ES2923643T3 - Anticuerpos monoclonales anti-(+)--metanfetamina - Google Patents

Abstract

La presente invención abarca composiciones y métodos para tratar de manera efectiva al menos un síntoma o un signo de uso de metanfetamina, o para ralentizar la tasa de entrada (+) metanfetamina en el cerebro de un sujeto. El método comprende la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo de metanfetamina anti-(+) con un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales anti-(+)-metanfetamina

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-(+)-metanfetamina y al uso de los anticuerpos para bloquear o reducir los efectos farmacológicos inducidos por la metanfetamina.

Antecedentes de la invención

El abuso de la metanfetamina ha sido un problema importante en los Estados Unidos durante la última década. Según la Administración de Servicios de Salud Mental y de Abuso de Sustancias, en 2011 había 439000 consumidores de metanfetamina en Estados Unidos. Los nuevos consumidores de metanfetamina fueron 133 000. En 2010, más de 100000 personas fueron admitidas a tratamiento por abuso de drogas con la metanfetamina como principal sustancia de abuso. Además, se produjeron 54,9 visitas a los servicios de urgencias por cada 100000 habitantes de 21 años o más relacionadas al consumo de metanfetamina.

Los tratamientos actuales para el abuso de la metanfetamina no suelen ser eficaces a largo plazo. El Centro para el Tratamiento del Abuso de Sustancias ("Center for Substance Abuse Treatment", CSAT) de la UCLA informó de que el 36 % de los pacientes que completaron con éxito los programas de tratamiento volvieron a consumir (+)-metanfetamina en los primeros 6 meses después del tratamiento y otro 15 % volvió a consumir en un plazo de 13 meses (Brecht et al., 2000). Así, al menos la mitad de los pacientes que completan los programas de tratamiento acaban consumiendo de nuevo metanfetamina. Estos altos índices de reincidencia pueden deberse a que los enfoques actuales son principalmente de apoyo. Aunque algunos síntomas del abuso y la toxicidad de la metanfetamina pueden tratarse eficazmente (por ejemplo, el tratamiento de la hipertensión con antihipertensivos, la supresión de la depresión y la ansiedad de la abstinencia con complementos farmacológicos), no existen tratamientos para reducir los efectos placenteros de refuerzo del consumo de (+)-metanfetamina que promueven la adicción (es decir, el subidón eufórico que los consumidores de drogas ansían). Los tratamientos actuales más eficaces para la adicción a la metanfetamina son las intervenciones cognitivo-conductuales de enfoque a largo plazo utilizadas para modificar el pensamiento, las expectativas y los comportamientos del paciente y aumentar las habilidades para hacer frente a diversos factores de estrés de la vida, mientras los pacientes aprenden técnicas para evitar las drogas. Se analizan anticuerpos monoclonales antimetanfetamina en Owens et al., 2011.

Por lo tanto, la técnica anterior carece de un enfoque farmacológico eficaz para reducir los efectos reforzantes críticos de la metanfetamina, así como de los medios para tratar eficazmente la sobredosis de metanfetamina. La presente invención satisface esta antigua necesidad y deseo de la técnica.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo quimérico o humanizado aislado, en el que el anticuerpo se une específicamente a la (+)-metanfetamina y comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10. Las reivindicaciones dependientes proporcionan las realizaciones.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el anticuerpo del primer aspecto para su uso como medicamento, en particular, para su uso en el tratamiento de al menos un problema médico asociado al consumo de metanfetamina en un sujeto. El anticuerpo es útil para atenuar terapéuticamente los efectos tóxicos de la metanfetamina en un mamífero vivo o los efectos de la metanfetamina que promueve la adicción en un mamífero vivo. Las reivindicaciones dependientes proporcionan las realizaciones.

Otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo del primer aspecto junto con un diluyente, un excipiente o un vehículo. La composición puede comprender al menos un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina que comprenda una cadena pesada de SEQ ID NO:4 y una cadena ligera de SEQ ID NO:3. La invención incluye una composición medicinal que comprende al menos un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina como se define en el primer aspecto.

La invención también incluye una composición medicinal útil para tratar al menos un síntoma clínicamente detectable del consumo de metanfetamina. La composición comprende una cantidad medicinalmente eficaz de un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina como se define en el primer aspecto, adaptado para su administración a un sujeto humano vivo. Un anticuerpo útil en dicho tratamiento incluye un anticuerpo que atenúa terapéuticamente los efectos tóxicos de la metanfetamina en un mamífero vivo o los efectos de la metanfetamina que promueven la adicción en un mamífero vivo. La composición medicinal es adecuada para la administración eficaz a un sujeto vivo.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa dos gráficas que muestran los cambios en la unión in vivo de MET (metanfetamina) por anticuerpos monoclonales (mAb) anti-MET en presencia de una infusión continua de MET durante 13 días. Una vez que la MET alcanzó niveles de estado estacionario (pre-mAb) en cada una de las ratas Sprague-Dawley (n = 2 por grupo), se administró una dosis única de tratamiento con vehículo (solo MET) o de un tratamiento con tres mAb anti-MET diferentes en forma de inyección en embolada i.v. (180 mg/kg, equimolar en los sitios de unión a la carga corporal de MET). Se recogieron muestras de suero antes del tratamiento con mAb y en varios momentos después del tratamiento con mAb para determinar las concentraciones de MET a lo largo del tiempo (A). Los valores representan la concentración media de MET de cada grupo para cada momento. Los datos del AUC de la MET se muestran en (B).

La figura 2 representa gráficas que muestran la actividad locomotora tras una dosis de 1,68 mg/kg de (+)-MET en estudios de fase 2. Estas dosis se administraron10 días (A y B) y 14 días (C y D) después de la última administración del anticuerpo 51 el día 14. (A) y (C) muestran la distancia recorrida en función del tiempo. (B) y (D) muestran el área bajo las curvas de actividad locomotora de 0-120 min (cuando se produce un comportamiento estereotípico significativo y movimiento horizontal), y de 120-240 min cuando la respuesta predominante es el movimiento horizontal (medido por la distancia recorrida). Los círculos blancos/abiertos (A y C) y las barras blancas/abiertas (B y D) representan el vehículo; los círculos negros/cerrados (A y C) y las barras negras/abiertas (B y D) representan el anticuerpo 51.

La figura 3 representa gráficas que muestran el número de presiones de la palanca (eje de ordenadas) en el día 1, el día 4, el día 7, el día 10 y el día 13 (eje de abscisas) para el grupo de solución salina (círculos abiertos) y el grupo del anticuerpo 51 (círculos cerrados) en tres dosis: 30 mg/kg (A), 56 mg/kg (B) y 100 mg/kg (C). La administración de anticuerpos o solución salina se detuvo el día 10, por lo que los días 10 y 13 se identifican como "sin mAb". * p < 0,05

La figura 4 representa una gráfica que muestra el número de presiones de la palanca de MET (eje de ordenadas de la izquierda) y el porcentaje de respuesta de control (eje de ordenadas de la derecha) frente a la dosis de inyección de MET (eje de abscisas). Las presiones de la palanca frente a la dosis de (+)-MET se representan como la curva negra sólida en forma de campana. Esta curva teórica en forma de campana se generó a partir de los datos de dosis-respuesta de ratas entrenadas para presionar la palanca para diferentes dosis unitarias de MET de estudios anteriores en laboratorio de los inventores. Se representa al cambio porcentual promedio en la presión de la palanca en cada día de tratamiento con el anticuerpo 51 durante (flechas azules junto a la línea negra) y después del tratamiento con el mAb (flechas rojas junto a la línea negra) (calculado a partir de la figura 5A-5C) en combinación con la curva en forma de campana de respuesta a la dosis de MET obtenida anteriormente. La dirección de las puntas de flecha conectadas es una interpretación de los cambios progresivos de tiempo y dosis en la respuesta en presencia del anticuerpo 51 hasta niveles que estaban cerca de los niveles de extinción de la respuesta.

La figura 5 representa una gráfica que muestra una curva típica de DPM (desintegración por minuto del radioligando) frente a la concentración en nM de MET (u otros inhibidores de prueba) de un ensayo de reactividad cruzada del ligando. Estos ensayos comienzan con la incubación de MET radiomarcada (como ligando trazador) con MET no marcada u otros inhibidores del ligando en un intervalo de concentraciones. En esta figura, el inhibidor es MET sin marcar (véase el eje de abscisas para el intervalo de concentraciones), ch-anticuerpo 51 es el anticuerpo de unión a MET, y se usa la proteína G conjugada a las esferas magnéticas para separar la MET unida al anticuerpo de la MET libre. Tras alcanzar el equilibrio, las esferas se separan de la solución con un imán. El [3H]-MET unido a los anticuerpos se cuantifica mediante recuento por centelleo líquido y las DPM se representan gráficamente en función de la concentración de inhibidor no marcado en el tubo. La concentración de inhibidor requerida para inhibir la unión de [3H]-MET en un 50 % menos la concentración de [3H]-MET es el valor de Kd (si es MET) o Ki (si es un inhibidor no homólogo).

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-(+)-metanfetamina y el uso de los mismos para el tratamiento de los problemas médicos asociados al consumo de metanfetamina. Los anticuerpos de la presente invención bloquean y/o reducen eficazmente los efectos farmacológicos inducidos por la metanfetamina. Por lo tanto, la administración de una cantidad farmacológicamente eficaz de un anticuerpo de la invención a un sujeto vivo que lo necesite proporcionaría un antagonismo adecuado de las propiedades farmacocinéticas de la metanfetamina. Por lo tanto, la presente divulgación incluye el descubrimiento de que un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina proporciona un tratamiento para el abuso y/o adicción a la metanfetamina, incluyendo la sobredosis aguda y crónica, y la recaída en el consumo de drogas.

