ES2926021T3 - Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona un método para introducir roturas de doble cadena en un ADN diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método poner en contacto el ADN diana con un sistema CRISPR/Cas9 de tipo II que comprende (a) proteína Cas9 con una señal de localización nuclear añadida a la C -terminal de la proteína Cas9; y (b) un ARN guía monocatenario que comprende una porción de crRNA fusionada con una porción de tracrRNA, en el que el método no es para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, y en el que el método no modifica la identidad genética de la línea germinal de seres humanos. La invención proporciona además una célula de mamífero que comprende dicho sistema CRISPR/Cas9 de tipo II y un método para preparar dicha célula de mamífero. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma
Campo técnico
La presente invención generalmente se relaciona con la edición orientada del genoma en células u organismos eucariotas. Más particularmente, la presente invención se relaciona con métodos para escindir un ADN objetivo en células u organismos eucariotas que comprenden un ARN guía específico para el ADN objetivo y el ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o la proteína Cas9, y usos de los mismos.
Antecedente de la técnica
Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) son loci que contienen múltiples repeticiones cortas directas que se encuentran en los genomas de aproximadamente 40 % de las bacterias secuenciadas y 90 % de las arqueas secuenciadas. Las CRISPR funcionan como un sistema inmunológico procariótico, ya que confiere resistencia a elementos genéticos exógenos como plásmidos y fagos. El sistema CRISPR proporciona una forma de inmunidad adquirida. Los segmentos cortos de ADN extraño, llamados espaciadores, se incorporan al genoma entre las repeticiones de CRISPR y sirven como memoria de exposiciones pasadas. Luego, los espaciadores CRISPR se utilizan para reconocer y silenciar elementos genéticos exógenos de una manera análoga al ARNi en organismos eucariotas.
Cas9, un componente proteico esencial en el sistema CRISPR/Cas Tipo II, forma una endonucleasa activa cuando se combina con dos ARN denominados ARN CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr), cortando así elementos genéticos extraños en fagos o plásmidos invasores para proteger las células huésped. El ARNcr se transcribe desde el elemento CRISPR en el genoma del huésped, que se capturó previamente de tales invasores extraños. Recientemente, Jinek et al. (1) demostraron que un ARN quimérico de cadena única producido mediante la fusión de una porción esencial de ARNcr y ARNtracr podría reemplazar los dos ARN en el complejo Cas9/ARN para formar una endonucleasa funcional.
Los sistemas CRISPR/Cas ofrecen una ventaja para los dedos de zinc y las proteínas de unión al ADN efectoras similares a activadores de la transcripción, ya que la especificidad del sitio en las proteínas CRISPR-Cas de unión de nucleótidos se rige por una molécula de a Rn en lugar de la proteína de unión al ADN, que puede ser más difícil de diseñar y sintetizar.
Sin embargo, hasta ahora no se ha desarrollado un método de edición del genoma que utilice la endonucleasa guiada por ARN (RGEN) con base en el sistema CRISPR/Cas.
Mientras tanto, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es uno de los métodos de genotipado más antiguos, convenientes y menos costosos que todavía se usa ampliamente en biología molecular y genética, pero a menudo está limitado por la falta de sitios apropiados reconocidos por las endonucleasas de restricción.
Las mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas se detectan mediante diversos métodos, que incluyen endonucleasa T7 sensible a errores de emparejamiento (T7E1) o ensayos de nucleasa Surveyor, RFLP, electroforesis capilar de productos de PCR fluorescentes, secuenciación didesoxi y secuenciación profunda. Los ensayos T7E1 y Surveyor se utilizan ampliamente, pero son engorrosos. Además, estas enzimas tienden a subestimar las frecuencias de mutación porque las secuencias mutantes pueden formar homodúplex entre sí y no pueden distinguir los clones mutantes bialélicos homocigóticos de las células de tipo silvestre. RFLP está libre de estas limitaciones y por lo tanto es un método de elección. De hecho, RFLP fue uno de los primeros métodos para detectar mutaciones mediadas por nucleasas diseñadas en células y animales. Desafortunadamente, sin embargo, RFLP está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción apropiados. Es posible que no haya sitios de restricción disponibles en el sitio objetivo de interés.
Divulgación de la invención
Hasta ahora, no se ha desarrollado un método de edición y genotipado del genoma utilizando la endonucleasa guiada por ARN (RGEN) con base en el sistema CRISPR/Cas.
Bajo estas circunstancias, los presentes inventores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un método de edición del genoma con base en el sistema CRISPR/Cas y finalmente establecieron una endonucleasa programable guiada por ARN que escinde el ADN de forma orientada en células y organismos eucariotas.
Además, los presentes inventores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un método novedoso de uso de endonucleasas guiadas por ARN (RGEN) en el análisis de RFLP. Han usado RGEN para genotipar mutaciones recurrentes que se encuentran en el cáncer y aquellas inducidas en células y organismos por nucleasas modificadas genéticamente que incluyen los propios RGEN, completando así la presente invención.
Resumen de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos para escindir un ADN objetivo en células de mamífero que comprenden poner en contacto el ADN objetivo con un sistema de proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR/repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas Tipo II (CRISPR) que comprende una guía ARN específico para el ADN objetivo y una proteína Cas9, como se define en las reivindicaciones. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para fabricar una célula de mamífero que comprenda el sistema CRISPR/Cas9 anterior.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro o ex vivo para introducir roturas de doble cadena en un ADN objetivo en una célula de mamífero, comprendiendo el método poner en contacto el ADN objetivo con un sistema CRISPR/Cas9 que comprende (a) una proteína Cas9 con una señal de localización nuclear (NLS) añadida al terminal C de la proteína Cas9; y (b) un ARN guía de cadena única que comprende una porción de ARN CRISPR (ARNcr) fusionada con una porción de ARNcr de transactivación (ARNtracr), en la que el método comprende transfectar la célula de mamífero con un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 seguido de la transfección de la célula de mamífero con el ARN guía de cadena única.
En una realización, la proteína Cas9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes.
En otra realización, el ARN guía de cadena única es un ARN transcrito in vitro.
En otra realización, el ADN objetivo es un ADN genómico.
En otra realización, la secuencia de ADN objetivo consiste en 20 nucleótidos complementarios a la porción de ARNcr del ARN guía de cadena única y un motivo adyacente al protoespaciador de trinucleótido (PAM), y en donde el PAM consiste en el trinucleótido 5'-NGG-3'.
En otra realización, la porción de ARNcr del ARN guía de cadena única comprende 20 nucleótidos complementarios a la secuencia de ADN objetivo.
En otra realización, la célula de mamífero es una célula humana.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos in vitro o ex-vivo para preparar la célula de mamífero de la invención, comprendiendo el método transfectar en serie una célula de mamífero con (a) un ácido nucleico que codifica una proteína Cas9 con una señal de localización nuclear (NLS) añadida al terminal C de la proteína Cas9; y (b) un ARN guía de cadena única que comprende una porción de ARN CRISPR (ARNcr) fusionada con una porción de ARNcr de transactivación (ARNtracr), en la que el método comprende transfectar la célula de mamífero con el ácido nucleico seguido de la transfección de la célula de mamífero con el ARN guía de cadena única.
En una realización de los métodos, la proteína Cas9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes.
En otra realización de los métodos, el ARN guía de cadena única es un ARN transcrito in vitro.
En otra realización de los métodos, la célula de mamífero es una célula humana.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 muestra la escisión del ADN plasmídico catalizado por Cas9 in vitro. (a) Representación esquemática de las secuencias de ADN objetivo y ARN quimérico. Los triángulos rojos indican sitios de división. La secuencia PAM reconocida por Cas9 se muestra en negrilla. Las secuencias en el ARN guía derivado de ARNcr y ARNtracr se muestran en recuadro y subrayadas, respectivamente. (b) escisión in vitro del ADN plasmídico por Cas9. Se incubó un plásmido circular intacto o un plásmido digerido con ApaLI con Cas9 y ARN guía.
Fig. 2 muestra la mutagénesis inducida por Cas9 en un sitio objetivo episomal. (a) Descripción general esquemática de los ensayos con base en células utilizando un reportero RFP-GFP. GFP no se expresa desde este reportero porque la secuencia GFP está fusionada con la secuencia RFP fuera de marco. La proteína de fusión RFP-GFP se expresa solo cuando el sitio objetivo entre las dos secuencias se escinde mediante una nucleasa específica del sitio. (b) Citometría de flujo de células transfectadas con Cas9. Se indica el porcentaje de células que expresan la proteína de fusión RFP-GFP.
Fig. 3 muestra mutaciones impulsadas por RGEN en sitios cromosómicos endógenos. (a) locus CCR5. (b) locus C4BPB. (Arriba) El ensayo T7E1 se utilizó para detectar mutaciones impulsadas por RGEN. Las flechas indican la posición esperada de las bandas de ADN escindidas por T7E1. Las frecuencias de mutación (Indeles (%)) se calcularon midiendo las intensidades de las bandas. (Abajo) Secuencias de ADN de los clones mutantes y de tipo silvestre (WT) CCR5 y C4BPB. La región de la secuencia objetivo complementaria al ARN guía se muestra en el recuadro. La secuencia PAM se muestra en negrita. Los triángulos indican el sitio de escisión. Las bases correspondientes a las microhomologías están subrayadas. La columna de la derecha indica el número de bases insertadas o eliminadas.
Fig. 4 muestra que las mutaciones fuera del objetivo impulsadas por RGEN son indetectables. (a) Secuencias en el objetivo y potencialmente fuera del objetivo. El genoma humano fue buscado en silico para posibles sitios fuera de objetivo. Se identificaron cuatro sitios, cada uno de los cuales presenta desajustes de 3 bases con el sitio CCR5 en el objetivo. Las bases no coincidentes están subrayadas. (b) El ensayo T7E1 se usó para investigar si estos sitios estaban mutados en células transfectadas con el complejo Cas9/ARN. No se detectaron mutaciones en estos sitios. N/A (no aplicable), un sitio intergénico. (c) Cas9 no indujo eliminaciones cromosómicas asociadas fuera del objetivo. El RGEN y ZFN específicos de CCR5 se expresaron en células humanas. Se usó PCR para detectar la inducción de eliminaciones cromosómicas de 15 kb en estas células.
Fig. 5 muestra la orientación del gen Foxnl inducido por RGEN en ratones. (a) Un diagrama esquemático que representa un ARNsg específico para el exón 2 del gen Foxnl de ratón PAM en el exón 2 se muestra en rojo y la secuencia en el ARNsg que es complementaria al exón 2 está subrayada. Los triángulos indican sitios de división. (b) Ensayos representativos de T7E1 que demuestran eficiencias dirigidas a genes de ARNm Cas9 más ARNsg específico de Foxn1 que se administraron mediante inyección intracitoplasmática en embriones de ratón en etapa de una célula. Los números indican ratones fundadores independientes generados a partir de la dosis más alta. Las flechas indican bandas escindidas por T7E1. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes observados en tres fundadores mutantes Foxnl identificados en (b). El número de ocurrencias se muestra entre paréntesis. (d) Genotipado por PCR de progenies F1 derivadas del cruce de Foxnl fundador #108 y FVB/NTac de tipo silvestre. Nótese la segregación de los alelos mutantes encontrados en Foxnl fundador #108 en las progenies.
Fig. 6 muestra la orientación del gen Foxnl en embriones de ratón mediante inyección intracitoplasmática de ARNm Cas9 y Foxnl-ARNsg. (a) Un resultado representativo de un ensayo T7E1 que monitoriza la tasa de mutación después de inyectar la dosis más alta. Las flechas indican bandas escindidas por T7E1. (b) Un resumen de los resultados del ensayo T7E1. Se indican las fracciones mutantes entre embriones cultivados in vitro obtenidos después de la inyección intracitoplasmática de las dosis de RGEN indicadas. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes de Foxnl identificados a partir de un subconjunto de embriones mutantes positivos para T7E1. La secuencia objetivo del alelo de tipo silvestre se indica en el recuadro.
Fig. 7 muestra la orientación del gen Foxn1 en embriones de ratón utilizando la proteína Cas9 recombinante: Complejo Foxnl-ARNsg. (a) y (b) son resultados de ensayos T7E1 representativos y sus resúmenes. Los embriones fueron cultivados in vitro después de que se sometieran a una inyección pronuclear (a) o intracitoplasmática (b). Los números en rojo indican ratones fundadores mutantes positivos para T7E1. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes de Foxnl identificados a partir de embriones cultivados in vitro que se obtuvieron mediante la inyección pronúcleo de proteína Cas9 recombinante: Complejo Foxnl-ARNsg en la dosis más alta. La secuencia objetivo del alelo de tipo silvestre se indica en el recuadro.
Fig. 8 muestra la transmisión de la línea germinal de los alelos mutantes encontrados en el mutante fundador #12 de Foxnl. (a) análisis de fPCR. (b) Genotipado por PCR de FVB/NTac de tipo silvestre, el ratón fundador y sus progenies F1.
Fig. 9 muestra genotipos de embriones generados cruzando fundadores mutantes de Prkdc. Se cruzaron fundadores mutantes de Prkdc c?25 y $ 15 y se aislaron embriones E13.5. (a) análisis de fPCR de tipo silvestre, fundador c?25, y fundador $15. Nótese que, debido a las limitaciones técnicas del análisis fPCR, estos resultados mostraron pequeñas diferencias con respecto a las secuencias precisas de los alelos mutantes; por ejemplo, a partir del análisis de secuencia, se identificaron A269/A61/WT y A5+1/+7/+12/WT en los fundadores c?25 y $ 15, respectivamente. (b) Genotipos de los embriones generados.
Fig. 10 muestra la mutación dirigida inducida por el complejo proteína Cas9/ARNsg.
Fig. 11 muestra mutaciones inducidas por la proteína Cas9 recombinante en protoplastos de Arabidopsis.
Fig. 12 muestra secuencias mutantes inducidas por proteína Cas9 recombinante en el gen BRI1 de Arabidopsis.
