RS63431B1 - Proteini specifični za baff i b7rp1 i njihova upotreba - Google Patents

Proteini specifični za baff i b7rp1 i njihova upotreba

Info

Publication number
RS63431B1
RS63431B1 RS20220711A RSP20220711A RS63431B1 RS 63431 B1 RS63431 B1 RS 63431B1 RS 20220711 A RS20220711 A RS 20220711A RS P20220711 A RSP20220711 A RS P20220711A RS 63431 B1 RS63431 B1 RS 63431B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
host cell
cell
Prior art date
Application number
RS20220711A
Other languages
English (en)
Inventor
Hailing Hsu
Ming Zhang
Gunasekaran Kannan
Frederick W Jacobsen
Wayne Tsuji
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50483540&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63431(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of RS63431B1 publication Critical patent/RS63431B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovde opisani bispecifični molekuli su u oblasti proteinske terapije.
STANJE TEHNIKE
[0002] Većina terapeutskih proteina se vezuje za jedan ciljni protein sa visokom specifičnošću, čime ometa aktivnost ovog ciljnog proteina. Taj protein može biti deo jednog ili više bioloških puteva koji posreduju u tretiranju bolesti kod čoveka, a terapeutski protein stoga može inhibirati progresiju bolesti. Međutim, efikasnost terapeutskih proteina je retko potpuna za sve pacijente. Nepotpuna efikasnost terapeutskih proteina može u nekim slučajevima biti posledica složenosti bolesti. Na primer, neke bolesti mogu biti posredovane višestrukim biološkim putevima, ili različiti biološki putevi mogu imati dominantnu ulogu u posredovanju aktivnosti bolesti kod različitih pacijenata koji imaju isto klinički definisano stanje. Stoga, kod nekih bolesti može biti korisno da se istovremeno inhibiraju najmanje dva biološka puta.
SAŽETAK
[0003] Ovde je obelodanjen bispecifični protein koji se može vezati za, i inhibirati biološku aktivnost i humanog B7-srodnog proteina 1 (B7RP1, takođe poznatog kao GL50, i T-ćelijskog kostimulator liganda (ICOSLG)) i faktora aktivacije humanih B-ćelija (BAFF, takođe poznat kao nadporodica faktora tumorske nekroze, član 13b (TNFSF13B)). BAFF ima ulogu u preživljavanju B ćelija, a B7RP1 ima ulogu u kostimulaciji T ćelija. Sifuentes Giraldo et al. (Reumatologia Clinica 2012, Vol.8, No.5, pp.263-269) obelodanjuje mete leka za tretiranje sistemskog eritemskog lupusa, između ostalog, antagoniste BAFF i antagoniste ICOS-L/B7RP1/CD275, ali ne sugeriše kombinovanje inhibitora BAFF i B7RP1. Dakle, protein koji inhibira aktivnost oba proteina ometa aktivnost i B i T ćelija.
[0004] Ovaj pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Konkretno, ovaj pronalazak pruža:
1. Ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bispecifični protein i/ili vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira bispecifični protein, pri čemu bispecifični protein obuhvata:
a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa sledećom formulom: A-L1-P-L2-P, gde je A teški lanac imunoglobulin IgG antitela, L1 je prvi peptidni linker ef-koji je odsutan ili je dug 3 do 40 aminokiselina, P je BAFF-vezujući peptid koji je dug 10 do 40 aminokiselina, a L2 je drugi peptidni linker koji je odsutan ili je dug 5 do 50 aminokiselina, i
b) laki lanac imunoglobulin IgG antitela,
gde teški lanac imunoglobulina (a) i laki lanac imunoglobulina (b) formiraju IgG antitelo, koje se sastoji od dva molekula polipeptida (a) i dva molekula lakog lanca (b), koji mogu da vežu B7RP1, i
gde protein može da inhibira BAFF-posredovanu proliferaciju humanih B ćelija, i
gde protein može da inhibira B7RP1-posredovanu proliferaciju humanih T ćelija, i
gde je ćelija domaćina bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta, ćelija biljke ili ćelija sisara.
2. Ćelija domaćina tačke 1, gde bispecifični protein obuhvata teški lanac imunoglobulina kome nedostaje lizin na njegovom C-terminalu neposredno uzvodno od L1.
3. Ćelija domaćina tačke 1, gde je IgG antitelo humano ili humanizovano anti-B7RP1 IgG1 antitelo.
4. Ćelija domaćina tačke 1 ili 2, gde je anti-B7RP1 antitelo humano ili humanizovano IgG2 antitelo, ili humano ili humanizovano IgG4 antitelo.
5. Ćelija domaćina bilo koje od tačaka 1-4, gde P ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL).
6. Ćelija domaćina bilo koje od tačaka 1-5, gde L1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40 (GGGGG).
elija domaćina bilo koje od tačaka 1-6, gde L2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, poželjno gde L2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7.
elija domaćina bilo koje od tačaka 1-7, koja kodira laki lanac CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8 (RASQGISNWLA), laki lanac CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9 (AASSLQS), laki lanac CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10 (QQYDSYPRT), teški lanac CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11 (SYWMS), teški lanac CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12 (YIKQDGNEKYVDSVKG) i teški lanac CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13
(EGILWFDLPF).
elija domaćina bilo koje od tačaka 1-8, gde kodirani bispecifični protein obuhvata varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14.
Ćelija domaćina bilo koje od tačaka 1-9, gde kodirani bispecifični protein obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15.
Ćelija domaćina bilo koje od tačaka 5-10, gde laki lanac imunoglobulina (b) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19.
Ćelija domaćina bilo koje od tačaka 5-11, gde polipeptid (a) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17 ili 18.
Ćelija domaćina tačke 1, gde polipeptid (a) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17 ili SEQ ID NO:18, i polipeptid (b) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19.
Ćelija domaćina tačke 1, gde bispecifični protein obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:14 i SEQ ID NO:15, poželjno, gde protein dalje obuhvata linker koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7.
Ćelija domaćina bilo koje od tačaka 1-14, gde je ćelija domaćina ćelija sisara izabrana iz grupe koju čine jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna, HeLa ćelije, ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma i ćelije 293.
Metoda za pravljenje bispecifičnog proteina koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina bilo koje od tačaka 1-14 pod uslovima da je nukleinska kiselina
eksprimirana, i izdvaja protein iz ćelijske mase ili kultivacionog medijuma, pri čemu je ćelija domaćin bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta ili ćelija biljke.
17. Metoda tačke 16, gde se nukleinska kiselina ili vektor unosi u ćeliju (a) elektroporacijom, ili kalcijum hlorid transformacijom, pri čemu je ćelija domaćina bakterijska ćelija, ili (b) litijum acetat transformacijom, ili polietilen glikol transformacijom, pri čemu je ćelija domaćina ćelija kvasca.
[0005] Ovde opisan je bispecifični protein, pri čemu protein može da inhibira BAFF-posredovanu proliferaciju humanih B ćelija i pri čemu protein može da inhibira B7RP1-posredovanu proliferaciju humanih T ćelija. Bispecifični protein može sadržati IgG antitelo koje obuhvata dva teška lanca imunoglobulina koji imaju različite aminokiselinske sekvence i dva laka lanca imunoglobulina koji imaju različite aminokiselinske sekvence. IgG antitelo može inhibirati BAFF-posredovanu proliferaciju humanih B ćelija i B7RP1-posredovanu proliferaciju humanih T ćelija. IgG antitelo može biti IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo i može biti humano ili humanizovano IgG antitelo. Bispecifični protein može sadržati hipervarijabilni region 1 (CDR1) lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8, hipervarijabilni region 2 (CDR2) lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9, hipervarijabilni region 3 (CDR3) lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10, CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11, CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12, i CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13. Dalje, bispecifični protein može sadržati varijabilni region teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:15 ili njenu varijantu i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:14 ili njenu varijantu. Takve varijantne sekvence mogu da obuhvate ne više od 10 delecija, insercija supstitucija jedne aminokiseline na 100 aminokiselina u odnosu na referentnu sekvencu.
[0006] Dalje obelodanjen ovde je bispecifični protein koji može da inhibira BAFF-posredovanu proliferaciju humanih B ćelija i koji može da inhibira B7RP1- posredovanu proliferaciju humanih T ćelija, može da sadrži: (a) polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa sledećom formulom: A-L1-P-L2-P, gde je A imunoglobulinski teški lanac IgG antitela, L1 je prvi linker onog koji je odsutan ili je dug 3 do 40 aminokiselina, P je BAFF-vezujući peptid koji je dug 10 do 40 aminokiselina, a L2 je peptidni linker koji je odsutan ili je dug 5 do 50 aminokiselina; i (b) laki lanac imunoglobulina. Teški lanac imunoglobulina (a) i laki lanac imunoglobulina (b) mogu formirati IgG antitelo, koje se sastoji od dva molekula polipeptida (a) i dva molekula lakog lanca (b), koji mogu vezati B7RP1 i/ili mogu inhibirati proliferaciju humanih T ćelija posredstvom B7RP1. Teškom lancu imunoglobulina može nedostajati lizin na njegovom C-terminalu upravo uzvodno od L1. IgG antitelo može biti humano ili humanizovano IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo. BAFF-vezujući peptid P može imati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3. L1 može imati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 37, 38, 39 ili 40. L2 može imati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, 6 ili 7. Bispecifični protein može sadržati CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8 (RASQGISNWLA), CDR2 lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 (AASSLQS), CDR3 lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:10 (QQYDSYPRT), CDR1 teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:11 (SYWMS), CDR2 teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:12 (YIKQDGNEKYVDSVKG) i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:13 (EGILWFDLPF). Bispecifični protein može sadržati varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:14 i/ili varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:15. Bispecifični protein se može sastojati od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:19 ili njene varijante i aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:17 ili 18 ili njihovih varijanti. Takve varijantne sekvence mogu da obuhvate ne više od 10 delecija, insercija supstitucija jedne aminokiseline na 100 aminokiselina u odnosu na referentnu sekvencu.
[0007] U daljem vidu, ovde je opisan bispecifični protein koji se sastoji od: (a) polipeptida koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:17 ili SEQ ID NO:18 ili njihovih varijanti; i (b) drugog polipeptida koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:19 ili njene varijante. Takve varijantne sekvence mogu da obuhvate ne više od 10 delecija, insercija supstitucija jedne aminokiseline na 100 aminokiselina u odnosu na referentnu sekvencu. Bispecifični protein može da inhibira BAFF- posredovanu proliferaciju humanih B ćelija i B7RP1-posredovanu proliferaciju humanih T ćelija. Bispecifični protein može biti tetramer koji se sastoji od dva molekula polipeptida iz (a) i dva molekula polipeptida iz (b).
[0008] Dalje obelodanjeno ovde je protein koji se sastoji od linkera koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7. Ovaj protein može da inhibira BAFF-posredovanu proliferaciju humanih B ćelija i/ili B7RP1-posredovanu proliferaciju humanih T ćelija. Takav protein može da sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:14 i/ili SEQ ID NO:15. Takav protein može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od najmanje dve kopije SEQ ID NO:1 odvojene putem SEQ ID NO:6 ili 7. Takav protein može uključivati laki lanac imunoglobulina i teški lanac imunoglobulin, a SEQ ID NO:6 ili 7 može biti nizvodno od C-terminala teškog lanca. SEQ ID NO:6 ili 7 mogu biti nastavljene peptidima koji se vezuju za protein koji se razlikuje od onog koji je vezan teškim i lakim lancem.
[0009] Dalje, ovde je opisan farmaceutski sastav koji se sastoji od bilo kog ovde opisanog bispecifičnog proteina ili proteina koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:6 ili 7 i fiziološki prihvatljive pomoćne supstance (ekscipijensa).
[0010] Takođe je ovde opisana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji polipeptid uključen u jedan od bispecifičnih proteina ili proteina koji sadrže SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7 ovde opisan. Primer nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptid uključen u bispecifični protein uključuju, na primer, SEQ ID NO: 55, 56, 60, 61, 62 i 63, između ostalih. Opisani su vektori koji se sastoje od takvih nukleinskih kiselina i ćelija domaćina koje sadrže takve vektore i/ili nukleinske kiseline. Dalje opisano ovde je metoda za pravljenje bispecifičnog proteina koji se sastoji od kulture ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koji od bispecifičnih proteina opisanih ovde pod uslovima da je nukleinska kiselina eksprimirana i izdvaja protein iz ćelijske mase ili kultivacionog medijuma. Ćelija domaćina može biti ćelija sisara, na primer, ćelija CHO, ili bakterijska ćelija kao što je Escherichia coli.
[0011] U drugom vidu, opisana ovde je metoda za tretiranje sistemskog eritemskog lupusa, uključujući lupus nefritis, koja obuhvata davanje pacijentu terapeutski efikasne količine bilo kog od ovde opisanih bispecifičnih proteina ili farmaceutskog sastava koji sadrži takav bispecifični protein. Pacijentu se može dati drugi terapeutski lek pre, posle ili istovremeno sa bispecifičnim proteinom. Drugi terapeutski lek može biti kortikosteroid, antimalarik, retinoična kiselina, NSAID, ciklofosfamid, dehidroepiandrosteron, mofetilmikofenolat, azatioprin, hlorambucil, metotreksat, takrolimus, dapson, talidomid, leflunomid ili ciklosporin.
[0012] U daljem vidu, ovde je opisana metoda tretiranja koja se sastoji od davanja pacijentu terapeutski efikasne količine bilo kog od ovde opisanih bispecifičnih proteina ili farmaceutskog sastava koji se sastoji od ovde opisanog bispecifičnog proteina, pri čemu pacijent ima bolest izabranu iz grupe koju čine: ANCA-pozitivni vaskulitis, reumatoidni artritis (RA), Kronova bolest, ulcerozni kolitis, celijakija, pemfigus, pemfigoid, subakutni kutani eritemski lupus (SCLE), multipla skleroza, hronična upalna demijelinirajuća polineuropatija (CIDP), miastenija gravis, Gudpasturov sindrom, glomerulonefritis, autoimuna hemolitička anemija (AIHA), idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), aktivni hronični hepatitis, primarna ciroza, Sjogrenov sindrom, hronična skleroza, Hašimoto tireoiditis, Grejvsova bolest, Adisonova bolest i multipla endokrina neoplazija (MEN).
[0013] U drugom vidu, ovde je opisan farmaceutski sastav koji se sastoji od bilo kog od bispecifičnih proteina ili proteina koji sadrže SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7 ovde opisane. Farmaceutski sastav može biti, na primer, za tretiranje sistemskog eritemskog lupusa ili lupus nefritisa.
[0014] U drugom vidu, opisana je upotreba bilo kog od bispecifičnih proteina koji su ovde obelodanjeni kao medikament. Međutim, svako pozivanje na metodu tretiranja koji se primenjuje na ljudskom ili životinjskom telu podrazumeva da se odnosi na supstance i sastave koji se koriste u takvim tretmanima.
KRATAK OPIS SLIKA
[0015]
Slika 1: Dijagrami bispecifičnih proteina koji se vezuju za BAFF i B7RP1. U gornjem redu su navedeni identifikatori za svaki konstrukt. U drugom redu je kratka opisna fraza koja se odnosi na strukturu svakog konstrukta. U donjem redu je dijagram strukture svakog konstrukta. Nepunjene elipse predstavljaju konstantne regione teškog ili lakog lanca imunoglobulina. Elipse popunjene horizontalnim linijama predstavljaju regione sa teškim ili lakim lancem imunoglobulina (VH ili VL). Mali, crni kvadrati i petlje predstavljaju peptide koji vezuju BAFF. Regioni šarke su prikazani kao pune vertikalne linije, dok su disulfidni mostovi prikazani kao pune horizontalne linije. Sekvenca „G4S“ na slici 1 je obelodanjena u SEQ ID NO: 72. Slika 2: Aktivnost bispecifičnih proteina u testu proliferacije humanih B ćelija.