A. Problemas médicos asociados al consumo de metanfetamina

La metanfetamina se presenta en dos enantiómeros, el dextrógiro y el levógiro. La dextrometanfetamina (o (+)-metanfetamina) posee los conocidos efectos psicoestimulantes de la droga, mientras que la levometanfetamina es inactiva en el SNC. La metanfetamina puede venderse de modo ilegal como dextrometanfetamina pura o en una mezcla racémica. Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "(+)-metanfetamina" y "dextrometanfetamina" se refieren a una muestra que solo contiene el enantiómero dextrógiro, mientras que el término "metanfetamina" se refiere a una mezcla racémica. Sin embargo, al describir los efectos farmacológicos de la metanfetamina (es decir, una mezcla racémica), debe entenderse que estas propiedades son intercambiables con las de la (+)-metanfetamina, ya que la levometanfetamina es inactiva en el SNC.

La metanfetamina se ha utilizado como droga medicinal y lúdica. La metanfetamina puede aumentar el estado de alerta, la concentración y la energía en individuos fatigados en dosis bajas. En dosis más altas, puede inducir manía con la consiguiente euforia, sensaciones de aumento de la autoestima y aumento de la libido. La FDA ("Food and Drug Administration") ha aprobado el uso de la metanfetamina para el tratamiento del TDAH y la obesidad exógena (obesidad originada por factores ajenos al control del paciente) tanto en adultos como en niños. También se receta para el tratamiento de la narcolepsia y la depresión resistente al tratamiento. En Estados Unidos, la metanfetamina es una droga de la lista II y se vende bajo la marca Desoxyn. También se sintetiza y distribuye de modo ilegal.

La presente invención proporciona anticuerpos anti-(+)-metanfetamina como se define en la reivindicación 1 y usos de los mismos para el tratamiento de los problemas médicos asociados al consumo de metanfetamina. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "problemas médicos" se refiere a los efectos físicos y/o psicológicos adversos o tóxicos del consumo de metanfetamina. Los efectos físicos y/o psicológicos adversos o tóxicos del consumo de metanfetamina son bien conocidos en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de los efectos físicos del consumo de metanfetamina pueden ser anorexia, hiperactividad, pupilas dilatadas, piel enrojecida, sudoración excesiva, inquietud, sequedad de boca y bruxismo (lo que lleva a la "boca de metanfetamina"), dolor de cabeza, aceleración de los latidos del corazón, ralentización de los latidos del corazón, respiración rápida, presión arterial alta, presión arterial baja, temperatura corporal alta, diarrea, estreñimiento, visión borrosa, mareos, espasmos, insomnio, entumecimiento, palpitaciones, temblores, piel seca y/o con picores, acné, palidez, y, con dosis crónicas y/o altas, convulsiones, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y muerte. Algunos ejemplos no limitantes de los efectos psicológicos del consumo de metanfetamina pueden ser euforia, ansiedad, aumento de la libido, estado de alerta, concentración, aumento de la energía, aumento de la autoestima, confianza en sí mismo, sociabilidad, irritabilidad, agresividad, trastornos psicosomáticos, agitación psicomotriz, dermatilomanía (arrancarse la piel de forma compulsiva), tirarse del pelo, delirios de grandeza, alucinaciones, sensaciones excesivas de poder e invencibilidad, comportamientos repetitivos y obsesivos, paranoia y, con un consumo crónico y/o dosis elevadas, psicosis anfetamínica. En algunas realizaciones ejemplares, un problema médico asociado al consumo de metanfetamina puede ser el abuso de la misma. En otras realizaciones ejemplares, un problema médico asociado al consumo de metanfetamina puede ser la adicción a la metanfetamina. En otras realizaciones ejemplares, un problema médico asociado al consumo de metanfetamina son los efectos adversos o tóxicos de la misma.

Además, los "problemas médicos asociados al consumo de metanfetamina" significan los efectos reforzadores de la metanfetamina que contribuyen a la adicción y a la recaída en el consumo de drogas. La rápida aparición de los efectos subjetivos de la metanfetamina cuando se fuma o se inyecta por vía intravenosa es un factor que contribuye al poder de refuerzo y adicción de la droga. Los métodos para medir los efectos subjetivos de la metanfetamina (por ejemplo, la euforia, la sensación de "colocón" y el ansia de consumo) son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, un problema médico asociado al consumo de metanfetamina son los efectos reforzadores de la misma.

En algunas realizaciones, el problema médico es el abuso y/o la adicción a la metanfetamina. La metanfetamina tiene un alto potencial de abuso y adicción, ya que activa el sistema de recompensa psicológico al desencadenar una liberación en cascada de dopamina en el cerebro. Los signos y/o síntomas del abuso y/o adicción a la metanfetamina son bien conocidos en la técnica y son, entre otros, los efectos físicos y psicológicos del consumo de metanfetamina descritos anteriormente, así como los síntomas de abstinencia y neurotóxicos descritos a continuación. Los síntomas de abstinencia de la metanfetamina consisten principalmente en fatiga, depresión y aumento del apetito. Los síntomas pueden durar días con el consumo ocasional y semanas o meses con el consumo crónico, y la gravedad depende del tiempo y de la cantidad de metanfetamina consumida. Los síntomas de abstinencia también pueden incluir ansiedad, irritabilidad, dolores de cabeza, agitación, inquietud, sueño excesivo, sueños vívidos o lúcidos, sueño REM profundo e ideación suicida. El consumo de metanfetamina también está muy vinculado con la depresión y el suicidio, así como con enfermedades cardíacas graves, psicosis anfetamínica, ansiedad y comportamientos violentos. La metanfetamina no es directamente neurotóxica, pero su consumo a largo plazo puede tener efectos secundarios neurotóxicos. Su consumo se asocia a un mayor riesgo de efectos similares al párkinson, probablemente debido a que la liberación incontrolada de dopamina es neurotóxica. El aumento de la dopamina a largo plazo que se produce como resultado del abuso de la metanfetamina puede causar neurotoxicidad, que se cree que es responsable de causar déficits cognitivos persistentes, como la pérdida de memoria, el deterioro de la atención y la disminución de la función ejecutiva. Al igual que los efectos neurotóxicos sobre el sistema dopaminérgico, la metanfetamina también puede provocar neurotoxicidad en el sistema de la serotonina.

En algunas realizaciones, un problema médico asociado con el abuso de metanfetamina puede ser la sobredosis aguda de metanfetamina. En otras realizaciones, un problema médico asociado al abuso de metanfetamina puede ser la sobredosis crónica de metanfetamina. En otras realizaciones, un problema médico asociado con el abuso de metanfetamina puede ser los efectos adversos de la misma. En otras realizaciones, un problema médico asociado con el abuso de metanfetamina puede ser los efectos tóxicos de la misma. En otras realizaciones, un problema médico asociado con el abuso de metanfetamina puede ser los efectos de refuerzo de la misma. En diferentes realizaciones, un problema médico asociado al abuso de metanfetamina puede ser la recaída en el consumo de drogas. En realizaciones alternativas, un problema médico asociado al abuso de la metanfetamina puede ser el riesgo de drogodependencia en poblaciones que aún no se han convertido en drogodependientes.

B. Anticuerpos anti-(+)-metanfetamina

Los anticuerpos según la invención se definen en las reivindicaciones. Los anticuerpos anti-(+)-metanfetamina útiles en el presente documento incluyen todos los anticuerpos que atenúan terapéuticamente los problemas médicos asociados al consumo de metanfetamina. Los problemas médicos asociados al consumo de metanfetamina se describen detalladamente más arriba.

Los anticuerpos útiles incluyen, entre otros, aquellos que se unen específicamente a un epítopo exclusivo dentro de la (+)-metanfetamina, o que se unen específicamente a un epítopo común dentro de la (+)-metanfetamina, metabolitos de la (+)-metanfetamina, estimulantes similares a la (+)-metanfetamina, o una combinación de los mismos. Los ejemplos no limitantes de metabolitos de (+)-metanfetamina incluyen la (+)-anfetamina. Los estimulantes similares a la (+)-metanfetamina se refieren a estimulantes estructuralmente relacionados y/o análogos alucinógenos. Como ejemplos no limitantes, los análogos similares a la (+)-metanfetamina incluyen la (+)-3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) y la (+)-3,4-metilendioxianfetamina (MDA).

Los anticuerpos útiles en el presente documento incluyen aquellos anticuerpos que han sido aislados, caracterizados, purificados, son funcionales y han sido recuperados (obtenidos) para su uso en una composición terapéutica funcional que se administra a un sujeto vivo que tiene signos o síntomas de consumo de metanfetamina, abuso de metanfetamina y/o adicción a la metanfetamina. Los signos o síntomas del consumo de metanfetamina, del abuso de metanfetamina y/o de la adicción a la metanfetamina se describen detalladamente más arriba.

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de una sola copia o clon, incluyendo, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota o fago. Un "anticuerpo monoclonal" no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología del hibridoma. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando, por ejemplo, técnicas de hibridoma bien conocidas en la técnica, así como tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación de fagos, tecnologías sintéticas o combinaciones de dichas tecnologías y otras tecnologías muy conocidas en la técnica. Además, el anticuerpo monoclonal puede ser marcado con un marcador detectable, puede inmovilizarse sobre una fase sólida y/o puede conjugarse con un compuesto heterólogo (por ejemplo, una enzima o una toxina) según métodos conocidos en la técnica.