Fig. 13 muestra el ensayo T7E1 que muestra la interrupción del gen CCR5 endógeno en células 293 mediante el tratamiento de Cas9-mal-9R4L y el complejo ARNsg/C9R4LC.
Fig. 14 (a, b) muestra las frecuencias de mutación en los sitios dentro y fuera del objetivo de los RGEN informados en Fu et al. (2013). Ensayos T7E1 que analizan ADN genómico de células K562 (R) transfectadas en serie con 20 |jg de plásmido que codifica Cas9 y con 60 |jg y 120 |jg de in vitro GX transcritoig ARNcr y ARNtracr, respectivamente (1 * 106 células), o (D) cotransfectadas con 1 jg de plásmido que codifica Cas9 y 1 jg de GXig plásmido de expresión de ARNsg (2 * 105 células).
Fig. 15 (a, b) muestra la comparación de la estructura del ARN guía. Las frecuencias de mutación de los RGEN informados en Fu et al. (2013) se midieron en sitios dentro y fuera del objetivo utilizando el ensayo T7E1. Las células K562 se cotransfectaron con el plásmido que codifica Cas9 y el plásmido que codifica GX1g ARNsg o GGX20 ARNsg. Los sitios fuera del objetivo (OT1-3, etc.) están etiquetados como en Fu et al. (2013).
Fig. 16 muestra que la escisión del ADN in vitro por nicasas Cas9. (a) Descripción esquemática de la nucleasa Cas9 y la nicasa Cas9 emparejada. Las secuencias de PAM y los sitios de escisión se muestran en el recuadro. (b) Sitios objetivo en el locus AAVS1 humano. La posición de cada sitio objetivo se muestra en un triángulo, (c) Resumen esquemático de las reacciones de escisión del ADN. Los colorantes FAM (que se muestran en el recuadro) se unieron a ambos extremos 5' del sustrato de ADN. (d) DSB y SSB analizados mediante electroforesis capilar fluorescente. Los sustratos de ADN marcados con fluorescencia se incubaron con nucleasas o nicasas Cas9 antes de la electroforesis.
Fig. 17 muestra la comparación del comportamiento de la nucleasa Cas9 y la nicasa. (a) Frecuencias de mutación en el objetivo asociadas con nucleasas Cas9 (WT), nicasas (D10A) y nicasas emparejadas. Se indican las nicasas emparejadas que producirían voladizos de 5' o de 3'. (b) Análisis de los efectos fuera del objetivo de las nucleasas Cas9 y las nicasas emparejadas. Se analizaron un total de siete posibles sitios fuera del objetivo para tres ARNsg.
Fig. 18 muestra nicasas Cas9 emparejadas probadas en otros loci humanos endógenos. (a, c) Los sitios objetivo de ARNsg en los loci CCR5 y BRCA2 humanos. Las secuencias de PAM se indican en rojo. (b, d) Las actividades de edición del genoma en cada sitio objetivo fueron detectadas por el ensayo T7E1. La reparación de dos mellas que producirían voladizos de 5' condujo a la formación de indeles con mucha más frecuencia que los que producían voladizos de 3'.
Fig. 19 muestra que las nicasas Cas9 emparejadas median la recombinación homóloga. (a) Estrategia para detectar la recombinación homóloga. El ADN del donante incluía un sitio de la enzima de restricción Xbal entre dos brazos de homología, mientras que el sitio objetivo endógeno carecía de este sitio. Se usó un ensayo de PCR para detectar secuencias que habían sufrido recombinación homóloga. Para evitar la amplificación del ADN donante contaminante, se usaron cebadores específicos para el ADN genómico. (b) Eficiencia de la recombinación homóloga. Solo los amplicones de una región en la que se había producido una recombinación homóloga podían digerirse con Xbal; las intensidades de las bandas de escisión se usaron para medir la eficiencia de este método.
Fig. 20 muestra el empalme de ADN inducido por nicasas Cas9 emparejadas. (a) Los sitios objetivo de nicasas emparejadas en el locus AAVS1 humano. Se muestran las distancias entre el sitio AS2 y cada uno de los otros sitios. Las flechas indican cebadores de PCR, (b) Eliminaciones genómicas detectadas mediante PCR. Los asteriscos indican productos de PCR específicos de eliminaciones. (c) Secuencias de ADN de productos de PCR específicos de eliminación obtenidos utilizando ARNsg AS2 y L1. Las secuencias de PAM del sitio objetivo se muestran en el recuadro y las secuencias coincidentes de ARNsg se muestran en letras mayúsculas. Las secuencias coincidentes de ARNsg intactas están subrayadas. (d) Un modelo esquemático de eliminaciones cromosómicas mediadas por nicasa Cas9 emparejadas. Las cadenas de ADN recién sintetizadas se muestran en el recuadro.
Fig. 21 muestra que las nicasas Cas9 emparejadas no inducen translocaciones. (a) Resumen esquemático de las translocaciones cromosómicas entre los sitios en el objetivo y fuera del objetivo. (b) Amplificación por PCR para detectar translocaciones cromosómicas. (c) Translocaciones inducidas por nucleasas Cas9, pero no por el par de nicasa.
Fig. 22 muestra un diagrama conceptual de los ensayos T7E1 y RFLP. (a) Comparación de las reacciones de escisión del ensayo en cuatro escenarios posibles después del tratamiento con nucleasas diseñadas en una célula diploide: (A) tipo silvestre, (B) una mutación monoalélica, (C) mutaciones bialélicas diferentes (hetero) y (D) mutaciones bialélicas idénticas (homo). Las líneas negras representan productos de PCR derivados de cada alelo; los recuadros discontinuos y punteados indican mutaciones de inserción/eliminación generadas por NHEJ. (b) Resultados esperados de la digestión de T7E1 y RGEN resueltos por electroforesis.
Fig. 23 espectáculos in vitro ensayo de escisión de un plásmido linealizado que contiene indeles portadores del sitio objetivo C4BPB. Secuencias de ADN de sustratos de plásmidos individuales (panel superior). La secuencia PAM está subrayada. Las bases insertadas se muestran en el recuadro. Las flechas (panel inferior) indican las posiciones esperadas de las bandas de ADN escindidas por el RGEN específico de tipo silvestre después de la electroforesis.
Fig. 24 muestra el genotipado de mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas en células a través de RFLP mediado por RGEN. (a) Genotipo de clones de células K562 mutantes C4BPB. (b) Comparación del ensayo T7E1 sensible a desajuste con el análisis RFLP mediado por RGEN. Las flechas negras indican el producto de escisión por tratamiento de enzima T7E1 o RGEN.
Fig. 25 muestra el genotipado de mutaciones inducidas por RGEN a través de la técnica RGEN-RFLP. (a) Análisis de clones interrumpidos por C4BPB utilizando ensayos RGEN-RFLP y T7E1. Las flechas indican las posiciones esperadas de las bandas de ADN escindidas por RGEN o T7E1. (b) Comparación cuantitativa del análisis RGEN-RFLP con ensayos T7E1. Se mezclaron muestras de ADN genómico de células K562 de tipo silvestre y C4BPB alteradas en diversas proporciones y se sometieron a amplificación por PCR. (c) Genotipado de mutaciones inducidas por RGEN en el gen HLA-B en células HeLa con análisis RFLP y T7E1.
Fig. 26 muestra el genotipado de mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas en organismos a través de RFLP mediado por RGEN. (a) Genotipo de ratones fundadores mutantes Pibfl. (b) Comparación del ensayo T7E1 sensible a desajuste con el análisis RFLP mediado por RGEN. Las flechas negras indican el producto de escisión por tratamiento de enzima T7E1 o RGEN.
Fig. 27 muestra el genotipado mediado por RGEN de mutaciones inducidas por ZFN. El sitio objetivo de ZFN se muestra en el recuadro. Las flechas negras indican bandas de ADN escindidas por T7E1.
Fig. 28 muestra sitios polimórficos en una región del gen HLA-B humano. La secuencia, que rodea el sitio objetivo de RGEN, es la de un amplicón de PCR de células HeLa. Las posiciones polimórficas se muestran en el recuadro. El sitio objetivo de RGEN y la secuencia de PAM se muestran en el recuadro punteado y en negrilla, respectivamente. Las secuencias de los cebadores están subrayadas.
Fig. 29 muestra el genotipado de mutaciones oncogénicas a través del análisis RGEN-RFLP. (a) Los RGEN detectaron una mutación recurrente (c. 133-135 eliminación de TCT) en el gen CTNNB1 humano en células HCT116. Se usaron células HeLa como control negativo. (b) Genotipado de la mutación de sustitución KRAS (c.34 G> A) en la línea celular de cáncer A549 con RGEN que contienen ARN guía no coincidentes. Los nucleótidos no coincidentes se muestran en el recuadro. Se usaron células HeLa como control negativo. Las flechas indican bandas de ADN escindidas por RGEN. Se muestran secuencias de ADN confirmadas por secuenciación de Sanger.
Fig. 30 muestra el genotipado del alelo CCR5 delta32 en células HEK293T mediante análisis RGEN-RFLP. (a) Ensayos RGEN-RFLP de líneas celulares. Se usaron células K562, SKBR3 y HeLa como controles de tipo silvestre. Las flechas indican bandas de ADN escindidas por RGEN. (b) Se subraya la secuencia de ADN de los alelos CCR5 de tipo silvestre y delta32, ambos dentro y fuera del objetivo de los RGEN utilizados en el análisis de RFLP. En el recuadro se muestra un desajuste de un solo nucleótido entre los dos sitios. La secuencia PAM está subrayada. (C) Escisión in vitro de plásmidos que albergan alelos WT o del32 CCR5 utilizando el RGEN específico de tipo silvestre. (d) Confirmación de la presencia de un sitio fuera del objetivo del RGEN específico de CCR5-delta32 en el locus CCR5. Ensayos de escisión in vitro de plásmidos que albergan secuencias en el objetivo o fuera del objetivo utilizando diversas cantidades del RGEN específico de del32.
Fig. 31 muestra el genotipado de una mutación puntual de KRAS (c.34 G>A). (a) Análisis RGEN-RFLP de la mutación KRAS (c.34 G> A) en líneas celulares de cáncer. Los productos de PCR de células HeLa (utilizadas como control de tipo silvestre) o células A549, que son homocigóticas para la mutación puntual, se digirieron con RGEN con ARNcr perfectamente coincidente específico para la secuencia de tipo silvestre o los genotipos KRAS de secuencia mutante en estas células fueron confirmados por secuenciación de Sanger. (b) Los plásmidos que albergaban las secuencias de KRAS de tipo silvestres o mutantes se digirieron utilizando RGEN con ARNcr perfectamente emparejados o ARNcr atenuados con una base no coincidente. Los ARNcr atenuados que se eligieron para el genotipado están etiquetados en un recuadro encima de los geles.
Fig. 32 muestra el genotipado de una mutación puntual de PIK3CA (c.3140 A>G). (a) Análisis RGEN-RFLP de la mutación PIK3CA (c.3140 A> G) en líneas celulares de cáncer. Los productos de PCR de células HeLa (utilizadas como control de tipo silvestre) o células HCT116 que son heterocigotas para la mutación puntual se digirieron con RGEN con ARNcr perfectamente coincidente específico para la secuencia de tipo silvestre o la secuencia mutante. Los genotipos de PIK3CA en estas células se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. (b) Los plásmidos que albergaban las secuencias de PIK3CA de tipo silvestre o mutantes se digirieron utilizando RGEN con ARNcr perfectamente emparejados o ARNcr atenuados con una base no coincidente. Los ARNcr atenuados que se eligieron para el genotipado están etiquetados en un recuadro encima de los geles.
Fig. 33 muestra el genotipado de mutaciones puntuales recurrentes en líneas de células cancerosas. (a) Ensayos RGEN-RFLP de mutaciones puntuales oncogénicas recurrentes en IDH (c.394 C>T), (b) PIK3CA (c.3140 A>G), (c) NRAS (c.181 C>A), (d) y genes BRAF (c.1799 T>A). Se muestran los genotipos de cada línea celular confirmados por secuenciación de Sanger. Los nucleótidos no coincidentes se muestran en el recuadro. Las flechas negras indican bandas de ADN escindidas por RGEN.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona métodos in vitro y ex-vivo para escindir ADN objetivo en células de mamífero como se define en las reivindicaciones. Además, la presente invención proporciona métodos para preparar una célula de mamífero que comprende una composición CRISPR/Cas9 como se define en las reivindicaciones.
En la presente invención, la composición también se denomina composición de endonucleasa guiada por ARN (RGEN).
Las ZFN y TALEN permiten la mutagénesis dirigida en células de mamíferos, organismos modelo, plantas y ganado, pero las frecuencias de mutación obtenidas con nucleasas individuales son muy diferentes entre sí. Además, algunas ZFN y TALEN no muestran ninguna actividad de edición del genoma. La metilación del ADN puede limitar la unión de estas nucleasas modificadas a los sitios objetivo. Además, es técnicamente desafiante y lleva mucho tiempo hacer nucleasas personalizadas.
Los presentes inventores han desarrollado una nueva composición de endonucleasa guiada por ARN basada en la proteína Cas9 para superar las desventajas de las ZFN y las TALEN.
Antes de la presente invención, se conocía la actividad endonucleasa de las proteínas Cas. Sin embargo, no se ha sabido si la actividad endonucleasa de la proteína Cas funcionaría en una célula eucariota debido a la complejidad del genoma eucariota. Además, hasta ahora, no se ha desarrollado una composición que comprenda proteína Cas o ácido nucleico que codifica proteína Cas y un ARN guía específico para el a Dn objetivo para escindir un ADN objetivo en células u organismos eucariotas.
