ES2923909T3 - Proteínas específicas para BAFF y B7RP1 y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen proteínas biespecíficas específicas para BAFF y B7RP1, ácidos nucleicos que codifican tales proteínas, métodos para producir tales proteínas y usos para tales proteínas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas específicas para BAFF y B7RP1 y usos de las mismas

CAMPO

Las moléculas biespecíficas descritas en esta memoria están dentro del campo de la terapéutica proteica.

ANTECEDENTES

La mayoría de las proteínas terapéuticas se unen a una única proteína diana con alta especificidad, interfiriendo con ello con la actividad de esta única proteína diana. Esa proteína puede ser parte de una o más vías biológicas que median en una enfermedad humana que está siendo tratada y, por lo tanto, la proteína terapéutica puede inhibir la progresión de la enfermedad. Sin embargo, la eficacia de las proteínas terapéuticas rara vez es completa para todos los pacientes. La eficacia incompleta de las proteínas terapéuticas podría deberse en algunos casos a la complejidad de una enfermedad. Por ejemplo, algunas enfermedades pueden estar mediadas por múltiples vías biológicas, o diferentes vías biológicas pueden desempeñar un papel predominante en la mediación de la actividad de la enfermedad en diferentes pacientes que tienen la misma afección definida clínicamente. Por lo tanto, en algunas enfermedades puede ser ventajoso inhibir simultáneamente al menos dos vías biológicas.

SUMARIO

En esta memoria se describe una proteína biespecífica que puede unirse e inhibir la actividad biológica de la proteína 1 relacionada con B7 humana (B7RP1, también conocida como GL50 y ligando co-estimulador de células T (ICOSLG, por sus siglas en inglés)) y el factor activador de células B humanas (BAFF, también conocido como superfamilia del factor de necrosis tumoral, miembro 13b (TNFSF13B, por sus siglas en inglés)). BAFF juega un papel en la supervivencia de las células B y B7RP1 juega un papel en la co-estimulación de las células T. Sifuentes Giraldo et al. (Reumatologia Clinica 2012, Vol. 8, N° 5, pp. 263-269) describe dianas farmacológicas para el tratamiento de lupus eritematoso sistémico, entre otros, antagonistas de BAFF y antagonistas de ICOS-L/B7RP1/CD275 pero no sugiere combinar inhibidores de BAFF y B7RP1. Por lo tanto, una proteína que inhibe la actividad de ambas proteínas interfiere con la actividad tanto de las células B como T.

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. En particular, la presente invención proporciona: 1. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína biespecífica y/o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína biespecífica, en donde la proteína biespecífica comprende: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente fórmula:

A-L1-P-L2-P, en donde A es una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo IgG, L1 es un primer enlazador peptídico ef que está ausente o tiene una longitud de 3 a 40 aminoácidos, P es un péptido de unión a BAFF que tiene una longitud de 10 a 40 aminoácidos y L2 es un segundo enlazador peptídico que está ausente o tiene una longitud de 5 a 50 aminoácidos, y

(b) una cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo IgG,

en donde la cadena pesada de inmunoglobulina de (a) y la cadena ligera de inmunoglobulina de (b) forman un anticuerpo IgG, que comprende dos moléculas del polipéptido de (a) y dos moléculas de la cadena ligera de (b), que pueden unirse a B7RP1, y

en donde la proteína puede inhibir la proliferación mediada por BAFF de células B humanas, y

en donde la proteína puede inhibir la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1, y

en donde la célula huésped es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de mamífero.

2. La célula huésped del punto 1, en donde la proteína biespecífica comprende una cadena pesada de inmunoglobulina a la que le falta una lisina en su extremo C-terminal justo aguas arriba de L1.

3. La célula huésped del punto 1, en donde el anticuerpo IgG es un anticuerpo IgG1 anti-B7RP1 humano o humanizado.

4. La célula huésped del punto 1 o 2, en donde el anticuerpo anti-B7RP1 es un anticuerpo IgG2 humano o humanizado, o un anticuerpo IgG4 humano o humanizado.

5. La célula huésped de cualquiera de los puntos 1-4, en donde P tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL).

6. La célula huésped de cualquiera de los puntos 1-5, en donde L1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 (GGGGG).

7. La célula huésped de cualquiera de los puntos 1-6, en donde L2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, preferiblemente en donde L2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

8. La célula huésped de cualquiera de los puntos 1-7, que codifica una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (RASQGISNWLA), una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AASSLQS ), una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 (QQYDSYPRT), una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (SYWMS), una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (YIKQDGNEKYYVDSVKG), y una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (EGILWFGDLPTF).

9. La célula huésped de cualquiera de los puntos 1-8, en donde la proteína biespecífica codificada comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

10. La célula huésped de cualquiera de los puntos 1 -9, en donde la proteína biespecífica codificada comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

11. La célula huésped de cualquiera de los puntos 5-10, en donde la cadena ligera de inmunoglobulina de (b) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

12. La célula huésped de cualquiera de los puntos 5-11, en donde el polipéptido de (a) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o 18.

13. La célula huésped del punto 1, en donde el polipéptido (a) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, y el polipéptido (b) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

14. La célula huésped del punto 1, en donde la proteína biespecífica comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, preferiblemente, en donde la proteína comprende, además, un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

15. La célula huésped de cualquiera de los puntos 1-14, en donde la célula huésped es una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en una célula de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), una célula de riñón de hámster bebé (BHK por sus siglas en inglés), una célula de riñón de mono, una célula HeLa, una célula de carcinoma hepatocelular humano y una célula 293.

16. Un método para producir una proteína biespecífica, que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de los puntos 1-14 en condiciones tales que el ácido nucleico se exprese y recuperar la proteína de la masa celular o del medio de cultivo, en donde la célula huésped es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal.

17. El método del punto 16, en donde el ácido nucleico o vector se introduce en la célula mediante (a) electroporación o transformación con cloruro de calcio, en el que la célula huésped es una célula bacteriana, o (b) transformación con acetato de litio o transformación con polietilenglicol, en donde la célula huésped es una célula de levadura.

En esta memoria se describe una proteína biespecífica, en donde la proteína puede inhibir la proliferación de células B humanas mediada por BAFF y en donde la proteína puede inhibir la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1. La proteína biespecífica puede comprender un anticuerpo IgG que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina que tienen diferentes secuencias de aminoácidos y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. El anticuerpo IgG puede inhibir la proliferación de células B humanas mediada por BAFF y la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1. El anticuerpo IgG puede ser un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 y puede ser un anticuerpo IgG humano o humanizado. La proteína biespecífica puede comprender una región determinante de la complementariedad 1 (CDR1) de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, una cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Además, la proteína biespecífica puede comprender una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma y una región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 14 o una variante de la misma. Secuencias variantes de este tipo pueden comprender no más de 10 deleciones, inserciones o sustituciones de un solo aminoácido por cada 100 aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia.

Además, en esta memoria se describe una proteína biespecífica que puede inhibir la proliferación de células B humanas mediada por BAFF y que puede inhibir la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1, que puede comprender: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente fórmula: A-L1-P-L2-P, en donde A es una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo IgG, L1 es un primer enlazador que está ausente o tiene una longitud de 3 a 40 aminoácidos, P es un péptido de unión a BAFF que es de 10 a 40 aminoácidos de longitud, y L2 es un enlazador peptídico que está ausente o es de 5 a 50 aminoácidos de longitud; y (b) una cadena ligera de inmunoglobulina.

La cadena pesada de inmunoglobulina de (a) y la cadena ligera de inmunoglobulina de (b) pueden formar un anticuerpo IgG, que comprende dos moléculas del polipéptido de (a) y dos moléculas de la cadena ligera de (b), que pueden unirse a B7RP1 y/o que pueden inhibir la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1. A la cadena pesada de la inmunoglobulina le puede faltar una lisina en su extremo C-terminal justo aguas arriba de L1. El anticuerpo IgG puede ser un anticuerpo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano o humanizado. El péptido P de unión a BAFF puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. L1 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 37, 38, 39 o 40. L2 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6 o 7. La proteína biespecífica puede comprender una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (RASQGISNWLA), una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AASSLQS), una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (QQYDSYPRT), una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (SYWMS), una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (YIKQDGNEKYYVDSVKG) y una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (EGILWFGDLPTF). La proteína biespecífica puede comprender una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y/o una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. La proteína biespecífica puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o 18 o variantes de las mismas. Secuencias variantes de este tipo pueden comprender no más de 10 deleciones, inserciones o sustituciones de un solo aminoácido por cada 100 aminoácidos con respecto a la secuencia de referencia.

En un aspecto adicional, en esta memoria se describe una proteína biespecífica que comprende: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18 o variantes de las mismas; y (b) otro polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma. Secuencias variantes de este tipo pueden comprender no más de 10 deleciones, inserciones o sustituciones de un solo aminoácido por cada 100 aminoácidos con respecto a la secuencia de referencia. La proteína biespecífica puede inhibir la proliferación de células B humanas mediada por BAFF y la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1. La proteína biespecífica puede ser un tetrámero que comprende dos moléculas del polipéptido de (a) y dos moléculas del polipéptido de (b).

Además, en esta memoria se describe una proteína que comprende un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7. Esta proteína puede inhibir la proliferación de células B humanas mediada por BAFF y/o la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1. Una proteína de este tipo puede comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID NO: 15. Una proteína de este tipo puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos dos copias de SEQ ID NO: 1 separadas por SEQ ID NO: 6 o 7. Una proteína de este tipo puede incluir una cadena ligera de inmunoglobulina y una cadena pesada de inmunoglobulina, y SEQ ID NO: 6 o 7 puede estar aguas abajo del extremo C-terminal de la cadena pesada. La SEQ ID NO: 6 o 7 puede estar flanqueada por péptidos que se unen a una proteína distinta de la unida por las cadenas pesada y ligera.

Además, en esta memoria se describe una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria o la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 7 y un excipiente fisiológicamente aceptable.

También se describe en esta memoria un ácido nucleico que codifica cualquier polipéptido incluido en una de las proteínas biespecíficas o las proteínas que comprenden SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 descritas en esta memoria. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido incluido en una proteína biespecífica incluyen, por ejemplo, SEQ ID NO: 55, 56, 60, 61, 62 y 63, entre otros. Se describen vectores que comprenden ácidos nucleicos de este tipo y células huésped que contienen vectores y/o ácidos nucleicos de este tipo. En esta memoria también se describe un método para producir una proteína biespecífica, que comprende cultivar la célula huésped que contiene un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria en condiciones tales que el ácido nucleico se exprese y recuperar la proteína de la masa celular o del medio de cultivo. La célula huésped puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO, o una célula bacteriana tal como Escherichia coli.

En otro aspecto, en esta memoria se describe un método para tratar el lupus eritematoso sistémico, incluyendo la nefritis lúpica, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria o una composición farmacéutica que comprende una proteína biespecífica de este tipo. Se puede administrar otro agente terapéutico al paciente antes, después o al mismo tiempo que la proteína biespecífica. El otro agente terapéutico puede ser un corticosteroide, un antipalúdico, ácido retinoico, un NSAID, ciclofosfamida, dehidroepiandrosterona, micofenolato mofetilo, azatioprina, clorambucilo, metotrexato, tacrolimus, dapsona, talidomida, leflunomida o ciclosporina.

En un aspecto adicional, en esta memoria se describe un método de tratamiento, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria o una composición farmacéutica que comprende una proteína biespecífica descrita en esta memoria, en el que el paciente tiene una enfermedad seleccionada del grupo formado por: vasculitis ANCA-positiva, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, pénfigo, penfigoide, lupus eritematoso cutáneo subagudo (SCLE, por sus siglas en inglés), esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP, por sus siglas en inglés), miastenia gravis, síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis, anemia hemolítica autoinmune (AIHA, por sus siglas en inglés), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP, por sus siglas en inglés), hepatitis crónica activa, cirrosis biliar primaria, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison y neoplasia endocrina múltiple (MEN, por sus siglas en inglés).

En otro aspecto, en esta memoria se describe una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las proteínas biespecíficas o las proteínas que comprenden SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 descritas en esta memoria. La composición farmacéutica puede ser, por ejemplo, para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico o de la nefritis lúpica.