Además, "anticuerpo" significa un anticuerpo monoclonal funcional o un fragmento inmunológicamente eficaz del mismo, como un fragmento Fab, Fab' o F(ab')2 del mismo. En algunos contextos del presente documento, los fragmentos se mencionarán específicamente para enfatizarlos; no obstante, se entenderá que, independientemente de que se especifiquen los fragmentos, el término "anticuerpo" incluye dichos fragmentos, así como las formas monocatenarias. Los anticuerpos monoclonales biespecíficos (es decir, una proteína que comprende fragmentos de dos anticuerpos monoclonales diferentes y, en consecuencia, se une a dos antígenos diferentes) también se incluyen en la definición de "anticuerpo". Mientras la proteína conserve la capacidad de unirse específicamente a su diana prevista, esta se incluye dentro del término "anticuerpo" También se incluyen en la definición de "anticuerpo", por ejemplo, las formas monocatenarias, generalmente denominadas Fv (o scFV para un fragmento variable monocatenario), regiones, de anticuerpos con esta especificidad. Preferible, pero no necesariamente, los anticuerpos útiles en la divulgación se producen de forma recombinante, ya que se requiere la manipulación de anticuerpos generalmente murinos u otros anticuerpos no humanos con la especificidad adecuada para convertirlos en forma humanizada. Los anticuerpos pueden estar o no glicosilados, aunque para algunas aplicaciones se prefieren los anticuerpos glicosilados. Los anticuerpos se reticulan de modo adecuado mediante enlaces disulfuro, como es sabido.

La unidad estructural básica de un anticuerpo útil en el presente documento comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, y cada par contiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y otra "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de entre aproximadamente 100 y 110 o más secuencias de aminoácidos, responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora.

Los anticuerpos anti-(+)-metanfetamina útiles en el presente documento incluyen aquellos que están aislados, caracterizados, purificados, funcionales y que han sido recuperados (obtenidos) de un proceso para su preparación y, por lo tanto, están disponibles para su uso en el presente documento en una forma útil en una cantidad terapéutica y medicinalmente suficiente.

Las cadenas ligeras se clasifican en gamma, mu, alfa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más secuencias de aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 secuencias más de aminoácidos.

Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Así, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Las cadenas presentan la misma estructura general de regiones marco ("framework regions", FR) relativamente conservadas, unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad (en adelante, "CDR", "complementarity determining regions") Las CDR de las dos cadenas están alineadas por las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 respectivamente. La asignación de las secuencias de aminoácidos a cada dominio se ajusta a las convenciones conocidas (véase, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991; Chothia, et al., J. Mol. Bio., (1987), 196:901-917; Chothia, et al., Nature (1989), 342:878-883).

Los anticuerpos monoclonales anti-(+)-metanfetamina se generan con la especificidad adecuada mediante técnicas convencionales de inmunización de mamíferos, formando hibridomas a partir de las células productoras de anticuerpos de dichos mamíferos o inmortalizándolas de otro modo, y cultivando los hibridomas o las células inmortalizadas para evaluar su especificidad adecuada. Tales anticuerpos podrían generarse inmunizando a un ser humano, conejo, rata o ratón, por ejemplo, con un hapteno como se describe en el documento US 7 202 348,. Los materiales para la manipulación recombinante pueden obtenerse recuperando las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo deseado a partir del hibridoma u otra célula que lo produce. Estas secuencias de nucleótidos pueden entonces ser manipuladas y aisladas, caracterizadas, purificadas y recuperadas para proporcionarlas en forma humanizada, para su uso en el presente documento si se desea.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo humanizado" incluye un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina que está compuesto parcial o totalmente por secuencias de aminoácidos derivadas de un anticuerpo humano mediante la alteración, la combinación o la sustitución de secuencias por las de un anticuerpo que tiene c Dr no humanas. La alteración más sencilla de este tipo puede consistir simplemente en la sustitución de la región constante de un anticuerpo humano por la región constante murina, lo que da lugar a una quimera humana/murina que puede tener una inmunogenicidad lo suficientemente baja como para ser aceptable para su uso farmacéutico. Sin embargo, es preferible que la región variable del anticuerpo también se humanice mediante técnicas que ya son bien conocidas en la técnica. Las regiones marco de las regiones variables se sustituyen por las correspondientes regiones marco humanas dejando la CDR no humana sustancialmente intacta. Las estructuras sustancialmente humanas tienen al menos un 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia marco humana conocida. Los anticuerpos humanos totalmente útiles se producen en ratones modificados genéticamente cuyo sistema inmunitario (por ejemplo, al menos las células B) ha sido alterado para que se corresponda con el del sistema inmunitario humano. Como se ha mencionado anteriormente, es suficiente para su uso en los métodos de la presente divulgación emplear un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, incluyendo fragmentos que representen formas monocatenarias.

Además, tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina que comprende un marco humano, al menos una CDR de un anticuerpo no humano, y en el que cualquier región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85-90 %, preferiblemente al menos un 95 % idéntica. Por lo tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto quizá las CDR, son sustancialmente idénticas a los pares correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativa.

Si se desea, el diseño de inmunoglobulinas humanizadas puede llevarse a cabo de la siguiente manera. Cuando una secuencia de aminoácidos entra en la siguiente categoría, la secuencia de aminoácidos marco de una inmunoglobulina humana que se va a utilizar (inmunoglobulina receptora) se sustituye por una secuencia de aminoácidos marco de una inmunoglobulina no humana que proporciona CDR (inmunoglobulina donante): (a) la secuencia de aminoácidos en la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora es inusual para la inmunoglobulina humana en esa posición, mientras que la secuencia de aminoácidos correspondiente en la inmunoglobulina donante es típica para la inmunoglobulina humana en esa posición; (b) la posición de la secuencia de aminoácidos es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o (c) cualquier átomo de la cadena lateral de una secuencia de aminoácidos marco está dentro de aproximadamente 5-6 ángstroms (de centro a centro) de cualquier átomo de una secuencia de aminoácidos de CDR en un modelo tridimensional de inmunoglobulina (Queen, et al., op. cit., y Co, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88:2869). Cuando cada una de las secuencias de aminoácidos en la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora y una secuencia de aminoácidos correspondiente en la inmunoglobulina donante es inusual para la inmunoglobulina humana en esa posición, dicha secuencia de aminoácidos se sustituye por una secuencia de aminoácidos típica para la inmunoglobulina humana en esa posición.

En todos los casos, un anticuerpo de la invención se une específicamente a la (+)-metanfetamina, y también puede unirse a un metabolito de la (+)-metanfetamina, o a un estimulante similar a la (+)-metanfetamina. La expresión "se une específicamente" significa en el presente documento que los anticuerpos se unen a la (+)-metanfetamina, o a un metabolito de la (+)-metanfetamina, con una constante de unión en el intervalo de al menos 10'4-10'6 M-1, siendo un intervalo preferido 10-7-10-9 M-1. Los métodos para determinar si un anticuerpo se une a la (+)-metanfetamina, a un metabolito de la (+)-metanfetamina o a un estimulante similar a la (+)-metanfetamina son conocidos en la técnica y se detallan en los ejemplos. Los anticuerpos específicos reconocen la (+)-metanfetamina y pueden reconocer dos compuestos del grupo formado por (+)-metanfetamina, (+)-anfetamina y (+)-MDMA. En una realización ejemplar, los anticuerpos específicos pueden reconocer los tres compuestos del grupo que consiste en (+)-metanfetamina, (+)-anfetamina y (+)-MDMA. En otra realización ejemplar, los anticuerpos específicos pueden reconocer los tres compuestos del grupo formado por (+)-metanfetamina, (+)-anfetamina y (+)-MDMA, y no reconocer la (-)-metanfetamina, la (-)-anfetamina y el (-)-MDMA. En otra realización ejemplar, los anticuerpos específicos pueden reconocer los tres compuestos del grupo formado por (+)-metanfetamina, (+)-anfetamina y (+)-MDMA, y no reconocer los medicamentos sin receta.

Un anticuerpo preferido es una forma humanizada de un anticuerpo de ratón que comprende las CDR de SEQ ID NO:5-10. Dicho de otro modo, un "anticuerpo preferido" comprende al menos regiones CDR compuestas por las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9 y 10.

En una realización, un anticuerpo de la invención puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % de identidad con la región variable de cadena ligera de s Eq ID NO:1, y una secuencia de ácido nucleico que comprende un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % de identidad con la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:2. En otra realización, un anticuerpo de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos con un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % de identidad con la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:3, o puede comprender una secuencia de aminoácidos con un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % de identidad con la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:4. El anticuerpo puede estar humanizado.

En una realización ejemplar de un anticuerpo de la invención que se une a la (+)-metanfetamina, el anticuerpo comprende la secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de SEQ ID NO:1 y la secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de SEQ ID NO:2. En otra realización ejemplar de un anticuerpo de la invención que se une a la (+)-metanfetamina, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO:3 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO:4.

Un anticuerpo de la invención comprende una CDR1 de cadena ligera. El anticuerpo 1 de la tabla A comprende una CDR1 de cadena ligera. Un anticuerpo de la invención comprende una CDR2 de cadena ligera. El anticuerpo 4 de la tabla A comprende una CDR2 de cadena ligera. Un anticuerpo de la invención comprende una CDR3 de cadena ligera. El anticuerpo 6 de la tabla A comprende una CDR3 de cadena ligera. Un anticuerpo de la invención comprende una combinación de tres CDR de cadena ligera. Los anticuerpos 2, 3 y 5 de la tabla A comprenden una combinación de dos o tres CDR de cadena ligera.

