ES2916221T3 - Procedimiento para identificar selectivamente un mutante dentro de una población de organismos mediante la aplicación de una estrategia de agrupamiento y división - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de identificación de un organismo de una especie predefinida que porta una o más mutaciones predeterminadas en nucleótido(s) de interés [NOI(s)], en una secuencia diana, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) Proporcionar un agrupamiento de organismos de dicha especie, o partes reproductivas de los mismos, que representan una pluralidad de genotipos; b) Dividir dicho agrupamiento en uno o más subagrupamientos de organismos, o partes reproductivas de los mismos; c) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADN genómico (ADNg), de cada genotipo dentro de un subagrupamiento, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento; d) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una la muestra de ADNg de un subagrupamiento, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, comprendiendo cada una parte de dicha muestra de ADNg, uno o más conjuntos de cebadores, flanqueando cada conjunto una secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la(s) secuencia(s) diana; e) Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) una o más secuencias diana que comprenden la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), identificando así subagrupamiento(s) que comprende(n) dicha(s) mutación(es); f) Dividir los organismos, o partes reproductivas de los mismos, de dicho(s) subagrupamiento(s) identificado(s) en subagrupamientos secundarios, tales como al menos 10, preferiblemente al menos 90 subagrupamientos secundarios; g) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento secundario, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento secundario; h) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una la muestra de ADNg de un subagrupamiento secundario, uno o más conjuntos de cebadores, flanqueando cada conjunto una secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la(s) secuencia(s) diana; i) Detectar productos de amplificación por PCR que comprenden una o más secuencias diana que comprenden la(s) mutación(es) predeterminada(s) en el(los) NOI(s), identificando así subagrupamientos secundarios en la etapa i) que comprenden dicha(s) mutación(es); j) Identificar un organismo, o parte reproductivas del mismo dentro de dicho subagrupamiento secundario que porta dicha(s) mutación(es), con la condición de que cuando la especie es una planta o un animal, el procedimiento no comprende una etapa de reproducción sexual.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para identificar selectivamente un mutante dentro de una población de organismos mediante la aplicación de una estrategia de agolpamiento y división
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona procedimientos y procesos altamente acelerados que hacen prácticamente posible ampliar y abordar la preparación, selección y/o propagación de un organismo con mutación(es) predeterminada(s) específica(s) en uno o más nucleótidos de interés (NOI, por sus siglas en inglés). Los procedimientos de la invención son, por ejemplo, útiles para avanzar en el ritmo y la capacidad de preparar plantas con mutación(es) predeterminada(s) específica(s) en uno o más NOI(s).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los procedimientos genéticos para generar organismos genéticamente modificados (GM, por sus siglas en inglés) (OGMs, por sus siglas en inglés) están ampliamente disponibles. Sin embargo, para muchos fines, particularmente en las industrias alimentaria y de bebidas, el uso de OGMs es a menudo menos deseable. Por tanto, sigue existiendo una necesidad permanente de proporcionar procedimientos mejorados y más precisos para la mejora tradicional de cultivos, incluyendo cereales, tales como la cebada, simplemente para obtener mejores materiales crudos a medida para su aplicación en el desarrollo y la fabricación de nuevos productos. Inconvenientes similares existen en relación con otros organismos, incluyendo microorganismos y animales. Desafortunadamente, ha habido una falta persistente de procedimientos en las estrategias de mejora tradicional para abordar el hallazgo de mutaciones en nucleótidos predefinidos de genomas, limitando de este modo el progreso del desarrollo de materiales crudos.
Están disponibles procedimientos para permitir la edición del genoma y la introducción de roturas de ADN bicatenario en sitios específicos en el genoma de un organismo, por ejemplo, mediante la tecnología CRISPR-Cas9 (Jiang y col., 2016). Dos complicaciones principales distintas siguen asociadas con la tecnología CRISPR-Cas9:
- En primer lugar, la tecnología CRISPR-Cas9 puede considerarse como basada en GM. Por tanto, falta información legislativa básica sobre cómo las autoridades pretenden regular las nuevas herramientas genéticas en la edición del genoma, incluyendo la introducción de roturas de ADN bicatenario en sitios específicos en el genoma;
- En segundo lugar, existen complicaciones importantes relacionadas con escisiones inespecíficas con la tecnología CRISPR-Cas9.
Las mutaciones de la línea germinal en un contexto natural, por ejemplo, aquellas que conducen a consecuencias fenotípicas en los organismos, representan tanto la causa principal de la variación de rasgos hereditarios como la fuente última del cambio evolutivo en virtud de efectos ventajosos o perjudiciales a nivel molecular. Las mutaciones surgen en respuesta a una serie de factores, que incluyen:
- Errores de replicación;
- Daño en el ADN, ya sea reparado incorrectamente o dejado sin reparar;
- Daño en el ADN causado por factores exógenos, tales como productos químicos, luz ultravioleta y radiación ionizante; - Factores endógenos, por ejemplo, especies reactivas de oxígeno, aldehídos o errores mitóticos;
- Enzimas implicadas en la reparación del ADN o la edición del genoma;
- Virus y retrotransposones endógenos que insertan fragmentos de ADN.
Adicionalmente, el entendimiento actual es que la exposición a un mutágeno puede inducir numerosas mutaciones genéticas somáticas, la mayoría de las cuales sin una ventaja selectiva notable, pero algunas pueden alterar funciones celulares clave. Además, es probable que algunas propiedades relacionadas con el genoma no sean mutacionales, por ejemplo, cambios y alteraciones epigenéticos en el microambiente celular.
La mejora tradicional de cultivos ha implicado una mutagénesis aleatoria seguida de una identificación selectiva de un rasgo deseado. Desafortunadamente, hay una falta de procedimientos de identificación selectiva eficaces para identificar cambios genéticos predeterminados, es decir, sustituciones nucleotídicas específicas en genes o elementos reguladores de organismos mutagenizados, por ejemplo, cereales sin empleo de procedimientos con base GM. De hecho, las plantas GM han experimentado una ventaja competitiva > a 10 años en lo que respecta a las estrategias dirigidas sobre el desarrollo de rasgos per se y la adopción por parte de la comunidad científica en general. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, los procedimientos con base GM pueden ser menos preferibles.
Los resultados de la tecnología de secuenciación del genoma desarrollada recientemente revolucionaron la comprensión de la arquitectura genética de los rasgos (y los cambios correspondientes en respuesta a la mutagénesis). Existe, por ejemplo, una expectativa generalizada de que la secuenciación del genoma completo y los nuevos procedimientos computacionales, con la ayuda de grandes esfuerzos de secuenciación de ADNg de alto rendimiento, ayudará a responder varias cuestiones biológicas básicas y acelerará la caracterización de mutantes, por ejemplo, utilizando la cebada, una planta de cereal monocotiledónea.
En eucariotas, parece que algunos procedimientos de mutación muestran una variación considerable en la distribución genómica (Pleasance y col., 2010; Schuster-Bochler y Lehner, 2012). El número de mutaciones puntuales varía a lo largo del genoma y suele ser mayor en las regiones de secuencia con bajos niveles de expresión génica, cromatina reprimida y tiempos de replicación tardíos. Parte de esta variación puede deberse al acceso reducido de la maquinaria de reparación de apareamiento incorrecto a las regiones de cromatina cerradas.
Dada la información básica proporcionada anteriormente, los expertos en el campo de la investigación de cereales sabrán que los avances analíticos han situado la investigación de cebada y cereales en el umbral de nuevas fronteras, específicamente en la interfase I+D entre la comprensión profunda basada en la biología molecular y la aplicación industrial de plantas con nuevas características. Dicho esto, a pesar de los avances en las tecnologías de secuenciación del genoma para la identificación de mutantes, dichos procedimientos siguen siendo lentos y logísticamente desafiantes, y resultan poco útiles para la identificación de mutaciones predeterminadas específicas.
Dos propiedades adicionales siguen siendo de interés, no solo con respecto a la identificación de plantas con mutaciones predeterminadas, sino también para aprovechar las mejoras:
- Delimitación de la extensión de las tasas de mutación en la línea germinal y somática en cereales.
- Las estrategias actuales se centran en la reducción de la búsqueda de mutantes a fragmentos de ADNg en función del análisis de secuencias de ADNg independiente del contexto, [por ejemplo, la metodología Tilling, que está restringida a la identificación selectiva de un máximo de 5.000 a 10.000 mutantes, y las diferencias de punto de fusión entre fragmentos de ADNg derivados de mutantes y de tipo salvaje (Botticella y col., 2011)].
Hasta ahora, se consideraba poco realista encontrar mutaciones predeterminadas y complejas utilizando procedimientos que no sean GM. También siguiendo esta línea, no hubo sugerencias sobre los tamaños de muestra con los que se debe trabajar para identificar con firmeza las sustituciones nucleotídicas específicas de interés. Esto ahora es posible siguiendo la guía proporcionada en la presente publicación.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención divulga procedimientos para encontrar organismos individuales, tradicionalmente desarrollados, que tienen mutación(es) predeterminada(s) en nucleótidos de interés en una o más secuencias diana. Dichas mutaciones pueden ser mutaciones en genes que confieren rasgos útiles específicos.
En particular, basándose en novedosos y sorprendentes conocimientos sobre las estructuras mutacionales, la invención proporciona un nuevo procedimiento para todo el genoma, notable aunque relativamente simple, para su aplicación en el hallazgo de mutantes. La invención proporciona procedimientos de identificación de organismos con una mutación predeterminada en uno o más NOls. La mutación predeterminada puede ser cualquier mutación deseable. Por tanto, la invención proporciona procedimientos que no sean GM, que permiten la identificación de organismos con mutaciones particulares. Esto es posible gracias a la explotación inventiva de las técnicas de PCR, en particular de la PCR digital. En consecuencia, la invención divulga una estrategia novedosa que aborda el contexto del ADN mutacional a identificar selectivamente, combinado con un sistema logísticamente inventivo que permite el análisis de colecciones gigantescas de organismos mutados.
También se divulgan novedosas acciones que reducen el tiempo y minimizan el procesamiento para alcanzar la desafiante tarea de encontrar mutaciones raras, por ejemplo, aquellas que se espera que estén localizadas en las regiones de cromatina cerradas antes mencionadas de los núcleos de cereales, incluyendo los de cebada. Se puede utilizar el acceso a secuencias genómicas completas para el diseño de cebadores y/o sondas para los procedimientos. Por tanto, la secuencia genómica completa de la cebada (ensamblaje genómico de la cebada en Ensembl Plants, versión 082214v1), puede utilizarse para el diseño de cebadores y sondas para genes específicos, es muy adecuado para mejorar la tasa de hallazgo de una planta con una mutación predeterminada.
En una realización, la presente invención proporciona procedimientos para buscar, mediante mejora tradicional o convencional, mutaciones predeterminadas que son, por ejemplo, mutaciones que dan como resultado una sustitución nucleotídica en un gen, o genes, relacionados con un rasgo de cereal. Con los procedimientos divulgados se presentan formas de ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes relacionados con la mutagénesis endógena e inducida.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas a la presente.
La invención proporciona procedimientos de identificación de un organismo de una especie predefinida que porta una o más mutaciones predeterminadas en NOI(s) de una secuencia diana, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) Proporcionar un ag o l pamiento de organismos de dicha especie, o partes reproductivas de los mismos, que representan una pluralidad de genotipos;
b) Dividir dicho ag o l pamiento en uno o más subagrupamientos de organismos, o partes reproductivas de los mismos; c) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento; d) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una la muestra de ADNg de un subagrupamiento, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas que comprenden cada una parte de dicha muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la secuencia diana;
e) Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) una o más secuencias diana que comprenden la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s) de interés, identificando así subagrupamiento(s) que comprende(n) dicha mutación; f) Dividir los organismos, o partes reproductivas de los mismos, de dicho subagrupamiento identificado en subagrupamientos secundarios;
g) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento secundario, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento secundario;
h) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una la muestra de ADNg de un subagrupamiento secundario, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la secuencia diana;
i) Detectar productos de amplificación por PCR que comprenden una secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) predeterminada(s) en el(los) NOI(s), identificando así subagrupamientos secundarios en la etapa h) que comprenden dicha mutación;
j) Identificar un organismo, o parte(s) reproductiva(s) del mismo, dentro de dicho subagrupamiento secundario que porta dicha(s) mutación(es),
con la condición de que cuando la especie es una planta o un animal, el procedimiento no comprende una etapa de reproducción sexual.
La invención también proporciona organismos identificados por los procedimientos de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona una planta de cebada que porta una mutación en el gen HvGS1-3 que codifica la glutamina sintasa, donde dicho gen mutado codifica la proteína HvGS1-3 mutada con actividad reducida.
La invención se ilustra además en esta invención en 5 líneas de trabajo (WSs, por sus siglas en inglés), que de manera secuencial permiten la identificación de una mutación nucleotídica predeterminada específica en una colección de granos mutantes de cereal: los detalles de WS1 divulgan procedimientos para establecer colecciones de plantas de cereal inducidas tradicionalmente; los detalles de WS2 detallan cómo estructurar muestras de granos complejas; WS3 destaca por cómo identificar aquellas muestras de granos que comprenden mutantes; las informaciones analíticas relacionadas con WS4 describen cómo encontrar granos de cereal mutados individuales y; WS5 se centra en cómo el uso combinado de dos instrumentos de PCR digital diferentes facilita la identificación selectiva de cantidades muy altas de muestras de ADNg derivadas de granos de cereal.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 ilustra un ejemplo sobre el concepto experimental general de la presente solicitud.
La Figura 2 ilustra un ejemplo del concepto experimental general de la presente solicitud, utilizando la cebada, una especie de planta, como ejemplo. A se refiere a la propagación de granos de cebada mutados (WS1 como se explica en la descripción detallada de la invención); B muestra aspectos de producción de una biblioteca ordenada de granos mutados (WS2 como se explica en la descripción detallada de la invención); C proporciona un resumen sobre cómo determinar si una fracción de granos contiene granos individuales de interés (WS3 como se explica en la descripción detallada de la invención); D se centra en cómo identificar, en muestras con mezclas de granos, un grano con una mutación específica (WS4 como se explica en la descripción detallada de la invención); E proporciona una ilustración del flujo de trabajo involucrado en la detección de ADN mutado en muestras de ADNg combinado (WS5 como se explica en la descripción detallada de la invención).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
El término "alelo" se refiere a una versión o estado específico de un gen. La expresión "alelo mutante", como se usa en esta invención, se refiere a un gen que porta una o más mutaciones predeterminadas en el(los) NOI(s). Cuando la mutación es una deleción de un gen entero, el alelo mutante también puede ser un alelo que carezca de dicho gen.
El término "aproximadamente", como se usa en esta invención, en relación con los números, se refiere a ±10 %, preferiblemente ±5 %, por ejemplo a ±1 %.
La expresión "sonda de bloqueo", como se usa en esta invención, se refiere a un oligonucleótido, que no se puede extender en el extremo 3' por una ADN polimerasa. La sonda de bloqueo será en general un oligonucleótido, que es idéntico a la secuencia diana o complementario a la misma, incluyendo el NOI de referencia unido a un agente de bloqueo, que inhibe la extensión de la sonda de bloqueo por una ADN polimerasa.
El término "genotipo", como se usa en esta invención, se refiere a un organismo que comprende un conjunto específico de genes. Por tanto, dos organismos que comprenden genomas idénticos son del mismo genotipo. El genotipo de un organismo en relación con un gen particular está determinado por los alelos portados por dicho organismo. En los organismos diploides, el genotipo para un gen dado puede ser AA (homocigoto, dominante), Aa (heterocigoto) o aa (homocigoto, recesivo).
La expresión "sonda de detección de mutantes", como se usa en esta invención, se refiere a un oligonucleótido opcionalmente unido a un medio detectable, donde el oligonucleótido es idéntico a la secuencia diana o complementario a la misma, incluyendo la mutación predeterminada del NOI.
El término "PCR", como se usa en esta invención, se refiere a una reacción en cadena de la polimerasa. Una PCR es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. El procedimiento se basa en ciclados térmicos y consiste en ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento de la reacción para obtener la fusión y la replicación enzimática secuenciales de dicho ADN. En la primera etapa, las dos hebras que forman la doble hélice del ADN se separan físicamente a alta temperatura en un procedimiento también conocido como fusión del ADN. En la segunda etapa, la temperatura se reduce permitiendo la replicación enzimática del ADN. La PCR también puede implicar la incubación a una temperatura adicional con el fin de mejorar la hibridación de los cebadores y/o de optimizar la(s) temperatura(s) para la replicación. En una PCR, la temperatura generalmente transcurre en ciclos entre las varias temperaturas durante una serie de ciclos.
La expresión "reactivos de PCR", como se usa en esta invención, se refiere a reactivos, que se añaden a una PCR además de una muestra y un conjunto de cebadores. Los reactivos de PCR comprenden al menos nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico. Adicionalmente, los reactivos de PCR pueden comprender otros compuestos, tales como sal(es) y tampón(es).
El término "ddPCR" se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas. En ddPCR, se realizan una o más amplificaciones por PCR, donde cada reacción se separa en una pluralidad de gotas de emulsión agua-aceite, de modo que la amplificación por PCR de la secuencia diana puede producirse en cada gota individual.
El término "reproducción", como se usa en esta invención, se refiere exclusivamente a la reproducción asexual.
Por tanto, la reproducción puede ser la multiplicación de un organismo de una manera clonal (también conocida como "reproducción asexual"). La reproducción también puede ser la generación de descendencia de un organismo, donde la descendencia comprende alelo(s) del organismo parental. Por tanto, la reproducción de un organismo que comprende un alelo mutante puede referirse a la generación de descendencia de dicho organismo, donde la descendencia comprende el alelo mutante. Preferiblemente, el alelo mutante porta una o más mutaciones en el(los) NOI(s).
La expresión "partes reproductivas de un organismo", como se usa en esta invención, se refiere a cualquier parte de un organismo que, en las condiciones adecuadas, puede crecer en forma de un organismo completo. A modo de ejemplo, en realizaciones de la invención donde la especie es una planta, la parte reproductiva de dicho organismo puede ser, por ejemplo, una semilla, un grano o un embrión de dicha planta. En realizaciones de la invención, donde la especie es un organismo unicelular, entonces las partes reproductivas son el organismo completo, es decir, una célula.
La expresión "conjunto de cebadores que flanquean una secuencia diana", como se usa en esta invención, se refiere a un conjunto de dos cebadores que flanquean una secuencia diana, de modo que un cebador comprende una secuencia idéntica al extremo 5' de la secuencia diana (también denominado "cebador directo") y un cebador comprende una secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia diana (también denominado "cebador inverso"). El "conjunto de cebadores" es capaz de amplificar la secuencia diana cuando se añade a una PCR junto con un ácido nucleico que comprende la secuencia diana y los reactivos de PCR en condiciones que permiten la amplificación de dicha secuencia diana.
La expresión "secuencia diana", como se usa en esta invención, se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico dentro de la cual es deseable generar o identificar una mutación. Es más, la secuencia diana es preferiblemente una secuencia de ácido nucleico, que puede amplificarse mediante tecnología PCR utilizando cebadores que flanquean la secuencia diana. Además, la secuencia diana generalmente comprende uno o más NOIs. La invención proporciona procedimientos de producción y/o identificación de organismo(s) portador(es) de una mutación en dicho NOI. La secuencia diana puede ser, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico asociada con un rasgo específico.
La expresión "sonda de detección de referencia", como se usa en esta invención, se refiere a un oligonucleótido opcionalmente unido a un medio detectable, donde el oligonucleótido es idéntico o complementario a la secuencia diana, incluyendo el NOI de referencia. En general, la secuencia diana, incluyendo el NOI de referencia, corresponde a la secuencia diana antes de la mutagénesis. La "sonda de detección de referencia" también puede denominarse "sonda de tipo salvaje".
La expresión "línea de trabajo" (WS), como se usa en esta invención, se refiere a una serie de una o más etapas de un procedimiento.
Procedimiento de identificación de un organismo.
La presente invención se refiere a procedimientos de identificación de un organismo de una especie predefinida, por ejemplo, cualquiera de las especies descritas más adelante en esta invención en la sección "Especies", que portan una mutación en un NOI en una secuencia diana [por ejemplo cualquiera de las mutaciones descritas más adelante en esta invención en la sección "Nucleótido(s) de interés"], y comprendiendo dichos procedimientos las etapas de:
a. Proporcionar un agrupamiento de organismos de las especies predefinidas especificadas, o partes reproductivas de los mismos, que representen una pluralidad de genotipos, por ejemplo, cualquiera de los agrupamientos descritos más adelante en esta invención en las secciones "Agrupamiento de organismos";
b. Dividir dicho agrupamiento en uno o más subagrupamientos de organismos o partes reproductivas de los mismos, por ejemplo, como se describe más adelante en esta invención en la sección "División del agrupamiento en subagrupamientos";
c. Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento, que, por ejemplo, se puede realizar como se describe más adelante en la sección "Preparación de muestras de ADN"; d. Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una muestra de ADNg de un subagrupamiento, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas que comprenden cada una parte de dicha muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la secuencia diana, que, por ejemplo, se puede realizar como se describe más adelante en esta invención en la sección "Amplificación por PCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas";
e. Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) una secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), identificando así subagrupamiento(s) que comprende(n) dicha mutación, que, por ejemplo, puede llevarse a cabo como se describe más adelante en esta invención en la sección "Detección de producto(s) de amplificación por PCR";
f. Dividir los organismos, o partes reproductivas de los mismos, de dicho subagrupamiento identificado en subagrupamientos secundarios, por ejemplo, como se describe más adelante en esta invención en la sección "División del subagrupamiento en subagrupamientos secundarios";
g. Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADN genómico de cada genotipo dentro de un subagrupamiento secundario, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento secundario, que, por ejemplo, se puede realizar como se describe en la sección "Preparación de una muestra de ADN";
h. Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una muestra de ADNg de un subagrupamiento secundario, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la secuencia diana, que, por ejemplo, se puede realizar como se describe en la sección "Identificación de subagrupamientos secundarios";
i. Detectar amplificación(es) por PCR que comprende(n) una secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), identificando así subagrupamientos secundarios que comprenden dicha mutación, que, por ejemplo, puede realizarse como se describe en la sección "Identificación de subagrupamientos secundarios";
j. Identificar un organismo dentro de dicho subagrupamiento secundario que porta dicha mutación, que, por ejemplo, puede realizarse como se describe en la sección "Identificación del organismo".
La etapa a. puede comprender, por ejemplo, proporcionar un agrupamiento de organismos preparados como se describe en WS1 en esta invención.
La etapa b. puede, por ejemplo, realizarse como se describe en WS2 en esta invención.
Las etapas c., d. y e. se pueden realizar, por ejemplo, como se describe en WS3 en esta invención.
Las etapas f., g., h., i. y j. pueden, por ejemplo, realizarse como se describe en WS4 en esta invención.
Los reactivos de PCR comprenden, en general, al menos nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico. Adicionalmente, los reactivos de PCR también pueden comprender preferiblemente una o más sondas de detección, por ejemplo, una sonda de detección de mutación y/o una sonda de detección de referencia como se describió anteriormente en esta invención en la sección "Detección de producto(s) de PCR".
Además de las etapas indicadas anteriormente, los procedimientos de la invención pueden comprender una o más etapas adicionales. Los procedimientos pueden, por ejemplo, comprender una etapa de preparación de dicho ag o l pamiento de organismos, por ejemplo, mediante mutagénesis. Los procedimientos de preparación del ag o l pamiento de organismos se describen más adelante en esta invención en la sección "Agrupamiento de organismos".
Los procedimientos también pueden comprender una etapa de reproducción de uno o más de dichos organismos, o partes reproductivas de los mismos, dentro del agrupamiento o dentro de un subagrupamiento de organismos, o parte(s) reproductiva(s) de los mismos, con la condición de que cuando la especie es una planta o un animal, el procedimiento no comprende una etapa de reproducción sexual. Dicha etapa de reproducción puede comprender, en el caso de organismos simples, por ejemplo, organismos unicelulares que se reproducen asexualmente, una o múltiples divisiones celulares. En el caso de organismos más complejos, por ejemplo, organismos que se reproducen sexualmente, esta etapa puede incluir el cultivo de dichos organismos, o partes reproductivas de los mismos, a través de uno o más ciclos con la condición de que cuando la especie es una planta o un animal, el procedimiento no comprende una etapa de reproducción sexual.
A continuación, se hace referencia solamente a "organismo". Sin embargo, las mismas consideraciones se aplican a procedimientos que utilizan partes reproductivas de organismos. Cada etapa de cultivo de un organismo puede dar como resultado una descendencia, que no es idéntica al organismo original. Por ejemplo, después de la mutagénesis aleatoria de organismos poliploides, la mayoría de los organismos portarán cualquier mutación aleatoria solo en un alelo y, por tanto, serán genéticamente heterocigotos con respecto a esa mutación. Generalmente, los organismos de descendencia comprenden organismos sin la mutación, organismos de descendencia genéticamente heterocigotos para la mutación y organismos de descendencia genéticamente homocigotos para la mutación. Por tanto, un agrupamiento de descendencia de un agrupamiento original u organismos, o partes reproductivas de los mismos, no será idéntico al agrupamiento original, pero, en general, al menos representará cualquier mutación en el(los) NOI(s) presente(s) en el agrupamiento original, ya sean organismos heterocigotos y/u homocigotos. Por tanto, al menos parte de dicha descendencia comprenderá el alelo mutante. De manera similar, la descendencia de un subagrupamiento, un superagrupamiento o un subagrupamiento secundario puede no ser idéntica al subagrupamiento, superagrupamiento o subagrupamiento secundario original, pero, en general, al menos representará cualquier mutación en el(los) NOI(s) presente(s) en el subagrupamiento, superagrupamiento o subagrupamiento secundario original, ya sea en forma de heterocigotos u homocigotos.
La etapa b) de dividir el agrupamiento en uno más subagrupamientos puede comprender, por tanto, una etapa de reproducción de organismos, o partes reproductivas de los mismos. Esto puede, por ejemplo, realizarse simultáneamente con la división del agrupamiento en subagrupamientos. Alternativamente, esto se puede hacer después de dividir el agrupamiento en subagrupamientos. Por tanto, los procedimientos de la invención pueden comprender después de la etapa b) una etapa de reproducción de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, dentro de dichos subagrupamientos.
De manera similar, los procedimientos de la invención pueden comprender después de la etapa f) una etapa de reproducción de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, dentro de dichos subagrupamientos secundarios. Sin embargo, en algunas realizaciones de la invención, y en particular en las realizaciones de la invención, donde la especie es una planta, tal como un cereal, entonces puede resultar preferido que los procedimientos no comprendan una etapa de reproducción de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, de los subagrupamientos secundarios entre las etapas f) y g).
En algunas realizaciones de la invención, los procedimientos comprenden una etapa de reproducción de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, contenidos en el subagrupamiento secundario que comprende la mutación en el NOI. Dicha etapa se puede realizar en cualquier momento útil, por ejemplo, entre las etapas i) y j) como se indica anteriormente.
Los procedimientos también pueden comprender una etapa de identificar un grupo de subagrupamientos que comprenden la mutación en el NOI. Dicha etapa se puede realizar en cualquier momento útil, pero con frecuencia se realiza después de la etapa c) de los procedimientos anteriores y se puede realizar, por ejemplo, como se describe en la sección "Superagrupamientos" más adelante en esta invención.
En una realización, los procedimientos de la invención se pueden resumir en 4 a 5 líneas de trabajo individuales, por ejemplo, WS1 a WS5, cada una dividida en una serie de "Etapas" individuales como se describe más adelante. Mientras que los procedimientos que comprenden, o incluso consisten en, WS1 a WS5, representan realizaciones preferidas de la invención, la invención no se limita a procedimientos que comprenden estas WSs. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender solo WS2 a WS5 y carecer de WS1. Tal procedimiento se ilustra, por ejemplo, en la Figura 1. Un ejemplo de un procedimiento que comprende WS1 a WS5 se ilustra además en la Figura 2, dividida en 5 partes, en la que:
- La Figura 2A se refiere a un ejemplo específico de WS1 en una realización de la invención, donde la especie es cebada. La figura ilustra la propagación de granos de cebada mutados, como se detalla en WS1 en esta invención. - La Figura 2B muestra un ejemplo de los aspectos de preparar una biblioteca ordenada de granos mutados, como se detalla en WS2 en esta invención (cf. Ejemplo 1 y Ejemplo 2).
- La Figura 2C proporciona un ejemplo de un resumen sobre cómo determinar si una fracción del "Total de granos" contiene grano(s) caracterizado(s) por una mutación en el NOI, como se detalla en WS3 en esta invención (cf. Ejemplo 3 a Ejemplo 7).
- La Figura 2D destaca un ejemplo de WS4, es decir, procedimientos para determinar cuál(es) del(de los) grano(s) en una fracción del "Total de granos", con dicha fracción previamente mostrada por contener granos que contienen la(s) mutación(es) en NOI(s), cf. Figura 2C, alberga la mutación en el(los) NOI(s), como se detalla en la Etapa 4 en esta invención (cf. Ejemplo 8 a Ejemplo 15).
- La Figura 2E presenta un ejemplo de una descripción general de los procedimientos en WS5 en los que se utiliza una tecnología de PCR compartimentada (por ejemplo, ddPCR) para determinar los "Superagrupamientos" de ADNg, es decir, alícuotas combinadas de muestras de ADNg (Ejemplo 17), que comprenden la mutación correspondiente a aquella en el NOI.
Nucleótido de interés (NOI)
La invención se refiere a procedimientos para la identificación de uno o más organismos que portan mutación(es) en uno o más nucleótidos de interés. En particular, los procedimientos permiten la identificación de organismo(s) que porta(n) una o más mutaciones predeterminadas en NOI(s). En consecuencia, el procedimiento permite la identificación de un organismo que porta una mutación específica, sin dejar de depender de procedimientos que no sean GM.
La mutación puede ser cualquier mutación, donde dichos uno o más NOI de interés difieren de los NOI correspondientes en una secuencia de referencia. Con frecuencia, la secuencia de referencia es una secuencia de tipo salvaje. Sin embargo, la secuencia de referencia también puede ser cualquier otra secuencia.
La mutación puede ser cualquier tipo de mutación, por ejemplo, una deleción, una inserción, una sustitución o una mezcla de las anteriores.
El(los) NOI(s) puede(n) ser un único nucleótido o varios nucleótidos y, por tanto, el(los) NOI(s) puede(n) consistir en al menos uno, tal como 1, por ejemplo 2, tal como 3, por ejemplo 4, tal como 5, por ejemplo 6, tal como 7, por ejemplo 8, tal como 9, por ejemplo 10, tal como de 10 a 20, por ejemplo de 20 a 50, tal como más de 50 nucleótidos.
En realizaciones preferidas de la invención, el NOI consiste en un único nucleótido, en cuyo caso la mutación, por ejemplo, puede ser una sustitución de un único nucleótido. Dichas mutaciones también se conocen como mutaciones puntuales.
En otras realizaciones de la invención, la mutación puede ser una deleción de dicho NOI. En otras realizaciones, la mutación puede ser una inserción de uno o más nucleótidos entre dos nucleótidos de interés.
En una realización, la secuencia de referencia es una secuencia de tipo salvaje, es decir, la secuencia de origen natural que se da con más frecuencia, y la mutación es, por tanto, una mutación en comparación con dicha secuencia de tipo salvaje.
En una realización, la mutación puede estar asociada con un rasgo deseable dentro de dicha especie. Dependiendo del tipo de especie, el rasgo deseable puede seleccionarse de entre una multitud de rasgos diferentes. En realizaciones de la invención, donde la especie es una planta domesticada, dicho rasgo podría, por ejemplo, tener viabilidad mejorada, resistencia mejorada a diversos factores ambientales, crecimiento mejorado o rendimiento mejorado. En realizaciones de la invención, donde la especie es una planta utilizada para la producción de alimentos, piensos o bebidas, el rasgo también podría relacionarse con un valor nutricional mejorado, propiedades de sabor mejoradas, propiedades de almacenamiento mejoradas o utilidad mejorada para la producción de dicho alimento, pienso o bebida.