En otro aspecto, se describe el uso de cualquiera de las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria como medicamento. Sin embargo, cualquier referencia a un método de tratamiento practicado en el cuerpo humano o animal debe entenderse que se refiere a sustancias y composiciones para uso en tratamientos de este tipo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Diagramas de proteínas biespecíficas que se unen a BAFF y B7RP1. En la fila superior se enumera el identificador para cada una de las construcciones. En la segunda fila hay una breve frase descriptiva relacionada con la estructura de cada una de las construcciones. En la fila inferior hay un diagrama de la estructura de cada una de las construcciones. Los óvalos en blanco representan regiones constantes de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. Los óvalos en negro con líneas horizontales representan regiones variables de la cadena ligera o pesada (VH o VL) de inmunoglobulina. Los pequeños cuadrados y bucles negros sólidamente representan péptidos de unión a BAFF. Las regiones bisagra se muestran como líneas verticales gruesas, mientras que los puentes disulfuro se muestran como líneas horizontales gruesas. La secuencia de "G4S" en la Figura 1 se describe en SEQ ID NO: 72.

Figura 2: Actividad de proteínas biespecíficas en un ensayo de proliferación de células B humanas. Los datos que se muestran en las Figuras 2A (arriba) y 2B (abajo) son de ensayos de proliferación de células B realizados como se describe en el Ejemplo 1. En ambos paneles, el eje x indica la concentración (log[nM]) de la proteína biespecífica contenida en la mezcla de ensayo, y el eje y indica la cantidad de captación de 3H-timidina (recuentos por minuto (cpm)). El significado de cada uno de los símbolos se indica mediante un identificador para cada una de las proteínas ensayadas. Los significados de los identificadores se muestran en la Figura 1 y se explican en el Ejemplo 1.

Figura 3: Actividad de proteínas biespecíficas en un ensayo de proliferación de células T humanas. Los datos que se muestran son de ensayos de proliferación de células T realizados como se describe en el Ejemplo 1. El eje x indica la concentración (log[nM]) del anticuerpo biespecífico o aB7RP1 en la mezcla de ensayo, y el eje y indica el porcentaje de captación de 3H-timidina de células T en presencia de inhibidores de B7RP1 a las concentraciones indicadas con relación a la captación de 3H-timidina de células T sin inhibidores de B7RP1 (porcentaje de control). Se indica el identificador para cada una de las proteínas ensayadas.

Figura 4: Liberación de citoquinas por células de amígdalas humanas estimuladas con enterotoxina B de Staphylococcus (SEB, por sus siglas en inglés). Los métodos se describen en el Ejemplo 1. Los ejes y muestran los niveles de señal detectados para las diversas citoquinas medidos utilizando kits Meso Scale Discovery (Rockville, Maryland) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se trataron con aB7RP1 (pista 1), P74293 (pista 2), CTLA4-Ig (pista 3) o IgG humana (pista 4). Las citoquinas ensayadas se indican en la figura.

Figura 5: Perfil farmacocinético de construcciones biespecíficas en ratones. Los métodos para evaluar las propiedades farmacocinéticas in vivo de P71617, P71619, P71621, P71622, P74293 y P74294 en ratones se describen en el Ejemplo 1. Como se explica en el Ejemplo 1, las proteínas biespecíficas se detectaron mediante dos ensayos diferentes, uno de los cuales detectó solo la porción Fc de las proteínas (puntos de datos indicados por rombos negros; ensayo Fc) y uno de los cuales detectó tanto la porción Fc como la porción de unión a BAFF de las proteínas (puntos de datos indicados por cuadrados negros; ensayo intacto). El eje x indica el tiempo posterior a la inyección (horas) y el eje y indica la concentración de la proteína detectada en suero (ng/mL). La construcción inyectada se indica en cada uno de los paneles.

Figura 6A: Inhibición de la proliferación de células B murinas por una molécula biespecífica sustituta murina (la "sustituta murina") que se une a BAFF y B7RP1. El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 2. La sustituta murina comprende un anticuerpo IgG anti-B7RP1 murino que tiene dos copias de un péptido de unión a BAFF unido al extremo C de la cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo, como se explica en el Ejemplo 2 El control positivo era un pepticuerpo de unión a BAFF ("aBAFF"). Los datos de la sustituta murina y aBAFF se indican, respectivamente, mediante círculos y cuadrados completamente negros. El eje x indica la concentración de estas proteínas de prueba en el ensayo (log[pM]) y el eje y indica la incorporación de 3H-timidina (cpm).

Figura 6B: Inhibición de la unión de B7RP1 a células T murinas por la sustituta murina. El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 2. Se utilizó un anticuerpo IgG anti-B7RP1 murino ("anti-mB7RP1") como control positivo. Los datos de la sustituta murina y anti-mB7RP1 se indican, respectivamente, mediante círculos y cuadrados completamente negros. El eje x indica la concentración de estas proteínas de prueba en el ensayo (log[pM]), y el eje y indica el porcentaje de B7RP1 -Fc murino unido a las células T.

Figura 7: Efectos in vivo sobre los parámetros inmunológicos de la administración de glóbulos rojos de oveja a ratones. Todos los resultados que se muestran en esta figura son de los ensayos descritos en el Ejemplo 2. Las proteínas con las que fueron tratados los ratones se indican mediante el relleno de cada una de las barras como sigue: en blanco, antimB7RP1; líneas verticales, aBAFF; líneas horizontales, anti-mB7RP1 más aBAFF; líneas diagonales, la sustituta murina; tablero de ajedrez, mlgG1; y negro sólido (solo en el panel inferior), ratones no enfrentados a SBRC. Panel superior, porcentaje de células B de bazo en ratones enfrentados a glóbulos rojos de oveja (SRBC, por sus siglas en inglés). El eje y indica el porcentaje de células del bazo que son células B. Panel central, porcentaje de células T CD4+ de bazo que son células T de la memoria en ratones enfrentados a SRBC. Panel inferior, niveles de anticuerpos anti-SRBC en suero de ratones enfrentados a SRBC.

Figura 8A: Proteinuria en ratones NZB/NZW tratados con diversas proteínas. Los métodos se describen en el Ejemplo 2. El tratamiento para cada uno de los grupos de ratones se indica como sigue: círculos negros, solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés); cuadrados negros, IgG1 murina (un control de isotipo; 5 mg/kg); cuadrados en blanco, anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); triángulos negros que apuntan hacia arriba, aBAFF (1,88 mg/kg); triángulos en blanco que apuntan hacia arriba, aBAFF (1,88 mg/kg) más anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); y triángulos en blanco que apuntan hacia abajo, la sustituta murina (5 mg/kg). El eje x indica la edad de los ratones (meses) y el eje y indica el porcentaje de ratones que exhibieron proteinuria, es decir, > 300 mb/dL de proteína en la orina.

Figura 8B: Niveles de anticuerpos contra ADN de doble cadena (ADNdc) en ratones NZB/NZW de 8,5 meses de edad tratados con diversas proteínas. Los métodos se describen en el Ejemplo 2. El eje x indica la identidad de la o las moléculas con las que se trataron los ratones como sigue: 1, anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); 2, aBAFF (1,88 mg/kg); 3, aBAFF (1,88 mg/kg) más anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); 4, la sustituta murina biespecífica (5 mg/kg); y 5, mlgG1 (el control de isotipo; 5 mg/kg). El eje y indica los niveles de anticuerpos anti-ADNdc detectados como porcentaje del control positivo. Cada uno de los puntos indica datos de un solo ratón.

Figura 9A: Niveles de IgG anti-ADNdc en ratones NZB/NZW. Los métodos se describen en el Ejemplo 2. Los datos de diversos grupos de ratones se identifican como sigue: 1, ratones que recibieron anti-mB7RP1 (14 mg/kg); 2, ratones que recibieron aBAFF (5,6 mg/kg); 3, ratones que recibieron una combinación de anti-mB7RP1 (14 mg/kg) y aBAFF (5,6 mg/kg); 4, ratones que recibieron la sustituta murina (15 mg/kg); 5, ratones que recibieron el control de isotipo mlgG (15 mg/kg); y 6, ratones que recibieron PBS. Los asteriscos sobre las pistas 1,3 y 4 indican una diferencia significativa (*, p < 0,05; ***, p < 0,0001) entre los datos en esas pistas y los datos de la pista 5 (mlgG).

Figura 9B: Porcentajes de ratones NZB/W F¹ en cada uno de los grupos que tienen proteinuria. Los métodos se describen en el Ejemplo 2. Los datos de diversos grupos de ratones se identifican como sigue: cuadrados en blanco, ratones que recibieron anti-mB7RP1 (14 mg/kg); triángulos negros que apuntan hacia arriba, ratones que recibieron aBAFF (5,6 mg/kg); triángulos en blanco que apuntan hacia arriba, ratones que recibieron una combinación de anti-mB7RP1 (14 mg/kg) y aBAFF (5,6 mg/kg); triángulos en blanco que apuntan hacia abajo, ratones que recibieron la sustituta murina (15 mg/kg); cuadrados negros, ratones que recibieron el control de isotipo mlgG (15 mg/kg); y círculos negros, ratones que recibieron PBS. Se detectaron diferencias significativas entre la sustituta murina frente a anti-mB7RP1 (p < 0,01), aBAFF (p < 0,0001) y mlgG (p < 0,0001). Se indica la ventana de tiempo en la que se produjo el tratamiento.

Figura 10: Puntuaciones renales de ratones NZB/W F¹. Como se explica en el Ejemplo 2, los riñones se recogieron cuando murió un ratón, si eso sucedió antes del final del estudio, o al final del estudio. Las puntuaciones renales se determinaron como se describe en el Ejemplo 2, indicando las puntuaciones más altas una enfermedad renal más grave. Se muestran los promedios para cada uno de los grupos de ratones más las barras de error apropiadas. Los grupos de ratones recibieron los siguientes tratamientos: 1) anti-mB7RP1 (14 mg/kg), barra llena de líneas verticales; 2) aBAFF (5,6 mg/kg), barra llena de líneas horizontales; 3) combinación de anti-mB7RP1 (14 mg/kg) y aBAFF (5,6 mg/kg), barra llena con controles de ventana; 4) la sustituta murina (15 mg/kg), barra llena con patrón de tablero de ajedrez; 5) mlgG (15 mg/kg), barra llena de puntos blancos sobre fondo negro; y 6) PBS, barra llena sólidamente. Los asteriscos indican una diferencia significativa de los ratones tratados con mlgG con un valor de p < 0,05 (*) o < 0,001 (***).

Figura 11: Efectos de la inhibición de BAFF y/o B7RP1 sobre la artritis inducida por colágeno murino. Los métodos se describen en el Ejemplo 4. Los cinco grupos de ratones se trataron con sustancias de ensayo indicadas como sigue: mlgG, cuadrados negros conectados por líneas continuas; PBS, cuadrados negros conectados por líneas discontinuas; antimB7RP1, círculos negros conectados por líneas discontinuas; aBAFF, círculos en blanco conectados por líneas continuas; y combinación de anti-mB7RP1 y aBAFF, círculos negros conectados por líneas continuas. El panel superior muestra el porcentaje de incidencia de artritis de los diversos grupos, y el panel inferior muestra las puntuaciones promedio de artritis de los grupos. La flecha vertical que apunta hacia abajo en cada uno de los paneles indica el momento de la segunda inmunización con colágeno bovino.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS LISTADOS DE SECUENCIAS

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En esta memoria se describen proteínas biespecíficas que se unen e inhiben tanto el factor activador de células B (BAFF; también conocido como BLYS, TALL1, THANk o TNFSF13B) como la proteína 1 relacionada con B7 (B7RP1; también conocida como ligando ICOS, ICOSL, LICOS, B7 homólogo 2, B7H2 y GL50), ácidos nucleicos que codifican estas proteínas biespecíficas y métodos para producir y utilizar estas proteínas. Las proteínas biespecíficas pueden inhibir tanto la proliferación de células B mediada por BAFF como la proliferación de células T mediada por B7RP1. En otro aspecto, las proteínas biespecíficas pueden inhibir la unión de B7RP1 a las células T. Una proteína biespecífica de este tipo puede ser un anticuerpo IgG que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina diferentes y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina diferentes, en que un par de cadena pesada/cadena ligera se une a BAFF y el otro se une a B7RP1. Alternativamente, la porción de unión a B7RP1 de la proteína biespecífica puede comprender un anticuerpo IgG que incluye dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, y la porción de unión a BAFF de la proteína biespecífica puede comprender uno o más péptidos de unión a BAFF, que pueden ser condensados al anticuerpo anti-B7RP1, opcionalmente a través del extremo N de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina, el extremo carboxi de la cadena pesada de la inmunoglobulina y/o dentro de la región CH2 y/o CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina.

Definiciones

Un "anticuerpo", como se entiende en esta memoria, es una proteína que comprende una región variable de la cadena pesada y/o ligera de la inmunoglobulina.

Una proteína "biespecífica", como se entiende en esta memoria, es una proteína que puede unirse específicamente a dos moléculas diferentes, que pueden ser proteínas; por ejemplo, una proteína biespecífica que puede unirse tanto a BAFF como a B7RP1.