Un anticuerpo de la invención comprende una CDR1 de cadena pesada. El anticuerpo 7 de la tabla A comprende una CDR1 de cadena pesada. Un anticuerpo de la invención comprende una CDR2 de cadena pesada. El anticuerpo 10 de la tabla A comprende una CDR2 de cadena pesada. Un anticuerpo de la invención comprende una CDR3 de cadena pesada. El anticuerpo 12 de la tabla A comprende una CDR3 de cadena pesada. Un anticuerpo de la invención comprende una combinación de tres CDR de cadena pesada. Los anticuerpos 8, 9 y 11 de la tabla A comprenden una combinación de dos o tres CDR de cadena pesada.

Los anticuerpos 13-48 de la tabla A comprenden una o más CDR de cadena ligera y una o más CDR de cadena pesada.

Tabla A

Tabla B

En varias realizaciones, un anticuerpo de la invención está humanizado. Un anticuerpo humanizado de la invención comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10. En una realización ejemplar, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:6, una CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10.

Descritos, pero no reivindicados, los anticuerpos en una cantidad farmacológicamente eficaz preferida de calidad farmacéutica, incluyendo fragmentos inmunológicamente reactivos, se administran a un sujeto como, por ejemplo, a un sujeto vivo, para ser tratado de los síntomas asociados al abuso de metanfetamina. La administración se lleva a cabo mediante técnicas eficaces convencionales, que incluyen de forma periférica (es decir, no mediante la administración al sistema nervioso central) o local al sistema nervioso central. La administración periférica incluye, entre otras, la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. La administración local, que incluye directamente al sistema nervioso central (SNC), incluye, entre otras, a través de un catéter lumbar, intraventricular o intraparenquimatoso o utilizando una formulación de liberación controlada implantada quirúrgicamente.

Las composiciones farmacéuticas para una administración eficaz se diseñan deliberadamente para que sean apropiadas para el modo de administración seleccionado, y se utilizan excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes dispersantes compatibles, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes isotónicos, agentes estabilizantes y similares, según corresponda. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16a, ISBN: 0-912734-04-3, última edición, ofrece un compendio de las técnicas de formulación generalmente conocidas por los profesionales. Puede ser particularmente útil alterar las características de solubilidad de los anticuerpos útiles en esta divulgación, haciéndolos más lipofílicos, por ejemplo, encapsulándolos en liposomas o bloqueando los grupos polares.

La administración sistémica periférica eficaz por inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea es un método preferido de administración a un sujeto vivo. Los vehículos adecuados para estas inyecciones son sencillos. Sin embargo, la administración también puede realizarse a través de las membranas mucosas mediante aerosoles nasales o supositorios. Las formulaciones adecuadas para estos modos de administración son muy conocidas y suelen incluir tensioactivos que facilitan la transferencia a través de la membrana. Dichos tensioactivos suelen ser derivados de esteroides o son lípidos catiónicos, como el cloruro de N-[1-(2,3-dioleoil)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) o diversos compuestos, como el hemisuccinato de colesterol, los fosfatidilgliceroles y similares.

La concentración del anticuerpo humanizado en las formulaciones que se van a administrar es una cantidad efectiva y varía desde una concentración baja de aproximadamente el 0,1 % en peso hasta una concentración más alta de aproximadamente el 15 o aproximadamente el 20 % en peso, y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluidos, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado si se desea. Una composición típica para la inyección a un sujeto vivo podría fabricarse para contener 1 mL de agua estéril tamponada o solución salina tamponada con fosfato y aproximadamente 1-1500 mg de cualquiera de los anticuerpos humanizados de la presente divulgación o una combinación de los mismos. La formulación podría esterilizarse por filtración después de fabricar la formulación, o de otro modo hacerla microbiológicamente aceptable. Una composición típica para la infusión intravenosa podría tener unos volúmenes de entre 1-250 mL de fluido, tal como solución de Ringer estéril, y 1-100 mg por ml o más en concentración de anticuerpos anti-(+)-metanfetamina. Los agentes terapéuticos de la divulgación pueden ser congelados o liofilizados para su conservación y ser reconstituidos en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y la reconstitución pueden dar lugar a diversos grados de pérdida de actividad de los anticuerpos (por ejemplo, con las inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG). Las dosificaciones administradas son dosificaciones eficaces y pueden tener que ajustarse para compensar. El pH de las formulaciones, generalmente de calidad farmacéutica, se seleccionará para equilibrar la estabilidad de los anticuerpos (química y física) y la comodidad para el sujeto cuando se administran. En general, se tolera un pH de entre 4 y 8. Las dosis variarán de un individuo a otro en función de la talla, el peso y otras características fisiobiológicas del individuo que reciba la administración con éxito.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" significa una cantidad de una sustancia, como un compuesto, que produce efectos medibles y beneficiosos para el sujeto al que se le administra la sustancia, es decir, una eficacia significativa. La cantidad o dosis efectiva del compuesto administrado según la presente divulgación se determinará en función de las circunstancias que rodean el caso, incluyendo el compuesto administrado, la vía de administración, el estado de los síntomas que se están tratando y consideraciones similares del sujeto y de la situación de administración, entre otras consideraciones. Una dosis típica puede contener desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina descrito en el presente documento. Las dosis pueden variar entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, más preferentemente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg. La frecuencia de dosificación puede ser diaria o una, dos, tres o más veces por semana o por mes, según sea necesario para tratar eficazmente los síntomas. En realizaciones ejemplares, la frecuencia de dosificación puede variar de una vez a la semana a una vez al mes, más preferiblemente una vez cada dos a cuatro semanas. Por ejemplo, la frecuencia de dosificación puede ser una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

El momento de la administración del tratamiento en relación con la propia enfermedad y la duración del mismo se determinarán en función de las circunstancias que rodeen el caso. El tratamiento podría comenzar inmediatamente, por ejemplo, en el lugar de la lesión, administrado por el personal médico de emergencia. El tratamiento puede comenzar en el propio hospital o clínica, o en un momento posterior tras el alta hospitalaria o tras ser atendido en una clínica externa. La duración del tratamiento puede variar desde una dosis única administrada una sola vez hasta un curso de tratamientos terapéuticos de por vida.

Aunque los métodos anteriores parecen ser los más convenientes y los más apropiados y eficaces para la administración de proteínas, como anticuerpos humanizados, mediante una adaptación adecuada, pueden emplearse otras técnicas eficaces de administración, como la administración intraventricular, la administración transdérmica y la administración oral, siempre que se utilice la formulación adecuada del presente documento.

Además, puede ser deseable emplear formulaciones de liberación controlada utilizando películas y matrices biodegradables, o minibombas osmóticas, o sistemas de transporte basados en esferas de dextrano, alginato o colágeno.

Los niveles típicos de dosificación pueden determinarse y optimizarse utilizando técnicas clínicas convencionales y dependerán del modo de administración.

C. Anticuerpos anti-(+)-metanfetamina para su uso

Un anticuerpo anti-(+)-metanfetamina de la invención puede mezclarse con al menos un adyuvante o excipiente compatible adecuado, dando lugar a una composición medicinal terapéutica. La composición es adecuada para su administración a un sujeto vivo afectado por signos o síntomas de consumo, abuso y/o adicción a la metanfetamina. Normalmente se trata de una composición acuosa de gran pureza. En las reivindicaciones se describen anticuerpos anti(+)-metanfetamina adecuados. Los ejemplos no limitantes de sujetos adecuados incluyen un ser humano o un animal de laboratorio. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal de laboratorio. Los ejemplos no limitantes de un animal de laboratorio pueden incluir roedores, caninos, felinos y primates no humanos. En ciertas realizaciones, el animal es un roedor. Los ejemplos no limitantes de roedores pueden ser ratones, ratas, cobayas, etc. En otras realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Tal y como se utilizan en este documento, los términos "tratar" o "tratamiento" incluyen la prevención, la atenuación, la reversión o la mejora de al menos un síntoma o signo del consumo, abuso o adicción a la metanfetamina. Los signos o síntomas del consumo, el abuso y la adicción a la metanfetamina se describen detalladamente en la sección IA.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "atenuar terapéuticamente" incluye inducir un cambio o tener un efecto positivo beneficioso resultante.

En un aspecto, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en el tratamiento de al menos un problema médico asociado al consumo de metanfetamina en un sujeto.