El NOI se puede situar en cualquier secuencia diana en cualquier ácido nucleico. Con frecuencia, la secuencia diana es parte de una secuencia de ADNg. Más preferiblemente, la secuencia diana es parte de una secuencia de ADNg. Por tanto, la mutación puede ser una mutación del ADNg de dicho organismo. El NOI se puede situar en cualquier parte del ADNg, tanto en regiones codificantes como no codificantes. Con frecuencia, el NOI se puede situar en cualquier parte de un gen, por ejemplo, dentro de una región codificante (por ejemplo, dentro de un exón), en un intrón o en regiones reguladoras de un gen, por ejemplo, en promotores, terminadores y/o intrones.
Especie
Los procedimientos de la invención comprenden la identificación de un organismo de una especie predefinida. La especie puede ser cualquier especie, incluyendo organismos tanto multicelulares como unicelulares. Por ejemplo, la especie puede ser una especie contenida en el Open Tree of Life, por ejemplo, la taxonomía de referencia de The Open Tree of Life versión 2.9 borrador 12 generado el 12 de octubre de 2015.
La especie puede ser una procariota, tal como una bacteria. Los ejemplos de bacterias incluyen las utilizadas en la producción de alimentos, por ejemplo bacterias de un género seleccionado de entre el grupo que consiste en Acetobacter, Arthrobacter, Alactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium, Brachybacterium, Brevibacterium, Carnobacterium, Corynebacterium; enterococcus, Gluconacetobacter, Hafnia, Halomonas, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Macrococcus, Microbacterium, Micrococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudimonas, Psychrobacter, Staphylococcus, Streptomyces, Tetragenococcus, Weissella y Zymomonas.
La especie también puede ser una eucariota, por ejemplo, seleccionada de entre el grupo que consiste en hongos, algas, plantas y animales.
En una realización, la especie se selecciona de entre el grupo que consiste en hongos. Por tanto, la especie puede ser un organismo unicelular o multicelular. Por ejemplo, la especie puede ser un hongo de un género seleccionado de entre el grupo que consiste en Aspergillus, Candida, Cystofilobasidium, Cyberlindnera, Debaryomyces, Fusarium, Geotrichum, Issatchenkia, Kazachstania, Kloeckera, Klyveromyces, Mucor, Neurospora, Penicillium, Pichia, Rhiozopus, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulaspora, Torulopsis, Thrichosporon, Verticillium, Yarrowia y Zygotorulaspora.
En particular, la especie puede ser una levadura, tal como levadura seleccionada de entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus y Saccharomyces uvarum. Otras levaduras de interés incluyen especies de Brettanomyces y similares.
En una realización preferida de la invención, la especie es una planta. Dicha planta puede ser una planta verde, por ejemplo, una planta seleccionada de entre el grupo que consiste en plantas con flores, coníferas, gimnospermas, helechos, licopidios, antocerotes, hepáticas, musgos y algas verdes. La planta puede ser, por ejemplo, una monocotiledónea o una dicotiledónea.
En particular, la planta puede ser una planta domesticada. Dicha planta domesticada puede ser cualquier planta cultivada por seres humanos, por ejemplo, como fuente de alimento, pienso o como material crudo para la producción de artículos o con fines estéticos.
En una realización preferida de la invención, la especie es un cereal. Un "cereal", como se define en esta invención, es un miembro de la familia de plantas Graminae, cultivado principalmente por sus semillas o granos que contienen almidón. Los cereales incluyen, aunque de forma no limitativa, cebada (Hordeum), trigo (Triticum), arroz (Oryza), maíz (Zea), centeno (Secale), avena (Avena), sorgo (Sorghum) y el híbrido de trigo y centeno Triticale.
La planta también puede ser otras plantas domesticadas, incluyendo tomate.
Como se mencionó anteriormente, la especie también puede ser un animal, por ejemplo, un animal domesticado, tal como un animal seleccionado de entre el grupo que consiste en vaca, pollo, cerdo, oveja, cabra, camello, caballo, pavo, pato y conejo.
Agrupamiento de organismos
Los procedimientos de la invención comprenden proporcionar un agrupamiento de organismos de una especie dada que representa una pluralidad de genotipos. Dicha especie puede ser, por ejemplo, cualquiera de las especies descritas en esta invención anteriormente en la sección "Especie".
Por tanto, el agrupamiento de organismos comprende una pluralidad de organismos, todos los cuales pertenecen a la misma especie, pero que representan diferentes genotipos de dicha especie. El agrupamiento puede comprender más de un organismo de cada genotipo. Sin embargo, el agrupamiento debe comprender una pluralidad de organismos de diferentes genotipos. Preferiblemente, el agrupamiento comprende al menos 100, más preferiblemente al menos 1000, incluso más preferiblemente al menos 5000, aún más preferiblemente al menos 10.000, incluso más preferiblemente al menos 50.000, aún más preferiblemente al menos 100.000, por ejemplo, al menos 500.000, tal como al menos 1.000.000 de organismos, o partes reproductivas de los mismos, con genotipos diferentes.
Se prefiere que el agrupamiento de organismos comprenda un número suficiente de organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos, de modo que el agrupamiento pueda comprender teóricamente todas las mutaciones posibles en todos los genes de dicho organismo. Por ejemplo, en realizaciones de la invención, donde la especie es cebada, se cree que un agrupamiento que comprende -500.000 granos de cebada mutagenizados aleatoriamente comprenderá teóricamente todas las mutaciones posibles en todos los genes de dicha cebada (en función de la suposición de -10.000 mutaciones de una única base en un grano mutagenizado con NaN31 mM). Para mejorar la eficiencia de los procedimientos de la invención, el agrupamiento puede comprender al menos 2x, tal como al menos 3x tantos organismos, o partes reproductivas de los mismos, con genotipos diferentes de los esperados teóricamente para comprender todas las mutaciones posibles. Por tanto, el agrupamiento de organismos puede comprender al menos 500.000, tal como al menos 1.000.000, por ejemplo, al menos 1.500.000 de organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos. Este puede ser el caso, por ejemplo, en realizaciones donde la especie en cuestión es cebada.
En algunas realizaciones, el ag o l pamiento puede comprender al menos 30.000 organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos, tal como en el intervalo de 30.000 a 500.000.
En algunas realizaciones, el ag o l pamiento de organismos puede comprender al menos 5.000.000, tal como en el intervalo de 1.000.000 a 100.000.000 de organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos. Este puede ser, por ejemplo, el caso en realizaciones de la invención, donde el organismo es un organismo pequeño, por ejemplo, un organismo unicelular.
En otras realizaciones, el agrupamiento puede estar comprendido en el intervalo de 100.000 a 500.000 organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos. Este puede ser, por ejemplo, el caso en realizaciones de la invención, donde el organismo es un organismo unicelular.
Una ventaja de los procedimientos de la presente invención es que los procedimientos permiten identificar selectivamente un número muy grande de organismos de diferentes genotipos. Por tanto, el agrupamiento de organismos puede comprender un gran número de organismos de diferentes genotipos. Además, los procedimientos de la invención pueden permitir identificar un organismo con una mutación predeterminada en cualquier NOI. Con el fin de poder identificar un organismo con una mutación en cualquier NOI, esto puede requerir que el agrupamiento de organismos comprenda un gran número de genotipos diferentes, tales como los números de genotipos diferentes antes mencionados.
El agrupamiento de organismos puede obtenerse de cualquier manera útil.
En una realización, el agrupamiento de organismos se obtiene recolectando organismos individuales. Esto puede hacerse, por ejemplo, a partir de bancos de semillas (siempre que la especie sea una planta), de colecciones de células (siempre que la especie sea un organismo unicelular) o de otras colecciones de organismos. También se puede lograr recolectando organismos individuales, o muestras de dichos organismos, de cualquier otra manera.
En una realización preferida de la invención, el agrupamiento de organismos se prepara mediante mutagénesis, en particular, mediante mutagénesis aleatoria. Por tanto, una pluralidad de organismos puede someterse a mutagénesis con el fin de obtener el agrupamiento de organismos. Dicha mutagénesis puede ser, en particular, una mutagénesis aleatoria que, por ejemplo, puede realizarse como se describe más adelante.
En las realizaciones de la invención, donde el organismo es un organismo unicelular, a continuación normalmente una pluralidad de organismos intactos se someten a mutagénesis aleatoria.
En realizaciones de la invención, donde la especie es un organismo multicelular, puede ser suficiente someter una parte reproductiva de dicho organismo multicelular a dicha mutagénesis aleatoria. En tales realizaciones, ya sea una pluralidad de organismos, o una pluralidad de partes reproductivas de organismos, o una mezcla de las mismas, se somete a mutagénesis aleatoria.
En realizaciones de la invención, donde la especie es una planta, a continuación dicho agrupamiento puede comprender una pluralidad de semillas que representan una pluralidad de genotipos. Por tanto, el agrupamiento puede comprender una pluralidad de semillas, que se han sometido a mutagénesis. Sin embargo, el agrupamiento también puede comprender descendencia de semillas, que han sido sometidas a mutagénesis.
En esta invención, las semillas (por ejemplo, granos de cereal) que han sido sometidas a mutagénesis pueden denominarse generación M0. Dichas semillas, por ejemplo, granos de cereales, pueden sembrarse y permitir que se desarrollen en plantas maduras, cuyas semillas (por ejemplo, granos de cereales) se consideran de generación M1. Las semillas de generación M1 se pueden sembrar y permitir que crezcan hasta convertirse en plantas maduras, cuyas semillas se consideran de la generación M2 y así sucesivamente. Este principio se ilustra en la Figura 2A.
El grupo de organismos puede comprender semillas, por ejemplo, granos de cereales, de cualquiera de las generaciones antes mencionadas. Por tanto, el agrupamiento no contiene necesariamente semillas previamente sometidas a mutagénesis directa. El agrupamiento de organismos también puede comprender semillas, por ejemplo, granos de cereales, de generación M1, M2 o M3.
Dicha mutagénesis aleatoria se puede realizar de cualquier manera útil, por ejemplo, por irradiación o tratamiento químico. La irradiación puede ser irradiación UV, irradiación de rayos X o irradiación radiactiva. La mutagénesis química puede ser un tratamiento con cualquier producto químico mutagenizante, por ejemplo, un producto químico seleccionado de entre el grupo que consiste en azida de sodio (NaN3), agentes alquilantes, tales como N-etil-N-nitrosourea (ENU), metilnitrosoguanidina (MNNG) y metanosulfonato de etilo (EMS) o los agentes alquilantes mencionados más adelante. NaN3, ENU y EMS se utilizan a menudo para generar mutantes al azar. MNNG y EMS se utilizan con frecuencia para preparar cultivos de levadura mutagenizados aleatoriamente.
Para inducir mutaciones aleatorias en el ADNg de una planta, los granos o los tejidos vegetativos de plantas regenerables pueden tratarse con un mutágeno o una mezcla de mutágenos, incluyendo, aunque de forma no limitativa, agentes alquilantes tales como: sulfonatos, por ejemplo, sulfonato de etilmetano (EMS), dietil sulfonato (DES); mostazas de azufre, por ejemplo, sulfuro de etil-2-cloroetilo; mostazas nitrogenadas, por ejemplo, 2-cloroetildimetilamina, y; epóxidos, por ejemplo, óxido de etileno. Otros son etilenimina, hidroxilamina (NH2OH), N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), NaN3 y diazometano. Los tejidos o granos tratados pueden a continuación propagarse para generar organismos de progenie. Dicha mutagénesis aleatoria puede usarse con plantas, tales como plantas de cultivo, incluyendo cereales, aunque de forma no limitativa, trigo, maíz, arroz, sorgo y mijo, y plantas de cultivo dicotiledóneas, incluyendo, aunque de forma no limitativa, semillas de colza, algodón, soja y remolacha.
Los procedimientos de la invención no están restringidos a ningún tipo particular de mutagénesis. Por tanto, se puede usar cualquier tipo de mutagénesis, tal como cualquier forma de mutagénesis aleatoria.
En una realización de la invención, a continuación el agrupamiento de organismos puede prepararse como se describe en esta invención más adelante en la sección "WS1" de los Ejemplos. En realizaciones de la invención, donde la especie es cebada, el agrupamiento de organismos puede prepararse como se describe en esta invención más adelante en la sección "WS1" de los Ejemplos en relación con la cebada. El experto en la materia será capaz de adaptar los procedimientos descritos en WS 1 para su uso con otras plantas con flores, incluyendo otras plantas de cereales. En realizaciones de la invención, donde la especie es levadura, el agrupamiento de organismos puede prepararse como se describe en esta invención más adelante en la sección "WS1" de los Ejemplos en relación con la levadura. El experto en la materia será capaz de adaptar los procedimientos descritos en WS1 para su uso con otros organismos unicelulares.
División de un agrupamiento de organismos en subagrupamientos
Los procedimientos de la invención comprenden una etapa de dividir el agrupamiento de organismos en uno o más subagrupamientos, donde cada subagrupamiento comprende una pluralidad de organismos, o partes reproductivas de los mismos. Preferiblemente, cada subagrupamiento comprende una pluralidad de organismos, o partes reproductivas de los mismos, que representan una pluralidad de genotipos.
Usualmente, el agrupamiento se divide en una pluralidad de subagrupamientos, preferiblemente en al menos 5 subagrupamientos, más preferiblemente en al menos 10 subagrupamientos, incluso más preferiblemente en al menos 30 subagrupamientos, aún más preferiblemente en al menos 50 subagrupamientos, incluso más preferiblemente en al menos 70 subagrupamientos, aún más preferiblemente en al menos 90 subagrupamientos.
En algunas realizaciones, el agrupamiento se divide en al menos 500, tal como al menos 1000, por ejemplo, al menos 1500 subagrupamientos. Este puede ser, en particular, el caso en realizaciones de la invención, donde el agrupamiento comprende un gran número de organismos de diferente genotipo.
En principio, no existe un límite superior para el número de subagrupamientos. Normalmente, sin embargo, el grupo se divide en un máximo de 50.000, tal como un máximo de 25.000, por ejemplo, un máximo de 10.000 subagrupamientos.
En algunas realizaciones, el agrupamiento se divide en el intervalo de 90 a 500 subagrupamientos.
Cada subagrupamiento comprende preferiblemente una pluralidad de organismos, o partes reproductivas de los mismos, que representan una pluralidad de genotipos. Preferiblemente, cada subagrupamiento comprende al menos 10, más preferiblemente al menos 100, incluso más preferiblemente al menos 500, aún más preferiblemente al menos 1000, incluso más preferiblemente al menos 5000, aún más preferiblemente al menos 10.000, por ejemplo, al menos 50.000, tal como al menos 100.000 organismos, o partes reproductivas de los mismos, con genotipos diferentes. En algunas realizaciones, cada subagrupamiento comprende en el intervalo de 2000 a 10.000, tal como en el intervalo de 3000 a 5000 organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos.
En algunas realizaciones, cada subagrupamiento comprende en el intervalo de 1000 a 2000 organismos, o partes reproductivas de los mismos, que representan diferentes genotipos.
Los subagrupamientos se pueden ordenar de cualquier forma deseada. Si un agrupamiento comprende una pluralidad de organismos del mismo genotipo, se prefiere que la mayoría de los organismos, o incluso todos los organismos del mismo genotipo, estén contenidos dentro del mismo subagrupamiento. Esto se puede asegurar de múltiples maneras dependiendo de la especie, por ejemplo, como se describe más adelante. En realizaciones de la invención, donde el agrupamiento de organismos, o partes reproductivas de los mismos, se prepara mediante mutagénesis aleatoria, puede preferirse que dicho agrupamiento se divida de tal manera que toda la descendencia de un organismo de dicho agrupamiento o parte reproductiva del mismo, se comprenda dentro de un subagrupamiento.
Por ejemplo, el agrupamiento puede dividirse en subagrupamientos, y dichos subagrupamientos pueden someterse a una etapa de reproducción. También es posible que la etapa de reproducción se realice simultáneamente con la etapa de dividir el agrupamiento en subagrupamientos de una manera que permita que la descendencia de un único organismo, o parte reproductiva del mismo, acabe en el mismo subagrupamiento.
También se prefiere que cada subagrupamiento comprenda más de un organismo, o parte reproductiva del mismo, de cada genotipo. Esto puede asegurarse de diferentes maneras. Por ejemplo, los subagrupamientos pueden someterse a una etapa de reproducción que permita la formación de descendencia de cada organismo, o parte reproductiva del mismo, de dicho subagrupamiento. En particular, se prefiere que cada subagrupamiento comprenda suficientes organismos de cada genotipo con el fin de dividir aleatoriamente el subagrupamiento en 2, 3 o 4 partes de tal manera que cada parte, teóricamente, comprenda organismos (o partes reproductivas de los mismos), que representan cada genotipo del subagrupamiento. Por tanto, se prefiere que cada subagrupamiento comprenda al menos 5, preferiblemente al menos 10, incluso más preferiblemente al menos 15 organismos que representan cada genotipo. Este puede ser, en particular, el caso en realizaciones de la invención, donde la especie es una planta, por ejemplo, un cereal. En realizaciones de la invención, donde la especie es un organismo unicelular, entonces puede preferirse que cada subagrupamiento comprenda muchos más organismos de cada genotipo, por ejemplo, al menos 100, tal como al menos 1000, por ejemplo, al menos 10.000.
En la Figura 1A se proporciona un ejemplo de un procedimiento de división del agrupamiento en subagrupamientos.
En realizaciones de la invención, donde la especie es un organismo unicelular, y el agrupamiento se prepara mutagenizando una pluralidad de organismos unicelulares, los subagrupamientos pueden, por ejemplo, prepararse de la siguiente manera:
- Después de la mutagénesis, se puede permitir que cada organismo unicelular se multiplique de manera separada de modo que cada organismo unicelular se desarrolle en un cultivo clonal. Esto se puede hacer cultivando colonias de cada clon en un medio sólido o cultivando cada clon en espacios separados, por ejemplo, en tubos o pocillos, con medio líquido. El subagrupamiento puede formarse combinando organismos unicelulares de una pluralidad de clones. - Los organismos unicelulares se pueden dividir en subagrupamientos inmediatamente después de la mutagénesis, y se puede permitir que cada subagrupamiento se reproduzca.
Por tanto, los procedimientos pueden comprender las etapas de:
-Proporcionar una pluralidad de organismos unicelulares, por ejemplo, levadura;
- Someter dichos organismos a mutagénesis aleatoria;
- Dividir los organismos mutagenizados en subagrupamientos;
- Someter cada subagrupamiento a una etapa de reproducción.
Dicha etapa de reproducción puede comprender incubar cada subagrupamiento en medio de cultivo en condiciones que permitan el crecimiento de dicho organismo. Por ejemplo, la etapa puede implicar incubar los subagrupamientos en medio de cultivo durante un intervalo de 1 a 5 días a una temperatura que permita el crecimiento de dicho organismo.
En realizaciones de la invención, donde la especie es una planta, entonces el subagrupamiento se puede preparar de tal manera que todas las semillas de una planta en particular estén contenidas dentro de un subagrupamiento. Por tanto, en una realización de la divulgación, los procedimientos comprenden las etapas de:
- Proporcionar una pluralidad de semillas de una planta, por ejemplo, granos de cereales;
- Mutagenizar dichas semillas, obteniendo así semillas de generación M0;
- Hacer crecer dichas semillas de generación M0 en plantas maduras y obtener semillas de dichas plantas maduras, donde dichas semillas son semillas de generación M1;
- Opcionalmente repetir la etapa anterior X veces para obtener plantas que comprendan semillas de generación M(1+X);
- Obtener semillas de generación M1 o M(1+X) de dichas plantas maduras, obteniendo así un agrupamiento de semillas (por ejemplo, un agrupamiento de granos de cereales);
- Dividir dicho agrupamiento en subagrupamientos, donde todas las semillas (por ejemplo, granos de cereales) de una planta madura dada se sitúan en el mismo subagrupamiento.
Estas etapas se ilustran en la Figura 2A y 2B utilizando cebada como ejemplo. El procedimiento puede comprender las etapas ilustradas en la Figura 2A y 2B. Las etapas ilustradas en la Figura 2A y 2B se pueden realizar utilizando cualquier planta con flores y, por tanto, no se limitan a la cebada. Asimismo, las etapas ilustradas en la Figura 2A y 2B se pueden realizar utilizando cualquier número de plantas mutadas (los números proporcionados en la figura son meramente un ejemplo).
Por consiguiente, el procedimiento puede comprender las etapas de:
- Proporcionar una pluralidad de semillas de plantas, por ejemplo, granos de cereales;
- Mutagenizar dichas semillas, obteniendo así semillas de generación M0;
- Opcionalmente cultivar dichas semillas de generación M0 en plantas maduras y obtener semillas de dichas plantas maduras, donde dichas semillas son semillas de generación M1;
- Opcionalmente repetir la etapa anterior X veces para obtener plantas que comprendan semillas de generación M(1+X);
- Cultivar semillas de generación M0, M1 o M(1+X) en parcelas de campo discretas en plantas maduras, donde las semillas de dichas plantas maduras constituyen el agolpamiento de semillas;
- Dividir dichas áreas en subparcelas de campo;
- Recoger todas las semillas de todas las plantas dentro de una subparcela de campo, obteniendo así un subagrupamiento de semillas (por ejemplo, un subagrupamiento de granos de cereales), que puede denominarse "Total de granos" (cf. Figura 2B).
En lugar de cultivar semillas en parcelas de campo, éstas pueden cultivarse de cualquier manera útil para permitir la división de las plantas en subgrupos, obteniendo por tanto subagrupamientos. Por ejemplo, las semillas se pueden cultivar en recipientes separados, comprendiendo cada uno una o más plantas. Las semillas también se pueden cultivar en un invernadero.
Un ejemplo de un procedimiento de división de un agrupamiento en un subagrupamiento se describe en esta invención más adelante en WS2.
Identificación de subagrupamientos
Los procedimientos de la invención comprenden las etapas de dividir un agrupamiento de organismos, o partes reproductivas de los mismos, en subagrupamientos. A esto le sigue una etapa de identificar un subagrupamiento que comprende un organismo, o partes reproductivas del mismo, que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s).
La identificación de dicho subagrupamiento puede comprender las etapas de:
a) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento, que, por ejemplo, puede realizarse como se describe en esta invención más adelante en la sección "Preparación de muestras de ADN";
b) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, por ejemplo, realizado según lo descrito en esta invención más adelante en la sección "Amplificación por PCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas";
c) Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s) de interés, identificando así dicho(s) subagrupamiento(s), por ejemplo, realizado según lo descrito en esta invención más adelante en la sección "Detección de producto(s) de amplificación por PCR".
El subagrupamiento puede, por ejemplo, identificarse directamente siempre que el(los) producto(s) de amplificación por PCR comprenda(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s) que puede(n) detectarse directamente después o durante la amplificación por PCR. Esto puede hacerse, por ejemplo, si el(los) producto(s) de amplificación por PCR comprende(n) medios de detección que dan lugar a una o más señales detectables, siempre que el(los) producto(s) de amplificación por PCR comprenda(n) la(s) secuencia(s) diana que comprende(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). Dichos medios de detección se describen con más detalle más adelante en la sección "Detección de producto(s) de amplificación por PCR", y pueden ser, por ejemplo, sondas de detección de mutación.
En la Figura 1B se ilustra un ejemplo de un procedimiento de identificación de un subagrupamiento que comprende una o más mutaciones específicas, y se destacan las siguientes etapas:
- Proporcionar un subagrupamiento;
- Preparar una muestra de una parte de dicho subagrupamiento;
- Preparar una muestra de ADNg a partir de dicha muestra;
- Preparar amplificaciones de PCR con la totalidad de las muestras de ADNg individuales de la totalidad de los subagrupamientos, por ejemplo, en pocillos individuales de una placa, por ejemplo, en placas de microtitulación; - Seleccionar aquellas muestras que comprenden la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s).
En la Figura 2C se muestra un ejemplo más específico de un procedimiento para identificar un subagrupamiento. En este ejemplo, la especie pertenece al grupo de las plantas de cereales. Los números específicos proporcionados en la Figura 2c son solo ejemplos, y el experto en la materia comprenderá que el procedimiento se puede realizar usando otra cantidad de granos. Por ejemplo, la identificación de un subagrupamiento que comprende la mutación en el NOI se puede realizar como se indica en WS3 en esta invención más adelante.
Preparación de muestras de ADN
Los procedimientos de la invención comprenden una o más etapas de preparar muestras de ADN, en particular muestras de ADNg. En particular, los procedimientos pueden comprender una etapa de preparar muestras de ADNg de un subagrupamiento y una etapa de preparar muestras de ADNg de un subagrupamiento secundario. Los procedimientos también pueden comprender una etapa de preparar muestras de ADNg a partir de un superagrupamiento.
En general, dichas muestras de ADNg se preparan de manera que la muestra de ADNg en teoría comprenda ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento, subagrupamiento secundario o superagrupamiento, mientras se mantiene el potencial de reproducción de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento, subagrupamiento secundario o superagrupamiento.
Esto puede asegurarse de diferentes maneras. Por ejemplo, se puede preferir que cada subagrupamiento y superagrupamiento comprenda más de un organismo individual, o partes reproductivas del mismo, de cada genotipo. En particular, puede ser preferido que cada subagrupamiento o superagrupamiento comprenda suficientes organismos de cada genotipo con el fin de ser capaz de dividir aleatoriamente el subagrupamiento o el superagrupamiento en 2, 3 o 4 partes de tal manera que cada parte comprenda en teoría organismos, o partes reproductivas de los mismos, que representen cada genotipo del subagrupamiento o superagrupamiento.
De esa manera, una parte de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, del subagrupamiento o superagrupamiento, por ejemplo, en el intervalo de 10 a 90 %, preferiblemente en el intervalo de 10 a 50 %, tal como en el intervalo de 25 a 50 % de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, de cada subagrupamiento o cada superagrupamiento puede usarse para preparar la muestra de ADNg. Dicha parte de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, también se denomina en esta invención "muestra de organismos". El resto de los organismos del subagrupamiento puede almacenarse en condiciones que mantengan el potencial reproductivo de dichos organismos o partes reproductivas de los mismos. En realizaciones, donde el organismo es una planta, puede ser suficiente almacenar semillas de dichas plantas. Las semillas, por ejemplo, los granos de cereales, pueden almacenarse con frecuencia en cualquier lugar seco y oscuro. En realizaciones de la invención donde el organismo es un organismo unicelular, puede preferirse congelar dicho organismo, por ejemplo, en presencia de un crioprotector, tal como glicerol.
De manera similar, cada uno de dicho subagrupamiento secundario puede comprender más de un organismo individual, o partes reproductivas del mismo, de cada genotipo. Por tanto, una parte de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, del subagrupamiento secundario, por ejemplo, en el intervalo de 10 a 90 %, preferiblemente en el intervalo de 40 a 60 %, tal como en el intervalo de 25 a 50 % de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, de cada subagrupamiento secundario puede usarse para preparar la muestra de ADNg. Sin embargo, en algunas realizaciones, en particular cuando la especie es un organismo más grande, entonces puede preferirse que la muestra de ADNg del subagrupamiento secundario se prepare a partir de una muestra de una parte de cada organismo, o parte reproductiva del mismo, como se describe más adelante.
También está comprendido dentro de la invención que la muestra de ADNg puede prepararse a partir de una muestra obtenida de cada organismo, o parte reproductiva del mismo, de un subagrupamiento, de un subagrupamiento secundario o de un superagrupamiento. Por ejemplo, está comprendido dentro de la invención que cada subagrupamiento, superagrupamiento y subagrupamiento secundario puede comprender solo uno o unos pocos organismos, o partes reproductivas de los mismos, de cada genotipo. En dichas realizaciones, la muestra de ADNg se puede preparar a partir de una muestra obtenida de cada organismo, o parte reproductiva del mismo. En general, solo es posible obtener una muestra de cada organismo en realizaciones de la invención, donde la especie tiene un tamaño suficiente para obtener dicha muestra. Esto puede, en particular, ser relevante en realizaciones de la invención donde la especie es un animal o una planta, tal como una planta con flores.
Mientras que el subagrupamiento y el superagrupamiento comprenden preferiblemente varios organismos individuales, o partes reproductivas de los mismos, de cada genotipo, como se indica en esta invención en otra parte, entonces el subagrupamiento secundario con frecuencia puede comprender solo unos pocos, a veces incluso solo uno, organismos individuales, o partes reproductivas de los mismos, de cada genotipo. Por tanto, en realizaciones de la invención, donde la especie es una planta (por ejemplo, un cereal), se prefiere que la muestra de ADNg del subagrupamiento secundario se prepare obteniendo una muestra de cada organismo individual y preparando muestras de ADNg a partir de dichas muestras.
Cuando se obtienen muestras de cada organismo, o partes reproductivas del mismo, se prefiere que las muestras se obtengan de una manera que no perjudique significativamente a dichos organismos, o parte reproductiva de los mismos, con respecto al potencial de reproducción. Por tanto, preferiblemente, la muestra comprende o consiste en una parte del organismo, o parte reproductiva del mismo, que no es esencial para la reproducción. La muestra se puede obtener de cualquier manera útil dependiendo de la especie, por ejemplo, mediante biopsia, corte, perforación, raspado, desgarro o aplicando una jeringa equipada con una aguja.
A modo de ejemplo, en realizaciones donde la especie es un cereal y donde el subagrupamiento, superagrupamiento o subagrupamiento secundario comprende granos de cereales, entonces dicha muestra comprende preferiblemente una parte del grano de cereal, que no es esencial para la reproducción. La muestra se puede obtener de diferentes maneras, por ejemplo, cortando parte(s) del grano con cualquier instrumento afilado, tal como un cuchillo, escalpelo o tijeras, raspando parte del grano, o se puede obtener perforando un agujero en el grano. En este último caso, la muestra puede ser la harina obtenida tras la perforación.
Una vez que la muestra de organismos, o la muestra obtenida de los organismos, o partes de los mismos, está disponible (en esta invención también denominada colectivamente "muestra"), la muestra de ADNg puede prepararse a partir de dichas muestras de cualquier manera útil. Si dichas muestras contienen estructuras grandes, por ejemplo, semillas enteras, la primera etapa para preparar una muestra de ADNg implicará típicamente dividir dichos contenidos de dicha muestra en partes más pequeñas, por ejemplo, por medios físicos, por ejemplo, por trituración o molienda. Los procedimientos de preparación de la muestra de ADNg generalmente comprenden las etapas de romper las células y/o tejidos, por ejemplo, por detergente, por enzimas (por ejemplo, liticasa), por ultrasonidos o por combinaciones de los mismos, creando así un lisado crudo. Dicho lisado puede separarse de cualquier desecho restante por cualquier medio útil. El lisado crudo puede constituir la muestra de ADNg. Alternativamente, el ADNg se puede purificar aún más, por ejemplo, separando dicho ADNg del resto del lisado, por ejemplo, uniéndolo a una matriz selectiva, centrifugación, centrifugación en gradiente y/o precipitación (por ejemplo, utilizando un agente de precipitación, tal como una sal, un alcohol o perlas magnéticas). Antes de dicha separación, otros componentes del lisado, incluyendo proteínas y/o nucleoproteínas, pueden desnaturalizarse o destruirse, por ejemplo, mediante el uso de enzimas y/o agentes de desnaturalización. Se pueden eliminar otras moléculas que contienen ARN, por ejemplo, con la ayuda de enzimas. Los procedimientos útiles para preparar muestras de ADNg se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning - Laboratory Manual, ISBN 978-1-936113-42-2.
Amplificación por PCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas
Los procedimientos de la invención comprenden una etapa de realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una muestra de ADNg de un subagrupamiento (por ejemplo, preparado según lo descrito en las secciones anteriores), amplificando así la secuencia diana. Cada amplificación por PCR puede comprender una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, comprendiendo cada una parte de dicha muestra de ADNg, uno o más conjuntos de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR.
La reacción de PCR completa que comprende una pluralidad de amplificaciones de PCR compartimentadas se puede preparar de varias maneras diferentes. En una realización, la amplificación por PCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas se puede llevar a cabo como una amplificación por PCR digital (dPCR, por sus siglas en inglés). Cualquier amplificación por dPCR conocida por el experto en la materia puede usarse con la invención. En general, se preparará al menos una amplificación por dPCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas para cada muestra de ADNg preparada. Por tanto, se preparará por subagrupamiento al menos una amplificación por dPCR que comprenda una pluralidad de amplificaciones por dPCR compartimentadas.