Un paciente está recibiendo un tratamiento "concurrente" con dos o más productos terapéuticos cuando el paciente recibe los dos o más productos terapéuticos durante el mismo período de tiempo general, opcionalmente al mismo tiempo. Por ejemplo, si a un paciente se le dosificara una dosis terapéutica diaria de forma continua y también se le dosificara otro producto terapéutico una vez al mes de forma continua, el paciente estaría recibiendo estos dos fármacos al mismo tiempo. De manera similar, un paciente al que se dosifican dos productos terapéuticos diferentes, cada uno de ellos administrado cada dos semanas, pero no el mismo día, estaría recibiendo un tratamiento concurrente con los dos productos terapéuticos. Además, un paciente que recibe un producto terapéutico de forma continua una vez a la semana y otro producto terapéutico una vez al día durante solo tres días estaría recibiendo tratamiento durante un corto período de tiempo con estos dos productos terapéuticos.

Como se entiende en esta memoria, una "región Fc" es un dímero que consiste en dos cadenas polipeptídicas unidas por uno o más enlaces disulfuro, comprendiendo cada una de las cadenas parte o la totalidad de un dominio bisagra más un dominio CH2 y CH3. Cada una de las cadenas polipeptídicas se denomina "cadena polipeptídica Fc". Más específicamente, las regiones Fc contempladas para uso con la presente invención son regiones Fc de IgG, que pueden ser regiones Fc de mamífero, por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de ser humano. Entre las regiones Fc de IgG1 de ser humano, se conocen al menos dos tipos alélicos. Las secuencias de aminoácidos de una cadena polipeptídica Fc pueden variar de las de un polipéptido Fc de mamífero en no más de 20, 15, 12, 10, 8, 5 o 3 sustituciones, inserciones o deleciones de un solo aminoácido con relación a una secuencia de aminoácidos del polipéptido Fc de mamífero. Alternativamente o además, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica Fc puede variar de la secuencia de una cadena polipeptídica Fc conocida o que se produce de forma natural en no más de 10 inserciones, deleciones o sustituciones de un solo aminoácido por cada 100 aminoácidos de secuencia. Variaciones de este tipo pueden ser "alteraciones heterodimerizantes" que facilitan la formación de heterodímeros frente a homodímeros. Al referirse a posiciones particulares dentro de una cadena polipeptídica Fc, se utiliza el sistema de numeración de la UE (Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85), como se ilustra en el alineamiento de las cadenas polipeptídicas Fc de IgG humana en la Tabla 1 que figura a continuación.

Tabla 1: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de regiones Fc de IgG humana

En algunas posiciones, pueden ocurrir polimorfismos que se producen de forma natural. Por ejemplo, la metionina en la posición 282 en la secuencia de IgG2 arriba dada es más típicamente una valina en las secuencias de IgG2 que se producen de forma. De manera similar, la tirosina en la posición 296 en una secuencia de IgG3 también puede ser una fenilalanina.

"Alteraciones heterodimerizantes" se refieren generalmente a alteraciones en las regiones CH3 de dos cadenas pesadas de IgG diferentes que facilitan la formación de dímeros de cadenas pesadas heterodiméricas, es decir, cadenas pesadas dimerizadas que no tienen secuencias de aminoácidos idénticas. Las alteraciones heterodimerizantes pueden ser asimétricas, es decir, una cadena pesada que tiene una determinada alteración puede emparejarse con otra cadena pesada que tiene una alteración diferente. Estas alteraciones facilitan la heterodimerización y desfavorecen la homodimerización. Un ejemplo de alteraciones heterodimerizantes emparejadas de este tipo son las denominadas sustituciones de "botones en ojales". Véase, p. ej., la Patente de EE.UU. 7.695.936 y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. 2003/0078385. Tal como se entiende en esta memoria, el par cadena pesada-cadena pesada que contiene un par de sustituciones de botones en ojales, contiene una sustitución en una cadena pesada y otra sustitución en la otra cadena pesada. Por ejemplo, se ha encontrado que las siguientes sustituciones de botones en ojales aumentan la formación de heterodímeros en comparación con la que se encuentra con cadenas pesadas no modificadas: 1) Y407T en una cadena y T366Y en la otra; 2) Y407A en una cadena y T366W en la otra; 3) F405A en una cadena y T394W en la otra; 4) F405W en una cadena y T394S en la otra; 5) Y407T en una cadena y T366Y en la otra; 6) T366Y y F405A en una cadena y T394W e Y407T en la otra; 7) T366W y F405W en una cadena y T394S e Y407A en la otra; 8) F405W e Y407A en una cadena y T366W y T394S en la otra; y 9) T366W en un polipéptido de Fc y T366S, L368A e Y407V en el otro. Como se entiende en esta memoria, las mutaciones en un polipéptido Fc se indican de la siguiente manera. El aminoácido (utilizando el código de una letra) normalmente presente en una posición dada en la región CH3 utilizando el sistema de numeración de la UE (que se presenta en Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85) va seguido del número de posición de la UE, que va seguido del aminoácido alternativo que está presente en esa posición. Por ejemplo, Y407T significa que la tirosina normalmente presente en la posición 407 de la UE se reemplaza por una treonina. En aras de la claridad, el sistema de numeración de la UE se ilustra en la Tabla 1 que figura más adelante. Como alternativa o además de alteraciones de este tipo, las sustituciones que crean nuevos puentes disulfuro pueden facilitar la formación de heterodímeros. Véase, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU.2003/0078385. Alteraciones de este tipo en una región Fc de IgG1 incluyen, por ejemplo, las siguientes sustituciones: Y349C en una cadena polipeptídica Fc y S354C en la otra; Y349C en una cadena polipeptídica Fc y E356C en la otra; Y349C en una cadena polipeptídica Fc y E357C en la otra; L351C en una cadena polipeptídica Fc y S354C en la otra; T394C en una cadena polipeptídica Fc y E397C en la otra; o D399C en una cadena polipeptídica Fc y K392C en la otra. De manera similar, las sustituciones que cambian la carga de uno o más residuos, por ejemplo, en la interfaz CH3-CH3, pueden potenciar la formación de heterodímeros como se explica en el documento WO 2009/089004. A sustituciones de este tipo se las alude en esta memoria como "sustituciones de pares de cargas", y una región Fc que contiene un par de sustituciones de pares de cargas contiene una sustitución en una cadena pesada y una sustitución diferente en la otra. Ejemplos generales de sustituciones de pares de carga incluyen los siguientes: 1) R409D, R409E, K409D o K409E en una cadena más D399K o D399R en la otra; 2) N392D, N392E, K392D o K392E en una cadena más D399K o D399R en la otra; 3) K439D o K439E en una cadena más E356K, E356R, D356K o D356R en la otra; y 4) K370D o K370E en una cadena más E357K o E357R en la otra. Además, las sustituciones Q355D, Q355E, R355D, R355E, K360D o K360R en ambas cadenas pueden estabilizar los heterodímeros cuando se utilizan con otras alteraciones heterodimerizantes. Las sustituciones de pares de cargas específicas se pueden utilizar solas o con otras sustituciones de pares de cargas. Ejemplos específicos de pares únicos de sustituciones de pares de carga y combinaciones de los mismos incluyen los siguientes: 1) K409E en una cadena más D399K en la otra; 2) K409E en una cadena más D399R en la otra; 3) K409D en una cadena más D399K en la otra; 4) K409D en una cadena más D399R en la otra; 5) K392E en una cadena más D399R en la otra; 6) K392E en una cadena más D399K en la otra; 7) K392D en una cadena más D399R en la otra; 8) K392D en una cadena más D399K en la otra; 9) K409D y K360D en una cadena más D399K y E356K en la otra; 10) K409D y K370D en una cadena más D399K y E357K en la otra; 11) K409D y K392D en una cadena más D399K, E356K y E357K en la otra; 12) K409D y K392D en una cadena y D399K en la otra; 13) K409D y K392D en una cadena más D399K y E356K en la otra; 14) K409D y K392D en una cadena más D399K y D357K en la otra; 15) K409D y K370D en una cadena más D399K y D357K en la otra; 16) D399K en una cadena más K409D y K360D en la otra; y 17) K409D y K439D en una cadena más D399K y E356K en la otra. Cualquiera de estas alteraciones heterodimerizantes puede ser parte de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG como se describe en esta memoria.

Un anticuerpo o proteína "humano", como se entiende en esta memoria, es un anticuerpo o una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico de origen humano. Un anticuerpo o una proteína humana se puede producir en células no humanas cultivadas o in vivo en un organismo transgénico en el que se ha introducido una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o la proteína humana. Alternativamente, se puede producir un anticuerpo o una proteína humana en células humanas cultivadas o en un ser humano in vivo.

Un "anticuerpo IgG", como se entiende en esta memoria, es un anticuerpo que consiste esencialmente en los dominios de inmunoglobulina presentes en la mayoría de los anticuerpos IgG que se producen de forma natural, es decir, una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada (VH), una primera región constante de la cadena pesada (CH1), una región bisagra, una segunda región constante de la cadena pesada (CH2) y una tercera región constante de la cadena pesada (CH3) y una cadena ligera que comprende una región variable de la cadena ligera (VL) y una región constante de la cadena ligera (CL). Numerosas secuencias de dominios de inmunoglobulina de este tipo se reseñan a lo largo de la bibliografía científica, p. ej., en SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service, N.I.H, Bethesda, MD, 1991. Un anticuerpo IgG, como se entiende en esta memoria, es un tetrámero que consiste esencialmente en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Los anticuerpos que se producen de forma natural que incluyen solo dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y ninguna cadena ligera de inmunoglobulina tales como algunos que se encuentran en camellos y tiburones (veáse, p. ej., Muyldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al, 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90; Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909), no son "anticuerpos IgG" como se entiende en esta memoria. Un anticuerpo IgG puede ser humano o puede ser de otra especie. Además, un anticuerpo IgG puede contener no más de 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 sustituciones, inserciones y/o deleciones de un solo aminoácido con relación a la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada o ligera de un anticuerpo IgG que se produce de forma natural.

Una "cadena pesada de inmunoglobulina" se refiere a una cadena pesada de un anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgE o IgD o variantes del mismo que contiene no más de 40, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 inserciones, deleciones o sustituciones de un solo aminoácido con relación a una cadena pesada de inmunoglobulina codificada por secuencias de ácidos nucleicos que se originan en la naturaleza. Una "cadena pesada de inmunoglobulina IgG" se limita a cadenas pesadas de anticuerpos IgG o variantes de los mismos que no contienen más de 40, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 inserciones, deleciones o sustituciones de un solo aminoácido con relación a la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de IgG codificada por secuencias de ácidos nucleicos que se originan en la naturaleza. Una cadena pesada de inmunoglobulina consiste esencialmente en un cierto número de regiones o dominios distintos que incluyen una región VH, una región CH1, una región bisagra, una región CH2 y una región CH3. En algunos otros isotipos, es decir, IgM e IgA, se incluyen regiones adicionales aguas abajo de la región CH3. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina y las regiones incluidas en las mismas se describen generalmente en, p. ej., Carayannopoulos y Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp. 283-314 en FUNDAMENTAL IMMu NOlOGY, 3a ed., Paul, ed., Raven Press, Nueva York, 1993. Además, se conocen en la técnica numerosas secuencias de subregiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina. Véase, p. ej., Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991. En algunos casos, se hará referencia en esta memoria a una cadena polipeptídica que incluye una cadena pesada de inmunoglobulina más algunas secuencias que no son de inmunoglobulina como una "cadena pesada".

Una "cadena ligera de inmunoglobulina", como se entiende en esta memoria, es una cadena kappa o lambda de un anticuerpo humano o un anticuerpo de otra especie. También se incluyen entre las cadenas ligeras de inmunoglobulina, como se entiende en esta memoria, proteínas con no más de 20, 15, 10 o 5 inserciones, deleciones y/o sustituciones de un solo aminoácido con relación a una cadena ligera de inmunoglobulina codificada por secuencias de ácido nucleico de origen natural. Cadenas ligeras de inmunoglobulina se describen generalmente en, p. ej., Carayannopoulos y Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp. 283-314 en FUNDAMENTAL IMMUⁿ O^lOGY, 3a Ed., Paul, ed., Raven Press, Nueva York, 1993. Una cadena ligera de inmunoglobulina contiene una región VL y una región CL. Se conocen en la técnica numerosas secuencias de estas regiones. Véase, p. ej., Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991. En algunos casos, se hará referencia en esta memoria a una cadena polipeptídica que incluye una cadena ligera de inmunoglobulina más algunas secuencias que no son de inmunoglobulina como una "cadena ligera".