En una realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en el tratamiento del abuso de metanfetamina en un sujeto. Los métodos para diagnosticar el abuso de la metanfetamina son conocidos en la técnica.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en el tratamiento de la adicción a la metanfetamina en un sujeto. Los métodos de diagnóstico de la adicción a la metanfetamina son conocidos en la técnica.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en el tratamiento de al menos un efecto tóxico asociado al consumo de metanfetamina en un sujeto. En el presente documento también se dan ejemplos no limitantes de efectos tóxicos. En realizaciones ejemplares, el efecto tóxico puede seleccionarse del grupo que consiste en convulsiones, ataque cardíaco, accidente cerebrovascular, toxicidad y neurotoxicidad.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en el tratamiento de al menos un efecto adverso asociado al consumo de metanfetamina en un sujeto. En el presente documento también se dan ejemplos no limitantes de efectos adversos. En realizaciones ejemplares, el efecto adverso puede ser seleccionado del grupo que consiste en ansiedad, alucinaciones, psicosis anfetamínica y paranoia.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en el tratamiento de la sobredosis aguda de metanfetamina en un sujeto adicto a la metanfetamina. Los métodos de diagnóstico de la sobredosis aguda de metanfetamina son conocidos en la técnica.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en el tratamiento de la sobredosis crónica de metanfetamina en un sujeto adicto a la metanfetamina. Los métodos de diagnóstico de la sobredosis crónica de metanfetamina son conocidos en la técnica.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en la prevención de la recaída en el consumo de metanfetamina en un sujeto adicto a la metanfetamina.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en la reducción de la frecuencia de recaída en el consumo de metanfetamina en un sujeto adicto a la metanfetamina. La "frecuencia de recaída", tal y como se utiliza en el presente documento, puede referirse a las posibilidades de que un sujeto vuelva a abusar de la metanfetamina tras un periodo inicial de recuperación. El periodo inicial de recuperación puede variar, y lo hará sin limitación, desde uno o varios días hasta un periodo de tiempo que oscila entre una semana y varios años. La frecuencia de las recaídas puede medirse con respecto a sujetos de control o de tratamiento y puede utilizarse para describir a los individuos o grupos en comparación con sujetos no tratados o con sujetos tratados de control negativo. La frecuencia de las recaídas puede disminuir al menos en un 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 % en comparación con sujetos no tratados o con sujetos tratados de control negativo. En algunas realizaciones, la frecuencia de recaída puede disminuir al menos en un 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % en comparación con sujetos no tratados o con sujetos tratados de control negativo. En otras realizaciones, la frecuencia de recaída puede disminuir al menos en un 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 % en comparación con sujetos no tratados o con sujetos tratados de control negativo. Los métodos para medir la frecuencia de las recaídas son conocidos en la técnica.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en la reducción del riesgo de drogodependencia en poblaciones que aún no se han convertido en drogodependientes, pero que están en riesgo. Las poblaciones "en riesgo" pueden incluir, entre otras, fetos y bebés lactantes de madres drogadictas, y niños adolescentes que aún no consumen drogas, pero tienen padres drogodependientes.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo reivindicado para su uso en la disminución de la tasa de entrada de (+)-metanfetamina en el cerebro de un sujeto, en un sujeto. Dicho de otro modo, la tasa de entrada de (+)-metanfetamina en el cerebro es más lenta o se reduce en comparación con la tasa de entrada de (+)-metanfetamina en el cerebro sin tratamiento. Los métodos para medir la tasa de entrada de (+)-metanfetamina en el cerebro de un sujeto son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las concentraciones de (+)-metanfetamina en el tejido cerebral, el líquido cefalorraquídeo o el líquido intersticial pueden medirse a lo largo del tiempo.

Ejemplos ilustrativos:

Ejemplo 1: Producción de anticuerpos monoclonales anti-MET de ratón

El hapteno similar a MET (S)-(+)-3-(9-carboxiniloxi)metanfetamina (abreviado (+)-MET M010) (Peterson E.C. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2007), 322: 30-39; Carroll F.I. et al., Med. Chem. (2009), 52, 7301-7309) se unió covalentemente a la albúmina de suero bovino ("bovine serum albumin", BSA) mediante un procedimiento de acoplamiento con carbodiimida (Davis M.T. y Preston J.F., Anal. Biochem. (1981), 116: 402-407). Esta síntesis implica la formación de un enlace covalente entre el terminal ácido carboxílico del hapteno (+)-MET MO10 y los grupos aminoácidos terminales de la BSA. La densidad del hapteno (+)-MET M010 con respecto al epítopo BSA del producto final (5:1) se determinó por espectrometría de masas.

Para el descubrimiento de líneas celulares de hibridoma secretoras de anticuerpos monoclonales anti-MET, se utilizó la siguiente técnica general. Grupos de ratones BALB/c hembra fueron inmunizados con el conjugado (+)-MET MO10-BSA (por ejemplo, 20 |jg de antígeno), emulsionado en un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Tres semanas y ocho semanas después, los ratones fueron reforzados con la misma vacuna conjugada de MET y el adyuvante. Dos semanas más tarde, se analizaron los sueros de los ratones para detectar anticuerpos específicos contra MET utilizando un conjugado (+)-MET MO10-ovoalbúmina en un formato ELISA, y se consideró que la respuesta era lo suficientemente alta como para producir anticuerpos monoclonales. Para este proceso se utilizó el bazo del animal con el título más alto de antisuero anti-MET. La pareja de fusión del hibridoma para las células del bazo de ratón fue la línea celular de mieloma P3 x 63Ag8.653 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). Tras el éxito de la fusión, se identificaron los hibridomas que secretaban anticuerpos anti-MET mediante un ELISA, con un conjugado (+)-MET MO10-ovoalbúmina, como se había descrito previamente (Laurenzana E.M. et al., Drug Metab. Dispos. (1995), 23: 271-278).

El isotipo de la IgG y la identidad de la cadena ligera se determinaron con un kit de isotipificación de anticuerpos de ratón (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). Los pocillos de las microplacas de titulación con una reacción positiva a MET se subclonaron a la monoclonalidad. Los anticuerpos IgG anti-MET fueron elegidos entre varios de los clones más prometedores en un cultivo de tejido. En las pruebas posteriores, se determinó el isotipo de la Ig, el tipo de cadena ligera de la IgG, la especificidad de ligando del anticuerpo, la afinidad por los fármacos similares a MET y los niveles de producción de IgG de la línea celular (un factor crucial para el uso posible en la producción de IgG a gran escala). Una vez identificados los mejores mAb candidatos, se llevó a cabo una caracterización más amplia de la especificidad con una serie de ligandos mediante radioinmunoanálisis con un radioligando [3H]-MET. A partir de estas líneas celulares estabilizadas de hibridoma de anticuerpos monoclonales se creó un banco celular maestro y de trabajo. A continuación, todas las líneas celulares se conservaron en nitrógeno líquido.

Ejemplo 2: Determinación de la función in vivo a largo plazo de un anticuerpo murino anti(+)-MET

La función de unión in vivo de los tres mAb anti-MET (anticuerpo 51, mAb10D1 y mAb4G9) a lo largo del tiempo después del tratamiento con el mAb se evaluó comparando los efectos del pre-mAb (para las concentraciones promedio de (+)-MET en suero en estado estacionario) y del post-mAb en la farmacocinética sérica de MET, y el área bajo la curva del tiempo de concentración sérica de MET desde el día 0 hasta el día 13. El día 0 del estudio comenzó un día después de la implantación de las bombas osmóticas de (+)-MET por vía subcutánea. Los grupos de dosificación se muestran en la tabla 1.

Tabla 1

Los mAb se formularon justo antes de los estudios con ratas. Todos los procedimientos se realizaron en una campana de seguridad en una sala limpia de purificación de proteínas. La purificación de los anti-mAb se realizó mediante cromatografía de afinidad con una columna de proteína G-Sepharose (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Buckinghamshire, Reino Unido) (Peterson et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2007), 322(1): 30-39). Tras la purificación, los mAb se concentraron en una célula de agitación de 500 ml (Amicon Inc., Beverly, MA) con una membrana de celulosa con un límite de exclusión de peso molecular de 30000 (Millipore Corporation, Bedford, MA). El tampón se cambió en el mismo proceso a fosfato de sodio 15 mM con cloruro de sodio 150 mM (pH 6,5-7,5). Para garantizar que las concentraciones de endotoxinas en las soluciones proteicas finales fueran insignificantes, se utilizó un kit de lisado de amebocitos de Limulus (QCL-1000; Cambrex Corp., East Rutherford, NJ) para analizar el producto final. Los niveles de endotoxinas eran insignificantes. El producto final de anticuerpos se ultracentrifugó a 100 000 x g durante 90 minutos a 4 °C para eliminar posibles complejos de anticuerpos de alto peso molecular, que pueden ser muy antigénicos. Se llevaron a cabo la absorbencia de UV y la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS para determinar las concentraciones de proteínas y para garantizar la pureza de la preparación final, respectivamente. Para preparar las dosis de mAb, se centrifugó una parte alícuota de la solución madre de anticuerpos a -100000 veces la gravedad durante 1 hora a 4 °C. El sobrenadante se conservó en un vial estéril sellado a 4 °C hasta la preparación de la dosis. Antes de la administración a las ratas, el mAb purificado se calentó rápidamente a 37 °C antes de extraer las dosis en jeringas estériles.

Para estos estudios, las ratas (n = 2 por grupo de control y de prueba de mAb) con catéteres dobles de vena yugular fueron alojadas individualmente en jaulas convencionales. Se prepararon minibombas osmóticas (2 semanas, Alzet, Durect Corp., Cupertino, CA) para administrar una dosis de (+)-MET (base libre) de 5,6 mg/kg/día disuelta en solución salina estéril. Las bombas se implantaron por vía subcutánea entre las escápulas de las ratas bajo anestesia de halotano.