Podaci prikazani na slikama 2A (gore) i 2B (dole) su iz testova proliferacije B ćelija izvedenih kao što je opisano u Primeru 1. U oba panela, x osa označava koncentraciju (log[nM]) bispecifičnog proteina sadržanog u test smeši, a y osa označava apsorpciju<3>H-timidina (broj u minuti (cpm)). Značenje svakog simbola je označeno identifikatorom za svaki testirani protein. Značenja identifikatora prikazana su na Slici 1 i objašnjena na Primeru 1.
Slika 3: Aktivnost bispecifičnih proteina u testu proliferacije humanih T ćelija.
Prikazani podaci su iz testova proliferacije T ćelija izvedenih kao što je opisano u Primeru 1. X osa označava koncentraciju (log[nM]) bispecifičnog ili αB7RP1 antitela u smeši testa, a y osa označava procenat apsorpcije T ćelija<3>H-timidina u prisustvu B7RP1 inhibitora u naznačenim koncentracijama u odnosu na apsorpciju T ćelija<3>H-timidina bez B7RP1 inhibitora (procenat kontrole). Naznačen je identifikator za svaki testirani protein.
Slika 4: Oslobađanje citokina od strane humanih ćelija krajnika stimulisano sa Staphylococcus enterotoksinom B (SEB). Metode su opisane u Primeru 1. Y ose pokazuju nivo signala detektovanih za različite citokine izmerene pomoću kompleta Meso Scale Discovery (Rockville, Maryland) u skladu sa uputstvima proizvođača. Ćelije su tretirane sa ili αB7RP1 (traka 1), P74293 (traka 2), CTLA4-Ig (traka 3) ili humanim IgG (traka 4). Citokini koji su testirani su naznačeni na slici.
Slika 5: Farmakokinetički profil bispecifičnih konstrukata kod miševa. Metode za procenu in vivo farmakokinetičkih svojstava P71617, P71619, P71621, P71622, P74293 i P74294 kod miševa opisane su u Primeru 1. Kao što je objašnjeno u Primeru 1, bispecifični proteini su detektovani pomoću dva različita testa, od kojih je jedan detektovao samo Fc deo proteina (tačke podataka naznačene punim rombovima; Fc test) i jedan koji je detektovao i Fc i BAFF-vezujući deo proteina (tačke podataka naznačene punim kvadratima; intaktni test). Osa x označava vreme nakon injektiranja (časovi), a y osa označava koncentraciju proteina detektovanog u serumu (ng/mL). Ubrizgani konstrukt je naznačen na svakom panelu.
Slika 6A: Inhibicija proliferacije mišjih B ćelija putem bispecifičnog molekula mišjeg surogata ("mišji surogat") koji se vezuje za BAFF i B7RP1. Test je urađen kako je opisano u Primeru 2. Mišji surogat obuhvata anti-mišje B7RP1 IgG antitelo koje ima dve kopije BAFF-vezujućeg peptida prikačenog na C terminus imunoglobulinskog teškog lanca antitela, kao što je objašnjeno u Primeru 2. Pozitivna kontrola je bila BAFF-vezujuće peptitelo ("αBAFF"). Podaci iz mišjeg surogata i αBAFF označeni su punim krugovima i kvadratima. X osa označava koncentraciju ovih test proteina u testu (log[pM]), a y osa označava inkorporaciju<3>H-timidina (cpm).
Slika 6B: Inhibicija vezivanja B7RP1 za mišje T ćelije od strane mišjeg surogata. Test je urađen kako je opisano u Primeru 2. Kao pozitivna kontrola korišćeno je antimišje B7RP1 IgG antitelo ("anti-mB7RP1"). Podaci iz mišjeg surogata i αBAFF označeni su punim krugovima i kvadratima. Osa x označava koncentraciju ovih test proteina u testu (log[pM]), a y osa označava procenat mišjeg B7RP1-Fc vezanog za T ćelije.
Slika 7: In vivo efekti na imunološke parametre primene crvenih krvnih zrnaca ovaca na miševe. Svi rezultati prikazani na ovoj slici su iz testova opisanih u Primeru 2. Proteini kojima su miševi tretirani označeni su ispunom u svakoj traci na sledeći način: nepopunjeni, anti-mB7RP1; vertikalne linije, αBAFF; horizontalne linije, antimB7RP1 plus αBAFF; dijagonalne linije, mišji surogat; šahovska tabla, mlgG1; i ispunjeni (samo u donjem panelu), miševi koji nisu izazvani sa SBRC. Gornji panel, procenat B ćelija slezine kod miševa izazvanih crvenim krvnim zrncima ovaca (SRBC). Y osa označava procenat ćelija iz slezine koje su B ćelije. Srednji panel, procenat CD4<+>T ćelija slezine koje su memorijske T ćelije kod miševa izazvanih sa SRBC. Donji panel, nivoi anti-SRBC antitela u serumu iz miševa izazvanih sa SRBC.
Slika 8A: Proteinurija kod NZB/NZW miševa tretiranih različitim proteinima.
Metode su opisane u Primeru 2. Tretman za svaku grupu miševa je indikovan na sledeći način: popunjeni krugovi, fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS); popunjeni kvadrati, mišji IgG1 (izotip kontrola; 5 mg/kg); nepopunjeni kvadrati, antimB7RP1 (4,68 mg/kg); popunjeni trouglovi prema gore, αBAFF (1,88 mg/kg); nepopunjeni trouglovi prema gore, αBAFF (1,88 mg/kg) plus anti-mB7RP1 (4,68 mg/kg); i nepopunjeni trouglovi prema dole, mišji surogat (5 mg/kg). X osa označava starost miševa (meseci), a y osa označava procenat miševa koji su pokazali proteinuriju, tj. ≥ 300 mb/dL proteina u urinu.
Slika 8B: Nivoi antitela prema dvolančanoj DNK (dsDNA) kod NZB/NZW miševa u starosti od 8,5 meseci tretiranih različitim proteinima. Metode su opisane u Primeru 2. X osa označava identitet molekula kojima su miševi tretirani na sledeći način: 1, antimB7RP1 (4,68 mg/kg); 2, αBAFF (1,88 mg/kg); 3, αBAFF (1,88 mg/kg) plus antimB7RP1 (4,68 mg/kg); 4, mišji surogat bispecifični (5 mg/kg); i 5, mlgG1 (izotip
1
kontrola; 5 mg/kg). Y osa pokazuje nivoe anti-dsDNK antitela detektovanih kao procenat pozitivne kontrole. Svaka tačka označava podatke iz jednog miša.
Slika 9A: Nivoi anti-dsDNK IgG u NZB/NZW miševima. Metode su opisane u Primeru 2. Podaci iz različitih grupa miševa identifikovani su na sledeći način: 1, miševi koji su primili anti-mB7RP1 (14 mg/kg); 2, miševi koji su primili αBAFF (5,6 mg/kg); 3, miševi koji su primili kombinaciju antimB7RP1 (14 mg/kg) i αBAFF (5,6 mg/kg); 4, miševi koji su primili mišji surogat (15 mg/kg); 5, miševi koji su primili izotip kontrolu mlgG (15 mg/kg); i 6, miševi koji su primili PBS. Zvezdice iznad traka 1, 3 i 4 ukazuju na značajnu (*, p<0,05; * **, p<0,0001) razliku između podataka u tim trakama i podataka iz trake 5 (mlgG).
Slika 9B: Procenti NZB/W F1miševa u svakoj grupi koji imaju proteinuriju. Metode su opisane u Primeru 2. Podaci iz različitih grupa miševa identifikovani su na sledeći način: nepopunjeni kvadrati, miševi koji su primili anti-mB7RP1 (14 mg/kg); ispunjeni trouglovi prema gore, miševi koji su primili αBAFF (5,6 mg/kg); nepopunjeni trouglovi prema gore, miševi koji su primili kombinaciju anti-mB7RP1 (14 mg/kg) i αBAFF (5,6 mg/kg); nepopunjeni trouglovi prema dole, miševi koji su primili mišji surogat (15 mg/kg); popunjeni kvadrati, miševi koji su primili izotip kontrolu mlgG (15 mg/kg); i popunjeni krugovi, miševi koji su primili PBS.
Detektovane su značajne razlike između mišjeg surogata u odnosu na anti-mB7RP1 (p<0,01), αBAFF (p<0,0001) i mlgG (p<0,0001). Naznačen je vremenski okvir u kome je došlo do tretiranja.
Slika 10: Bodovi bubrega NZB/W F1miševa. Kao što je objašnjeno u Primeru 2, bubrezi su uzeti kada je miš uginuo, ako se to desilo pre kraja ispitivanja ili na kraju ispitivanja. Bodovi bubrega su utvrđeni kao što je opisano u Primeru 2, sa većim bodovima koji ukazuju na težu bolest bubrega. Prikazane su prosečne vrednosti za svaku grupu miševa plus odgovarajuće trake grešaka. Grupe miševa su primile sledeće tretmane: 1) anti-mB7RP1 (14 mg/kg), traka ispunjena vertikalnim linijama; 2) αBAFF (5,6 mg/kg), traka ispunjena horizontalnim linijama; 3) kombinacija antimB7RP1 (14 mg/kg) i αBAFF (5,6 mg/kg), traka ispunjena rešetkama; 4) mišji surogat (15 mg/kg), traka ispunjena šahovskim šablonom; 5) mlgG (15 mg/kg), traka ispunjena belim tačkama na crnoj pozadini; i 6) PBS, puna traka. Zvezdice ukazuju na značajnu razliku u odnosu na miševe tretirane mlgG sa p vrednostima <0,05 (*) ili <0,001 (***).
Slika 11: Efekti inhibicije BAFF i/ili B7RP1 na mišji artritis izazvan kolagenom. Metode su opisane u Primeru 4. Pet grupa miševa tretirano je ispitivanim supstancama na sledeći način: mlgG, popunjeni kvadrati povezani punim linijama; PBS, popunjeni kvadrati povezani isprekidanim linijama; anti-mB7RP1, ispunjeni krugovi povezani isprekidanim linijama; α\BAFF, otvoreni krugovi povezani punim linijama; i kombinacija anti-mB7RP1 i αBAFF, ispunjeni krugovi povezani punim linijama. Gornji panel pokazuje procenat incidencije artritisa u različitim grupama, a donji panel pokazuje prosečne bodove artritisa u grupama. Vertikalna strelica koja pokazuje na dole na svakom panelu ukazuje na vreme druge imunizacije goveđim kolagenom.
KRATAK OPIS SPISKA SEKVENCI
[0016]
1
1
DЕТАLJNI ОPIS
[0017] Ovde obelodanjeni su bispecifični proteini koji se vezuju za i inhibiraju faktor aktivacije B ćelija (BAFF; takođe poznat kao BLYS, TALL1, THANK ili TNFSF13B) i protein 1 srodan B7 (B7RP1; takođe poznat kao ICOS Ligand, ICOSL, LICOS, B7 Homolog 2, B7H2 i GL50), nukleinske kiseline koje kodiraju ove bispecifične proteine i metode pravljenja i upotrebe ovih proteina. Bispecifični proteini mogu inhibirati i proliferaciju B ćelija posredovanu BAFF-om i proliferaciju T ćelija posredovanu B7RP1-om. U drugom vidu, bispecifični proteini mogu inhibirati vezivanje B7RP1 za T ćelije. Takav bispecifični protein može biti IgG antitelo koje se sastoji od dva različita imunoglobulinska teška lanca i dva različita imunoglobulinska laka lanca, gde se jedan par teški lanac/laki lanac veže za BAFF, a drugi veže za B7RP1. Alternativno, B7RP1-vezujući deo bispecifičnog proteina može da sadrži IgG antitelo, uključujući dva identična teška lanca i dva identična laka lanca, a BAFF-vezujući deo bispecifičnog proteina može da sadrži jedan ili više BAFF-vezujućih peptida, koji se mogu fuzionisati sa anti-B7RP1 antitelom, opciono preko N-terminusa teškog ili lakog lanca imunoglobulina, karboksi-terminusa teškog lanca imunoglobulina i/ili unutar CH2 i/ili CH3 regiona teškog lanca imunoglobulina.
Definicije
[0018] "Antitelo", kao što se ovde misli, je protein koji se sastoji od varijabilnog regiona teškog i/ili lakog lanca imunoglobulina.
[0019] "Bispecifični" protein, kao što se ovde misli, je protein koji se može vezati specifično za dva različita molekula, koji mogu biti proteini; na primer, bispecifični protein koji se može vezati i za BAFF i za B7RP1.
[0020] Pacijent prima "istovremeni" tretman sa dva ili više terapeutika kada pacijent prima dve ili više terapija u istom opštem vremenskom periodu, opciono u isto vreme. Na primer, ako se pacijentu daje jedna terapijska doza dnevno u kontinuitetu, a takođe se daje i druga terapijska doza jednom mesečno u kontinuitetu, pacijent bi istovremeno primao ova dva leka. Slično tome, pacijent kome su dozirane dve različite terapije, od kojih se svaka daje svake
1
dve nedelje, ali ne istog dana, primao bi istovremeni tretman sa ta dva leka. Dalje, pacijent koji prima jednu terapiju kontinuirano jednom nedeljno i drugu terapiju jednom dnevno tokom samo tri dana, primao bi terapiju u kratkom vremenskom periodu sa ova dva terapijska leka.
[0021] Kao što se ovde misli, "Fc region" je dimer koji se sastoji od dva polipeptidna lanca spojena jednom ili više disulfidnih veza, od kojih svaki lanac sadrži deo ili ceo domen šarke plus CH2 i CH3 domen. Svaki od polipeptidnih lanaca se naziva "Fc polipeptidni lanac".
Preciznije, Fc regioni koji se razmatraju za upotrebu sa sadašnjim pronalaskom su IgG Fc regioni, koji mogu biti sisarski, na primer humani, IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc regioni. Među humanim IgG1 Fc regionima poznata su najmanje dva alelna tipa. Aminokiselinske sekvence Fc polipeptidnog lanca mogu se razlikovati od onih sisarskog Fc polipeptida za ne više od 20, 15, 12, 10, 8, 5 ili 3 supstitucija, insercija ili delecija jedne aminokiseline u odnosu na aminokiselinsku sekvencu Fc polipeptida kod sisara. Alternativno ili dodatno, aminokiselinska sekvenca Fc polipeptidnog lanca može se razlikovati od sekvence poznatog ili prirodno prisutnog Fc polipeptidnog lanca za ne više od 10 insercija, delecija ili supstitucija jedne aminokiseline na svakih 100 aminokiselina sekvence. Takve varijacije mogu biti "heterodimerizujuće izmene" koje olakšavaju formiranje heterodimera preko homodimera. U vezi sa određenim pozicijama unutar Fc polipeptidnog lanca, sistem numeracije EU (Edelman et al (1969), Proc. Natl. Acad. Sci.63: 78-85) se koristi, kao što je prikazano u poravnanju humanih IgG Fc polipeptidnih lanaca u Tabeli 1 ispod.
Tabela 1: Poravnanje aminokiselinskih sekvenci Fc regiona humanog IgG
1
1
[0022] Na nekim pozicijama mogu se javiti prirodno prisutni polimorfizmi. Na primer, metionin na poziciji 282 u sekvenci IgG2 datoj prethodno je tipičnije valin u prirodno prisutnim sekvencama IgG2. Slično tome, tirozin na poziciji 296 u IgG3 sekvenci takođe može biti fenilalanin.
[0023] "Heterodimerizujuće izmene" se generalno odnose na izmene u CH3 regionima dva različita IgG teška lanca koja olakšavaju formiranje dimera heterodimernog teškog lanca, odnosno dimerizovanih teških lanaca koji nemaju identične aminokiselinske sekvence.