En comparación con las ZFN y las TALEN, la composición actual de RGEN basada en la proteína Cas9 se puede personalizar más fácilmente porque solo se reemplaza el componente de ARN guía sintético para crear una nueva nucleasa de edición del genoma. No se requieren pasos de subclonación para crear endonucleasas guiadas por ARN personalizadas. Además, el tamaño relativamente pequeño del gen Cas (por ejemplo, 4.2 kpb para Cas9) en comparación con un par de genes TALEN (~6 kpb) proporciona una ventaja para esta composición de endonucleasa guiada por ARN en algunas aplicaciones, tal como la entrega de genes mediada por virus. Además, esta endonucleasa guiada por ARN no tiene efectos fuera del objetivo y, por lo tanto, no induce mutaciones, eliminaciones, inversiones ni duplicaciones no deseadas. Estas características hacen que la presente composición de endonucleasa guiada por ARN sea una herramienta escalable, versátil y conveniente para la ingeniería genómica en células y organismos eucariotas. Además, RGEN se puede diseñar para dirigirse a cualquier secuencia de ADN, casi cualquier polimorfismo de un solo nucleótido o pequeña inserción/eliminación (indel) se puede analizar a través de RFLP mediado por RGEN. La especificidad de las RGEN está determinada por el componente de ARN que se hibrida con una secuencia de ADN objetivo de hasta 20 pares de bases (pb) de longitud y por la proteína Cas9 que reconoce el motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Las RGEN se reprograman fácilmente reemplazando el componente de ARN. Por lo tanto, las RGEN brindan una plataforma para usar un análisis RFLP simple y sólido para diversas variaciones de secuencia.
El ADN objetivo puede ser un ADN endógeno o un ADN artificial, preferiblemente ADN endógeno.
Como se usa en el presente documento, el término "proteína Cas9" se refiere a un componente de proteína esencial en el sistema CRISPR/Cas9, forma una endonucleasa o nicasa activa cuando forma un complejo con dos ARN denominados ARN CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr).
La información sobre el gen y la proteína de Cas está disponible en GenBank del GenBank of National Center for Biotechnology Information (NCBI), sin limitación.
Los genes asociados a CRISPR (cas) que codifican proteínas Cas a menudo se asocian con matrices de espaciadores repetidos de CRISPR. Se han descrito más de cuarenta familias diferentes de proteínas Cas. De estas familias de proteínas, Cas1 parece ser omnipresente entre diferentes sistemas CRISPR/Cas. Hay tres tipos de sistema CRISPR-Cas. Entre ellos, el sistema CRISPR/Cas de tipo II que implica la proteína Cas9 y ARNcr y ARNtracr es representativo y es bien conocido. Se han utilizado combinaciones particulares de genes cas y estructuras repetidas para definir 8 subtipos CRISPR (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern y Mtube).
La proteína Cas puede estar unida a un dominio de transducción de proteína. El dominio de transducción de proteínas puede ser poliarginina o una proteína TAT derivada del VIH, pero no se limita a ellos.
La presente composición comprende el componente Cas9 en forma de proteína o en forma de ácido nucleico que codifica la proteína Cas9.
En la presente invención, la proteína Cas9 puede ser cualquier proteína Cas9 siempre que tenga una actividad de endonucleasa o nicasa cuando forma complejo con un ARN guía.
El término proteína Cas9 incluye proteína Cas9 o variantes de la misma. La variante de la proteína Cas9 puede ser una forma mutante de Cas9 en la que el residuo de aspartato catalítico se cambia a cualquier otro aminoácido. Preferiblemente, el otro aminoácido puede ser una alanina, pero no se limita a ello.
Además, la proteína Cas9 puede ser la aislada de un organismo tal como Streptococcus sp., preferiblemente Streptococcus pyogens o una proteína recombinante, pero no se limita a ello.
La proteína Cas9 derivada de Streptococcus pyogens puede reconocer el trinucleótido NGG. La proteína Cas puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, pero no se limita a ello.
El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativo, o que la celda se deriva de una celda así modificada. Así, por ejemplo, se puede generar una proteína Cas9 recombinante reconstituyendo la secuencia que codifica la proteína Cas9 usando la tabla de codones humanos.
En cuanto a la presente invención, el ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 puede estar en forma de vector, tal como un plásmido que comprende una secuencia que codifica Cas9 bajo un promotor tal como CMV o CAG. La secuencia codificante de Cas9 puede derivarse de Streptococcus sp., y preferiblemente derivado de Streptococcus pyogenes. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Además, el ácido nucleico que codifica Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos 50 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 o 99 % de la SEQ ID NO: 1, pero no se limita a ella. El ácido nucleico que codifica Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.108, 110, 106 o 107.
Como se usa en el presente documento, el término "ARN guía" se refiere a un ARN que es específico para el ADN objetivo y puede formar un complejo con la proteína Cas9 y llevar la proteína Cas9 al ADN objetivo.
En la presente invención, el ARN guía es un ARN de cadena única (ARNsg) producido por fusión de una porción esencial de ARNcr y ARNtracr.
Si el ARN guía comprende la porción esencial de ARNcr y ARNtracr y una porción complementaria a un objetivo, se puede usar cualquier ARN guía en la presente invención.
El ARNcr puede hibridarse con un ADN objetivo.
La RGEN puede consistir en proteína Cas9 y ARNsg (fusión de una porción esencial de ARNtracr invariable y ARNcr específico del objetivo), y puede reprogramarse fácilmente reemplazando ARNcr.
El ARN guía puede comprender además uno o más nucleótidos adicionales en el extremo 5' del ARN guía de cadena única o la parte ARNcr del mismo.
Preferiblemente, el ARN guía comprende además 2 nucleótidos de guanina adicionales en el extremo 5' del ARN guía de cadena única o la parte ARNcr del mismo.
El ARN guía puede transferirse a una célula en forma de ARN.
Cuando el ARN guía se transfecta en forma de ARN aislado en una célula, el ARN guía puede prepararse mediante transcripción in vitro usando cualquier sistema de transcripción in vitro conocido en la técnica. El ARN guía se transfiere preferiblemente a una célula en forma de ARN aislado. Como se usa en el presente documento, el término "ARN aislado" puede ser intercambiable con "ARN desnudo". Esto ahorra tiempo y dinero porque no requiere un paso de clonación. Sin embargo, no se excluye el uso de ADN plasmídico o suministro de genes mediado por virus para la transfección del ARN guía.
La presente composición de RGEN que comprende la proteína Cas9 o el ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 y un ARN guía puede escindir específicamente un ADN objetivo debido a la especificidad del ARN guía para un objetivo y una actividad de endonucleasa o nicasa de la proteína Cas9.
Como se usa en el presente documento, el término "escisión" se refiere a la rotura del esqueleto covalente de una molécula de nucleótido.
En la presente invención, se puede preparar un ARN guía para que sea específico para cualquier objetivo que se vaya a escindir. Por lo tanto, la presente composición de RGEN puede escindir cualquier ADN objetivo mediante la manipulación o el genotipado de la porción específica del objetivo del ARN guía.
El ARN guía y la proteína Cas9 pueden funcionar como un par. Como se usa en el presente documento, el término "cas9 nicasa emparejada" puede referirse al ARN guía y la proteína Cas9 que funcionan como un par. El par comprende dos ARN guía. El ARN guía y la proteína Cas9 pueden funcionar como un par e inducir dos mellas en diferentes cadenas de ADN. Las dos mellas pueden estar separadas por al menos 100 pbs, pero no se limitan a eso.
En los ejemplos, los presentes inventores confirmaron que la nicasa Cas9 emparejada permite la mutagénesis dirigida y grandes eliminaciones de segmentos cromosómicos de hasta 1 kpb en células humanas. Es importante destacar que las nicasas emparejadas no indujeron indeles en sitios fuera del objetivo en los que sus nucleasas correspondientes inducen mutaciones. Además, a diferencia de las nucleasas, las nicasas emparejadas no promovieron translocaciones no deseadas asociadas con escisiones de ADN fuera del objetivo. En principio, las nicasas emparejadas duplican la especificidad de la mutagénesis mediada por Cas9 y ampliarán la utilidad de las enzimas guiadas por ARN en aplicaciones que requieren una edición precisa del genoma, tal como la terapia génica y celular.
Como se divulga, la composición se puede usar en el genotipado de un genoma en las células u organismos eucariotas in vitro.
En una realización específica, el ARN guía puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en el que la parte de la posición de nucleótidos 3 ~ 22 es una porción específica del objetivo y, por lo tanto, la secuencia de esta parte puede cambiarse dependiendo del objetivo.
Como se usa en el presente documento, una célula eucariota puede ser levadura, hongo, protozoo, planta, planta superior e insecto, o células de anfibio, o células de mamífero tales como CHO, HeLa, HEK293 y COS-1, por ejemplo, células cultivadas (in vitro), células de injerto y cultivo celular primario (in vitro y ex-vivo), y también células de mamíferos, incluidas las humanas, que se usan comúnmente en la técnica, sin limitación.
Se descubrió que la proteína Cas9/ARN guía de cadena única podría generar roturas de doble cadena de ADN específicas del sitio in vitro y en células de mamíferos, cuya reparación espontánea indujo mutaciones genómicas dirigidas a altas frecuencias.
Además, se descubrió que los ratones con genes inactivados podrían ser inducidos mediante la inyección de complejos de proteína Cas9/ARN guía o ARNm Cas9/ARN guía en un embrión en etapa de una célula y mutaciones transmisibles de línea germinal podrían generarse mediante el sistema Cas9/ARN guía.
El uso de la proteína Cas9 en lugar de un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 para inducir una mutagénesis dirigida es ventajoso porque el ADN exógeno no se introduce en un organismo. Por lo tanto, la composición que comprende la proteína Cas9 y un ARN guía puede usarse para desarrollar cultivos terapéuticos o de valor agregado, ganado, aves, peces, mascotas, etc.
De acuerdo con otro aspecto, los presentes métodos pueden usarse para inducir mutagénesis dirigida en células de mamífero.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se describe anteriormente.
Los componentes del sistema CRISPR/Cas9 utilizados en los métodos de la invención pueden proporcionarse como un kit para escindir un ADN objetivo o inducir mutagénesis dirigida en células de mamífero.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se ha descrito anteriormente.
El kit puede comprender un ARN guía y un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 como componentes separados o como una composición.
El kit puede comprender algunos componentes adicionales necesarios para transferir el ARN guía y el componente Cas9 a una célula.
Por ejemplo, el kit puede comprender un tampón de inyección tal como un tampón de inyección tratado con DEPC y los materiales necesarios para el análisis de la mutación de un ADN objetivo, pero no se limitan a ellos.
Los métodos pueden usarse para preparar una célula de mamífero que comprende la proteína Cas9 y un ARN guía que comprende un paso de transfección en serie de la célula de mamífero con la composición CRISPR/Cas9.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se ha descrito anteriormente.
Un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 y un ARN o ADN guía que codifica el ARN guía pueden transferirse a una célula mediante diversos métodos conocidos en la técnica, tales como microinyección, electroporación, tratamiento con DEAE-dextrano, lipofección, nanopartículas. transfección mediada, transducción mediada por dominio de transducción de proteínas, administración de genes mediada por virus y transfección mediada por PEG en protoplastos, y así sucesivamente, pero no se limitan a ellos. Un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 se puede transferir a una célula en forma de complejo con un ARN guía, o por separado. La proteína Cas9 fusionada con un dominio de transducción de proteína como Tat también se puede administrar de manera eficiente en las células.
La transfección en serie se puede realizar primero mediante transfección con ácido nucleico que codifica la proteína Cas9, seguida de una segunda transfección con ARN guía desnudo. Preferiblemente, la segunda transfección es después de 3, 6, 12, 18, 24 horas, pero no se limita a eso.
Las células eucariotas pueden prepararse transfiriendo la composición CRISPR/Cas9 a la célula.
La célula eucariota puede ser una levadura, un hongo, un protozoo, una planta superior y un insecto, o células anfibias, o células de mamífero tales como CHO, HeLa, HEK293 y COS-1, por ejemplo, células cultivadas (in vitro), células de injerto y cultivo celular primario (in vitro y ex-vivo), y también células de mamíferos, incluyendo las humanas, que se usan comúnmente en la técnica, sin limitación.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos in vitro y ex-vivo para escindir un ADN objetivo o inducir mutagénesis dirigida en células de mamífero, que comprenden un paso de tratamiento de una célula que comprende un ADN objetivo con una composición CRISPR/Cas9.
El paso de tratar una célula con la composición se puede realizar transfiriendo la presente composición que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 a la célula.
Como se ha descrito anteriormente, dicha transferencia puede realizarse mediante microinyección, transfección, electroporación, etc.
Los métodos pueden usarse para proporcionar un embrión no humano que comprenda un genoma editado por la presente composición RGEN.
Puede utilizarse cualquier embrión no humano. Por ejemplo, el embrión puede ser un embrión de ratón. El embrión se puede producir mediante la inyección de PMSG (gonadotropina sérica de yegua embarazada) y hCG (gonadotropina corínica humana) en un ratón hembra de 4 a 7 semanas y el ratón hembra súperovulado se puede aparear con machos y se pueden recolectar los embriones fertilizados de los oviductos.
La presente composición de RGEN introducida en un embrión puede escindir un ADN objetivo complementario al ARN guía por la acción de la proteína Cas9 y provocar una mutación en el ADN objetivo. Por tanto, el embrión en el que se ha introducido la presente composición de RGEN tiene un genoma editado.
Se encontró que la presente composición de RGEN podría causar una mutación en un embrión de ratón y la mutación podría transmitirse a la descendencia.
Un método para introducir la composición de RGEN en el embrión puede ser cualquier método conocido en la técnica, tal como microinyección, inserción de células madre, inserción de retrovirus, etc. Preferiblemente, se puede utilizar una técnica de microinyección.
Los métodos pueden usarse para proporcionar un animal no humano con genoma modificado obtenido mediante la transferencia de un embrión no humano que comprende un genoma editado por la presente composición de RGEN en los oviductos de un animal.
En la presente divulgación, el término "animal con genoma modificado" se refiere a un animal no humano cuyo genoma ha sido modificado en la etapa de embrión por la presente composición de RGEN y el tipo de animal no humano no está limitado.