Una "región variable de inmunoglobulina", como se entiende en esta memoria, es una región VH o VL, que puede ser de origen humano o de otra especie. Regiones variables de inmunoglobulina se describen generalmente en, p. ej., Carayannopoulos y Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp. 283-314 en FUNDAMENTAL IMMUNOLOg Y, 3a Ed, Paul, ed., Raven Press, Nueva York, 1993. También se incluyen entre regiones variables de inmunoglobulina, como se entiende en esta memoria, proteínas con no más de 20, 15, 10 o 5 inserciones, deleciones y/o sustituciones de un solo aminoácido con relación a una región variable de inmunoglobulina codificada por secuencias de ácidos nucleicos de origen natural. Una región variable de inmunoglobulina contiene tres regiones hipervariables, conocidas como región determinante de la complementariedad 1 (CDR1), región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) y región determinante de la complementariedad 3 (CDR3). Estas regiones forman el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Las CDRs están integradas dentro de las regiones marco menos variables (FR1-FR4). El orden de estas subregiones dentro de una región variable es el siguiente: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Se conocen en la técnica numerosas secuencias de regiones variables de inmunoglobulina. Véase, p, ej,, Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991.

Las CDRs se pueden ubicar en una secuencia de la región VH de la siguiente manera. CDR1 comienza aproximadamente en el residuo 31 de la región VH madura y generalmente tiene una longitud de aproximadamente 5-7 aminoácidos, y casi siempre está precedida por Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx (SEQ ID NO: 20) (en que "Xxx" es cualquier aminoácido). El residuo que sigue a la cadena pesada CDR1 es casi siempre un triptófano, a menudo un Trp-Val, un Trp-Ile o un Trp-Ala. Catorce aminoácidos casi siempre se encuentran entre el último residuo en CDR1 y el primero en CDR2, y CDR2 contiene típicamente 16 a 19 aminoácidos. CDR2 puede estar precedido inmediatamente de Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 21) y puede estar seguido inmediatamente por Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Otros aminoácidos pueden preceder o seguir a CDR2. Treinta y dos aminoácidos están casi siempre entre el último residuo en CDR2 y el primero en CDR3, y CDR3 puede tener una longitud de aproximadamente 3 a 25 residuos. Un Cys-Xxx-Xxx casi siempre precede inmediatamente a CDR3, y un Trp-Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: 22) casi siempre sigue a CDR3.

Las CDRs de cadena ligera se pueden ubicar en una región VL de la siguiente manera. CDR1 comienza aproximadamente en el residuo 24 del anticuerpo maduro y habitualmente es de una longitud de aproximadamente 10 a 17 residuos. Casi siempre está precedido por una Cys. Casi siempre hay 15 aminoácidos entre el último residuo de CDR1 y el primer residuo de CDR2, y CDR2 es casi siempre de 7 residuos de longitud. CDR2 está precedido típicamente por Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys o Ile-Phe. Casi siempre hay 32 residuos entre CDR2 y CDR3, y CDR3 tiene habitualmente una longitud de aproximadamente 7 a 10 aminoácidos. CDR3 está precedido casi siempre por Cys y habitualmente es seguido por Phe-Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: 23).

Un "enlazador", como se entiende en esta memoria, es un péptido que enlaza dos polipéptidos. Un enlazador puede tener una longitud de 1 -80 aminoácidos. Un enlazador puede tener una longitud de 2-40, 3-30 o 3-20 aminoácidos. Un enlazador puede ser un péptido de no más de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos de longitud. Un enlazador puede tener una longitud de 5-25, 5-15, 10-20 o 20-30 aminoácidos. Un enlazador puede ser de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos de longitud. En muchos casos, los enlazadores carecen de residuos cisteína libres (es decir, y por lo tanto no están implicados en los enlaces disulfuro) y tampoco contienen sitios de N-glicosilación (es decir, Asn - Xxx - Ser/Thr, en que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina).

Un "pepticuerpo", como se entiende en esta memoria, es uno o más péptidos biológicamente activos condensados a una región Fc. Shimamoto et al. (2012), mAbs 4(5): 586-591.

Un "péptido", como se entiende en esta memoria, es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos corta, que puede o no estar glicosilada y/o contener aminoácidos modificados. Un péptido puede tener una longitud de 2 a 75 aminoácidos; p.ej., 3-60, 3-50, 3-40, 3-30 o 3-20 aminoácidos de longitud. Un péptido puede tener una longitud de 5-25, 5­ 15, 10-20 o 20-30 aminoácidos. Un péptido puede ser de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos de longitud.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un fármaco utilizado para tratar una enfermedad es una cantidad que puede reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o su tratamiento o retrasar la aparición de síntomas más graves o una enfermedad más grave que puede ocurrir con cierta frecuencia después de la afección tratada.

"Tratamiento" de cualquier enfermedad mencionada en esta memoria abarca el alivio de al menos un síntoma de la enfermedad, una reducción de la gravedad de la enfermedad o el retraso o la prevención de la progresión de la enfermedad a síntomas más graves que pueden, en algunos casos, acompañar a la enfermedad o conducir a por lo menos otra enfermedad. El tratamiento no tiene por qué significar que la enfermedad está totalmente curada. Un agente terapéutico útil solo necesita reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o su tratamiento, o retrasar la aparición de síntomas más graves o de una enfermedad más grave que puede ocurrir con cierta frecuencia después de la afección tratada. Por ejemplo, si la enfermedad fuera una enfermedad intestinal inflamatoria, un agente terapéutico utilizado como tratamiento puede reducir el número de sitios distintos de inflamación en el intestino o la extensión total del intestino afectado. Puede reducir el dolor y/o la hinchazón, reducir síntomas tales como diarrea, estreñimiento o vómitos y/o prevenir la perforación del intestino. El estado de un paciente puede evaluarse mediante técnicas estándar, tales como una radiografía realizada después de un enema de bario o enteroclisis, endoscopia, colonoscopia y/o una biopsia. Procedimientos adecuados varían según el estado y los síntomas del paciente. De manera similar, si la enfermedad tratada fuera lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés), la actividad de la enfermedad podría evaluarse utilizando el índice SLEDAI para la puntuación, como se explica más adelante.

Proteínas biespecíficas que se unen a BAFFy B7RP1

En esta memoria se describen proteínas biespecíficas que se unen a B7RP1 y BAFF y/o que pueden inhibir la proliferación de células T mediada por B7RP1 y la proliferación de células B mediada por BAFF in vitro. Las proteínas BAFF y B7RP1 a las que se une una proteína biespecífica tal como se describe en esta memoria pueden ser proteínas humanas y/o pueden ser proteínas de otras especies, tales como de mono cynomolgus, mono rhesus, chimpancé, ratón y/o conejo, entre otras. Una proteína biespecífica como se describe en esta memoria puede, por ejemplo, unirse a proteínas B7RP1 y BAFF tanto humanas (Homo sapiens) como de mono cynomolgus (Macaca fascicuiaris).

Estas proteínas biespecíficas pueden ser anticuerpos IgG biespecíficos en los que la porción de unión a B7RP1 y la porción de unión a BAFF consisten cada una esencialmente en una cadena pesada de inmunoglobulina IgG y una cadena ligera de inmunoglobulina. Por lo tanto, un anticuerpo biespecífico de este tipo contiene dos cadenas pesadas de inmunoglobulina diferentes y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina diferentes. Juntos, estos dos pares de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina forman un anticuerpo IgG biespecífico completo. Anticuerpos IgG biespecíficos se conocen en la técnica, y también se conoce un cierto número de otros formatos para anticuerpos biespecíficos. Véase, p. ej., Kontermann, Bispecific Antibodies: Developments and Current Perspectives, pp. 1-28 en BISPECIFIC ANTIBODIES, Kontermann, ed., Springer-Verlag, Berlín, Heidelburg, 2011. Anticuerpos que se pueden unir a BAFF y B7RP1, independientemente del formato, se contemplan en esta memoria. Anticuerpos IgG biespecíficos pueden ser humanos, humanizados o quiméricos y pueden ser del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Anticuerpos IgG biespecíficos descritos en esta memoria pueden conjugarse con otros restos. Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-BAFF y anti-B7RP1 se conocen en la técnica. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. 7.737.111 y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US 2011/0117093. Anticuerpos biespecíficos de este tipo pueden comprender "alteraciones heterodimerizantes", tal como se define arriba, que incluyen sustituciones de pares de carga, que facilitan la formación de un anticuerpo IgG biespecífico heterotetramérico.

Las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria pueden ser proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo que se une a B7RP1, que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina IgG y una cadena ligera de inmunoglobulina, y un péptido de unión a BAFF. El péptido de unión a BAFF puede estar presente en una o múltiples copias, tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o hasta 16 copias. El péptido de unión a BAFF puede unirse a proteínas BAFF de especies tales como ratón, mono cynomolgus y/o seres humanos, entre muchas otras especies posibles. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG anti-B7RP1, opcionalmente un anticuerpo humano o humanizado que se une a B7RP1 humana y/o de mono cynomolgus. En algunas realizaciones, un enlazador se puede unir al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo IgG anti-B7RP1, seguido de un primer péptido de unión a BAFF, otro enlazador y un segundo péptido de unión a BAFF. Un tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo o hasta el decimosexto péptido de unión a BAFF puede seguir a estos dos, opcionalmente intercalado con enlazadores. Alternativamente o además, se pueden insertar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho péptidos de unión a BAFF en cualquier otro lugar del anticuerpo anti-B7RP1, por ejemplo, en el extremo N de la cadena pesada de la inmunoglobulina o de la cadena ligera de la inmunoglobulina o en una región de bucle en la región CH2 o CH3. El anticuerpo IgG puede ser un anticuerpo de mamífero, tal como un anticuerpo humano o murino. El anticuerpo anti-B7RP1 puede ser un anticuerpo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano o humanizado. En proteínas de fusión biespecíficas de este tipo que comprenden un anticuerpo IgG anti-B7RP1, la proteína biespecífica puede comprender una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ NO: 19. Se contemplan variantes que comprenden una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que no contiene más de 30, 25, 20, 15, 10, 5 o 3 inserciones, deleciones o sustituciones de un solo aminoácido con respecto a SEQ ID NO: 17 o 18. De manera similar, se contemplan variantes que comprenden una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos que no contiene más de 20, 15, 10, 8, 7, 5 o 3 inserciones, deleciones o sustituciones o un solo aminoácido con respecto a ^s E^q ID NO: 19. Proteínas biespecíficas de este tio pueden ser tetrámeros que comprenden dos polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o 18 o una variante de la misma y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma.

Una porción peptídica de unión a BAFF de una proteína de fusión biespecífica como se describe arriba puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Péptidos de unión a bAfF de este tipo se describen en la Patente de EE.UU. 7.737.111. Puede haber una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis copias de un péptido de unión a BAFF de este tipo presentes en la proteína biespecífica. Se puede unir un péptido de unión a BAFF al extremo carboxi del anticuerpo anti-B7RP1, por ejemplo, a través de un enlazador. Por ejemplo, el extremo carboxi de un anticuerpo IgG anti-B7RP1 puede ir seguido de un enlazador que tenga, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4). Ejemplos de otros enlazadores adecuados incluyen Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser (SeQ ID NO: 37), Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 38), Gly-Gly-Gly-Gln (SEQ ID NO: 39) y Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SeQ ID NO: 40), entre muchos otros. Este enlazador puede ir seguido de un péptido de unión a BAFf . El péptido de unión a BAFF puede ir seguido de otro enlazador que comprende, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 24. También podría utilizarse otro enlazador. Este enlazador puede ir seguido de otro péptido de unión a BAFF que comprende, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

En las proteínas de fusión biespecíficas descritas inmediatamente antes o en los anticuerpos IgG heterotetraméricos biespecíficos descritos arriba, una región VL puede contener una CDR1, una CDR2 y una CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente. Una región VH de CDR1, CDR2 y CDR3 puede comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente. Una región VL del anticuerpo IgG descrito en esta memoria puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una variante de la misma, y la región VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma. Secuencias variantes de este tipo pueden comprender no más de 10 deleciones, inserciones o sustituciones de un solo aminoácido por cada 100 aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia.

Proteínas que Comprenden un Enlazador

En esta memoria se describen enlazadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6 o 7 que confieren propiedades físicas favorables a una proteína que los contiene. Como se muestra en el Ejemplo 1 que figura más adelante, el uso de dos enlazadores particulares, es decir, aquellos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, tuvo efectos positivos sobre propiedades tales como expresión, estabilidad y viscosidad de un molécula biespecífica. Por lo tanto, una diversidad de proteínas que contienen estos enlazadores puede tener propiedades favorables de este tipo en comparación con proteínas similares que contienen otros enlazadores.

