupo protector, el grupo protector se desprende, tras lo cual se puede fabricar un péptido deseado. Los métodos de condensación y desprotección conocidos incluyen los procedimientos descritos en la siguiente bibliografía (1) -(5).
(1) M. Bodanszky y M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, Nueva York, 1966,
(2) Schroeder y Luebke, The Peptide, Academic Press, Nueva York, 1965,
(3) Nobuo Izumiya et al. Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975,
(4) Haruaki Yajima y Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977, y
(5) Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten.
Después de la reacción, el péptido o polipéptido se puede purificar y aislar mediante una combinación de técnicas de purificación convencionales tales como extracción con disolvente, cromatografía en columna, cromatografía líquida, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico y recristalización. Cuando el péptido aislado como se ha indicado anteriormente, es un compuesto libre, este puede convertirse en una sal adecuada mediante el método conocido. Por el contrario, cuando el producto aislado es una sal, puede convertirse en el péptido libre por el método conocido.
La amida del polipéptido se puede obtener usando una resina para la síntesis de péptidos, que sea adecuada para la amidación. La resina incluye resina de clorometilo, resina de hidroximetilo, resina de benzhidrilamina, resina de aminometilo, resina de alcohol 4-benciloxibencílico, resina de 4-metilbenzohidrilamina, resina de PAM, resina de 4-hidroximetilmetilfenilacetamidometilo, resina de poliacrilamida, resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-hidroximetil)fenoxi, resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi, resina de cloruro de 2-clorotritilo, etc. Utilizando una resina de este tipo, los aminoácidos cuyos grupos a-amino y grupos funcionales de la cadena lateral se han protegido adecuadamente se condensan sobre la resina según la secuencia del péptido objetivo mediante diversas técnicas de condensación conocidas por sí mismas. Al final de la serie de reacciones, el péptido o el péptido protegido se elimina de la resina y los grupos protectores se eliminan y, si es necesario, se forman enlaces disulfuro para obtener el polipéptido objetivo.
Para la condensación de los aminoácidos protegidos mencionados anteriormente, se puede utilizar una diversidad de reactivos de activación para la síntesis de péptidos, tales como HATU, HCTU o, p. ej., una carbodiimida. La carbodiimida incluye DCC, N,N'-diisopropilcarbodiimida y N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Para la activación con un reactivo de este tipo, se puede utilizar un aditivo inhibidor de la racemización, p. ej., HOBt u Oxyma Pure. El aminoácido protegido puede añadirse directamente a la resina junto con los reactivos de activación y el inhibidor de la racemización o puede pre-activarse como anhídrido de ácido simétrico, éster HOBt o éster HOOBt y después añadirse a la resina. El disolvente para la activación de aminoácidos protegidos o la condensación con la resina puede seleccionarse adecuadamente entre aquellos disolventes que se sabe que son útiles para reacciones de condensación de péptidos. Por ejemplo, pueden mencionarse N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona, cloroformo, trifluoroetanol, dimetilsulfóxido, DMF, piridina, dioxano, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, acetonitrilo, acetato de etilo o mezclas adecuadas de ellos. La temperatura de reacción puede seleccionarse del intervalo hasta ahora conocido por ser útil para la formación de enlaces peptídicos y habitualmente se selecciona del intervalo de aproximadamente -20 °C - 50 °C. El derivado de aminoácido activado se utiliza generalmente en una proporción de 1,5-4 veces en exceso. Si la condensación resulta ser insuficiente mediante una prueba que utilice la reacción de la ninhidrina, la reacción de condensación se puede repetir para lograr una condensación suficiente sin eliminar el grupo protector. Si la condensación repetida sigue sin proporcionar un grado suficiente de condensación, el grupo amino que no ha reaccionado puede acetilarse con anhídrido acético o acetilimidazol.
El grupo protector del grupo amino para el aminoácido material de partida incluye Z, Boc, amiloxicarbonilo terciario, isoborniloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, Cl-Z, Br-Z, adamantiloxicarbonilo, trifluoroacetilo, ftalilo, formilo, 2-nitrofenilsulfonil, difenilfosfinotioil o Fmoc. El grupo protector de carboxi que se puede utilizar incluye el alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8 y arilo C6-10-alquilo C1-2 mencionados anteriormente, así como 2-adamantilo, 4-nitrobencilo, 4-metoxibencilo, 4-clorobencilo, fenacilo, benciloxicarbonilhidrazido, butoxicarbonilhidrazido terciario y tritilhidrazido.
El grupo hidroxi de serina y treonina puede protegerse mediante esterificación o eterificación. El grupo adecuado para dicha esterificación incluye grupos derivados de carbono tales como grupos alcanoílo inferior, por ejemplo, acetilo, etc., grupos aroílo, por ejemplo, benzoílo, etc., benciloxicarbonilo y etoxicarbonilo. El grupo adecuado para dicha eterificación incluye bencilo, tetrahidropiranilo y butilo terciario. El grupo protector para el grupo hidroxilo fenólico de tirosina incluye Bzl, Cl2-Bzl, 2-nitrobencilo, Br-Z y butilo terciario.
El grupo protector de imidazol para histidina incluye Tos, 4-metoxi-2,3,6-trietilbencenosulfonilo, DNP, benciloximetilo, Bum, Boc, Trt y Fmoc.
El grupo carboxilo activado del aminoácido de partida incluye el correspondiente anhídrido de ácido, azida y ésteres activos, p. ej., ésteres con alcoholes tales como pentaclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 2,4-dinitrofenol, alcohol cianometílico, p-nitrofenol, HONB, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxiftalimida, HOBt, etc. El grupo amino activado del aminoácido de partida incluye la correspondiente fosforamida.
El método para la eliminación de grupos protectores incluye la reducción catalítica utilizando hidrógeno gaseoso en presencia de un catalizador tal como negro de paladio o paladio sobre carbono, tratamiento ácido con fluoruro de hidrógeno anhidro, ácido metanosulfónico, ácido trifluorometanosulfónico, ácido trifluoroacético o una mezcla de dichos ácidos, tratamiento básico con diisopropiletilamina, trietilamina, piperidina, piperazina, reducción con sodio metálico en amoniaco líquido. La reacción de eliminación mediante el tratamiento con ácido mencionado anteriormente se lleva a cabo generalmente a una temperatura de -20 °C - 40 °C y se puede realizar de manera ventajosa con la adición de un aceptor de cationes, tal como anisol, fenol, tioanisol, m-cresol, p-cresol, sulfuro de dimetilo, 1,4-butanoditiol, 1,2-etanoditiol. El grupo 2,4-dinitrofenilo utilizado para proteger el grupo imidazol de histidina puede eliminarse mediante tratamiento con tiofenol, mientras que el grupo formilo utilizado para proteger el grupo indol del triptófano puede eliminarse mediante tratamiento alcalino con solución diluida de hidróxido de sodio o amoniaco acuoso diluido. así como el tratamiento con ácido mencionado anteriormente, en presencia de 1,2-etanoditiol, 1,4-butanoditiol.
El método de protección de los grupos funcionales que no deben participar en la reacción del material de partida, los grupos protectores que se pueden utilizar, el método para eliminar los grupos protectores y el método para activar los grupos funcionales que deben participar en la reacción, se puede seleccionar críticamente entre los grupos y métodos conocidos.
Otro método para obtener la forma amida del polipéptido comprende amidar el grupo -carboxilo del aminoácido C-terminal al principio, después extender la cadena peptídica hacia el lado N hasta la longitud de cadena deseada, y después desproteger selectivamente el grupo a-amino del péptido C-terminal y el grupo a-carboxilo del aminoácido o péptido que va a formar el resto del polipéptido objetivo y condensar los dos fragmentos cuyo grupo a-amino y grupos funcionales de cadena lateral se han protegido con grupos protectores adecuados, mencionados anteriormente, en un disolvente mixto tal como el mencionado anteriormente en el presente documento. Los parámetros de esta reacción de condensación pueden ser los mismos que los descritos anteriormente en el presente documento. A partir del péptido protegido obtenido por condensación, todos los grupos protectores se eliminan mediante el método descrito anteriormente para proporcionar con ello el péptido bruto deseado. Este péptido bruto puede purificarse mediante procedimientos de purificación conocidos y la fracción principal puede liofilizarse para proporcionar el polipéptido amidado objetivo. Para obtener un éster del polipéptido, el grupo a-carboxilo del aminoácido C-terminal se condensa con un alcohol deseado para dar un éster de aminoácido y después se sigue el procedimiento descrito anteriormente para la producción de la amida.
Como alternativa, los métodos de expresión recombinante son particularmente útiles. En la técnica se utiliza habitualmente la expresión de la proteína recombinante utilizando una célula hospedadora (una célula modificada artificialmente para que comprenda ácidos nucleicos que codifiquen la secuencia del péptido y que transcribirá y traducirá y, opcionalmente, secretará el péptido en el medio de crecimiento celular). Para el procedimiento de producción recombinante, un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido se sintetizaría normalmente mediante métodos convencionales y se integraría en un vector de expresión. Dichos métodos se prefieren particularmente para la fabricación de las composiciones polipeptídicas que comprenden los péptidos fusionados con secuencias peptídicas u otras proteínas o fragmentos o dominios proteicos adicionales. La célula hospedadora puede ser, opcionalmente, al menos una seleccionada de células de E. coli, COS-1, COS-7, HEK293, Bh T21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, heLa, mieloma, linfoma, levadura, insectos o vegetales, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.
En el presente documento también se desvelan polinucleótidos que codifican las variantes descritas anteriormente que pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, cuyo ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble cadena o de cadena sencilla. Las secuencias codificantes que codifican las composiciones de la presente invención pueden variar como resultado de la redundancia o degeneración del código genético.
Los polinucleótidos que codifican las composiciones de la presente invención pueden incluir lo siguiente: solo la secuencia codificante de la variante, la secuencia codificante de la variante y la secuencia codificante adicional tal como un polipéptido funcional, o una secuencia conductora o secretora o una pro-secuencia de proteínas; la secuencia codificante para la variante y la secuencia no codificante, tal como intrones o secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia codificante para la variante. Por lo tanto, la expresión "polinucleótido que codifica una variante" incluye un polinucleótido que puede incluir no solo la secuencia codificante para la variante, sino también un polinucleótido, que incluye una secuencia codificante y/o no codificante adicional.
En el presente documento también se desvelan variantes de los polinucleótidos descritos que codifican fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que contienen las sustituciones indicadas. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica de origen natural de la secuencia de GDF15 humana, una variante de origen no natural o una variante truncada como se ha descrito anteriormente. Por tanto, la presente invención también incluye polinucleótidos que codifican las variantes descritas anteriormente, así como variantes de dichos polinucleótidos, cuyas variantes codifican un fragmento, derivado o análogo de la variante desvelada. Dichas variantes de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución, variantes truncadas y variantes de adición o inserción siempre que esté presente al menos una de las sustituciones de aminoácidos indicadas de la primera o segunda realizaciones.
Los polinucleótidos se pueden expresar en hospedadores después de que las secuencias se hayan unido operativamente a (es decir, se hayan colocado para asegurar el funcionamiento de) una secuencia de control de la expresión. Normalmente, estos vectores de expresión pueden replicarse en los organismos hospedadores, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del hospedador. Habitualmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, p. ej., tetraciclina, neomicina y dihidrofolato reductasa, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas. La variante de GDF15 puede expresarse en células de mamífero, insectos, levaduras, bacterias u otras células que están el control de promotores apropiados. También se pueden emplear sistemas de traducción exentos de células para producir proteínas de este tipo utilizando ARN derivados de construcciones de ADN de la presente invención.
Escherichia Coli (E. coli) es un hospedador procariota útil particularmente para clonar los polinucleótidos de la presente invención. Otros hospedadores microbianos adecuados para su uso incluyen Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias especies de Serratia, Pseudomonas, Streptococcus, y Staphylococcus, aunque también se pueden emplear otros a elección. En estos hospedadores procariotas, también se pueden preparar vectores de expresión, que normalmente contendrán secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (p. ej., un origen de replicación). Además, puede estar presente cualquiera de diversos promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (Trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor de fagos lambda o T7. Los promotores controlarán normalmente la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tendrán secuencias de sitios de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción.
Un experto en la técnica de la expresión de proteínas reconocerá que la secuencia de metionina o metionina-arginina puede introducirse en el extremo N de la secuencia madura para la expresión en E. coli y se contemplan dentro del contexto de esta invención. Por lo tanto, a menos que se indique lo contrario, las composiciones de la presente invención expresadas en E. coli tienen una secuencia de metionina introducida en el extremo N.
También pueden utilizarse para la expresión otros microbios, tales como levaduras u hongos. Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia angusta son ejemplos de hospedadores de levadura preferidos, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee. Aspergillus niger, Trichoderma reesei y Schizophyllum commune son ejemplos de hospedadores fúngicos, aunque también se pueden emplear otros a elección.
También se puede utilizar un cultivo de células de tejido de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención. En la técnica se ha desarrollado un cierto número de líneas celulares hospedadoras adecuadas capaces de secretar variantes intactas, e incluyen las líneas de células CHO, diversas líneas de células COS, células NSO, líneas de células de ovario de hámster sirio, células HeLa o líneas celulares de riñón embrionario humano (es decir, HEK293, HEK293EBNA).
Los vectores de expresión para células de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión de ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados de SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus, virus del sarcoma de Raus y similares. Sitios de poliadenilación preferidos incluyen secuencias derivadas de SV40 y hormona del crecimiento bovino.
Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (p. ej., que codifican las composiciones de la presente invención y las secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a la célula hospedador mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio 0 la electroporación se pueden utilizar para otros hospedadores celulares.
Pueden emplearse diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado para las composiciones de la presente invención. Los polipéptidos se pueden preparar en forma sustancialmente pura o aislada (p. ej., sin otros polipéptidos). Los polipéptidos pueden estar presentes en una composición que está enriquecida con el polipéptido en relación con otros componentes que pueden estar presentes (p. ej., otros polipéptidos u otros componentes de la célula hospedadora). Por ejemplo, el polipéptido purificado puede proporcionarse de manera que el polipéptido esté presente en una composición que esté sustancialmente exenta de otras proteínas expresadas, p. ej., menos del 90 %, menos del 60 %, menos del 50 %, menos del 40 %, menos del 30 %, menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % de la composición está formada por otras proteínas expresadas.
Síntesis de la fracción de ácido graso
El Esquema 1 describe la síntesis de una fracción de ácido graso de referencia de Fórmula A2.
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Esquema 1
en donde P1 y P2 son un grupo protector de ácido carboxílico tal como, por ejemplo, metilo, etilo, tere-butilo, metoxibencilo, bencilo, benciloxi, metoximetilo, metiltiometilo, tetrahidropiranilo, fenacilo, N-ftalimida, cinamilo, trifenilmetilo, 9-antrilmetilo, piperonilo, trimetilsililo, t-butildimetilsilil o 2-alquil 1,3 oxazolinas; en donde LG (leaving group) es un grupo saliente, tal como, por ejemplo, halo (por ejemplo, Br, Cl, I) o trifluorometanosulfoniloxi y en donde R4 y p son como se describe en la realización 1.
La alquilación de ácido malónico protegido (1A) con un agente alquilante (1B) en presencia de una base (por ejemplo, hidruro de sodio, carbonatos de potasio o cesio, hidróxido de sodio, diisopropilamida de litio, bis(trimetilsilil)amida de sodio, bis(trimetilsilil)amida de potasio, tertametilpiperidida de litio, 1,8-diaazacicloundec-7-eno, N,N-diisopropiletilamina o 2,6-dit-butilputridina), en un disolvente, talcomo DMF, THF o dimetilacetamida, genera la fracción de ácido graso protegido (1C). Cuando R4 es OH o CO2H, puede ser necesaria la protección de estos grupos funcionales antes de la etapa de alquilación. Los grupos protectores para hidroxilo son conocidos en la técnica y son, por ejemplo, 1. éteres tales como éter metílico, éter metoximetílico (MOM), éter tetrahidropiranílico (THP), t-Butiléter, aliléter, benciléter, t-butildimatilsililéter, t-butildifenilsililéter, tribencilsililéter, isopropildimetilsililéter, trifenilmetiléter, nitrobenciléter, 2. Ésteres y carbonatos tales como éster de ácido acético, éster de formiato, éster de tricloroacetato, éster de fenoxiacetato, éster de pivaloato, éster de benzoato, carbonato de metilo, carbonato de bencilo, carbonato de alilo, éster de nitrato, éster de adamantano, carbonato de nitrofenilo.
La fracción de ácido graso de Fórmula A2 se obtiene mediante desprotección usando un método de desprotección apropiado. Se pueden aplicar métodos estándar para la hidrólisis del compuesto intermedio (1C) usando una base seleccionada entre NaOH, KOH o LiOH, o un ácido seleccionado entre TFA, HCl o BCl3. Cuando P1 o P2 es bencilo o metoxibencilo, un método preferible de desprotección es la hidrogenación en presencia de un catalizador tal como paladio sobre carbono.
El Esquema 2 ilustra la síntesis de una fracción de ácido graso de Fórmula A1 en donde R1 es C(O)2H.
Esquema 2
en donde P1 y P2, LG son como se definen anteriormente y R2, R3, n y m son como se definen en la realización 1.
El ácido malónico protegido (1A) experimenta 2 alquilaciones posteriores con el agente alquilante (2A) y (2C), cuyo orden se puede invertir, antes de la desprotección usando el método apropiado como se describe anteriormente en el Esquema 1. Cuando R2 y R3 son OH o CO2H, puede ser necesaria la protección de estos grupos funcionales antes de las etapas de alquilación.
La fracción de ácido graso de referencia de Fórmula A1 en donde R1 es H, se puede preparar por descarboxilación de la fracción de ácido graso correspondiente de Fórmula A1 en donde R1 es CO2H. En la técnica se conocen bien condiciones de descarboxilación, tales como, por ejemplo, descarboxilación en condiciones básicas (por ejemplo, hidróxido de amonio).
Síntesis de la construcción enlazadora de biomoléculas
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Esquema 3
en donde B es una biomolécula o una forma modificada de la misma, Z1 es un enlazador de alquileno C1-C20 en donde la cadena de alquileno está opcionalmente sustituida con oxo (=O), y en donde uno o más carbonos se reemplazan con O o NH; y en donde C1 es un sistema de anillo carbocíclico o heterocíclico mono, di o tricíclico opcionalmente sustituido con flúor.
El cicloalquino (3B) está unido a un resto amino de la biomolécula (3A) (por ejemplo, a la funcionalidad amino del N-terminal o a la cadena lateral de una lisina) a través de su grupo reactivo con ácido carboxílico usando métodos estándar de acoplamiento de amidas. Se pueden aplicar métodos de acoplamiento conocidos, incluida la conversión del compuesto intermedio (3B) a una forma activada del mismo, [por ejemplo, a una pirrolidina-2,5-diona correspondiente (usando la química estándar de N-hidrosuccinimida), o al ácido de conversión (3B) usando reactivos tales como trifosgeno, carbonildiimidazol, cloroformiato de 4-nitrofenilo o carbonato de disuccinimidilo, conversión del ácido (3B) a un haluro de ácido correspondiente, usando reactivos como cloruro de tionilo o cloruro de oxalilo, o conversión del ácido (3B) a un anhídrido mixto correspondiente usando reactivos tales como ClC(O)O-isobutilo, cloruro de 2,4,6-triclorobenzoílo o trímero cíclico de anhídrido propilfosfónico (T3P), seguido de la reacción de la oxazolidina-2,5-diona, el haluro de ácido, o el anhídrido mixto] con la biomolécula (3A) en presencia o ausencia de una base como una amina terciaria (por ejemplo, trietilamina o Ñ,W-d¡isoprop¡l etilamina) o K2CO3. Como alternativa, la biomolécula 3A se puede acoplar con el ácido 3B utilizando reactivos de condensación de péptidos que incluyen diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetillaminopropil)carbodiimida (EDC HCl), benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), o benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio hexafluorofosfato (BOP) en presencia o ausencia de un reactivo tal como 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol o dimetilaminopiridina. Preferentemente, el compuesto intermedio cicloalquino/ácido (3B) se convierte en su forma activada del mismo usando química NHS antes de reaccionar con la funcionalidad amino en la biomolécula.
Se ha desarrollado una acilación selectiva de la funcionalidad amino en el extremo N-terminal de la biomolécula y se ha comunicado en una solicitud de Estados Unidos presentada conjuntamente con los números 62/015.858 (expediente de abogado PAT056275-US-PSP) y 62/082.337 (expediente de abogado número PAT056275-US-PSP02).
La acilación selectiva implica la reacción del análogo de ciclooctina activado por NHS (derivados de NHS de (3B) con una biomolécula en la que el extremo N-terminal se ha modificado para incluir un aminoácido histidina adyacente al aminoácido N-terminal. La reacción es altamente selectiva para la funcionalidad amino en el extremo N-terminal cuando se lleva a cabo a pH 4, debido a la presencia de un efecto vecino del aminoácido histidina.
Síntesis de la construcción de ácido graso-enlazador
Construcción de ácido graso-enlazador con química de clic
El Esquema 4 describe la síntesis de una construcción enlazadora de ácido graso-PEG con un grupo funcional azido terminal.
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Esquema 4
en donde y es de 0 a 34 y AG es una fracción de ácido graso como se describe en la Fórmula A1, A2 o A3
Figure imgf000028_0002
R1 es CO2H o H;
R2, R3 y R4 son independientes entre sí H, OH, CO2H, -CH=CH2 o —C=CH;
Ak es un alquileno C6-C30 ramificado;
n, m y p son independientemente entre sí un número entero entre 6 y 30,
que se une a través de una de sus funcionalidades de ácido carboxílico al enlazador PEG, y en donde el AG tiene las siguientes fórmulas:
Figure imgf000028_0003
La fracción de ácido graso (4B) se une a un enlazador que contiene PEG (4A) a través de una reacción de acoplamiento de amida. Los métodos de acoplamiento conocidos se han descrito con detalle anteriormente en el Esquema 3. Preferentemente, la funcionalidad ácida en la fracción de ácido graso se activa usando química NHS. Donde R1 es CO2H, R2, R3 y R4 son CO2H u OH, los grupos protectores pueden necesitar ser introducidos antes de la reacción de acoplamiento con el fin de controlar el sitio reactivo. Los grupos protectores para el ácido carboxílico y los grupos hidroxi se han descrito anteriormente en el Esquema 1. Como alternativa, la activación selectiva del ácido carboxílico se puede lograr usando la química del NHS.