El animal no humano con genoma modificado tiene mutaciones causadas por una mutagénesis dirigida con base en la presente composición de RGEN. Las mutaciones pueden ser cualquiera de eliminación, inserción, translocación, inversión. El sitio de la mutación depende de la secuencia del ARN guía de la composición RGEN.
El animal no humano con genoma modificado que tiene una mutación de un gen puede usarse para determinar la función del gen.
Los métodos pueden usarse para preparar un animal modificado con genoma no humano que comprende un paso de introducir la presente composición de RGEN en un embrión de un animal no humano; y un paso de transferir el embrión a un oviducto de una madre adoptiva pseudoembarazada para producir un animal no humano con genoma modificado. El paso de introducir la presente composición de RGEN se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como microinyección, inserción de células madre, inserción retroviral, etc.
Los métodos descritos anteriormente pueden usarse para proporcionar una planta regenerada a partir de un protoplasto modificado con genoma.
Los métodos pueden usarse para genotipificar mutaciones o variaciones en una muestra biológica aislada. Los métodos también pueden usarse para genotipificar secuencias de ácidos nucleicos en microorganismos patógenos en una muestra biológica aislada.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se ha descrito anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término "genotipado" se refiere al "ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)".
El RFLP se puede utilizar en 1) la detección de indel en células u organismos inducida por las nucleasas modificadas, 2) el genotipado de mutaciones o variaciones naturales en células u organismos, o 3) el genotipado del ADN de microorganismos patógenos infectados, incluyendo virus o bacterias, etc
Las mutaciones o variaciones pueden ser inducidas por nucleasas manipuladas en las células.
La nucleasa manipulada puede ser una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) o RGEN, pero no se limita a ellas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "muestra biológica" incluye muestras para análisis, tales como tejidos, células, sangre entera, semen, plasma, saliva, esputo, líquido cefalorraquídeo u orina, pero no se limita a ellos.
Las mutaciones o variaciones pueden ser mutaciones o variaciones naturales.
Las mutaciones o variaciones son inducidas por los microorganismos patógenos. Es decir, las mutaciones o variaciones se producen debido a la infección de microorganismos patógenos, cuando se detectan los microorganismos patógenos, la muestra biológica se identifica como infectada.
Los microorganismos patógenos pueden ser virus o bacterias, pero no se limitan a ellos.
Las mutaciones inducidas por nucleasas modificadas se detectan mediante diversos métodos, que incluyen ensayos de endonucleasa I (T7E1) o Surveyor sensibles a desajuste, análisis RFLP, PCR fluorescente, análisis de fusión de ADN y Sanger y secuenciación profunda. Los ensayos T7E1 y Surveyor se usan mucho, pero a menudo subestiman las frecuencias de mutación porque los ensayos detectan heterodúplex (formados por la hibridación de secuencias mutantes y de tipo silvestre o dos secuencias mutantes diferentes); no logran detectar los homodúplex formados por la hibridación de dos secuencias mutantes idénticas. Por lo tanto, estos ensayos no pueden distinguir clones mutantes bialéicos homocigóticos de células de tipo silvestre ni mutantes bialélicos heterocigóticos de mutantes monoalléicos heterocigóticos (Fig. 22). Además, los polimorfismos de secuencia cerca del sitio objetivo de la nucleasa pueden producir resultados confusos porque las enzimas pueden escindir heterodúplex formados por hibridación de estos diferentes alelos de tipo silvestre. El análisis RFLP está libre de estas limitaciones y, por lo tanto, es un método de elección. De hecho, el análisis RFLP fue uno de los primeros métodos utilizados para detectar mutaciones mediadas por nucleasas modificadas. Desafortunadamente, sin embargo, está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción apropiados.
Los componentes del sistema CRISPR/Cas9 utilizados en los métodos de la invención pueden proporcionarse en un kit para genotipificar mutaciones o variaciones en una muestra biológica aislada. Además, los componentes pueden proporcionarse en un kit para el genotipado de secuencias de ácidos nucleicos en microorganismos patógenos en una muestra biológica aislada.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se describe anteriormente.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos, y no se pretende que la invención quede limitada por estos Ejemplos.
Ejemplo 1: Ensayo de edición del genoma
1-1. Actividad de escisión del ADN de la proteína Cas9
En primer lugar, se probó la actividad de escisión del ADN de Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes en presencia o ausencia de un ARN guía quimérico in vitro.
Con este fin, se usó la proteína Cas9 recombinante que se expresó y purificó a partir de E. coli para escindir un ADN de plásmido circular o predigerido que contenía la secuencia objetivo del CCR5 humano de 23 pares de bases (pb). Una secuencia objetivo de Cas9 consiste en una secuencia de ADN de 20 pb complementaria al ARNcr o un ARN guía quimérico y el motivo adyacente protoespaciador trinucleótido (5-NGG-3') (PAM) reconocido por el propio Cas9 (Fig. 1A).
Específicamente, se reconstituyó la secuencia codificante de Cas9 (4104 pb), derivada de Streptococcus pyogenes la cepa M1 GAS (NC_002737.1), usando la tabla de uso de codones humanos y se sintetizó usando oligonucleótidos. En primer lugar, se ensamblaron segmentos de ADN de 1 kb utilizando oligonucleótidos de ~35 mer superpuestos y polimerasa Phusion (New England Biolabs) y se clonaron en el vector T (SolGent). Se ensambló una secuencia completa de Cas9 utilizando cuatro segmentos de ADN de 1 kpb mediante PCR superpuesta. Se subclonó el segmento de ADN que codifica Cas9 en p3s, que se derivó de pcDNA3.1 (Invitrogen). En este vector, se añadió una etiqueta peptídica (NH2-GGSGPPKKKRKVYPYDVPDYA-COOH, SEQ ID NO: 2) que contenía el epítopo HA y una señal de localización nuclear (NLS) al terminal C de Cas9. Se confirmaron la expresión y la localización nuclear de la proteína Cas9 en las células HEK 293T mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-HA (Santa Cruz).
Luego, se subclonó el casete Cas9 en pET28-b() y se transformó en BL21(DE3). Se indujo la expresión de Cas9 utilizando IPTG 0,5 mM durante 4 ha 25 °C. Se purificó la proteína Cas9 que contenía la etiqueta His6 en el terminal C usando resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) y se dializó frente a HEPES 20 mM (pH 7,5), KCl 150 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10 % (1). Se incubó Cas9 purificado (50 nM) con ADN de plásmido superenrollado o predigerido (300 ng) y ARN quimérico (50 nM) en un volumen de reacción de 20 pl en amortiguador 3 n Eb durante 1 hora a 37 °C. Se analizó el ADN digerido por electroforesis utilizando geles de agarosa al 0,8 %.
Cas9 escindió el ADN del plásmido de manera eficiente en la posición esperada solo en presencia del ARN sintético y no escindió un plásmido de control que careciera de la secuencia objetivo (Fig. 1B).
1-2. Escisión del ADN por el complejo Cas9/ARN guía en células humanas
Se utilizó un reportero RFP-GFP para investigar si el complejo Cas9/ARN guía puede escindir la secuencia objetivo incorporada entre las secuencias RFP y GFP en células de mamífero.
En este reportero, la secuencia GFP se fusiona con la secuencia RFP fuera de marco (2). La GFP activa se expresa solo cuando la secuencia objetivo es escindida por nucleasas específicas del sitio, lo que provoca pequeñas inserciones o eliminaciones (indeles) de marco de lectura alrededor de la secuencia objetivo a través de la reparación de unión final no homóloga (NHEJ) propensa a errores de la rotura de doble cadena (DSB) (Fig. 2).
Se construyeron los plásmidos informadores RFP-GFP utilizados en este estudio como se describió anteriormente (2). Se sintetizaron (Macrogen) y se hibridaron los oligonucleótidos correspondientes a los sitios objetivo (Tabla 1) Se ligaron los oligonucleótidos recocidos en un vector informador digerido con EcoRI y BamHI.
Se cotransfectaron las células HEK 293T con el plásmido que codifica Cas9 (0.8 pg) y el plásmido informador RFP-GFP (0.2 pg) en una placa de 24 pocillos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Mientras tanto, se había preparado el ARN quimérico in vitro transcrito como sigue. El ARN fue in vitro transcrito a través de reacciones de escorrentía utilizando el kit MEGAshortscript T7 (Ambion) de acuerdo con el manual del fabricante. Se generaron las plantillas para transcripción de ARN in vitro mediante la hibridación de dos ADN de cadena únicas complementarios o mediante amplificación por PCR (Tabla 1). Se resolvió el ARN transcrito en un gel de urea-PAGE desnaturalizante al 8%. Se cortó el trozo de gel que contenía el ARN y se transfirió a un amortiguador de elución de sonda. Se recuperó el ARN en agua libre de nucleasas seguido de extracción con fenol: cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. Se cuantificaron los ARN purificados por espectrometría.
A las 12 h después de la transfección, se transfectó el ARN quimérico (1 pg) preparado por transcripción in vitro usando Lipofectamine 2000.
A los 3 días posteriores a la transfección, se sometieron las células transfectadas a citometría de flujo y se contaron las células que expresaban RFP y GFP.
Se encontró que las células que expresan GFP se obtuvieron solo cuando las células se transfectaron primero con el plásmido Cas9 y luego con el ARN guía 12 h más tarde (Fig. 2), lo que demuestra que las RGEN pueden reconocer y escindir la secuencia de ADN objetivo en células humanas cultivadas. Por lo tanto, se obtuvieron las células que expresan GFP mediante transfección en serie del plásmido Cas9 y el ARN guía en lugar de cotransfección.
Tabla 1
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1-3. Interrupción dirigida de genes endógenos en células de mamíferos por RGEN
Para probar si las RGEN pudieran usarse para la interrupción orientada de genes endógenos en células de mamíferos, se aisló ADN genómico de células transfectadas usando endonucleasa I T7 (T7E1), una endonucleasa sensible a desajustes que reconoce y escinde específicamente heterodúplex formados por la hibridación de tipo silvestre y se analizaron las secuencias de ADN mutante (3).
Para introducir DSB en células de mamíferos usando RGEN, se transfectaron 2 * 106 células K562 con 20 |jg de plásmido que codifica Cas9 utilizando el kit 4D-Nucleofector, SF Cell Line 4D-Nucleofector X, programa FF-120 (Lonza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para este experimento, se cultivaron células K562 (ATCC, CCL-243) en RPMI-1640 con FBS con 10 % y la mezcla de penicilina/estreptomicina (100 U/ml y 100 jg/ml, respectivamente).
Después de 24 h, se nucleofectaron 10-40 jg de ARN quimérico transcrito in vitro en 1 * 106 células K562. Se había preparado el ARN quimérico transcrito in vitro como se describe en el Ejemplo 1-2.
Se recogieron las células dos días después de la transfección de ARN y se aisló el ADN genómico. Se amplificó las región que incluye el sitio objetivo por PCR usando los cebadores descritos en la Tabla 1. Se sometieron los amplicones al ensayo T7E1 como se describió anteriormente (3). Para el análisis de secuenciación, se purificaron y clonaron los productos de PCR correspondientes a las modificaciones genómicas en el vector T-Blunt utilizando el kit de clonación T-Blunt PCR (SolGent). Se secuenciaron los productos clonados utilizando el cebador M13.
Se encontró que las mutaciones se inducían solo cuando las células se transfectaban en serie con el plásmido que codifica Cas9 y luego con el ARN guía (Fig. 3). Las frecuencias de mutación (Indeles (%) en la Fig. 3A) estimadas a partir de las intensidades relativas de las bandas de ADN dependían de la dosificación de ARN, y oscilaban entre 1,3 % y 5,1 %. El análisis de secuenciación de ADN de los amplicones de PCR corroboró la inducción de mutaciones mediadas por RGEN en los sitios endógenos. Se observaron indeles y microhomologías, característicos de NHEJ propensos a errores, en el sitio objetivo. La frecuencia de mutación medida por secuenciación directa fue del 7,3 % (= 7 clones mutantes/96 clones), a la par de las obtenidas con nucleasas con dedos de zinc (ZFN) o nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN).
Se requirió la transfección en serie del plásmido Cas9 y el ARN guía para inducir mutaciones en las células. Pero cuando los plásmidos que codifican guían el ARN, la transfección en serie fue innecesaria y las células se cotransfectaron con el plásmido Cas9 y el plásmido que codifica el ARN guía.
Mientras tanto, tanto ZFN como TALEN se han desarrollado con éxito para interrumpir el gen CCR5 humano (3-6), que codifica un receptor de quimiocina acoplado a proteína G, un coreceptor esencial de la infección por VIH. Un ZFN específico de CCR5 se encuentra ahora bajo investigación clínica en los EE. UU. para el tratamiento del SIDA (7). Estos ZFN y TALEN, sin embargo, tienen efectos fuera del objetivo, induciendo mutaciones locales en sitios cuyas secuencias son homólogas a la secuencia del objetivo (6, 8-10) y reordenamientos del genoma que surgen de la reparación de dos DSB concurrentes inducidos en sitios dentro y fuera del objetivo (11-12). Los sitios fuera del objetivo más llamativos asociados con estas nucleasas modificadas específicamente para CCR5 residen en el locus CCR2, un homólogo cercano de CCR5, ubicado 15 kbp corriente arriba de CCR5. Para evitar mutaciones fuera del objetivo en el gen CCR2 y eliminaciones, inversiones y duplicaciones no deseadas del segmento cromosómico de 15 kpb entre los sitios CCR5 en el objetivo y CCR2 fuera del objetivo, los presentes inventores eligieron intencionalmente el sitio objetivo de la RGEN específica de CCR5 para reconocer una región dentro de la secuencia CCR5 que no tiene una homología aparente con la secuencia CCR2.