Heterodimerizujuće izmene mogu biti asimetrične, odnosno, jedan teški lanac koji ima određenu izmenu može se upariti sa drugim teškim lancem koji ima drugačiju izmenu. Ove izmene olakšavaju heterodimerizaciju i defavorizuju homodimerizaciju. Jedan primer takvih uparenih heterodimerizujućih izmena su takozvane supstitucije "ispupčenja i udubljenja". Vidi, npr., SAD Patent 7,695,936 i SAD Patentnu prijavu 2003/0078385. Kao što se ovde misli, par teški lanac-teški lanac koji sadrži jedan par supstitucija "ispupčenja i udubljenja", sadrži jednu supstituciju u jednom teškom lancu i drugu supstituciju u drugom teškom lancu. Na primer, utvrđeno je da sledeće supstitucije "ispupčenja i udubljenja" povećavaju formiranje heterodimera u poređenju sa onom koja je nađena sa nemodifikovanim teškim lancima: 1) Y407T u jednom lancu i T366Y u drugom; 2) Y407A u jednom lancu i T366W u drugom; 3) F405A u jednom lancu i T394W u drugom; 4) F405W u jednom lancu i T394S u drugom; 5) Y407T u jednom lancu i T366Y u drugom; 6) T366Y i F405A u jednom lancu i T394W i Y407T u drugom; 7) T366W i F405W u jednom lancu i T394S i Y407A u drugom; 8) F405W i Y407A u jednom lancu i T366W i T394S u drugom; i 9) T366W u jednom polipeptidu Fc i T366C, L366C i Y407V u drugom. Kao što se ovde misli, mutacije u Fc polipeptida su označene na sledeći način. Aminokiselina (koristeći jednoslovnu šifru) koja je normalno prisutna na određenoj poziciji u CH3 regionu koristeći sistem numeracije EU (koji je predstavljen u Edelman et al (1969), Proc. Natl. Acad. Sci.63: 78-85) praćena je EU brojem pozicije, nakon čega sledi alternativna aminokiselina koja je prisutna na toj poziciji.
1
Na primer, Y407T znači da je tirozin koji je obično prisutan na poziciji EU 407 zamenjen treoninom. Radi jasnoće, sistem numerisanja u EU prikazan je u Tabeli 1 u nastavku.
Alternativno ili pored takvih izmena, supstitucije koje stvaraju nove disulfidne mostove mogu olakšati formiranje heterodimera. Vidi, npr., SAD patentnu prijavu 2003/0078385. Takve izmene u IgG1 Fc regionu uključuju, na primer, sledeće supstitucije: Y349C u jednom Fcpolipeptidnom lancu i S354C u drugom; Y349C u jednom Fc-polipeptidnom lancu i E356C u drugom; Y349C u jednom Fc-polipeptidnom lancu i E357C u drugom; L351C u jednom Fcpolipeptidnom lancu i S354C u drugom; T394C u jednom Fc-polipeptidnom lancu i E397C u drugom; ili D399C u jednom Fc-polipeptidnom lancu i K392C u drugom. Slično tome, supstitucije koje menjaju naelektrisanje jednog ili više ostataka, na primer, u CH3-CH3 graničnoj površini, mogu poboljšati formiranje heterodimera kao što je objašnjeno u WO 2009/089004. Takve supstitucije se ovde nazivaju "supstitucije naelektrisanih parova", a Fc region koji sadrži jedan par supstitucije naelektrisanih parova sadrži jednu supstituciju u jednom teškom lancu i različitu supstituciju u drugom. Opšti primeri supstitucije naelektrisanih parova uključuju sledeće: 1) R409D, R409E, K409D ili K409E u jednom lancu plus D399K ili D399R u drugom; 2) N392D, N392E, K392D ili K392E u jednom lancu plus D399K ili D399R u drugom; 3) K439D ili K439E u jednom lancu plus E356K, E356R, D356K ili D356R u drugom; i 4) K370D ili K370E u jednom lancu plus E357K ili E357R u drugom. Pored toga, supstitucije Q355D, Q355E, R355D, R355E, K360D ili K360R u oba lanca mogu stabilizovati heterodimere kada se koriste sa drugim heterodimerizacionim izmenama. Specifične supstitucije naelektrisanih parova mogu se koristiti samostalno ili sa drugim supstitucijama naelektrisanih parova. Specifični primeri pojedinačnih parova supstitucija naelektrisanih parova i njihovih kombinacija uključuju sledeće: 1) K409E u jednom lancu plus D399K u drugom; 2) K409E u jednom lancu plus D399R u drugom; 3) K409D u jednom lancu plus D399K u drugom; 4) K409D u jednom lancu plus D399R u drugom; 5) K392E u jednom lancu plus D399R u drugom; 6) K392E u jednom lancu plus D399K u drugom; 7) K392D u jednom lancu plus D399R u drugom; 8) K392D u jednom lancu plus D399K u drugom; 9) K409D i K360D u jednom lancu plus D399K i E356K u drugom; 10) K409D i K370D u jednom lancu plus D399K i E357K u drugom; 11) K409D i K392D u jednom lancu plus D399K, E356K i E357K u drugom; 12) K409D i K392D u jednom lancu i D399K u drugom; 13) K409D i K392D na jednom lancu plus D399K i E356K u drugom; 14) K409D i K392D na jednom lancu plus D399K i D357K na drugom; 15) K409D i K370D na jednom lancu plus D399K i D357K na drugom; 16) D399K na jednom lancu plus K409D i K360D na drugom; i 17) K409D i K439D na jednom lancu plus D399K i
2
E356K na drugom. Svaka od ovih heterodimerizujućih izmena može biti deo imunoglobulin IgG teškog lanca kao što je opisano ovde.
[0024] "Humano" antitelo ili protein, kako se ovde misli, je antitelo ili protein koji kodira sekvenca nukleinske kiseline humanog porekla. Humano antitelo ili protein može biti napravljen u kultivisanim ne-humanim ćelijama ili in vivo u transgenom organizmu u koji je unet molekul nukleinske kiseline koja kodira humano antitelo ili protein. Alternativno, humano antitelo ili protein mogu se napraviti u kultivisanim humanim ćelijama ili u ljudskom organizmu in vivo.
[0025] "IgG antitelo", kao što je ovde navedeno, je antitelo koje se sastoji u suštini od imunoglobulinskih domena prisutnih u većini prirodno prisutnih IgG antitela, tj., teškom lancu imunoglobulina koji sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca, prvi konstantni region teškog lanca (CH1), region šarke, drugi konstantni region teškog lanca (CH2), i treći konstantni region teškog lanca (CH3) i laki lanac koji se sastoji od varijabilnog regiona (VL) lakog lanca i konstantnog regiona (CL) lakog lanca. Brojne sekvence takvih imunoglobulinskih domena su prijavljene u celoj naučnoj literaturi, npr. u SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service, N.I.H., Bethesda, MD, 1991. IgG antitelo, kao što se ovde misli, je tetramer koji se sastoji u osnovi od dva teška lanca i dva laka lanca. Prirodno prisutna antitela uključujući samo dva teška lanca imunoglobulina i bez lakih lanaca imunoglobulina, kao što su neki nađeni u kamilama i ajkulama (vidi, npr.
Muyldermans et al., 2001, J. Biotechnol.74:277-302; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem.
276:26285-90; Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909), nisu "IgG antitela" kao što se ovde misli. IgG antitelo može biti humano ili može biti od druge vrste. Pored toga, IgG antitelo može da sadrži ne više od 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ili 5 supstitucija, insercija i/ili delecija jedne aminokiseline u odnosu na aminokiselinsku sekvencu teških ili lakih lanaca prirodno prisutnog IgG antitela.
[0026] "Teški lanac imunoglobulina" se odnosi na teški lanac IgG, IgA, IgM, IgE ili IgD antitela ili njihovih varijanti koji sadrži ne više od 40, 30, 25, 20, 15, 10 ili 5 insercija, delecija ili supstitucija jedne aminokiseline u odnosu na teški lanac imunoglobulina koji kodiraju sekvence nukleinske kiseline poreklom iz prirode. "Teški lanac imunoglobulina IgG " je ograničen na teške lance iz IgG antitela ili njihove varijante koje sadrže ne više od 40, 30, 25, 20, 15, 10 ili 5 insercija, delecija ili supstitucija jedne aminokiseline u odnosu na aminokiselinsku sekvencu IgG teškog lanca koji kodiraju sekvence nukleinske kiseline poreklom iz prirode. Teški lanac imunoglobulina sastoji se u osnovi od niza različitih regiona ili domena, uključujući VH region, CH1 region, region šarke, CH2 region i CH3 region. Kod nekih drugih izotipova, odnosno, IgM i IgA, dodatni regioni su uključeni nizvodno od CH3 regiona. Teški lanci imunoglobulina i regioni uključeni u njih su generalno opisani u, npr., Carayannopoulos i Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp.283-314 u FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3rd Ed., Paul, ed., Raven Press, New York, 1993. Pored toga, u stanju tehnike su poznate brojne sekvence podregija teških lanaca imunoglobulina. Vidi, npr. Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991. U nekim slučajevima, polipeptidni lanac koji uključuje teški lanac imunoglobulina plus neke ne-imunoglobulinske sekvence će se ovde nazivati "teški lanac".
[0027] "Laki lanac imunoglobulina", kako se ovde misli, je kapa ili lambda lanac iz humanog antitela ili antitela druge vrste. Takođe, među lakim lancima imunoglobulina, kao što se ovde podrazumeva, nalaze se proteini sa ne više od 20, 15, 10 ili 5 insercija, delecija i/ili supstitucija jedne aminokiseline u odnosu na laki lanac imunoglobulina koji kodiraju sekvence nukleinske kiseline prirodnog porekla. Laki lanci imunoglobulina su generalno opisani u, npr., Carayannopoulos and Capra, Immunoglobulini: Immunoglobulins: Structure and Function, pp.283-314 in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3rd Ed, Paul, ed., Raven Press, New York, 1993. Laki lanac imunoglobulina sadrži VL region i CL region. U stanju tehnike su poznate brojne sekvence ovih regiona. Vidi, npr. Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991. U nekim slučajevima, polipeptidni lanac koji uključuje laki lanac imunoglobulina plus neke ne-imunoglobulinske sekvence će se ovde nazivati "laki lanac".
[0028] „Varijabilni region imunoglobulina“, kao što se ovde misli, je VH ili VL region, koji može biti humanog porekla ili od druge vrste. Varijabilni regioni imunoglobulina su generalno opisani u, npr., Carayannopoulos and Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp.283-314 in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3rd Ed, Paul, ed., Raven Press, New York, 1993. Takođe, među varijabilnim regionima imunoglobulina, kao što se ovde podrazumeva, nalaze se proteini sa ne više od 20, 15, 10 ili 5 insercija, delecija i/ili supstitucija jedne aminokiseline u odnosu na varijabilni region imunoglobulina koji kodiraju sekvence nukleinske kiseline prirodnog porekla. Imunoglobulinski varijabilni region sadrži tri hipervarijabilna regiona, poznata kao region koji određuje komplementarnost 1 (CDR1), region koji određuje komplementarnost 2 (CDR2) i region koji određuje komplementarnost 3 (CDR3). Ovi regioni formiraju mesto vezivanja antigena antitela. CDRi su ugrađeni u manje varijabilne okvirne regione (FR1-FR4). Redosled ovih podregiona unutar varijabilnog regiona je sledeći: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. U stanju tehnike su poznate brojne sekvence varijabilnih regiona imunoglobulina. Vidi, npr. Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991.
[0029] CDRi se mogu nalaziti u sekvenci VH regiona na sledeći način. CDR1 počinje na približno ostatku 31 zrelog VH regiona i obično je dugačak oko 5-7 aminokiselina, a skoro uvek mu prethodi Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx (SEQ ID NO: 20) (gde je "Xxx" bilo koja aminokiselina). Ostatak koji prati CDR1 teškog lanca je skoro uvek triptofan, često Trp-Val, Trp-Ile ili Trp-Ala. Četrnaest aminokiselina je skoro uvek između poslednjeg ostatka u CDR1 i prvog u CDR2, a CDR2 obično sadrži 16 do 19 aminokiselina. CDR2-u može neposredno da prethodi Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 21) i može neposredno da sledi Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Druge aminokiseline mogu prethoditi ili slediti CDR2. Trideset dve aminokiseline su skoro uvek između poslednjeg ostatka u CDR2 i prvog u CDR3, a CDR3 može biti dugačak oko 3 do 25 ostataka. Cys-Xxx-Xxx gotovo uvek neposredno prethodi CDR3, a Trp-Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: 22) gotovo uvek prati CDR3.
[0030] CDRi lakog lanca mogu se nalaziti u VL regionu na sledeći način. CDR1 počinje pri približno ostatku 24 zrelog antitela i obično je dugačak oko 10 do 17 ostataka. Skoro uvek mu prethodi Cys. Skoro uvek postoji 15 aminokiselina između poslednjeg ostatka CDR1 i prvog ostatka CDR2, a CDR2 je skoro uvek dugačak 7 ostataka. CDR2-u obično prethode Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys ili Ile-Phe. Između CDR2 i CDR3 gotovo uvek postoje 32 ostatka, a CDR3 je obično dugačak oko 7 do 10 aminokiselina. Cys skoro uvek prethodi CDR3 i obično sledi Phe-Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: 23).
[0031] "Linker", kako se ovde misli, je peptid koji povezuje dva polipeptida. Linker može biti dugačak 1-80 aminokiselina. Linker može biti dug 2-40, 3-30 ili 3-20 aminokiselina. Linker može biti peptid ne duži od 14,13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselina. Linker može biti dug 5-25, 5-15, 10-20 ili 20-30 aminokiselina. Linker može biti dugačak oko 2, 3,
2
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 aminokiselina. U mnogim slučajevima, linkerima nedostaju slobodni ostaci cisteina (tj. i stoga nisu uključeni u disulfidne veze) i takođe ne sadrže mesta N-glikozilacije (odnosno Asn - Xxx - Ser/Thr, gde X može biti bilo koja aminokiselina osim prolina).
[0032] "Peptitelo", kako se ovde misli, je jedan ili više biološki aktivnih peptida fuzionisanih u Fc region. Shimamoto et al. (2012), mAbs 4(5): 586-591.
[0033] "Peptid", kako se ovde misli, je polipeptid koji se sastoji od kratke aminokiselinske sekvence, koja može ili ne mora biti glikozilirana i/ili sadržati modifikovane aminokiseline. Peptid može biti dugačak od 2 do 75 aminokiselina; npr. 3-60, 3-50, 3-40, 3-30, ili 3-20 aminokiselina. Peptid može biti dug 5-25, 5-15, 10-20 ili 20-30 aminokiselina. Peptid može biti dugačak oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 aminokiselina.
[0034] "Terapeutski efikasna količina" leka koji se koristi za tretiranje bolesti je količina koja može smanjiti težinu bolesti, smanjiti težinu jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili njenim tretmanom, ili odložiti nastanak ozbiljnijih simptoma ili ozbiljnije bolesti koja se može pojaviti sa određenom učestalošću nakon tretiranog stanja.
[0035] "Tretman" bilo koje bolesti pomenute ovde obuhvata ublažavanje najmanje jednog simptoma bolesti, smanjenje težine bolesti ili odlaganje ili sprečavanje progresije bolesti do ozbiljnijih simptoma koji u nekim slučajevima mogu pratiti bolest ili dovesti do najmanje još jedne bolesti. Tretman ne mora da znači da je bolest potpuno izlečena. Korisni terapeutski agens treba samo da smanji težinu bolesti, smanji težinu jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili njenim tretmanom, ili odloži pojavu težih simptoma ili teže bolesti koje se mogu javiti sa određenom učestalošću nakon tretiranog stanja. Na primer, ako je bolest zapaljenska bolest creva, terapeutski agens koji se koristi kao terapija može smanjiti broj različitih mesta zapaljenja u crevima ili ukupan obim pogođenog creva. Može smanjiti bol i/ili oticanje, smanjiti simptome kao što su dijareja, konstipacija ili povraćanje i/ili sprečiti perforaciju creva. Stanje pacijenta se može proceniti standardnim tehnikama kao što je rendgenski snimak koji se obavlja nakon barijum klistira ili enteroklize, endoskopije, kolonoskopije i/ili biopsije. Odgovarajuće procedure variraju u zavisnosti od stanja pacijenta i simptoma. Slično tome, ako bi se bolest tretirala sistemskim eritematskim lupusom (SLE), aktivnost bolesti bi se mogla proceniti korišćenjem SLEDAI indeksa za bodovanje, kao što je objašnjeno u nastavku.