Enlazador de ácidos grasos para la conexión directa a la biomolécula de interés
El Esquema 5 describe la síntesis de una construcción de enlazador de ácido graso-PEG con un grupo funcional CO2H terminal.
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Esquema 5
en donde el AG es como se define anteriormente en el Esquema 4 e y es de 0 a 34.
El ácido graso (4B) puede unirse a un enlazador que contenga PEG (5A) usando el acoplamiento de amida descrito anteriormente.
Construcción de ácido graso-enlazador para la conexión a una biomolécula de interés utilizando la enzima transglutaminasa
El Esquema 5A describe la preparación de una construcción de ácido graso-enlazador que contiene un aminoácido de ácido glutámico que permite la modificación selectiva del sitio de una lisina cuando se usa la enzima transglutaminasa.
Figure imgf000029_0002
en donde y y AG son como se ha definido anteriormente. Tales construcciones permiten la modificación selectiva del sitio de un grupo amino en la cadena lateral de una lisina. Esta modificación del sitio selectivo de transglutaminasa de la proteína se ha descrito en la solicitud de EE.UU. número 61/845.273 presentada el 11 de julio de 2013 (número de expediente de abogado PAT055641-US-PSP).
Síntesis de conjugados que comprenden una biomolécula unida a un ácido graso mediante un enlazador Conjugación usando química de clic
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en donde B es una biomolécula de interés o una forma modificada de la misma (por ejemplo, un mutante o una biomolécula que contiene un marcador de histidina) e y, C1, Z1, AG e y son como se ha definido anteriormente. La construcción de cicloalquino (3C) experimenta una cicloadición de Huisgen con una azida terminal de la construcción de ácidos graso-enlazador (4C) comúnmente conocida como química de clic. En el documento US 2009/0068738 se describen ejemplos de químicas clic.
Conjugación mediante conexión directa usando condiciones de acoplamiento
Figure imgf000030_0002
Esquema 7
en donde B es una biomolécula de interés o una forma modificada de la misma (tal como, por ejemplo, un mutante y/o una biomolécula que contiene un marcador de histidina) y la construcción de ácido graso-enlazador se une al extremo N-terminal de la biomolécula.
La construcción de ácido graso-enlazador (5B) está unida a un resto amino de la biomolécula (3A) (por ejemplo, a la funcionalidad amino del N-terminal o a la cadena lateral de una lisina) a través de su grupo reactivo con ácido carboxílico usando métodos estándar de acoplamiento de amidas. Los métodos de acoplamiento conocidos se han descrito con detalle anteriormente en el Esquema 3. Preferentemente, la funcionalidad ácida en la construcción de ácido graso-enlazador se activa usando química NHS.
Se ha desarrollado una acilación selectiva de la funcionalidad amino en el extremo N-terminal de la biomolécula y se ha comunicado en una solicitud de Estados Unidos presentada conjuntamente con los números 62/015.858 (expediente de abogado PAT056275-US-PSP) y 62/082.337 (expediente de abogado número PAT056275-US-PSP02). La acilación selectiva implica la reacción de un compuesto activado por NHS (derivados de NHS de (5B)) con una biomolécula en donde el extremo N-terminal se ha modificado para incluir un aminoácido histidina adyacente al aminoácido N-terminal. La reacción es altamente selectiva para la funcionalidad amino en el extremo N-terminal cuando se lleva a cabo a pH 4, debido a la presencia de un efecto vecino del aminoácido histidina.
Conjugación usando enzima transglutaminasa
Figure imgf000031_0001
La modificación selectiva de la biomolécula en su cadena lateral de lisina se puede lograr usando la enzima transglutaminasa. Dicha modificación se ha comunicado en la solicitud de Estados Unidos número 61/845.273 presentada el 11 de julio de 2013 (número de expediente de abogado PAT055641 -US-PSP) o en el documento WO 2015/006728 (en el ejemplo 25 de la presente solicitud).
Composición farmacéutica
El conjugado de la presente invención se puede administrar en cualquiera de una variedad de formas, incluyendo la vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, inhalatoria, intranasal, oral, etc. En realizaciones particularmente preferidas de la invención se emplea la administración intravenosa continua de los conjugados de la presente invención, o una amida, éster o sal de los mismos. Los conjugados de la presente invención se pueden administrar como un bolo o como una infusión continua durante un período de tiempo. Se puede utilizar una bomba implantable. En algunas realizaciones de la invención, la administración intermitente o continua de los conjugados, se prolonga durante uno a varios días (por ejemplo, 2-3 o más días), o durante períodos de tiempo más largos, por ejemplo, semanas, meses o años. En algunas realizaciones, la administración intermitente o continua de los conjugados se proporciona durante al menos aproximadamente 3 días, preferentemente al menos aproximadamente 6 días. En otras realizaciones, la administración intermitente o continua del conjugado se proporciona durante al menos aproximadamente una semana. En otras realizaciones, la administración intermitente o continua del conjugado se proporciona durante al menos aproximadamente dos semanas. Puede ser deseable mantener una concentración de conjugado en plasma media por encima de un valor umbral particular durante la administración o entre la administración de múltiples dosis. Una concentración deseable puede determinarse, por ejemplo, basándose en la afección fisiológica del sujeto, la gravedad de la enfermedad, etc. Dicho valor o valores deseables pueden identificarse mediante realizando ensayos clínicos estándar. Alternativamente, los péptidos y conjugados de los mismos podrían administrarse por vía oral a través del mecanismo FcRn. (Nat Rev Immunol. 7(9), 715-25, 2007; Nat Commun. 3;3:610, 2012, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304: G262-G270, 2013).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de la presente invención o una amida, un éster o una sal del mismo y uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica puede formularse para vías de administración particulares, tales como administración oral, administración subcutánea, administración parenteral y administración rectal, etc. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse en forma sólida (incluyendo, sin limitación, cápsulas, comprimidos, píldoras, gránulos, liofilizados, polvos o supositorios) o en forma líquida (incluidas, sin limitación, soluciones, suspensiones o emulsiones). Las composiciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como fabricación aséptica, esterilización y/o pueden contener diluyentes inertes convencionales, agentes formadores de torta, agentes de tonicidad, agentes lubricantes o agentes tampón, así como adyuvantes, tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes y tampones, etc.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen normalmente soluciones acuosas estériles (en los casos en los que sean hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles.
Para la administración intravenosa, como transportadores adecuados se incluyen, solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS, phosphate buffered satine). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de ser incorporada en una jeringa. Las formulaciones farmacéuticas preferidas son estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. En general, el transportador en cuestión puede ser un medio disolvente o de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, aminoácidos, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. En algunas realizaciones, se puede incorporar un excipiente multifuncional tal como albúmina recombinante en el proceso de formulación para facilitar la estabilización del producto conjugado frente a la degradación o agregación, para mejorar la solubilidad y ayudar en la administración y liberación del componente activo. (BioPharm International, 2012, Vol 23, Número 3, págs. 40-44).
Algunas composiciones inyectables son soluciones o suspensiones isotónicas acuosas, y los supositorios se preparan ventajosamente a partir de emulsiones o suspensiones grasas. Dichas composiciones pueden esterilizarse y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Dichas composiciones se preparan según métodos convencionales de mezclado, granulación o recubrimiento, respectivamente, y contienen aproximadamente un 0,1-75 %, o contienen aproximadamente un 1-50 %, de principio activo.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión de carácter básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier principio adicional deseado de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.
Las composiciones orales incluyen, en general, un diluyente inerte o un transportador comestible. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas, p. ej., cápsulas de gelatina. También pueden prepararse composiciones orales utilizando un transportador líquido para uso como colutorio. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares, pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja. Las formulaciones para administración oral pueden incorporar de forma ventajosa agentes para mejorar la estabilidad dentro del tubo gastrointestinal y/o potenciar la absorción.
Para la administración por inhalación, los agentes terapéuticos de la invención se administran preferentemente en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. Cabe señalar que los pulmones proporcionan una gran área de superficie para el suministro sistémico de agentes terapéuticos.
Los agentes pueden estar encapsulados, p. ej., en micropartículas poliméricas tales como las descritas en la publicación de Estados Unidos 20040096403, o junto con cualquiera de una amplia diversidad de otros vehículos de suministro de fármacos conocidos en la técnica. En otras realizaciones de la invención, los agentes se administran junto con un lípido cargado como se describe, por ejemplo, en la publicación de Estados Unidos 20040062718. Cabe señalar que el último sistema se ha utilizado para la administración de un polipéptido terapéutico, la insulina, demostrando la utilidad de este sistema para la administración de agentes peptídicos.
La administración sistémica también puede realizarse por medios transmucosos o transdérmicos.
Las composiciones adecuadas para aplicación transdérmica incluyen una cantidad eficaz de un conjugado de la invención con un transportador adecuado. Los transportadores adecuados para la administración transdérmica incluyen disolventes absorbibles farmacológicamente aceptables para ayudar al paso a través de la piel del hospedador. Por ejemplo, los dispositivos transdérmicos se encuentran en forma de un vendaje que comprende un elemento de soporte, un depósito que contiene el compuesto, opcionalmente con transportadores, opcionalmente una barrera de control de la velocidad para suministrar el compuesto a la piel del hospedador a una velocidad controlada y predeterminada durante un periodo de tiempo determinado y medios para fijar el dispositivo a la piel.
Las composiciones adecuadas para la aplicación tópica, p. ej., a la piel y los ojos, incluyen soluciones acuosas, suspensiones, pomadas, cremas, geles o formulaciones pulverizables, p. ej., para el suministro por aerosol o similares. Dichos sistemas de suministro tópico serán en particular apropiados para la aplicación dérmica. Por lo tanto, son particularmente adecuados para su uso en formulaciones tópicas, incluyendo cosméticas, bien conocidas en la técnica. Estos pueden contener agentes solubilizantes, estabilizantes, potenciadores de la tonicidad, tampones y conservantes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para administración subcutánea. En la técnica se conocen componentes y métodos de formulación adecuados para la administración subcutánea de agentes terapéuticos polipeptídicos (p. ej., anticuerpos, proteínas de fusión y similares). Véanse, p. ej., la solicitud de patente de Estados Unidos publicada N.° 2011/0044977 y las patentes de Estados Unidos N.° 8.465.739 y 8.476.239. Normalmente, las composiciones farmacéuticas para la administración subcutánea contienen estabilizantes adecuados (p. ej., aminoácidos, tales como metionina, y sacáridos, tales como sacarosa), agentes tampón y agentes tonificantes. Como se usa en el presente documento, una aplicación tópica también puede referirse a una inhalación o a una aplicación intranasal. Se pueden administrar convenientemente en forma de un polvo seco (ya sea solo, como una mezcla, por ejemplo, una mezcla seca con lactosa, o una partícula de componente mixto, por ejemplo con fosfolípidos) desde un inhalador de polvo seco o una presentación en aerosol de un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado.
La invención proporciona además composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas que comprenden uno o más agentes que reducen la velocidad a la que se descompondrá el compuesto de la presente invención como principio activo. Dichos agentes que, en el presente documento, se denominan "estabilizantes", incluyen antioxidantes tales como ácido ascórbico, tampones de pH o tampones de sal, albúmina recombinante.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que conservan la eficacia y las propiedades biológicas de los conjugados de la presente invención y, que normalmente no son biológicamente o de otra manera indeseables. En muchos casos, los conjugados de la presente invención son capaces de formar sales ácidas y/o básicas en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos.
Se pueden formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos, por ejemplo, sales de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, canforsulfonato, cloruro/clorhidrato, cloroteofilonato, citrato, etandisulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogenofosfato/dihidrogenofosfato, poligalacturonato, propionato, estearato, succinato, sulfosalicilato, tartrato, tosilato y trifluoroacetato.
Los ácidos inorgánicos de los que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares.
Los ácidos orgánicos de los que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluensulfónico, ácido sulfosalicílico y similares. Se pueden formar sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables con bases orgánicas e inorgánicas.
Las bases inorgánicas de las que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, sales de amonio y metales de las columnas I a XII de la tabla periódica. En algunas realizaciones, las sales se obtienen de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, zinc y cobre; las sales particularmente adecuadas incluyen sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio.
Las bases orgánicas a partir de las cuales pueden obtenerse sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas, resinas de intercambio iónico básicas y similares. Algunas aminas orgánicas incluyen isopropilamina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina y trometamina.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden sintetizar a partir de un compuesto precursor, una fracción básica o ácida, mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar formas de ácido libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base apropiada (como hidróxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg o K, o similares), o haciendo reaccionar formas de base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica del ácido apropiado. Las reacciones de este tipo normalmente se llevan a cabo en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos. Por lo general, siempre que sea posible, es deseable el uso de medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Se pueden encontrar listas de sales adecuadas adicionales, p. ej., en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 20a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); y en "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002).
Como se usa en el presente documento, la expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (p. e j., agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, excipientes multifuncionales, tales como albúmina recombinante y similares y combinaciones de los mismos, como conocerán los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier transportador convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
Método de la invención
Se ha comunicado que los niveles circulantes de GDF15 son elevados en múltiples afecciones patológicas y fisiológicas, sobre todo en el embarazo (Moore AG 2000. J C lin E n d o c rin o ! M e tab 85: 4781-4788), p-talasemia (Tanno T 2007, Nat Med 13:1096-101) (Zimmermann MB, 2008 A m J C lin N u tr 88:1026-31) y anemia diseritropoyética congénita (Tamary H 2008, B lood. 112:5241-4). El GDF15 también se ha relacionado con múltiples actividades biológicas en informes bibliográficos. Los estudios de ratones transgénicos y con inactivación de GDF15 sugirieron que GDF15 puede proteger contra la lesión cardíaca inducida por isquemia/reperfusión o sobrecarga (Kempf T, 2006, C irc R es. 98:351-60) (Xu J 2006, C irc R es. 98:342-50), proteger contra la pérdida de neuronas motoras y sensoriales asociadas al envejecimiento (Strelau J 2009, J N eurosc i. 29: 13640-8), proteger levemente contra la acidosis metabólica en el riñón y puede causar caquexia en pacientes con cáncer (Johnen H 2007 N a t Med. 11: 1333-40). Muchos grupos también estudiaron el papel de GDF15 en la apoptosis y la proliferación celular y comunicaron resultados controvertidos utilizando diferentes modelos de cultivo celular y xenoinjerto. Los estudios en ratones transgénicos mostraron que el GDF15 protege contra la neoplasia inducida por carcinógenos o por mutaciones Ape en el intestino y el pulmón (Baek SJ 2006, G astroe n te ro log y . 131: 1553-60; Cekanova M 2009, C a n c e rP re v R es 2:450-8).
También se ha comunicado que el GDF15 juega un papel en la inflamación, el cáncer y el metabolismo (Samule Breit et al. Growth Factors, octubre de 2011; 29(5): 187-195). El GDF15 también se ha implicado en la regulación del apetito fisiológico y el peso corporal (Vicky Wang-Wei Tsai et al. Public Library of Science: PLOS ONE 2013, vol. 8, número 2, e55174).
Los conjugados de la presente invención pueden usarse para el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos metabólicos, diabetes, diabetes mellitus tipo 2, obesidad, pancreatitis, dislipidemia, esteatosis hepática/esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica y otras hepatopatías progresivas, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, arteriopatía periférica, accidente cerebrovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía coronaria, complicaciones diabéticas (incluida la hepatopatía crónica), neuropatía, gastroparesia y otros trastornos metabólicos, en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención, o una amida, ester o sal del mismo o una mezcla de conjugados, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos del mismo.
Dichos métodos pueden tener un efecto ventajoso tal como, por ejemplo, disminuir la frecuencia de administración.
Por tanto, la presente invención proporciona un conjugado como se describe en el presente documento, o una amida, éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una mezcla de los conjugados descritos en el mismo, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos del mismo, para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos metabólicos, diabetes mellitus tipo 2, obesidad, pancreatitis, dislipidemia, esteatosis hepática/esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica y otras hepatopatías progresivas, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, arteriopatía periférica, accidente cerebrovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía coronaria, complicaciones diabéticas (incluida la hepatopatía crónica), neuropatía, gastroparesia y otros trastornos metabólicos.
Por tanto, la presente invención proporciona un conjugado o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una mezcla de conjugados, para su uso en terapia.
La cantidad eficaz de una composición farmacéutica o combinación de la invención a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y de los objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán, por lo tanto, dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que se usa el conjugado, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, cuerpo superficie o tamaño del órgano) y el estado (la edad y la salud general) del paciente. En consecuencia, el médico puede ajustar la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis característica puede variar de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras realizaciones, la dosis puede variar de 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg; o de 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En un aspecto adicional de esta realización, la dosis puede variar de 5 pg/kg a 25 pg/kg. En otro aspecto adicional de esta realización, la dosis puede variar de 10 pg/kg a 20 pg/kg.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de doble función en la formulación que se utilice. Normalmente, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como una dosis única, como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo, o como una infusión continua mediante un dispositivo de implantación o catéter. Los expertos habituales en la técnica realizan un ajuste adicional de la dosis apropiada de manera habitual y está dentro del ámbito de las tareas que realizan habitualmente. Se pueden determinar las dosis apropiadas usan datos apropiados de respuesta a la dosis.
Las expresiones "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usan en el presente documento, significan una cantidad de conjugado que provoca una respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o ser humano buscado por un investigador, médico u otro clínico, que incluye el alivio o la mejora de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se está tratando, es decir, una cantidad de conjugado de polipéptido GDF15 (o GDF15 mutante) que soporta un nivel observable de una o más respuestas biológicas o medicinales deseadas, por ejemplo reduciendo los niveles de glucosa, insulina, triglicéridos o colesterol en sangre; reducir el peso corporal; reducir la ingesta de alimento o mejorar la tolerancia a la glucosa, el gasto energético o la sensibilidad a la insulina).
Los términos "paciente" o "sujeto" se usan indistintamente para referirse a un ser humano o a un animal no humano (por ejemplo, un mamífero).
Como se usa en el presente documento, el término "tratar", "tratando" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refiere, en una realización, a mejorar la enfermedad o el trastorno (es decir, ralentizar, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o de al menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico que incluye aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En otra realización más, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico), o ambas cosas. Por lo tanto, el tratamiento incluye inhibir (es decir, detener el desarrollo o el desarrollo posterior de la enfermedad, trastorno o afección o síntomas clínicos asociados con los mismos) una enfermedad activa (por ejemplo, en el caso del conjugado de GDF15, para disminuir el peso corporal, disminuir la ingesta de alimento, disminuir el nivel de insulina y/o glucosa en el torrente circulatorio, aumentar la tolerancia a la glucosa para minimizar la fluctuación de los niveles de glucosa y/o para proteger contra enfermedades causadas por la alteración de la homeostasis de la glucosa).
En otra realización más, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retrasar el inicio o desarrollo o avance de la enfermedad o trastorno.
La expresión "que necesita tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a un juicio realizado por un médico u otro cuidador de que un sujeto requiere o se beneficiará de un tratamiento. Este juicio se realiza basándose en una variedad de factores que están dentro del ámbito de la experiencia del médico o del cuidador.
Los términos "prevenir", "previniendo", "prevención" y similares, se refieren a un procedimiento (tal como administrar un conjugado de la invención o una composición farmacéutica que comprenda un conjugado) iniciado de una manera (por ejemplo, antes de la aparición de una enfermedad, un trastorno, una afección o un síntoma de los mismos) que impida, suprima, inhiba o reduzca, ya sea temporal o permanentemente, el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad, un trastorno, una afección o similar (según determinado, por ejemplo, por la ausencia de síntomas clínicos) o retrasar la aparición de los mismos, generalmente en el contexto de un sujeto predispuesto a tener una enfermedad, un trastorno o una afección particular. En algunos casos, los términos también se refieren a ralentizar el avance de la enfermedad, trastorno o afección o a inhibir el avance de los mismos hacia un estado perjudicial o no deseado de otro modo.
La expresión "enfermedad o trastorno metabólico" se refiere a un conjunto de rasgos asociados que incluyen hiperinsulinemia, tolerancia anómala a la glucosa, obesidad, redistribución de la grasa al compartimiento abdominal o superior del cuerpo, hipertensión, dislipidemia caracterizada por triglicéridos elevados, colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) bajo y partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) pequeñas y densas elevadas. Los sujetos que tienen una enfermedad o trastorno metabólico corren el riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 y, por ejemplo, aterosclerosis.
La expresión "trastorno del metabolismo de la glucosa" incluye cualquier trastorno caracterizado por un síntoma clínico o una combinación de síntomas clínicos que está asociado con un nivel elevado de glucosa y/o un nivel elevado de insulina en un sujeto en relación con un individuo sano. Los niveles elevados de glucosa y/o insulina pueden manifestarse en las siguientes enfermedades, trastornos y afecciones: hiperglucemia, diabetes tipo II, diabetes gestacional, diabetes tipo I, resistencia a la insulina, tolerancia alterada a la glucosa, hiperinsulinemia, alteración del metabolismo de la glucosa, prediabetes, trastornos metabólicos (tal como enfermedad o trastorno metabólico, que también se conoce como síndrome X) y obesidad, entre otros. Los conjugados de GDF15 de la presente divulgación, y sus composiciones, pueden usarse, por ejemplo, para lograr y/o mantener la homeostasis de la glucosa, por ejemplo, para reducir el nivel de glucosa en el torrente circulatorio y/o para reducir el nivel de insulina a un intervalo encontrado en un sujeto sano.
La expresión "resistencia a la insulina" como se usa en el presente documento se refiere a una afección donde una cantidad normal de insulina es incapaz de producir una respuesta fisiológica o molecular normal. En algunos casos, una cantidad hiperfisiológica de insulina, ya sea producida de forma endógena o administrada de forma exógena, es capaz de superar la resistencia a la insulina, en su totalidad o en parte, y producir una respuesta biológica.