Los presentes inventores investigaron si la RGEN específica de CCR5 tenía efectos fuera del objetivo. Con este fin, buscamos posibles sitios fuera del objetivo en el genoma humano identificando los sitios que son más homólogos a la secuencia objetivo de 23 pb prevista. Como era de esperar, no se encontraron tales sitios en el gen CCR2. En su lugar, se encontraron cuatro sitios, cada uno de los cuales lleva desajustes de 3 bases con el sitio en el objetivo (Fig. 4A). Los ensayos de T7E1 mostraron que no se detectaron mutaciones en estos sitios (sensibilidad del ensayo, ~0,5 %), lo que demuestra especificidades exquisitas de las RGEN (Fig. 4B). Además, se utilizó PCR para detectar la inducción de eliminaciones cromosómicas en células transfectadas por separado con plásmidos que codifican ZFN y RGEN específicos para CCR5. Mientras que ZFN indujo eliminaciones, la RGEN no lo hizo (Fig. 4C).
A continuación, las RGEN se reprogramaron reemplazando el ARN guía específico de CCR5 con un ARN recién sintetizado diseñado para apuntar al gen C4BPB humano, que codifica la cadena beta de la proteína de unión a C4b, un factor de transcripción. Esta RGEN indujo mutaciones en el sitio objetivo cromosómico en células K562 a altas frecuencias (Fig. 3B). Las frecuencias de mutación medidas por el ensayo T7E1 y por secuenciación directa fueron 14 % y 8,3 % (= 4 clones mutantes/48 clones), respectivamente. De cuatro secuencias mutantes, dos clones contenían una inserción de base única o de dos bases precisamente en el sitio de escisión, un patrón que también se observó en el sitio objetivo de CCR5. Estos resultados indican que las RGEN escinden el ADN objetivo cromosómico en las posiciones esperadas en las células.
Ejemplo 2: Edición proteica del genoma mediada por RGEN (ejemplo de referencia)
Las RGEN se pueden administrar en las células de muchas formas diferentes. La RGEN consisten en proteína Cas9, ARNcr y ARNtracr. Los dos ARN se pueden fusionar para formar un ARN guía de cadena única (ARNsg). Un plásmido que codifica Cas9 bajo un promotor como CMV o CAG puede transfectarse en células. ARNcr, ARNtracr o ARNsg también se pueden expresar en células usando plásmidos que codifican estos ARN. El uso de plásmidos, sin embargo, a menudo da como resultado la integración de la totalidad o parte de los plásmidos en el genoma huésped. Las secuencias bacterianas incorporadas en el ADN del plásmido pueden provocar una respuesta inmunitaria no deseada en vivo. Las células transfectadas con plásmido para terapia celular o animales y plantas derivados de células transfectadas con ADN deben pasar por un largo y costoso procedimiento de regulación antes de la aprobación comercial en la mayoría de los países desarrollados. Además, el ADN del plásmido puede persistir en las células durante varios días después de la transfección, lo que agrava los efectos secundarios de las RGEN.
Aquí, se usó la proteína Cas9 recombinante complejada con ARN guía transcrito in vitro para inducir la interrupción orientada de genes endógenos en células humanas. Se expresó La proteína Cas9 recombinante fusionada con la etiqueta de hexahistidina y purificó a partir de E. coli usando cromatografía de afinidad de iones de Ni estándar y filtración en gel. Se concentró la proteína Cas9 recombinante purificada en tampón de almacenamiento (HEPES 20 mM pH 7.5, KCl 150 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10%). Se introdujo directamente el complejo de proteína Cas9/ARNsg en las células K562 mediante nucleofección: se transfectaron 1*10® células K562 con 22.5-225 (1.4-14 j M ) de proteína Cas9 mezclada con 100 ug (29 j M ) de ARNsg transcrito in vitro (o ARNcr 40 ug y ARNtracr 80 ug) en 100 j l de solución utilizando el 4D-Nucleofector, SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit, programa FF-120 (Lonza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la nucleofección, se colocaron las células en medios de cultivo en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 48 horas. Cuando se transfectaron 2*105 células K562 con un protocolo reducido a escala 1/5, se usaron 4.5-45 jg de proteína Cas9 mezclada con 6-60 jg de n ARNsg transcrito in vitro (o 8 jg de ARNcr y 16 jg de ARNtracr) y se nucleofectaron en 20 j l de solución. A continuación, las células nucleofectadas se colocaron en medios de cultivo en placas de 48 pocillos. Después de 48 h, se recogieron las células y se aisló el ADN genómico. Se amplificó la región de ADN genómico que abarca el sitio objetivo por PCR y se sometió al ensayo T7E1.
Como se muestra en la Fig. 10, el complejo proteína Cas9/ARNsg indujo una mutación orientada en el locus CCR5 a frecuencias que oscilaron entre 4.8 y 38 % en una forma dependiente de la dosis de ARNsg o proteína Cas9, a la par de la frecuencia obtenida con la transfección del plásmido Cas9 (45%). El complejo proteína Cas9/ARNcr/ARNtracr fue capaz de inducir mutaciones a una frecuencia del 9.4 %. La proteína Cas9 sola no logró inducir mutaciones.
Cuando se transfectaron 2*105 células con dosis reducidas en escala de 1/5 de proteína Cas9 y ARNsg, las frecuencias de mutación en el locus CCR5 oscilaron entre 2.7 y 57 % de manera dependiente de la dosis, mayor que la obtenida con la cotransfección del plásmido Cas9 y el plásmido ARNsg (32 %).
También se probó el complejo de proteína Cas9/ARNsg que se dirige al gen ABCC11 y se descubrió que este complejo inducía indeles a una frecuencia del 35 %, lo que demuestra la utilidad general de este método.
Tabla 2
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Ejemplo 3: Edición del genoma guiado por ARN en ratones (ejemplo de referencia)
Para examinar el potencial de selección de genes de las RGEN en embriones de ratón en etapa pronuclear (PN), el gen forkhead box N1 (Foxnl), que es importante para el desarrollo del timo y la diferenciación de los queratinocitos (Nehls et al., 1996), y la proteína quinasa, se usaron el gen del polipéptido catalítico (Prkdc) activado por ADN, que codifica una enzima crítica para la reparación y recombinación de d Sb de ADN (Taccioli et al., 1998).
Para evaluar la actividad de edición del genoma de Foxnl-RGEN, se inyectaron ARNm de Cas9 (solución de 10 ng/pl) con diversas dosis de ARNsg (Fig. 5a) en el citoplasma de embriones de ratón en etapa PN y se realizaron los ensayos de endonucleasa T7. I (T7E1) (Kim et al. 2009) utilizando ADN genómico obtenido de embriones cultivados in vitro (Fig. 6a).
Alternativamente, se inyectó directamente la RGEN en forma de proteína Cas9 recombinante (0.3 a 30 ng/pl) complejada con el doble exceso molar de ARNsg específico de Foxnl (0,14 a 14 ng/pl) en el citoplasma o pronúcleo de embriones de ratón de una célula, y se analizaron mutaciones en el gen Foxnl usando embriones cultivados in vitro (Fig. 7).
Específicamente, se sintetizaron ARNm Cas9 y ARNsgs in vitro de plantillas de ADN lineal utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (Ambion) y el kit MEGAshortscript T7 (Ambion), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se diluyeron con cantidades apropiadas de amortiguador de inyección tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma) (EDTA 0.25 mM, Tris 10 mM, pH 7.4). Las plantillas para la síntesis de ARNsg se generaron utilizando los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 3. La proteína Cas9 recombinante se obtuvo de ToolGen, Inc.
Tabla 3
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Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de la Korean Food and Drug Administration (KFDA). Los protocolos fueron revisados y aprobados por los Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) del Laboratory Animal Research Center en Yonsei University (Número de permiso: 2013-0099). Todos los ratones se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos específicos del Yonsei Laboratory Animal Research Center. Se utilizaron cepas de ratón FVB/NTac (Taconic) e ICR como donantes de embriones y madres adoptivas, respectivamente. Se superovularon ratones FVB/NTac hembra (7-8 semanas de edad) mediante inyecciones intraperitoneales de 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG, Sigma) y 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG, Sigma) a intervalos de 48 horas. Los ratones hembra súperovulados se aparearon con machos sementales FVB/NTac y los embriones fertilizados se recolectaron de los oviductos.
Se inyectaron Cas9 ARNm y los ARNsg en medio M2 (Sigma) en el citoplasma de óvulos fertilizados con pronúcleos bien reconocidos utilizando un micromanipulador piezoeléctrico (Prime Tech).
En el caso de inyección de proteína Cas9 recombinante, la proteína Cas9 recombinante: Se diluyó el complejo Foxnl-ARNsg con amortiguador de inyección tratado con DEPC (EDTA 0.25 mM, Tris 10 mM, pH 7.4) y se inyectó en pronúcleos masculinos utilizando un micromanipulador TransferMan NK2 y un microinyector FemtoJet (Eppendorf).
Los embriones manipulados se transfirieron a los oviductos de madres adoptivas pseudoembarazadas para producir animales vivos, o se cultivaron in vitro para análisis posteriores.
Para cribar ratones F0 y embriones de ratón cultivados in vitro con mutaciones inducidas por RGEN, se realizaron los ensayos T7E1 como se describió anteriormente utilizando muestras de ADN genómico de biopsias de cola y lisados de embriones completos (Cho et al., 2013).
Brevemente, se amplificó la región genómica que abarca el sitio objetivo de RGEN por PCR, se fundió y se refusionó para formar ADN heterodúplex, que se trató con endonucleasa 1 T7 (New England Biolabs) y luego se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se identificaron los posibles sitios fuera del objetivo buscando con bowtie 0.12.9 y también se monitorizaron de manera similar mediante ensayos T7E1. Los pares de cebadores utilizados en estos ensayos se enumeran en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4
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Tabla 5
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Se analizaron adicionalmente los fundadores mutantes identificados por el ensayo T7E1 mediante fPCR. Las regiones apropiadas de ADN genómico se secuenciaron como se describió anteriormente (Sung et al., 2013). Para el genotipado de PCR de rutina de las progenies F1, se usaron los siguientes pares de cebadores para los alelos mutantes y de tipo silvestre: 5'-CTACTCCCTCCGCAGTCTGA-3' (SEQ ID NO: 69) y 5'-CCAGGCCTAGGTTCCAGGTA-3' (SEQ ID NO: 70) para el gen Foxnl, 5'-CCCCAGCATTGCAGATTTCC-3' (SEQ ID NO: 71) y 5'-AGGGCTTCTTCTCTACAATCACG-3' (SEQ ID NO: 72) para el gen Prkdc.
En el caso de la inyección de ARNm de Cas9, las fracciones mutantes (la cantidad de embriones mutantes/la cantidad de embriones totales) dependían de la dosis, y oscilaban entre 33 % ( i ng/pl de ARNsg) y 91 % (100 ng/pl) (Figura 6b). El análisis de secuencias confirmó mutaciones en el gen Foxnl; la mayoría de las mutaciones fueron pequeñas eliminaciones (Fig. 6c), que recuerdan a las inducidas por ZFN y TALEN (Kim et al., 2013).
En el caso de la inyección de la proteína Cas9, estas dosis y métodos de inyección afectaron mínimamente la supervivencia y el desarrollo de los embriones de ratón. in vitro: más del 70 % de los embriones inyectados con RGEN eclosionaron normalmente en ambos experimentos. Nuevamente, las fracciones mutantes obtenidas con la inyección de proteína Cas9 fueron dependientes de la dosis y alcanzaron hasta el 88 % en la dosis más alta mediante inyección en el pronúcleo y hasta 71 % mediante inyección intracitoplasmática (Figs. 7a y 7b). De manera similar a los patrones de mutación inducidos por Cas9 ARNm más ARNsg (Fig. 6c), los inducidos por el complejo de proteína Cas9-ARNsg fueron en su mayoría pequeñas eliminaciones (Fig. 7c). Estos resultados demuestran claramente que las RGEN tienen una alta actividad dirigida a genes en embriones de ratón.
Alentados por las altas frecuencias mutantes y la baja citotoxicidad inducida por las RGEN, se produjeron animales vivos mediante la transferencia de embriones de ratón a los oviductos de madres adoptivas pseudoembarazadas. En particular, las ratas de natalidad fueron muy altas, oscilando entre 58 % y 73 %, y no se vieron afectadas por las dosis crecientes de Foxnl-ARNsg (Tabla 6).
Tabla 6
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De 147 recién nacidos, se obtuvieron 99 ratones fundadores mutantes. De acuerdo con los resultados observados en embriones cultivados (Fig. 6b), las fracciones mutantes fueron proporcionales a las dosis de Foxnl-ARNsg y alcanzaron hasta 93 % (100 ng/pl Foxnl-ARNsg) (Tablas 6 y 7, Fig. 5b).
Tabla 7
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Para generar ratones dirigidos a Prkdc, se aplicó una concentración 5 veces mayor de ARNm de Cas9 (50 ng/pl) con dosis crecientes de Prkdc-ARNsg (50, 100 y 250 ng/pl). Una vez más, las tasas de natalidad fueron muy altas, oscilando entre 51 % y 60 %, lo suficiente como para producir un número suficiente de recién nacidos para el análisis (Tabla 6). La fracción mutante fue del 57 % (21 mutantes fundadores entre 37 recién nacidos) a la dosis máxima de Prkdc-ARNsg. Estas ratas de natalidad obtenidas con RGEN fueron aproximadamente de 2 a 10 veces más altas que aquellas con las TALEN informadas en el estudio anterior (Sung et al., 2013). Estos resultados demuestran que las RGEN son potentes reactivos dirigidos a genes con una toxicidad mínima.
Para probar la transmisión de la línea germinal de los alelos mutantes, se cruzó el fundador mutante Foxnl #108, un mosaico con cuatro alelos diferentes (Fig. 5c y Tabla 8) con ratones de tipo silvestre, y se monitorizaron los genotipos de la descendencia F1.
Tabla 8
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Los alelos subrayados fueron secuenciados.
Alelos en rojo, detectados por secuenciación, pero no por fPCR.