Bispecifični proteini koji se vezuju za BAFF i B7RP1
[0036] Ovde obelodanjeni su bispecifični proteini koji se vezuju za B7RP1 i BAFF i/ili koji mogu inhibirati B7RP1-posredovanu proliferaciju T ćelija i BAFF-posredovanu proliferaciju B ćelija in vitro. BAFF i B7RP1 proteini za koje se vezuje bispecifični protein opisan u ovom dokumentu mogu biti humani proteini i/ili proteini iz drugih vrsta kao što su majmun javanski makaki, majmun rezus, šimpanza, miš i/ili zec, između ostalog. Bispecifični protein kao što je opisano ovde može, na primer, da se veže i za humane (Homo sapiens) i za majmunske (Macaca fascicuiaris) proteine B7RP1 i BAFF.
[0037] Ovi bispecifični proteini mogu biti bispecifična IgG antitela u kojima se B7RP1-vezujući deo i BAFF-vezujući deo u suštini sastoje od teškog lanca IgG imunoglobulina i lakog lanca imunoglobulina. Dakle, takvo bispecifično antitelo sadrži dva različita teška imunoglobulinska lanca i dva različita laka imunoglobulinska lanca. Zajedno, ova dva para teških i lakih lanaca imunoglobulina formiraju kompletno bispecifično IgG antitelo.
Bispecifična IgG antitela su poznata u stanju tehnike, a takođe su poznati i brojni drugi formati za bispecifična antitela. Vidi, npr., Kontermann, Bispecific Antibodies:
Developments and Current Perspectives, pp.1-28 in BISPECIFIC ANTIBODIES, Kontermann, ed., Springer-Verlag, Berlin, Heidelburg, 2011. Antitela koja se mogu vezati za BAFF i B7RP1, bez obzira na format, razmatraju se ovde. Bispecifična IgG antitela mogu biti humana, humanizovana ili himerna i mogu biti IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa.
Bispecifična IgG antitela obelodanjena ovde mogu biti konjugovana sa drugim delovima. U stanju tehnike su poznate aminokiselinske sekvence anti-BAFF i anti-B7RP1 antitela. Vidi npr., SAD Patent 7,737,111 i SAD Patentnu prijavu US 2011/0117093. Takva bispecifična antitela se mogu sastojati od "heterodimerizujućih izmena", kao što je prethodno definisano, uključujući supstitucije naelektrisanih parova, koje olakšavaju formiranje heterotetramernog bispecifičnog IgG antitela.
[0038] Ovde opisani bispecifični proteini mogu biti fuzioni proteini koji se sastoje od antitela koje se vezuje za B7RP1, koje se sastoji od teškog lanca imunoglobulina IgG i lakog lanca imunoglobulina, i peptida koji se vezuje za BAFF. BAFF-vezujući peptid može biti prisutan u jednom ili više kopija, kao što su dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili do 16 kopija.
2
BAFF-vezujući peptid se može vezati za BAFF proteine iz vrsta kao što su miš, javanski makaki majmun i/ili ljudi, između mnogih drugih mogućih vrsta. Antitelo može biti anti-B7RP1 IgG antitelo, opciono humano ili humanizovano antitelo koje se vezuje za humani B7RP1 i/ili javanskog makaki majmuna. U nekim otelotvorenjima, linker se može priključiti na C terminus teškog lanca anti-B7RP1 IgG antitela, nakon čega sledi prvi BAFF-vezujući peptid, drugi linker, i drugi BAFF-vezujući peptid. Treći, četvrti, peti, šesti, sedmi, osmi, ili do šesnaestog BAFF-vezujućeg peptida može da prati ovo dvoje, opciono isprepleteno sa linkerima. Alternativno ili dodatno, jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam BAFF-vezujućih peptida mogu se insertovati drugde u anti-B7RP1 antitelu, na primer u N terminus teškog lanca imunoglobulina ili lakog lanca imunoglobulina ili u region petlje u CH2 ili CH3 regionu. IgG antitelo može biti antitelo sisara, kao što je humano ili mišje antitelo. Anti-B7RP1 antitelo može biti himano ili humanizovano IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo. U takvim bispecifičnim fuzionim proteinima koji se sastoje od anti-B7RP1 IgG antitela, bispecifični protein može da sadrži teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:17 ili SEQ ID NO:18 i imunoglobulinskog lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:19. Razmotrene su varijante koje se sastoje od teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom koja ne sadrži više od 30, 25, 20, 15, 10, 5 ili 3 insercija, delecija ili supstitucija jedne aminokiseline u odnosu na SEQ ID NO: 17 ili 18. Slično tome, razmatraju se varijante koje se sastoje od lakog lanca imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ne sadrži više od 20, 15, 10, 8, 7, 5 ili 3 insercija, delecija ili supstitucija jedne aminokiseline u odnosu na SEQ ID NO:19. Takvi bispecifični proteini mogu biti tetrameri koji se sastoje od dva polipeptida koji se sastoje od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:17 ili 18 ili njihove varijante i dva laka lanca koji se sastoje od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:19 ili njene varijante.
[0039] Peptidni deo bispecifičnog fuzionog proteina, koji vezuje BAFF, kao što je gore opisano, može se sastojati od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3. Takvi BAFF-vezujući peptidi su opisani u SAD patentu 7,737,111. Može postojati jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest ili šesnaest kopija takvog BAFF-vezujućeg peptida prisutnog u bispecifičnom proteinu. BAFF-vezujući peptid se može pričvrstiti na karboksi kraj anti-B7RP1 antitela, na primer, preko linkera. Na primer, karboksi kraj anti-B7RP1 IgG antitela može biti praćen linkerom koji ima, na primer, aminokiselinsku sekvencu Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:4). Primeri drugih pogodnih linkera uključuju Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-
2
Gly-Ser (SEQ ID NO:37), Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO:38), Gly-Gly-Gly-Gln (SEQ ID NO:39) i Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:40), između mnogih drugih. Ovaj linker može pratiti BAFF-vezujući peptid. BAFF-vezujući peptid može pratiti drugi linker koji se sastoji, na primer, od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:5, SEQ ID:6, SEQ ID NO:7 ili SEQ ID NO:24. Može se koristiti i drugi linker. Ovaj linker može pratiti drugi BAFF-vezujući peptid koji se sastoji, na primer, od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1.
[0040] U bispecifičnim fuzionim proteinima opisanim neposredno prethodno ili u prethodno opisanim bispecifičnim heterotetramernim IgG antitelima, VL region može da sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona mogu da sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 i SEQ ID NO:13. VL region IgG antitela obelodanjenog ovde može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14 ili njenu varijantu, istog, a VH region može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15 ili njenu varijantu. Takve varijantne sekvence mogu da obuhvate ne više od 10 delecija, insercija ili supstitucija jedne aminokiseline na 100 aminokiselina u odnosu na referentnu sekvencu.
Proteini koji sadrže linker
[0041] Ovde obelodanjeni su linkeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:5, 6 ili 7 koje daju povoljna fizička svojstva proteinu koji ih sadrži. Kao što je prikazano u Primeru 1 u nastavku, upotreba dva određena linkera, tj., onih koji imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:7, imala je pozitivne efekte na svojstva kao što su ekspresija, stabilnost i viskozitet bispecifičnog molekula. Dakle, raznovrsni proteini koji sadrže ove linkere mogu imati takva povoljna svojstva u poređenju sa sličnim proteinima koji sadrže druge linkere.
Terapijska primena bispecifičnih proteina
[0042] Bispecifični proteini koji se vezuju za BAFF i B7RP1 opisani u ovom dokumentu mogu se koristiti kao terapija za različite indikacije, posebno za stanja koja pokreću autoantitela i/ili stanja u kojima posreduju i T ćelije i B ćelije. Takva stanja uključuju, na primer, SLE, lupus, nefritis, ANCA-pozitivni vaskulitis, reumatoidni artritis (RA), dermatomiozitis, polimiozitis, gastrointestinalne bolesti kao što su Kronova bolest, ulcerozni kolitis i celijakija, kožna stanja kao što su pemfigus, pemfigoid i subakutni kožni eritematski lupus (SCLE), bolesti nervnog sistema kao što su multipla skleroza i hronična inflamatorna
2
demijelinizirajuća polineuropatija (CIDP), neuromuskularne bolesti kao što su mijastenija gravis, bolesti koje obuhvataju bubrege, Goodpasture-ov sindrom i glomerulonefritis, hematološka stanja kao što su autoimuna hemolitička anemija (AIHA), idiopatska trombocitopenijska purpura (ITP), i autoimuna neutropenija, stanja jetre kao što su hronični aktivni hepatitis i primarna bilijarna ciroza, Sjogren-ov sindrom, sistemska skleroza, i endokrina stanja uključujući Hašimotov tiroiditis, Graveova bolest, Adisonova bolest i poliendokrinopatije (obično uključujući dijabetes, hipotireozu, Adisonovu bolest i hipogonadizam). Terapeutski efikasna količina bispecifičnog proteina kao što je opisano u ovom dokumentu može se primeniti pacijentu koji boluje od bilo kog od ovih stanja za tretiranje ovog stanja.
[0043] Bispecifični protein koji može da inhibira proliferaciju B ćelija posredovanu BAFF-om i proliferaciju T ćelija posredovanu B7RP1-om, obelodanjen ovde može se koristiti za tretiranje pacijenta koji boluje od SLE. SLE je autoimuna bolest nepoznate etiologije obeležena autoreaktivnošću na nuklearne sopstvene antigene. Njene kliničke manifestacije su toliko raznolike da je upitno da li se zaista radi o jednoj bolesti ili grupi srodnih stanja. Kotzin (1996) Systemic lupus erythematosus. Cell 85: 303-306; Rahman and Isenberg (2008), Systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med.358: 929-939. Simptomi mogu uključivati sledeće: konstitutivni simptomi kao što su malaksalost, umor, groznica, anoreksija i gubitak težine; raznovrsni simptomi kože uključujući akutne, prolazne osipe lica kod odraslih, bulozne bolesti i hronični i distorzivni osip glave i vrata; artritis; bol u mišićima i/ili slabost; kardiovaskularne simptome kao što su zadebljanje mitralnih zalistaka, vegetacija, regurgitacija, stenoza, perikarditis i ishemijska bolest srca, od kojih neki mogu kulminirati moždanim udarom, embolijskom bolešću, zatajenjem srca, infektivnim endokarditisom ili zatajenjem zalistaka; nefritis, koji je glavni uzrok morbiditeta u SLE; neurološke simptome uključujući kognitivne disfunkcije, depresiju, psihozu, komu, poremećaje napadaja, migrene i druge glavobolje, aseptični meningitis, horeja, moždani udar, i kranijalne neuropatije; hemotološke simptome uključujući leukopeniju, trombocitopeniju, serozitis, anemiju, abnormalnosti koagulacije, splenomegaliju i limfadenopatiju i razne gastrointestinalne poremećaje; Id; Vratsanos et al., "Systemic Lupus Erythematosus," Chapter 39 in Samter's Immunological Diseases, 6th Edition, Austen et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Phiiladelphia, PA, 2001. Težina simptoma varira u velikoj meri, kao i tok bolesti. SLE može biti smrtonosan.
2
[0044] Pacijent sa SLE može se tretirati bispecifičnim proteinom koji inhibira BAFF i B7RP1 pre, posle ili istovremeno sa tretiranjem koristeći postojeću terapiju za SLE. Takve postojeće terapije za SLE uključuju kortikosteroide kao što su prednizon, prednizolon i metilprednizolon, antimalarike kao što su hidroksihlorokin, kvinakrin i hlorokin, retinoinska kiselina, aspirin i drugi nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAID), ciklofosfamid, dehidroepiandrosteron, mofetilmikofenolat, azatioprin, hlorambucil, metotreksat, takrolimus, dapson, talidomid, leflunomid, ciklosporin, belimumab, anti-CD20 antitela kao što je rituksimab i fuzioni proteini kao što je abatacept.
[0045] Aktivnost bolesti kod bolesnika sa SLE može se oceniti pomoću instrumenta kao što je Indeks aktivnosti sistemskog Lupus Erythematosus (SLEDAI), koji daje ocenu za aktivnost bolesti koja uzima u obzir sledeće simptome, koji su ponderisani prema težini: napad, psihoza, organski moždani sindrom, poremećaj vida, poremećaj kranijalnog nerva, glavobolja lupusa, vaskulitis, artritis, miozitis, urinarni odlivci, hematurija, proteinurija, piurija, novi osip, alopecija, čirevi na sluznici, pleurija, perikarditis, niski komplement, povećano vezivanje DNK, groznica, trombocitopenija i leukopenija. Bombardier et al. (1992), Arthr. & Rheum. 35(6): 630-640. Tretmani opisani u ovom dokumentu mogu biti korisni u smanjenju ili eliminisanju simptoma SLE, kako je izmereno pomoću SLEDAI. Metode tretiranja opisane u ovom dokumentu mogu poboljšati SLEDAI bodovanje pacijenta u poređenju sa početnom vrednošću za istog pacijenta pre početka tretmana bispecifičnim proteinom kako je opisano u ovom dokumentu.
[0046] Druga metoda za procenu aktivnosti bolesti u SLE je indeks British Isles Lupus Assessment Group (BILAG), koji je sistem za procenu aktivnosti bolesti za SLE pacijente na osnovu principa namere lekara da tretira. Stoll et al. (1996), En. Rheum Dis.55: 756-760; Hay et al. (1993), Q. J. Med.86: 447-458. BILAG bod se dodeljuje davanjem odvojenih numeričkih ili abecednih bodova aktivnosti bolesti u svakom od osam sistema na bazi organa, opštih (kao što su groznica i umor), mukokutanih (kao što su osip i alopecija, između mnogih drugih simptoma), neuroloških (kao što su napadi, migrenske glavobolje i psihoze, između mnogih drugih simptoma), mišićno-koštanih (kao što je artritis), kardiorespiratornih (kao što su zastoj srca i smanjena pulmonalna funkcija), vaskulitisa i tromboze, bubrežnih (kao što je nefritis) i hematoloških. Id. Tretmani opisani u ovom dokumentu mogu biti korisni u smanjenju ili eliminisanju simptoma SLE koji se mere BILAG indeksom ili u smanjenju
2
BILAG bodova pacijenta u poređenju sa početnom vrednošću pre početka tretmana bispecifičnim proteinom kako je opisano u ovom dokumentu.
[0047] Za lečenje reumatoidnog artritisa (RA) može se koristiti i bispecifični protein kao što je opisano u ovom dokumentu, koji inhibira BAFF-om posredovanu proliferaciju B ćelija i B7RP1-om posredovanu proliferaciju T ćelija. RA je hronična bolest sa sistemskim simptomima, kao i simptomima koji se posebno odnose na zglobove. Simptomi najčešće uključuju sinovitis, koji dovodi do bolnih i otečenih zglobova, i razne laboratorijske abnormalnosti kao što su viši od normalnih nivoa reumatoidnog faktora, anti-citrulinski modifikovana proteinska (anti-CCP) antitela, i C-reaktivni protein (CRP) i povišena stopa sedimentacije eritrocita (ESR). Manje česti simptomi uključuju različite ekstra-artikularne simptome koji uključuju, npr. tetive, ligamente, krvne sudove, srce i pluća. Aktivnost bolesti se često može izmeriti korišćenjem različitih indeksa. Vidi, npr. Anderson et al. (2012), Arthritis care & Res. 64 (5): 640-647. Elementi uključeni u takve indekse bodovanja uključuju broj osetljivih zglobova, broj natečenih zglobova, funkcionalne procene i različite laboratorijske nalaze kao što su CRP, ESR, itd.