La expresión "tolerancia a la glucosa", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un sujeto para controlar el nivel de glucosa en plasma y/o insulina en plasma cuando la ingesta de glucosa fluctúa. Por ejemplo, la tolerancia a la glucosa incluye la capacidad del sujeto para reducir, en aproximadamente 120 minutos, el nivel de glucosa en plasma de nuevo a un nivel determinado antes de la ingesta de glucosa.
La expresión "intolerancia a la glucosa" o "tolerancia alterada a la glucosa (TAG)" es un estado prediabético de disglucemia que se asocia con un mayor riesgo de patología cardiovascular. La condición de prediabético impide que el sujeto transporte la glucosa al interior de las células de manera eficaz y la utilice como una fuente de combustible eficaz, lo que conduce a niveles elevados de glucosa en sangre y a cierto grado de resistencia a la insulina.
La expresión "diabetes mellitus tipo 2" es una afección caracterizada por un exceso de producción de glucosa y los niveles de glucosa en circulación permanecen excesivamente altos como resultado de una eliminación inadecuada de la glucosa y la incapacidad del páncreas para producir suficiente insulina.
El término "hiperglucemia", como se usa en el presente documento, se refiere a una afección en la que circula una cantidad elevada de glucosa en el plasma sanguíneo de un sujeto en relación con un individuo sano. La hiperglucemia se puede diagnosticar usando métodos conocidos en la técnica, incluida la medición de los niveles de glucosa en sangre en ayunas como se describe en el presente documento.
El término "hipoglucemia", también llamado bajo nivel de azúcar en sangre, se produce cuando el nivel de glucosa en sangre desciende demasiado para proporcionar suficiente energía para las actividades del organismo.
El término "hiperinsulinemia", como se usa en el presente documento, se refiere a una afección en la que hay niveles elevados de insulina en circulación cuando, simultáneamente, los niveles de glucosa en sangre son elevados o normales. La hiperinsulinemia puede producirse a consecuencia de resistencia a la insulina que se asocia con dislipidemia, tal como triglicéridos elevados, colesterol alto, lipoproteína de baja densidad (LDL, low-density lipoprotein) elevada y lipoproteína de alta densidad (HDL, high-densitylipoprotein) baja; niveles elevados de ácido úrico; síndrome del ovario poliquístico; diabetes tipo II y obesidad. La hiperinsulinemia puede diagnosticarse con un nivel de insulina plasmática superior a aproximadamente 2 pU/ml.
El término "pancreatitis" es la inflamación del páncreas.
El término "dislipidemia" es un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas, que incluye la sobreproducción o deficiencia de lipoproteínas. Las dislipidemias pueden manifestarse por la elevación del colesterol total, las concentraciones de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL) y triglicéridos, y una disminución de la concentración de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) en la sangre.
La expresión "esteatosis hepática (EH)", también conocida como hígado graso, es una afección en donde se acumulan grandes vacuolas de grasa triglicérida en los hepatocitos mediante el proceso de esteatosis (es decir, retención anómala de lípidos dentro de una célula). A pesar de tener múltiples causas, puede considerarse que el hígado graso es una enfermedad única que se da en todo el mundo en personas con un consumo excesivo de alcohol y en personas obesas (con o sin efectos de la resistencia a la insulina). Cuando este proceso del metabolismo de las grasas se interrumpe, la grasa puede acumularse en el hígado en cantidades excesivas, lo que da como resultado un hígado graso. La acumulación de grasa también puede ir acompañada de una inflamación progresiva del hígado (hepatitis), denominada esteatohepatitis. Teniendo en cuenta la contribución del alcohol, el hígado graso puede denominarse esteatosis alcohólica o esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), siendo las formas más graves la esteatohepatitis alcohólica y la esteatohepatitis no alcohólica (ENA).
El término "esteatohepatitis" es un tipo de hepatopatía, caracterizada por el cambio graso de los hepatocitos, acompañado de inflamación intralobulillar y fibrosis. Cuando no se asocia con una consumo excesivo de alcohol, se conoce como esteatohepatitis no alcohólica (ENA).
La expresión "hepatopatía progresiva" es una hepatopatía causada por una amplia gama de patologías hepáticas que avanzan desde un estado relativamente benigno como la esteatosis hepática a estados más graves que incluyen hepatitis, fibrosis, cirrosis y carcinoma hepatocelular. PNPLA3 se ha asociado específicamente con hepatopatías progresivas tales como EHNA/ENA, EHA/Ea , hepatitis vírica, enfermedad de Wilson, hemocromatosis hereditaria y colangitis esclerosante primaria (Paola Dongiovanni et al. World Journal of Gastroenterology, 2013, 19(41), 6969­ 6978).
El término "obesidad", en términos del sujeto humano, se puede definir como un adulto con un índice de masa corporal (IMC) de 30 o mayor (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades).
El "síndrome metabólico" se puede definir como un conjunto de factores de riesgo que aumentan el riesgo de cardiopatía y otras enfermedades como diabetes y accidente cerebrovascular. Estos factores de riesgo incluyen: nivel elevado de azúcar en sangre--al menos 110 miligramos por decilitro (mg/dl) después del ayuno; triglicéridos elevados--al menos 150 mg/dl en el torrente circulatorio; HDL baja--inferior a 40 mg/dl; y presión arterial de 130/85 mmHg o más elevada (Organización Mundial de la Salud).
La expresión "enfermedades cardiovasculares" son enfermedades relacionadas con el corazón o los vasos sanguíneos.
El término "aterosclerosis" es una enfermedad vascular caracterizada por depósitos de lípidos distribuidos de manera irregular en la íntima de arterias grandes y medianas, que a veces provocan el estrechamiento de las luces arteriales y finalmente avanzan a fibrosis y calcificación. Las lesiones suelen ser focales y avanzan lenta e intermitentemente. La limitación del flujo sanguíneo explica la mayoría de las manifestaciones clínicas, que varían con la distribución y la gravedad de las lesiones.
La expresión "cardiopatía coronaria", también denominada enfermedad de las arterias coronarias, es un estrechamiento de los vasos sanguíneos pequeños que suministran sangre y oxígeno al corazón.
Las "complicaciones diabéticas" son problemas causados por altos niveles de glucosa en sangre, con otras funciones corporales como los riñones, nervios (neuropatías), pies (úlceras en los pies y mala circulación) y ojos (por ejemplo, retinopatías). La diabetes también aumenta el riesgo de cardiopatía y trastornos de los huesos y las articulaciones. Otras complicaciones a largo plazo de la diabetes incluyen problemas de la piel, problemas digestivos, disfunción sexual y problemas con los dientes y las encías.
Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno de peso corporal" se refiere a afecciones asociadas a un peso corporal y/o a un aumento de apetito excesivos. Para determinar si un sujeto tiene sobrepeso en comparación con un individuo sano de referencia, se utilizan varios parámetros, incluida la edad, la altura, el sexo y el estado de salud del sujeto. Por ejemplo, se puede considerar que un sujeto tiene sobrepeso u obesidad mediante la evaluación del índice de masa corporal (IMC) del sujeto, que se calcula dividiendo el peso del sujeto en kilogramos entre la altura del sujeto en metros al cuadrado. Se considera que un adulto que tiene un IMC en el intervalo de -18,5 a -24,9 kg/m tiene un peso normal; un adulto que tiene un IMC entre -25 y -29,9 kg/m puede considerarse con sobrepeso (pre-obeso); un adulto que tiene un iMc de -30 kg/m o más puede considerarse obeso. El aumento del apetito contribuye con frecuencia a un peso corporal excesivo. Hay varias afecciones asociadas con el aumento del apetito, incluido, por ejemplo, el síndrome de alimentación nocturna, que se caracteriza por anorexia matutina y polifagia vespertina a menudo asociada con insomnio, pero que puede estar relacionada con una lesión del hipotálamo.
Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, pretende simplemente explicar mejor la invención y no supone una limitación del alcance de la invención reivindicada de otro modo.
La actividad y la estabilidad en plasma de un conjugado según la presente invención pueden evaluarse mediante los siguientes métodos descritos a continuación.
Ensayos y datos
La actividad y la estabilidad en plasma de los conjugados de GDF15 de los Ejemplos 1 y 19B según la presente invención, pueden evaluarse mediante los siguientes métodos in vitro e in vivo que se describen a continuación. Métodos de estudios con animales
Todos los estudios con animales descritos en el presente documento fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de los Institutos Novartis para la Investigación Biomédica según las normas y directrices locales y federales. Se adquirieron ratones macho con obesidad inducida por la dieta (C57BL/6NTac) en Taconic y a partir de las 6 semanas de vida, se alimentaron con una dieta con un 60 % de grasa (Research Diets D12492i). A su llegada, los ratones se alojaron a razón de un animal por jaula con un ciclo inverso de luz y oscuridad de 12 h:12 h. Antes de cualquier uso, todos los animales recibieron una aclimatación mínima de 1 semana. Normalmente, se estudiaron ratones entre los 3 y 4 meses de vida. Un día antes del estudio, los ratones se asignaron al azar en función del peso corporal, de modo que cada grupo tenía un peso corporal promedio similar. El día del estudio, los ratones se colocaron en jaulas nuevas y se retiró el alimento sobrante. Aproximadamente 1 h más tarde y justo antes del ciclo de oscuridad, los ratones recibieron una sola dosis subcutánea de vehículo (acetato de sodio 30 mM, pH 4) o de un análogo de GDF15 conjugado con lípido (0,5 mg/kg). Una vez completadas todas las inyecciones, se volvió a pesar a los ratones y se les devolvió una cantidad definida de alimento (~ 50 g por ratón). La ingesta de alimento y el peso corporal se midieron en el transcurso de ~ 2 semanas en los momentos indicados. En los tiempos indicados, se extrajo plasma de los animales sustitutos tratados como se ha descrito anteriormente, y mediante un ELISA se midieron los niveles de GDF15 se midieron siguiendo las instrucciones del fabricante (R&D Systems Quantikine Human GDF15 Immunoassay; DGD150).
Una sola dosis sc de 0,5 mg/kg en ratones con OID
La actividad y la semivida de los conjugados de la invención se analizaron en el ensayo descrito anteriormente.
Tabla 1
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Los datos de la tabla 1 demuestran que los conjugados de la invención poseen una duración de acción significativamente mayor en comparación con hGDF15 no conjugado y/o en comparación con hGDF15 pegilado. Eficacia del conjugado de GDF15 en perros alimentados con pienso: Conjugado de GDF15-ácido graso Objetivo del estudio: Evaluar los efectos de la administración subcutánea de 0,05 mg/kg de un conjugado de GDF15-fracción de ácido graso según la invención o de un control de vehículo sobre la ingesta de alimento en un contexto breve (6 horas) y durante un período de 96 horas en perros Beagle. Para evaluar el perfil FC de este compuesto, se extrajeron muestras de plasma en varios puntos temporales durante los 14 días posteriores a la dosis. El peso corporal se determinó durante el estudio.
Animales: Tratamientos y pesos corporales de referencia
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Tabla 2
Procedimiento de dosificación: La dosificación del vehículo o del GDF15 se realizó después de la recogida de muestras de sangre y de determinar el peso corporal de referencia. El conjugado de GDF15-fracción de ácido graso se suministró como una solución de 0,97 mg/ml y se dosificó mediante inyección subcutánea sin dilución a 0,05 mg/kg. Mediante inyección subcutánea, se administró un volumen equivalente de vehículo de acetato de sodio 30 mmol/l (52 pl/kg) a pH 4 a los animales del grupo que recibió vehículo.
Extracción de sangre: Se extrajeron muestras de sangre de la vena cefálica o yugular (3 ml, en tubos que contenían EDTA y los inhibidores de proteasa Diprotina A y Aprotinina) y se colocaron en hielo hasta su centrifugación a 3.000 rpm durante 20 min a 4 °C. El plasma se distribuyó en alícuotas y se conservó a -70 °C hasta el análisis. Se recogieron los siguientes puntos temporales: 0, 6,75, 24,75, 48,75, 72,75 y 96,75 horas. Se extrajeron muestras adicionales los días 7, 10 y 14.
Mediciones de la ingesta de alimento: La medición de la ingesta de alimento a voluntad se inició 45 minutos después de la dosificación. Esta medición de la ingesta de alimento consta de dos fases: una medición breve (0-6 horas) y una medición de corta duración (0-96 horas).
De 0 a 2 horas, los perros recibieron 500 g de pienso regular (dieta J/D de Hill). A las 2 horas, se retiró el alimento residual, se pesó y se ofrecieron otros 500 g de pienso durante el período de 2-4 horas. A las 4 horas, se retiró el alimento residual, se pesó y se ofrecieron otros 300 g de pienso durante el período de 4-6 horas. A las 6 horas, se retiró el alimento residual y se pesó. Se extrajo una muestra de sangre en este momento (6,75 horas). A continuación, se ofreció a los perros 500 g de pienso durante la noche. Las mañanas de los días 1-4, se retiró el alimento residual, se pesó y se extrajo una muestra de sangre de cada animal. Los días 1-3, se ofreció a los perros 500 g de pienso durante un período de 24 horas. El día 4, los perros volvieron a su asignación normal de pienso (260 g).
Mediciones adicionales de la ingesta de alimento: Los días 7, 14 y 28, los animales del estudio tuvieron 6 horas para consumir su pienso diario (260 g). Al final de este período de tiempo, se recogió y se pesó cualquier alimento residual. Mediciones de peso corporal: Los pesos corporales se midieron al inicio del estudio y los días 2, 4, 7, 10, 14, 18 y 28. Los pesos corporales de referencia se recogieron en ayunas. Los pesos corporales recogidos los días 2 y 4 eran de animales que no estaban en ayunas. En el caso de los animales tratados con vehículo, los restantes pesos corporales se recogieron en ayunas. En el caso de los animales tratados con GDF15, los pesos corporales determinados los días 7-28 no estaban en ayunas, ya que los animales recibían alimento continuamente para estimular el apetito y recuperar peso.
Eficacia del conjugado de ensayo GDF15-ácido graso de la invención en perros alimentados con pienso Objetivo del estudio: Evaluar los efectos de la administración subcutánea de un control de vehículo y de 0,015 mg/kg o 0,005 mg/kg del conjugado de GDF15-fracción de ácido graso de la invención, sobre la ingesta de alimento en un contexto breve (6 horas) y durante un período de 96 horas en perros Beagle. (En este caso, en todos los perros, el estudio del grupo que recibe vehículo se realizará antes que el del grupo tratamiento). Para evaluar el perfil FC de este compuesto, se extraerán muestras de plasma en varios puntos temporales durante los 14 días posteriores a la dosis. El peso corporal se determinó durante el estudio.
Animales: Tratamientos y pesos corporales de referencia
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Tabla 3
Procedimiento de dosificación: La dosificación del vehículo se realizó después de la extracción de muestras de sangre y de determinar el peso corporal de referencia. Mediante inyección subcutánea, se administraron 52 pl/kg de vehículo de acetato de sodio 30 mmol/l (52 pl/kg) a pH 4 a los animales del grupo que recibió vehículo. La dosificación de GDF15 se realizó después de la extracción de la muestras de sangre y de determinar el peso corporal de referencia. El conjugado GDF15-fracción de ácido graso se suministró como una solución de 1,20 mg/ml y se dosificó mediante inyección subcutánea después de la dilución a 0,015 mg/kg y 0,005 mg/kg. La solución madre de GDF15 se diluyó para mantener los 52 pl/kg suministrados en un estudio anterior.
Extracción de sangre: Se extrajeron muestras de sangre de los grupos que recibieron vehículo y de tratamiento del estudio. Se extrajeron muestras de la vena cefálica o yugular (3 ml, en tubos que contenían EDTA y los inhibidores de proteasa Diprotina A y Aprotinina) y se colocaron en hielo hasta su centrifugación a 3.000 rpm durante 20 min a 4 °C. El plasma se distribuyó en alícuotas y se conservó a -70 °C hasta el análisis. Se recogieron los siguientes puntos temporales: 0, 6,75, 24,75, 48,75, 72,75 y 96,75 horas. Se extrajeron muestras adicionales los días 7, 10 y 14.
Mediciones de la ingesta de alimento: La ingesta de alimento se midió durante las secciones de vehículo y de tratamiento del estudio. La medición de la ingesta de alimento a voluntad se inició 45 minutos después de la dosificación. Esta medición de la ingesta de alimento consta de dos fases: una medición breve (0-6 horas) y una medición de corta duración (0-96 horas).
De 0 a 2 horas, los perros recibieron 500 g de pienso regular (dieta J/D de Hill). A las 2 horas, se retiró el alimento residual, se pesó y se ofrecieron otros 500 g de pienso durante el período de 2-4 horas. A las 4 horas, se retiró el alimento residual, se pesó y se ofrecieron otros 300 g de pienso durante el período de 4-6 horas. A las 6 horas, se retiró el alimento residual y se pesó. Se extrajo una muestra de sangre en este momento (6,75 horas). A continuación, se ofreció a los perros 500 g de pienso durante la noche. Las mañanas de los días 1-4, se retiró el alimento residual, se pesó y se extrajo una muestra de sangre de cada animal. Los días 1-3, se ofreció a los perros 500 g de pienso durante un período de 24 horas. El día 4, los perros volvieron a su asignación normal de pienso (260 g).
Mediciones adicionales de la ingesta de alimento: En varios días, entre los días 7 y 14 en el grupo que recibe vehículo y entre los días 7 y 28 en el grupo de tratamiento, los animales del estudio tuvieron 6 horas para consumir su pienso diario (225 g). Al final de este período de tiempo, se recogió y se pesó cualquier alimento residual. Una vez a la semana, se tomó una medición cronometrada del consumo de alimento. El consumo de 225 g de pienso se midió 1, 2, 4 y 6 horas después de la alimentación para determinar si el patrón de alimentación de cada perro había vuelto a la normalidad.
Mediciones de peso corporal: El peso corporal se midió durante los grupos tratados con vehículo y de tratamiento del estudio. Durante el grupo que recibe vehículo, se midieron los pesos corporales al inicio del estudio y los días 2, 4, 7, 10 y 14. Durante el grupo de tratamiento, los pesos corporales se midieron al inicio del estudio y los días 2, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 24 y 28. Los pesos corporales recogidos los días 2 y 4 eran de animales que no estaban en ayunas. Los restantes pesos corporales se determinaron en ayunas.
El conjugado del Ejemplo 2 se analizó en el ensayo anterior
Dosis sc única en perro
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Tabla 4
El conjugado de GDF15 mejora las medidas de la enfermedad metabólica, incluida la diabetes y la enfermedad del hígado graso en ratones obesos
Durante 4 semanas, ratones con obesidad inducida por la dieta, recibieron una dosis semanal de vehículo o del Ejemplo 19Bm (0,5 mg/kg/s.c.). La glucosa y la insulina no en ayunas se midieron 2 semanas después de la primera dosis, y la glucosa y la insulina en sangre en ayunas durante la noche se midieron 4 semanas después de la primera dosis. El Ejemplo 19Bm redujo la glucosa no en ayunas en un 23 % (tratado con 207,1 mg/dl de vehículo frente a 160,4 mg/dl del Ejemplo 19Bm; p <0,05). El Ejemplo 19Bm redujo los niveles de insulina no en ayunas en un 75 % en comparación con los ratones tratados con vehículo (2,1 frente a 8,7 ng/ml; p <0,05). Cuatro semanas después de la dosis inicial, el Ejemplo 19Bm redujo la glucosa en sangre en ayunas en un 28 % (142,7 frente a 199,5 mg/dl; p <0,05) y la insulina en ayunas en un 78 % (0,77 frente a 3,5 ng/ml; p <0,05). Los marcadores de la enfermedad del hígado graso también mejoraron con cuatro dosis semanales del Ejemplo 19Bm. El Ejemplo 19Bm redujo la esteatosis hepática en 57,5 % (11,36 frente a 26,73 % de grasa hepática; p <0,05) y los niveles séricos de un marcador de daño de hepatocitos, la alanina aminotransferasa (ALT), en un 58 % (46,2 frente a 110,5 U/l; p <0,05). Además, el Ejemplo 19Bm disminuye la expresión hepática de PNPLA3, un gen causante de hepatopatías progresivas, en un 77 % (p <0,05).
Los conjugados de la presente invención tienen una estabilidad en plasma de al menos 5 h, al menos 10 h, al menos 20 h, al menos 30 h, al menos 40 h o al menos 50 h. En una realización, la mejora de la estabilidad en plasma en comparación con la biomolécula no conjugada es de al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces o 50 veces o 75 veces.
Terapia de combinación
El conjugado de la presente invención puede administrarse simultáneamente con, o antes o después de, uno o más agentes terapéuticos distintos. El conjugado de la presente invención puede administrarse por separado, por la misma o diferente vía de administración, o juntos en la misma composición farmacéutica que los otros agentes.
En una realización, la invención proporciona un producto que comprende un conjugado de la invención o una mezcla de conjugados como se describe en las realizaciones 10 y 13, y al menos otro agente terapéutico como una preparación combinada para su uso simultáneo, por separado o secuencial en terapia. La terapia puede ser el tratamiento de un trastorno o enfermedad metabólica, diabetes mellitus tipo 2, obesidad, dislipidemia, niveles elevados de glucosa, niveles elevados de insulina y nefropatía diabética, en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención, o una amida, éster o sal del mismo, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos y otras formas modificadas del mismo.
Los productos proporcionados como una preparación combinada incluyen una composición que comprende un conjugado de una cualquiera de las realizaciones anteriores, y el otro agente o agentes terapéuticos juntos en la misma composición farmacéutica, o un conjugado de la invención, y el otro agente o agentes terapéuticos por separado, por ejemplo, en forma de kit.
En una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de la invención o una mezcla de conjugados según la realización 10 o 13, y otro(s) agente(s) terapéutico(s). Opcionalmente, la composición farmacéutica puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, como se ha descrito anteriormente.
