ES3062700T3 - Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof - Google Patents

Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof

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ES3062700T3
ES3062700T3 ES24165204T ES24165204T ES3062700T3 ES 3062700 T3 ES3062700 T3 ES 3062700T3 ES 24165204 T ES24165204 T ES 24165204T ES 24165204 T ES24165204 T ES 24165204T ES 3062700 T3 ES3062700 T3 ES 3062700T3
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Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Composición para escindir un ADN diana que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o proteína Cas y uso de las mismas
[0003] Campo técnico
[0004] La presente invención se refiere a la edición del genoma dirigida en células eucariotas. Más particularmente, la presente invención se refiere a una composición para escindir un ADN diana en células eucariotas que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o proteína Cas y uso de las mismas.
[0005] Antecedentes
[0006] Las CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) son loci que contienen múltiples repeticiones directas cortas que se encuentran en los genomas de aproximadamente 40% de las bacterias secuenciadas y 90% de las arqueas secuenciadas. CRISPR funciona como un sistema inmune procariota, ya que confiere resistencia a elementos genéticos exógenos como plásmidos y fagos. El sistema CRISPR proporciona una forma de inmunidad adquirida. Los segmentos cortos de ADN extraño, llamados espaciadores, se incorporan al genoma entre repeticiones CRISPR y sirven como memoria de exposiciones pasadas. Los espaciadores CRISPR se utilizan luego para reconocer y silenciar elementos genéticos exógenos de una manera análoga al ARNi en organismos eucariotas.
[0007] Cas9, un componente proteico esencial en el sistema CRISPR/Cas Tipo II, forma una endonucleasa activa cuando forma un complejo con dos ARN denominados ARN de CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr), cortando así elementos genéticos extraños en fagos o plásmidos invasores para proteger a las células hospederas. El ARNcr se transcribe a partir del elemento CRISPR en el genoma hospedero, que fue capturado previamente por dichos invasores extraños. Recientemente, Jinek et al. (1) demostraron que un ARN quimérico de cadena sencilla producido mediante la fusión de una porción esencial de ARNcr y ARNtracr podría reemplazar los dos ARN en el complejo Cas9/ARN para formar una endonucleasa funcional.
[0008] Los sistemas CRISPR/Cas ofrecen una ventaja sobre las proteínas de unión al ADN con efectores tipo activador de transcripción y de dedo de zinc, ya que la especificidad del sitio en la unión de nucleótidos de las proteínas CRISPR-Cas está gobernada por una molécula de ARN en lugar de la proteína de unión al ADN, lo que puede ser más difícil de diseñar y sintetizar.
[0009] Sin embargo, hasta ahora, no se ha desarrollado un método de edición del genoma que utilice la endonucleasa guiada por ARN (RGEN) basada en el sistema CRISPR/Cas. [7]
[0010] Mientras tanto, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es uno de los métodos de genotipificación más antiguos, más convenientes y menos costosos que todavía se utiliza ampliamente en biología molecular y genética, pero a menudo está limitado por la falta de sitios apropiados reconocidos por las endonucleasas de restricción.
[0011] Las mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas se detectan mediante diversos métodos, los cuales incluyen ensayos de T7 endonucleasa I sensible a falta de coincidencias (T7E1) o nucleasa Surveyor, RFLP, electroforesis capilar de productos de PCR fluorescentes, secuenciación didesoxi y secuenciación profunda. Los ensayos T7E1 y Surveyor son ampliamente utilizados, pero son engorrosos. Además, estas enzimas tienden a subestimar las frecuencias de mutación porque las secuencias mutantes pueden formar homodúplex entre sí y no pueden distinguir los clones mutantes bialélicos homocigotos de las células de tipo silvestre. RFLP está libre de estas limitaciones y, por lo tanto, es un método de elección. De hecho, RFLP fue uno de los primeros métodos para detectar mutaciones mediadas por nucleasas diseñadas en células y animales. Sin embargo, desafortunadamente, RFLP está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción apropiados. Es posible que no haya sitios de restricción disponibles en el sitio diana de interés.
[0012] Sumario
[0013] Problema técnico
[0014] Hasta ahora, no se ha desarrollado un método de edición del genoma y genotipificación que utilice la endonucleasa guiada por ARN (RGEN) basado en el sistema CRISPR/Cas.
[0015] Bajo estas circunstancias, los presentes inventores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un método de edición del genoma basado en el sistema CRISPR/Cas y finalmente han establecido una endonucleasa programable guiada por ARN que escinde el ADN de forma dirigida en células y organismos eucariotas. Además, los presentes inventores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un nuevo método de uso de endonucleasas guiadas por ARN (RGEN) en el análisis RFLP. Ellos han utilizado RGEN para genotipar mutaciones recurrentes encontradas en el cáncer y aquellas inducidas en células y organismos mediante nucleasas diseñadas, incluyendo las propias RGEN.
[0016] Solución al problema
[0017] La presente invención proporciona en un primer aspecto un métodoin vitrooex vivopara escindir un ADN diana en una célula de mamífero, inducir una mutagénesis dirigida en una célula de mamífero o edición del genoma en una célula de mamífero, comprendiendo el método los pasos de (a) proporcionar una composición que comprende un ARN guía de cadena sencilla (ARNsg) y una proteína Cas9 y (b) transferir la composición a la célula, en la que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
[0018] La presente invención proporciona en un segundo aspecto un métodoin vitrooex vivopara preparar una célula de mamífero, comprendiendo el método los pasos de (a) proporcionar una composición que comprende un ARN guía de cadena sencilla (ARNsg) y una proteína Cas9 y (b) transferir la composición a la célula, en la que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
[0019] La presente invención proporciona en un tercer aspecto un usoin vitrooex vivode un ARNsg y una proteína Cas9 para transferencia a una célula de mamífero para escindir un ADN diana en dicha célula de mamífero, inducir una mutagénesis dirigida en dicha célula de mamífero o edición del genoma en dicha célula de mamífero, en la que el ARNsg y la proteína Cas9 se proporcionan en una composición y la composición se transfiere a la célula y en la que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
[0020] La presente invención proporciona en un cuarto aspecto un usoin vitrooex vivode una proteína Cas9 formando un complejo con un ARNsg para su transferencia a una célula de mamífero para escindir un ADN diana en dicha célula de mamífero, inducir una mutagénesis dirigida en dicha célula de mamífero o la edición del genoma en dicha célula de mamífero, en la que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes. Cualquier usoin vivoy también las implementaciones en las que se modifica la identidad genética de la línea germinal de seres humanos no están abarcadas por la invención.
[0021] Efectos ventajosos de la invención
[0022] Los presentes métodos para escindir un ADN diana o inducir una mutagénesis dirigida en células de mamífero, utilizando una composición que comprende un ARN guía de cadena sencilla específico para el ADN diana y la proteína Cas9 deStreptococcus pyogenesproporcionan una nueva y conveniente herramienta de edición del genoma. Además, debido a que las endonucleasas guiadas por ARN personalizadas (RGEN) pueden diseñarse para dirigirse a cualquier secuencia de ADN, casi cualquier polimorfismo de un solo nucleótido o pequeña inserción/deleción (indel) puede analizarse a través de RFLP mediado por RGEN, por lo tanto, el método puede utilizarse para detectar y escindir variaciones y mutaciones que ocurren naturalmente.
[0023] Descripción breve de las figuras
[0024] La Fig.1 muestra la escisión del ADN plasmídico catalizada por Cas9 in vitro. (a) Representación esquemática de secuencias de ADN diana y ARN quimérico. Los triángulos rojos indican los sitios de escisión. La secuencia PAM reconocida por Cas9 se muestra en negritas. Las secuencias del ARN guía derivadas de ARNcr y ARNtracr se muestran en recuadro y subrayadas, respectivamente. (b) Escisión in vitro de ADN plasmídico por Cas9. Se incubó un plásmido circular intacto o un plásmido digerido con ApaLl con Cas9 y ARN guía.
[0025] La Fig.2 muestra la mutagénesis inducida por Cas9 en un sitio diana episomal. (a) Descripción esquemática de ensayos basados en células que utilizan un reportero RFP-GFP. GFP no se expresa desde este reportero porque la secuencia GFP está fusionada a la secuencia RFP fuera del marco. La proteína de fusión RFP-GFP se expresa solo cuando el sitio diana entre las dos secuencias es escindido por una nucleasa específica del sitio. (b) Citometría de flujo de células transfectadas con Cas9. Se indica el porcentaje de células que expresan la proteína de fusión RFP-GFP.
[0026] La Fig.3 muestra mutaciones impulsadas por RGEN en sitios cromosómicos endógenos. (a) Locus CCR5. (b) Locus C4BPB. (Arriba) Se utilizó el ensayo T7E1 para detectar mutaciones impulsadas por RGEN. Las flechas indican la posición esperada de las bandas de ADN escindidas por T7E1. Las frecuencias de mutación (Indels (%)) se calcularon midiendo las intensidades de las bandas. (Abajo) Secuencias de ADN de los clones de tipo silvestre (WT) y mutantes de CCR5 y C4BPB. La región de la secuencia diana complementaria al ARN guía se muestra en recuadro. La secuencia PAM se muestra en negritas. Los triángulos indican el sitio de escisión. Las bases correspondientes a microhomologías están subrayadas. La columna de la derecha indica el número de bases insertadas o eliminadas.
[0027] La Fig.4 muestra que las mutaciones fuera de la diana impulsadas por RGEN son indetectables. (a) Secuencias en la diana y potencialmente fuera de la diana. Se buscó in silico en el genoma humano para encontrar sitios potencialmente fuera de la diana. Se identificaron cuatro sitios, cada uno de los cuales porta faltas de coincidencia de 3 bases con el sitio en la diana de CCR5. Las bases con falta de coincidencia están subrayadas.
[0028] (b) Se utilizó el ensayo T7E1 para investigar si estos sitios estaban mutados en células transfectadas con el complejo Cas9/ARN. No se detectaron mutaciones en estos sitios. N/A (no aplicable), un sitio intergénico. (c) Cas9 no indujo deleciones cromosómicas asociadas fuera de la diana. Las RGEN y ZFN específicas de CCR5 se expresaron en células humanas. Se utilizó PCR para detectar la inducción de deleciones cromosómicas de 15 kb en estas células.
[0029] La Fig. 5 muestra el direccionamiento del gen Foxn1 inducido por RGEN en ratones. (a) Un diagrama esquemático que representa un ARNsg específico del exón 2 del gen Foxn1 de ratón. El PAM en el exón 2 se muestra en rojo y la secuencia en el ARNsg que es complementaria al exón 2 está subrayada. Los triángulos indican sitios de escisión. (b) Ensayos representativos de T7E1 que demuestran la eficiencia de focalización genética del ARNm de Cas9 más el ARNsg específico de Foxn1 que se administraron mediante inyección intracitoplasmática en embriones de ratón en etapa de una sola célula. Los números indican ratones fundadores independientes generados a partir de la dosis más alta. Las flechas indican bandas escindidas por T7E1. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes observados en tres mutantes fundadores de Foxn1 identificados en b. El número de ocurrencias se muestra entre paréntesis. (d) Genotipificación por PCR de las progenies F1 derivadas del cruce del fundador Foxn1 #108 y el FVB/NTac de tipo silvestre. Nótese la segregación de los alelos mutantes encontrados en el fundador Foxn1 #108 en las progenies.
[0030] La Fig. 6 muestra el direccionamiento del gen Foxn1 en embriones de ratón mediante inyección intracitoplasmática de ARNm de Cas9 y ARNsg de Foxn1. (a) El resultado representativo de un ensayo T7E1 que monitorea la tasa de mutación después de inyectar la dosis más alta. Las flechas indican bandas escindidas por T7E1. (b) Un sumario de los resultados del ensayo T7E1. Se indican las fracciones mutantes entre los embriones cultivadosin vitroobtenidos después de la inyección intracitoplasmática de las dosis indicadas de RGEN. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes de Foxn1 identificados a partir de un subconjunto de embriones mutantes positivos para T7E1. La secuencia diana del alelo de tipo silvestre se indica en recuadro. La Fig. 7 muestra el direccionamiento del gen Foxn1 en embriones de ratón utilizando la proteína Cas9 recombinante: Complejo Foxn1-ARNsg. (a) y (b) son resultados representativos de ensayos T7E1 y sus sumarios. Se cultivaron embrionesin vitrodespués de ser sometidos a inyección del pronúcleo (a) o intracitoplasmática (b). Los números en rojo indican ratones mutantes fundadores positivos para T7E1. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes de Foxn1 identificados a partir de embriones cultivadosin vitroque se obtuvieron mediante la inyección del pronúcleo de la proteína Cas9 recombinante: Complejo Foxn1-ARNsg en la dosis más alta. La secuencia diana del alelo de tipo silvestre se indica en recuadro.
[0031] La Fig.8 muestra la transmisión de la línea germinal de los alelos mutantes encontrados en el mutante fundador Foxn1 #12. (a) análisis de fPCR, (b) genotipificación por PCR de FVB/NTac de tipo silvestre, el ratón fundador y sus progenies F1.
[0032] La Fig.9 muestra los genotipos de embriones generados al cruzar los mutantes fundadores Prkdc. Se cruzaron mutantes fundadores Prkdc ♂25 y ♀15 y se aislaron embriones E13.5. (a) Análisis de fPCR del tipo silvestre, fundador ♂25 y fundador ♀15. Nótese que, debido a las limitaciones técnicas del análisis fPCR, estos resultados mostraron pequeñas diferencias con respecto a las secuencias precisas de los alelos mutantes; por ejemplo, a partir del análisis de secuencia, se identificaron Δ269/Δ61/WT y ΔS+1/+7/+12/WT en los fundadores ♂25 y ♀15, respectivamente. (b) Genotipos de los embriones generados.
[0033] La Fig.10 muestra la mutación dirigida inducida por el complejo proteína Cas9/ARNsg.
[0034] La Fig.11 muestra mutaciones inducidas por la proteína Cas9 recombinante en protoplastos de Arabidopsis. La Fig. 12 muestra secuencias mutantes inducidas por la proteína Cas9 recombinante en el gen BRI1 de Arabidopsis.
[0035] La Fig. 13 muestra el ensayo T7E1 que muestra la interrupción endógena del gen CCR5 en células 293 mediante el tratamiento de Cas9-mal-9R4L y el complejo ARNsg/C9R4LC.
[0036] La Fig. 14 (a, b) muestra las frecuencias de mutación en sitios en la diana y fuera de la diana de RGEN reportadas en Fu et al. (2013). Ensayos T7E1 que analizan ADN genómico de células K562 (R) transfectadas en serie con 20 mg de plásmido que codifica para Cas9 y con 60 mg y 120 mg de ARNcr y ARNtracr de GX19 transcritosin vitro, respectivamente (1 × 10<6>células) o (D) cotransfectadas con 1 mg de plásmido que codifica para Cas9 y 1 mg de plásmido de expresión de ARNsg de GX19 (2 × 10<5>células).
[0037] La Fig.15 (a, b) muestra la comparación de la estructura del ARN guía. Las frecuencias de mutación de las RGEN reportadas en Fu et al. (2013) se midieron en sitios en la diana y fuera de la diana utilizando el ensayo T7E1. Las células K562 se cotransfectaron con el plásmido que codifica para Cas9 y el plásmido que codifica para ARNsg de GX19 o ARNsg de GGX20. Los sitios fuera de la diana (OT1-3, etc.) están etiquetados como en Fu et al. (2013).
[0038] La Fig.16 muestra la escisiónin vitrode ADN por nickasas Cas9. (a) Descripción esquemática de la nucleasa Cas9 y la nickasa Cas9 pareada. Las secuencias PAM y los sitios de escisión se muestran en recuadro. (b) Sitios diana en el locus AAVS1 humano. La posición de cada sitio diana se muestra en un triángulo. (c) Esquema general de las reacciones de escisión del ADN. Los colorantes FAM (mostrados en recuadro) se unieron a ambos extremos 5' del sustrato de ADN. (d) DSB y SSB analizados mediante electroforesis capilar fluorescente. Los sustratos de ADN etiquetados con fluorescencia se incubaron con nucleasas o nickasas Cas9 antes de la electroforesis.
[0039] La Fig.17 muestra la comparación del comportamiento de la nucleasa y la nickasa Cas9. (a) Frecuencias de mutación en la diana asociadas con nucleasas Cas9 (WT), nickasas (D10A) y nickasas pareadas.
[0040] Se indican las nickasas pareadas que producirían salientes de 5' o salientes de 3'. (b) Análisis de los efectos fuera de la diana de las nucleasas y las nickasas Cas9 pareadas. Se analizaron un total de siete sitios potenciales fuera de la diana para tres ARNsg.
[0041] La Fig.18 muestra nickasas Cas9 pareadas probadas en otros loci humanos endógenos. (a,c) Los sitios diana del ARNsg en los loci humanos de CCR5 y BRCA2. Las secuencias PAM están indicadas en rojo. (b,d) Las actividades de edición del genoma en cada sitio diana se detectaron mediante el ensayo T7E1.
[0042] La reparación de dos mellas que producirían salientes de 5' condujo a la formación de indels con mucha más frecuencia que aquellos que producían salientes de 3'.
[0043] La Fig.19 muestra que las nickasas Cas9 pareadas median la recombinación homóloga. (a) Estrategia para detectar la recombinación homóloga. El ADN donante incluía un sitio de enzima de restricción Xbal entre dos brazos de homología, mientras que el sitio diana endógeno carecía de este sitio. Se utilizó un ensayo de PCR para detectar secuencias que habían sufrido recombinación homóloga. Para evitar la amplificación del ADN donante contaminante, se utilizaron cebadores específicos del ADN genómico. (b) Eficiencia de la recombinación homóloga. Sólo los amplicones de una región en la que se había producido una recombinación homóloga se pudieron digerir con Xbal; las intensidades de las bandas de escisión se utilizaron para medir la eficacia de este método.
[0044] La Fig. 20 muestra el empalme de ADN inducido por nickasas Cas9 pareadas. (a) Los sitios diana de las nickasas pareadas en el locus AAVS1 humano. Se muestran las distancias entre el sitio AS2 y cada uno de los otros sitios. Las flechas indican cebadores de PCR. (b) Deleciones genómicas detectadas utilizando PCR. Los asteriscos indican productos de PCR específicos de deleción. (c) Secuencias de ADN de productos de PCR específicos de deleción obtenidos utilizando ARNsg de AS2 y L1. Las secuencias PAM del sitio diana se muestran en recuadro y las secuencias coincidentes con ARNsg se muestran en letras mayúsculas. Las secuencias coincidentes con ARNsg intactas están subrayadas. (d) Un modelo esquemático de deleciones cromosómicas pareadas mediadas por la nickasa Cas9. Las cadenas de ADN recién sintetizadas se muestran en recuadro.
[0045] La Fig.21 muestra que las nickasas Cas9 pareadas no inducen translocaciones. (a) Esquema general de las translocaciones cromosómicas entre los sitios en la diana y los sitios fuera de la diana. (b) Amplificación por PCR para detectar translocaciones cromosómicas. (c) Translocaciones inducidas por las nucleasas Cas9, pero no por el par nickasa.
[0046] La Fig.22 muestra un diagrama conceptual de los ensayos T7E1 y RFLP. (a) Comparación de las reacciones de escisión del ensayo en cuatro posibles escenarios después del tratamiento con nucleasa diseñada en una célula diploide: (A) tipo silvestre, (B) una mutación monoalélica, (C) mutaciones bialélicas diferentes (hetero) y (D) mutaciones bialélicas idénticas (homo). Las líneas negras representan productos de PCR derivados de cada alelo; los cuadros discontinuos y punteados indican mutaciones de inserción/deleción generadas por NHEJ. (b) Resultados esperados de la digestión con T7E1 y RGEN resueltos por electroforesis.