En general, la amplificación por dPCR compartimentada se prepara en un procedimiento que comprende las etapas de:
- Preparar una amplificación por dPCR que comprenda la muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR;
- Particionar dicha amplificación por dPCR de modo que las moléculas de ácido nucleico dentro de la muestra se localicen y concentren dentro de una pluralidad de compartimentos espacialmente separados;
- Realizar una amplificación por dPCR;
- Detectar productos de amplificación basados en dPCR.
Dichos compartimentos separados pueden ser cualquier compartimento separado en el que se puedan realizar amplificaciones por PCR. Por ejemplo, puede ser un pocillo de una placa, por ejemplo, un pocillo de una placa de micropocillos o una placa de microtitulación, pueden ser cámaras microfluídicas, pueden ser capilares, puede ser la fase dispersa de una emulsión, o puede ser una gota o cámaras miniaturizadas de un conjunto de cámaras miniaturizadas. Los compartimentos separados también pueden ser puntos discretos sobre un soporte sólido, por ejemplo, superficies discretas de unión a ácido nucleico.
Por lo general, se prefiere que la muestra de ADNg se distribuya aleatoriamente en las muestras para la amplificación por dPCR compartimentada. También se prefiere que cada amplificación de dPCR compartimentada comprenda solo un pequeño número de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia diana. Debido a la naturaleza de la distribución aleatoria, puede haber alguna variación en el número de moléculas de ácido nucleico comprendidas en cada amplificación por dPCR compartimentada. En una realización, cada amplificación por dPCR compartimentada comprende, en promedio, como máximo 10, tal como máximo 5 moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia diana.
En una realización preferida de la invención, la amplificación por dPCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por p Cr compartimentadas es una reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas (ddPCR). La ddPCR es un procedimiento para realizar la dPCR que se basa en la tecnología de gotas de emulsión de agua-aceite. La amplificación por PCR se fracciona en una pluralidad de microgotas, y la amplificación por PCR de la secuencia diana se produce en cada gota individual. En general, la tecnología ddPCR utiliza reactivos de PCR y líneas de trabajo similares a las que se utilizan para realizar PCRs convencionales. Por tanto, la partición de la amplificación por PCR es un aspecto clave de la técnica ddPCR.
En consecuencia, las amplificaciones por ddPCR compartimentadas pueden estar contenidas en gotas, que pueden, por ejemplo, incluir composiciones de emulsión o mezclas de dos o más fluidos inmiscibles (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. N.° 7.622.280 o como se describe en los ejemplos en esta invención más adelante). Las gotas pueden ser generadas por dispositivos descritos en el documento WO/2010/036352. En particular, las gotas se pueden preparar usando un generador de gotas, por ejemplo, el QX200 Droplet Generator disponible de Bio-Rad Laboratories, Ee . UU. (en lo sucesivo abreviado Bio-Rad). El término emulsión, como se usa en esta invención, se puede referir a una mezcla de líquidos inmiscibles (tales como aceite y agua). Las emulsiones pueden ser, por ejemplo, gotas de agua en aceite, por ejemplo, como se describe en [Hindson, BJ y col. (2011). High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem 83: 8604-8610]. Las emulsiones pueden por tanto comprender gotas acuosas en una fase oleosa continua. Las emulsiones pueden ser también emulsiones de aceite en agua, donde las gotas son gotas de aceite en una fase continua acuosa. Las gotas usadas en esta invención normalmente están diseñadas para impedir la mezcla entre compartimentos, con el contenido de un compartimento individual no solo siendo protegido de la evaporación, sino también de la coalescencia con los contenidos de otros compartimentos. Por tanto, cada gota puede considerarse como un compartimento espacialmente separado.
Cada gota para ddPCR puede tener cualquier volumen útil. Preferiblemente, sin embargo, las gotas tienen un volumen en el intervalo de nl. En consecuencia, se prefiere que el volumen de gotas, en promedio, esté en el intervalo de 0,1 a 10 nl.
Se sabe que los procedimientos microfluídicos para producir gotas de emulsión que usan el enfoque de flujo cruzado a través de microcanales o la agitación física producen emulsiones monodispersas o polidispersas. Las gotas pueden ser gotas monodispersas. También, las gotas se pueden generar de tal manera que los tamaños de las gotas novarían en más de ±5 % del tamaño promedio de las gotas. En algunos casos, las gotas se generan de tal manera que los tamaños de las gotas solo varían con ±2 % del tamaño promedio de las gotas.
La estabilidad mecánica superior puede ser útil para las manipulaciones microfluídicas y el procesamiento fluídico de cizallamiento superior (por ejemplo, en capilares microfluídicos o mediante giros de 90°, tal como válvulas en las trayectorias fluídicas). Las gotas o cápsulas pre- y postratadas térmicamente pueden ser mecánicamente estables a las manipulaciones y la centrifugación de pipetas estándar.
Se puede formar una gota haciendo fluir una fase oleosa a través de una muestra acuosa. La fase acuosa puede comprender, o consistir, en componentes en una amplificación por PCR, por ejemplo, una amplificación por PCR que comprende la muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de p Cr , tales como cualquiera de los reactivos de PCR descritos en esta invención más adelante en la sección "Reactivos de PCR".
La fase oleosa puede comprender un aceite base fluorado, que puede estabilizarse adicionalmente mediante la combinación con un tensioactivo fluorado, tal como un poliéter perfluorado. En algunos casos, el aceite base puede ser uno o más de HFE 7500, FC-40, FC-43, FC-70 u otro aceite fluorado común. En algunos casos, el tensioactivo aniónico es Ammonium Krytox (Krytox-AM), la sal de amonio de Krytox FSH o el derivado de morfolino de Krytox-FSH.
La fase oleosa puede comprender además un aditivo para ajustar las propiedades del aceite, tales como la presión de vapor, viscosidad o tensión superficial. Los ejemplos no limitativos incluyen perfluorooctanol y 1H,1H,2H,2H-perfluorodecanol. La fase oleosa también puede ser un aceite generador de gotas, por ejemplo, el Droplet Generation Oil disponible en Bio-Rad.
La emulsión se puede formular para producir gotas muy monodispersas que tienen una película interfacial similar a un líquido que se puede convertir mediante calentamiento en microcápsulas que tienen una película interfacial similar a un sólido; tales microcápsulas pueden comportarse como biorreactores que retienen sus contenidos a través de un procedimiento de reacción, tal como la amplificación por PCR. La conversión a la forma de microcápsulas se puede producir tras el calentamiento. Por ejemplo, tal conversión se puede producir a una temperatura superior a 50, 60, 70, 80, 90, o 95°C. En algunos casos, este calentamiento se produce usando un termociclador. Durante el procedimiento de calentamiento, se puede usar un revestimiento de fluido o aceite mineral para impedir la evaporación.
En algunos casos, la gota se genera utilizando un generador de gotas disponible comercialmente, tal como el QX100™ Droplet Generator de Bio-Rad o el QX200™ Droplet Generator de Bio-Rad. La ddPCR y la detección posterior pueden llevarse a cabo utilizando un lector de gotas disponible comercialmente, tal como el QX100 o QX200™ Droplet Reader de Bio-Rad.
Cada amplificación por PCR se puede compartimentar en cualquier número adecuado de compartimentos. Sin embargo, en una realización preferida de la invención, cada amplificación por PCR se compartimenta en el intervalo de 1000 a 100.000 compartimentos (por ejemplo, gotas). Por ejemplo, cada amplificación por PCR puede compartimentarse en el intervalo de 10.000 a 50.000 compartimentos (por ejemplo, gotas). Por ejemplo, cada amplificación por PCR puede compartimentarse en el intervalo de 15.000 a 25.000 compartimentos (por ejemplo, gotas). Además, cada amplificación por PCR puede compartimentarse en aproximadamente 20.000 compartimentos (por ejemplo, gotas).
Reactivos de PCR
El procedimiento abarca la realización de varias amplificaciones por PCR, donde al menos algunas de estas PCRs pueden comprender una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas.
Independientemente de si dicha PCR comprende amplificaciones por PCR compartimentadas o no, a continuación las amplificaciones por PCR comprenderán en general una muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR. Dichos reactivos de PCR pueden ser cualquiera de los reactivos de PCR descritos en esta invención en esta sección.
Los reactivos de PCR comprenden, en general, al menos nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico. Los nucleótidos pueden ser moléculas de desoxirribonucleótido trifosfato, y preferiblemente los reactivos de PCR comprenden al menos dATP, dCTP, dGTP y dTTP. En algunos casos, los reactivos de PCR también comprenden dUTP.
La polimerasa de ácido nucleico puede ser cualquier enzima capaz de catalizar la polimerización de nucleótidos dependiente del molde, es decir, la replicación. La polimerasa de ácido nucleico debe tolerar las temperaturas utilizadas para la amplificación por PCR y debe tener actividad catalítica a la temperatura de elongación. El experto en la materia conoce varias polimerasas de ácido nucleico termoestables.
En algunas realizaciones de la invención, la polimerasa de ácido nucleico tiene actividad nucleasa 5'-3' y, por tanto, puede usarse en la reacción de amplificación con una sonda TaqMan®.
La polimerasa de ácido nucleico puede ser ADN polimerasa I de Escherichia coli. La polimerasa de ácido nucleico también puede ser ADN polimerasa Taq, que tiene una hebra dependiente de la síntesis de ADN que reemplaza la actividad exonucleasa 5'-3'. Otras polimerasas que tienen actividad nucleasa 5'-3' incluyen, aunque de forma no limitativa, ADN polimerasa rTth. La ADN polimerasa Taq, por ejemplo, obtenida en New England Biolabs, puede incluir ADN polimerasa CrimonLngAmp® Taq, ADN polimerasa Crimson Taq, Hemo KlenTaq™, o LongAmp®Taq.
En algunos casos, la polimerasa de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN polimerasa de E. coli, fragmento de Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa T7, ADN polimerasa t 4, polimerasa Taq, ADN polimerasa Pfu, ADN polimerasa Vent, bacteriófago 29, REDTaq™, ADN polimerasa genómica o secuenasa. Las ADN polimerasas se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 20120258501.
Además, los reactivos de PCR pueden comprender sales, tampones y medios de detección. El tampón puede ser cualquier tampón útil, por ejemplo, TRIS. La sal puede ser cualquier sal útil, por ejemplo, cloruro de potasio, cloruro de magnesio o acetato de magnesio o sulfato de magnesio.
Los reactivos de PCR pueden comprender un agente de bloqueo no específico, tal como BSA, gelatina de piel bovina, beta-lactoglobulina, caseína, leche en polvo, ADN de esperma de salmón u otros agentes de bloqueo comunes.
Los reactivos de PCR también pueden comprender bioconservadores (por ejemplo, NaN3), potenciadores de PCR (por ejemplo, betaína, trehalosa, etc.) e inhibidores (por ejemplo, inhibidores de RNasa). Otros aditivos pueden incluir dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, betaína (mono)hidratada, trehalosa, trifosfato de 7-desaza-2'-desoxiguanosina (7-desaza-2'-dGTP), albúmina sérica bovina (BSA), formamida (metanamida), cloruro de tetrametilamonio (TMAC), otros derivados de tetraalquilamonio [por ejemplo, cloruro de tetraetilamonio (TEA-Cl)]; cloruro de tetrapropilamonio (TPrA-Cl) o detergente no iónico, por ejemplo, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (Np -40) o PREXCEL-Q.
Es más, los reactivos de PCR también pueden comprender uno o más medios para la detección de producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). Dichos medios pueden ser cualquier medio detectable, y pueden añadirse como compuestos individuales o asociarse con, o incluso unirse covalentemente a, uno de los cebadores. Los medios detectables incluyen, aunque de forma no limitativa, colorantes, compuestos radiactivos, compuestos bioluminiscentes y fluorescentes. En una realización preferida de la invención, el medio para la detección es una o más sondas. Por tanto, se prefiere que el reactivo de PCR comprenda una o más sondas de detección, por ejemplo, cualquiera de las sondas descritas en esta invención más adelante en la sección "Detección de producto(s) de amplificación por PCR".
Cebadores que flanquean la secuencia diana
Los procedimientos de la invención implican el uso de uno o más conjuntos de cebadores que flanquean la secuencia diana. Un "conjunto de cebadores" discreto que flanquea una secuencia diana incluye un cebador que comprende una secuencia idéntica al extremo 5' de la secuencia diana (también denominado "cebador directo") y un cebador que comprende una secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia diana (también denominado "cebador inverso"). El conjunto de cebadores es capaz de amplificar la secuencia diana cuando se añade a una PCR junto con un ácido nucleico que comprende la secuencia diana y reactivos de PCR en condiciones que permiten la amplificación de dicha secuencia diana. El mismo conjunto de cebadores se puede usar para todas las amplificaciones por PCR de los procedimientos según la invención, aunque también es posible que se usen diferentes conjuntos de cebadores para las amplificaciones por PCR de las diferentes etapas de la invención.
Además de la secuencia idéntica al extremo 5' de la secuencia diana, el cebador directo puede comprender secuencias adicionales. De forma similar, además de la secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia diana, el cebador inverso puede comprender secuencias adicionales. Por ejemplo, los cebadores pueden contener en el extremo 5' una secuencia de ácido nucleico adicional, que no se hibrida con un ácido nucleico diana, pero que facilita la manipulación del cebador o del producto de amplificación por PCR, por ejemplo, la detección de dicho producto.
La longitud del cebador directo y el cebador inverso puede depender de la secuencia de la secuencia diana. Por ejemplo, la longitud de los cebadores se puede ajustar para lograr una temperatura de fusión deseable, Tm, de los cebadores. Por tanto, la longitud del cebador directo y del cebador inverso puede estar, individualmente, en el intervalo de 10 a 100 nucleótidos, por ejemplo en el intervalo de 10 a 50 nucleótidos, tal como en el intervalo de 15 a 20 nucleótidos, tal como en el intervalo de 15 a 25 nucleótidos, tal como en el intervalo de 15 a 30 nucleótidos, tal como en el intervalo de 15 a 40 nucleótidos, tal como en el intervalo de 15 a 45 nucleótidos, tal como en el intervalo de 15 a 50 nucleótidos de longitud. La Tm del cebador directo y del cebador inverso se ajusta normalmente en el intervalo de 40 a 70°C.
La concentración de cebadores dentro de la fase acuosa de las amplificaciones por PCR puede, por ejemplo, estar en el intervalo de 0,05 a 2,0 pM, tal como en el intervalo de 0,1 a 1,0 pM, tal como en el intervalo de 0,2 a 1,0 pM, tal como en el intervalo de 0,3 a 1,0 pM, tal como en el intervalo de 0,4 a 1,0 pM o en el intervalo de 0,5 a 1,0 pM.
El cebador directo y el cebador inverso en general comprenden, o incluso consisten, en oligonucleótidos. Sin embargo, en algunos casos, los cebadores pueden comprender análogos de nucleótidos. Los expertos en la materia conocen numerosos análogos de nucleótidos e incluyen derivados, donde se modifica un azúcar, como en derivados de 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y 2',3'-didesoxinucleósido, análogos de ácido nucleico basados en otras cadenas principales de azúcar, tales como treosa, ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés), derivados de LNA, ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico de glicol (GNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico de treosa (TNA, por sus siglas en inglés), azúcares biciclo o hexosa, azúcares de glicerol y glicol, análogos de ácidos nucleicos basados en cadenas principales no iónicas, o ácidos nucleicos y sus análogos en topologías no lineales, tales como dendrímeros, estructuras en peine y nanoestructuras.
Los cebadores también pueden unirse a varias etiquetas (por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas funcionalizadas o etiquetas de unión), que pueden unirse opcionalmente a sus extremos, azúcares o nucleobases.
Los cebadores se pueden preparar mediante un abanico de procedimientos que incluyen, aunque de forma no limitativa, la clonación de secuencias apropiadas y la síntesis química directa usando procedimientos muy conocidos en la técnica [Narang y col., Methods Enzymol. 68:90 (1979); Brown y col., Methods Enzymol. 68:109 (1979)]. Los cebadores también se pueden obtener de proveedores comerciales.
El cebador directo y el cebador inverso pueden tener una temperatura de fusión idéntica o una temperatura de fusión similar, por ejemplo, una temperatura de fusión de ±5°C. Las longitudes de los cebadores se pueden extender o acortar en el(los) extremo(s) 5' y/o 3' para producir un conjunto de cebadores con las temperaturas de fusión deseadas. Por consiguiente, uno de los cebadores de un par de cebadores puede ser más largo que el otro cebador.
Los cebadores pueden diseñarse en función de la temperatura de fusión. Se conoce una ecuación para determinar la temperatura de fusión de los cebadores menores de 25 pb como la Regla de Wallace [Td = 2 x (A+T) 4 x (G+C)]. Aquí, la Td es la temperatura a una concentración particular de sal a la que el 50 % de un oligonucleótido y su complemento perfecto unido al filtro están en conformación de dúplex. Típicamente, la Td se determina en NaCl 0,9 M. Sin embargo, otras consideraciones también son relevantes cuando se diseña un cebador, por ejemplo, su estructura secundaria predicha. Varios programas informáticos y servicios en línea están disponibles para el diseño de cebadores.
En una realización, el conjunto de cebadores puede diseñarse de una manera, donde los cebadores específicamente son capaces de la amplificación de la secuencia diana que comprende la mutación en el NOI, pero no son capaces de amplificar la secuencia diana que comprende el NOI de referencia. Esto se puede lograr, por ejemplo, diseñando el cebador directo para que comprenda una secuencia idéntica a el(los) NOI(s) que comprende(n) la(s) mutación(es), y/o puede hacerse diseñando el cebador inverso de modo que comprenda una o más secuencias complementarias al NOI que comprende la(s) mutación(es).
En otras realizaciones, el conjunto de cebadores puede diseñarse de varias maneras, donde los cebadores específicamente son capaces de la amplificación de la secuencia diana que comprende el NOI de referencia, pero no son capaces de amplificar la secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). Esto se puede lograr, por ejemplo, diseñando el cebador directo de modo que comprenda una secuencia idéntica al NOI de referencia, y/o diseñando el cebador inverso que comprende una secuencia complementaria al NOI de referencia.
Sin embargo, en realizaciones preferidas de la invención, los conjuntos de cebadores son capaces de amplificar tanto la secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s) como la secuencia diana que comprende el NOI de referencia.
Cabe destacar que los procedimientos de la invención comprenden amplificaciones por PCR con más de un conjunto de cebadores, por ejemplo, 2 conjuntos de cebadores, tal como 3 conjuntos de cebadores, por ejemplo en el intervalo de 2 a 10 conjuntos de cebadores. Por tanto, cada amplificación por PCR puede comprender varios conjuntos de cebadores que flanquean diferentes secuencias diana. Esto permite la detección de más de una mutación diferente durante una amplificación por PCR.
Detección de producto(s) de PCR
Los procedimientos de la invención comprenden al menos dos etapas de detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) secuencia(s) diana que comprende(n) mutación(es) en NOI(s) de interés. El(los) producto(s) de amplificación por PCR puede(n) detectarse por cualquier medio útil.
Como se describió anteriormente, dicha(s) mutación(es) puede(n) ser(s) sustitución(es), deleción(es) y/o inserción(es), involucrando desde solo uno o unos pocos nucleótidos hasta un gran número de nucleótidos. Por tanto, la detección puede adaptarse a la mutación particular especificada por el NOI.
En algunas realizaciones, el conjunto de cebadores se diseña de una manera, donde los cebadores específicamente son capaces de amplificar la secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), pero no son capaces de la amplificación de la secuencia diana que comprende el NOI de referencia. En otras realizaciones, el conjunto de cebadores puede diseñarse de una manera, donde estos cebadores específicamente son capaces de amplificar la secuencia diana que comprende el NOI de referencia, pero no la secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). En dichas realizaciones, la detección puede basarse simplemente en la detección de la presencia o ausencia de un producto de amplificación por PCR. Este puede ser, en particular, el caso en realizaciones de la invención, donde la mutación es una mutación de un número mayor de NOIs.
En realizaciones preferidas de la invención, los productos de amplificación por PCR se detectan con la ayuda de sonda(s) de detección. Este puede ser, en particular, el caso cuando la(s) mutación(es) es una mutación de un número menor de NOI(s), por ejemplo, una o más mutaciones puntuales.
La sonda de detección puede ser un oligonucleótido que comprende una secuencia que es idéntica al NOI que comprende la mutación. Adicionalmente, dicha sonda suele comprender también secuencias idénticas a las regiones de la secuencia diana que flanquean el NOI. De manera similar, la sonda de detección puede ser un oligonucleótido que comprende una secuencia que es complementaria al NOI que comprende la mutación, y además dicha sonda también puede comprender secuencias complementarias a las regiones de la secuencia diana que flanquean el NOI. Dichas regiones que flanquean el NOI pueden ser la(s) secuencia(s) inmediatamente 5' y/o 3' del(de los) NOI(s), respectivamente. Dichas sondas se hibridarán preferiblemente con los productos de amplificación por PCR que comprenden la mutación en el NOI, pero no con los productos de amplificación por PCR que comprenden el NOI de referencia. Dichas sondas de detección también se denominan "sondas de detección de mutantes" en esta invención. La sonda de detección de mutantes típicamente comprende nucleótidos en el intervalo de 10 a 30. En particular, la sonda de detección de mutantes puede comprender una secuencia consecutiva en el intervalo de 10 a 30 nucleótidos idénticos o complementarios a la secuencia diana que comprende la mutación en el NOI.
La sonda de detección también puede ser un oligonucleótido que comprende una secuencia que es idéntica al NOI de referencia. Adicionalmente, dicha sonda suele comprender también secuencias idénticas a las regiones de la secuencia diana que flanquean el NOI. De manera similar, la sonda de detección puede ser un oligonucleótido que comprende una secuencia que es complementaria al NOI de referencia, y dicha sonda también puede comprender adicionalmente secuencias complementarias a las regiones de la secuencia diana que flanquean el NOI. Dichas sondas se hibridarán preferiblemente con los productos de amplificación por PCR que comprenden el NOI de referencia, pero no con estos productos de amplificación por PCR que comprenden la mutación en el NOI. Dichas sondas de detección también se denominan "sondas de detección de referencia" en esta invención. La sonda de detección de referencia típicamente comprende nucleótidos en el intervalo de 10 a 30. En particular, la sonda de detección de referencia puede comprender una secuencia consecutiva en el intervalo de 10 a 30 nucleótidos idénticos a la secuencia diana o complementarios a la misma que comprende el NOI de referencia.
En algunas realizaciones, los reactivos de PCR comprenden un conjunto de sondas que consiste en una sonda de detección de mutantes y una sonda de detección de referencia. El "conjunto de sondas" es preferiblemente capaz de competir por el(los) sitio(s) de unión en el(los) NOI(s) cuando se añade a una amplificación por PCR junto con un ácido nucleico que comprende la secuencia diana, reactivos de PCR y el conjunto de cebadores en condiciones que permiten la amplificación de dicha secuencia diana. Como se indicó anteriormente, las sondas de detección son típicamente oligonucleótidos. En particular, pueden ser tramos cortos de nucleótidos de ADN monocatenario. Las sondas de detección pueden asociarse con un medio detectable, o incluso unirse covalentemente al mismo, incluyendo, aunque de forma no limitativa, indicadores, colorantes, compuestos radiactivos, compuestos bioluminiscentes, compuestos fluorescentes y pares de fluoróforo/desactivador de fluorescencia.
En algunas realizaciones, el nucleótido más 5' de la sonda de detección no es G. Por tanto, la sonda de detección de mutación puede comprender un oligonucleótido, donde el nucleótido más 5' no es G. De manera similar, la sonda de detección de referencia puede comprender un oligonucleótido, donde el nucleótido más 5' no es G.
Los procedimientos de la invención pueden comprender el uso de tanto una sonda de detección de mutantes como de una sonda de detección de referencia. En tales casos, preferiblemente, las sondas están marcadas diferencialmente, por ejemplo, de modo que una de las sondas está asociada con un medio detectable, o unida covalentemente al mismo, mientras que la otra no lo está. También es posible que ambas sondas estén asociadas con un medio detectable, o unidas covalentemente al mismo, donde dichos medios detectables son diferentes.
En una realización, la sonda de detección de referencia se marca con un fluoróforo en el extremo 5' y con un desactivador de fluorescencia en el extremo 3'. Dicho fluoróforo y desactivador de fluorescencia pueden ser, por ejemplo, HEX y el desactivador de fluorescencia Black-Hole, respectivamente. En una realización, la sonda de detección de mutantes se marca con un fluoróforo en el extremo 5' y con un desactivador de fluorescencia en el extremo 3'. Dicho fluoróforo y desactivador de fluorescencia pueden ser, por ejemplo, FAM y el desactivador de fluorescencia Black-Hole, respectivamente.
Las reacciones de PCR pueden comprender una cantidad similar de la sonda de detección de mutantes y la sonda de detección de tipo salvaje. Sin embargo, en algunas realizaciones se puede preferir que se emplee un exceso de sonda de detección de mutantes. Este puede ser el caso, en particular, para la detección de producto(s) de PCR después de la amplificación por PCR en un superagrupamiento. En tales casos, las reacciones de PCR pueden comprender un exceso de al menos 2 veces, más preferiblemente al menos 4 veces de la sonda de detección de mutantes en comparación con la sonda de detección de referencia.
En algunas realizaciones, la sonda de detección es una sonda TaqMan® (Heid y col, 1996), que aprovecha la actividad exonucleasa 5' de una polimerasa de ácido nucleico. Esta es la razón por la que los reactivos de PCR comprenden preferiblemente una polimerasa de ácido nucleico con actividad exonucleasa 5' (por ejemplo, polimerasa Taq). Por lo general, la sonda TaqMan® puede ser una sonda de detección de mutantes, como se describió anteriormente, o una sonda de detección de referencia, como se describió anteriormente, unida covalentemente a un par de fluoróforo/desactivador de fluorescencia. Por tanto, la sonda puede contener un fluoróforo, normalmente en la base 5' o cerca de ella. Adicionalmente, las sondas TaqMan® pueden contener un desactivador de fluorescencia, que puede estar en la base 3' o cerca de ella, y capaz de desactivar la fluorescencia de dicho fluoróforo. [cf. Tyagi y col., Nature Biotechnology 16:49-53 (1998)]. Cuando se irradia, el fluoróforo excitado transfiere energía al desactivador de fluorescencia cercano en lugar de emitir fluorescencia [transferencia de energía Forster o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)]. Por tanto, una estrecha proximidad del fluoróforo y el desactivador de fluorescencia puede impedir la emisión de cualquier fluorescencia, mientras que la sonda está intacta. Sin embargo, cuando la sonda TaqMan® se hibrida con una región interna de la secuencia diana y la polimerasa replica una plantilla en la que se une una sonda TaqMan®, su actividad exonucleasa 5' puede escindir la sonda. Esta serie de eventos anula la funcionalidad de desactivación de fluorescencia, es decir, sin FRET, y el fluoróforo comienza a emitir fluorescencia, que puede medirse por cualquier medio útil.
Especialmente, como se destacó anteriormente, también está comprendido dentro de la invención que los procedimientos pueden usarse para identificar más de una mutación diferente. Esto se puede lograr usando una pluralidad de conjuntos de cebadores como se describió anteriormente. Sin embargo, esto también se puede lograr usando varias sondas de detección diferentes. Por tanto, en una realización, los procedimientos pueden usarse para identificar más de una mutación diferente dentro de los NOIs en la secuencia diana. En tales realizaciones, los reactivos de PCR pueden comprender una sonda de detección de referencia y varias sondas de detección de mutación, donde cada sonda de detección de mutación comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia idéntica a una de las mutaciones a o complementaria a una de las mismas. Preferiblemente, la sonda de detección de referencia y las sondas de detección de mutación están unidas a diferentes medios de detección. Todas las sondas de detección de mutación pueden estar unidas al mismo medio de detección, o a un medio de detección similar o a un medio de detección diferente.
En algunos casos, la sonda de detección es una baliza molecular (MB, por sus siglas en inglés), es decir, una sonda que comprende secuencias complementarias capaces de autohibridación (también denominada "tallo"), lo que da como resultado una estructura de "bucle en horquilla". El bucle de la MB puede contener secuencias complementarias al(a los) NOI(s), o idénticas al(a los mismos), ya sean NOI(s) de mutante o de referencia. Es más, la MB normalmente comprende un fluoróforo y un desactivador de fluorescencia situados en cualquier extremo de la MB, de modo que estén próximos entre sí, cuando la sonda se hibrida consigo misma. La MB puede ser una sonda de detección de mutantes como se describió anteriormente o una sonda de detección de referencia como se describió anteriormente unida covalentemente a un par de fluoróforo/desactivador de fluorescencia, y a secuencia(s) tallo que proporcionan las regiones complementarias de la MB. Más detalles sobre los procedimientos estándar de fabricación y uso de MB están bien establecidos en la bibliografía y las MBs están disponibles a partir de un número de varios proveedores comerciales de reactivos.
En algunos casos, un cebador/sonda se usa; en algunos casos, el cebador/sonda es una sonda Scorpions™, que puede proporcionar un mecanismo de detección de tallo-bucle basado en FRET similar a MB, excepto que la sonda también tiene un segmento fijado que sirve como cebador directo o inverso (cf. Whitcombe y col. Nature Biotechnol. agosto de 1999, 17(8): 804-7; patente de EE. UU. N.° 6.326.145). Una sonda Scorpions™ puede mantener una configuración tallo-bucle en el estado no hibridado, con el fluoróforo desactivado. Una sonda Scorpions™ puede tener una estructura multicomponente más larga, por ejemplo, un fluoróforo 5', luego una sección de tallo-bucle específica de diana, luego un desactivador de fluorescencia, luego un bloqueador [por ejemplo, hexetelenglicol (HEG)], y finalmente una secuencia de cebador 3'. El bloqueador puede evitar la extensión inversa del producto sobre la sonda.
En algunos casos, un cebador/sonda es una sonda Sunrise™, que comprende un cebador fijado a una sonda de horquilla que se extiende durante la amplificación. Esta disposición puede separar un desactivador de fluorescencia interno de un fluoróforo terminal 5' (Nazarenko y col., Nucl. Acids Res. 1997, 25: 2516-2521).
La sonda de detección puede tener cualquier longitud útil, por ejemplo, en el intervalo de 10 a 60 nucleótidos de longitud. La sonda de oligonucleótidos también puede estar en el intervalo de 10 a 30 nucleótidos de longitud. La secuencia y la longitud precisas de una sonda de oligonucleótidos pueden depender en parte de la naturaleza del polinucleótido diana al que se une. La ubicación de unión y la longitud se pueden variar para lograr propiedades de hibridación y fusión apropiadas para una situación particular. Por ejemplo, la sonda de detección puede estar diseñada para tener una temperatura de fusión en el mismo intervalo que el cebador directo y/o el cebador inverso, por ejemplo, dentro de ±10°C, tal como dentro de ±5°C.
El nucleótido terminal 3' de la(s) sonda(s) de detección puede bloquearse o volverse incapaz de extenderse mediante una polimerasa de ácido nucleico. Tal bloqueo puede llevarse a cabo convenientemente mediante la unión de medios detectables, ya sea a través de un fluoróforo o un desactivador de fluorescencia a la base 3' terminal de la sonda de oligonucleótidos mediante un resto de enlace.
Hay una gran cantidad de guía práctica disponible en la bibliografía que describe pares de fluoróforo-desactivador de fluorescencia útiles, incluyendo procedimientos de selección de pares de fluoróforo-desactivador de fluorescencia, como se ejemplifica en esta invención más adelante:
- Clegg, Meth. Enzymol., 211: 353-388 (1992); Wo y col., Anal. Biochem., 218: 1-13 (1994); Pesce et al., editores, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, Nueva York, 1971); White y col., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, Nueva York, 1970); y similares.
- La bibliografía también incluye referencias que proporcionan listas exhaustivas de moléculas fluorescentes y cromogénicas y sus propiedades ópticas relevantes para elegir pares de indicador-desactivador de fluorescencia, por ejemplo, Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2a Edición (Academic Press, Nueva York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, Nueva York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992) Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, Nueva York, 1949); y similares.
- Además, existe una guía extensa en la bibliografía para derivatizar moléculas indicadoras y desactivadoras de fluorescencia para la unión covalente a través de grupos reactivos comunes que se pueden añadir a un oligonucleótido, como se ejemplifica en las siguientes referencias: Haugland (citado anteriormente); Ullman y col., patente de EE.UU. N.° 3.996.345; Khanna y col., patente de EE.UU. N.° 4.351.760; y similares.