•sólo se secuenció un clon.
••No determinado por fPCR.
Como era de esperar, todas las progenies eran mutantes heterocigóticos que poseían el alelo de tipo silvestre y uno de los alelos mutantes (Fig. 5d). También se confirmó la transmisión de la línea germinal en ratones fundadores independientes de Foxnl (Fig. 8) y Prkdc (Fig. 9). Hasta donde se sabe, estos resultados proporcionan la primera evidencia de que los alelos mutantes inducidos por RGEN se transmiten de manera estable a las progenies F1 en animales.
Ejemplo 4: Edición del genoma guiada por ARN en plantas (ejemplo de referencia) 4-1. Producción de proteína Cas9
Se clonó la secuencia de codificación Cas9 (4104 bps), derivada de la cepa M1 GAS de Streptococcus pyogenes (NC_002737.1) en el plásmido pET28-b (+). Se incluyó una secuencia de orientación nuclear (NLS) en el terminal N de la proteína para garantizar la localización de la proteína en el núcleo. El plásmido pET28-b (+) que contenía Cas9 ORF se transformó en BL21(DE3). A continuación, se indujo Cas9 usando IPTG 0,2 mM durante 16 horas a 18 °C y se purificó usando perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína Cas9 purificada se concentró usando Ultracel - 100K (Millipore).
4-2. Producción de ARN guía
Se evaluó la secuencia genómica del gen de Arabidopsis que codifica el BRI1 se evaluó en busca de la presencia de un motivo NGG, el denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM), en un exón que se requiere para la orientación de Cas9 Para interrumpir el gen BRI1 en Arabidopsis, se identificaron dos sitios objetivo de RGEN en un exón que contienen el motivo NGG. Se produjeron ARNsg in vitro usando plantilla de ADN. Cada plantilla de ADN se generó por extensión con dos oligonucleótidos parcialmente superpuestos (Macrogen, Tabla X1) y polimerasa Phusion (Thermo Scientific) utilizando las siguientes condiciones: 98 °C 30 seg {98 °C 10 seg, 54 °C 20 seg, 72 °C 2 min}x20, 72 °C 5 min.
Tabla 9
Figure imgf000027_0001
El ADN extendido se purificó y se usó como plantilla para la producción in vitro de los ARN guía utilizando el kit MEGAshortscript T7 (Life Technologies). A continuación, el ARN guía se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Para preparar los complejos Cas9/ARNsg, se mezclaron 10 ul de proteína Cas9 purificada (12 pg/pl) y 4 ul de cada uno de dos ARNsg (11 pg/pl) en 20 pl de amortiguador NEB3 (New England Biolabs) y se incubaron durante 10 min a 37°C.
4-3. Transfección del complejo Cas9/ARNsg a protoplasto
Se digirieron las hojas de plántulas de Arabidopsis de 4 semanas de edad cultivadas asépticamente en placas de Petri en una solución enzimática (1 % de celulosa R10, 0.5 % de macerozima R10, manitol 450 mM, MES 20 mM pH 5.7 y sal CPW) durante 8~16 horas a 25°C con agitación de 40 rpm en la oscuridad. Las soluciones de enzima/protoplasto se filtraron y centrifugaron a 100 X g durante 3~5 min. Se resuspendieron los protoplastos en solución de CPW después de contar las células bajo el microscopio (X100) usando un hemocitómetro. Finalmente, los protoplastos se resuspendieron a 1 * 106 /ml en solución de MMG (HEPES 4 mM pH 5.7, manitol 400 mM y MgCh 15 mM). Para transfectar los protoplastos con el complejo Cas9/ARNsg, se mezclaron suavemente 200 pE (200,000 protoplastos) de la suspensión de protoplastos con 3,3 o 10 uL del complejo Cas9/ARNsg [proteína Cas9 (6 pg/pL) y dos ARNsg (2.2 pg/pL cada uno)] y 200 ul de amortiguador de transfección de polietilenglicol al 40 % (PEG4000 al 40 %, manitol 200 mM y CaCh 100 mM) en tubos de 2 ml. Después de 5~20 min de incubación a temperatura ambiente, la transfección se detuvo añadiendo amortiguador de lavado con solución W5 (MES 2 mM pH 5.7, NaCl 154 mM, CaCh 125 mM y KCl 5 mM). A continuación, se recogieron los protoplastos mediante centrifugación durante 5 min a 100 X g, se lavaron con 1 ml de solución W5 y se centrifugaron durante otros 5 min a 100 X g. La densidad de protoplastos se ajustó a 1 * 105/ml y se cultivaron en medio líquido KM 8p modificado con glucosa 400 mM.
4- 4. Detección de mutaciones en protoplastos y plantas de Arabidopsis
Después de 24 horas o 72 horas después de la transfección, se recogieron los protoplastos y se aisló el ADN genómico. La región de ADN genómico que abarca los dos sitios objetivo se amplificó mediante p Cr y se sometió al ensayo T7E1. Como se muestra en la Figura 11, las RGEN indujeron indeles a altas frecuencias que oscilaron entre 50 % y 70 %. Sorprendentemente, se indujeron mutaciones 24 horas después de la transfección. Aparentemente, la proteína Cas9 funciona inmediatamente después de la transfección. Los productos de PCR se purificaron y clonaron en el kit de clonación T-Blunt PCR (Solgent). Los plásmidos se purificaron y se sometieron a secuenciación de Sanger con el cebador M13F. Una secuencia mutante tenía una eliminación de 7 pb en un sitio (Figura 12). Las otras tres secuencias mutantes tenían eliminaciones de segmentos de ADN de ~220 pb entre los dos sitios RGEN.
Ejemplo 5: Transducción de proteína Cas9 usando un péptido que penetra en la célula o un dominio de transducción de proteína (ejemplo de referencia) 5-1. Construcción del plásmido que codifica His-Cas9
Se preparó Cas9 con una cisteína en el terminal C mediante amplificación por PCR utilizando el plásmido Cas9 {Cho, 2013 #166} descrito anteriormente como plantilla y se clonó en el vector pET28-(a) (Novagen, Merk Millipore, Alemania) que contenía His- etiqueta en el extremo N.
5- 2. Cultivo de células
Se cultivaron 293T (línea celular de riñón embrionario humano) y HeLa (línea celular de cáncer de ovario humano) en DMEM (GIBCO-BRL Rockville) suplementado con FBS al 10 % y penicilina y estreptomicina al 1 %.
5-3. Expresión y purificación de la proteína Cas9
Para expresar la proteína Cas9, se transformaron células BL21 de E. coli con el vector pET28-(a) que codifica Cas9 y se sembraron en medio de agar Luria-Bertani (LB) que contenía 50 pg/ml de kanamicina (Amresco, Solon, OH). Al día siguiente, se recogió una sola colonia y se cultivó en caldo LB que contenía 50 pg/mL de kanamicina a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, se inoculó este cultivo iniciador a 0.1 OD600 en caldo Luria que contenía 50 pg/ml de kanamicina y se incubó durante 2 horas a 37 °C hasta que OD600 alcanzó 0.6-0.8. Para inducir la expresión de la proteína Cas9, se cultivaron las células a 30 °C durante la noche después de la adición de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Promega, Madison, WI) hasta la concentración final de 0.5 mM.
Se recogieron las células por centrifugación a 4000 rpm durante 15-20 min, se resuspendieron en un amortiguador de lisis (Tris-Cl 20 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, cóctel inhibidor de proteasa IX, 1 mg/ml de lisozima) y lisado por sonicación (40 % de trabajo, 10 segundos de pulso, 30 segundos de descanso, durante 10 minutos en hielo). Se separó las fracción soluble como sobrenadante después de centrifugar a 15,000 rpm durante 20 minutos a 4°C. Se purificó las proteína Cas9 a 4 °C utilizando una columna que contenía resina de agarosa Ni-NTA (QIAGEN) y un instrumento AKTa prime (AKTA prime, GE Healthcare, Reino Unido). Durante este paso de cromatografía, se cargaron las fracciones de proteínas solubles en una columna de resina de agarosa Ni-NTA (GE Healthcare, Reino Unido) a una rata de flujo de 1 ml/min. Se lavó la columna se lavó con un amortiguador de lavado (Tris-Cl 20 mM pH 8.0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, cóctel inhibidor de proteasa IX) y se eludió la proteína unida a un caudal de 0.5 ml/min con un amortiguador de elución. (Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, cóctel inhibidor de proteasa IX). Se concentró la fracción eludida agrupada y se dializó contra amortiguador de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, KCl 200 mM, EDTA 0.1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.5 mM, glicerol al 20 %). Se cuantificó la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford (Biorad, Hercules, CA) y se analizó la pureza mediante SDS-PAGE utilizando albúmina de suero bovino como control.
5-4. Conjugación de Cas9 a 9R4L
Se mezclaron 1 mg de proteína Cas9 diluida en PBS a una concentración de 1 mg/mL y 50 |jg de maleimida-9R4L péptido en 25 jL DW (Peptron, Corea) suavemente utilizando un rotor a temperatura ambiente durante 2 h y a 4 °C durante la noche. Para eliminar la maleimida-9R4L no conjugada, se dializaron las muestras utilizando una membrana de corte de peso molecular de 50 kDa frente a DPBS (pH 7,4) a 4 °C durante 24 horas. Se recogió la proteína Cas9-9R4L de la membrana de diálisis y se determinó la cantidad de proteína usando el ensayo de Bradford.
5-5. Preparación de ARNsg-9R4L
Se añadió suavemente ARNsg (1 jg ) a diversas cantidades de péptido C9R4LC (oscilando en una relación de peso de 1 a 40) en 100 j l de DPBS (pH 7.4). Se incubó esta mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos y se diluyó a 10 veces usando agua desionizada libre de ARNasa. Se midieron el diámetro hidrodinámico y el potencial z de las nanopartículas formadas mediante dispersión de luz dinámica (Zetasizer-nanoanalyser ZS; Malvern instruments, Worcestershire, Reino Unido).
5-6. Tratamientos de proteína Cas9 y ARNsg
Se trataron Cas9-9R4L y ARNsg-C9R4LC en las células de la siguiente manera: Se añadió 1 jg de ARNsg y 15 jg de péptido C9R4LC a 250 mL de medio OPTIMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. A las 24 horas después de la siembra, se lavaron las células con medio OPTIMEM y se trataron con el complejo ARNsg-C9R4LC durante 4 horas a 37 °C. Las células se lavaron nuevamente con medio OPTIMEM y se trataron con Cas9-9R4L durante 2 horas a 37 °C. Después del tratamiento, se reemplazó el medio de cultivo con medio completo que contenía suero y se incubó a 37 °C durante 24 horas antes del siguiente tratamiento. Se siguió el mismo procedimiento para múltiples tratamientos de Cas9 y ARNsg durante tres días consecutivos.
5-7. Cas9-9R4L y ARNsg-9R4L pueden editar genes endógenos en células de mamíferos cultivadas sin el uso de herramientas de administración adicionales
Para determinar si Cas9-9R4L y ARNsg-9R4L pueden editar genes endógenos en células de mamífero cultivadas sin el uso de herramientas de administración adicionales, se trataron 293 células con Cas9-9R4L y ARNsg-9R4L dirigidas al gen CCR5 y se analizó el ADN genómico. El ensayo T7E1 mostró que 9 % del gen CCR5 se interrumpió en las células tratadas con Cas9-9R4L y ARNsg-9R4L y que la interrupción del gen CCR5 no se observó en las células de control, incluyendo las no tratadas, las tratadas con Cas9-9R o ARNsg-9R4L o tratadas con Cas-9 y ARNsg no modificados (Fig. 13), lo que sugiere que el tratamiento con proteína Cas9-9R4L y ARNsg conjugado con 9R4L, pero no Cas9 y ARNsg no modificados, puede conducir a una edición genómica eficiente en células de mamífero.
Ejemplo 6: Control de mutación fuera del objetivo de acuerdo con la estructura del ARN guía (ejemplo de referencia)
Recientemente, tres grupos informaron que las RGEN tenían efectos fuera del objetivo en las células humanas. Para sorpresa, las RGEN indujeron mutaciones de manera eficiente en sitios fuera del objetivo que difieren entre 3 y 5 nucleótidos de los sitios en el objetivo. Sin embargo, se notó que había varias diferencias entre las RGEN y las utilizados por otros. Primero, se usó ARNdual, que es ARNcr más ARNtracr, en lugar de ARN de guía única (ARNsg) que se compone de porciones esenciales de ARNcr y ARNtracr. En segundo lugar, se transfectaron células K562 (pero no células HeLa) con ARNcr sintético en lugar de plásmidos que codifican ARNcr. Se transfectaron las células HeLa con plásmidos que codifican ARNcr. Otros grupos utilizaron plásmidos que codifican ARNsg. En tercer lugar, el ARN guía tenía dos nucleótidos de guanina adicionales en el extremo 5', que son necesarios para una transcripción eficiente por parte de la polimerasa T7 in vitro. No se incluyeron tales nucleótidos adicionales en el ARNsg utilizado por otros. Por lo tanto, la secuencia de ARN del ARN guía se puede mostrar como 5 -GGX20, mientras que 5-GX-ig, en el que X20 o GX-ig corresponde a la secuencia objetivo de 20 pb, representa la secuencia utilizada por otros. El primer nucleótido de guanina es necesario para la transcripción de la ARN polimerasa en las células. Para probar si los efectos de RGEN fuera del objetivo se pueden atribuir a estas diferencias, se eligieron cuatro RGEN que indujeron mutaciones fuera del objetivo en células humanas a altas frecuencias (13). Primero, se comparó el método de usar ARNdual transcrito in vitro con el método de transfección de plásmidos que codifican ARNsg en células K562 y midió las frecuencias de mutación en los sitios en el objetivo y fuera del objetivo a través del ensayo T7E1. Tres RGEN mostraron frecuencias de mutación comparables en sitios dentro y fuera del objetivo, independientemente de la composición del ARN guía. Curiosamente, una RGEN (sitio 1 de VEFGa ) no indujo indeles en un sitio fuera del objetivo validado, que difiere en tres nucleótidos del sitio en el objetivo (denominado OT1-11, Fig. 14), cuando se usó ARNdual sintético. Pero el ARNdual sintético no discriminó el otro sitio fuera del objetivo validado (OT1-3), que difiere en dos nucleótidos del sitio del objetivo.