[0047] La Fig.23 muestra un ensayo de escisiónin vitrode un plásmido linealizado que contiene los indels que portan el sitio diana de C4BPB. Secuencias de ADN de sustratos de plásmidos individuales (panel superior). La secuencia PAM está subrayada. Las bases insertadas se muestran en recuadro. Las flechas (panel inferior) indican las posiciones esperadas de las bandas de ADN escindidas por la RGEN específica de tipo silvestre después de la electroforesis.
[0048] La Fig.24 muestra la genotipificación de mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas en células a través de RFLP mediado por RGEN. (a) Genotipo de los clones de células K562 mutantes C4BPB. (b) Comparación del ensayo T7E1 sensible a la falta de coincidencia con el análisis RFLP mediado por RGEN. Las flechas negras indican el producto de escisión mediante tratamiento con la enzima T7E1 o RGEN.
[0049] La Fig.25 muestra la genotipificación de mutaciones inducidas por RGEN mediante la técnica RGEN-RFLP. (a) Análisis de clones C4BPB alterados utilizando ensayos RGEN-RFLP y T7E1. Las flechas indican las posiciones esperadas de las bandas de ADN escindidas por RGEN o T7E1. (b) Comparación cuantitativa del análisis RGEN-RFLP con ensayos T7E1. Se mezclaron muestras de ADN genómico de células K562 de tipo silvestre y con C4BPB alterado en diversas proporciones y se sometieron a amplificación por PCR. (c) Genotipificación de mutaciones inducidas por RGEN en el gen HLA-B en células HeLa con análisis RFLP y T7E1.
[0050] La Fig. 26 muestra la genotipificación de mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas en organismos a través de RFLP mediado por RGEN. (a) Genotipo de los ratones mutantes fundadores Pibf1. (b) Comparación del ensayo T7E1 sensible a la falta de coincidencia con el análisis RFLP mediado por RGEN. Las flechas negras indican el producto de escisión mediante tratamiento con la enzima T7E1 o RGEN.
[0051] La Fig.27 muestra la genotipificación mediada por RGEN de mutaciones inducidas por ZFN. El sitio diana de ZFN se muestra en recuadro. Las flechas negras indican bandas de ADN escindidas por T7E1.
[0052] La Fig.28 muestra sitios polimórficos en una región del gen HLA-B humano. La secuencia, que rodea el sitio diana de RGEN, es la de un amplicón de PCR de células HeLa. Las posiciones polimórficas se muestran en recuadro. El sitio diana de RGEN y la secuencia PAM se muestran en recuadros discontinuos y en negritas, respectivamente. Las secuencias de cebadores están subrayadas.
[0053] La Fig. 29 muestra la genotipificación de mutaciones oncogénicas mediante análisis RGEN-RFLP. (a) Las RGEN detectaron una mutación recurrente (deleción c.133-135 de TCT) en el gen CTNNB 1 humano en células HCT116. Se utilizaron células HeLa como un control negativo. (b) Genotipificación de la mutación de sustitución KRAS (c.34 G>A) en la línea de células cancerosas A549 con RGEN que contienen ARN guía con falta de coincidencia. Los nucleótidos con falta de coincidencia se muestran en recuadro. Se utilizaron células HeLa como un control negativo. Las flechas indican bandas de ADN escindidas por RGEN. Se muestran secuencias de ADN confirmadas mediante secuenciación de Sanger.
[0054] La Fig.30 muestra la genotipificación del alelo de CCR5 delta32 en células HEK293T mediante análisis RGEN-RFLP. (a) Ensayos RGEN-RFLP de líneas celulares. Se utilizaron células K562, SKBR3 y HeLa como controles de tipo silvestre. Las flechas indican bandas de ADN escindidas por RGEN. (b) Secuencia de ADN de los alelos CCR5 de tipo silvestre y delta32. Se subrayan los sitios en la diana y fuera de la diana de las RGEN utilizadas en el análisis RFLP. En recuadro se muestra la falta de coincidencia de un solo nucleótido entre los dos sitios. La secuencia PAM está subrayada. (c) Escisiónin vitrode plásmidos que albergan alelos WT o del32 de CCR5 utilizando la RGEN específica de tipo silvestre. (d) Confirmar la presencia de un sitio fuera de la diana de la RGEN específica de CCR5-delta32 en el locus CCR5. Ensayos de escisiónin vitrode plásmidos que albergan secuencias en la diana o fuera de la diana utilizando diversas cantidades de RGEN específica de del32. La Fig.31 muestra la genotipificación de una mutación puntual KRAS (c.34 G>A). (a) Análisis RGEN-RFLP de la mutación KRAS (c.34 G>A) en líneas de células cancerosas. Los productos de PCR de células HeLa (utilizadas como un control de tipo silvestre) o células A549, que son homocigotas para la mutación puntual, se digirieron con RGEN con ARNcr perfectamente coincidente específico para la secuencia de tipo silvestre o la secuencia mutante. Los genotipos de KRAS en estas células se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. (b) Los plásmidos que albergaban secuencias KRAS de tipo silvestre o mutantes se digirieron utilizando RGEN con ARNcr perfectamente coincidentes o ARNcr atenuados con una base no coincidente. Los ARNcr atenuados que fueron seleccionados para la genotipificación están etiquetados en recuadro encima de los geles.
[0055] La Fig.32 muestra la genotipificación de una mutación puntual PIK3CA (c.3140 A>G). (a) Análisis RGEN-RFLP de la mutación PIK3CA (c.3140 A>G) en líneas de células cancerosas. Los productos de PCR de células HeLa (utilizadas como un control de tipo silvestre) o células HCT116 que son heterocigotas para la mutación puntual se digirieron con RGEN con ARNcr perfectamente coincidente específico para la secuencia de tipo silvestre o la secuencia mutante. Los genotipos de PIK3CA en estas células se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. (b) Los plásmidos que albergaban secuencias PIK3CA de tipo silvestre o mutantes se digirieron utilizando RGEN con ARNcr perfectamente coincidentes o ARNcr atenuados con una base no coincidente. Los ARNcr atenuados que fueron seleccionados para la genotipificación están etiquetados en recuadro encima de los geles.
[0056] La Fig.33 muestra la genotipificación de mutaciones puntuales recurrentes en líneas de células cancerosas. (a) Ensayos RGEN-RFLP de mutaciones puntuales oncogénicas recurrentes en los genes IDH (c.394c>T), (b) PIK3CA (c.3140A>G), (c) NRAS (c.181C>A), (d) y BRAF (c.1799T>A). Se muestran los genotipos de cada línea celular confirmados mediante secuenciación de Sanger. Los nucleótidos con falta de coincidencia se muestran en recuadro. Las flechas negras indican bandas de ADN escindidas por RGEN.
[0057] Descripción detallada
[0058] De acuerdo con un aspecto de la invención, la presente invención proporciona un métodoin vitrooex vivopara escindir ADN diana en células de mamífero utilizando una composición que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y proteína Cas9. Además, la presente invención proporciona un uso de la composición para escindir ADN diana en células de mamífero que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y proteína Cas9.
[0059] La composición también se conoce como una composición de endonucleasa guiada por ARN (RGEN).
[0060] ZFN y TALEN permiten la mutagénesis dirigida en células de mamífero, organismos modelo, plantas y ganado, pero las frecuencias de mutación obtenidas con nucleasas individuales son muy diferentes entre sí. Además, algunas ZFN y TALEN no lograron mostrar ninguna actividad de edición del genoma. La metilación del ADN puede limitar la unión de estas nucleasas diseñadas a los sitios diana. Además, fabricar nucleasas personalizadas es un desafío técnico y requiere mucho tiempo.
[0061] Los presentes inventores han desarrollado una nueva composición de endonucleasa guiada por ARN basada en la proteína Cas para superar las desventajas de ZFN y TALEN.
[0062] Antes de la presente invención, se conocía una actividad endonucleasa de las proteínas Cas. Sin embargo, no se sabe si la actividad endonucleasa de la proteína Cas funcionaría en una célula eucariota debido a la complejidad del genoma eucariota. Además, hasta ahora, no se ha desarrollado una composición que comprenda proteína Cas o ácido nucleico que codifica para la proteína Cas y un ARN guía específico para el ADN diana para escindir un ADN diana en células u organismos eucariotas.
[0063] En comparación con ZFN y TALEN, la composición actual de RGEN basada en la proteína Cas se puede personalizar más fácilmente porque solo se reemplaza el componente de ARN guía sintético para crear una nueva nucleasa de edición del genoma. No se requieren pasos de subclonación para crear endonucleasas guiadas por ARN personalizadas. Además, el tamaño relativamente pequeño del gen Cas (por ejemplo, 4.2 kpb para Cas9) en comparación con un par de genes TALEN (~6 kpb) proporciona una ventaja para esta composición de endonucleasa guiada por ARN en algunas aplicaciones, como la administración de genes mediada por virus. Además, esta endonucleasa guiada por ARN no tiene efectos fuera de la diana y, por lo tanto, no induce mutaciones, deleciones, inversiones ni duplicaciones no deseadas. Estas características hacen que la presente composición de endonucleasa guiada por ARN sea una herramienta escalable, versátil y conveniente para el diseño genómico en células y organismos eucariotas. Además, RGEN puede diseñarse para dirigirse a cualquier secuencia de ADN, casi cualquier polimorfismo de un solo nucleótido o pequeña inserción/deleción (indel) puede analizarse a través de RFLP mediado por RGEN. La especificidad de RGEN está determinada por el componente de ARN que se hibrida con una secuencia de ADN diana de hasta 20 pares de bases (pb) de longitud y por la proteína Cas9 que reconoce el motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Las RGEN se reprograman fácilmente reemplazando el componente de ARN. Por lo tanto, las RGEN proporcionan una plataforma para utilizar un análisis RFLP simple y robusto para diversas variaciones de secuencia.
[0064] El ADN diana puede ser un ADN endógeno o ADN artificial, preferiblemente, ADN endógeno.
[0065] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína Cas" se refiere a un componente proteico esencial en el sistema CRISPR/Cas, que forma una endonucleasa o nickasa activas cuando forma un complejo con dos ARN denominados ARN de CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr).
[0066] La información sobre el gen y la proteína de Cas está disponible en el GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), sin limitación.
[0067] Los genes asociados a CRISPR (cas) que codifican para proteínas Cas a menudo están asociados con arreglos de espaciadores de repetición CRISPR. Se han descrito más de cuarenta familias diferentes de proteínas Cas. De estas familias de proteínas, Cas1 parece ser omnipresente entre los diferentes sistemas CRISPR/Cas. Hay tres tipos de sistemas CRISPR-Cas. Entre ellos, el sistema CRISPR/Cas Tipo II que involucra la proteína Cas9 y ARNcr y ARNtracr es representativo y es bien conocido. Se han utilizado combinaciones particulares de genes cas y estructuras repetidas para definir 8 subtipos de CRISPR (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern y Mtube).
[0068] La proteína Cas puede estar vinculada a un dominio de transducción de proteínas. El dominio de transducción de proteínas puede ser poliarginina o una proteína TAT derivada del VIH, pero no está limitado a esto.
[0069] La proteína Cas puede ser cualquier proteína Cas siempre que tenga actividad endonucleasa o nickasa cuando forma un complejo con un ARN guía.
[0070] Una variante de la proteína Cas9 puede ser una forma mutante de Cas9 en la que el residuo de aspartato catalítico se cambia por cualquier otro aminoácido. Preferiblemente, el otro aminoácido puede ser una alanina, pero no se limita a esto.
[0071] La proteína Cas derivada de Streptococcus pyogenes puede reconocer el trinucleótido NGG. La proteína Cas puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, pero no se limita a esto.
[0072] El término "recombinante", cuando se utiliza con referencia, por ejemplo, a una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector han sido modificados mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, se puede generar una proteína Cas recombinante reconstituyendo la secuencia que codifica para la proteína Cas utilizando la tabla de codones humanos.
[0073] El ácido nucleico que codifica para la proteína Cas puede ser una forma de vector, como un plásmido que comprende una secuencia que codifica para Cas bajo un promotor como CMV o CAG. Cuando la proteína Cas es Cas9, la secuencia que codifica para Cas9 se deriva de Streptococcus pyogenes. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica para Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID. NO: 1. Además, el ácido nucleico que codifica para Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 50% con la secuencia de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 o 99% de la SEQ ID NO: 1, pero no está limitado a ello. El ácido nucleico que codifica para Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.108, 110, 106 o 107.
[0074] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "ARN guía" se refiere a un ARN que es específico para el ADN diana y puede formar un complejo con la proteína Cas y llevar la proteína Cas al ADN diana.
[0075] Un ARN guía puede constar de dos ARN, es decir, ARN de CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr) o ser un ARN de cadena sencilla (ARNsg) producido por la fusión de una porción esencial de ARNcr y ARNtracr. En la invención se utiliza un ARN guía de cadena sencilla.
[0076] Un ARN guía puede ser un ARN dual que comprende un ARNcr y un ARNtracr.
[0077] El ARNcr se puede hibridar con un ADN diana.
[0078] La RGEN puede consistir en proteína Cas y ARNsg (fusión de una porción esencial de ARNtracr invariable y ARNcr específico de la diana), y puede reprogramarse fácilmente reemplazando ARNcr.
[0079] El ARN guía comprende además uno o más nucleótidos adicionales en el extremo 5' del ARN guía de cadena sencilla o del ARNcr del ARN dual.
[0080] Preferiblemente, el ARN guía comprende adicionalmente 2 nucleótidos de guanina adicionales en el extremo 5' del ARN guía de cadena sencilla o del ARNcr del ARN dual.
[0081] Un ARN guía puede transferirse a una célula o un organismo en forma de ARN o ADN que codifica para el ARN guía. Un ARN guía puede estar en forma de ARN aislado, ARN incorporado a un vector viral o estar codificado en un vector. Preferiblemente, el vector puede ser un vector viral, un vector plasmídico o un vector de agrobacteria, pero no está limitado a esto.
[0082] Un ADN que codifica para el ARN guía puede ser un vector que comprende una secuencia que codifica para el ARN guía. Por ejemplo, el ARN guía se puede transferir a una célula u organismo transfectando la célula u organismo con el ARN guía aislado o el ADN plasmídico que comprende una secuencia que codifica para el ARN guía y un promotor.
[0083] Alternativamente, el ARN guía puede transferirse a una célula u organismo utilizando la administración de genes mediada por virus.
[0084] Cuando el ARN guía se transfecta en forma de ARN aislado en una célula u organismo, el ARN guía puede prepararse mediante transcripción in vitro utilizando cualquier sistema de transcripción in vitro conocido en la técnica. El ARN guía se transfiere preferiblemente a una célula en forma de ARN aislado en lugar de en forma de plásmido que comprende una secuencia que codifica para un ARN guía. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "ARN aislado" puede ser intercambiable con "ARN desnudo". Esto supone un ahorro de costes y de tiempo porque no requiere ningún paso de clonación.
[0085] La presente composición de RGEN que comprende la proteína Cas9 y un ARN guía de cadena sencilla puede escindir específicamente un ADN diana debido a una especificidad del ARN guía para una diana y una actividad de endonucleasa o nickasa de la proteína Cas.
[0086] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "escisión" se refiere a la rotura de la cadena principal covalente de una molécula de nucleótido.
[0087] En la presente invención, se puede preparar un ARN guía de cadena sencilla para que sea específico para cualquier diana que se vaya a escindir. Por lo tanto, la composición RGEN utilizada puede escindir cualquier ADN diana manipulando o genotipando la porción específica de la diana del ARN guía.
[0088] El ARN guía y la proteína Cas pueden funcionar como un par. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "nickasa Cas pareada" puede referirse al ARN guía y a la proteína Cas funcionando como un par. El par está compuesto por dos ARN guía. El ARN guía y la proteína Cas pueden funcionar como un par e inducir dos mellas en diferentes cadenas de ADN. Las dos mellas pueden estar separadas por al menos 100 pb, pero las mellas no están limitadas a esto.
[0089] En el ejemplo, los presentes inventores confirmaron que las nickasas Cas pareadas permiten una mutagénesis dirigida y grandes deleciones de segmentos cromosómicos de hasta 1 kpb en células humanas. Es importante destacar que las nickasas pareadas no indujeron indels en sitios fuera de la diana en los que sus nucleasas correspondientes inducen mutaciones. Además, a diferencia de las nucleasas, las nickasas pareadas no promovieron translocaciones no deseadas asociadas con escisiones de ADN fuera de la diana. En principio, las nickasas pareadas duplican la especificidad de la mutagénesis mediada por Cas9 y ampliarán la utilidad de las enzimas guiadas por ARN en aplicaciones que requieren una edición precisa del genoma, tal como la terapia genética y celular.
[0090] En el contexto de la presente invención, la composición puede utilizarse en la genotipificación de un genoma en células u organismos eucariotas in vitro.
[0091] En una realización específica, el ARN guía puede comprender la secuencia de nucleótidos de Seq ID.No.1, en la que la porción de la posición de nucleótido 3 ~ 22 es una porción específica de la diana y, por lo tanto, la secuencia de esta porción puede cambiarse dependiendo de la diana.
[0092] Tal como se utiliza en la presente memoria, una célula u organismo eucariota puede ser levadura, hongo, protozoo, planta, planta superior e insecto o células de anfibios o células de mamífero tales como CHO, HeLa, HEK293 y COS-1, por ejemplo, células cultivadas (in vitro), células de injerto y cultivo de células primarias (in vitro y ex vivo) y también células de mamífero incluyendo humanas, que se utilizan comúnmente en la técnica, sin limitación.
[0093] En una realización específica, se descubrió que la proteína Cas9/ARN guía de cadena sencilla podía generar roturas de doble cadena de ADN en sitios específicos in vitro en células de mamífero, cuya reparación espontánea inducía mutaciones genómicas dirigidas a altas frecuencias.
[0094] En un ejemplo de referencia, se encontró que los ratones con genes eliminados podían ser inducidos mediante la inyección de complejos de proteína Cas9/ARN guía o de ARNm de Cas9/ARN guía en embriones en etapa de una sola célula y que las mutaciones transmisibles de la línea germinal podían ser generadas por el sistema Cas9/ARN guía.
[0095] Utilizar la proteína Cas en lugar de un ácido nucleico que codifica para la proteína Cas para inducir una mutagénesis dirigida es ventajoso porque no se introduce ADN exógeno en un organismo. De esta manera, la composición que comprende la proteína Cas y un ARN guía puede utilizarse para desarrollar productos terapéuticos o de valor añadido para cultivos, ganado, aves de corral, peces, mascotas, etc.
[0096] De acuerdo con otro aspecto de la invención, la presente invención proporciona un uso de un ARNsg y una proteína Cas9 para transferir a una célula de mamífero para escindir un ADN diana en dicha célula de mamífero, inducir una mutagénesis dirigida en dicha célula de mamífero o la edición del genoma en dicha célula de mamífero, en la que el ARNsg y la proteína Cas9 se proporcionan en una composición y la composición se transfiere a la célula y en la que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
[0097] Un kit para escindir un ADN diana o inducir mutagénesis dirigida en células u organismos eucariotas, que no está abarcado por la presente invención, puede comprender un ARN guía específico para el ADN diana o ADN que codifica para el ARN guía y un ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o proteína Cas.
[0098] El kit puede comprender un ARN guía y un ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o proteína Cas como componentes separados o como una composición.