Los fluoróforos y los desactivadores de fluorescencia se pueden seleccionar, por ejemplo, a partir de colorantes de fluoresceína y rodamina. Estos colorantes, combinados con metodologías de unión apropiadas para la unión a oligonucleótidos, se describen en muchas referencias, por ejemplo, Khanna y col. (citado anteriormente); Marshall, Histochemical J., 7:299-303 (1975); Menchen y col., patente de EE. UU. N.° 5.188.934; Menchen y col., solicitud de patente europea 87310256.0; y Bergot y col., solicitud internacional PCT/US90/05565.
Un par de fluoróforo/desactivador de fluorescencia puede usar un fluoróforo, tal como EDANS o fluoresceína, por ejemplo, en el extremo 5' y un desactivador de fluorescencia tal como Dabcyl, por ejemplo, en el extremo 3'.
La detección de producto(s) de amplificación por PCR puede implicar una etapa de comparar la señal obtenida en una amplificación por PCR que comprende una muestra determinada de ADNg con la señal obtenida en una amplificación por PCR de control. La señal normalmente puede estar relacionada con los medios detectables asociados con una sonda de detección de mutantes y/o una sonda de detección de tipo salvaje. Por tanto, si dichas sondas están asociadas a un fluoróforo, la señal puede ser de fluorescencia. La amplificación por PCR de control puede ser una amplificación por PCR realizada en las mismas condiciones, pero que carece de una muestra de ADNg, es decir, dicha amplificación por PCR de control puede carecer de una plantilla de ADNg, o puede contener solo un ADN de control que comprende solo la secuencia diana de referencia, por ejemplo, ADNg de tipo salvaje. En algunas realizaciones, cualquier señal que sea más fuerte que la señal de la amplificación por PCR de control puede considerarse una señal positiva, es decir, una señal que indica la presencia de una secuencia diana que comprende una o más mutaciones en el NOI.
En una realización, cualquier señal que esté por encima de un umbral determinado puede considerarse una señal positiva. El umbral se puede determinar de cualquier manera útil, normalmente mediante el uso de un software adecuado, por ejemplo, el software QX200™ Droplet Reader y Quantasoft ™ disponible en Biorad.
En realizaciones de la invención, donde se emplean sondas de detección de referencia y de detección de mutación, la abundancia fraccional entre la señal obtenida de la sonda de detección de mutación y la de la sonda de detección de referencia puede determinarse y usarse para evaluar la presencia de un producto de PCR. La abundancia fraccional se puede determinar como: [Señal de ("sonda de detección de mutantes")] dividida por [Señales de ("sonda de detección de referencia" "sonda de detección de mutantes")].
Se puede suponer, por ejemplo, que una muestra puede contener ADN diana que comprende la mutación en el NOI, siempre que, en una comparación con una amplificación por PCR de control, se caracterice por:
1) Una mayor abundancia fraccional, y/o;
2) Mayor concentración de gotas de mutantes, y/o;
3) Mayor número de eventos mutantes a una escala del 50 % o más por encima del promedio.
Las gotas de mutantes pueden ser gotas que dan una señal positiva de la sonda de detección de mutantes. En esta invención, "evento mutante" es igual al número de gotas de mutantes.
División de un subagrupamiento en subagrupamientos secundarios
Una vez que se ha identificado un subagrupamiento que comprende un organismo, o partes reproductivas del mismo, que porta la mutación en el NOI, entonces los procedimientos de la invención comprenden una etapa de dividir dicho subagrupamiento en una pluralidad de subagrupamientos secundarios.
Como se describió anteriormente, parte del subagrupamiento puede haberse utilizado para preparar una muestra de ADNg. Por tanto, solo la parte restante del subagrupamiento está disponible para la división en subagrupamientos secundarios. También está comprendido dentro de la invención que el subagrupamiento se divida en varias fracciones, y que solo se use una fracción para preparar el subagrupamiento secundario.
Cada subagrupamiento secundario puede comprender solo un organismo o parte(s) reproductiva(s) del mismo. Alternativamente, cada subagrupamiento secundario puede comprender una pluralidad de organismos o partes reproductivas de los mismos. Por ejemplo, cada subagrupamiento secundario puede comprender una pluralidad de organismos, o partes reproductivas de los mismos, que representan una pluralidad de genotipos.
Usualmente, el agrupamiento, o una fracción del mismo, se divide en una pluralidad de subagrupamientos secundarios, preferiblemente en al menos 5 subagrupamientos secundarios, más preferiblemente en al menos 10 subagrupamientos secundarios, incluso más preferiblemente en al menos 30 subagrupamientos secundarios, aún más preferiblemente en al menos 50 subagrupamientos secundarios, incluso más preferiblemente en al menos 70 subagrupamientos secundarios, aún más preferiblemente en al menos 90 subagrupamientos secundarios. En principio, no existe un límite superior para el número de subagrupamientos secundarios. Sin embargo, el agrupamiento normalmente se divide en un máximo de 50.000, tal como un máximo de 25.000, por ejemplo, un máximo de 10.000 subagrupamientos secundarios.
Cada subagrupamiento secundario puede comprender uno o una pluralidad de organismos, o partes reproductivas de los mismos, que representan una pluralidad de genotipos. Preferiblemente, cada subagrupamiento secundario comprende en el intervalo de 1 a 100, preferiblemente en el intervalo de 1 a 50, incluso más preferiblemente en el intervalo de 1 a 20 organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos.
Los subagrupamientos secundarios se pueden ordenar de cualquier forma deseada. En algunas realizaciones, un subagrupamiento secundario comprende solo un número limitado de organismos o partes reproductivas de los mismos.
En otras realizaciones, el subagrupamiento secundario comprende una pluralidad de organismos del mismo genotipo. Esto puede asegurarse sometiendo el subagrupamiento secundario a una etapa de reproducción. También es posible que la etapa de reproducción se realice simultáneamente con la etapa de dividir el subagrupamiento en subagrupamientos secundarios de una manera que permita que la descendencia de un único organismo, o parte reproductiva del mismo, acabe en el mismo subagrupamiento secundario.
Los procedimientos de la invención comprenden la preparación de una o más muestras de ADNg del subagrupamiento secundario. En realizaciones de la invención, donde el subagrupamiento secundario solo comprende uno o unos pocos organismos de cada genotipo, o partes reproductivas de los mismos, entonces la muestra de ADNg se prepara típicamente a partir de una muestra de cada organismo, o parte reproductiva del mismo, por ejemplo, como se describe en esta invención anteriormente en la sección "Preparación de muestras de ADN".
En realizaciones donde el subagrupamiento secundario comprende una pluralidad de organismos de genotipos individuales, o partes reproductivas de los mismos, de cada genotipo, entonces la muestra de ADNg puede prepararse a partir de una fracción del subagrupamiento secundario.
En la Figura 1C se proporciona un ejemplo de un procedimiento de división del subagrupamiento en subagrupamientos secundarios, donde las primeras etapas de dicha figura ilustran la división del subagrupamiento y la obtención de una muestra de ADNg.
En realizaciones de la invención, donde la especie es un organismo unicelular, los subagrupamientos secundarios se pueden preparar, por ejemplo, de la siguiente manera:
- Después de la identificación de un subagrupamiento que comprende la mutación en el NOI, se puede permitir que cada organismo unicelular de dicho subagrupamiento se multiplique de manera separada, de modo que cada organismo unicelular dé lugar a un cultivo clonal. Esto se puede hacer cultivando colonias de cada clon en un medio sólido o cultivando cada clon en espacios separados con medio líquido, por ejemplo, en microtubos o en pocillos de placas de microtitulación. El subagrupamiento secundario puede formarse combinando organismos unicelulares de una pluralidad de clones.
- Los organismos unicelulares pueden dividirse en subagrupamientos secundarios inmediatamente después de la identificación del subagrupamiento de interés, y se puede dejar que cada subagrupamiento secundario se reproduzca.
En una realización, los subagrupamientos secundarios se preparan mediante las siguientes etapas:
i) Proporcionar un subagrupamiento que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s);
ii) Propagar algunos, o todos los organismos, de dicho subagrupamiento de manera clonal para obtener cultivos clonales;
iii) Combinar una fracción de organismos de una pluralidad de dichos cultivos clonales para obtener subagrupamientos secundarios.
Como se describió anteriormente, las muestras de ADNg se pueden preparar a partir de una parte del organismo de un subagrupamiento, mientras que el resto de los organismos de un subagrupamiento puede almacenarse. Cuando los organismos son unicelulares, a continuación dichos organismos pueden congelarse para su almacenamiento. En dichas realizaciones, la etapa i) anterior puede comprender una etapa de revivir los organismos por incubación en medio de cultivo a una temperatura adecuada para el crecimiento de dicho organismo. Preferiblemente, dicha etapa de revivir comprende solo una reproducción mínima.
La etapa ii) mencionada anteriormente puede, por ejemplo, realizarse sembrando en placas los organismos en un medio sólido a un título lo suficientemente bajo como para separar espacialmente los organismos entre sí en dicho medio.
La etapa iii) mencionada anteriormente puede comprender combinar una fracción en el intervalo de 10 a 1000, preferiblemente en el intervalo de 10 a 500, más preferiblemente en el intervalo de 10 a 100, por ejemplo, en el intervalo de 30 a 70 cultivos clonales individuales. Puede ser preferible obtener dos copias de cada subagrupamiento secundario. Esto se puede hacer combinando dichas fracciones como se mencionó anteriormente y a continuación dividiendo cada subagrupamiento secundario en al menos 2 partes. Alternativamente, se pueden preparar dos copias de cada subagrupamiento secundario desde el principio combinando fracciones de los mismos cultivos clonales en dos recipientes diferentes. Por lo general, una parte del subagrupamiento se usa para preparar una muestra de ADNg, mientras que la otra se almacena (por ejemplo, se congela en presencia de un crioprotector). Antes de preparar una muestra de ADNg y/o antes del almacenamiento, los subagrupamientos secundarios pueden someterse a una etapa de reproducción, por ejemplo, a incubación en medio de cultivo a una temperatura útil para el crecimiento del organismo.
En realizaciones de la invención, donde la especie es una planta, el subagrupamiento secundario puede prepararse obteniendo una muestra de cada semilla dentro de un subagrupamiento y combinando muestras de un número predeterminado de semillas. En tales realizaciones, es importante ordenar los subagrupamientos secundarios, de modo que las semillas de un subagrupamiento secundario y las muestras de dicho subagrupamiento secundario puedan identificarse. Por tanto, en una realización de la divulgación, los procedimientos comprenden las etapas de:
- Proporcionar un subagrupamiento que comprende una pluralidad de semillas de una planta, por ejemplo, granos de cereales, donde dicho subagrupamiento comprende la mutación del NOI.
- Dividir las semillas de dicho subagrupamiento en subagrupamientos secundarios, comprendiendo cada uno al menos una semilla, por ejemplo, en el intervalo de 1 a 100 semillas.
- Obtener una muestra de cada semilla de los subagrupamientos secundarios de una manera que queden lo suficientemente intactos como para desarrollarse en una planta, y combinar todas las muestras de todas las semillas de cada subagrupamiento secundario.
- Preparar una muestra de ADNg a partir de dichas muestras combinadas.
Las etapas indicadas anteriormente se ilustran en la parte superior de la Figura 2D, usando granos de cereales como ejemplo. Por tanto, el procedimiento puede comprender las etapas ilustradas en la Figura 2D. También, las etapas ilustradas en la Figura 2d se pueden realizar utilizando cualquier planta con flores, por lo que no se limita a los cereales. Además, las etapas ilustradas en la Figura 2D se pueden realizar utilizando cualquier número de plantas mutadas (los números proporcionados en la Figura 2D representan meramente un ejemplo).
Un ejemplo de un procedimiento de división de un subagrupamiento en subagrupamientos secundarios se describe a continuación en la WS4.
Identificación de subagrupamientos secundarios
Los procedimientos de la invención comprenden las etapas de dividir un subagrupamiento de organismos, o partes reproductivas de los mismos, que comprenden una o más mutaciones en el(los) NOI(s), en subagrupamientos secundarios, seguido de una etapa de identificar un subagrupamiento secundario que comprende un organismo, o partes reproductivas del mismo, que comprende la(s) mutación(es) especificada(s) por el(los) NOI(s).
La identificación de dicho subagrupamiento secundario puede comprender las etapas de:
a) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento secundario, que, por ejemplo, puede realizarse como se describe en esta invención anteriormente en la sección "Preparación de muestras de a Dn ";
b) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR para amplificar la secuencia diana;
c) Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), identificando así dicho(s) subagrupamiento(s) secundarios, que, por ejemplo, puede realizarse según lo descrito en esta invención más adelante en la sección "Detección de producto(s) de amplificación por PCR".
La amplificación por PCR descrita anteriormente en esta invención puede ser cualquier amplificación por PCR de la secuencia diana. Por tanto, dicha amplificación por PCR puede ser una amplificación por PCR convencional, o puede ser una amplificación por PCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas como se describe en esta invención anteriormente.
Cada una de dichas amplificaciones por PCR, en general, comprende la muestra de ADNg de un subagrupamiento secundario, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR. Los cebadores pueden ser cualquiera de los cebadores descritos en esta invención anteriormente en la sección "Cebadores que flanquean la secuencia diana". Los reactivos de PCR pueden ser cualquiera de los reactivos de PCR descritos en esta invención anteriormente en la sección "Reactivos de PCR". En particular, los reactivos de PCR comprenden nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico. Preferiblemente, los reactivos de PCR también comprenden una o más sondas de detección, por ejemplo, una sonda de detección de mutación y/o una sonda de detección de referencia, como se describió anteriormente en esta invención en la sección "Detección de producto(s) de PCR".
El subagrupamiento secundario puede, por ejemplo, identificarse directamente siempre que el(los) producto(s) de amplificación por PCR comprenda(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s) que puede(n) detectarse directamente después o durante el procedimiento de amplificación por PCR. Esto puede hacerse, por ejemplo, si la amplificación por PCR comprende medios de detección, que dan lugar a una señal detectable siempre que el(los) producto(s) de amplificación por PCR comprenda(n) la secuencia diana que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). Dichos medios de detección se describen con más detalle anteriormente en la sección "Detección de producto(s) de amplificación por PCR", y pueden ser, por ejemplo, sondas para la detección de mutaciones.
En la parte inferior de la Figura 1C se ilustra un ejemplo de un procedimiento de identificación de un subagrupamiento secundario que comprende dicha(s) mutación(es), que muestra las siguientes etapas:
- Proporcionar un subagrupamiento secundario;
- Preparar una muestra de una parte de dicho subagrupamiento secundario;
- Preparar una muestra de ADNg a partir de dicha muestra;
- Preparar amplificaciones por PCR con la totalidad de las muestras de ADNg individuales de la totalidad de los subagrupamientos secundarios, por ejemplo, en pocillos individuales de una placa, por ejemplo, en placas de microtitulación;
- Detectar la presencia de la secuencia diana que comprende la mutación en el(los) NOI(s).
En la Figura 2D se muestra un ejemplo más específico en un procedimiento para la identificación de un subagrupamiento secundario. En este ejemplo, la especie en cuestión es una planta de cereal. Los números específicos proporcionados en la Figura 2D son solo ejemplos, y el experto en la materia comprenderá que el procedimiento se puede realizar usando otro número de granos.
Cabe destacar que la identificación de un subagrupamiento secundario que comprende la(s) mutación(es) específica(s) de NOI se puede realizar como se indica en WS4 en esta invención más adelante.
Identificación de organismos
Una vez que se ha identificado un subagrupamiento secundario que comprende un organismo, o una parte reproductiva del mismo, el procedimiento comprende la identificación de un organismo que comprende la(s) mutación(es) del(de los) NOI(s).
Esto se puede hacer de varias maneras, dependiendo de la especie y de los subagrupamientos secundarios.
En realizaciones de la invención, donde el subagrupamiento secundario solo comprende un organismo, o partes reproductivas del mismo, entonces el organismo, o parte(s) reproductiva(s) del mismo, se identifica(n)tan pronto como se identifica el subagrupamiento secundario relevante.
En realizaciones de la invención, en donde el subagrupamiento secundario comprende más de un organismo, o parte(s) reproductiva(s) del mismo, entonces los procedimientos típicamente comprenden una etapa de identificar el(los) organismo(s). Antes de ello, simultáneamente con, o después de la identificación de los organismos, o partes reproductivas de los mismos, el subagrupamiento secundario que comprende la(s) mutación(es) del(de los) NOI(s) puede someterse a una etapa de reproducción.
En realizaciones de la invención, donde la especie es un organismo unicelular, dicha etapa de reproducción puede ser una expansión clonal de los organismos, por ejemplo, mediante la clonación de cada uno de los organismos del subagrupamiento secundario de manera espacialmente separada. Por tanto, el procedimiento puede comprender las etapas de:
i) Proporcionar un subagrupamiento secundario que comprende la mutación en el NOI;
ii) Reproducir algunos o la totalidad de los organismos de dicho subagrupamiento de manera clonal;
iii) Determinar qué clones comprenden organismos que comprenden la mutación en el NOI.
La etapa ii) mencionada anteriormente puede, por ejemplo, realizarse sembrando en placas los organismos en un medio sólido a un título lo suficientemente bajo como para separar espacialmente cada organismo en dicho medio sólido.
La etapa iii) anterior puede implicar preparar una muestra de ADNg de una fracción de cada clon y realizar una amplificación por PCR, por ejemplo, una amplificación por PCR esencialmente como se describe en la sección "Identificación de un subagrupamiento secundario" en esta invención anteriormente.
En realizaciones de la divulgación, donde la especie es una planta, y el subagrupamiento secundario comprende semillas de dicha planta, los procedimientos pueden comprender las etapas de:
A. Identificar un subagrupamiento secundario que comprende un organismo, o partes reproductivas del mismo, que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NO(s);
B. Cultivar todas las semillas dentro de dicho subagrupamiento secundario para permitir la germinación y, opcionalmente, el crecimiento de las plantas de cada semilla;
C. Obtener una muestra de cada semilla germinada;
D. Analizar dicha muestra para detectar la presencia de dicha(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), donde dicho ensayo puede realizarse mediante cualquier procedimiento, por ejemplo, preparando una muestra de ADNg a partir de dicha muestra y realizando una amplificación por PCR como se describió anteriormente en esta invención, identificando así una planta que porta la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s).
En la etapa B. anterior, dichas semillas pueden, por ejemplo, germinar y permitir que se desarrollen en plántulas que comprendan raíces, tallos y hojas. En dichas realizaciones, la muestra obtenida en la etapa C. puede ser, por ejemplo, una hoja, una raíz o partes de la misma de dicha plántula, tal como secciones de las primeras hojas. Después de que se haya obtenido la muestra, la semilla germinada, o la plántula, puede crecer hasta la madurez. También está comprendido dentro de la invención que las plantas crezcan hasta su madurez, en cuyo caso la muestra obtenida en la etapa C., por ejemplo, puede ser una hoja, una flor, una raíz, una semilla, un tallo o partes de los mismos. Con posterioridad a la identificación de un único organismo, o partes reproductivas del mismo, que comprende una o más mutaciones en el(los) NOI(s), dicho organismo, o partes reproductivas del mismo, estarán, en general, sometidos a una o más etapas de reproducción con el fin de obtener una pluralidad de organismos que comprenden la mutación. En las realizaciones que no pertenecen a la invención donde el organismo identificado es heterocigoto con respecto a la mutación en cuestión, el procedimiento puede comprender a continuación etapas de mejora de dicho organismo hasta la homocigosis con respecto a dicha mutación.
Después de la identificación de un organismo que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), los procedimientos que no pertenecen a la invención pueden comprender una etapa de mejora adicional de dicho organismo de manera que se preserve la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). Dicha mejora puede realizarse con el objetivo de combinar el rasgo conferido por la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s) con rasgos de otros organismos de la misma especie.
Los procedimientos también pueden comprender etapas adicionales para verificar la presencia de la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). Por ejemplo, la secuencia diana, o un gen que comprende la secuencia diana, puede secuenciarse en su totalidad.
Superagrupamientos
En una realización de la invención, los procedimientos comprenden una etapa de identificar un grupo de subagrupamientos, en esta invención también denominados superagrupamientos, que comprenden la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). De esa manera, un número muy grande de organismos potenciales, o partes reproductivas de los mismos, pueden identificarse selectivamente para detectar la presencia de la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). Dicha etapa se realiza preferiblemente después de dividir el agrupamiento en subagrupamientos y preparar muestras de ADNg a partir de los subagrupamientos, por ejemplo, después de la etapa c) de los procedimientos de la invención.
Por tanto, los procedimientos pueden comprender las siguientes etapas realizadas después de la etapa c):
- Preparar una fracción de cada muestra de ADNg de cada subagrupamiento;
- Combinar una pluralidad de fracciones de subagrupamientos en superagrupamientos, obteniendo así muestras de ADNg de superagrupamientos que comprenden ADNg de una pluralidad de subagrupamientos;
- Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una muestra de ADNg de un superagrupamiento, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, comprendiendo cada una parte de dicha muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la secuencia diana, donde dicha PCR, por ejemplo, puede realizarse como se describe más adelante en esta invención en la sección "Amplificación por PCR en superagrupamiento";
- Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) la(s) secuencia(s) diana que comprende(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), identificando así superagrupamiento(s) que comprende(n) dicha(s) mutación(es), donde dicha etapa de detección, por ejemplo, puede realizarse como se describió anteriormente en esta invención en la sección "Detección de productos de PCR".
En algunas realizaciones, puede ser preferible enriquecer las muestras de ADNg de superagrupamientos. Esto puede ayudar a detectar específicamente la(s) secuencia(s) diana que comprende(n) la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s). El etapa de enriquecimiento puede comprender las etapas de
- Proporcionar muestras de ADNg de superagrupamientos que comprenden ADNg de una pluralidad de subagrupamientos como se describió anteriormente;
- Realizar amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una muestra de ADNg de un superagrupamiento, donde cada amplificación por PCR comprende un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana, una sonda de bloqueo y reactivos de PCR.
La amplificación por PCR realizada durante la etapa de enriquecimiento es típicamente una amplificación por PCR convencional y puede, por ejemplo, realizarse como se describe en esta invención más adelante en la sección "PCR". Frecuentemente, esta PCR comprende un número relativamente bajo de ciclos, por ejemplo, en el intervalo de 10 a 30, tal como en el intervalo de 15 a 25 ciclos de PCR.
La sonda de bloqueo suele ser una sonda diseñada para inhibir la amplificación de la secuencia diana que comprende el NOI de referencia. Por tanto, la sonda de bloqueo puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido, que:
- no puede extenderse en el extremo 3' por una ADN polimerasa;
- se une preferentemente a la secuencia diana que comprende el NOI de referencia o su secuencia complementaria respecto a la secuencia diana que comprende la mutación predeterminada del NOI.
La sonda de bloqueo típicamente comprende nucleótidos en el intervalo de 10 a 30. En particular, la sonda de bloqueo puede comprender una secuencia consecutiva en el intervalo de 10 a 30 nucleótidos idénticos a la secuencia diana, o complementarios a la misma, que comprende el NOI de referencia. Es más, la sonda de bloqueo normalmente está unida a un agente de bloqueo, que inhibe la extensión de la sonda por la ADN polimerasa.
Dicho agente de bloqueo puede ser, por ejemplo, un resto unido covalentemente al nucleótido más 3' de la sonda de bloqueo. De hecho, las modificaciones más 3' bloquearán la extensión. Por ejemplo, dicho agente de bloqueo puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en el espaciador 2',3'-didesoxiC, 3'ddC y 3' dT invertida. El agente de bloqueo también puede ser una modificación del grupo hidroxilo 3' terminal, por ejemplo, con un grupo amino (por ejemplo, un 3' amino) o un alquilo, por ejemplo, un espaciador 3' C3. El agente de bloqueo también puede ser una fosforilación del nucleótido 3'.
Una vez que se identifica un superagrupamiento que comprende una o más mutaciones en el(los) NOI(s), a continuación se pueden realizar la etapa d) y las etapas subsiguientes. Sin embargo, la etapa d) puede limitarse para preparar amplificaciones por PCR con muestras de ADNg de los subagrupamientos contenidos en el superagrupamiento.
La identificación de un superagrupamiento también puede realizarse directamente después de preparar los subagrupamientos en la etapa b). En este caso, los procedimientos pueden comprender las siguientes etapas después de la etapa b):
- Si los subagrupamientos comprenden solo unos pocos, por ejemplo, solo un organismo, o una parte reproductiva del mismo, de cada genotipo, a continuación dichos subagrupamientos pueden someterse a una etapa de reproducción; - Preparar una fracción de cada subagrupamiento, que representa cada genotipo dentro del subagrupamiento, donde la parte restante del subagrupamiento también representa cada genotipo dentro del subagrupamiento;
- Combinar una pluralidad de fracciones en superagrupamientos, obteniendo así superagrupamientos que comprenden organismos, o partes reproductivas de los mismos, a partir de una pluralidad de subagrupamientos, donde los organismos, o partes reproductivas de los mismos, solo están presentes en un superagrupamiento;
- Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento, que, por ejemplo, puede realizarse como se describe en esta invención anteriormente en la sección "Preparación de muestras de ADN";
- Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una muestra de ADNg de un superagrupamiento, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, comprendiendo cada una parte de dicha muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la secuencia diana, donde dicha PCR, por ejemplo, puede realizarse como se describe más adelante en esta invención en la sección "Amplificación por PCR en superagrupamiento".
- Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) secuencia(s) diana que comprenden la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), identificando así superagrupamiento(s) que comprende(n) dicha(s) mutación(es).
En tales realizaciones, no es importante que las muestras de ADNg de los superagrupamientos se preparen de una manera que se mantenga el potencial de reproducción de los organismos de cada genotipo dentro de dicho superagrupamiento. Esto se logra normalmente porque cada superagrupamiento contiene ADN de varios subagrupamientos, y cada subagrupamiento comprende organismos (o partes reproductivas de los mismos) que representan cada genotipo dentro del subagrupamiento.
Una vez que se identifica un superagrupamiento que comprende la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), entonces se pueden realizar la etapa c) y las etapas subsiguientes. Sin embargo, la etapa c) puede limitarse para preparar muestras de ADNg de los subagrupamientos contenidos en el superagrupamiento.
Se puede preparar cualquier número deseable de superagrupamientos, por ejemplo, en el intervalo de 5 a 100, tal como en el intervalo de 5 a 50, por ejemplo, en el intervalo de 5 a 20.
En la Figura 1D se ilustra un ejemplo de un procedimiento de identificación de un superagrupamiento. Otro ejemplo, donde la especie es un cereal como se ilustra en la Figura 2E. Se entiende que los números proporcionados en la Figura 2E son solo ejemplos y que el procedimiento se puede realizar con otro número de granos, etc.
Un ejemplo no limitativo de preparación e identificación de un superagrupamiento también se describe en esta invención más adelante en WS5.
Amplificación por PCR en un superagrupamiento
Los procedimientos de la invención comprenden una etapa de realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, una muestra de ADNg de un superagrupamiento, por ejemplo, preparada como se describe en las secciones anteriores, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, cada una de las cuales comprende parte de dicha muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la secuencia diana.
En general, dicha PCR se puede realizar como se describió anteriormente en esta invención en la sección "Amplificación por PCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas", preferiblemente, sin embargo, con las excepciones que se describen más adelante:
- Las amplificaciones por PCR compartimentadas pueden estar contenidas en gotas, como se describió anteriormente. Para las amplificaciones por PCR en los superagrupamientos, la alta sensibilidad es importante, mientras que las amplificaciones por PCR en los subagrupamientos requieren una sensibilidad más baja. Mientras que normalmente se requiere una gran cantidad de reactivos para las amplificaciones por PCR con alta sensibilidad, las amplificaciones por PCR con menor sensibilidad requieren una menor cantidad de reactivos. Por tanto, se prefiere que las amplificaciones por PCR en los superagrupamientos tengan una sensibilidad para detectar uno o varios NOIs de mutantes dentro de al menos 200.000, más preferiblemente dentro de al menos 250.000 NOIs de referencia.
- Para las amplificaciones por PCR en un superagrupamiento, se puede preferir que cada gota tenga un volumen muy pequeño, por ejemplo, un volumen en el tamaño de pl. En consecuencia, se prefiere que las gotas tengan en promedio un volumen en el intervalo de 0,1 a 10 pl.
- Cada amplificación por PCR se puede compartimentar en cualquier número adecuado de compartimentos. Sin embargo, en una realización preferida de la invención, cada amplificación por PCR se compartimenta en el intervalo de 200.000 a 100.000.000 compartimentos (por ejemplo, gotas). Por ejemplo, cada amplificación por PCR puede compartimentarse en el intervalo de 500.000 a 50.000.000 de compartimentos (por ejemplo, gotas), por ejemplo, cada amplificación por PCR puede compartimentarse en el intervalo de 1.000.000 a 10.000.000 de compartimentos (por ejemplo, gotas). Puede preferirse que cada amplificación por PCR se compartimente en al menos 1.000.000, preferiblemente al menos 3.000.000, incluso más preferiblemente al menos 5.000.000, tal como al menos 7.000.000 de compartimentos (por ejemplo, gotas).
- En algunos casos, las gotas se generan usando un generador de gotas disponible comercialmente, tal como el sistema de PCR digital RainDrop de Raindance Technologies, un sistema que también se puede usar para detectar producto(s) de amplificación por PCR.
Una vez que se han preparado las reacciones de PCR compartimentadas, la amplificación se puede realizar como se describe más adelante en esta invención en la sección "PCR". La detección de la presencia de la secuencia diana que comprende el(los) NOI(s) de mutante(s) puede realizarse como se describió anteriormente en esta invención en la sección "Detección de producto(s) de PCR".
En una realización, se puede preferir que la detección se realice utilizando una sonda de detección de referencia y una sonda de detección de mutantes descritas esencialmente en la sección "Detección de producto(s) de PCR", donde se emplea un exceso de sonda de detección de mutantes. Preferiblemente, las reacciones de PCR comprenden un exceso de al menos 2 veces, más preferiblemente al menos 4 veces de la sonda de detección de mutantes en comparación con la sonda de detección de referencia. También es posible que no se use una sonda de detección de referencia y solo se use una sonda de detección de mutantes.
PCR
Los procedimientos descritos en esta invención comprenden múltiples etapas de realizar amplificaciones por PCR, incluyendo amplificaciones por PCR compartimentadas, por ejemplo, amplificaciones por PCR como se describe en la sección "Amplificación por PCR que comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas" o en la sección "Amplificación por PCR en un superagrupamiento".
En esta invención, en general, una amplificación por PCR comprende las etapas de:
1) Preparar una amplificación por PCR que comprende la muestra de ADNg, un conjunto de cebadores que flanquean la secuencia diana y reactivos de PCR;
2) Realizar una amplificación por PCR, que normalmente comprende las etapas de:
o Incubar la amplificación por PCR a una temperatura de desnaturalización, por ejemplo, en el intervalo de 85 a 100°C, por ejemplo, en el intervalo de 90 a 98°C durante un tiempo suficiente para desnaturalizar el ADN bicatenario, por ejemplo, en el intervalo de 15 a 30 min, tal como en el intervalo de 30 s a 5 min;
o Realizar una pluralidad de ciclos, por ejemplo, en el intervalo de 10 a 60 ciclos, tal como en el intervalo de 20 a 40 ciclos, que comprende las siguientes etapas:
- Incubación a una temperatura de hibridación para permitir la hibridación entre los cebadores y el ADN diana, por ejemplo, en el intervalo de 15 s a 2 min, tal como en el intervalo de 30 s a 1 min. Normalmente, la temperatura de hibridación será similar a la temperatura de fusión de los cebadores, o inferior a la misma, por ejemplo, una temperatura en el intervalo de 45 a 75°C. La incubación a la temperatura de hibridación también puede permitir la elongación de los cebadores;
- Opcionalmente, la incubación a una temperatura de elongación a la que la polimerasa de ácido nucleico tiene actividad, por ejemplo, a una temperatura en el intervalo de 55 a 75°C, en el intervalo de 15 s a 2 min, por ejemplo, en el intervalo de 30 s a 1 min;
- Incubación a una temperatura de desnaturalización, por ejemplo, a una temperatura en el intervalo de 85 a 100°C, o en el intervalo de 90 a 98°C, en el intervalo de 15 s a 2 min, por ejemplo, en el intervalo de 30 s a 1 min;
- Incubación a una temperatura de elongación de una ADN polimerasa, por ejemplo, en el intervalo de 55 a 98°C, tal como en el intervalo de 15 s a 20 min, tal como en el intervalo de 1 a 15 min.