Puede proporcionarse un kit que comprenda dos o más composiciones farmacéuticas distintas, conteniendo al menos una de ellas un conjugado según la invención. En una realización, el kit comprende medios para guardar por separado dichas composiciones, tal como un recipiente, un frasco dividid o un envase de aluminio dividido. Un ejemplo de un kit de este tipo es un envase alveolado, como el que normalmente se utiliza para el envasado de comprimidos, cápsulas y similares.
El kit se puede utilizar para administrar diferentes formas farmacéuticas, por ejemplo, oral, subcutánea y parenteral, para administrar las composiciones por separado a diferentes intervalos de dosificación, o para ajustar las distintas composiciones entre sí. Para ayudar al cumplimiento, el kit de la invención normalmente comprende instrucciones para la administración.
En las terapias de combinación, un mismo o diferentes fabricantes pueden fabricar y/o formular el conjugado de la invención y el otro agente terapéutico. Además, el conjugado de la invención y el otro agente terapéutico se pueden combinar en una terapia de combinación: (i) antes de poner el producto combinado a disposición de los médicos (por ejemplo, en el caso de un kit que comprende el conjugado de la invención y el otro agente terapéutico); (ii) por el mismo médico (o con la guía del médico) poco antes de la administración; (iii) en el propio paciente, por ejemplo, durante la administración secuencial de un conjugado de la invención y el otro agente terapéutico.
Se puede utilizar un conjugado de la invención para tratar una enfermedad o afección expuesta en el presente documento, en donde el paciente se ha tratado previamente (por ejemplo, dentro de las 24 horas) con otro agente terapéutico. Se puede utilizar otro agente terapéutico para tratar una enfermedad o afección expuesta en el presente documento, en donde el paciente ha sido tratado previamente (por ejemplo, dentro de las 24 horas) con un conjugado según la invención.
La expresión "en combinación con" un segundo agente o tratamiento incluye la coadministración del conjugado de la invención (por ejemplo, un conjugado descrito en el presente documento) con el segundo agente o tratamiento, primero la administración del compuesto de la invención, seguido del segundo agente o tratamiento y primero la administración del segundo agente o tratamiento, seguido del conjugado de la invención.
Las expresiones "segundo agente" y "coagente" se usan indistintamente e incluyen cualquier agente conocido en la técnica para tratar, prevenir o reducir los síntomas de una enfermedad o un trastorno descrito en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad o un trastorno seleccionado de una enfermedad o un trastorno metabólico, diabetes mellitus tipo 2, obesidad, pancreatitis, dislipidemia, esteatosis hepática/esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica y otras hepatopatías progresivas, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, arteriopatía periférica, accidente cerebrovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía coronaria, complicaciones diabéticas (incluida la hepatopatía crónica), neuropatía, gastroparesia y otros trastornos metabólicos.
La terapia puede ser el tratamiento de enfermedades o trastornos metabólicos, diabetes, diabetes mellitus tipo 2, obesidad, pancreatitis, dislipidemia, esteatosis hepática/esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica y otras enfermedades hepáticas progresivas, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, arteriopatía periférica, accidente cerebrovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía coronaria, complicaciones diabéticas (incluida la hepatopatía crónica), neuropatía, gastroparesia y otros trastornos metabólicos, en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención, o una amida, ester o sal del mismo, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos y otras formas modificadas del mismo.
Como ejemplos de segundos agentes para combinar con un conjugado de la presente invención, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes, fragmentos y otras formas modificadas de los mismos; se incluyen: 1
1. Agentes antidiabéticos, tales como insulina, derivados y miméticos de insulina; secretagogos de insulina tales como sulfonilureas (por ejemplo, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, tolbutamida, gliburida, glimepirida, glipizida); gliburida y amaril; ligandos del receptor insulinotrópico de sulfonilurea tales como meglitinidas, por ejemplo, nateglinida y repaglinida; tiazolidinedionas (por ejemplo, rosiglitazona (AVANDIA), troglitazona (REZULIN), pioglitazona (ACTOS), balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazona, ciglitazona, adaglitazona, darglitazona que mejoran la acción de la insulina (por ejemplo, por la sensibilidad a la insulina), promoviendo así la utilización de glucosa en tejidos periféricos; inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa-1B (PTP-1B) como PTP-112; inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP) como torcetrapib, inhibidores de GSK3 (glucógeno sintasa quinasa-3) como SB-517955, SB-4195052, SB-216763, Nn -57-05441 y NN-57-05445; ligandos RXR como GW-0791 y AGN-194204; inhibidores del cotransportador de glucosa dependiente de sodio como T-1095; inhibidores de glucógeno fosforilasa A como BAY R3401; biguanidas como metformina y otros agentes que actúan promoviendo la utilización de glucosa, reduciendo la producción de glucosa hepática y/o disminuyendo la producción de glucosa intestinal; inhibidores de la alfa-glucosidasa como acarbosa y miglitol) y otros agentes que ralentizan la digestión de los carbohidratos y, en consecuencia, la absorción intestinal y reducen la hiperglucemia posprandial; GLP-1 (péptido 1 similar al glucagón), análogos de GLP-1 tales como exendina-4 y miméticos de GLP-1; e inhibidores de DPPIV (dipeptidil peptidasa IV) tales como vildagliptina;
2. Agentes hipolipidémicos tales como inhibidores de 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, por ejemplo lovastatina, pitavastatina, simvastatina, pravastatina, cerivastatina, mevastatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, atorvastatina, rosuvastatina y rivastatina; inhibidores de escualeno sintasa; ligandos de FXR (receptor X farnesoide) y LXR (receptor X hepático); secuestradores de ácidos biliares, tales como colestiramina y colesevelam; fibratos; ácido nicotínico y aspirina;
3. Agentes antiobesidad, tales como orlistat o rimonabant, fentermina, topiramato, qnexa y lorcaserina;
4. Agentes antihipertensivos, por ejemplo, diuréticos del asa tales como ácido etacrínico, furosemida y torsemida; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, moexipril, perinodopril, quinapril, ramipril y trandolapril; inhibidores de la bomba de membrana de Na-K-ATPasa como digoxina; inhibidores de endopeptidasa neutra (NEP); inhibidores de la ECA/NEP como omapatrilat, sampatrilat y fasidotril; antagonistas de la angiotensina II tales como candesartan, eprosartan, irbesartan, losartan, telmisartan y valsartan, en particular valsartan; inhibidores de renina tales como ditekiren, zankiren, terlakiren, aliskiren, RO 66-1132 y RO-66-1168; bloqueadores de los receptores p-adrenérgicos tales como acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, metoprolol, nadolol, propranolol, sotalol y timolol; agentes inotrópicos como digoxina, dobutamina y milrinona; bloqueadores de los canales de calcio tales como amlodipina, bepridil, diltiazem, felodipina, nicardipina, nimodipina, nifedipina, nisoldipina y verapamilo; antagonistas del receptor de aldosterona; e inhibidores de la aldosterona sintasa;
5. Agonistas de receptores activados por proliferadores de peroxisomas, tales como fenofibrato, pioglitazona, rosiglitazona, tesaglitazar, BMS-298585, L-796449, los compuestos específicamente descritos en la solicitud de patente WO 2004/103995 es decir, los compuestos de los ejemplos 1 a 35 o los compuestos específicamente enumerados en la reivindicación 21, o los compuestos específicamente descritos en la solicitud de patente WO 03/043985 es decir, los compuestos de los ejemplos 1 a 7 o los compuestos específicamente enumerados en la reivindicación 19 y especialmente (R)-1-{4-[5-metil-2-(4-trifluorometil-fenil)-oxazol-4-ilmetoxi]-bencenosulfonil}-2,3-dihidro-1H-indol-2-carboxílico o una sal del mismo; y
6. Los compuestos antidiabéticos específicos descritos en Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623­ 633, figuras 1 a 7.
Además, la presente divulgación contempla la terapia de combinación con agentes y métodos para promover la pérdida de peso, tales como agentes que estimulan el metabolismo o disminuyen el apetito, y dietas modificadas y/o regímenes de ejercicio para promover la pérdida de peso.
Ejemplos de la invención
Abreviaturas
ACN Acetonitrilo
BEH Híbrido con puente de etileno
BOC terc-butiloxicarbonilo
BSA Seroalbúmina bovina
DCM diclorometano
DCC N,N'-diciclohexilcarbodiimida
DIC W,W-Diisopropilcarbodiimida
DIPEA W,W-Diisopropiletilamina
DMAP Dimetilaminopiridina
DMF W,W-dimetilformamida
DTT Ditiotreitol
DOT 3,6-dioxa-1,8-octanoditiol
EDC 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EDTA ácido etilenodiaminotretraacético
ESI ionización por electronebulización
FFA ensayo de foco fluorescente
Fmoc cloruro de fluorenilmetiloxicarbonilo
HCTU: hexafluorofosfato de O-(6-Clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HEP Heptano
HFIP Hexafluoroisopropanol
HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento
HRMS Espectrometría de masas de alta resolución
HOBT Hidroxibenzotriazol
SH Suero humano
LC/MS cromatografía líquida/espectrometría de masas
MS Espectrometría de masas
PM peso molecular
MRT tiempo medio de residencia
NHS N-hidroxisuccinimida
NMM N-metilmorfolina
RMN Resonancia magnética nuclear
PEG polietilenglicol
PE Piroglutamato
pbf 2,2,4,6,7-Pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
GP: grupo protector
FC farmacocinética
Pol Soporte de polímero
QTOF: Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo
Rt: tiempo de retención
Ta o TA: temperatura ambiente
Rpm: ronda por minuto
Sc subcutánea
SFC fluido supercrítico
SPPS síntesis de péptidos en fase sólida
TBME metil terc-butil éter
T rt tritilo
THF Tetrahidrofurano
TEA trimetilamina
TIS trietilsilano
t, s, quin, br, m, d (triplete, singlete, quinteto, anchura, multiplete)
UPLC Cromatografía líquida de ultra rendimiento
Síntesis:
Métodos de LCMS descritos
Método A
Columna Acquity BEH 1,7 pm 2,1 x 50 mm
Temperatur 50 C
Eluyentes A: Agua (ácido fórmico al 0,1 %); B: ACN (ácido fórmico al
0,1 %)
Caudal 1 ml/min
Gradiente 0 min 2 % de B; de 2 % a 98 % de B en 1,7 min; 2,06 min 98 % de B; 2,16 min 2 % de B
Espectróm Cuadrupolo Sencillo ESI intervalo de escaneo 120-1600
UPLC
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Waters Acquity
Método B
Columna Acquity BEH 1,7 pm 2,1 x 50 mm
Temperatu 50 C
Eluyentes A: Agua (ácido fórmico al 0,1 %); B: ACN (ácido fórmico al
0,1 %)
Caudal 1 ml/min
Gradiente 0 min 40 % de B; de 40 % a 98 % de B en 1,40 min; 2,05 min al 98 % de B; 2,1 min al 40 % de B
Espectróm Cuadrupolo Sencillo ESI intervalo de escaneo 120-1600
UPLC
Figure imgf000044_0002
Waters Acquity
Método C
Columna XBridge Columna C18, 3,5 pm, 3,0 x 30 mm
Temperatur 40 C
Eluyentes A: Agua (ácido fórmico al 0,1 %); B: ACN
Caudal 2 ml/min
Gradiente 0 min 40 % de B; de 40 % a 95 % de B en 1,70 min; 2,0 min al 95 % de B; 2,1 min al 40 % de B
Espectróme Cuadrupolo Sencillo ESI intervalo de escaneo 150-1600
HPLC
Figure imgf000044_0004
Serie Agilent 1100
Método D
Columna Hilic 2,1 x 100 mm
Figure imgf000044_0003
Temperatura de la columna 55 C
Figure imgf000045_0001
Método H: Método LC-MS
• HPLC: Fase móvil A: HFIP al 2 % TEA al 0,1 %; Fase móvil B: Metanol;
• Gradiente: 0 min al 95 % de A, 4 min: al 75 % de A, 8 min al 10 % de A, 8,1 min al 95 % de A, 10 min al 95 % de A;
• Caudal: 250 pl/min;
• Columna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 um, 2,1 x 50 mm (Waters);
• Temp. de la columna: 75 °C
• MS: Modo negativo QTOF (Waters);
• ESI: 2,9 kv; Temperatura del capilar 350 °C; Gas de pulverización: 600 ml/min; Temp. de la fuente: 150 °C Método J de UPLC HRMS:
• Columna: Acquity BEH300 C4 1,7 pm, 2,1 x 50 mm
• Eluyente A: Agua (TFA al 0,1 %)
• Eluyente B: ACN (TFA al 0,1 %)
• Flujo: 0,5 ml/min
• Temperatura: 40 °C
• Gradiente: 20 % mantener 0,5 min, aumentar ACN al 80 % en 10 min
Método K:
• Columna: Columna Waters Protein BEH C4, 300 Angstrom, 3,5 um, 4,6 x 100mm
• Fase móvil: A: Agua (TFA al 0,05 %) B: ACN (TFA al 0,05 %)
• Flujo: 2 ml/min
• Temperatura: 40 °C
• Gradiente: Mantenga el 25 % de B durante 1 min, aumente del 25-60 % de ACN a los 10 min, aumente al 95 % de B a los 10,50 min y manténgalo durante 2 minutos, después equilibre al 25 % durante 2 min. El tiempo de ejecución total es de 15 minutos.
• Espectrómetro de masas: Especificaciones de masas de Waters ZQ
• UPLC: Columna: BEH C4, 300 Angstrom, 1,7 um, 2,1 x 50mm
Método L:
• Columna: Proswift Monolith 4,6 x 50 mm
• Fase móvil: A: Agua (ácido fórmico al 0,1 %) B: ACN (ácido fórmico al 0,1 %)
• Flujo: 1 ml/min
• Temperatura: 50 °C
• Gradiente: 0 min 3 % de B; 3 % a 80 % de B en 2 min; 2,1 min 10 % de B; 2,8 min 95 % de B; 2,9 min 3 % de B • Espectrómetro de masas: Qtof intervalo de escaneo ESI 100-1900; desconvolucionado por Max Ent 1 en el paquete de software Mass Lynx
• UPLC: Waters Acquity
Método analítico T:
Figure imgf000046_0002
Compuesto intermedio 1: 11-bromoundecanoato de bencilo
Figure imgf000046_0001
Se disolvieron ácido 11-bromoundecanoico (4 g, 15,08 mmol), alcohol bencílico (1,875 ml, 18,10 mmol) y DMAP (92 mg, 0,754 mmol) en DCM con N2 a temperatura ambiente. Se añadió EDC-HCl (4,34 g, 22,63 mmol) y la reacción se agitó durante 17 h. La reacción se concentró, seguido de dilución con Et2O (150 ml). La mezcla se extrajo con agua (30 ml) y la fase acuosa se extrajo con Et2O (150 ml). Los orgánicos combinados se lavaron con salmuera (20 ml) y se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se eliminó y el residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (sílice 120 g, 0-10 % de Et2O / éter de petróleo) para producir el compuesto intermedio 1 como un líquido incoloro (6,75 g, cuantitativo): Método de LCMS Método A Rt = 1,79 min, M+H 355,2; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 1,18 - 1,36 (m, 10 H) 1,37 - 1,47 (m, 2 H) 1,64 (quin, J=7,33 Hz, 2 H) 1,85 (dt, J=14,56, 7,06 Hz, 2 H) 2,35 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 3,40 (t, J=6,88 Hz, 2 H) 5,11 (s, 2 H) 7,28 - 7,45 (m, 5 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 2 : T rib e n c il u n d e c a n o -1 ,1 ,11 -tr ic a rb o x ila to .
Figure imgf000047_0001
Se suspendió NaH (113 mg, 2,83 mmol) en DMF (6 ml) con N2 a 0 °C. Se añadió lentamente malonato de dibencilo (0,704 ml, 2,82 mmol) a la suspensión en agitación durante 30 min. Se añadió el compuesto intermedio 1 (903 mg, 2,54 mmol) disuelto en DMF (3 ml) y la reacción se agitó a 0 °C durante 2,75 h antes de dejarla entibiar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con agua (20 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml) y los orgánicos combinados se lavaron con salmuera (30 ml). Los orgánicos se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El concentrado se purificó mediante columna ultrarrápida (sílice 80 g, 0­ 10 % de EtOAc/HEP) para producir un aceite incoloro (770 mg, 1,38 mmol, 34%) con una pureza del 70 %: Método de LCMS B Rt = 1,41 min, M+H 559,6.
Compuesto intermedio 3: Tribencil docosano-1,11,11 -tricarboxilato
Figure imgf000047_0002
A una suspensión de NaH (66,1 mg, 1,65 mmol) en DMF (2 ml) a 0 °C con N2, se le añadió el compuesto intermedio 2 (770 mg, 1,38 mmol) en DMF (4 ml). Después de 35 min, se añadió a la reacción una solución de 1 -bromoundecano (0,338 ml, 1,52 mmol) en DMF (2 ml), que se dejó entibiar a temperatura ambiente después de agitar durante 25 min. La reacción se agitó durante 2 días. La reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con 10 % de LiCl (25 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml). Los orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y el disolvente se evaporó. La purificación del residuo mediante columna ultrarrápida (80 g de sílice, 0-10 % de EtOAc/HEP) produjo el compuesto intermedio 3 como un aceite incoloro (590 mg, 0,827 mmol, 33 %): Método de LCMS Método B Rt = 1,89 min, M+Na 735,5; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ó ppm 0,87 - 0,95 (m, 3 H) 1,07 (s a., 4 H) 1,14 - 1,36 (m, 28 H) 1,66 (quin, J=7,43 Hz, 2 H) 1,85 - 1,95 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 5,12 (s, 4 H) 5,14 (s, 2 H) 7,27 (d, J=2,32 Hz, 1 H) 7,28 - 7,43 (m, 14 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 4 : Á c id o d o c o s a n o -1 ,11 ,11 -tr ic a rb o x ílic o
Figure imgf000048_0001
El compuesto intermedio 3 (590 mg, 0,827 mmol) disuelto en THF (12 ml) se combinó con una suspensión de Pd al 10 % sobre carbón en THF (8 ml). La suspensión se agitó y se colocó en una atmósfera de hidrógeno mediante un globo. Después de 1 hora, la reacción se pasó a través de un filtro de membrana y los sólidos se aclararon con EtOAc. El filtrado se evaporó, proporcionando el compuesto del título como un aceite incoloro (353 mg, 0,798 mmol, 96 %): Método de LCMS Método B Rt = 1,16 min, M+H 443,5; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ó ppm 0,77 - 0,84 (m, 3 H) 1,06 - 1,33 (m, 32 H) 1,59 (quin, J=7,18 Hz, 2 H) 1,83 - 1,92 (m, 4 H) 2,32 (t, J=7,03 Hz, 2 H).
Compuesto intermedio 5: Ácido 2-(((2,5-Dioxopirrolidin-1-il)oxi)carbonil)-2-undeciltridecanodioico
Figure imgf000048_0002
Se añadió una solución de DCC (126 mg, 0,610 mmol) en DCM (1,57 ml) a una solución de compuesto intermedio 4 y N-hidroxisuccinimida en DCM (5 ml) y THF (5 ml) con N2. Después de 3,5 horas, se evaporó el disolvente y el residuo se purificó mediante cromatografía de fluidos supercríticos (SFC; Princeton 2-etil-piridina, 20 x 150 mm, 20-30 % de MeOH/CO2), produciendo el compuesto del título como un aceite incoloro (138 mg, 0,256 mmol, 50 %): Método de LCMS B Rt = 1,21 min, M+H 540,5; 1H RMN (600 MHz, ACETONITRILO-d3) ó ppm 0,91 (t, J=7,20 Hz, 3 H) 1,22 -1,42 (m, 34 H) 1,57 (quin, J=7,34 Hz, 2 H) 1,93 - 1,96 (m, 2 H) 2,28 (t, J=7,47 Hz, 2 H) 2,79 (a. d, J=6,30 Hz, 4 H).
Compuesto intermedio 6 y 6A: Construcción de ácido 2-(Azido-PEG23-carbamoil)-2-undeciltridecanodioico (6) y ácido 12-(Azido-PEG23-cabamoil)tricosanoico (6A)
Figure imgf000049_0001
El compuesto intermedio 5 (36 mg, 0,066 mmol) y azido-dPEG23-NH2 (Quanta Biodesign: 73 mg, 0,066 mmol) se combinaron en THF (1,5 ml) y se mezclaron en una placa de agitación durante 15 minutos antes de la adición de DIPEA (17 pl, 0,10 mmol). La reacción se dejó en la placa de agitación durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm, 55-80 % de ACN/agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto intermedio 6 (39 mg, 0,025 mmol, 38 %) e compuesto intermedio 6a (20 mg, 0,013 mmol, 20 %): Método de LCMS B Rt = 1,11 min, [M+2H]+2763,4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,86 - 0,93 (m, 3 H) 1,10 -1,19 (m, 2 H) 1,20 - 1,29 (m, 23 H) 1,32 (s a., 7 H) 1,58 - 1,69 (m, 2 H) 1,69 - 1,79 (m, 2 H) 1,96 - 2,10 (m, 2 H) 2,35 (t, J=7,15 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,51 - 3,57 (m, 2 H) 3,58 - 3,62 (m, 2 H) 3,62 - 3,73 (m, 90 H) 7,46 (s a., 1 H); LCMS Método B Rt = 1,23 min, [M+2]+2740,9; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,83 - 0,96 (m, 3 H) 1,27 (s a., 25 H) 1,29 - 1,37 (m, 7 H) 1,37 - 1,46 (m, 2 H) 1,53 - 1,73 (m, 4 H) 2,34 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,44 - 3,52 (m, 2 H) 3,55 - 3,60 (m, 2 H) 3,60 - 3,74 (m, 90 H) 6,19 - 6,30 (m, 1 H).