[0048] Pacijent koji pati od RA može se tretirati bispecifičnim proteinom koji je ovde obelodanjen koji inhibira proliferaciju B ćelija posredovanu BAFF-om i proliferaciju T ćelija posredovanu B7RP1-om pre, posle ili istovremeno sa tretiranjem lekom koji se trenutno koristi za RA. Terapije koje se trenutno koriste za reumatoidni artritis (RA) uključuju nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAID) (kao što su aspirin i ciklooksigenaza-2 (COX-2) inhibitori), antiinflamatorne lekove koji modifikuju bolest (DMARD, kao što su metotreksat, leflunomid i sulfasalazin), anti-malarike (kao što su hidroksihlorokin), ciklofosfamid, D-penicilamin, azatioprin, soli zlata, inhibitori faktora nekroze tumora (kao što su etanercept, infliksimab, adalimumab, golimumab i certolizumab pegol), inhibitori CD20 kao što su rituksimab, IL-1 antagonisti kao što su anakrain, IL-6 inhibitori kao što su tocilizumab, inhibitori Janus kinaza (JAK kao što je tofacitinib), abatacept i kortikosteroidi, između ostalih.
[0049] Terapeutski efikasna količina bispecifičnog proteina kao što je opisano u ovom dokumentu, koji inhibira BAFF-posredovanu proliferaciju B ćelija i B7RP1-posredovanu proliferaciju T ćelija, takođe se može koristiti za tretiranje upalne bolesti creva, kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis. Kronova bolest uključuje abnormalno zapaljenje bilo kog dela digestivnog trakta od usta do anusa, iako je kod većine pacijenata abnormalno zapaljenje ograničeno na ileokolične, tanko-crevne i kolono-anorektalne regije. Obično, zapaljenje je diskontinuirano. Uobičajeni simptomi uključuju bol u stomaku, anoreksiju, gubitak težine, groznicu, dijareju, punoću i/ili osetljivost u donjem desnom delu abdomena, konstipaciju, povraćanje i perianalnu nelagodnost i iscedak. Ostali mogući simptomi uključuju periferni artritis, zaostajanje u rastu, episkleritis, aftozni stomatitis, eritema nodosum, pioderma gangrenozum, bubrežni kamenac, narušeno razređivanje i alkalizaciju mokraće, malapsorpciju i žučne kamence, između ostalog. Pogledajte npr. Strober et al., Medical Immunology, 10th Edition, Section III, Ch.35 (2001); Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th Edition, Section 3, Ch.31 (1999). Makrofagi izolovani od pacijenata sa Kronovom bolešću proizvode povećane količine IL-12, IFNγ, TNFα i drugih inflamatornih citokina.
[0050] Ulcerozni kolitis, iako ga je ponekad teško razlikovati od Kronove bolesti, razlikuje se od Kronove bolesti u nekoliko aspekata. Prvo, generalno je ograničen na debelo crevo, dok se Kronova bolest može javiti u celom digestivnom traktu. Drugo, ulcerozni kolitis uglavnom uključuje zapaljenje samo površinskih slojeva creva, za razliku od Kronove bolesti kod koje zapaljenje može da penetrira sve do zida creva ili druge lokacije u digestivnom traktu.
Konačno, ulcerozni kolitis obično uključuje kontinuiranu oblast zapaljenja, a ne diskontinuirana mesta zapaljenja tipična za Kronovu bolest. Kao i Kronova bolest, ulcerozni kolitis se primarno nalazi u urbanim sredinama. Takođe, genetski faktori verovatno igraju ulogu u ulceroznom kolitisu jer postoji porodična agregacija slučajeva. Autoantitela se primećuju kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom češće nego kod pacijenata sa Kronovom bolešću. Autoantitela su često usmerena na komponente epitelnih ćelija debelog creva. Među najčešćim su antineutrofilna citoplazmatska antitela sa specifičnostima za katalazu, α-enolazu i laktoferin. U nekim slučajevima takva antitela unakrsno reaguju sa mikroorganizmima debelog creva.
[0051] U kliničkim ispitivanjima, aktivnost Kronove bolesti se često ocenjuje pomoću indeksa aktivnosti Kronove bolesti (CDAI). CDAI daje bodovanje aktivnosti bolesti na osnovu osam faktora, uključujući (1) broj tečnih ili mekih stolica dnevno, (2) ocenu pacijenta za količinu bola u stomaku dnevno, (3) ocenu pacijenta za opštu ugodnost, (4) izveštaj pacijenta o drugim simptomima, uključujući artritis, iritis, uveitis, eritema nodozum, pioderma gangrenozum, eftozni stomatitis, analnu fisuru, fitulu ili apsces, druge fistule ili
1
groznicu, (5) izveštaj pacijenta o uzimanju lomotila ili drugih opijata za dijareju, (6) abdominalnu masu, (7) hematokrit i (8) telesnu težinu. Vidi, npr. Best et al. (1976), Gastroenterol. 70: 439-444.
[0052] Simptomi ulceroznog kolitisa su promenljivi. Oni mogu uključivati dijareju, tenesmus, grčeve u stomaku, krv i sluz u stolici, groznicu i rektalno krvarenje. Može se javiti i toksični megakolon, potencijalno po život opasno stanje u kojem je debelo crevo dilatirano preko oko 6 centimetara i može izgubiti mišićni tonus i/ili perforirati. Drugi simptomi koji mogu pratiti ulcerozni kolitis uključuju periferni artritis, ankilozirajući spondilitis, sakroiliitis, anteriorni uveitis, eritema nodozum, pioderma gangrenozum, episkleritis, autoimuni hepatitis, primarni sklerozirajući holangitis, cirozu i zaostali rast i razvoj kod dece.
[0053] Pacijent koji boluje od zapaljenske bolesti creva (IBD), kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis, može se tretirati bispecifičnim proteinima koji se vezuju za BAFF i B7RP1 koji su ovde obelodanjeni pre, posle ili istovremeno sa terapijom za IBD. Postojeći lekovi za IBD uključuju, na primer, sulfasalazin, 5-aminosalicilnu kiselinu i njene derivate (kao što su olsalazin, balsalazid i mezalamin), anti-TNF antitela (uključujući infliksimab, adalimumab, golimumab i certolizumab pegol), kortikosteroide za oralnu ili parenteralnu primenu (uključujući prednizon, metilprednizon, budesonid ili hidrokortizon), adrenokortikotropni hormon, antibiotike (uključujući metronidazol, ciprofloksacin ili rifaksimin), azatioprin, 6-merkaptopurin, metotreksat, ciklosporin, takrolimus i talidomid.
Nukleinske kiseline koje kodiraju bispecifične proteine
[0054] Ovde obelodanjene su nukleinske kiseline koje kodiraju bispecifični protein koji može da inhibira proliferaciju T ćelija posredovanu B7RP1-om i proliferaciju B ćelija posredovanu BAFF-om. Na primer, SEQ ID NO:52 kodira VL region koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14, a SEQ ID NO:53 kodira VH region koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15. Slično tome, SEQ ID NO:55 i 56 kodiraju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:17 odnosno 18, koje su polipeptidi koji čine teški lanac anti-B7RP1 antitela fuzionisanog sa dva BAFF-vezujuća peptida. SEQ ID NO:57 kodira laki lanac anti-B7RP1 antitela, koji može biti deo hetero-tetramernog bispecifičnog IgG antitela ili bispecifičnog fuzionog proteina, kao što je gore opisano. Razmatra se svaka sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira bilo koju aminokiselinsku sekvencu koja je ovde obelodanjena. Slično tome, razmatraju se varijante sekvence nukleotida uključujući tihe mutacije u odnosu na sekvence
2
koje su ovde obelodanjene ili koje kodiraju prethodno opisane varijante aminokiselinske sekvence. Preciznije, ove nukleinske kiseline mogu biti nukleotidne sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence koje variraju za ne više od 10 insercija, delecija ili supstitucija jedne aminokiseline na 100 aminokiselina iz aminokiselinskih sekvenci koje su obelodanjene ovde.
[0055] Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju ovde opisane bispecifične proteine mogu se odrediti pomoću jedne od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde obelodanjene, zasnovane na stanju tehnike i znanju u struci. Pored tradicionalnijih metoda proizvodnje kloniranih segmenata DNK koji kodiraju određenu aminokiselinsku sekvencu, kompanije kao što su DNA 2.0 (Menlo Park, CA, USA) i BlueHeron (Bothell, WA, USA), između ostalog, sada rutinski proizvode hemijski sintetizovane DNK veličine gena bilo koje željene sekvence po narudžbini, čime se pojednostavljuje proces proizvodnje takvih DNK. Korišćenje kodona se može podesiti tako da optimizuje ekspresiju u sistemu izbora.
Metode pravljenja bispecifičnih proteina koji se vezuju za BAFF i B7RP1
[0056] Nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisane bispecifične proteine mogu se insertovati u vektore odgovarajuće za ćeliju domaćina u kojima će nukleinska kiselina biti eksprimirana. Ove nukleinske kiseline se mogu uneti u ćelije domaćina bilo kojom od metoda poznatih u struci. Ćelije domaćina koje se mogu koristiti uključuju bakterije, uključujući Escherichia coli, kvasac, uključujući Saccharomyces cerevisiae ili Pichia pastoris, ćelije insekata uključujući ćelije Spodoptera frugiperda, biljne ćelije i ćelije sisara, uključujući ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna, ćelije HeLa, ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma i 293 ćelije, između ostalog. Ove ćelije domaćini mogu biti kultivisane pod takvim uslovima da će unete nukleinske kiseline biti eksprimirane, a bispecifični protein se može izdvojiti iz supernatanta kulture ili ćelijske mase.
[0057] Generalno, postupak koji se koristi za unošenje nukleinskih kiselina u ćelije domaćina može zavisiti od ćelije domaćina u koju će se nukleinske kiseline uneti. Metode unošenja nukleinskih kiselina u bakterije dobro su poznate u struci. Na primer, obično se koriste elektroporacija ili transformacija kalcijum hlorida. Metode za unošenje nukleinskih kiselina u kvasac su takođe dobro poznate u struci i uključuju, na primer, metode transformacije pomoću litijum acetata i polietilen glikola. Metode za unošenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznate u struci i uključuju, ali nisu ograničene na, transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfata, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u liposomima i direktno mikroinjektiranje DNK u jezgra.
[0058] Vektori ekspresije koji se koriste u bilo kojoj od ćelija domaćina mogu da sadrže sekvence neophodne za replikaciju DNK, selekciju ćelija domaćina koje sadrže vektor i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence obično mogu da obuhvate jednu ili više sledećih nukleotidnih sekvenci: promotor, jednu ili više sekvenci pojačivača, poreklo replikacije, sekvencu koja prekida translaciju, kompletnu sekvencu introna koja sadrži donorsko i akceptorsko mesto isecanja, sekvencu koja kodira navodeću sekvencu za sekreciju polipeptida, mesto vezivanja ribosoma, sekvencu poliadenilacije, polilinker region za insertovanje nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji se eksprimira i selektabilni marker element. Brojni ekspresioni vektori pogodni za ekspresiju u različitim ćelijama domaćina poznati su u struci i komercijalno su dostupni.
Farmaceutski sastavi, doziranje i načini primene
[0059] Ovde su obelodanjeni farmaceutski sastavi koji obuhvataju ovde opisane bispecifične proteine. Takvi sastavi mogu da sadrže terapeutski efikasnu količinu bispecifičnog proteina sa jednom ili više dodatnih komponenti kao što su fiziološki prihvatljiv nosač, ekscipijensi ili razblaživač. Takve dodatne komponente mogu uključivati pufere, ugljene hidrate, poliole, aminokiseline, helatante, stabilizatore i/ili konzervanse, među mnogim mogućnostima.
Mnoge takve dodatne komponente su opisane u, npr., REMINGTON's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
[0060] Doziranje ovde opisanih bispecifičnih proteina može se prilagoditi kako bi se postigli željeni efekti. U mnogim slučajevima, ponavljano doziranje će biti potrebno zbog hronične prirode bolesti koja se tretira. Na primer, bispecifični protein kao što je ovde opisano može se dozirati dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom u dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset nedelja, ili jednom u dva, tri, četiri, pet ili šest meseci. Količina bispecifičnog proteina koji se daje na svaki dan davanja može biti od oko 0,0036 mg do oko 700 mg.
Alternativno, doza se može kalibrirati prema procenjenoj površini kože pacijenta, a svaka doza može biti od oko 0,002 µg/m<2>do oko 350 mg/m<2>. U drugoj alternativi, doza se može
4
kalibrirati prema težini pacijenta, a svaka doza može biti od oko 0,000051 mg/kg do oko 10,0 mg/kg.
[0061] Bispecifični proteini, ili farmaceutski sastavi koji sadrže ove molekule, mogu se primeniti bilo kojom izvodljivom metodom. Terapija koja se sastoji od proteina obično će se primenjivati parenteralnim putem, na primer injekcijom, jer bi oralna primena, u odsustvu neke posebne formulacije ili okolnosti, dovela do hidrolize proteina u kiseloj sredini želuca. Subkutane, intramuskularne, intravenske, intraarterijske, intralezijske i peritonealne bolus injekcije su mogući putevi primene. Bispecifični proteini se takođe mogu primeniti putem infuzije, na primer intravenskom ili supkutanom infuzijom. Moguća je i topikalna primena, naročito kod bolesti koje zahvataju kožu. Alternativno, bispecifični proteini se mogu primeniti putem kontakta sa sluznom membranom, na primer intra-nazalnom, sublingvalnom, vaginalnom ili rektalnom primenom ili primenom kao inhalant. Alternativno, određeni odgovarajući farmaceutski sastavi koji se sastoje od bispecifičnog proteina mogu se primeniti oralno.
[0062] Nakon što je prethodno opisan pronalazak u opštim uslovima, sledeći primeri se nude kao ilustracija, a ne kao ograničenje.
PRIMERI
Primer 1: Projektovanje i testiranje BAFF/B7RP1bispecifičnog molekula za humanu terapijsku upotrebu
[0063] Cilj ovog niza eksperimenata bio je da se pronađe bispecifični molekul koji (1) inhibira proliferaciju B ćelija posredovanu BAFF-om i B7RP1-om posredovanu proliferaciju T ćelija, (2) je visoko aktivan u biološkim testovima i (3) ima povoljna biofizička svojstva. Na Slici 1 prikazane su brojne šeme za fuziju peptida koji vezuje humani BAFF za antihumano B7RP1 IgG antitelo (anti-huB7RP1). Sekvenca BAFF-vezujućeg peptida data je u SEQ ID NO:1, a sekvence imunoglobulinskog teškog i lakog lanca anti-huB7RP1 date su u SEQ ID NO:25, odnosno SEQ ID NO:19.