Antes de la etapa de amplificación, por ejemplo, antes de la etapa 2) de la lista anterior, la PCR puede particionarse en una pluralidad de compartimentos espacialmente separados con el fin de obtener amplificaciones por PCR compartimentadas. Esto puede lograrse, por ejemplo, generando gotas, por ejemplo, añadiendo un aceite generador de gotas, y preparando gotas en un generador de gotas.
Planta de cebada que porta una mutación en el gen GS1-3
En una realización, la invención se refiere a una planta de cebada que porta una mutación en el gen que codifica la glutamina sintetasa 1, específicamente la isoterma 3 (GS1-3). Dicho gen también puede denominarse gen HvGS1-3, cuya secuencia codificante de proteína se proporciona en esta invención como SEQ ID NO:1, mientras que la secuencia de aminoácidos de las enzimas codificadas por HvGS1-3 se proporciona como SEQ ID NO:2.
Preferiblemente, dicha mutación es una mutación que en dicho gen confiere una secuencia que codifica una enzima HvGS1-3 mutada con actividad reducida. La actividad de HvGS1-3 es una o más de las siguientes:
i. Catalizar la condensación de amonio;
ii. Catalizar la condensación de amoniaco y glutamato en glutamina;
iii. Catalizar la síntesis de glutamil hidroxamato a partir de glutamato, hidroxilamina y ATP.
En particular, la actividad de HvGS1-3 puede ser como se describe en iii. En este caso, la actividad puede, por ejemplo, determinarse como se describe en el Ejemplo 19 en esta invención más adelante en la sección "Ensayo de actividad in vitro de HvGS1-3 recombinante".
Se prefiere que la proteína HvGS1-3 mutada tenga una actividad que sea menor que la actividad de la proteína de tipo salvaje. Sin embargo, la enzima preferiblemente debería conservar al menos algo de actividad. En particular, dicha proteína HvGS1-3 mutada puede tener una kcat (min-1), que está en el intervalo de 1 a 20 %, tal como en el intervalo de 2 a 10 % de la kcat (min-1) de la proteína HvGS1-3 de tipo salvaje, cuando se determina como se describe en la leyenda del Ejemplo 19.
Se cree que la enzima HvGS1-3 de tipo salvaje es un decámero que consiste en dos anillos compuestos por 5 subunidades. En una realización, la proteína HvGS1-3 mutada contiene una mutación en un residuo de aminoácido que recubre la interfase entre los dos anillos. En particular, la mutación puede ser una mutación en un residuo de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en los residuos de aminoácido 141, 235, 285, 287 y 290 de SEQ ID NO:2.
Por tanto, la planta de cebada puede comprender una mutación en el gen que codifica HvGS1-3, donde dicho gen codifica una proteína HvGS1-3 mutada que porta una mutación de uno de los residuos de aminoácidos mencionados anteriormente.
En particular, la proteína HvGS1-3 mutada puede ser una proteína con una mutación en el residuo de aminoácido n.° 287 de SEQ ID NO:2, por ejemplo, una mutación de Gly a cualquier otro residuo de aminoácido, tal como cualquier otro residuo de aminoácido de origen natural. La mutación también puede ser una mutación del residuo de aminoácido 287 de SEQ ID NO:2, es decir, de Gly a un residuo de aminoácido polar o cargado, por ejemplo, a un residuo de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Arg, Lys, Asp, Glu, Gin, Asn, His, Ser, Thr, Tyr, Cys, Met y Trp, o, por ejemplo, a un residuo de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Arg, Lys, Asp, Glu, Tyr, Phe, Met y Trp. La mutación también puede ser una mutación del residuo de aminoácido 287 de SEQ ID NO:2 de Gly a un residuo cargado, por ejemplo, a un residuo de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Arg, Lys, Asp y Glu. En particular, la mutación también puede ser una mutación del residuo de aminoácido 287 de SEQ ID NO:2 de Gly a Asp.
Por tanto, la mutación en el gen HvGS1-3 puede ser cualquier mutación que resulte en un gen HvGS1-3 que codifique una o más de las mutaciones antes mencionadas. En una realización, la mutación del gen puede ser una mutación de uno o más de los nucleótidos 859, 860 y 861 para obtener un codón que codifica uno de los residuos de aminoácidos mencionados anteriormente. En un ejemplo, la mutación es una mutación de gen del nucleótido 860 de G a A.
En una realización, la proteína HvGS1-3 mutada puede ser una proteína que lleva una mutación en el residuo de aminoácido n.° 235 de SEQ ID NO:2, por ejemplo, una mutación de Asp a cualquier otro residuo de aminoácido. La mutación también puede ser una mutación del residuo de aminoácido 235 de SEQ ID NO:2 de Asp a un residuo positivamente cargado, por ejemplo, a un residuo de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Arg y Lys. La mutación en el gen HvGS1-3 puede ser, por tanto, cualquier mutación que dé como resultado un gen HvGS1-3 que codifique cualquiera de las proteínas HvGS1-3 mutadas antes mencionadas.
En una realización, la proteína HvGS1-3 mutada puede ser una proteína que porta una mutación en el residuo de aminoácido 285 de SEQ ID NO:2, por ejemplo, una mutación de Gly en cualquier otro aminoácido, tal como cualquier otro aminoácido de origen natural. La mutación también puede ser una mutación del aminoácido 285 de SEQ ID NO:2 de Gly a un aminoácido polar o cargado, por ejemplo, a un residuo de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Arg, Lys, Asp, Glu, Gin, Asn, His, Ser, Thr, Tyr, Cys, Met y Trp. La mutación en el gen HvGS1-3 puede ser, por tanto, cualquier mutación que dé como resultado un gen HvGS1-3 que codifique las proteínas HvGS1-3 mutadas antes mencionadas.
En una realización, la proteína HvGS1-3 mutada puede ser una proteína que porta una mutación en el residuo de aminoácido 290 de SEQ ID NO:2, por ejemplo, una mutación de Arg a cualquier otro residuo de aminoácido. La mutación también puede ser una mutación del residuo de aminoácido 290 de SEQ ID NO:2 de Arg a un residuo negativamente cargado, por ejemplo, a un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Asp y Glu. La mutación en el gen HvGS1-3 puede ser, por tanto, cualquier mutación que dé como resultado un gen HvGS1-3 que codifique las proteínas HvGS1-3 mutadas antes mencionadas.
En una realización, la proteína HvGS1-3 mutada puede ser una proteína que porta una mutación en el residuo de aminoácido 141 de SEQ ID NO:2, por ejemplo, una mutación de Trp a cualquier otro residuo de aminoácido. La mutación también puede ser una mutación del residuo de aminoácido 141 de SEQ ID NO:2 de Trp a cualquier otro aminoácido de origen natural, excepto Tyr o Trp. La mutación en el gen HvGS1-3 puede ser, por tanto, cualquier mutación que dé como resultado un gen HvGS1-3 que codifique cualquiera de las proteínas HvGS1-3 mutadas antes mencionadas.
La solicitud también se refiere a las siguientes realizaciones:
1. Una planta de cebada con una mutación en el gen que codifica HvGS1-3, donde dicho gen mutado codifica una proteína HvGS1-3 mutada con actividad enzimática reducida.
2. La planta de cebada según la realización 1, donde la proteína HvGS1-3 mutada tiene un valor de kcat con respecto a la síntesis de glutamil hidroxamato a partir de glutamato, hidroxilamina y ATP en el intervalo de 1 a 20 % de la kcat de HvGS1-3 de tipo salvaje.
3. La planta de cebada según una cualquiera de las realizaciones 1 a 2, donde una forma de HvGS1-3 porta una mutación en el residuo de aminoácido 287 de SEQ ID NO:2.
4. Malta preparada a partir de una planta de cebada según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3.
5. Una bebida preparada a partir de una planta de cebada según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3.
6. Un procedimiento de producción de una bebida, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
i. Proporcionar granos de una planta de cebada según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3;
ii. Opcionalmente, maltear al menos parte de dichos granos, obteniendo así malta;
iii. Preparar un extracto de dicha cebada y/o dicha malta de cebada;
iv. Procesar dicho extracto en una bebida.
7. El procedimiento según la realización 6, donde la bebida es cerveza.
Planta de trigo que porta una mutación en el gen GASR7
En una realización, la invención se refiere a una planta de trigo que porta una mutación en el gen que codifica GASR7 en el genoma A. Dicho gen también puede denominarse TaGASR7-A1 y la secuencia está disponible en GenBank con el número NCBI: KJ000052 y la secuencia codificante se proporciona en esta invención como SEQ ID NO:25. La secuencia de aminoácidos de GASR7 se proporciona como SEQ ID NO:8.
Preferiblemente, dicha mutación es una mutación que en dicho gen confiere una secuencia que codifica una enzima GASR7 mutada con actividad reducida. Más preferiblemente, la mutación es una mutación que conduce a una pérdida total de la función GASR7. La pérdida total de la función GASR7 puede ser, por ejemplo, la ausencia del polipéptido GASR7. La pérdida de la función GASR7 también puede conducir a una mayor longitud de grano.
En particular, se prefiere que la mutación sea una mutación que conduzca al gen GASR7 que codifica una forma truncada de GASR7, donde dicha forma truncada de GASR7 comprende como máximo 91 aminoácidos, tal como, como máximo 91 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:8. Por ejemplo, la planta de trigo puede comprender una mutación en el gen GASR7 que conduce a un codón de terminación prematuro, por ejemplo, una mutación que da como resultado la formación de un codón de terminación en un codón que codifica un Trp. En una realización, la planta de trigo puede comprender una mutación en el gen GASR7 que conduce a un codón de terminación prematuro en el codón 91 (nucleótidos 271-273) de SEQ ID NO:25 o en cualquier codón posicionado más 5'.
En una realización, la planta de trigo puede comprender una mutación en el gen GASR7 que conduce a un codón de terminación prematuro en la posición que codifica el residuo de aminoácido n.° 91 de SEQ ID NO:8.
La solicitud también se refiere a las siguientes realizaciones:
8. Una planta de trigo que porta una mutación en el gen que codifica GASR7.
9. La planta de trigo según la realización 8, donde la planta de trigo porta una mutación en el gen que codifica GASR7 que conduce a un codón de terminación prematuro.
Productos vegetales y procedimientos de producción de los mismos.
En una realización, la invención se refiere a productos vegetales de una planta de cebada que porta una mutación en el gen HvGS1-3, por ejemplo, cualquiera de las plantas de cebada descritas anteriormente en esta invención en la sección "Planta de cebada que porta una mutación en el gen GS1-3". El producto vegetal puede ser la planta per se o partes de la misma. Por ejemplo, el producto vegetal puede ser granos de cebada.
En una realización, el producto vegetal es una composición de malta. La composición de malta puede comprender o consistir en plantas de cebada malteada o partes de las mismas, por ejemplo, en granos de cebada malteada, es decir, granos de cebada de una planta de cebada que porta una mutación en el gen HvGS1-3, por ejemplo, cualquiera de las plantas de cebada descritas anteriormente en esta invención en la sección "Planta de cebada que porta una mutación en el gen GS1-3".
Los granos de cebada malteada son granos de cebada que se han sometido a una etapa de germinación, seguido de una etapa de secado. La composición de malta puede comprender o consistir en malta procesada, por ejemplo, puede ser "malta molida" o "harina". Por tanto, dicha composición de malta se puede preparar mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
- Macerar granos de cereales, por ejemplo, granos de cebada;
- Germinar granos de cereales;
- Secar dichos granos de cereales germinados, por ejemplo, mediante secado al horno a temperaturas elevadas.
La invención también se refiere a mosto preparado de una planta de cebada que porta una mutación en el gen HvGSI-3, por ejemplo, una cualquiera de las plantas de cebada descritas anteriormente en esta invención en la sección "Planta de cebada que porta una mutación en el gen GS1-3". El mosto es un extracto acuoso de cebada que, por ejemplo, se puede preparar macerando malta, granos de cebada sin maltear y/o adyuvantes. Se entiende que los "adyuvantes" comprenden cualquier fuente de carbohidrato distinta de malta tal como, aunque de forma no limitativa, cereales (por ejemplo, cebada, maíz o arroz), como granos enteros o productos procesados como sémola, jarabes o almidón. Todos los adyuvantes mencionados anteriormente se pueden usar principalmente como una fuente adicional de extracto (los jarabes se dosifican típicamente después de la maceración). Antes de la maceración, la malta normalmente se muele. Los adyuvantes, que están en trozos más grandes, por ejemplo, granos enteros, también se muelen típicamente.
Los granos de cebada sin maltear carecen, o contienen solo una cantidad limitada, de enzimas beneficiosas para la producción de mosto, tales como enzimas capaces de degradar las paredes celulares o despolimerizar almidón en azúcares. Por tanto, en realizaciones de la invención donde se usa cebada sin maltear para macerar, se prefiere que se añadan una o más enzimas externas adecuadas para la preparación de cerveza al macerado. Incluso en realizaciones de la invención, donde se usa malta de cereal para la producción de mosto, se pueden añadir enzimas externas durante la maceración. Las enzimas adecuadas pueden ser lipasas, enzimas degradadoras de almidón (por ejemplo, amilasas), glucanasas [preferiblemente (1-4)- y/o (1-3,1-4)-p-glucanasa], y/o xilanasas (tales como arabinoxilanasas), y/o proteasas o mezclas de enzimas que comprenden una o más de las enzimas antes mencionadas, por ejemplo, Cereflo, Ultraflo u Ondea Pro (Novozymes).
La maceración normalmente se realiza incubando dicha malta molida y/o granos de cebada y, opcionalmente, adyuvantes con agua a temperaturas elevadas predeterminadas. Típicamente, la maceración se realiza a temperaturas en el intervalo de 40 a 80°C. La temperatura de incubación se mantiene en general constante (maceración isotérmica) o se aumenta gradualmente. Esto puede, por ejemplo, ponerse en práctica de manera secuencial. Si la temperatura de gelatinización es superior a la normalmente observada para la sacarificación normal de la malta, a continuación el almidón se puede gelatinizar y licuar antes de la adición al macerado. En cualquier caso, las sustancias solubles en la malta/cebada/adyuvantes se liberan en dicha fracción líquida. Una filtración posterior permite la separación del mosto y las partículas sólidas residuales, estas últimas también denominadas "bagazo". El mosto así obtenido también se puede denominar "primer mosto". Se puede añadir líquido adicional, tal como agua, al bagazo durante un procedimiento denominado lavado de bagazo. Después del lavado de bagazo y la filtración, se puede obtener un "segundo mosto". Se pueden preparar mostos adicionales repitiendo el procedimiento. Los ejemplos no limitantes de procedimientos adecuados para la preparación de mosto son descritos por Briggs y col. (supra) y Hough y col. (supra).
Después de la maceración y/o lavado de bagazo, el mosto puede someterse a una etapa de ebullición, opcionalmente en presencia de compuestos adicionales, por ejemplo, lúpulo, para obtener mosto hervido.
El mosto según la invención puede ser un primer mosto, segundo mosto, otros mostos o combinaciones de los mencionados anteriormente, así como versiones hervidas de cualquiera de los mencionados anteriormente.
En una realización preferida de la invención, el producto vegetal es una bebida preparada a partir de una planta de cebada que porta una mutación en el gen que codifica HvGS1-3, por ejemplo, una bebida a base de cebada, tal como bebidas alcohólicas a base de cebada y bebidas no alcohólicas a base de cebada. Las bebidas alcohólicas a base de cereales pueden ser, por ejemplo, cerveza o un alcohol destilado.
Dicha cerveza puede ser cualquiertipo de cerveza, por ejemplo, lageroale. Por tanto, la cerveza se puede seleccionar, por ejemplo, de entre el grupo que consiste en Altbier, AmberAle, BarleyWine, Berliner Weisse, Biére de Garde, Bitter, Blonde Ale, Bock, Brown Ale, California Common, CreamAle, Dortmunder Export, Doppelbock, Dunkel, Dunkelweizen, Eisbock, Fruit Lambic, Golden Ale, Gose, Gueuze, Hefeweizen, Helles, India Pale Ale, Kolsch, Lambic, Light Ale, Maibock, Malt Liquor, Mild, Marzenbier, Old Ale, Oud Bruin, Pale Ale, Pilsener, Porter, Red Ale, Roggenbier, Saison, Scotch Ale, Steam Beer, Stout, Schwarzbier, Lager, Witbier, Weissbier y Weizenbock.
Dicho alcohol destilado puede ser cualquier tipo de alcohol destilado. En particular, el alcohol destilado puede basarse en una planta de cebada que porta una mutación en el gen HvGS1-3, por ejemplo, un cereal malteado, tal como una malta de cebada. Los ejemplos no limitantes de tal alcohol destilado incluyen whisky y vodka.
La bebida puede ser una bebida no alcohólica, tal como una bebida no alcohólica a base de cebada, por ejemplo, cerveza sin alcohol o bebidas no alcohólicas de malta, tales como maltina.
Las bebidas se pueden preparar, por ejemplo, mediante cualquiera de los procedimientos que se describen más adelante.
Procedimiento de producción de una bebida
En una realización, la invención se refiere a procedimientos de producción de una bebida. Dichos procedimientos pueden comprender las etapas de:
- Proporcionar una planta de cebada que porta una mutación en el gen HvGS1-3, por ejemplo, cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente en esta invención en la sección "Planta de cebada que porta una mutación en el gen GS1-3";
- Preparar un extracto acuoso de dicha planta o partes de la misma;
- Opcionalmente, procesar además dicho extracto acuoso en una bebida.
Por tanto, la invención proporciona en una realización procedimientos de producción de una bebida, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) Proporcionar granos de una planta de cebada que porta una mutación en el gen que codifica HvGS1-3, por ejemplo, cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente en esta invención en la sección "Planta de cebada que porta una mutación en el gen GS1-3";
b) Opcionalmente preparar una composición de malta de al menos parte de dichos granos, obteniendo así una composición de malta;
c) Preparar un extracto acuoso de dicha cebada y/o composición de malta;
d) Procesar dicho extracto en una bebida.
La etapa b) se puede realizar como se describió anteriormente en esta invención en la sección "Productos vegetales y procedimientos de producción de los mismos". Y la etapa c) puede ser, por ejemplo, una etapa de preparar mosto, es decir, el extracto acuoso puede ser mosto. Dicho mosto puede ser cualquiera de los descritos anteriormente en esta invención en la sección "Productos vegetales y procedimientos de producción de los mismos"; también se puede preparar como se describe en esa sección.
La etapa d) puede comprender la etapa de fermentar dicho extracto acuoso, por ejemplo, fermentar dicho mosto con levadura. La etapa d) puede comprender las etapas de:
d-i) Calentar el extracto (por ejemplo, en presencia de ingrediente(s) adicional(es), tal(es) como lúpulo);
d-ii) Fermentar el extracto calentado, o el mosto calentado, en presencia de levadura;
d-iii) Opcionalmente añadir uno o más ingredientes adicionales,
produciendo así una cerveza.
Dichos ingredientes adicionales pueden ser, por ejemplo, CO2 o compuestos aromáticos.
Los procedimientos de producción de cerveza son bien conocidos en la técnica y, por tanto, los procedimientos de producción de una bebida pueden ser cualquier procedimiento convencional de producción de cerveza que implique el uso de la planta de cebada de la invención como material de partida. Por ejemplo, se pueden encontrar descripciones detalladas de ejemplos de procedimientos adecuados para maltear y elaborar cerveza, incluyendo las publicaciones de Briggs y col. (1981) y Hough y col. (1982). Existen numerosos procedimientos actualizados periódicamente para los análisis de la cebada, la malta y los productos de cerveza, por ejemplo, aunque de forma no limitativa, American Association of Cereal Chemists (1995), American Society of Brewing Chemists (1992), European Brewery Convention (1998) e Institute of Brewing (1997). Se reconoce que se emplean muchos procedimientos específicos para una fábrica de cerveza determinada, estando relacionadas las variaciones más significativas con las preferencias de los consumidores locales. Cualquiera de tales procedimientos de producción de cerveza se puede usar con la presente invención.
La solicitud también se refiere a las siguientes realizaciones:
10. Una levadura que porta una mutación en el gen FDC1 que da como resultado una pérdida total de la función de la actividad fdc1, donde la mutación da como resultado la formación de un codón de terminación en un codón que codifica un Trp.
11. La levadura según la realización 10, donde la levadura es S. cerevisiae y dicha S. cerevisiae porta una mutación que da como resultado la formación de un codón de terminación en el codón que codifica Trp159 de ScFDC1 de S. ce rev is iae .
12. Un procedimiento de preparación de una bebida, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
i. Proporcionar mosto;
ii. Fermentar dicho mosto con una levadura según una cualquiera de las realizaciones 10 a 11;
iii. Opcionalmente procesar adicionalmente el mosto fermentado en una bebida.
Listado de secuencias
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A menos que se indique lo contrario, todos los números de acceso a GenBank se dan en relación con la versión de la base de datos de GenBank a 1 de julio de 2016.
EJEMPLOS
La invención se ilustra adicionalmente mediante las descripciones y ejemplos de WS que no se deben interpretar como limitantes de la invención. A menos que se indique lo contrario, se utilizaron técnicas bioquímicas y de biología molecular básicas para trabajar con ácidos nucleicos, proteínas (incluyendo enzimas) y organismos.
Todos las líneas de trabajo descritas a continuación incluyen, por ejemplo, números específicos de granos usados, concentración específica y condiciones específicas para p Cr , etc. El experto en la materia podrá adaptar los ejemplos específicos proporcionados para usar un número diferente de granos, concentraciones diferentes, condiciones para PCR diferentes, etc.
WS1: Preparación de granos de cereales mutagenizados al azar
Etapa 1.1: Procedimiento de mutagénesis
Para inducir mutaciones, los granos recolectados de plantas de cebada se incubaron en una solución del mutágeno NaN3, según los detalles proporcionados por Kleinhofs y col. (1978) y aquellos en el documento US 7.838.053 de K. Breddam y col. Este procedimiento induce mutaciones puntuales en el ADNg de los granos de cebada, lo que normalmente confiere codones distribuidos aleatoriamente para sustituciones de aminoácidos o terminaciones traduccionales del ADN que codifica la proteína, es decir, provocando cambios en las proteínas y truncamientos en las proteínas codificadas por el ADN mutagenizado. Sin embargo, los procedimientos de la invención también son útiles para producir plantas de cereales con mutaciones puntuales en el ADNg de regiones que no codifican proteínas, por ejemplo, promotores, terminadores e intrones.
Se sembró un total de 500 g de granos mutagenizados, todos de la generación M0, en una parcela de 7,5 m2 en el campo. Los granos de la generación M1 se multiplicaron, en algunos casos, en parcelas de campo, produciendo finalmente plantas mutantes de generación M2 o M3 (cf. Figura 2A). Se esperaba que las mutaciones en los granos de generación M3 se produjeran a una frecuencia correspondiente a 0,9-2,3 por 10.000 granos (cf. Kleinhofs y col., supra).
WS2: Preparación de una biblioteca ordenada de granos derivados de plantas de cereales mutadas Etapa 2.1: Recogida de plantas de cereal, trillado de espigas
Cada "Parcela de campo" de 7,5 m2 (FP#01, FP#02, etc.; cf. Figura 2B) en el campo se dividió en una serie de "subparcelas de campo" (FSP#01, FSP#02, etc.; Figura 2B, acción etiquetada 1), cada una de 0,45 m2 de tamaño y conteniendo -300 plantas individuales. Todas las espigas en una subparcela se recogieron manualmente usando una hoz y luego se recogieron en una única bolsa. Los contenidos de las bolsas individuales se trillaron por separado, lo que produjo bolsas etiquetadas como "Total de granos", con cada una comprendiendo ~6000 granos (GT#01, GT#02, etc.; Figura 2B, acción etiquetada 2).
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, los siguientes temas relevantes para la Etapa 2 se detallan en los Ejemplos a continuación:
- Ejemplo 1: Cultivo de plantas de cebada en "Parcelas de campo";
- Ejemplo 2: Recogida de granos en "Parcelas de campo" individuales.
WS3: Determinación de si una muestra de biblioteca contiene granos mutados
Etapa 3.1: División de agrupamientos de granos de "Total de granos" individuales en dos fracciones Los granos trillados en bolsas de "Total de granos" individuales se dividieron en dos fracciones, de las cuales las muestras de "Total de subgranos" consistieron en -1500 granos (etiquetados SGT#01, SGT#02, etc.; cf. Figura 2C; acción 1), cuyo procesamiento se detalla en la Etapa 3.2 a la Etapa 3.4 a continuación. El procesamiento de granos en fracciones de "Total de subgranos" busca, en términos generales, determinar cuál(es) de dicha(s) fracción(es) de grano contiene(n) la(s) mutación(es) de interés. Por razones de claridad, pero no de relevancia para las acciones relacionadas con la Etapa 3, el resto de una fracción de "Total de granos", consistente en ~4500 granos, se procesó como se detalla en la descripción relacionada con la Etapa 4.
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, el siguiente tema relevante para la Etapa 3.1 se detalla en los Ejemplos a continuación:
- Ejemplo 3: Descripción de granos en "Total de subgranos".
Etapa 3.2: Preparación de muestras de harina a partir de granos de "Total de subgranos"
Cada muestra de total de subgranos que contiene 1500 granos, es decir, muestras indicadas SGT#01, SGT#02, etc., se molió en un molino de laboratorio estándar (cf. Figura 2B, acción 2), con una limpieza minuciosa entre aplicaciones, produciendo las correspondientes muestras de harina, indicadas SFT#01, SFT#02, etc., (cf. Figura 2C).
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, el siguiente tema relevante para la Etapa 3.2 se detalla en los Ejemplos a continuación:
- Ejemplo 4: Elaboración de harina de granos derivados de una muestra de "Total de subharina".
Etapa 3.3: Preparación de ADNg a partir de alícuotas de harina
Se distribuyeron alícuotas de muestras de "Total de subharina" individuales, cada una de 25 g y denominadas "Alícuota de muestra de subharina" (ASFT#01, ASFT#02, etc.), en recipientes separados (cf. Figura 2C, acción 3).
A continuación se extrajo ADNg de cada alícuota de harina (cf. Figura 2C, acción 4), y cada ADNg extraído se situó en un pocillo de una placa de microtitulación con las muestras indicadas ADNg(GT#01), ADNg(GT#02), etc., que denota el origen del "Total de granos" específico de una muestra. Alternativamente, la extracción se puede realizar en pocillos de una placa de microtitulación.
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, los siguientes temas relacionados con la Etapa 3.3 se detallan en los Ejemplos a continuación:
- Ejemplo 5: Preparación de alícuotas de harina de 25 g (ASFTs);
- Ejemplo 6: Preparación de ADNg de ASFTs.
Etapa 3.4: Análisis de muestras que contienen ADNg de GTs
A continuación, se transfirieron alícuotas de ADNg derivadas de muestras individuales de "Total de granos" a una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos (cf. Figura 2C, acción 5), incluyendo ocasionalmente dos muestras de control negativo. El análisis de ddPCR posterior, por ejemplo, como se detalla en el Ejemplo 7, puede ayudar a identificar muestras que contienen ADNg de plantas mutantes.
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, el siguiente tema relacionado con la Etapa 3.4 se detalla en la sección de Ejemplos:
- Ejemplo 7: Experimentos basados en ddPCR con ADNg derivado de ASFTs.
WS4: Hallazgo de grano(s) individual(es) caracterizado(s) por una mutación de interés
Etapa 4.1: Especificaciones de un "Agrupamiento de bibliotecas de granos" (GLP, por sus siglas en inglés)
Dado que un análisis, por ejemplo, como se detalla en la Etapa 3.4 anterior, arrojó una señal para indicar la presencia de ADNg mutado en una o más de las 96 muestras analizadas, es decir, aquellas indicadas ADNg(GT#01), ADNg(GT#02), etc. en la Figura 2C, se consideró muy probable que los 4500 granos de la fracción de "Total de granos", etiquetada como "Agrupamiento de bibliotecas de granos" (GLP#01, GLP#02, etc.; Figura 2D, acción 2), comprendían uno o más granos con la mutación de interés idéntica. En la presente solicitud, el procesamiento de dichos GLPs se relacionaría con los últimos esfuerzos para hallar un grano mutado específico, que alberga la misma mutación que la de una molécula plantilla detectada en una alícuota procesada derivada de una muestra de "Total de granos" (Figuras 2B, 2C y 2D), y que además provocó una señal mutante en el análisis de ddPCR correspondiente (como se ilustra en la Figura 2C, acción 5).
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, el siguiente tema relevante para la Etapa 4.1 se detalla en la sección de Ejemplos de la presente publicación:
- Ejemplo 8: Recogida de granos para un "Agrupamiento de bibliotecas de granos".
Etapa 4.2: Reducción de un "Agrupamiento de bibliotecas de granos" a una "Fracción de agrupamiento de bibliotecas de granos"
Con una muestra de GLP intacta que contenía ~4500 granos derivados de un GT específico (y dado que el análisis basado en ddPCR de ADNg, como se ilustra en la Figura 2C, acción 5, había indicado que dicho ADNg contenía una mutación en el ADNg, normalmente era suficiente para identificar selectivamente menos de 12 granos individuales para una mutación génica específica idéntica a la revelada por el análisis de la Etapa 3.4. Por esta razón, se preparó una muestra de ~1200 granos de un GLP de interés (Figura 2d , acción 2), produciendo una "Fracción de agrupamiento de bibliotecas de granos", abreviada FGLP. Finalmente, se aislaron un total de 96 muestras, cada una consistiendo en 12 granos de una FGLP específica, cada una consistiendo en un subagrupamiento secundario.
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, el siguiente tema para la Etapa 4.2 se detalla en los siguientes Ejemplos de la presente publicación:
- Ejemplo 9: Obtención de una "Fracción de un agrupamiento de bibliotecas de granos" de un "Agrupamiento de bibliotecas de granos".
Etapa 4.3: Separación de granos y muestras de harina correspondientes
Cada uno de los 12 granos en una muestra preparada como se describió anteriormente en la Etapa 4.2, se dañó perforando un orificio delgado en los endospermas. Mientras que los granos dañados, pero viables, se transfirieron a un pocillo de una placa de microtitulación de pocillos profundos (Figura 2D, acción 3), la harina liberada al perforar los mismos granos se agrupó y transfirió a una segunda placa de microtitulación (Figura 2D, acción 4). Este procedimiento se llevó a cabo para las 95 muestras restantes (manteniendo un sistema de numeración idéntico de las dos placas), produciendo una placa de microtitulación con muestras de granos (indicada "Agrupamientos de granos perforados de fracción de agrupamiento de bibliotecas", abreviado PDGLP; cf. Figura 2D), y una placa de microtitulación con muestras de harina de endosperma (indicada "Agrupamientos de harina de granos perforados", abreviado PFGLP; Figura 2D).
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, los siguientes temas relacionados con la presente Etapa 4.3 se detallan en los Ejemplos a continuación:
- Ejemplo 10: Perforación de granos de cebada;
- Ejemplo 11: Realización de "Agrupamientos de harina a partir de granos perforados".
Etapa 4.4: Preparación de ADNg derivado de harina de endosperma de plantas mutantes
La harina de cada pocillo de la placa de microtitulación, preparada como se describió anteriormente en la Etapa 4.3, se sometió por separado a la extracción de ADNg (Figura 2D, acción 5). Dicha extracción empleó un procedimiento semiautomatizado, basado en las recomendaciones proporcionadas por el kit NucleoSpin 96 Plant II (Machery-Nagel), produciendo "Agrupamientos de ADNg" en los que un pocillo individual de una placa de microtitulación contiene ADNg derivado de harina de 12 granos de cebada.
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, los siguientes temas relacionados con la Etapa 4.4 se detallan en los Ejemplos de la presente publicación:
- Ejemplo 12: Purificación de ADNg a partir de harina de granos perforados ("Agrupamientos de ADNg").