Como alternativa, la construcción 6 A se obtiene según el siguiente procedimiento: Se añadió una solución del compuesto intermedio 5 (48 mg, 0,042 mmol) en THF (1 ml) a un vial cargado con azido-PEG23-amina (Quanta Biodesign n.° de cat 10525) (46 mg, 0,042 mmol). La reacción se agitó durante 20 min antes de la adición de DIPEA (11 pl, 0,063 mmol) y después se mantuvo durante la noche. Se añadieron azido-PEG23-amina (23 mg, 0,021 mmol) y DIPEA (5 pl, 0,029 mmol) y la reacción se agitó al otro día. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (xbridge C1830 x 50 mm, 10-30 % de ACN/NH4OH 5 mM). La liofilización de las fracciones dio como resultado una mezcla de productos. El material se purificó por HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm, 45-70 % de ACN/agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto intermedio del título 6A (30 mg, 0,020 mmol, 48 %): Método de LCMS B Rt = 0,81 min, [M+H+HaO]+2764,5; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILO-d3) 5 ppm 1,30 (s a., 28 H) 1,40 - 1,50 (m, 2 H) 1,50 -1,62 (m, 6 H) 2,14 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 2,23 - 2,35 (m, 3 H) 3,32 (c, J=5,58 Hz, 2 H) 3,37 - 3,43 (m, 2 H) 3,47 - 3,52 (m, 2 H) 3,53 - 3,68 (m, 90 H) 6,54 (s a., 1 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 7: (((11 -B ro m o u n d e c il)o x i)m e ta n o triil)tr ib e n c e n o
Figure imgf000050_0001
Se disolvieron cloruro de tritilo (2,49 g, 8,92 mmol), 11-bromoundecan-1-ol (2,00 g, 7,96 mmol) y DMAP (10 mg, 0,080 mmol) en DCM (16 ml) con N2. Con agitación, se añadió DIPEA (1,39 ml, 7,96 mmol) y la reacción se mantuvo durante 7 días. La reacción se dividió entre DCM (20 ml) y agua (10 ml). La fase orgánica se extrajo con agua (20 ml), se secó sobre MgSO4 y se concentró. El concentrado se purificó mediante columna ultrarrápida (sílice 120 g, 0-6 % de EtOAc/HEP) para producir el compuesto intermedio 7 (2,50 g, 5,07 mmol, 64 %) como un aceite incoloro: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 1,19 - 1,49 (m, 14 H) 1,58 - 1,69 (m, 2 H) 1,79 (dt, J=14,50, 7,00 Hz, 1 H) 1,87 (dt, J=14,55, 7,03 Hz, 1 H) 3,07 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 3,43 (t, J=6,85 Hz, 1 H) 3,55 (t, J=6,79 Hz, 1 H) 7,18 - 7,36 (m, 10 H) 7,42 - 7,52 (m, 5 H).
Compuesto intermedio 8: Dibenzil 2-(11-(tritiloxi)undecil)malonato
Figure imgf000050_0002
Se suspendió NaH (113 mg, 2,83 mmol) en DMF (6 ml) a 0 °C con N2. Se añadió lentamente malonato de dibencilo a la suspensión agitada. Después de 30 min, se añadió una solución de compuesto intermedio 7 (1,26 g, 2,54 mmol) en DMF (3 ml). Después de 15 minutos de agitación, la mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 3 días, la reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con agua (40 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml). Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El concentrado se purificó mediante columna ultrarrápida (80 g de sílice, 0-10 % de EtOAc/HEP) para producir el compuesto del título como un aceite incoloro (815 mg, 1,17 mmol, 41 %): Método de HPLC B Rt = 1,68 min; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 1,16 - 1,40 (m, 16 H) 1,58 - 1,69 (m, 2 H) 1,94 (c, J=7,38 Hz, 2 H) 3,06 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 3,45 (t, J=7,52 Hz, 1 H) 5,16 (s, 4 H) 7,21 - 7,28 (m, 3 H) 7,28 - 7,39 (m, 16 H) 7,42 - 7,51 (m, 6 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 9: T rib e n c il 22 -(tr it ilo x i)d o c o s a n o -1 ,11,11 -tr ic a rb o x ila to
Figure imgf000051_0001
Una solución de compuesto intermedio 8 (815 mg, 1,17 mmol) en DMF (2 ml) se añadió a una suspensión de NaH (56 mg, 1,40 mmol) en DMF (2 ml) bajo N2 a 0 °C. La mezcla se agitó durante 1 hora. Se añadió a la reacción 11-bromoundecanoato de bencilo (457 mg, 1,29 mmol) en DMF (2 ml). La reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente 20 min después de la adición y se agitó durante la noche. La reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con agua (25 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml) y los orgánicos se combinaron. Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. El residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (40 g de sílice, 0-10 % de EtOAc/HEP) para producir el compuesto del título como un aceite incoloro (780 mg, 0,803 mmol, 69 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,99 - 1,14 (m, 4 H) 1,15 - 1,41 (m, 26 H) 1,58 - 1,71 (m, 4 H) 1,82 - 1,96 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 3,06 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 5,12 (s, 4 H) 5,14 (s, 2 H) 7,28 (s, 24 H) 7,42 - 7,52 (m, 6 H).
Compuesto intermedio 10: Ácido 22-(Tritiloxi)docosano-1,11,11 -tricarboxílico
Figure imgf000051_0002
Se añadió una suspensión de Pd al 10 % sobre carbón (11 mg, 0,010 mmol) en THF (2,5 ml) a una solución de compuesto intermedio 9 (200 mg, 0,206 mmol) en THF (2,5 ml). La suspensión agitada se colocó en hidrógeno mediante un globo. Después de 2,25 horas, la reacción se pasó a través de un filtro de membrana y los sólidos se aclararon con EtOAc. El filtrado se evaporó para producir el compuesto intermedio 10 (150 mg, cuantitativo): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 1,04 - 1,33 (m, 30 H) 1,45 - 1,62 (m, 4 H) 1,76 - 1,91 (m, 4 H) 2,21 - 2,36 (m, 2 H) 2,97 (t, J=6,60 Hz, 2 H) 7,06 - 7,18 (m, 4 H) 7,19 - 7,24 (m, 5 H) 7,33 - 7,50 (m, 6 H).
Compuesto_______ intermedio_______ 11 Ácido 2-(((2,5-Dioxopirrolidin-1-il)oxi)carbonil)-2-(11-(tritiloxi)undecil)tridecanodioico (11).
Figure imgf000052_0001
El compuesto intermedio 10 (150 mg, 0,214 mmol) y N-hidroxisuccinimida (25 mg, 0,214 mmol) se combinaron en DCM (4 ml). Se añadió DCC (49 mg, 0,235 mmol) disuelto en DCM (0,61 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 7 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm; 65-95 % de ACN/agua 0,1 % de TFA) seguido de SFC (Princeton 2-etilpiridina columna 20 x 100 mm, 25-35 % MeOH / CO2) para producir el compuesto intermedio 11 (34 mg, 0,043 mmol, 20 %) como aceite incoloro: Método de LCMS B Rt = 1,47 min, M-CO2H 752,7; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 1,13 - 1,42 (m, 30 H) 1,56 - 1,73 (m, 4 H) 1,94 - 2,14 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 2,83 (s a., 4 H) 3,06 (t, J=6,66 Hz, 2 H) 7,15 - 7,28 (m, 3 H) 7,29 - 7,36 (m, 6 H) 7,41 - 7,50 (m, 6 H).
Compuesto intermedio 12: Construcción de ácido 2-((Azido-PEG23)carbamoil)-2-(11-hidroxiundecil)tridecanodioico
Figure imgf000052_0002
Azido-dPEG23-amina (Quanta Biodesign) 42 mg, 0,038 mmol) en THF (1,5 ml) se combinó con compuesto intermedio 11 (34 mg, 0,043 mmol) con N2. La reacción se colocó en una placa de agitación y se agitó durante 20 min. Se añadió DIPEA (7,44 pl, 0,043 mmol) y la reacción se agitó durante 2 horas. Se añadió DIPEA (4 pl, 0,023 mmol) y la reacción se mantuvo durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se recogió en DCM (3 ml) y TFA (0,5 ml). La solución se agitó durante 1 hora, momento en donde se eliminó el disolvente. El residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm, 45-70 % de ACN/agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto intermedio del título 12 (4 mg, 1,8 pmol, 4,2 %): Método de LCMS B Rt = 0,75 min, [M+2H]+2771,4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 1,05 - 1,39 (m, 30 H) 1,52 - 1,82 (m, 6 H) 1,97 - 2,09 (m, 2 H) 2,35 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,51 - 3,63 (m, 6 H) 3,63 - 3,75 (m, 90 H) 4,36 (t, J=6,72 Hz, 1 H) 7,49 - 7,65 (m, 1 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 13: Á c id o 13 -(B e n c ilo x i)-12 -((b e n c ilo x i)c a rb o n il)-13 -o x o trid e c a n o ic o
Figure imgf000053_0001
Se añadió lentamente malonato de dibencilo (0,88 ml, 3,52 mmol) en DMF (3 ml) a una suspensión de NaH (274 mg, 6,86 mmol) con N2 a 0 °C. La mezcla se agitó durante 1,5 horas antes de dejar que se calentara a temperatura ambiente. Se añadió ácido 11-bromoundecanoico (933 mg, 3,52 mmol) en DMF (3 ml) y se dejó que la reacción transcurriera durante la noche. La reacción se calentó a 80 °C durante 3 horas antes de dejarla enfriar. La reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y Et2O (50 ml) y se extrajo con HCl 1 M (25 ml). La fase acuosa se extrajo con EtOAc/Et2O (100 ml). Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se evaporó el disolvente. El residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (C18 50 g 30-100 % de ACN/agua 0,1 TFA) para producir el compuesto intermedio 13 (315 mg, 0,672 mmol, 19 %) como un polvo blanco: Método de Lc Ms B Rt = 1,05 min, M+H 469,5.
Compuesto intermedio 14: Ácido 23-(Benciloxi)-12,12-bis((benciloxi)carbonil)-23-oxotricosanoico
Figure imgf000053_0002
Se suspendió NaH (54 mg, 1,34 mmol) en DMF (1 ml) a 0 °C con N2. A la mezcla se le añadió compuesto intermedio 13 (315 mg, 0,672 mmol) en DMF (3 ml) gota a gota. La reacción se agitó durante 1 hora antes de que se añadiese el compuesto intermedio 1 (239 mg, 0,672 mmol) en DMF (1 ml). La reacción se mantuvo a 0 °C durante 45 min más antes de dejarla entibiar a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante la noche. La reacción se diluyó con Et2O y EtOAc a 1:1 (75 ml) y se extrajo con HCl 1 M (20 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O y EtOAc a 1:1 (75 ml). Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. La purificación del residuo resultante por HPLC (Xbridge C1830 x 50 mm, 45-70 % de ACN / agua 5 mM NH4OH) produjo el compuesto del título (132 mg, 0,178 mmol, 26 %): Método de LCMS B; Rt = 1,53 min, M-H 741,8.
Compuesto intermedio 15: 1,11,11-Tribencil 21-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) henicosan-1,11,11,21-tetracarboxilato
Figure imgf000054_0001
Se añadió DCC (44 mg, 0,213 mmol) en DCM (1 ml) a una solución de compuesto intermedio 14 (132 mg, 0,178 mmol) y de N-hidroxisuccinimida (20 mg, 0,178 mmol) en DCM (2,5 ml). La reacción se agitó en una placa de agitación durante 17 horas. La reacción se filtró y los sólidos se aclararon con DCM. El filtrado se concentró y se purificó mediante columna ultrarrápida (12 g de sílice, 0-40 % de EtOAc / HEP) para producir el compuesto intermedio 15 (107 mg, 0,127 mmol, 72 %): Método de LCMS B Rt = 1,53 min, M+Na 862,8.
Compuesto intermedio 16: Ácido 22-((2,5-Dioxopirrolidin-1 -il)oxi)-22-oxodocosano-1,11,11 -tricarboxílico
Figure imgf000054_0002
A una solución del compuesto intermedio 15 (107 mg, 0,127 mmol) en THF (2,5 ml) se le añadió una suspensión de Pd al 10 % sobre carbono en THF (2,5 ml). La mezcla se colocó en una atmósfera de hidrógeno durante 1,5 horas. La reacción se pasó a través de un filtro de membrana y los sólidos se lavaron con DCM y THF. El filtrado se evaporó para producir un aceite incoloro (95 mg, cuantitativo) que contenía el compuesto del título: Método de LCMS B Rt = 0,65 min, M+H 570,5.
C o m p u e s to in te rm e d io 17: C o n s tru c c ió n d e ác id o 2 -(11 -(a z id o -P E G 23 -a m in o )-11 -o x o u n d e c il)tr id e c a n o d io ic o
Figure imgf000055_0001
Se añadió una solución del compuesto intermedio 16 (48 mg, 0,042 mmol) en THF (1 ml) a un vial cargado con azidodPEG23-amina (Quanta Biodesign: 46 mg, 0,042 mmol). La reacción se agitó durante 20 min antes de la adición de DIPEA (11 pl, 0,063 mmol) y después se mantuvo durante la noche. Se añadieron azido-PEG23-amina (23 mg, 0,021 mmol) y DIPEA (5 pl, 0,029 mmol) y la reacción se agitó al otro día. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Xbridge C18 30 x 50 mm, 10-30 % de ACN / NH4OH 5 mM). La liofilización de las fracciones dio como resultado una mezcla de productos. El material se purificó por HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm, 45-70 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto intermedio 17 del título (30 mg, 0,020 mmol, 48 %): LCMS SQ4 Rt = 0,81 min, [M+H+HaO]+2764,5; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILO-d3) ó ppm 1,30 (s a., 28 H) 1,40 - 1,50 (m, 2 H) 1,50 - 1,62 (m, 6 H) 2,14 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 2,23 - 2,35 (m, 3 H) 3,32 (c, J=5,58 Hz, 2 H) 3,37 - 3,43 (m, 2 H) 3,47 -3,52 (m, 2 H) 3,53 - 3,68 (m, 90 H) 6,54 (s a., 1 H).
Compuesto intermedio 18: Tetrabencil henicosan-1,11,11,21 -tetracarboxilato
Figure imgf000055_0002
A una suspensión de NaH (48 mg, 1,21 mmol) en DMF (2 ml) a 0 °C en N2, se añadió lentamente el compuesto intermedio 2 (337 mg, 0,603 mmol) en DMF (2 ml). La mezcla se agitó durante 15 min antes de la adición del compuesto intermedio 1 (429 mg, 1,21 mmol) en DMF (2 ml). La reacción se agitó a 0 °C durante 20 min antes de dejarla entibiar a temperatura ambiente. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente con agitación durante 3 días. La reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con agua (20 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml). Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. El residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (24 g de sílice, 0-15 % de EtOAc / HEP) para producir el compuesto del título (315 mg, 0,378 mmol, 63 %): Método de LCMS B Rt = 1,70 min, M+Na 855,8; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,95 - 1,13 (m, 4 H) 1,13 - 1,40 (m, 24 H) 1,59 - 1,72 (m, 4 H) 1,82 - 1,95 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 4 H) 5,12 (s, 4 H) 5,14 (s, 4 H) 7,14 - 7,44 (m, 20 H).
Compuesto intermedio 19: Ácido henicosan-1,11,11,21-tetracarboxílico
Figure imgf000056_0001
Se añadió una suspensión de Pd al 10 % sobre carbón (20 mg, 0,019 mmol) en THF (4 ml) a una solución del compuesto intermedio 18 (315 mg, 0,378 mmol) en THF (6 ml) y la reacción se colocó en una atmósfera de hidrógeno durante 2 h. Se utilizó un filtro de membrana para eliminar los sólidos que se lavaron con EtOAc. La evaporación del filtrado produjo compuesto intermedio 19 (179 mg, cuantitativo) como un sólido blanco: Método de LCMS A Rt = 1,24 min, M+H 473,4; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 0,99 - 1,15 (m, 4 H) 1,24 (s a., 24 H) 1,48 (quin, J=6,94 Hz, 4 H) 1,62 - 1,76 (m, 4 H) 2,18 (t, J=7,34 Hz, 4 H) 12,23 (s a., 4 H).
Compuesto intermedio 20: Ácido 11-(((2,5-Dioxopirrolidin-1-il)oxi)carbonil)henicosan-1,11,21-tricarboxílico
Figure imgf000056_0002
N-hidroxisuccinimida (20 mg, 0,170 mmol) e compuesto intermedio 19 (90 mg, 0,190 mmol) se disolvieron en DCM (3 ml) y THF (0,3 ml). Se añadió una solución de DCC (39 mg, 0,190 mmol) en DCM (0,5 ml) y la reacción se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm; 35-60 % de ACN/agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto del título como un polvo blanco (21 mg, 0,037 mmol, 19 %): LCMS (Método C Rt = 1,01 min, M+H 570,3.
Compuesto intermedio 21 y 21a: Ácido 11-((Azido-PEG23)carbamoil) henicosan-1,11,21-tricarboxílico (21) y ácido 12-((Azido-PEG23)carbamoil) tricosanodioico (21a)
Figure imgf000057_0001
Se combinaron azido-PEG23-amina (41 mg, 0,037 mmol) y el compuesto intermedio 20 (21 mg, 0,037 mmol) en THF (1 ml) y se agitaron durante 10 min. Se añadió DIPEA (9,66 pl, 0,055 mmol) y la reacción se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm, 35-60 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto intermedio 21 (22 mg, 0,014 mmol, 38 %) y 21a (4 mg, 2,6 pmol, 7 %): Método de LCMS B Rt = 0,69 min, M+H 1555,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 1,27 (s a., 19 H) 1,29 - 1,41 (m, 9 H) 1,65 (quin, J=7,12 Hz, 4 H) 1,78 (td, J=12,13, 4,22 Hz, 2 H) 1,95 - 2,08 (m, 2 H) 2,35 (t, J=7,21 Hz, 4 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,54 (c, J=5,05 Hz, 2 H) 3,58 - 3,77 (m, 92 H) 7,60 (t, J=4,95 Hz, 1 H); LCMS Método B Rt = 0,78 min, M-H 1509,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 1,18 (s a., 19 H) 1,21 - 1,38 (m, 11 H) 1,43 -1,63 (m, 6 H) 1,91 - 2,04 (m, 1 H) 2,26 (t, J=7,15 Hz, 4 H) 3,31 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,40 (c, J=5,14 Hz, 2 H) 3,46 - 3,50 (m, 2 H) 3,51 - 3,69 (m, 90 H) 6,23 (t, J=5,01 Hz, 1 H).
Compuesto intermedio 22: Dibencil 2-undecilmalonato
Figure imgf000057_0002
Se añadió gota a gota malonato de dibencilo (0,88 ml, 3,52 mmol) en DMF (1,5 ml) a una suspensión de NaH (155 mg, 3,87 mmol) en DMF (6 ml) con N2 a 0 °C. La mezcla se agitó durante 30 min antes de la adición de 1-bromoundecano (0,785 ml, 3,52 mmol) en DMF (1,5 ml) a la reacción. La reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente y se agitó durante 5 días. La reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con agua (20 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml). Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. El residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (80 g de sílice, 0-10 % de EtOAc / HEP) para producir el compuesto del título (974 mg, 2,22 mmol, 63 %) como un aceite incoloro: Método de LCMS B Rt = 1,55 min, M+H 439,5.
Compuesto intermedio 23: Ácido 2-(((2,5-Dioxopirrolidin-1-il)oxi)carbonil)-2-undeciltridecanoico
Figure imgf000058_0001
El dibencil 2-undecilmalonato (compuesto intermedio 22: 400 mg, 0,912 mmol) se añadieron gota a gota en DMF (1 ml) a una suspensión de NaH (44 mg, 1,09 mmol) en DMF (2 ml) en N2 a 0 °C. La mezcla se agitó durante 45 min antes de añadir a la reacción 1-bromoundecano (0,285 ml, 1,28 mmol) en DMF (1 ml). La reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente y se agitó durante 1 día. La reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con agua (20 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml). Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. El residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (40 g de sílice, 0-5 % de EtOAc / HEP) para producir un aceite incoloro (412 mg). El aceite se disolvió en THF/MeOH y se pasó a través de un Thales Nano H-Cube (1 ml/min, 2 bar H2, 22C) con un cartucho de Pd/C al 10 %. El efluente se recogió y se evaporó para producir un sólido ceroso (272 mg). El sólido ceroso se disolvió en DCM / THF 3:1 y se concentró hasta un aceite. El aceite se redisolvió en DCM (6 ml) con N2 y se añadió N-hidroxisuccinimida (68 mg), seguido de DCC (136 mg) en DCM (3 ml). La reacción se agitó durante días. La reacción se filtró y el filtrado se concentró. El concentrado se purificó mediante columna ultrarrápida (C18 12 g, 25-100 % de ACN / agua 0,1 % de ácido fórmico). El material resultante se purificó adicionalmente mediante cromatografía de fluidos supercríticos (Princeton 2-etilpiridina 20 x 150 mm; 5-15 % de MeOH / CO2) para producir el compuesto intermedio 23 (37 mg, 0,073 mmol, 8 %): Método de LCMS B Rt = 1,67 min, M+NH4527,6; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ó ppm 0,80 - 0,94 (m, 6 H) 1,18 - 1,42 (m, 36 H) 1,97 - 2,14 (m, 4 H) 2,87 (s a., 4 H).
Compuesto intermedio 24: Ácido 2-((azido-PEG23)carbamoil)-2-undeciltridecanoico
Figure imgf000058_0002
Se añadió una solución del compuesto intermedio 23 (37 mg, 0,073 mmol) en THF (1 ml) a un vial cargado con azidodPEG23-amina (Quanta Biodesign: 80 mg, 0,073 mmol). La solución se agitó en una placa de agitación y se añadió DIPEA (11 pl, 0,065 mmol). La reacción se agitó durante la noche antes de que se añadiera una parte adicional de DIPEA (12 pl, 0,071 mmol) y se dejó que la reacción transcurriera durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía de fluidos supercríticos (Princeton Amino 21 x 150 mm; 20-30 % de MeOH / CO2) para producir el compuesto del título (45 mg, 0,030 mmol, 41 %): Método de LCMS B Rt = 1,50 min, [M+2H]+2 748,1; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ct ppm 0,90 (t, J=6,85 Hz, 6 H) 1,09 - 1,38 (m, 30 H) 1,58 (s a., 12 H) 1,64 - 1,76 (m, 2 H) 1,98 - 2,16 (m, 2 H) 3,41 (t, J=5,14 Hz, 2 H) 3,46 - 3,64 (m, 5 H) 3,64 - 3,91 (m, 83 H).