A continuación, se probó si la adición de dos nucleótidos de guanina en el extremo 5' del ARNsg podía hacer que las RGEN fueran más específicas comparando 5 -GGX20 (o 5-GGGX-ig) ARNsg con 5-GX-ig ARNsg. Se complejaron cuatro GX-ig ARNsg con indeles inducidos por Cas9 de manera igualmente eficiente en sitios dentro y fuera del objetivo, tolerando hasta cuatro desajustes de nucleótidos. En marcado contraste, los GGX20 ARNsg discriminaron los sitios fuera del objetivo de manera efectiva. De hecho, el ensayo T7E1 apenas detectó indeles inducidos por RGEN en seis de los siete sitios fuera del objetivo validados cuando se usaron los cuatro GGX20 ARNsg (Fig. 15). Se notó, sin embargo, que dos GGX20 ARNsg (sitios 1 y 3 de VEGFA) fueron menos activos en los sitios objetivo que los correspondientes GX-ig ARNsg. Estos resultados muestran que los nucleótidos adicionales en el extremo 5' pueden
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afectar las frecuencias de mutación en los sitios en el objetivo y fuera del objetivo, tal vez alterando la estabilidad, la concentración o la estructura secundaria del ARN guía.
Estos resultados sugieren que tres factores- el uso de ARN guía sintético en lugar de plásmidos que codifican ARN guía, ARNdual en lugar de ARNsg y GGX20 ARNsg en lugar de GX19 ARNsg-tiene efectos acumulativos en la discriminación de sitios fuera del objetivo.
Ejemplo 7: Nicasas Cas9 emparejados (ejemplo de referencia)
En principio, las roturas de una sola cadena (SSB) no pueden repararse mediante NHEJ propenso a errores, pero aún desencadenan una reparación dirigida por homología (HDR) de alta fidelidad o una reparación por escisión de base. Pero la mutagénesis dirigida inducida por nicasa a través de HDR es mucho menos eficiente que la mutagénesis inducida por nucleasa. Se razonó que las Nicasas Cas9 emparejadas producirían DSB compuestos, que desencadenan la reparación del ADN a través de NHEJ o HDR, lo que conduce a una mutagénesis eficiente (Fig. 16A). Además, los nicasas emparejadas duplicarían la especificidad de la edición del genoma basada en Cas9.
Primero se probaron varias nucleasas Cas9 y nicasas diseñadas para apuntar a sitios en el locus AAVS1 (Fig. 16B) in vitro mediante electroforesis capilar fluorescente. A diferencia de las nucleasas Cas9 que escindieron ambas cadenas de sustratos de ADN, las nicasas Cas9 compuestas de ARN guía y una forma mutante de Cas9 en la que un residuo de aspartato catalítico se cambia a alanina (D10A Cas9) escindieron solo una cadena, produciendo mellas específicas del sitio (Fig..16C, D). Curiosamente, sin embargo, algunas nicasas (AS1, AS2, AS3 y S6 en la Fig. 17A) indujeron indeles en sitios objetivo en células humanas, lo que sugiere que las mellas se pueden convertir en DSB, aunque de manera ineficiente in vivo. Las nicasas Cas9 emparejadas que producían dos muescas adyacentes en cadenas de ADN opuestas produjeron indeles a frecuencias que oscilaron entre 14 % y 91 %, comparables a los efectos de las nucleasas emparejadas (Fig. 17A). La reparación de dos mellas que producirían salientes en 5' condujo a la formación de indeles con mucha más frecuencia que los que producían salientes en 3' en tres loci genómicos (Fig. 17A y Fig. 18). Además, los nicasas emparejadas permitieron la edición del genoma dirigido a través de la reparación dirigida por homología de manera más eficiente que los nicasas individuales (Fig. 19).
A continuación, se midieron las frecuencias de mutación de nicasas y nucleasas emparejadas en sitios fuera del objetivo mediante secuenciación profunda. Las nucleasas Cas9 complejadas con tres ARNsg indujeron mutaciones fuera del objetivo en seis sitios que difieren en uno o dos nucleótidos de sus correspondientes sitios en el objetivo con frecuencias que oscilaron desde 0.5 % a 10 % (Fig. 17B). Por el contrario, las nicasas Cas9 emparejadas no produjeron indeles por encima del límite de detección del 0,1 % en ninguno de los seis sitios fuera del objetivo. El sitio S2 Off-1 que difiere en un solo nucleótido en la primera posición en el PAM (es decir, N en NGG) desde su sitio en el objetivo puede considerarse como otro sitio en el objetivo. Como se esperaba, la nucleasa Cas9 complejada con el ARNsg S2 fue igualmente eficiente en este sitio y en el sitio objetivo. En marcado contraste, D10A Cas9 complejado con los ARNsg S2 y AS2 discriminó este sitio del sitio en el objetivo por un factor de 270 veces. Esta nicasa emparejada también discriminó los sitios AS2 fuera del objetivo (Off-1 y Off-9 en la Fig. 17B) del sitio en el objetivo por factores de 160 veces y 990 veces, respectivamente.
Ejemplo 8: Empalme de ADN cromosómico inducido por nicasas Cas9 emparejadas (ejemplo de referencia)
Dos DSB concurrentes producidos por nucleasas diseñadas como ZFN y TALEN pueden promover grandes eliminaciones de los segmentos cromosómicos intermedios. Se probaron si dos SSB inducidos por nicasas Cas9 emparejadas también pueden producir eliminaciones en células humanas. Se utilizó PCR para detectar eventos de eliminación y se descubrió que siete nicasas emparejadas inducían eliminaciones de segmentos cromosómicos de hasta 1,1 kpb con la misma eficacia que las nucleasas Cas9 emparejadas (Fig. 20A, B). Las secuencias de ADN de los productos de PCR confirmaron los eventos de eliminación (Fig. 20c ). Curiosamente, la secuencia coincidente de ARNsg permaneció intacta en dos de los siete amplicones de PCR específicos de eliminación (subrayados en la Fig. 20C). Por el contrario, los pares de nucleasas Cas9 no produjeron secuencias que contuvieran sitios objetivo intactos. Este hallazgo sugiere que dos ellas distantes no se convirtieron en dos DSB separados para promover las eliminaciones del segmento cromosómico intermedio. Además, es poco probable que dos mellas separadas por más de 100 pb puedan producir un DSB compuesto con grandes salientes bajo condiciones fisiológicas porque la temperatura de fusión es muy alta.
Se propone que dos mellas distantes se reparan mediante el desplazamiento de las cadenas en una dirección de cabeza a cabeza, lo que da como resultado la formación de un DSB en el medio, cuya reparación a través de NHEJ provoca pequeñas eliminaciones (Fig. 20D). Debido a que los dos sitios objetivo permanecen intactos durante este proceso, las nicasas pueden inducir SSB nuevamente, desencadenando el ciclo repetidamente hasta que se eliminen los sitios objetivo. Este mecanismo explica por qué dos mellas desplazadas que producen voladizos en 5' pero no aquellas que producen voladizos en 3' indujeron indeles de manera eficiente en tres loci.
Luego se investigó si las nucleasas y nicasas Cas9 pueden inducir translocaciones cromosómicas no deseadas que resultan de la reparación por NHEJ de escisiones de ADN en el objetivo y fuera del objetivo (Fig. 21A). Se pudieron detectar translocaciones inducidas por nucleasas Cas9 usando PCR (Fig. 21B, C). No se amplificó ninguno de estos productos de PCR usando ADN genómico aislado de células transfectadas con los plásmidos que codifican el par de nicasa AS2 S3 Cas9. Este resultado está en línea con el hecho de que tanto las nicasas AS2 como las S3, a diferencia de sus nucleasas correspondientes, no produjeron indeles en sitios fuera del objetivo (Fig. 17B).
Estos resultados sugieren que las nicasas Cas9 emparejadas permiten la mutagénesis dirigida y grandes eliminaciones de segmentos cromosómicos de hasta 1 kpb en células humanas. Es importante destacar que las nicasas emparejadas no indujeron indeles en sitios fuera del objetivo en los que sus nucleasas correspondientes inducen mutaciones. Además, a diferencia de las nucleasas, las nicasas emparejadas no promovieron translocaciones no deseadas asociadas con escisiones de ADN fuera del objetivo. En principio, las nicasas emparejadas duplican la especificidad de la mutagénesis mediada por Cas9 y ampliarán la utilidad de las enzimas guiadas por ARN en aplicaciones que requieren una edición precisa del genoma, tal como la terapia génica y celular. Una advertencia para este enfoque es que se necesitan dos ARNsg altamente activos para hacer un par de nicasas eficiente, lo que limita los sitios objetivo. Como se muestra en este y otros estudios, no todos los ARNsg son igualmente activos. Cuando se utilizan clones individuales en lugar de poblaciones de células para estudios o aplicaciones adicionales, la elección de ARN guía que representen secuencias únicas en el genoma y el uso de ARN guía optimizados serían suficientes para evitar mutaciones fuera del objetivo asociadas con las nucleasas Cas9. Se propone que tanto las nucleasas Cas9 como las nicasas emparejadas son opciones poderosas que facilitarán la edición precisa del genoma en células y organismos.
Ejemplo 9: Genotipado con endonucleasas guiadas por ARN derivadas de CRISPR/Cas (ejemplo de referencia)
A continuación, se razonó que las RGEN se pueden usar en el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), en sustitución de las enzimas de restricción convencionales. Las nucleasas diseñadas, incluyendo las RGEN, inducen indeles en los sitios de objetivo, cuando los DSB causados por las nucleasas son reparados por el sistema de unión de extremos no homólogos (NHEJ) propenso a errores. Las RGEN que están diseñadas para reconocer las secuencias objetivo no pueden escindir las secuencias mutantes con indeles, pero escindirán las secuencias objetivo de tipo silvestre de manera eficaz.
9-1. Componentes RGEN
Se prepararon ARNcr y ARNtracr por transcripción in vitro utilizando el kit MEGAshortcript T7 (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN transcritos se resolvieron en un gel de urea-PAGE desnaturalizante al 8 %. Se cortó el trozo de gel que contenía ARN y se transfirió a un tampón de elución. Se recuperó el ARN en agua libre de nucleasas seguido de extracción con fenol: cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. Se cuantificó el ARN purificado por espectrometría. Se prepararon plantillas para ARNcr fusionando un oligonucleótido cuya secuencia se muestra como 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGX20GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTG-3'(SEQ ID NO: 76), en la que X20 es la secuencia objetivo y su oligonucleótido complementario. Se sintetizó la plantilla para ARNtracr por extensión de oligonucleótidos directos e inversos.
(5 ’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTT
AAAATAAGGCTAGTCCG-3’ (SEQ ID NO: 77) y
5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTnTCAAGTTGATAACGGACTAGCC
TTATTTTAACTTGCTATG-3’(SEQ ID NO: 78) utilizando polimcrasa Phusion (New
England Biolabs).
9-2. Purificación de proteína Cas9 recombinante
Se insertó el constructo de ADN Cas9 utilizado en el ejemplo anterior, que codifica Cas9 fusionado con la etiqueta His6 en el extremo C, en el vector de expresión pET-28a. Se expresó la proteína Cas9 recombinante en cepa de E. coli BL21(DE3) cultivada en medio LB a 25 °C durante 4 horas después de la inducción con IPTG 1 mM. Las células se recogieron y se resuspendieron en tampón que contenía Tris PH 8.020 mM, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM y PMSF 1 mM. Se congelaron las células en nitrógeno líquido, se descongelaron a 4 °C y se sonicaron. Después de la centrifugación, la proteína Cas9 en el lisado se unió a resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen), se lavó con tampón que contenía Tris 20 mM pH 8.0, NaCl 500 mM e imidazol 20 mM, y se eludió con tampón que contenía Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 500 mM e imidazol 250 mM. Se dializó la proteína Cas9 purificada frente a HEPES 20 mM (pH 7.5), KCl 150 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10% y se analizó mediante SDS-PAGE.
9-3. Ensayo de endonucleasa I T7
Se realizó el ensayo T7E1 como sigue. En resumen, se desnaturalizaron los productos de PCR amplificados con ADN genómico a 95 °C, se refusionaron a 16 °C y se incubaron con 5 unidades de T7 Endonuclease I (New England BioLabs) durante 20 min a 37 °C. Se resolvieron los productos de reacción utilizando electroforesis en gel de agarosa del 2 al 2,5 %.
9-4. Ensayo RGEN-RFLP
Se incubaron los productos de PCR (100-150 ng) durante 60 min a 37 °C con concentraciones optimizadas (Tabla 10) de proteína Cas9, ARNtracr, ARNcr en 10 j l de tampón NEB 3 (IX). Después de la reacción de escisión, se añadió RNasa A (4 jg ) y la mezcla de reacción se incubó durante 30 min a 37 °C para eliminar el ARN. Se detuvieron las reacciones con tampón de solución de parada 6X que contenía glicerol al 30 %, SDS al 1.2 % y EDTA 100 mM. Se resolvieron los productos con electroforesis en gel de agarosa al 1-2.5 % y se visualizaron con tinción con EtBr.
Tabla 10
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Tabla 11
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9-5. Ensayo de escisión de plásmidos
Se incubó el plásmido linealizado tratado con enzimas de restricción (100 ng) durante 60 min a 37 °C con proteína Cas9 (0.1 |jg), ARNtracr (60 ng) y ARNcr (25 ng) en 10 j l de tampón NEB 3 (IX). Se detuvieron las reacciones con una solución de parada 6X que contenía glicerol al 30 %, SDS al 1.2 % y EDTA 100 mM. Se resolvieron los productos con electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron con tinción con EtBr.