Unas 16 h después de la implantación de las bombas, las ratas fueron anestesiadas con halotano. Se recogieron inmediatamente muestras de sangre (aproximadamente 250 pl) a través de los catéteres de la vena yugular derecha para determinar los niveles séricos pre-mAb-MET en estado estacionario. El catéter se lavó con 200 pl de solución salina estéril. A continuación, se administró una dosis de mAb (180 mg/kg, la misma dosis para los tres mAb de este estudio) equimolar en los sitios de unión a la carga corporal de MET en el momento de la dosificación a través del catéter de la vena yugular izquierda. Tras la dosis de mAb, el catéter se lavó con 200 pl de solución salina. A los 5 minutos de la administración del mAb, se recogió una muestra de sangre a través de un catéter en la vena yugular derecha. Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 350 pl) a través del catéter de la vena yugular derecha a las 24 horas, 4, 7 y 13 días después de la administración del mAb. El día 13, las ratas fueron anestesiadas con halotano y sacrificadas por decapitación. Se recogieron inmediatamente muestras de sangre del tronco y del cerebro. Tras dejar que la sangre coagulase, se recogió el suero por centrifugación. Las muestras de suero se conservaron a -80 °C hasta su análisis. A continuación, se determinaron las concentraciones de MET en las muestras de suero mediante un análisis de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS/MS) por un método previamente documentado de nuestro laboratorio (Laurenzana E.M. et al., Drug Metab. Dispos. (1995), 23: 271-278).

La vía de dosificación de (+)-MET fue una infusión subcutánea (s.c.). Los tratamientos con suero fisiológico, control de mAb y artículos de prueba de mAb se realizaron mediante dosificación intravenosa a través de un catéter permanente. Se trata de una dosis única administrada 24 horas después del inicio de la infusión de (+)-MET s.c. Se registraron los pesos corporales, el comportamiento alimentario y las observaciones generales sobre la salud de cada animal. Las concentraciones de (+)-MET se determinaron por LC/MS/MS, de forma similar al método descrito por Laurenzana E.M. et al., Drug Metab. Dispos. (1995), 23: 271-278.

Para determinar los parámetros farmacocinéticos séricos de los mAb anti-MET individuales, se analizaron las curvas promedio de concentración frente al tiempo de los mAb mediante métodos farmacocinéticos independientes del modelo. Para los datos de MET en suero en presencia de diversos mAb, se determinó el área bajo la curva (AUC) de concentración-tiempo de MET en suero desde el momento de la administración del mAb hasta el final del estudio (día 13; AUC^ía013) utilizando la regla trapezoidal lineal y el software Origin Graphing and Analysis, versión 7.0 (OriginLab Corp., Northampton, MA).

No se observaron cambios significativos en el peso corporal, el consumo de alimentos, las condiciones médicas ni cambios de comportamiento inesperados en los animales que completaron los estudios.

El anticuerpo 51 (denominado mAb7F9 en las figuras) mostró propiedades funcionales a largo plazo como se había documentado previamente para mAb4G9 (véase, figura 1; Owens S.M. et al., CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2011), 10: 892-898; véase también, Laurenzana E.M. et al., Drug Metab. Dispos. (1995), 23: 271-278). Mab7F9 se repitió en este estudio como control positivo. MAb10D1 (MET KD = 34 nM) no mostró una función a largo plazo. Estudios inéditos más recientes muestran que cuatro de los cinco mAb generados a partir del mismo hapteno de brazo espaciador más largo que el mAb4G9 y el anticuerpo 51 también tienen una duración de acción prolongada, mientras que cuatro de los cinco mAb generados a partir de un grupo de conectores de haptenos similares a MET más cortos mostraron inactivación después de solo 1-3 días in vivo (Laurenzana E.M. et al., Drug Metab. Dispos. (1995), 23: 271­ 278). Estudios recientes (no publicados) de un prototipo de anticuerpo inactivado muestran que la KD del mAb no se modifica, pero la capacidad de unión a MET (Bmax) se reduce significativamente. Este otro anticuerpo (mAb6H4) se generó mediante la inmunización con un hapteno similar al MET acoplado a través de un grupo conector más corto unido a un vehículo de proteína de antígeno. Esto significa que hay un número mucho menor de anticuerpos funcionales una vez que se produce la inactivación. Por lo tanto, la hipótesis de los inventores es que un brazo espaciador más largo entre la estructura del esqueleto de la MET y el antígeno protege de alguna manera contra la inactivación in vivo. Los inventores también saben por estos estudios recientes no publicados que los mAb se inactivan in vivo con o sin una infusión de (+)-MET. Esta unión del metabolito de MET al sitio de unión del anticuerpo no forma parte del mecanismo de inactivación.

En resumen, este estudio demuestra la importancia de la caracterización tanto in vitro como in vivo de las propiedades funcionales de los mAb terapéuticos. Estos datos también sugieren que los estudios cuidadosos de estructuraactividad con mAb generados a partir de una gama de haptenos pueden revelar mejores opciones para las vacunas óptimas. Los estudios también muestran que la función in vivo de los mAb no siempre se predice a partir de la caracterización inmunoquímica in v itro . Estos resultados enfatizan la necesidad de una amplia caracterización preclínica de los mAb terapéuticos, y destacan la prolongada función de unión a MET in vivo y la eficacia de los anti-MET mAb4G9 y anticuerpo 51.

Ejemplo 3: Prevención de la recaída inducida por MET en ratas

El anticuerpo 51 se formuló como se describe en el ejemplo 2.

Se eligió la rata Long Evans macho como modelo animal para este estudio porque es una especie de roedor preferida para las pruebas de toxicidad preclínica de los paradigmas de autoadministración de fármacos. Se utilizaron cámaras de prueba obtenidas en el mercado y equipadas con dos palancas retráctiles, una luz blanca de señalización colocada encima de cada palanca, una luz doméstica de 5 w y un generador de tonos Sonalert® (MED Associates, Inc., St. Albans, VT) que emite un tono de 2900 Hz y 60 dB. Las infusiones se administraron en un volumen de 0,2 ml mediante una activación de 6 segundos de las bombas de infusión (modelo PHS-100; MED Associates, Inc., St. Albans, VT). Las grabaciones de las presiones de las palancas y las activaciones de las luces, las bombas y los Sonalerts® se realizaron mediante un microordenador, una interfaz y el software asociado (MED-PC® IV, MED Associates, Inc., St. Albans, VT).

Las sesiones de entrenamiento de autoadministración ("self-administration", SA) de (±)-MET se realizaron cinco días a la semana (de lunes a viernes) durante 2 horas diarias. Al comienzo de las sesiones de SA de (±)-MET, las palancas se extendieron y la luz doméstica se encendió. Cada respuesta (proporción fija 1, FR1) en la palanca del lado derecho (palanca reforzada) daba lugar a la administración de una infusión de metanfetamina 0,1 mg/kg (0,2 ml/6 s), seguida de un período de tiempo de espera adicional de 14 s. Al comienzo de una infusión se apagó la luz doméstica, se hizo sonar el Sonalert® y las luces de señalización sobre cada palanca parpadearon a 3 Hz. El Sonalert® y las luces de señalización permanecieron activados durante la infusión de 6 s. Veinte segundos después del inicio de la infusión, se volvió a encender la luz doméstica y se volvió a ofrecer la oportunidad de autoadministrarse (±)-MET (es decir, cada infusión de (±)-MET iniciaba un periodo de 20 s durante el cual se registraban las presiones de la palanca, pero sin las consecuencias programadas, y no se podían obtener más infusiones). Se registraron las presiones de la palanca reforzada (lado derecho) durante las infusiones, así como todas las presiones de la palanca no reforzada (lado izquierdo), pero estas últimas sin las consecuencias programadas.

El entrenamiento de SA continuó hasta que se cumplieron tres criterios: 1) se realizaron al menos 12 sesiones de autoadministración; 2) se realizaron al menos 15 infusiones de (±)-MET durante cada una de las últimas cuatro sesiones; y 3) se obtuvieron al menos 125 infusiones de (±)-MET de por vida. Posteriormente, se realizaron doce sesiones de extinción de 2 horas diarias (de lunes a domingo). Durante las sesiones de extinción, la presión de la palanca no produjo infusiones ni cambios de estímulo, que se habían asociado previamente con las infusiones de (±)-MET (es decir, no se apagó la luz doméstica ni se activaron las luces de señalización y del Sonalert®). Las demás condiciones durante la extinción fueron idénticas a las de la SA. Es decir, durante las sesiones de extinción, ambas palancas estaban extendidas y la luz doméstica encendida. Antes de las últimas cuatro sesiones de extinción, se administró una inyección de solución salina (el vehículo para el cebado con (±)-MET) i.p. 30 min antes de la sesión para aclimatar a las ratas al procedimiento de inyección.

La prueba de reincorporación siguió al entrenamiento de extinción. Se consideró que una rata era elegible para la prueba de reincorporación posterior si durante las tres últimas sesiones de extinción el número medio de presiones de la palanca reforzada era menor que el número medio producido durante las tres primeras sesiones de extinción. Las ratas que no cumplieron este criterio de extinción fueron excluidas de las pruebas posteriores. Una rata del grupo del vehículo fue conservada inadvertidamente, a pesar de que su media de respuestas (12,3 respuestas) durante las tres últimas sesiones de extinción superó a sus tres primeras sesiones de extinción (11,6 respuestas). Las pruebas de reincorporación se realizaron en 13 sesiones experimentales diarias (de lunes a domingo) de 2 horas. Las condiciones durante las pruebas de reincorporación fueron idénticas a las del entrenamiento de extinción, con dos excepciones. 1) Se administró solución salina (S) o (±)-MET 1 mg/kg (M) (es decir, el cebado con (±)-MET) por vía i.p. 30 minutos antes de la sesión según el siguiente programa diario: LDDLDDLDDLDDL, y 2) seis horas antes del inicio de la primera (día 1), segunda (día 4) y tercera (día 7) sesiones de prueba de (±)-MET se administró por vía intravenosa a través de los catéteres una dosis de anticuerpo 51 o de solución salina estéril al 0,9 % (para el grupo de prueba con vehículo). Para prolongar los efectos del tratamiento con mAb en la reintegración inducida por el cebado con (±)-MET, no se administró el anticuerpo 51 (ni el vehículo salino) en las dos últimas sesiones de prueba de (±)-MET (día 10 y día 13). Se asignaron aleatoriamente grupos de 12 ratas a cada uno de los cuatro grupos de prueba de reintegración inducida por cebado con MET: 1) vehículo del anticuerpo 51 (solución salina); 2) anticuerpo 51 30 mg/kg; 3) anticuerpo 51 56 mg/kg; 4) anticuerpo 51 100 mg/kg (ver tabla 3).