Compuesto intermedio 25: Di-terc-butil 2-undecilmalonato
Figure imgf000059_0001
Se añadió malonato de di-terc-butilo (1,0 g, 4,62 mmol) en DMF (2 ml) a una suspensión de NaH (213 mg, 5,32 mmol) en DMF (5 ml) en N2 a 0 °C. La reacción se agitó durante 30 min antes de añadir 1-bromoundecano en DMF (2 ml). Tras la adición, la reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente y se agitó durante 2 días. La reacción se diluyó con Et2O (75 ml) y se extrajo con agua (25 ml). La fase acuosa se extrajo con Et2O (75 ml). Los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se evaporó el disolvente. El concentrado se purificó mediante columna ultrarrápida (120 g de sílice, 0-40 % de Et2O/éter de petróleo) para producir el compuesto intermedio 25 (0,998 g, 2,69 mmol, 58 %): Método de LCMS B Rt = 1,64 min, M+Na 393,5; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 0,85 - 0,94 (m, 3 H) 1,24 - 1,36 (m, 18 H) 1,41 - 1,52 (m, 18 H) 1,74 - 1,86 (m, 2 H) 3,13 (t, J=7,58 Hz, 1 H).
Compuesto intermedio 26: 1-Bencil 11,11 -di-terc-butil docosano-1,11,11-tricarboxilato
Figure imgf000059_0002
El compuesto del título se sintetizó de una manera similar a la del compuesto intermedio 9 usando compuesto intermedio 25 como material de partida para producir un aceite incoloro (980 mg, 1,52 mmol, 66 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 0,89 (t, J=6,91 Hz, 3 H) 1,06 - 1,20 (m, 4 H) 1,20 - 1,35 (m, 28 H) 1,45 (s, 18 H) 1,58 - 1,70 (m, 2 H) 1,72 - 1,83 (m, 4 H) 2,36 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 5,12 (s, 2 H) 7,30 - 7,45 (m, 5 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 27 : Á c id o 12 ,12 -B is (te rc -b u to x ic a rb o n il)tr ic o s a n o ic o
Figure imgf000060_0001
Usando el compuesto intermedio 26, el compuesto del título (472 mg, 0,851 mmol, 100 %) se sintetizó de una manera similar a la del compuesto intermedio 19: Método de LCMS B Rt = 1,76 min, M-H 553,6; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,84 - 0,95 (m, 3 H) 1,07 - 1,21 (m, 4 H) 1,21 - 1,40 (m, 28 H) 1,46 (s, 18 H) 1,58 - 1,70 (m, 2 H) 1,72 - 1,84 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,46 Hz, 2 H).
Compuesto intermedio 28: 11,11-Di-terc-butil 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) docosano-1,11,11-tricarboxilato
Figure imgf000060_0002
El compuesto intermedio 27 (200 mg, 0,360 mmol) y N-hidroxisuccinimida (42 mg, 0,360 mmol) se disolvieron en DCM (3 ml). Se añadió una solución de DCC (89 mg, 0,433 mmol) en DCM (1,6 ml) y la reacción se agitó durante 4,5 horas. La reacción se filtró y el filtrado se concentró. El concentrado se purificó mediante columna ultrarrápida (24 g de sílice, 0-40 % de EtOAc/HEP) para producir el compuesto del título como un aceite incoloro (70 mg, 0,107 mmol, 30 %): Método de LCMS B Rt = 1,74 min, M+Na 674,7.
Producto intermedios 29 y 29A: Ácido 2-(11-((azido-PEG23)-amino)-11-oxoundecil)-2-undecilmalónico (29) y ácido 13-((azido-PEG23)-amino)-13-oxo-2-undeciltridecanoico (29A)
Figure imgf000061_0001
Se añadió una solución del compuesto intermedio 28 (35 mg, 0,054 mmol) en THF (1 ml) a un vial cargado con azido-PEG23-amina (59 mg, 0,054 mmol). Se añadió DIPEA (14 pl, 0,081 mmol) y la reacción se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se volvió a disolver en DCM (1 ml) y TFA (0,2 ml). La reacción se agitó durante 1,25 horas antes de que se evaporara el disolvente. El residuo se purificó mediante HpLC (Sunfire 30 x 50 mm C18, 55­ 80 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) y el material resultante se redisolvió en DCM (4 ml) y TFA (2 ml) y se agitó durante 1,5 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire 30 x 50mm C18, 55-80 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto intermedio 29 (28 mg, 0,016 mmol, 29 %) y el compuesto intermedio 29A (1 mg, 0,6 pmol, 1 %): Método de LCMS B Rt = 1,08 min, [M+H+H3Ü]+2771.5; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) o ppm 0,90 (t, J=6,72 Hz, 3 H) 1,26 (s a., 24 H) 1,32 - 1,41 (m, 8 H) 1,62 (quin, J=7,64 Hz, 2 H) 1,88 - 2,01 (m, 4 H) 2,31 (t, J=7,70 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,46 - 3,56 (m, 3 H) 3,57 - 3,90 (m, 91 H); LCMS Método B Rt = 1,29 min, [M+2H]+2741,1.
Compuesto intermedio 30: Ácido 22-((azido-PEG23)amino)-22-oxodocosano-1,11,11 -tricarboxílico
Figure imgf000061_0002
Se añadió una solución del compuesto intermedio 16 (58 mg, 0,063 mmol) en THF (1 ml) a un vial cargado con azido-PEG23-amina (70 mg, 0,063 mmol). Se añadió DIPEA (17 pl, 0,095 mmol) y la reacción se agitó en una placa de agitación durante la noche. La reacción se concentró y purificó por HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm, 35-60 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto intermedio 30 (57 mg, 0,036 mmol, 57 %) como un sólido blanco ceroso: Método de LCMS B Rt = 0.62 min, M+H 1555.4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 1,28 (s a., 18 H) 1,30 - 1,40 (m, 10 H) 1,63 (m, J=7,10, 7,10, 7,10, 7,10, 7,10 Hz, 4 H) 1,88 - 2,02 (m, 4 H) 2,28 (t, J=8,10 Hz, 2 H) 2,35 (t, J=7,40 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=5,07 Hz, 2 H) 3,50 (dt, J=9,20, 4,39 Hz, 2 H) 3,57 - 3,63 (m, 2 H) 3,63 - 3,73 (m, 90 H)
Compuesto intermedio 31: 3-terc-butil-2-undecilmalonato de 1-bencilo
Figure imgf000062_0001
A una suspensión de NaH (160 mg, 4,0 mmol) en DMF (8 ml) a 0 °C con N2, se añadió terc-butil malonato de bencilo (1,0 g, 4,0 mmol) en DMF (2 ml). La mezcla se agitó durante 50 min, después de lo cual se añadió 1-bromoundecano en DMF (2 ml). Después de una hora adicional de agitación, la reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente. La reacción se mantuvo durante la noche. Se añadieron Et2O (100 ml) y agua (20 ml) para dividir la reacción. La fase acuosa se extrajo con Et2O (100 ml) y los componentes orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante una columna ultrarrápida (C18 12 g, 40-100 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto del título como un aceite incoloro (1,14 g, 2,82 mmol, 71 %): Método de LCMS A Rt = 1,58 min, M+Na 427,4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,84 - 0,96 (m, 3 H) 1,28 (s a., 12 H) 1,31 (m, J=3,90 Hz, 6 H) 1,41 (s, 9 H) 1,88 (c, J=7,38 Hz, 2 H) 3,29 (t, J=7,58 Hz, 1 H) 5,19 (c, J=12,27 Hz, 2 H) 7,30 - 7,42 (m, 5 H).
Como alternativa, la alquilación de terc-butil malonato se puede llevar a cabo usando 1-yodoundecano (1,2 eq) en presencia de carbonato de potasio (2 eq) en DMF.
Compuesto intermedio 32: 11-terc-butil docosano-1,11,11-tricarboxilato de 1,11-dibencilo
Figure imgf000062_0002
El compuesto del título se sintetizó de una manera similar a la del compuesto intermedio 9 utilizando el compuesto intermedio 31 (650 mg, 1,61 mmol) como material de partida para producir un aceite incoloro (823 mg, 1,21 mmol, 75 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,84 - 0,94 (m, 3 H) 1,12 (m, J=6,60 Hz, 4 H) 1,19 - 1,33 (m, 28 H) 1,35 (s, 9 H) 1,66 (quin, J=7,40 Hz, 2 H) 1,85 (t, J=8,44 Hz, 4 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 5,14 (s, 2 H) 5,16 (s, 2 H) 7,30 - 7,42 (m, 10 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 33: Á c id o 13 -(b e n c ilo x i)-2 -((b e n c ilo x i)c a rb o n il)-13 -o x o -2 -u n d e c iltr id e c a n o ic o
Figure imgf000063_0001
A una solución del compuesto intermedio 32 (200 mg, 0,295 mmol) en DCM (3 ml) se añadió TFA (0,6 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (sílice 12 g, 0-15 % de EtOAc / HEP) para producir el compuesto del título (177 mg, 0,284 mmol, 96 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,87 - 0,94 (m, 3 H) 0,94 - 1,05 (m, 2 H) 1,19 (s a., 14 H) 1,23 - 1,37 (m, 16 H) 1,65 (quin, J=7,40 Hz, 2 H) 1,78 - 1,91 (m, 2 H) 1,93 - 2,05 (m, 2 H) 2,37 (t, J=7,52 Hz, 2 H) 5,14 (s, 2 H) 5,27 (s, 2 H) 7,31 - 7,44 (m, 10 H).
Compuesto intermedio 34: 11-(2,5-dioxociclopentil)docosano-1,11,11-tricarboxilato de 1,11-dibencilo
Figure imgf000063_0002
El compuesto del título se sintetizó de forma similar a la del compuesto intermedio 15 utilizando el compuesto intermedio 33 (177 mg, 0,284 mmol) como material de partida para producir un aceite incoloro (153 mg, 0,213 mmol, 75 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,86 - 0,93 (m, 3 H) 1,12 - 1,21 (m, 2 H) 1,21 - 1,37 (m, 30 H) 1,66 (quin, J=7,40 Hz, 2 H) 1,89 - 2,07 (m, 4 H) 2,37 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 2,84 (s a., 4 H) 5,13 (s, 2 H) 5,25 (s, 2 H) 7,30 - 7,47 (m, 10 H).
Compuesto intermedio 35:
Figure imgf000063_0003
Se añadió una solución del compuesto intermedio 34 (145 mg, 0,201 mmol) en THF (1,5 ml) y DCM (1,5 ml) a un vial cargado con amino-PEG24-ácido. Se añadió DIPEA (88d, 0,504 mmol) y la reacción se agitó en una placa de agitación durante 15 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía de fluidos supercríticos (Waters HILIC 20 x 150 mm; 15-25 % de MeOH / CO2) para producir el compuesto intermedio 35 (151 mg, 0,086 mmol, 43 %): Método de LCMS D Rt = 1,30 min, [M+2H]+2876,4; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,86 - 0,93 (m, 3 H) 0,93 - 1,04 (m, 2 H) 1,19 (s a., 15 H) 1,23 - 1,37 (m, 15 H) 1,61 - 1,68 (m, 2 H) 1,78 (td, J=12,44, 4,34 Hz, 2 H) 1,92 - 2,05 (m, 2 H) 2,37 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 2,62 (t, J=6,05 Hz, 2 H) 3,49 (dd, J=6,72, 2,32 Hz, 2 H) 3,52 -3,59 (m, 2 H) 3,59 - 3,73 (m, 92 H) 3,80 (t, J=6,05 Hz, 2 H) 5,13 (s, 2 H) 5,18 (s, 2 H) 7,31 - 7,42 (m, 10 H) 8,09 (t, J=5,26 Hz, 1 H).
Compuesto intermedio 36:
Figure imgf000064_0001
Se añadió DCC (22 mg, 0,103 mmol) en DCM (0,265 ml) a una solución del compuesto intermedio 35 (150 mg, 0,086 mmol) y N-hidroxisuccinimida en DCM (1,5 ml). La reacción se agitó durante 1,5 h. Se añadió N-hidroxisuccinimida adicional (10 mg) en THF (0,5 ml) y DCC (22 mg) en DCM (0,265 ml) y la reacción se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (sílice 12, 0-5 % de MeOH / DCM) para producir el compuesto intermedio 36 (159 mg, cuantitativo) como un sólido blanco: Método de LCMS B Rt = 1,55 min, [M+HaO+H]+2933,9.
Compuesto intermedio 37:
Figure imgf000064_0002
A una solución del compuesto intermedio 36 (159 mg, 0,086 mmol) en THF (5 ml) se le añadió una suspensión de Pd al 10 % sobre carbono (4,6 mg, 4,3 pmol) en THF (1 ml). La reacción se colocó en hidrógeno y se agitó durante 40 min. Se añadió más Pd sobre carbono (7 mg, 6,5 pmol) y se agitó durante 1 hora más en hidrógeno. La reacción se hizo pasar a través de un filtro de membrana y el filtrado se evaporó. El residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C18 30 x 50 mm, 45-70 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto del título (83 mg, 0,047 mmol, 54 %): Método de LCMS B Rt = 1,03 min, [M+2H]+2835,2; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 0,84 - 0,94 (m, 3 H) 1,17 (s a., 2 H) 1,21 - 1,39 (m, 30 H) 1,57 - 1,68 (m, 2 H) 1,69 - 1,80 (m, 2 H) 1,97 - 2,10 (m, 2 H) 2,34 (t, J=7,21 Hz, 2 H) 2,86 (s, 4 H) 2,92 (t, J=6,48 Hz, 2 H) 3,51 - 3,73 (m, 96 H) 3,87 (t, J=6,48 Hz, 2 H) 7,45 (t, J=4,46 Hz, 1 H)
C o m p u e s to in te rm e d io 38: 11 -B ro m o u n d e c -1 -ino
CBr4, PPh3
Figure imgf000065_0001
A una solución de 10-undecin-1-ol (2,29 ml, 11,9 mmol) y tetrabromuro de carbono (4,34 g, 13,1 mmol) en DCM (10 ml) con N2 a 0 °C, se añadió trifenilfosfina en partes (3,43 g, 13,1 mmol) durante 30 min. Una vez completada la adición, la reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente. Después de 1,5 h, la reacción se vertió en ciclohexano con agitación (75 ml) y se recogió el precipitado. El sólido se lavó con ciclohexano y los filtrados combinados se evaporaron. El residuo se purificó mediante columna ultrarrápida (sílice 80 g, 0-10 % de EtOAc/HEP) para producir el compuesto del título (1,75 g, 7,57 mmol, 64 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ó ppm 1,21 - 1,35 (m, 6 H) 1,35 - 1,48 (m, 4 H) 1,48 - 1,59 (m, 2 H) 1,80 - 1,91 (m, 2 H) 1,94 (t, J=2,63 Hz, 1 H) 2,19 (td, J=7,09, 2,69 Hz, 2 H) 3,41 (t, J=6,85 Hz, 2 H).
Compuesto intermedio 39: Di-terc-butil 2-(undec-10-in-1-il)malonato
Figure imgf000065_0002
Se disolvió malonato de di-terc-butilo (800 mg, 3,70 mmol) en DMF (9 ml) a 0 °C con N2 y se añadió NaH (148 mg, 3,70 mmol). La reacción se agitó 30 minutos a 0 °C y el compuesto intermedio 38 (770 mg, 3,33 mmol) se añadió gota a gota lentamente, dando como resultado una solución amarilla. La reacción se agitó a 0 °C durante 2 horas, después se calentó a t.a. y se agitó durante 16 horas. La mezcla se recogió en EtOAc (75 ml) y se lavó con H2O (25 ml). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (75 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. La mezcla se purificó dos veces mediante una columna ultrarrápida (cartucho de sílice de 12 g, 0­ 20 % de EtOAc / heptanos) y las fracciones se concentraron para producir 162,1 mg del producto deseado como un aceite incoloro (12 %). LCMS (Waters Acquity UPLC BEH C18, 130 A, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm, 50 °C, nombre del disolvente A: Agua 0,1 % de ácido fórmico, nombre del disolvente B: Acetonitrilo 0,1 % de ácido fórmico, 98 % de B durante 2,20 min): Rt = 1,37 min, se observó EM [M+H]: 366,0; calculado: 366,535. 1H RMN (400 MHz, Cloroformod) ó ppm 1,29 (s, 10 H) 1,47 (s, 18 H) 1,52 (dd, J=14,78, 7,20 Hz, 3 H) 1,48 (d, J=1,26 Hz, 1 H) 1,75 - 1,83 (m, 2 H) 1,94 (t, J=2,65 Hz, 1 H) 2,18 (td, J=7,14, 2,65 Hz, 2 H) 3,11 (t, J=7,58 Hz, 1 H).
Compuesto intermedio 40: 11,11 -di-terc-butil 1-etil docos-21-ina-1,11,11-tricarboxilato
Figure imgf000065_0003
El compuesto intermedio 39 (162,1 mg, 0,442 mmol) se disolvió en DMF (2 ml) a 0 °C y se añadió NaH (21,23 mg, 0,531 mmol). La reacción se agitó a 0 °C durante 15 minutos y se añadió lentamente gota a gota 11-bromoundecanoato de etilo (143 mg, 0,486 mmol). La reacción se calentó a t.a. y se agitó durante 16 horas. La mezcla se diluyó con EtOAc (40 ml) y se lavó una vez con H2O (20 ml). La capa acuosa se extrajo una vez con EtOAc (40 ml) y las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para dar un aceite amarillo claro. La muestra se disolvió en 1 ml de DCM y se purificó mediante una columna ultrarrápida (columna de sílice de 12 g, 0­ 20 % de EtOAc / heptano, 15 min). Las fracciones se combinaron y concentraron para dar 90,1 mg del producto deseado (35 %). 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) ó ppm 1,28 (s a., 24 H) 1,45 (s, 18 H) 1,48 (s, 3 H) 1,53 (d, J=7,58 Hz, 3 H) 1,51 (s, 1 H) 1,64 (s a., 1 H) 1,61 (d, J=7,33 Hz, 1 H) 1,77 (d, J=16,93 Hz, 2 H) 1,74 - 1,80 (m, 2 H) 1,94 (t, J=2,65 Hz, 1 H) 2,18 (td, J=7,07, 2,53 Hz, 2 H) 2,29 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 4,13 (c, J=7,24 Hz, 2 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 41: Á c id o 12 ,12 -b is (te rc -b u to x ic a rb o n il)tr ic o s -22 -in o ic o
Figure imgf000066_0001
A una solución de compuesto intermedio 40 (21,7 mg, 0,037 mmol) en ‘BuOH (1 ml) se añadió una solución de KOtBu (114 mg, 1,012 mmol) en tBuOH (2 ml) a 30 °C con N2. La mezcla se agitó a t.a. y se controló mediante TLC (EtOAc/hexanos a 1:1, KMnO4, reflujo). El material de partida se consumió después de 3 horas y la mezcla de reacción se inactivó con HCl 1 M (20 ml) y se extrajo dos veces con EtOAc (25 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron hasta un aceite transparente e incoloro (18 mg, 87 %). El material se pasó a la siguiente etapa sin más purificación. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5 ppm 1,27 (s a., 22 H) 1,44 (s a., 18 H) 1,48 (s, 3 H) 1,52 (s, 3 H) 1,62 (s a., 2 H) 1,77 (s a., 4 H) 1,94 (s a., 1 H) 2,18 (s, 2 H) 2,35 (s, 2 H).
Compuesto intermedio 42: Ácido docos-21 -in-1,11,11 -tricarboxílico
Figure imgf000066_0002
Se añadió TFA (2 ml) al compuesto intermedio 41 (12 mg, 0,022 mmol) y la reacción se agitó a t.a. durante 1 hora. La mezcla se diluyó con DCM (10 ml) y se concentró dos veces para dar un aceite marrón. El material se recogió en EtOAc (10 ml) y se lavó con H2O (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró hasta obtener un aceite marrón. El material bruto se disolvió en 1 ml de MeOH y se purificó mediante HPLC activada por MS (columna Sunfire 30 x 50 mm 5 um ACN/H2O con TFA al 0,1 % 75 ml/min, inyección de 1,5 ml, ACN al 45-70 % durante 3,5 min): Rt = 3,42 min; se observó EM [M+H+Na]: 461,00; calculado: 461,597. Las fracciones se combinaron y liofilizaron para dar 5,3 mg del compuesto del título con un rendimiento del 56 %.
Compuesto intermedio 43: Ácido 2-(((2,5-dioxopirrolidin-1 -il)oxi)carbonil)-2-(undec-10-in-1 -il)tridecanodioico
Figure imgf000066_0003
A una solución de compuesto intermedio 42 (5,3 mg, 0,012 mmol) en THF (0,5 ml) se añadió N-hidroxisuccinimida (1,53 mg, 0,013 mmol). Se añadió una solución de DCC (2,493 mg, 0,012 mmol) en THF (0,5 ml) y la mezcla se agitó a t.a. con N2 durante 4 horas. La conversión completa del material de partida se observó mediante LCMS. La mezcla se concentró y se llevó a la siguiente etapa sin más purificación. LCMS (Sunfire C18 3,5 pm 3,0 x 30 mm, 40 °C, eluyente ácido A: Agua 0,05 % de Ácido trifluoroacético, eluyente básico A: Agua Hidróxido de amonio 5 mM, Eluyente B: ACN, 5-95 % durante 2 min): Rt = 1,72 min; se observó EM [M+H+Na]: 558,0; calculado: 558,67.