Etapa 4.5: Análisis de ADNg de endospermas mutantes
Se realizaron análisis de ddPCR estándar con las muestras de ADNg, preparadas como se describe en la Etapa 4.4 anterior, según las recomendaciones proporcionadas por Bio-Rad para la utilización del lector de gotas y del aparato generador de gotas QX200, utilizando conjuntos de cebadores para analizar mutaciones específicas de interés. Siempre que el análisis de ADNg derivado de un pocillo individual proporcione señales para indicar la presencia de ADN mutado en esa muestra (cf. Figura 2D, acción 6), había una alta probabilidad de que uno o varios de los granos de los que se originó el ADNg contuvieran la mutación de interés.
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, el siguiente tema relacionado con la Etapa 4.5 se detalla en la sección de Ejemplos de la presente publicación:
- Ejemplo 13: Análisis de ADNg basado en ddPCR de harina de granos perforados.
Etapa 4.6: Identificación del grano mutante de interés
Si bien las muestras de la placa de microtitulación indicadas PFGLP contenían harina (cf. Etapa 4.3), los pocillos correspondientes en las placas indicadas PDGLP contenían 12 granos vivos correspondientes. En consecuencia, la siguiente etapa fue aislar la muestra que consistía en los 12 granos de interés (Figura 2D, acción 7), y posteriormente germinar estos (Figura 2D, acción 8).
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, el siguiente tema de la Etapa 4.6 se detalla en la sección de Ejemplos de la presente publicación:
- Ejemplo 14: Germinación de posibles plantas mutantes.
Etapa 4.7: Verificación de rasgos
El investigador experto dispone de varios procedimientos con el fin de determinar si un mutante potencial posee las características esperadas, es decir, rasgos de interés. En el presente caso, se extrajo ADNg de las plántulas germinadas, se identificó y propagó como se describe en la Etapa 4.6 anterior y se confirmó mediante análisis combinados utilizando ddPCR y secuenciación de ADN cuál de los 12 mutantes posibles alberga realmente la mutación de interés (cf. Figura 2D, acción 9).
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, los siguientes temas relacionados con la Etapa 4.7 se detallan en la sección de Ejemplos de la presente publicación:
- Ejemplo 15: Detalles de análisis, incluyendo ddPCR y secuenciación de ADN.
WS5: Generación y uso de "Superagrupamientos" de ADNg
Etapa 5.1: Identificación de ultra alto rendimiento de granos de cebada mutados
La presente invención también describe el uso combinado de dos plataformas analíticas de PCR digital diferentes, lo que mejora los procedimientos de identificación de mutaciones de baja prevalencia. En esta invención, la plataforma RainDrop, comercializada por RainDance Technologies, se utilizó para encontrar mutaciones de ADN en muestras complejas de ADNgs derivados de plantas mutantes, mientras que la de Bio-Rad proporcionó formas de identificar esos extractos de granos derivados de mutantes de cebada individuales.
En aras de la claridad de la descripción, y no como limitación, los siguientes temas relacionados con la Etapa 4.7 se detallan en la sección de Ejemplos de la presente publicación:
- Ejemplo 16: Preparación de "Superagrupamientos" de ADNg;
- Ejemplo 17: ddPCR con ADNg derivado de "Superagrupamientos".
En resumen, simplemente para proporcionar una breve descripción general, las WSs y los ejemplos correspondientes se organizan de la siguiente manera:
WS2:
- Ejemplo 1: Cultivo de plantas de cebada en "Parcelas de campo";
- Ejemplo 2: Recogida de granos en "Parcelas de campo" individuales.
WS3:
- Ejemplo 3: Descripción de granos en "Total de subgranos";
- Ejemplo 4: Elaboración de harina de granos derivados de una muestra de "Total de subharina;
- Ejemplo 5: Preparación de alícuotas de harina de 25 g (ASFTs);
- Ejemplo 6: Preparación de ADNg de ASFTs;
- Ejemplo 7: Experimentos basados en ddPCR con ADNg derivado de ASFTs.
WS4:
- Ejemplo 8: Recogida de granos para un "Agrupamiento de bibliotecas de granos";
- Ejemplo 9: Obtención de una "Fracción de un agrupamiento de bibliotecas de granos" de un "Agrupamiento de bibliotecas de granos";
- Ejemplo 10: Perforación de granos de cebada;
- Ejemplo 11: Realización de "Agrupamientos de harina a partir de granos perforados";
- Ejemplo 12: Purificación de ADNg a partir de harina de granos perforados ("Agrupamientos de ADNg");
- Ejemplo 13: Análisis de ADNg basado en ddPCR de harina de granos perforados;
- Ejemplo 14: Germinación de posibles plantas mutantes;
- Ejemplo 15: Detalles de plantas mutantes identificadas a través de identificaciones selectivas basadas en ddPCR. WS5:
- Ejemplo 16: Preparación de "Superagrupamientos" de ADNg;
- Ejemplo 17: ddPCR con ADNg derivado de "Superagrupamientos".
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Cultivo de plantas de cebada en "Parcelas de campo".
Los granos de cebada se mutagenizaron con NaN3 como se describió anteriormente en WS1 en esta invención. Los granos de cebada mutagenizados se propagaron en parcelas de campo de 7,5 m2 En cada parcela, se sembraron 250 g de granos y se cultivaron hasta la madurez.
Ejemplo 2: Recogida de granos en "Parcelas de campo" individuales.
En el momento de la recogida, las parcelas de campo se dividieron en 15-17 subparcelas, cada una conteniendo aproximadamente 300 plantas. Las plantas se recogieron con hoz y se trillaron y embolsaron, cada subparcela individualmente. Así, los granos en una bolsa de "Total de granos" se derivaron de 300 plantas.
Ejemplo 3: Descripción de granos en "Total de subgranos".
Todos los granos de una muestra de "Total de granos" se dividieron en 4 fracciones aleatorias de igual tamaño, usando un divisor de muestras de granos riffle. Cada fracción representa el 25 % de la cantidad total de granos de una muestra de "Total de granos". Una de estas fracciones constituye un "Total de subgranos".
Ejemplo 4: Elaboración de harina de granos derivados de una muestra de "Total de subharina".
Todos los granos de una muestra de "Total de subgranos" se situaron en un molino de granos (Retsch, GrindoMix GM200). Los granos se molieron durante 30 s a 10.000 RPM. La harina resultante ("Total de subharina"; -75 g) se situó en una bolsa de papel y se almacenó a 23°C.
Ejemplo 5: Preparación de alícuotas de harina de 25 g (ASFTs).
De una muestra de "Total de subharina", se pesó una alícuota de 25 g de harina. La alícuota de 25 g de harina (ASTF) se transfirió a una bolsa de papel y se almacenó a 23°C.
Ejemplo 6: Preparación de ADNg purificado de ASFTs.
Se transfirió una alícuota de 25 g de harina (ASTF) a una botella de vidrio de 250 ml y se volvió a suspender en 30 ml de H2O, seguido de la adición de 70 ml de tampón de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) al 2 % calentado a 65 °C conteniendo NaCl 1,4 M, Na2EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, ajustado a pH 8,0 con NaOH 1 M. Después de que la solución se esterilizara en autoclave y posteriormente se complementara con 250 j l de 10 mg/ml de RNasa A y 250 |jl de proteinasa K, se incubó con mezcla regular para degradar ARN y proteína. Se transfirió una alícuota de 50 ml a un tubo Falcon de 50 ml, seguido de la eliminación de los precipitados insolubles por centrifugación a 4000 rpm durante 10 min, y luego se transfirieron 24 ml del sobrenadante resultante a un tubo nuevo de 50 ml.
Después de dos extracciones consecutivas con cloroformo (la primera con 15 ml, la segunda con 12,5 ml), se transfirieron 15 ml de la fase acuosa que contenía ácidos nucleicos, incluyendo ADNg, a un tubo de 50 ml que contenía 30 ml de un tampón CTAB al 0,5 % preparado con NaCl 0,04 M, Tris-HCl 50 mM, ajustado a pH 8,0 con NaOH 1 M. El tubo se invirtió 6-8x y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente antes de la centrifugación a 4000 rpm durante 10 min. Mientras se descartaba la fase acuosa, el precipitado que contenía ADNg se disolvió lentamente en 10 ml de NaCl 1,2 M durante la noche a 8°C. A continuación, se realizó la extracción con 10 ml de cloroformo antes de la centrifugación a 4000 rpm durante 15 min. De la fase acuosa, se combinaron 9,5 ml con 5,5 ml de isopropanol y la muestra resultante se invirtió suavemente 6-8x, y a continuación se incubó a temperatura ambiente durante 20 min, seguido de la precipitación de ADNg por centrifugación a 4000 rpm durante 10 min.
El precipitado que contenía ADNg se lavó con 5 ml de etanol al 70 % antes de la centrifugación a 4000 rpm durante 10 min, con el sobrenadante resultante descartado, mientras que el precipitado de ADNg se secó durante -40 min a temperatura ambiente. Después de la adición de 5 ml de H2O e incubación durante 30 min a 65°C para resuspender el ADNg, se transfirieron 500 j l del ADNg derivado de "Total de subharina" a un pocillo profundo específico de 2 ml de una placa de microtitulación correspondiente. Dicha placa con muestras de diferentes muestras de ADNg derivadas de "Alícuotas de SFTs individuales" se denominó "ADNg purificado" y se utilizó para almacenamiento a largo plazo o análisis experimental.
Ejemplo 7: Experimentos basados en ddPCR con ADNg derivado de ASFTs.
La ddPCR se realizó con un sistema Droplet Digital PCR QX200 (Bio-Rad), de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Los cebadores y las sondas específicos de secuencia para los alelos mutantes y de tipo salvaje se adquirieron en Bio-Rad.
Para fines analíticos, se añadieron 5 j l de ADNg purificado de ASFTs separadas, cf. Figura 2C, o de ADNg de levadura (preparado como se describe en WS3 de levadura) a una mezcla de PCR de 17 j l que contenía 11 j l de Supermix para ddPCR 2x para sondas (n.° dUTP; Bio-Rad), cebador para PCR específico de diana 900 nM, sondas de detección de mutantes 250 nM y de referencia marcadas con sondas 6-carboxi-fluoresceína - FAM y hexaclorofluoresceína -HEX, respectivamente. La sonda de detección de mutantes se une específicamente a la secuencia diana que comprende la mutación, mientras que la sonda de detección de referencia se une específicamente a la secuencia de tipo salvaje. La mezcla de reacción se cargó en el generador de gotas AutoDG (Bio-Rad), y la generación de gotas se llevó a cabo de acuerdo con el manual del fabricante. La emulsión de gotas se sometió a un ciclo térmico utilizando condiciones estándar de PCR: desnaturalización a 95°C durante 10 min, 40 ciclos de PCR a 94°C durante 30 s y 55°C durante 1 min, y una extensión final a 98°C durante 10 min antes del almacenamiento de la placa de microtitulación a 8°C. La amplificación por PCR en gotas se confirmó utilizando el QX200 Droplet Reader (Bio-Rad). El umbral analítico se determinó comparando los resultados de ddPCR de tipo salvaje y sin plantilla. Todos los datos se evaluaron por encima del umbral.
Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft, versión v1.7 (Bio-Rad).
Ejemplo 8: Recogida de granos para un "Agrupamiento de bibliotecas de granos".
Todos los granos de una muestra de "Total de granos" se dividieron en 4 fracciones aleatorias de igual tamaño, usando un divisor de muestras de granos riffle. Cada fracción representa el 25 % de la cantidad total de granos de una muestra de "Total de granos". Un "Agrupamiento de bibliotecas de granos" contenía los granos agrupados de 3 de las fracciones.
Ejemplo 9: Obtención de una "Fracción de un agrupamiento de bibliotecas de granos" de un "Agrupamiento de bibliotecas de granos".
La "Fracción de un agrupamiento de bibliotecas de granos" se estableció eliminando secuencialmente 96 muestras de 12 granos, cada una de un "Agrupamiento de bibliotecas de granos", donde cada muestra de 12 granos constituye un subagrupamiento secundario.
Ejemplo 10: Perforación de granos de cebada
Los granos de la "Fracción de agrupamiento de bibliotecas de granos" se separaron en 96 alícuotas, cada una consistiendo en 12 granos. Cada alícuota de 12 granos se situó en un trozo de papel de pesaje y a continuación se fijó consecutivamente con un par de fórceps mientras se usaba una máquina de grabado (Marathon-3, Saeyang Microtech) equipada con un taladro de 1,6 mm para perforar un pequeño orificio de 2-3 mm de profundidad en el endosperma. El movimiento giratorio movía la harina desde el endosperma hasta la parte superior del grano y el papel de pesaje circundante. Las muestras perforadas de 12 granos se situaron en pocillos separados de 2 ml de una placa de microtitulación, lo que produjo subagrupamientos secundarios de granos de cebada perforados, también denominados "Agrupamientos de granos de cebada perforados de la fracción del agrupamiento de bibliotecas". (Figura 2D, acción 3). Los granos perforados se almacenaron a 20°C hasta su posterior análisis.
Ejemplo 11: Realización de "Agrupamientos de harina a partir de granos perforados".
Las 96 muestras de harina, cada una con harina derivada de 12 granos de cebada perforados (como se detalla en el Ejemplo 10), se transfirieron a pocillos separados de una placa de microtitulación de 1,5 ml ("Agrupamientos de harina de granos perforados"; cf. Figura 2D, acción 4), manteniendo un sistema de numeración de muestras que coincida con el de los granos perforados.
Ejemplo 12: Purificación de ADNg a partir de harina de granos perforados ("Agrupamientos de ADNg").
Los agrupamientos de harina de granos de cebada perforados, preparados como se detalla en el Ejemplo 11, se sometieron a extracción de ADNg utilizando un procedimiento de extracción de ADN semiautomatizado como se detalla en las instrucciones del kit NucleoSpin 96 Plant II (Macherey-Nagel). En consecuencia, cada pocillo de la placa de microtitulación contenía ADNg de harina de 12 granos (Figura 2d , acción 5).
Ejemplo 13: Análisis de ADNg basado en ddPCR de harina de granos perforados.
Mientras que los ensayos de WS3, cf. Figura 2C y Ejemplos 3-7, se diseñaron para identificar qué muestra(s) individual(es) de 96 alícuotas de ADNg, en total representando ADNg de ~6000 granos mutados, contenía(n) una mutación nucleotídica de interés, los esfuerzos posteriores específicos de WS4, cf. Figura 2D, fueron diseñados para indicar con precisión granos mutantes específicos.
Como se ilustra en la Figura 2D, acción 6, un esfuerzo principal fue determinar qué muestra de ADNg de 12 granos distintos daría un resultado de ensayo positivo en un análisis de ddPCR. Por lo tanto, utilizando condiciones de reacción y parámetros de análisis idénticos a los proporcionados en el Ejemplo 7, fue posible distinguir qué pocillo en una placa de microtitulación contenía el ADNg de interés. Las muestras que comprendían un grano mutante heterocigoto se definieron como que tenían una abundancia fraccional de 5 % (±2,5 %), las que tienen un 10 % (±2,5%) comprendían un grano mutante homocigoto.
En base a los esfuerzos analíticos descritos anteriormente, fue posible identificar y seleccionar posibles agrupamientos de harina y, en consecuencia, los agrupamientos de granos correspondientes con una mutación nucleotídica de interés. Los mutantes homocigotos y heterocigotos se transfirieron al suelo en macetas grandes y se transfirieron al invernadero para su propagación. Se descartaron todas las plántulas negativas.
Ejemplo 14: Germinación de posibles plantas mutantes.
Siempre que el análisis de ADNg de harina de 12 granos de cebada arrojara una señal mutante (cf. Figura 2D, acción 6), se germinaron los granos correspondientes de los "Agrupamientos de granos perforados de fracción de agrupamiento de bibliotecas" (Figura 2D, acciones 7 y 8).
Ejemplo 15: Detalles de plantas mutantes identificadas a través de identificaciones selectivas basadas en ddPCR.
El contenido de un "Agrupamiento de granos perforados de fracción del agrupamiento de bibliotecas", que consistía en 12 granos perforados, se situó en una placa de Petri de 9 mm (preparada con 2 láminas de papel de filtro (8,5 mm; Whatman) al que se añadieron 2 ml de H2O). Después de la fase de germinación durante 96 h en la oscuridad a 16°C, los granos se situaron en el suelo y se cultivaron adicionalmente en condiciones controladas durante 7 días. A continuación, se extrajeron secciones de tejido de 2 x 5 mm de las primeras hojas y se situaron en tubos de 0,2 ml. Se pipetearon 50 pl de solución de extracción (Sigma) sobre cada hoja y se incubaron a 95°C durante 10 min. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y se mezclaron con 50 pl de solución de dilución (Sigma). Las muestras de ADNg se finalizaron combinando 10 pl de la mezcla de extracción y dilución con 30 pl de H2O.
Con fines analíticos, se añadieron 5 pl de ADNg purificado a una mezcla de PCR de 17 pl que contenía 11 pl de Supermix para ddPCR 2x para sondas (n.° dUTP; Bio-Rad), cebadores de PCR específicos de diana 900 nM, sondas específicas de mutantes 250 nM (6-carboxi-fluoresceína - FAM) y específicas de tipo salvaje (hexaclorofluoresceína -h Ex ). La mezcla de reacción se cargó en el generador de gotas AutoDG (Bio-Rad), y la generación de gotas se llevó a cabo de acuerdo con el manual del fabricante. La emulsión de gotas se sometió a un ciclo térmico utilizando condiciones estándar de PCR: desnaturalización a 95°C durante 10 min, 40 ciclos de PCR a 94°C durante 30 s y 55°C durante 1 min, y una extensión final a 98°C durante 10 min antes del almacenamiento de la placa de microtitulación a 8°C. La amplificación por PCR en gotas se confirmó utilizando el QX200 Droplet Reader (Bio-Rad). El umbral de ensayo se determinó comparando los resultados de ddPCR de tipo salvaje y sin plantilla. Todos los datos obtenidos se evaluaron por encima del umbral. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). Una plántula individual se consideró un mutante heterocigoto, siempre que el 50 % del número total de eventos positivos de ddPCR derivaran de la sonda mutante (FAM). Una plántula individual se consideró un mutante homocigoto, cuando el 100 % del número total de eventos positivos de ddPCR se derivaran de la sonda mutante (FAM). Las plantas mutantes individuales se cultivaron hasta la madurez (cf. Figura 1D, acción 9).
Ejemplo 16: Preparación de "Superagrupamientos" de ADNg.
Simplemente, una alícuota (por ejemplo, 50 j l ) de cada extracto de ADNg de todos los 94 "Subagrupamientos" de una placa de biblioteca se agruparon en un "Superagrupamiento".
En algunas realizaciones, los superagrupamientos de ADNg se enriquecen aún más antes de realizar el análisis de ddPCR.
Por tanto, por ejemplo, se pueden amplificar 2 j l de ADNg de un superagrupamiento en una reacción de PCR estándar que comprende, por ejemplo, 10 j l de tampón de reacción 5X Q5 (New England Biolabs), dNTP 200 jM , 0,02 U /jl de ADN polimerasa Q5 de alta fidelidad, 100 nM de cebador directo de PCR específico de diana, 100 nM de cebador inverso de PCR específico de diana, 100 nM de una sonda de bloqueo y agua. A continuación, la mezcla de PCR puede someterse a ciclos térmicos utilizando condiciones de PCR estándar durante aprox. 20 ciclos de PCR. Esto conduce a la generación de un superagrupamiento enriquecido de ADNg.
Ejemplo 17: Análisis de ddPCR de ADNg derivado de "Superagrupamientos".
Para reducir el uso de productos químicos en paralelo con la obtención de tasas de rendimiento mejoradas en los esfuerzos de identificación selectiva con granos de cebada mutados, se desarrolló un uso combinado de dos tecnologías, de las cuales una fue proporcionada por RainDance Technologies (superior en la fabricación de gotas) y la otra por Bio-Rad (sobresaliente en la cantidad de muestras a procesar simultáneamente). En términos generales, la tecnología RainDance se utilizó para identificar muestras específicas, aunque complejas, que contienen plantillas de ADNg de numerosos granos mutantes (en esta invención más adelante se detallan en la sección "Procedimiento A"), mientras que los análisis posteriores basados en Bio-Rad ayudaron a identificar granos únicos caracterizados por la mutación de interés (en esta invención más adelante descrito en el "Procedimiento B").
Procedimiento A: ddPCR basada en RainDance con 16 "superagrupamientos" de ADNg.
En primer lugar, se generaron gotas para "Superagrupamientos" individuales (por ejemplo, para 4 a 8 superagrupamientos) usando el instrumento RainDrop Source. El ADNg usado para la ddPCR basada en RainDance puede ser el extracto de ADNg combinado o puede ser el superagrupamiento enriquecido de ADNg preparado como se describe en el Ejemplo 16. Por ejemplo, una alícuota de 20 j l de ADNg de un "Superagrupamiento" o una alícuota de 10 j l del superagrupamiento enriquecido de ADNg se combinaron con 25 j l de Supermix para sondas (Bio-Rad); Estabilizador de gotas (RainDance); 900 nM del cebador directo específico de diana; 900 nM del cebador inverso específico de diana; 120-250 nM de la sonda de detección de tipo salvaje (VIC); 250-440 nM de la sonda de detección de mutantes (FAM), y; H2O para un ajuste a un volumen de reacción total de 50 jl. Se añadieron un total de 4-8 mezclas de reacción individuales, que representan 4-8 "Superagrupamientos" individuales de ADNgs, al chip de fuente de 8 canales (RainDance) y se procesaron en el instrumento Source (RainDance). Todo el procedimiento descrito anteriormente en esta invención puede repetirse para "Superagrupamientos" adicionales, con lo que el número total de muestras para el análisis posterior será de 8 a 16.
Se sellaron dos tiras de 8 pocillos que contenían las gotas generadas a partir de las mezclas de reacción, según lo descrito anteriormente en esta invención, y los contenidos se amplificaron como se detalla en el Ejemplo 9 en esta invención. Posteriormente, las mezclas amplificadas se transfirieron al Instrumento Sense (RainDance) y se analizaron utilizando el software de análisis de datos RainDrop Analyst.
Los "Superagrupamientos" que revelaron señales más altas relacionadas con la mutación de interés, en comparación con la señal promedio de los eventos mutantes en los 16 "Superagrupamientos", se definieron como que contenían ADNg derivado de posibles mutantes.
Procedimiento B: Análisis de ddPCR basado en Bio-Rad de "Superagrupamientos".
El análisis de ddPCR se realizó en alícuotas de cada una de las 96 muestras de ADNg que constituían un "Superagrupamiento" de interés, como se detalla en el Procedimiento A en esta invención anterior, había indicado la presencia de una plantilla mutante. El análisis se llevó a cabo como se describe en esta invención anteriormente para WS3 y WS4.
Particularmente, el análisis de datos tuvo como objetivo seleccionar el agolpamiento de granos que comprende la mutación predeterminada de interés. Los conjuntos de datos en el umbral se definieron individualmente con respecto a los gráficos de todos los puntos de datos para la placa completa. Las categorías de análisis, incluyendo, aunque de forma no limitativa, gráficos de concentración diana, abundancia fraccional y eventos de mutación identificados, se evaluaron individualmente con respecto a la selección de candidatos.
La abundancia fraccional se puede determinar como: [Señal de ("sonda de detección de mutantes")] dividida por [Señales de ("sonda de detección de referencia" "sonda de detección de mutantes")].
Se supuso que las muestras contenían ADN mutante siempre que se observaran las siguientes propiedades:
- Una mayor abundancia fraccional;
- Un mayor nivel de gotas mutantes, o;
- Un mayor número de eventos mutantes a una escala del 50 % o más, por encima del promedio.
Ejemplo 18: Identificación selectiva basada en ddPCR para mutantes de cebada con mutaciones específicas en el gen para glutamina sintetasa GS1-3.
Se identificó una planta de cebada que porta una mutación específica utilizando los procedimientos descritos en las Líneas de trabajo y los Ejemplos anteriores en esta invención. Tal como se describe, los procedimientos pueden usarse para la identificación de cualquier mutante. Identificación de una mutación específica, G ^ A , que conduce a la sustitución de un residuo de ácido Gly por Asp en la posición 287 de la secuencia para la isoforma 3 de glutamina sintetasa 1 de cebada (HvGS1-3).
Glutamina sintetasa
La glutamina sintetasa 1 (GS1) es una enzima clave involucrada en la asimilación de nitrógeno en plantas superiores al catalizar la condensación de amonio o amoniaco y glutamato en glutamina. En suelos ricos en nitrógeno, la disponibilidad excesiva de nitrógeno puede conducir a una mayor acumulación de nitrógeno durante el llenado del grano en la cebada, lo que afecta negativamente a la calidad de la malta. Las mutaciones inactivadas en GS1 pueden conducir a graves deficiencias de crecimiento, lo que destaca la importancia de la enzima para la adaptación general de la planta (Tomoyuki Yamaya y Miyako Kusano, 2014). Se conocen tres isoformas de g S1 en la cebada (HvGS1-1, HvGS1-2, HvGS1-3). De las tres isoformas de cebada, HvGS1-3 es principalmente activa en el grano en desarrollo y es regulada positivamente en condiciones de alto contenido de amonio. Se diseñó una estrategia de mutación con el objetivo de mantener un desarrollo óptimo de la planta, pero reduciendo la capacidad de acumulación de nitrógeno en grano. La estrategia de mutación se centró en las sustituciones de aminoácidos que reducen la actividad enzimática de GS1-3. Se identificó una sustitución de aminoácido adecuada en la posición 287 en la secuencia de la proteína (SEQ ID de la proteína, NCBI: AFX60877.1 - proporcionada en esta invención como SEQ ID NO:2). Cambiar el codón GGC (nucleótido 859, 860, 861; CDS de GenBank número NCBI: JX878491.1 - proporcionado en esta invención como SEQ ID NO:1) a GAC, conduce a un intercambio de aminoácidos de glicina a ácido aspártico en la posición 287 en la secuencia de la proteína (SEQ ID de la proteína, NCBI: AFX60877.1). Este cambio de aminoácido introducirá un aminoácido cargado negativamente en la secuencia de la proteína. GS1-3 es un decámero que consiste en dos anillos compuestos por 5 subunidades, con el residuo de aminoácido 287 ubicado en la interfase entre los dos anillos y lejos del sitio activo. Por tanto, se propone que la introducción de un aminoácido cargado negativamente no afectaría la capacidad general para catalizar su reacción, sino que podría reducir la actividad enzimática a través de cambios estructurales en el ensamblaje del decámero.
Ensayo de ddPCR
Se diseñó un ensayo único de ddPCR, específicamente para distinguir entre el alelo mutante y el alelo de tipo salvaje de HvGS1-3 en la posición nucleotídica 860 en la secuencia de codificación de tipo salvaje (número GenBank NCBI: JX878491.1). La sonda de detección de mutantes era complementaria a la secuencia codificante, conteniendo una base A en la posición nucleotídica 860. La sonda de detección de referencia era complementaria a la secuencia codificante, conteniendo una base G en la posición nucleotídica 860. Se diseñaron dos cebadores flanqueantes para amplificar la secuencia genómica que rodea al nucleótido 860 en la secuencia codificante.
Los siguientes cebadores y sondas se diseñaron específicamente para el locus HvGS1-3:
- Cebador directo específico de diana (SEQ ID NO:3):
- 5'-GTGATCAAGAGGGCGATCAA-3';
- Cebador inverso específico de diana (SEQ ID NO:4):
- 5'-CAAGTCTCAACTCGCCGTAT-3';
- Sonda de detección específica de mutantes (SEQ ID NO:5):
- 5'-AAGACAACGAGCGC-3' - marcada con 6-carboxifluoresceína (FAM);
- Sonda de detección específica de referencia (SEQ ID NO:6):
- 5'-AAGGCAACGAGCGC-3' - marcada con hexaclorofluoresceína (HEX).
Se preparó un agolpamiento de granos de cebada mutagenizados al azar como se describe en WS1 en esta invención anteriormente, seguido de la preparación de una biblioteca ordenada.
Determinación de si una muestra de biblioteca contiene granos mutados (WS3)
La siguiente etapa, en general, fue determinar si la biblioteca contenía granos mutados, esencialmente como se describe para WS3 y en el Ejemplo 7 en esta invención anteriormente con los siguientes detalles:
- La identificación selectiva se realizó con un total de 376 GLPs (es decir, 376 subagrupamientos), que representan aproximadamente 120.000 plantas de cebada mutadas. La ddPCR se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 7.
- Una muestra de ADNg de 5 pl derivada de ADNg (GT#377-GT#470) se añadió a cada pocillo que contenía 17 pl de la mezcla de reacción de PCR y se mezcló minuciosamente al pipetear hacia arriba y hacia abajo.
La placa de microtitulación para PCR se cargó en el QX200 Droplet Reader (Bio-Rad) para el análisis de gotas. Los datos obtenidos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó mediante el gráfico 2-D, establecido en 2700 y 1500 para la amplificación para la amplitud del Canal 1 y el Canal 2, respectivamente. La comparación de los valores individuales para la abundancia fraccional mostró que el ADNg (GT#380) proporcionó señales más altas que cualquier otra muestra con respecto a la detección de mutantes. La abundancia fraccional de ADNg (GT#380) fue 0,089 % en comparación con 0,0077 %, este último representando la abundancia fraccional promedio de todas las 94 muestras de ADNg analizadas.
Hallazgo de grano(s) individual(es) caracterizado(s) por una mutación de interés (WS4)
Los granos de cebada individuales que portaban una mutación génica se identificaron esencialmente como se describió anteriormente en esta invención en la WS4, incluyendo los siguientes detalles ordenados consecutivamente:
1. Basándose en el análisis de ADNg derivado de GT#377-GT#470 con un ensayo de ddPCR específico de HvGS1-3, se consideró muy probable que los 4500 granos de GLP#380 [correspondientes a la muestra positiva de ADNg (GT#380)], comprenderían uno o más granos con la mutación génica de interés.
2. FGLP#380 se estableció mediante la eliminación secuencial de 96 x 12 muestras de grano de GLP#380. Cada alícuota de 12 granos se situó en un trozo de papel de pesaje y a continuación se fijó consecutivamente con un par de fórceps al mismo tiempo que se usaba una máquina de grabado (Marathon-3, Saeyang Microtech) equipada con un taladro de 1,6 mm para perforar un pequeño orificio de 2-3 mm de profundidad en el endosperma. El movimiento giratorio movía la harina desde el endosperma hasta la parte superior del grano y el papel de pesaje circundante. Las muestras perforadas de 12 granos se situaron en pocillos separados de 2 ml de una placa de microtitulación, lo que produjo el subagrupamiento secundario de granos de cebada perforados PDGLP#380. Las 96 muestras de harina, cada una con harina derivada de 12 granos de cebada perforados, se transfirieron a pocillos separados de una placa de microtitulación de 1,5 ml (PFGLP#380) manteniendo un sistema de numeración de muestras que coincida con el de los granos perforados.
3. A continuación, PFGLP#380 se sometió a extracción de ADNg utilizando un procedimiento de extracción de ADN semiautomatizado como se detalla en las instrucciones del kit NucleoSpin 96 Plant II (Macherey-Nagel). En consecuencia, cada pocillo de la placa de microtitulación contenía ADNg de harina de 12 granos.
4. ADNg derivado de PFGLP#380 se analizó como se describió anteriormente. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2700 para la amplitud del Canal 1 y 1500 para la amplitud del Canal 2. La comparación de los valores individuales para la abundancia fraccional mostró que ninguna de las muestras de PFGLP#380 contenía un grano mutante. Como se consideró muy probable que GLP#380 contenía un grano mutante, se decidió preparar y analizar muestras adicionales estableciendo un segundo FGLP (FGLP#380-2). Esto dio como resultado la preparación de PDGLP#380-2 y PFGLP#380-2. El ADNg de PFGLP#380-2 se analizó como se describió anteriormente. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2700 para la amplitud del Canal 1 y 1500 para la amplitud del Canal 2. Se identificaron tres pocillos individuales en la placa de microtitulación (C02, F04, F05) que mostraron una abundancia fraccional de 4,02 %, 4,11 % y 5,55 %, todos indicando la presencia de tres mutantes heterocigotos individuales en 3 pocillos independientes de PDGLP#380-2.