Usos Terapéuticos de Proteínas Biespecíficas

Las proteínas biespecíficas de unión a BAFF y B7RP1 descritas en esta memoria se pueden utilizar como agentes terapéuticos para una diversidad de indicaciones, particularmente afecciones impulsadas por auto-anticuerpos y/o afecciones mediadas tanto por células T como por células B. Afecciones de este tipo incluyen, por ejemplo, SLE, lupus, nefritis, vasculitis ANCA-positiva, artritis reumatoide (RA), dermatomiositis, polimiositis, enfermedades gastrointestinales, tales como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad celíaca, afecciones de la piel, tales como pénfigo, penfigoide, y lupus eritematoso cutáneo subagudo (SCLE), enfermedades del sistema nervioso, tales como esclerosis múltiple y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP, por sus siglas en inglés), enfermedades neuromusculares tales como la miastenia grave, enfermedades que afectan a los riñones tales como el síndrome de Goodpasture y glomerulonefritis, afecciones hematológicas, tales como la anemia hemolítica autoinmune (AIHA, por sus siglas en inglés), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) y neutropenia autoinmune, afecciones hepáticas, tales como hepatitis activa crónica y cirrosis biliar primaria, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica y afecciones endocrinas que incluyen tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison e insuficiencia autoinmune endocrina múltiple (que incluye comúnmente diabetes, hipotiroidismo, enfermedad de Addison e insuficiencia gonadal). Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína biespecífica como se describe en esta memoria a un paciente que padezca cualquiera de estas afecciones para tratar la afección.

Una proteína biespecífica que puede inhibir la proliferación de células B mediada por BAFF y la proliferación de células T mediada por B7RP1 descrita en esta memoria puede utilizarse para tratar a un paciente que padece SLE. SLE es una enfermedad autoinmune de etiología desconocida caracterizada por autorreactividad a autoantígenos nucleares. Sus manifestaciones clínicas son tan diversas que es cuestionable si realmente se trata de una sola enfermedad o de un grupo de afecciones relacionadas. Kotzin (1996) Systemic lupus erythematosus. Cell 85: 303-306; Rahman e Isenberg (2008), Systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med. 358: 929-939. Los síntomas pueden incluir los siguientes: síntomas constitucionales tales como malestar profundo, fatiga, fiebres, anorexia y pérdida de peso; diversos síntomas cutáneos que incluyen erupciones faciales agudas y transitorias en adultos, enfermedad ampollosa y erupciones crónicas y desfigurantes de la cabeza y el cuello; artritis; dolor y/o debilidad muscular; síntomas cardiovasculares, tales como engrosamiento de la válvula mitral, vegetaciones, regurgitación, estenosis, pericarditis y cardiopatía isquémica, algunas de las cuales pueden culminar en apoplejía, enfermedad embólica, insuficiencia cardiaca, endocarditis infecciosa o insuficiencia valvular; nefritis, que es una de las principales causas de morbilidad en el SLE; síntomas neurológicos que incluyen disfunción cognitiva, depresión, psicosis, coma, trastornos convulsivos, migraña y otros síndromes de dolor de cabeza, meningitis aséptica, corea, apoplejía y neuropatías craneales; síntomas hemotológicos, incluyendo leucopenia, trombocitopenia, serositis, anemia, anomalías de la coagulación, esplenomegalia y linfadenopatía; y diversas anomalías gastrointestinales. Id; Vratsanos et al., "Systemic Lupus Erythematosus", Capítulo 39 en Samter's Immunological Diseases, 6a Edición, Austen et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Phiiladelphia, PA, 2001. La gravedad de los síntomas varía ampliamente, al igual que el curso de la enfermedad El SLE puede ser mortal.

Un paciente con SLE puede ser tratado con una proteína biespecífica que inhibe BAFF y B7RP1 antes, después o simultáneamente con el tratamiento utilizando una terapia existente para el SLE. Terapias existentes de este tipo para el SLE incluyen corticosteroides tales como prednisona, prednisolona y metilprednisolona, antipalúdicos, tales como hidroxicloroquina, quinacrina y cloroquina, ácido retinoico, aspirina y otros fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDs, por sus siglas en inglés), ciclofosfamida, dehidroepiandrosterona, micofenolato de mofetilo, azatioprina, clorambucilo, metotrexato, tacrolimus, dapsona, talidomida, leflunomida, ciclosporina, belimumab, anticuerpos anti-CD20 tales como rituximab y proteínas de fusión tales como abatacept.

La actividad de la enfermedad de los pacientes con SLE se puede clasificar utilizando un instrumento tal como el Índice de Actividad de la Enfermedad del Lupus Eritematoso Sistémico (SLEDAI, por sus siglas en inglés), que proporciona una puntuación para la actividad de la enfermedad que tiene en cuenta los siguientes síntomas, que se ponderan de acuerdo con la gravedad: convulsiones, psicosis, síndrome cerebral orgánico, alteración visual, trastorno de los nervios craneales, cefalea lúpica, vasculitis, artritis, miositis, cilindros urinarios, hematuria, proteinuria, piuria, nueva erupción, alopecia, úlceras en las mucosas, pleuresía, pericarditis, complemento bajo, unión del ADN incrementada, fiebre, trombocitopenia y leucopenia. Bombardier et al. (1992), Arthr. y Rheum. 35(6): 630-640. Los tratamientos descritos en esta memoria pueden ser útiles para disminuir o eliminar los síntomas de SLE medidos por SLEDAI. Métodos de tratamiento descritos en esta memoria pueden mejorar la puntuación SLEDAI de un paciente en comparación con un valor de referencia para el mismo paciente antes del inicio del tratamiento con una proteína biespecífica como se describe en esta memoria.

Otro método para evaluar la actividad de la enfermedad en el SLE es el índice del Grupo de Evaluación del Lupus de las Islas Británicas (BILAG, por sus siglas en inglés), que es un sistema de evaluación de la actividad de la enfermedad para pacientes con SLE basado en el principio de la intención de tratar del médico. Stoll et al. (1996), Ann. Rheum Dis. 55: 756­ 760; Hay et al. (1993), Q. J. Med. 86: 447-458. Se asigna una puntuación BILAG al dar puntuaciones numéricas o alfabéticas separadas de la actividad de la enfermedad en cada uno de los ocho sistemas basados en órganos, general (tal como fiebre y fatiga), mucocutáneo (tal como sarpullido y alopecia, entre muchos otros síntomas), neurológico (tal como convulsiones, migrañas y psicosis, entre muchos otros síntomas), musculoesqueléticos (tal como artritis), cardiorrespiratorios (tales como insuficiencia cardíaca y disminución de la función pulmonar), vasculitis y trombosis, renales (tal como nefritis) y hematológicos. Id. Los tratamientos descritos en esta memoria pueden ser útiles para disminuir o eliminar los síntomas de SLE medidos por el índice BILAG o para disminuir la puntuación BILAG de un paciente en comparación con un valor de referencia antes del inicio del tratamiento con una proteína biespecífica como se describe en esta memoria.

Una proteína biespecífica como se describe en esta memoria, que inhibe la proliferación de células B mediada por BAFF y la proliferación de células T mediada por B7RP1, también podría utilizarse para tratar la artritis reumatoide (RA). La RA es una enfermedad crónica con síntomas sistémicos, así como síntomas relacionados específicamente con las articulaciones. Los síntomas incluyen habitualmente sinovitis, que provoca dolor e inflamación de las articulaciones, y diversas anomalías de laboratorio, tales como niveles más altos de lo normal de factor reumatoide, anticuerpos antiproteína modificada con citrulina (anti-CCP), y proteína C reactiva (CRP, por sus siglas en inglés) y una tasa de sedimentación de eritrocitos (ESR, por sus siglas en inglés) elevada. Síntomas menos comunes incluyen diversos síntomas extraarticulares que implican, p. ej., tendones, ligamentos, vasos sanguíneos, el corazón y los pulmones. La actividad de la enfermedad se puede medir a menudo utilizando una diversidad de índices. Véase, p. ej., Anderson et al. (2012), Arthritis care & Res.64 (5): 640-647. Elementos incluidos en índices de puntuación de este tipo incluyen el número de articulaciones dolorosas, el número de articulaciones inflamadas, evaluaciones funcionales y diversos hallazgos de laboratorio, tales como CRP, ESR, etc.

Un paciente que padece RA puede ser tratado con una proteína biespecífica descrita en esta memoria que inhibe la proliferación de células B mediada por BAFF y la proliferación de células T mediada por B7RP1 antes, después o al mismo tiempo que el tratamiento con un fármaco de uso actual para la RA. Productos terapéuticos actualmente en uso para la artritis reumatoide (RA) incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDs) (tales como inhibidores de la aspirina y ciclooxigenasa-2 (COX-2)), fármacos antiinflamatorios modificadores de la enfermedad (DMARDs, tales como metotrexato, leflunomida y sulfasalazina), antipalúdicos (tal como hidroxicloroquina), ciclofosfamida, D-penicilamina, azatioprina, sales de oro, inhibidores del factor de necrosis tumoral (tal como etanercept, infliximab, adalimumab, golimumab y certolizumab pegol), inhibidores de CD20 tales como rituximab, antagonistas de IL -1, tal como anakinra, inhibidores de IL-6, tal como tocilizumab, inhibidores de quinasas Jano (JAKs, tal como tofacitinib), abatacept y corticoides, entre otros.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína biespecífica como se describe en esta memoria, que inhibe la proliferación de células B mediada por BAFF y la proliferación de células T mediada por B7RP1, también se puede utilizar para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal, tal como la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. La enfermedad de Crohn implica una inflamación anormal de cualquier porción del tracto alimentario desde la boca hasta el ano, aunque en la mayoría de los pacientes la inflamación anormal se limita a las regiones ileocólica, del intestino delgado y colónicoanorrectal. Típicamente, la inflamación es discontinua. Síntomas comunes incluyen dolor abdominal, anorexia, pérdida de peso, fiebre, diarrea, plenitud y/o sensibilidad en el cuadrante inferior derecho del abdomen, estreñimiento, vómitos y molestias y secreción perianal. Otros posibles síntomas incluyen artritis periférica, retraso del crecimiento, epiescleritis, estomatitis aftosa, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, cálculos renales, alteración de la dilución y alcalinización urinaria, malabsorción y cálculos biliares, entre otros. Véase, p. ej, Strober et al., Medical Immunology, 10a Edición, Sección III, Cap. 35 (2001); Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17a edición, Sección 3, Cap. 31 (1999). Macrófagos aislados de pacientes con enfermedad de Crohn producen cantidades incrementadas de IL-12, IFNy, TNFa y otras citoquinas inflamatorias.

La colitis ulcerativa, aunque a veces es difícil de distinguir de la enfermedad de Crohn, es distinta de la enfermedad de Crohn en varios aspectos. Primero, generalmente se limita al colon, mientras que la enfermedad de Crohn puede aparecer en todo el tracto alimentario. En segundo lugar, la colitis ulcerosa implica principalmente la inflamación solo de las capas superficiales del intestino, a diferencia de la enfermedad de Crohn, en la que la inflamación puede penetrar completamente a través de la pared del intestino u otra ubicación en el tracto alimentario. Finalmente, la colitis ulcerativa implica típicamente una zona continua de inflamación, en lugar de los sitios discontinuos de inflamación típicos de la enfermedad de Crohn. Al igual que la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa se encuentra principalmente en zonas urbanas. Además, es probable que factores genéticos desempeñen un papel en la colitis ulcerativa, ya que existe una agregación familiar de casos. Los auto-anticuerpos se observan en pacientes con colitis ulcerativa con mayor frecuencia que en pacientes con enfermedad de Crohn. Los auto-anticuerpos a menudo se dirigen a los componentes de las células epiteliales del colon. Entre los más comunes están los anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos con especificidades para catalasa, a-enolasa y lactoferrina. En algunos casos, anticuerpos de este tipo reaccionan de forma cruzada con microorganismos del colon.

En ensayos clínicos, la actividad de la enfermedad de Crohn se puntúa a menudo utilizando el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn (CDAI, por sus siglas en inglés). El CDAI proporciona una puntuación de la actividad de la enfermedad basada en ocho factores que incluyen (1) la cantidad de heces líquidas o blandas por día, (2) una calificación del paciente de la cantidad de dolor abdominal por día, (3) una calificación del paciente de bienestar general, (4) un informe del paciente de otros síntomas, incluyendo artritis, iritis, uveítis, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, estomatitis eftosa, fisura anal, fítula o absceso, otra fístula o fiebre, (5) informe del paciente de tomar lomotil u otros opiáceos para la diarrea, (6) masa abdominal, (7) hematocrito y (8) peso corporal. Véase, p. ej., Best et al. (1976), Gastroenterol. 70: 439-444.