C o m p u e s to in te rm e d io 44:
Figure imgf000067_0001
A una solución de compuesto intermedio 43 (3,2 mg, 5,97 pmol) en DCM (0,5 ml) se añadió una solución de azidodPEG23-amina (Quanta Biodesign, 7,88 mg, 7,17 pmol) en DCM (0,5 ml) y DIPe A (2,09 pl, 0,012 mmol) y la mezcla se agitó a t.a. durante 16 horas, momento en donde se observó la conversión del material de partida mediante LCMS. La mezcla de reacción se concentró y se disolvió en 1 ml de MeOH y se purificó mediante HPLC activada por MS (columna Sunfire 30 x 50 mm 5 um ACN/H2O con TFA al 0,1 % 75 ml/min, inyección de 1,5 ml, gradiente de 5 min de Ac N al 55-80 %, Rt = 1,92 min) y las fracciones se combinaron y liofilizaron para dar 1,7 mg del compuesto del título con un rendimiento del 19 %. lCm S (Acquity BEH 1,7 pm 2,1 x 50 mm - 50 °C, nombre del disolvente A: Agua 0,1 % de ácido fórmico, nombre del disolvente B: Acetonitrilo 0,1 % de ácido fórmico, 98 % de B durante 2,20 min): Rt = 1,89 min; se observó EM [M+H/2]: 760,0; calculado: 759,5.
Compuesto intermedio 45: Ácido docos-21-en-1,11,11-tricarboxílico
Figure imgf000067_0002
El compuesto intermedio 45 se preparó siguiendo el procedimiento del compuesto intermedio 39-42 sustituyendo 11-bromo-dec-1-eno por 11-bromo-dec-1-ino.
C o m p u e s to in te rm e d io 46: Á c id o 2 -(((2 ,5 -D io x o p irro lid in -1 -il)o x i)c a rb o n il)-2 -(u n d e c -10 -e n -1 -il)tr id e c a n o d io ic o
Figure imgf000068_0001
Se añadió DCC (187 mg, 0,908 mmol) en DCM (2 ml) a una solución de N-hidroxisuccinimida (99 mg, 0,862 mmol) y ácido docos-21-eno-1,11,11-tricarboxílico (compuesto intermedio 45: 400 mg, 0,908 mmol) en DCM (7 ml) y THF (0,7 ml). La reacción se agitó toda la noche antes de que se evaporara el disolvente. El residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C18 30 x 50 mm; 55-80 % de ACN / agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto del título (155 mg, 0,288 mmol, 32 %): mediante LCMS Método C Rt = 1,51 min, M+H 538,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 1,16 - 1,46 (m, 28 H) 1,60 - 1,87 (m, 3 H) 1,91 - 2,17 (m, 5 H) 2,38 (t, J=7,03 Hz, 2 H) 2,86 (s a., 4 H) 3,68 (dd, J=11,25, 7,34 Hz, 1 H) 3,78 (dd, J=11,31, 5,20 Hz, 1 H) 3,99 - 4,10 (m, 1 H).
Producto intermedios 47 y 47A:
Figure imgf000068_0002
La azido-dPEG23-amina (Quanta Biodesign: 164 mg, 0,149 mmol) y el compuesto intermedio 46 (80 mg, 0,149 mmol) se disolvieron en THF (2,5 ml). Se añadió DIPEA (39 pl, 0,233 mmol) y la reacción se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C1830 x 50 mm, 45-70 % de ACN/agua 0,1 % de TFA) para producir los compuestos 47 (97 mg, 0,061 mmol, 41 %) y 47A (32 mg, 0,021 mmol, 14 %): Método de LCMS C Rt = 1,35 min, [M+2H]+2761,9; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILO-d3) 5 ppm 1,05 - 1,18 (m, 3 H) 1,19 -1,32 (m, 20 H) 1,36 (t, J=7,15 Hz, 1 H) 1,48 - 1,59 (m, 2 H) 1,65 - 1,75 (m, 2 H) 2,01 - 2,06 (m, 2 H) 2,25 (t, J=7,46 Hz, 2 H) 3,33 - 3,39 (m, 2 H) 3,39 - 3,44 (m, 2 H) 3,50 - 3,67 (m, 98 H) 4,84 - 4,95 (m, 1 H) 4,95 - 5,06 (m, 1 H) 5,83 (ddt, J=17,07, 10,29, 6,68, 6,68 Hz, 1 H) 7,31 (t, J=5,44 Hz, 1 H); LCMS Método C Rt = 1,50 min, [M+2H]+2739,9; 1H RMN (400 MHz, ACETONITRILO-d3) 5 ppm 1,16 - 1,42 (m, 30 H) 1,42 - 1,63 (m, 5 H) 2,00 - 2,07 (m, 2 H) 2,22 - 2,28 (m, 2 H) 2,40 - 2,52 (m, 2 H) 3,25 - 3,33 (m, 2 H) 3,33 - 3,42 (m, 2 H) 3,42 - 3,50 (m, 2 H) 3,50 - 3,68 (m, 88 H) 4,86 - 5,06 (m, 2 H) 5,83 (ddt, J=17,04, 10,26, 6,71, 6,71 Hz, 1 H) 6,40 - 6,74 (m, 1 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 48 : Á c id o 2 -u n d e c ilm a ló n ic o
Figure imgf000069_0001
Utilizando el compuesto intermedio 22 (290 mg, 0,661 mmol), el compuesto del título (185 mg, cuantitativo) se sintetizó de una manera similar a la del compuesto intermedio 19: Método de LCMS B LCMS Rt = 0,82 min, M-H 257,3 Compuesto intermedio 49: Ácido 2-(((2,5-Dioxopirrolidin-1 -il)oxi)carbonil)tridecanoico
Figure imgf000069_0002
Se añadió DCC (122 mg, 0,592 mmol) a una solución del compuesto intermedio 48 (170 mg, 0,658 mmol) y N-hidroxisuccinimida (68 mg, 0,592 mmol) en DCM (6 ml) y THF (0,5 ml). La reacción se agitó durante 16 h antes de añadir más DCC (30 mg, 0,145 mmol) en DCM (0,5 ml). La reacción se agitó durante 2 días más. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante HPLC (Sunfire C18 30 x 50 mm, 45-70 % de ACN/agua 0,1 % de TFA) para producir el compuesto del título como un polvo blanco (46 mg, 0,129 mg, 20 %): Método de LCMS B Rt = 0,94 min, M+H 356,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,89 (t, J=7,00 Hz, 3 H) 1,20 - 1,40 (m, 16 H) 1,43 - 1,55 (m, 2 H) 1,99 - 2,14 (m, 2 H) 2,86 (s, 4 H) 3,71 (t, J=7,46 Hz, 1 H).
C o m p u e s to in te rm e d io 50 y 50A :
Figure imgf000070_0001
Los compuestos del título se sintetizaron de manera similar a 50 y 50A desde el compuesto intermedio 49 (30 mg, 0,084 mmol) produciendo el compuesto intermedio 50 (18 mg, 0,013 mmol, 16 %) y el compuesto intermedio 50A (5 mg, 4 pmol, 5 %): Método de LCMS B Rt = 0,85 min, M+H 1340,3; 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0,82 - 0,98 (m, 3 H) 1,20 - 1,36 (m, 16 H) 1,36 - 1,51 (m, 2 H) 1,83 - 2,02 (m, 1 H) 2,11 - 2,27 (m, 1 H) 2,33 (dd, J=11,80, 4,22 Hz, 1 H) 3,41 (t, J=5,14 Hz, 3 H) 3,49 (d, J=5,01 Hz, 1 H) 3,56 - 3,79 (m, 92 H); LCMS Método B Rt = 0,96 min, M+H 1296,3.
Productos intermedios 51-57: mutante de la proteína GDF15.
Expresión de proteínas GDF-15 humanas en células de E.coli
Las células de las cepas de E. coli BL21 (DE3) Gold (Stratagene) y Rosetta (DE3) pLysS (Novagen) se transformaron con las construcciones 51 a 56 y la construcción MAHA-(200-308)-hGDF15 respectivamente, clonadas en vectores pET26b. Las células transformadas se cultivaron con selección de antibióticos primero en 3 ml y después en 50 ml de caldo Luria (Bacto-Triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 5/l, glucosa 6 g/l) hasta que se alcanzó una DO600 de 1,5. Los precultivos se utilizaron para inocular dos fermentadores de 1 l cargados con medio Terrific Broth (NH4SO4 1,2 g/l, H2PO4 0,041 g/l, K2HPO4 0,052 g/l, Bacto-Triptona 12 g/l, Extracto de levadura 24 g/l). Los cultivos se indujeron mediante la adición automática de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM cuando el pH aumentó por encima de 7,1. Otros parámetros de fermentación fueron: temp = 37 °C; pH 7,0 /- 0,2 ajustado mediante la adición de NaOH/H2SO42 N; pO2 > 30 % con cascadas de velocidad del agitador, flujo de aire y adición de oxígeno. Cinco horas después de la inducción, los cultivos se enfriaron a 10 °C y las células se recogieron por centrifugación.
Purificación y replegamiento de variantes de GDF15
a) Cuerpos de inclusión
Los sedimentos de coli recombinantes que expresan la proteína de interés se resuspendieron (5 % p/v) en NaH2PO4 50 mM / NaCl 150 mM / benzamidina.HCl 5 mM / DTT 5 mM, a pH 8,0 a 4 °C, se homogeneizaron y se lisaron mediante 2 pases a través de una prensa francesa (800 y 80 bar). Los cuerpos de inclusión (IB, inclusión bodies) se aislaron mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 60 min a 4 °C.
b) Purificación de proteína cruda desplegada
Los IB se solubilizaron (5 % p/v) en guanidina 6 M / NaH2PO4100 mM / Tris 10 mM / beta-mercaptoetanol 20 mM, pH 8,0 y se agitaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los residuos se retiraron mediante centrifugación a 12.000 rpm. Los IB solubilizados se purificaron adicionalmente en Ni-NTA-Superflow (la construcción sin la etiqueta de His se une también a esta resina debido al alto contenido de histidina). Después de lavar la línea de base con guanidina 6 M / NaH2PO4100 mM / Tris 10 mM / beta-mercaptoetanol 5 mM, pH 8.0, el material unido se eluyó con el mismo tampón ajustado a pH 4,5. El material eluido se ajustó a pH 8,0, se añadió DTT 100 mM y la solución se agitó durante la noche a 4 °C. A continuación, se ajustó el pH a 2 mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA, solución madre al 10 % en agua) y la solución se diluyó adicionalmente 1:1 con TFA al 0,1 % en agua. La solución de proteína bruta se purificó adicionalmente utilizando RP-HPLC (Poros) utilizando un gradiente de acetonitrilo al 0-50 % en 50 min. Las fracciones que contenían GDF-15 se combinaron y liofilizaron.
c) Plegado de proteínas
Método 1: El material liofilizado se disolvió a razón de 2 mg/ml en ácido acético 100 mM, se diluyó 15-20 veces en tampón de plegamiento (CHES 100 mM / NaCl 1 M / CHAPS 30 mM / GSH 5 mM / GSSG 0,5 mM / DMSO al 20 %, pH 9,5, 4°C) y la solución se agitó suavemente durante 3 días a 4 °C. Después de 3 días, se añadieron 3 volúmenes de ácido acético 100 mM y la solución se concentró por ultrafiltración (valor de 5 kDa) hasta aproximadamente 100­ 200 ml, se diluyó 10 veces con ácido acético 100 mM y se volvió a concentrar. El material replegado se purificó adicionalmente mediante RP-HPLC preparativa en una columna Vydac C4 a 50 °C (tampón A: TFA al 0,1 % en agua; tampón B: TFA al 0,05 % en acetonitrilo). Después de cargar la columna, se lavó con tampón B al 15 % y se eluyó con un gradiente de 15 % de B a 65 % de B en 50 min. Las fracciones recogidas que contenían la proteína de interés se diluyeron con un mismo volumen de tampón A y se liofilizaron. Los rendimientos del replegamiento fueron de aproximadamente el 25 % para ambas proteínas.
Método 2: Protocolo seguido como en el método 1 con tampón de plegamiento: CHES 100 mM, pH 9,4, arginina 0,9 M, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, GSH 2,5 mM, GSSG 1 mM (concentración final).
Los siguientes mutantes de GDF15 se prepararon según el procedimiento anterior:
Compuesto intermedio 51: M-(His) 6 -hGDF15
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI (SEQ ID NO: 1)
LCMS: Masa calculada: 26462 Masa Observada: 26464
Compuesto intermedio 52: M-(His) 6 -M-hGDF15
MHHHH HHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADVWLSPREVQVTMCIGACPSQF RAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 2)
LCMS: Masa calculada: 26724 Masa Observada: 26725
Compuesto intermedio 53: His-dGDF15:
MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVAPRELDVRMCVGACPSQFR SANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV
(SEQ ID NO: 3)
LCMS: Masa calculada (dímero): 26368 Masa Observada: 26363
Compuesto intermedio 54: MH-(199-308)-hGDF15 MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQI KTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 4) LCMS: Masa calculada: 24636 Masa Observada: 24638
C o m p u e s to in te rm e d io 55: A H -(199 -308 )-h G D F 15 AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQI KTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 5) Etapa 1: preparación de la construcción M-HiS6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15 aa199-308
La construcción M-His6-TEV(ENLYFQ/)-H-hsGDF15 aa199-308 se preparó según el procedimiento anterior (etapas a, b y c).
Etapa 2: Escisión por TEV de la proteína de la etapa 1
La proteína liofilizada se solubilizó en agua hasta una concentración final de 1,75 mg/ml. La proteína se desplegó de nuevo diluyendo 1:1 en Guan 6 M/Tris 50 mM, pH 8,0 DTT 50 mM, y se agitó a TA durante 1 h. El material se volvió a purificar mediante RP-HPLC preparativa en una columna Vydac C4 y se liofilizó. Se solubilizaron 26 mg de liofilizado en 26 ml de Tris 50 mM/UREA 3 M, pH 7,5 3000 Unidades de Proteasa AcTEV (Invitrogen, 12575-023) y se incubaron durante 4 días. Después, el pH se ajustó a pH 2,0 mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA, solución madre al 10 % en agua) y la solución se diluyó adicionalmente a 150 ml con TFA al 0,1 % en agua. Después de filtrar a través de una membrana de 0,22 um, el material se purificó de nuevo mediante RP-HPLC preparativa en una columna Vydac C4 para aislar la proteína escindida con éxito. Las fracciones se recogieron manualmente; las fracciones que contenían la proteína diana se aislaron y liofilizaron. A continuación, la proteína GDF15 escindida se replegó y la proteína replegada se purificó como se ha descrito anteriormente.
LCMS: Masa calculada (dímero): 24516 Masa observada: 24518
El siguiente mutante de GDF15 se puede preparar de acuerdo con el procedimiento anterior:
Compuesto intermedio 56: MHA-(200-308)-hGDF15 MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADVWLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQI KTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 6) LCMS: Masa calculada (dímero): 24752
El siguiente mutante de GDF15 se preparó de acuerdo con el procedimiento anterior:
Compuesto intermedio 57: AHA-(200-308)-hGDF15 AHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQI KTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 7) LCMS: Masa calculada (dímero): 24430: Masa observada (dímero): 24432
Compuesto intermedio 58: Conjugado His-hGDF15 BCN
Figure imgf000072_0001
Seq:MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACP SQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
(SEQ ID NO: 2)
Una solución madre de His-hGDF15 (compuesto intermedio 52: 0,6 ml, 4,8 mg/ml) se diluyó a 0,5 mg/ml con tampón NaOAc 30 mM pH 4,5 (5,2 ml). Una solución madre de 10 mg/ml de (2,5-dioxopirrolidin-1-il)carbonato de (1R,8S,9s)-biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetilo (NHS-BCN) en DMSO (251 pl) se añadió lentamente y la reacción se colocó en una placa de agitación a 24 °C durante 21 h. La reacción se diluyó hasta 30 ml con tampón NaOAc 30 mM pH 4,5 y se concentró hasta 2 ml utilizando un cartucho de ultrafiltración con un MWCO (molecular weight cutoff, corte de peso molecular) de 10 kDa (repetición 4 veces) para producir 2,5 ml de concentrado. Basándose en A280 (e = 29090M-1 cm-1, 26730g/mol) el concentrado fue de 0,93 mg/ml (2,33 mg, 80 %): LCMS QT2_15-60kDa_15min_polar (método E). La solución resultante se analizó por MALDI para indicar que la conjugación principal es 1 y 2 (marcaje del extremo N-terminal del monómero y el dímero)
Figure imgf000073_0002
His-hGDF15 1BCN (biciclo[6.1.0]non-4-inil) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en la única molécula del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2BCN corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3BCN corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15.
Compuesto intermedio 59: Conjugado His-hGDF15 BCN
Figure imgf000073_0001
His-hGDF15 Seq:
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA
CPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD
DLLAK DCHCI (SEQ ID NO: 1)
Una solución madre de His-hGDF15 (compuesto intermedio 51: 7,04 ml, 1,42 mg/ml) se diluyó a 0,5 mg/ml con tampón NaOAc 30 mM, pH 4,5 (12,95 ml). Una solución madre de 10 mg/ml de (2,5-dioxopirrolidin-1-il)carbonato de (1R,8S,9s)-biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetilo (NHS-BCN) en DMSO (0,88 ml) se añadió lentamente y la reacción se colocó en una placa de agitación a 24 °C durante 24 h. Se añadió una parte adicional de la solución madre de NHS-BCN (176 pl) y la reacción se mantuvo a 24 °C durante 24 h. La reacción se diluyó hasta 60 ml con tampón NaOAc 30 mM pH 4,5 y se concentró hasta 4 ml utilizando un cartucho de ultrafiltración con un MWCO de 10 kDa (repetición 4 veces) para producir 4,1 ml de concentrado. Basándose en A280 (e = 29090M-1 cm-1, 26700 g/mol) el concentrado fue de 2,19 mg/ml (8,98 mg, 89 %): LCMS QT2_15-60kDa_15min_polar (Método E)
Figure imgf000073_0003
His-hGDF15 1BCN (biciclo[6.1.0]non-4-inil) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en la única molécula del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2BCN corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3BCN corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15.
Compuesto intermedio 60: His-GDF15 de perro-BCN
Figure imgf000074_0001
Se combinaron 100 ul de His-dGDF15 (0,68 mg/ml), 100 ul de tampón de pH 4,5, 4 ul de una solución de BCN-NHS de 10 mg/ml y se incubaron a ta ambiente durante dos días. La mezcla resultante se lavó con Amicon 10k 4 veces para dar 200 ul de solución, que se usó en la siguiente etapa. El producto se mantuvo en bruto para su posterior conversión a conjugado.
Ejemplos de la invención:
Procedimiento general con clic de His-hGDF15 ácido graso-PEG-N3. El GDF15 marcado con BCN se diluyó a 0,5 mg/ml en tampón de NaOAc 30 mM a pH 4,5 mientras que se preparó una solución de 10 mg/ml de AG-PEG-N3 (ácido graso-PEG23-azida) en agua. A la solución de GDF15 se le añadieron 10 eq de AG-PEG-N3, y la reacción se colocó en una placa de agitación a 24 °C durante la noche. El progreso de la reacción se controló mediante LCMS (método QTOF 15-60kDa_15min_polar) y se añadió AG-PEG-N3 adicional, si era necesario hasta 50 eq, hasta que no se observó GDF15 marcado con BCN sin reaccionar. Después, la reacción se diluyó 5-10x con tampón NaOAc 30 mM pH 4 y el tampón se intercambió con tampón nuevo usando un cartucho de ultrafiltración con un MWCO de 10 kDa (4 ciclos de concentración seguidos de dilución). La muestra se concentró a ~ 1 mg/ml medido por A280, las recuperaciones fueron cuantitativas al 34 %. Los conjugados finales se analizaron mediante LCMS (método QTOF 15-60kDa_15min_polar) o Maldi.
Ejemplo 1: His-hGDF15 BCN (I-59) conjugado con el compuesto intermedio 21:
Figure imgf000074_0002
Figure imgf000074_0003
H is-h G D F 15 1A G (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad am ino del extrem o N-term inal en una molécula (una unidad m onom érica) del hom odím ero G D F15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 2 : His-hGDF15 BCN (I-59) conjugado con el compuesto intermedio 44:
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000075_0002
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula (una unidad monomérica) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15.
Ejem plo 3 (ejem plo de referencia): H is -h G D F 15 B C N (I-59 ) c o n ju g a d o con el c o m p u e s to in te rm e d io 29A :
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000076_0003
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula (una unidad monomérica) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 4: His-hGDF15 BCN (compuesto intermedio 58) conjugado con compuesto intermedio 24:
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000076_0004
H is-h G D F 15 1A G (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad am ino del extrem o N-term inal en una molécula (una unidad m onom érica) del hom odím ero G D F15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 5: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado con el compuesto intermedio 29:
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000077_0003
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 6 (ejemplo de referencia): His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado con el compuesto intermedio 55:
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000077_0004
H is-hG D F15 1A G (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad am ino del extrem o N-term inal en una m olécula del hom odím ero G D F15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 7 (ejemplo de referencia): His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado con el compuesto intermedio 6A:
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000078_0002
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula (una unidad monomérica) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas unidades monoméricas del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15.
E je m p lo 9: H is -h G D F 15 B C N (I-58 ) c o n ju g a d o con e l c o m p u e s to in te rm e d io 30:
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000079_0003
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula (unidad monomérica) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas moléculas (unidades monoméricas) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 10: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado con el compuesto intermedio 12:
Figure imgf000079_0002
Figure imgf000079_0004
H is-hG D F15 1A G (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad am ino del extrem o N-term inal en una m olécula (una unidad m onom érica) del hom odím ero G D F15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas moléculas (unidades monoméricas) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 13: His-hGDF15 BCN (I-59) conjugado con el compuesto intermedio 6:
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000080_0002
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula (una unidad monomérica) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas moléculas (ambas unidades monoméricas) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15.
Ejem plo 14 (ejem plo de referencia): H is -h G D F 15 B C N (I-58 ) c o n ju g a d o con el c o m p u e s to in te rm e d io 17:
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000081_0003
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula (una unidad monomérica) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas moléculas (ambas unidades monoméricas) del homodímero GDF15.