5. Los 12 granos del pocillo C02 y F04 de PDGLP#380-2 fueron germinados. El material foliar de las 24 plántulas se recogió y se sometió a extracción de ADN utilizando REDExtract (Sigma Aldrich). El ADNg derivado de muestras de hojas se analizó como se describió anteriormente. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2700 para la amplitud del Canal 1 y 1500 para la amplitud del Canal 2. Una plántula derivada del pocillo C02 de PDGLP#380-2 mostró una abundancia fraccional de 41 %, confirmando la presencia de un mutante heterocigoto. Una plántula derivada del pocillo F04 de PDGLP#380-2 mostró una abundancia fraccional de 39,6 %, confirmando la presencia de un mutante heterocigoto.
6. Se realizó una verificación adicional de rasgos mediante secuenciación directa tanto en mutantes identificados como en una muestra de referencia. El ADN se extrajo del material de hoja utilizando el procedimiento de extracción de ADN REDExtract (Sigma Aldrich). Para el análisis de secuenciación, se preparó una reacción de PCR de 50 pl que contenía 1 |jl de ADNg purificado, 20 |jl de REDExtract (Sigma Aldrich), 500 nM de un cebador directo específico de diana, 500 nM de un cebador inverso específico de diana y agua. Las muestras se sometieron a ciclos térmicos utilizando las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización a 94°C durante 2 min, 38 ciclos de PCR a 94°C durante 45 s, 58°C durante 45 s y 72°C durante 45 s, y una extensión final a 72°C durante 5 min antes del almacenamiento de la placa de PCR a 8°C. Los productos de PCR individuales se purificaron utilizando el Gel NucleoSpin y el kit de limpieza de PCR. Todas las muestras se secuenciaron utilizando un cebador directo específico de diana y un cebador inverso específico de diana.
7. Las dos plántulas que se identificaron como positivas para la mutación en el análisis de ddPCR eran heterocigotas con respecto al genotipo en la ubicación genómica predeterminada. La muestra de referencia mostró un genotipo de tipo salvaje homocigoto en la misma ubicación.
Ejemplo 19: Análisis de formas recombinantes de glutamina sintasa de cebada.
La síntesis de tres variantes recombinantes de HvGS1-3 utilizó células huésped de E. coli, seguido de un enriquecimiento de la enzima a un alto grado de pureza mediante purificación por afinidad. Las siguientes variantes se expresaron en E.coli:
- Q: Referencia de tipo salvaje - SEQ ID NO:1;
- 3864: SEQ ID NO:1 con un intercambio de aminoácidos G287D, es decir, correspondiente a la proteína mutante expresada por una planta de cebada mutante (identificada como se describe en el Ejemplo 18).
- LR: SEQ ID NO:1 con un intercambio de aminoácidos D300N, es decir, una variante enzimática en la que se espera que el cambio tenga poco impacto en la actividad enzimática.
Las actividades de las tres variantes de HvGS1-3 se determinaron siguiendo la síntesis de glutamil hidroxamato a partir de glutamato, hidroxilamina y ATP en presencia de la enzima. Se determinaron las cinéticas enzimáticas para las tres variantes de HvGS1-3 a diferentes concentraciones de glutamato e hidroxilamina, con los resultados que se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente.
Mientras que kcaty kcat/KM para HvGS1-3 Q y LR fueron similares, HvGS1-33864 reveló sistemáticamente valores que fueron uno o dos órdenes de magnitud más bajos en comparación con las otras dos variantes. Los datos cinéticos indicaron que la mutación identificada en HvGS1-3 3864, Gly 287 a Asp, tuvo un impacto severo en la unión y utilización de cualquiera de los sustratos en esta variante. No se pudieron determinar los valores cinéticos de la unión y utilización de ATP debido a un alto grado de variabilidad en absorbancia a altas concentraciones de sustrato del nucleótido.
Tabla 1. Cinética enzimática de variantes HvGS1-3 en presencia de distintas concentraciones de glutamato. Con respecto a Q, LR y 3864, los números entre paréntesis se refieren a la cantidad total de proteína, en jg , de la reacción.
Figure imgf000043_0001
Tabla 2. Cinética enzimática de variantes HvGS1-3 en presencia de distintas concentraciones del sustrato hidroxilamina. Con respecto a Q, LR y 3864, los números entre paréntesis se refieren a la cantidad total de proteína, en jg, de la reacción.
Figure imgf000043_0002
Con el fin de determinar si la oligomerización del complejo GS1-3 se vio afectada en cualquiera de las dos variantes en comparación con Q, primero se evaluó una alícuota de HvGS1-3 purificado sobre una columna de exclusión por tamaño. Las tres variantes tuvieron un pico principal con el mismo volumen de elución.
A continuación se describe una relación detallada de 6 etapas de los experimentos que se utilizaron con el fin de obtener los resultados descritos en este ejemplo.
Etapa 1: Diseño de la secuencia génica de HvGS1-3 para la expresión génica heteróloga
La secuencia de codificación de la isoterma GS1-3 de glutamina sintetasa de cebada (HvGS1-3), depositada en GenBank con el número de acceso JX878491.1, se utilizó como base para la síntesis de 3 secuencias génicas correspondientes (GenScript, China), que representan HvGS1-3 (Q) de tipo salvaje y dos formas que contienen mutaciones (3864 o LR). Las secuencias del gen y la proteína GS1-3 de tipo salvaje se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican proteínas de las tres variantes se insertaron en el plásmido de expresión de E. coli pET-28a(+) adquirido en MerckMillipore (Alemania), seguido de transformación de células de E. coli de la cepa BL21 (DE3), usando procedimientos estándar.
Etapa 2: Expresión heteróloga de HvGS1-3
Se utilizaron células de E. coli BL21(DE3) transformadas con HvGS1-3 Q o sus variantes en pET-28a(+). Las bacterias se cultivaron en medio LB que contenía 30 pg/ml de kanamicina en condiciones estándar. La expresión génica se indujo con la adición de 250 pM de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, Sigma-Aldrich). La expresión se llevó a cabo a 37°C durante 4 h a 120 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a 4000 xg durante 15 min a 8°C. Mientras se descartaba el sobrenadante, los sedimentos celulares se volvieron a suspender en 10 ml de tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, MgCh 1mM). Las células resuspendidas se congelaron a -20°C hasta su uso posterior.
Etapa 3: Lisis celular de células E. coli BL21 (DE3) después de la expresión génica recombinante
Las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas y congeladas se descongelaron primero y a continuación se rompieron usando un sonicador de células Vibra (Sonics & Materials Inc., EE. UU.) al 30 % de amplitud durante 90 s, con pulsos de 5 s y pausas de 5 s, en hielo húmedo. Después de la sonicación, el ADN se digirió durante 10 min usando 5 pg/ml de DNasel (Sigma-Aldrich). Las células lisadas se eliminaron mediante centrifugación durante 10 min a 13.000 xg y 4°C. El sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,45 pm de una jeringa a un tubo nuevo.
Etapa 4: Enriquecimiento de HvGS1-3 por cromatografía de afinidad con metal inmovilizado
Una cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC, por sus siglas en inglés) de 1 ml, cargada con una solución de níquel, se lavó con cinco volúmenes de columna de agua doblemente destilada y se equilibró con el mismo volumen de tampón A (cuya composición se detalló anteriormente). La fracción soluble filtrada se inyectó manualmente en una columna equilibrada utilizando una jeringa, con material no unido recogido y mantenido a 4°C. El material de la columna débilmente unido se lavó usando tampón A, que contenía imidazol 50 mM (Sigma-Aldrich), en 10 volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés). Se eluyó HvGS1-3 y se recogió en condiciones similares, utilizando tampón A, que contenía imidazol 400 mM, durante 10 Cv . Las soluciones de proteínas eluidas se diafiltraron 4x en una unidad de filtro centrífugo hecha de celulosa regenerada con un corte molecular nominal de 10.000 (Millipore, Irlanda), frente al tampón A [por centrifugación a 3.000xg (SL-16R) a 8°C durante 20 min, para eliminar el exceso de imidazol].
Etapa 5: Ensayo de actividad in vitro de HvGS1-3 recombinante
Se usó una adaptación del ensayo de actividad descrito porW ellnery Meister (1966) para determinar los cambios en la actividad de las dos variantes de HvGS1-3 (en comparación con la de HvGS1-3 Q). Una reacción de 50 pl contenía Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, MgCh 50 mM, ATP 20 mM, diferentes concentraciones de Y-glutamato hidroxilamina (cuando el L-glutamato variaba; de lo contrario, 50 mM), diferentes concentraciones de L-glutamato (cuando la glutamato hidroxilamina variaba; de lo contrario, a 50 mM). Las reacciones se prepararon en una microplaca de 96 pocillos de fondo plano y área media (Corning, EE. UU.), equilibrada a 37°C. La reacción se inició mediante la adición de HvGS1-3 purificado a una concentración final de 1 o 5 pg/ml. Después de 30 min, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de Fe(III)Cl3370 mM, TCA 200 mM, HCl 670 mM. A continuación, se midió la A540 nm del fondo en un lector de microplacas SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices, EE. UU.), utilizando la corrección de trayectoria para tener en cuenta las diferencias menores de volumen. Los datos se representaron en un gráfico utilizando GraphPad Prism (versión 4, GraphPad Software, EE. UU.).
Etapa 6: Cromatografía de exclusión por tamaño
Se cargaron cantidades iguales de las tres variantes HvGS1-3 individualmente en una columna de exclusión por tamaño 10/300 que contenía Superdex 200 (GE Life Sciences, EE. UU.) y equilibrada en tampón A en una FPLC ÁKTA (GE Life Sciences). La elución de la proteína unida se llevó a cabo a 0,5 ml/min y la elución de la proteína fue seguido por una medición de A280.
Ejemplo 20: análisis de ddPCR con ADNg derivado de células de levadura mutagenizadas.
En aras de la claridad de descripción, y no como limitación, los siguientes temas se detallan en el presente ejemplo: - Parte 1: Preparación de un cultivo de levadura mutagenizado al azar
- Parte 2: Preparación de una biblioteca ordenada
- Parte 3: Identificación del pocillo que contiene ADNg con una mutación predefinida
- Parte 4: Enriquecimiento de células de levadura caracterizadas por una mutación predeterminada
WS1: Preparación de un cultivo de levadura mutagenizado al azar
Etapa 1.1: Procedimiento de mutagénesis
Para inducir mutaciones, la cepa de levadura se somete a tratamiento con MNNG (metilnitronitrosoguanidina) según el protocolo descrito en Methods in Molecular Biology, Yeast Protocols, V. 313, 2006).
MNNG es un mutágeno conocido por alquilizar guanidina o timina del ADNg seguido de una transición del par G C a A T tras la replicación del ADNg. El procedimiento descrito en esta sección tiene como objetivo identificar la mutación puntual en el gen de interés que altera el codón de aminoácido definido en un codón de terminación prematuro. El experto en la materia podrá adaptar el procedimiento a la identificación de otros tipos de mutaciones. La mutación puntual conduce así a la proteína truncada y correspondientemente no funcional o defectuosa. Las mutaciones puntuales deseables para crear un codón de terminación se definen en función de la secuencia del gen/proteína diana. Mediante este procedimiento también se pueden identificar otras mutaciones puntuales que afectan a regiones reguladoras del gen de interés.
La mutagénesis se realiza en el cultivo de levadura, por ejemplo, con un recuento de células totales de 2x107. El estado mutador de las células de levadura para la mutagénesis se determina y ajusta para garantizar la tasa de mutación deseable. Las condiciones de mutagénesis se ajustan típicamente para dar una tasa de supervivencia del 60-70 %. La concentración de mutágeno y el tiempo de exposición varían según la cepa de levadura.
WS2: Preparación de una biblioteca ordenada
Etapa 2.1: Viabilidad celular
Se determina el título de células viables y todas las células de levadura mutagenizadas se inoculan en alícuotas en placas de 96 pocillos con YPD usando un robot Biomek FXp. Se inoculan 3000-5000 células individuales viables por pocillo.
WS3: Identificación del pocillo que contiene ADNg con una mutación predefinida
Etapa 3.1: Preparación de una biblioteca de células de levadura mutagenizadas
[0376]Las células de levadura mutagenizadas inoculadas en placas de 96 pocillos de la Etapa 1.1 se consideran una biblioteca total que contiene levadura mutada diana. Las células de levadura se incuban durante 3 días para permitir la saturación de crecimiento. La biblioteca se amplifica mediante la reinoculación en medio de crecimiento mínimo con el robot Biomek FXp (etapa de copia) para su uso para el aislamiento de ADNg después de 3 días de crecimiento. El resto de la suspensión de células de levadura en placas de 96 pocillos se conserva con glicerol (concentración final del 15 %) a -80°C para su aplicación aguas abajo para aislar la levadura mutante deseada.
Etapa 3.2: Aislamiento de ADNg de levadura
Para preparar ADNg, las células de levadura se transfieren a una placa de 96 pocillos de aislamiento de ADN y se someten al procedimiento de aislamiento de ADN mediante robótica (Biomek FXp, kit Agencourt DNAdvance y protocolo de Beckman Coulter). El procedimiento sigue las instrucciones del fabricante, con una etapa adicional que usa la enzima liticasa para digerir la pared celular de la levadura y romper las células. El protocolo emplea la precipitación de ADNg con perlas magnéticas. El ADNg en una placa de 96 pocillos se usa para la aplicación aguas abajo para identificar el agrupamiento positivo para la mutación predeterminada. La concentración de ADN se mide utilizando el lector de placas de 96 pocillos, con la concentración de ADN ajustada a 25 ng/5 pl y se usa directamente para la ddPCR. El ADN concentrado original en placas de 96 pocillos se almacena para su uso posterior.
Etapa 3.3: Análisis de las muestras por ddPCR
El ADNg preparado en la Etapa 2.2 en formato de placa de 96 pocillos se cuantifica y la concentración se ajusta a 25 ng/5 pl. Se incluyen muestras de ADN de control positivo y negativo. El análisis de ddPCR posterior se realiza en cada muestra de ADNg esencialmente como se describe en el Ejemplo 7. En esta etapa, se puede aplicar una matriz de sondas que reconocen diferentes mutaciones puntuales en varias o todas las posiciones posibles en la secuencia génica, que crean un codón de terminación prematuro para aumentar la posibilidad de la identificación de mutantes. El procedimiento permite la identificación de pocillos positivos para la mutación deseable, es decir, pocillos que comprenden levadura que porta la mutación deseable.
WS4: Enriquecimiento de células de levadura caracterizadas por una mutación predeterminada
Etapa 4.1: Preparación de una biblioteca de levaduras agrupadas
Una placa de 96 pocilios que comprende el pocilio positivo para la mutación se descongela y las células de levadura se reviven mediante la inoculación del contenido del pocillo positivo en caldo YPD fresco (1:10) y se incuban durante 4-6 h con rotación a temperatura ambiente. Para garantizar la ausencia de una mayor proliferación de las células de levadura, el cultivo de levadura revivido se almacena en un refrigerador hasta que se complete el cultivo en placas aguas abajo y se complete satisfactoriamente el aislamiento del cultivo mutante puro. Antes de la siembra en placas, las células de levadura viables se cuentan y se diluyen con PBS que contiene EDTA 1 mM y, posteriormente, se sembraron en placas cuadradas Qpix con agar YPD para obtener 2000-3000 colonias por placa. El número de placas a preparar de esta manera depende del título de células de levadura viables después de la reactivación de la solución madre congelada y del progreso de la identificación de mutantes. Por ejemplo, se pueden inocular 10-12 placas Qpix con hasta 50.000 células individuales que dan lugar a colonias individuales. La identificación del agrupamiento positivo descrito en la Parte 3 con la relación del tipo salvaje:mutante de hasta 1:5000 sugiere que de entre 50.000 células individuales al menos 10 células son el mutante diana. El crecimiento de las colonias se controla para garantizar el tamaño y la distancia adecuados entre las colonias para poder seleccionar las colonias individuales con el robot Qpix. Una vez que las colonias están listas para la recolección, se crea una biblioteca de placas de 96 pocillos con células de levadura cultivadas en YPD de la siguiente manera: las colonias de todas las placas Qpix se recogen aleatoriamente en diez placas de 96 pocillos, por lo que cada pocillo contiene un agrupamiento de 50 colonias con la relación potencial mínima de tipo salvaje:mutante equivalente a 1:50. Estas placas se procesan aún más para aislar ADNg y también para preparar solución madre congelada y almacenada a -80°C para su aplicación aguas abajo adicional, como se describe en la Etapa 3.1 (WS3).
Etapa 4.2: Aislamiento de ADNg de levadura de la biblioteca agrupada
Para preparar ADNg a partir de agrupamientos de 50 colonias aisladas, los cultivos de levadura en una placa de 96 pocillos obtenida en la Etapa 3.1 se vuelven a inocular en medio de crecimiento mínimo fresco. Una vez que el crecimiento es suficiente, los cultivos de levadura se someten al procedimiento de aislamiento de ADN mediante robótica, como se describe en la Etapa 3.2 (WS3). La concentración de ADN se mide utilizando el lector de placas de 96 pocillos, y la concentración de a Dn se ajusta a 25 ng/5 pl y una alícuota se usa directamente para la ddPCR. Se conserva el ADNg concentrado original en un formato de placas de 96 pocillos. El ADNg en una placa de 96 pocillos se usa para la aplicación aguas abajo para identificar el agrupamiento/pocillo positivo con la mutación predeterminada. Se preparan un total de 10 placas de 96 pocillos con ADNg.
Etapa 4.3: Análisis de las muestras por ddPCR
El ADNg preparado en la Etapa 3.2 en un formato de placa de 96 pocillos se cuantifica y la concentración se ajusta a 25 ng/5 pl. Se incluyen muestras de ADN de control positivo y negativo. El análisis de ddPCR posterior se realiza en cada muestra de ADNg, básicamente como se describe en el Ejemplo 7. Si se utilizan varias sondas en la Etapa 3.3, entonces en esta etapa solo se aplica(n) la(s) sonda(s) que dio(dieron) una identificación positiva del agrupamiento positivo en la Etapa 3.3. El procedimiento permite la identificación de subagrupamiento(s) positivo(s) con una mutación predeterminada.
Etapa 4.4: Preparación de una biblioteca de levaduras de única colonia
Se utiliza una placa congelada de 96 pocillos con pocillo(s) positivo(s), identificada en la Etapa 4.3, para situar en placas de cultivo para el crecimiento de colonias individuales. Se inocula un cultivo de levadura de un pocillo positivo en caldo YPD fresco y se deja crecer durante la noche. Se sembraron en placas 1000 células en agar YPD (formato de placa cuadrada Qpix) para producir colonias individuales. El robot Qpix recoge las colonias cultivadas en diez placas de 96 pocillos con caldo YPD como medio de crecimiento. Estas placas se procesan aún más para aislar ADNg y también para preparar solución madre congelada para su aplicación aguas abajo adicional, como se describe en la Etapa 3.1 (WS3).
Etapa 4.5: Aislamiento de ADNg de una biblioteca de colonias individuales
El ADNg se prepara como se describe en la Etapa 4.2.
Etapa 4.6: Análisis de las muestras por ddPCR
El ADNg preparado en la Etapa 4.5 en un formato de placa de 96 pocillos se cuantifica y la concentración se ajusta a 25 ng/5 pl. Se incluyen muestras de ADN de control positivo y negativo. El análisis de ddPCR posterior se realiza como se describe en el Ejemplo 7. En esta etapa, solo se aplica(n) la(s) sonda(s) que (dio)dieron una identificación positiva en la Etapa 3.1. El procedimiento permite la identificación del cultivo de levadura pura con la mutación predeterminada. El procedimiento permite determinar el estado homocigoto o heterocigoto del aislado.
Etapa 4.7: Aislamiento de un cultivo puro de levadura mutante
Para preparar la solución madre de la levadura mutante, una suspensión de levadura del(de los) pocillo(s) positivo(s) se siembra en placas en el agar YPD para lograr el crecimiento de las colonias aisladas. Se recogen 3 colonias manualmente y se procesan posteriormente como réplicas biológicas.
Etapa 4.8: Secuenciación del gen diana o un tramo de ADNg de interés
Los aislados mutantes de levadura con la mutación identificada de la Etapa 4.7 (WS4) se utilizan para el aislamiento de ADNg, seguido de PCR específica, clonación del fragmento de ADN obtenido y realización de la secuenciación del ADN para confirmar la identidad de la mutación.
Etapa 4.9: Funcionalidad de la mutación
El mutante de levadura con una mutación homocigota de interés se usa directamente para confirmar que la mutación tiene el efecto esperado. Si se determina un estado heterocigoto y se encuentra insuficiente para proporcionar el efecto esperado, entonces se repite la mutagénesis o el aislado de levadura sufre esporulación seguido de segregación de la mutación para confirmar el estado homocigoto y el fenotipo mutante. El aislado de levadura con la mutación de interés se usa directamente para el propósito aplicado, o se usa en la mejora de levadura para controlar el fenotipo deseable.
Ejemplo 21
En S a cch a ro m yce s ce rev is iae , la descarboxilasa del ácido ferúlico Fdc1 es esencial para la descarboxilación de ácidos carboxílicos aromáticos, incluyendo el ácido cinámico o cumárico. La reacción de descarboxilación convierte los sustratos en sus derivados de vinilo correspondientes, algunos de los cuales se sabe que son compuestos activos de sabor. Durante la fermentación de la cerveza, por ejemplo, Fdc1 convierte el ácido ferúlico del mosto en 4-vinil guayacol, que se hace perceptible como notas similares a clavo en la cerveza final. Si bien estas notas son típicas de ciertas cervezas, especialmente las cervezas de trigo alemanas, se consideran sabores fenólicos desagradables (POF, por sus siglas en inglés) en otras, incluyendo las cervezas lager. Aquí se describe la identificación de S. cerevisiae que porta una mutación interruptora en el gen S c F D C I mediante procedimientos que no sean OMG. Se espera que la levadura identificada sea una cepa de levadura POF negativa.
En la industria alimentaria, el uso de técnicas genéticas moleculares para modificar organismos seleccionados es indeseable, y las personas confían en el uso de técnicas clásicas de mutagénesis aleatoria e identificaciones selectivas que consumen mucho tiempo para identificar las cepas de interés. El procedimiento que se describe a continuación representa una técnica que consume menos tiempo para identificar cepas que portan una mutación seleccionada de interés dentro de una población de organismos mutagenizados aleatoriamente. Más específicamente, en este ejemplo, las cepas de levadura que portan una mutación interruptora específica (W159*) resultante de una transición de G a A en la posición 476 del gen S c F D C I en la cepa FS0105 de S. c e re v is ia e var. d ias ta ticu s . La secuencia del gen S c F D C I está disponible en GenBank con el número NCBI: NM_001180847, la secuencia de ADNc se proporciona en esta invención como SEQ ID NO:26 y la secuencia de aminoácidos de fdc1 se proporciona como SEQ ID NO:7.
WS1: Preparación de una población mutagenizada aleatoriamente de células de levadura FS0105.
Etapa 1.1: Mutagénesis con EMS en la cepa FS0105.
Para inducir mutaciones, la cepa de levadura FS0105 se sometió a tratamiento con metanosulfonato de etilo (EMS) según el protocolo descrito en "Methods in Yeast Genetics" (CSHL Press, 2000). En resumen, la cepa FS0105 se cultivó durante la noche en medio YPD hasta la fase estacionaria. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron una vez con agua destilada estéril y una vez con tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7). Finalmente, las células se volvieron a suspender en tampón fosfato 0,1 M hasta aproximadamente 2 x 108 células/ml. Se añadieron 30 |jl de EMS a 1 ml de células en un tubo de reacción de cierre seguro de 2 ml y las células se incubaron durante aprox. 75 minutos a 30 °C y 1000 rpm en un Eppendorf Thermomixer comfort (1,5 ml), lo que generalmente resultó en una tasa de destrucción de ~60-80 % para la cepa FS0105. Para detener la mutagénesis, las células se sedimentaron mediante una breve centrifugación y se lavaron tres veces con solución de tiosulfato de sodio estéril al 5 % recién preparada y una vez con agua destilada estéril. Finalmente, las células se volvieron a suspender en 1 ml de YPD y se incubaron durante 1 hora a 30 °C y 1000 rpm en un Eppendorf Thermomixer comfort (1,5 ml). En esta etapa, las células se podían almacenar a 4 °C, o se usaban inmediatamente para procedimientos aguas abajo, por ejemplo, determinación de las tasas de destrucción mediante placas en un medio complejo.
La bibliografía sugirió que poner las células de levadura mutagenizadas bajo presión selectiva inmediatamente después de la mutagénesis daría como resultado un número significativamente mayor de mutaciones por célula (Lada y col., 2013; Den Abt y col., 2016), lo que podría reducir significativamente el número de células de levadura a identificar selectivamente con el fin de identificar una mutación de interés. Por lo tanto, aproximadamente 2 x 107 de células vivas pero mutagenizadas por placa se sembraron en placas de medio SD que contenían 2 jg/m l del herbicida metsulfurón metil, y se incubaron las placas durante varios días a 30 °C hasta que aparecieron colonias resistentes al herbicida en las placas selectivas. El objetivo era aprox. 50.000 colonias resistentes a herbicidas en total. Para aumentar aún más el número de mutaciones por célula, se eliminaron por lavado las células resistentes a herbicidas con tampón fosfato de sodio 0,1 M estéril (pH 7) de las placas, se diluyeron a aprox. 2 x 108 células/ml y se repitió la mutagénesis con EMS como se describió anteriormente. Este ciclo de mutagénesis y selección se repitió cuatro veces en total.
WS2: Preparación de una biblioteca aleatoria de células de levadura FS0105 mutagenizadas al azar.
Etapa 2.1: Creación de una biblioteca aleatoria total de células de levadura FS0105 mutagenizadas.
Después de la cuarta y última ronda de mutagénesis con EMS (véase la Etapa 1.1), se determinó el título de células viables sembrando en placas las respectivas diluciones en placas de medio complejo. Posteriormente, se distribuyeron aprox. 1200-1500 células vivas/placa en placas YPD y las placas de Petri se incubaron a 30 °C durante tres días. De 96 placas separadas, las células se eliminaron por lavado con 3 ml de tampón fosfato de sodio 0,1 M cada una, para formar 96 "agrupamientos de bibliotecas". Posteriormente, se usaron aprox. 5 x 107 células de estos agrupamientos de bibliotecas para el aislamiento de ADN (véase más adelante), mientras que las células restantes se centrifugaron, se volvieron a suspender en 40 % de glicerol/10 % de YP, y se congelaron a -80 °C para establecer una "biblioteca aleatoria total" de 96 agrupamientos de bibliotecas que contenían aprox. 120.000-150.000 clones FS0105 mutagenizados con EMS en total.
WS3: Identificación de agrupamientos de bibliotecas que contienen clones con una mutación interruptora S c fd c l seleccionada en la biblioteca aleatoria total FS0105.
Etapa 3.1: Aislamiento de ADN genómico de levadura de la biblioteca aleatoria total FS0105.
El ADN genómico de cada agrupamiento de la biblioteca aleatoria total se aisló usando el kit de ADN genómico PureLink® Pro 96 (invitrogen) y un colector de vacío universal EveryPrep™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN de cada muestra se determinó utilizando un NanoDrop 1000 3.8.1 y las soluciones de ADN se ajustaron a una concentración final de 5 ng de ADN/pl con agua libre de DNAsa estéril. Las muestras de ADN se almacenaron en una placa de PCR de 96 pocillos a -20 °C hasta su uso posterior.
Etapa 3.2: Análisis de las muestras de ADNg del agrupamiento de bibliotecas mediante ddPCR.
Se diseñó un ensayo de ddPCR único, específicamente para distinguir entre el alelo mutante y el alelo de tipo salvaje de S c F D C I en la posición nucleotídica 476 en la secuencia codificante de tipo salvaje de la cepa FS0105. El codón TGG correspondiente es idéntico a la secuencia S c F D C I de la cepa de referencia de laboratorio común S288C en esta posición (número GenBank NCBI: NM_001180847). La sonda de detección de mutantes era complementaria a la secuencia codificante, conteniendo una base A en la posición nucleotídica 476. La sonda de detección de referencia era complementaria a la secuencia codificante, conteniendo una base G en la posición nucleotídica 476. Se diseñaron dos cebadores flanqueantes para amplificar la secuencia genómica que rodea al nucleótido 476 en la secuencia codificante. El ensayo se diseñó utilizando la herramienta de diseño de ensayos de PCR digital en gotas de BioRads para la detección de mutaciones. Los siguientes cebadores y sondas se desarrollaron para el locus ScFDC1 específico: cebador directo específico de diana (5'- CATGTTTCAGACGGTGG - 3')(SEQ ID NO:13) cebador inverso específico de diana (5'- CAt Ac CTCTAGCAAt Tg ACC - 3')(SEQ ID NO:14) sonda de detección de mutantes ((5'-ACGTACGGAATGTAGATTCT - 3')(SEQ ID NO:15) - marcada con 6-carboxifluoresceína - FAM sonda de detección de referencia (5'- ACGTACGGAAt Gt GGATT - 3')(SeQ ID NO:16) - marcada con h e x a c lo ro flu o re s c e ín a - HEX.
La siguiente etapa, en general, fue determinar si la biblioteca contenía cepas de levadura mutadas. La identificación selectiva se realizó con un total de 96 agrupamientos de bibliotecas de levaduras, comprendiendo cada uno 1200­ 1500 colonias de levaduras mutadas y representando un total de aproximadamente 120.000-150.000 cepas de levaduras mutadas. La ddPCR se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 7. Se añadieron muestras de ADNg de 5 pl de ADNg de 96 agrupamientos de cepas de levadura mutagenizadas a cada pocillo de una placa de microtitulación que contenía 17 pl de la mezcla de reacción de PCR y se mezclaron a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
La placa de microtitulación para PCR se cargó en el QX200 Droplet Reader (Bio-Rad) para el análisis de gotas. Los datos obtenidos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó mediante el gráfico 2-D, establecido en 2700 y 1500 para la amplificación para la amplitud del Canal 1 y el Canal 2, respectivamente. La comparación de los valores individuales para la abundancia fraccional mostró que el ADNg con las coordenadas de la placa G01 proporcionó una señal más alta que cualquier otra muestra con respecto a la detección de mutantes. La abundancia fraccional del agrupamiento G01 de ADNg fue de 0,190 % en comparación con 0,030 %, este último representando la abundancia fraccional promedio de todas las 96 muestras de ADNg analizadas.
WS4: Identificación de clones de levadura individuales que portan una mutación Scfdcl seleccionada mediante la creación de subagrupamientos posteriores.
Etapa 4.1: Creación de subagrupamientos 100er a partir de la biblioteca aleatoria total FS0105.
Sobre la base del análisis de 96 muestras de ag o l pamiento de bibliotecas de ADNg analizadas con un ensayo de ddPCR específico de S c F D C I, se consideró muy probable que las 1200-1500 cepas de levadura en el agrupameinto G01 contendrían uno o más clones individuales que portan la mutación génica de interés.
El título de células del ag o l pamiento de bibliotecas positivas G01 identificado en la Etapa 3.2 se determinó sembrando en placas las respectivas diluciones en placas de agar YPD. Posteriormente, se inocularon 48 tubos de cultivo de 15 ml que contenían 3 ml de medio líquido YPD con aprox. 100 células cada uno del agrupamiento de bibliotecas G01. Los tubos de cultivo se incubaron durante tres días en una incubadora rotatoria a 30 °C, lo que dio como resultado 48 subagrupamientos 100er de la biblioteca G01 que representan aprox. 4800 clones individuales del agrupamiento de bibliotecas G01.
Etapa 4.2: Aislamiento de ADN genómico de levadura de subagrupamientos 100er FS0105.
El ADN genómico se aisló de cada uno de los 48 subagrupamientos 100er (véase la etapa anterior) de acuerdo con la Etapa 3.1, y la concentración final se ajustó nuevamente a aproximadamente 5 ng de ADNg/pl.
Etapa 4.3: Análisis de las muestras de ADNg del subagrupamiento 100er mediante ddPCR.
Se analizó el ADNg derivado de los 48 subagrupamientos 100er, que contienen aprox. 100 colonias de cada agrupamiento G01 como se describió anteriormente (véase la etapa 3.2). Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2000 para la amplitud del Canal 1 y 2500 para la amplitud del Canal 2. Se identificaron cuatro pocillos individuales en la placa de microtitulación (G07, C08, C09, G10) que mostraron una abundancia fraccional superior a 1 %, indicando la presencia de al menos 1 colonia mutada en un agrupamiento específico de 100 colonias.