Tabla 3

La vía i.p. de exposición al (±)-MET durante la prueba de recaída se seleccionó principalmente por la comodidad de la dosificación y para evitar el uso adicional de los catéteres. El artículo de prueba (anticuerpo 51) se administró mediante infusión por catéter intravenoso (durante aproximadamente 2 minutos) una vez el día 1, el día 4 y el día 7. El volumen de la dosis para cada animal se basó en la medición más reciente del peso corporal.

Se registraron los pesos corporales, el comportamiento alimentario y las observaciones generales de salud de cada animal. Los análisis de las respuestas de presión de palanca de un animal al vehículo y la recaída inducida por (±)-MET a la respuesta activa de palanca se utilizaron como medida de la respuesta del animal a una inyección i.p. de vehículo (control) o (±)-MET (1,0 mg/kg).

Inicialmente, se comparó el número de presiones de la palanca del lado derecho que se produjeron durante los días de prueba entre los grupos de prueba utilizando un ANOVA de dos factores y medidas repetidas (Prism 5 para Macintosh, GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). Si los resultados con el ANOVA fueron significativos (p < 0,05), se realizaron comparaciones entre los días de prueba similares entre los dos grupos de prueba utilizando una prueba de Bonferroni (Prism 5 para Macintosh, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Las comparaciones se consideraron estadísticamente significativas si p < 0,05.

El número de presiones de la palanca en la palanca reforzada durante el último día de SA no difirió significativamente (p > 0,61) entre todos los grupos de prueba, lo que indica que todas las ratas habían sido entrenadas para autoadministrarse (±)-MET a niveles similares antes del entrenamiento de extinción. Durante las sesiones de extinción inmediatamente anteriores a cada sesión de prueba de recaída, el número de presiones de la palanca reforzada tampoco difirió significativamente entre los grupos de prueba (p > 0,2), lo que indica que las ratas habían sido extinguidas a niveles similares antes de cada prueba de reincorporación. Sin embargo, al examinar estas cifras entre las sesiones de extinción, el ANOVA fue significativo (p < 0,04), aunque ninguna de las comparaciones por pares de Bonferroni fue significativa, lo que indica que los niveles de extinción no cambiaron sistemáticamente con el tiempo (datos no mostrados). Los cebados con (±)-MET reincorporaron significativamente la respuesta en el grupo de solución salina durante las sesiones de prueba de recaída del día 1, día 4, día 7, día 10 y día 13 (p < 0,05), respectivamente, lo que indica que estas condiciones fueron eficaces para generar la reincorporación inducida por el cebado con MET, independientemente del momento de la prueba.

Al someter todos los conjuntos de datos para cada día de prueba de recaída a una prueba de valores atípicos de Grubb, hubo tres valores atípicos en los datos de control y dos en el grupo del anticuerpo 51 30 mg/kg. Estos datos puntuales se eliminaron del análisis estadístico. La aparición de valores atípicos parecía ser aleatoria y ningún animal individual mostró un patrón de generación de valores atípicos repetidos. Estos cinco datos puntuales individuales procedían de un total de 240 observaciones individuales (5 días de pruebas, 12 animales por grupo, 4 grupos de control o de anticuerpo 51, 5 x 12 x 4 = 240 datos puntuales).

La figura 3 muestra los resultados de las presiones de la palanca reforzada para cada prueba de recaída para el grupo de control (círculo abierto) y las tres dosis del anticuerpo 51 (círculos cerrados). Los mismos resultados para el grupo de la solución salina (círculos abiertos) se repiten en cada una de las tres gráficas.

En el grupo de tratamiento con el mAb más alto (anticuerpo 51 100 mg/kg, figura 3C), la respuesta parecía estar al mismo nivel que la del tratamiento con vehículo durante el día 1 de la prueba, pero luego disminuyó a un ritmo constante desde el día 4 hasta el día 7. En el día 7 (tras la tercera dosis de anticuerpo 51), la respuesta se redujo significativamente (p < 0,05), en comparación con la respuesta de control. La respuesta permaneció atenuada durante el día 10 cuando se suspendió la administración del anticuerpo 51 (p > 0,08). En el día 13 pareció volver a los niveles de respuesta cercanos al control. Sin embargo, esta aparente vuelta a los niveles de respuesta de control podría ser engañosa, ya que la respuesta en los grupos de 30 y 56 mg/kg siguió siendo elevada por encima de los valores de referencia del vehículo en este mismo momento (figuras 3A y 3B).

En cambio, los estudios con dosis de 30 y 56 mg/kg (figuras 3A y 3B) mostraron unas tasas de respuesta que aumentaron a 70 y 91 presiones, o un aumento del 143% y 182% sobre los valores de control en el día 1, respectivamente. Los tratamientos posteriores con el anticuerpo 51 cada tres días con 30 y 56 mg/kg produjeron respuestas progresivamente más bajas desde el nivel de respuesta del día 1 para la dosis de mAb de 56 mg/kg, mientras que el tratamiento con 30 mg/kg mantuvo la respuesta a niveles siempre superiores al control.

Para comprender mejor el significado de estos cambios inducidos por el mAb, se realizó un análisis farmacodinámico del anticuerpo 51 de 100 mg/kg (figura 3C). Se simuló una gráfica que mostraba el número de inyecciones de MET (eje de ordenadas) frente a la dosis de inyección de MET (eje de abscisas). Los datos para esta simulación farmacodinámica se basaron en los estudios de SA de (+)-MET de McMillan et al. (2004) realizado en la UAMS. La simulación de los datos de SA (presiones de palanca frente a la dosis de (+)-MET) se representa como la curva negra sólida en forma de campana en la figura 4. Como parte de la interpretación, se representó el cambio porcentual promedio en la presión de la palanca en cada día de tratamiento con el anticuerpo 51 durante (flechas azules junto a la línea negra) y después del tratamiento con el mAb (flechas rojas junto a la línea negra). La dirección de las puntas de flecha conectadas es la interpretación de los cambios progresivos de tiempo y dosis en la respuesta en presencia del anticuerpo 51.

Este análisis farmacodinámico indicó que el anticuerpo 51 produjo cambios drásticos en los efectos percibidos o aparentes de la dosis de cebado de (±)-MET. Así, en el día 1, cuando no había ninguna diferencia aparente entre los niveles de respuesta del control y los tratados con el anticuerpo 51 100 mg/kg, la simulación sugiere que las ratas tratadas con el anticuerpo 51 produjeron realmente alrededor de 50 presiones de la palanca en la pendiente ascendente de la curva de respuesta a la dosis, mientras que, en los estudios actuales, los valores de los controles tratados con solución salina produjeron aproximadamente 50 presiones de la palanca en la pendiente descendente de la curva de respuesta a la dosis. Este dato puntual de los controles se representa como el círculo negro sólido a 0,1 mg/kg/iny en la porción descendente de la curva dosis-respuesta en forma de campana en la figura 4. Los cambios inducidos por el anticuerpo 51 fueron dependientes del tiempo y de la dosis de mAb. De hecho, cada nueva dosis de mAb iba acompañada de desplazamientos progresivos hacia la izquierda a lo largo de esta curva en forma de campana, hasta que la tercera dosis de 100 mg/kg del anticuerpo 51 produjo efectos en las ratas que llevaron a un nivel de respuesta casi de extinción ("Ext", círculo negro abierto).

Este análisis muestra que la aparente falta de cambio en la respuesta en el día 1 para la dosis de 100 mg/kg no se encontraba probablemente en "aproximadamente 50 respuestas" en el lado derecho descendente de la curva en forma de campana en el mismo lugar que el valor de "Control" (figura 4, círculo negro cerrado), sino que se encontraba en el lado izquierdo ascendente de la curva dosis-respuesta, donde 50 respuestas se cruzan con una dosis de aproximadamente 0,025 mg/kg/iny (punta de flecha azul superior). Es importante destacar que las dos siguientes dosis de mAb 100 mg/kg produjeron nuevas reducciones sustanciales de la respuesta en comparación con los valores de control. Así, las ratas parecían "percibir" la dosis de cebado de (±)-MET como mucho menor que las ratas no tratadas con mAb. Aunque se espera que la mayoría de los pacientes adictos intenten al principio superar los efectos neuroprotectores de la dosis de mAb, estos datos sugieren que, en condiciones óptimas, obtendrán pocos o ningún efecto de refuerzo.

Estos datos de tres dosis diferentes de anticuerpo 51 también sugieren la necesidad de una dosificación crónica de anticuerpo 51 para lograr los efectos máximos, incluso si las primeras dosis parecen proporcionar solo un antagonismo parcial o incompleto de los efectos de la MET. La necesidad de repetir la dosificación hasta alcanzar el estado estacionario es novedosa para el tratamiento de la adicción con mAb, pero es totalmente coherente con el principio farmacológico clínico bien establecido que establece que el máximo beneficio terapéutico no se alcanza hasta que el paciente recibe una dosis de 4 a 7 semividas de un fármaco. Para el anticuerpo 51, la semivida de eliminación terminal en ratas es de aproximadamente 6 días (hallazgo no publicado). En los seres humanos, la semivida de eliminación terminal del ch-anticuerpo 51 podría ser de 2 a 4 semanas.