9-6. Estrategia de RFLP
Se pueden crear fácilmente nuevas RGEN con las especificidades de ADN deseadas reemplazando ARNcr; se requiere la purificación no de novo de proteínas personalizadas una vez que la proteína Cas9 recombinante está disponible. Las nucleasas diseñadas, incluyendo las RGEN, inducen pequeñas inserciones o eliminaciones (indeles) en los sitios objetivo cuando los DSB causados por las nucleasas se reparan mediante la unión de extremos no homólogos propensos a errores (NHEJ). Las RGEN que están diseñadas para reconocer las secuencias objetivo escinden las secuencias de tipo silvestre de manera eficiente pero no pueden escindir las secuencias mutantes con indeles (Fig. 22).
Primero se probó si las RGEN pueden escindir diferencialmente plásmidos que contienen secuencias objetivo C4BPB de tipo silvestre o modificadas que albergan indeles de 1 a 3 bases en el sitio de escisión. Ninguno de los seis plásmidos con estos indeles fue escindido por una RGEN5 específica de C4BPB compuesta por ARNcr específico ele objetivo, ARNtracr y proteína Cas9 recombinante (Fig. 23). Por el contrario, el plásmido con la secuencia objetivo intacta fue escindido eficientemente por esta RGEN.
9-7. Detección de mutaciones inducidas por las mismas RGEN utilizando RFLP mediado por RGEN
A continuación, para probar la viabilidad de RFLP mediado por RGEN para la detección de mutaciones inducidas por las mismas RGEN, se utilizaron clones de células cancerosas humanas K562 modificados genéticamente establecidos usando un gen C4BPB dirigido a RGEN (Tabla 12).
Tabla 12
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Los clones mutantes de C4BPB usados en este estudio tienen diversas mutaciones que van desde la eliminación de 94 pb hasta la inserción de 67 pb (Fig. 24A). Es importante destacar que todas las mutaciones ocurridas en clones mutantes dieron como resultado la pérdida del sitio objetivo de RGEN. Entre los 6 clones de C4BPB analizados, 4 clones tienen alelos de tipo silvestre y mutantes (+/-) y 2 clones tienen solo alelos mutantes (-/-).
Los productos de PCR que abarcan el sitio objetivo de RGEN amplificado a partir de ADN genómico de K562 de tipo salvaje fueron digeridos completamente por la RGEN compuesta por ARNcr específico objetivo, ARNtracr y proteína Cas9 recombinante expresada y purificada a partir de E. coli (Fig. 24B/Carril 1). Cuando los clones mutantes de C4BPB se sometieron a análisis RFLP utilizando RGEn , los amplicones de PCR de los clones /- que contenían alelos de tipo silvestre y mutante se digirieron parcialmente, y los clones de -/- que no contenían el alelo de tipo silvestre no se digirieron en absoluto, sin producir productos de escisión correspondientes a la secuencia de tipo silvestre (Fig. 24B). Incluso una inserción de una sola base en el sitio objetivo bloqueó la digestión (clones #12 y #28) de los alelos mutantes amplificados por el C4BPB RGEN, lo que demuestra la alta especificidad de la RFLp mediada por RGEN. Se sometieron los amplicones de PCR al ensayo T7E1 sensible a discrepancias en paralelo (Fig. 24B). En particular, el ensayo T7E1 no pudo distinguir los clones -/- de los clones /-. Para empeorar las cosas, el ensayo T7E1 no puede distinguir los clones mutantes homocigóticos que contienen la misma secuencia mutante de los clones de tipo silvestre, porque la hibridación de la misma secuencia mutante formará un homodúplex. Por lo tanto, RFLP mediado por RGEN tiene una ventaja crítica sobre el ensayo de nucleasa sensible a desajustes convencionales en el análisis de clones mutantes inducidos por nucleasas modificadas, incluyendo ZFN, TALEN y RGEN.
9-8. Ensayo cuantitativo para análisis RGEN-RFLP
También se investigó si el análisis RGEN-RFLP es un método cuantitativo. Se mezclaron las muestras de ADN genómico aisladas del clon nulo C4BPB y las células de tipo silvestre en diversas proporciones y se usaron para amplificaciones por PCR. Se sometieron los productos de la PCR al genotipado RGEN y al ensayo T7E1 en paralelo (Fig. 25b). Como se esperaba, la escisión del ADN por la RGEN fue proporcional a la proporción de tipo silvestre a mutante. Por el contrario, los resultados del ensayo T7E1 se correlacionaron mal con las frecuencias de mutación deducidas de las proporciones y fueron inexactos, especialmente en un alto porcentaje de mutantes, una situación en la que las secuencias mutantes complementarias pueden hibridarse entre sí para formar homodúplex.
9-9. Análisis de fundadores de ratones mutantes utilizando un genotipado de RFLP mediado por RGEN
También se aplicó el genotipado de RFLP mediado por RGEN (genotipado de RGEN, en resumen) al análisis de fundadores de ratones mutantes que se habían establecido mediante la inyección de TALEN en embriones de una célula de ratón (Fig. 26A). Se diseñó y usó una RGEN que reconoció el sitio objetivo de TALEN en el gen Pibfl (Tabla 10). Se aisló el ADN genómico de un ratón de tipo silvestre y de ratones mutantes y se sometió a genotipado RGEN después de la amplificación por PCR. El genotipado RGEN detectó con éxito diversas mutaciones, que oscilaron entre una y eliminaciones de 27 pb (Fig. 26B). A diferencia del ensayo T7E1, el genotipado RGEN permitió la detección diferencial del fundador /- y -/-.
9-10. Detección de mutaciones inducidas en células humanas por un ZFN específico de CCR5 utilizando RGEN
Además, su utilizó RGEN para detectar mutaciones inducidas en células humanas por un ZFN específico de CCR5, lo que representa otra clase más de nucleasas diseñadas (Fig. 27). Estos resultados muestran que las RGEN pueden detectar mutaciones inducidas por nucleasas distintas de las propias RGEN. De hecho, se espera que las RGEN puedan diseñarse para detectar mutaciones inducidas por la mayoría, si no todas, las nucleasas diseñadas. La única limitación en el diseño de un ensayo de genotipado RGEN es el requisito del dinucleótido GG o AG (CC o CT en la cadena complementaria) en la secuencia PAM reconocida por la proteína Cas9, que ocurre una vez cada 4 pb en promedio. Se espera que los indeles inducidos en cualquier lugar dentro de la región semilla de varias bases en ARNcr y los nucleótidos PAM interrumpan la escisión del ADN catalizada por RGEN. De hecho, se identificó al menos un sitio RGEN en la mayoría (98 %) de los sitios ZFN y TALEN.
9-11. Detección de polimorfismos o variaciones mediante RGEN
A continuación, se diseñó y probó una nueva RGEN que se dirige a un locus altamente polimórfico, HLA-B, que codifica el antígeno leucocitario humano B (también conocido como proteína MHC de clase I) (Fig. 28). Las células HeLa se transfectaron con plásmidos RGEN y el ADN genómico se sometió a análisis T7E1 y RGEN-RFLP en paralelo. T7E1 produjo bandas de falsos positivos que resultaron de polimorfismos de secuencia cerca del sitio objetivo (Fig. 25c). Como era de esperar, sin embargo, la misma RGEN utilizada para la interrupción de genes escindió completamente los productos de PCR de las células de tipo silvestre, pero parcialmente los de las células transfectadas con RGEN, lo que indica la presencia de indeles inducidos por RGEN en el sitio objetivo. Este resultado muestra que el análisis RGEN-RFLP tiene una clara ventaja sobre el ensayo T7E1, especialmente cuando no se sabe si los genes objetivo tienen polimorfismos o variaciones en las células de interés.
9-12. Detección de mutaciones recurrentes encontradas en el cáncer y polimorfismos de origen natural a través del análisis RGEN-RFLP
El análisis RGEN-RFLP tiene aplicaciones más allá del genotipado de mutaciones inducidas por nucleasas modificadas. Se intentó utilizar el genotipado RGEN para detectar mutaciones recurrentes encontradas en el cáncer y polimorfismos de origen natural. Se eligió la línea celular de cáncer colorrectal humano, HCT116, que lleva una eliminación de 3 pb de ganancia de función en el gen oncogénico CTNNB1 que codifica la beta-catenina. Se escindieron los productos de PCR amplificados a partir del ADN genómico de HCT116 parcialmente mediante RGEN específicas de tipo silvestre y específicos de mutantes, en línea con el genotipo heterocigoto en las células HCT116 (Fig. 29a). En marcado contraste, los productos de PCR amplificados a partir de ADN de células HeLa que albergan solo alelos de tipo silvestre fueron digeridos completamente por la RGEN específica de tipo silvestre y no fueron escindidos en absoluto por la RGEN específica de mutación.
También se notó que las células HEK293 albergan la eliminación de 32 pb (de132) en el gen CCR5, que codifica un coreceptor esencial de la infección por VIH: Los portadores homocigotos del32 CCR5 son inmunes a la infección por VIH. Se diseño una RGEN específica para el alelo del32 y el otro para el alelo de tipo silvestre. Como era de esperar, la RGEN específica de tipo silvestre escindió completamente los productos de PCR obtenidos de células K562, SKBR3 o HeLa (utilizadas como controles de tipo silvestre), pero parcialmente los de células HEK293 (Fig. 30a), lo que confirma la presencia del alelo inescindible del32 en células HEK293. Sin embargo, inesperadamente, la RGEN específica de del32 escindió los productos de la PCR de las células de tipo silvestre tan eficientemente como los de las células HEK293. Curiosamente, esta RGEN tenía un sitio fuera del objetivo con un desajuste de una sola base inmediatamente corriente abajo del sitio en el objetivo (Fig. 30). Estos resultados sugieren que las RGEN se pueden usar para detectar indeles que ocurren naturalmente, pero no pueden distinguir secuencias con polimorfismos de un solo nucleótido o mutaciones puntuales debido a sus efectos fuera del objetivo.
Para genotipar las variaciones oncogénicas de un solo nucleótido utilizando RGEN, se atenuó la actividad de RGEN mediante el empleo de un ARN guía de base única que no coincidía en lugar de un ARN perfectamente coincidente. Las RGEN que contenían el ARN guía perfectamente emparejado específico para la secuencia de tipo silvestre o la secuencia mutante escindieron ambas secuencias (Figs. 31a y 32a). Por el contrario, las RGEN que contenían un ARN guía no coincidente de una sola base distinguieron las dos secuencias, lo que permitió la genotipificación de tres mutaciones puntuales oncogénicas recurrentes en los genes KRAS, PIK3CA e IDH1 en líneas celulares de cáncer humano (Fig. 29b y Figs. 33a, b). Además, se pudo detectar mutaciones puntuales en los genes BRAF y NRAS utilizando RGEN que reconocen la secuencia NAG PAM (Figs. 33c, d). Se cree que se puede usar RGEN-RFLP para genotipar casi todas las mutaciones o polimorfismos, si no todos, en el genoma humano y otros.
Los datos anteriores proponen que las RGEN proporcionen una plataforma para usar un análisis RFLP simple y robusto para diversas variaciones de secuencia. Con una alta flexibilidad en la reprogramación de la secuencia objetivo, las RGEN se pueden usar para detectar diversas variaciones genéticas (variaciones de un solo nucleótido, pequeñas inserciones/eliminaciones, variaciones estructurales) como mutaciones recurrentes relacionadas con enfermedades, genotipos relacionados con la respuesta al fármaco de un paciente y también mutaciones inducida por nucleasas modificadas en las células. Aquí, se utilizó el genotipado RGEN para detectar mutaciones inducidas por nucleasas modificadas en células y animales. En principio, también se podrían usar las RGEN que detectarán y dividirán específicamente las variaciones y mutaciones que ocurren naturalmente.
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método in vitro o ex vivo para introducir roturas de doble cadena en un ADN objetivo en una célula de mamífero, comprendiendo el método poner en contacto el ADN objetivo con un sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas Tipo II (CRISPR)/proteína 9 asociada a c R iSPR (Cas9) que comprende: a. una proteína Cas9 con una señal de localización nuclear (NLS) añadida al terminal C de la proteína Cas9; y b. un ARN guía de cadena única que comprende una porción de ARN CRISPR (ARNcr) fusionada con una porción de ARNcr trans activador (ARNtracr),
    en el que el método comprende transfectar la célula de mamífero con un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 seguido de transfectar la célula de mamífero con el ARN guía de cadena única.
    2. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el ARN guía de cadena única es un ARN transcrito in vitro.
    4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ADN objetivo es un ADN genómico.
    5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de ADN objetivo consiste en 20 nucleótidos complementarios a la porción ARNcr del ARN guía de cadena única y un motivo adyacente al protoespaciador de trinucleótido (PAM), y en el que el PAM consiste en el trinucleótido 5-NGG-3'.
    6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la porción de ARNcr del ARN guía de cadena única comprende 20 nucleótidos complementarios a la secuencia de ADN objetivo.
    7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
    8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el método es un método in vitro.
    9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el método es un método ex-vivo.
    10. Un método in vitro o ex-vivo para preparar una célula de mamífero que comprende el sistema CRISPR/Cas9 Tipo II como se define en las reivindicaciones 1 a 3 y 6, comprendiendo el método transfectar en serie una célula de mamífero con:
    a. un ácido nucleico que codifica una proteína Cas9 con una señal de localización nuclear (NLS) añadida al terminal C de la proteína Cas9; y
    b. un ARN guía de cadena única que comprende una porción de ARN CRISPR (ARNcr) fusionada con una porción de ARNcr de transactivación (ARNtracr)
    en el que el método comprende transfectar la célula de mamífero con el ácido nucleico seguido de transfectar la célula de mamífero con el ARN guía de cadena única.
    11. El método de la reivindicación 10, en el que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes.
    12. El método de la reivindicación 10 u 11, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
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