[0099] El kit puede incluir algunos componentes adicionales necesarios para transferir el ARN guía y el componente Cas a una célula o un organismo. Por ejemplo, el kit puede comprender una inyección de tampón, tal como una inyección de tampón tratado con DEPC y materiales necesarios para el análisis de la mutación de un ADN diana, pero no se limita a esto.
[0100] De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un métodoin vitro o ex vivopara preparar una célula de mamífero que comprende un paso de proporcionar una composición que comprende un ARN guía de cadena sencilla (ARNsg) y una proteína Cas9 y transferir la composición a la célula.
[0101] El ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o la proteína Cas y un ARN guía o ADN que codifica para el ARN guía se pueden transferir a una célula mediante varios métodos conocidos en la técnica, tales como microinyección, electroporación, tratamiento con DEAE-dextrano, lipofección, transfección mediada por nanopartículas, transducción mediada por dominio de transducción de proteínas, administración de genes mediada por virus y transfección mediada por PEG en protoplastos y así sucesivamente, pero no se limitan a estos. Además, un ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o una proteína Cas y un ARN guía se pueden transferir a un organismo mediante diversos métodos conocidos en la técnica para administrar un gen o una proteína, tal como una inyección. Un ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o proteína Cas se puede transferir a una célula en forma de complejo con un ARN guía o por separado. La proteína Cas fusionada a un dominio de transducción de proteínas, como Tat también puede administrarse de manera eficiente a las células.
[0102] Fuera del alcance de la invención, una célula u organismo eucariota puede ser cotransfectado o transfectado en serie con una proteína Cas9 y un ARN guía.
[0103] La transfección en serie se puede realizar primero mediante la transfección con el ácido nucleico que codifica para la proteína Cas, seguida de una segunda transfección con ARN guía desnudo. Preferiblemente, la segunda transfección es después de 3, 6, 12, 18, 24 horas, pero no está limitada a esto.
[0104] Se puede preparar una célula u organismo eucariota que comprende un ARN guía específico para ADN diana o ADN que codifica para el ARN guía y un ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o proteína Cas transfiriendo la composición que comprende un ARN guía específico para ADN diana o ADN que codifica para el ARN guía y un ácido nucleico que codifica para la proteína Cas o proteína Cas a la célula u organismo. La célula eucariota puede ser levadura, hongo, protozoo, planta superior e insecto o células de anfibios o células de mamífero tales como CHO, HeLa, HEK293 y COS-1, por ejemplo, células cultivadas (in vitro), células de injerto y cultivo de células primarias (in vitro y ex vivo) y también células de mamífero incluyendo humanas, que se utilizan comúnmente en la técnica, sin limitación.
[0105] De acuerdo con otro aspecto de la invención, la presente invención proporciona un métodoin vitro o ex vivopara escindir un ADN diana o inducir mutagénesis dirigida en células de mamífero, que comprende un paso de transferir una composición que comprende un ARN guía de cadena sencilla específico para el ADN diana y proteína Cas9 deStreptococcus pyogenesen la célula.
[0106] Como se describe anteriormente, dicha transferencia puede realizarse mediante microinyección, transfección, electroporación y así sucesivamente.
[0107] Se descubrió que la presente composición de RGEN podría provocar una mutación en un embrión de ratón y la mutación podría transmitirse a la descendencia.
[0108] Fuera del alcance de la invención, un método para introducir la composición de RGEN en el embrión puede ser cualquier método conocido en la técnica, tal como microinyección, inserción de células madre, inserción de retrovirus, etc. Preferiblemente se puede utilizar una técnica de microinyección.
[0109] El término "animal con genoma modificado" se refiere a un animal cuyo genoma ha sido modificado en la etapa de embrión por la composición actual de RGEN y el tipo de animal no está limitado.
[0110] El animal con genoma modificado tiene mutaciones causadas por una mutagénesis dirigida basada en la composición actual de RGEN. Las mutaciones pueden ser una de deleción, inserción, translocación, inversión. El sitio de mutación depende de la secuencia del ARN guía de la composición de RGEN.
[0111] El animal con genoma modificado que tiene una mutación de un gen puede utilizarse para determinar la función del gen.
[0112] La genotipificación de mutaciones o variaciones en una muestra biológica aislada se puede realizar utilizando una composición que comprende un ARN guía específico para la secuencia de ADN diana de la proteína Cas. Además, se puede realizar la genotipificación de secuencias de ácidos nucleicos en microorganismos patógenos en una muestra biológica aislada.
[0113] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "genotipificación" se refiere al "ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)".
[0114] El RFLP se puede utilizar en 1) la detección de indel en células u organismos inducidos por nucleasas diseñadas, 2) la genotipificación de mutaciones o variaciones que ocurren naturalmente en células u organismos o 3) la genotipificación del ADN de microorganismos patógenos infectados, incluidos virus o bacterias, etc.
[0115] Las mutaciones o variaciones pueden ser inducidas por nucleasas diseñadas en las células.
[0116] La nucleasa diseñada puede ser una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) o RGEN, pero no se limita a estas.
[0117] Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "muestra biológica" incluye muestras para análisis, tal como tejidos, células, sangre completa, suero, plasma, saliva, esputo, líquido cefalorraquídeo u orina, pero no se limita a estos.
[0118] Las mutaciones o variaciones pueden ser mutaciones o variaciones que ocurren naturalmente.
[0119] Las mutaciones o variaciones son inducidas por los microorganismos patógenos. Es decir, las mutaciones o variaciones se producen debido a la infección de microorganismos patógenos, cuando se detectan los microorganismos patógenos la muestra biológica se identifica como infectada.
[0120] Los microorganismos patógenos pueden ser virus o bacterias, pero no se limitan a estos.
[0121] Las mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas se detectan mediante diversos métodos, que incluyen ensayos de Surveyor sensibles a la falta de coincidencia o de T7 endonucleasa I (T7E1), análisis RFLP, PCR fluorescente, análisis de fusión de ADN y secuenciación profunda y de Sanger. Los ensayos T7E1 y Surveyor se utilizan ampliamente, pero a menudo subestiman las frecuencias de mutación porque los ensayos detectan heterodúplex (formados por la hibridación de secuencias mutantes y de tipo silvestre o dos secuencias mutantes diferentes); no detectan homodúplex formados por la hibridación de dos secuencias mutantes idénticas. Por lo tanto, estos ensayos no pueden distinguir entre clones mutantes bialélicos homocigotos y células de tipo silvestre, ni entre mutantes bialélicos heterocigotos y mutantes monoalélicos heterocigotos (Fig. 22). Además, los polimorfismos de secuencia cerca del sitio diana de la nucleasa pueden producir resultados confusos porque las enzimas pueden escindir heterodúplex formados mediante hibridación de estos diferentes alelos de tipo silvestre. El análisis RFLP está libre de estas limitaciones y, por lo tanto, es un método de elección. De hecho, el análisis RFLP fue uno de los primeros métodos utilizados para detectar mutaciones mediadas por nucleasas diseñadas. Sin embargo, desafortunadamente, esto está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción apropiados.
[0122] Ejemplo de referencia 1: Ensayo de edición del genoma
[0123] 1-1. Actividad de escisión del ADN de la proteína Cas9
[0124] En primer lugar, se probó la actividad de escisión de ADN de Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes en presencia o ausencia de un ARN guía quimérico in vitro.
[0125] Con esta finalidad, se utilizó la proteína Cas9 recombinante que se expresó y purificó de E. coli para escindir un ADN plasmídico predigerido o circular que contenía la secuencia diana de CCR5 humana de 23 pares de bases (pb). Una secuencia diana de Cas9 consta de una secuencia de ADN de 20 pb complementaria al ARNcr o un ARN guía quimérico y el motivo adyacente al protoespaciador (PAM) de trinucleótido (5'-NGG-3') reconocido por la propia Cas9 (Fig.1A).
[0126] Específicamente, la secuencia que codifica para Cas9 (4,104 pb), derivada de la cepa M1 GAS de Streptococcus pyogenes (NC_002737.1), se reconstituyó utilizando la tabla de uso de codones humanos y se sintetizó utilizando oligonucleótidos. Primero, se ensamblaron segmentos de ADN de 1 kb utilizando oligonucleótidos superpuestos de ~35 meros y polimerasa Phusion (New England Biolabs) y se clonaron en el vector T (SolGent). Se ensambló una secuencia de Cas9 de longitud completa utilizando cuatro segmentos de ADN de 1 kpb mediante PCR superpuesta. El segmento de ADN que codifica para Cas9 se subclonó en p3s, que se derivó de pcDNA3.1 (Invitrogen). En este vector, se agregó una etiqueta peptídica (NH2-GGSGPPKKKRKVYPYDVPDYA-COOH, SEQ ID NO: 2) que contiene el epítope HA y una señal de localización nuclear (NLS) en el C terminal de Cas9. La expresión y localización nuclear de la proteína Cas9 en células HEK 293T se confirmaron mediante transferencia tipo western utilizando anticuerpo anti-HA (Santa Cruz). Posteriormente, el casete Cas9 se subclonó en pET28-b(+) y se transformó en BL21(DE3). La expresión de Cas9 se indujo con 0.5 mM de IPTG durante 4 h a 25 °C. La proteína Cas9, que contiene la etiqueta His6 en el C terminal, se purificó utilizando resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) y se dializó contra 20 mM de HEPES (pH 7.5), 150 mM de KCl, 1 mM de DTT y glicerol al 10% (1). La Cas9 purificada (50 nM) se incubó con ADN plasmídico superenrollado o predigerido (300 ng) y ARN quimérico (50 nM) en un volumen de reacción de 20 ml en tampón NEB 3 durante 1 h a 37 °C. El ADN digerido se analizó mediante electroforesis utilizando geles de agarosa al 0.8%.
[0127] Cas9 escindió el ADN plasmídico eficientemente en la posición esperada solo en presencia del ARN sintético y no escindió un plásmido de control que carecía de la secuencia diana (Fig.1B).
[0128] 1-2. Escisión de ADN mediante el complejo Cas9/ARN guía en células humanas
[0129] Se utilizó un reportero RFP-GFP para investigar si el complejo Cas9/ARN guía puede escindir la secuencia diana incorporada entre las secuencias RFP y GFP en células de mamífero.
[0130] En este reportero, la secuencia GFP se fusiona a la secuencia RFP fuera del marco (2). La GFP activa se expresa solo cuando la secuencia diana es escindida por nucleasas específicas del sitio, lo que provoca pequeñas inserciones o deleciones (indels) con cambio del marco alrededor de la secuencia diana a través de reparación propensa a errores por unión de extremos no homólogos (NHEJ) de la rotura de doble cadena (DSB) (Fig.2).
[0131] Los plásmidos reporteros RFP-GFP utilizados en este estudio se construyeron como se describió anteriormente (2). Se sintetizaron oligonucleótidos correspondientes a los sitios diana (Tabla 1) (Macrogen) y se recocieron. Los oligonucleótidos recocidos se ligaron en un vector reportero digerido con EcoRI y BamHI.
[0132] Las células HEK 293T se cotransfectaron con el plásmido que codifica para Cas9 (0.8 µg) y el plásmido reportero RFP-GFP (0.2 µg) en una placa de 24 pocillos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
[0133] Mientras tanto, el ARN quimérico transcritoin vitrose preparó de la siguiente manera. El ARN era transcritoin vitroa través de reacciones de corrida utilizando el kit MEGAshortscript T7 (Ambion) de acuerdo con el manual del fabricante. Los templados para la transcripción de ARNin vitrose generaron mediante el recocido de dos ADN de cadena sencilla complementarios o mediante amplificación por PCR (Tabla 1). El ARN transcrito se resolvió en un gel PAGE con urea desnaturalizante al 8%. Se cortó la porción de gel que contenía ARN y se transfirió al tampón de elución de la sonda. El ARN se recuperó en agua libre de nucleasas seguido de extracción con fenol:cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. Los ARN purificados se cuantificaron mediante espectrometría.
[0134] 12 horas después de la transfección, el ARN quimérico (1 µg) preparado mediante transcripciónin vitrose transfectó utilizando Lipofectamine 2000.
[0135] Tres días después de la transfección, las células transfectadas se sometieron a citometría de flujo y se contaron las células que expresaban tanto RFP como GFP.
[0136] Se encontró que las células que expresaban GFP se obtuvieron solo cuando las células se transfectaron primero con el plásmido Cas9 y luego con el ARN guía 12 horas después (Fig.2), lo que demuestra que las RGEN podían reconocer y escindir la secuencia de ADN diana en células humanas cultivadas. De esta forma, las células que expresaban GFP se obtuvieron mediante transfección en serie del plásmido Cas9 y el ARN guía en lugar de cotransfección.
[0137] Tabla 1
[0138] [Tabla 1]
[0140]
[0141]
[0143] 1-3. Interrupción dirigida de genes endógenos en células de mamífero mediante RGEN
[0144] Para probar si las RGEN se podían utilizar para la interrupción dirigida de genes endógenos en células de mamífero, se analizó el ADN genómico aislado de células transfectadas utilizando la T7 endonucleasa (T7E1), una endonucleasa sensible a la falta de coincidencia que reconoce y escinde específicamente los heterodúplex formados mediante la hibridación de secuencias de ADN de tipo silvestre y mutante (3).
[0145] Para introducir DSB en células de mamífero utilizando RGEN, 2×10<6>células K562 se transfectaron con 20 µg de plásmido que codifica para Cas9 utilizando el kit 4D-Nucleofector, SF Cell Line 4D-Nucleofector X, programa FF-120 (Lonza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para este experimento, las células K562 (ATCC, CCL-243) se cultivaron en RPMI-1640 con FBS al 10% y la mezcla de penicilina/estreptomicina (100 U/ml y 100 µg/ml, respectivamente).
[0146] Después de 24 horas, 10-40 µg de ARN quimérico transcritoin vitrose nucleofectó en 1x10<6>células K562. El ARN quimérico transcritoin vitrose había preparado como se describe en el Ejemplo 1-2.
[0147] Las células se recolectaron dos días después de la transfección de ARN y se aisló el ADN genómico. La región que incluye el sitio diana se amplificó por PCR utilizando los cebadores descritos en la Tabla 1. Los amplicones se sometieron al ensayo T7E1 como se describió anteriormente (3). Para el análisis de secuenciación, los productos de PCR correspondientes a las modificaciones genómicas se purificaron y clonaron en el vector T-Blunt utilizando el kit de clonación por PCR T-Blunt (SolGent). Los productos clonados se secuenciaron utilizando el cebador M13.
[0148] Se encontró que las mutaciones se indujeron solo cuando las células se transfectaron en serie con el plásmido que codifica para Cas9 y luego con el ARN guía (Fig.3). Las frecuencias de mutación (Indels (%) en la Fig.3A) estimadas a partir de las intensidades relativas de las bandas de ADN dependían de la dosis de ARN, variaban del 1.3% al 5.1%. El análisis de secuenciación de ADN de los amplicones de PCR corroboró la inducción de mutaciones mediadas por RGEN en los sitios endógenos. Se observaron indels y microhomologías, características de NHEJ propensos a errores, en el sitio diana. La frecuencia de mutación medida por secuenciación directa fue del 7.3% (= 7 clones mutantes/96 clones), similar a la obtenida con nucleasas de dedo de zinc (ZFN) o nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN).
[0149] Se requirió la transfección en serie del plásmido Cas9 y del ARN guía para inducir mutaciones en las células. Pero cuando se trataba de plásmidos que codificaban para el ARN guía, la transfección en serie no era necesaria y las células se cotransfectaron con el plásmido Cas9 y el plásmido que codificaba para el ARN guía. Mientras tanto, se han desarrollado con éxito tanto ZFN como TALEN para alterar el gen CCR5 humano (3-6), que codifica para un receptor de quimiocina acoplado a proteína G, un correceptor esencial de la infección por VIH. Actualmente se está investigando clínicamente en EE. UU. una ZFN específica de CCR5 para el tratamiento del SIDA (7). Sin embargo, estas ZFN y TALEN tienen efectos fuera de la diana, induciendo tanto mutaciones locales en sitios cuyas secuencias son homólogas a la secuencia en la diana (6, 8-10) como reordenamientos del genoma que surgen de la reparación de dos DSB concurrentes inducidas en sitios en la diana y fuera de la diana (11-12). Los sitios fuera de la diana más llamativos asociados con estas nucleasas diseñadas específicas de CCR5 residen en el locus CCR2, un homólogo cercano de CCR5, ubicado 15 kpb corriente arriba de CCR5. Para evitar mutaciones fuera de la diana en el gen CCR2 y deleciones, inversiones y duplicaciones no deseadas del segmento cromosómico de 15 kpb entre los sitios en la diana de CCR5 y los sitios fuera de la diana de CCR2, los presentes inventores eligieron intencionalmente el sitio diana de nuestra RGEN específica de CCR5 para reconocer una región dentro de la secuencia de CCR5 que no tiene homología aparente con la secuencia de CCR2.
[0151] Los presentes inventores investigaron si la RGEN específica de CCR5 tenía efectos fuera de la diana. Con este fin, buscamos potenciales sitios fuera de la diana en el genoma humano identificando sitios que sean más homólogos a la secuencia diana de 23 pb deseada. Como se esperaba, no se encontraron tales sitios en el gen CCR2. En cambio, se encontraron cuatro sitios, cada uno de los cuales presenta desajustes de 3 bases con el sitio diana (Fig. 4A). Los ensayos T7E1 mostraron que no se detectaron mutaciones en estos sitios (sensibilidad del ensayo, -0.5%), lo que demuestra especificidades exquisitas de las RGEN (Fig.4B). Además, se utilizó PCR para detectar la inducción de deleciones cromosómicas en células transfectadas por separado con plásmidos que codifican para ZFN y RGEN específicas de CCR5. Mientras que ZFN indujo deleciones, la RGEN no lo hizo (Fig.4C).
[0153] A continuación, se reprogramó RGEN reemplazando el ARN guía específico de CCR5 con un ARN recientemente sintetizado diseñado para dirigirse al gen C4BPB humano, que codifica para la cadena beta de la proteína de unión a C4b, un factor de transcripción. Esta RGEN indujo mutaciones en el sitio diana cromosómico en células K562 en altas frecuencias (Fig.3B). Las frecuencias de mutación medidas mediante el ensayo T7E1 y mediante secuenciación directa fueron 14% y 8.3% (= 4 clones mutantes/48 clones), respectivamente. De cuatro secuencias mutantes, dos clones contenían una inserción de una base o dos bases precisamente en el sitio de escisión, un patrón que también se observó en el sitio diana CCR5. Estos resultados indican que las RGEN escinden el ADN cromosómico diana en las posiciones esperadas en las células.
[0154] Ejemplo 2: Edición del genoma mediada por RGEN proteínica
[0156] Las RGEN se pueden administrar a las células en muchas formas diferentes. Las RGEN constan de proteína Cas9, ARNcr y ARNtracr. Los dos ARN se pueden fusionar para formar un ARN guía de cadena sencilla (ARNsg). Un plásmido que codifica para Cas9 bajo un promotor como CMV o CAG se puede transfectar en las células. El ARNcr, ARNtracr o ARNsg también se pueden expresar en células utilizando plásmidos que codifican para estos ARN. Sin embargo, el uso de plásmidos a menudo da como resultado la integración de la totalidad o parte de los plásmidos en el genoma hospedero. Las secuencias bacterianas incorporadas en el ADN plasmídico pueden provocar una respuesta inmune no deseadain vivo.Las células transfectadas con plásmido para terapia celular o los animales y plantas derivados de células transfectadas con ADN deben pasar por un costoso y largo procedimiento de regulación antes de su aprobación para el mercado en la mayoría de los países desarrollados. Además, el ADN plasmídico puede persistir en las células durante varios días después de la transfección, lo que agrava los efectos no deseados de las RGEN fuera de la diana.