Los resultados de este estudio sugieren que la administración del anticuerpo murino de alta afinidad anti-MET anticuerpo 51 puede cambiar la respuesta a una recaída inducida por (±)-MET en ratas. Los efectos dependían de la dosis de anticuerpo 51 administrada y del número de administraciones previas de anticuerpo 51. Los efectos sobre la respuesta continuaron incluso después de que se suspendiera la administración del anticuerpo 51 (en los días 10 y 13), lo que sugiere una eficacia prolongada más allá de la administración real. Mientras que las dos dosis más bajas de mAb aumentaron inicialmente el número de presiones de la palanca, antes de converger con los niveles de respuesta de control aparentes, la dosis más alta del anticuerpo 51 (100 mg/kg) redujo la respuesta por debajo de los niveles de control después de la segunda administración. Dado que la recaída en la respuesta a la MET fue inducida por el uso del estereoisómero (±)-MET, estos datos sugieren que el anticuerpo anti(+)-MET, el anticuerpo 51, puede seguir siendo eficaz contra el comportamiento inducido por el (+)-MET incluso cuando el (-)-MET está presente. Por último, estos datos muestran que la eficacia contra la recaída inducida por (±)-MET mejoró con un número creciente de administraciones de mAb7F9.

Ejemplo 4: Prevención de la recaída inducida por MET en ratas

El anticuerpo quimérico 51 (ch-anticuerpo 51) se basa en el anticuerpo murino original, el anticuerpo 51, y es un anticuerpo quimérico, tal como se utiliza el término en la técnica. El ch-anticuerpo 51 es un anticuerpo monoclonal quimérico diseñado para unirse a la (+)-metanfetamina

(MET) y algunos estimulantes estructuralmente relacionados (es decir, (+)-anfetamina y (+)-MDMA) de manera eficaz dentro del cuerpo humano. El ch-anticuerpo 51 fue diseñado para mantener las regiones marco variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de ratón, incluyendo las tres CDR de las cadenas pesada y ligera, pero incluye una región Fc de IgG2 humana. Estos estudios fueron diseñados para estudiar el potencial de unión del ch-anticuerpo 51 a estimulantes estructuralmente relacionados, neurotransmisores, medicamentos seleccionados y otras drogas de abuso (tabla 4). El ensayo utilizó un radioinmunoensayo (RIA) modificado en un formato de unión competitiva con [3H]-MET (similar al RIA en Peterson et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2008), 325:124-133). El ensayo se inicia incubando MET radiomarcada ([3H]-MET) con un ligando potencial no marcado (las concentraciones suelen oscilar entre 0,03­ 5000 nM), el ch-anticuerpo 51 y la proteína G conjugada con esferas magnéticas. Tras alcanzar el equilibrio, las esferas con el anticuerpo y el ligando unidos se separan de la solución con un imán y se aspira el sobrenadante. La cantidad de [3H]-MET unida al mAb se cuantifica mediante recuento por centelleo líquido. Para cada uno de los estimulantes relacionados, se construyó una curva de inhibición completa para determinar el valor de K^d o Kⁱ (véase la figura 5). Para el resto de los ligandos de prueba, se utilizó el mismo método, pero solo se probaron 2 concentraciones de ligando en lugar de la gama ampliada. Además, se utilizaron grupos de compuestos altamente concentrados para intentar la inhibición de la unión de [3H]-MET al ch-anticuerpo 51. Si la unión del MET se inhibía en un 50 % o más por cualquier grupo de ligandos, se repetía el ensayo con los compuestos por separado para identificar los ligandos individuales que reaccionaban de forma cruzada.

Tabla 4. Ligandos probados para la reactividad cruzada del anticuerpo 51

Las desintegraciones promedio por minuto (DPM) del contador de centelleo se representaron frente a la concentración de ligando no marcado utilizando el software Origin (OriginLab). Se ajustó a los datos una función logística de 4 parámetros para obtener los valores que describen las mesetas superior e inferior, la pendiente y el punto medio. El punto medio de la curva identifica la concentración de ligando no marcado necesaria para inhibir el 50 % de la unión de [3H]-MET. Para los ensayos homólogos en los que el MET no marcado compite con el [3H]-MET para unirse al chanticuerpo 51, se determina la constante de disociación (K^d) restando la concentración de [3H]-MET del punto medio. Para los ensayos no homólogos en los que los ligandos no marcados que no son MET compiten por la unión con [3H]-MET, la resta produce un valor Kⁱ.

Cada uno de los estimulantes estructuralmente relacionados enumerados en la tabla 4 se probó individualmente, en un intervalo de concentraciones, como inhibidor de la unión de la MET marcada radiactivamente. Los datos resultantes se utilizaron para determinar la constante de disociación del ch-anticuerpo 51 (K^d, que es la inversa de la constante de afinidad) o Kⁱ (concentración del ligando [por ejemplo, el inhibidor] que impide la unión del 50 % de la [3H]-MET) para el ligando específico. La figura 5 ilustra una curva típica que resulta de tales experimentos.

Estos resultados se compararon con los del anticuerpo parental murino, el anticuerpo 51, para demostrar la retención del perfil de unión tras la conversión a una forma quimérica de ratón-humano. Basándose en las características de unión al ligando, hubo una buena concordancia entre las formas murina y quimérica del anticuerpo, lo que sugiere que los datos de eficacia de la forma murina son relevantes y predictivos de la forma quimérica. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos (AMP y MDMA) o tres (MET) veces para obtener el valor promedio de K^d o Kⁱ que se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Resultados de las pruebas de reactividad cruzada de estimulantes relacionados.

Los resultados de los grupos de ligandos potenciales se presentan en la tabla 6. Cada grupo se analizó por triplicado, dos veces en cada concentración.

Tabla 6. Resultados de las pruebas de reactividad cruzada de los ligandos

Tres (3) de los grupos inhibieron la unión del MET marcado radiactivamente en más del 50 %, por lo que estos ligandos individuales se volvieron a probar a 1 pM por triplicado en 2 ensayos distintos. Los resultados promedio se recogen en la tabla 7.

Tabla 7. Resultados de las pruebas de reactividad cruzada de ligandos individuales a 1 pM

Dado que solo el (-)-MDMA fue capaz de inhibir la unión de [3H]-MET en más del 50 % cuando se probó individualmente, este es el único ligando con una Ki inferior a 1 pM. Todos los demás ligandos probados deben estar presentes en concentraciones superiores a 1 pM para tener un efecto apreciable en la capacidad de unión del chanticuerpo 51. El éxtasis es una mezcla racémica de las isoformas (+) y (-) del (±)-MDMA. Son análogos estructurales de la (±)-MET, por lo que se espera cierta reactividad cruzada. La capacidad del ch-anticuerpo 51 de unirse a ambas formas de MDM^a puede mejorar su utilidad como tratamiento del abuso de MDMA en el futuro.

Se estudió el perfil de reactividad cruzada del ligando para el ch-anticuerpo 51 utilizando un radioinmunoensayo modificado y ligandos potenciales seleccionados. Como era de esperar, el ch-anticuerpo 51 y el anticuerpo 51 tienen perfiles de unión muy similares para los estimulantes estructuralmente relacionados, especialmente para la (+)-MET. Esto sugiere que los datos de eficacia obtenidos de los estudios del anticuerpo 51 en roedores deberían ser útiles y predictivos para evaluar el potencial de uso del ch-anticuerpo 51 para tratar a los sujetos que abusan de la MET. En resumen, el perfil de unión del ch-anticuerpo 51 se limita al MET y a los estimulantes estructuralmente similares. La falta de reactividad cruzada con los medicamentos probados, los neurotransmisores y otras drogas de abuso sugiere que no es probable que el ch-anticuerpo 51 interactúe con sustancias habituales en el cuerpo con un tamaño similar a la MET.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. -Un anticuerpo quimérico o humanizado aislado, en el que el anticuerpo se une específicamente a la (+)-metanfetamina y comprende:

(a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5;

(b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6;

(c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;

(d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8;

(e) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10.

2. - El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2.

3. - El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une además a un epítopo dentro de un metabolito de la (+)-metanfetamina.

4. - Un anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso como medicamento.

5. - Un anticuerpo de la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de al menos un problema médico asociado al consumo de metanfetamina en un sujeto.

6. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, en el que el tratamiento incluye la prevención, la atenuación, la reversión o la mejora de al menos un síntoma o signo del consumo de metanfetamina en un sujeto.

7. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, en el que el problema médico asociado al consumo de metanfetamina se selecciona del grupo que consiste en la adicción a la metanfetamina y el abuso de la metanfetamina.

8. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, en el que el problema médico asociado al consumo de metanfetamina se selecciona del grupo que consiste en sobredosis aguda de metanfetamina, sobredosis crónica de metanfetamina y recaída en el consumo de metanfetamina.

9. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo anti-(+)-metanfetamina se une a un epítopo dentro de un metabolito de la (+)-metanfetamina.

10. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, en el que el tratamiento reduce la tasa de entrada de (+)-metanfetamina en el cerebro de un sujeto.

11. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, en el que el tratamiento reduce la frecuencia de recaída en el consumo de metanfetamina en un sujeto adicto a la misma.

12. - Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la reivindicación 1 junto con un diluyente, un excipiente o un vehículo.