Los síntomas de la colitis ulcerativa son variables. Pueden incluir diarrea, tenesmo, calambres abdominales, sangre y moco en las heces, fiebre y sangrado rectal. También puede aparecer megacolon tóxico, una afección potencialmente mortal en la que el colon se dilata más de aproximadamente 6 centímetros y puede perder su tono muscular y/o perforarse. Otros síntomas que pueden acompañar a la colitis ulcerativa incluyen artritis periférica, espondilitis anquilosante, sacroilitis, uveítis anterior, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, epiescleritis, hepatitis autoinmune, colangitis esclerosante primaria, cirrosis y retraso en el crecimiento y desarrollo en niños.

Un paciente que padece una enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, por sus siglas en inglés), tales como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa, puede tratarse con una proteína biespecífica que se une a BAFF y B7RP1 descrita antes en esta memoria, después o al mismo tiempo que el tratamiento con una terapia existente para la IBD. Los productos terapéuticos existentes para la IBD incluyen, por ejemplo, sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y sus derivados (tales como olsalazina, balsalazida y mesalamina), anticuerpos anti-TNF (incluyendo infliximab, adalimumab, golimumab y certolizumab pegol), corticosteroides para administración oral o parenteral (incluyendo prednisona, metilprednisona, budesonida o hidrocortisona), hormona adrenocorticotrópica, antibióticos (incluyendo metronidazol, ciprofloxacina o rifaximina), azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, tacrolimus y talidomida.

Ácidos Nucleicos que Codifican Proteínas Biespecíficas

En esta memoria se describen ácidos nucleicos que codifican una proteína biespecífica que puede inhibir la proliferación de células T mediada por B7RP1 y la proliferación de células B mediada por BAFF. Por ejemplo, SEQ ID NO: 52 codifica la región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y SEQ ID NO: 53 codifica la región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. De manera similar, s Eq ID NOs: 55 y 56 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente, que son polipéptidos que comprenden la cadena pesada de un anticuerpo anti-B7RP1 condensado con dos péptidos de unión a BAFF. SEQ ID NO: 57 codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-B7RP1, que puede ser parte de un anticuerpo IgG biespecífico heterotetramérico o una proteína de fusión biespecífica, como se describe arriba. Se contempla cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifique cualquier secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria. De manera similar, se contemplan variantes de secuencias de nucleótidos que incluyen mutaciones silenciosas relativas a secuencias descritas en esta memoria o que codifican las variantes de secuencias de aminoácidos arriba descritas. Más específicamente, estos ácidos nucleicos pueden ser secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que varían en no más de 10 inserciones, deleciones o sustituciones de un solo aminoácido por cada 100 aminoácidos de las secuencias de aminoácidos descritas en esta memoria.

Secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas biespecíficas descritas en esta memoria pueden ser determinadas por un experto en la técnica basándose en las secuencias de aminoácidos descritas en esta memoria y el conocimiento en la técnica. Además de métodos más tradicionales de producir segmentos de ADN clonados que codifican una secuencia de aminoácidos particular, compañías tales como DNA 2.0 (Menlo Park, CA, EE.UU.) y BlueHeron (Bothell, WA, EE.UU.) entre otras, producen ahora de forma rutinaria ADNs de tamaño de genes sintetizados químicamente de cualquier secuencia deseada para ordenar, simplificando así el proceso de producción de ADNs de este tipo. El uso de codones se puede ajustar para optimizar la expresión en el sistema elegido.

Métodos para Hacer Proteínas Biespecíficas que se Unen a BAFF y B7RP1

Ácidos nucleicos que codifican las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria pueden insertarse en vectores apropiados para la célula huésped en la que se expresará el ácido nucleico. Estos ácidos nucleicos se pueden introducir en las células huésped mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Células huésped que se pueden utilizar incluyen bacterias, incluyendo Escherichia coli, levadura, incluyendo Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, células de insectos, incluyendo células de Spodoptera frugiperda, células vegetales y células de mamíferos, incluyendo células de ovario de hámster chino (CHO), riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono, células HeLa, células de carcinoma hepatocelular humano y células 293, entre muchas otras. Estas células huésped pueden cultivarse en condiciones tales que los ácidos nucleicos introducidos se expresen y la proteína biespecífica pueda recuperarse del sobrenadante del cultivo o de la masa celular.

En general, el procedimiento utilizado para introducir los ácidos nucleicos en las células huésped puede depender de la célula huésped en la que se han de introducir los ácidos nucleicos. Métodos para introducir ácidos nucleicos en bacterias son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se utilizan comúnmente la electroporación o la transformación de cloruro de calcio. Métodos para la introducción de ácidos nucleicos en levadura también son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos de transformación utilizando acetato de litio y polietilenglicol. Métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células huésped pueden contener secuencias necesarias para la replicación del ADN, la selección de células huésped que contienen el vector y la expresión de las secuencias de nucleótidos exógenas. Secuencias de este tipo pueden incluir típicamente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de corte y empalme donante y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia conductora para la secreción del polipéptido, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de polienlazador para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se ha de expresar y un elemento marcador seleccionable. Se conocen en la técnica numerosos vectores de expresión apropiados para la expresión en diversas células huésped y están disponibles comercialmente.

Composiciones Farmacéuticas, Dosificación y Métodos de Administración

Se describen composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria. Composiciones de este tipo pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína biespecífica con uno o más componentes adicionales tales como un soporte, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Componentes adicionales de este tipo pueden incluir tampones, hidratos de carbono, polioles, aminoácidos, agentes quelantes, estabilizadores y/o conservantes, entre muchas posibilidades. Muchos de estos componentes adicionales se describen, p. ej., en REMINGTON'S PH^a R^mACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

La dosificación de las proteínas biespecíficas descritas en esta memoria se puede ajustar para lograr los efectos deseados. En muchos casos, se requerirán dosis repetidas debido a la naturaleza crónica de la enfermedad que se está tratando. Por ejemplo, una proteína biespecífica como se describe en esta memoria se puede dosificar dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez semanas, o una vez cada dos, tres, cuatro, cinco o seis meses. La cantidad de la proteína biespecífica administrada cada día que se administra puede ser de aproximadamente 0,0036 mg a aproximadamente 700 mg. Alternativamente, la dosis se puede calibrar de acuerdo con la superficie de la piel estimada de un paciente, y cada una de las dosis puede ser de aproximadamente 0,002 pg/m2 a aproximadamente 350 mg/m2. En otra alternativa, la dosis se puede calibrar de acuerdo con el peso del paciente, y cada una de las dosis puede ser de aproximadamente 0,000051 mg/kg a aproximadamente 10,0 mg/kg.

Las proteínas biespecíficas, o composiciones farmacéuticas que contienen estas moléculas, pueden administrarse mediante cualquier método factible. Productos terapéuticos que comprenden una proteína se administrarán normalmente por vía parenteral, por ejemplo por inyección, ya que la administración oral, en ausencia de alguna formulación o circunstancia especial, conduciría a la hidrólisis de la proteína en el entorno ácido del estómago. Las inyecciones en bolo subcutáneas, intramusculares, intravenosas, intraarteriales, intralesionales y peritoneales son posibles vías de administración. Las proteínas biespecíficas también se pueden administrar mediante infusión, por ejemplo, infusión intravenosa o subcutánea. También es posible la administración tópica, especialmente para enfermedades que afectan a la piel. Alternativamente, las proteínas biespecíficas pueden administrarse a través del contacto con una membrana mucosa, por ejemplo, mediante administración intranasal, sublingual, vaginal o rectal o administración como inhalante. Alternativamente, determinadas composiciones farmacéuticas apropiadas que comprenden una proteína biespecífica pueden administrarse por vía oral.

Habiendo descrito la invención en términos generales anteriormente, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Diseño y ensayo de una molécula biespecífica BAFFIB7RP1 para uso terapéutico humano

El objeto de esta serie de experimentos era encontrar una molécula biespecífica que (1) inhiba la proliferación de células B mediada por BAFF y la proliferación de células T mediada por B7RP1, (2) sea altamente activa en ensayos biológicos y (3) tenga propiedades biofísicas favorables. En la Figura 1 se ilustra un cierto número de diseños esquemáticos para la fusión de un péptido que une a BAFF humano a un anticuerpo IgG anti-B7RP1 humano (anti-huB7RP1). La secuencia del péptido de unión a BAFF se proporciona en SEQ ID NO: 1, y las secuencias de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de anti-huB7RP1 se proporcionan en SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 19, respectivamente.

Para determinar qué diseño tenía las mejores propiedades biofísicas, conservando al mismo tiempo la actividad biológica, se fabricaron y testaron las moléculas biespecíficas diagramadas en la Figura 1. En una construcción, dos copias en tándem del péptido de unión a BAFF con un enlazador intermedio (el "enlazador 1K", que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24) se condensaron al extremo N de la cadena pesada de inmunoglobulina (P71617) o cadena ligera de inmunoglobulina (P71618) de anti-huB7RP1. Véase la Figura 1. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de P71617 se proporciona en SEQ ID NO: 26, y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de P71617 es la misma que la de la cadena ligera de inmunoglobulina de anti-huB7RP1 (SEQ ID NO: 19). La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de P71618 se proporciona en SEQ ID NO: 27, y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de P71618 es la misma que la cadena pesada de inmunoglobulina de anti-huB7RP1 (SEQ ID NO: 25). También se condensaron dos copias en tándem del péptido de unión a BAFF al extremo C-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina de anti-huB7RP1 (que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25) utilizando el enlazador 1K arriba mencionado (que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; P71619) o un enlazador 5X (G4S) (SEQ ID NO: 71) entre los dos péptidos de unión a BAFF (P71620). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de estas dos construcciones de fusión se proporcionan en SEQ ID NO: 16 (P71619) y SEQ ID NO: 28 (P71620). En la construcción P71621, dos copias en tándem del péptido de unión a BAFF con un enlazador 1K intermedio se insertaron en el dominio CH3 del anticuerpo entre los residuos 358 y 359 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina pesada del anticuerpo anti-huB7RP1). La secuencia de la cadena pesada de la construcción P71621 se proporciona en SEQ ID NO: 29. En la construcción P71622, el péptido de unión a BAFF se insertó en el dominio CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina de anti-huB7RP1 (entre los residuos 358 y 359 de SEQ ID NO: 25 y una segunda copia del péptido de unión a BAFF se condensó con el extremo C-terminal de la cadena pesada. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de P71622 se proporciona en SEQ ID NO: 30. En la construcción P71623, un péptido de unión a BAFF se insertó en la región CH2 (entre los residuos 268 y 269 de SEQ ID NO: 25), y un segundo péptido de unión a BAFF se insertó en la región CH3 (entre los residuos 358 y 359 de SEQ ID NO: 25). SEQ ID NO: 31 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de P71623. Todas las construcciones P71619-P71623 tienen la cadena ligera de inmunoglobulina de anti-huB7RP1 (SEQ ID NO: 19).

En las construcciones P74293 y P74294 se modificó el enlazador entre las dos copias en tándem de los péptidos de unión a BAFF en la construcción P71619. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de P74293 y P74294 se proporcionan en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de estas construcciones también tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

Ácidos nucleicos que codifican las construcciones arriba descritas se prepararon como sigue. Ácidos nucleicos que codifican la porción N-terminal de las fusiones del péptido BAFF N-terminal (P71617 y P71618), incluyendo dos copias del péptido de unión a BAFF más una región variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, se generaron sintéticamente. Estos se ligaron, a través de sitios de endonucleasas de restricción convenientes, a ácidos nucleicos que codifican la región constante de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina en vectores apropiados. Ácidos nucleicos que codifican las fusiones C-terminales de la región constante de la cadena pesada (P71619 y P71620), inserciones del bucle Fc (P71621 y P71623) y la inserción del bucle Fc/fusión C-terminal (P71622) se generaron sintéticamente y se ligaron en un vector que contenía la región variable de la cadena pesada a través de sitios de endonucleasas de restricción convenientes.

Las diversas construcciones biespecíficas arriba descritas se expresaron tanto en células 293 transfectadas de forma transitoria como en células CHO transfectadas de forma estable. Las proteínas de fusión se purificaron y se testaron en cuanto a la actividad biológica. No se observaron diferencias en las proteínas producidas en estos dos tipos diferentes de células huésped.