[0158] Aquí, utilizamos la proteína Cas9 recombinante formando un complejo con ARN guía transcritoin vitropara inducir la interrupción dirigida de genes endógenos en células humanas. La proteína Cas9 recombinante fusionada con la etiqueta hexa-histidina se expresó y purificó de E. coli utilizando cromatografía de afinidad de iones Ni estándar y filtración en gel. La proteína Cas9 recombinante purificada se concentró en tampón de almacenamiento (20 mM de HEPES pH 7.5, 150 mM de KCI, 1 mM de DTT y glicerol al 10%). El complejo proteína Cas9/ARNsg se introdujo directamente en las células K562 mediante nucleofección: 1×10<6>células K562 se transfectaron con 22.5-225 (1.4-14 µM) de proteína Cas9 mezclada con 100 ug (29 µM) de ARNsg transcritoin vitro(o 40 ug de ARNcr y 80 ug de ARNtracr) en solución de 100 µl utilizando el kit 4D-Nucleofector, SF Cell Line 4D-Nucleofector X (Lonza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la nucleofección, las células se colocaron en medio de crecimiento en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 48 horas. Cuando 2×10<5>células K562 se transfectaron con un protocolo de escala reducida de 115, se utilizaron 4.5-45 µg de proteína Cas9 mezclada con 6-60 ug de ARNsg transcritoin vitro(u 8 µg de ARNcr y 16 µg de ARNtracr) y se nucleofectaron en una solución de 20 µl. Luego, las células nucleofectadas se colocaron en medios de crecimiento en placas de 48 pocillos. Después de 48 horas, se recolectaron las células y se aisló el ADN genómico. La región de ADN genómico que abarca el sitio diana se amplificó por PCR y se sometió al ensayo T7E1.
[0160] Como se muestra en la Fig. 10, el complejo proteína Cas9/ARNsg indujo una mutación dirigida en el locus CCR5 a frecuencias que variaron del 4.8 al 38% de manera dependiente de la dosis de ARNsg o proteína Cas9, a la par de la frecuencia obtenida con la transfección del plásmido Cas9 (45%). El complejo proteína Cas9/ARNcr/ARNtracr fue capaz de inducir mutaciones con una frecuencia del 9.4%. La proteína Cas9 por sí sola no logró inducir mutaciones. Cuando 2×10<5>células fueron transfectadas con dosis reducidas de 1/5 de la proteína Cas9 y ARNsg, las frecuencias de mutación en el locus CCR5 variaron de 2.7 a 57% de manera dependiente de la dosis, mayor que la obtenida con la cotransfección del plásmido Cas9 y el plásmido ARNsg (32%).
[0161] También probamos el complejo proteína Cas9/ARNsg que se dirige al gen ABCC11 y descubrimos que este complejo inducía indels con una frecuencia del 35%, lo que demuestra la utilidad general de este método. Tabla 2
[0162] [Tabla 2]
[0164]
[0167] Ejemplo de referencia 3: Edición del genoma guiada por ARN en ratones
[0168] Para examinar el potencial de direccionamiento genético de las RGEN en embriones de ratón en etapa pronuclear (PN), se utilizaron el gen caja de la cabeza de tenedor N1 (Foxn1), que es importante para el desarrollo del timo y la diferenciación de los queratinocitos (Nehls et al., 1996) y la proteína cinasa, el ADN activado y gen del el polipéptido catalítico (Prkdc), que codifica para una enzima crítica para la reparación y recombinación de DSB del ADN (Taccioli et al., 1998).
[0169] Para evaluar la actividad de edición del genoma de Foxn1-RGEN, inyectamos ARNm de Cas9 (solución de 10 ng/µl) con varias dosis de ARNsg (Fig.5a) en el citoplasma de embriones de ratón en etapa PN y realizamos ensayos de T7 endonucleasa I (T7E1) (Kim et al. 2009) utilizando ADN genómico obtenido de embriones cultivadosin vitro(Fig.6a).
[0170] Alternativamente, inyectamos directamente la RGEN en forma de proteína Cas9 recombinante (0.3 a 30 ng/ul) formando un complejo con el exceso molar de dos veces el ARNsg específico de Foxn1 (0.14 a 14 ng/µl) en el citoplasma o pronúcleo de embriones de ratón de una célula y analizamos las mutaciones en el gen Foxn1 utilizando embriones cultivadosin vitro(Fig.7).
[0171] Específicamente, se sintetizaron ARNm y ARNsg de Cas9in vitroa partir de templados de ADN lineales utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (Ambion) y el kit MEGAshortscript T7 (Ambion), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, y se diluyeron con cantidades apropiadas de tampón de inyección tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma) (0.25 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 7.4). Los templados para la síntesis de ARNsg se generaron utilizando oligonucleótidos enlistados en la Tabla 3. La proteína Cas9 recombinante se obtuvo de ToolGen, Inc.
[0172] Tabla 3
[0173] [Tabla 3]
[0175]
[0176]
[0179] Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Corea (KFDA). Los protocolos fueron revisados y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Investigación con Animales de Laboratorio de la Universidad de Yonsei (Número de permiso: 2013-0099). Todos los ratones se mantuvieron en las instalaciones específicas libres de patógenos del Centro de Investigación Animal de Laboratorio de Yonsei. Se utilizaron cepas de ratones FVB/NTac (Taconic) e ICR como donantes de embriones y madres adoptivas, respectivamente. Se superovularon ratones hembra FVB/NTac (de 7-8 semanas de edad) mediante inyecciones intraperitoneales de 5 IU de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG, Sigma) y 5 IU de gonadotropina coriónica humana (hCG, Sigma) a intervalos de 48 horas. Las hembras de ratón superovuladas se aparearon con machos sementales FVB/NTac y se recolectaron embriones fertilizados de los oviductos. Se inyectaron ARNm y ARNsg de Cas9 en medio M2 (Sigma) en el citoplasma de óvulos fertilizados con pronúcleos bien reconocidos utilizando un micromanipulador piezoeléctrico (Prime Tech).
[0180] En el caso de la inyección de proteína Cas9 recombinante, la proteína Cas9 recombinante: el complejo Foxn1-ARNsg se diluyó con tampón de inyección tratado con DEPC (0.25 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 7.4) y se inyectó en pronúcleos masculinos utilizando un micromanipulador TransferMan NK2 y un microinyector FemtoJet (Eppendorf).
[0181] Los embriones manipulados fueron transferidos a los oviductos de madres adoptivas pseudopreñadas para producir animales vivos o fueron cultivadosin vitropara análisis adicionales.
[0182] Para examinar ratones F0 y embriones de ratón cultivadosin vitrocon mutaciones inducidas por RGEN, se realizaron ensayos T7E1 como se describió previamente utilizando muestras de ADN genómico de biopsias de cola y lisados de embriones completos (Cho et al., 2013).
[0183] Brevemente, la región genómica que abarca el sitio diana RGEN se amplificó por PCR, se fundió y se volvió a recocer para formar ADN heterodúplex, que se trató con T7 endonucleasa 1 (New England Biolabs) y luego se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los sitios potenciales fuera de la diana se identificaron mediante una búsqueda con bowtie 0.12.9 y también se monitorearon de manera similar mediante ensayos T7E1. Los pares de cebadores utilizados en estos ensayos se enlistaron en las Tablas 4 y 5.
[0184] Tabla 4
[0185] [Tabla 4]
[0187]
[0190] Tabla 5
[0191] [Tabla 6]
[0193]
[0194]
[0196] Los mutantes fundadores identificados mediante el ensayo T7E1 fueron analizados adicionalmente mediante fPCR. Las regiones apropiadas del ADN genómico se secuenciaron como se describió anteriormente (Sung et al., 2013). Para la genotipificación rutinaria por PCR de las progenies F1, se utilizaron los siguientes pares de cebadores tanto para los alelos de tipo silvestre como para los mutantes:
[0197] 5'-CTACTCCCTCCGCAGTCTGA-3' (SEQ ID NO: 69) y
[0198] 5'-CCAGGCCTAGGTTCCAGGTA-3' (SEQ ID NO: 70) para el gen Foxn1,
[0199] 5'-CCCCAGCATTGCAGATTTCC-3' (SEQ ID NO: 71) y
[0200] 5'-AGGGCTTCTTCTCTACAATCACG-3' (SEQ ID NO: 72) para el gen Prkdc.
[0201] En el caso de la inyección de ARNm de Cas9, las fracciones mutantes (el número de embriones mutantes/el número de embriones totales) fueron dependientes de la dosis y variaron del 33% (1 ng/µl de ARNsg) al 91% (100 ng/µl) (Fig. 6b). El análisis de la secuencia confirmó mutaciones en el gen Foxn1; la mayoría de las mutaciones eran pequeñas deleciones (Fig.6c), que recuerdan a las inducidas por ZFN y TALEN (Kim et al., 2013).
[0202] En el caso de la inyección de la proteína Cas9, estas dosis y métodos de inyección afectaron mínimamente la supervivencia y el desarrollo de los embriones de ratónin vitro:más del 70% de los embriones inyectados con RGEN eclosionaron normalmente en ambos experimentos. Nuevamente, las fracciones mutantes obtenidas con la inyección de proteína Cas9 fueron dependientes de la dosis y alcanzaron hasta el 88% en la dosis más alta mediante inyección del pronúcleo y hasta el 71% mediante inyección intracitoplasmática (Figs.7a y 7b). De manera similar a los patrones de mutación inducidos por el ARNm de Cas9 más el ARNsg (Fig.6c), aquellos inducidos por el complejo proteína Cas9-ARNsg fueron en su mayoría pequeñas deleciones (Fig. 7c). Estos resultados demuestran claramente que las RGEN tienen una alta actividad de direccionamiento génico en embriones de ratón.
[0203] Alentados por las altas frecuencias de mutantes y la baja citotoxicidad inducida por las RGEN, produjimos animales vivos transfiriendo embriones de ratón a los oviductos de madres adoptivas pseudopreñadas. Notablemente, las tasas de natalidad fueron muy altas, oscilando del 58% al 73%, y no se vieron afectadas por las dosis crecientes de Foxn1-ARNsg (Tabla 6).
[0204] Tabla 6
[0205] [Tabla 6]
[0207]
[0210] De 147 recién nacidos, obtuvimos 99 ratones mutantes fundadores. En consonancia con los resultados observados en embriones cultivados (Fig. 6b), las fracciones mutantes fueron proporcionales a las dosis de Foxn1-ARNsg y alcanzaron hasta el 93% (100 ng/µl de Foxn1-ARNsg) (Tablas 6 y 7, Fig.5b).
[0211] Tabla 7
[0212] [Tabla 7]
[0213]
[0214]
[0215]
[0218] Para generar ratones dirigidos a Prkdc, aplicamos una concentración 5 veces mayor de ARNm de Cas9 (50 ng/µl) con dosis crecientes de Prkdc-ARNsg (50, 100 y 250 ng/µl). Nuevamente, las tasas de natalidad fueron muy altas, oscilando del 51% al 60%, suficiente para producir un número suficiente de recién nacidos para el análisis (Tabla 6). La fracción mutante fue del 57% (21 mutantes fundadores entre 37 recién nacidos) con la dosis máxima de Prkdc-ARNsg. Estas tasas de natalidad obtenidas con RGEN fueron aproximadamente de 2 a 10 veces más altas que aquellas con TALEN reportadas en nuestro estudio anterior (Sung et al., 2013). Estos resultados demuestran que las RGEN son potentes reactivos dirigidos a los genes con una toxicidad mínima. Para probar la transmisión de la línea germinal de los alelos mutantes, cruzamos el mutante fundador Foxn1 #108, un mosaico con cuatro alelos diferentes (Fig.5c y Tabla 8) con ratones de tipo silvestre y monitoreamos los genotipos de la descendencia F1.
[0219] Tabla 8
[0220] [Tabla 8]
[0222]
[0223]
[0225] Como se esperaba, todas las progenies fueron mutantes heterocigotos que poseían el alelo de tipo silvestre y uno de los alelos mutantes (Fig. 5d). También confirmamos la transmisión de la línea germinal en ratones fundadores independientes de Foxn1 (Fig. 8) y Prkdc (Fig. 9). Hasta donde sabemos, estos resultados proporcionan la primera evidencia de que los alelos mutantes inducidos por RGEN se transmiten de manera estable a las progenies F1 en animales.
[0226] Ejemplo de referencia 4: Edición del genoma guiada por ARN en plantas
[0227] 4-1. Producción de proteína Cas9
[0228] La secuencia que codifica para Cas9 (4104 pb), derivada de la cepa M1 GAS de Streptococcus pyogenes (NC_002737.1), se clonó en el plásmido pET28-b(+). Se incluyó una secuencia de direccionamiento nuclear (NLS) en el N terminal de la proteína para garantizar la localización de la proteína en el núcleo. El plásmido pET28-b(+) que contiene el ORF de Cas9 se transformó en BL21(DE3). Luego se indujo Cas9 utilizando 0.2 mM de IPTG durante 16 horas a 18 °C y se purificó utilizando perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína Cas9 purificada se concentró utilizando Ultracel - 100K (Millipore).
[0229] 4-2. Producción de ARN guía
[0230] Se examinó la secuencia genómica del gen de Arabidopsis que codifica para BRI1 para detectar la presencia de un motivo NGG, el llamado motivo adyacente al protoespaciador (PAM), en un exón que es necesario para el direccionamiento de Cas9. Para interrumpir el gen BRI1 en Arabidopsis, identificamos dos sitios diana RGEN en un exón que contienen el motivo NGG. Los ARNsg se produjeron in vitro utilizando un templado de ADN. Cada templado de ADN se generó por extensión con dos oligonucleótidos parcialmente superpuestos (Macrogen, Tabla X1) y polimerasa Phusion (Thermo Scientific) utilizando las siguientes condiciones: -98 °C 30 segundos {98 °C 10 segundos, 54 °C 20 segundos, 72 °C 2 minutos}x20, 72 °C 5 minutos.
[0231] Tabla 9
[0232] [Tabla 9]
[0234]
[0237] El ADN extendido se purificó y se utilizó como templado para la producciónin vitrode ARN guía utilizando el kit MEGAshortscript T7 (Life Technologies). Posteriormente, el ARN guía se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Para preparar complejos Cas9/ARNsg, se mezclaron 10 ul de proteína Cas9 purificada (12 µg/µl) y 4 ul de cada uno de dos ARNsg (11 µg/µl) en 20 µl de tampón NEB3 (New England Biolabs) y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C.
[0238] 4-3. Transfección del complejo Cas9/ARNsg al protoplasto
[0239] Las hojas de plántulas de Arabidopsis de 4 semanas de edad cultivadas asépticamente en placas de Petri se digirieron en solución enzimática (celulosa R10 al 1%, macerozima R10 al 0.5%, 450 mM de manitol, 20 mM de MES pH 5.7 y sal CPW) durante 8-16 horas a 25 °C con agitación de 40 rpm en la oscuridad. Las soluciones de enzima/protoplasto se filtraron y centrifugaron a 100 X g durante 3~5 minutos. Los protoplastos se resuspendieron en solución de CPW tras el recuento celular bajo el microscopio (X100) utilizando un hemocitómetro. Finalmente, los protoplastos se resuspendieron a 1×10<6>/ml en solución MMG (4 mM de HEPES pH 5.7, 400 mM de manitol y 15 mM de MgCl2). Para transfectar los protoplastos con el complejo Cas9/ARNsg, se mezclaron suavemente 200 µL (200,000 protoplastos) de la suspensión de protoplastos con 3.3 o 10 uL de complejo Cas9/ARNsg [proteína Cas9 (6 µg/µL) y dos ARNsg (2.2 µg/µL cada uno)] y 200 ul de tampón de transfección de polietilenglicol al 40% (PEG4000 al 40%, 200 mM de manitol y 100 mM de CaCl2) en tubos de 2 ml. Después de 5~20 minutos de incubación a temperatura ambiente, se detuvo la transfección agregando tampón de lavado con solución W5 (2 mM de MES pH 5.7, 154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl2 y 5 mM de KCI). Los protoplastos se recolectaron entonces mediante centrifugación durante 5 minutos a 100 × g, se lavaron con 1 ml de solución W5 y se centrifugaron durante otros 5 minutos a 100 × g. La densidad de los protoplastos se ajustó a 1 × 10<5>/ml y se cultivaron en medio líquido KM 8p modificado con 400 mM de glucosa.
[0240] 4-4. Detección de mutaciones en protoplastos y plantas de Arabidopsis
[0241] Después de 24 horas o 72 horas de la transfección, se recolectaron los protoplastos y se aisló el ADN genómico. La región de ADN genómico que abarca los dos sitios diana se amplificó por PCR y se sometió al ensayo T7E1. Como se muestra en la Figura 11, los indels fueron inducidos por RGEN a frecuencias altas que variaron del 50% al 70%. Sorprendentemente, se indujeron mutaciones 24 horas después de la transfección. Aparentemente, la proteína Cas9 funciona inmediatamente después de la transfección. Los productos de PCR se purificaron y clonaron en el kit de clonación PCR T-Blunt (Solgent). Los plásmidos se purificaron y se sometieron a secuenciación de Sanger con el cebador M13F. Una secuencia mutante tenía una deleción de 7 pb en un sitio (Figura 12). Las otras tres secuencias mutantes tenían deleciones de segmentos de ADN de ~220 pb entre los dos sitios RGEN.
[0242] Referencia
[0243] Ejemplo 5: Transducción de la proteína Cas9 utilizando un péptido que penetra la célula o un dominio de transducción de proteínas
[0244] 5-1. Construcción del plásmido que codifica para His-Cas9
[0245] Se preparó Cas9 con una cisteína en el C terminal mediante amplificación por PCR utilizando el plásmido Cas9 descrito previamente {Cho, 2013 #166} como templado y se clonó en el vector pET28-(a) (Novagen, Merk Millipore, Alemania) que contenía una etiqueta His en el N terminal.
[0246] 5-2. Cultivo celular
[0247] Se cultivaron 293T (línea celular de riñón embrionario humano) y HeLa (línea celular de cáncer de ovario humano) en DMEM (GIBCO-BRL Rockville) suplementado con FBS al 10% y penicilina y estreptomicina al 1%.
[0248] 5-3. Expresión y purificación de la proteína Cas9
[0249] Para expresar la proteína Cas9, las células BL21 de E. coli se transformaron con el vector pET28-(a) que codifica para Cas9 y se sembraron en medio de agar Luria-Bertani (LB) que contenía 50 µg/mL de kanamicina (Amresco, Solon, OH). Al día siguiente, se seleccionó una sola colonia y se cultivó en caldo LB que contenía 50 µg/mL de kanamicina a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, este cultivo iniciador a OD6000.1 se inoculó en caldo Luria que contenía 50 µg/mL de kanamicina y se incubó durante 2 horas a 37 °C hasta que la OD600 alcanzó 0.6-0.8. Para inducir la expresión de la proteína Cas9, las células se cultivaron a 30 °C durante la noche después de la adición de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Promega, Madison, WI) a la concentración final de 0.5 mM.