[0064] Da bi se utvrdilo koja šema ima najbolja biofizička svojstva, uz zadržavanje biološke aktivnosti, napravljeni su i testirani bispecifični molekuli prikazani na Slici 1. U jednom konstruktu, dve tandem kopije BAFF-vezujućeg peptida sa interventnim linkerom („1K linker“, sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:24) fuzionisane su sa N-terminusom ili teškog lanca imunoglobulina (P71617) ili lakog lanca imunoglobulina (P71618) antihuB7RP1. Vidite Sliku 1. Aminokiselinska sekvenca teškog lanca P71617 data je u SEQ ID NO:26, a aminokiselinska sekvenca lakog lanca P71617 ista je kao i sekvenca imunoglobulinskog lakog lanca anti-huB7RP1 (SEQ ID NO:19). Aminokiselinska sekvenca lakog lanca P71618 data je u SEQ ID NO:27, a aminokiselinska sekvenca teškog lanca P71618 ista je kao i imunoglobulinskog teškog lanca anti-huB7RP1 (SEQ ID NO:25). Dve tandem kopije BAFF-vezujućeg peptida takođe su fuzionisane sa C-terminalnim krajem imunoglobulinskog teškog lanca anti-huB7RP1 (sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:25) koristeći bilo gore pomenuti 1K linker (sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:24; P71619) ili 5X(G4S) linker (SEQ ID NO: 71) između dva BAFF-vezujuća peptida (P71620). Aminokiselinske sekvence teških lanaca ova dva fuziona konstrukta date su u SEQ ID NO:16 (P71619) i SEQ ID NO:28 (P71620). U konstruktu P71621, dve tandem kopije BAFF-vezujućeg peptida sa interventnim 1K linkerom su insertovane u CH3 domen antitela između ostataka 358 i 359 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:25 (aminokiselinska sekvenca imunoglobulinskog teškog lanca anti-huB7RP1 antitela). Sekvenca teškog lanca konstrukta P71621 data je u SEQ ID NO:29. U konstruktu P71622, BAFF-vezujući peptid je insertovan u CH3 domen imunoglobulinskog teškog lanca anti-huB7RP1 (između ostataka 358 i 359 SEQ ID NO:25, a druga kopija BAFF-vezujućeg peptida je fuzionisana sa C-terminalnim krajem teškog lanca. Aminokiselinska sekvenca teškog lanca P71622 data je u SEQ ID NO:30. U konstruktu P71623, jedan BAFF-vezujući peptid je insertovan u CH2 region (između ostataka 268 i 269 SEQ ID NO:25), a drugi BAFF-vezujući peptid je insertovan u CH3 region (između ostataka 358 i 359 SEQ ID NO:25). SEQ ID NO:31 je aminokiselinska sekvenca teškog lanca P71623. Konstrukti P71619-P71623 svi imaju imunoglobulinski laki lanac anti-huB7RP1 (SEQ ID NO:19).
[0065] U konstruktima P74293 i P74294 modifikovan je linker između dve tandem kopije BAFF-vezujućih peptida u konstruktu P71619. Aminokiselinske sekvence teških lanaca P74293 i P74294 navedene su u SEQ ID NO:17, odnosno SEQ ID NO:18. Imunoglobulinski laki lanci ovih konstrukata takođe imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19.
[0066] Nukleinske kiseline koje kodiraju gore opisane konstrukte napravljene su na sledeći način. Nukleinske kiseline koje kodiraju N-terminalni deo N-terminalnih BAFF peptidnih fuzija (P71617 i P71618), uključujući dve kopije BAFF-vezujućeg peptida plus varijabilni region teškog ili lakog lanca imunoglobulina, generisane su sintetički. One su bile vezane, preko pogodnih mesta restrikcione endonukleaze, sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju konstantni region teškog ili lakog lanca imunoglobulina u odgovarajuće vektore. Nukleinske kiseline koje kodiraju C-terminalne fuzije konstantnog regiona teškog lanca (P71619 i P71620), insercije Fc-petlje (P71621 i P71623) i inserciju Fc-petlje/C-terminalnu fuziju (P71622), sve su sintetički generisane i vezane u vektor koji sadrži varijabilni region teškog lanca kroz pogodna mesta restrikcione endonukleaze.
[0067] Različiti bispecifični konstrukti opisani prethodno eksprimirani su i u tranzijentno transfektovane 293 ćelije i u stabilno transfektovane CHO ćelije. Fuzioni proteini su prečišćeni i testirani na biološku aktivnost. Nisu uočene razlike u proteinima proizvedenim u ove dve različite vrste ćelija domaćina.
[0068] Aktivnosti inhibiranja BAFF bispecifičnih molekula testirane su u testu proliferacije humanih primarnih B ćelija posredovane BAFF-om. Ukratko, humane B ćelije su prečišćene iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) koristeći negativnu selekciju koristeći komplet II humanih B ćelija iz Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Oko 10<5>prečišćenih B ćelija je kultivisano u mikrotitarskim pločama sa 96 bunara u Minimal Essential Media (MEM) plus 10% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS) u prisustvu 50 ng/ml humanog BAFF proteina, 2 µg/ml kozjeg F(ab') 2 anti-humanog IgM (Jackson ImmunoResearch) i različitih koncentracija jednog od gore opisanih bispecifičnih proteina na 37°C u 5% CO<2>tokom 48 sati. Kao pozitivna kontrola korišćeno je anti-BAFF peptitelo ("αBAFF", što je homodimer koji sadrži dva polipeptidna lanca, od kojih svaki sadrži dva BAFF-vezujuća peptida fuzionisana sa Fc polipeptidom). Molekul αBAFF je detaljno opisan u SAD Patentu 7,259,137, a aminokiselinska sekvenca jednog polipeptidnog lanca ovog homodimera je data u SEQ ID NO:32. Proliferacija je merena apsorpcijom radioaktivnog<3>H-timidina tokom poslednjih 18 časova inkubacije. Rezultati su prikazani na Slikama 2A i 2B.
[0069] Podaci na Slici 2A ukazuju da su dva C-terminalna fuziona konstrukta (P71619 i P71620) međusobno uporediva u inhibiciji proliferacije B ćelija posredovane BAFF-om i potentnija od svih drugih fuzionih konstrukta testiranih u ovom eksperimentu. Sa P71620 se nije dalje nastavilo, jer je imao tendenciju da se agregira, što je svojstvo koje je veoma nepoželjno u terapeutskom proteinu. Podaci na Slici 2B ukazuju da je P71619 uporediv sa dve prethodno opisane malo izmenjene verzije ovog konstrukta (P74293 i P74294) i sa pozitivnom kontrolom (αBAFF) u inhibiciji proliferacije B ćelija posredovane BAFF-om.
Dakle, među testiranim bispecifičnim konstruktima, P71619, P71620, P74293 i P74294 su imali uporednu aktivnost u ovom testu proliferacije B ćelija posredovane BAFF-om i bolju aktivnost od svih ostalih testiranih konstrukcija.
[0070] Inhibitorna aktivnost B7RP1 (konstrukata) P71619, P74293 i P74294 je testirana pomoću testa proliferacije T ćelija posredovanog humanim B7RP1-Fc. Primarne humane T ćelije prečišćene iz PBMC od zdravih humanih donora koristeći komplet za izolaciju Pan T ćelija iz Miltenyi Biotec (Auburn, CA) i stimulisane sa anti-CD3 (1 µg/mL) antitelom vezanim za mikrotitar ploču i B7RP1-Fc fuzionim proteinom (3 µg/mL) u prisustvu različitih koncentracija prethodno opisanih bispecifičnih proteina ili IgG2 anti-humanog B7RP1 antitela (u daljem tekstu pod nazivom "αB7RP1").<3>H-timidin je dodat ćelijama nakon 48 sati, a inkorporacija<3>H-timidina je izmerena 24 sata kasnije. Sva bispecifična antitela koja su testirana imala su slične IC50, koji su bili slični onima kod αB7RP1 (Slika 3). Dakle, ovi podaci sugerišu da je konjugacija peptida koji vezuju BAFF za anti-huB7RP1 antitelo imala mali ili nikakav uticaj na sposobnost antitela da inhibira aktivnost B7RP1.
[0071] Afiniteti vezivanja heterodimernih bispecifičnih antitela P74293 i P74294 za BAFF i B7RP1 mereni su pomoću Kinetic Exclusion Assay (KinExA<®>; Sapidyne Instruments, Boise, Idaho). Oba antitela imaju visoke afinitete vezivanja za humani BAFF (sa Kdod približno 30 pM) i za humani B7RP1 (sa Kdod približno 40 pM). Vidite Tabelu 2 u nastavku. Pored toga, obe ove bispecifičnosti imaju slične afinitete vezivanja za BAFF majmuna javanskog makakija u poređenju sa humanim BAFF i za B7RP1 majmuna javanskog makakija u poređenju sa humanim B7RP1. Tabela 2.
Tabela 2: afinitet vezivanja i ćelijska potencija P74293 i P74294.
[0072] Za dalju procenu aktivnosti P74293 u in vitro sistemu koristeći humane ćelije, proizvodnja citokina u humanim ćelijama krajnika aktivirana Staphylococcus enterotoksinom B (SEB) je procenjena u prisustvu različitih testnih molekula. Ukratko, humane ćelije krajnika su izolovane iz tkiva i stimulisane sa SEB (1 µg/mL) u prisustvu jednog od sledećih molekula: (1) αB7RP1, (2) P74293, (3) CTLA4-Ig (pozitivna kontrola) ili (4) humani IgG (negativna kontrola). Nakon 72 sata kultivisanja, ćelijski supernatant je prikupljen, a nivoi citokina su testirani korišćenjem kompleta iz Meso Scale Discovery prema uputstvima proizvođača. Rеzultаti su prikаzаni nа Slici 4.
[0073] Sva tri αB7RP1, P74293 i CTLA4-Ig, trake 1, 2 i 3, u svim panelima na Slici 4, inhibiraju oslobađanje IL-17, IL-10, IL-4 i IFNγ. Oslobađanje IL-2 je inhibirao samo CTLA4-Ig. Dakle, αB7RP1 i anti-BAFF/B7RP1 bispecifični P74293 imali su uporedive i specifične efekte na sekreciju citokina od strane ćelija krajnika aktiviranih SEB-om.
[0074] Ispitana su tri heterodimerna bispecifična proteina, odnosno P71619, P74293 i P74294, na dodatna svojstva. Titri proteina iz kultura ćelija domaćina koje proizvode ove proteine pokazali su da su P74293 i P74294 proizvedeni na približno dvostruko višem nivou od onog na kojem je proizveden P71619. P74293 i P74294 su takođe bili stabilniji od P71619 nakon skladištenja na dve nedelje na 40 °C, kako je procenjeno dimenziono ekskluzivnom hromatografijom (SEC). P74293 je formirao bistri rastvor na početku skladištenja i nakon 4 nedelje skladištenja, dok su rastvori koji sadrže P74394 bili zamagljeni u svim vremenskim tačkama. Rastvori P74293 i P74294 su bili manje viskozni od rastvora P71619. Dakle, P74293 i P74294 su eksprimirani na višim nivoima od P71619 i takođe su bili stabilniji i manje viskozni u testiranom rasponu koncentracije nego P71619. Najočiglednija razlika između ovih molekula leži u linkeru između dva BAFF-vezujuća peptida. Ovi podaci sugerišu da linkeri u P74293 i P74294 (SEQ ID NO:6 i 7) mogu dati poboljšana svojstva ovim molekulima.
[0075] Farmakokinetička svojstva opisanih bispecifičnih molekula procenjena su na miševima. Mužjaci CD-1 miševa dobili su jednu intravensku (IV) dozu (5 mg/kg) bispecifičnih fuzionih proteina P71617, P71619, P71621, P71622, P74293 ili P74294. Uzorci seruma su prikupljeni pre doziranja i u 0,5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408, 504 časa nakon doziranja. Koncentracija bispecifičnog molekula u serumu određena je dvema ELISA metodama, od kojih jedna registruje prisustvo Fc dela i jedna registruje prisustvo i Fc dela i BAFF-vezujućeg peptidnog dela. Za merenje Fc dela, korišćeno je anti-Fc antitelo obeleženo biotinom kao reagens za hvatanje, a anti-Fc antitelo obeleženo sa ALEXA FLUOR<®>647 je korišćeno kao reagens za detekciju. Da bi se detektovao BAFF-vezujući deo i Fc deo bispecifičnog, kao reagens za hvatanje je korišćen biotinilisani BAFF protein, a kao reagens za detekciju je korišćeno ALEXA FLUOR<®>647-obeleženo anti-Fc antitelo. Bispecifični proteini sa dve tandem kopije BAFF-vezujućih peptida fuzionisani sa N-terminusom (P71617), C-terminusom (P71619, P74293 i P74294) ili CH3 domenom (P71621) teškog lanca imaju veoma slične PK profile kod miševa. Slika 5. Bispecifični protein sa jednom kopijom BAFF-vezujućeg peptida insertovanog u domen CH3 i drugom kopijom fuzionisanom sa C-terminalnim krajem teškog lanca (P71622) imao je manju izloženost u poređenju sa drugim bispecifičnim proteinima. Slika 5. Pored toga, dva različita ELISA testa rezultirala su sličnim serumskim koncentracijama bispecifičnih proteina, što sugeriše da nije došlo do značajnog cepanja bispecifičnih proteina in vivo.
[0076] Farmakokinetički i farmakodinamički parametri heterodimernih bispecifičnih antitela P74293 i P74294 takođe su procenjeni ispitivanjem jedne doze na javanskim makaki majmunima. Naivni mužjaci javanskog makaki majmuna (n=4) su dobili jednu bolus intravensku ili supkutanu dozu P74293 (10 mg/kg), ili jednu supkutanu dozu P74294 (10 mg/kg). Oba bispecifična molekula imaju PK profile slične onima kod IgG antitela. Uočeni farmakokinetički parametri za P74293 i P74294, kao i za anti-huB7RP1, prikazani su u Tabeli 3 u nastavku.
Tabela 3: Farmakokinetički parametri kod majmuna javanski makaki
4
[0077] Podaci u Tabeli 3 ukazuju da su farmakokinetički parametri P74293 i P75294 uporedivi međusobno i sa parametrima anti-huB7RP1 antitela.
Primer 2: Dizajniranje i testiranje mišjeg bispecifičnog surogat molekula
[0078] Za sprovođenje pretkliničkih studija na miševima, konstruisan je mišji surogat bispecifični molekul koji bi se mogao vezati za mišji B7RP1 i mišji BAFF (u daljem tekstu „mišji surogat“). Anti-huB7RP1 antitelo koje je korišćeno za izgradnju bispecifičnih konstrukta opisanih u Primeru 1, ne vezuje se za mišji B7RP1, dok se BAFF-vezujući peptid koji je korišćen u ovim konstruktima vezuje i za humani i za mišji BAFF. Podaci nisu prikazani. Mišji surogat obuhvata antagonističko IgG anti-mišje B7RP1 antitelo (koje se ovde naziva "anti-mB7RP1"), koje je bilo himera konstantnih regiona mišjeg imunoglobulina i varijabilnih regiona anti-mišjeg B7RP1 imunoglobulina pacova. Upotreba anti-mB7RP1 je opisana u Hu et al. (2009), J. Immunol.182: 1421, gde je označeno kao 1B7-V2. Mišji surogat ima dve kopije BAFF-vezujućeg peptida (SEQ ID NO:1) fuzionisanog preko kratkog linkera (dužine pet aminokiselina) sa C-terminusom imunoglobulinskog teškog lanca antimB7RP1. Dve kopije BAFF-vezujućeg peptida su razdvojene drugim linkerom koji je dug 23 aminokiseline. Nukleinske kiseline koje kodiraju teški lanac mišjeg surogata napravljene su korišćenjem PCR preklapanja za spajanje nukleinskih kiselina koje kodiraju BAFF-vezujući deo αBAFF na nizvodni kraj nukleinskih kiselina koje kodiraju teški lanac 1B7-V2, tj. antimB7RP1.
[0079] BAFF inhibicija pomoću mišjeg surogata je procenjena u testu proliferacije B ćelija posredovane BAFF-om. B limfociti miša izolovani su iz C57BL/6 slezine negativnom selekcijom sa MACS CD43 (ly-48) Microbeads prema uputstvima proizvođača (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) ili iz PBMC koristeći komplet za izolovanje B ćelija (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Prečišćene B ćelije su stimulisane sa 0,1 µg/ml anti-IgM i 200 ng/ml BAFF u prisustvu različitih koncentracija mišjeg surogata ili αBAFF. Proliferacija B ćelija merena je inkorporacijom<3>H-timidina na dan 4. IC50mišjeg surogata i αBAFF bili su 0,59 nM, odnosno 0,73 nM. Vidi Sliku 6A. Dakle, mišji surogat je efikasno inhibirao BAFF sa potentnošću uporedivom sa potentnošću αBAFF.