Las actividades inhibitorias de BAFF de las moléculas biespecíficas se testaron en un ensayo de proliferación de células B primarias humanas mediado por BAFF. En resumen, células B humanas se purificaron a partir de células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés) utilizando selección negativa utilizando un kit II de células B humanas de Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Aproximadamente 105 células B purificadas se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos en Medio Esencial Mínimo (MEM) más suero de bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) al 10 % inactivado por calor, en presencia de 50 ng/ml de proteína BAFF humana, 2 pg/ml de IgM antihumana F(ab') 2 de cabra (Jackson ImmunoResearch), y concentraciones variables de una de las proteínas biespecíficas arriba descritas a 37 °C en 5 % de CO² durante 48 horas. Se utilizó un pepticuerpo anti-BAFF como control positivo ("aBAFF", que es un homodímero que contiene dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende dos péptidos de unión a BAFF condensados con un polipéptido Fc). La molécula aBAFF se describe en detalle en la Patente de EE.UU. 7.259.137, y la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de este homodímero se proporciona en SEQ ID NO: 32. La proliferación se midió por la captación de ³H-timidina radiactiva durante las últimas 18 horas de incubación. Los resultados se muestran en las Figuras 2A y 2B.

Los datos en la Figura 2A indican que las dos construcciones de fusión C-terminales (P71619 y P71620) fueron equiparables entre sí en la inhibición de la proliferación de células B mediada por BAFF y más potentes que todas las demás construcciones de fusión testadas en este experimento. No se prosiguió con P71620 porque tendía a agregarse, una propiedad que es altamente indeseable en una proteína terapéutica. Los datos en la Figura 2B indican que P71619 es equiparable a las dos versiones ligeramente modificadas de esta construcción arriba descrita (P74293 y P74294) y a un control positivo (aBAFF) en la inhibición de la proliferación de células B mediada por BAFF. Por lo tanto, entre las construcciones biespecíficas testadas, P71619, P71620, P74293 y P74294 tenían una actividad equiparable en este ensayo de proliferación de células B mediada por BAFF y mejor actividad que todas las demás construcciones testadas.

La actividad inhibidora B7RP1 de P71619, P74293 y P74294 se ensayó utilizando un ensayo de proliferación de células T mediado por B7RP1-Fc humana. Células T humanas primarias purificadas a partir de PBMCs de donantes humanos sanos utilizando el kit de aislamiento de células Pan T de Miltenyi Biotec (Auburn, CA) y estimuladas con anticuerpo anti-CD3 unido a placa (1 pg/mL) y una proteína de fusión B7RP1-Fc (3 pg/mL) en presencia de concentraciones variables de las proteínas biespecíficas arriba descritas o un anticuerpo IgG2 anti-humano B7RP1 (al que se alude en esta memoria como "aB7RP1"). Se añadió ³H-timidina a las células después de 48 horas y se midió la incorporación de ³H-timidina 24 horas más tarde. Todos los anticuerpos biespecíficos que se testaron tenían CI⁵⁰ similares^, que eran similares a las de aB7RP1 (Figura 3). Por lo tanto, estos datos sugieren que la conjugación de los péptidos de unión a BAFF con el anticuerpo antihuB7RP1 tuvo poco o ningún efecto sobre la capacidad del anticuerpo para inhibir la actividad de B7RP1.

Las afinidades de unión de los anticuerpos biespecíficos heterodiméricos P74293 y P74294 a BAFF y B7RP1 se midieron mediante el Ensayo de Exclusión Cinética (KinExA^® ; Sapidyne Instruments, Boise, Idaho). Ambos anticuerpos tienen altas afinidades de unión a BAFF humano (que tiene K^d de aproximadamente 30 pM) y B7RP1 humana (que tiene K^d de aproximadamente 40 pM). Véase la Tabla 2 que figura más adelante. Además, estos dos anticuerpos biespecíficos tienen afinidades de unión similares al BAFF del mono cynomolgus en comparación con el BAFF humano y a B7RP1 del mono cynomolgus en comparación con B7RP1 humana. Tabla 2.

Tabla 2: Afinidad de unión y potencia celular de P74293 y P74294.

Para evaluar adicionalmente la actividad de P74293 en un sistema in vitro utilizando células humanas, se evaluó la producción de citoquinas por parte de células de amígdalas humanas activadas por enterotoxina B de Staphylococcus (SEB, por sus siglas en inglés) en presencia de diversas moléculas de prueba. Brevemente, se aislaron células de amígdalas humanas del tejido y se estimularon con SEB (1 pg/mL) en presencia de una de las siguientes moléculas: (1) aB7RP1, (2) P74293, (3) CTLA4-Ig (un control positivo) o (4) IgG humana (un control negativo). Después de 72 horas de cultivo, se recogió el sobrenadante celular y se analizaron los niveles de citoquinas utilizando kits de Meso Scale Discovery de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Los tres de aB7RP1, P74293 y CTLA4-Ig, barras 1,2 y 3, respectivamente, en todos los paneles de la Figura 4 inhibieron la liberación de IL-17, IL-10, IL-4 e IFNy. La liberación de IL-2 fue inhibida únicamente por CTLA4-Ig. Por lo tanto, aB7RP1 y P74293 biespecífica anti-BAFF/B7RP1 tuvieron efectos equiparables y específicos sobre la secreción de citoquinas por células de amígdalas humanas activadas por SEB.

Tres proteínas biespecíficas heterodiméricas, es decir, P71619, P74293 y P74294 se examinaron en cuanto a propiedades adicionales. Los títulos de proteína de cultivos de células huésped que producen estas proteínas indicaron que P74293 y P74294 se produjeron a aproximadamente el doble de los niveles en los que se produjo P71619. P74293 y P74294 también fueron más estables que P71619 después del almacenamiento durante dos semanas a 40 °C como se evaluó por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). P74293 formó una solución transparente al inicio del almacenamiento y después de 4 semanas de almacenamiento, mientras que las soluciones que contenían P74394 eran turbias en todos los momentos. Soluciones de P74293 y P74294 fueron menos viscosas que las soluciones de P71619. Por lo tanto, P74293 y P74294 se expresaron en niveles más altos que P71619 y también fueron más estables y menos viscosas en el intervalo de concentraciones testado que P71619. La diferencia más obvia entre estas moléculas radica en el enlazador entre los dos péptidos de unión a BAFF. Estos datos sugieren que los enlazadores en P74293 y P74294 (SEQ ID NOs: 6 y 7) pueden conferir propiedades mejoradas a estas moléculas.

Las propiedades farmacocinéticas de las moléculas biespecíficas descritas se evaluaron en ratones. A ratones CD-1 machos se les administró una dosis intravenosa (IV) única (5 mg/kg) de las proteínas de fusión biespecíficas P71617, P71619, P71621, P71622, P74293 o P74294. Se recogieron muestras de suero antes de la dosificación y a las 0,5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408, 504 horas después de la dosificación. La concentración de la molécula biespecífica en el suero se determinó mediante dos métodos ELISA, registrando uno la presencia de la porción Fc y registrando otro la presencia tanto de la porción Fc como de la porción peptídica de unión a BAFF. Para la medición de la porción Fc, se utilizó un anticuerpo anti-Fc biotinilado como reactivo de captura y un anticuerpo anti-Fc marcado con ALEXA FLUOR® 647 como reactivo de detección. Para detectar la porción de unión a BAFF y la porción Fc de la proteína biespecífica, se utilizó una proteína BAFF biotinilada como reactivo de captura, y el anticuerpo anti-Fc marcado con ALEXA FLUOR® 647 se utilizó como reactivo de detección . Las proteínas biespecíficas con dos copias en tándem de péptidos de unión a BAFF condensados al extremo N (P71617), el extremo C (P71619, P74293 y P74294) o el dominio ^c H3 (P71621) de la cadena pesada tienen perfiles farmacocinéticos muy similares en ratones. Figura 5. La proteína biespecífica con una copia del péptido de unión a BAFF insertado en el dominio CH3 y otra copia condensada al extremo C-terminal de la cadena pesada (P71622) tenía una exposición más baja en comparación con las otras proteínas biespecíficas. Figura 5. Además, los dos ensayos ELISA diferentes dieron como resultado concentraciones séricas similares de las proteínas biespecíficas, lo que sugiere que no se produjo una escisión significativa de las proteínas biespecíficas in vivo.

Parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de los anticuerpos biespecíficos heterodiméricos P74293 y P74294 también se evaluaron mediante un estudio de dosis única en monos cynomolgus. A monos cynomolgus machos sin tratamiento previo (n = 4) se les administró una dosis única intravenosa o subcutánea en bolo de P74293 (10 mg/kg), o una dosis única subcutánea de P74294 (10 mg/kg). Ambas moléculas biespecíficas tienen perfiles farmacocinéticos similares a los de un anticuerpo IgG. Los parámetros farmacocinéticos observados para P74293 y P74294, así como para anti-huB7RP1, se reseñan en la Tabla 3 que figura a continuación.

Tabla 3: Parámetros farmacocinéticos en monos cynomolgus

Los datos en la Tabla 3 indican que los parámetros farmacocinéticos de P74293 y P75294 son equiparables entre sí y con los del anticuerpo anti-huB7RP1.

Ejemplo 2: Diseño y prueba de una molécula sustituta biespecífica murina

Para realizar estudios preclínicos en ratones se construyó una molécula biespecífica sustituta murina que podría unirse a B7RP1 murina y BAFF murino (en lo sucesivo, la "sustituta murina"). El anticuerpo anti-huB7RP1 utilizado para construir las construcciones biespecíficas descritas en el Ejemplo 1, no se une a B7RP1 murina, mientras que el péptido de unión a BAFF utilizado en estas construcciones se une a BAFF tanto humano como murino. Datos no mostrados. La sustituta murina comprende un anticuerpo IgG anti-B7RP1 murino antagonista (denominado “anti-mB7RP1” en esta memoria), que era una quimera de regiones constantes de inmunoglobulina de ratón y regiones variables de inmunoglobulina anti-B7RP1 murina de rata. El uso de anti-mB7RP1 se describe en Hu etal. (2009), J. Immunol. 182: 1421 en donde se designa 1B7-V2. La sustituta murina tiene dos copias de un péptido de unión a BAFF (SEQ ID NO: 1) condensado a través de un enlazador corto (cinco aminoácidos de longitud) al extremo C de la cadena pesada de inmunoglobulina de anti-mB7RP1. Las dos copias del péptido de unión a BAFF están separadas por otro enlazador que es de 23 aminoácidos de longitud. Los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada de la sustituta murina se generaron utilizando PCR solapante para unir los ácidos nucleicos que codifican la porción de unión a BAFF de aBAFF con el extremo aguas abajo de los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada de 1B7-V2. es decir, anti-mB7RP1.

La inhibición de BAFF por la sustituta murina se evaluó en un ensayo de proliferación de células B mediado por BAFF. Se aislaron linfocitos B de ratón de bazos C57BL/6 mediante selección negativa con microperlas MACS CD43 (ly-48) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) o de PBMC utilizando un kit de aislamiento de células B (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las células B purificadas se estimularon con 0,1 pg/ml de anti-IgM y 200 ng/ml de BAFF en presencia de concentraciones variables de la sustituta murina o aBAFF. La proliferación de células B se midió mediante la incorporación de ³H-timidina el día 4. Las CI⁵⁰ de la sustituta murina y aBAFF fueron 0,59 nM y 0,73 nM, respectivamente. Véase la Figura 6A. Por lo tanto, la sustituta murina inhibió eficazmente BAFF con una potencia equiparable a la de aBAFF.

Para medir la inhibición de la unión de B7RP1 a su receptor por parte de la sustituta murina, primero se activaron células de bazo de ratón para potenciar su expresión del receptor de B7RP1 incubándolas en pocillos de microtitulación recubiertos con un anticuerpo anti-CD3 (5 pg/ml). durante 24 horas. Las células de bazo activadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se incubaron con 5 pg/ml de muB7RP1 :Fc biotinilado en presencia de concentraciones variables de la sustituta murina a 4 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron y luego se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 de ratón conjugado con aloficocianina (APC, por sus siglas en inglés) y estreptavidina-ficoeritrina (estreptavidina-PE) durante 20 minutos adicionales. La unión de B7RP1-Fc a las células T se analizó mediante citometría de flujo. Las CI⁵⁰ de la sustituta murina y anti-mB7RP1 fueron 4,01 pM y 2,8 pM, respectivamente. Véase la Figura 6B. Por lo tanto, la actividad de la sustituta murina fue similar a la de anti-mB7RP1 en este ensayo. Por lo tanto, la sustituta murina inhibe tanto BAFF como B7RP1.

Los efectos farmacodinámicos in vivo de la sustituta murina se evaluaron en ratones inmunizados con glóbulos rojos de oveja (SRBC, por sus siglas en inglés). En resumen, ratones BALB/c (8 semanas de edad) recibieron una inmunización primaria el día 0 y una inmunización de refuerzo el día 28 con 2 X 10⁸ SRBC en 0,2 ml de PBS mediante inyección intraperitoneal. Los ratones (n=5 para cada una de las moléculas) se trataron dos veces por semana desde el día 0 hasta el día 33 con una de las siguientes moléculas a 5 mg/kg: la sustituta murina; aBAFF; anti-mB7RP1; o IgG1 murina. Ratones tratados con SBRC, pero que no recibieron otro tratamiento, sirvieron como controles positivos. Los ratones se sacrificaron el día 34 y se recogieron suero y bazos.