[0250] Las células se recolectaron por centrifugación a 4000 rpm durante 15-20 minutos, se resuspendieron en un tampón de lisis (20 mM de Tris-Cl pH 8.0, 300 mM de NaCl, 20 mM imidazol, cóctel de inhibidores de proteasa 1X, 1 mg/ml de lisozima) y se lizaron por sonicación (40% de trabajo, 10 segundos de pulso, 30 segundos de descanso, durante 10 minutos en hielo). La fracción soluble se separó como sobrenadante tras centrifugar a 15,000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. La proteína Cas9 se purificó a 4 °C utilizando una columna con resina de agarosa Ni-NTA (QIAGEN) y el instrumento AKTA prime (AKTA prime, GE Healthcare, UK). Durante este paso de cromatografía, las fracciones de proteína soluble se cargaron en una columna de resina de agarosa Ni-NTA (GE Healthcare, UK) a un caudal de 1 mL/min. La columna se lavó con un tampón de lavado (20 mM de Tris-Cl pH 8.0, 300 mM de NaCl, 20 mM imidazol, cóctel de inhibidores de proteasa 1X) y la proteína unida se eluyó a un caudal de 0.5 ml/minuto con un tampón de elución (20 mM de Tris-Cl pH 8.0, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol, cóctel de inhibidores de proteasa 1X). La fracción eluida agrupada se concentró y se dializó contra un tampón de almacenamiento (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 200 de mM KCI, 0.1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 0.5 mM de PMSF, glicerol al 20%). La concentración de proteína se cuantificó mediante el ensayo de Bradford (Biorad, Hercules, CA) y la pureza se analizó mediante SDS-PAGE utilizando albúmina de suero bovino como el control.
[0251] 5-4. Conjugación de Cas9 a 9R4L
[0252] Se mezclaron suavemente 1 mg de proteína Cas9 diluida en PBS a una concentración de 1 mg/ml y 50 µg de péptido maleimida-9R4L en 25 µL de DW (Peptron, Corea) utilizando un rotor a temperatura ambiente durante 2 horas y a 4 °C durante la noche. Para eliminar la maleimida-9R4L no conjugada, las muestras se dializaron utilizando una membrana de DPBS de 50 kD con un punto de corte de peso molecular (pH 7.4) a 4 °C durante 24 h. Se recolectó la proteína Cas9-9R4L de la membrana de diálisis y se determinó la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford.
[0253] 5-5. Preparación de ARNsg-9R4L
[0254] Se añadió suavemente ARNsg (1 µg) a diversas cantidades de péptido C9R4LC (en una proporción de peso que oscilaba de 1 a 40) en 100 µl de DPBS (pH 7.4). Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se diluyó 10 veces usando agua desionizada libre de ARNasa. El diámetro hidrodinámico y el potencial z de las nanopartículas formadas se midieron utilizando dispersión de luz dinámica (Zetasizer-nano analizador ZS; Malvern Instruments, Worcestershire, UK).
[0255] 5-6. Tratamientos con proteína Cas9 y ARNsg
[0256] Las células se trataron con Cas9-9R4L y ARNsg-C9R4LC de la siguiente manera: se agregaron µg de ARNsg y 15 µg de péptido C9R4LC a 250 mL de medio OPTIMEM y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. 24 horas después de la siembra, las células se lavaron con medio OPTIMEM y se trataron con el complejo ARNsg-C9R4LC durante 4 horas a 37 °C. Las células se lavaron de nuevo con medio OPTIMEM y se trataron con Cas9-9R4L durante 2 horas a 37 °C. Después del tratamiento, el medio de cultivo se sustituyó por medio completo con suero y se incubó a 37 °C durante 24 horas antes del siguiente tratamiento. Se siguió el mismo procedimiento para tratamientos múltiples de Cas9 y ARNsg durante tres días consecutivos.
[0257] 5-7. Cas9-9R4L y ARNsg-9R4L pueden editar genes endógenos en células de mamífero cultivadas sin el uso de herramientas de administración adicionales.
[0258] Para determinar si Cas9-9R4L y ARNsg-9R4L pueden editar genes endógenos en células de mamífero cultivadas sin el uso de herramientas de administración adicionales, tratamos células 293 con Cas9-9R4L y ARNsg-9R4L dirigidos al gen CCR5 y analizamos el ADN genómico. El ensayo T7E1 mostró que el 9% del gen CCR5 se interrumpió en las células tratadas con Cas9-9R4L y con ARNsg-9R4L y que la interrupción del gen CCR5 no se observó en las células de control, incluyendo las no tratadas, tratadas con Cas9-9R o con ARNsg-9R4L o tratadas con Cas-9 sin modificar y ARNsg (Fig.13), lo que sugiere que el tratamiento con la proteína Cas9-9R4L y ARNsg conjugado con 9R4L, pero no con Cas9 sin modificar y ARNsg, puede conducir a una edición eficiente del genoma en células de mamífero.
[0259] Referencia
[0260] Ejemplo 6: Control de mutación fuera de la diana de acuerdo con la estructura del ARN guíaRecientemente, tres grupos reportaron que las RGEN tenían efectos fuera de la diana en las células humanas. Para nuestra sorpresa, las RGEN indujeron mutaciones de manera eficiente en sitios fuera de la diana que difieren de 3 a 5 nucleótidos de los sitios en la diana. Observamos, sin embargo, que había varias diferencias entre nuestras RGEN y las utilizadas por otros. Primero, utilizamos ARN dual, que es ARNcr más ARNtracr, en lugar de ARN guía sencilla (ARNsg), que está compuesto de porciones esenciales de ARNcr y ARNtracr. Segundo, transfectamos células K562 (pero no células HeLa) con ARNcr sintético en lugar de plásmidos que codifican para ARNcr. Las células HeLa fueron transfectadas con plásmidos que codifican para ARNcr. Otros grupos utilizaron plásmidos que codifican para ARNsg. Tercero, nuestro ARN guía tenía dos nucleótidos de guanina adicionales en el extremo 5', que son necesarios para una transcripción eficiente por la T7 polimerasain vitro.No se incluyeron nucleótidos adicionales en el ARNsg utilizado por otros. Por lo tanto, la secuencia de ARN de nuestro ARN guía se puede mostrar como 5'-GGX<20>, mientras que 5'-GX<19>, en la que X<20>o GX<19>corresponde a la secuencia diana de 20 pb, representa la secuencia utilizada por otros. El primer nucleótido de guanina es necesario para la transcripción por la ARN polimerasa en las células. Para probar si los efectos de RGEN fuera de la diana pueden atribuirse a estas diferencias, elegimos cuatro RGEN que indujeron mutaciones fuera de la diana en células humanas a altas frecuencias (13). Primero, comparamos nuestro método de utilizar ARN dual transcritoin vitrocon el método de transfección de plásmidos que codifican para ARNsg en células K562 y midió las frecuencias de mutación en los sitios en la diana y fuera de la diana a través del ensayo T7E1. Tres RGEN mostraron frecuencias de mutación comparables en sitios en la diana y fuera de la diana, independientemente de la composición del ARN guía. Interesantemente, una RGEN (sitio 1 de VEFGA) no indujo indels en un sitio fuera de la diana validado, el cual difiere en tres nucleótidos del sitio en la diana (denominado OT1-11, Fig.14), cuando se utilizó ARN dual sintético. Pero el ARN dual sintético no discriminó el otro sitio validado fuera de la diana (OT1-3), que difiere en dos nucleótidos del sitio en la diana.
[0261] A continuación, probamos si la adición de dos nucleótidos de guanina en el extremo 5' del ARNsg podría hacer que las RGEN sean más específicas comparando 5'-GGX<20>(o 5'-GGGX<19>) de ARNsg con 5'-GX<19>de ARNsg. Cuatro GX<19>de ARNsg formando complejos con Cas9 indujeron indels con la misma eficiencia en sitios en la diana y fuera de la diana, tolerando hasta cuatro faltas de coincidencia de nucleótidos. En marcado contraste, los GGX<20>de ARNsg discriminaron eficazmente los sitios fuera de la diana. De hecho, el ensayo T7E1 apenas detectó indels inducidos por RGEN en seis de los siete sitios fuera de la diana validados cuando utilizamos los cuatro GGX<20>de ARNsg (Fig.15). Observamos, sin embargo, que dos GGX<20>de ARNsg (sitios 1 y 3 de VEGFA) fueron menos activos en los sitios en la diana que los GX<19>de ARNsg correspondientes. Estos resultados muestran que los nucleótidos adicionales en el extremo 5' pueden afectar las frecuencias de mutación en sitios en la diana y fuera de la diana, tal vez alterando la estabilidad, la concentración o la estructura secundaria del ARN guía.
[0262] Estos resultados sugieren que tres factores -el uso de ARN guía sintético en lugar de plásmidos que codifican para ARN guía, ARN dual en lugar de ARNsg y GGX<20>de ARNsg en lugar de GX<19>de ARNsg tienen efectos acumulativos en la discriminación de sitios fuera de la diana.
[0263] Ejemplo 7: Nickasas Cas9 pareadas
[0264] En principio, las roturas de cadena sencilla (SSB) no pueden ser reparadas por NHEJ propensa a errores, pero aun así desencadenan una reparación dirigida por homología (HDR) de alta fidelidad o una reparación por escisión de bases. Pero la mutagénesis dirigida inducida por nickasa a través de HDR es mucho menos eficiente que la mutagénesis inducida por nucleasa. Razonamos que las nickasas Cas9 pareadas producirían DSB compuestas, que desencadenan la reparación del ADN a través de NHEJ o HDR, lo que conduce a una mutagénesis eficiente (Fig.16A). Además, las nickasas pareadas duplicarían la especificidad de la edición del genoma basada en Cas9.
[0265] Primero probamos varias nucleasas y nickasas Cas9 diseñadas para dirigirse a sitios en el locus AAVS1 (Fig. 16B)in vitromediante electroforesis capilar fluorescente. A diferencia de las nucleasas Cas9 que escindieron ambas cadenas de sustratos de ADN, las nickasas Cas9 compuestas de ARN guía y una forma mutante de Cas9 en la que un residuo de aspartato catalítico se cambia a una alanina (D10A Cas9) escindieron solo una cadena, produciendo mellas específicas del sitio (Fig.16C,D). Sin embargo, interesantemente algunas nickasas (AS1, AS2, AS3 y S6 en la Fig.17A) indujeron indels en sitios diana en células humanas, lo que sugiere que las mellas se pueden convertir en DSB, aunque de manera ineficiente,in vivo.Las nickasas Cas9 pareadas que producen dos mellas adyacentes en cadenas de ADN opuestas produjeron indels en frecuencias que variaron del 14% al 91%, comparables a los efectos de las nucleasas pareadas (Fig.17A). La reparación de dos mellas que producirían salientes de 5' condujo a la formación de indels con mucha más frecuencia que aquellas que producían salientes de 3' en tres loci genómicos (Fig. 17A y Fig. 18). Además, las nickasas pareadas permitieron una edición dirigida del genoma a través de una reparación dirigida por homología de manera más eficiente que las nickasas individuales (Fig.19).
[0266] A continuación, medimos las frecuencias de mutación de nickasas y nucleasas pareadas en sitios fuera de la diana utilizando secuenciación profunda. Las nucleasas Cas9 que formaron complejos con tres ARNsg indujeron mutaciones fuera de la diana en seis sitios que difieren en uno o dos nucleótidos de sus sitios en la diana correspondientes con frecuencias que variaron del 0.5% al 10% (Fig.17B). Por el contrario, las nickasas Cas9 pareadas no produjeron indels por encima del límite de detección del 0.1% en ninguno de los seis sitios fuera de la diana. El sitio Fuera-1 de S2 que difiere en un solo nucleótido en la primera posición en el PAM (es decir, N en NGG) de su sitio en la diana puede considerarse como otro sitio en la diana. Como se esperaba, la nucleasa Cas9 que forma un complejo con el ARNsg de S2 fue igualmente eficiente en este sitio y en el sitio en la diana. En marcado contraste, D10A de Cas9 que forma un complejo con los ARNsg de S2 y AS2 discriminó este sitio del sitio en la diana por un factor de 270 veces. Esta nickasa pareada también discriminó los sitios fuera de la diana de AS2 (Fuera-1 y Fuera-9 en la Fig.17B) del sitio en la diana por factores de 160 veces y 990 veces, respectivamente.
[0267] Ejemplo 8: Empalme de ADN cromosómico inducido por nickasas Cas9 pareadas
[0268] Se ha reportado que dos DSB concurrentes producidas por nucleasas diseñadas tal como ZFN y TALEN pueden promover grandes deleciones de los segmentos cromosómicos intermedios. Probamos si dos SSB inducidas por nickasas Cas9 pareadas también pueden producir deleciones en células humanas. Utilizamos PCR para detectar eventos de deleción y descubrimos que siete nickasas pareadas indujeron deleciones de segmentos cromosómicos de hasta 1.1 kpb tan eficientemente como lo hicieron las nucleasas Cas9 pareadas (Fig.20A,B). Las secuencias de ADN de los productos de PCR confirmaron los eventos de deleción (Fig.20C). Interesantemente, la secuencia coincidente de ARNsg permaneció intacta en dos de los siete amplicones de PCR específicos de deleción (subrayados en la Fig. 20C). Por el contrario, los pares de nucleasas Cas9 no produjeron secuencias que contuvieran sitios diana intactos. Este hallazgo sugiere que dos mellas distantes no se convirtieron en dos DSB separadas para promover la deleción del segmento cromosómico intermedio. Además, es poco probable que dos mellas separadas por más de 100 pb puedan producir una DSB compuesta con grandes salientes bajo condiciones fisiológicas porque la temperatura de fusión es muy alta.
[0269] Proponemos que dos mellas distantes se reparan mediante el desplazamiento de la hebra en una dirección de cabeza a cabeza, lo que da como resultado la formación de una DSB en el medio, cuya reparación a través de NHEJ causa pequeñas deleciones (Fig.20D). Debido a que los dos sitios diana permanecen intactos durante este proceso, las nickasas pueden inducir SSB nuevamente, activando el ciclo repetidamente hasta que se eliminen los sitios diana. Este mecanismo explica por qué dos mellas desplazadas que producen salientes de 5' pero no aquellas que producen salientes de 3' indujeron indels de manera eficiente en tres loci.
[0270] Posteriormente investigamos si las nucleasas y nickasas Cas9 pueden inducir translocaciones cromosómicas no deseadas que resultan de la reparación NHEJ de las escisiones de ADN en la diana y fuera de la diana (Fig. 21A). Pudimos detectar translocaciones inducidas por nucleasas Cas9 utilizando PCR (Fig. 21B,C). No se amplificaron dichos productos de PCR utilizando ADN genómico aislado de células transfectadas con los plásmidos que codifican para el par de nickasas Cas9 AS2+S3. Este resultado está en línea con el hecho de que las nickasas AS2 y S3, a diferencia de sus nucleasas correspondientes, no produjeron indels en sitios fuera de la diana (Fig.17B).
[0271] Estos resultados sugieren que las nickasas Cas9 pareadas permiten una mutagénesis dirigida y grandes deleciones de segmentos cromosómicos de hasta 1 kpb en células humanas. Importantemente, las nickasas pareadas no indujeron indels en sitios fuera de la diana en los que sus nucleasas correspondientes inducen mutaciones. Además, a diferencia de las nucleasas, las nickasas pareadas no promovieron translocaciones no deseadas asociadas con escisiones de ADN fuera de la diana. En principio, las nickasas pareadas duplican la especificidad de la mutagénesis mediada por Cas9 y ampliarán la utilidad de las enzimas guiadas por ARN en aplicaciones que requieren una edición precisa del genoma, como la terapia genética y celular. Una salvedad de esta aproximación es que se necesitan dos ARNsg altamente activos para formar un par de nickasas eficiente, lo que limita los sitios diana. Como se muestra en este y otros estudios, no todos los ARNsg son igualmente activos. Cuando se utilizan clones individuales en lugar de poblaciones de células para estudios o aplicaciones posteriores, la elección de ARN guía que representan secuencias únicas en el genoma y el uso de ARN guía optimizados serían suficientes para evitar mutaciones fuera de la diana asociadas con las nucleasas Cas9. Proponemos que tanto las nucleasas Cas9 como las nickasas pareadas son opciones poderosas que facilitarán la edición precisa del genoma en células y organismos.
[0272] Referencia
[0273] Ejemplo 9: Genotipificación con endonucleasas guiadas por ARN derivadas de CRISPR/Cas
[0274] A continuación, razonamos que las RGEN se pueden utilizar en el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), reemplazando a las enzimas de restricción convencionales. Las nucleasas diseñadas, incluidas las RGEN, inducen indels en sitios diana, cuando las DSB causadas por las nucleasas son reparadas por el sistema de unión de extremos no homólogos (NHEJ) propenso a errores. Las RGEN que están diseñadas para reconocer las secuencias diana no pueden escindir secuencias mutantes con indels, pero escindirán secuencias diana de tipo silvestre de manera eficiente.
[0275] 9-1. Componentes de RGEN
[0276] El ARNcr y el ARNtracr se prepararon mediante transcripciónin vitroutilizando el kit MEGAshortcript T7 (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN transcritos se resolvieron en un gel PAGE con urea desnaturalizante al 8%. Se cortó la porción de gel que contenía ARN y se transfirió al tampón de elución. El ARN se recuperó en agua libre de nucleasas seguido de extracción con fenol:cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. El ARN purificado se cuantificó mediante espectrometría. Los templados para ARNcr se prepararon mediante el recocido de un oligonucleótido cuya secuencia se muestra como 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGX<20>GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTG-3' (SEQ ID NO: 76), en la que X<20>es la secuencia diana y su oligonucleótido complementario. El templado para ARNtracr se sintetizó mediante la extensión de oligonucleótidos delanteros y reversos (5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCG-3' (SEQ ID NO: 77) y 5'-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGCTATG-3'(SEQ ID NO: 78)) utilizando la polimerasa Phusion (New England Biolabs).
[0277] 9-2. Purificación de la proteína Cas9 recombinante
[0278] La construcción de ADN de Cas9 utilizada en nuestro ejemplo anterior, que codifica para Cas9 fusionada a la etiqueta His6 en el C terminal, se insertó en el vector de expresión pET-28a. La proteína Cas9 recombinante se expresó en la cepa de E. coli BL21 (DE3) cultivada en medio LB a 25 °C durante 4 horas después de la inducción con 1 mM de IPTG. Las células se cosecharon y se resuspendieron en un tampón que contenía 20 mM de Tris PH 8.0, 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol y 1 mM de PMSF. Las células se congelaron en nitrógeno líquido, se descongelaron a 4 °C y se sonicaron. Después de la centrifugación, la proteína Cas9 en el lisado se unió a resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen), se lavó con un tampón que contenía 20 mM de Tris pH 8.0, 500 mM de NaCl y 20 mM de imidazol, y se eluyó con un tampón que contenía 20 mM de Tris pH 8.0, 500 mM de NaCl y 250 mM de imidazol. La proteína Cas9 purificada se dializó contra 20 mM de HEPES (pH 7.5), 150 mM de KCI, 1 mM de DTT y glicerol al 10% y se analizó mediante SDS-PAGE.
[0279] 9-3. Ensayo de T7 endonucleasa I
[0280] El ensayo T7E1 se realizó de la siguiente manera. En resumen, los productos de PCR amplificados utilizando ADN genómico se desnaturalizaron a 95 °C, se recocieron a 16 °C y se incubaron con 5 unidades de T7 endonucleasa I (New England BioLabs) durante 20 minutos a 37 °C. Los productos de reacción se resolvieron utilizando electroforesis en gel de agarosa de 2 a 2.5%.