[0080] Da bi se izmerila inhibicija vezivanja B7RP1 za njegov receptor pomoću mišjeg surogata, prvo su aktivirane mišje ćelije slezine kako bi se poboljšala njihova ekspresija B7RP1 receptora njihovom inkubacijom u mikrotitarskim bunarima obloženim sa anti-CD3 (5 µg/ml) antitelima 24 časa. Aktivirane ćelije slezine su isprane sa fosfatnim puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS), a zatim inkubirane sa 5 µg/ml biotinilisanog muB7RP1:Fc u prisustvu različitih koncentracija mišjeg surogata na 4°C tokom 30 minuta. Ćelije su oprane i zatim obojene alofikocijanin (APC)-konjugovanim anti-mišjim CD3 antitelima i streptavidinfikoeritrinom (Streptavidin-PE) dodatnih 20 minuta. Vezivanje B7RP1-Fc za T ćelije analizirano je protočnom citometrijom. IC50mišjeg surogata i anti-mB7RP1 su bili 4,01 pM, odnosno 2,8 pM. Vidi Sliku 6B. Stoga je aktivnost mišjeg surogata bila slična aktivnosti antimB7RP1 u ovom testu. Dakle, mišji surogat inhibira i BAFF i B7RP1.
[0081] Farmakodinamički efekti mišjeg surogata in vivo procenjeni su na miševima imunizovanim sa ovčijim eritrocitima (SRBC). Ukratko, BALB/c miševi (stari 8 nedelja) su primili primarnu imunizaciju na dan 0 i buster imunizaciju 28. dana sa 2 X 10<8>SRBC u 0,2 ml PBS putem intraperitonealne injekcije. Miševi (n=5 za svaki molekul) su tretirani dva puta nedeljno od 0. do 33. dana jednim od sledećih molekula pri 5 mg/kg: mišji surogat; αBAFF; anti-mB7RP1; ili mišji IgG1. Miševi tretirani sa SBRC, ali bez drugog tretiranja, služili su kao pozitivne kontrole. Miševi su žrtvovani 34. dana, a serum i slezina su prikupljeni.
[0082] Za merenje proporcije B ćelija i memorijskih T ćelija u slezini, ćelije slezine su ubrane mlevenjem tkiva slezine kroz ćelijsku cediljku. Ćelije slezine su prethodno inkubirane neobeleženim anti-CD16/32 da bi blokirale nespecifično vezivanje antitela za Fc gama receptore (FcyR). Udeo B ćelija određen je bojenjem PE-obeleženim anti-B220 (koji je eksprimiran na B ćelijama). Udeo memorijskih T ćelija (CD44<hi>CD62L<lo>CD4 T ćelija) određen je bojenjem sa FITC-konjugovanim anti-CD44, PE-konjugovanim anti-CD62L, APC-konjugovanim anti-CD4 i PerCP-konjugovanim anti-CD3. Sva antitela za bojenje su kupljena od BD Bioscience (San Diego, CA). Za određivanje B i T ćelija, protočna citometrija je izvedena pomoću FACSCALIBUR<™>(BD Bioscience, San Jose, CA) protočnog citometra, a podaci su analizirani pomoću FLOWJO<®>(TreeStar Inc., Ashland, OR) softvera za analizu podataka protočne citometrije. Rеzultаti su prikаzаni na Slici 4.
[0083] Za merenje nivoa anti-SBRC antitela u serumu, mikrotitarske ploče obložene rastvorljivim SRBC antigenom od 10 µg/ml inkubirane su dva časa na sobnoj temperaturi razblaženim serumom tretiranih miševa. Vezani Ig specifičan za SRBC iz seruma je detektovan sa HRP-konjugovanim poliklonalnim kozjim anti-mišjim IgG i IgM antitelima (Southern Biotech, Birmingham, AL). Reakcija supstrata je izvedena korišćenjem SUREBLUE<™>TMB peroksidaza supstratom za mikrobunare (KPL, Gaithersburg, MD) prema uputstvima proizvođača, a optička gustina je očitana korišćenjem čitača mikroploča Spectrum Max (Molecular Devices). Kao pozitivna kontrola, na svaku ploču su dodata serijska razblaženja mešavine seruma iz SRBC-imunizovanih miševa bez ikakvog tretmana, a od očitavanja iz ovih bunara izvedena je standardna kriva. Nivoi anti-SBRC antitela drugih uzoraka su prikazani na Slici 7 kao procenat ove pozitivne kontrole.
[0084] Procenat ćelija slezine koje su B ćelije smanjen je kod miševa tretiranih mišjim surogatom u poređenju sa procentom koji je primećen kod miševa tretiranih mišjim IgG1. Slika 7 (gornji panel). Slično smanjenje je primećeno kod miševa tretiranih sa αBAFF ili αBAFF plus anti-mB7RP1, ali ne i kod miševa tretiranih samo sa anti-mB7RP1. Slika 7 (gornji panel). Što se tiče memorijskih T ćelija, miševi tretirani mišjim surogatom, antimB7RP1, ili anti-mB7RP1 plus αBAFF imali su smanjene udele memorijskih T ćelija u poređenju sa onima koje su primećene kod miševa tretiranih sa muIgG1. Slika 7 (srednji panel). Nasuprot tome, tretiranje sa αBAFF nije promenilo populaciju memorijskih T ćelija u slezini u poređenju sa onim primećenim u tretiranju sa mulgG. Slika 7 (srednji panel). Mišji surogat je takođe pokazao snažno smanjenje nivoa anti-SRBC antitela u serumu, slično onom primećenom nakon tretiranja sa anti-mB7RP1 ili anti-mB7RP1 plus αBAFF ili kod miševa kojima nije injektiran SRBC. Slika 7 (donji panel). Umerena inhibicija nivoa anti-SRBC antitela, u poređenju sa nivoom primećenim u tretiranju sa mIgG1, primećena je kod miševa
4
tretiranih samo sa αBAFF. Slika 7 (donji panel). Ovi podaci ukazuju da je mišji surogat imao dvostruke inhibitorne efekte u odeljcima B ćelija i T ćelija kod miševa in vivo.
[0085] Uticaj mišjeg surogata na bolest procenjen je u NZB/WF1 lupus modelu koristeći dve različite dozne količine za svaki od testiranih molekula. Ženke NZB/WF1 miševa (4,5 meseca starosti, n=20) tretirane su dva puta nedeljno intraperitonealnom injekcijom tokom 18 nedelja koristeći svaki od sledećih režima doziranja: 5 ili 15 mg/kg mišjeg surogata (MW≅ 160KDa); 4,68 ili 14 mg/kg anti-mB7RP1 (MW≅ 150KDa); 1,88 ili 5,6 mg/kg αBAFF (MW ≅64KDa); kombinacija αBAFF (1,88 ili 5,6 mg/kg) i anti-mB7RP1 (4,68 ili 14 mg/kg); mišji IgG1 (15 mg/kg; kontrola izotipa); ili fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS) (negativna kontrola). Proteinurija je merena u urinu koristeći ALBUSTIX<®>(Bayer, Elkhart, IN) svake dve nedelje počevši od 5 meseci starosti. Incidenca proteinurije je izražena kao procenat miševa sa urin proteinom u koncentraciji od najmanje 300 mg/dl u dva uzastopna merenja. Izmeren je nivo serumskog anti-dsDNK IgG putem ELISA. Bodovanje bubrežnog oboljenja svih miševa vršeno je pregledom uzoraka bubrežnog tkiva za osam različitih vrsta lezija, odnosno glomerularne kapilarne proliferacije, hiperplazije mezangijalnih ćelija, povećane mezangijalne matrice, adhezije glomerularnih resa, parijetalne epitelne hiperplazije, intersticijskog nefritisa, tubularne dilatacije/proteinskih odlivaka i tubularne atrofije/intersticijske fibroze. Svaka vrsta lezije dobila je bod težine od 0 do 5, za maksimalno moguće bodovanje 32. Rezultati svake grupe miševa su bili prosečni. Preživljavanje je praćeno.
[0086] U starosnoj dobi od 12 meseci, nijedan od miševa tretiranih mišjim surogatom na bilo kom nivou doze nije razvio proteinuriju. Nasuprot tome, 100% miševa tretiranih sa mišjim IgG1 ili PBS u oba testirana nivoa doze je pokazalo proteinuriju. Slike 8A i 9B. Oko 60% i 35% miševa tretiranih manjim dozama anti-mB7RP1, odnosno αBAFF, i oko 50% i 25% miševa tretiranih većim dozama anti-mB7RP1 odnosno αBAFF, razvilo je proteinuriju. Slike 8A i 9B. Pored toga, tretiranje mišjim surogatom na oba nivoa doze rezultiralo je značajnim smanjenjem nivoa anti-dsDNK IgG u serumu u poređenju sa negativnom kontrolom tretiranom sa muIgG1. Slika 8B i 9A. Bispecifično tretiranje je takođe značajno poboljšalo preživljavanje u poređenju sa kontrolnim grupama mlgG i PBS. Podaci nisu prikazani.
Međutim, nije uočena jasna razlika u preživljavanju između tretiranja bispecifičnim u odnosu na pojedinačno sredstvo u trenutku terminacije eksperimenta.
[0087] Bubrezi svih tretiranih miševa, uključujući miševe uginule pre kraja ispitivanja, prikupljeni su za histološko bodovanje težine bolesti bubrega. Grupe miševa tretiranih sa αBAFF, kombinacijom αBAFF plus anti-mB7RP1, ili mišjim surogatom imale su značajno niže bodove za bolest bubrega u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom sa mIgG1. Slika 10. Grupe tretirane sa bispecifičnim surogatom ili kombinacijom takođe su pokazale trend smanjenja patologije bubrega u poređenju sa grupama tretiranim jednim agensom, što je rezultat koji je u dobroj korelaciji sa prethodno opisanim rezultatima proteinurije. Uporedite Sliku 10 sa Slikama 8A i 9B. Ukratko, dvostruka inhibicija BAFF i B7RP1 od strane mišjeg surogata ili kombinovanim tretiranjem sa αBAFF plus anti-mB7RP1 bila je efikasnija od inhibicije samo sa BAFF (αBAFF) ili samo sa B7RP1 (anti-mB7RP1) u sprečavanju pojave i progresije bolesti u modelu NZB/WF1lupusa.
[0088] Da bi se utvrdilo da li inhibicija i BAFF i B7RP1 može efikasno inhibirati simptome artritisa izazvanog mišjim kolagenom, urađen je sledeći eksperiment. Muški DBA miševi su imunizovani sa 100 µg goveđeg kolagena tipa II emulgovanog u 2 x Kompletnog Frojndovog adjuvansa (CFA) na dan 0 i pojačanog goveđim kolagenom tipa II u Nekompletnom Frojndovom adjuvansu (IFA) na dan 21. Miševi su tretirani jednom od ispitnih supstanci dva puta nedeljno tokom 41 nedelje ispitivanja počevši od 0. dana. Procenat miševa koji pokazuju simptome artritisa u svakoj grupi i prosečan skor artritisa za svaku grupu je procenjen u svakoj vremenskoj tački. Bodovanja artritisa utvrđena su pregledom svakog uda i dodeljivanjem bodova od 0-3 za svaki ud, sa većim bodovima za otečene i/ili upaljene udove. Maksimalni ukupni skor artritisa je 12. Smatrano je da miš ima artritis ako je imao zbir bodova artritisa od najmanje 1 u bilo kom ekstremitetu.
[0089] Rezultati su prikazani na Slici 11. Ovi podaci ukazuju da je kombinacija αBAFF i anti-mB7RP1 (popunjeni krugovi povezani punim linijama) bila mnogo efikasnija u suzbijanju simptoma artritisa od bilo αBAFF (otvoreni krugovi povezani punim linijama) ili anti-mB7RP1 (popunjeni krugovi povezani isprekidanim linijama). Negativne kontrolne grupe tretirane sa mlgG (popunjeni kvadrati povezani punim linijama) ili PBS (popunjeni kvadrati povezani isprekidanim linijama) imale su najveći procenat incidencije artritisa i najveće bodovanje artritisa. Ovi rezultati sugerišu da inhibicija BAFF i B7RP1, za razliku od inhibicije samo jednim od ovih puteva, može biti efikasan tretman autoimunog i/ili inflamatornog artritičnog stanja kao što je reumatoidni artritis.
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
�
2
�
1
2
4
1
2
4
1
11

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Ćelija domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira bispecifični protein i/ili vektora koji se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira bispecifični protein, pri čemu bispecifični protein obuhvata:
(a) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa sledećom formulom: A-L1-P-L2-P, gde je A imunoglobulinski teški lanac IgG antitela, L1 je prvi peptidni linker koji je odsutan ili je dugačak 3 do 40 aminokiselina, P je BAFF-vezujući peptid koji je dugačak 10 do 40 aminokiselina, a L2 je drugi peptidni linker koji je odsutan ili je dugačak 5 do 50 aminokiselina, i
b) imunoglobulinski laki lanac IgG antitela,
gde teški lanac imunoglobulina (a) i laki lanac imunoglobulina (b) formiraju IgG antitelo, koje se sastoji od dva molekula polipeptida (a) i dva molekula lakog lanca (b), koji mogu da vežu B7RP1, i
gde protein može da inhibira BAFF-posredovanu proliferaciju humanih B ćelija, i gde protein može da inhibira B7RP1-posredovanu proliferaciju humanih T ćelija, i gde je ćelija domaćina bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta, ćelija biljke ili ćelija sisara.
2. Ćelija domaćina zahteva 1, gde bispecifični protein sadrži imunoglobulinski teški lanac kome nedostaje lizin na njegovom C-terminalnom kraju neposredno uzvodno od L1.
3. Ćelija domaćina zahteva 1, gde je IgG antitelo humano ili humanizovano anti-B7RP1 IgG1 antitelo.
4. Ćelija domaćina zahteva 1 ili 2, gde je anti-B7RP1 antitelo humano ili humanizovano IgG2 antitelo, ili humano ili humanizovano IgG4 antitelo.
5. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 1-4, gde P ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL).
6. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 1-5, gde L1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40 (GGGGG).
7. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 1-6, gde L2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, poželjno gde L2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7.
8. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 1-7, koja kodira laki lanac CDR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8 (RASQGISNWLA), laki lanac CDR2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 (AASSLQS), laki lanac CDR3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:10 (QQYDSYPRT), teški lanac CDR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:11 (SYWMS), teški lanac CDR2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:12 (YIKQDGNEKYVDSVKG) i teški lanac CDR3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:13 (EGILWFDLPF).
9. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 1-8, gde kodirani bispecifični protein obuhvata varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14.
10. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 1-9, gde kodirani bispecifični protein obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15.
11. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 5-10, gde laki lanac imunoglobulina (b) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19.
12. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 5-11, gde polipeptid (a) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17 ili 18.
13. Ćelija domaćina zahteva 1, gde polipeptid (a) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17 ili SEQ ID NO:18, i polipeptid (b) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19.
14. Ćelija domaćina zahteva 1, gde bispecifični protein obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:14 i SEQ ID NO:15, poželjno, gde protein dalje obuhvata linker koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7.
1
15. Ćelija domaćina bilo kog od zahteva 1-14, gde je ćelija domaćina ćelija sisara izabrana iz grupe koju čine ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna, ćelije HeLa, ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma i ćelije 293.
16. Metoda za pravljenje bispecifičnog proteina koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina bilo kog od zahteva 1-14 pod uslovima da je nukleinska kiselina eksprimirana i izdvaja protein iz ćelijske mase ili kultivacionog medija, pri čemu je ćelija domaćin bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta ili ćelija biljke.