Para medir la proporción de células B y células T de memoria en el bazo, se recogieron células del bazo triturando el tejido del bazo a través de un colador de células. Las células de bazo se preincubaron con anti-CD16/32 no marcado para bloquear la unión no específica de anticuerpos a receptores Fc gamma (FcyR). La proporción de células B se determinó mediante tinción con anti-B220 marcado con PE (que se expresa en células B). La proporción de células T de memoria (células T CD44h'CD62L lo CD4) se determinó mediante tinción con anti-CD44 conjugado con FITC, anti-CD62L conjugado con PE, anti-CD4 conjugado con APC y anti-CD3 conjugado con PerCP. Todos los anticuerpos de tinción se adquirieron de BD Bioscience (San Diego, CA). Para las determinaciones de células tanto B como T, la citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo FACSCALIBUR^™ (BD Bioscience, San Jose, CA) y los datos se analizaron utilizando el software FLOWJO^® (TreeStar Inc., Ashland, OR) para el análisis de los datos de citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Figura 7.

Para medir niveles de anticuerpos anti-SBRC en suero, se incubaron placas de microtitulación recubiertas con 10 pg/ml de antígeno SRBC soluble durante dos horas a temperatura ambiente con suero diluido de ratones tratados. Ig específica para SRBC unida del suero se detectó con anticuerpos IgG e IgM anti-ratón de cabra policlonales conjugados con HRP (Southern Biotech, Birmingham, AL). La reacción del sustrato se realizó utilizando sustrato de peroxidasa de micropocillos SUREBLUE^™ TMB (KPL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la densidad óptica se leyó utilizando un lector de microplacas Spectrum Max (Molecular Devices). Como control positivo se añadieron a cada una de las placas diluciones en serie de una mezcla de sueros de ratones inmunizados con SRBC sin tratamiento alguno, y se construyó una curva estándar a partir de las lecturas de estos pocillos. Los niveles de anticuerpos anti-SBRC de otras muestras se reseñan en la Figura 7 como porcentaje de este control positivo.

El porcentaje de células de bazo que son células B se redujo en ratones tratados con la sustituta murina en comparación con el porcentaje observado en ratones tratados con IgG1 murina. Figura 7 (panel superior). Se observó una reducción similar en los ratones tratados con aBAFF o aBAFF más anti-mB7RP1, pero no en los ratones tratados solo con antimB7RP1. Figura 7 (panel superior). Con respecto a las células T de memoria, los ratones tratados con la sustituta murina, anti-mB7RP1 o anti-mB7RP1 más aBAFF tenían proporciones reducidas de células T de memoria en comparación con las observadas en los ratones tratados con muIgG1. Figura 7 (panel central). Por el contrario, el tratamiento con aBAFF no alteró la población de células T de memoria en el bazo en comparación con lo observado con el tratamiento con mulgG. Figura 7 (panel central). La sustituta murina también mostró una potente reducción del nivel de anticuerpos anti-SRBC en suero, similar a la observada con el tratamiento con anti-mB7RP1 o anti-mB7RP1 más aBAFF o en ratones a los que no se les había inyectado SRBC. Figura 7 (panel inferior). Se observó una inhibición moderada del nivel de anticuerpos anti-SRBC, en comparación con el nivel observado con el tratamiento con mIgG1, en ratones tratados con aBAFF solo. Figura 7 (panel inferior). Estos datos indican que la sustituta murina tenía efectos inhibidores duales en los compartimientos de células B y células T en ratones in vivo.

El impacto de la sustituta murina sobre la enfermedad se evaluó en el modelo de lupus NZB/WF¹ utilizando dos cantidades de dosis diferentes para cada una de las moléculas testadas. Se trataron ratones hembra NZB/WF¹ (4,5 meses de edad, n = 20) dos veces por semana mediante inyección intraperitoneal durante 18 semanas utilizando cada uno de los siguientes regímenes de dosificación: 5 o 15 mg/kg de sustituta murina (PM s 160 kDa); 4,68 o 14 mg/kg anti-mB7RP1 (MW s 150 KDa); 1,88 o 5,6 mg/kg de aBAFF (MW s 64 KDa); una combinación de aBAFF (1,88 o 5,6 mg/kg) y anti-mB7RP1 (4,68 o 14 mg/kg); IgG1 murina (15 mg/kg; un control de isotipo); o solución salina tamponada con fosfato (PBS) (un control negativo). La proteinuria se midió en orina utilizando ALBUSTIX^® (Bayer, Elkhart, IN) cada dos semanas a partir de los 5 meses de edad. La incidencia de proteinuria se expresó como el porcentaje de ratones con proteína en orina a una concentración de al menos 300 mg/dl en dos mediciones consecutivas. El nivel de IgG anti-ADNdc en suero se midió mediante ELISA. La puntuación de la enfermedad renal de todos los ratones se realizó mediante el examen de muestras de tejido renal para ocho tipos diferentes de lesiones, es decir, proliferación de capilares glomerulares, hiperplasia de células mesangiales, aumento de la matriz mesangial, adhesión de mechones glomerulares, hiperplasia epitelial parietal, nefritis intersticial, dilatación tubular/cilindros proteicos y atrofia tubular/fibrosis intersticial. Cada uno de los tipos de lesión recibió una puntuación de gravedad de 0 a 5, para una puntuación máxima posible de 32. Se promediaron las puntuaciones de cada uno de los grupos de ratones. Se controló la supervivencia.

A los 12 meses de edad, ninguno de los ratones tratados con la sustituta murina en cualquier nivel de dosis desarrolló proteinuria. Por el contrario, el 100 % de los ratones tratados con IgG1 murina o PBS en ambos niveles de dosis testados exhibieron proteinuria. Figuras 8A y 9B. Aproximadamente el 60 % y el 35 % de los ratones tratados con los niveles de dosis más bajos de anti-mB7RP1 y aBAFF, respectivamente, y aproximadamente el 50 % y el 25 % de los ratones tratados con las dosis más altas de anti-mB7RP1 y aBAFF, respectivamente, desarrollaron proteinuria. Figuras 8A y 9B. Además, el tratamiento con sustituta murina en ambos niveles de dosis dio como resultado una reducción significativa en los niveles séricos de IgG anti-ADNdc en comparación con el control negativo tratado con muIgG1. Figuras 8B y 9A. El tratamiento biespecífico también mejoró significativamente la supervivencia en comparación con los grupos de control mlgG y PBS. Datos no mostrados. Sin embargo, no se observó una diferencia clara en la supervivencia entre los tratamientos biespecíficos frente a los de agente único en el momento de la finalización del experimento.

Se recogieron los riñones de todos los ratones tratados, incluyendo los ratones fallecidos antes del final del estudio, para la valoración histológica de la gravedad de la enfermedad renal. Los grupos de ratones tratados con aBAFF, la combinación de aBAFF más anti-mB7RP1 o la sustituta murina tuvieron puntuaciones significativamente más bajas para la enfermedad renal en comparación con el grupo de control tratado con mIgG1. Figura 10. Los grupos tratados con la sustituta biespecífica o la combinación también mostraron una tendencia hacia la reducción de la patología renal en comparación con los grupos de tratamiento con agente único, un resultado que se correlaciona bien con los resultados de proteinuria arriba descritos. Compárese la Figura 10 con las Figuras 8A y 9B. En resumen, la inhibición dual de BAFF y B7RP1 por la sustituta murina o por un tratamiento combinado con aBAFF más anti-mB7RP1 fue más eficaz que la inhibición de solo BAFF (aBAFF) o solo B7RP1 (anti-mB7RP1) para prevenir el inicio y la progresión de la enfermedad en el modelo de lupus NZB/WF^1.

Para determinar si la inhibición tanto de BAFF como de B7RP1 podría inhibir eficazmente los síntomas de la artritis inducida por colágeno murino, se realizó el siguiente experimento. Se inmunizaron ratones DBA machos con 100 pg de colágeno bovino tipo II emulsionado en 2 x adyuvante completo de Freund (CFA) el día 0 y se reforzaron con colágeno bovino tipo II en adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) el día 21. Los ratones se trataron con una de las sustancias de prueba dos veces por semana durante el curso de 41 semanas del estudio, comenzando el día 0. Se evaluó el porcentaje de ratones en cada uno de los grupos que exhibían síntomas de artritis y una puntuación artrítica promedio para cada uno de los grupos en cada momento. Las puntuaciones de artritis se determinaron examinando cada una de las extremidades y asignando una puntuación de 0 a 3 para cada una de las extremidades, con puntuaciones más altas para las extremidades más hinchadas y/o inflamadas. Por lo tanto, la puntuación total máxima de artritis es 12. Se consideró que un ratón tenía artritis si tenía una puntuación de artritis de al menos 1 en cualquier miembro.

Los resultados se muestran en la Figura 11. Estos datos indican que la combinación de aBAFF y anti-mB7RP1 (círculos negros conectados por líneas continuas) fue mucho más eficaz para suprimir los síntomas de artritis que aBAFF (círculos en blanco conectados por líneas continuas) o anti-mB7RP1 (círculos negros conectados por líneas discontinuas) solo. Los grupos de control negativo tratados con mlgG (cuadrados negros conectados por líneas continuas) o PBS (cuadrados negros conectados por líneas discontinuas) tuvieron el porcentaje más alto de incidencia de artritis y las puntuaciones artríticas más altas. Estos resultados sugieren que inhibir tanto BAFF como B7RP1, en lugar de inhibir solo una de estas vías, podría ser un tratamiento eficaz de una afección artrítica autoinmune y/o inflamatoria como la artritis reumatoide.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína biespecífica y/o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína biespecífica, en donde la proteína biespecífica comprende: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente fórmula:

A-L1-P-L2-P, en donde A es una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo IgG, L1 es un primer enlazador peptídico que está ausente o tiene una longitud de 3 a 40 aminoácidos, P es un péptido de unión a BAFF que es de 10 a 40 aminoácidos de longitud, y L2 es un segundo enlazador peptídico que está ausente o es de 5 a 50 aminoácidos de longitud, y

(b) una cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo IgG,

en donde la cadena pesada de inmunoglobulina de (a) y la cadena ligera de inmunoglobulina de (b) forman un anticuerpo IgG, que comprende dos moléculas del polipéptido de (a) y dos moléculas de la cadena ligera de (b), que pueden unirse a B7RP1, y

en donde la proteína puede inhibir la proliferación mediada por BAFF de células B humanas, y

en donde la proteína puede inhibir la proliferación de células T humanas mediada por B7RP1, y

en donde la célula huésped es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de mamífero.

2. La célula huésped de la reivindicación 1, en donde la proteína biespecífica comprende una cadena pesada de inmunoglobulina a la que le falta una lisina en su extremo C-terminal justo aguas arriba de L1.

3. La célula huésped de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo IgG es un anticuerpo IgG 1 anti-B7RP1 humano o humanizado.

4. La célula huésped de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo anti-B7RP1 es un anticuerpo IgG2 humano o humanizado, o un anticuerpo IgG4 humano o humanizado.

5. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde P tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL).

6. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde L1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 (GGGGG).

7. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde L2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, preferiblemente en donde L2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

8. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, que codifica una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 (RASQGISNWLA), una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AASSLQS ), una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (QQYDSYPRT), una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (SYWMS), una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (YIKQDGNEKYYVDSVKG) y una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (EGILWFGDLPTF).

9. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde la proteína biespecífica codificada comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

10. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la proteína biespecífica codificada comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

11. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde la cadena ligera de inmunoglobulina de (b) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

12. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en donde el polipéptido de (a) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o 18.

13. La célula huésped de la reivindicación 1, en donde el polipéptido (a) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, y el polipéptido (b) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

14. La célula huésped de la reivindicación 1, en donde la proteína biespecífica comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, preferiblemente, en donde la proteína comprende, además, un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

15. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la célula huésped es una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón de hámster bebé (BHK), una célula de riñón de mono, una célula HeLa, una célula de carcinoma hepatocelular humano y una célula 293.

16. Un método para producir una proteína biespecífica, que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en condiciones tales que el ácido nucleico se exprese y recuperar la proteína de la masa celular o del medio de cultivo, en donde la célula huésped es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el ácido nucleico o vector se introduce en la célula mediante

(a) electroporación o transformación de cloruro de calcio, en donde la célula huésped es una célula bacteriana, o (b) transformación de acetato de litio o transformación de polietilenglicol, en donde la célula huésped es una célula de levadura.