[0281] 9-4. Ensayo RGEN-RFLP
[0282] Los productos de PCR (100-150 ng) se incubaron durante 60 minutos a 37 °C con concentraciones optimizadas (Tabla 10) de proteína Cas9, ARNtracr, ARNcr en 10 µl de tampón NEB 3 (1X). Después de la reacción de escisión, se añadió ARNasa A (4 µg) y la mezcla de reacción se incubó durante 30 minutos a 37 °C para eliminar el ARN. Las reacciones se detuvieron con tampón de solución de parada 6X que contenía glicerol al 30%, SDS al 1.2% y 100 mM de EDTA. Los productos se resolvieron con electroforesis en gel de agarosa al 1-2.5% y se visualizaron con tinción con EtBr.
[0283] Tabla 10
[0284] [Tabla 10]
[0286]
[0287]
[0289] Tabla 11
[0290] [Tabla 11]
[0291]
[0292]
[0295] 9-5. Ensayo de escisión de plásmidos
[0296] El plásmido linealizado tratado con enzima de restricción (100 ng) se incubó durante 60 minutos a 37 °C con proteína Cas9 (0.1 µg), ARNtracr (60 ng) y ARNcr (25 ng) en 10 µl de tampón NEB 3 (1X). Las reacciones se detuvieron con una solución de parada 6X que contenía glicerol al 30%, SDS al 1.2% y 100 mM de EDTA. Los productos se resolvieron con electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron con tinción con EtBr. 9-6. Estrategia de RFLP
[0297] Se pueden crear fácilmente nuevas RGEN con especificidades de ADN deseadas reemplazando ARNcr; no se requiere purificación de novo de proteínas personalizadas una vez que la proteína Cas9 recombinante está disponible. Las nucleasas diseñadas, incluyendo RGEN, inducen pequeñas inserciones o deleciones (indels) en sitios diana cuando las DSB causadas por las nucleasas se reparan mediante unión de extremos no homólogos propensos a errores (NHEJ). Las RGEN que están diseñadas para reconocer las secuencias diana escinden secuencias de tipo silvestre de manera eficiente, pero no pueden escindir secuencias mutantes con indels (Fig.22).
[0298] Primero probamos si las RGEN pueden escindir de manera diferencial plásmidos que contienen secuencias diana de C4BPB de tipo silvestre o modificadas que albergan indels de 1 a 3 bases en el sitio de escisión. Ninguno de los seis plásmidos con estos indels fue escindido por un RGEN5 específico de C4BPB compuesto por ARNcr específico de la diana, ARNtracr y proteína Cas9 recombinante (Fig.23). Por el contrario, el plásmido con la secuencia diana intacta fue escindido eficientemente por esta RGEN.
[0299] 9-7. Detección de mutaciones inducidas por las mismas RGEN utilizando RFLP mediado por RGEN
[0300] A continuación, para probar la viabilidad de RFLP mediado por RGEN para la detección de mutaciones inducidas por las mismas RGEN, utilizamos clones de células cancerosas humanas K562 modificadas genéticamente establecidas utilizando una RGEN dirigida al gen C4BPB (Tabla 12).
[0301] Tabla 12
[0302] [Tabla 12]
[0304]
[0307] Los clones mutantes de C4BPB utilizados en este estudio tienen varias mutaciones que van desde la deleción de 94 pb hasta la inserción de 67 pb (Fig.24A). Es importante destacar que todas las mutaciones ocurridas en clones mutantes dieron como resultado la pérdida del sitio diana de RGEN. Entre los 6 clones C4BPB analizados, 4 clones tienen alelos tanto de tipo silvestre como mutantes (+/-) y 2 clones solo tienen alelos mutantes (-/-).
[0308] Los productos de PCR que abarcan el sitio diana de RGEN amplificados a partir del ADN genómico de K562 de tipo silvestre fueron digeridos completamente por la RGEN compuesta de ARNcr específico de la diana, ARNtracr y proteína Cas9 recombinante expresada y purificada de E. coli (Fig.24B/Carril 1). Cuando los clones mutantes de C4BPB fueron sometidos al análisis RFLP utilizando la RGEN, los amplicones de PCR de los clones /- que contenían tanto alelos de tipo silvestre como mutantes fueron parcialmente digeridos, y aquellos de los clones -/- que no contenían el alelo de tipo silvestre no fueron digeridos en absoluto, sin producir ningún producto de escisión correspondiente a la secuencia de tipo silvestre (Fig.24B). Incluso una inserción de una sola base en el sitio diana bloqueó la digestión (clones #12 y #28) de alelos mutantes amplificados por la RGEN de C4BPB, lo que demuestra la alta especificidad de RFLP mediado por RGEN. Sometimos los amplicones de PCR al ensayo T7E1 sensible a faltas de coincidencia en paralelo (Fig.24B). Notablemente, el ensayo T7E1 no pudo distinguir los clones -/- de los clones /-. Para empeorar las cosas, el ensayo T7E1 no puede distinguir los clones mutantes homocigotos que contienen la misma secuencia mutante de los clones de tipo silvestre, porque el recocido de la misma secuencia mutante formará un homodúplex. Por lo tanto, RFLP mediado por RGEN tiene una ventaja crítica sobre el ensayo de nucleasa sensible a faltas de coincidencia convencional en el análisis de clones mutantes inducidos por nucleasas diseñadas, incluyendo ZFN, TALEN y RGEN.
[0309] 9-8. Ensayo cuantitativo para el análisis RGEN-RFLP
[0310] También investigamos si el análisis RGEN-RFLP es un método cuantitativo. Las muestras de ADN genómico aisladas del clon nulo de C4BPB y de las células de tipo silvestre se mezclaron en diversas proporciones y se utilizaron para amplificaciones por PCR. Los productos de PCR se sometieron a genotipificación RGEN y al ensayo T7E1 en paralelo (Fig.25b). Como se esperaba, la escisión del ADN por RGEN fue proporcional a la proporción entre el tipo silvestre y el mutante. Por el contrario, los resultados del ensayo T7E1 se correlacionaron pobremente con las frecuencias de mutación inferidas a partir de las proporciones y fueron inexactos, especialmente en un alto % de mutantes, una situación en la que las secuencias mutantes complementarias pueden hibridarse entre sí para formar ho-móduplex.
[0311] 9-9. Análisis de ratones mutantes fundadores utilizando genotipificación RFLP mediado por RGEN También aplicamos la genotipificación RFLP mediada por RGEN (genotipificación RGEN para abreviar) al análisis de ratones mutantes fundadores que se habían establecido mediante inyección de TALEN en embriones unicelulares de ratón (Fig.26A). Diseñamos y utilizamos una RGEN que reconoció el sitio diana de TALEN en el gen Pibf1 (Tabla 10). Se aisló el ADN genómico de un ratón de tipo silvestre y de ratones mutantes y se sometió a genotipificación RGEN después de la amplificación por PCR. La genotipificación RGEN detectó con éxito varias mutaciones, que iban desde deleciones de una a 27 pb (Fig. 26B). A diferencia del ensayo T7E1, la genotipificación RGEN permitió la detección diferencial del fundador /- y -/-.
[0312] 9-10. Detección de mutaciones inducidas en células humanas por una ZFN específica para CCRS utilizando RGEN
[0313] Además, utilizamos RGEN para detectar mutaciones inducidas en células humanas por una ZFN específica para CCR5, que representa otra clase de nucleasas diseñadas (Fig. 27). Estos resultados muestran que las RGEN pueden detectar mutaciones inducidas por nucleasas distintas a las propias RGEN. De hecho, esperamos que las RGEN puedan diseñarse para detectar mutaciones inducidas por la mayoría, si no que todas, las nucleasas diseñadas. La única limitación en el diseño de un ensayo de genotipificación RGEN es el requisito del dinucleótido GG o AG (CC o CT en la cadena complementaria) en la secuencia PAM reconocida por la proteína Cas9, que aparece una vez cada 4 pb en promedio. Se espera que los indels inducidos en cualquier parte dentro de la región semilla de varias bases en ARNcr y los nucleótidos PAM interrumpan la escisión del ADN catalizada por RGEN. De hecho, identificamos al menos un sitio RGEN en la mayoría (98%) de los sitios ZFN y TALEN.
[0314] 9-11. Detección de polimorfismos o variaciones utilizando RGEN
[0315] A continuación, diseñamos y probamos una nueva RGEN que se dirige a un locus altamente polimórfico, HLA-B, que codifica para el antígeno leucocitario humano B (también conocido como proteína MHC de clase I) (Fig. 28). Las células HeLa se transfectaron con plásmidos RGEN y el ADN genómico se sometió a análisis T7E1 y RGEN-RFLP en paralelo. T7E1 produjo bandas falsas positivas que resultaron de polimorfismos de secuencia cerca del sitio diana (Fig.25c). Sin embargo, como se esperaba, la misma RGEN utilizada para la interrupción genética escindió completamente los productos de PCR de las células de tipo silvestre, pero parcialmente los de las células transfectadas con RGEN, lo que indica la presencia de indels inducidos por RGEN en el sitio diana. Este resultado muestra que el análisis RGEN-RFLP tiene una clara ventaja sobre el ensayo T7E1, especialmente cuando no se sabe si los genes diana tienen polimorfismos o variaciones en las células de interés.
[0316] 9-12. Detección de mutaciones recurrentes encontradas en cáncer y polimorfismos que ocurren naturalmente mediante análisis RGEN-RFLP
[0317] El análisis RGEN-RFLP tiene aplicaciones más allá de la genotipificación de mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas. Buscamos utilizar la genotipificación RGEN para detectar mutaciones recurrentes encontradas en el cáncer y polimorfismos que ocurren naturalmente. Elegimos la línea celular de cáncer colorrectal humano, HCT116, que porta una deleción de 3 pb de ganancia de función en el gen oncogénico CTNNB1 que codifica para beta-catenina. Los productos de PCR amplificados a partir del ADN genómico de HCT116 fueron escindidos parcialmente por RGEN específicas del tipo silvestre y específicas del mutante, de acuerdo con el genotipo heterocigoto en las células HCT116 (Fig.29a). En marcado contraste, los productos de PCR amplificados a partir del ADN de células HeLa que albergan solo alelos de tipo silvestre fueron digeridos completamente por la RGEN específica del tipo silvestre y no fueron escindidos en absoluto por la RGEN específica de la mutación.
[0318] También observamos que las células HEK293 albergan la deleción de 32 pb (del32) en el gen CCR5, que codifica para un correceptor esencial de la infección por VIH: Los portadores homocigotos del32 de CCR5 son inmunes a la infección por VIH. Diseñamos una RGEN específica para el alelo del32 y otro para el alelo de tipo silvestre. Como se esperaba, la RGEN específica de tipo silvestre escindió completamente los productos de PCR obtenidos de células K562, SKBR3 o HeLa (utilizadas como controles de tipo silvestre), pero parcialmente los de células HEK293 (Fig. 30a), lo que confirma la presencia del alelo del32 no escindible en las células HEK293. Sin embargo, inesperadamente, la RGEN específica de del32 escindió los productos de PCR de las células de tipo silvestre tan eficientemente como los de las células HEK293. Interesantemente, esta RGEN tenía un sitio fuera de la diana con una falta de coincidencia de una sola base inmediatamente corriente abajo del sitio en la diana (Fig.30). Estos resultados sugieren que las RGEN se pueden utilizar para detectar indels que ocurren naturalmente, pero no pueden distinguir secuencias con polimorfismos de un solo nucleótido o mutaciones puntuales debido a sus efectos fuera de la diana.
[0319] Para genotipar variaciones oncogénicas de un solo nucleótido utilizando RGEN, atenuamos la actividad de RGEN empleando un ARN guía con una sola base no coincidente en lugar de un ARN perfectamente coincidente. Las RGEN que contenían el ARN guía perfectamente coincidente específico para la secuencia de tipo silvestre o la secuencia mutante escindieron ambas secuencias (Figs.31a y 32a). Por el contrario, RGEN que contenían un ARN guía con una sola base no coincidente distinguieron las dos secuencias, lo que permitió la genotipificación de tres mutaciones puntuales oncogénicas recurrentes en los genes KRAS, PIK3CA e IDH1 en líneas celulares de cáncer humano (Fig. 29b y Figs. 33a, b). Además, pudimos detectar mutaciones puntuales en los genes BRAF y NRAS utilizando RGEN que reconocen la secuencia PAM NAG (Figs.33c, d). Creemos que podemos utilizar RGEN-RFLP para genotipar casi todas, si no todas, las mutaciones o polimorfismos en el genoma humano y otros.
[0320] Los datos anteriores proponen que las RGEN proporcionan una plataforma para utilizar un análisis RFLP simple y sólido para diversas variaciones de secuencia. Con una gran flexibilidad en la reprogramación de la secuencia diana, las RGEN pueden utilizarse para detectar diversas variaciones genéticas (variaciones de un solo nucleótido, pequeñas inserciones/deleciones, variaciones estructurales), tales como mutaciones recurrentes relacionadas con enfermedades, genotipos relacionados con la respuesta a fármacos por parte de un paciente y también mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas en células. Aquí, utilizamos la genotipificación RGEN para detectar mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas en células y animales. En principio, también se podrían utilizar RGEN que detecten y escindan específicamente variaciones y mutaciones que ocurren naturalmente.
[0321] Referencias
[0322] 1. M. Jinek et al., Science 337, 816 (Aug 17, 2012).
[0323] 2. H. Kim, E. Um, S. R. Cho, C. Jung, J. S. Kim, Nat Methods 8, 941 (Nov, 2011).
[0324] 3. H. J. Kim, H. J. Lee, H. Kim, S. W. Cho, J. S. Kim, Genome Res 19, 1279 (Jul, 2009).
[0325] 4. E. E. Perez et al., Nat Biotechnol 26, 808 (Jul, 2008).
[0326] 5. J. C. Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143 (Feb, 2011).
[0327] 6. C. Mussolino et al., Nucleic Acids Res 39, 9283 (Nov, 2011).
[0328] 7. J. Cohen, Science 332, 784 (May 13, 2011).
[0329] 8. V. Pattanayak, C. L. Ramirez, J. K. Joung, D. R. Liu, Nat Methods 8, 765 (Sep, 2011).
[0330] 9. R. Gabriel et al., Nat Biotechnol 29, 816 (Sep, 2011).
[0331] 10. E. Kim et al., Genome Res, (Apr 20, 2012).
[0332] 11. H. J. Lee, J. Kweon, E. Kim, S. Kim, J. S. Kim, Genome Res 22, 539 (Mar, 2012).
[0333] 12. H. J. Lee, E. Kim, J. S. Kim, Genome Res 20, 81 (Jan, 2010).
[0334] 13. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. Highfrequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotech advance online publication (2013)

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
1. Un métodoin vitrooex vivopara escindir un ADN diana en una célula de mamífero, inducir una mutagénesis dirigida en una célula de mamífero o edición el genoma en una célula de mamífero, comprendiendo el método los pasos de
(a) proporcionar una composición que comprende un ARN guía de cadena sencilla (ARNsg) y una proteína Cas9, y
(b) transferir la composición a la célula,
en el que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
2. Un métodoin vitrooex vivode preparación de una célula de mamífero, comprendiendo el método los pasos de
(a) proporcionar una composición que comprende un ARN guía de cadena sencilla (ARNsg) y una proteína Cas9, y
(b) transferir la composición a la célula,
en el que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
3. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el ARNsg comprende la secuencia GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAU CAACUUGAAAAAGUGGCACCG-AGUCGGUGCUUUUUUU.
4. Un usoin vitrooex vivode un ARNsg y una proteína Cas9 para transferir a una célula de mamífero para escindir un ADN diana en dicha célula de mamífero, inducir una mutagénesis dirigida en dicha célula de mamífero o edición del genoma en dicha célula de mamífero, en el que el ARNsg y la proteína Cas9 se proporcionan en una composición y la composición se transfiere a la célula, y en el que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
5. Un usoin vitrooex vivode una proteína Cas9 formando un complejo con un ARNsg para transferir a una célula de mamífero para escindir un ADN diana en dicha célula de mamífero, inducir una mutagénesis dirigida en dicha célula de mamífero o la edición del genoma en dicha célula de mamífero, en el que la proteína Cas9 es una proteína Cas9 deStreptococcus pyogenes.
6. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el usoin vitrooex vivode acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que la transferencia a la célula se realiza mediante electroporación, preferiblemente mediante nucleofección.
7. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6 o el usoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para la edición del genoma.
8. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 6 y 7 o el usoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el ADN diana es ADN endógeno.
9. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6 a 8 o el usoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 para inducir una interrupción dirigida de un gen endógeno en dicha célula.
10. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6 a 9 o el usoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que la proteína Cas9 es una proteína recombinante.
11. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6 a 10 o el usoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
12. El métodoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6 a 11 o el usoin vitrooex vivode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6 a 11, en el que la proteína Cas9 está formando un complejo con el ARNsg en la composición proporcionada.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2831144A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for producing a complex transgenic trait locus
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
EP3604555B1 (en) 2011-10-14 2024-12-25 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
AU2013293270B2 (en) * 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
AU2013335451C1 (en) 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
IL239344B2 (en) * 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
CN113355357B (zh) 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP3031921B1 (en) * 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP2840140B2 (en) * 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
DK2931891T3 (da) * 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
RU2662932C2 (ru) 2013-03-14 2018-07-31 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
WO2014144155A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
EP4286517A3 (en) 2013-04-04 2024-03-13 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
DK3456831T3 (da) 2013-04-16 2021-09-06 Regeneron Pharma Målrettet modifikation af rottegenom
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
AU2014273082B2 (en) * 2013-05-29 2018-11-08 Cellectis A method for producing precise DNA cleavage using Cas9 nickase activity
SG10201913068PA (en) * 2013-06-04 2020-02-27 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
JP2016521561A (ja) 2013-06-14 2016-07-25 セレクティス 植物における非トランスジェニックのゲノム編集のための方法
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
MX374532B (es) 2013-06-17 2025-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
ES2929143T3 (es) * 2013-07-09 2022-11-25 Harvard College Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex
EP3019595A4 (en) 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
KR102243597B1 (ko) 2013-08-16 2021-04-26 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 세포로의 선택적 물질 전달
CN120574876A (zh) 2013-08-22 2025-09-02 纳幕尔杜邦公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
EP3988649B1 (en) 2013-09-18 2024-11-27 Kymab Limited Methods, cells and organisms
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
EP3080279B1 (en) 2013-12-11 2018-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
KR102170502B1 (ko) 2013-12-11 2020-10-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
JP7103750B2 (ja) 2013-12-12 2022-07-20 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
SG10201804975PA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
US10286084B2 (en) 2014-02-18 2019-05-14 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
ES2898460T3 (es) 2014-02-27 2022-03-07 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la modificación genómica dirigida al sitio
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
EP3115457B1 (en) * 2014-03-05 2019-10-02 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
EP3540061A1 (en) 2014-04-02 2019-09-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
JP2017512481A (ja) 2014-04-08 2017-05-25 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子を用いた、ｒｎａ依存性の転写抑制のための方法および組成物
US20170175143A1 (en) * 2014-05-20 2017-06-22 Regents Of The University Of Minnesota Method for editing a genetic sequence
WO2015183025A1 (ko) * 2014-05-28 2015-12-03 주식회사 툴젠 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법
WO2015188056A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
HRP20200529T1 (hr) 2014-06-06 2020-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postupci i pripravci za modificiranje ciljnog lokusa
EP3155116A4 (en) 2014-06-10 2017-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
CN106536056B (zh) 2014-06-13 2021-07-16 儿童医学中心公司 分离线粒体的产品和方法
ES2781323T3 (es) 2014-06-23 2020-09-01 Regeneron Pharma Montaje de ADN mediado por nucleasas
US20150376586A1 (en) * 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
WO2015200555A2 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Caribou Biosciences, Inc. Rna modification to engineer cas9 activity
SI3161128T1 (sl) 2014-06-26 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe
US10676754B2 (en) 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
WO2016007839A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
CA2954791C (en) * 2014-07-14 2025-11-18 The Regents Of The University Of California CRISPR/CAS TRANSCRIPTIONAL MODULATION
CA2955382C (en) * 2014-07-21 2023-07-18 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
EP4194557A1 (en) 2014-08-06 2023-06-14 Institute for Basic Science Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen
JP6598860B2 (ja) 2014-08-06 2019-10-30 カレッジ オブ メディシン ポチョン チャ ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション Ｈｌａをコードする遺伝子のヌクレアーゼ媒介編集により作製される免疫適合性細胞
WO2016025759A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Shen Yuelei Dna knock-in system
SG11201701245QA (en) * 2014-08-27 2017-03-30 Caribou Biosciences Inc Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
EP3186375A4 (en) 2014-08-28 2019-03-13 North Carolina State University Novel CAS9 PROTEINS AND CHARACTERISTICS FOR DNA TARGETING AND GENOME EDITING
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
CN104212836A (zh) * 2014-09-18 2014-12-17 东华大学 一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法
AU2015330699B2 (en) 2014-10-10 2021-12-02 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
BR112017007770A2 (pt) 2014-10-15 2018-01-16 Regeneron Pharma cultura in vitro, população de hipscs, método para modificar um locus-alvo genômico, e, hipsc.