17. Metoda zahteva 16, gde se nukleinska kiselina ili vektor unosi u ćeliju putem
(a) elektroporacije ili kalcijum hlorid transformacije, pri čemu je ćelija domaćina bakterijska ćelija, ili
b) litijum acetat transformacije ili polietilen glikol transformacije, pri čemu je ćelija domaćina ćelija kvasca.
1 4
RS20220711A 2013-03-13 2014-03-12 Proteini specifični za baff i b7rp1 i njihova upotreba RS63431B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361780260P 2013-03-13 2013-03-13
US201461942776P 2014-02-21 2014-02-21
EP18182864.1A EP3456344B1 (en) 2013-03-13 2014-03-12 Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63431B1 true RS63431B1 (sr) 2022-08-31

Family

ID=50483540

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220711A RS63431B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-12 Proteini specifični za baff i b7rp1 i njihova upotreba
RS20181088A RS57689B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-12 Proteini specifični za baff i b7rp1 i njihove upotrebe

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181088A RS57689B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-12 Proteini specifični za baff i b7rp1 i njihove upotrebe

Country Status (36)

Country Link
US (4) US10421823B2 (sr)
EP (3) EP3456344B1 (sr)
JP (2) JP6523243B2 (sr)
KR (2) KR102361632B1 (sr)
CN (2) CN110437336B (sr)
AP (1) AP2015008768A0 (sr)
AU (1) AU2014244498B2 (sr)
CA (1) CA2904992C (sr)
CL (1) CL2015002600A1 (sr)
CR (1) CR20150544A (sr)
CY (2) CY1120569T1 (sr)
DK (2) DK3456344T3 (sr)
EA (1) EA035388B1 (sr)
ES (3) ES2923909T3 (sr)
HR (2) HRP20220884T1 (sr)
HU (2) HUE040169T2 (sr)
IL (1) IL241281B (sr)
JO (2) JOP20140087B1 (sr)
LT (2) LT3456344T (sr)
MX (2) MX369502B (sr)
MY (2) MY171938A (sr)
NZ (2) NZ751502A (sr)
PE (1) PE20151772A1 (sr)
PH (2) PH12022550138A1 (sr)
PL (2) PL3456344T3 (sr)
PT (2) PT2968491T (sr)
RS (2) RS63431B1 (sr)
SG (1) SG11201507208VA (sr)
SI (2) SI3456344T1 (sr)
SM (2) SMT201800515T1 (sr)
TN (1) TN2015000414A1 (sr)
TW (1) TWI603978B (sr)
UA (1) UA120034C2 (sr)
UY (1) UY35396A (sr)
WO (1) WO2014159725A1 (sr)
ZA (1) ZA201506708B (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU229910B1 (hu) * 2001-05-11 2014-12-29 Amgen Inc Thousand Oaks A TALL-1-hez kötõdõ peptidek és rokon molekulák
US9458246B2 (en) * 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
PH12022550138A1 (en) 2013-03-13 2023-03-06 Amgen Inc Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof
ITUB20151014A1 (it) * 2015-05-27 2016-11-27 Univ Degli Studi Del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro Ligandi del recettore b7h nel trattamento di osteopenia e osteoporosi
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
KR102956998B1 (ko) * 2018-07-31 2026-04-27 도꾜 다이가꾸 새로운 결합 특이성을 항체에 부여하는 초범용법
CN111925442B (zh) * 2020-08-19 2022-10-11 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
TW202440636A (zh) 2023-03-21 2024-10-16 美商傳記５５有限公司 Ｃｄ１９／ｃｄ３８多特異性抗體
TW202544037A (zh) * 2023-12-11 2025-11-16 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司 抗原結合蛋白

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US6018026A (en) 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
WO1990014363A1 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Amgen Inc. Metalloproteinase inhibitor
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US6641809B1 (en) 1990-03-26 2003-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Method of regulating cellular processes mediated by B7 and CD28
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
JPH06508035A (ja) 1991-06-14 1994-09-14 ディーエヌエックス　コーポレーション トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5733731A (en) 1991-10-16 1998-03-31 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
ES2178654T3 (es) 1993-08-12 2003-01-01 Neurotech Sa Capsulas biocompatibles inmonoaisladoras que contienen celulas geneticamente alteradas para el suministro de moleculas biologicamente activas.
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5922545A (en) 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
DE4435919C1 (de) 1994-10-07 1995-12-07 Deutsches Krebsforsch Zinkfinger-DNA, -Protein und ihre Verwendung
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JPH11506722A (ja) 1995-06-07 1999-06-15 ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン 細胞に核酸を送達するための核酸運搬体
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
EP0934526B1 (en) 1996-10-08 2003-01-08 U-BISys B.V. Methods and means for selecting peptides and proteins having specific affinity for a target
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
NZ334309A (en) 1996-10-25 2000-08-25 Human Genome Sciences Inc Neutrokine alpha protein, a member of the TNF family, and its use in treating and/or detecting immune disorders
WO1999035170A2 (en) 1998-01-05 1999-07-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor
EP1972194A1 (en) 1996-12-03 2008-09-24 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7112655B1 (en) 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
EP1012292A1 (en) 1997-06-06 2000-06-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
EP0991759A1 (en) 1997-06-06 2000-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
TR200000654T2 (tr) 1997-09-12 2000-07-21 Apotech R & D Sa KAY-Yeni bir bağışıklık sistemi proteini.
DE19821060A1 (de) 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
JP4463418B2 (ja) 1997-09-23 2010-05-19 ドイツ連邦共和国 Ｔ細胞共同刺激性ポリペプチド、モノクローナル抗体、ならびにその製法および使用
WO1999062951A1 (en) 1998-06-04 1999-12-09 Shanghai Second Medical University A human zinc finger protein gene (bmzf3)
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CZ303272B6 (cs) 1999-01-07 2012-07-11 Zymogenetics, Inc. Farmaceutický prostredek obsahující fúzní protein, izolovaná molekula polynukleotidu, expresní vektor, kultivovaná bunka, zpusob prípravy polypeptidu a izolovaný polypeptid
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
CZ299819B6 (cs) 1999-01-25 2008-12-03 Biogen Idec Ma Inc. Farmaceutické kompozice obsahující protilátky specifické pro rozpustný BAFF
US8624010B1 (en) 1999-02-03 2014-01-07 Steven K. Yoshinaga Nucleic acids encoding B7RP1
EP2332976B1 (en) 1999-02-03 2014-04-02 Amgen, Inc Novel polypeptides involved in immune response
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
US7435796B1 (en) 1999-02-03 2008-10-14 Amgen Inc. Antibodies which bind B7RP1
WO2000047740A2 (en) 1999-02-12 2000-08-17 Amgen Inc. Tnf-related proteins
BR0009323A (pt) 1999-03-25 2002-01-08 Knoll Gmbh Anticorpos humanos que ligam a il-12 humana e métodos para a produção
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
WO2000068378A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EP1194451A1 (en) 1999-07-02 2002-04-10 Genentech, Inc. Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
CN1399645A (zh) 1999-07-29 2003-02-26 米德列斯公司 Her2/neu的人单克隆抗体
WO2001012658A2 (en) 1999-08-11 2001-02-22 Isis Innovations Limited Human icos ligand and application thereof
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
EP1900816A3 (en) 1999-09-21 2008-03-26 Genetics Institute, LLC GL50 molecules and uses therefor
EP1218504B1 (en) 1999-09-21 2007-07-11 Genetics Institute, LLC Gl50 molecules and uses therefor
EP1254227A2 (en) 2000-02-11 2002-11-06 Amgen Inc. Fusion receptor from tnf family
AU2001245396A1 (en) 2000-03-02 2001-09-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hb7-h2, a novel co-stimulatory molecule
AU2001268427B2 (en) 2000-06-16 2007-03-29 Glaxosmithkline Intellectual Property Limited Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
GB0016633D0 (en) 2000-07-07 2000-08-23 Bp Exploration Operating Process
US6635750B1 (en) 2000-07-20 2003-10-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. B7-H2 nucleic acids, members of the B7 family
AU2001288301A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
EP2267017A3 (en) 2000-08-18 2011-07-06 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
EP2042596B1 (en) 2000-11-28 2015-02-11 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
WO2002057435A2 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Merck Patent Gmbh Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
HU229910B1 (hu) 2001-05-11 2014-12-29 Amgen Inc Thousand Oaks A TALL-1-hez kötõdõ peptidek és rokon molekulák
AR035119A1 (es) 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
WO2004043989A2 (en) 2002-11-07 2004-05-27 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to heparanase
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
WO2004060911A2 (en) 2002-12-30 2004-07-22 Amgen Inc. Combination therapy with co-stimulatory factors
AU2004242845B2 (en) 2003-05-31 2011-06-02 Amgen Research (Munich) Gmbh Human-anti-human CD3 binding molecules
US7271245B2 (en) 2004-02-13 2007-09-18 The Scripps Research Institute Methods and compositions for inhibition of metastasis
WO2006003999A1 (ja) 2004-07-05 2006-01-12 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗ヒトb7rp-1抗体およびその抗体フラグメント
EP1773400A2 (en) 2004-07-08 2007-04-18 Amgen Inc. Therapeutic peptides
CA2580796C (en) 2004-09-24 2013-03-26 Amgen Inc. Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions
DK1915398T3 (en) * 2005-07-18 2016-07-04 Amgen Inc Humane anti-B7RP1 neutraliserende antistoffer
KR20140053410A (ko) 2005-08-19 2014-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
AR056806A1 (es) * 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
CA2681728C (en) 2007-03-27 2015-12-22 Zymogenetics, Inc. Combination of blys and/or april inhibition and immunnosuppressants for treatment of autoimmune disease
AR067584A1 (es) 2007-07-20 2009-10-14 Hoffmann La Roche Un conjugado de un anticuerpo contra la cd4 y peptidos antifusogenicos
WO2009015345A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
DK2233149T3 (en) 2007-10-16 2016-05-17 Zymogenetics Inc COMBINATION OF TRANSMEMBRANAKTIVATOR AND CALCIUM MODULATOR AND cyclophilin-LIGAND INTERAKTOR (TACI) AND ANTI-CD20 MEANS FOR TREATMENT OF AUTO-IMMUNE DISEASE
EP2072527A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-24 Altonabiotec AG Fusion polypeptides comprising a SHBG dimerization component and uses thereof
US8557243B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute EFGR antibodies comprising modular recognition domains
EA021967B1 (ru) 2008-01-03 2015-10-30 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Доставка антител посредством модульного домена распознавания
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
FR2944448B1 (fr) * 2008-12-23 2012-01-13 Adocia Composition pharmaceutique stable comprenant au moins un anticorps monodonal et au moins un polysacharide amphiphile comprenant des substituants derives d'alcools hydrofobes ou d'amines hydrophobes.
DK2714738T3 (en) 2011-05-24 2019-01-28 Zyngenia Inc MULTIVALENT AND MONOVALENT MULTISPECIFIC COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS
AR090626A1 (es) 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos
PH12022550138A1 (en) * 2013-03-13 2023-03-06 Amgen Inc Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof
US9458246B2 (en) * 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
MX2015013163A (es) 2013-03-15 2016-04-04 Zyngenia Inc Complejos multiespecificos multivalente y monovalentes y sus usos.
CA2934965A1 (en) 2014-01-31 2016-03-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel anti-baff antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
AP2015008768A0 (en) 2015-09-30
DK2968491T3 (en) 2018-10-22
CN105324127B (zh) 2019-07-05
EA201591720A1 (ru) 2016-01-29
NZ751502A (en) 2021-07-30
CY1125447T1 (el) 2025-05-09
JP6523243B2 (ja) 2019-05-29
BR112015022300A2 (pt) 2017-10-10
WO2014159725A1 (en) 2014-10-02
KR102361632B1 (ko) 2022-02-14
HUE059507T2 (hu) 2022-11-28
KR20210021123A (ko) 2021-02-24
LT3456344T (lt) 2022-08-10
LT2968491T (lt) 2018-10-10
IL241281B (en) 2020-03-31
ES3058850T3 (en) 2026-03-13
CR20150544A (es) 2015-12-01
EP3689371A1 (en) 2020-08-05
EP3689371B1 (en) 2025-10-22
NZ711954A (en) 2021-07-30
SMT202200322T1 (it) 2022-11-18
US20230128444A1 (en) 2023-04-27
KR102218723B1 (ko) 2021-02-24
EP2968491A1 (en) 2016-01-20
HRP20181629T1 (hr) 2018-12-14
JOP20210010A1 (ar) 2023-01-30
AU2014244498B2 (en) 2017-12-14
PL2968491T3 (pl) 2019-01-31
UA120034C2 (uk) 2019-09-25
EP3456344A1 (en) 2019-03-20
PL3456344T3 (pl) 2022-09-12
CY1120569T1 (el) 2019-07-10
PH12015502074A1 (en) 2016-01-25
CN110437336A (zh) 2019-11-12
US20260132222A1 (en) 2026-05-14
MX2019013442A (es) 2020-01-14
JOP20140087B1 (ar) 2021-08-17
US11492417B2 (en) 2022-11-08
KR20150130343A (ko) 2015-11-23
CL2015002600A1 (es) 2016-09-09
JP2016512546A (ja) 2016-04-28
ES2687299T3 (es) 2018-10-24
HRP20220884T1 (hr) 2022-10-14
CA2904992A1 (en) 2014-10-02
ES2923909T3 (es) 2022-10-03
ZA201506708B (en) 2017-07-26
SMT201800515T1 (it) 2018-11-09
SG11201507208VA (en) 2015-10-29
MX2015012440A (es) 2016-01-25
MY171938A (en) 2019-11-07
PH12022550138A1 (en) 2023-03-06
PT3456344T (pt) 2022-07-29
UY35396A (es) 2014-09-30
US12479930B2 (en) 2025-11-25
TW201446797A (zh) 2014-12-16
CN105324127A (zh) 2016-02-10
CN110437336B (zh) 2024-08-27
HUE040169T2 (hu) 2019-02-28
AU2014244498A1 (en) 2015-09-24
BR112015022300A8 (pt) 2018-01-23
IL241281A0 (en) 2015-11-30
PT2968491T (pt) 2018-11-08
TWI603978B (zh) 2017-11-01
CA2904992C (en) 2023-07-04
HK1218885A1 (en) 2017-03-17
EP3456344B1 (en) 2022-05-04
MX369502B (es) 2019-11-11
PE20151772A1 (es) 2015-12-17
EA035388B1 (ru) 2020-06-04
JP6825033B2 (ja) 2021-02-03
JP2019141084A (ja) 2019-08-29
SI3456344T1 (sl) 2022-09-30
US10421823B2 (en) 2019-09-24
MY198370A (en) 2023-08-28
DK3456344T3 (da) 2022-08-01
RS57689B1 (sr) 2018-11-30
US20160024225A1 (en) 2016-01-28
TN2015000414A1 (en) 2017-01-03
SI2968491T1 (sl) 2018-11-30
EP2968491B1 (en) 2018-07-18
US20210206881A1 (en) 2021-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12479930B2 (en) Proteins specific for BAFF and B7RP1 and uses thereof
JP7410143B2 (ja) 二重特異性抗体及びその用途
US10421824B2 (en) Proteins specific for BAFF and B7RP1
CA2705292C (en) Humanized antibodies against tl1a
JP2012531885A (ja) Ｉｌ６免疫治療剤
CN118317975A (zh) 靶向baff-r的抗体及其用途
IL307336A (en) Novel tnfr2 binding molecules
JP2025527967A (ja) タンパク質結合ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及びｃｅａｃａｍ５
HK40005997A (en) Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof
HK40005997B (en) Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof
HK1218885B (en) Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof
BR112015022300B1 (pt) Proteínas específicas para baff e b7rp1, seu método de produção bem como seu uso, composições farmacêuticas, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira microbiana