His-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Ejemplo 15 (ejemplo de referencia):
Etapa 1:
Figure imgf000081_0002
A una solución de ácido 2,2,13,13-tetrametiltetradecanodioico (Aldrich CPR, número de pedido PH002322) (100 mg, 0,318 mmol) y N-hidroxisuccinimida (40,3 mg, 0,35 mmol) en THF (5 ml) se añadió a una solución de DCC (65,6 mg, 0,318 mmol) en THF (5 ml), y la mezcla se agitó a t.a. durante la noche. Se observó una conversión parcial al producto deseado mediante análisis LC-MS. La mezcla se filtró y se concentró el filtrado. El residuo se volvió a disolver en DCM (40 ml) y se lavó con agua, se secó sobre Na2SO4 y se purificó mediante cromatografía de sílice eluyendo con heptano/EtOAc/DCC (10:1:1) para dar una mezcla. La mezcla se purificó adicionalmente mediante HPLC ácida activada por MS [(gradiente de 3,5 min de ACN al 55-80 %): rt = 2,48 min, masa calculada: 314,46 masa observada: 314,00] para dar para dar un producto claro (50 mg, 38,2 % de rendimiento) y recuperar el material de partida.
Etapa 2:
A una solución de ácido NHS-2,2,13,13-tetrametiltetradecanodioico (10 mg, 0,024 mmol) en DCM (3 ml) se añadió azido-dPEG3-amina (10 mg, 0,049 mmol) y DIPEA (9 ul, 0,049 mmol) y la mezcla se agitó a t.a. durante 1 h. La mezcla se concentró, se volvió a disolver en MeOH (3 ml) y se purificó mediante HPLC activada por MS (gradiente de 3,5 min de ACN al 55-80 % rt = 2,35, masa esperada: 514,70 masa observada: 514,40) para dar 7 mg de producto claro con un rendimiento del 58 %.
Etapa 3:
Figure imgf000082_0001
A una solución de 100 |jl de BCN-dGDF15 (I-60: 0,68 mg/ml en tampón de pH 4,5) se añadió tampón de pH 4,5 (100 |jl) y azida (6 ^l en DMSO, 10 mg/ml) y la mezcla se incubó a t.a. durante la noche. La mezcla se lavó con Amicon 10k 4 veces. La solución resultante se analizó por MALDI para indicar que la conjugación principal es 1 y 2. Maldi: Masa calculada: 26546 Masa observada: 26483; Masa calculada: 27060 Masa observada: 27128; Masa calculada: 27574 Masa observada: 27789.
Ejemplo 16: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado con el compuesto intermedio 44:
Figure imgf000082_0002
Figure imgf000082_0003
His-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una molécula (una unidad monomérica) del homodímero GDF15.
H is-h G D F 15 2A G (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extrem o N-term inal en am bas moléculas (am bas unidades m onom éricas) del hom odím ero G D F 15.
Ejemplo 17: His-hGDF15-BCN conjugado con el compuesto intermedio 52
Figure imgf000083_0001
A una solución de 3 ml de ciclooctino GDF15 (I-58: 0,46 mg/ml, 0,051 umol) en 7 ml de tampón de acetato de sodio pH 4 se añadió ácido graso azida peg (15 ul en 35 mg/ml de DMSO, 0,36 umol) y la mezcla se incubó a t.a. durante la noche. La conversión completa se observó mediante análisis MALDI. El producto se purificó mediante filtración con amicon 10 kD lavando tres veces para dar 4,3 ml de 0,29 mg/ml del producto deseado con un rendimiento del 90 %. Maldi: ciclooctina sm ~ 5 % masa esperada: 26902 masa observada: 26997; 1 ácido graso ~ 40 % masa esperada: 28421 masa observada: 28525; 2 ácidos grasos ~ 50 % masa esperada: 29940 masa observada: 30191 3 ácidos grasos 5 % masa esperada: 31459 masa observada: 31874.
Ejemplo 18: MH-(199-308)GDF15 (I-54) conjugado con el compuesto intermedio 37
Figure imgf000083_0002
Se añadió MH-(199-308)-GDF15 (compuesto intermedio 54: 0,393 ml, 0,028 pmol, 1,78 mg/ml) a 1,5 ml de tampón acetato de sodio 30 mM y se añadió NHS ácido graso (474 ug, 0,284 umol, 10 mg/ml) a solución. Después de 5 horas, la reacción se completó según MALDI. Los productos se purificaron lavando 5 veces utilizando ultrafiltración de amicon 10 kD para dar 575 ug de conjugado con un rendimiento del 73 %. MALDI: sm (18 %), masa esperada: 24638 masa observada: 24735; 1 ácido graso (38 %) masa esperada: 26192 masa observada: 26268; 2 ácido graso (40 %) masa esperada: 27746 masa observada: 27798; 3 ácido graso (4 %) masa esperada: 29300 masa observada: 29333.
E je m p lo 19A: H is -h G D F 15 (I-59 ) c o n ju g a d o co n el c o m p u e s to in te rm e d io 37
Figure imgf000084_0001
Se añadió His-GDF15 (0,493 ml, 0,026 |jmol, 1,42 mg/ml) a 1,5 ml de tampón de acetato de sodio 30 mM pH=4 y se añadió ácido graso nhs (0,221 mg, 0,132 umol, 10 mg/ml) a la solución. Durante la noche la reacción no se completó, por lo que se añadieron 2,5 equivalentes más de ácido graso NHS (0,110 mg, 0,066 umol, 10 mg/ml) y después de 5 h, Maldi mostró un conjugado 2 como producto principal. El producto se purificó lavando 5 veces utilizando ultrafiltración de amicon 10 kD para dar 565 ug de conjugado con un rendimiento del 76 %. MALDI: sm (18 %), masa esperada: 26468 masa observada: 26553; 1 ácido graso (38 %) masa esperada: 28022 masa observada: 28099; 2 ácido graso (40 %) masa esperada: 29576 masa observada: 29649; 3 ácido graso (4 %) masa esperada: 31130 masa observada: 31201.
Ejemplo 19B: AHA-hGDF15 conjugado con compuesto intermedio 37
Figure imgf000084_0002
Se preparó una solución de 10 mg/ml de compuesto intermedio 37 en agua de calidad de biología molecular. A AHA-hGDF15 (compuesto intermedio 57, 6,67 mg/ml en NaOAc 30 mM pH 4,0, 5,247 ml, 1,433 jm ol) se añadió NaOAc 30 mM pH 4,6 (intervalo aceptable 4,5-5,0) para dar una concentración final de proteína de 0,88 mg/ml. Se añadió compuesto intermedio 37 (10 eq., 2,39 ml, 0,014 mmol) y la reacción se mezcló a t.a. durante 18 horas. En el vial de reacción se había formado un precipitado. La mezcla de reacción se dividió entre 4 x 15 ml de filtros de centrífuga Amicon de 10 kDa y cada uno de ellos se diluyó a 15 ml con NaOAc 30 mM pH 4,0. El material se intercambió con tampón 4x en NaOAc 30 mM pH 4,0 y las muestras se combinaron hasta un volumen de 25,6 ml, agitando el precipitado en el filtro entre cada lavado con una punta de pipeta. El precipitado permaneció en solución, por lo que la mezcla se dejó reposar a 4 °C durante la noche. La concentración se midió mediante A280 (30040 cm-1M-1, 27538 g/mol) para ser 1,62 mg/ml (100 %). El análisis mediante UPLC mostró una recuperación del 60 % de los productos 1AG (tiempo de retención: 4,88 min) y 2AG (tiempo de retención: 5,80 min) (Método J). El método de LCMS T muestra las masas deseadas.
La mezcla bruta del Ejemplo 19B (relación representada en la tabla siguiente) se analizó in vivo y se comunicó en la tabla 1:
Figure imgf000085_0001
AHA-hGDF15 1AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en una de las cadenas polipeptídicas (en la unidad monomérica) del homodímero GDF15 (como se representa en la realización 11B, Fórmula H).
AHA-hGDF15 2AG (ácido graso) corresponde a una reacción en la funcionalidad amino del extremo N-terminal en ambas cadenas polipeptídicas del homodímero GDF15 (como se representa en la realización 11B, Fórmula G). AHA-hGDF15 3AG (ácido graso) corresponde a una reacción no selectiva en algún otro sitio del homodímero GDF15. Purificación:
El producto bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa (Tampón A TFA al 0,1 % en agua; Tampón B TFA 0,1 M en gradiente de ACN; 99 %-80 % de Tampón A) en un Waters BEH300 130 A, 3,5 pm, 4,6 mm x 100 mm caudal 2,5 ml/min.
Fracción 1: AHA-hGDF15 que no ha reaccionado: Rt = 17,33 min
Fracción 2: (19B1): AHA-GDF15 1AG: Rt = 20,2 min (rendimiento de aproximadamente 15 %) (Fórmula H) Fracción 3: (19B2): AHA-GDF15 2AG: Rt = 21,6 min (rendimiento de aproximadamente 15 %) (Fórmula G) Fracción 4: (19B3): AHA-GDF15 3AG: Rt = 23,0 min (rendimiento de aproximadamente 5 %)
Se preparó y analizó una mezcla en proporción 1:1 de 19B1 y 19B2 (19Bm).
Alternativamente, la reacción se puede llevar a cabo en Na2HPÜ4-7H2O 10 mM y NaOAc 30 mM a un pH de 4,73: Se preparó una solución de 10 mg/ml de compuesto intermedio 37 en agua de calidad de biología molecular. A AHA-hGDF15 (compuesto intermedio 57, 12,04 mg/ml en NaOAc 30 mM pH 4,0, 4,15 pl, 0,002 pmol) se añadió NaOAc 30 mM, Na2HPO4 10 mM - 7H2O pH 4,73 para dar una concentración de proteína final de 0,88 mg/ml. Se añadió compuesto intermedio 37 (20 eq., 6,83 pl, 0,041 pmol) y la reacción se mezcló a t.a. durante 18 horas. La mezcla de reacción se había vuelto turbia con un precipitado. El análisis de UPLC mostró un 58 % de productos 1 y 2 (Método J).
Figure imgf000085_0002
Alternativamente, la reacción también se puede llevar a cabo en NaOAc 30 mM y K2HPO410 mM a un pH de 4,6: Se preparó una solución de 10 mg/ml de compuesto intermedio 37 en agua de calidad de biología molecular. A AHA-hGDF15 (compuesto intermedio 57, 6,21 mg/ml en NaOAc 30 mM pH 4,0, 5,261 ml, 1,337 pmol) se añadió NaOAc 30 mM, K2HPO410 mM, pH 4,6 (rango aceptable 4,5-5,0) para dar una concentración de proteína final de 0,88 mg/ml. Se añadió el compuesto intermedio 37 (10 eq., 68,3 pl, 0,409 pmol) y la reacción se mezcló a t.a. durante 7 horas. La mezcla de reacción se había vuelto turbia con un precipitado. La mezcla de reacción se dividió en cuatro partes de 9 ml en 15 ml de filtros de centrífuga Amicon de 10 kDa y se diluyó a 15 ml con NaOAc 30 mM pH 4,0. El material se intercambió 4x con tampón en NaOAc 30 mM pH 4,0, agitando el precipitado entre cada lavado con una punta de pipeta. La mezcla de reacción se concentró hasta un volumen de 75 ml. El precipitado permaneció, por lo que el material se almacenó a 4 °C durante dos días. La concentración se midió mediante A280 (30040 cirr1M'1, 27538 g/mol) para ser 0,4 mg/ml (97 %). El análisis de UPLC mostró un 61 % de recuperación de productos 1 y 2 (Método J).
Figure imgf000086_0003
Ejemplo de referencia 1: His-hGDF15 BCN (I-58) conjugado con la construcción compuesto intermedio de PEG-ácido mirístico:
Etapa 1:
Figure imgf000086_0001
A una mezcla de Azido-PEG23-Amina (30 mg, 0,027 mmol) y éster mirístico de NHS (Toronto Research Chemicals, n.° de cat. S69080) (12 mg, 0,037 mmol) se añadió DCM (1 ml) y DIPEA (13 ul), y la mezcla se agitó a t.a. durante la noche. La mezcla se purificó mediante cromatografía de sílice eluyendo con EtOAc/heptano (0-100 %) y después MeOH/DCM (0-10 %) para dar un producto claro a aproximadamente el 5 % de MeOH/DCM. lCm S: (Gradiente: de 40 a 98 % de B en 1,4 min - flujo de 1 ml/min Eluyente A: agua 0,05 % de ácido fórmico acetato de amonio 3,75 mM, Eluyente B: acetonitrilo 0,04 % de ácido fórmico) LCMS: rt = 2,20 (Método C) Masa H calculado: 1354,71 Masa observada: 1354,4.
Etapa 2:
Figure imgf000086_0002
A una solución de BCN-hGDF15 (I-52: 800 ul, 0,25 mg/ml) se añadió a (2 mg/ml en DMSO, 6,3 ul, 10 eq) y la mezcla se agitó a t.a. durante la noche. 1,1 ml 0,20 mg/ml en rendimiento cuantitativo. (Maldi: 1 masa calculada: 28223 masa observada: 28640; 2 masa calculada: 29543; masa observada: 29962, 3 masa calculada: 30863 masa observada: 31426, 4 masa calculada: 32183 masa observada: 32911).
Ejemplo de referencia 2 : his-hGDF15-PEG23
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000087_0002
A una solución de His-hGDF15 BCN (I59: 427 |jl, 1,17 mg/ml, 0,019 |jmol) en NaOAc 30 mM pH 4,0 (427 j l) se añadió az¡do-dPEG23-am¡na (Quanta Biodesign, 104 jg , 0,094 jimol). La reacción se mezcló a t.a. durante 16 horas, momento en el que la mezcla se cambió a NaOAc 30 mM pH 4,0 usando un filtro de centrífuga Amicon con un MWCO de 10 kDa diluyendo y concentrando la muestra 5 veces hasta un volumen de 140 j l. El análisis MALDI mostró una conversión completa de 1 a 4 productos. La concentración se midió mediante A280 (29090 M-1cm-1; 27600 g/mol) para ser 2,099 mg/ml (57 %).
Puede observarse que los conjugados de la invención tienen una eficacia similar o mejorada en comparación con la biomolécula no conjugada, pero además los conjugados de la invención tienen una estabilidad en plasma mejorada en comparación con la biomolécula no conjugada. Se ha descubierto que los conjugados de los ejemplos anteriores tienen una estabilidad en plasma superior a 5 h, superior a 10 h, superior a 20 h, superior a 30 h, superior a 40 h y en algunos casos superior a 50 h.
La presente invención no se limita a las realizaciones específicas ilustradas en la misma.

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que comprende una biomolécula unida a un ácido graso mediante un enlazador, en donde la biomolécula es el factor de diferenciación del crecimiento humano 15 (GDF15), homólogos, variantes, mutantes o fragmentos del mismo o un dímero del mismo, y
en donde el ácido graso tiene la siguiente Fórmula A1:
Figure imgf000114_0001
R1 es CO2H;
R2 y R3 son independientemente entre sí H, OH, CO2H, -CH=CH2 o —C=CH;
n y m son independientemente entre sí un número entero entre 6 y 30; o una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Un conjugado según la reivindicación 1, en donde el ácido graso se selecciona de
Figure imgf000114_0002
en donde Ak3, Ak4, Ak5, Ak6 y Ak7 son independientemente un alquileno (C8-20) lineal, R5 y R6 son independientemente alquilo (C8-20) lineal, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Un conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el ácido graso se selecciona de:
Figure imgf000115_0001
o una amida, éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. Un conjugado según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde el enlazador comprende alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, polietilenglicol, uno o más aminoácidos naturales o no naturales, o una combinación de los mismos, en donde cada uno de los alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, polietilenglicol y/o los aminoácidos naturales o no naturales se combinan opcionalmente y se unen entre sí o se unen a la biomolécula y/o a la fracción de ácido graso a través de un grupo químico seleccionado de -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- o =NH-N(alquilo)-; o una amida, éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el enlazador comprende una fracción de oligoetilenglicol no ramificado de fórmula:
Figure imgf000115_0002
en donde y es 0 a 34; o una amida, éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el enlazador comprende una fracción heterocíclica seleccionada de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000116_0001
y
en donde r es un número entero de 0 a 2 y s es un número entero de 0 a 3; o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador comprende uno o más aminoácidos seleccionados independientemente de histidina, metionina, alanina, glutamina, asparagina y glicina; o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
8. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el conjugado tiene una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000117_0001
FORMULA D;
en donde en las Fórmulas C y D; ambas unidades monoméricas de his-hGDF15 o de hGDF15* están unidas a la fracción de ácido graso a través del enlazador en ambos extremos N-terminales;
o
Figure imgf000118_0001
en donde en las Fórmulas E y F, solo una de las unidades monoméricas de his-hGDF15 o de hGDF15* está unida a la fracción de ácido graso a través del enlazador en el extremo N-terminal;
y en donde
hGDF15* es hGDF15 en donde los 2 o 3 aminoácidos en el extremo N-terminal se han reemplazado con una secuencia de aminoácidos XH- o XHX'- respectivamente, en donde H es histidina y X y X' se seleccionan independientemente de M y A; e
his-hGDF15 es hGDF15 en donde se ha añadido una etiqueta, que comprende de 1 a 6 aminoácidos de histidina y opcionalmente 1 o 2 aminoácidos de metionina, al extremo N-terminal de hGDF15;
s es un número entero entre 20-30; y
la línea entre las 2 unidades monoméricas de his-hDGF15 o las 2 unidades monoméricas de hGDF15* representa un enlace disulfuro.
9. Una mezcla que comprende el conjugado según la reivindicación 8 que tiene la Fórmula C, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el conjugado según la reivindicación 8 que tiene la Fórmula E, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o una mezcla que comprende el conjugado según la reivindicación 8 que tiene la Fórmula D, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el conjugado según la reivindicación 8 que tiene la Fórmula F, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la biomolécula es MH(199-308)hGDF15, MHA(200-308)hGDF15, AHA(200-308)hGDF15 o AH(199-308)GDF15, MHHHHHHM-hGDF15 y MHHHHHH-hGDF15 o un dímero de los mismos.
11. Un conjugado según la reivindicación 8, o una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde hGDF15* es MH(199-308)hGDF15, MHA(200-308)hGDF15, AHA(200-308)hGDF15 o AH(199-308)GDF15; e his-hGDF15 es MHHHHHHM-hGDF15 o MHHHHHH-hGDF15.
12. Un conjugado según la reivindicación 8 o 10, o una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el conjugado es de Fórmula G o de Fórmula H:
Figure imgf000120_0001
en donde AHA-hGDF15 es SEQ ID NO: 7 y el ácido graso está unido a través del enlazador en el extremo N-terminal de una o de dos unidades monoméricas de AHA-hGDF15, y
en donde la línea entre las dos unidades AHA-hGDF15 representa un enlace disulfuro.
13. Una mezcla que comprende el conjugado según la reivindicación 12 que tiene la Fórmula G, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el conjugado según la reivindicación 12 que tiene la Fórmula H, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14. Una mezcla según la reivindicación 13, en donde la mezcla es una proporción molar 1:1 de un conjugado de Fórmula G, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un conjugado de Fórmula H, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
15. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10, 11 o 12, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una mezcla de conjugados según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 13 o 14, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como un medicamento.
16. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10, 11 o 12, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una mezcla de conjugados según la reivindicación 9, 13 o 14, o una amida, un éster de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos metabólicos, diabetes, diabetes mellitus tipo 2, obesidad, pancreatitis, dislipidemia, esteatosis hepática/esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica y otras hepatopatías progresivas, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, arteriopatía periférica, accidente cerebrovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía coronaria, complicaciones diabéticas, nefropatía crónica, neuropatía, gastroparesia y otros trastornos metabólicos.
17. Una combinación que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10, 11 o 12, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una mezcla de conjugados según la reivindicación 9, 13 o 14, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y uno o más coagentes terapéuticamente activos.
18. Una combinación según la reivindicación 17, en donde el coagente se selecciona de un agente antidiabético, un agente hipolipidémico, agentes antiobesidad, agentes antihipertensivos y agonistas de receptores activados por proliferadores de peroxisomas.
19. Una combinación según la reivindicación 18, en donde el coagente se selecciona de
insulina, derivados y miméticos de insulina; secretagogos de insulina; gliburida, amaril; ligandos del receptor de sulfonilurea insulinotrópico; tiazolidinedionas, pioglitazona, balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazona, ciglitazona, adaglitazona, darglitazona, inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP), inhibidores de GSK3 (glucógeno sintasa quinasa-3); ligandos RXR; inhibidores del cotransportado r de glucosa dependiente de sodio; inhibidores de la glucógeno fosforilasa A; biguanidas; inhibidores de la alfa-glucosidasa, GLP-1 (péptido 1 similar al glucagón), análogos de GLP-1, miméticos de GLP-1; inhibidores de DPPIV (dipeptidil peptidasa IV), inhibidores de 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa; inhibidores de la escualeno sintasa; FXR (receptor X farnesoide), ligandos LXR (receptor X hepático); colestiramina; fibratos; ácido nicotínico, aspirina; orlistat o rimonabant; diuréticos de asa, furosemida, torsemida; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA); inhibidores de la bomba de membrana de Na-K-ATPasa; inhibidores de endopeptidasa neutra (NEP); inhibidores de la ECA/NEP; antagonistas de angiotensina II; inhibidores de renina; bloqueadores de los receptores padrenérgicos; agentes inotrópicos, dobutamina, milrinona; bloqueadores de los canales de calcio; antagonistas del receptor de aldosterona; inhibidores de la aldosterona sintasa; fenofibrato, pioglitazona, rosiglitazona, tesaglitazar, BMS-298585 y L-796449.
20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10, 11 o 12, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o una mezcla de conjugados según la reivindicación 9, 13 o 14, o una amida, un éster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables.
21. Un compuesto de fórmula:
Figure imgf000121_0001
R1 es CO2H;
R2 y R3 son independientemente entre sí H, OH, CO2H, -CH=CH2 o —C=CH; con la condición de que R2 y R3 no sean idénticos;
n y m son independientemente entre sí un número entero entre 6 y 30; o una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
22. Un compuesto según la reivindicación 21, seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000121_0002
Figure imgf000122_0001
una amida, éster o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
23. Un compuesto seleccionado de:
Figure imgf000123_0001
Figure imgf000124_0001
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