US10131901B2 (en) 2014-10-15 2018-11-20 Sage Science, Inc. Apparatuses, methods and systems for automated processing of nucleic acids and electrophoretic sample preparation
GB201418965D0 (es) 2014-10-24 2014-12-10 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon
KR20170074235A (ko) 2014-10-31 2017-06-29 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 면역 세포로의 생체분자의 전달
JP6823593B2 (ja) * 2014-11-06 2021-02-03 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞へのペプチド媒介輸送
EP3215623A4 (en) 2014-11-06 2018-09-26 President and Fellows of Harvard College Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells
EP4464338A3 (en) * 2014-11-07 2025-02-12 Editas Medicine, Inc. Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing
CN107109486B (zh) * 2014-11-14 2021-08-13 基础科学研究院 用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法
US11352666B2 (en) 2014-11-14 2022-06-07 Institute For Basic Science Method for detecting off-target sites of programmable nucleases in a genome
KR102531016B1 (ko) 2014-11-21 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CN116059378A (zh) 2014-12-10 2023-05-05 明尼苏达大学董事会 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
FI3234150T3 (fi) * 2014-12-16 2025-11-05 Danisco Us Inc Sienigenomin muokkausjärjestelmät ja niiden käyttömenetelmät
CA2970683A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
ES2947714T3 (es) 2014-12-19 2023-08-17 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida a través de múltiples direccionamientos en un solo paso
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
CN107250373A (zh) * 2015-01-12 2017-10-13 麻省理工学院 通过微流体递送实现的基因编辑
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
JP2018508221A (ja) * 2015-03-16 2018-03-29 中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法
EP3271461A1 (en) * 2015-03-20 2018-01-24 Danmarks Tekniske Universitet Crispr/cas9 based engineering of actinomycetal genomes
EP3274453B1 (en) * 2015-03-26 2021-01-27 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-mediated gene conversion
BR112017017260A2 (pt) 2015-03-27 2018-04-17 Du Pont construções de dna, vetor, célula, plantas, semente, método de expressão de rna e método de modificação de local alvo
KR102888521B1 (ko) 2015-04-06 2025-11-19 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
JP2018522249A (ja) 2015-04-24 2018-08-09 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価
CN107921148A (zh) 2015-05-08 2018-04-17 哈佛学院校长同事会 通用供体干细胞和相关方法
CA2986310A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
KR101785847B1 (ko) 2015-05-12 2017-10-17 연세대학교 산학협력단 선형 이중가닥 ＤＮＡ를 활용한 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 표적 유전체 교정
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
EA201792663A1 (ru) 2015-05-29 2018-04-30 Норт Каролина Стейт Юниверсити Способы скрининга бактерий, архей, водорослей и дрожжей с использованием нуклеиновых кислот crispr
EP3303585A4 (en) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
CN108026526B (zh) 2015-06-09 2023-05-12 爱迪塔斯医药公司 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
TWI906646B (zh) * 2015-06-18 2025-12-01 美商博得學院股份有限公司 降低脫靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變
US9790490B2 (en) * 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
AU2016289530B2 (en) 2015-07-09 2021-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of materials to anucleate cells
WO2017019867A1 (en) * 2015-07-28 2017-02-02 Danisco Us Inc Genome editing systems and methods of use
GB2592821B (en) 2015-07-31 2022-01-12 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
CA3033909A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
WO2017035416A2 (en) * 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
EP3344575B1 (en) 2015-09-04 2020-04-15 SQZ Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
US20180237800A1 (en) * 2015-09-21 2018-08-23 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
EP3353296B1 (en) 2015-09-24 2020-11-04 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
EP3356533A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
WO2017061805A1 (ko) * 2015-10-06 2017-04-13 기초과학연구원 식물 원형질체로부터 유전체 교정 식물체를 고효율로 제조하는 방법
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
BR112018008134A2 (pt) * 2015-10-20 2018-11-06 Pioneer Hi Bred Int método para restaurar a função de um produto gênico não funcional no genoma de uma célula, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula, planta ou planta de progênie, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula sem o uso de um molde polinucleotídico de modificação e método para entregar um complexo de rna guia/endonuclease cas numa célula
WO2017070598A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Caribou Biosciences, Inc. Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids
IL310721B2 (en) 2015-10-23 2025-11-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
AU2016349288A1 (en) 2015-11-03 2018-05-31 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
KR101885901B1 (ko) * 2015-11-13 2018-08-07 기초과학연구원 5' 말단의 인산기가 제거된 rna를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물
US11542495B2 (en) 2015-11-20 2023-01-03 Sage Science, Inc. Preparative electrophoretic method for targeted purification of genomic DNA fragments
US11903974B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from cultured cells
CN106811479B (zh) * 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
KR102787119B1 (ko) 2015-11-30 2025-03-27 듀크 유니버시티 유전자 편집에 의한 인간 디스트로핀 유전자의 교정을 위한 치료용 표적 및 사용 방법
CN108473981B (zh) 2015-12-04 2022-04-12 卡里布生物科学公司 工程化靶向核酸的核酸
CN106845151B (zh) * 2015-12-07 2019-03-26 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
WO2017099494A1 (ko) * 2015-12-08 2017-06-15 기초과학연구원 Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도
US11542466B2 (en) 2015-12-22 2023-01-03 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials
MX2018008345A (es) 2016-01-11 2018-12-06 Univ Leland Stanford Junior Proteínas quiméricas y métodos de inmunoterapia.
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins- containing systems and uses thereof in regulating gene expression
WO2017124037A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
CN109414001A (zh) * 2016-01-15 2019-03-01 杰克逊实验室 通过cas9蛋白的多循环电穿孔产生的遗传修饰的非人哺乳动物
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
LT3436077T (lt) * 2016-03-30 2025-06-25 Intellia Therapeutics, Inc. Lipidų nanodalelių vaisto formos, skirtos crispr/cas komponentams
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
EP3445853A1 (en) 2016-04-19 2019-02-27 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
KR20260004568A (ko) 2016-04-19 2026-01-08 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규한 crispr 효소 및 시스템
EP4613756A3 (en) 2016-04-25 2025-11-12 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
CN107326046A (zh) * 2016-04-28 2017-11-07 上海邦耀生物科技有限公司 一种提高外源基因同源重组效率的方法
CN113831407B (zh) 2016-05-20 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
CA3025523A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
CA3209273A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Sigma-Aldrich Co. Llc Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017217768A1 (ko) * 2016-06-15 2017-12-21 주식회사 툴젠 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도
EP3472321A2 (en) * 2016-06-17 2019-04-24 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
CN109642231A (zh) 2016-06-17 2019-04-16 博德研究所 Vi型crispr直向同源物和系统
US11371051B2 (en) 2016-06-20 2022-06-28 Keygene N.V. Method for targeted DNA alteration in plant cells
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
KR20190039115A (ko) * 2016-07-05 2019-04-10 더 존스 홉킨스 유니버시티 암을 치료하기 위한 crispr/cas9-기반 조성물 및 방법
BR112019000430A2 (pt) * 2016-07-13 2019-07-09 Dsm Ip Assets Bv sistema crispr-cas para uma célula hospedeira de algas
JP7490211B2 (ja) 2016-07-19 2024-05-27 デューク ユニバーシティ Ｃｐｆ１に基づくゲノム編集の治療適用
WO2018015995A1 (ja) * 2016-07-19 2018-01-25 株式会社バイオダイナミクス研究所 長鎖一本鎖ｄｎａを調製する方法
EP3492096A4 (en) 2016-07-28 2020-04-15 Institute for Basic Science PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF EYE DISEASES WITH CAS9 PROTEINS AND GUIDE RNA
JP2019523009A (ja) 2016-07-29 2019-08-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃ末端切断型フィブリリン−１の発現をもたらす変異を有するマウス
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
CN110214183A (zh) 2016-08-03 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 腺苷核碱基编辑器及其用途
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR101856345B1 (ko) * 2016-08-24 2018-06-20 경상대학교산학협력단 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제조하는 방법
CN118853848A (zh) 2016-08-31 2024-10-29 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
US20190225974A1 (en) * 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
BR112019006388A2 (pt) 2016-09-30 2019-06-25 Univ California enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por rna e métodos de uso das mesmas
KR20260019012A (ko) 2016-10-07 2026-02-09 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 아이엔씨. Ｓ. 피오게네스 ｃａｓ９ 돌연변이 유전자 및 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드
US11242542B2 (en) 2016-10-07 2022-02-08 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
KR101997116B1 (ko) 2016-10-14 2019-07-05 연세대학교 산학협력단 Kras 유전자에 상보적인 가이드 rna 및 이의 용도
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
CN110520530A (zh) 2016-10-18 2019-11-29 明尼苏达大学董事会 肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法
CN109906030B (zh) 2016-11-04 2022-03-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
US20190264218A1 (en) 2016-11-04 2019-08-29 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Novel Plant Cells, Plants, and Seeds
KR102437228B1 (ko) * 2016-11-14 2022-08-30 주식회사 툴젠 인위적으로 조작된 sc 기능 조절 시스템
KR20190082318A (ko) 2016-11-22 2019-07-09 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 아이엔씨. Crispr/cpf1 시스템 및 방법
WO2018111947A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
KR101748575B1 (ko) * 2016-12-16 2017-06-20 주식회사 엠젠플러스 Ins 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법
EP3555297A1 (en) 2016-12-19 2019-10-23 Editas Medicine, Inc. Assessing nuclease cleavage
EA202091316A1 (ru) * 2016-12-22 2020-08-18 Тулджин Инкорпорейтид Обогащенный олеиновой кислотой растительный организм, имеющий генетически модифицированный fad2, и способ его получения
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US20200385753A1 (en) * 2016-12-23 2020-12-10 Institute For Basic Science Composition for base editing for animal embryo and base editing method
JP6994730B2 (ja) * 2016-12-26 2022-02-04 独立行政法人酒類総合研究所 ゲノム編集タンパク質の直接導入による糸状菌ゲノム編集方法
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
JP7229923B2 (ja) 2017-01-06 2023-02-28 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド ヌクレアーゼ切断を評価する方法
KR102515727B1 (ko) * 2017-01-11 2023-03-30 주식회사 툴젠 중첩된 가이드핵산을 이용한 표적 핵산에 특정 핵산 서열을 삽입하기 위한 조성물 및 방법
RU2019126483A (ru) 2017-01-23 2021-02-24 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Варианты 17-бета-гидроксистероиддегидрогеназы 13 (hsd17b13) и их применение
WO2018140899A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
WO2018164457A1 (ko) * 2017-03-06 2018-09-13 기초과학연구원 C2cL 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 이를 이용한 유전체 교정 방법
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR20240116572A (ko) 2017-03-23 2024-07-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
CN110506203A (zh) 2017-04-07 2019-11-26 塞奇科学股份有限公司 用于通过使用集成电泳dna纯化来检测遗传结构变异的系统和方法
WO2018189360A1 (en) * 2017-04-13 2018-10-18 Cellectis New sequence specific reagents targeting ccr5 in primary hematopoietic cells
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
KR102746223B1 (ko) 2017-04-20 2024-12-27 이제네시스, 인크. 유전자 변형 동물의 생성 방법
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
CN117051035A (zh) * 2017-05-05 2023-11-14 苏州齐禾生科生物科技有限公司 不使用转基因标记序列分离细胞的方法
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN108977442B (zh) * 2017-06-05 2023-01-06 广州市锐博生物科技有限公司 用于dna编辑的系统及其应用
US10738284B2 (en) 2017-06-05 2020-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4GALT1 cDNA variants and compositions comprising the same
MX2019014640A (es) 2017-06-09 2020-10-05 Editas Medicine Inc Nucleasas de repeticiones palíndromicas agrupadas y regularmente interespaciadas de proteina asociada 9 (cas9) genomanipuladas.
IL271275B1 (en) 2017-06-13 2026-04-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc Preparations containing croons and their uses
WO2018232356A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
CN112501254B (zh) 2017-07-14 2024-07-19 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
EP3655961A4 (en) * 2017-07-17 2021-09-01 Massachusetts Institute of Technology HEALTHY AND SICK BARRIER TISSUE CELL ATLAS
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
KR20200033259A (ko) 2017-07-31 2020-03-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 생체내에서 CRISPR/Cas-매개된 파괴 또는 삭제 및 외인성 도너 핵산과의 CRISPR/Cas-유도된 재조합을 평가하기 위한 방법 및 조성물
EP3585161A1 (en) 2017-07-31 2020-01-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assessment of crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
CN110891420B (zh) 2017-07-31 2022-06-03 瑞泽恩制药公司 Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用
EP3663310A4 (en) 2017-08-04 2021-08-11 Peking University TALE RVD SPECIFICALLY RECOGNIZING A DNA BASE MODIFIED BY METHYLATION AND CORRESPONDING APPLICATION
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019051419A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 University Of North Texas Health Science Center Engineered cas9 variants
EP3686275A4 (en) 2017-09-18 2021-09-29 Edigene Inc. GENE EDITING LYMPHOCYTE T AND RELATED USE
US11572574B2 (en) 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
JP2020536501A (ja) * 2017-09-28 2020-12-17 ツールゲン インコーポレイテッドＴｏｏｌｇｅｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 遺伝子発現調節のための人為的なゲノム操作
WO2019067910A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Intellia Therapeutics, Inc. POLYNUCLEOTIDES, COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENOMIC EDITION
KR102207352B1 (ko) * 2017-09-29 2021-01-26 서울대학교산학협력단 Klotho 유전자 넉아웃 질환모델 동물 및 이의 용도
US20190098879A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use
KR20250107288A (ko) 2017-10-16 2025-07-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
JP7101419B2 (ja) 2017-10-27 2022-07-15 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
CN109722414A (zh) 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
WO2019089804A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Casy compositions and methods of use
CN108192956B (zh) * 2017-11-17 2021-06-01 东南大学 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用
AU2018370588B2 (en) 2017-11-21 2022-09-08 Genkore Co. Ltd. Composition for Genome Editing Using Crispr/CPF1 System and Use Thereof
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
AU2019207409B2 (en) 2018-01-12 2023-02-23 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
EP3740580A4 (en) 2018-01-19 2021-10-20 Duke University GENOME ENGINEERING WITH CRISPR-CAS SYSTEMS IN EUKARYONTS
JP7075170B2 (ja) * 2018-01-23 2022-05-25 インスティチュート フォー ベーシック サイエンス 延長された単一ガイドｒｎａ及びその用途
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
KR102086689B1 (ko) 2018-02-06 2020-03-09 주식회사 진씨커 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법
WO2019156475A1 (ko) * 2018-02-06 2019-08-15 주식회사 진씨커 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법
WO2019165168A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 orthologs
KR102907245B1 (ko) 2018-03-14 2026-01-05 에디타스 메디신, 인코포레이티드 혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법
EP3592140A1 (en) 2018-03-19 2020-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
KR102922694B1 (ko) 2018-04-19 2026-02-03 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법
WO2019206233A1 (zh) * 2018-04-25 2019-10-31 中国农业大学 一种RNA编辑的CRISPR/Cas效应蛋白及系统
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
EP3823633A4 (en) 2018-06-29 2023-05-03 Editas Medicine, Inc. SYNTHETIC LEAD MOLECULES, COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
KR102035654B1 (ko) * 2018-07-23 2019-10-24 대한민국 항균 펩타이드를 생산하는 돌연변이 곤충 세포주 또는 이의 제조방법
US12545910B2 (en) 2018-08-31 2026-02-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US12534743B2 (en) 2018-08-31 2026-01-27 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP3851528A4 (en) * 2018-09-12 2023-12-06 Institute for Basic Science COMPOSITION FOR INDUCATING DEATH OF CELLS HAVING MUTATED GENE AND METHOD FOR INDUCATING DEATH OF CELLS HAVING MODIFIED GENE USING THE COMPOSITION
WO2020072254A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for killing target cells
WO2020072248A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
WO2020072250A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for genome modification and alteration of expression
US12203123B2 (en) 2018-10-01 2025-01-21 North Carolina State University Recombinant type I CRISPR-Cas system and uses thereof for screening for variant cells
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
KR102081962B1 (ko) * 2018-10-11 2020-02-26 충남대학교 산학협력단 아밀로이드 전구 단백질 유전자를 절단하기 위한 조성물
AU2019360270B2 (en) 2018-10-18 2025-08-07 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for expressing factor IX.