Etapa 4.4: Creación de subagrupamientos 10er a partir de la biblioteca aleatoria total FS0105.
El subagrupamiento100er C09 mostró la mayor abundancia fraccional en los análisis de ddPCR (2,99 %) y fue seleccionado para análisis posteriores.
Al igual que en la Etapa 4.1, el título celular del subagrupamiento 100er C09 positivo identificado en la Etapa 3.2 se determinó sembrando en placas las respectivas diluciones en placas de agar YPD. Posteriormente, se inocularon 24 tubos de cultivo de 15 ml que contenían 3 ml de medio líquido YPD con aprox. 10 células cada uno del subagrupamiento 100er C09. Los tubos de cultivo se incubaron durante tres días en una incubadora rotatoria a 30 °C, lo que dio como resultado 24 subagrupamientos 100er de la biblioteca C09 que representan aprox. 240 clones individuales del subagrupamiento 100erG01.
Etapa 4.5: Aislamiento de ADN genómico de levadura de subagrupamientos 100er FS0105.
El ADN genómico se aisló de cada uno de los 24 subagrupamientos 10er (véase la Etapa 4.4) de acuerdo con la Etapa 3.1, y la concentración final se ajustó nuevamente a aproximadamente 5 ng de ADNg/pl.
Etapa 4.6: Análisis de las muestras de ADNg del subagrupamiento 10er mediante ddPCR.
El ADNg derivado de 24 subagrupamientos 10er individuales se analizó como se describió anteriormente. Los datos se analizaron como se describió anteriormente (véase la Etapa 3.2) utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 1500 para la amplitud del Canal 1 y 2000 para la amplitud del Canal 2. Tres agrupamientos individuales (A02, C03 y D03) mostraron una abundancia fraccional superior a 10 %, confirmando la presencia de al menos una colonia mutada en cada uno de los tres agrupamientos de 10 colonias.
Etapa 4.7: Identificación de clones individuales de los subagrupamientos 10er FS0105 que portan la mutación de interés introducida.
El subagrupamiento 10er D03 que muestra la mayor abundancia fraccional en el análisis de ddPCR (Etapa 4.6) se seleccionó para un análisis posterior. Se aisló ADNg de 16 colonias de levadura individuales derivadas del subagrupamiento 10er D03 y se sometió al mismo análisis descrito anteriormente (véase la Etapa 4.3 y 4.6). Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2000 para la amplitud del Canal 1 y 2500 para la amplitud del Canal 2. Dos agrupamientos individuales (C02 y D02) mostraron una abundancia fraccional superior a 99,9 %, confirmando la presencia de dos colonias de levaduras mutadas entre 16 colonias individuales analizadas.
Etapa 4.8: Aislamiento del cultivo puro de levadura mutante.
La cepa FS0105 muestra la tendencia a formar agregados celulares más grandes. Para asegurar que la solución madre futura de la levadura mutante de interés se derivara de una única célula y no de un grupo de células, se utilizó un microscopio de disección Singer MSM 400 para aislar células únicas de los dos ag o l pamientos individuales C02 y D02. Hasta este punto, las suspensiones celulares de los ag o l pamientos individuales se diluyeron 1000 veces en tampón TE, que ayuda a la liberación de ciertos aglomerados celulares, y 10 pl de la dilución se situaron en una placa de agar de medio complejo. A continuación se aislaron células únicas de acuerdo con las recomendaciones/manual de los fabricantes.
Etapa 4.9: Confirmación de la mutación de interés seleccionada mediante análisis de secuencia de ADN.
El ADN genómico de los aislados de células únicas de la Etapa 4.8 se aisló utilizando un protocolo estándar de preparación de ADN genómico de levadura, y la región que cubre el gen diana S c F D C I se amplificó mediante técnicas de PCR estándar utilizando oligonucleótidos específicos de S c F D C I. Los fragmentos de ADN resultantes se limpiaron con Gel Wizard® SV y el Sistema de Limpieza PCR (Promega) y se secuenciaron (LGC Genomics) para el área alrededor del nucleótido de interés (+476 de S c F D C I). El análisis de las secuencias de ADN recuperadas mostró que ambos clones de células únicas que derivaron de los agrupamientos individuales C02 y D03 (véase 4.7 y 4.8) contenían la mutación interruptora deseada W159* causada por una transición de G a A en el nucleótido 476 del gen S c F D C 1.
Ejemplo 22
Se identificó una planta de trigo que porta una mutación específica utilizando los procedimientos descritos en las Líneas de trabajo y los Ejemplos anteriores en esta invención. La denominación de los diversos agrupamientos, etc., se realizó utilizando la denominación que se muestra en la figura 2. Mientras que la cebada es una especie diploide autopolinizante con 14 cromosomas, la poliploidía es común en el trigo. El presente Ejemplo demuestra que los procedimientos de la invención pueden usarse incluso con un organismo poliploide, tal como el trigo. Tal como se describe, los procedimientos pueden usarse para la identificación de cualquier mutante. El presente ejemplo describe la identificación de una mutación específica (guanina a adenina) que conduce al intercambio del aminoácido triptófano en una parada traduccional en la región del codón del gen GASR7 del trigo en el genoma A (TaGASR7-Al) en la posición 91. La secuencia del gen GASR7-A1 está disponible en GenBank con el número NCBI: KJ000052, la secuencia de ADNc se proporciona en esta invención como SEQ ID NO:25 y la secuencia de aminoácidos de GASR7 se proporciona como SEQ ID NO:8.
Ensayo de ddPCR
Se diseñó un ensayo de ddPCR específico, que distingue específicamente entre el alelo mutante y el alelo de tipo salvaje de TaGASR7-A1 en la posición nucleotídica 273 en la secuencia de codificación de tipo salvaje (número GenBank NCBI: KJ000052). La sonda de detección de mutantes era complementaria a la secuencia codificante que contiene una adenina en la posición nucleotídica 273. La sonda de detección de referencia era complementaria a la secuencia codificante que contiene una guanina en la posición nucleotídica 273. Se diseñaron dos cebadores flanqueantes para amplificar la secuencia genómica que rodea al nucleótido 273 en la secuencia codificante. Los siguientes cebadores y sondas se desarrollaron para el locus TaGASR7-A1 específico: cebador directo específico de diana (5'- CGCCTGCCCCTGCTA - 3')(SEQ ID NO:9) cebador inverso específico de diana (5'-AGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAACCAAGAA - 3')(SEQ ID NO:10) sonda de detección de mutantes (5'-CAACAACTGAAAGACCA - 3')(SEQ ID NO:11) - marcada con 6-carboxifluoresceína - FAM sonda de detección de referencia (5'- CAACAACTGGAAGACCA - 3')(SEQ ID NO:12) - marcada con fluoróforo VIC
Se preparó un agrupamiento de granos de trigo mutagenizados al azar remojando los granos en EMS al 0,6 % durante 17 horas. Posteriormente, los granos se enjuagaron con agua y se secaron en papel de filtro durante 45 minutos. Los granos mutagenizados se sembraron en placas inmediatamente después del secado.
WS3; Determ inación de s i una m uestra de b ib lio teca contiene granos m utados
A continuación se determinó si la biblioteca contenía granos mutados, esencialmente como se describe en WS3 y el Ejemplo 7 anterior en esta invención con los siguientes detalles:
La identificación selectiva se realizó en un total de 94 GLPs (94 subagrupamientos), que representan aproximadamente 30.000 plantas de trigo mutadas. La ddPCR se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 7.
Una muestra de ADNg de 5 pl derivada de ADNg (GT#10001-GT#10094) se añadió a cada pocillo que contenía 17 pl de la mezcla de reacción de PCR y se mezcló minuciosamente al pipetear hacia arriba y hacia abajo.
La placa de PCR se cargó en el QX200 Droplet Reader (Bio-Rad Laboratories) para el análisis de gotas. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad Laboratories). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 3000 para la amplitud del Canal 1 y 2000 para la amplitud del Canal 2. La comparación de los valores individuales para la abundancia fraccional mostró que ADNg(GT#10072) contenía más señal derivada de la detección de mutantes que cualquier otra muestra. La abundancia fraccional de ADNg(GT#10072) fue del 0,130 % en comparación con el 0,024 %, que representa la abundancia fraccional promedio de todas las 94 muestras de ADNg analizadas.
W S4: H allazgo de grano(s) individual(es) caracterizado(s) p o r una m utación de in terés
Los granos de trigo individuales que portaban la mutación se identificaron esencialmente como se describe en esta invención anteriormente en WS4 con los siguientes detalles:
Basándose en el análisis de ADNg de subagrupamientos (GT#10001-GT#10094) con un ensayo de ddPCR específico de TaGASR7-A1, se consideró muy probable que los 4500 granos de GLP#10072 (correspondiente a una muestra positiva ADNg(GT#10072)) comprendería uno o más granos con la mutación idéntica de interés.
FGLP#10072 se estableció mediante la eliminación secuencial de 96 muestras de 10 granos cada una de GLP#10072. Cada alícuota de 10 granos se situó en un trozo de papel de pesaje y a continuación se fijó consecutivamente con un par de fórceps mientras se usaba una máquina de grabado (Marathon-3, Saeyang Microtech) equipada con un taladro de 1,6 mm para perforar un pequeño orificio de 2-3 mm de profundidad en el endosperma. El movimiento giratorio movía la harina desde el endosperma hasta la parte superior del grano y el papel de pesaje circundante. Las muestras perforadas de 10 granos se situaron en pocillos separados de 2 ml de una placa de microtitulación, lo que produjo el subagrupamiento secundario de granos de trigo perforados PDGLP#10072. Las 96 muestras de harina, cada una con harina derivada de 10 granos de trigo perforados, se transfirieron a pocillos separados de una placa de microtitulación de 1,5 ml (PFGLP#10072) manteniendo un sistema de numeración de muestras que coincida con el de los granos perforados.
PFGLP#10072 se sometió a extracción de ADNg utilizando un procedimiento de extracción de ADN semiautomatizado como se detalla en las instrucciones del kit NucleoSpin 96 Plant II (Macherey-Nagel). En consecuencia, cada pocillo de la placa de microtitulación contenía ADNg de harina de 10 granos.
El ADN derivado de PFGLP#10072 se analizó como se describió anteriormente. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad Laboratories). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2500 para la amplitud del Canal 1 y 1700 para la amplitud del Canal 2. Se identificaron dos pocillos individuales en la placa de microtitulación (B10 y G05) que mostraron una abundancia fraccional de 7,6 % y 5,2 %, todos indicando la presencia de dos mutantes individuales en 2 pocillos independientes de PDGLP#10072.
Los 10 granos del pocillo B10 de PDGLP#10072 fueron germinados. El material foliar de las 10 plántulas se recogió y se sometió a extracción de ADN utilizando REDExtract (Sigma Aldrich). El ADNg derivado de muestras de hojas se analizó como se describió anteriormente. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad Laboratories). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2000 para la amplitud del Canal 1 y 1600 para la amplitud del Canal 2. Una plántula derivada del pocillo C03 de PDGLP#10072 mostró una abundancia fraccional de 99 %, confirmando la presencia de un mutante homocigoto.
Se realizó una verificación adicional de rasgos mediante secuenciación directa tanto en el mutante identificado como en una muestra de referencia. El ADN se extrajo del material de hoja utilizando el procedimiento de extracción de ADN REDExtract (Sigma Aldrich). Para el análisis de secuenciación, se preparó una reacción de PCR de 50 pl que contenía 1 pl de ADNg purificado, 20 pl de REDExtract (Sigma Aldrich), 500 nM de un cebador directo específico de diana, 500 nM de un cebador inverso específico de diana y agua. Las muestras se sometieron a ciclos térmicos utilizando las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización a 94°C durante 2 min, 38 ciclos de PCR a 94°C durante 45 s, 58°C durante 45 s y 72°C durante 45 s, y una extensión final a 72°C durante 5 min antes del almacenamiento de la placa de PCR a 8°C. Los productos de PCR individuales se purificaron utilizando el Gel NucleoSpin y el kit de limpieza de PCR. Todas las muestras se secuenciaron utilizando un cebador directo específico de diana y un cebador inverso específico de diana.
La plántula que resultó positiva para la mutación en el análisis de ddPCR también mostró un genotipo mutante heterocigoto en la ubicación genómica predeterminada. La muestra de referencia mostró un genotipo de tipo salvaje homocigoto en la misma ubicación.
Ejemplo 23
Se identificó una planta de cebada que porta una mutación específica mediante el uso combinado de dos tecnologías, de las cuales una fue proporcionada por RainDance Technologies y la otra por Bio-Rad Laboratories. En términos generales, la tecnología RainDance se utilizó para identificar muestras específicas, aunque complejas, que contenían plantillas de ADNg de numerosos granos mutantes mientras que los análisis posteriores basados en Bio-Rad ayudaron a identificar granos únicos caracterizados por la mutación de interés. La denominación de los diversos agrupamientos, etc., se realizó utilizando la denominación que se muestra en la figura 2.
Tal como se describe, los procedimientos pueden usarse para la identificación de cualquier mutante. El presente Ejemplo describe la identificación de una mutación específica (guanina a adenina) que conduce al intercambio del aminoácido triptófano a una parada traduccional en la región del codón de un gen de cebada que codifica una BAHD aciltransferasa putativa (HvBADH1) en la posición 31.
Ensayo de ddPCR
Se diseñó un ensayo de ddPCR específico, que distingue específicamente entre el alelo mutante y el alelo de tipo salvaje de HvBADH1 en la posición nucleotídica 93. La secuencia de codificación de tipo salvaje (secuencia de ADNc) se proporciona en esta invención como SEQ ID NO:17 y la secuencia codificante de mutantes se proporciona en esta invención como SEQ ID NO:18. La secuencia de aminoácidos de HvBADH1 se proporciona como s Eq ID NO:19. La sonda de detección de mutantes era complementaria a parte de la secuencia codificante que contenía una adenina en la posición nucleotídica 93 de SEQ ID NO:17. La sonda de detección de referencia era complementaria a parte de la secuencia codificante que contenía una guanina en la posición nucleotídica 93. Se diseñaron dos cebadores flanqueantes para amplificar la secuencia genómica que rodea al nucleótido 93 en la secuencia codificante. Adicionalmente, se desarrolló una sonda de bloqueo, utilizando la secuencia de nucleótidos de la sonda de detección de referencia, complementada con un espaciador 3', que impide la extensión de la secuenciación de referencia, por las ADN polimerasas durante la PCR. Los siguientes cebadores y sondas se desarrollaron para el locus HvBADH1 específico:
cebador directo específico de diana (5'- CCCGACCACACGC - 3')(SEQ ID NO:20)
cebador inverso específico de diana (5'- ACTCCACCAGGCCG - 3')(SEQ ID NO:21)
sonda de detección de mutantes (5'- Ct GGCGTGAGTGGAC - 3')(SEQ ID NO:22) - marcada con 6-carboxifluoresceína - FAM
sonda de detección de referencia (5'- CTGGCGTGGGTGGA- 3')(SEQ ID NO:23) - marcada con tetraclorofluoresceína -TET
sonda de bloqueo (5'- CTGGCGTGGGTGGA - 3')(SEQ ID NO:24) - marcada con un espaciador 2',3'-didesoxiC
P reparación de "Superagrupam ientos" de ADNg.
Simplemente, 50 pl de cada extracto de ADNg de todas las 94 "Alícuotas de totales de subharina individuales (ASFTs)" representadas en una placa de 96 pocillos, se agruparon en un "Superagrupamiento".
Determ inación de s i un "Superagrupam iento" contiene granos m utados
A continuación se determinó si un "Superagrupamiento", que comprendía ADN de 94 ASFTs, contenía granos mutados, esencialmente como se describe en el Ejemplo 17 anterior en esta invención con los siguientes detalles:
En primer lugar, se añadieron 2 pl de ADNg de un superagrupamiento a una PCR de enriquecimiento y bloqueo de 50 pl que contiene 10 pl de tampón de reacción 5X Q5 (New England Biolabs), dNTP 200 pM, 0,02U/pl Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad, 100 nM de cebador de PCR directo específico de diana, 100 nM de cebador de PCR inverso específico de diana, sonda de bloqueo 100 nM (espaciador 2',3'-didesoxiC) y agua. La mezcla de PCR se sometió a un ciclo térmico utilizando condiciones de PCR estándar: desnaturalización a 98°C durante 2 min, 20 ciclos de PCR a 98°C durante 10 s, 57°C durante 20 s y 72°C durante 10 s, y una extensión final a 72°C durante 5 min antes del almacenamiento a 8°C.
En segundo lugar, se generaron gotas para 4 "Superagrupamientos" individualmente enriquecidos y bloqueados usando el instrumento Source de RainDrop. Una alícuota de 10 pl de producto de PCR enriquecido y bloqueado de cada "Superagrupamiento" se combinó individualmente con 25 pl de Supermix para Sondas (Bio-Rad); 1X estabilizador de gotas (RainDance); 900 nM del cebador directo específico de diana; 900 nM del cebador inverso específico de diana; 120 nM de la sonda de detección de referencia (TET); 440 nM de la sonda de detección de mutantes (FAM), y; H2O para ajuste a un volumen de reacción total de 50 pl. Se añadieron un total de 4 mezclas de reacción individuales, que representan 4 "Superagrupamientos" individuales de ADNgs, al chip de fuente (RainDance) y se procesaron en el Instrumento Source (RainDance).
La tira de PCR de 8 pocillos que contenía las gotas generadas a partir de las mezclas de reacción por el Instrumento Source (RainDance), descrito anteriormente en esta invención, se sellaron y sometieron a ciclos térmicos utilizando condiciones de PCR estándar: desnaturalización a 95°C durante 10 min, 40 ciclos de PCR a 95°C durante 15 s, 55°C durante 1 min y una extensión final a 98°C durante 10 min antes del almacenamiento a 8°C. Posteriormente, las mezclas amplificadas se transfirieron al Instrumento Sense (RainDance) y se analizaron utilizando el software de análisis de datos RainDrop Analyst.
La abundancia fraccional promedio de 4 superagrupamientos fue del 0,0115 %. El superagrupamiento SP-ADNg#05 tenía una abundancia fraccional de 0,0228 %, lo que indica una alta probabilidad de que este superagrupamiento contenga ADN de granos mutantes.
Determ inación de s i una m uestra de b ib lio teca contiene g ranos m utados
A continuación se determinó si la placa de 94 ASFTs correspondientes a SP-ADNg#05 contenían granos mutados, esencialmente como se describe en el Ejemplo 7 anterior en esta invención con los siguientes detalles:
La identificación selectiva se realizó en un total de 94 SGTs (totales de subgrano), que representaban aproximadamente 30.000 plantas de cebada mutadas. El ADNg utilizado para esta parte de la identificación selectiva fue el ADNg purificado de ASFT, es decir, el ADN que no había sido enriquecido. Para fines analíticos, 5 pl de ADNg purificado derivado de ADNg(GT#377-GT#470) se añadió a una mezcla de PCR de 17 pl que contenía 11 pl 2x de ddPCR Supermix para sondas (n.° dUTP; Bio-Rad Laboratories), cebadores de PCR específicos de diana 900 nM, sonda de detección de mutantes 250 nM (6-carboxifluoresceína - FAM) y sondas de sonda de detección de tipo salvaje (tetraclorofluoresceína - TET). La mezcla de reacción se cargó en el generador de gotas AutoDG (Bio-Rad), y la generación de gotas se llevó a cabo de acuerdo con el manual del fabricante. La emulsión de gotas se sometió a un ciclo térmico utilizando condiciones estándar de PCR: desnaturalización a 95°C durante 10 min, 40 ciclos de PCR a 94°C durante 30 s y 55°C durante 1 min, y una extensión final a 98°C durante 10 min antes del almacenamiento de la placa de microtitulación a 8°C. La amplificación por PCR en gotas se confirmó utilizando el QX200 Droplet Reader (Bio-Rad Laboratories).
La placa de PCR se cargó en el QX200 Droplet Reader (Bio-Rad Laboratories) para el análisis de gotas. Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad Laboratories). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 2200 para la amplitud del Canal 1 y 2700 para la amplitud del Canal 2. La comparación de los valores individuales para la abundancia fraccional mostró que ADNg(GT#416) contenía más señal derivada de la detección de mutantes que cualquier otra muestra. La abundancia fraccional de ADNg(GT#416) fue del 0,4 % en comparación con el 0,073 %, que representa la abundancia fraccional promedio de todas las 94 muestras de ADNg analizadas.
H allazgo de grano(s) individual(es) caracterizado(s) p o r una m utación de interés
Los granos de cebada individuales que portaban la mutación se identificaron esencialmente como se describió en esta invención anteriormente en los Ejemplos 9 a 15 con los siguientes detalles:
Basándose en el análisis de ADNg(GT#416) con un ensayo de ddPCR específico de HvBADH1, se consideró muy probable que los 4500 granos de GLP#416 (correspondiente a una muestra positiva ADNg(GLP#416)) comprenderían uno o más granos con la mutación idéntica de interés.
FGLP#416 se estableció mediante la eliminación secuencial de 96 muestras de 12 granos cada una de GLP#416. Cada alícuota de 12 granos se situó en un trozo de papel de pesaje y a continuación se fijó consecutivamente con un par de fórceps mientras se usaba una máquina de grabado (Marathon-3, Saeyang Microtech) equipada con un taladro de 1,6 mm para perforar un pequeño orificio de 2-3 mm de profundidad en el endosperma. El movimiento giratorio movía la harina desde el endosperma hasta la parte superior del grano y el papel de pesaje circundante. Las muestras perforadas de 10 granos se situaron en pocillos separados de 2 ml de una placa de microtitulación, lo que produjo el subagrupamiento secundario de granos de cebada perforados PDGLP#416. Las 96 muestras de harina, cada una con harina derivada de 12 granos de cebada perforados, se transfirieron a pocillos separados de una placa de microtitulación de 1,5 ml (PFGLP#416) manteniendo un sistema de numeración de muestras que coincida con el de los granos perforados.
PFGLP#416 se sometió a extracción de ADNg utilizando un procedimiento de extracción de ADN semiautomatizado como se detalla en las instrucciones del kit NucleoSpin 96 Plant II (Macherey-Nagel). En consecuencia, cada pocillo de la placa de microtitulación contenía ADNg de harina de 12 granos.
El ADN derivado de PFGLP#416 se analizó usando la misma mezcla de PCR y las mismas condiciones de reacción de PCR que se describieron anteriormente (D e te rm in a c ió n de s i u n a m u e s tra de b ib lio te c a co n tie n e g ra n o s m u tad os). Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad Laboratories). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 3000 para la amplitud del Canal 1 y 2500 para la amplitud del Canal 2. Se identificaron dos pocillos individuales en la placa de microtitulación (D10 y F02) que mostraron una abundancia fraccional de 3,4 % y 13,7 %, indicando la presencia de dos mutantes individuales en 2 pocillos independientes de PDGLP#416.
Los 12 granos del pocillo F02 de PDGLP#416 fueron germinados. El material foliar de las 12 plántulas se recogió y se sometió a extracción de ADN utilizando REDExtract (Sigma Aldrich). El ADNg derivado de muestras foliares se analizó usando la misma mezcla de PCR y las condiciones de reacción de PCR que se describieron anteriormente (D e te rm in a c ió n de s i u n a m u e s tra de b ib lio te c a co n tie n e g ra n o s m u tad os). Los datos se analizaron utilizando el software QuantaSoft (versión v1.7, Bio-Rad Laboratories). El umbral se determinó utilizando el gráfico 2-D y se fijó en 5000 para la amplitud del Canal 1 y 3200 para la amplitud del Canal 2. Una plántula derivada del pocillo F02 de PDGLP#416 mostró una abundancia fraccional de 39 %, confirmando la presencia de un mutante heterocigoto.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de identificación de un organismo de una especie predefinida que porta una o más mutaciones predeterminadas en nucleótido(s) de interés [NOI(s)], en una secuencia diana, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) Proporcionar un agolpamiento de organismos de dicha especie, o partes reproductivas de los mismos, que representan una pluralidad de genotipos;
b) Dividir dicho agrupamiento en uno o más subagrupamientos de organismos, o partes reproductivas de los mismos; c) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADN genómico (ADNg), de cada genotipo dentro de un subagrupamiento, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento;
d) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una la muestra de ADNg de un subagrupamiento, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, comprendiendo cada una parte de dicha muestra de ADNg, uno o más conjuntos de cebadores, flanqueando cada conjunto una secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la(s) secuencia(s) diana; e) Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) una o más secuencias diana que comprenden la(s) mutación(es) en el(los) NOl(s), identificando así subagrupamiento(s) que comprende(n) dicha(s) mutación(es); f) Dividir los organismos, o partes reproductivas de los mismos, de dicho(s) subagrupamiento(s) identificado(s) en subagrupamientos secundarios, tales como al menos 10, preferiblemente al menos 90 subagrupamientos secundarios; g) Preparar muestras de ADNg, comprendiendo cada una ADNg de cada genotipo dentro de un subagrupamiento secundario, mientras se mantiene el potencial de multiplicación de organismos de cada genotipo dentro de dicho subagrupamiento secundario;
h) Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una la muestra de ADNg de un subagrupamiento secundario, uno o más conjuntos de cebadores, flanqueando cada conjunto una secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la(s) secuencia(s) diana;
i) Detectar productos de amplificación por PCR que comprenden una o más secuencias diana que comprenden la(s) mutación(es) predeterminada(s) en el(los) NOI(s), identificando así subagrupamientos secundarios en la etapa i) que comprenden dicha(s) mutación(es);
j) Identificar un organismo, o parte reproductivas del mismo dentro de dicho subagrupamiento secundario que porta dicha(s) mutación(es),
con la condición de que cuando la especie es una planta o un animal, el procedimiento no comprende una etapa de reproducción sexual.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, donde la(s) amplificación(es) por PCR de la etapa d) se realiza(n) mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
- Preparar una o más amplificaciones por PCR que comprenden la muestra de ADNg, uno o más conjuntos de cebadores, flanqueando cada conjunto una secuencia diana y reactivos de PCR;
- Particionar dicha(s) amplificación(es) por PCR en una pluralidad de compartimentos espacialmente separados; - Realizar amplificación(es) por PCR;
- Detectar productos de amplificación por PCR,
donde dichos compartimentos espacialmente separados, por ejemplo, son gotas, tales como gotas de una emulsión de agua-aceite, donde cada gota, por ejemplo, tiene un volumen promedio en el intervalo de 0,1 a 10 nl, y/o
donde cada PCR, por ejemplo, se compartimenta en el intervalo de 1000 a 100.000 compartimentos espacialmente separados.
3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los reactivos de PCR comprenden
a) una o más sondas de detección de mutación, donde cada sonda de detección de mutación comprende un oligonucleótido unido opcionalmente a un medio detectable, donde el oligonucleótido es idéntico a una secuencia diana o complementario a la misma, incluyendo una mutación predeterminada del NOI; y/o
b) una o más sondas de detección de referencia, donde cada sonda de detección de referencia comprende un oligonucleótido opcionalmente unido a un medio detectable, donde el oligonucleótido es idéntico a una secuencia diana o complementario a la misma, incluyendo un NOI de referencia;
donde la(s) sonda(s) de detección de mutantes está(n) unida(s) opcionalmente a un fluoróforo y a un desactivador de fluorescencia, y/o la sonda de detección de referencia está opcionalmente unida a un fluoróforo diferente y a un desactivador de fluorescencia, y donde los reactivos de PCR comprenden opcionalmente un exceso de al menos 2 veces de la(s) sonda(s) de detección de mutantes con respecto a la(s) sonda(s) de detección de referencia.
4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho ag o l pamiento de organismos se prepara sometiendo los organismos de dicha especie, o partes reproductivas de los mismos, a una mutagénesis aleatoria, donde el ag o l pamiento de organismos comprende, por ejemplo, al menos 10.000, preferiblemente al menos 100.000, aún más preferiblemente al menos 500.000 organismos, o partes reproductivas de los mismos, con diferentes genotipos.
5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la especie es una planta.
6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la especie es un organismo unicelular,
y las etapas a) y b) de dicho procedimiento comprenden las etapas de:
- Proporcionar una pluralidad de organismos unicelulares;
- Someter dichos organismos a una mutagénesis aleatoria;
- Dividir los organismos mutagenizados en subagrupamientos;
- Someter cada subagrupamiento a una etapa de reproducción;
y/o la etapa f) comprende las siguientes etapas:
- Proporcionar un subagrupamiento que comprende la(s) mutación(es) en uno o varios NOls;
- Reproducir algunos, o la totalidad de los organismos, de dicho subagrupamiento de manera clonal para obtener cultivos clonales;
- Combinar una fracción de organismos de una pluralidad de dichos cultivos clonales para obtener subagrupamientos secundarios, preferiblemente cada subagrupamiento secundario comprende fracciones en el intervalo de 10 a 100 cultivos clonales;
y/o donde la etapa j) de identificar el organismo comprende las etapas de:
- Proporcionar un subagrupamiento secundario que comprende la mutación en el NOI;
- Reproducir algunos o la totalidad de los organismos de dicho subagrupamiento de manera clonal;
- Determinar qué clon(es) comprende(n) organismos que comprenden la mutación en el NOI.
7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la amplificación por PCR de la etapa h) comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento comprende además una etapa de identificar un superagrupamiento que comprende una o más mutaciones en el(los) NOI(s), donde el superagrupamiento es un grupo de subagrupamientos.
9. El procedimiento según la reivindicación 8, donde el procedimiento comprende además las siguientes etapas realizadas después de la etapa c):
- Obtener una fracción de cada muestra de ADNg de cada subagrupamiento;
- Combinar una pluralidad de fracciones en superagrupamientos, por ejemplo en 5 a 100 superagrupamientos, obteniendo así superagrupamientos de ADNg que comprenden muestras de ADNg de una pluralidad de subagrupamientos, donde el ADNg de cada subagrupamiento solo está presente en un superagrupamiento;
- opcionalmente, realizar una etapa de enriquecimiento de los superagrupamientos de ADNg
- Realizar una pluralidad de amplificaciones por PCR, comprendiendo cada una, un subagrupamiento de muestras de ADNg, donde cada amplificación por PCR comprende una pluralidad de amplificaciones por PCR compartimentadas, comprendiendo cada una parte de dicha muestra de ADNg, uno o más conjuntos de cebadores, flanqueando cada conjunto una secuencia diana y reactivos de PCR, amplificando así la(s) secuencia(s) diana;
- Detectar producto(s) de amplificación por PCR que comprende(n) una o más secuencias diana que comprenden la(s) mutación(es) en el(los) NOI(s), identificando así subagrupamiento(s) que comprende(n) dicha mutación,
donde la etapa d) de realizar amplificaciones por PCR opcionalmente se realiza solo en muestras de ADNg de subagrupamiento(s) que comprende(n) una de la(s) mutación(es).
10. El procedimiento según la reivindicación 9, donde la(s) amplificación(es) por PCR que comprende(n) un superagrupamiento de muestras de ADNg se realiza(n) mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
- Preparar una amplificación por PCR que comprende la muestra de ADNg, uno o más conjuntos de cebadores, flanqueando cada conjunto una secuencia diana y reactivos de PCR;
- Particionar dicha(s) amplificación(es) por PCR en una pluralidad de compartimentos espacialmente separados, donde cada compartimento tiene un volumen promedio en el intervalo de 0,1 a 10 pL;
- Realizar una amplificación por PCR;
- Detectar productos de amplificación por PCR
donde cada PCR se compartimenta opcionalmente en al menos 1.000.000 de compartimentos, tales como compartimentos espacialmente separados
y/o
donde dichos compartimentos espacialmente separados son gotas, tales como gotas de una emulsión de agua-aceite.
11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6 a 10, donde la especie es un organismo unicelular, por ejemplo una levadura.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 10, donde la especie es una planta, por ejemplo una planta con flores, tal como un cereal, por ejemplo cebada.
13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la mutación es una sustitución de un único nucleótido.
14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento es un procedimiento de identificación de más de una mutación predeterminada, y/o
el procedimiento es un procedimiento de identificación de una mutación predeterminada en una secuencia diana, y el procedimiento emplea solo un conjunto de cebadores que flanquean dicha secuencia diana.
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