US20200270617A1 (en) 2018-10-18 2020-08-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
CN113272428A (zh) 2018-10-18 2021-08-17 英特利亚治疗股份有限公司 核酸构建体和使用方法
WO2020082047A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
KR102929494B1 (ko) * 2018-10-29 2026-02-20 차이나 어그리컬처럴 유니버시티 신규 CRISPR/Cas12f 효소 및 시스템
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
EP3874048A1 (en) * 2018-11-01 2021-09-08 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
EP3650557B1 (en) * 2018-11-07 2021-10-20 Justus-Liebig-Universität Gießen Method for determination of restriction efficiency of endonucleases mediating double-strand breaks in dna target sequences
US12365923B2 (en) 2018-11-16 2025-07-22 Osaka University Method for producing genome-edited cell
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
JP7553100B2 (ja) * 2018-12-12 2024-09-18 国立大学法人九州大学 ゲノム編集された細胞の製造方法
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
WO2020123887A2 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
KR102925054B1 (ko) 2018-12-20 2026-02-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 뉴클레아제-매개 반복부 팽창
WO2020146290A1 (en) * 2019-01-07 2020-07-16 Crisp-Hr Therapeutics, Inc. A non-toxic cas9 enzyme and application thereof
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
CN109868275A (zh) * 2019-03-12 2019-06-11 中国农业大学 CRISPR/Cas9介导的羊FGF5基因敲除和定点整合MTNR1A基因的方法
CN120648640A (zh) 2019-03-18 2025-09-16 瑞泽恩制药公司 用于鉴定tau接种或聚集的基因修饰因子的CRISPR/Cas筛选平台
EP3769090B1 (en) 2019-03-18 2023-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
WO2020191233A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
AU2020256225B9 (en) 2019-04-03 2025-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
RU2771374C1 (ru) 2019-04-04 2022-05-04 Редженерон Фармасьютикалс, Инк. Способы для бесшовного внесения целевых модификаций в направленные векторы
KR102661779B1 (ko) 2019-04-04 2024-04-30 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 응고 인자 12 좌위를 포함하는 비-인간 동물
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
AU2020265060A1 (en) 2019-04-30 2021-12-16 Edigene (Guangzhou) Inc. Method for predicting effectiveness of treatment of hemoglobinopathy
US11692197B2 (en) 2019-05-06 2023-07-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
CN111304180B (zh) * 2019-06-04 2023-05-26 山东舜丰生物科技有限公司 一种新的dna核酸切割酶及其应用
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
CN113906134B (zh) 2019-06-14 2025-06-24 瑞泽恩制药公司 Tau蛋白病模型
CN114630910A (zh) 2019-06-25 2022-06-14 伊纳瑞农业技术有限公司 改善的同源依赖修复基因组编辑
EP3999103A4 (en) 2019-07-19 2023-11-22 Inari Agriculture Technology, Inc. GENOMIC EDITING FOR ENHANCED HOMOLOGY-DIRECTED REPAIR
CN115244176A (zh) * 2019-08-19 2022-10-25 钟明宏 向导rna-cas蛋白复合物的缀合物
JP2022547105A (ja) 2019-09-04 2022-11-10 博雅▲輯▼因（北京）生物科技有限公司 オフターゲット評価に基づく遺伝子編集治療の評価方法
EP4028063A1 (en) 2019-09-13 2022-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
CN114729376A (zh) 2019-09-23 2022-07-08 欧米茄治疗公司 用于调节肝细胞核因子4α(HNF4α)基因表达的组合物和方法
EP4048807A1 (en) 2019-09-23 2022-08-31 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
JP7689949B2 (ja) 2019-10-03 2025-06-09 アーティサン ディベロップメント ラブズ インコーポレイテッド 操作されたデュアルガイド核酸を有するｃｒｉｓｐｒシステム
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
AU2020369599A1 (en) 2019-10-23 2022-05-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for RNA-templated editing in plants
CA3160186A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
US12521451B2 (en) 2019-11-08 2026-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
JP7448120B2 (ja) * 2019-11-14 2024-03-12 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 プラズマを用いてゲノム編集酵素を植物細胞内に導入する方法
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
WO2021108442A2 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 The Regents Of The University Of California Modulators of cas9 polypeptide activity and methods of use thereof
CN114901813A (zh) 2019-12-30 2022-08-12 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
EP4086341A1 (en) 2019-12-30 2022-11-09 Edigene Biotechnology Inc. Method for purifying ucart cell and use thereof
KR102616080B1 (ko) 2020-01-14 2023-12-21 주식회사 툴젠 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도
CN114945680A (zh) * 2020-01-14 2022-08-26 深圳华大智造科技股份有限公司 使用微流体隔室化快速多路复用基于crispr的诊断
CA3167681A1 (en) * 2020-01-14 2021-07-22 Toolgen Incorporated Cells having high adaptability under hypoxic conditions, and use thereof
EP4097251A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for analyte detection
WO2021163515A1 (en) * 2020-02-12 2021-08-19 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Crispr-cas9 mediated disruption of alcam gene inhibits adhesion and trans-endothelial migration of myeloid cells
KR102940466B1 (ko) 2020-02-27 2026-03-16 주식회사 엘지화학 원형질체를 활용한 식물 유전자 교정 효율 증대 방법
KR20230004456A (ko) 2020-03-04 2023-01-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
US12057197B2 (en) 2020-04-03 2024-08-06 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
CN111690720B (zh) * 2020-06-16 2021-06-15 山东舜丰生物科技有限公司 利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
KR102638799B1 (ko) * 2020-10-08 2024-02-22 주식회사 진코어 CRISPR/Cas12f1(Cas14a1) system 효율화를 위한 engineered guide RNA 및 이의 용도
WO2022120022A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
WO2022124839A1 (ko) * 2020-12-09 2022-06-16 재단법인 아산사회복지재단 온-타겟 활성이 유지되고 오프-타겟 활성이 감소된 가이드 rna 및 이의 용도
TW202235622A (zh) 2020-12-23 2022-09-16 美商旗艦先鋒創新公司 包裹rna之指環病毒(anellovirus)蛋白殼之活體外組裝
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
KR102285906B1 (ko) * 2021-02-18 2021-08-04 주식회사 엔에이피 수생태계 교란어종 관리를 위한 큰입배스 불임 유도용 조성물
AU2022227650A1 (en) 2021-02-25 2023-10-12 Celyntra Therapeutics Sa Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
CA3218511A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
KR102616916B1 (ko) * 2021-05-11 2023-12-21 주식회사 애이마 발암성 돌연변이 유전자 검출용 가이드 rna 내지 이의 용도
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
EP4347826A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
KR102618072B1 (ko) 2021-06-15 2023-12-28 대한민국 작물의 개화조절 관련 유전자 교정용 가이드 rna 및 이의 용도
EP4370676A2 (en) 2021-06-18 2024-05-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023282688A1 (ko) 2021-07-09 2023-01-12 주식회사 툴젠 산화스트레스 저항성을 갖는 중간엽 줄기세포, 이의 제조방법 및 용도
CA3227357A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Eun Ji Shin Hemocompatible mesenchymal stem cells, preparation method therefor and use thereof
CN113584134B (zh) * 2021-09-06 2024-01-30 青岛金斯达生物技术有限公司 一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用
JP2024534945A (ja) 2021-09-10 2024-09-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ
IL311962A (en) 2021-10-14 2024-06-01 Lonza Sales Ag Modified producer cells for extracellular vesicle production
JP2024537991A (ja) 2021-10-14 2024-10-18 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞
US20240415980A1 (en) 2021-10-28 2024-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
EP4426828A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
KR20240117571A (ko) 2021-12-08 2024-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도
AU2022420615A1 (en) 2021-12-22 2024-07-04 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
JP2025501755A (ja) 2021-12-23 2025-01-23 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 脆弱ｘ関連障害に対する治療的処置
AU2022424002A1 (en) 2021-12-29 2024-06-13 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
US20250230412A1 (en) 2022-02-01 2025-07-17 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
CA3242731A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertions for treatment of pompe disease
EP4486881A1 (en) 2022-03-01 2025-01-08 Celyntra Therapeutics SA Composition and methods for transgene insertion
EP4488364A1 (en) 2022-03-04 2025-01-08 Toolgen Incorporated Low immunogenic stem cells, low immunogenic cells differentiated or derived from stem cells, and production method therefor
CN114410609B (zh) * 2022-03-29 2022-07-12 舜丰生物科技(海南)有限公司 一种活性提高的Cas蛋白以及应用
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023205844A1 (en) * 2022-04-26 2023-11-02 Peter Maccallum Cancer Institute Nucleic acids and uses thereof
CN117004604A (zh) * 2022-04-28 2023-11-07 南京北恒生物科技有限公司 一种ciita基因被敲除的工程化免疫细胞及其用途
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
US20250302998A1 (en) 2022-05-09 2025-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023219434A1 (ko) 2022-05-13 2023-11-16 주식회사 툴젠 혈액 적합성을 갖는 혈관 내 이식용 세포, 이의 제조방법 및 용도
JP2025516823A (ja) 2022-05-19 2025-05-30 ライエル・イミュノファーマ・インコーポレイテッド Ｎｒ４ａ３を標的とするポリヌクレオチド及びその使用
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
US20250308637A1 (en) 2022-05-20 2025-10-02 Celyntra Therapeutics Sa Systems and methods for assessing risk of genome editing events
AU2023276757A1 (en) 2022-05-25 2024-11-21 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
CN119563038A (zh) 2022-05-25 2025-03-04 旗舰创业创新七公司 用于调节免疫应答的组合物和方法
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
US20250319115A1 (en) 2022-05-25 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and Methods for Modulating Cytokines
CA3254388A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING TRAFFIC FACTORS
JP2025521154A (ja) 2022-05-31 2025-07-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２反復伸長疾患のためのｃｒｉｓｐｒ干渉療法
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
IL317874A (en) 2022-06-24 2025-02-01 Tune Therapeutics Inc Compounds, systems and methods for reducing low density lipoproteins through targeted gene suppression
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
CN120659627A (zh) 2022-07-29 2025-09-16 瑞泽恩制药公司 用于转铁蛋白受体（tfr）介导的脑和肌肉递送的组合物和方法
JP2025525745A (ja) 2022-08-05 2025-08-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｔｄｐ－４３の凝集耐性バリアント
CN115386597B (zh) * 2022-09-19 2025-04-25 国家纳米科学中心 一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
KR20250075694A (ko) 2022-09-28 2025-05-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 세포 기반 요법을 강화하기 위한 항체 저항성 변형 수용체
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
EP4612184A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
KR20250116795A (ko) 2022-11-14 2025-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 별아교세포로의 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-매개된 전달을 위한 조성물 및 방법
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
WO2024159071A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified rhabdovirus glycoproteins and uses thereof
WO2024211287A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites
EP4697940A1 (en) 2023-04-21 2026-02-25 Vib Vzw Allelic combinations in crops for yield increase
WO2024234006A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Tome Biosciences, Inc. Systems, compositions, and methods for targeting liver sinusodial endothelial cells (lsecs)
EP4716741A2 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Flagship Labs 114, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
KR20260026049A (ko) 2023-06-15 2026-02-25 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 청력 장애에 대한 유전자 치료
KR20260032927A (ko) 2023-06-30 2026-03-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상동성 지향 복구를 증가시키는 방법 및 조성물
IL326018A (en) 2023-07-28 2026-03-01 Regeneron Pharma Introduction of anti-TFR:GAA and anti-CD63:GAA for the treatment of Pompe disease
US20250049896A1 (en) 2023-07-28 2025-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency
CN121693566A (zh) 2023-07-28 2026-03-17 瑞泽恩制药公司 使用bGH-SV40L串联PolyA在单向基因插入期间增强转基因表达
WO2025038750A2 (en) 2023-08-14 2025-02-20 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2025038164A1 (en) * 2023-08-15 2025-02-20 University Of Massachusetts Nick resection in cancer
WO2025049524A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cxcr4 antibody-resistant modified receptors
WO2025050069A1 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion using engineered integration enzymes
CN121866324A (zh) 2023-09-13 2026-04-14 格拉茨医科大学 提供抗原反应性淋巴细胞的方法
WO2025076141A1 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Viral delivery of grna to the scion
WO2025137439A2 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2025168705A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Vib Vzw Means and methods for the production of saponins with endosomal escape-enhancing properties
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025188676A1 (en) * 2024-03-04 2025-09-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genetic engineering of cells for secretion of therapeutic antibodies
WO2025217398A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells with improved culture medium
EP4677108A1 (en) 2024-04-22 2026-01-14 Basecamp Research Ltd Method and compositions for detecting off-target editing
WO2025224182A2 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Basecamp Research Ltd Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2025235388A1 (en) 2024-05-06 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transgene genomic identification by nuclease-mediated long read sequencing
WO2025240947A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2025259669A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for characterizing modified oligonucleotides
WO2025265017A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ass1 gene insertion for the treatment of citrullinemia type i
WO2026036000A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Invaio Sciences, Inc. Nature-derived lipid particles for use in agriculture
WO2026064425A2 (en) 2024-09-17 2026-03-26 Dxome Co., Ltd. Mirror image crispr-cas compositions
WO2026072529A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Mettl7a for improved embryo competence
WO2026080515A2 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cells and cell lines and methods of use thereof

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0262516A2 (en) * 1986-09-29 1988-04-06 Miles Inc. Genetic transformation of lactic acid bacteria
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
IL90161A0 (en) 1988-05-13 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b s and pres2 proteins in methylotrophic yeasts
US5767367A (en) * 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US6040295A (en) 1995-01-13 2000-03-21 Genemedicine, Inc. Formulated nucleic acid compositions and methods of administering the same for gene therapy
JPH1080274A (ja) 1996-09-06 1998-03-31 Hirofumi Hamada 核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーター
FR2753204B1 (fr) 1996-09-11 1998-12-04 Transgene Sa Procede de preparation d'adn plasmidique
GB9816138D0 (en) * 1998-07-24 1998-09-23 Ciba Geigy Ag Organic compounds
WO2000055378A1 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Lentiviral vector system for high quantity screening
US6759064B2 (en) 2001-02-22 2004-07-06 Purdue Research Foundation Compositions based on vanilloid-catechin synergies for prevention and treatment of cancer
AU2002246012A1 (en) 2001-02-24 2002-09-12 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Beta-endorphin/crf gene therapy for locally combating pain
DE10131786A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Sungene Gmbh & Co Kgaa Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen
AU2011203213A1 (en) 2002-08-28 2011-08-04 Chromocell Corporation Selection and Isolation of Living Cells Using mRNA-Binding Probes
JP2005006578A (ja) * 2003-06-20 2005-01-13 Nippon Genetech Co Ltd イン・ビトロ転写反応を利用した機能性ｒｎａ分子の製造方法
DK1667678T3 (da) 2003-10-03 2009-08-24 Veijlen N V Dyrefodersammensætning
GB2424887B (en) 2003-11-26 2008-05-21 Univ Massachusetts Sequence-specific inhibition of small RNA function
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
US20070254291A1 (en) * 2004-06-14 2007-11-01 Xiaoxia Cui Gene Targeting in Eukaryotic Cells by Group II Intron Ribonucleoprotein Particles
US20070048741A1 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 Getts Robert C Methods and kits for sense RNA synthesis
WO2007024029A1 (en) 2005-08-26 2007-03-01 Kyoto University Antiviral agent and viral replication inhibitor
CN101688241B (zh) 2007-03-02 2015-01-21 杜邦营养生物科学有限公司 具有改善的噬菌体抗性的培养物
EP2188384B1 (en) 2007-09-27 2015-07-15 Sangamo BioSciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
HRP20161004T1 (hr) * 2007-09-27 2016-10-21 Dow Agrosciences Llc Tehnološki konstruirani proteini cinkovi prsti koji imaju kao cilj gene za sintazu 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfata
WO2009137263A2 (en) 2008-04-18 2009-11-12 New Jersey Institute Of Technology Ultra-miniaturized thz communication device and system
WO2010001189A1 (en) 2008-07-03 2010-01-07 Cellectis The crystal structure of i-dmoi in complex with its dna target, improved chimeric meganucleases and uses thereof
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
EP2184292A1 (en) 2008-11-10 2010-05-12 Ulrich Kunzendorf Anti-Apoptotic Fusion Proteins
US8388824B2 (en) 2008-11-26 2013-03-05 Enthone Inc. Method and composition for electrodeposition of copper in microelectronics with dipyridyl-based levelers
KR20100080068A (ko) * 2008-12-31 2010-07-08 주식회사 툴젠 신규한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도
WO2011007193A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Cellectis Viral vectors encoding a dna repair matrix and containing a virion-associated site specific meganuclease for gene targeting
US8586526B2 (en) 2010-05-17 2013-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. DNA-binding proteins and uses thereof
US8846350B2 (en) * 2009-10-26 2014-09-30 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University MicroRNA affinity assay and uses thereof
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2011130343A1 (en) 2010-04-13 2011-10-20 Sigma-Aldrich Co. Biosensors comprising protein-binding domains and fluorescent proteins
MX2012013037A (es) * 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
US9512444B2 (en) 2010-07-23 2016-12-06 Sigma-Aldrich Co. Llc Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
CN102358902B (zh) 2011-04-02 2013-01-02 西南大学 家蚕丝素重链基因突变序列及突变的方法和应用
CA3111953C (en) 2011-04-05 2023-10-24 Cellectis Method for the generation of compact tale-nucleases and uses thereof
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US20150166969A1 (en) * 2012-02-24 2015-06-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
DK2852540T3 (en) 2012-05-23 2016-10-10 Carrier Corp Climate controlled cargo container
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
CN104540382A (zh) 2012-06-12 2015-04-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
AU2013293270B2 (en) * 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
SG10201701601WA (en) * 2012-08-29 2017-04-27 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for treatment of a genetic condition
UA118090C2 (uk) * 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
US9914930B2 (en) 2012-09-07 2018-03-13 Dow Agrosciences Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
AU2013335451C1 (en) 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8889559B2 (en) 2012-12-12 2014-11-18 Micron Technology, Inc. Methods of forming a pattern on a substrate
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
IL239344B2 (en) 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
WO2014093655A2 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
CN113355357B (zh) 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
ES2953523T3 (es) * 2012-12-27 2023-11-14 Keygene Nv Método para inducir una translocación dirigida en una planta
CN103233028B (zh) * 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
EP2922393B2 (en) * 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
RU2662932C2 (ru) * 2013-03-14 2018-07-31 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
WO2014144155A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
CA2913234A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
WO2014194190A1 (en) * 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
SG10201913068PA (en) * 2013-06-04 2020-02-27 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
CN105683379A (zh) 2013-06-17 2016-06-15 布罗德研究所有限公司 用于对有丝分裂后细胞的疾病和障碍进行靶向和建模的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
MX374532B (es) 2013-06-17 2025-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
CN103343120B (zh) * 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN120574876A (zh) * 2013-08-22 2025-09-02 纳幕尔杜邦公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
EP3188763B1 (en) * 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification

Also Published As

Publication number Publication date
EP4342987B8 (en) 2026-03-18
KR101706085B1 (ko) 2017-02-14
DE202013012597U1 (de) 2017-11-21
HK1257302A1 (en) 2019-10-18
CN105441440B (zh) 2020-12-15
CN110066775A (zh) 2019-07-30
EP4397760A3 (en) 2024-10-09
SG10201809564YA (en) 2018-11-29
BR112015008708A2 (pt) 2017-09-26
KR101656236B1 (ko) 2016-09-12
EP4549567A2 (en) 2025-05-07
US20230374525A1 (en) 2023-11-23
KR20150101446A (ko) 2015-09-03
AU2013335451C1 (en) 2024-07-04
US20250327084A1 (en) 2025-10-23
JP6517143B2 (ja) 2019-05-22
EP4549567A3 (en) 2025-09-03
JP2023166400A (ja) 2023-11-21
CN110669746A (zh) 2020-01-10
AU2015218519A1 (en) 2015-09-17
JP2024099674A (ja) 2024-07-25
EP3372679A1 (en) 2018-09-12
US20250171788A1 (en) 2025-05-29
SG11201503059XA (en) 2015-06-29
CN110592089A (zh) 2019-12-20
US12612633B2 (en) 2026-04-28
EP2912175A4 (en) 2015-12-09
US20240026367A1 (en) 2024-01-25
KR20150101478A (ko) 2015-09-03
US12612634B2 (en) 2026-04-28
EP4342987B1 (en) 2026-02-04
CA2888190A1 (en) 2014-05-01
ES2886448T3 (es) 2021-12-20
US20150322457A1 (en) 2015-11-12
AU2017254854A1 (en) 2017-11-16
CN110643600A (zh) 2020-01-03
DK4357457T3 (da) 2025-01-13
EP3733847A1 (en) 2020-11-04
KR20150101476A (ko) 2015-09-03
AU2013335451B2 (en) 2016-09-15
DK2912175T3 (en) 2018-10-22
US20240240192A9 (en) 2024-07-18
KR102052286B1 (ko) 2019-12-06
EP2912175A1 (en) 2015-09-02
DK4342987T3 (da) 2026-03-02
EP4397760B1 (en) 2026-01-21
JP2016027807A (ja) 2016-02-25
JP7571226B2 (ja) 2024-10-22
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